ANEXOS A LA SOLICITUD DE DEPÓSITO DE LALÍNEA CELULAR EN EL BANCOIC-AD6-F-iPS-4F-1

NACIONAL DE LÍNEAS CELULARES

ANNEXES TO THE APPLICATION FORM FOR DEPOSITINGCELL LINEIC-AD6-F-iPS-4F-1

INTO THE NATIONAL BANK OF STEM CELL LINES

ANEXOS / ANNEXES

Anexo 1: Test de pluripotencia de la línea IC-AD6-F-iPS-4F-1Annex 1: Pluripotency Test

Anexo 2: Test de diferenciación in vitro de la línea IC-AD6-F-iPS-4F-1Annex 2: In vitro di erentiation Test

Anexo 3: Cariotipo de la línea IC-AD6-F-iPS-4F-1Annex 3: Karyotype

Anexo 4: Huella genética de los fibroblastos (células de origen) y de la líneaIC-AD6-F-iPS-4F-1

Annex 4: Genetic fingerprinting

Anexo 5: Test de silenciamiento de la línea IC-AD6-F-iPS-4F-1Annex 5: Silencing Test

Anexo 6: Confirmación del diagnóstico genotípico de la línea IC-AD6-F-iPS-4F-1Annex 6: Confirmation of genotypic diagnosis of the line

Anexo 7: Test de micoplasma de la línea IC-AD6-F-iPS-4F-1Annex 7: Mycoplasma Test

Anexo 1Test de pluripotencia de la línea IC-AD6-F-iPS-4F-1

Annex 1Pluripotency Test

Niveles de expresion de OCT4, SOX2 y NANOG de la línea IC-AD6-F-iPS-4F-1Expression leves of OCT4, SOX2 and NANOG

Detección por inmunofluorescencia de la expresion de TRA1-60 y TRA1-81 enla línea IC-AD6-F-iPS-4F-1Immunofluorescence detection of TRA1-60 and TRA1-81 expression

TRA1-60

250 µm

50 µm

250 µm

TRA1-81

50 µm

OCT4 SOX2 NANOG

Nor

mal

ized

mR

NA

leve

ls

0.25

0.20

0.15

0.10

0.05

0.00

Detección por inmunofluorescencia de la expresión de SSEA-4 y SSEA-3en la línea IC-AD6-F-iPS-4F-1Immunofluorescence detection of SSEA-4 and SSEA-3 expression

Detección por inmunofluorescencia de la expresión de NANOG enla línea IC-AD6-F-iPS-4F-1Immunofluorescence detection of NANOG expression

NANOG

250 µm

50 µm

SSEA-4

250 µm

50 µm

250 µm

SSEA-3

50 µm

C

Detección de la actividad fosfatasa alcalina en la línea IC-AD6-F-iPS-4F-1Detection of alkaline phosphatase activity

200 µm

250µm

Anexo 2Test de diferenciación in vitro de la línea IC-AD6-F-iPS-4F-1

Annex 2

In vitro di erentiation Test

Diferenciación in vitro a Ectodermo de la línea Células positivasIC-AD6-F-iPS-4F-1. para PAX6 y TUJ1.In vitro di erentiation into Ectoderm. PAX6 and TUJ1 positive cells.

Diferenciación in vitro a Mesodermo de la línea Células positivasIC-AD6-F-iPS-4F-1. para DESMIN.In vitro di erentiation into Mesoderm. DESMIN positive cells.

C

PAX6 TUJ1

20 µm

DESMIN

Diferenciación in vitro a Endodermo de la línea Células positivasIC-AD6-F-iPS-4F-1. para alfa-fetoproteina.In vitro di�erentiation into Endoderm. Alpha-fetoprotein positive cells.

AFP

Anexo 3Cariotipo de la línea IC-AD6-F-iPS-4F-1

Annex 3

Karyotype

GenePrint10 Marker Test Sample Profile

TH01 7, 9.3

D21S11 30, 31.2

D5S818 11, 12

D13S317 8, 11

D7S820 11, 12

D16S539 9, 13

CSF1PO 10, 12

AMEL X, Y

vWA 16

TPOX 8, 11

Anexo 4de los fibroblastos (células de origen) Huella genética .

Annex 4

Genetic fingerprinting of fibroblasts

GenePrint10 Marker Test Sample Profile

TH01 7, 9.3

D21S11 30, 31.2

D5S818 11, 12

D13S317 8, 11

D7S820 11, 12

D16S539 9, 13

CSF1PO 10, 12

AMEL X, Y

vWA 16

TPOX 8, 11

Anexo 4.de la línea Huella genética IC-AD6-F-iPS-4F-1

Annex 4

Genetic fingerprinting of line IC-AD6-F-iPS-4F-1

Anexo 5Test de silenciamiento de la línea IC-AD6-F-iPS-4F-1

Annex 5

Silencing Test

Gene Primer (5’-3’) Length

ForwardReverseForwardReverseForwardReverseForwardReverse

SeVGGA TCA CTA GGT GAT ATC GAG C*

ACC AGA CAA GAG TTT AAG AGA TAT GTA TC*181 bp

KOS 528 bpATG CAC CGC TAC GAC GTG AGC GC

ACC TTG ACA ATC CTG ATG TGG

Klf4 410 bpTTC CTG CAT GCC AGA GGA GCC C

AAT GTA TCG AAG GTG CTC AA*

532 bpTAA CTG ACT AGC AGG CTT GTC G*

TCC ACA TAC AGT CCT GGA TGA TGA TGcMyc

* Primer contains SeV genome sequences. Pairing of these primers with transgene-specific primersallows specific detection of transgenes carried by the CytoTune™ 2.0 Sendai reprogramming vectors.

1000

100

850650500400300200

Bp

CRTDNA

LadderAD6C+CPCR CRT

DNALadder

AD6C+CPCR CRTDNA

LadderAD6C+CPCR

CRTDNA

LadderAD6C+CPCR

KOS cMyc cMycSeV Klf4

Anexo 6Confirmación del diagnóstico genotípico de la línea IC-AD6-F-iPS-4F-1

Annex 6Confirmation of genotypic diagnosis of the line IC-AD6-F-iPS-4F-1

Using TaqMan SNP genotyping assays, we analyzed the rs429358 and rs7412 SNPs showingthat both probe (VIC, green; FAM, blue) bound to the C- and T-containing allele in rs429358 SNPand only the VIC probe (green) bound to the C-containing allele in rs7412 SNP, confirming thatthe IC-AD6-F-iPS-4F-1 cell line has an ApoE3/E4 genotype.

SNP rs7412SNP rs429358

80 90 100

GC T G T G G A C T A C A T T A C T G T T G C A C T C C T G

120 130 140

T T T T G G T G T G G T G G G A A T G A T T T C C A T T C A

160 170 180

G T C C A C T T C G A C T C C A G C A G G C A T A T C T C A T

200 210 220

G T G C C C T C A T G G C C C T G G T G T T T A T C A A G T A C

240 250 260

A T G G A C T G C G T G G C T C A T C T T G G C T G T G A T T

We analized, by DNA sequencing,the nucleotide substitution from GGTto GAT in the g.61242 position andwe confirmed that IC-AD6-F-iPS-4F-1cell line has the PSEN1 Gly206Aspmutation in heterozygosis.

Anexo 7Test de micoplasma de la línea IC-AD6-F-iPS-4F-1

Annex 7

Mycoplasma Test

Contaminación: Bandas entre 448-611 bp Micoplasma positivo

Control interno 270 bp

A mayor contaminación menos amplificación del control interno

C- : control interno

C+ : control positivo de cultivo contaminado con micoplasma

Mix C- C+ AD6