analiza metabolitÓw roŚlin transgenicznych z podwyŻszonĄ zawartoŚciĄ flawonoidÓw

ANALIZA METABOLITÓW ANALIZA METABOLITÓW ROŚLIN TRANSGENICZNYCH Z ROŚLIN TRANSGENICZNYCH Z

PODWYŻSZONĄ PODWYŻSZONĄ ZAWARTOŚCIĄ ZAWARTOŚCIĄ

FLAWONOIDÓWFLAWONOIDÓW

Petunia hybrida DFRa Petunia hybrida DFRa cDNAcDNA

NOSNOSPromotor Promotor GTGT

HindIII BamHI

SacI EcoRI

pBinAR

Promotor genu Promotor genu transferazy transferazy glukozowej (GT), glukozowej (GT), gdyż:gdyż:

jest regulowany jest regulowany czynnikami czynnikami środowiskwymiśrodowiskwymi

jest tkankowo-jest tkankowo-specyficznyspecyficzny

Gen reduktazy Gen reduktazy dihydroflawonlu (DFR), dihydroflawonlu (DFR), gdyż:gdyż:

DFR jest kluczowym DFR jest kluczowym enzymem na szlaku enzymem na szlaku biosyntezy antocyjanówbiosyntezy antocyjanów

Rośliny pGT/DFRRośliny pGT/DFR

Celowość tworzenia roślin Celowość tworzenia roślin pGT/DFRpGT/DFR

Ekspresja genu DFR pod kontrolą promotora Ekspresja genu DFR pod kontrolą promotora genu transferazy glukozowej pozwala na genu transferazy glukozowej pozwala na zwiększanie puli flawonoidów w roślinie:zwiększanie puli flawonoidów w roślinie:

w określonych tkankach w określonych tkankach

w określonych warunkach ( czynniki w określonych warunkach ( czynniki stresowe)stresowe)

1 AATTTAATTG ATAATACTTA CCTATTAAAT AAATTTCTTA AGATAAATAT AAATACAGAA

61 AATTGATTTG AATAATGCTA TTCAAGTCAT AGTGGCAAGA TTGAAGTAAA AAAAAAAAAG

121 AAATTGCATT TTATTTTATT TAGTTTTCAA ATTTAGTTCA TTATTTAGCT CAAAATATAT

181 CCAAATTAAG TTAAAATTTA CAATGTCAAT AACTAAAATA TAAAGTTTAT TTTTTTTAAA

241 AAAAAGAGAA CATTATATAT ATATTGATCC ATAGCATTTA ATGCCATAAA ATTTCCGTTA

301 ATAAAAGAAA GAGAACAACA TTCCATGTGG TGGTCAATAC ATATTCGGTA TATCATGTGA

361 CAATTATTAA TGACGAATTT AAAATTTAAA TTTTATAAAT TTAAAACTAA CTTATTATAT

421 TTTTAAAGTT ACAAATCCAT AATTACTAGT ATATTTATTA CAATTTGAAT AATATTTTAT

481 ATATAAATTA ATTTTTTACG TTAAAAATAT TATATTCAAA AGAACTCGAT ACTATGACGT

541 TAGATCAGCC CGTGATAGAT GCATCAAAAT CCATGCCCAA CTTCAATCTC TACATTGTAT

601 CTGGCTATCC TAGATTAGGC AGTAGCTTGC CAGAAGTTTT TATTTTTATA ATAATTGAAT

661 TAAAAAATAA TAATAACAGA AACATATTCC AGACAACTCA TGTCATGCAT GACAAATTCT

721 GAAATTGGGC TTACTGGCTA CTGCTGAAAG GTATGGCTCA CTAACCAAAA TAAAATACTA

781 GTGCCCACAA CGAGTGATGG AGTGGTAAGA TTACTCTGTC TTTAGTAAAG ATCTGGAATT

841 TCAATTTTAA ATATGAAGAA AATTTGGTTA GGAGTATCAC TCCCAAATGA GCTTTGCATT

901 GCACGATTCG AATTTAGGCG AAGGTCCAGC GGTGAGAAAC TACCAAACAC AATCCATACA

961 ATAGTAGAAT TTATTTATTT TCTTGCATCA ATTTGTTTTT CTTTTTTTAG ACCGTTTGAT

1021 AAAAATGTCT TTTTTCCTTT TTGATAATTA TTTAATTTTT GATTTTTTAC ATGATATATT

1081 TAAAATTAGA GAATTAAAGA ACGTTTTAGT ACATATATTT AATTTAAGAT TTTAAAACTT

1141 AAAAGTCTTA TTTTCTTTTG TAAATTACGT ATCAAATTAA AATTAGTTAA ATAAATAAAA

1201 ACAAAATATT TGTTTTGCAA GTAAGATAAA TAGTCACTCT CTTCTGTCCA TCTGGTGTTT

1261 TTTCTATAGA ATTAAATAAA TTAAAAGAAA GAAACAAAAA CGAAGTACCG GCAAAATTTG

1321 TCTTCTCATC AATTTCGTCA CCTCAAACGT CATATGACAT GCATGTGTTT AAATTTGGTC

1381 CTCAAACATG TTACTCAAAC GTAGAAATGG ACATGATGGG ATAGATATTG AAATTTTTAC

1441 TAACGTAACG TGCTCACCCC TACAAACTCC TTATATATAT CCCTCTAACT ATCATCATAT

1501 ATACCACACA ATAATTAAGA GTCTTACAAG TCAAAGATTT CTCTCACACA ATACTAAAGT

1561 CTACTTTCAT TCATTTGACC TCGAACTTTG AACTTAGGTT CTATTTTAAG TTTGTGAGTG

1621 TAAAAATGATG

SEKWENCJE INDUKOWANE PROMIENIOWANIEM UV

sekwencja homologiczna z fragmentem promotora genu liazy fenyloalanyloamoniowej z pietruszki CCCCTACAAACCCTTCCCCTACAAACCCTTSEKWENCJE INDUKOWANE

KWASEM ABSCYSYNOWYM (ABA)

E – boxy

sekwencja genu β – konglicyniny

motyw ABRE

SEKWENCJE REGULOWANE ŚWIATŁEM

I – boxy

sekwencja CCCCTACAAACCCTTCCCCTACAAACCCTT

sekwencja GAAAGAAGAAAGAA

motywy GATAGATA, , GT1GT1, , G - boxyG - boxy

PROMIENIOWANIE UVPROMIENIOWANIE UV

5,5 X

0

100

200

300

400

500

600

700

15min 30min

acti

vit

y (

%)

próba kontrolna

próba naświetlana UV-C

NISKA TEMPERATURANISKA TEMPERATURA

0

100

200

300

400

500

600

700

0h 6h 12h 24h 48h

ac

tiv

ity

(%

)

pGT/GUS, 22C

pGT/GUS, 4C

6 X6 X

KWAS KWAS ABSCYSYNOWYABSCYSYNOWY

0

200

400

600

800

1000

1200

0h 12h 24h 48h

acti

vity

(%

)

8 X8 X

pGT/ GUS

pCaMV35S/ GUS

0

100

200

300

400

500

600

700

0h 8h 12h

%ac

tivi

ty

ŚWIATŁOŚWIATŁO

pGT/ GUS

pCaMV35S/ GUS

5 X5 X

BULWA LIŚĆ KORZEŃ

- miękisz gąbczasty

- miękisz palisadowy

- cortex

- cortex

- komórki przy wiązkach przewodzących

DFR / dihydroflavonol 4-reductase -DFR / dihydroflavonol 4-reductase - katalizuje reakcję redukcji dihydroflawonolu do katalizuje reakcję redukcji dihydroflawonolu do leukoantocyjanidynyleukoantocyjanidyny

EcoRI Ncol EcoRV KpnI BamHI HindIII

promotor terminator

CaMV35S Petunia hybrida DFR cDNA OCS

Konstrukt DFR EcoRI Ncol EcoRV KpnI BamHI HindIII

promotor terminator

CaMV35S Petunia hybrida DFR cDNA OCS

Konstrukt DFRanty

Desi DFR DFRa

2 0 0 2 r .

2 0 0 1 r .

2 0 0 3 r .

0

1 1 0

2 2 0

3 3 0

D D F R 2 D F R 5 D F R

1 1

D F R a

1

D F R a

2

D F R a

3

mg/1

00gD

W

0

1 5

3 0

4 5


1 1

D F R a

1

D F R a

2

D F R a

3

mg/1

00gD

W

0

7 0

1 4 0

2 1 0


1 1

D F R a

1

D F R a

2

D F R a

3

mg/1

00gD

W

0

3 0

6 0

9 0


1 1

D F R a

1

D F R a

2

D F R a

3mg

/100

gDW

0

5 0

1 0 0

1 5 0

2 0 0


1 1

D F R a

1

D F R a

2

D F R a

3

mg/1

00gD

W

0

1 0

2 0


1 1

D F R a

1

D F R a

2

D F R a

3

mg/1

00gD

W

p e t u n i d y n a 3 - r u t 5 - g l c a c y l o w a n a k w a s e m p - k u m a r o w y m

p e l a r g o n i d y n a 3 - r u t 5 - g l c a c y l o w a n a k w a s e m p - k u m a r o w y m

Zawartość Zawartość antocyjanówantocyjanów

2001r.

0

0,1

0,2

0,3

0,4

Desi DFR 2 DFR 5 DFR11

DFRa1

DFRa2

DFRa3

ug D

W

Potencjał antyoksydacyjny Potencjał antyoksydacyjny (IC50)(IC50)

Zawartość kwasów Zawartość kwasów fenolowychfenolowych

k w a s i z o c h l o r o g e n o w y

0

5 0

1 0 0

1 5 0

D D F R2

D F R5

D F R1 1

D F R a1

D F R a2

D F R a3

mg/10

0gDW

k w a s c h l o r o g e n o w y

0

5 0

1 0 0

1 5 0

D D F R2

D F R5

D F R1 1

D F R a1

D F R a2

D F R a3

mg/10

0gDW

k w a s k a w o w y

0

6 0

1 2 0

1 8 0

D D F R2

D F R5

D F R1 1

D F R a1

D F R a2

D F R a3

mg/10

0gDW

2 0 0 2 r .

k w a s c h l o r o g e n o w y

0

1 0 0

2 0 0

3 0 0

D D F R2

D F R5

D F R1 1

D F R a1

D F R a2

D F R a3

mg/10

0gDW

k w a s k a w o w y

0

6 0

1 2 0

1 8 0

D D F R2

D F R5

D F R1 1

D F R a1

D F R a2

D F R a3

mg/10

0gDW

k w a s i z o c h l o r o g e n o w y

0

1 0 0

2 0 0

D D F R2

D F R5

D F R1 1

D F R a1

D F R a2

D F R a3

mg/10

0gDW

2 0 0 1 r .

Petunia hybrida DFRa Petunia hybrida DFRa cDNAcDNA

NOSNOSPromotor Promotor GTGT

HindIII BamHI

SacI EcoRI

pBinAR

Promotor genu Promotor genu transferazy transferazy glukozowej (GT), glukozowej (GT), gdyż:gdyż:

jest regulowany jest regulowany czynnikami czynnikami środowiskwymiśrodowiskwymi

jest tkankowo-jest tkankowo-specyficznyspecyficzny

Gen reduktazy Gen reduktazy dihydroflawonlu (DFR), dihydroflawonlu (DFR), gdyż:gdyż:

DFR jest kluczowym DFR jest kluczowym enzymem na szlaku enzymem na szlaku biosyntezy antocyjanówbiosyntezy antocyjanów

Rośliny pGT/DFRRośliny pGT/DFR

Analiza roślin pGT/DFRAnaliza roślin pGT/DFR

Selekcja roślin pGT/DFRSelekcja roślin pGT/DFR

Preselekcja metodą PCRPreselekcja metodą PCR

A) PRIMERY NA KANAMYCYNĘA) PRIMERY NA KANAMYCYNĘ

0,5 kb0,5 kb

SEKWENCJA PRIMERÓW:GMO6/1 5’ – CCGACCTGTCCGGTGCCCC-3’

GMO6/2 5’ - CCGCCACACCCAGCCGGCC-3’

H20 Desi BinAR 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10H20 Desi BinAR 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

B) PRIMERY NAMNAŻAJĄCE GEN DFRB) PRIMERY NAMNAŻAJĄCE GEN DFR

SEKWENCJA PRIMERÓW:DFRAR 5'- GGT GCA TTC TCT TTG CCA CTT GC-

3’DFRAF 5‘ - GAC AGT TTG CGT CAC TGG AGC

TG-3’

1,5 kb1,5 kb

H20 Desi DFR 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10H20 Desi DFR 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Analiza Analiza fenotypowafenotypowa

pGT/DFRpGT/DFR DesireeDesiree

Kwitnienie roślin: 6. 07. 2004Kwitnienie roślin: 6. 07. 2004

Wstępna analiza Wstępna analiza metabolitów metodą GCMSmetabolitów metodą GCMS

FENYLOALANINA

0

50

100

150

200

control ABA UV COLD NaCl

%

TYROZYNA

0

50

100

150

200

250


%

TRYPTOFAN

0

20

40

60

80

100

120

140

160

control ABA UV COLD NaCl%

prefenian

indol

antranilan

Trp

choryzmian

Tyr

Phe

quinian

heptuzolonian-7P

szikimian

2 PEPD-erytrozo-4P +

cykl pentozowy glikoliza

flawonoidy

POZIOM AMNOKWASÓWPOZIOM AMNOKWASÓW

MANNITOL

0

50

100

150


%

SORBITOL

0

50

100

150

200


%

PRO

0

20

40

60

80

100

120

140

160


%

Glc-6P Fru6P

sorbitolpyruvate

mannitol-1P

2-oxoglutaratesuccinate

fumarate

malate

oxaloacetate citrate

cis-aconitate

isocitrate

Arg Pro metabolism

Tyr metabolism

myo-Inositol-1P

ononitol

mannitol

pinitol

sorbitol-6P

myo-Inositol

phospholipids, phosphoinositides, phytate

raffinose, gums, gluconeogenesis

Protektanty w warunkach Protektanty w warunkach stresustresu

warunki kontrolne

chłód

ABA

UV

CO BĘDZIEMY ROBIĆ:CO BĘDZIEMY ROBIĆ:

• pomiar poziomu antocyjanów w roślinach pomiar poziomu antocyjanów w roślinach pGT/DFR poddanych działaniu czynników pGT/DFR poddanych działaniu czynników stresowych (ABA, UV, CHŁÓD)stresowych (ABA, UV, CHŁÓD)

•oznaczenie potencjału antyoksydacyjnego oznaczenie potencjału antyoksydacyjnego (IC 50) w stresowanych roślinach pGT/DFR(IC 50) w stresowanych roślinach pGT/DFR

prefenian

indol

antranilan

Trp

choryzmian

Tyr

t-cynamonian

p-kumarynian

Phe

quinian

salicylansalicylan-Glc

benzoinian

kawoinian ferulan synapinian

naringenina

suberynyligniny

eriodiktiol

chlorogenian

CHS

CHI

PAL

3-OH-flawanon(dihydroflawonol)

flawan-3,4-diol(leukoantocyjanidyna)

antocyjan

DFR

heptuzolonian-7P

szikimian

katechol


p-kumarylo-CoAacetylo-CoA

biosynteza kwasów tłuszczowych

3 malonylo-CoA +

trihydroksychalkon tetrahydroksychalkon

likwirtigenina

2’-hydroksyizoflawanon

izoflawonoid

izoflawon

flawan-4-ol 3-deoksyantocyjanidyny

flawon

aurony

flawonol glukozyd flawonolu

flawan-3-ol

3-OH-antocyjanidyna proantocyjanidyna skondensowane taniny


F3HF3’HF3’5’H

ANS

GTOMTRT

DAHP

CM

PDT

CHR

IFSIFS

rezweratrol (stilbeny)

SS

4CL

prefenian

indol

antranilan

Trp

choryzmian

Tyr

t-cynamonian

p-kumarynian

Phe

quinian

salicylansalicylan-Glc

benzoinian

kawoinian ferulan synapinian

naringenina

suberynyligniny

eriodiktiol

chlorogenian

CHS

CHI

PAL

3-OH-flawanon(dihydroflawonol)

flawan-3,4-diol(leukoantocyjanidyna)

antocyjan

DFR

heptuzolonian-7P

szikimian

katechol


p-kumarylo-CoAacetylo-CoA

biosynteza kwasów tłuszczowych

3 malonylo-CoA +

trihydroksychalkon tetrahydroksychalkon

likwirtigenina

2’-hydroksyizoflawanon

izoflawonoid

izoflawon

flawan-4-ol 3-deoksyantocyjanidyny

flawon

aurony

flawonol glukozyd flawonolu

flawan-3-ol

3-OH-antocyjanidyna proantocyjanidyna skondensowane taniny


F3HF3’HF3’5’H

ANS

GTOMTRT

DAHP

CM

PDT

CHR

IFSIFS

rezweratrol (stilbeny)

SS

4CL

Potencjał antyoksydacyjny (IC50)

0

0,1

0,2

0,3

0,4

Desi DFR2

DFR5

DFR11

DFRa1

DFRa2

DFRa3

Desi DFR2

DFR5

DFR11

DFRa1

DFRa2

DFRa3

ug F

W

Potencjał antyoksydacyjny (IC 50)

Wpływ promieniowania UV na Wpływ promieniowania UV na właściwości antyoksydacyjne roślin z właściwości antyoksydacyjne roślin z

nadekspresją DFRnadekspresją DFR

rośliny CaMV35S/DFR /kontrola

rośliny CaMV35S/DFR/naświetlane UV

Funkcje flawonoidówFunkcje flawonoidów

odporność na patogeny

ochrona przed UV

ODPOWIEDŹ NA STRESY ABIOTYCZNE I BIOTYCZNE

analiza metabolitÓw roŚlin transgenicznych z podwyŻszonĄ zawartoŚciĄ flawonoidÓw

Documents