ankara Ünİverİstesİ fen bİlİmlerİ enstİtÜsÜ...

140
ANKARA ÜNİVERİSTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ DOKTORA TEZİ MEMELİ HÜCRELERİNİN FARKLI SUBSTRAT YÜZEYLER ÜZERİNE ADEZYONUNUN KUARTZ KRİSTAL MİKROBALANS SİSTEMİ İLE -ZAMANLI BELİRLENMESİ Şükran ŞEKER KİMYA ANABİLİM DALI ANKARA 2011 Her hakkı saklıdır

Upload: others

Post on 08-Feb-2020

4 views

Category:

Documents


0 download

TRANSCRIPT

Page 1: ANKARA ÜNİVERİSTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ ...acikarsiv.ankara.edu.tr/browse/24522/SukranSEKER.pdfmodifikasyonunun hücre adezyonunu arttırdığını; PLGA nanolif yüzey

ANKARA ÜNİVERİSTESİ

FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ

DOKTORA TEZİ

MEMELİ HÜCRELERİNİN FARKLI SUBSTRAT YÜZEYLER ÜZERİNE

ADEZYONUNUN KUARTZ KRİSTAL MİKROBALANS SİSTEMİ İLE

EŞ-ZAMANLI BELİRLENMESİ

Şükran ŞEKER

KİMYA ANABİLİM DALI

ANKARA

2011

Her hakkı saklıdır

Page 2: ANKARA ÜNİVERİSTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ ...acikarsiv.ankara.edu.tr/browse/24522/SukranSEKER.pdfmodifikasyonunun hücre adezyonunu arttırdığını; PLGA nanolif yüzey

i

ÖZET

Doktora Tezi

MEMELİ HÜCRELERİNİN FARKLI SUBSTRAT YÜZEYLER ÜZERİNE

ADEZYONUNUN KUARTZ KRİSTAL MİKROBALANS SİSTEMİ İLE EŞ-ZAMANLI

BELİRLENMESİ

Şükran ŞEKER

Ankara Üniversitesi

Fen Bilimleri Enstitüsü

Kimya Anabilim Dalı

Danışman: Prof. Dr. Y. Murat ELÇİN

Bu tez çalışmasında kuartz kristaller; kendiliğinden düzenlenen tek tabaka (KDTT),

elektroeğirme, döndürerek kaplama ve damlatma tekniği olmak üzere dört farklı yüzey kaplama

tekniği kullanılarak kaplandı. 11-Merkaptoundekanoik asit (11-MUA), 2-Merkaptoetanol ve 2-

Merkaptoetilamin kullanılarak kristallerin altın elektrot yüzeyleri KDTT tekniği ile modifiye

edildi. Kristal yüzeylerinin modifikasyonu dönüşümlü voltametri deneyleri ile doğrulandı.

Kristal yüzeyleri çeşitli teknikler kullanılarak farklı polimerlerle kaplandı. Kristal yüzeylerini

kaplamak için, elektroeğirme tekniği kullanılarak, poli(D,L-laktik-ko-glikolik asit) (PLGA)

nanolifleri; döndürerek kaplama tekniği kullanılarak, poli(stiren) (PS), poli(kaprolakton) ve

PLGA polimerleri; damlatma tekniği kullanılarak ise, kitosan, hyalüronik asit, kollajen, alginat

ve poli(l-lizin) (PLL) polimerleri kullanıldı. Hazırlanan yüzeylerin topografileri atomik kuvvet

mikroskobu (AKM) ile incelendi. Mezenkimal kök hücreler (MKH), Wistar sıçanların kemik

iliğinden izole edildi. Hücre kültürü şartlarında çoğaltılan hücreler, akış sistemine enjekte

edilerek, her bir yüzey için kristallerin frekansında meydana gelen değişimler, kuartz kristal

mikrobalans (KKM) sistemi ile eş zamanlı olarak belirlendi. KKM bulguları, hücrelerin kristal

yüzeyleri üzerine farklı oranlarda tutunduğunu gösterdi. Elde edilen sonuçlar, yüzey

modifikasyonunun hücre adezyonunu arttırdığını; PLGA nanolif yüzey üzerindeki hücre

adezyonunun, PLGA film kaplı yüzeye oranla daha fazla olduğunu gösterdi. Çalışmanın ikinci

aşaması olan hücre-ilaç etkileşiminin incelendiği deneylerde ise, MKH üzerine belirli dozlarda

vinblastin, vinorelbin ve kolsişin ilaçları enjekte edilerek, hücrelerin bu anti-mikrotübül

ilaçlarına verdikleri cevaplar KKM sistemi ile belirlendi. Kristallerin frekansında meydana

gelen değişimler, ilaçların mikrotübüllere bağlanarak, hücrelerin yüzey üzerinden ayrılmalarına

sebep olduğunu gösterdi. Elde edilen KKM bulgularının, hücre canlılığı ve mitokondriyal

dehidrogenaz aktivitesi testleri (MTT) ile paralel olduğu belirlendi.

Mayıs 2011, 125 sayfa

Anahtar Kelimeler: Kuartz kristal mikrobalans, Frekans değişimi, Hücre biyosensörü,

Hücre-substrat etkileşimi, Hücre adezyonu, Hücre yayılması, Biyomalzemeler, Anti-

mikrotübül ilaçları, Nanobiyoteknoloji.

Page 3: ANKARA ÜNİVERİSTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ ...acikarsiv.ankara.edu.tr/browse/24522/SukranSEKER.pdfmodifikasyonunun hücre adezyonunu arttırdığını; PLGA nanolif yüzey

ii

ABSTRACT

PhD Thesis

REAL-TİME DETERMİNATİON OF THE ADHESİON OF MAMMALİAN CELLS ON

DİFFERENT SUBSTRATE SURFACES BY QUARTZ CRYSTAL MİCROBALANCE

SYSTEM

Şükran ŞEKER

Ankara University

Graduate School of Natural and Applied Science

Department of Chemistry

Supervisor: Prof. Dr. Y. Murat ELÇİN

In this study, the quartz crystals were coated by using four different surface coating techniques

which are self assembled monolayer (SAM), electrospining, spin coating and casting. The gold

electrode surfaces of crystals were modified with SAM method by using 11-

Mercaptoundecanoic acid (11-MUA), 2-Mercaptoethanol and 2- Mercaptoethylamine. The

modification of crystal surfaces were confirmed with cyclic voltammetry experiments. Crystal

surfaces were coated with different polymers using various techniques. In order to coat the

crystal surfaces; with electrospinning technique Poli(D,L-lactic-co-glycolic asit) (PLGA)

nanofibers, with spin coating technique poly(styrene) (PS), poly(caprolactone) and PLGA, with

dropping technique chitosan, hyaluronic acid, collagen, alginate and poly(l-lysine) (PLL)

polymers were used. The topographic examination of the fabricated surfaces were performed by

atomic force microscopy (AFM). Mesenchymal stem cells (MSCs) were isolated from the bone

marrow of Wistar rats. The proliferated cells under cell culture conditions were injected to the

flow system, and the changes in frequency of crystal for each surface were determined by quartz

crystal microbalance (QCM) system in real time. The QCM findings indicated that the cells

were attached onto the crystal surfaces in different ratios. The obtained results showed that the

surface modification increased the cell adhesion; the cell adhesion on the PLGA nanofiber was

larger than the PLGA film. In the second step of the study, cell-to-drug interaction was

investigated. In the experiments, vinblastine, vinorelbine and colchicine of some dose were

injected to MSCs and the cell response was determined by QCM system. The changes in the

frequency of crystals indicated that, binding of drugs to microtubules caused cells to be

detached from the surface. The obtained QCM data was parallel with the cell viability and

mitocondrial dehidrogenase activity test (MTT).

May 2011, 125 pages

Key Words: Quartz crystal microbalance, Frequency shift, Cell biosensor, Cell-substrate

interaction, Cell adhesion, Cell spreading, Biomaterials, Anti-mikrotübül drugs,

Nanobiotechnology.

Page 4: ANKARA ÜNİVERİSTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ ...acikarsiv.ankara.edu.tr/browse/24522/SukranSEKER.pdfmodifikasyonunun hücre adezyonunu arttırdığını; PLGA nanolif yüzey

iii

TEŞEKKÜR

Bu çalışmanın doktora tezi olarak yürütülmesinde öncü olan ve çalışmanın her

aşamasında değerli önerilerinden yararlandığım danışman hocam

Prof. Dr. Y. Murat ELÇİN’e (Ankara Üniversitesi Kimya ABD) teşekkürlerimi

sunarım.

Doktora çalışmam boyunca bana her konuda destek olup, yakın ilgi ve yardımlarını

esirgemeyen değerli hocam Doç. Dr. Eser ELÇİN’e (Gazi Üniversitesi Gazi Eğitim

Fakültesi) teşekkürlerimi sunarım.

Çalışmalarım süresince birçok fedakarlıklar göstererek beni destekleyen aileme

teşekkürlerimi sunarım.

Şükran ŞEKER

Ankara, Mayıs 2011

Page 5: ANKARA ÜNİVERİSTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ ...acikarsiv.ankara.edu.tr/browse/24522/SukranSEKER.pdfmodifikasyonunun hücre adezyonunu arttırdığını; PLGA nanolif yüzey

iv

İÇİNDEKİLER

ÖZET ................................................................................................................................. i

ABSTRACT ...................................................................................................................... ii

TEŞEKKÜR .................................................................................................................... iii

SİMGELER DİZİNİ ...................................................................................................... viii

ŞEKİLLER DİZİNİ ........................................................................................................ ix

ÇİZELGELER DİZİNİ ................................................................................................. xiv

1. GİRİŞ ............................................................................................................................ 1

2. KURAMSAL TEMELLER ......................................................................................... 6

2.1 Piezoelektrik Özellik .................................................................................................. 6

2.2 Kuartz Kristaller ........................................................................................................ 8

2.2.1 Kuartz kristal kesim tipleri .................................................................................... 9

2.2.2 Kristal kesim tipi ile sıcaklık ilişkisi ..................................................................... 11

2.3 Akustik Dalga Cihazları ........................................................................................... 13

2.3.1 Hacim akustik dalga sensörleri ............................................................................. 14

2.3.2 Yüzey akustik dalga sensörleri ............................................................................. 15

2.4 Kuartz Kristal Mikrobalans .................................................................................... 15

2.4.1 Sauerbrey ve Kanazawa eşitliği ............................................................................ 16

2.4.2 KKM biyosensör uygulamaları ............................................................................. 17

2.5 Yüzey Kaplama Yöntemleri ..................................................................................... 25

2.5.1 Kendiliğinden düzenlenen tek tabaka yöntemi ................................................... 25

2.5.1.1 Alkantiyol tek tabakalar ..................................................................................... 25

2.5.1.2 Alkilsiloksan tek tabakalar ................................................................................ 27

2.5.2 Polimer kaplama yöntemleri ................................................................................. 28

2.5.2.1 Elektroeğirme yöntemi ....................................................................................... 28

Page 6: ANKARA ÜNİVERİSTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ ...acikarsiv.ankara.edu.tr/browse/24522/SukranSEKER.pdfmodifikasyonunun hücre adezyonunu arttırdığını; PLGA nanolif yüzey

v

2.5.2.2 Döndürerek kaplama yöntemi ........................................................................... 29

2.6 Dönüşümlü Voltametri (Cyclic Voltammetry, CV) ............................................... 30

2.7 Atomik Kuvvet Mikroskobu (Atomic Force Microscopy, AFM) ......................... 31

2.8 Hücre İskeleti ve Hücre Adezyon Molekülleri ....................................................... 34

2.8.1 Hücre adezyon molekülleri .................................................................................. 35

2.9 Anti-Mikrotübül İlaçları ......................................................................................... 36

2.9.1 Taksanlar ................................................................................................................ 38

2.9.2 Vinka alkaloidler ................................................................................................... 38

2.9.2.1 Kolsişin ................................................................................................................ 38

2.9.2.2 Vinorelbin ........................................................................................................... 39

2.9.2.3 Vinblastin ............................................................................................................ 40

3. MATERYAL ve YÖNTEM ........................................................................................ 42

3.1 Madde ve Malzeme ................................................................................................... 42

3.2 Ölçüm Sistemi ve Kuartz Kristaller ........................................................................ 43

3.3 Kristal Yüzeylerinin Kaplanması ............................................................................ 45

3.3.1 Kendiliğinden düzenlenen tek tabaka yöntemi ile yüzey modifikasyonu ......... 45

3.3.1.1 Dönüşümlü voltametri ölçümleri ....................................................................... 46

3.3.2 Elektroeğirme (electrospining) tekniği ile yüzey kaplama ................................. 46

3.3.3 Döndürerek kaplama (spin coating) tekniği ile yüzey kaplama ........................ 47

3.3.4 Damlatma tekniği ile yüzey kaplama ................................................................... 47

3.3.4.1 Kitosan film ile kaplama ..................................................................................... 47

3.3.4.2 Hyalüronik asit polimeri ile kaplama ................................................................ 47

3.3.4.3 Kollajen film ile kaplama ................................................................................... 48

3.3.4.4 Alginat film ile kaplama ..................................................................................... 48

3.3.4.5 PLL film ile kaplama .......................................................................................... 48

Page 7: ANKARA ÜNİVERİSTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ ...acikarsiv.ankara.edu.tr/browse/24522/SukranSEKER.pdfmodifikasyonunun hücre adezyonunu arttırdığını; PLGA nanolif yüzey

vi

3.4 Atomik Kuvvet Mikroskobu .................................................................................... 49

3.5 Kaplı Yüzeylerin Kararlılık Testleri ....................................................................... 49

3.6 Sıçan Kemik İliğinden Mezenkimal Kök Hücrelerinin İzolasyonu ...................... 49

3.6.1 Hücre kültürü ve pasajlama .................................................................................. 50

3.6.2 Tripsinizasyon işlemi ............................................................................................. 50

3.7 Hücre Adezyonunun KKM Sistemi ile Görüntülenmesi ....................................... 50

3.8 Toksisite Testleri ....................................................................................................... 51

3.8.1 MTT testi ................................................................................................................ 52

3.8.2 IC50 değerlerinin hesaplanması ........................................................................... 53

3.9 Hücre-İlaç Etkileşiminin KKM Sistemi ile Görüntülenmesi ................................ 53

4. BULGULAR ................................................................................................................ 55

4.1 Kaplamaların Neden Olduğu Frekans Değişimleri Bulguları .............................. 55

4.2 Kristal Yüzeylerinin AFM Bulguları ...................................................................... 56

4.2.1 Altın yüzeyin AFM bulguları ................................................................................ 56

4.2.2 11-MUA ile modifiye edilen yüzeyin AFM bulguları .......................................... 57

4.2.3 2-Merkaptoetanol ile kaplı yüzeyin AFM bulguları ........................................... 59

4.2.4 2-Merkaptoetilamin ile kaplı yüzeyin AFM bulguları ........................................ 60

4.2.5 PLGA nanolif ile kaplı yüzeyin AFM bulguları .................................................. 62

4.2.6 PLGA film ile kaplı yüzeyin AFM bulguları ....................................................... 63

4.2.7 PCL ile kaplı yüzeyin AFM bulguları .................................................................. 65

4.2.8 PS ile kaplı yüzeyin AFM bulguları ..................................................................... 66

4.2.9 Kitosan ile kaplı yüzeyin AFM bulguları ............................................................. 68

4.2.10 Hyalüronik asit ile kaplı yüzeyin AFM bulguları ............................................. 69

4.2.11 Kollajen ile kaplı yüzeyin AFM bulguları ......................................................... 71

4.2.12 Alginat ile kaplı yüzeyin AFM görüntüleri ........................................................ 72

Page 8: ANKARA ÜNİVERİSTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ ...acikarsiv.ankara.edu.tr/browse/24522/SukranSEKER.pdfmodifikasyonunun hücre adezyonunu arttırdığını; PLGA nanolif yüzey

vii

4.2.13 PLL ile kaplı yüzeyin AFM bulguları ................................................................ 73

4.2.14 Yüzeylerin RMS değerleri ................................................................................... 75

4.3. CV Bulguları ............................................................................................................. 76

4.4 Faz Kontrast Mikroskobu Bulguları ....................................................................... 78

4.4 Hücre Adezyonu Bulguları ....................................................................................... 79

4.4.1 Altın ve alkilsiloksan tek tabaka yüzeyler üzerine hücre adezyonu

bulguları ................................................................................................................. 79

4.4.2 PLGA nanolif ve PLGA film kaplı yüzeyler üzerine hücre adezyonu

bulguları ................................................................................................................. 82

4.4.3 PCL ve PS polimeri ile kaplı yüzeyler üzerine hücre adezyonu sonuçları ....... 84

4.4.4 PLL, kitosan, hyalüronik asit, kollajen ve alginat polimeri ile kaplı

kristal yüzeyinin hücre adezyonu sonuçları ........................................................ 86

4.5 Hücre-İlaç Etkileşimi ile İlgili Araştırma Bulguları .............................................. 90

4.5.1 Faz kontrast mikroskobu bulguları ...................................................................... 90

4.5.2 MTT bulguları ........................................................................................................ 94

4.5.2.1 Faz kontrast mikroskobu bulguları ................................................................... 94

4.5.2.2 MTT hücre canlılık testi sonuçları .................................................................... 98

4.5.3 KKM Bulguları ..................................................................................................... 100

4.5.3.1 Kolsişin’in MKH üzerine etkisi ........................................................................ 100

4.5.3.2 Vinorelbin’in MKH üzerine etkisi .................................................................... 102

4.5.3.3 Vinblastin’in MKH üzerine etkisi .................................................................... 104

5. TARTIŞMA ve SONUÇ ............................................................................................ 107

KAYNAKLAR ............................................................................................................... 115

EKLER ............................................................................................................................ 122

EK 1 Kaplama işlemlerinde kullanılan polimerlerin molekül yapıları .................... 123

EK 2 Kaplamalrın neden olduğu frekans değişimleri ................................................ 124

ÖZGEÇMİŞ .................................................................................................................... 125

Page 9: ANKARA ÜNİVERİSTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ ...acikarsiv.ankara.edu.tr/browse/24522/SukranSEKER.pdfmodifikasyonunun hücre adezyonunu arttırdığını; PLGA nanolif yüzey

viii

SİMGELER DİZİNİ

11-MUA 11-Merkaptoundekanoik asit

AFM Atomik kuvvet mikroskopisi

AMEM Alpha modified eagle’s medium

CV Dönüşümlü voltametri

F Frekans

IC İnhibitör konsantrasyonu

MKH Mezenkimal kök hücre

PCL Poli(kaprolakton)

PLGA Poli(D,L-laktik-ko-glikolik asit)

PLL Poli(l-lizin)

PS Poli(stiren)

PZ Piezoelektrik

QCM Kuartz kristal mikrobalans

R Direnç

RMS Yüzey pürüzlülük değeri

SAM Kendiliğinden düzenlenen tek tabaka

SAW Yüzey akustik dalga

SEM Taramalı elektron mikroskopisi

TEM Geçirmeli elektron mikroskopisi

TSM Kalınlık kayma modu

Page 10: ANKARA ÜNİVERİSTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ ...acikarsiv.ankara.edu.tr/browse/24522/SukranSEKER.pdfmodifikasyonunun hücre adezyonunu arttırdığını; PLGA nanolif yüzey

ix

ŞEKİLLER DİZİNİ

Şekil 2.1 Piezoelektrik etkiyi açıklayan basit moleküler model: a. Doğal molekül,

b. Kuvvet uygulanan molekül, c. Malzeme yüzeyi üzerindeki

polarizasyon etkisi ............................................................................................ 7

Şekil 2.2 Piezolektrik etki ile oluşan elektrik akımı .......................................................... 8

Şekil 2.3 Kuartz kristaldeki SiO2 kafes yapısı ................................................................... 9

Şekil 2.4 Kuartz kristalin optik z-eksenine 35o 10’ açıyla kesimi sonucunda elde

edilen AT-kesim kuartz kristali ........................................................................ 10

Şekil 2.5 Kuartz kristalin titreşim modları ........................................................................ 11

Şekil 2.6 Farklı kesim tipine sahip kristallerin titreşim frekanslarının sıcaklık ile

ilişkisi ............................................................................................................. 12

Şekil 2.7 AT-kesim kristallerin titreşim frekansının sıcaklıkla değişimi .......................... 13

Şekil 2.8 Akustik dalga sistemleri (Akustik rezonatörler) ve dalga yayılımları ............... 14

Şekil 2.9 Kuartz kristali..................................................................................................... 15

Şekil 2.10 Piezoelektrik kuartz kristalin titreşimi sırasında oluşan kayma ....................... 16

Şekil 2.11 KKM enzim sensörü ile glikonik asidin eş zamanlı belirlenmesi.................... 22

Şekil 2.12 KKM hücre biyosensörünün şematik olarak gösterimi ................................... 23

Şekil 2.13 Alkilsiloksan tek tabaka tekniği ile kristal yüzeyinin modifikasyonu ............. 26

Şekil 2.14 Alkilsiloksan tek tabaka ................................................................................... 27

Şekil 2.15 Elektroeğirme yönteminin şematik olarak gösterimi ....................................... 28

Şekil 2.16 Döndürerek kaplama yöntemi ile yüzey kaplama ............................................ 30

Şekil 2.17 AFM sisteminin şematik olarak gösterimi ....................................................... 32

Şekil 2.18 Mikrotübüllerin polimerizasyonu .................................................................... 34

Şekil 2.19 Mikrotübüllerin farklı bölgelerine bağlanan anti-mikrotübül ilaçları .............. 37

Şekil 2.20 Kolsişin molekülünün yapısı ........................................................................... 39

Şekil 2.21 Vinorelbin molekülünün yapısı ....................................................................... 40

Şekil 2.22 Vinblastin sülfat molekülünün yapısı .............................................................. 41

Page 11: ANKARA ÜNİVERİSTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ ...acikarsiv.ankara.edu.tr/browse/24522/SukranSEKER.pdfmodifikasyonunun hücre adezyonunu arttırdığını; PLGA nanolif yüzey

x

Şekil 3.1 Çalışmalarda kullanılan ölçüm sistemi ve kuartz kristali .................................. 43

Şekil 3.2 Kristalin akış hücresi içerisine yerleştirilmesi ................................................... 44

Şekil 3.3 Hücre adezyonu ve hücre-ilaç etkileşimi ölçümleri için deney düzeneği.......... 45

Şekil 3.4 CV ölçümleri için deney düzeneği ..................................................................... 46

Şekil 3.5 Formazan kristallerinin oluşum reaksiyonu ....................................................... 52

Şekil 4.1 Kurartz kristalin altın yüzeyinin üç boyutlu AFM görüntüsü ve

histogram analizi ................................................................................................ 56

Şekil 4.2 Altın yüzeyin kesit analizi ................................................................................. 57

Şekil 4.3 11-MUA ile kaplı yüzeyin üç boyutlu AFM görüntüsü ve histogram

analizi ............................................................................................................. 58

Şekil 4.4 11-MUA ile kaplı yüzeyin kesit analizi ............................................................. 58

Şekil 4.5 2-Merkaptoetanol ile kaplı yüzeyin üç boyutlu AFM görüntüsü ve

histogram analizi ............................................................................................ 59

Şekil 4.6 2-Merkaptoetanol ile kaplı yüzeyin kesit analizi ............................................... 60

Şekil 4.7 2-Merkaptoetilamin ile kaplı yüzeyin üç boyutlu AFM görüntüsü ve

histogram analizi ............................................................................................ 61

Şekil 4.8 2-Merkaptoetilamin ile kaplı yüzeyin kesit analizi ............................................ 61

Şekil 4.9 PLGA nanolif ile kaplı yüzeyin üç boyutlu AFM görüntüsü ve histogram

analizi ............................................................................................................. 62

Şekil 4.10 PLGA nanolif ile kaplı yüzeyin kesit analizi ................................................... 63

Şekil 4.11 PLGA film kaplı yüzeyin üç boyutlu AFM görüntüsü ve histogram

analizi ............................................................................................................. 64

Şekil 4.12 PLGA film ile kaplı yüzeyin kesit analizi........................................................ 64

Şekil 4.13 PCL ile kaplı yüzeyin üç boyutlu AFM görüntüsü ve histogram analizi ........ 65

Şekil 4.14 PCL ile kaplı yüzeyin kesit analizi .................................................................. 66

Şekil 4.15 PS kaplı yüzeyin üç boyutlu AFM görüntüsü ve histogram analizi ................ 67

Şekil 4.16 PS ile kaplı yüzeyin kesit analizi ..................................................................... 67

Şekil 4.17 Kitosan ile kaplı yüzeyin üç boyutlu AFM görüntüsü ve histogram

analizi ............................................................................................................. 68

Şekil 4.18 Kitosan ile kaplı yüzeyin kesit analizi ............................................................. 69

Page 12: ANKARA ÜNİVERİSTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ ...acikarsiv.ankara.edu.tr/browse/24522/SukranSEKER.pdfmodifikasyonunun hücre adezyonunu arttırdığını; PLGA nanolif yüzey

xi

Şekil 4.19 Hyalüronik asit ile kaplı yüzeyin üç boyutlu AFM görüntüsü ve

histogram analizi ............................................................................................ 70

Şekil 4.20 Hyalüronik asit ile kaplı yüzeyin kesit analizi ................................................. 70

Şekil 4.21 Kollajen ile kaplı yüzeyin üç boyutlu AFM görüntüsü ve histogram

analizi ............................................................................................................. 71

Şekil 4.22 Kollajen ile kaplı yüzeyin kesit analizi ............................................................ 72

Şekil 4.23 Alginat ile kaplı yüzeyin üç boyutlu AFM görüntüsü ve histogram

analizi ............................................................................................................. 73

Şekil 4.24 Alginat ile kaplı yüzeyin kesit analizi .............................................................. 73

Şekil 4.25 PLL ile kaplı yüzeyin üç boyutlu AFM görüntüsü ve histogram analizi ......... 74

Şekil 4.26 PLL ile kaplı yüzeyin kesit analizi................................................................... 74

Şekil 4.27.a. Kaplanmamış kristalin, b. 11-MUA ile kaplı kristalin CV

voltamogramı. ................................................................................................ 76

Şekil 4.28.a. Kaplanmamış kristalin, b. 2-Merkaptoetanol ile kaplı kristalin CV

voltamogramı. ................................................................................................ 77

Şekil 4.29.a. Kaplanmamış kristalin, b. 2-Merkaptoetilamin ile kaplı kristalin CV

voltamogramı. ................................................................................................ 77

Şekil 4.30.a. Sıçan kemik iliği mezenkimal kök hücrelerinin 1. Pasajın 10.

gününde, b. 3. Pasajın 10. gününde elde edilen faz kontrast görüntüleri ....... 78

Şekil 4.31.a. Kaplanmamış kristal yüzeyi üzerine hücresiz besiyeri, b. hücreli

besiyeri enjeksiyonu sonrasında kristaldeki frekans değişimi ....................... 79

Şekil 4.32 11-MUA ile kaplı yüzey üzerine hücresiz (a) ve hücreli besiyeri (b)

enjeksiyonu sonrasında kristaldeki frekans değişimi ..................................... 80

Şekil 4.33.a. 2-Merkaptoetanol ile kaplı yüzey üzerine hücresiz besiyeri, b. hücreli

besiyeri enjeksiyonu sonrasında kristaldeki frekans değişimi ....................... 81

Şekil 4.34.a. 2-Merkaptoetilamin ile kaplı yüzey üzerine hücresiz besiyeri, b.

hücreli besiyeri enjeksiyonu sonrasında kristaldeki frekans değişimi ........... 81

Şekil 4.35.a. PLGA nanolif ile kaplı yüzey üzerine hücresiz besiyeri, b. hücreli

besiyeri enjeksiyonu sonrasında kristaldeki frekans değişimi ....................... 83

Şekil 4.36.a. PLGA film ile kaplı yüzey üzerine hücresiz besiyeri, b. hücreli

besiyeri enjeksiyonu sonrasında kristaldeki frekans değişimi ....................... 84

Şekil 4.37.a. PCL ile kaplı yüzey üzerine hücresiz besiyeri, b. hücreli besiyeri

enjeksiyonu sonrasında kristaldeki frekans değişimi ..................................... 85

Şekil 4.38.a. PS ile kaplı yüzey üzerine hücresiz besiyeri, b. hücreli besiyeri

enjeksiyonu sonrasında kristaldeki frekans değişimi ..................................... 86

Şekil 4.39.a. PLL ile kaplı yüzey üzerine hücresiz besiyeri, b. hücreli besiyeri

enjeksiyonu sonrasında kristaldeki frekans değişimi ..................................... 87

Page 13: ANKARA ÜNİVERİSTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ ...acikarsiv.ankara.edu.tr/browse/24522/SukranSEKER.pdfmodifikasyonunun hücre adezyonunu arttırdığını; PLGA nanolif yüzey

xii

Şekil 4.40 Kitosan ile kaplı yüzey üzerine hücre enjeksiyonu sonrasında

kristaldeki frekans değişimi ........................................................................... 88

Şekil 4.41 Hyalüronik asit ile kaplı yüzey üzerine hücre enjeksiyonu sonrasında

kristaldeki frekans değişimi ........................................................................... 89

Şekil 4.42 Kollajen ile kaplı yüzey üzerine hücre enjeksiyonu sonrasında

kristaldeki frekans değişimi ........................................................................... 89

Şekil 4.43 Alginat ile kaplı yüzey üzerine hücre enjeksiyonu sonrasında

kristaldeki frekans değişimi ........................................................................... 90

Şekil 4.44 Şekil 4.44 Artan kolsişin derişimine bağlı olarak mezenkimal kök

hücrelerinin morfolojilerinde meydana gelen değişimi gösteren faz

kontrast mikroskobu görüntüleri, a. Kontrol, b. 50 µM, c. 100 µM, d.

150 µM, e. 200 µM, f. 250 µM ...................................................................... 91

Şekil 4.45 Artan vinorelbin derişimine bağlı olarak mezenkimal kök hücrelerinin

morfolojilerinde meydana gelen değişimi gösteren faz kontrast

mikroskobu görüntüleri, a. Kontrol, b. 50 µM, c. 100 µM, d. 150 µM,

e. 200 µM, f. 250 µM ..................................................................................... 92

Şekil 4.46 Artan vinblastin derişimine bağlı olarak mezenkimal kök hücrelerinin

morfolojilerinde meydana gelen değişimi gösteren faz kontrast

mikroskobu görüntüleri, a. Kontrol, b. 50 µM, c. 100 µM, d. 150 µM,

e. 200 µM, f. 250 µM ..................................................................................... 93

Şekil 4.47 Artan konsantrasyonlarda kolsişin içeren besiyeri ile 6 saat muamele

edilen mezenkimal kök hücrelerin MTT boyamalarının faz kontrast

mikroskobu görüntüleri, a. Kontrol, b. 50 µM, c. 100 µM, d. 150 µM,

e. 200 µM, f. 250 µM ..................................................................................... 95

Şekil 4.48 Artan konsantrasyonlarda vinorelbin içeren besiyeri ile 6 saat muamele

edilen mezenkimal kök hücrelerin MTT boyamalarının faz kontrast

mikroskobu görüntüleri, a. Kontrol, b. 50 µM, c. 100 µM, d. 150 µM,

e. 200 µM, f. 250 µM ..................................................................................... 96

Şekil 4.49 Artan konsantrasyonlarda vinblastin içeren besiyeri ile 6 saat muamele

edilen mezenkimal kök hücrelerin MTT boyamalarının faz kontrast

mikroskobu görüntüleri, a. Kontrol, b. 50 µM, c. 100 µM, d. 150 µM,

e. 200 µM, f. 250 µM ..................................................................................... 97

Şekil 4.50 Artan kolsişin miktarına bağlı olarak hücre canlılığında meydana gelen

değişim ........................................................................................................... 98

Şekil 4.51 Artan vinorelbin miktarına bağlı olarak hücre canlılığında meydana

gelen değişim.................................................................................................. 99

Şekil 4.52 Artan vinblastin miktarına bağlı olarak hücre canlılığında meydana

gelen değişim.................................................................................................. 99

Şekil 4.53 Hücre ilavesi (1. ok) ve kolsişin ilavesi (2. ok) sonrası kristalin

frekansında meydana gelen değişim ............................................................. 101

Şekil 4.54 PS ile kaplı yüzey (hücresiz) üzerine kolsişin ilavesi sonrası kristalin

frekansında meydana gelen değişim ............................................................. 101

Page 14: ANKARA ÜNİVERİSTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ ...acikarsiv.ankara.edu.tr/browse/24522/SukranSEKER.pdfmodifikasyonunun hücre adezyonunu arttırdığını; PLGA nanolif yüzey

xiii

Şekil 4.55 Hücre ilavesi (1. ok) ve vinorelbin ilavesi (2. ok) sonrası kristalin

frekansında meydana gelen değişim ............................................................. 103

Şekil 4.56 PS ile kaplı yüzey (hücresiz) üzerine vinorelbin ilavesi sonrası kristalin

frekansında meydana gelen değişim ............................................................. 103

Şekil 4.57 Hücre ilavesi (1. ok) ve vinblastin ilavesi (2. ok) sonrası kristalin

frekansında meydana gelen değişim ............................................................. 104

Şekil 4.58 PS ile kaplı yüzey (hücresiz) üzerine vinblastin ilavesi sonrası kristalin

frekansında meydana gelen değişim ............................................................. 105

Şekil 4.59 Kristal yüzeyindeki hücreler üzerine DMSO enjeksiyonu sonucu

kristalin frekansında meydana gelen değişim ............................................... 106

Page 15: ANKARA ÜNİVERİSTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ ...acikarsiv.ankara.edu.tr/browse/24522/SukranSEKER.pdfmodifikasyonunun hücre adezyonunu arttırdığını; PLGA nanolif yüzey

xiv

ÇİZELGELER DİZİNİ

Çizelge 1.1 Çalışmada kullanılan kristal kaplama malzemeleri ve kaplama

yöntemleri........................................................................................................ 5

Çizelge 4.1 Kaplamaların neden olduğu frekans değişimleri ........................................... 55

Çizelge 4.2 Yüzeylerin RMS değerleri ............................................................................. 75

Çizelge 4.3 MKH’lerin IC50 değerleri ............................................................................ 100

Page 16: ANKARA ÜNİVERİSTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ ...acikarsiv.ankara.edu.tr/browse/24522/SukranSEKER.pdfmodifikasyonunun hücre adezyonunu arttırdığını; PLGA nanolif yüzey

1

1. GİRİŞ

Biyosensörler, biyokimyasal sinyaleri ölçülebilir elektrik sinyallerine dönüştürebilen

analitik cihazlardır. Günümüzde biyosensörler basit ve düşük maliyetli olmaları, hızlı

cevap verme süresine sahip olmaları, çok az aktif malzemeye ihtiyaç göstermeleri ve

yüksek hassasiyetli cihazlar olmalarından dolayı, başta klinik teşhisler olmak üzere,

gıda, eczacılık, çevre kirliliği ve ilaç keşfi çalışmalarında yaygın olarak

kullanılmaktadırlar.

Biyosensörler reseptör ve dönüştürücü olmak üzere iki ana yapıdan oluşmaktadır.

Biyoreseptörler analiti tanıyan biyomoleküllerdir. Dönüştürücüler ise biyoreseptörün

analiti tanıdığı anda ürettiği kimyasal veya fiziksel sinyali, elektrik sinyallerine

dönüştüren yapılardır. Biyosensör sistemlerinde, optik, elektrokimyasal, termometrik,

manyetik veya piezoelektrik özelliğe sahip farklı dönüştürücü sistemleri

kullanılmaktadır. Piezoelektrik (PZ) biyosensörlerde kullanılan dönüştürücü sistemini,

piezoelektrik kuartz kristaller oluşturmaktadır.

Kuartz kristal mikrobalans sisteminde, kristal yüzeyi üzerinde meydana gelen herhangi

bir kütle birikimi, kristalin temel titreşim frekansının azalmasına neden olmakta ve bu

değişimden yararlanılarak kalitatif ve kantitatif analizler yapılabilmektedir. KKM’in

diğer sensör sistemleriyle kıyaslandığında sahip olduğu en önemli avantajı, herhangi bir

işaretleme işlemi yapılmadan, analiz edilecek maddelerin eş zamanlı olarak belirlendiği

bir sistem olmasıdır (Bunde vd. 1998). Sistem sahip olduğu bu avantajlarından dolayı,

kimyasal (Chao ve Shih 1998, Shih vd. 2001) ve biyolojik (Minunni vd. 2003)

maddelerin analizlerinde yaygın olarak kullanılmaktadır.

Katı yüzeyler üzerine hücre adezyonu, hücrelerin biyomalzemelere karşı

davranışlarının belirlenmesinde oldukça önemlidir. Biyomalzemlerin, fiziksel,

kimyasal, mekanik ve termal özellikerinin iyi bilinmesi; allerjik, toksik, karsinojenik

etki göstermemesi gerekmektedir. Biyomalzemelerin fizikokimyasal özelliklerinin ve

Page 17: ANKARA ÜNİVERİSTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ ...acikarsiv.ankara.edu.tr/browse/24522/SukranSEKER.pdfmodifikasyonunun hücre adezyonunu arttırdığını; PLGA nanolif yüzey

2

biyouyumluluklarının belirlenmesinde yeni metodların geliştirilmesi, tıp alanında yeni

biyomalzemlerin kullanıma sunulması amacıyla son derece önemlidir. Malzemelerin

biyouyumluluk özellikleri, yüzey üzerine hücre adezyonuyla yakından ilişkilidir

(Anselme vd. 2005). Biyomalzeme yüzeyi üzerine hücre adezyonunun belirlenmesi

için birçok farklı yöntem kullanılmaktadır. Bu yöntemlerde; enzimatik ayırma veya

fiksasyon sonrasında, işaretlenmiş hücrelerin direkt olarak sayımı, hücre lizisi sonrası

boyanmış hücrelerin spektrofluorimetre ile indirekt olarak sayımı, farklı optik

tekniklerle hücre alan ve yoğunluk ölçümleri ve adezyon kuvvetlerinin analizinde

kullanılan fluoresans yoğunluk ölçümleri yapılmaktadır. Hücre adezyonu

gerçekleştikten sonra, hücreyi yüzeyden ayırma, boyama işlemleri veya fiksasyon

basamakları gibi zaman alıcı işlemlerin uygulanması bu yöntemlerin

dezavantajlarındandır (Fredriksson vd. 1998).

Biyomalzeme araştırma ve geliştirme çalışmalarında karşılaşılan en önemli

problemlerden biri hücre-malzeme ve hücre-ilaç ilişkilerini in vitro ortamda, eş

zamanlı olarak belirleyebilen bir sistemin eksikliğidir (Lord vd. 2006). Kuartz kristal

mikrobalans sistemi, hücreyi yüzey üzerinden ayırmadan ya da herhangi bir işaretleme

işlemi yapmadan hücre adezyonunun eş zamanlı olarak belirlenebildiği bir tekniktir

(Modin vd. 2006).

Kuartz kristal mikrobalans biyosensörlerin hazırlanmasında ilk basamak, kuartz

kristalin uygun bir kaplama malzemesi ile kaplanarak, analiz edilecek maddenin (ya da

hücrenin) sensör yüzeyine doğru bir şekilde bağlanmasını sağlamaktır. Bu amaç için

farklı kaplama teknikleri kullanılmaktadır. Bu çalışmada kuartz kristallerin kaplanması

aşamasında; kendiliğinden düzenlenen tek tabaka, elektroeğirme, döndürerek kaplama

ve damlatma yöntemi olmak üzere dört farklı kaplama yöntemi kullanılmıştır. KKM

hücre sensörü uygulamalarında, kuartz kristalin elektrot yüzeyine kaplanan malzeme,

hücre adezyonunu arttırmak ve bağlanan hücrelerin canlı bir şekilde yüzeyde kalmasını

sağlamak amacıyla oldukça önemlidir (Guo vd. 2008). Aynı zamanda kaplama

malzemesinin viskoelastik özelliklerinin, KKM sensörünün kütle hassasiyeti üzerinde

Page 18: ANKARA ÜNİVERİSTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ ...acikarsiv.ankara.edu.tr/browse/24522/SukranSEKER.pdfmodifikasyonunun hücre adezyonunu arttırdığını; PLGA nanolif yüzey

3

önemli bir rolü bulunmaktadır (Lucklum vd. 2000). Bu sebeple, sensör için en uygun

kaplama malzemesi, bu gibi özellikler göz önünde bulundurularak belirlenmelidir.

İşaretsiz (label-free) hücre temelli teknolojiler ilaç keşfi çalışmalarının önemli bir

parçasını oluşturmaktadır. Bu teknolojinin en önemli avantajlarından biri hücre

cevaplarının belirlenmesinde herhangi bir işaretleme işlemine gerek duyulmamasıdır.

İşaretleme amacıyla kullanılan bazı maddeler hücre davranışlarını etkileyen

fonksiyonlar gösterebilmektedir. Bu durum hücrenin doğal davranışlarını

engellemektedir. Bu teknolojinin diğer bir avantajı ise, hücrelerin noninvaziv (non-

invasive) olarak incelenmesidir (Xi vd. 2008). Bu özellik hücre davranışlarının eş

zamanlı olarak ölçülmesine olanak sağlamaktadır. Hücresel prosesleri eş zamanlı olarak

görüntüleyen tekniklerin, diğer geleneksel yöntemlerle kıyaslandığında önemli

avantajları bulunmaktadır. Bu teknoloji ile, hücre büyümesi, çoğalması, apoptozis ve

morfolojik değişimler gibi biyolojik olaylar hakkında önemli bilgiler sağlanmaktadır.

Anti-mikrotübül ilaçları kanser tedavisinde kullanılan anti-mitotik özelliğe sahip

maddelerdir. Bu maddeler mikrotübüllere bağlanıp mikrotübüllerin fonksiyonunu

bozarak, mitoz bölünmenin durmasına neden olmaktadır (Jordan ve Wilson 2004). Anti-

mikrotübül ilaçlarına karşı zamanla kazanılan direnç o ilacın etkinliğini azalmaktadır.

Genel olarak üç temel ilaç direnci oluşum mekanizması bulunmaktadır (Checchi vd.

2003). İlk direnç mekanizmasında, hücre membranında yer alan ve bir protein olan P

glikoproteininin fazla miktarda sentezlenmesi ile ilaç direnci ortaya çıkmaktadır. Bu

protein tıpkı bir pompa gibi çalışarak, hücre içerisinden ilaçları hızlı bir şekilde dışarı

atmaktadır. İkinci olarak, alfa ve beta tübülinin alt ünitelerini kodlayan genlerde

meydana gelen mutasyonlardır. Bu gen mutasyonları ilaçların tübüline bağlanmasını

engelleyebilmektedir. Üçüncü olarak ise; memelilerde altı β-tübülin izotipi

bulunmaktadır ve izotiplerin ekspresyonları dokulara özgündür. Bu çeşitlilik nedeniyle

ilaçların etkinlikleri her dokuda farklılık göstermektedir. Geliştirilen dirençlilik pek çok

anti-mikrotübül ilacın hastalar üzerinde beklenen etkisini gösterememesine ve hastalığın

ilerlemesine neden olmaktadır. Artırılan ilaç dozları ise hastalarda görülen yan etkilerin

artmasına neden olmaktadır (Kars vd. 2009). Bu nedenle son yıllarda yeni anti-

Page 19: ANKARA ÜNİVERİSTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ ...acikarsiv.ankara.edu.tr/browse/24522/SukranSEKER.pdfmodifikasyonunun hücre adezyonunu arttırdığını; PLGA nanolif yüzey

4

mikrotübül ilaçlarının geliştirilmesi yönünde önemli çabalar sarf edilmektedir (Checchi

vd. 2003). Kuartz kristal mikrobalans sistemi, kemoterapötik potansiyeli bulunan bazı

maddelerin mikrotübüle bağlanma aktivitelerinin, işaretleme işlemi yapılmadan ve eş

zamanlı olarak incelenebilmesine olanak sağlamaktadır.

Bu çalışma genel olarak iki aşamadan oluşmaktadır: (1) Hücre-malzeme etkileşiminin

incelenmesi, (2) Hücre-ilaç etkileşiminin incelenmesi. Çalışmanın ilk aşamasında

mezenkimal kök hücrelerinin farklı yüzeyler üzerindeki bağlanma oranları KKM

sistemi ile incelendi. Bu amaçla, herhangi bir kaplama işlemi yapılmamış kristal yüzeyi

(altın) ile birlikte toplam 13 farklı yüzey üzerinde çalışıldı (Çizelge 1.1).

Çalışmanın birinci aşaması için, kuartz kristal yüzeyi, dört farklı kaplama tekniği

kullanılarak farklı malzemelerle kaplandı. Kaplamaların neden olduğu frekans

değişimlerini belirlemek amacıyla, kristalin kaplamadan önceki ve sonraki frekansları

ölçülerek frekans değişimleri hesaplandı. Yüzeyi kaplanan kristal, hücre adezyonu

ölçümleri için akış hücresi içerisine yerleştirildi. Akış hücresinin osilatörle bağlantısı

yapılarak karbondioksit inkübatörü içerisine (%5 CO2, 37oC ve %95 nem) yerleştirildi

ve peristaltik pompa ile bağlantısı yapıldı. Akış hücresi içerisinde bulunan kristal yüzeyi

üzerine, peristaltik pompa yardımıyla 0.40 mL/dk hızıyla besiyeri (AMEM) akışı

sağlandı. Wistar sıçanlarının kemik iliğinden standart protokollere uygun olarak izole

edilen mezenkimal kök hücreler, hücre kültürü şartlarında çoğaltıldıktan sonra

tripsinleme işlemi yapıldı. Elde edilen hücre süspansiyonu akış sistemine üç aşamada

ilave edilerek mezenkimal kök hücrelerinin her bir yüzey üzerine bağlanma oranı KKM

sistemi ile belirlendi. Frekans ölçümleri aynı koşullarda hücresiz ortamda

gerçekleştirildi. Ayrıca çalışılan yüzeylerin morfolojileri atomik kuvvet mikroskobu ile

incelendi.

Page 20: ANKARA ÜNİVERİSTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ ...acikarsiv.ankara.edu.tr/browse/24522/SukranSEKER.pdfmodifikasyonunun hücre adezyonunu arttırdığını; PLGA nanolif yüzey

5

Çizelge 1.1 Çalışmada kullanılan kristal kaplama malzemeleri ve kaplama yöntemleri

Kaplama yöntemi Kaplama malzemesi

Kendiliğinden düzenlenen

tek tabaka

11-MUA, 2-Merkaptoetilamin, 2-Merkaptoetanol

Elektroeğirme PLGA

Döndürerek kaplama PLGA, PS, PCL

Damlatma Kitosan, Hyalüronik asit, Kollajen, Alginat, PLL

Çalışmanın ikinci aşamasında ise, PS polimeri ile kaplanan ve akış hücresi içerisine

yerleştirilen kristal üzerinde mezenkimal kök hücrelerinin çoğalması sağlandı. Ardından

kristal yüzeyindeki hücreler üzerine belirli dozlarda anti-mikrotübül ilaçları enjekte

edilerek, hücrelerin bu ilaçlara karşı verdikleri cevaplar KKM sistemi ile belirlendi.

Çalışmada, kolsişin, vinorelbin ve vinblastin olmak üzere üç farklı anti-mikrotübül ilacı

kullanıldı. Bu ilaçlar mikrotübüllerin farklı bölgelerine bağlanarak mikrotübüllerin

polimerizasyonunu inhibe eden maddelerdir (Jordan ve Wilson 2004). Bu çalışmada,

her bir ilacın IC50 değerini hesaplamak amacıyla toksisite testi yapıldı. Bu amaçla,

ilaçların farklı konsantrasyonlarında mezenkimal kök hücrelerinin canlılığını belirlemek

için MTT yöntemi kullanıldı. Aynı zamanda ilaçların farklı konsantrasyonlarının hücre

morfolojilerinde meydana getirdiği değişimler faz kontrast mikroskobu kullanılarak

incelendi.

Bu tez çalışmasının konusu olan, mezenkimal kök hücrelerinin farklı substrat yüzeyler

üzerine adezyonunun ve anti-mikrotübül ilaçlarıyla etkileşiminin, kuartz kristal

mikrobalans sistemi ile eş-zamanlı belirlenmesi bugüne kadar gösterilmiş değildir.

Page 21: ANKARA ÜNİVERİSTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ ...acikarsiv.ankara.edu.tr/browse/24522/SukranSEKER.pdfmodifikasyonunun hücre adezyonunu arttırdığını; PLGA nanolif yüzey

6

2. KURAMSAL TEMELLER

2.1 Piezoelektrik Özellik

Piezoelektrik etki ilk kez 1880 yılında Paul Jacques Curie ve Pierre Curie kardeşlerin,

bazı kristaller üzerinde (kuartz, turmalin, topaz, Rouchelle tuzu vd.) yaptıkları

çalışmalar sonucunda bilimsel olarak kanıtlanmıştır. Piezoelektrik özellik, bazı

kristallerin yüzeylerine mekanik bir kuvvet uygulandığında, kristalin yüzeyleri arasında

bir elektriksel potansiyel farkının oluşması (direkt piezoelektrik etki) şeklinde

tanımlanmıştır. Piezoelektrik etkinin keşfinden bir yıl sonra, Lippmann direkt etki

gösteren kristallerin, ters etki göstermesi gerektiğini öne sürmüş (Lippmann 1881) ve

ters piezoelektrik etki Curie kardeşler tarafından aynı yıl deneysel olarak ispatlanmıştır.

Yunancada ‘bastırmak’ anlamına gelen ‘piezein’ ön ekinden türetilen piezoelektrik

kavramı özetle, üzerine mekanik bir basınç uygulanan bazı kristal ve seramik

malzemelerde bir elektriksel gerilimin oluşması olarak tanımlanmaktadır. Kristalin

yapısında meydana gelen bu şekil değişikliği kalıcı değildir. Kristal uygulanan gerilim

boyunca, orjinal şekli etrafında titreşmektedir. Piezoelektrik özellik; kuarz (SiO2),

turmalin, lityum sülfat, kadminyum sülfit, çinko oksit (ZnO), rochelle tuzu

(NaKC4H4O6-4H2O), baryum titanat (BaTiO3), kurşun zirkonat titanat (PZT) gibi tek

kristal polar eksenine sahip maddelerde görülmektedir.

Şekil 2.1’de piezolektrik etkiyi açıklayan bir moleküler model verilmiştir. Malzeme

üzerine herhangi bir kuvvet uygulanmadığında iç yapıdaki pozitif ve negatif yükler

birbirini dengeleyecek şekilde yerleşmiştir. Bu nedenle negatif ve pozitif yüklerin dış

etkileri karşılıklı olarak etkisiz hale gelmektedir. Sonuç olarak, malzeme elektriksel

olarak nötr özellik göstermektedir. Malzeme üzerine belirli miktarda kuvvet

uygulandığında malzemenin iç yapısı deforme olarak pozitif ve negatif yükler

birbirinden ayrılır ve malzemenin iç yapısında bir dipol meydana gelir. Bir başka

Page 22: ANKARA ÜNİVERİSTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ ...acikarsiv.ankara.edu.tr/browse/24522/SukranSEKER.pdfmodifikasyonunun hücre adezyonunu arttırdığını; PLGA nanolif yüzey

7

deyişle malzeme polarize olur. Bu polarizasyon bir elektrik alanın oluşmasına neden

olur.

Şekil 2.1 Piezoelektrik etkiyi açıklayan basit moleküler model: a. Doğal molekül, b. Kuvvet uygulanan molekül, c. Malzeme yüzeyi üzerindeki polarizasyon etkisi

Şekil 2.2’de piezoelektrik malzeme üzerine belirli şiddette uygulanan kuvvet sonucu

elektrik yükünün oluşumu görülmektedir. Elektrot olarak kullanılan iki metal plaka, zıt

yüklerin bulunduğu yüzey üzerine yerleştirilmiştir. Uygulanan kuvvetin etkisiyle

elektrotlar arasında oluşan gerilim farkını belirlemek amacıyla potansiyometre

kullanılmaktadır. Şekilde görüldüğü gibi, piezoelektrik materyal üzerine uygulanan

kuvvet, malzemenin iç yapısında bir polarizasyon oluşmasına neden olmaktadır. Bu

polarizasyon kondüktörde bulunan serbest yüklerin akışına sebep olan bir elektrik alan

meydana getirmektedir. Malzeme üzerindeki kuvvetin kaldırılması, polarizasyonun sona

ermesine ve yük akışının durmasına neden olmaktadır.

Page 23: ANKARA ÜNİVERİSTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ ...acikarsiv.ankara.edu.tr/browse/24522/SukranSEKER.pdfmodifikasyonunun hücre adezyonunu arttırdığını; PLGA nanolif yüzey

8

Şekil 2.2 Piezolektrik etki ile oluşan elektrik akımı

2.2 Kuartz Kristaller

Piezoelektrik özelliğe sahip kuartz kristali SiO2 monokristalidir. Herbir birim hücresi üç

adet SiO2 molekülünden oluşan kuartz kristali, çoğu kimyasal çözücülerden

etkilenmediği gibi, kristal yapısını çok yüksek sıcaklıklara kadar koruyabilmektedir.

Kuartz kristalin doğada α-kuartz ve β-kuartz olmak üzere iki farklı formu

bulunmaktadır. 573oC inversiyon sıcaklığında α-kuartz, β-kuartza tersinir olarak

dönüşmektedir (Faccio vd. 1995). Kristalin α- formu, 573oC sıcaklığına kadar

piezoelektrik özelliğini kaybetmeden kararlı olabilmektedir. Piezoelektrik sensör

uygulamalarında yüksek sıcaklıklara karşı dayanıklı olması ve suda çözünmemesinden

dolayı, kristalin α-kuartz formu kullanılmaktadır.

Page 24: ANKARA ÜNİVERİSTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ ...acikarsiv.ankara.edu.tr/browse/24522/SukranSEKER.pdfmodifikasyonunun hücre adezyonunu arttırdığını; PLGA nanolif yüzey

9

Şekil 2.3 Kuartz kristaldeki SiO2 kafes yapısı (www.utas.edu.au/sciencelinks)

2.2.1 Kuartz kristal kesim tipleri

Kuartz kristalin farklı açılardan kesimi sonucunda farklı özelliklere ve titreşim

modlarına sahip kristal türleri oluşmaktadır. Kuartz kristalin optik z-eksenine 35o 10’

açıyla kesimi sonucunda AT-kesim kuartz kristali oluşmaktadır (Şekil 2.4).

Page 25: ANKARA ÜNİVERİSTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ ...acikarsiv.ankara.edu.tr/browse/24522/SukranSEKER.pdfmodifikasyonunun hücre adezyonunu arttırdığını; PLGA nanolif yüzey

10

Şekil 2.4 Kuartz kristalin optik z-eksenine 35o 10’ açıyla kesimi sonucunda elde edilen AT-kesim kuartz kristali

SiO2 kristaline enerji verildiğinde, kristal belli frekansta ve belli modlarda titreşmeye

başlamaktadır (Şekil 2.5). Kuartz kristallerin temel titreşim modları (Faccio vd. 1995);

a) Eğilme (bending),

b) Uzama (extension),

c) Yüzey kayma (face shear),

d) Kalınlık kayma (thickness shear)’dır

Page 26: ANKARA ÜNİVERİSTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ ...acikarsiv.ankara.edu.tr/browse/24522/SukranSEKER.pdfmodifikasyonunun hücre adezyonunu arttırdığını; PLGA nanolif yüzey

11

Şekil 2.5 Kuartz kristalin titreşim modları

Kristalin titreşim frekansı, boyutuna, yoğunluğuna, kesim türüne ve titreşim moduna

bağlıdır. TSM (thickness shear modunda) modundaki titreşim hareketi kristal yüzeyine

paraleldir. TSM modu, kütle değişimlerine en hassas titreşim moddur. AT ve BT kesim

kristaller TSM modunda titreşen kristal türleridir. PZ biyosensör çalışmalarında, AT

kesim kristaller kullanılmaktadır.

2.2.2 Kristal kesim tipi ile sıcaklık ilişkisi

Bir kuartz kristalin titreşim frekansı, kristalin yoğunluğuna, kesimine, titreşim moduna

ve geometrik boyutuna bağlı olduğu gibi, sıcaklık, basınç ve nem gibi çevresel koşullara

da bağlıdır. Piezoelektrik sensör çalışmalarında kristalin frekansının ortam koşullarında

kararlı olması son derece önemlidir. Sıcaklık değişimleri kuartz plakanın boyutunu ve

elastiklik sabitini değiştirmektedir. Piezoelektrik uygulamalarda kullanılacak kristalin

türü, bu özellikler göz önüne alınarak seçilmektedir. Şekil 2.6’da farklı kesim tipine

sahip kristallerin, sıcaklık değişimleri sonucunda frekanslarında meydana gelen

değişimler görülmektedir.

Page 27: ANKARA ÜNİVERİSTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ ...acikarsiv.ankara.edu.tr/browse/24522/SukranSEKER.pdfmodifikasyonunun hücre adezyonunu arttırdığını; PLGA nanolif yüzey

12

Şekil 2.6 Farklı kesim tipine sahip kristallerin titreşim frekanslarının sıcaklık ile ilişkisi (www.txc.com.tw/en/d_support/01.html)

Kristalin titreşim frekansının sıcaklıkla önemli ölçüde değiştiği H, BT, GT veya CT

kesim kristaller, sıcaklık sensörleri gibi uygulamalarda tercih edilmektedir.

Piezoelektrik sensör uygulamalarında, kuartz kristallerin mevcut kesim tipleri içinde,

sıcaklık değişimlerinden en az etkilenen, oda sıcaklığında en kararlı kristal tipi olan AT-

kesim kuartz kristalleri tercih edilmektedir. Şekil 2.7’de AT-kesim kristallerin titreşim

frekanslarının sıcaklık değişimleri ile ilişkisi görülmektedir.

Page 28: ANKARA ÜNİVERİSTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ ...acikarsiv.ankara.edu.tr/browse/24522/SukranSEKER.pdfmodifikasyonunun hücre adezyonunu arttırdığını; PLGA nanolif yüzey

13

Şekil 2.7 AT-kesim kristallerin titreşim frekansının sıcaklıkla değişimi (www.hfc.net.cn/en/Terminology.asp)

2.3 Akustik Dalga Cihazları

Genel olarak tüm akustik dalga (acoustic wave) cihazlarında ve sensörlerinde akustik

dalga üretmek için piezoelektrik malzemeler kullanılmaktadır. Akustik dalga sensörleri

ve cihazlarında kullanılan piezoelektrik malzemeler, kuartz (SiO2), lityum tantalat

(LiTaO3) ve lityum niyobat (LiNbO3)’tır.

Mekanik titreşimin modunu belirleyen kesim açısına bağlı olarak, farklı rezonatör

türleri bulunmaktadır (Janshoff vd. 2000). Örneğin TSM (thickness shear mode), FPW

(flexure plate wave), SAW (surface acoustic wave), LW (Love wave), ve SH-APW

(shear horizontal acoustic plate wave), sensör sistemlerinde en sık kullanılan rezonatör

türleridir (Şekil 2.8). TSM modundaki kristalin elektrotları arasına belirli büyüklükte bir

voltaj uygulandığında kristalde bir kayma (shear) deformasyonu meydana gelmektedir.

Page 29: ANKARA ÜNİVERİSTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ ...acikarsiv.ankara.edu.tr/browse/24522/SukranSEKER.pdfmodifikasyonunun hücre adezyonunu arttırdığını; PLGA nanolif yüzey

14

KKM sisteminde TSM modunda titrşen AT-kesim kuartz kristaller kullanılmaktadır ve

bu moddaki titreşim hareketi kuartz kristalin yüzeyine paraleldir.

TSM FPW SAW SH-APW

Şekil 2.8 Akustik dalga sistemleri (Akustik rezonatörler) ve dalga yayılımları

Genel olarak piezoelektrik cihazlar hacim akustik dalga (bulk acoustic wave, BAW) ve

yüzey akustik dalga (surface acoustic wave, SAW) olmak üzere iki sınıfa ayrılmaktadır

(Bunde vd. 1998).

2.3.1 Hacim akustik dalga sensörleri

Hacim akustik dalga sensörler, kalınlık kayma moduna sahip rezonatörlerdir. Bu

sebeple TSM olarak adlandırıldıkları gibi, kütle hassasiyetlerinden dolayı kuartz kristal

mikrobalans olarak da adlandırılmaktadırlar. TSM rezonatörlerinde 5-30 MHz

arasındaki frekans değerlerinde titreşen kristaller kullanılmaktadır. Üretimi ve kullanımı

zor olan daha ince TSM sistemleri ile yüksek frekanslarda çalışabilmek mümkündür.

Page 30: ANKARA ÜNİVERİSTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ ...acikarsiv.ankara.edu.tr/browse/24522/SukranSEKER.pdfmodifikasyonunun hücre adezyonunu arttırdığını; PLGA nanolif yüzey

15

2.3.2 Yüzey akustik dalga sensörleri

Yüzey akustik dalga sistemleri akustik sensörlerin tamamen farklı bir sınıfıdır. Sistemde

elektrotlar kristalin aynı yüzeyi üzerinde bulunmaktadır. Yüzey akustik dalga

sensörlerinde 25-500 MHz frekans değerlerinde titreşen kristaller kullanılmaktadır. Bu

sistemlerin sıvı ile temaslarında yüzey dalgalarında aşırı derecede bir azalma meydana

gelir. Bu sebeple biyosensör uygulamalarında biyolojik çözeltiler yüzey akustik dalga

sistemleri için problemler oluşturduğundan, kuartz kristal mikrobalans sistemi

biyosensör uygulamalarında daha sık kullanılmaktadır.

2.4 Kuartz Kristal Mikrobalans

Kuartz kristal rezonatörler akustik-dalga’ya dayalı sensörler içinde en sık kullanılan

sistemlerdir. Sistemde kuartz kristal iki metal elektrot arasına yerleştirilmiştir (Şekil

2.9). Elektrotlar, kuartz kristalin her iki yüzeyine metal buharının biriktirilmesiyle

hazırlanmaktadır. Kristalin frekans çalışma aralığı yüzeye biriktirilen metal miktarıyla

ayarlanmaktadır. Piezoelektrik sensör uygulamalarında kullanılan kristaller, 10-16 mm

boyutlarında, yaklaşık 0.15 mm kalınlığında disk, kare veya dikdörtgen şeklindedir.

Elektrot olarak kullanılan metaller genel olarak altın, gümüş, platin, aluminyum ve

nikeldir. Altın elektrotlar inert olmaları nedeniyle birçok uygulamada tercih

edilmektedir. Sensör çalışmalarında rezonans frekansları 5, 8, 9 ya da 10 MHz olan

kuartz kristaller tercih edilmektedir.

Şekil 2.9 Kuartz kristali

Page 31: ANKARA ÜNİVERİSTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ ...acikarsiv.ankara.edu.tr/browse/24522/SukranSEKER.pdfmodifikasyonunun hücre adezyonunu arttırdığını; PLGA nanolif yüzey

16

Elektrotlar arasına belirli voltta akım uygulandığında kristal belirli frekansta

titreşmektedir. Bu titreşimden kaynaklanan kayma elektrotlara paralel yöndedir (Şekil

2.10).

Şekil 2.10 Piezoelektrik kuartz kristalin titreşimi sırasında oluşan kayma

2.4.1 Sauerbrey ve Kanazawa eşitliği

Kuartz kristalin yüzeyinde meydana gelen kütle değişimi, kristalin titreşim frekansının

azalmasına neden olur. Kuartz kristalin titreşim frekansı ile, kristal yüzeyinde biriken

maddenin miktarı arasındaki ilişki ilk defa Sauerbrey (Sauerbrey 1959) tarafından

tanımlanmıştır.

∆f = -2.26 x 106 x f02 x (AM∆ )

Sauerbrey eşitliğinde;

∆F, frekans farkı, Hz

∆M, kristal yüzeyine kaplanan ve kristal yüzeyinde adsorblanan kütle, g

A, kristal yüzey alanı, cm2

F0, kristalin temel titreşim frekansı, MHz’dir.

Page 32: ANKARA ÜNİVERİSTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ ...acikarsiv.ankara.edu.tr/browse/24522/SukranSEKER.pdfmodifikasyonunun hücre adezyonunu arttırdığını; PLGA nanolif yüzey

17

Verilen formülden, kuartz kristalin frekansındaki 1 Hz’lik bir değişim ile yüzeyindeki

kütle miktarı arasındaki ilişkinin nanogramlar mertebesinde olduğu bulunabilmektedir.

Sauerbrey eşitliği gaz fazındaki uygulamalar ve kristal yüzeyi üzerindeki sert ve ince

olan kaplamalar için geçerlidir.

Sıvı fazda ise, kütle ve frekans arasındaki bağıntı 1985 yılında Kanazawa ve Gordon

tarafından rapor edilmiştir (Kanazawa ve Gordon 1985). Bu eşitliğe göre, sıvı

ortamlarda kuartz kristalin titreşim frekansı, kullanılan çözeltinin viskozitesine ve

yoğunluğuna bağlıdır.

∆f = -f03/2 x (ρ1η1/πµqρq)1/2

Kanazawa ve Gordon eşitliğinde;

∆F, frekans farkı, Hz

F0, kristalin temel titreşim frekansı, MHz

µq, kristalin kayma (shear) modülü (µq = 2.947x1011 g/cm.s2)

ρq, kristalin yoğunluğu (ρq = 2.648 g/cm3)

ρ1, çözeltinin yoğunluğu, g/cm3

η1, çözeltinin vizkozitesi, g/cm.s’dir.

2.4.2 KKM biyosensör uygulamaları

Piezoelektrik özelliğin sensör teknolojisinde kulanımı gaz fazı ölçümleriyle başlamıştır.

Piezoelektrik kuartz kristaller kullanılarak geliştirilen biyosensörler ilk kez 1964 yılında

W. H. King tarafından, gaz fazındaki kimyasal örneklerin analizinde kullanılmıştır.

Page 33: ANKARA ÜNİVERİSTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ ...acikarsiv.ankara.edu.tr/browse/24522/SukranSEKER.pdfmodifikasyonunun hücre adezyonunu arttırdığını; PLGA nanolif yüzey

18

(O’Sullivan ve Guilbault 1999). Sonraki yıllarda ise, piezoelektrik sensörler, analitik

elektrokimya alanında uygulama alanı bulmuştur (Ward 1995).

Bu uygulamalardan sonra antikor-antijen etkileşimine dayanan piezoelektrik biyosensör

uygulamaları hızla artmıştır. Piezoelektrik immunsensörler genel olarak, analizi

yapılacak antijene spesifik olan antikorlar uygun bir immobilizasyon yöntemi ile kristal

yüzeyi üzerine immobilize edilerek hazırlanmaktadır. Hazırlanan kristal, immobilize

edilen antikora spesifik antijenin bulunduğu çözelti ile muamele edildiğinde, kristal

yüzeyinde antikor-antijen etkileşimi meydana gelmekte ve bu spesifik etkileşim,

kristalin frekansında belli bir azalmaya sebep olmaktadır. Yapılan bir çalışmada,

kendiliğinden düzenlenen tek tabaka tekniği ve polietilenimin (PEI) polimeri

kullanılarak hazırlanan PZ kristal üzerine, insan α-fetoproteinine (AFP) özgü antikorlar,

gluteraldehit ile çapraz bağlama yöntemi kullanılarak immobilize edilmiştir. Çalışmada,

PEI membran üzerine immobilize edilen antikorların, alkantiyol tek tabaka tekniği

kullanılarak hazırlanan kristal üzerine immobilize edilen antikorlardan daha fazla

aktivite gösterdiği KKM sistemi ile belirlenmiştir (Chou vd. 2002).

Başka bir çalışmada ise, dank (denque) virüsünün teşhisine yönelik bir immünsensör

geliştirilmiştir (Su vd. 2003). Çalışmada, dank virüs zar proteini olan protein E ve

virüsün enfekte ettiği hücreler tarafından eksprese edilen NS-1 proteinine (non-structural

1 protein) özgü olan monoklonal antikorlar ile kaplanan KKM sistemi geliştirilmiştir.

Çalışmada üç farklı immobilizasyon yöntemi karşılaştırılmıştır. Bu yöntemler,

gluteraldehit yöntemi, protein A yöntemi ve karbodiimid (1-etil-3-(3-dimetil-amino

propil) karbodiimid, EDC) yöntemleridir. Yapılan çalışmalar sonucunda, kullanılan

immobilizasyon yöntemlerinden protein A yönteminin, diğer yöntemlere oranla daha

etkin olduğu KKM sistemi ile belirlenmiştir. Ayrıca, immün sensörün hassasiyetinin,

ELISA yöntemine oranla 100 kat daha fazla olduğu ve bu sebeple hastalığın erken

safhalarında kanda az miktarda bulunan virüsün KKM sistemi ile kolaylıkla

belirlenebileceği ve hastalığın daha fazla yayılmadan erken dönemde teşhisinin mümkün

olabileceği belirtilmiştir.

Page 34: ANKARA ÜNİVERİSTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ ...acikarsiv.ankara.edu.tr/browse/24522/SukranSEKER.pdfmodifikasyonunun hücre adezyonunu arttırdığını; PLGA nanolif yüzey

19

Piezoelektrik immünsensörlerin bir diğer uygulama alanı ise mikroorganizmaların

belirlenmesine yönelik çalışmalardır. Bu uygulamalardan birinde, Salmonella

typhimurium mikroorganizmasının belirlenmesi amaçlanmıştır (Babacan vd. 2000).

Kristal yüzeyinin kaplanması için iki farklı yöntem kullanılmıştır. Bu yöntemlerden ilki,

polietilenimin ile kaplanan kristalin gluteraldehit ile modifiye edilerek, yüzeyde serbest

aldehit gruplarının oluşturulduğu, PEI-GA yöntemidir. Diğer yöntemde ise, hücre duvarı

proteini olan protein A kaplama materyali olarak kullanılmıştır. Protein A’nın, IgG

molekülünün Fc bölgesi ile etkileşmesini sağlayan bağlanma bölgeleri bulunmaktadır.

Çalışmada, altın elektrotlu piezoelektrik kuartz kristallerin yüzeyine anti-Salmonella

antikorları immobilize edilmiştir. Sonuç olarak, protein A yöntemi ile kaplanan sensör

sisteminin, PEI-GA yöntemi ile kaplanan sistemden daha etkin ve hassas olduğu

belirlenmiştir. Vaughan vd. (2001) tarafından yapılan bir çalışmada ise, Listeria

monocytogenes mikroorganizması; tiyosiyalikasit ile kaplanmış altın elektrodlu kuartz

kristal kullanılarak belirlenmiştir.

Piezoelektrik sensörlerin bir diğer uygulama alanı DNA sensörleridir. Piezoelektrik DNA

sensörlerinde analiz edilecek örneğin DNA dizisine spesifik olan tek zincirli

oligonükleotit probları kristal yüzeyi üzerine immobilize edilmektedir. Hazırlanan kristal,

hedef diziyi bulunduran çözelti ile muamele edildiğinde kristal yüzeyinde meydana gelen

hibridizasyon reaksiyonu, frekansta belli bir azalmaya neden olmaktadır. Kristalin

frekansında meydana gelen bu değişimden yararlanarak klinik örneklerin analizi

mümkün olmaktadır. Zhou vd. (2002) tarafından gerçekleştirilen bir çalışmada, KKM

sistemi ile hepatit B virüsünün (HBV) belirlenmesi amaçlanmıştır. Çalışmada, HBV

nükleik asit probları, altın elektrotlu piezoelektrik kuartz kristaller üzerine immobilize

edilmiştir. Kuartz kristaller, polietilenimin-gluteraldehit yöntemi ve fiziksel adsorpsiyon

yöntemleri kullanılarak hazırlanmıştır. Çalışmanın sonucunda, HBV nükleik asit

problarının immobilizasyonunda PEI-GA yönteminin, fiziksel adsorpsiyon yöntemine

göre daha etkili olduğu KKM sistemi ile belirlenmiştir.

Mannelli vd. (2003) tarafından yapılan bir çalışmada, genetiği değiştirilmiş

organizmaların belirlenmesi amaçlanmıştır. Çalışmada, sensör yüzeyine immobilize

Page 35: ANKARA ÜNİVERİSTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ ...acikarsiv.ankara.edu.tr/browse/24522/SukranSEKER.pdfmodifikasyonunun hücre adezyonunu arttırdığını; PLGA nanolif yüzey

20

edilen tek zincirli DNA probları, organizmanın genomuna transfer edilen genin

sentezinin düzenlendiği, Nos terminatör ve 35S promotör gen bölgelerine spesifik olan

dizilerdir. pBI121 plazmidinden izole edilen bu bölge, PCR ile çoğaltıldıktan sonra, tek

zincir haline getirilip, piezoelektrik kuartz kristal DNA sensörüyle analiz edilmiştir.

Başka bir piezoelektrik DNA sensörü çalışmasında, Akdeniz popülasyonunda β-

Thalessemia hastalığına neden olan, β-globin geninin, kodon 39 bölgesinde, C-T

değişimi sonucu oluşan nokta mutasyonunun belirlenmesi çalışılmıştır. (Minunni vd.

2003). Çalışmada, 39. kodon çevresindeki bölgeye spesifik 25 merli, 5’ ucu

biyotinlenmiş oligonükleotit problar, streptavidin ile kaplanmış altın elektrotlu 10 MHz

AT-kesim kuartz kristalin yüzeyine immobilize edilmiştir. Bu problar, mutasyonlu 39.

kodon bölgesine komplementer (Prob 2) olan ve normal 39. kodon bölgesine

komplementer (prob 1) olan oligonükleotitlerdir. Bu çalışma için, Thalassemia

hastalarının (%100 TAG), taşıyıcıların (%50 CAG + %50 TAG) ve normal bireylerin

kanlarından izole edilen DNA’nın 39. kodon ve çevresindeki gen bölgesi PCR tekniği

kullanılarak çoğaltılmıştır. Probların immobilize edildiği kristaller, çoğaltılan dizileri

içeren çözeltiler ile muamele edilerek, hibridizasyon reaksiyonu KKM sistemi ile

belirlenmiştir.

Bir başka KKM DNA biyosensörü çalışmasında, farklı immobilizasyon yöntemi

kullanılarak immobilize edilen prob oligonükleotitlerinin hibridizasyon reaksiyonu KKM

sistemi ile incelenmiştir (Tombelli vd. 2002). Çalışmanın sonucunda, karboksillenmiş

dekstran tabakasına bağlı streptavidin üzerine, biyotinlenmiş probların immobilizasyonu

ile oluşturulmuş DNA sensörü ile, hibridizasyon reaksiyonunun daha hassas bir şekilde

belirlendiği belirtilmiştir.

KKM enzim sensörünün temel prensibi, enzimatik reaksiyon sonucu oluşan ürünün

kristal yüzeyi üzerine bağlanması ile, kristalin frekansında meydana gelen değişimin

belirlenmesidir. Bu amaçla enzimatik ürünün kristal yüzeyi üzerine etkin bir şekilde

bağlanabileceği farklı kaplama malzemeleri geliştirilmiştir. Bu kaplama malzemelerinden

biri karbon allotrobu olan fulleren C60’dır (Chuang ve Shih 2001). Fulleren C60, yapı

Page 36: ANKARA ÜNİVERİSTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ ...acikarsiv.ankara.edu.tr/browse/24522/SukranSEKER.pdfmodifikasyonunun hücre adezyonunu arttırdığını; PLGA nanolif yüzey

21

gereği 60 π-elektronu içermektedir. Bu özellik fullerene, amino grubu gibi elektronegatif

gruplara bağlanabilme yeteneği kazandırmıştır. Çalışmada C60 ile kaplı piezoelektrik

kristal, glikozun glikoz oksidaz tarafından yükseltgenmesi sonucu oluşan glikonik asidi

belirlemek amacıyla kullanılmıştır.

Bir başka glikoz sensörü çalışmasında ise, piezoelektrik kristaller fullerenin kriptand

türevi olan fulleren-kriptand 22 maddesi ile kaplanmıştır (Chang ve Shih 2000). Kriptand

22 yapay makrosiklik bir eterdir. Kriptand 22 ve 18-taç-eter gibi makrosiklik polieterler

su ve organik çözücülerde kolaylıkla çözünürler, fakat fulleren ile verdikleri türevler

hidrofobik özellikte maddeler olduklarından suda çözünmezler. Bu özelliklerinden dolayı

kaplama materyali olarak tercih edilmektedirler. Çalışmada, glikoz içeren çözelti içine

belli miktarda immobilize glikoz oksidaz enzimi ilave edilerek reaksiyon başlatılmış ve

reaksiyon sonucu oluşan glikonik asit miktarı frekans değişimi ile belirlenmiştir. Sonuç

olarak, glikonik asidin fulleren-kriptand 22 kaplı piezoelektrik sensör üzerine

adsorpsiyonu sonucunda kristalin frekansında meydana gelen azalmanın kristal

yüzeyinde biriken glikonik asit miktarıyla orantılı olduğu belirlenmiştir.

Aynı kaplama materyali kullanılarak yapılan bir başka çalışmada ise, immobilize ve

çözünmüş üreaza dayalı olarak geliştirilen KKM üre sensörü kullanılarak, üreaz

enziminin üre ile enzimatik reaksiyonu sonucunda oluşan amonyum iyonunun

belirlenmesi hedeflenmiştir (Wei ve Shih 2000). Kanda bulunan bazı metal iyonları,

glikoz, askorbik asit gibi maddelerin frekans değişimine etkileri incelenerek, sensörün

spesifikliği araştırılmıştır. Ayrıca, kaplama miktarı, üreaz aktivitesi, üre konsantrasyonu,

çözücü ve pH parametrelerinin frekans değişimine etkileri incelenmiştir.

KKM enzim sensörü çalışmalarında kristal yüzeyinin kaplanması için diğer bir yaklaşım

ise, elektroeğirme tekniğidir. Elektroeğirme tekniği, yüksek gözenekliliğe sahip ince

kaplamalar elde etmek amacıyla sensör çalışmalarında yaygın olarak kullanılan bir

yöntemdir (Ding vd. 2004). KKM enzim sensörü çalışmasında (Şeker vd. 2010), kuartz

kristaller, C60 molekülünün PLGA polimeri içerisine belirli oranda karıştırılmasıyla

oluşturulan, PLGA-C60 nanolif membran ile kaplanmıştır. Elektroeğirme nanolifler

Page 37: ANKARA ÜNİVERİSTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ ...acikarsiv.ankara.edu.tr/browse/24522/SukranSEKER.pdfmodifikasyonunun hücre adezyonunu arttırdığını; PLGA nanolif yüzey

22

normal film yapısından 10-1000 kat daha fazla yüzey alanına sahiptir. Bu özellik sensör

yüzeyine enzimatik ürünün adsorpsiyon oranının artmasına ve cevap zamanının

kısalmasına neden olmaktadır. Aynı zamanda çalışmada kullanılan bu kaplama materyali

ile; çözelti içerisinde kümeleşme eğiliminde olan C60 molekülünün nanolif içerisinde

daha homojen bir şekilde dağılması sağlanmıştır (Şekil 2.11).

Şekil 2.11 KKM enzim sensörü ile glikonik asidin eş zamanlı belirlenmesi

(Şeker vd. 2010)

Son yıllarda ise sınırlı sayıda olmakla birlikte hücre sensörü çalışmalarına

rastlanmaktadır (Marx vd. 2007). Hücre sensörlerinde genel hedef, hücrelerin bağlanma

ve çoğalma davranışlarını, hücre-malzeme ya da hücre-ilaç etkileşimlerini eş zamanlı

olarak belirlemektir. KKM hücre sensörleri kullanılarak, hücrelerin farklı malzemeler

karşısındaki davranışlarının incelenmesi; büyüme faktörleri, ilaç molekülleri ve

biyolojik öneme sahip olan kimyasalların hücreler üzerindeki etkilerinin eş zamanlı

olarak belirlenmesi mümkün olmaktadır (Marx vd. 2009).

KKM hücre biyosensörü (Şekil 2.12), deney koşullarının zorluklarından dolayı diğer

biyosensör uygulamalarına kıyasla daha az çalışılan bir alandır (Marx 2003). Hücre

Page 38: ANKARA ÜNİVERİSTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ ...acikarsiv.ankara.edu.tr/browse/24522/SukranSEKER.pdfmodifikasyonunun hücre adezyonunu arttırdığını; PLGA nanolif yüzey

23

sensörü çalışmalarında en temel koşul steril hücre kültürü şartlarının sağlanmasıdır (%5

CO2, %95 nem ve 37oC).

KKM hücre sensörleriyle gerçekleştirilmiş sınırlı sayıdaki çalışmalarda kullanılan hücre

kaynaklarından bazıları, MCF-7 hücreleri (Jia vd. 2008), Neuro-2A hücreleri (Khraiche

vd. 2005), osteoblastlar (Redepenning vd. 1993), MDCK I ve II hücreleri (Wegener vd.

2000), fibroblast hücreleri (Lord vd. 2006), MC3T3-E1 hücreleri (Modin vd. 2006),

CHO hücreleri (Fredriksson vd. 1998), VERO hücreleri (Gryte vd. 1993) ve endotel

hücrelerdir (Marx vd. 2003).

Şekil 2.12 KKM hücre biyosensörünün şematik olarak gösterimi

Son on yılda KKM hücre sensörü kullanılarak, kuartz kristal yüzeyi üzerine farklı hücre

türlerinin bağlanma ve çoğalma davranışları eş zamanlı olarak belirlenmiştir. Örneğin

Khraiche vd. (2005) tarafından gerçekleştirilen bir çalışmada neuro-blastoma (Neuro-

2A) hücrelerinin; kaplanmamış ve PLL ile kaplanmış kristal yüzeyleri üzerindeki

bağlanma oranları karşılaştırılmış, PLL kaplı yüzey üzerinde Neuro-2A hücrelerinin

bağlanma oranının daha fazla olduğu belirlenmiştir. Başka bir çalışmada, sıçan epitel

hücreleri (WB F344) ve akciğer melanoma hücrelerinin (B16F10), vitronektin ve

laminin gibi hücre dışı matriks proteinleri ile kaplı kristal yüzeyleri üzerine bağlanma

oranları karşılaşırılmıştır (Fohlerová vd. 2007). McCoy insan fibroblast hücrelerinin

kullanıldığı bir çalışmada, hücrelerin poli(metil metakrilat) (PMMA) ve farklı PMMA

Page 39: ANKARA ÜNİVERİSTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ ...acikarsiv.ankara.edu.tr/browse/24522/SukranSEKER.pdfmodifikasyonunun hücre adezyonunu arttırdığını; PLGA nanolif yüzey

24

türevleri üzerine adezyonu KKM sistemiyle incelenmiş ve sonuçlar hücre sayım

yöntemleriyle karşılaştırıldığında, her iki teknik kullanılarak elde edilen verilerin

birbiriyle paralellik gösterdiği belirlenmiştir (Guillou-Buffello 2005).

Hücre-ilaç etkileşiminin KKM sistemi ile incelendiği bir çalışmada ise, hücre kaynağı

olarak endotel hücreleri kullanılmıştır. Çalışmada, nokodazol (nocodazole) adı verilen

ve hücrelerdeki mikrotübüllerin depolimerizasyonuna neden olan bir ilacın farklı

dozlarında; hücrelerin kristal yüzeyi üzerine bağlanmaları KKM sistemi ile eş zamanlı

olarak incelenmiştir (Marx vd. 2001). Çalışmada KKM kristali üzerine hücreler kültüre

edildikten sonra 2.0 µM nokodazol ilave edilmiştir. Bu doz mikrotübüllerin

polimerizasyonunu etkilemiş ve bu değişim KKM tarafından belirlenmiştir. Eklenen

nokodazol, kristalin frekansında 360 Hz’lik bir düşüşe sebep olmuştur. Kontrol

çalışması olarak nokodazol içermeyen besiyeri ilave edilmiş ve yaklaşık 20 Hz’lik bir

azalma gözlenmiştir. Benzer bir çalışmada ise, iki farklı hücre tipinin (endotel hücre ve

MDA-MB-231 hücreleri) farklı dozlardaki anti-mikrotübül ilaçları (nokodazol ve

taksol) ile etkileşimi incelenmiştir (Marx vd. 2007).

Aynı grup tarafından gerçekleştirilen bir başka çalışmada ise, iki farklı hücre tipinin

(MCF-7 ve MD-MBA-231) paklitaksel (paclitaxel) ve dosetaksel (docetaxel) ilaçlarına

verdikleri cevaplar incelenmiştir (Braunhut vd. 2005). İlk 6 saat mikrotübüllere

bağlanma sonucunda stres fiberlerinin oluşmasıyla, hücrelerin yüzeye daha fazla

tutunması sonucunda frekansta azalma; 6-24 saat süresinde ise, apoptozis dolayısıyla

hücrelerin yüzeyden ayrılması sonucunda frekansta artış meydana geldiği belirlenmiştir.

Ayrıca KKM ölçümleri, hücreler üzerine dosetakselin paklitakselden daha etkili

olduğunu ve MCF-7 hücrelerinin MD-MBA-231 hücrelerine kıyasla taksan sınıfı

ilaçlara daha dirençli olduğunu göstermiştir.

Page 40: ANKARA ÜNİVERİSTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ ...acikarsiv.ankara.edu.tr/browse/24522/SukranSEKER.pdfmodifikasyonunun hücre adezyonunu arttırdığını; PLGA nanolif yüzey

25

2.5 Yüzey Kaplama Yöntemleri

Piezoelektrik sensör uygulamalarında, kuartz kristallerin yüzeyi seçici bir kaplama

malzemesi ile kaplanmaktadır. KKM sensörleri ile ilgili yapılan bir çok çalışmada, analiz

edilecek maddeye spesifik bir kristal yüzeyi oluşturmak için kristal yüzeyi çeşitli yüzey

modifikasyon teknikleri kullanılarak kaplanmaktadır. Kaplama işleminden önce,

kullanılan yöntemden bağımsız olarak, kristal üzerine immobilizasyonu engelleyebilecek

maddeleri uzaklaştırmak için, elektrot yüzeylerinin uygun yöntemlerle temizlenmesi

gerekmektedir. Temizleme işlem için en sık kullanılan çözelti, %30 H2O2 ve %70 H2SO4

içeren piranha çözeltisidir. Genel olarak yüzey kaplama yöntemleri; a) kimyasal

modifikasyon (kendiliğinden düzenlenen tek tabaka yöntemi) ve b) polimer kaplama

yöntemi olmak üzere ikiye ayrılmaktadır.

2.5.1 Kendiliğinden düzenlenen tek tabaka yöntemi

Kristal yüzeyinin kimyasal modifikasyonunda, kendiliğinden düzenlenen tek tabaka

(self-assembled monolayer, SAM) tekniği yaygın olarak kullanılan bir kaplama

yöntemidir. Kendiliğinden düzenlenen tek tabakalar, katı bir yüzey (altın, cam veya

silisyum oksit) ile moleküler fonksiyonel gruplar arasında meydana gelen bir bağlanma

sonucunda, substrat yüzeyi üzerinde belirli bir düzene göre adsorbe olan moleküllerin

oluşturduğu tek tabakalardır. Kendiliğinden düzenlenen tek tabakalar, altın üzerinde

alkantiyol tek tabakalar ve alkilsiloksan tek tabakalar olmak üzere ikiye ayrılmaktadır.

2.5.1.1 Alkantiyol tek tabakalar

Alkantiyol tek tabakaka yöntemi, altın yüzey üzerine uzun zincirli alkantiyollerin (RSH,

R=X(CH2)n, n=11-18) adsorpsiyonuna dayanmaktadır.

R-SH + Au(0)n R-SAu(I). Au(0)n + ½ H2

Page 41: ANKARA ÜNİVERİSTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ ...acikarsiv.ankara.edu.tr/browse/24522/SukranSEKER.pdfmodifikasyonunun hücre adezyonunu arttırdığını; PLGA nanolif yüzey

26

Altın yüzey üzerine, alkantiyoller kükürt atomları üzerinden koordine olmaktadırlar.

Farklı tiyol çözeltileri kullanımıyla yüzey üzerinde istenilen fonksiyonel gruplara sahip,

dolayısıyla istenilen fiziksel ve kimyasal özelliklere sahip tek tabakaların oluşturulması

mümkündür. Tek tabakalar oluşturulduktan sonra yüzey uygun kimyasallarla modifiye

edilerek istenilen özelliklere sahip tek tabakalar oluşturulabilmektedir. Tek tabakanın

özellikleri ayrıca, iki veya daha fazla alkantiyol çözeltisi kullanılarak farklı fonksiyonel

grupları içeren tek tabakaların oluşturulmasıyla da kontrol edilebilmektedir. Ayrıca farklı

karbon sayısına sahip olan tiyol bileşikleri kullanımıyla istenilen kalınlıkta yüzeyler elde

edilebilmektedir (Love vd. 2005).

Kuartz kristalin altın elektrot yüzeyi üzerinde düzgün ve sıralı bir tek tabaka elde etmek

amacıyla, kuartz kristal düşük konsantrasyondaki (genellikle 1-2 mM) tiyol çözeltisi

içerisinde oda sıcaklığında belirli bir süre bekletilmektedir (Şekil 2.13). Çözücü olarak

en çok etanol kullanılmaktadır. Yıkama işleminin ardından istenilen fonksiyonel grubu

bulunduran altın yüzeyler (-COOH, -NH2, -OH…) havada kurutularak hazır hale

getirilmektedir.

Şekil 2.13 Alkantiyol tek tabaka tekniği ile kristal yüzeyinin modifikasyonu

Yüzeyin türü ve temizliği, kullanılan tiyol bileşiğinin yapısı ve saflığı, kullanılan çözücü,

bekletme süresi, sıcaklık ve konsantrasyon gibi deneysel faktörlerin bir çoğu alkantiyol

tek tabaka yapısını ve onun oluşum kinetiğini etkilemektedir. Alkantiyol tek tabakalar,

altın ve kükürt atomları arasında oluşan güçlü kovalent bağ sebebiyle birkaç ay etanol

Page 42: ANKARA ÜNİVERİSTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ ...acikarsiv.ankara.edu.tr/browse/24522/SukranSEKER.pdfmodifikasyonunun hücre adezyonunu arttırdığını; PLGA nanolif yüzey

27

veya su içerisinde ya da havada kararlı olarak kalmaktadır. 70oC’dan daha yüksek

sıcaklıklarda altın yüzey üzerindeki tiyoller desorbe olurken, oksijen varlığında UV ışığa

maruz bırakıldıklarında oksidize olurlar.

2.5.1.2 Alkilsiloksan tek tabakalar

Alkilsiloksan tek tabakalar, alkiltriklorosilan (veya alkiltrietoksisilan) ile hidroksillenmiş

yüzey (cam veya silisyum oksit) arasındaki reaksiyon sonucu oluşturulurlar. Bu tek

tabakalar üzerindeki siloksan grupları hem birbirleriyle, hem de yüzey üzerindeki

hidroksil grupları ile çarpraz bağlar yapmaktadır. Bu özelliklerinden dolayı alkantiyol tek

tabakalara oranla termal olarak daha kararlıdırlar.

Şekil 2.14 Alkilsiloksan tek tabaka

Bu tek tabakada, adsorpsiyon için itici güç silanol gruplarına (SiOH) Si-O-Si kovalent

bağıyla bağlanan polisiloksanların ‘in-sitü’ oluşumudur (Maoz ve Sagiv, 1987). Silan

türevlerinin adsorpsiyonu sırasında çözelti içerisindeki suyun miktarı alkantiyol tek

tabakanın düzeni için önemli bir faktördür. Ayrıca bu sistemlerde sıcaklık azaldıkça

reaksiyon kinetiği azalmakta ve oldukça düzensiz yapılar meydana gelmektedir.

Page 43: ANKARA ÜNİVERİSTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ ...acikarsiv.ankara.edu.tr/browse/24522/SukranSEKER.pdfmodifikasyonunun hücre adezyonunu arttırdığını; PLGA nanolif yüzey

28

2.5.2 Polimer kaplama yöntemleri

2.5.2.1 Elektroeğirme yöntemi

Elektroeğirme yönteminin prensibi, kontrollü olarak belirli büyüklükte bir elektriksel

kuvvet uygulanmasıyla, polimer çözeltilerinin başka bir noktaya, yapı ve boyut

değişimiyle transfer edilmesi temeline dayanmaktadır. Yöntemde yüksek elektrostatik

alana (DC voltaj) maruz bırakılan polimer çözeltisinin, benzer yükler ile yüklenerek

ayrışma ve incelme göstermesi sonucu, çok ince lifli yapılar oluşturulabilmektedir.

Sistem temel olarak, yüksek voltaj sağlayacak bir güç kaynağı, polimer çözeltisinin

enjeksiyonu için kullanılacak, çapı küçük olan bir kapiler tüp ya da iğne ve, metal bir

toplayıcı plakadan oluşmaktadır (Huang vd. 2003).

Şekil 2.15 Elektroeğirme yönteminin şematik olarak gösterimi (Şeker vd. 2010)

Page 44: ANKARA ÜNİVERİSTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ ...acikarsiv.ankara.edu.tr/browse/24522/SukranSEKER.pdfmodifikasyonunun hücre adezyonunu arttırdığını; PLGA nanolif yüzey

29

Özetle, polimer çözeltisi bir enjektör içerisine konmakta ve bu enjektörden belirli bir

mesafe uzaklığa toplayıcı bir plaka yerleştirilmektedir. Gerekli yüksek voltajı

sağlayacak güç kaynağının artı ucu enjektörün metal olan ucuna bağlanırken, toplayıcı

plaka ise topraklanmaktadır. Böylece enjektör ve toplayıcı plaka arasında yüksek bir

elektriksel alan elde edilmiş olmaktadır. Yüksek voltajın oluşturduğu elektriksel alan

içerisinde yüklenen polimer çözeltisi, karşı kutup olarak topraklanmış veya zıt kutup ile

yüklenmiş bir metal yüzey üzerine doğru, dönme hareketi ile incelerek nanometre

mertebelerinde lifler oluşturulmaktadır (İnanç vd. 2009).

2.5.2.2 Döndürerek kaplama yöntemi

Döndürerek kaplama yöntemi, kaplama yapılacak yüzey üzerinde homojen ve ince bir

film oluşturmak amacıyla, uygulamalarda yaygın olarak kullanılan bir yöntemdir. Bu

yöntemde, en basit şekliyle, kaplama için kullanılacak malzemenin uygun bir çözücü

içinde çözülmesi sonucu elde edilen çözelti, kaplanacak yüzey üzerine

damlatılmaktadır. Merkezkaç kuvvetinin etkisiyle çözeltinin yüzey üzerine tamamen

yayılmasını sağlamak amacıyla, belirli rpm’de dönme hareketi uygulanmaktadır.

Çözücünün buharlaşması ile istenilen incelikte kaplama elde edilebilmektedir. Bu

yöntemle, çözeltinin konsantrasyonu, dönme hızı ve dönme süresi gibi parametreler

optimize edilerek istenilen incelikte kaplamalar elde etmek mümkündür (Flack vd.

1984).

Page 45: ANKARA ÜNİVERİSTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ ...acikarsiv.ankara.edu.tr/browse/24522/SukranSEKER.pdfmodifikasyonunun hücre adezyonunu arttırdığını; PLGA nanolif yüzey

30

Şekil 2.16 Döndürerek kaplama yöntemi ile yüzey kaplama

Genel olarak olarak kaplama işlemi; hazırlanan yüzey üzerine çözelti damlatılması ile

başlayan kaplama işlemi, yüksek hızda döndürme ile çözeltinin yüzey üzerine yayılması

ve fazla çözeltinin uzaklaşması işlemi olmak üzere üç adımdan oluşmaktadır (Şekil

2.16). Merkezi hızlandırma fazla çözeltinin uzaklaştırılmasına ve kalan çözeltinin,

kaplanacak yüzeye ince film şeklinde yayılmasına neden olmaktadır. Film kalınlığı,

kullanılan çözeltinin viskozitesine, kuruma hızına, konsantrasyonuna ve yüzey

gerilimine bağlıdır. Aynı zamanda devir sayısı ve kaplama süresi film kalınlığını

etkileyen faktörlerdendir.

2.6 Dönüşümlü Voltametri (Cyclic Voltammetry, CV)

Voltametri, elektrokimyasal reaksiyonlarla ilgili kalitatif bilgilerin elde edilmesinde

kullanılan en yaygın tekniktir. Aynı zamanda, yükseltgenme ve indirgenme

reaksiyonlarının incelenmesi, yüzeydeki adsorbsiyon olaylarının araştırılması ve

kimyasal olarak modifiye edilen elektrot yüzeylerinde gerçekleşen elektron aktarım

Page 46: ANKARA ÜNİVERİSTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ ...acikarsiv.ankara.edu.tr/browse/24522/SukranSEKER.pdfmodifikasyonunun hücre adezyonunu arttırdığını; PLGA nanolif yüzey

31

mekanizmalarının aydınlatılması gibi çeşitli amaçlar için de yaygın bir şekilde

kullanılmaktadır. Dönüşümlü voltametri, potansiyel taraması süresince, çalışma

elektrodundaki akımın ölçülmesiyle elde edilir. Tarama hızı ile pik yüksekliğinin

değişimi incelendiğinde, difüzyon, adsorpsiyon ve elektron aktarımına eşlik eden

kimyasal reaksiyonlarla ilgili bilgi edinmek mümkündür.

Tiyol tek tabaka filmlerinin elektrokimyasal özelliklerinin araştırılmasında, dönüşümlü

voltametri tekniğinden faydalanılmaktadır. Alkantiyol tek tabaka modifikasyonu

öncesinde ve sonasında kaydedilen dönüşümlü voltamogramların karşılaştırılması

sonucunda, elde edilen kaplamanın özellikleri belirlenebilmektedir. Oldukça kusurlu ve

zayıf kaplanma özelliği sergileyen alkantiyol tek tabaka yapılarında, elektroaktif türler

tek tabakadaki kusurlardan oldukça kolay bir şekilde, elektrot yüzeyine yaklaşarak

elektron transferini gerçekleştirmektedir. Bu durumda elde edilen dönüşümlü

voltamogramda, elektron transferi nedeniyle pik biçimlidir. Çok düzenli, kusursuz tek

tabaka yüzeylerinde redoks türlerinin elektrot yüzeyine yaklaşarak redoks reaksiyonunu

gerçekleştirmesi mümkün değildir. Bu durumda, yüzeyde bariyer olarak davranan tek

tabaka yapısı, redoks türlerinin elektron transferini engellemektedir. Ayrıca uzun

zincirli tiyol tek tabakalarının, kısa zincirli alkantiyol tek tabakalara kıyasla daha etkili

bariyer özellik sergilediği bilinmektedir.

2.7 Atomik Kuvvet Mikroskobu (Atomic Force Microscopy, AFM)

Atomik kuvvet mikoskopi, moleküler boyutta yüzey görüntüleme amacıyla kullanılan,

yüzey topografisini, angstrom (Å) mertebesinden 100 mikrona (µ) kadar

görüntüleyebilen bir tekniktir. 1985’de Binnig, Quate ve Gerber’in yapmış olduğu

çalışmalar sırasında; yalnızca iletken ve yarıiletken yüzeyleri görüntüleyebilen STM’ye

(taramalı elektron mikroskobu) alternatif olarak geliştirilmiştir. AFM ile, seramikler,

kompozitler, camlar, biyolojik örnekler, metaller ve polimerler gibi iletken olmayan

maddeleri görüntülemek mümkündür.

Page 47: ANKARA ÜNİVERİSTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ ...acikarsiv.ankara.edu.tr/browse/24522/SukranSEKER.pdfmodifikasyonunun hücre adezyonunu arttırdığını; PLGA nanolif yüzey

32

Şekil 2.17 AFM sisteminin şematik olarak gösterimi

AFM tekniğinde, yüzeyi tarayan iğne ile yüzeyde bulunan atomlar arasında oluşan

kuvvetlerin ölçülmesi söz konusudur. Birkaç atom genişliğine kadar sivriltilmiş AFM

iğnesi, örnek üzerinde istenilen tarama hızında hareket ettirilerek iğne ve örnek

arasındaki itme ve çekme kuvvetleri piko-newton hassasiyetinde ölçülmektedir. İğne

kantilever denilen bir yaya tutturulmuştur. Kantileverın ucunda ona dik olarak duran

iğne bir yüzeye yaklaştırıldığında, yüzeye temas eder etmez kantilever bükülmeye

başlamaktadır. Kantilever bir yüzey üzerinde gezdirilirken oluşan bükülme, yüzeydeki

atom ve moleküllerin oluşturduğu tepe ve çukurları algılamaktadır

En basit şekliyle, sistemde bulunan bir lazer kaynağından gelen ışın, kantileverden

yansıyarak pozisyona duyarlı fotodetektöre gelmektedir. Bu kantileverin yükseklik

bilgisi bilgisayara gönderilip x ve y pozisyonuna karşı kaydedilmektedir. Uygun bir

bilgisayar programında değerlendirilen bu bilgilerden, üç boyutlu topografik görüntüler

elde edilmektedir (Şekil 2.17).

Page 48: ANKARA ÜNİVERİSTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ ...acikarsiv.ankara.edu.tr/browse/24522/SukranSEKER.pdfmodifikasyonunun hücre adezyonunu arttırdığını; PLGA nanolif yüzey

33

AFM analizlerinde, bir ön örnek hazırlama aşaması olmadığı için biyolojik moleküllerin

üç boyutlu yapısını bozmadan, bulundukları ortamda görüntülenmesi sağlanmaktadır.

Bu özelliği ile alternatifleri olan SEM ve TEM gibi mikroskobik tekniklere önemli bir

üstünlük sağlamıştır. SEM yöntemiyle kıyaslandığında en önemli avantajı, dehidrasyon,

sabitleme ve kaplama işlemi yapılmadan inceleme yapılabilmesidir.

AFM, uygulamaya bağlı olarak birçok modda çalıştırılabilmektedir. Temas modunda

(Contact Mode) kantilever’in ucundaki iğneyle yüzey arasında hafif bir fiziksel temas

meydana gelmektedir. Bu modda iyonik itme kuvvetleri önemli bir rol oynamaktadır.

Temas olmayan modda (Noncontact Mode) ise, atomik kuvvetlerin etkisiyle kantilever

eğilmekte ve böylece örneğe dokunmadan topografik görüntü elde edilmektedir. Bu

amaçla iğne örnekten 50-150 Angstrom uzakta tutulmaktadır. Bu uzaklıkta prob ve

örnek arasında Wan der Waals kuvvetleri etkin olmaya başlamaktadır. Bu modun en

büyük avantajı, iğnenin hasar görmemesi ve yumuşak malzemelerin daha uygun

biçimde ölçülmesidir. İğne örnek etkileşmesi bazı durumlarda örneği bozabilmektedir.

Bu sebeple birçok biyolojik örnek için temas olmayan mod daha uygun olmaktadır.

Dinamik temas modunda (Dynamic contact mode, Tapping Mode) kantilever kendi

rezonans frekansında titreşim hareketi yapmaktadır. Bu titreşim fotodetektör tarafından

ölçülmektedir. İğne örneğe yaklaştığında yüzeyle meydana gelen etkileşimden dolayı

enerji kaybederek kantileverin titreşim şiddetinin azalmasına neden olmaktadır.

Geridöngü mekanizması bu şiddeti sabit tutmak için, yüzey üzerindeki kantileverin

yüksekliğini değiştirmektedir. Meydana gelen değişimden, etkileşim miktarı

belirlenebilmektedir.

Page 49: ANKARA ÜNİVERİSTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ ...acikarsiv.ankara.edu.tr/browse/24522/SukranSEKER.pdfmodifikasyonunun hücre adezyonunu arttırdığını; PLGA nanolif yüzey

34

2.8 Hücre İskeleti ve Hücre Adezyon Molekülleri

Hücre iskeleti, hücre şeklinin korunmasında ve hücre hareketlerinin yerine

getirilmesinde görev almaktadır. Mikrotübüller, mikrofilamanlar ve ara filamanlar hücre

iskeletini oluşturan yapılardır.

Şekil 2.18 Mikrotübüllerin polimerizasyonu

Mikrotübüller mitoz bölünme, hücre-hücre iletişimi, hücre içi taşınma, hücre büyümesi

ve kontrollü hücre ölümü (apotozis) gibi birçok biyolojik prosesde görev alan silindirik

yapılardır. Mirotübüller α-tübülin ve β-tübülin heterodimerlerinin polimerizasyonu

sonucunda oluşan hücre iskeleti elemanıdır (Şekil 2.18). Hücrede gereksinim olduğunda

tübülinler bir araya gelerek yeni mikrotübüller oluşturmakta; uygun koşullarda ise

tekrar parçalanmaktadır.

Mikrofilamanlar aktin molekülünden oluşan ipliksi yapılardır. Hücrenin fonksiyonu ve

şekline göre çok sayıda aktin tipi bulunmaktadır. Bu fibröz elemanlar hücre şeklinin

korunmasında ve makromoleküllerle organellerin hücre içi transportunda rol

oynamaktadırlar.

Page 50: ANKARA ÜNİVERİSTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ ...acikarsiv.ankara.edu.tr/browse/24522/SukranSEKER.pdfmodifikasyonunun hücre adezyonunu arttırdığını; PLGA nanolif yüzey

35

Ara filamanlar mikrotübüller ve mikrofilamanlara benzer şekilde olup 8-10 nm

çapındadırlar. Ara filamanların bulundukları yere göre çeşitli görevleri vardır. Örneğin

epitel hücrelerinde başlıca görevleri mekanik sağlamlılık kazandırmak, su ve ısı kaybını

önlemektir.

2.8.1 Hücre adezyon molekülleri

Hücre adezyonu, hücrelerin özgül olarak dokulara yönlenmelerinde, birbirlerini

tanımalarında, embriyogenez, hücre büyümesi, hücre farklılaşması ve inflamasyon gibi

olguların düzenlenmesinde önemli bir rol oynamaktadır. Doku ve hücrelerin

bütünlüğünün ve fonksiyonunun korunabilmesi için hücrenin çevresindeki değişimleri

algılaması ve uygun cevaplar vermesi gerekmektedir. Hücre bunu, yüzeyinde bulunan

hücre adezyon molekülleri aracılığı ile gerçekleştirmektedir.

Hücre adezyon molekülleri, hücre yüzeylerinde bulunan glikoprotein moleküllerinden

oluşan bir gruptur. Hücrelerin, birbirlerine ya da hücre dışı matrikse bağlanmalarını

sağlayan yüzey proteinleridir. Aynı zamanda, hücreler arası sinyal iletiminin

düzenlenmesinde, hücre hareketlerinin organizasyonunda, immün ve inflamatuvar

yanıtın ortaya çıkmasında da önemli rolleri bulunmaktadır.

Adezyon molekülleri; reseptör protein tirozin fosfatazlar, Ig süperailesi, kadherinler,

integrinler, hiyalurinat reseptörleri ve selektinler olmak üzere 6 grupta toplanmaktadır

(Ergüler vd. 2002).

Hücre-matriks temas alanlarında bulunan reseptör protein tirozin fosfatazlar, hücre-

hücre etkileşiminde etkin reseptörler olarak tanımlanmaktadırlar. İmmünoglobülin

süperailesi, hücre içindeki iskelet sistemine bağlanan transmembran glikoproteinlerdir.

Kadherinler, hem adezyon hem de Ca2+ bağlayıcı bölge içerirler. Embriyonik

gelişiminde ve doku organizasyonunda önemli rolleri bulunmaktadır. İntegrinler, hem

Page 51: ANKARA ÜNİVERİSTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ ...acikarsiv.ankara.edu.tr/browse/24522/SukranSEKER.pdfmodifikasyonunun hücre adezyonunu arttırdığını; PLGA nanolif yüzey

36

hücre–hücre, hem de hücre–matriks bağlanmasında görev alan transmembran

glikoproteinlerdir. Hedef hücrelerdeki spesifik ligandlarına bağlanmaktadırlar.

Hyalurinat reseptörleri, hücre dışı matrikste bulunan bir sakkarit komponentidir. Tümör

gelişimi ve iltihaplı durumlar gibi çeşitli patolojik dokularda önemli rolleri

bulunmaktadır. Selektinler, geçici transmembran bağlayıcı glikoproteinlerdir. Kalsiyum

varlığında hücrelerin spesifik oligosakkaritlerini tanıyarak onları başka bir hücreye

bağlamakla görevlidirler. Karbonhidrat bağlayan moleküllerdir. Ligandları genellikle

siyalik glikanlardır. Adezyon moleküllerinin üç karakteristik özelliği bulunmaktadır

(Darka 2003):

1. Transmembranal glikoproteinlerdir. Hücre içini dış ortama bağlarlar. En büyük olan

hücre dışı kısım, membranöz kısım ve hücre içine doğru ilerleyen sitoplazmik

fonksiyonel kısımdan oluşmaktadırlar.

2. Dışarıdan gelen bir uyarının (bu bir hücre veya matrikse bağlı bir molekül olabilir)

hücre dışı kısımda konformasyonel değişime yol açması ile aktive olurlar. Hücre

adezyon molekülüne bağlanan molekül adezyon molekülünün ligandı olarak

isimlendirilir, özgül olması şarttır.

3. Hücre içinde bağlı bulundukları diğer moleküller sayesinde hücre fonksiyonunu

etkileyebilirler. Bazıları hücre iskeleti ile, bazıları da hücresel enzimlerle bağlantılıdır.

Reseptör ligand birleşmesi hücrede morfolojik veya kimyasal bir değişime yol

açmaktadır.

2.9 Anti-Mikrotübül İlaçları

Mikrotübüllere bağlanan ilaçlar kanser tedavilerinde kullanılan önemli anti-mitotik

maddelerdir. Mikrotübüller mitozda sentrozomların oluşmasında görev alırlar. Mitoz

boyunca mikrotübüller sürekli olarak polimerize olmakta ve hızlı bir şekilde

depolimerize olmaktadır. Bu ilaçların çoğu mikrotübüllere bağlanarak bu fonksiyonu

bozduklarından, mitoz bölünmenin durmasına neden olmaktadırlar.

Page 52: ANKARA ÜNİVERİSTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ ...acikarsiv.ankara.edu.tr/browse/24522/SukranSEKER.pdfmodifikasyonunun hücre adezyonunu arttırdığını; PLGA nanolif yüzey

37

Antimitotik ilaçlar mikrotübüllerde tübülin dimerlerinin değişik bölgelerine, farklı

kimyasal mekanizmalarla bağlanarak mikrotübül dinamiğinin bozulmasına neden

olurlar (Şekil 2.19). Örneğin vinblastin, mikrotübüllerin pozitif ucuna bağlanarak

mikrotübül fonksiyonunu engellemektedir. Kolsişin, tübülin dimerleri ile mikrotübül-

kolsişin kompleksi oluşturarak mikrotübül fonksiyonunu durdurmaktadır. Paklitaksel

ise, mikrotübülün iç bölgesine bağlanarak mikrotübül fonksiyonunun bozulmasına

neden olmaktadır (Jordan ve Wilson 2004). Anti-mikrotübül ilaçları genel olarak

taksanlar ve vinka alkoloidler olmak üzere iki sınıfa ayrılmaktadır.

Şekil 2.19 Mikrotübüllerin farklı bölgelerine bağlanan anti-mikrotübül ilaçları

Uzun dönem tedavilerde kanser hücreleri zamanla bu ilaçlara karşı direnç

kazanmaktadır (Drukman ve Kavallaris 2002, Kavallaris 2010). Bu sebeple son yıllarda,

farmasötik alanda kanser tedavilerinde kullanılabilecek anti-mitotik özelliğe sahip

maddelerin keşfi önem kazanmıştır (Paula vd. 2003).

Page 53: ANKARA ÜNİVERİSTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ ...acikarsiv.ankara.edu.tr/browse/24522/SukranSEKER.pdfmodifikasyonunun hücre adezyonunu arttırdığını; PLGA nanolif yüzey

38

2.9.1 Taksanlar

Porsuk ağacından elde edilen diterpen yapısındaki bir bileşiktir. Taksanlar çeşitli

kemoterapi ilaçlarının üretiminde kullanılmaktadır. “Docetaxel, larotaxel, ortataxel,

paclitaxel, tesetaxel” taksan sınıfı bileşiklerin bazılarıdır. Taksan sınıfı ilaçların genel

mekanizması, mikrotübüllere bağlanarak mikrotübül fonksiyonunu bozmaları ve mitoz

bölünmeyi durdurmalarıdır.

2.9.2 Vinka alkaloidler

Vinka alkaloidler, mitoz bölünmede iğ ipliklerinin oluşumu için gerekli olan tübüler

proteinlere bağlanarak, mikrotübül fonksiyonlarını inhibe eden bitkisel kaynaklı

bileşiklerdir. “Vinblastine, vincristine, vinflunine, vindesine ve vinorelbine” bu sınıfa

giren bileşiklerdir. Hücrede mikrotübüllerin depolimerizasyonunu önleyerek stabil

mikrotübül topluluklarının oluşmasına neden olmaktadırlar. Bu durum, mitotik

iğciklerin üretiminin yapılamamasına ve metafaz evresinin bloke olmasına neden

olmaktadır.

2.9.2.1 Kolsişin

Colchicum Autumnale (sonbahar çiçeği) bitkisinden elde edilen, kolsişin, tübülin

dimerlerine bağlanarak mikrotübüllerin polimerizasyonunu inhibe etmektedir. Tübülin

üzerinde kolsişin bağlanma bölgesine bağlanan bileşikler ve kolsişin, toksisitelerinden

dolayı kanser tedavilerinde çok sık kullanılmamaktadır (Jordan ve Wilson 2004).

Page 54: ANKARA ÜNİVERİSTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ ...acikarsiv.ankara.edu.tr/browse/24522/SukranSEKER.pdfmodifikasyonunun hücre adezyonunu arttırdığını; PLGA nanolif yüzey

39

Şekil 2.20 Kolsişin molekülünün yapısı (http://science.jrank.org/article_images/science.jrank.org/colchicine.1.jpg)

Kolsişin mitotik ipliklerin oluşumunu engelleyerek, metafaz safhasında mitoz

bölünmenin durmasına neden olmaktadır. Sonuç olarak, mikrotübüllerin oluşumunu

inhibe etmektedir.

Yıllardır gut tedavisinde kullanılan kolsişin, son 50 yıldır Ailevi Akdeniz Ateşi

(Familial Mediterranean Fever, FMF), Behçet hastalığı, skleroderma, amiloidoz ve

karaciger sirozu tedavilerinde de basvurulan ilaç olmuştur. Günümüzde yapılan

çalışmalar, kolsişinin adezyon önlemede etkin olduğunu göstermiştir (Ben-Chetrit vd.

2006).

2.9.2.2 Vinorelbin

Catharanthus roseus (Cezayir menekşesi) adlı bir bitkiden ekstrakte edilen, yarı sentetik

bir vinka alkoloididir. Tübüline bağlanarak, mikrotübül dinamiğinin bozulmasına ve

mitoz bölünmenin durmasına neden olmaktadır.

Page 55: ANKARA ÜNİVERİSTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ ...acikarsiv.ankara.edu.tr/browse/24522/SukranSEKER.pdfmodifikasyonunun hücre adezyonunu arttırdığını; PLGA nanolif yüzey

40

Şekil 2.21 Vinorelbin molekülünün yapısı (http://www.newdruginfo.com/pharmacopeia/usp28/v28230/usp28nf23s0_m88270.htm)

Vinorelbin vinka alkaloidler ailesinden bir antineoplastik ilaç olmakla birlikte, etkisini,

moleküler olarak, hücrenin mikrotübülleri üzerinde göstermektedir. Tübülin

polimerizasyonunu inhibe ederek, mitotik mikrotübüllere bağlanmakta ve aksonal

miktotübülleri yalnızca yüksek konsantrasyonlarda etkilemektedir. Vinorelbin, mitozu

G2-M evresinde bloke ederek, interfazda ya da sonraki evrelerde hücre ölümüne sebep

olmaktadır (http://www.iegm.gov.tr).

2.9.2.3 Vinblastin

Vinblastin sülfat Vinca rosea Linn (Cezayir menekşesi) bitkisinden elde edilmiş bir

alkoloit tuzudur. Tübülin dimerlerinin β-alt ünitelerinde bulunan vinka bağlanma

bölgesi olarak adlandırılan bir bölgeye bağlanmaktadır. Vinblastinin mikrotübüllere

bağlanması tübülin dimerlerinde konformasyonal bir değişime neden olmaktadır.

Page 56: ANKARA ÜNİVERİSTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ ...acikarsiv.ankara.edu.tr/browse/24522/SukranSEKER.pdfmodifikasyonunun hücre adezyonunu arttırdığını; PLGA nanolif yüzey

41

Şekil 2.22 Vinblastin sülfat molekülünün yapısı (http://www.sigmaaldrich.com/structureimages/57/mfcd00082457.gif)

Doku kültürü çalışmaları, amino asitlerin glutamik asitten sitrik asit döngüsü ve üreye

varan metabolik oluşumunda bir etkisi olduğunu düşündürmektedir. Vinblastin sülfatın

antitümör etkisinin glutamik asit ya da triptofan ile ortadan kalktığı gösterilmiştir

(http://www.iegm.gov.tr).

Page 57: ANKARA ÜNİVERİSTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ ...acikarsiv.ankara.edu.tr/browse/24522/SukranSEKER.pdfmodifikasyonunun hücre adezyonunu arttırdığını; PLGA nanolif yüzey

42

3. MATERYAL ve YÖNTEM

3.1 Madde ve Malzeme

Kuartz kristallerin altın yüzeylerinin modifikasyonunda, 11-Merkaptoundekanoik asit

(Sigma), 2-Merkaptoetanol (Sigma) ve 2-Merkaptoetilamin (Sigma); kristal

yüzeylerinin kaplanmasında, poli[(D,L-laktik-ko-glikolik asit) (85:15)] (PLGA; Sigma,

St. Louis, MO, ABD), PS, PCL, kitosan (Fluka), hyalüronik asit (Fluka), kollajen,

alginat (Sigma) ve PLL (Sigma) polimerleri kullanıldı. Bazı polimer çözeltilerinin

hazırlanmasında, diklorometan, tetrahidrofuran, dimetilformamit, toluen, kloroform gibi

organik çözücüler (Sigma, St. Louis, MO, ABD) kullanıldı.

Elektroeğirme işleminde, polimer çözeltisinden lif elde etmek amacıyla 60 kV DC güç

kaynağı (FC60P02, Glassman, ABD), polimer çözeltisini voltaj bölgesine itmek için bir

şırınga pompası (Harvard Apparatus, CH) kullanıldı. Toplayıcı plaka olarak uygun

boyutta kesilen alüminyum folyolar kullanıldı.

Kristal yüzeylerinin sterilizasyon için UV lambalı (254 nm) laminer akış kabini (Nuaire,

Class II, Plymouth, Minnesota, ABD) kullanıldı.

Dönüşümlü voltametri deneylerinde, K3[Fe(CN)6] (potasyum demir III siyanür) (Sigma)

kullanıldı.

Hücre kültürü çalışmalarında, hücrelerin ekilip çoğaltıldığı steril doku kültür kapları

(Corning, NY, ABD), besiyeri olarak, Alpha-MEM (Modified Eagle’s Medium)

(Sigma), besiyeri katkısı olarak L-glutamin, penisilin-streptomisin (antibiyotik-

antimikotik) ve fetal sığır serumu (FCS) (Sigma, St. Louis, MO), hücrelerin

pasajlanması işleminde ise tripsin/EDTA çözeltisi (Sigma) kullanıldı. Çalışmaların

tamamı laminer akışlı steril kabinde (Nuaire, Class II, Plymouth, Minnesota, ABD)

Page 58: ANKARA ÜNİVERİSTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ ...acikarsiv.ankara.edu.tr/browse/24522/SukranSEKER.pdfmodifikasyonunun hücre adezyonunu arttırdığını; PLGA nanolif yüzey

43

yapılmış ve hücre kültürleri ise 37ºC, %5 CO2, %95 nem ortamını sağlayan bir

karbondioksitli inkübatörde (Heracell 240®, Waltham, Massachusetts, ABD)

gerçekleştirildi.

Anti-mikrotübül ilaç olarak, vinblastin sülfat (Sigma), vinorelbin ditartarat (Sigma) ve

kolsişin (Sigma) kullanıldı. İlaçların stok çözeltilerinin hazırlanmasında çözücü olarak

dimetil sülfoksit (Sigma) kullanıldı.

3.2 Ölçüm Sistemi ve Kuartz Kristaller

Frekans ölçüm deneyleri ve dönüşümlü voltametri (cyclic voltammetry) deneylerinde

EQCM (CHI440, CH Instruments) ölçüm sistemi ve 7.995 MHz temel titreşim

frekansına sahip, 5.1 mm çapında, parlatılmış altın elektrotlu, AT-kesim kuartz

kristaller (CHI) kullanıldı (Şekil 3.1).

Şekil 3.1 Çalışmada kullanılan ölçüm sistemi ve kuartz kristali

Hücre-yüzey ve hücre-ilaç etkileşiminin KKM sistemi ile belirlendiği çalışmalarda, akış

hücresinin kullanıldığı bir deney düzeneği hazırlandı. Elektrot yüzeyi kaplanan kuartz

kristal ve akış hücresinin her bir parçası steril edildi. Kristal O-ring’ler yardımıyla akış

hücresi içerisine; kristalin sadece tek yüzeyi sıvı ile temas edecek şekilde yerleştirildi

(Şekil 3.2).

Page 59: ANKARA ÜNİVERİSTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ ...acikarsiv.ankara.edu.tr/browse/24522/SukranSEKER.pdfmodifikasyonunun hücre adezyonunu arttırdığını; PLGA nanolif yüzey

44

Şekil 3.2 Kristalin akış hücresi içerisine yerleştirilmesi

Hücre-malzeme ve hücre-ilaç etkileşiminin incelendiği çalışmalar, şekil 3.3’de şematik

olarak verilen akış sistemli bir KKM düzeneğinde gerçekleştirildi. Özetle, içerisinde

yüzeyi incelenecek kristalin bulunduğu KKM akış hücresi ve osilatör, 37ºC, %5 CO2,

%95 nem ortamını sağlayan bir karbondioksit inkübatörüne yerleştirildi. Kristalin

yerleştirildiği bölüme, peristaltik pompa (Servatechnik Inc., Oftringen, Almanya)

yardımıyla 4 saat boyunca serumsuz besiyeri akışı (0.40 ml/dk) sağlandı. Bu süre

boyunca kristalin frekansında meydana gelen değişimler bilgisayar programı aracılığıyla

kaydedildi.

Page 60: ANKARA ÜNİVERİSTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ ...acikarsiv.ankara.edu.tr/browse/24522/SukranSEKER.pdfmodifikasyonunun hücre adezyonunu arttırdığını; PLGA nanolif yüzey

45

Şekil 3.3 Hücre adezyonu ve hücre-ilaç etkileşimi ölçümleri için deney düzeneği

3.3 Kristal Yüzeylerinin Kaplanması

3.3.1 Kendiliğinden düzenlenen tek tabaka yöntemi ile yüzey modifikasyonu

Kristal yüzeyleri, yüzey modifikasyon ve kaplama işlemlerinden önce piranha çözeltisi

(%30 H2O2 ve %70 H2SO4) ile temizlenip, distile su ile yıkanarak kurutuldu. Yüzey

temizleme işleminin ardından kuartz kristalin altın elektrot yüzeyi kendiliğinden

düzenlenen tek tabaka tekniği kullanılarak modifiye edildi. Bu amaçla, 11-

Merkaptoundekanoik (11-MUA) asit, 2-Merkaptoetanol ve 2-Merkaptoetilamin’in

etanol içerisindeki çözeltileri hazırlandı (1 mM). Yüzeyi temizlenen ve ilk frekansları

(Fo) kaydedilen kristaller, hazırlanan bu tiyol çözeltileri içerisinde bir gece boyunca

bekletildi. Bu sürenin sonunda yüzeyler, etanol ve distile suyla yıkanarak kurumaya

bırakıldı. Kuruyan kristallerin son (F1) frekansları kaydedildi. Bu işlemlerin ardından,

farklı fonksiyonel gruba sahip (-COOH, -OH veya -NH2) kristal yüzeyleri hazırlanmış

oldu.

Page 61: ANKARA ÜNİVERİSTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ ...acikarsiv.ankara.edu.tr/browse/24522/SukranSEKER.pdfmodifikasyonunun hücre adezyonunu arttırdığını; PLGA nanolif yüzey

46

3.3.1.1 Dönüşümlü voltametri ölçümleri

Alkantiyol tek tabaka tekniği ile yüzey modifikasyonunu doğrulamak amacıyla

dönüşümlü voltametri deneyleri yapıldı. Ölçümler, 5 mM K3[Fe(CN)6] çözeltisi içine

daldırılmış üçlü elektrot sistemi ile gerçekleştirildi. Çalışma elektrodu olarak modifiye

edilmiş kuartz kristali, karşıt elektrot olarak platin tel ve, referans elektrot olarak

Ag/AgCl elektrodu kullanıldı.

Şekil 3.4 CV ölçümleri için deney düzeneği

3.3.2 Elektroeğirme (electrospining) tekniği ile yüzey kaplama

Temizlenen ve temizleme işleminden sonra ilk frekans değerleri kaydedilen kuartz

kristaller, elektroeğirme cihazında kaplanmak üzere, toplayıcı plaka üzerine

yerleştirildi. %20’lik poli[(D,L-laktik-ko-glikolik asit) (85:15)] (PLGA) çözeltisi

(Diklorometan, tetrahidrofuran, dimetilforamit, 3:1:1) 10 ml’lik enjektöre alındı ve

enjektör pompasına yerleştirildi. Polimer çözeltisinin yüksek elektrostatik alana (DC

voltaj) maruz bırakılması sonucu oluşan PLGA nanolifler toplayıcı plaka üzerinde

bulunan kristaller üzerinde biriktirildi. Kuruyan kristallerin son frekansları kaydedildi.

Page 62: ANKARA ÜNİVERİSTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ ...acikarsiv.ankara.edu.tr/browse/24522/SukranSEKER.pdfmodifikasyonunun hücre adezyonunu arttırdığını; PLGA nanolif yüzey

47

3.3.3 Döndürerek kaplama (spin coating) tekniği ile yüzey kaplama

Temizlenen ve ilk frekans değerleri kaydedilen kristaller, %1’lik PS (toluende), %1’lik

PCL (kloroformda) ve %2’lik PLGA polimerleri ile döndürerek kaplama cihazı

kullanılarak (Primus SB15) 3000 rpm’de kaplandı. Kuruyan kristallerin son frekansları

kaydedildi.

3.3.4 Damlatma tekniği ile yüzey kaplama

Suda çözünen polimerler damlatma yöntemine göre kristal yüzeyi üzerine kaplandı.

Kaplanacak kristaller temizlendikten sonra %0.1’lik kitosan, hyalüronik asit, kollajen,

alginat ve PLL polimerleri ile kaplandı. Kaplanan film tabakaları farklı çarpraz

bağlayıcılar ile belirli sürelerde muamele edildi. Yıkama işlemlerinin ardından kuruyan

kristallerin son frekansları kaydedildi.

3.3.4.1 Kitosan film ile kaplama

%0.1’lik kitosan çözeltisi hazırlamak için, belirli miktardaki kitosan (Sigma) %1’lik

asetik asit çözeltisi içerisine ilave edildi ve homojen bir çözelti elde edilinceye kadar

manyetik karıştırıcıda karıştırıldı. Hazırlanan bu çözeltinin 5 µL’si kristal yüzeyinin

üzerine mikropipet yardımıyla homojen olarak kaplandı ve bir saat bekletildi. Ardından

çarpraz bağlama işlemi için film tabakası 1 M NaOH ile 30 dakika muamele edildi.

Yıkama işleminin ardından kristaller havada kurutularak son frekansları kaydedildi.

3.3.4.2 Hyalüronik asit polimeri ile kaplama

%0.1’lik hyalüronik asit çözeltisi, belirli miktardaki hyalüronik asidin (Fluka) saf su

içerisinde çözülmesiyle hazırlandı. Hazırlanan bu çözeltinin 5 µL’si kristal yüzeyinin

Page 63: ANKARA ÜNİVERİSTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ ...acikarsiv.ankara.edu.tr/browse/24522/SukranSEKER.pdfmodifikasyonunun hücre adezyonunu arttırdığını; PLGA nanolif yüzey

48

üzerine mikropipet yardımıyla homojen olarak kaplandı ve bir saat bekletildi. Bir saatin

sonunda 1 M NaOH ile çarpraz bağlama işlemi için 30 dakika muamele edildi. Yıkama

işleminin ardından kristaller havada kurutularak son frekansları kaydedildi.

3.3.4.3 Kollajen film ile kaplama

%0.1’lik kollajen çözeltisi hazırlamak için, belirli miktardaki kollajen, %0.1’lik asetik

asit çözeltisi içerisine ilave edildi ve homojen bir çözelti elde edilinceye kadar manyetik

karıştırıcıda karıştırıldı. Hazırlanan bu çözeltinin 5 µL’si kristal yüzeyinin üzerine

mikropipet yardımıyla homojen olarak kaplandı ve bir saat bekletildi. Ardından çarpraz

bağlama işlemi için film tabakası %2.5’lik glutaraldehit ile 30 dakika muamele edildi.

Yıkama işleminin ardından kristaller havada kurutularak son frekansları kaydedildi.

3.3.4.4 Alginat film ile kaplama

%0.1’lik alginat çözeltisi, belirli miktardaki alginat’ın (Sigma) saf su içerisinde

çözülmesiyle hazırlandı. Hazırlanan bu çözeltinin 5 µL’si kristal yüzeyinin üzerine

mikropipet yardımıyla homojen olarak kaplandı ve bir saat bekletildi. Bir saatin

sonunda kaplı kristal, 0.4 M CaCl2 ile çarpraz bağlama işlemi için 30 dakika muamele

edildi. Yıkama işleminin ardından kristaller havada kurutularak son frekansları

kaydedildi.

3.3.4.5 PLL film ile kaplama

5 µL %0.1 PLL çözeltisi (suda), temizlenen kristal yüzeyi üzerine damlatıldı ve

mikropipet yardımıyla yüzey üzerine homojen bir şekilde kaplanarak bir saat bekletildi.

Yıkama işleminin ardından kristaller havada kurutularak son frekansları kaydedildi.

Page 64: ANKARA ÜNİVERİSTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ ...acikarsiv.ankara.edu.tr/browse/24522/SukranSEKER.pdfmodifikasyonunun hücre adezyonunu arttırdığını; PLGA nanolif yüzey

49

3.4 Atomik Kuvvet Mikroskobu

Kristal yüzeylerinin kaplama topografisini ve yüzey morfolojisini incelemek amacıyla

Atomik Kuvvet Mikroskobu (Atomic Force Microscopy, AFM) tekniği kullanıldı. Altın

yüzey üzerine hücrelerin bağlanma kapasitesini arttırmak amacıyla kristal yüzeyi farklı

tekniklerle ve polimerlerle kaplanarak farklı yüzey topografileri oluşturuldu. AFM

görüntüleri, kuartz kristalin altın elektrot yüzeyleri üzerinde alındı. Hazırlanan

yüzeylerin AFM görüntüleri, NI-AFM marka (Nanomagnetics Inst.) cihaz ile dinamik

modda ve hava ortamında alındı. Kristal yüzeyleri 40 N/m kuvvet sabiti ile, farklı yüzey

alanlarında, oda sıcaklığında tarandı.

3.5 Kaplı Yüzeylerin Kararlılık Testleri

11-Merkaptoundekanoik asit (11-MUA), 2-Merkaptoetanol ve 2-Merkaptoetilamin ile

modifiye edilen ve farklı polimer malzemelerle kaplanan kristal yüzeylerinin

kararlılıklarını belirlemek amacıyla, kuartz kristaller serum içermeyen besiyeri ile 4 saat

muamele edildi. Bu süre boyunca kristallerin frekansında meydana gelen değişimler

KKM sistemi ile eş zamanlı olarak belirlendi.

3.6 Sıçan Kemik İliğinden Mezenkimal Kök Hücrelerinin İzolasyonu

Çalışmada, 8-12 haftalık 200-250 g ağırlığındaki Wistar soyu sıçanların femurlarından,

standart protokollere göre izole edilip stoklanan kemik iliği mezenkimal kök hücreleri

kullanıldı. Özetle, avertin anestezisi sonrası sıçanın her iki bacağındaki femurlar

çıkarıldı. %70’lik etanol ile etrafındaki yağ ve kas kalıntıları iyice temizlenerek, alt ve

üst kısımlarından kesildi. İçerisinde 5 mL α-MEM bulunan 25 G’lik enjektör yardımıyla

kemik iliği hücreleri santrifüj tüpüne aktarılarak 1100 rpm’de 10 dakika süreyle

santrifüj edildi. Santrifüj sonrası çözeltinin üst kısmı atıldı ve 5’er dakika 1100 rpm’de

3 kere santrifüjleme işlemi yapılarak hücreler besiyeri ile yıkandı.

Page 65: ANKARA ÜNİVERİSTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ ...acikarsiv.ankara.edu.tr/browse/24522/SukranSEKER.pdfmodifikasyonunun hücre adezyonunu arttırdığını; PLGA nanolif yüzey

50

3.6.1 Hücre kültürü ve pasajlama

Yıkama işlemleri ardından elde edilen kemik iliği mezenkimal kök hücreleri, %20 fetal

sığır serumu, 2 mM L-glutamin, 100 µL/mL penisilin-streptomisin içeren α-MEM

içerisinde, 37oC’da, %5 CO2, %95 hava, %90 nem içeren ortam şartlarında inkübe

edildi. Kültürün üçüncü gününde kültür kabına yapışmayan hücreler, besiyeri

değiştirilerek uzaklaştırıldı. Haftada üç kez besiyeri değiştirilerek, bağlanan hücrelerin

kültürüne devam edildi.

3.6.2 Tripsinizasyon işlemi

Sıçan femurlarından izole edilen kemik iliği mezenkimal kök hücreleri, %20 fetal sığır

serumu, 2mM L-glutamin, 100 µL/mL penisilin-streptomisin içeren α-MEM içerisinde,

7oC’da, %5 CO2, %95 hava, %90 nem içeren ortam şartlarında inkübe edildi. Hücreler

%80-90 bolluk noktasına geldiğinde %0.25 tripsin ve 1 mM EDTA içeren çözelti

yardımıyla kap yüzeyinden kaldırılarak pasajlama işlemi yapıldı. 2.-4. pasajdaki

mezenkimal kök hücreleri (MKH) kültür kabında bolluk noktasına ulaştıktan sonra,

tripsinizasyonla enzimatik olarak kap tabanından ayrıldı. Elde edilen hücre

süspansiyonu, hücre adezyonunun ve ilaç etkileşiminin incelendiği deneylerde

kullanılmak üzere enjektöre alındı.

3.7 Hücre Adezyonunun KKM Sistemi ile Görüntülenmesi

Hücre adezyonunun incelendiği deneyler için, ilk olarak kristal UV ışıkta (254 nm) 15

dakika; kristal hücresi ve peristaltik pompa aparatları otoklavda (121oC; 15 dk) steril

edildi. Sterilizasyon işlemlerinden sonra, içine kuartz kristal yerleştirilen akış hücresi ve

osilatör, inkübatör içerisine yerleştirildi. Akış hücresine kontrollü miktarda 0.40 mL/dk

hızıyla besiyeri akışı sağlamak amacıyla peristaltik pompa kullanıldı. MKH’leri kültür

kabında bolluk noktasına ulaştıktan sonra, tripsinizasyonla enzimatik olarak kap

Page 66: ANKARA ÜNİVERİSTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ ...acikarsiv.ankara.edu.tr/browse/24522/SukranSEKER.pdfmodifikasyonunun hücre adezyonunu arttırdığını; PLGA nanolif yüzey

51

tabanından ayrıldı. Elde edilen hücre süspansiyonu (3x105 hücre/mL) yaklaşık birer saat

aralıklarla kristal yüzeyine üç aşamada ilave edildi.

3.8 Toksisite Testi

Mezenkimal kök hücrelerinin aktivitesi üzerine, vinblastin, vinorelbin ve kolsişin

ilaçlarının etkisini etkisini incelemek amacıyla toksisite testi yapıldı. Bu amaçla ilk

olarak, ilaçların dimetil sülfoksit (DMSO) içerisindeki stok çözeltileri hazırlandı. Stok

çözeltilerin, farklı hacimlerdeki besiyeri ile seyreltilmesi sonucunda, istenilen

konsantrasyonlardaki (50 µM, 100 µM, 150 µM, 200 µM ve 250 µM) ilaç çözeltileri

hazırlandı.

Kültür kabında doygunluk noktasına ulaşan MKH’ler tripsin/EDTA ile kap tabanından

ayrılarak, 48 kuyucuklu plakalara, her bir kuyucuğa 2x105 hücre olacak şekilde ekildi ve

4 gün inkübasyona bırakıldı. 4 gün süren in vitro hücre kültürü işleminde, hücrelerin

besiyeri iki günde bir değiştirildi. 4. günün sonunda besiyeri, farklı konsantrasyonlarda

ilaçları içeren besiyeri ile değiştirildi ve hücrelerin 6 saat boyunca bu besiyeri ile

kültürüne devam edildi.

Çalışmada iki ayrı kontrol grubu oluşturuldu. Birinci kontrol grubu normal besiyeri ile

kültürüne devam edilen hücreleri, ikinci kontrol grubu ise, ilaç içermeyen DMSO ile

muamele edilen hücreleri içermiştir. Hücrelerin 6 saat sonundaki morfolojilerindeki

değişimlerin görüntülenmesi inversiyon mikroskobu (Nikon TS-100, Tokyo, Japonya)

ile gerçekleştirilmiştir.

Page 67: ANKARA ÜNİVERİSTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ ...acikarsiv.ankara.edu.tr/browse/24522/SukranSEKER.pdfmodifikasyonunun hücre adezyonunu arttırdığını; PLGA nanolif yüzey

52

3.8.1 MTT testi

Farklı dozlarda anti-mikrotübül ilaçları ile etkileştirilen MKH’lerin, 6 saat sonundaki

mitokondriyel dehidrogenaz aktiviteleri, sarı renkli MTT [3-(4,5-dimetildiyazol-2-il)-

2,5-difeniltetrazolyum bromür] tuzunun mitokondriyal enzimler tarafından mor renkli

formazan kristallerine indirgenmesi prensibine dayanan bir test ile belirlenmiştir (Şekil

3.5).

Şekil 3.5 Formazan kristallerinin oluşum reaksiyonu (www.dojindo.com/newimages/MTT-RS)

Bu amaçla, 48 kuyucuklu kültür kabı içerisinde 6 saat boyunca ilaçların farklı dozlarına

maruz bırakılan hücreler faz kontrast mikroskobu ile görüntülendikten sonra

kuyucuklardan besiyerleri uzaklaştırıldı. Hücrelerin serum içermeyen besiyeri ile

yıkanması işleminin ardından, her bir kuyucuğa 30 µL MTT ve 270 µL besiyeri ilave

edilerek 4 saat boyunca 37oC’de karbondioksit inkübatöründe inkübe edildi.

İnkübasyonun ardından oluşan formazan kristalleri faz kontrast mikroskobu ile

görüntülendi. Ardından besiyeri ortamdan uzaklaştırıldı ve oluşan formazan kristalleri,

300 µL MTT çözücüsü (Sigma) ile çözüldükten sonra spektrofotometre cihazı ile

(Biotrak II, Amersham Biosciences) 570 nm dalga boyundaki optik yoğunlukları köre

karşı belirlendi.

Page 68: ANKARA ÜNİVERİSTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ ...acikarsiv.ankara.edu.tr/browse/24522/SukranSEKER.pdfmodifikasyonunun hücre adezyonunu arttırdığını; PLGA nanolif yüzey

53

3.8.2 IC50 değerlerinin hesaplanması

Her bir ilacın inhibitör konsantrasyonu aşağıdaki formüle göre hesaplanmıştır:

OD kontrol: Normal besiyeri ile kültüre edilen hücrelerin optik yoğunluğu

OD örnek: İlaçlı besiyeri ile kültüre edilen hücrelerin optik yoğunluğu

Elde edilen inhibisyon değerleri örneklerde bulunan ilaçların konsantrasyonunun

logaritmasına karşılık grafiğe aktarılıp, grafikten elde edilen doğrunun denklemi

yardımı ile %50’ye karşılık gelen değer grafikten belirlenmiştir. (Şekil 3.6). Grafikten

belirlenen bu değerin antilogaritması alınarak her bir ilaç için IC50 değeri

hesaplanmıştır. Bu miktar da hücre canlılığını %50 engelleyen test bileşiğinin

konsantrasyonunu vermiştir.

3.9 Hücre-İlaç Etkileşiminin KKM Sistemi ile Görüntülenmesi

Hücre-ilaç etkileşiminin eş zamanlı olarak görüntülendiği deneylerde ilk olarak

kristaller %0.1’lik PS polimeri ile 3000 rpm’de kaplandı. Kaplı kristal sterilizasyon

amacıyla UV ışıkta 15 dakika bekletildi. Steril edilen kristal, laminer kabin içerisinde

kristal hücresi içerisine monte edildi. Kristal hücresi inkübatör içerisine yerleştirilerek

osilatör ve peristaltik pompa ile bağlantısı yapıldı. MKH’leri kültür kabında bolluk

noktasına ulaştıktan sonra, tripsinizasyonla enzimatik olarak kap tabanından ayrıldı.

Elde edilen hücre süspansiyonu (3x105 hücre/mL) akış ortamına enjekte edilerek 20 saat

boyunca PS yüzey üzerinde hücrelerin çoğalması sağlandı. 20 saat sonunda PS yüzey

üzerinde yayılan hücrelere, 150 ve 300 µM konsantrasyonda ilaç çözeltileri enjekte

Page 69: ANKARA ÜNİVERİSTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ ...acikarsiv.ankara.edu.tr/browse/24522/SukranSEKER.pdfmodifikasyonunun hücre adezyonunu arttırdığını; PLGA nanolif yüzey

54

edildi. Her aşama sonucunda kristalin frekansında meydana gelen değişimler KKM

sistemi ile belirlendi.

Çalışmanın bu aşaması için iki ayrı kontrol deneyi gerçekleştirildi. Birinci kontrol

deneyinde, PS yüzey üzerine aynı şekilde ekilen hücreler üzerine, ilaç içermeyen

DMSO çözücüsü ilave edilerek frekans değişimleri kaydedildi. İkinci kontrol deneyinde

ise, hücre ekimi yapılmayan PS kaplı yüzey üzerine ilaç enjeksiyonu yapılarak frekans

değişimleri kaydedildi.

Page 70: ANKARA ÜNİVERİSTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ ...acikarsiv.ankara.edu.tr/browse/24522/SukranSEKER.pdfmodifikasyonunun hücre adezyonunu arttırdığını; PLGA nanolif yüzey

55

4. BULGULAR

4.1 Kaplamaların Neden Olduğu Frekans Değişimleri Bulguları

Kaplama işlemleri sonrasında kristalin yüzeyindeki kütle artışı nedeniyle kristalin

titreşim frekansı azalmıştır. Kaplamanın neden olduğu frekans değişiminin belirlenmesi

amacıyla, her bir kristalin kaplama işleminden önceki ve sonraki frekansları ölçülerek

frekans değişimleri (∆F) hesaplanmıştır. Çalışılan her bir yüzey için beş farklı kristalin

frekans farkları hesaplanarak ortalamaları alınmış ve standart sapmaları hesaplanmıştır.

Çizelge 4.1 Kaplamaların neden olduğu frekans değişimleri

a: Beş değer için standart sapma

Kaplama türü Frekans değişimia (Hz)

11-MUA 111±12

2-Merkaptoetanol 67±10

2-Merkaptoetilamin 63±9

PLGA nanolif 226±83

PLGA film 2039±613

PCL membran 3546±304

PS membran 4826±114

Kitosan 6390±1751

Hyalüronik asit 4997±2121

Kollajen 5180±2787

Alginat 5570±3297

PLL 2270±1163

Page 71: ANKARA ÜNİVERİSTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ ...acikarsiv.ankara.edu.tr/browse/24522/SukranSEKER.pdfmodifikasyonunun hücre adezyonunu arttırdığını; PLGA nanolif yüzey

56

4.2 Kristal Yüzeylerinin AFM Bulguları

4.2.1 Altın yüzeyin AFM bulguları

Kuartz kristal yüzeyi üzerinde herhangi bir kaplama işlemi yapılmadan, parlatılmış altın

yüzeyin AFM görüntüsü alındı. Kristal yüzeyi üzerinde 3x3 µm2’lik bir alanda tarama

yapıldı. Histogram analizi ve iki farklı bölgeden alınan kesit analizi sonuçları, yüzeyin

ortalama 3 nm civarında porözite içerdiğini gösterdi.

Şekil 4.1 Kurartz kristalin altın yüzeyinin üç boyutlu AFM görüntüsü ve histogram analizi

Page 72: ANKARA ÜNİVERİSTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ ...acikarsiv.ankara.edu.tr/browse/24522/SukranSEKER.pdfmodifikasyonunun hücre adezyonunu arttırdığını; PLGA nanolif yüzey

57

Şekil 4.2 Altın yüzeyin kesit analizi

4.2.2 11-MUA ile modifiye edilen yüzeyin AFM bulguları

11-MUA ile modifiye edilen kristal yüzeyinin AFM görüntüleri Şekil 4.3-4.4’de

verilmiştir. Kristal yüzeyi, kendiliğinden düzenlenen tek tabaka yöntemi kullanılarak

hazırlandı. Kristal yüzeyi üzerinde 3x3 µm2’lik bir alanda tarama yapıldı. Görüntüler

yüzey üzerinde homojen bir kaplama gerçekleştiğini; histogram analizi ve iki farklı

bölgeden alınan kesit analizi sonuçları ise, yüzeyde ortalama 7-8 nm kalınlığında bir

kaplama meydana geldiğini gösterdi.

Page 73: ANKARA ÜNİVERİSTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ ...acikarsiv.ankara.edu.tr/browse/24522/SukranSEKER.pdfmodifikasyonunun hücre adezyonunu arttırdığını; PLGA nanolif yüzey

58

Şekil 4.3 11-MUA ile kaplı yüzeyin üç boyutlu AFM görüntüsü ve histogram analizi

Şekil 4.4 11-MUA ile kaplı yüzeyin kesit analizi

Page 74: ANKARA ÜNİVERİSTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ ...acikarsiv.ankara.edu.tr/browse/24522/SukranSEKER.pdfmodifikasyonunun hücre adezyonunu arttırdığını; PLGA nanolif yüzey

59

4.2.3 2-Merkaptoetanol ile kaplı yüzeyin AFM bulguları

Şekil 4.5-4.6’da 2-Merkaptoetanol kaplı yüzeyin AFM görüntüleri verilmiştir. Altın

yüzey 2-Merkaptoetanol çözeltisi kullanılarak modifiye edildi. AFM görüntüleri 3x3

µm2’lik yüzey alanı üzerinde alındı. AFM sonuçları, modifikasyon sonrası yüzey

üzerinde ortalama 4-5 nm kalınlığında sıralı bir kaplama oluştuğunu gösterdi. Kesit

analizi kristal yüzeyi üzerinde 2 farklı bölgede gerçekleştirildi.

Şekil 4.5 2-Merkaptoetanol ile kaplı yüzeyin üç boyutlu AFM görüntüsü ve histogram analizi

Page 75: ANKARA ÜNİVERİSTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ ...acikarsiv.ankara.edu.tr/browse/24522/SukranSEKER.pdfmodifikasyonunun hücre adezyonunu arttırdığını; PLGA nanolif yüzey

60

Şekil 4.6 2-Merkaptoetanol ile kaplı yüzeyin kesit analizi

4.2.4 2-Merkaptoetilamin ile kaplı yüzeyin AFM bulguları

2-Merkaptoetilamin ile modifiye edilen kristal yüzeyinin AFM görüntüleri Şekil 4.7-

4.8’de verilmiştir. Kristal yüzeyi, kendiliğinden düzenlenen tek tabaka yöntemi

kullanılarak hazırlandı. Kristal yüzeyi üzerinde 3x3 µm2’lik yüzey alanında tarama

yapıldı. Görüntüler yüzey üzerinde sıralı bir kaplama gerçekleştiğini; histogram analizi

ve iki farklı bölgeden alınan kesit analizi sonuçları ise, yüzeyde ortalama 4-5 nm

kalınlığında bir kaplama meydana geldiğini gösterdi.

Page 76: ANKARA ÜNİVERİSTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ ...acikarsiv.ankara.edu.tr/browse/24522/SukranSEKER.pdfmodifikasyonunun hücre adezyonunu arttırdığını; PLGA nanolif yüzey

61

Şekil 4.7 2-Merkaptoetilamin ile kaplı yüzeyin üç boyutlu AFM görüntüsü ve histogram analizi

Şekil 4.8 2-Merkaptoetilamin ile kaplı yüzeyin kesit analizi

Page 77: ANKARA ÜNİVERİSTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ ...acikarsiv.ankara.edu.tr/browse/24522/SukranSEKER.pdfmodifikasyonunun hücre adezyonunu arttırdığını; PLGA nanolif yüzey

62

4.2.5 PLGA nanolif ile kaplı yüzeyin AFM bulguları

PLGA nanolif yüzeyin AFM görüntüleri Şekil 4.9-4.10’da verilmiştir. Bu örnek için

kuartz kristaller, elektroeğirme tekniği kullanılarak %20’lik PLGA polimeri ile

kaplandı. Yüzey üzerinde 20x20 µm2’lik bir alanda tarama işlemi yapıldı. Görüntüler

yüzey üzerinde homojen ve gözenekli bir kaplama gerçekleştiğini; histogram analizi ve

iki farklı bölgede gerçekleştirilen kesit analizi sonuçları ise, yüzeyde ortalama 550-700

nm kalınlığında bir kaplama meydana geldiğini gösterdi.

Şekil 4.9 PLGA nanolif ile kaplı yüzeyin üç boyutlu AFM görüntüsü ve histogram analizi

Page 78: ANKARA ÜNİVERİSTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ ...acikarsiv.ankara.edu.tr/browse/24522/SukranSEKER.pdfmodifikasyonunun hücre adezyonunu arttırdığını; PLGA nanolif yüzey

63

Şekil 4.10 PLGA nanolif ile kaplı yüzeyin kesit analizi

4.2.6 PLGA film ile kaplı yüzeyin AFM bulguları

PLGA film ile kaplanan altın yüzeyin topografi sonuçları Şekil 4.11-4.12’de verilmiştir.

Yüzey %2’lik PLGA polimeri ile 3000 rpm’de döndürerek kaplama yöntemi

kullanılarak kaplandı. Ölçümler 20x20 µm2’lik bir alanda gerçekleştirildi. AFM

ölçümleri sonucunda, yüzey üzerinde farklı boyutlarda polimer kümelerinin oluştuğu

gözlendi.

Page 79: ANKARA ÜNİVERİSTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ ...acikarsiv.ankara.edu.tr/browse/24522/SukranSEKER.pdfmodifikasyonunun hücre adezyonunu arttırdığını; PLGA nanolif yüzey

64

Şekil 4.11 PLGA film ile kaplı yüzeyin üç boyutlu AFM görüntüsü ve histogram analizi

Şekil 4.12 PLGA film ile kaplı yüzeyin kesit analizi

Page 80: ANKARA ÜNİVERİSTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ ...acikarsiv.ankara.edu.tr/browse/24522/SukranSEKER.pdfmodifikasyonunun hücre adezyonunu arttırdığını; PLGA nanolif yüzey

65

4.2.7 PCL ile kaplı yüzeyin AFM bulguları

Şekil 4.13-4.14’de PCL polimeri ile kaplanan kristal yüzeyinin AFM görüntüleri

verilmiştir. Kristal yüzeyi %1’lik PCL çözeltisi ile, döndürerek kaplama cihazı

kullanılarak 3000 rpm’de kaplandı. Kristal yüzeyi üzerinde 10x10 µm2’lik yüzey

alanında tarama işlemi yapıldı. Görüntüler yüzey üzerinde homojen bir kaplama

gerçekleştiğini; histogram analizi ve üç farklı bölge üzerinde gerçekleştirilen kesit

analizi sonuçları ise, yüzeyde ortalama 110-150 nm kalınlığında bir kaplama meydana

geldiğini gösterdi.

Şekil 4.13 PCL ile kaplı yüzeyin üç boyutlu AFM görüntüsü ve histogram analizi

Page 81: ANKARA ÜNİVERİSTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ ...acikarsiv.ankara.edu.tr/browse/24522/SukranSEKER.pdfmodifikasyonunun hücre adezyonunu arttırdığını; PLGA nanolif yüzey

66

Şekil 4.14 PCL ile kaplı yüzeyin kesit analizi

4.2.8 PS ile kaplı yüzeyin AFM bulguları

%1’lik PS polimeri ile kaplanan kristal yüzeyinin yüzey topografisi Şekil 4.15-4.16’da

görülmektedir. Kaplama işlemi döndürerek kaplama yöntemine göre 3000 rpm’de

yapıldı. AFM ölçümleri 10x10 µm2’lik yüzey üzerinde gerçekleştirildi. Elde edilen

veriler incelendiğinde yüzey üzerinde 40-50 nm kalınlığında bir kaplama gerçekleştiği

belirlendi.

Page 82: ANKARA ÜNİVERİSTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ ...acikarsiv.ankara.edu.tr/browse/24522/SukranSEKER.pdfmodifikasyonunun hücre adezyonunu arttırdığını; PLGA nanolif yüzey

67

Şekil 4.15 PS ile kaplı yüzeyin üç boyutlu AFM görüntüsü ve histogram analizi

Şekil 4.16 PS ile kaplı yüzeyin kesit analizi

Page 83: ANKARA ÜNİVERİSTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ ...acikarsiv.ankara.edu.tr/browse/24522/SukranSEKER.pdfmodifikasyonunun hücre adezyonunu arttırdığını; PLGA nanolif yüzey

68

4.2.9 Kitosan ile kaplı yüzeyin AFM bulguları

Şekil 4.17-4.18’de %0.1’lik kitosan film kaplı yüzeyin AFM görüntüleri verilmiştir.

Kaplama işlemi, damlatma yöntemi uygulanarak kristal yüzeyi üzerinde yapıldı.

Kaplama işlemi sonunda 1 M NaOH ile 30 dakika ile çarpraz bağlama işlemi yapıldı.

AFM ölçümleri 10x10 µm2’lik yüzey üzerinde gerçekleştirildi. Sonuçlar, kaplamanın

ortalama 20-30 nm kalınlığında olduğunu gösterdi.

Şekil 4.17 Kitosan ile kaplı yüzeyin üç boyutlu AFM görüntüsü ve histogram analizi

Page 84: ANKARA ÜNİVERİSTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ ...acikarsiv.ankara.edu.tr/browse/24522/SukranSEKER.pdfmodifikasyonunun hücre adezyonunu arttırdığını; PLGA nanolif yüzey

69

Şekil 4.18 Kitosan ile kaplı yüzeyin kesit analizi

4.2.10 Hyalüronik asit ile kaplı yüzeyin AFM bulguları

Hyalüronik asit film ile kaplanan altın yüzeyin topografi sonuçları Şekil 4.19-4.20’de

verilmiştir. Yüzey %0.1’lik hyalüronik asit polimeri ile damlatma yöntemi kullanılarak

kaplandı. Kaplama sonrasında 1 M NaOH ile çarpraz bağlama işlemi yapıldı. Ölçümler

10x10 µm2’lik bir alanda gerçekleştirildi. AFM ölçümleri, yüzey üzerinde 9-10 nm

kalınlığında bir kaplama meydana geldiğini gösterdi.

Page 85: ANKARA ÜNİVERİSTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ ...acikarsiv.ankara.edu.tr/browse/24522/SukranSEKER.pdfmodifikasyonunun hücre adezyonunu arttırdığını; PLGA nanolif yüzey

70

Şekil 4.19 Hyalüronik asit ile kaplı yüzeyin üç boyutlu AFM görüntüsü ve histogram

analizi

Şekil 4.20 Hyalüronik asit ile kaplı yüzeyin kesit analizi

Page 86: ANKARA ÜNİVERİSTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ ...acikarsiv.ankara.edu.tr/browse/24522/SukranSEKER.pdfmodifikasyonunun hücre adezyonunu arttırdığını; PLGA nanolif yüzey

71

4.2.11 Kollajen ile kaplı yüzeyin AFM bulguları

Kollajen film ile kaplanan altın yüzeyin AFM görüntüleri Şekil 4.21-4.22’de verilmiştir.

Yüzey %0.1’lik kollajen polimeri ile damlatma yöntemi kullanılarak kaplandı. Kaplama

sonrasında %2.5’luk glutaraldehit ile çarpraz bağlama işlemi yapıldı. Ölçümler 10x10

µm2’lik bir alanda gerçekleştirldi. AFM ölçümleri sonucunda, yüzey üzerinde 20 nm

kalınlığında bir kaplama meydana geldiği belirlendi.

Şekil 4.21 Kollajen ile kaplı yüzeyin üç boyutlu AFM görüntüsü ve histogram analizi

Page 87: ANKARA ÜNİVERİSTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ ...acikarsiv.ankara.edu.tr/browse/24522/SukranSEKER.pdfmodifikasyonunun hücre adezyonunu arttırdığını; PLGA nanolif yüzey

72

Şekil 4.22 Kollajen ile kaplı yüzeyin kesit analizi

4.2.12 Alginat ile kaplı yüzeyin AFM görüntüleri

Şekil 4.23-4.24’de %0.1’lik alginat film kaplı yüzeyin AFM görüntüleri verilmiştir.

Kaplama işlemi, damlatma yöntemi kullanılarak kristal yüzeyi üzerinde yapıldı.

Kaplama işlemi sonunda 0.4 M CaCl2 ile çarpraz bağlama işlemi yapıldı. AFM

ölçümleri 10x10 µm2’lik yüzey üzerinde gerçekleştirildi. Sonuçlar kaplamanın ortalama

5-6 nm kalınlığında olduğunu gösterdi.

Page 88: ANKARA ÜNİVERİSTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ ...acikarsiv.ankara.edu.tr/browse/24522/SukranSEKER.pdfmodifikasyonunun hücre adezyonunu arttırdığını; PLGA nanolif yüzey

73

Şekil 4.23 Alginat ile kaplı yüzeyin üç boyutlu AFM görüntüsü ve histogram analizi

Şekil 4.24 Alginat ile kaplı yüzeyin kesit analizi

4.2.13 PLL ile kaplı yüzeyin AFM bulguları

PLL kaplı yüzeyin yüzeyin AFM görüntüleri Şekil 4.25-4.26’da verilmiştir. Yüzey

%0.1’lik PLL polimeri ile damlatma yöntemine göre hazırlandı. AFM ölçümleri 10x10

Page 89: ANKARA ÜNİVERİSTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ ...acikarsiv.ankara.edu.tr/browse/24522/SukranSEKER.pdfmodifikasyonunun hücre adezyonunu arttırdığını; PLGA nanolif yüzey

74

µm2’lik yüzey üzerinde gerçekleştirildi. Histogram analizi ve iki farklı bölgede alınan

kesit analizi sonuçları, kaplamanın ortalama 15-20 nm kalınlığında olduğunu gösterdi.

Şekil 4.25 PLL ile kaplı yüzeyin üç boyutlu AFM görüntüsü ve histogram analizi

Şekil 4.26 PLL ile kaplı yüzeyin kesit analizi

Page 90: ANKARA ÜNİVERİSTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ ...acikarsiv.ankara.edu.tr/browse/24522/SukranSEKER.pdfmodifikasyonunun hücre adezyonunu arttırdığını; PLGA nanolif yüzey

75

4.2.14 Yüzeylerin RMS değerleri

Çalışılan yüzeylerin pürüzlülük oranlarını belirlemek amacıyla kristal yüzeyleri

üzerinde oluşturulan her bir kaplamanın rms (root mean square) değeri belirlenmiştir

(Çizelge 4.2). Çizelgede görüldüğü gibi altın yüzey oldukça düşük bir rms değerine

sahip iken kaplamalar sonrasında yüzeylerin rms değerlerinin arttığı gözlenmiştir.

PLGA nanolif kaplı yüzeyin ölçülen rms değeri diğer yüzeylerin rms değerleri ile

karşılaştırıldığında, nanolif yüzeyin oldukça yüksek rms değerine sahip olduğu

görülmüştür.

Çizelge 4.2 Çalışılan yüzeylerin RMS değerleri

Kaplama türü RMS değerleri (nm)

Altın yüzey 0.8

11-MUA 6.4

2-Merkaptoetanol 8.4

2-Merkaptoetilamin 6.9

PLGA nanolif 303.8

PLGA film 48.7

PCL membran 36.5

PS membran 91.8

Kitosan 28.6

Hyalüronik asit 20.1

Kollajen 20.5

Alginat 17.7

PLL 12.8

Page 91: ANKARA ÜNİVERİSTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ ...acikarsiv.ankara.edu.tr/browse/24522/SukranSEKER.pdfmodifikasyonunun hücre adezyonunu arttırdığını; PLGA nanolif yüzey

76

4.3 CV Bulguları

Tiyol tabakalarının, kristalin altın elektrot yüzeyine adsorpsiyonunu doğrulamak

amacıyla dönüşümlü voltametri deneyleri yapıldı. Bu amaçla, kaplanmamış kristalin ve

yüzeyi modifiye edilmiş kristallerin CV ölçümleri alındı.

Şekil 4.27.a. Kaplanmamış kristalin, b. 11-MUA ile kaplı kristalin CV voltamogramı

a

b

Page 92: ANKARA ÜNİVERİSTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ ...acikarsiv.ankara.edu.tr/browse/24522/SukranSEKER.pdfmodifikasyonunun hücre adezyonunu arttırdığını; PLGA nanolif yüzey

77

Şekil 4.28.a. Kaplanmamış kristalin, b. 2-Merkaptoetanol ile kaplı kristalin CV

voltamogramı

Şekil 4.29.a. Kaplanmamış kristalin, b. 2-Merkaptoetilamin ile kaplı kristalin CV

voltamogramı

a

b

a

b

Page 93: ANKARA ÜNİVERİSTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ ...acikarsiv.ankara.edu.tr/browse/24522/SukranSEKER.pdfmodifikasyonunun hücre adezyonunu arttırdığını; PLGA nanolif yüzey

78

4.4 Faz Kontrast Mikroskobu Bulguları

Sıçan kemik iliği mezenkimal kök hücrelerinin, 1. Pasajdaki (10. günde) ve 3. pasajdaki

(10. günde) faz kontrast mikroskobu görüntüleri şekil 4.30’da verilmektedir. Hücrelerin

10-11 gün içerisinde %80-90 bolluk noktasına ulaştığı belirlendi. Fotoğraflarda

görüldüğü gibi 1. Pasajın 10. gününde hücrelerin küresel bir morfolojiye, sonraki

pasajlarda ise iğ şeklindeki karakteristik morfolojiye sahip oldukları görüldü.

Şekil 4.30.a. Sıçan kemik iliği mezenkimal kök hücrelerinin 1. Pasajın 10. gününde, b. 3. Pasajın 10. gününde elde edilen faz kontrast görüntüleri

A B

Page 94: ANKARA ÜNİVERİSTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ ...acikarsiv.ankara.edu.tr/browse/24522/SukranSEKER.pdfmodifikasyonunun hücre adezyonunu arttırdığını; PLGA nanolif yüzey

79

4.4 Hücre Adezyonu Bulguları

4.4.1 Altın ve alkantiyol tek tabaka yüzeyleri üzerine hücre adezyonu bulguları

Şekil 4.31.b’de kaplanmamış kristal yüzeyi (altın yüzey) üzerine birer saat aralıklarla

ilave edilen mezenkimal kök hücrelerinin, kuartz kristalin rezonans frekansında

meydana getirdiği değişim görülmektedir. Üç aşamalı hücre ilavesi sonrası kristalin

frekansında meydana gelen azalma, hücrelerin altın yüzey üzerine bağlandığını

göstermektedir. Şekilde görüldüğü gibi birinci aşamada ilave edilen MKH’ler, birinci

saatin sonunda ~48 Hz’lik bir frekans değişimine sebep olmaktadır. Sonraki aşamalarda

ilave edilen hücreler kristalin frekansında daha düşük miktarda değişime neden olduğu

ve dört saatin sonunda kristaldeki frekans değişiminin ~52 Hz olduğu kaydedilmiştir.

Şekil 4.31.a. Kaplanmamış kristal yüzeyi üzerine hücresiz besiyeri, b. hücreli besiyeri

enjeksiyonu sonrasında kristaldeki frekans değişimi

a

b

Page 95: ANKARA ÜNİVERİSTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ ...acikarsiv.ankara.edu.tr/browse/24522/SukranSEKER.pdfmodifikasyonunun hücre adezyonunu arttırdığını; PLGA nanolif yüzey

80

Farklı fonksiyonel gruplar bulunduran kristal yüzeyleri (sırasıyla –COOH, -OH, -NH2)

üzerinde hücrelerin bağlanma davranışları incelendi. İlk olarak, MKH’lerin 11-MUA ile

modifiye edilerek elektrot yüzeyinde -COOH fonksiyonel grubu oluşturulan yüzey

üzerine adezyonu eş-zamanlı olarak belirlendi (Şekil 4.32). Üç aşamada ilave edilen

hücrelerin, dört saatin sonunda kristalin frekansında ~ 82 Hz’lik bir azalmaya neden

olduğu belirlendi.

Şekil 4.32.a. 11-MUA ile kaplı yüzey üzerine hücresiz besiyeri, b. hücreli besiyeri enjeksiyonu sonrasında kristaldeki frekans değişimi

a

b

Page 96: ANKARA ÜNİVERİSTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ ...acikarsiv.ankara.edu.tr/browse/24522/SukranSEKER.pdfmodifikasyonunun hücre adezyonunu arttırdığını; PLGA nanolif yüzey

81

Şekil 4.33.a. 2-Merkaptoetanol ile kaplı yüzey üzerine hücresiz besiyeri, b. hücreli

besiyeri enjeksiyonu sonrasında kristaldeki frekans değişimi

Şekil 4.34.a. 2-Merkaptoetilamin ile kaplı yüzey üzerine hücresiz besiyeri, b. hücreli

besiyeri enjeksiyonu sonrasında kristaldeki frekans değişimi

a

b

a

b

Page 97: ANKARA ÜNİVERİSTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ ...acikarsiv.ankara.edu.tr/browse/24522/SukranSEKER.pdfmodifikasyonunun hücre adezyonunu arttırdığını; PLGA nanolif yüzey

82

Elde edilen grafiklerden (Şekil 4.33.b ve Şekil 4.34.b), 2-Merkaptoetanol (-OH) ve 2-

Merkaptoetilamin (-NH2) yüzeyleri üzerine MKH adezyonunun 11-MUA’e oranla daha

düşük seviyede olduğu (sırasıyla ~ 62 Hz ve ~ 68 Hz) görülmektedir. Elde edilen

sonuçlar kristal yüzeyinin modifikasyonunun hücre adezyonunu arttırdığını ve

MKH’lerin –COOH fonksiyonel grubuna sahip yüzeyler üzerine bağlanmaya daha daha

fazla ilgi gösterdiği belirlendi. Her bir yüzey üzerine hücre içermeyen besiyeri

enjeksiyonunun, kristallerin frekansında meydana getirdiği değişimlerin ihmal edilebilir

düzeyde olduğu görüldü.

4.4.2 PLGA nanolif ve PLGA film kaplı yüzeyler üzerine hücre adezyonu bulguları

Şekil 4.35.b’de PLGA nanolif ile kaplı kristal yüzeyi üzerine birer saat aralıklarla ilave

edilen mezenkimal kök hücrelerinin, kuartz kristalin rezonans frekansında meydana

getirdiği değişim görülmektedir. Üç aşamalı hücre ilavesi sonrası kristalin frekansında

meydana gelen azalma, hücrelerin yüzey üzerine bağlandığını göstermektedir. Grafikte

görüldüğü gibi birinci aşamada ilave edilen MKH’ler, birinci saatin sonunda ~80 Hz’lik

bir frekans değişimine neden olmuştur. Sonraki aşamalarda ilave edilen hücrelerin

kristalin frekansında daha düşük miktarda değişime neden olduğu ve dört saatin

sonunda kristaldeki frekans değişiminin ~125 Hz olduğu kaydedilmiştir.

Page 98: ANKARA ÜNİVERİSTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ ...acikarsiv.ankara.edu.tr/browse/24522/SukranSEKER.pdfmodifikasyonunun hücre adezyonunu arttırdığını; PLGA nanolif yüzey

83

Şekil 4.35.a. PLGA nanolif ile kaplı yüzey üzerine hücresiz besiyeri, b. hücreli besiyeri

enjeksiyonu sonrasında kristaldeki frekans değişimi

Şekil 4.36.b’de ise döndürerek kaplama yöntemi ile oluşturulan PLGA film yüzeyi

üzerindeki hücre adezyonu sonuçları görülmektedir. Grafikte görüldüğü gibi PLGA film

yüzeyi üzerine mezenkimal kök hücrelerinin adezyonu frekansta yaklaşık 40 Hz’lik bir

değişime neden olmuştur.

a

b

Page 99: ANKARA ÜNİVERİSTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ ...acikarsiv.ankara.edu.tr/browse/24522/SukranSEKER.pdfmodifikasyonunun hücre adezyonunu arttırdığını; PLGA nanolif yüzey

84

Şekil 4.36.a. PLGA film ile kaplı yüzey üzerine hücresiz besiyeri, b. hücreli besiyeri

enjeksiyonu sonrasında kristaldeki frekans değişimi

Hücresiz ölçümlerde, kristalin frekansında meydana gelen değişimler şekil 4.35.a ve

şekil 4.36.a’da görülmektedir. Frekans değişim sonuçlarına göre, besiyeri içerisinde

bulunan maddelerin, kristal yüzeyi üzerine adsorbe olduğu ve yüzeyin uygulanan

besiyeri akış hızında gerekli mekanik dayanımı gösterdiği belirlendi. Besiyeri içerisinde

bulunan maddelerin adsorpsiyonundan kaynaklanan değişimin (~ 2-3 Hz), kristal yüzeyi

üzerindeki hücre adezyonu sonuçlarıyla karşılaştırıldığında ihmal edilebilir düzeyde

olduğu görüldü.

4.4.3 PCL ve PS polimeri ile kaplı yüzeyler üzerine hücre adezyonu sonuçları

Şekil 4.37.b’de PCL ile kaplı kristal yüzeyi üzerine birer saat aralıklarla ilave edilen

mezenkimal kök hücrelerinin, kuartz kristalin rezonans frekansında meydana getirdiği

değişim görülmektedir. Hücre ilavesi sonrası kristalin frekansında meydana gelen

azalma, hücrelerin yüzey üzerine bağlandığını göstermektedir. Birinci aşamada ilave

a

b

Page 100: ANKARA ÜNİVERİSTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ ...acikarsiv.ankara.edu.tr/browse/24522/SukranSEKER.pdfmodifikasyonunun hücre adezyonunu arttırdığını; PLGA nanolif yüzey

85

edilen MKH’ler, ilk saatin sonunda ~110 Hz’lik bir frekans değişimine neden olmuştur.

Sonraki aşamalarda ilave edilen hücrelerin kristalin frekansında daha düşük miktarda

değişime neden olduğu ve dört saatin sonunda kristaldeki frekans değişiminin ~154 Hz

olduğu belirlenmiştir.

Şekil 4.37.a. PCL ile kaplı yüzey üzerine hücresiz besiyeri, b. hücreli besiyeri

enjeksiyonu sonrasında kristaldeki frekans değişimi

Şekil 4.37.a’da hücresiz ölçümde elde edilen frekans değişimi sonuçları görülmektedir.

Besiyeri içerisinde bulunan maddelerin adsorpsiyonundan kaynaklanan değişimin (~ 5

Hz), kristal yüzeyi üzerindeki hücre adezyonu sonuçlarıyla (Şekil 4.37.b)

karşılaştırıldığında ihmal edilebilir düzeyde olduğu görüldü.

Şekil 4.38.b’de PS ile kaplı kristal yüzeyi üzerine ilave edilen mezenkimal kök

hücrelerinin, kuartz kristalin rezonans frekansında meydana getirdiği değişim

görülmektedir. Hücre ilavesi sonrası kristalin frekansında meydana gelen azalma,

hücrelerin yüzey üzerine bağlandığını göstermektedir. Birinci aşamada ilave edilen

MKH’ler, ilk saatin sonunda ~115 Hz’lik bir frekans değişimine sebep olmaktadır.

a

b

Page 101: ANKARA ÜNİVERİSTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ ...acikarsiv.ankara.edu.tr/browse/24522/SukranSEKER.pdfmodifikasyonunun hücre adezyonunu arttırdığını; PLGA nanolif yüzey

86

Sonraki aşamalarda ilave edilen hücrelerin kristalin frekansında daha düşük miktarda

değişime neden olduğu ve dört saatin sonunda kristaldeki frekans değişiminin ~135 Hz

olduğu belirlendi.

Şekil 4.38.a. PS ile kaplı yüzey üzerine hücresiz besiyeri, b. hücreli besiyeri

enjeksiyonu sonrasında kristaldeki frekans değişimi

Şekil 4.38.a’da hücresiz ölçümde elde edilen frekans değişimi sonuçları görülmektedir.

Besiyeri içerisinde bulunan maddelerin adsorpsiyonundan kaynaklanan değişimin (~ 5-6

Hz), kristal yüzeyi üzerindeki hücre adezyonu sonuçlarıyla karşılaştırıldığında ihmal

edilebilir düzeyde olduğu görüldü.

4.4.4 PLL, kitosan, hyalüronik asit, kollajen ve alginat polimeri ile kaplı kristal yüzeyinin hücre adezyonu sonuçları

Şekil 4.39.b’de PLL ile kaplı kristal yüzeyi üzerine birer saat aralıklarla ilave edilen

mezenkimal kök hücrelerinin, kuartz kristalin rezonans frekansında meydana getirdiği

a

b

Page 102: ANKARA ÜNİVERİSTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ ...acikarsiv.ankara.edu.tr/browse/24522/SukranSEKER.pdfmodifikasyonunun hücre adezyonunu arttırdığını; PLGA nanolif yüzey

87

değişim görülmektedir. Hücre ilavesi sonrası kristalin frekansında meydana gelen

azalma, hücrelerin yüzey üzerine bağlandığını göstermektedir. Birinci aşamada ilave

edilen MKH’ler, ilk saatin sonunda ~90 Hz’lik bir frekans değişimine neden olmuştur.

Sonraki aşamalarda ilave edilen hücrelerin kristalin frekansında daha düşük miktarda

değişime neden olduğu ve dört saatin sonunda kristaldeki frekans değişiminin ~180 Hz

olduğu belirlenmiştir.

Şekil 4.39.a. PLL ile kaplı yüzey üzerine hücresiz besiyeri, b. hücreli besiyeri

enjeksiyonu sonrasında kristaldeki frekans değişimi

Şekil 4.39.a’da hücresiz ölçümde elde edilen frekans değişimi sonuçları görülmektedir.

Besiyeri içerisinde bulunan maddelerin adsorpsiyonundan kaynaklanan değişimin (~ 5

Hz), kristal yüzeyi üzerindeki hücre adezyonu sonuçlarıyla karşılaştırıldığında ihmal

edilebilir düzeyde olduğu görüldü.

a

b

Page 103: ANKARA ÜNİVERİSTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ ...acikarsiv.ankara.edu.tr/browse/24522/SukranSEKER.pdfmodifikasyonunun hücre adezyonunu arttırdığını; PLGA nanolif yüzey

88

Kitosan, hyalüronik asit, kollajen ve alginat polimeri ile kaplanan yüzey üzerine hücre

enjeksiyonu sonucunda kristaldeki frekans değişimleri Şekil 4.40, 4.41, 4.42 ve 4.43’de

verilmiştir. Çalışmanın bu aşamasında, deney sonrasında kristal yüzeyi üzerinde hücre

adezyonu gerçekleşmesine rağmen anlamlı bir frekans değişimi elde edilememiştir.

Şekil 4.40 Kitosan ile kaplı yüzey üzerine hücre enjeksiyonu sonrasında kristaldeki frekans değişimi

Page 104: ANKARA ÜNİVERİSTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ ...acikarsiv.ankara.edu.tr/browse/24522/SukranSEKER.pdfmodifikasyonunun hücre adezyonunu arttırdığını; PLGA nanolif yüzey

89

Şekil 4.41 Hyalüronik asit ile kaplı yüzey üzerine hücre enjeksiyonu sonrasında kristaldeki frekans değişimi.

Şekil 4.42 Kollajen ile kaplı yüzey üzerine hücre enjeksiyonu sonrasında kristaldeki frekans değişimi

Page 105: ANKARA ÜNİVERİSTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ ...acikarsiv.ankara.edu.tr/browse/24522/SukranSEKER.pdfmodifikasyonunun hücre adezyonunu arttırdığını; PLGA nanolif yüzey

90

Şekil 4.43 Alginat ile kaplı yüzey üzerine hücre enjeksiyonu sonrasında kristaldeki

frekans değişimi

4.5 Hücre-İlaç Etkileşimi ile İlgili Araştırma Bulguları

4.5.1 Faz kontrast mikroskobu bulguları

Şekil 4.44, 6 saatin sonunda artan kolsişin derişimine bağlı olarak mezenkimal kök

hücrelerinin morfolojilerinde meydana gelen değişimi göstermektedir. Şekilde

görüldüğü gibi 150 µM kolsişin konsantrasyonuna kadar hücrelerin morfolojilerinde

önemli bir değişim gözlenmezken, bu konsantrasyondan sonra hücrelerin yuvarlak bir

şekil almaya başladığı gözlendi. Daha yüksek ilaç konsantrasyonlarında ise hücre ölümü

sonucu hücrelerin kültür kabından ayrıldığı gözlendi. Faz kontrast mikroskobu

görüntülerinde görüldüğü gibi, normal hücreler tipik iğ şeklinde bir morfolojiye sahip

iken, anti-mikrotübül ilaçlarına maruz kalan hücrelerin yuvarlak bir şekil aldığı

görülmüştür

Page 106: ANKARA ÜNİVERİSTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ ...acikarsiv.ankara.edu.tr/browse/24522/SukranSEKER.pdfmodifikasyonunun hücre adezyonunu arttırdığını; PLGA nanolif yüzey

91

Şekil 4.44 Artan kolsişin derişimine bağlı olarak mezenkimal kök hücrelerinin morfolojilerinde meydana gelen değişimi gösteren faz kontrast mikroskobu görüntüleri a. Kontrol, b. 50 µM, c. 100 µM, d. 150 µM, e. 200 µM, f. 250 µM

A

F E

D C

B

Page 107: ANKARA ÜNİVERİSTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ ...acikarsiv.ankara.edu.tr/browse/24522/SukranSEKER.pdfmodifikasyonunun hücre adezyonunu arttırdığını; PLGA nanolif yüzey

92

Şekil 4.45 Artan vinorelbin derişimine bağlı olarak mezenkimal kök hücrelerinin morfolojilerinde meydana gelen değişimi gösteren faz kontrast mikroskobu görüntüleri a. Kontrol, b. 50 µM, c. 100 µM, d. 150 µM, e. 200 µM, f. 250 µM

A

F E

D C

B

Page 108: ANKARA ÜNİVERİSTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ ...acikarsiv.ankara.edu.tr/browse/24522/SukranSEKER.pdfmodifikasyonunun hücre adezyonunu arttırdığını; PLGA nanolif yüzey

93

Şekil 4.46 Artan vinblastin derişimine bağlı olarak mezenkimal kök hücrelerinin morfolojilerinde meydana gelen değişimi gösteren faz kontrast mikroskobu görüntüleri a. Kontrol, b. 50 µM, c. 100 µM, d. 150 µM, e. 200 µM, f. 250 µM

A

F E

D C

B

Page 109: ANKARA ÜNİVERİSTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ ...acikarsiv.ankara.edu.tr/browse/24522/SukranSEKER.pdfmodifikasyonunun hücre adezyonunu arttırdığını; PLGA nanolif yüzey

94

Şekil 4.45-4.46’da görüldüğü gibi, hücrelerin morfolojilerindeki değişimin 50 µM

vinorelbin ve vinblastin konsantrasyonunda başladığı görülmektedir. Bu

konsantrasyondan sonra hücrelerin yuvarlak bir şekil almaya başladığı görülmektedir.

Daha yüksek ilaç konsantrasyonlarında ise hücre ölümü sonucu hücrelerin kültür

kabından ayrıldığı gözlendi. Kontrol deneylerinde ise hücrelerin iğ şeklinde bir

morfolojiye sahip olduğu gözlendi.

4.5.2 MTT bulguları

4.5.2.1 Faz kontrast mikroskobu bulguları

Farklı konsantrasyonda ilaçlara 6 saat boyunca maruz bırakılan kemik iliği hücrelerinin

MTT boyamaları Şekil 4.47, 4.48 ve 4.49’da verilmiştir. Faz kontrast görüntüleri

incelendiğinde ilaç konsantrasyonun artmasıyla hücre canlılığının ve MTT reaktifinin

etkisiyle oluşan formazan kristallerinin azaldığı gözlendi. MTT sonuçlarına göre,

vinorelbin ve vinblastin’e maruz bırakılan hücrelerin, kolsişine kıyasla daha düşük

mitokondriyel aktiviteye sahip olduğu belirlendi.

Page 110: ANKARA ÜNİVERİSTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ ...acikarsiv.ankara.edu.tr/browse/24522/SukranSEKER.pdfmodifikasyonunun hücre adezyonunu arttırdığını; PLGA nanolif yüzey

95

Şekil 4.47 Artan konsantrasyonlarda kolsişin içeren besiyeri ile 6 saat muamele edilen mezenkimal kök hücrelerin MTT boyamalarının faz kontrast mikroskobu görüntüleri a. Kontrol, b. 50 µM, c. 100 µM, d. 150 µM, e. 200 µM, f. 250 µM

A

F E

D C

B

Page 111: ANKARA ÜNİVERİSTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ ...acikarsiv.ankara.edu.tr/browse/24522/SukranSEKER.pdfmodifikasyonunun hücre adezyonunu arttırdığını; PLGA nanolif yüzey

96

Şekil 4.48 Artan konsantrasyonlarda vinorelbin içeren besiyeri ile 6 saat muamele edilen mezenkimal kök hücrelerin MTT boyamalarının faz kontrast mikroskobu görüntüleri a. Kontrol, b. 50 µM, c. 100 µM, d. 150 µM, e. 200 µM, f. 250 µM

A

F E

D C

B

Page 112: ANKARA ÜNİVERİSTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ ...acikarsiv.ankara.edu.tr/browse/24522/SukranSEKER.pdfmodifikasyonunun hücre adezyonunu arttırdığını; PLGA nanolif yüzey

97

Şekil 4.49 Artan konsantrasyonlarda vinblastin içeren besiyeri ile 6 saat muamele edilen mezenkimal kök hücrelerin MTT boyamalarının faz kontrast mikroskobu görüntüleri a. Kontrol, b. 50 µM, c. 100 µM, d. 150 µM, e. 200 µM, f. 250 µM

A

F E

D C

B

Page 113: ANKARA ÜNİVERİSTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ ...acikarsiv.ankara.edu.tr/browse/24522/SukranSEKER.pdfmodifikasyonunun hücre adezyonunu arttırdığını; PLGA nanolif yüzey

98

4.5.2.2 MTT hücre canlılık testi sonuçları

Anti-mikrotübül ilaçlarının MKH canlılığı üzerine olan sitotoksik etkisini araştırmak

amacıyla yapılan MTT testi sonuçları Şekil 4.50-4.52’de verilmiştir. Her bir doz değeri

için hücre canlılığı hesaplanıp, konsantrasyona karşı grafiğe geçirilmiştir. Grafiklerde

her üç anti-mikrotübül ilacın hücre canlılığına etkisi doza bağlı olarak görülmektedir.

MTT testi ile ilaçların hücre canlılığı üzerine etkisi, hücre morfolojileri üzerine olan

etkileri ile paralellik göstermektedir. Sonuç olarak, kolsişin, vinorelbin ve vinblastin

ilaçlarının MKH hücrelerinin canlılığı üzerinde önemli derecede etkili olduğu belirlendi.

Şekil 4.50 Artan kolsişin miktarına bağlı olarak hücre canlılığında meydana gelen değişim

Page 114: ANKARA ÜNİVERİSTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ ...acikarsiv.ankara.edu.tr/browse/24522/SukranSEKER.pdfmodifikasyonunun hücre adezyonunu arttırdığını; PLGA nanolif yüzey

99

Şekil 4.51 Artan vinorelbin miktarına bağlı olarak hücre canlılığında meydana gelen değişim

Şekil 4.52 Artan vinblastin miktarına bağlı olarak hücre canlılığında meydana gelen değişim

Page 115: ANKARA ÜNİVERİSTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ ...acikarsiv.ankara.edu.tr/browse/24522/SukranSEKER.pdfmodifikasyonunun hücre adezyonunu arttırdığını; PLGA nanolif yüzey

100

Çizelge 4.3 Anti-mikrotübül ilaçlarının MKH’leri üzerindeki IC50 değerleri

Kolsişin için IC50 değeri 255 µM, vinorelbin için 116 µM ve vinblastin için 92 µM

olarak belirlenmiştir (Çizelge 4.3). Bu değerlere göre aynı konsantrasyondaki

vinblastinin, diğer iki ilaca göre daha toksik bir etkiye sahip olduğu belirlenmiştir.

4.5.3 KKM Bulguları

4.5.3.1 Kolsişin’in MKH üzerine etkisi

Şekil 4.53’te görüldüğü gibi akış ortamına hücre enjeksiyonu sonrasında kristalin

frekansında yaklaşık 260 Hz’lik bir azalma meydana geldi. Bu azalma hücrelerin kristal

yüzeyine bağlandığını ve yayıldığını göstermektedir. Hücrelerin yüzey üzerine

bağlanmasının ardından akış ortamına kolsişin’in ilave edilmesinden 6 saat sonra

frekansta, 150 µM için 45 Hz’lik, 300 µM için ise yaklaşık 65 Hz’lik bir azalma

gözlendi. Frekanslardaki bu azalma kolsişin’in, hücrelerin mikrotübüllerine

bağlandığını göstermiştir. Bu azalmanın ardından belli bir süre sonra frekansta 150 µM

için yaklaşık 24 Hz’lik bir artış meydana gelirken, 300 µM kolsişin için yaklaşık 60

Hz’lik bir artış gözlenmiştir. Deneyler sonunda kristallerin frekansında meydana gelen

bu artış, ilaç etkisiyle hücrelerin bir kısmının kristal yüzeyleri üzerinden ayrıldığını

göstermiştir.

İlaç IC 50 (µM)

Kolsişin 255 ± 47

Vinorelbin 116 ± 30

Vinblastin 92 ± 24

Page 116: ANKARA ÜNİVERİSTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ ...acikarsiv.ankara.edu.tr/browse/24522/SukranSEKER.pdfmodifikasyonunun hücre adezyonunu arttırdığını; PLGA nanolif yüzey

101

Şekil 4.53 Hücre ilavesi (1. ok) ve kolsişin ilavesi (2. ok) sonrası kristalin frekansında

meydana gelen değişim, ( --- 150 µM, --- 300 µM kolsişin)

Şekil 4.54 PS ile kaplı yüzey (hücresiz) üzerine kolsişin ilavesi sonrası kristalin

frekansında meydana gelen değişim

Page 117: ANKARA ÜNİVERİSTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ ...acikarsiv.ankara.edu.tr/browse/24522/SukranSEKER.pdfmodifikasyonunun hücre adezyonunu arttırdığını; PLGA nanolif yüzey

102

Şekil 4.54 ise kontrol deneyinin sonucunu göstermektedir. PS kaplı kristal yüzeyi

üzerine aynı koşullarda 300 µM kolsişin enjeksiyonu yapılarak frekansında meydana

gelen değişim 6 saat boyunca kaydedildi. Grafikte görüldüğü gibi hücre bulunmayan PS

yüzey üzerine kolsişin ilavesi frekansta yaklaşık 5-6 Hz’lik bir değişime sebep

olmuştur.

4.5.3.2 Vinorelbin’in MKH üzerine etkisi

Şekil 4.55, kemik iliği hücrelerinin vinorelbine cevabını göstermektedir. Akış ortamına

hücre enjeksiyonu sonucunda 250 Hz civarında bir azalma gözlenmiştir. PS yüzey

üzerine bağlanan hücreler üzerine 150 µM ve 300 µM konsantrasyonlarında vinorelbin

enjekte edildi ve bu enjeksiyondan 6 saat sonra frekanslarda 150 µM vinorelbin için 60

Hz’lik, 300 µM için 80 Hz’lik bir azalma meydana geldi. Frekanslardaki bu azalma

vinorelbin’in, hücrelerin mikrotübüllerine bağlandığını göstermiştir. İlaç

enjeksiyonundan 12 saat sonra ise sırasıyla 35 Hz ve 69 Hz civarında artışın meydana

gelmesi, vinorelbin etkisiyle hücrelerin kristal yüzeylerinden ayrıldığını göstermiştir.

Şekil 4.56’da görüldüğü gibi PS yüzey üzerine akış ortamında gönderilen 300 µM

vinorelbin, frekansta 4-5 Hz’lik bir azalmaya neden olmuştur.

Page 118: ANKARA ÜNİVERİSTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ ...acikarsiv.ankara.edu.tr/browse/24522/SukranSEKER.pdfmodifikasyonunun hücre adezyonunu arttırdığını; PLGA nanolif yüzey

103

Şekil 4.55 Hücre ilavesi (1. ok) ve vinorelbin ilavesi (2. ok) sonrası kristalin frekansında meydana gelen değişim, (--- 150 µM, --- 300 µM vinorelbin)

Şekil 4.56 PS ile kaplı yüzey (hücresiz) üzerine vinorelbin ilavesi sonrası kristalin frekansında meydana gelen değişim

Page 119: ANKARA ÜNİVERİSTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ ...acikarsiv.ankara.edu.tr/browse/24522/SukranSEKER.pdfmodifikasyonunun hücre adezyonunu arttırdığını; PLGA nanolif yüzey

104

4.5.3.3 Vinblastin’in MKH üzerine etkisi

Şekil 4.57, kemik iliği hücrelerinin vinblastin’e olan cevabını göstermektedir. Grafikten

görüldüğü gibi, hücre enjeksiyonu kristallerin frekansında 260 Hz’lik bir azalmaya

sebep olmuştur. Vinblastin enjeksiyonlarından 6 saat sonra ise frekanslarda yaklaşık 85

Hz (150 µM vinblastin için) ve 100 Hz (300 µM vinblastin için) civarında azalmalar

meydana geldi. Frekanslardaki bu azalma vinblastin’in, hücrelerin mikrotübüllerine

bağlandığını göstermiştir. Bu azalmanın ardından belli bir süre sonra frekansta 150 µM

vinblastin için 45 Hz, 300 µM vinblastin için 84 Hz artış gözlendi. Deney sonunda

kristallerin frekansında meydana gelen bu değişimler, ilaç etkisiyle hücrelerin bir

kısmının kristal yüzeyi üzerinden ayrıldığını göstermiştir.

Şekil 4.57 Hücre ilavesi (1. ok) ve vinblastin ilavesi (2. ok) sonrası kristalin frekansında meydana gelen değişim, (--- 150 µM, --- 300 µM vinblastin)

Page 120: ANKARA ÜNİVERİSTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ ...acikarsiv.ankara.edu.tr/browse/24522/SukranSEKER.pdfmodifikasyonunun hücre adezyonunu arttırdığını; PLGA nanolif yüzey

105

Şekil 4.58 PS ile kaplı yüzey (hücresiz) üzerine vinblastin ilavesi sonrası kristalin frekansında meydana gelen değişim

Şekil 4.58 kontrol deneyinin sonucunu göstermektedir. PS yüzey üzerine vinblastin

ilavesi, kristalin frekansında 3-4 Hz’lik değişime sebep olmuştur.

Page 121: ANKARA ÜNİVERİSTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ ...acikarsiv.ankara.edu.tr/browse/24522/SukranSEKER.pdfmodifikasyonunun hücre adezyonunu arttırdığını; PLGA nanolif yüzey

106

Şekil 4.59 Kristal yüzeyindeki hücreler üzerine DMSO enjeksiyonu sonucu kristalin frekansında meydana gelen değişim

Şekil 4.59, kemik iliği hücrelerinin DMSO’ya olan cevabını göstermektedir. Akış

ortamına hücre enjeksiyonu sonucunda, kristalin frekansında 260 Hz civarında bir

azalma gözlendi. Ardından PS yüzey üzerine bağlanan hücreler üzerine, akış ortamına

ilave edilen ilaç ile aynı hacimde DMSO enjekte edildi. Bu enjeksiyon sonucunda

kristalin frekansında yaklaşık olarak 10 Hz’lik bir değişim gözlendi.

Page 122: ANKARA ÜNİVERİSTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ ...acikarsiv.ankara.edu.tr/browse/24522/SukranSEKER.pdfmodifikasyonunun hücre adezyonunu arttırdığını; PLGA nanolif yüzey

107

5. TARTIŞMA ve SONUÇ

Bu çalışmada, sıçan kemik iliği mezenkimal kök hücrelerinin farklı malzemeler üzerine

bağlanma oranlarının; vinblastin, vinorelbin ve kolsişin gibi farklı anti-mikrotübül

ilaçları ile etkileşimlerinin, kuartz kristal mikrobalans sistemi ile eş zamanlı olarak

belirlenebildiği bir sistemin geliştirilmesi amaçlanmıştır. Kuartz kristallerin kaplanması

çalışmalarında, kendiliğinden düzenlenen tek tabaka yöntemi, elektroeğirme yöntemi,

döndürerek kaplama yöntemi ve damlatma yöntemi kullanılmıştır. Çalışma genel olarak

iki aşamada gerçekleştirilmiştir. Çalışmanın ilk aşamasını, mezenkimal kök hücrelerinin

farklı malzemeler üzerindeki bağlanma oranlarının incelendiği hücre-malzeme

etkileşimi deneyleri; çalışmanın ikinci aşamasını ise, kristal yüzeyi üzerinde bulunan

hücrelerin belirli dozlarda anti-mikrotübül ilaçları ile olan etkileşimlerinin incelendiği

hücre-ilaç etkileşimi deneyleri oluşturmaktadır.

Hücre-malzeme etkileşiminin incelendiği deneylerde, hücre enjeksiyonuyla zamanla

frekansta meydana gelen azalma, hücrelerin yüzey üzerine bağlandığını göstermektedir.

Hücre-yüzey etkileşiminin incelendiği bu deneylerde hücre süspansiyonu birer saat

aralıklarla üç aşamada ilave edilmiştir. Her hücre ilavesi sonrasında, akış ortamındaki

hücre sayısının artmasıyla frekansta belli bir oranda azalma meydana gelmiş olup, dört

saatin sonunda frekans değeri sabit bir değere ulaşmıştır. Elde edilen frekans değişimi

grafikleri sonucunda, akış ortamına yapılan ilk hücre enjeksiyonundan sonra, kristalin

frekansında meydana gelen azalmanın, 2. ve 3. enjeksiyonlara oranla daha fazla olduğu

gözlenmiştir (Şekil 4.31-4.39).

Son yıllarda, çeşitli substrat yüzeyleri üzerinde, yüzey aktif organik moleküller

kullanılarak oluşturulan kendiliğinden düzenlenen tek tabakalar, biyoteknolojik alanda

önemli potansiyel uygulamaları nedeniyle oldukça fazla ilgi çekmektedir. Silikon

yüzeyler üzerinde silanlar, metaloksitler üzerinde yağ asitleri ve soy metaller üzerinde

tiyoller veya disülfitler gibi tek tabakalar, bu yöntem ile hazırlanan yüzeylerdir. Bunlar

arasında altın üzerinde alkantiyoller, kontrol edilebilen kalınlık ve istenilen fonksiyona

sahip tek tabakalar oluşturabilmek için mükemmel model sistemler olarak ortaya

Page 123: ANKARA ÜNİVERİSTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ ...acikarsiv.ankara.edu.tr/browse/24522/SukranSEKER.pdfmodifikasyonunun hücre adezyonunu arttırdığını; PLGA nanolif yüzey

108

çıkmıştır. Çeşitli amaçlar için tiyol moleküllerinin yüzey özellikleri, alkil zincirin

sonuna bağlı uç grupların kimyasal yapısı değiştirilerek kolayca dizayn

edilebilmektedir.

Kendiliğinden düzenlenen tek tabaka yöntemi, biyomalzeme araştırma çalışmalarında,

kullanım amacına göre farklı özelliklere sahip (hidrofobik ya da hidrofilik, yüzey yükü,

yüzey topografisi vb.) termodinamik olarak kararlı yüzeylerin elde edilmesinde yaygın

olarak kullanılan bir yöntemdir (Chaki vd. 2001). Bu yöntemin en önemli

avantajlarından biri, oldukça basit olması ve tiyol çözeltilerinin düşük

konsantrasyonlarının modifikasyon için yeterli olmasıdır. Oluşturulan tek tabakaların

elektrokimyasal karakterizasyonu için dönüşümlü voltametri ya da impedans ölçümleri

gibi teknikler kullanılmaktadır (Ganesh vd. 2006).

Şekil 4.27, 4.28 ve 4.29, modifikasyon öncesi ve sonrası Fe(CN)6-3 çözeltisinde

kaydedilen dönüşümlü voltamogramlarını göstermektedir. Modifiye filmler için

Fe(CN)6-3 çözeltisinde Ag/AgCl referans elektrota karşın +500 ve -500 mV

potansiyelleri arasında kaydedilen voltamogramlar, yüzey modifikasyonunun, elektrot

yüzeyindeki elektron transferini engelleyerek bu redoks türünün dönüşümlü

elektrokimyasal davranışını (elektron transferini) bloke ettiğini göstermektedir.

Modifiye kristallerin CV voltamogramları, kaplanmamış kristalin voltamogramı ile

karşılaştırıldığında; altın yüzeyin iletkenliğinin (kaplanmamış kristal), modifiye

yüzeylerin iletkenliğinden daha az olması, kristal yüzeylerinin kaplanmış olduğunu

doğrulamaktadır. Bu durum AFM görüntülerini destekler bir şekilde, tiyol filmlerinin

düzenli ve sıralı yapıda olmasıyla açıklanabilmektedir. Ayrıca, uzun zincirli alkil tek

tabakanın (11-MUA), kısa zincirli tek tabakalara (2-Merkaptoetanol, 2-

Merkaptoetilamin) kıyasla daha etkili bariyer özellik sergilediği görülmüştür. CV

voltamogramları karşılaştırıldığında, alkantiyol tek tabaka yüzeylerin, altın yüzeye

kıyasla daha az akım yoğunluğuna sahip olması, yüzeylerin düzgün bir şekilde

kaplandığını göstermektedir.

Page 124: ANKARA ÜNİVERİSTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ ...acikarsiv.ankara.edu.tr/browse/24522/SukranSEKER.pdfmodifikasyonunun hücre adezyonunu arttırdığını; PLGA nanolif yüzey

109

Kristal yüzeyi üzerinde 11-MUA, 2-Merkaptoetanol ve 2-Merkaptoetilamin filmlerinin

AFM görüntüleri, referans yüzey olarak alınan kaplanmamış altın yüzeyin AFM

görüntüsü ile karşılaştırıldığında, modifiye yüzeylerin tamamen kaplandığı

belirlenmiştir. Modifiye yüzeylerin AFM görüntüleri, tiyol moleküllerinin altın yüzey

üzerinde düzenli ve sıralı bir şekilde biriktiğini göstermiştir.

Çalışmada kendiliğinden düzenlenen tek tabaka yöntemi kullanılarak –COOH, -OH ve

–NH2 fonksiyonel uç gruplarına sahip yüzeyler oluşturulmuştur. Boş altın yüzey ve

oluşturulan modifiye yüzeyler üzerine hücre adezyonunun, KKM sistemi ile incelendiği

deneylerde elde edilen sonuçlar; kristal yüzeyinin modifikasyonunun hücre adezyonunu

arttırdığı ve MKH’lerin –COOH fonksiyonel grubuna sahip yüzeyler üzerine bağlanma

oranının daha fazla olduğunu gösterdi.

Kuartz kristallerin PLGA polimeri ile kaplanmasında iki farklı teknik kullanılmıştır.

Kristaller birinci yöntemde döndürerek kaplama tekniği ile kaplanarak yüzey üzerinde

ince bir PLGA film tabakası oluşturulmuştur. İkinci yöntemde ise, kristaller

elektroeğirme sistemi kullanılarak PLGA nanolif ile kaplanmıştır. Döndürerek kaplama

yöntemiyle elde edilen PLGA film yüzeyinin ve PLGA’nın elektroeğirme sistemine

uygulanması ile elde edilen nanolif membranların AFM görüntüleri sırasıyla şekil 4.9

ve şekil 4.11’de verilmiştir. Şekil 4.10’da görüldüğü gibi PLGA film yüzeyi üzerinde

farklı boyutlara sahip düzensiz ve rastgele polimer kümeleri oluşmuştur. PLGA

nanolifler elektroeğirme tekniği kullanılarak, kristal yüzeyi üzerinde belirli bir kalınlığa

kadar biriktirilmiştir. Hazırlanan PLGA nanolif membranın AFM görüntüsüne

bakıldığında, nanoliflerin birbirleri üzerindeki yönelmeleri, hücre tutunması ve

yayılmasına elverişli gözenekli yapıları açık bir şekilde görülmektedir.

Elektroeğirme tekniği, oldukça ince polimer lifler hazırlamak amacıyla yaygın olarak

kullanılan bir tekniktir Elektroeğirme yöntemi ile, geniş yüzey alanına ve kontrollü

gözenek boyutuna sahip nanolifler kolaylıkla üretilebilmektedir (Ramakrishna vd 2003).

Biyomalzeme çalışmalarında nanoliflerin tercih edilmesinin en önemli avantajı, hücre

adezyonunda önemli rol oynayan gözenekli bir yüzey topografisine sahip olmalarıdır

Page 125: ANKARA ÜNİVERİSTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ ...acikarsiv.ankara.edu.tr/browse/24522/SukranSEKER.pdfmodifikasyonunun hücre adezyonunu arttırdığını; PLGA nanolif yüzey

110

(Şekil 4.11). Çalışmada, hazırlanan PLGA nanolif ve PLGA film ile kaplı kristal

yüzeyleri üzerine mezenkimal kök hücrelerinin bağlanma oranları KKM sistemi ile

incelenmiştir. Bu iki yüzey için elde edilen frekans değişim grafikleri (Şekil 4.35-Şekil

4.36) incelendiğinde, PLGA nanolif yüzey üzerindeki hücre adezyonunun, PLGA film

yüzey üzerindeki hücre adezyonundan daha fazla olduğu görülmektedir.

Çalışmada kristal yüzeyi suda çözünen polimerlerden olan PLL polimeri ile

kaplanmıştır. PLL polimeri pozitif yüklüdür ve polimer yüzeyine hücrelerin bağlanması,

hücre yüzeyinde bulunan polisakkaritler ve negatif yüklü lipitlerle olan etkileşimler

sonucu gerçekleşmektedir (Frey ve Corn 1996). Bu etkileşimler hücrelerin yüzeye

bağlanma kapasitesinin artmasına neden olmaktadır. PLL polimeri ile elde edilen

sonuçlar (Şekil 4.39) ve kaplanmamış altın yüzey üzerinde elde edilen sonuçlar (Şekil

4.31) karşılaştırıldığında, hücre adezyonunun PLL yüzey üzerinde daha fazla olduğu

belirlenmiştir.

Çalışılan her kristal yüzeyi için dinamik modda alınan AFM görüntüleri Şekil 4.1-

4.26’da verilmiştir. Bu görüntüler örneklerin yüzey yapılarını ve yüzey pürüzlülüğünü

ortaya koymaktadır. AFM ölçümlerinden elde edilen yüzey rms değerleri, yüzey

pürüzlülüğünün en önemli göstergesidir. Yüzeyin rms değerinin yüksek olması, yüzey

pürüzlülüğünün fazla olduğunu göstermektedir. Kaplı yüzeylerin rms değerleri

kaplanmamış altın yüzeyin rms değeri ile karşılaştırıldığında, yüzey kaplamaları

sonrasında pürüzlülüğün arttığı gözlenmiştir (Çizelge 4.2). Kaplı yüzeyler arasında

PLGA nanolif kaplı yüzeyin ölçülen rms değeri, örneğin oldukça yüksek bir yüzey

pürüzlülüğüne sahip olduğunu göstermiştir. Aynı zamanda, PS polimerinin yüzey

pürüzlülüğünün, diğer polimer kaplamaların yüzey pürüzlülüğünden daha fazla olduğu

belirlenmiştir.

Çalışmada kaplı kristal yüzeyleri için kontrol deneyleri gerçekleştirilmiştir. Bu amaçla

yüzeyler hücre içermeyen besiyeri ile aynı koşullarda muamele edilmiştir. Hücresiz

yapılan deneyler sonucunda yüzeylerin uygulanan besiyeri akış hızında gerekli mekanik

dayanımı gösterdikleri belirlenmiştir. Aynı zamanda bu deneyler sonucunda elde edilen

Page 126: ANKARA ÜNİVERİSTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ ...acikarsiv.ankara.edu.tr/browse/24522/SukranSEKER.pdfmodifikasyonunun hücre adezyonunu arttırdığını; PLGA nanolif yüzey

111

frekans değişimi sonuçları, besiyeri içerisinde bulunan maddelerin, kristal yüzeyleri

üzerine adsorbe olduğunu; besiyeri içerisinde bulunan maddelerin adsorpsiyonundan

kaynaklanan değişimin (~6-10 Hz), kristal yüzeyi üzerindeki hücre adezyonu

sonuçlarıyla karşılaştırıldığında ihmal edilebilir düzeyde olduğunu göstermiştir.

Çalışmada doğal polimer sınıfından olan kitosan, hyalüronik asit, kollajen ve alginat

polimerleri kullanılarak kristal yüzeyleri kaplanmıştır. Doğal polimerlerin

biyouyumluluk özellikleri bu polimerlerin doku mühendisliği ve biyomalzeme

alanındaki kullanım yaygınlığını arttırmıştır. Doğal polimerlerin bu özelliklerine

rağmen, hidrojel yapıda olmalarından ve dolayısıyla su tutma özelliklerinin

bulunmasından dolayı, KKM ölçümlerinde anlamlı bir frekans değişimi elde

edilememiştir. Aynı zamanda yumuşak polimer kaplamalarda kristaldeki akustik enerji

kaybı, sert polimerlere oranla daha fazladır. Bunun sonucu olarak, sensörün hassasiyeti

yumuşak polimer kaplamalara oranla daha azdır (Lucklum ve Hauptmann 2000). Hücre

adezyonu deneyleri sonrasında, kristal yüzeyleri üzerinde hücre adezyonunun

gerçekleşmesine rağmen geçerli frekans değişim grafikleri elde edilememiştir.

Genel olarak hücre tipi ve kaplama malzemesinin yapısı kristalin frekans cevabını

etkilemektedir (Marxer vd. 2003). Hücre sensörü çalışmalarında kristalin frekansında

belli bir artışın meydana gelmesinin birçok sebebi bulunmaktadır. Kaplama

malzemesinin kristal yüzeyi üzerinden ayrılması, hücrelerin kaplama malzemesi ile

etkileşerek, malzemenin vizkoelastik özelliğininin değişimine sebep olması; hücrelerin

kısmen yüzeye bağlanıp, yüzeyden tekrar geri ayrılması gibi durumlar, kristaldeki

frekans artışına sebep olarak gösterilmektedir (Marxer vd. 2003, Fohlerová vd. 2007).

Hücre-ilaç etkileşiminin incelendiği çalışmalarda kristal yüzeyi PS polimeri ile

kaplanmıştır. PS polimeri, inert, ucuz ve kolay bulunabilir bir malzeme olmasından

dolayı çalışmalarda yaygın olarak kullanılmaktadır. PS yapısal olarak hidrofobik

özelliğe sahiptir. PS polimeri ile hazırlanan membranlar, çeşitli yöntemlerle modifiye

edilerek, hücre adezyonu için uygun hale getirilmektedir (Curtis vd. 1983). Bu

yöntemlerden biri yüzeyin belirli bir süre ultraviyole (UV) ışığa maruz bırakılmasıdır.

Page 127: ANKARA ÜNİVERİSTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ ...acikarsiv.ankara.edu.tr/browse/24522/SukranSEKER.pdfmodifikasyonunun hücre adezyonunu arttırdığını; PLGA nanolif yüzey

112

PS, UV ışığın etkisiyle oksidasyona uğrayarak hidrofilik özellik kazanmaktadır. PS

yüzeye hücre adezyonunun incelendiği bazı çalışmalarda hidrofobik özellikte olan PS

yüzey UV ışığa belirli süre maruz bırakılarak hidrofilik hale getirilmiştir (Fredriksson

vd. 1998, Lord vd. 2006).

Farklı anti-mikrotübül ilaçları ile etkileştirilen mezenkimal kök hücrelerinin in vitro

ortamda hücre canlılığını incelemek amacıyla, hücreler farklı dozlarda kolsişin,

vinorelbin ve vinblastin ilaçlarıyla etkileştirilmiştir. Anti-mikrotübül ilaçlarının

hücrelerin mikrotübüllerine farklı mekanizmalarla bağlanarak, mikrotübül

fonksiyonlarını bozup, mitoz bölünmeyi durdurma potansiyelleri bulunmaktadır.

Çalışmada ilk olarak, ilaçların hücreler üzerindeki bu etkisi ışık mikroskobu ile

incelenmiştir. Işık mikroskobu görüntüleri hücrelerin artan ilaç konsantrasyonunda

yuvarlak bir morfolojiye sahip olduğunu göstermiştir (Şekil 4.44, 4.45 ve 4.46).

Gözlenen yuvarlak morfoloji hücrelerin yüzey ile bağlantılarının zayıflamış olduğunu

göstermektedir. Yüksek dozlarda ise, hücrelerin nekrotik hücre görünümünde daha

şişkin bir görünüme sahip olduğu belirlenmiştir. Gözlenen morfolojik değişimlerin,

vinblastin ve vinorelbin ilaçları için benzer olduğu gözlenirken, kolsişin’in diğer ilaçlara

göre daha az toksik etki gösterdiği belirlenmiştir.

MTT testi hücrelerin canlılık ve çoğalma oranları hakkında bilgi veren kolorimetrik bir

yöntemdir. Metabolik aktivitesini koruyan sağlıklı hücreler tarafından sarı renkli MTT

reaktifinin indirgenerek, lacivert-mor renkli formazan kristallerinin oluşması prensibine

dayanmaktadır. Bu test farklı dozlarda anti-mikrotübül ilaçlarına maruz bırakılan

mezenkimal kök hücrelerin canlılığı hakkında bilgi vermektedir. Işık mikroskobu

görüntüleri incelendiğinde oluşan formazan kristallerinin yoğunluğunun artan ilaç

konsantrasyonlarıyla azaldığı gözlenmiştir (Şekil 4.47, 4.48 ve 4.49). Aynı

konsantrasyonda kolsişine maruz bırakılan hücrelerin vinorelbin ve vinblastin’e maruz

bırakılan hücrelere oranla daha fazla formazan kristalleri oluşturdukları görülmüştür.

Hücrelerin ilaç yanıtlarının belirlenmesinde biyosensör sistemlerinin kullanılmasının

önemli avantajları bulunmaktadır. KKM hücre biyosensörünün en önemli özelliği

Page 128: ANKARA ÜNİVERİSTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ ...acikarsiv.ankara.edu.tr/browse/24522/SukranSEKER.pdfmodifikasyonunun hücre adezyonunu arttırdığını; PLGA nanolif yüzey

113

kompleks hücre cevaplarının eş zamanlı olarak görüntülenebilmesidir. Diğer önemli bir

avantajı ise, herhangi bir işaretleme işleminin yapılmasına gerek duyulmamasıdır.

Çalışmanın ikinci aşamasında, mezenkimal kök hücrelerinin anti-mikrotübül ilaçlarına

olan cevabı KKM sistemi ile incelenmiştir.

Anti-mikrotübül ilaçlarının mezenkimal kök hücreler üzerine olan sitotoksik etkileri

konsantrasyona bağımlı olarak ortaya çıkmıştır (Şekil 4.50, 4.51 ve 4.52). IC50 değeri

ortamdaki anti-mikrotübül ilaçlarının, hücre canlılığını %50 inhibe ettiği konsantrasyon

olarak tanımlanmaktadır. Kullanılan ilacın IC50 değerinin düşük olması ilacın

toksisitesinin fazla olduğunu göstermektedir. MTT deneylerinde ölçülen absorbans

değerleri, kullanılan ilaç konsantrasyonlarına karşı grafiğe geçirilmiştir. Elde edilen bu

grafikleriden yararlanılarak, her ilaç için IC50 değeri hesaplanmıştır. Anti-mikrotübül

ilaçlarının mezenkimal kök hücreler üzerine etki derecesini belirlemek amacıyla

hesaplanan IC50 değerleri incelendiğinde; ilaçların farklı derecelerde toksisiteye neden

olduğu ve vinblastin’in, kolsişin ve vinorelbin’den daha fazla toksik etkiye neden

olduğu belirlenmiştir (Çizelge 4.3). Artan ilaç miktarına bağlı olarak hücre canlılığında

meydana gelen değişimler incelendiğinde, elde edilen bu sonuçların, ışık mikroskobu

görüntüleri ile paralellik gösterdiği görülmüştür.

Hücre-ilaç etkileşiminin KKM sistemi ile incelendiği çalışmalarda, ilk olarak akış

ortamına mezenkimal kök hücre çözeltisi enjekte edilerek, hücrelerin kristal yüzeyi

üzerine bağlanmaları sağlanmıştır. Hücre ilavesinden yaklaşık 20 saat sonra, kristalin

frekansı sabit bir değere ulaşmıştır. Bu zaman noktasından sonra ortama farklı iki dozda

(150 µM ve 300 µM) ilaç enjeksiyonu yapılarak, hücrelerin vinorelbin, vinblastin ve

kolsişin ilaçlarına olan cevabı, kristalin frekansında meydana gelen değişimler

kaydedilerek görüntülenmiştir (Şekil 4.53, 4.55 ve 4.57). Grafiklerde görüldüğü gibi

ilaç ilavesinin ardından ilk 6 saat içinde frekans değerinin azaldığı gözlenmiş ve her bir

ilaç için kristalin frekans değişimlerinin farklı olduğu görülmüştür. Frekansta meydana

gelen bu azalma anti-mikrotübül ilaçlarının, hücrelerin mikrotübüllerine

bağlanmasından ve bu bağlanma sonucu aktin flamentlerinin ve gerilim fiberlerinin

oluşmasından kaynaklanmaktadır (Marx vd. 2007). 6 saat sonrasında, kristalin

Page 129: ANKARA ÜNİVERİSTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ ...acikarsiv.ankara.edu.tr/browse/24522/SukranSEKER.pdfmodifikasyonunun hücre adezyonunu arttırdığını; PLGA nanolif yüzey

114

frekansında belli bir artışın meydana geldiği gözlenmektedir. İlaçların etkisiyle

hücrelerin apoptozise uğraması ve kristal yüzeyi üzerinde bulunan bu hücrelerin

yüzeyden ayrılması frekans artışının sebebi olarak görülmektedir (Braunhut vd. 2005).

Vinblastin enjeksiyonuyla kristalin frekansında meydana gelen artışın, vinorelbin ve

kolsişine göre daha fazla olduğu belirlenmiştir. 150 µM ilaç enjeksiyonu, 300 µM ilaç

enjeksiyonu ile karşılaştırıldığında; elde edilen grafikler, frekansların artan ilaç dozuna

bağlı olarak anlamlı değişimler gösterdiğini ifade etmektedir. Elde edilen grafiklere

bakıldığında, hücrelerin bu ilaçlara cevap zamanının yaklaşık 6 saat olduğu

görülmüştür. KKM sistemi ile elde edilen bu sonuçlar MTT testi ve faz kontrast

mikroskobu sonuçları ile doğrulanmıştır.

Hücre-ilaç etkileşiminin incelendiği çalışmalarda, iki kontrol deneyi gerçekleştirilmiştir.

Birinci kontrol deneylerinde, hücre bulunmayan PS yüzey üzerine ilaç enjeksiyonu

yapılarak her bir ilaç molekülünün PS yüzey üzerine bağlanma oranları incelenmiştir.

Şekil 4.54, 4.56 ve 4.58’de görüldüğü gibi önemli bir frekans değişimi (4-7 Hz)

gözlenmemiştir. İkinci kontrol deneyinde ise kristal yüzeyinde bulunan hücreler üzerine

ilaç içermeyen DMSO çözeltisi aynı hacimde eklenerek frekans değişimi

kaydedilmiştir. DMSO enjeksiyonuyla frekansta meydana gelen yaklaşık 10 Hz’lik

değişimin (Şekil 4.59), ilaç enjeksiyonu sonucu meydana gelen frekans değişimleri

(Şekil 4.53, 4.55 ve 4.57) ile kıyaslandığında; DMSO’nun eklenen miktarının hücreler

üzerine önemli bir derecede etkisinin olmadığı belirlenmiştir.

Sonuç olarak, kuartz kristal mikrobalans sisteminin, mezenkimal kök hücrelerinin farklı

yüzeylere bağlanmasının ve anti-mikrotübül ilaçlarına verdikleri cevapların eş zamanlı

görüntülenmesi için uygun bir sistem olduğu görülmüştür. Yukarıdaki verilerle

desteklenen bu yaklaşım, yeni ilaçların kemoterapötik aktivitelerinin farklı hücre türleri

üzerine etkilerinin eş zamanlı olarak incelenebilmesine olanak sağlamaktadır. Ayrıca,

integrinler, hücre iskeleti ya da hücre dışı matrikse bağlanarak etki gösteren bazı

moleküllerin (ilaçlar, proteinler, büyüme faktörleri gibi…) hücrelerle etkileşiminin,

geliştirilen bu biyosensör ile analizinin mümkün olabileceği düşünülmektedir.

Page 130: ANKARA ÜNİVERİSTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ ...acikarsiv.ankara.edu.tr/browse/24522/SukranSEKER.pdfmodifikasyonunun hücre adezyonunu arttırdığını; PLGA nanolif yüzey

115

KAYNAKLAR

Babacan, S., Pivarnik, P., Letcher, S. and Rand, A.G. 2000. Evaluation of antibody

immobilization methods for piezoelectric biosensor application. Biosensor&

Bioelectronics, Vol. 15, pp 615-621.

Ben-Chetrit, E., Bergmann S. and Sood R. 2006. Mechanism of the anti-inflamatory

effect of colchicine in rheumatic disease:a possible new outlook through

microarray analysis. Rheumatology, Vol. 45, pp 274–282.

Braunhut, S.J., McIntosh, D., Vorotnikova, E., Zhou, T. and Marx, K.A. 2005.

Detection of apoptosis and drug resistance of human breast cancer cells to

taxane treatments using quartz crystal microbalance biosensor technology.

ASSAY and Drug Development Technologies, Vol. 3, pp 77-88.

Bunde, R.L., Jarvi, E.J. and Rosentreter, J.J. 1998. Piezoelectric quartz crystal

biosensors. Talanta, Vol. 46, pp 1223-1236.

Chaki, N.K., Aslam, M., Sharma J. and Vijayamohanan K. 2001. Applications of self-

assembled monolayers in materials chemistry. Proc. Indian Acad. Sci.

(Chem. Sci.), Vol. 113, pp 659–670.

Chang, M.S. and Shih, J.S. 2000. Fullerene-cryptand-coated piezoelectric crystal

membrane glucose enzyme sensor. Sensors and Actuators B, Vol. 67, pp

275-281.

Chao, Y.C. and Shih, J. S. 1998. Adsorption study of organic molecules on fullerene

with piezoelectric crystal detection system. Analytica Chimica Acta, Vol.

374, pp 39-46.

Checchi, P.M., Nettles, J.H., Zhou, J., Snyder, J.P. and Joshi, H.C. 2003. Microtubule-

interacting drugs for cancer treatment. Trends in Pharmacological Sciences,

Vol. 24, pp 361-365.

Chou, S.F., Hsu, W.L., Hwang, J.M. and Chen, C.Y. 2002. Determination of α-

Fetoprotein in human serum by a quartz crystal microbalance-based

immunosensor. Automation and Analitical Techniques, 48:6, pp 913-918.

Page 131: ANKARA ÜNİVERİSTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ ...acikarsiv.ankara.edu.tr/browse/24522/SukranSEKER.pdfmodifikasyonunun hücre adezyonunu arttırdığını; PLGA nanolif yüzey

116

Chuang, C.W. and Shih, J.S. 2001. Preparation and application of immobilized C60-

glucose oxidase enzyme in fullerene C60-coated piezoelectric quartz crystal

glucose sensor. Sensors and Actuators B, Vol. 81, pp 1-8.

Curtis, A.S.G., Forrester, J.V., Mclnnes, C. and Lawrie, F. 1983. Adhesion of Cells to

Polystyrene Surfaces. The Journal of Cell Biology, Vol. 97, pp 1500-1506.

Darka, Ö. 2003. Hücre Adezyon Molekülleri ve Enflamasyondaki Rolleri. T Klin

Mikrobiyoloji Enfeksiyon, Vol. 2, pp 36-43.

Ding, B., Kima, J., Miyazaki, Y. and Shiratori, S. 2004. Electrospun nanofibrous

membranes coated quartz crystal microbalance as gas sensor for NH3

detection. J. Sens. Actuators B, Vol. 101, pp 373–380.

Drukman, S. and Kavallaris, M. 2002. Microtubule alterations and resistance to tubulin-

binding agents. Int. J. Oncol. Vol. 21, pp 621–628.

Ergüler, G., Demir, N. and Demir, R. 2002. Structural properties and functions of

adhesion molecules. T Klin J Med Sci., Vol. 22, pp 313-327.

Faccio, M., Feri G., Mancini, F. and Di Rosa, P. 1995. Resonating quartz

sensors.Sensors for Domestic Applications. Eds. D’Amico A. And

Sberveglieri G., WSP, Italy, pp.71-86.

Flack, W., Soong, D., Bell, A. and Hess, D. 1984. A mathematical model for spin

coating polymer resists. J. Appl. Phys., Vol. 56, pp 1199.

Fohlerová, Z., Skládal, P. and Turánek, J. 2007. Adhesion of eukaryotic cell lines on the

gold surface modified with extracellular matrix proteins monitored by the

piezoelectric sensor. Biosensors and Bioelectronics, Vol. 22, pp 1896–1901.

Fredriksson, C., Khilman, S., Kasemo, B. and Steel, D.M. 1998. In vitro real-time

characterization of cell attachment and spreading. J Mater Sci Mater Med.

9(12), pp 785-788.

Fredriksson, C., Kihlman, S., Rodahl, M. and Kasemo, B. 1998. The Piezoelectric

Quartz Crystal Mass and Dissipation Sensor: A Means of Studying Cell

Adhesion. Langmuir, Vol. 14, pp 248-251.

Page 132: ANKARA ÜNİVERİSTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ ...acikarsiv.ankara.edu.tr/browse/24522/SukranSEKER.pdfmodifikasyonunun hücre adezyonunu arttırdığını; PLGA nanolif yüzey

117

Frey, B.L. and Corn, R.M. 1996. Covalent attachment and derivatization of poly(l-

lysine) monolayers on gold surfaces as characterized by

polarizationmodulation FT-IR spectroscopy. Anal Chem, Vol. 68, pp 3187–

3193.

Ganesh, V., Pal, S.K., Kumar, S. and Lakshminarayanan, V. 2006. Self-assembled

monolayers (SAMs) of alkoxycyanobiphenyl thiols on gold—A study of

electron transfer reaction using cyclic voltammetry and electrochemical

impedance spectroscopy. Journal of Colloid and Interface Science, Vol. 296,

pp 195–203.

Gryte, D.M., Ward, M.D., and Hu, W.S. 1993. Real-Time Measurement of Anchorage-

Dependent Cell Adhesion Using a Quartz Crystal Microbalance, Biotechnol.

Prog., Vol. 9, pp 105-108.

Guillou-Buffello, D.L., Helary, G., Gindre, M., Pavon-Djavid, G., Laugier, P. and

Migonney, V. 2005. Monitoring cell adhesion processes on bioactive

polymers with the quartz crystal resonator technique. Biomaterials, Vol. 26,

pp 4197–4205.

Huang, Z.M,, Zhang, Y.Z., Kotaki, M. and Ramakrishna, S. 2003. A review on polymer

nanofibers by electrospinning and their applications in nanocomposites.

Composites Science and Technology, Vol. 63, pp 2223–2253.

Huang, Z.M., Zhang, Y.Z., Kotaki, M. and Ramakrishna, S. 2003. Composites Science

and Technology, Vol. 63, pp 2223–2253.

İnanç, B., Arslan, Y.E., Şeker, Ş., Elçin, A.E. and Elçin, Y.M. 2009. Periodontal

ligament cellular structures engineered with electrospun poly(DL-lactide-

co-glycolide) nanofibrous membrane scaffolds. J Biomed Mater Res A, Vol.

90,pp 186-195.

Janshoff, A., Galla, H.-J. And Steinem, C. 2000. Piezoelectric Mass-Sensing Devices as

Biosensors-An Alternative to Optical Biosensors? Angew. Chem., Int. Ed.

Engl. Vol. 39, pp 4004–4032.

Page 133: ANKARA ÜNİVERİSTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ ...acikarsiv.ankara.edu.tr/browse/24522/SukranSEKER.pdfmodifikasyonunun hücre adezyonunu arttırdığını; PLGA nanolif yüzey

118

Jia, X., Tan, L., Xie, Q., Zhang, Y. and Yao, S. 2008. Quartz crystal microbalance and

electrochemical cytosensing on a chitosan/multiwalled carbon nanotubes/Au

electrode. Sensors and Actuators B, Vol. 134, pp 273–280.

Jordan, M.A. and Wilson, L. 2004. Microtubules as a target for anticancer drugs. Nature

Reviews/Cancer, Vol. 4, pp 253-265.

Kanazawa, K.K. and Gordon II, J.G. 1985. Frequency of a quartz microbalance in

contact with liquid. Anal. Chem., Vol. 57, pp 1770–1771.

Kars, M., İşeri, Ö., Arpacı, F. ve Gündüz, U. 2009. Meme kanseri MCF-7 hücre

hattında paklitaksel ve vinkristin’e karşı gelişmiş çoklu ilaç direnci

mekanizmalarının mikrodizin analizi ile belirlenmesi. Türk Onkoloji

Dergisi, 24(4), pp 153-158.

Kavallaris, M. 2010. Microtubules and resistance to tubulin-binding agents. Nature

Reviews Cancer, Vol. 10, pp 194-204.

Khraiche, L.M., Zhou, A. and Muthuswamy, J. 2005. Acoustic sensor for monitoring

adhesion of Neuro-2A cells in real-time. Journal of Neuroscience Methods,

Vol. 144, pp 1–10.

Lippmann, G., 1881. Principe de conservation de l'électricité, Annales de Physique et de

Chimie, 5a Serie 24: pp145-178.

Lord, M.S., Modin, C., Foss, M., Duch, M., Simmons, A., Pedersen, F.S., Milthorpe,

B.K. and Besenbacher, F. 2006. Monitoring cell adhesion on tantalum and

oxidised polystyrene using a quartz crystal microbalance with dissipation.

Biomaterials, Vol. 27, pp 4529–4537.

Love, J.C., Estroff, L.A., , Kriebel, J.K., Nuzzo, R.G.and Whitesides, G.M. 2005. Self-

Assembled Monolayers of Thiolates on Metals as a Form of Nanotechnology.

Chem. Rev., Vol. 105, pp 1103-1169.

Lucklum, R. and Hauptmann, P. 2000. The quartz crystal microbalance: Mass

sensitivity, viscoelasticity and acoustic amplication. J. Sens. Actuators B,

Vol. 70, pp 30-36.

Page 134: ANKARA ÜNİVERİSTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ ...acikarsiv.ankara.edu.tr/browse/24522/SukranSEKER.pdfmodifikasyonunun hücre adezyonunu arttırdığını; PLGA nanolif yüzey

119

Mannelli, I., Minunni, M., Tombelli, S. and Mascini, M. 2003. Quartz crystal

microbalance (QCM) affinity biosensor for genetically modified organism

(GMOs) detection. Biosensors and Bioelectronics, Vol. 18, pp 129-140.

Maoz, R. and Sagiv, J. 1987. Penetration-controlled reactions in organized monolayer

assemblies. 1. Aqueous permanganate interaction with monolayer and

multilayer films of long-chain surfactants. Langmuir, 3(6), pp 1034-1044.

Marx, K.A, Zhou, T., McIntosh, D. and Braunhut, S.J. 2009. Electropolymerized

tyrosine-based thin films: Selective cell binding via peptide recognition to

novel electropolymerized biomimetic tyrosine RGDY films. Analytical

Biochemistry, Vol. 384, pp 86–95.

Marx, K.A. 2003. Quartz Crystal Microbalance: A Useful Tool for Studying Thin

Polymer Films and Complex Biomolecular Systems at the Solution-Surface

Interface, Biomacromolecules, Vol. 4, No. 5, pp 1099-1120.

Marx, K.A., Zhou, T., Montrone, A., McIntosh, D. and Braunhut, S.J. 2007. A

comparative study of the cytoskeleton binding drugs nocodazole and taxol

with a mammalian cell quartz crystal microbalance biosensor: Different

dynamic responses and energy dissipation effects. Analytical Biochemistry,

Vol. 361, pp 77–92.

Marx, K.A., Zhou, T., Montrone, A., Schulze, H. and Braunhut, S.J. 2001. A quartz

crystal microbalance cell biosensor: detection of microtubule alterations in

living cells at nM nocodazole concentrations. Biosensors & Bioelectronics,

Vol. 16, pp 773–782.

Marx, K.A., Zhou, T., Warren, M. and Braunhut, S.J. 2003. Quartz crystal microbalance

study of endothelial cell number dependent differences in initial adhesion

and steady state gehavior: evidence for cell–cell cooperativity in initial

adhesion and spreading. Biotechnol. Prog., Vol. 19, pp 987–999.

Marxer, C.G., Coen, M.C., Greber, T., Greber, U.F. and Schlapbach, L. 2003. Cell

spreading on quartz crystal microbalance elicits positive frequency shifts

indicative of viscosity changes, Anal Bioanal Chem, Vol. 377, pp 578–586.

Page 135: ANKARA ÜNİVERİSTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ ...acikarsiv.ankara.edu.tr/browse/24522/SukranSEKER.pdfmodifikasyonunun hücre adezyonunu arttırdığını; PLGA nanolif yüzey

120

Minunni, M., Tombelli, S., Scielzi, R., Mannelli, I., Macsini, M. and Gaudiano, C.

2003. Detection of β-Thalassemia by a DNA piezoelectric biosensor

coupled with polymerase chain reaction. Analytica Chimica Acta, Vol. 481,

pp 55-64.

Modin, C., Stranne, A.L., Foss, M., Duch, M., Justesen, J., Chevallier, J., Andersen,

L.K., Hemmersam, A.G., Pedersen, F.S. and Besenbacher, F., 2006. QCM-

D studies of attachment and differential spreading of pre-osteoblastic cells

on Ta and Cr surfaces. Biomaterials, Vol. 27, pp 1346–1354.

Nnávrátilová, I., Skládal, P. and Viklický, V. 2001. Development of piezoelectric

immunosensors for measurement of albuminuria. Talanta, Vol. 55, pp 831-

839.

O’Sullivan, C.K. and Guilbault, G.G. 1999. Commercial quartz crystal microbalances –

theory and applications. Biosensors & Bioelectronics, Vol. 14, pp 663–670.

Redepenning, J., Schlesinger T.K., Mechalke E.J., Puleo, D.A. and Bizios R. 1993.

Osteoblast Attachment Monitored with a Quartz Crystal Microbalance.

Anal. Chem., Vol. 65, pp 3378-3381.

Sauerbrey, G. 1959. The use of quartz oscillators for weighing thin layers and for

microweighing. Z. Phys., Vol. 155, pp 206-222.

Shih, J.S., Chao, Y.C., Sung, M.F., Gau, G.J. and Chiou, C.S. 2001. Piezoelectric

crystal membrane chemical sensors based on fulleren C60. Sensors and

Actuators B, Vol. 76, pp 374-353.

Su, C.C., Wu, T.Z., Chen, L.K., Yang, H.H. and Tai, D.F. 2003. Development of

immunochips for the detection of dengue viral antigens. Analytica Chimica

Acta, Vol. 479, pp 117-123.

Şeker, Ş., Arslan, Y.E. and Elçin, Y.M. 2010. Electrospun Nanofibrous

PLGA/Fullerene-C60 Coated Quartz Crystal Microbalance for Real-Time

Gluconic Acid Monitoring. IEEE Sensors Journal, Vol. 10, pp 1342-1348.

Page 136: ANKARA ÜNİVERİSTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ ...acikarsiv.ankara.edu.tr/browse/24522/SukranSEKER.pdfmodifikasyonunun hücre adezyonunu arttırdığını; PLGA nanolif yüzey

121

Tanaka, M., Mochizuki, A., Motomura, T., Shimura, K., Onishi, M. and Okahata, Y.

2001. In situ studies on protein adsorption onto a poly(2-

methoxyethylacrylate) surface by a quartz crystal microbalance. Colloids

and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects, Vol. 193, pp

145-152.

Tombelli, S., Macsini, M. and Turner, A.P.F. 2002. Improved procedures for

immobilisation of oligonucleotides on gold-coated piezoelectric quartz

crystals. Biosensors and Bioelectronics, Vol. 17, pp 929-936.

Vaughan, R.D., O’Ssullivan, C.K. and Guilbault, G.G. 2001. Development of a quartz

crystal microbalance (QCM) immunosensor for the detection of Listeria

monocytogenes. Enzyme and Microbial Technology, Vol. 29, pp 635-638.

Ward, M.D. 1995. Principles and applications of the electrochemical quartz crystal

microbalance, in: I. Rubenstein (Ed.), Physical Electrochemistry: Principles,

Methods and Applications, Marcel Dekker, Inc., NewYork, pp 293–338.

Wegener, J., Seebach, J., Janshoff, A. and Galla, H.J. 2000. Analysis of the Composite

Response of Shear Wave Resonators to the Attachment of Mammalian

Cells. Biophysical Journal, Vol. 78, pp 2821–2833.

Wei, L.F. and Shih, J.S. 2000. Fullerene-cryptand coated piezoelectric crystal urea

sensor based on urease. Analytica Chimica Acta, Vol. 437, pp 77-85.

Xi, B., Yu, N., Wang, X., Xu, X. and Abassi, Y.A. 2008. The application of cell-based

label-free technology in drug discovery. Biotechnolology Journal, Vol. 3, pp

484–495.

Zhou, X., Liu, L., Hu, M., Wang, L. and Hu, J. 2002. Detection of hepatitis B virus by

piezoelectric biosensor. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis,

Vol. 27, pp 341-345.

Page 137: ANKARA ÜNİVERİSTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ ...acikarsiv.ankara.edu.tr/browse/24522/SukranSEKER.pdfmodifikasyonunun hücre adezyonunu arttırdığını; PLGA nanolif yüzey

122

EKLER

EK 1 Kaplama işlemlerinde kullanılan polimerlerin molekül yapıları

EK 2 Kaplamaların neden olduğu frekans değişimleri

Page 138: ANKARA ÜNİVERİSTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ ...acikarsiv.ankara.edu.tr/browse/24522/SukranSEKER.pdfmodifikasyonunun hücre adezyonunu arttırdığını; PLGA nanolif yüzey

123

EK 1 Kaplama işlemlerinde kullanılan polimerlerin molekül yapıları

PLGA (http://www.unisa.edu.au/)

PCL (www.polysciences.com)

PS (www.wikilib.com)

Kitosan (www.gmp-chitosan.com)

Hyalüronik asit (www.madsci.org/posts)

Kollajen (http://chempolymerproject.wikispace.com)

Alginat (www.sigmaaldrich.com)

PLL (www.ichemistry.cn/structure)

Page 139: ANKARA ÜNİVERİSTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ ...acikarsiv.ankara.edu.tr/browse/24522/SukranSEKER.pdfmodifikasyonunun hücre adezyonunu arttırdığını; PLGA nanolif yüzey

124

EK 2 Kaplamaların neden olduğu frekans değişimleri

11-MUA 2-Merkaptoetanol F0 (Hz) F1 (Hz) ∆F (Hz) F0 (Hz) F1 (Hz) ∆F (Hz) 7990635 7990526 109 7979708 7979653 55 7984332 7984206 126 7983925 7983863 62 7992564 7992446 118 7987109 7987029 80 7987520 7987425 95 7981197 7981124 73 7988892 7988787 105 7984567 7984502 65

2-Merkaptoetilamin PLGA nanolif F0 (Hz) F1 (Hz) ∆F (Hz) F0 (Hz) F1 (Hz) ∆F (Hz) 7999876 7999826 50 7986072 7985937 135 7985643 7985571 72 7984252 7983992 260 7990456 7990391 65 7989689 7989402 287 7984590 7984530 60 7982942 7982801 141 7989834 7989764 70 7982988 7982679 309

PLGA membran PCL F0 (Hz) F1 (Hz) ∆F (Hz) F0 (Hz) F1 (Hz) ∆F (Hz) 7979057 7976816 2241 7991253 7987909 3344 7980535 7978082 2453 7981487 7977425 4062 7983172 7981966 1206 7984479 7981068 3411 7983567 7981955 1612 7987685 7984109 3576 7983542 7980858 2684 7980285 7976950 3335

PS Kitosan F0 (Hz) F1 (Hz) ∆F (Hz) F0 (Hz) F1 (Hz) ∆F (Hz) 7984516 7979563 4953 7980473 7975250 5223 7991130 7986440 4690 7976543 7968574 7969 7987032 7982309 4723 7984563 7978087 6476 7987332 7982452 4880 7984398 7980291 4107 7981712 7976824 4888 7983298 7975123 8175

Hyalüronik asit Kollajen F0 (Hz) F1 (Hz) ∆F (Hz) F0 (Hz) F1 (Hz) ∆F (Hz) 7982705 7977424 5281 7981434 7977858 3576 7982834 7981433 1401 7979597 7974845 4752 7977750 7972586 5164 7976654 7975031 1623 7984972 7978462 6510 7975723 7967896 7827 7975518 7968888 6630 7970747 7962624 8123

Alginat PLL F0 (Hz) F1 (Hz) ∆F (Hz) F0 (Hz) F1 (Hz) ∆F (Hz) 7980421 7971480 8941 7986578 7982366 4212 7979532 7977333 2199 7992365 7989985 2380 7985443 7976603 8840 7994094 7992444 1650 7981348 7978948 2400 7985609 7984383 1226 7979717 7974247 5470 7993429 7991545 1884

Page 140: ANKARA ÜNİVERİSTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ ...acikarsiv.ankara.edu.tr/browse/24522/SukranSEKER.pdfmodifikasyonunun hücre adezyonunu arttırdığını; PLGA nanolif yüzey

125

ÖZGEÇMİŞ

Adı Soyadı : Şükran ŞEKER

Doğum Yeri : Ankara

Doğum Tarihi: 08.02.1981

Medeni Hali : Bekar

Yabancı Dili : İngilizce

Eğitim Durumu (Kurum ve Yıl)

Lise : Dikmen Lisesi, (1998).

Lisans : Ankara Üniversitesi Fen Fakültesi Kimya Bölümü, (2003).

Yüksek Lisans: Ankara Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü, Kimya (Biyokimya)

Anabilim Dalı, (2005).

Çalıştığı Kurum/Kurumlar ve Yıl

Kimyager: Ankara Üniversitesi Kök Hücre Enstitüsü (Şubat 2011’den itibaren).

Araştırma Görevlisi: Ankara Üniversitesi Fen Fakültesi Kimya Bölümü

Biyokimya Anabilim Dalı (2005-2011).

SCI KAPSAMINDAKİ BİLİMSEL ARAŞTIRMA MAKALELERİ

B. Inanç, Y.E. Arslan, Ş. Şeker, A.E. Elçin, Y.M. Elçin., “Periodontal ligament cellular

structures engineered with electrospun poly(DL-lactide-co-glycolide) nanofibrous

membrane scaffolds”, J Biomed Mater Res A. 2009 Jul;90(1):186-95.

Ş. Şeker, Y.E. Arslan, and Y.M. Elçin, “Electrospun Nanofibrous PLGA/Fullerene-C60

Coated Quartz Crystal Microbalance for Real-Time Gluconic Acid Monitoring”, IEEE

Sensors Journal, 2010 (10): 1342-1348.