Metode Imunokimiauntuk analisis senyawa aktif

Marlia Singgih WibowoSchool of Pharmacy

Institut Teknologi Bandung

Analisis Imunokimia

Berdasarkan prinsip reaksi spesifik antara Antigen-Antibodi

Penggunaan senyawa penanda (label) untuk visualisasi reaksi

Deteksi menggunakan metode fisiko-kimia

Prinsip Reaksi : meniru reaksi imunologi dalam tubuh

Reaksi imunologi di dalam mamalia :

AgAb Reaksi primer

Reaksi sekunder

Reaksi tersier (degranulasi,opsonisasi)

(Fiksasi komplemen, aglutinasi, presipitasi)

memicu

Mengapa reaksi Antigen-Antibodi?

Reaksi dan kekuatan antibodi untuk “specific and reproducible protein binding”

Prinsip reaksi : immunoassays

Antigen-Antibody Interaction for analysis

SUBSRATE

PRODUCT (visualized)Complex

Ag-Ab-Label

Metode analisis berbasis imunokimia

Imunopresipitasi Imunoaglutinasi Imunokimia berlabel : EIA/ELISA (Enzyme ImmunoAssay) RIA (Radio ImmunoAssay) IFA (ImmunoFluorescence Assay) LIA (Luminescence Immuno Assay) dll

Antigen (antibody generator)

Senyawa atau kompleks senyawa yang dapat menginduksi sistem imun mamalia

Sifat : Imunogenik : induksi/stimulasi sistem imun mamalia

Antigenik : bereaksi spesifik dengan antibodi Syarat antigen: High Molecular Weight (>5000),

chemical structure → Complex Jika MW < 5000, supaya bersifat imunogenik dan

antigenik dapat dikonjugasi dengan suatu protein untuk meningkatkan immunogenicity

Yang dapat menjadi antigen

Mikroba patogen dan atau toksin mikroba Toksin tanaman, hewan Protein spesifik atau senyawa lain yang

berstruktur spesifik Senyawa obat (narkotik, psikotropik), tidak

imunogenik, tetapi dapat dikonjugasi dengan suatu protein carrier (contoh : BSA)

Senyawa pestisida, dll.

Apakah Antibodi? Antibodi adalah protein yang disekresi oleh

sel plasma limfosit B akibat stimulasi molekul asing (antigen) pada reseptor antigen limfosit B

Spesifik terhadap antigen yang memicunya Antibodi adalah molekul-molekul

glikoprotein yang dikenal sebagai immunoglobulin: IgA, IgD, IgM, IgE, IgG

SIFAT UMUM ANTIBODI Antibodi memiliki spesifisitas dan aktivitas biologi Struktur Antibodi : Dua fragmen tempat

berikatannya antigen secara spesifik, disebut sebagai fragmen Fab (fragment antigen binding) yang univalen, masing-masing memiliki satu situs pengikatan dan identik satu sama lain dalam segala hal

Fragmen ketiga adalah Fc (Fragment crystallisable), fragmen yang dapat dikristalkan, tidak berikatan dengan antigen, tetapi bertanggung jawab untuk fungsi biologik molekul antibodi setelah antigen berikatan dengan daerah Fab dari molekul utuh

Struktur Antibodi

Terdiri dari dua rantai berat (heavy chain = H) dan dua rantai ringan (light chain = L).

Rantai H IgG () memiliki massa molekul sekitar 50 –55 kDa, sementara rantai H IgM (μ) memiliki massa molekul sekitar 65 – 70 kDa.

Rantai L (dengan massa molekul 20 – 25 kDa) memiliki isotype kappa atau lambda dan ditemukan berikatan dengan seluruh kelas rantai H.

Rantai peptida ini berikatan melalui ikatan non-kovalen dan jembatan kovalen disulfida. Ikatan disulfida ini relatif terekspos dan oleh karena itu dapat mudah di reduksi atau oksidasi.

Domain konstan (Fc) IgG dan IgM dapat berinteraksi dengan sel dan sistem efektor dalam tubuh, dan domain variabel (Fab) nya dapat berinteraksi dengan antigen.

Lokasi pada struktur antigen tempat berikatan dengan antibodi disebut ‘epitope’ atau disebut ‘antigenic determinant’, sedangkan lokasi pada struktur antibodi yang dapat berikatan dengan antigen disebut ‘paratop’.

IgG and IgM

IgG IgM

Specificity and Selectivity

Monoclonal Antibody Polyclonal Antibody Recombinant Monoclonal Antibody

KELEBIHAN ANTIBODI MONOKLONAL DIBANDINGKAN POLIKLONAL

Dapat menjamin keseragaman kandungan antibodi yang dihasilkan karena berasal dari satu jenis klon saja yang diproduksi secara berulang dari suatu kumpulan sel hibrid yang telah diseleksi sebelumnya.

Mengurangi kemungkinan terjadinya reaksi silang atau reaksi non-spesifik seperti yang dapat terjadi pada penggunaan antibodi poliklonal.

Kekuatan atau afinitas kecepatan reaksi antigen-antibodi monoklonal umumnya lebih kuat dibandingkan dengan ikatan antigen-antibodi poliklonal.

Proses pemurnian lebih mudah karena relatif lebih sedikit jenis kandungan antibodinya.

Dapat digunakan untuk tujuan terapi yaitu antara lain untuk perbaikan overdosis obat, mengurangi resiko transplantasi organ, deteksi tumor metastasis, dan sebagai obat target sitotoksik.

Teknik lain untuk produksi antibodi monoklonal Teknologi Antibody Expression Libraries, yaitu konstruksi

cDNA dari mRNA yang diisolasi dari sel B manusia atau murine

Gen IgG diamplifikasi dengan cara PCR, lalu rantai berat dan ringan nya dikonstruksi dengan cara digesti dan insersi ke dalam bakteriofaga atau plasmid yang sesuai.

Rekombinasi random terjadi , lalu diekspresi di dalam bakteri, skrining dengan western blot

Klon yang positif diisolasi dan diperbanyak untuk menghasilkan antibodi Fab yang murni

Mudah melakukan kimerisasi, perubahan afinitas,dan modifikasi fungsi efektor

Penggunaan Prinsip reaksi Antigen-Antibodi di bidang Farmasi

Clinical Diagnosis , misalnya Serodiagnosis untuk Penyakit Infeksi

Drug Monitoring and Toxicology Cancer Research Proteomic Study

KINETIKA INTERAKSI ANTIGEN-ANTIBODI

Antigen-Antibody Interaction

Prinsip ELISA (Enzyme Linked-Immunosorbent Assay)

Antigen

AntibodiKompleks Ag-Ab

Konjugat enzim pada Ag-Ab

Substrat

Produk berwarna

Reaksi enzimatik

Kinetika reaksi Antigen-Antibodi

Reaksi reversibel

Ag + Ab Ag-Abk1

k2

k1 dan k2 adalah konstanta laju asosiasi dan disosiasi

Laju pembentukan kompleks Ag-Ab :

d (Ag-Ab)

dt= k1(Ag) (Ab) – k2 (Ag-Ab)

k1/k2 =(AgAb)

(Ag) (Ab)= K (konstanta kesetimbangan)

Bila antibodi memiliki aviditas atau afinitas tinggi, maka K tinggi, demikian sebaliknya

B (terikat)

B/F (rasio terikat dan bebas)

0

5.00

5.00

Bila F adalah antigen bebas, dan B adalah antigen yang terikat, Abx adalah konsentrasi awal Ab,maka pada kesetimbangan :

K = k1/k2 = (Ag-Ab)/(Ag)(Ab)

= B / F [(Abx)-B]

Jadi B/F = K [(Abx)-B]

Slope = -K, potongan dgn x adalah b, potongan dgn y adalah Kb

Reaksi pada permukaan bahan padat dan cair

Kebanyakan metode imunokimia yang ada dibuat dalam media/fase padat (solid phase) untuk memudahkan proses pemisahan dalam percobaan yang heterogen

Ketika antigen diimobilisasi pada fase padat, ikatan antibodi tergantung pada laju difusi dan ikatan pada konsentrasi diatas 1 pmol/cm2 dipengaruhi oleh interaksi sterik

Reaksi pada fase padat memiliki laju reaksi intrinsik dan reaksi balik yang lebih kecil dibandingkan reaksi di dalam larutan

Oleh karena itu reaksi Ag-Ab pada fase padat-cair secara praktis merupakan reaksi irreversibel

Parameter analisis

Sensitivitas Spesifisitas Selektivitas

Hal yang mempengaruhi parameter : Reaksi silang Adanya senyawa yang mempengaruhi

aviditas reaksi Ag-Ab, misalnya garam, urea

Bagaimana menentukan jenis analisis imunokimia berlabel?

Reaktan apa yang akan diberi label, antigen (analit) atau antibodi?

Apakah antigen atau antibodi yang akan ditentukan?

Apakah analisis kompetitif atau non-kompetitif?

Apakah sistem analisis homogen atau heterogen?

Pengelompokkan jenis analisis imunokimia

1. Analisis kompetitif untuk antigen/hapten dengan analit yang diberi label

2. Analisis kompetitif untuk antigen/hapten dengan antibodi yang diberi label

3. Analisis imunokimia yang tergantung pada deteksi langsung kompleks imun

4. Analisis imunokimia dengan melibatkan label dan reaksi khusus yang berlebih

5. Analisis imunokimia untuk mengukur antibodi spesifik

6. Analisis imunokimia yang melibatkan pereaksi berlabel dimana hasil reaksi Ag-Ab merupakan penguatan sinyal

1. Analisis kompetitif untuk antigen/hapten dengan analit yang diberi label : Analisis ini mirip dengan analisis radiokimia klasik, melibatkan penggunaan sejumlah terbatas antibodi. Analit dapat dilabel dengan senyawa radioaktif, fluoresensi, luminesensi atau enzim.

2. Analisis kompetitif untuk antigen/hapten dengan antibodi yang diberi label : analisis ini berguna ketika antigen atau hapten yg dilabel memiliki sifat yang kurang menguntungkan, misalnya kelarutan yang rendah dalam medium reaksi. Dalam reaksi digunakan analit imobilisasi dengan jumlah tetap dan terbatas. Sensitivitas reaksi tergantung pada afinitas antibodi berlabel

3. Analisis imunokimia yang tergantung pada deteksi langsung kompleks imun: analisis yang dilihat langsung yaitu presipitasi, turbidimetri, aglutinasi, perhitungan partikel

4. Analisis imunokimia dengan melibatkan label dan reaksi khusus yang berlebih: analisis sandwich seperti 2-site immunometric assay, dan ELISA. Analit diinkubasi dengan antibodi berlabel dalam jumlah berlebih, antibodi yang tidak berikatan akan dibuang

1. Analisis imunokimia untuk mengukur antibodi spesifik : analisis ini melibatkan antigen amobil berlebih pada fase padat untuk menangkap antibodi spesifik di dalam sampel.

2. Analisis imunokimia yang melibatkan pereaksi berlabel dimana hasil reaksi Ag-Ab merupakan penguatan sinyal: analisis ini termasuk imunokimia homogen untuk memberikan efek 100% modulasi sinyal dari label yang digunakan

Reaksi Imunokimia dengan jumlah antibodi berlebih (tipe I)

Analit + antibodi → kompleks Ag-Ab → sisa antibodi Sensitivitas maksimum dicapai pada jumlah antibodi

yang tidak terhingga Sensitivitas adalah 1 molekul analit (teoritis) Antigen yang dapat bereaksi silang berpotensi

reaksi seimbang dengan sistem antibodi berlebih Reaksi antigen-antibodi hanya sedikit dipengaruhi

oleh senyawa seperti garam atau urea Waktu analisis relatif cepat dengan antibodi berlabel

2-site immunometric sandwich assay(non-kompetitif untuk Ag polivalen)

Ukur aktivitas labelnya

Ab1 Ag

pencucian

Ab2 berlabel

ditambahkan berlebih

inkubasi

Pencucian dan inkubasi

Analit + antibodi → kompleks Ag-Ab → sisa antigen Sensitivitas maksimum dicapai ketika konsentrasi

antibodi mendekati 0 Penjenuhan ini diatur oleh konstanta kesetimbangan Sensitivitas tergantung pada konstanta afinitas

antibodi Sensitivitas maksimum 10-14 mol/liter (teoritis) Antigen yang dapat bereaksi silang akan

menunjukkan kekuatan relatifnya tergantung pada laju konstanta kesetimbangan antara analit dan antigen cross-reactant tersebut

Reaksi dalam percobaan lambat karena kesetimbangan harus tercapai

Reaksi Imunokimia dengan jumlah antigen berlebih (tipe II)

Imunokimia kompetitif dengan analit berlabel

+ +Ag Ag-berlabel Ab

+

Analit berlabel berkompetisi dengan antigen tidak berlabel untuk berikatan dengan antibodi.Aktivitas spesifik dari fraksi analit berlabel yang terikat dgn antibodi berbanding terbalik dengan konsentrasi analit bebas

Sensitivitas metode

Kesalahan eksperimen paling besar kira-kira 17%

Konstanta kesetimbangan antibodi kira-kira 10-11 liter/mol

Sensitivitas tertinggi (limit deteksi) kira-kira 10-13 mol/liter (kira-kira 108 molekul per mL)

ANALISIS IMUNOKIMIA

DENGAN LABEL NON-RADIOAKTIF

Karakteristik suatu label untuk analisis imunokimia

Memiliki aktivitas spesifik Mudah dideteksi Tidak berbahaya

Aktivitas spesifik label berhubungan dengan :

Fraksi pada label yang akan digunakan untuk deteksi

Derajat amplifikasi Efisiensi deteksi

Syarat Enzim yang ideal sebagai label Memiliki aktivitas tinggi pada konsentrasi (Km

rendah) Stabil pada kondisi reaksi (biasanya pH netral) Mudah dikonjugasi ke molekul lain untuk reaksi

lanjutan atau dalam penyimpanan Tersedia dalam keadaan murni (high purity) Harga murah Mudah dideteksi dengan cara yang sederhana Tidak terdapat di dalam cairan sampel biologi yang

akan diuji

Contoh enzim sebagai label

Enzim dan sumber

pH optimum Aktiv.spes (U/mg, 37 C)

BM

Alkalinfosfatase (usus sapi)

8-10 1000 100.000

-galaktosidase (E.coli)

6-8 600 540.000

HRP (lobak) 5-7 4500 40.000

Enzim lain : amilase, katalase, urease, xantin-oksidase, heksokinase, adenosin deaminase, invertase, -laktamase, dll.

Enzim dan sumbernya B-galaktosidase Peroksidase Glukosa oksidase A-amilase G6PDH MDH Heksokinase Propionil-CoA-karboksilase Lisozim

Escherichia coliLobakAspergillus sp.Bacillus subtilisLeoconostoc mesenteroidesLactobacillus arabinosusSaccharomyces sp.Saccharomyces sp.Egg-white

Senyawa berfluoresensi sebagai label Pada saat molekul fluoresensi dieksitasi oleh sinar

terpolarisasi, polarisasi sinar yang teremisi tergantung pada rotasi acak yang terjadi selama proses eksitasi

Semakin kecil molekul, makin cepat rotasi yg terjadi dan sinyal semakin kecil

Pada IFA, senyawa fluoresensi sebagai label yang terkonjugasi dengan Ag atau Ab, akan tereksitasi, lalu setelah ikatan Ag-Ab, rotasi diperlambat, dan polarisasi meningkat

Oleh karena itu, untuk label ukuran dan rotasi label bebas menjadi hal yang penting, karena akan mempengaruhi polarisasi label yang terikat

Syarat ideal Senyawa Fluoresensi sebagai label

Memiliki intensitas fluoresensi yang tinggi (absorptivitas molar tinggi)

Stoke shift > 50 nm untuk mengurangi pengaruh “latar belakang” (background) akibat scattering

Larut dalam air Mudah dikonjugasi dengan molekul lain Harga murah

Contoh label fluoresensiFluorofor Quantum

yieldLifetime (ns) Emisi/eksita

si (nm)Absorptivitas

(liter/mol)

Dansil klorida

0,3 14,0 480-520/340 3,4x10 3

Fluoresein isotiosianat

0,85 4,5 520/492 7x10 4

Rhodamin B isotiosianat

0,7 3,0 585/550 1,2x10 4

Senyawa kelat dari logam lantanida saat ini banyak digunakan untuk label fluoresensi

Europium, terbium, samarium, memiliki emisi fluoresensi yang panjang (mikrodetik sampai milidetik)

Dapat menghilangkan pengaruh background

Reaksi silang (cross-reaction)

Ketepatan suatu analisis tergantung pada spesifisitas nya

Reaksi Antigen-Antibodi bersifat spesifik, namun dapat pula terjadi reaksi silang, yaitu reaksi dengan sebagian atau seluruh struktur kimia dari analit lain

Reaksi silang dievaluasi dengan cara membandingkan kemampuan masing-masing analit terhadap ikatan dengan label

B (%)

Cross-reactantStd

x1 x2

100

50

Log konsentrasi

% reaksi silang = konsentrasi Std (x1) / konsentrasi cross-reactant (x2) x 100%

Perkembangan metode Imunokimia Penggunaan sintetik peptida untuk epitop spesifik

pada Ag virus Metode Scintillation Proximity : Radioimunokimia

menggunakan fluomicrosphere yang dilapisi dengan Ab atau reseptor. Fluomicrosphere ini akan menghasilkan sinyal bila Ab atau molekul reseptor berikatan dengan ligand yang dilabel dengan radioaktif (3H atau 125I)

Metode Idiometrik (Idiometric assay) : non-kompetitif untuk pengukuran senyawa molekuler yang kecil

Ultrasensitive two-site enzyme immunoassay

Metode Scintillation Proximity

FI A + L* FI A L*

sinar

Radiasi

Suatu Ligand radioaktif berikatan dengan molekul akseptor (A) yang terikat pada molekul fluomikrosfer, yang setelah diradiasi akan memancarkan sinar

Metode Idiometrik Pada metode ini digunakan tambahan dua jenis

antibodi “anti-idiotipik” (anti-idiotypic antibody) selain antibodi utama

Antibodi anti-idiotipik alfa dan beta Alfa akan mengenali epitop dalam daerah variabel

Ab utama, dan tidak sensitif terhadap ada atau tidaknya analit pada situs ikatannya

Beta akan berkompetisi dengan analit pada bagian paratop (daerah ikatan Ag pada Ab)

Biasanya digunakan untuk antigen kecil , misalnya estradiol

Ultrasensitive two-site enzyme immunoassay

Untuk mengukur kadar antigen yang sangat kecil : Chorionic gonadotropin dalam serum atau plasma

(pada kasus tumor) Thyrotropin dalam serum darah Luteinizing hormon dalam serum darah anak-

anak Growth hormon