Analiza cromozomilor Analiza cromozomilor umaniumani

Cromozomii sunt structuri nucleo-proteice, compacte ce contin Cromozomii sunt structuri nucleo-proteice, compacte ce contin informatia genetica responsabila de ereditatea si variabilitateainformatia genetica responsabila de ereditatea si variabilitatea

Org. Din punct de vedere morfologic sunt alc. dinOrg. Din punct de vedere morfologic sunt alc. dinCromatide-subunitatile functionale ale cr, la nivelul lor are locCromatide-subunitatile functionale ale cr, la nivelul lor are loc

Replicarea, sunt unitati de replicareReplicarea, sunt unitati de replicareCentromerul reprezinta locul unde cele 2 sub sunt unite, contine ADN inaltCentromerul reprezinta locul unde cele 2 sub sunt unite, contine ADN inalt

Repetitiv(ADN alpha satelit)asig. Integritatea funct si struct a cr.Repetitiv(ADN alpha satelit)asig. Integritatea funct si struct a cr.Telomerele- sunt regiunile terminale ale cr. Fiecarui brat, sunt Telomerele- sunt regiunile terminale ale cr. Fiecarui brat, sunt

elemente de stabilitate structurala cr, asigura integritatea si indivizibilitateaelemente de stabilitate structurala cr, asigura integritatea si indivizibilitateaCr. ADN repetitiv de tip palindrom(secventa de care se realizeaza complemCr. ADN repetitiv de tip palindrom(secventa de care se realizeaza complem

Entaritea in cadrul aceleasi catene, TAAGGGEntaritea in cadrul aceleasi catene, TAAGGG;;Cuplarea in zigoten, capete ce previn scurtarea cr., recunoaste AND defecteCuplarea in zigoten, capete ce previn scurtarea cr., recunoaste AND defecteBratele cr sunt impartite de catre centromer in regiuni egale sau inegale; Bratele cr sunt impartite de catre centromer in regiuni egale sau inegale;

De obicei p-brat scurt, q=brat lungDe obicei p-brat scurt, q=brat lung4 indici centromerici:4 indici centromerici:

Lungimea relativa a cr: L re=((p+q)/22+x) 1000Lungimea relativa a cr: L re=((p+q)/22+x) 1000Raportul dintre brate: r=q/p;Raportul dintre brate: r=q/p;Diferenta dintre brate:d=q-p;Diferenta dintre brate:d=q-p;

Indice centromeric: I c=(p/p+q) 100Indice centromeric: I c=(p/p+q) 100

CitogeneticaCitogenetica

• Studiul cromozomilor si a anomaliilor Studiul cromozomilor si a anomaliilor cromozomiale:cromozomiale:

- in metafaza - in metafaza /interfază (FISH)/interfază (FISH)

- Normal 46 cromozomi: 22 perechi - Normal 46 cromozomi: 22 perechi cromozomi somatici +2 cromozomi sexuali cromozomi somatici +2 cromozomi sexuali XX sau XYXX sau XY

CCiitogenetictogeneticaa

1/3 din sarcini sunt avortate spontan1/3 din sarcini sunt avortate spontan

• 50% din avorturile de trim I 50% din avorturile de trim I au ca etiologie o au ca etiologie o

anomalie cromozomialăanomalie cromozomială

1% 1% din n.n. vii sunt purtători ai unei aberaţii din n.n. vii sunt purtători ai unei aberaţii

cromozomialecromozomiale

• Prezenţa a 3 sau mai multe avorturi spontane Prezenţa a 3 sau mai multe avorturi spontane

→→ analiza cromozomilor la genitori analiza cromozomilor la genitori

CCarariiototipip –ordonarea –ordonarea cromozomilor metafazici cromozomilor metafazici în funcţie de mărime, în funcţie de mărime, poziţia centromerului , poziţia centromerului , prezenţa constricţiilor prezenţa constricţiilor secundare şi a sateliţilor secundare şi a sateliţilor şi a altor caracteristici şi a altor caracteristici morfologicemorfologice

Metode de cariotipareMetode de cariotipare• Tipuri de ţesuturi utilizateTipuri de ţesuturi utilizate

– făt/embrionfăt/embrion: amniocentesis: amniocentesis– biopsia de vilozităţi corialebiopsia de vilozităţi coriale

– Adult : Adult : sânge perifericsânge periferic ( (limfocitelimfocite))– ccelule din mucoasa elule din mucoasa

bucalăbucală– fibroblastefibroblaste – celule din măduva celule din măduva

osoasăosoasă

Metode de cariotipareMetode de cariotipare• 5 ml of 5 ml of sânge recoltat pe heparinăsânge recoltat pe heparină.   .   /10ml lichid amniotic obţinut prin /10ml lichid amniotic obţinut prin

amniocentezăamniocenteză..• Etapă de centrifugare în vederea Etapă de centrifugare în vederea

obţinerii unui sediment celularobţinerii unui sediment celular• Cultivarea celulelor pe medii de cultură Cultivarea celulelor pe medii de cultură

speciale în prezenţa antibioticelor şi a speciale în prezenţa antibioticelor şi a unor stimulente mitotice unor stimulente mitotice (fitohemaglutinina)(fitohemaglutinina). .

• Oprirea diviziunilor celulare în mOprirea diviziunilor celulare în metafazaetafaza prin adăugarea colchicinei (distruge prin adăugarea colchicinei (distruge fusul de diviziune)fusul de diviziune)..

• Etape de fixare şi hipotonizare. Etape de fixare şi hipotonizare. • Colorarea preparatelor metafazice şi Colorarea preparatelor metafazice şi

vizualizarea lor la microscopul opticvizualizarea lor la microscopul optic. .

Prepararea cariotipuluiPrepararea cariotipului

Metode de cariotipare

• cultivarea celulelor pt.48-72h zile• oprirea diviziunilor in metafază cu colchicină ;•distrugerea celulelor cu soluţii fixator.

metaphase

• Cromozomii metafazici sunt Cromozomii metafazici sunt numerotaţi de la 1-22 în ordinea numerotaţi de la 1-22 în ordinea descrescătoare a talieidescrescătoare a taliei

Braţul scurt

p

q (braţul lung)

Centromer

CentromerulCentromerul

Centromerul conţine o secvenţa de 171pb repetată de 100000 ori denumită secvenţă alpha satelit

• TelomereTelomere : :

Extremităţile cromozomilor

Repetiţii TTAGGG

Subtelomerele conţin secvenţe repetate variabile

Constrictriile secundareConstrictriile secundare sunt zone nespiralizate si sunt zone nespiralizate si necolorate ale crnecolorate ale cr; se gasesc pe cromozomii 1,9,16, pe bratul ; se gasesc pe cromozomii 1,9,16, pe bratul Q in apropierea centromerului, pe cromozomul Y, q median Q in apropierea centromerului, pe cromozomul Y, q median sau pe cromozomii acrocentrici,p in jurul organizatorului sau pe cromozomii acrocentrici,p in jurul organizatorului nuclearnuclear

satelitii sunt formatiuni extratelomerice situate la nivelul p satelitii sunt formatiuni extratelomerice situate la nivelul p al cromozomilor acrocentrici, mai rar pe 17, se datoreaza al cromozomilor acrocentrici, mai rar pe 17, se datoreaza localizarii distale a constrictiei sec pe brat; in jurul org localizarii distale a constrictiei sec pe brat; in jurul org nuclear se afla gene pentru sinteza arn rib(5s,18s,28s)o sub nuclear se afla gene pentru sinteza arn rib(5s,18s,28s)o sub mare:60s(5s+28s), mica 40(18s)mare:60s(5s+28s), mica 40(18s)Organizatorii nucleari sunt locusuri informationale, Organizatorii nucleari sunt locusuri informationale, responsabile pentru decodificarea ADN-ului si sinteza ARN-responsabile pentru decodificarea ADN-ului si sinteza ARN-ribozomal; se asociaza cu cr. Acrocentrici, in aceste zone in ribozomal; se asociaza cu cr. Acrocentrici, in aceste zone in mod exceptional And este transcris si sintetizeaza nucleoli.mod exceptional And este transcris si sintetizeaza nucleoli.

Metode de bandareMetode de bandare• Se folosesc preparatele cromozomiale obţinute prin tehnica clasicăSe folosesc preparatele cromozomiale obţinute prin tehnica clasică•Cromozomii sun supuşi unor tratamente termice,cu acizi/baze/tratamente Cromozomii sun supuşi unor tratamente termice,cu acizi/baze/tratamente enzimatice şi coloraţi cu diferiţi coloranţi.enzimatice şi coloraţi cu diferiţi coloranţi.

•Metode citogenetice clasiceMetode citogenetice clasice• Metoda de bandare Metoda de bandare G – G – Soluţie Soluţie GiemsaGiemsa; evidenţiază heterocromatina; evidenţiază heterocromatina intercalara intercalara, , regiunile de ADN bogate în A-Tregiunile de ADN bogate în A-T; se obtin benzi transversale colorate sau necolorate ; se obtin benzi transversale colorate sau necolorate similare celor din bandarea Q( cele intens luorecnte vor fi intens colorate si invers, similare celor din bandarea Q( cele intens luorecnte vor fi intens colorate si invers, exceptii cr. X, constrictiile sec 1,9,16, care sunt bogate in A,T(bine colorate cu exceptii cr. X, constrictiile sec 1,9,16, care sunt bogate in A,T(bine colorate cu GG, , neevidentiate cu Q)neevidentiate cu Q)• Bandarea Bandarea QQ – – subssubsttanţe fluorescente (anţe fluorescente (FluoresceFluoresceina)ina), heterocromatina constitutiva , heterocromatina constitutiva extracentromerica intercalata printre zonele eucromatidice; prezinta polimorfisme, extracentromerica intercalata printre zonele eucromatidice; prezinta polimorfisme, variatii individuale in functie de marimea si intensitatea zonelor variatii individuale in functie de marimea si intensitatea zonelor ffluorescente, studii luorescente, studii etnice;se obtin benzi transversale luorescente sau nuetnice;se obtin benzi transversale luorescente sau nu• Bandarea Bandarea R – R – benzi de rbenzi de reverseversie benzilor G; evidenţiază telomerele şi eucromatinaie benzilor G; evidenţiază telomerele şi eucromatina; ; Preparatele sunt incubate in solutii alcaline, renaturare si apoi colorate cu Preparatele sunt incubate in solutii alcaline, renaturare si apoi colorate cu Giemsa/acridin orange;Giemsa/acridin orange;•Bandarea C-Bandarea C- pt zona centromericăpt zona centromerică; tratare cu NAOH, renaturare si giemsa; tratare cu NAOH, renaturare si giemsa•Bandarea NOR pt regiunile organizator nucleolar de la nivelul constricţiilor Bandarea NOR pt regiunile organizator nucleolar de la nivelul constricţiilor secundare ale cromozomilor acrocentrici.secundare ale cromozomilor acrocentrici.•Benzile T sunt Benzile T sunt ffolosite pentru zonele reziste din bandarea R, se cololosite pentru zonele reziste din bandarea R, se colooreaza cu reaza cu Giemsa; telomerele sunt evidentiate printr-o coloratie variabila, verde fluorescentaGiemsa; telomerele sunt evidentiate printr-o coloratie variabila, verde fluorescenta

•Cariotipare molecularăCariotipare moleculară• Fluorescence In Situ HybridizationFluorescence In Situ Hybridization (FISH) (FISH)

Bandarea G a cromozomilor

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 X Y

Modelul de benzi este Modelul de benzi este cromozom-specificcromozom-specific

Aranjarea cromozomilor in Aranjarea cromozomilor in cariotipcariotip

Clasificarea cromozomilor în Clasificarea cromozomilor în funcţie de poziţia funcţie de poziţia centromeruluicentromerului

Se vizualizează 350-400 benzi dacă se folosesc cromozomi metafazici şi respectiv 800 benzi dacă se folosesc cromozomi în prometafază

Metacentrici

Submetacentrici: p= 1/3 din q

Acrocentrici:p=1/5-1/10 din q

Met

acen

tric

Sub

met

acent

ric

Acr

ocen

tric

Metode de bandareMetode de bandare

• Clasificarea Clasificarea cromozomilor în cromozomilor în funcţie de:funcţie de:

• 1. 1. talietalie

• 2. pattern2. pattern de de bandarebandare

• 3. 3. poziţia poziţia centromeruluicentromerului

ClasificaClasificarearea ccromoromozomilorzomilor

02_15.jpg02_15.jpg

Metode de bandareMetode de bandare

• ExampExamplu-1q24. lu-1q24.

cromozomul 1, braţul q, regiunea cromozomul 1, braţul q, regiunea 2, banda 42, banda 4

Numerotarea cromozomilor de la 1-22+X/Y

Fiecare braţ este împărţit în regiuni a căror numerotare se face de la centromer către extremităţi

Fiecare regiune în benzi a căror numerotare se face de la centromer către extremităţile regiunii

Heterochromatin vs Heterochromatin vs EuchromatinEuchromatin

Stabilirea poziţiei unor Stabilirea poziţiei unor gene pe cromozomigene pe cromozomi

•Gena intoleranţei la Gena intoleranţei la glucoză se află pe glucoză se află pe 3q263q26

FISHFISH

Proba locus-specifică hibridizează cu o secvenţă unică de pe un anumit cromozom. Proba este marcată prin încorporarea în

structura unui anumit nucleotid (Ex: timina) a unei subsranţe flurescente (fluoresceină, Texas-red, rodamină etc.).

Numărul punctelor fluorescente dintr-o metafază indică indică numărul punctelor de hibridizare.

Etapa 1: denaturarea dublului helix al ADN-ului probei şi al cromozomilor metafazici /interfazici în vederea obţinerii de monocatene prin încălzire la temperaturi ridicate într-o soluţie de formamidă.                                                                       

Etapa 2- se adaugă proba peste lama cu cromozomii metafazici obţinuţi prin tehnica clasică. Lama se acoperă cu o lamelă pentru a împiedica evaporarea şi se introduce la incubator la 37C în vederea obţinerii unei reacţii de hibridizare probă-secvenţă monocatenară cromozomială.

FISH ProbesFISH Probes

centromere

telomere

whole chromosome paint

locus

FISH

Cromozomii metafazici sunt coloraţi cu DAPI, o substanţă fluorescentă ce se leagă de ambele catene de ADN

Sindroame de Sindroame de MicrodeleMicrodeleţieţie: : probe probe llocus Specificocus Specificee

-diagnosticul -diagnosticul microduplicaţiilmicroduplicaţiilor/translocaţiilor/translocaţiiloror

Test FISH pt. a stabili rapid prezenţa unei aberaţii numerice

Cei 3 cromozomi 21 sunt vizualizaţi cu probe marcate cu roşu iar cromozomii 13 cu verde.

Identificarea sindromelor de microdeleţie utilizând probe-control.

William's SyndromeWilliam's Syndrome

• Normal KaryotypeNormal Karyotype

Williams del(7q11)

Prader-Willi del(15q12)

normal

Diagnosticul sindroamelor de microdeleţie

Aneuploidy 13, 18, 21, X and Y

Wolf Hurshorn 4p-Cri du Chat 5p-Williams 7q22-Retinoblastoma 13q14- Angelman 15q12-Prader-Willi 15q12-Miller-Dieker 17p13-Smith-Magenis 17p11-DiGeorge/VCF 22q11-STS Xp22.3-SRY Xp22.3- Kallmans Xp22.3-Sex X and Y

Subtelomeres (46 probes)M-FISH 23 chromosomes paints

Probe pt sdr. De Microdeletie

Centromere for X chromosome 48,XXXX

FISH: Fluorescent IN SITU hybridization green = probe for end of

chromosome 4

red = control probe for centromere of the X chromosome & another probe for end of chromosome X

• TranslocatiiTranslocatii

Figure 8.23Bx

Metoda FISH pe nuclei interfazici

verde = cromozomul 13rosu= cromozomul 21

bleu = cromozomul 18verde = Xrosu = Y

Nuclei de la acelasi produs de conceptie

Se folosesc probe oligonucleodidice marcate fluorecent pt. diagnosticul aneuplidiilor cromozomilor 13, 18, 21, X, si Y

FISH cu probe marcate coresumzătoare cromozomului Y

Cromozomi metafazici şi interfazici

FISH pe nuclei interfazici cu probe pt X marcate cu verde şi pt Y marcate cu roşu.

Prezenţa de mozaicisme

Mozaicisme gonosomale 47,XYY/46XY/47,XXY

Diagnosticul genetic prenatal prin metodaDiagnosticul genetic prenatal prin metoda FISHFISH

M-FISH (SKY)

Cromozomul"Philadelphia " Cromozomul"Philadelphia " Translocatie 9:22 Translocatie 9:22

CML

Philadelphiatranslocation

Relatively good prognosis in CML Relatively poor prognosis in ALLAdditional chromosome changes: +8, iso(17q), +19,+Ph1, - blast crisis = poor prognosis

Indicatii clinice pentru Indicatii clinice pentru analiza cromozomiloranaliza cromozomilor• Deficitul cresterii pre-/postnatalDeficitul cresterii pre-/postnatalee

• Avort spontan/n.n. mortAvort spontan/n.n. mort

• Sterilitate/infertilitateSterilitate/infertilitate

• Istoric familial de rearanjament Istoric familial de rearanjament cromozomialcromozomial

• Valori anormale ale markerilor serici Valori anormale ale markerilor serici materni/anomalii fetale depistate ecograficmaterni/anomalii fetale depistate ecografic

• NeoplaziiNeoplazii