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Dall’Olivo all’Olio: “Analisi Chimico-Fisiche e Strumentali dell’Olio” Capitolo VII

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Capitolo VII

ANALISI CHIMICO-FISICHE E STRUMENTALI DEGLI OLI

Le analisi che sono effettuate sui campioni d’olio, si dividono in due categorie: Qualità analisi che accertano la qualità dell'olio (chimico-fisiche):

sono i saggi di acidità, dei perossidi, l'analisi all'U.V., la composizione acidica, sterolica, quella dei solventi alogenati e quella al gascromatografo; la conservabilità in particolare da N°perossidi, UV, acidità, panel test, tempo di induzione;

Genuinità analisi che accertano la genuinità dell'olio: composizione acidica, sterolica, analisi UV, analisi solventi alogenati, differenza ECN 42 HPLC e ECN 42 calcolo teorico (non trattato).

Acidità Libera

Questo tipo di analisi esprime la percentuale di acido oleico (libera) presente nel prodotto. Tale percentuale di acidità è sulla quantità di acidi grassi liberi; questi ultimi si possono riscontrare soltanto dopo l'estrazione dell'olio dal frutto, poiché all'interno sono neutri. Gli acidi grassi liberi derivano come prodotto di alcune reazioni enzimatiche, innescate da enzimi lipolitici, durante la maturazione del frutto (vedi alterazioni: irrancidimento idrolitico) o a causa di una cattiva conservazione del frutto. Proprio per questo motivo l'analisi dell'acidità è considerata come parametro per stabilire la qualità di un olio di oliva. Un punto critico che può alterare il valore di acidità, è rappresentato dal sistema di trasporto delle olive e dallo stoccaggio dei frutti: sono quindi da evitare tutti quei sistemi di trasporto che provocano un ammassamento dei frutti, che possono risultare come promotori di processi di fermentazione, inoltre per evitare questo devono essere minimi i tempi che intercorrono fra la raccolta dei frutti e la loro lavorazione. La presenza elevata di questi acidi grassi liberi (superiori al 3-4%) rende un olio non commestibile, poiché avrebbero un'azione irritante sulla mucosa gastroenterica oltre che una sgradevole sensazione in bocca.

00.1 Determinazione dell'Acidità Libera OGGETTO . Determinazione degli acidi grassi liberi negli oli d'oliva. Il tenore in acidi grassi liberi è espresso in acido oleico mediante l'acidità calcolata in modo convenzionale.

SISTEMI DI ANALISI AUTOMATICA

analizzatore automatico di ac libera


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Protocollo 1.1. Principio. Dissoluzione di una aliquota della sostanza da analizzare in una miscela di solventi, poi titolazione degli acidi grassi liberi presenti mediante una soluzione etanolica di idrossido di potassio. 1.2. Reattivi. Tutti i reattivi devono essere di qualità analitica riconosciuta; l'acqua impiegata deve essere distillata o di purezza equivalente.

1.2.1. Etere dietilico - etanolo al 95 % (V/V), miscela 1/1 in volume. (Nota: l'etere etilico è molto infiammabile e può formare perossidi esplosivi. Esso deve pertanto essere usato con precauzioni particolari.) Neutralizzare esattamente al momento dell'impiego con la soluzione di idrossido di potassio (1.2.2) in presenza i 0,3 ml della soluzione di fenolftaleina (1.2.3) per 100 ml di miscela. (Nota: se non è possibile usare l'etere etilico, si può ricorrere a una miscela di solventi costituita da etanolo e da toluene. Se necessario, l'etanolo può essere sostituito dal 2-propanolo.). 1.2.2. Idrossido di potassio, soluzione etanolica titolata KOH 0,1M. La concentrazione esatta della soluzione etanolica di idrossido di potassio deve essere nota e verificata immediatamente prima dell'uso. Impiegare una soluzione preparata almeno 5 giorni prima dell'uso e decantata in un flacone di vetro bruno chiuso. La soluzione deve essere incolore o giallo pallida. Nota: una soluzione incolore stabile di idrossido di potassio può essere preparata come segue.

epoca di raccolta e proprietà

Portare e mantenere per un'ora all'ebollizione a ricadere 1000 ml di etanolo con 8 g di idrossido di potassio e 0,5 g di trucioli di alluminio. Distillare immediatamente. Sciogliere nel distillato il quantitativo necessario di idrossido di potassio. Lasciar riposare per parecchi giorni e decantare il liquido chiaro sopranatante del precipitato di carbonato di potassio. La soluzione può essere preparata altresì senza distillazione, come segue. A 1000 ml di etanolo aggiungere 4 ml di butilato di alluminio e lasciar riposare la miscela per qualche giorno. Decantare il liquido sopranatante e sciogliervi il quantitativo necessario di idrossido di potassio. Questa soluzione è pronta per l'uso. 1.2.3. Fenolftaleina, soluzione di 10 g/l in etanolo al 95-96 % (V/V) o blu alcalino (nel caso di sostanze grasse fortemente colorate), soluzione di 20 g/l nell'etanolo al 95-96 % (V/V). 1.3. Apparecchiatura. Materiale corrente da laboratorio: -Bilancia analitica, -Beuta da250 ml, -Buretta graduata da 10 ml, div. 0,05 ml. 1.4. Modo di operare. 1.4.1. La determinazione si effettua sul campione filtrato, se la somma umidità + impurezze è inferiore all'1 %, sul campione tal quale. 1.4.2. Sostanza da analizzare. Prelevare un'aliquota della sostanza da analizzare, a seconda del numero di acidità presunto, secondo le indicazioni della seguente tabella.

Numero di acidità presunto

Massa della sostanza da analizzare (in g)

Precisione della pesata della sostanza da analizzare (in g)

< 1 20 0,05

1 a 4 10 0,02

4 a 15 2,5 0,01

15 a 75 0,5 0,001

> 75 0,1 0,0002 Pesare la sostanza da analizzare nella beuta (1.3.2).


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1.4.3.Determinazione. Sciogliere l'aliquota di sostanza da analizzare (1.4.2) in 50-150 ml della miscela etere etilico/etanolo (1.2.1) precedentemente neutralizzata. Titolare, agitando, con la soluzione di idrossido di potassio di 0,1M (1.2.2) fino a viraggio dell'indicatore (colorazione rosa della fenolftaleina persistente per almeno 10 s). Nota 1: La soluzione etanolica titolata di idrossido di potassio (1.2.2) può essere sostituita con una soluzione acquosa di idrossido di potassio o di sodio se il volume d'acqua introdotto non comporta una separazione di fasi. Nota 2: Se il quantitativo necessario di soluzione di idrossido di potassio di 0,1 mol/l supera i 10 ml, usare una soluzione di 0,5 mol/l. Nota 3: Se la soluzione diventa torbida durante la titolazione, aggiungere un quantitativo sufficiente della miscela di solventi (1.2.1) per ottenere una soluzione chiara. 1.5. Espressione dell'acidità come % di acido oleico. L'acidità espressa come percentuale in massa, è pari a:

V * c * M *100/( 1000 * m) = V * c * M /( 10 * m ) Dove: V = è il volume, in millilitri, della soluzione titolata di idrossido di potassio usata; c = è la concentrazione esatta, in moli per litro, della soluzione titolata di idrossido di potassio usata; M = è il peso molare, in grammi per mole, dell'acido adottato per l'espressione del risultato (acido oleico = 282); m = è il peso, in grammi, della sostanza da analizzare. Prendere come risultato la media aritmetica di due determinazioni.

00.2 Determinazione dei Perossidi 1. OGGETTO

Metodo per la determinazione del numero di perossidi in oli e grassi. 2. CAMPO D'APPLICAZIONE Oli e grassi animali e vegetali. 3. DEFINIZIONE Il numero di perossidi è il quantitativo delle sostanze presenti nel campione, espresse in milliequivalenti di ossigeno attivo per kg (meq.O2/kg), che ossidano lo ioduro di potassio nelle condizioni che vengono descritte.

4. PRINCIPIO Trattamento della sostanza in esame, sciolta in acido acetico e cloroformio, con una soluzione di ioduro di potassio. Titolazione dello iodio liberato con soluzione di tiosolfato di sodio standardizzata.

5. APPARECCHIATURA Tutta l'apparecchiatura usata deve essere esente da sostanze riducenti od ossidanti. Nota: Non ungere le superfici smerigliate. 5.1. Ditale di vetro da 3 ml. 5.2. Palloni a collo e (tappo smerigliato), aventi una capacità di circa 250 ml, previamente asciugati e riempiti di gas puro, secco inerte (azoto o, di preferenza, anidride carbonica). 5.3. Buretta da 25 o 50 ml, graduata in 0,1 ml. 6. REAGENTI 6.1. Cloroformio, di qualità per reagente analitico, liberato dall'ossigeno facendovi gorgogliare una corrente di gas inerte puro e secco. 6.2. Acido acetico glaciale, di qualità per analisi, liberato dall'ossigeno facendovi gorgogliare una corrente di gas puro e secco. 6.3. Ioduro di potassio, soluzione acquosa satura, di recente preparazione, esente da iodio e da iodati. 6.4. Tiosolfato di sodio, 0,01 o 0,02 N, soluzione acquosa accuratamente standardizzata immediatamente prima dell'uso.


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6.5. Soluzione di amido, dispersione acquosa di 10 g/l, di recente preparazione da amido naturale solubile. 7. CAMPIONE Prelevare il campione e conservarlo al riparo dalla luce, tenendolo al fresco e mettendolo in contenitori di vetro completamente riempiti, sigillati ermeticamente con tappi a smeriglio o di sughero. 8. PROCEDIMENTO La prova deve essere effettuata alla luce del giorno diffusa oppure alla luce artificiale. Pesare in un ditale di vetro (5.1) oppure, in mancanza, in un pallone (5.2) con l'approssimazione di 0,001 g, una massa del campione conformemente alla seguente tabella e al numero di perossidi previsto:

Numero di perossidi previsto Peso della sostanza da analizzare

meq in g

0 - 12 5,0 - 2,0

12 - 20 2,0 - 1,2

20 - 30 1,2 - 0,8

30 - 50 0,8 - 0,5

50 - 90 0,5 - 0,3

Stappare un pallone (5.2) ed introdurre il ditale di vetro contenente la sostanza da analizzare. Aggiungere 10 ml di cloroformio (6.1). Sciogliere la sostanza da analizzare rapidamente, agitando. Aggiungere 15 ml di acido acetico (6.2), quindi 1 ml di soluzione di ioduro di potassio (6.3). Ritappare rapidamente, agitare per 1 minuto e lasciar riposare per 5 minuti esatti al riparo dalla luce, ad una temperatura compresa tra 15 e 25°C. Aggiungere circa 75 ml di acqua distillata. Titolare lo iodio liberato con una soluzione di tiosolfato di sodio (6.4) (soluzione 0,002N per valori previsti inferiori a 12 e soluzione 0,01N per valori previsti superiori a 12) agitando vigorosamente, usando la soluzione di amido (6.5) come indicatore. Eseguire due determinazioni sullo stesso campione di sostanza. Eseguire contemporaneamente una prova in bianco. Se il risultato del bianco supera 0,05 ml di soluzione 0,01N di tiosolfato di sodio (6.4), sostituire i reagenti impuri. 9. ESPRESSIONE DEI RISULTATI. Il numero di perossidi (P.V.), meq.O2/kg, viene dato dalla formula:

P.V. = (V · T)*1000/m Dove: V = è il numero di ml della soluzione standardizzata di tiosolfato di sodio (6.4) usata per la prova, corretto in modo da tener conto della prova in bianco. T = è la normalità esatta della soluzione di tiosolfato di sodio (6.4) usata. m = è il peso in g della sostanza da analizzare. Considerare come risultato la media aritmetica delle due determinazioni eseguite.


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00.3 Determinazioni all'UV-Visibile

Le frodi

Alcune frodi comuni: a) extravergini contenenti oli raffinati, di oliva e di semi; b) oli con parametri analitici non conformi alla classificazione; c) oli di semi commercializzati come oli di oliva.

00.3.1 Analisi spettrale U.V.

Questo esame, oltre a fornire utili elementi di giudizio sulla qualità di un olio, ha permesso di risolvere definitivamente il problema del riconoscimento dell'olio rettificato eventualmente aggiunto all'olio di oliva vergine, sfruttando il fatto che gli oli naturali di pressione non contengono doppi legami coniugati che invece si formano, sia pure in misura minima, durante la rettifica, particolarmente nella fase di decolorazione su terre attive. Ne consegue che i rettificati presentano valori di assorbimento nell'UV, particolarmente nella zona intorno ai 270 nm, notevolmente superiori a quelli dei vergini. Infatti i gruppi etilenici isolati, oppure i gruppi carbossilici degli acidi grassi, presentano massimi di assorbimento tra 175 e 185 nm, cioè al di fuori della zona utilizzabile dello spettro UV che inizia, come noto, a lunghezze d'onda superiori a 200 nm. Invece la formazione di idroperossidi in acidi grassi polinsaturi provoca uno slittamento del doppio legame con formazione di un sistema dienico coniugato che assorbe a 232 nm.

Durante la rettifica degli oli lampanti perossidati, il passaggio su terre attive provoca la formazione di trieni coniugati (aventi una banda di assorbimento, con tre massimi, intorno ai 270 nm) verosimilmente per decomposizione di un idroperossido linoleico. Anche la formazione di composti chetonici, per ossidazione ancora più spinta, provoca un maggiore assorbimento che si manifesta attorno ai 270 nm. L'esame UV viene condotto sull'olio disciolto in opportuno solvente (cicloesano o isottano) nell'intervallo compreso tra i 220 e i 280 nm. Le lunghezze d'onda più significative sono 232, 262, 268 e 274 nm.


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Metodo Ufficiale, (Gazzetta Ufficiale ‘63)

Protocollo L 'olio da esaminare deve essere perfettamente limpido; in caso contrario si filtra su carta. In un palloncino tarato da 50 ml si pesano esattamente 0,5 g circa di olio; se l'operatore ha motivo di ritenere che l'olio in esame presenti valori di assorbanza elevati (olio rettificato, olio di sansa) è opportuno pesare quantitativi minori (0,2-0,3 g) in modo da leggere valori di assorbanza non superiori a 0,8. Si aggiunge isottano spettrofotometricamente puro e si porta a volume, agitando per omogeneizzare la soluzione con la quale si riempie una vaschetta prismatica in quarzo per spettrofotometria UV dello spessore

di 1 cm. Si dispone la cuvetta nell'apposito alloggiamento dello spettrofotometro e si ricava lo spettro nell'intervallo compreso tra i 220 e i 280 nm, contro bianco di solvente puro,. Si prende nota dei valori di assorbenza. Con gli oli di oliva vergine, rettificato e di sansa si ottengono gli spettri di assorbimento riportati nella figura.

Conclusioni Il comportamento spettrale è notevolmente diverso nei tre tipi di olio, ciò permette di individuare anche piccole aggiunte di rettificato o di sansa, all'olio di oliva vergine. L’assorbimento dell’olio d’oliva vergine decresce rapidamente verso valori molto bassi (< 0,200) nella zona di lunghezza d’onda (�) compresa tra 260 e 280 nm. L’andamento della curva è praticamente parallelo all'asse delle ascisse. In ordinata sono riportati i valori di assorbanza. Nel caso del rettificato, e nel caso dell'olio di sansa, i valori di assorbanza in tale zona sono molto più elevati,la curva assume un andamento caratteristico con tre massimi, dovuti alla presenza dei trieni, dei quali il più accentuato è quello centrale a 268 nm.

00.3.2 Analisi delle Assorbanze (frodi, stato ossidativo, invecchiamento)

Questo tipo di analisi è espresso mediante dei coefficienti "K" che rappresentano l'assorbimento da parte dell'olio all'esposizione di luce ultravioletta in particolari condizioni. Il coefficiente di estinzione molare alla lunghezza d'onda, rispettivamente di 230 nm e di 270 nm, indica lo stato ossidativo dell'olio, perché si possono formare dieni e trieni coniugati durante l'ossidazione del prodotto. La normativa di legge prevede che per alcuni valori di K270 superiori ai limiti di legge è previsto un passaggio del prodotto saggiato ad allumina al fine di eliminare i trieni coniugati formatisi naturalmente durante l'invecchiamento oppure derivanti dalla presenza di oli diversi dai vergini. Questo parametro può risultare alterato da processi chimici indotti che portano ad una contraffazione del prodotto. Gli altri parametri analitici previsti nel Reg. CE 2568/91 indicano eventuali contraffazioni o sofisticazioni del prodotto che modificano negativamente il concetto di genuinità dell'olio. Tale metodica di analisi è in grado quindi di stabilire la presenza di tagli ad oli extravergini, ed in primis stabilisce se si tratta di un olio di oliva extravergine oppure di un qualsiasi olio di oliva.

Ai fini del giudizio, specialmente nel caso di miscele, è importante conoscere anche l'altezza del picco principale, tenendo conto del valore dell' assorbanza a 268 nm, corrispondente al massimo, e quelli a


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262 ed a 274 nm, corrispondenti ai due minimi. I valori di assorbimento vengono espressi come assorbanza specifica:

• assorbanza ad una certa lunghezza d'onda, di una soluzione all'1 % dell'olio in esame nel solvente prescelto, osservata in una cuvetta dello spessore di 1cm.

• Nel caso degli oli è d’uso di esprimere l'assorbanza specifica con la lettera K. Per esempio, l'espressione K268 indica I'assorbanza specifica dell'olio in esame alla lunghezza d'onda di 268 nm. I valori di K si calcolano mediante l'espressione:

K = A / c*s

Dove: K, A, c ed s hanno i significati già indicati. È opportuno che i valori di A, letti allo spettrofotometro, siano compresi tra 0,2 e 0,8. In caso contrario si ripete la lettura o sulla stessa soluzione posta in vaschette di spessore diverso da 1 cm, oppure su di una nuova soluzione di concentrazione opportunamente variata. In termini numerici si ha :

K268 = A (1cm/1%(268nm)) = A268/ c *s Dove: A268 è il valore dell'assorbanza a 268 nm della soluzione dell'olio in esame, c la concentrazione della soluzione espressa in g/100 ml s lo spessore in cm della cuvetta di quarzo nella quale viene esaminata la soluzione dell'olio in esame. Questa altezza, indicata come �K, si ti ricava dall'espressione:

�K=K268 −−−− (K262+K274)/2

Non sono stati ancora fissati per legge i dati spettrofotometrici caratteristici per i vari tipi di olio, ma, in pratica, vengono accettati i seguenti valori proposti dalla Commissione Tecnica Governativa:

• 232 nm (zona dei dieni), • da 262÷268 e 274 nm (zona dei trieni),

Categoria K232 K270 �K

Extra Vergine <2,50 <0,20 <0,01

Vergine <2,50 <0,20 <0,01

Tabella dei valori proposti


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00.3.3 Polifenoli

I polifenoli sono una famiglia di composti che si trovano negli elementi nutritivi delle piante, tradizionalmente usati in medicina e per curare diverse malattie. Nelle piante sono stati individuati oltre 8000 polifenoli e, negli ultimi anni, molti studi sono stati effettuati sui loro effetti sulla salute. Benché i polifenoli non siano stati identificati come indispensabili per la salute, come le vitamine, alcuni sono noti come potenti antiossidanti. Gli antiossidanti combattono i danni derivanti dall’ossigeno creato dai radicali liberi e ciò protegge dal deterioramento le cellule somatiche, contribuendo a prevenire alcune malattie croniche.

Prodotti in cui si trovano i polifenoli I polifenoli si trovano nella frutta e nella verdura, oliva e olio d’oliva, nel tè, nel vino, nel cacao e nei prodotti a base di cacao. Ogni pianta, o prodotto, possiedono una propria miscela unica di polifenoli. I polifenoli presenti nell’olio sono potenti antiossidanti. Questi polifenoli sono un gruppo di flavonoidi che comprendono sia i componenti singoli di catechina sia i più complessi procianidini. Effetti positivi sulla salute dei polifenoli contenuti negli alimenti Gli scienziati hanno dimostrato in studi recenti i diversi effetti positivi dei polifenoli sulla salute. Si ritiene che i polifenoli possano ridurre il rischio di sviluppo di cancro, malattie cardiovascolari, artrite reumatoide, e che possiedano benefici effetti antinvecchiamento. Una dieta ricca di frutta e verdura ha dimostrato di porsi in relazione inversa rispetto al manifestarsi di malattie croniche. Questo può essere in parte dovuto alle capacità antiossidanti di questi alimenti, di cui è stata provata l’efficacia nella diminuzione dell’ossidazione del colesterolo LDL. Oltre alle loro proprietà antiossidanti, i polifenoli potrebbero procurare vantaggi al sistema cardiovascolare diminuendo la funzione delle piastrine. Uno studio recente ha dimostrato che il consumo di olio d’oliva sopprime l’attivazione delle piastrine e sembra avere un effetto simile a quello dell’aspirina.

00.3.3.1 Determinazione dei polifenoli (vedi Cap. VIII pag. 157)

PREMESSA: I polifenoli sono sostanze antiossidanti e se presenti in elevata concentrazione costituiscono un pregio per l’olio. Non sono previsti indici limiti di legge, ma il loro valore dà indicazioni sulla qualità del prodotto. Sono composti della chimica aromatica con terminali ossidrilici, simili agli alcoli più semplici, in grado di attrarre atomi di ossigeno e fare con essi una reazione di ossido-riduzione, in modo da ridurre la capacità ossidante di questo ossigeno libero, o potenzialmente libero, che danneggerebbe, cioè invecchierebbe, cellule e tessuti.

Materiale occorrente: Becker, agitatore magnetico, centrifuga, matracci da 25 ml, bilancia tecnica, cilindro da 25 ml, soluzione di Na2CO3 7,5%,soluzione di Folin Ciocalteau 1:10,miscela CH3OH/H2O 80:20, spettrofotometro UV, imbuto, beuta carta, da filtro.


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Preparazione reattivo di Folin Ciocalteau: questo reattivo può essere trovato in commercio,altrimenti può essere trovato nel seguente modo: sciogliere 100 g di tungstato di sodio (Na2WO4.2H2O) e 25 g di molibdato di sodio (NaMoO4.2H2O) in 700 ml di acqua distillata. Aggiungere 50 ml di acido fosforico 85% e 100 ml di HCl 37%. Portare ad ebollizione in riflusso per 10 ore. Aggiungere poi 150 g di solfato di litio (Li2SO4.H2O) poi mettere alcune gocce di bromo e portare nuovamente ad ebollizione per 15 minuti. Raffreddare e portare a 1dm3 con acqua distillata. Conservare in frigo.

Principio: l’insieme dei composti fenolici viene ossidato dal reattivo di Folin Ciocalteau, costituito da una miscela di acido fosfotunstico (H3PW12O40) e acido fosfomolibdico (H3PMo12O40) che si riduce in una miscela di ossidi blu di tungsteno e molibdeno (W8O23 e Mo8O23), grazie all’ossidazione dei fenoli. La colorazione blu prodotta ha un massimo assorbimento intorno a 750 nm. Metodica di analisi: pesare circa 10 g di olio in un becker (segnare il peso esatto). Aggiungere 10 ml di miscela metanolo/acqua per estrarre i polifenoli dall’olio. Agitare per 30 minuti, aspettare 15 minuti e centrifugare. Si formano 2 fasi e con il contagocce estrarre la fase superiore e metterla in un matraccio da 25 ml. Sull’olio rimasto aggiungere ancora 10 ml di CH3OH/H2O, agitare, centrifugare e riseparare la fase superiore mettendola nello stesso matraccio da 25 ml di prima. Portare a volume con metanolo/acqua. Ghiacciare la soluzione, riportarla allo stato liquido e filtrarla per eliminare le eventuali tracce di olio rimaste. In un cilindro da 25 ml mettere 1 ml di filtrato, 10 ml di soluzione di Folin Ciocalteau 1:10 e 9 ml di soluzione al 7,5% di Na2CO3 per creare l’ambiente basico.

Preparazione bianco: 10 ml di soluzione di Folin Ciocalteau 1:10,9 ml di soluzione al 7,5% di Na2CO3 e 1 ml di miscela metanolo/acqua. Lettura: aspettare 2 ore prima di eseguire la lettura a 765 nm. Calcoli: Lo strumento esprime il risultato in mg acido gallico/dm3 olio. Riportare in mg acido gallico/kg olio = (concentrazione in mg acido gallico/dm3 olio * 25)/peso olio(g) P.S. Gli standard per la retta di taratura devono essere fatti in un intervallo compreso tra 25 e 500 mg/l di acido gallico. (Per la raccolta dei dati, i grafici e i calcoli vedere il Cap. VIII).

00.4 Cromatografia liquida ad alta risoluzione (HPLC) (vedi Cap. VIII pag. 159)

PRINCIPIO Il potere di risoluzione di una colonna cromatografica aumenta all'aumentare della lunghezza della colonna stessa e del numero di piatti teorici presenti per unità di lunghezza, quantunque esistano dei limiti alla lunghezza di una colonna dovuti al problema dell'allargamento dei picchi. Poiché il numero dei piatti teorici è in relazione all'area della fase stazionaria, ne consegue che a minori dimensioni delle particelle della fase stazionaria corrispondono migliori risoluzioni. Sfortunatamente in questo caso aumenta anche la resistenza al flusso dell'eluente. Tutte le forme di


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cromatografia si affidano a un'eluizione per gravità o mediante sistemi di pompaggio a bassa pressione dell'eluente. Con tali metodi si ottengono quindi velocità di flusso relativamente basse che favoriscono il fenomeno dell'allargamento dei picchi per semplice diffusione dei soluti. Non è possibile applicare velocità di flusso più elevate perché ciò provocherebbe un ritorno di pressione sufficiente a danneggiare la struttura della matrice della fase stazionaria con conseguente riduzione del flusso dell'eluente e peggioramento della risoluzione. Questa evoluzione tecnologica, che ha coinvolto la cromatografia d’adsorbimento, di ripartizione, a scambio ionico, ad esclusione e di affinità, ha incrementato di molto il grado di risoluzione e la velocità di separazione il che spiega perché l'HPLC sia considerata oggi la tecnica cromatografica più diffusa, efficace e versatile.

APPARATO

Apparecchiatura HPLC

HPLC

DISCAFF Università PO “A. Avogadro”

Novara

Le colonne per HPLC (vedi approfondimento Cap. VIII pag. 161) sono generalmente di acciaio inossidabile e sono capaci di sopportare alte pressioni. Di solito si usano colonne rettilinee lunghe 20-50 cm e con un diametro di 1-4 mm, anche se attualmente sono disponibili colonne capillari di diametro inferiore. Le migliori colonne sono calibrate ad alta pressione e con una rifinitura interna a specchio che consente un'efficiente impaccatura. Alle due estremità della colonna esistono setti perforati di acciaio inossidabile, o di teflon, che servono a trattenere il materiale in essa contenuto. I setti detono essere omogenei per consentire un flusso uniforme di solvente. Tutti i materiali di supporto per HPLC sono caratterizzati da una struttura regolarmente sferica che li contraddistingue dai materiali convenzionali. Queste piccole sferette s'impaccano più efficientemente e offrono buone proprietà di flusso. Tutti i solventi usati per HPLC devono essere particolarmente puri, poiché anche tracce di contaminanti alterano le caratteristiche della colonna e interferiscono con il sistema di rivelazione, in particolare quando si misura l'assorbanza al di sotto dei 200 nm. In commercio esistono solventi particolarmente puri per HPLC, ma anche in questo caso è opportuno inserire, prima della pompa, un microfiltro da 1-5 mm. È inoltre molto importante che tutti i solventi siano degassati prima dell'uso, per evitare la formazione di bolle di gas nelle pompe. Il solvente viene degassato mediante riscaldamento, agitazione vigorosa con agitatore magnetico, o sottovuoto, con ultrasuoni o facendo gorgogliare elio nel recipiente che lo contiene. Il sistema di rivelazione Poiché la quantità di campione applicato alla colonna è molto piccola, è essenziale che sia elevata e stabile la sensibilità del sistema di rivelazione. Questo è solitamente costituito da uno spettrofotometro a lunghezza d'onda variabile nel visibile e nell'ultravioletto, oppure da un fluorimetro, da un misuratore dell'indice di rifrazione o da un rivelatore elettrochimico. Attualmente, inoltre, esistono apparati per HPLC connessi a spettrometri di massa.

PROCEDURA In teoria il campione dovrebbe essere introdotto nella colonna sotto forma di banda estremamente sottile. A questo scopo esistono due metodi principali: il primo utilizza una microsiringa in grado di sostenere pressioni elevate. Il campione è iniettato, attraverso un foro d'iniezione, direttamente in colonna o in uno strato di materiale inerte immediatamente precedente la colonna. Questa operazione può essere compiuta mentre il sistema è sotto alta pressione, oppure si spegne la pompa prima dell'iniezione e quando la pressione è scesa al valore di quella atmosferica si inietta il campione e si riaccende la pompa. Quest'ultimo metodo viene chiamato iniezione a flusso


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interrotto. Il secondo metodo di introduzione del campione utilizza un iniettore a spirale, costituito da un occhiello metallico inserito lungo il capillare che alimenta la colonna. In esso viene introdotto il campione quindi, tramite una valvola, l'eluente viene incanalato nell'occhiello e così il campione si trova a essere spinto in colonna dall'eluente stesso, senza che s'interrompa il flusso di solvente. Dopo ripetute applicazioni di campioni complessi, la colonna può perdere il suo potere risolutivo. Per prevenire questa eventualità viene installata una precolonna tra l'iniettore e la colonna vera e propria. APPLICAZIONI L'HPLC di ripartizione in fase inversa è particolarmente utile nelle separazioni di composti polari quali farmaci e loro metaboliti, peptidi, vitamine, polifenoli e steroidi. L'HPLC ha trovato probabilmente il suo impiego più significativo nella separazione di oligopeptidi e proteine. Il sistema adibito alla separazione di molecole proteiche prende il nome di cromatografia liquida rapida delle proteine (FPLC). Alla base della tecnica di FPLC non è presente un unico principio, poiché in essa coesistono la cromatografia in fase inversa, quella a scambio ionico e la cromatofocalizzazione. Sebbene la cromatografia ad alta risoluzione mediante lo scambio ionico o l'esclusione molecolare si presti bene alla separazione di molecole proteiche, non tutte le proteine possono essere purificate completamente mediante l'FPLC. In questi casi può essere d'aiuto la cromatografia a interazioni idrofobiche, che sfrutta le zone di alta idrofobicità presenti sulla superficie delle proteine. La fase stazionaria è fortemente idrofobica e generalmente costituita da ottil- o fenilagarosio.

00.4.1 Determinazione HPLC dei principali polifenoli dell’olio (vedi anche Cap. VIII pag. 164) Per aumentare il livello di dettaglio a livello molecolare, è necessario applicare delle tecniche separative. La più versatile è sicuramente quella per cromatografia liquida ad alta prestazione, in fase inversa o normale a seconda della classe di composti. La disponibilità di rilevatori quali gli spettrometri di massa con interfaccia elettrospray, adatta a questa classe di composti, accoppiabili in particolare a rilevatori UV-VIS a fotodiodi, può semplificare enormemente il lavoro di riconoscimento dei singoli polifenoli, permettendo di acquisire simultaneamente importanti informazioni strutturali (tipicamente, il peso molecolare ed il tipo di aglicone), assieme allo spettro UV-VIS. Di seguito si descrivono alcuni esempi di analisi di questo tipo, applicati alla determinazione dei polifenoli dell’olio. Gli acidi cinnamici ed i flavanoli monomeri e bassi oligomeri possono essere separati in maniera conveniente su una colonna in fase inversa di tipo Hypersil ODS (5 mm, 250 x 2.1 mm, Agilent) con precolonna dello stesso tipo. Condizioni applicate:

• flusso 0.4 ml/min; • T = 40 °C.

Eluenti: • A = HCOOH 0.5% in acqua; • B = HCOOH 2% in metanolo.

Gradiente lineare: • -da 8% a 22% B in 14.3 min, • -poi fino al 27.8% B in 5.7 min, lavaggio (100% B in 1 min, 2 min isocratica, ritorno all'8% B in 2 min), • -5 min stabilizzazione.

• La durata tra una iniezione e la successiva è di 30 min. • In questa condizione si dosano con detector a fotodiodi, in UV:

• gli acidi cinnamici a 320 nm, ampiezza di banda 4 nm,


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• i flavanoli a 280 nm, eguale ampiezza di banda. • La calibrazione può essere fatta:

• con gli standard puri per gli acidi cinnamici liberi, l'acido clorogenico ed i flavanoli monomeri, • i restanti acidi cinnamici possono essere quantificati come acido clorogenico, • le proantocianidine come equivalenti di catechina, e rapportati al peso del frutto o della parte di esso utilizzata per l'analisi (mg/kg).

• I risultati relativi al campione di olio indicano: • una presenza di acidi cinnamici compresa tra 62 e 442 mg/kg nella buccia, • e tra 117 e 271 mg/kg nella polpa. In media le concentrazioni nella polpa e nella buccia sono paragonabili, quindi per questa classe di composti non è importante consumare il frutto con la buccia.

• Per chiudere questa rassegna di metodi applicabili allo studio dei polifenoli vegetali, merita fare un accenno alla analisi delle proantocianidine oligomere e dei pigmenti di combinazione tra flavanoli ed antociani. Queste sono sicuramente le due classi maggiormente complesse tra tutti i flavonoidi, ma d'altra parte sono anche tra le più interessanti tra quelle presenti nella alimentazione umana, sia perché presente in quantità elevate, sia perchè l’azione antiossidante che può essere esercitata da strutture complesse di questo tipo, con la presenza di numerosi gruppi fenolici sulla stessa molecola, è ritenuta essere particolarmente efficace. Infine, la produzione di banche dati contenenti la descrizione dettagliata della composizione polifenolica degli alimenti di origine vegetale costituisce un obiettivo utile per la migliore comprensione del ruolo della alimentazione come fattore protettivo della salute umana e per la elaborazione di linee guida nutrizionali. All'interno delle singole specie coltivate, questo fattore compositivo dovrebbe auspicabilmente essere considerato tra i criteri prioritari per il miglioramento genetico e la scelta varietale, al fine di conseguire un ulteriore ed importante arricchimento qualitativo delle proprietà nutrizionali dei prodotti della agricoltura.

00.4.2 Tocoferoli I tocoferoli sono sostanze antiossidanti e se presenti in elevata concentrazione costituiscono un pregio per l’olio. Non sono previsti indici limiti di legge, ma il loro valore dà indicazioni sulla qualità del prodotto. L'analisi è eseguita con un metodo che fa uso della cromatografia liquida ad alta risoluzione (HPLC).

00.4.2.1 Analisi dei tocoferoli

PREMESSA: gli antiossidanti, generalmente presenti nei grassi e negli oli, conferiscono loro una resistenza all'ossidazione assai superiore a quella dei trigliceridi puri. Importanti composti antiossidanti sono i tocoferoli (identici alla vitamina E), presenti in quasi tutte le sostanze grasse: la protezione dall'ossidazione esercitata dai tocoferoli, nei riguardi del grasso, è dovuta al fatto che questi composti sono facilmente ossidabili, catturando i radicali liberi che si formano durante l'ossidazione all'aria dei composti insaturi, ed ha le stesse funzioni sia nei cibi che nel tessuto cellulare. Nella frazione INSAPONIFICABILE degli oli risulta la VITAMINA E importante come antiossidante, per esempio protegge dalla ossidazione/perossidazione i grassi interagendo con O2 e con i radicali liberi, promuove l'utilizzazione della


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HPLC

Vitamina A e la sintesi dell'eme (aumentando i livelli degli enzimi delta-aminolevulinico-sintetasi e deidratasi). È usata come coadiuvante nell'aterosclerosi e nella sterilità, ed è un noto antiabortivo. La carenza causa fragilità dei globuli rossi e sintomi neurologici, oltre a distrofia muscolare). Per la determinazione, negli oli, dei tocoferoli naturali, nelle varie forme isomeriche e dell'alfa-tocoferil acetato è stato sviluppato un metodo che fa uso della cromatografia liquida ad alta risoluzione (HPLC).

epoca di raccolta

e proprietà

Il sistema cromatografico impiegato fa uso di una colonna RP-18, con particelle da 10 micro, di una fase mobile costituita da metanolo/acqua (96:4) e di un rivelatore spettrofotometrico UV a lunghezza d'onda variabile (288 nm). I campioni da analizzare vengono disciolti in acetato di etile e dopo filtrazione (0,45 micro) vengono iniettali direttamente in colonna. Questo metodo consente di determinare la composizione tocoferolica sia di oli di semi raffinati che greggi.

PARTE SPERIMENTALE Apparecchiatura: � Cromatografo Liquido mod. 1082 B, Hewlelt-Packard equipaggiato con LC Terminai 79850 B per la raccolta e l'elaborazione dei dati e rivelatore UV, mod. 79875 A-HP a lunghezza d'onda variabili � Colonna Erbasil RP-18, 10 micro, 250 x 4,6 mm. Materiali e reagenti matracci tarati da 25 ml, cilindri graduati da 100 e 500 ml, sistema per la filtrazione dei solventi sotto vuoto, fialette da 2 ml; solventi: �Metanolo RS per HPLC-Analyticals. -Acetato di etile: RS per �HPLC-Analyticals, -Acqua bidistillata e filtrata (0,45 micro).

Filtrazione dei solventi: � Filtri HVLP Millipore da 0,5 micro, diametro 47 mm e 12 mm; � Siringa Luer Lock da 5 mi; -Swinney filter holder, Millipore. Preparazione della fase mobile Solvente A: acetato di etile, filtrato su HVLP da 0,5 micro Solvente B: miscela metanolo acqua, 96/4 (v/v). Aggiungere a 960 ml di metanolo 40 ml di acqua; filtrare la miscela su filtro HVLP da 0,5 micro. Sia il solvente A che il solvente B vanno degasati per 5-10 minuti con un bagno ad ultrasuoni.

fig. 1


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Standards � d,l-gamma-tocoferolo, Supelco � d,l-alfa-tocoferolo, Fluka � d,l-alfa-tocoferil acetato. Di ogni singolo tocoferolo viene preparata una soluzione da 1000 microg/ml pesando 50 mg di sostanza in un matraccio tarato da 50 ml e portando a volume con acetato di etile. La soluzione standard impiegata per la calibrazione dello strumento si prepara aggiungendo rispettivamente: � 2 ml di gamma tocoferolo, � 1 ml di alfa-tocoferolo, � 1 ml di alfa tocoferil acetato in un matraccio tarato da 25 ml, e portando a volume con acetato di etile. In questa soluzione si possono aggiungere 5 mg di BHT come antiossidante. Questa soluzione viene preparata fresca all'inizio di ogni settimana e deve essere conservata in frigorifero al riparo dalla luce. Per il calcolo dei fattori e della linearità della risposta sono state preparate 5 soluzioni con una gamma di concentrazioni comprese fra i 10 ed i 150 microg/ml. Come si può vedere nella figura 1 la risposta è lineare nell'intervallo di concentrazione studiato. I coefficienti di correlazione per le tre rette sono rispettivamente di: (a) 0,9999; (b) 0,9998; (c) 0,9995).

Preparazione dei campioni Si pesano esattamente circa 2,5 g di olio in un matraccio tarato da 25 ml e si diluiscono a volume con acetato di etile circa 2 ml di campione vengono filtrati su filtro Millipore HVLP da 0,5 micro, diam. 12 mm, mediante lo Swinney filter holder ed una siringa Luer-Lock da 5 ml, in una fialetta da 2 ml. Condizioni strumentali � Flusso: 1,6 ml/min; � Temperatura del forno: 40°C; � Rivelatore UV: 288 nm (s)/464 nm (r); � Volume iniettato: 10 o 20 microlitri. L'eluizione dei tocoferoli viene effettuata pompando 1,6 ml di fase mobile B (metanolo/acqua) per 12 min. Dopo 1 o 2 iniezioni la colonna viene lavata dal materiale lipidico con acetato di etile (solvente A) utilizzando il seguente programma di gradiente:

1. Acetato di etile dallo O a1 100% in 3 minuti. 2. Mantenere il 100% di acetato di etile per 5 minuti. 3. Portare la percentuale di acetato di etile dal 100 allo 0% in 3 minuti. 4. Lasciar riequilibrare la colonna con la fase mobile B per circa 10 minuti prima di iniettare il

campione successivo. La calibrazione dello strumento viene ricontrollata durante la giornata iniettando lo standard ed eventualmente ricalibrando con il metodo della media pesata.


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Cromatogrammi di vari tipi di olio

00.4 Gascromatografia di acidi grassi (vedi anche Cap VIII pag. 168 e 180)

Gascromatografo

L'importanza di questa determinazione analitica dei grassi è dovuta al fatto che da una sola procedura analitica viene ricavata una notevole quantità di parametri; inoltre questi parametri sono specifici, cioè corrispondono alla percentuale di singoli componenti chimici presenti in un olio. La composizione acida può rappresentare quindi un indice di genuinità e tipicità di un olio. L'analisi degli acidi grassi come esteri metilici viene eseguita con le metodiche al gascromatografo.

PRINCIPIO Gli acidi grassi dei gliceridi presenti nell'olio vengono trasformati, mediante transesterificazione, nei rispettivi esteri metilici, che presentano una maggiore volatilità ed una minore polarità rispetto ai corrispondenti acidi liberi. Inoltre, con questa reazione, vengono decomposti i trigliceridi misti rendendo possibile il dosaggio dei singoli acidi che ne facevano parte. Gli acidi grassi metilati vengono iniettati in colonna e separati come tali. Ne segue che questa determinazione fornisce la composizione acidica in esteri metilici anzichè in acidi liberi. In pratica, la differenza tra le due composizioni è abbastanza piccola e comunque tutti i valori tabulati di riferimento sono basati sui metilati, quindi non si ha alcuna incertezza di attribuzione. L'identificazione dei singoli acidi avviene o mediante cromatogrammi eseguiti su standard e/o mediante il calcolo degli indici di ritenzione. Ma nell'analisi di routine, ferme restando le condizioni operative, sono sufficienti i tempi di ritenzione. Il calcolo delle percentuali dei singoli componenti viene effettuato col metodo della normalizzazione interna, in quanto tutti i componenti devono essere dosati.

Colonna impacchettata Colonna capillare


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CONDIZIONI OPERATIVE � Colonna: fase stazionaria a polarità medio alta, come ad esempio il dietilenglicolsuccinato (DEGS); si possono usare sia colonne impaccate, sia capillari, sia wide bare, tenendo presente tuttavia che con le impaccate la separazione degli acidi arachico, eicosenoico e linolenico è spesso insufficiente (e quindi vengono dosati assieme). � Temperatura della colonna: 190-200 °C. � Temperatura dell'iniettore: 250 °C. T. � Temperatura del rivelatore: 250 °C. � Gas di trasporto: elio, oppure azoto. ESECUZIONE DEL CROMATOGRAMMA La quantità di sostanza iniettata deve essere adeguata al tipo di colonna. In ogni caso deve essere tale da rendere dosabili (cioè nettamente distinguibili dal rumore di fondo) componenti presenti almeno sino allo 0,1%. Si attende che il registratore abbia tracciato tutto il cromatogramma. In genere, per gli oli di oliva, ciò avviene dopo l'uscita dell'acido eicosenoico (C20), ma se si hanno sospetti sulla genuinità dell'olio e bene protrarre l'acquisizione sino all'uscita dell'acido erucico (C22).

ESPRESSIONE DEI RISULTATI In un tipico referto di analisi GLC degli acidi grassi vengono riportati, per ciascun acido metilato: � il tempo di ritenzione assoluto; � il tempo di ritenzione relativo; � l'area assoluta del picco; � il fattore di risposta; � la percentuale di acidi metilati. Il dato che interessa maggiormente è quest'ultimo, in quanto consente di caratterizzare l'olio in esame attraverso il confronto con i valori di riferimento. Il calcolo delle percentuali viene effettuato, in base alla misura delle aree dei picchi che vengono trasformate in concentrazioni secondo il metodo della normalizzazione interna. Per calcolare i fattori di risposta, si esegue un cromatogramma su una miscela, a composizione esattamente nota e vicina a quella in esame, di esteri metilici di acidi grassi. Data la notevole somiglianza che sussiste tra i vari componenti degli oli, questi fattori non si discostano molto dall'unità.


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00.4.1 Analisi degli steroli (frazione insaponificabile)

Tra tutti i componenti della frazione insaponificabile si studiano principalmente gli steroli (ma anche eritrodiolo e alcoli alifatici superiori), essendo queste le sostanze che caratterizzano qualitativamente e quantitativamente le differenti sostanze grasse. L'analisi della frazione insaponificabile è uno dei metodi più accurati per accertare la sofisticazione dell'olio di oliva. Diverse sono le tecniche cromatografiche, che portano a vari risultati.

da Regolamento (CEE) n. 2568/91 della Commissione

(Allegato V)

00.4.1.1 Determinazione della composizione e contenuto di steroli mediante gascromatografia con colonna capillare

Al giorno d'oggi, per quanto riguarda l'analisi degli oli vegetali, è indispensabile l'analisi della frazione sterolica. I motivi sono da ricercarsi nel fatto che la frazione sterolica non è influenzabile da variazioni genetiche che invece possono mutare radicalmente la componente saponificabile e quella degli acidi grassi.

1. OGGETTO Il metodo descrive un procedimento per la determinazione del contenuto di steroli, singoli e totali, delle sostanze grasse.

2. PRINCIPIO DEL METODO La sostanza grassa, addizionata di a-colestanolo quale standard interno, è saponificata con idrossido di potassio in soluzione etanolica, quindi l'insaponificabile viene estratto con etere etilico. Dall'insaponificabile estratto è separata la frazione sterolica mediante cromatografia su placca di gel di silice basica; gli steroli recuperati dal gel di silice vengono trasformati in trimetilsilileteri ed analizzati mediante gascromatografia in colonna capillare.

3. APPARECCHIATURA 3.1. Matraccio da 250 ml, munito di refrigerante a ricadere

con giunti a smeriglio. 3.2. Imbuti separatori da 500 ml. 3.3. Matracci da 250 ml. 3.4. Attrezzatura completa per analisi cromatografica su

strato sottile, per lastre di vetro 20 * 20 cm. 3.5. Lampada a luce ultravioletta, con lunghezza d'onda 366

o 254 nm. 3.6. Microsiringhe da 100 µl e 500 µl. 3.7. Imbuto cilindrico filtrante a setto poroso G 3 (porosità

15-40 µm) di diametro circa 2 cm e altezza circa 5 cm, con attacco idoneo per filtrazione sotto vuoto e giunto smerigliato maschio 12/21.

3.8. Beuta per vuoto da 50 ml con giunto femmina smerigliato 12/21 adattabile all'imbuto filtrante (3.7.).

il β-sitosterolo costituisce circa l'80% del totale dei composti sterolici

Figura 1 - Gascromatogramma della frazione sterolica di un olio di oliva grezzo


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3.9. Provetta da 10 ml a fondo conico con tappo a tenuta. 3.10. GC idoneo per il funzionamento con colonna capillare, dotato di sistema di splittaggio, costituito da: 3.10.1. Camera termostatica per le colonne, idonea a mantenere la temperatura desiderata con la precisione di ± 1°C. 3.10.2. Complesso di vaporizzazione termoregolabile con elemento vaporizzante in vetro persilanizzato. 3.10.3. Rivelatore a ionizzazione di fiamma e convertitore-amplificatore. 3.10.4. Registratore-integratore idoneo per il funzionamento con il convertitore-amplificatore (3.10.3.), con tempo di risposta non superiore a 1 secondo e con velocità della carta variabile. 3.11. Colonna capillare in vetro o silice fusa, lunga 20/30

m, diametro interno 0,25/0,32 mm, internamente ricoperta con liquido SE-52 o SE-54 o equivalenti, con spessore uniforme compreso fra 0,10 e 0,30 µm. 3.12. Microsiringa per gascromatografia da 10 µl con ago cementato.

4. REAGENTI 4.1. Potassio idrossido, soluzione etanolica circa 2 N: si sciolgono, sotto raffreddamento, 130 g di idrossido di potassio (titolo minimo 85 %) in 200 ml di acqua distillata, quindi si porta ad 1 litro con etanolo. La soluzione si conserva in bottiglie di vetro scuro ben tappate. 4.2. Etere etilico, puro per analisi. 4.3. Sodio solfato anidro, puro per analisi. 4.4. Lastre di vetro stratificate con gel di silice, senza indicatore di fluorescenza, spessore 0,25 mm (sono reperibili in commercio già pronte per l'uso). 4.5. Potassio idrossido, soluzione etanolica 0,2 N: si sciolgono 13 g di idrossido di potassio in 20 ml di acqua distillata e si porta a 1 litro con etanolo. 4.6. Benzene, per cromatografia (vedi 5.2.2). 4.7. Acetone, per cromatografia (vedi 5.2.2). 4.8. Esano, per cromatografia (vedi 5.2.2). 4.9. Etere etilico, per cromatografia. 4.10. Cloroformio, puro per analisi. 4.11. Soluzione di riferimento per la cromatografia su placca: colesterolo o fitosteroli, soluzione al 5 % in cloroformio. 4.12. 2,7-Diclorofluoresceina, soluzione etanolica allo 0,2 %. Si rende leggermente basica aggiungendo qualche goccia di soluzione alcolica 2 N di idrossido di potassio. 4.13. Piridina anidra, per cromatografia. 4.14. Esametildisilazano. 4.15. Trimetilclorosilano. 4.16. Soluzioni campione di trimetilsilileteri degli steroli: si preparano al momento dell'impiego partendo da steroli puri o da miscele di steroli ottenute da oli che li contengano. 4.17. a-colestanolo, soluzione allo 0,2 % (m/V) in cloroformio (standard interno).

Figura 2 - Gascromatogramma della frazione

sterolica di un olio di oliva raffinato


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4.18. Gas vettore: idrogeno o elio, puri per gascromatografia. 4.19. Gas ausiliari: � idrogeno, puro per gascromatografia � aria, pura per gascromatografia.

5. PROCEDIMENTO 5.1. Preparazione dell'insaponificabile. 5.1.1. Nel matraccio da 250 ml si introduce, impiegano la microsiringa da 500 µl, un volume di soluzione di a -colestanolo allo 0,2 % in cloroformio (4.17.) che contenga una quantità di a -colestanolo corrispondente a circa il 10 % del contenuto di steroli nell'aliquota di campione da prelevare per la determinazione. Ad esempio per 5 g di campione si aggiungano 500 µl della soluzione di a-colestanolo allo 0,2 % se trattasi di un olio di oliva e 1 500 µl se trattasi di oli di semi o olio di sansa di oliva. Si evapora in corrente di azoto fino a secchezza, quindi nello stesso matraccio si pesano esattamente 5 g di campione secco e filtrato. In caso di oli e grassi animali o vegetali contenenti quantità notevoli di colesterolo può essere presente un picco avente tempo di ritenzione identico al colestanolo. In tali casi occorre analizzare la frazione sterolica in doppio con e senza standard interno. 5.1.2. Si aggiungono 50 ml di soluzione etanolica di idrossido di potassio 2 N, si applica il refrigerante a ricadere e si scalda a leggera ebollizione su bagnomaria sotto continua energica agitazione, fino a saponificazione avvenuta (la soluzione diviene limpida). Si continua il riscaldamento ancora per 20 minuti, quindi si aggiungono 50 ml di acqua distillata facendoli scendere dall'alto del refrigerante, si stacca il refrigerante e si raffredda il matraccio a circa 30°C. 5.1.3. Si travasa il contenuto del matraccio quantitativamente, in un imbuto separatore da 500 ml, aiutandosi con acqua distillata, a più riprese, impiegandone complessivamente circa 50 ml. Si aggiungono circa 80 ml di etere etilico, si agita energicamente per circa 30 secondi e si lascia stratificare (nota 1). Si separa la fase acquosa sottostante raccogliendola in un secondo imbuto separatore. Sulla fase acquosa si effettuano ancora due estrazioni, con le stesse modalità, impiegando ogni volta 60-70 ml di etere etilico. Nota 1 - Eventuali emulsioni possono essere eliminate aggiungendo, mediante spruzzetta, piccole quantità di alcol etilico o metilico. 5.1.4. Si riuniscono gli estratti eterei in un unico imbuto separatore e si lavano con acqua distillata (50 ml per volta) fino a reazione neutra delle acque di lavaggio. Eliminata l'acqua di lavaggio, si essicca con solfato di sodio anidro e si filtra, su solfato sodico anidro, in un matraccio da 250 ml previamente pesato, lavando imbuto e filtro con piccole quantità di etere etilico. 5.1.5. Si distilla l'etere fino a pochi ml, quindi si porta a secco sotto leggero vuoto o in corrente di azoto, si completa l'essiccamento in stufa a 100°C per un quarto d'ora circa e, dopo raffreddamento in essiccatore, si pesa. 5.2. Separazione della frazione sterolica. 5.2.1. Preparazione delle lastre basiche: si immergono le lastre al gel di silice (4.4.), completamente, nella soluzione etanolica 0,2 N di idrossido di potassio (4.5.) per 10 secondi, si lasciano quindi asciugare sotto cappa per 2 ore ed infine si pongono in stufa a 100°C per 1 ora. Si tolgono dalla stufa e si conservano in essiccatore a cloruro di calcio fino al momento dell'impiego (le placche così trattate devono essere impiegate entro 15 giorni). Nota 2 - Impiegando per la separazione della frazione sterolica delle lastre di gel di silice basiche si elimina la necessità del trattamento dell'insaponificabile con allumina. In tal modo vengono trattenuti sulla linea di caricamento tutti i composti di natura acida (acidi grassi ed altro) ottenendosi così la banda degli steroli nettamente separata dalle bande degli alcoli alifatici e triterpenici. 5.2.2. Nella camera di sviluppo delle lastre si introduce una miscela benzene-acetone 95:5 (V/V) fino all'altezza di circa 1 cm. In alternativa può essere usata una miscela esano-etere etilico 65:35 (V/V). Si chiude la camera con l'apposito coperchio e si lascia così per almeno mezz'ora in modo che si stabilisca l'equilibrio liquido-vapore. Sulle superfici interne della camera possono essere fissate delle strisce di carta da filtro che peschino nell'eluente: questo accorgimento permette di ridurre di circa 1/3 il tempo di sviluppo e di ottenere una più uniforme e regolare eluizione dei


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componenti. Nota 3 - Al fine di ottenere condizioni di eluizione perfettamente riproducibili la miscela di sviluppo deve essere sostituita ad ogni prova. 5.2.3. Si prepara una soluzione al 5 % circa di insaponificabile (5.1.5.) in cloroformio e, con la microsiringa da 100 µl si depositano su una placca cromatografica (5.2.1.) a 2 cm circa da una estremità, 0,3 ml di detta soluzione, in striscia il più possibile sottile ed uniforme. In allineamento con la linea di caricamento, ad un'estremità della lastra si depositano 2-3 µl della soluzione di riferimento degli steroli (4.11.), allo scopo di identificare, a sviluppo ultimato, la banda degli steroli. 5.2.4. Si pone la placca nella camera di sviluppo preparata come detto in 5.2.2. La temperatura ambiente dovrà essere mantenuta fra 15 e 20°C. Si chiude subito la camera col coperchio e si lascia eluire fino a che il fronte del solvente sia arrivato a circa 1 cm dal bordo superiore della placca. Si rimuove quindi la placca dalla camera di sviluppo e si evapora il solvente in corrente di aria calda oppure lasciando la placca per un pò di tempo sotto cappa. 5.2.5. Si spruzza la placca debolmente ed uniformemente con la soluzione di 2,7-diclorofluoresceina. Osservando la lastra alla luce ultravioletta si individua la banda degli steroli per allineamento con la macchia ottenuta con la soluzione di riferimento; si delimitano con una matita nera i limiti della banda lungo i margini di fluorescenza. 5.2.6. Con una spatola metallica si raschia il gel di silice compreso nell'area delimitata. Il materiale asportato, finemente sminuzzato, viene introdotto nell'imbuto filtrante (3.7.); si aggiungono 10 ml di cloroformio caldo, si mescola accuratamente con la spatola metallica e si filtra aiutandosi con il vuoto, raccogliendo il filtrato nella beuta (3.8.) collegata all'imbuto filtrante. Si lava il residuo nell'imbuto per tre volte con etere etilico (circa 10 ml per volta) raccogliendo sempre il filtrato nella stessa beuta adattata all'imbuto. Si evapora il filtrato fino ad un volume di circa 4-5 ml, si trasferisce la soluzione residua nella provetta da 10 ml (3.9.) previamente pesata, si porta a secco con blando riscaldamento in leggera corrente di azoto, si riprende con qualche goccia di acetone, si riporta ancora a secco, si pone 10 minuti circa in stufa a 105°C indi si lascia raffreddare in essiccatore e si pesa. Il residuo contenuto nella provetta è costituito dalla frazione sterolica. 5.3. Preparazione dei trimetilsilileteri. 5.3.1. Nella provetta contenente la frazione sterolica si aggiunge il reattivo per la sililazione, costituito da una miscela di piridina-esametildisilazano-trimetilclorosilano 9:3:1 (V/V/V) (nota 4) in ragione di 50 µl per ogni milligrammo di steroli, evitando ogni assorbimento di umidità (nota 5). Nota 4 - Esistono in commercio soluzioni già pronte per l'uso; sono inoltre disponibili altri reagenti silanizzanti, quali ad esempio il bis-trimetiltrifluorolacetammide + 1 % trimetilclorosilano da diluire in uno stesso volume di piridina anidra. 5.3.2. Si tappa la provetta, si agita cautamente (senza capovolgere) fino a completa solubilizzazione degli steroli. Si lascia a sé per almeno 15 minuti a temperatura ambiente, quindi si centrifuga per alcuni minuti: la soluzione limpida è pronta per l'analisi gascromatografica. Nota 5 - L'eventuale formazione di una leggera opalescenza è normale e non è causa di alcun disturbo. La formazione di un flocculato bianco o la comparsa di una colorazione rosa sono indizio della presenza di umidità o di alterazione del reattivo. In questo caso la prova dovrà essere ripetuta. 5.4. Analisi gascromatografica. 5.4.1. Operazioni preliminari, condizionamento della colonna. 5.4.1.1. Si installa nel gascromatografo la colonna, collegando il terminale di ingresso all'evaporatore connesso col sistema di splittaggio e il terminale di uscita al rivelatore. Si eseguono i controlli generali del complesso gascromatografico (tenuta dei circuiti dei gas, efficienza del rivelatore, efficienza del sistema di splittaggio e del sistema di registrazione, ecc.). 5.4.1.2. Se la colonna è messa in uso per la prima volta è consigliabile procedere al suo condizionamento. Si fa fluire un leggero flusso di gas attraverso la colonna stessa, quindi si accende il complesso gascromatografico e si inizia un riscaldamento graduale fino a raggiungere una temperatura di almeno 20°C superiore a quella di esercizio (nota 6). Si mantiene tale temperatura per almeno 2 ore, quindi si porta il complesso alle condizioni di funzionamento (regolazione del flusso dei gas e dello splittaggio, accensione della fiamma, collegamento con il registratore


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elettronico, regolazione della temperatura della camera per la colonna, del rivelatore e dell'iniettore, ecc.) e si registra il segnale ad una sensibilità almeno 2 volte superiore a quella prevista per l'esecuzione dell'analisi. Il tracciato della linea di base deve risultare lineare, esente da picchi di qualsiasi natura, e non deve presentare deriva. Una deriva rettilinea negativa indica imperfetta tenuta delle connessioni della colonna, una deriva positiva indica un insufficiente condizionamento della colonna. Nota 6 - La temperatura di condizionamento deve in ogni caso essere inferiore di almeno 20°C alla temperatura massima prevista per il liquido di ripartizione impiegato. 5.4.2. Scelta delle condizioni operative. 5.4.2.1. Condizioni operative di massima sono le seguenti:

• temperatura della colonna: 260°C ± 5°C; • temperatura dell'evaporatore: 280°C; • temperatura del rivelatore: 290°C; • velocità lineare del gas di trasporto: elio 20 + 35 cm/s, idrogeno 30 + 50 cm/s; • rapporto di splittaggio: da 1:50 a 1:100; • sensibilità strumentale: da 4 a 16 volte l'attenuazione minima; • sensibilità di registrazione: 1 + 2 mV f.s.; • velocità della carta: 30 + 60 cm/ora; • quantità di sostanza iniettata: 0,5 + 1 µl di soluzione di TMSE.

Tali condizioni possono essere modificate in funzione delle caratteristiche della colonna e del gascromatografo in modo da ottenere cromatogrammi che soddisfino le condizioni seguenti:

• il tempo di ritenzione del b -sitosterolo deve essere 20 ± 5 minuti • il picco del campesterolo deve essere: per l'olio di oliva (contenuto medio 3 %) 15 ± 5 % del

fondo scala, per l'olio di soia (contenuto medio 20 %) 80 ± 10 % del fondo scala • si deve avere separazione di tutti gli steroli presenti; è necessario che i picchi oltre che

separati siano anche completamente risolti cioè che il tracciato del picco raggiunga la linea di base prima dell'uscita del picco successivo. È tuttavia tollerata anche una risoluzione

• incompleta a condizione però che sia quantificabile secondo la perpendicolare il picco a TRR 1,02.

5.4.3. Esecuzione dell'analisi. 5.4.3.1. Con la microsiringa da 10 µl si preleva 1 ml di esano, si aspirano 0,5 µl di aria e successivamente 0,5 + 1 µl della soluzione del campione; si alza ancora lo stantuffo della siringa in modo che l'ago sia vuoto. Si introduce l'ago attraverso la membrana del complesso di iniezione e dopo 1-2 secondi si inietta rapidamente e si estrae quindi lentamente l'ago dopo circa 5 secondi. 5.4.3.2. Si effettua la registrazione fino a completa eluizione dei TMSE degli steroli presenti. La linea di base deve essere sempre corrispondente ai requisiti richiesti (5.4.1.2.). 5.4.4. Identificazione dei picchi. L'identificazione dei singoli picchi viene effettuata in base ai tempi di ritenzione e per paragone con miscele di TMSE degli steroli, analizzate nelle medesime condizioni. Gli steroli vengono eluiti secondo il seguente ordine: colesterolo, brassicasterolo, 24-metilencolesterolo, campesterolo, campestanolo, stigmasterolo, D 7-campesterolo, D 5'23-stigmastadienolo, clerosterolo, b -sitosterolo, sitostanolo, D 5-avenasterolo, D 5'24-stigmastadienolo, D 7-stigmastenolo, D 7-avenasterolo. Nella Tabella I sono riportati i tempi di ritenzione relativi al sitosterolo per le colonne SE 52 e SE 54. Le figure 1 e 2 illustrano cromatogrammi tipici di alcuni oli. 5.4.5. Valutazione quantitativa. 5.4.5.1. Si procede al calcolo con l'integratore, delle aree dei picchi dell'a-colestanolo e degli steroli. Non vengono considerati i picchi di eventuali componenti non compresi fra quelli elencati nella Tabella 1. Il coefficiente di risposta dell'a-colestanolo si deve intendere unitario.


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5.4.5.2. Si calcola il contenuto di ogni singolo sterolo, in mg/100 g di sostanza grassa, come segue: sterolo x = (AX * ms * 100 / As * m) in cui: AX = area del picco dello sterolo x, in millimetri quadrati; As = area del picco dell' a -colestanolo, in millimetri quadrati; ms = massa di a -colestanolo aggiunta, in milligrammi; m = massa del campione prelevato per la determinazione, in grammi.

5. ESPRESSIONE DEI RISULTATI 6.1 Si riportano i contenuti dei singoli steroli, in mg/100 g di sostanza grassa e, come steroli totali, la loro somma. 6.2 Si calcola il contenuto percentuale di ogni singolo sterolo dal rapporto fra l'area del picco corrispondente e la sommatoria delle aree dei picchi degli steroli.

% sterolo x = (AX / A) * 100 in cui: AX = Area del picco X, A = Sommatoria delle aree di tutti i picchi. APPENDICE Determinazione della velocità lineare dei gas. Nel gascromatografo, regolato alle normali condizioni operative, si iniettano 1 + 3 ml di metano (o propano) e si cronometra il tempo che il gas impiega a percorrere la colonna, dal momento dell'iniezione al momento dell'uscita del picco (tM). La velocità lineare in cm/s è data da L/tM in cui L è la lunghezza della colonna in centimetri e tM è il tempo cronometrato in secondi

Tab. 1 Tempi di ritenzione relativi degli steroli

Tempo di ritenzione relativo

Picco

Identificazione Colonna SE 54

Colonna SE 52

1 colesterolo D -5-colesten-3b -olo 0,67 0,63 2 colestanolo 5a colestan-3b -olo 0,68 0,64 3 brassicasterolo [24S]-24-metil-D -5,22-colestadien-3b -olo 0,73 0,71 4 24-metilencolesterolo 24-metilenD -5,24-colestadien-3b -olo 0,82 0,80 5 campesterolo [24R]-24-metil-D -5-colesten-3b -olo 0,83 0,81 6 campestanolo [24R]-24-metil-colestan-3b -olo 0,85 0,82 7 stigmasterolo [24S]-24-etil-D -5,22-colestadien-3b -olo 0,88 0,87 8 D -7-campesterolo [24R]-24-metil-D -7-colesten-3b -olo 0,93 0,92 9 D -5,23-stigmastadienolo [24R,S]-24-etil-D -5,23-colestadien-3b -olo 0,95 0,95 10 clerosterolo [24S]-24-etil-D -5,25-colestadien-3b -olo 0,96 0,96 11 �-sitosterolo [24R]-24-etil-D -5-colesten-3b -olo 1,00 1,00 12 sitostanolo 24-etil-colestan-3b -olo 1,02 1,02 13 D -5-avenasterolo [24Z]-24-etiliden-5-colesten-3b -olo 1,03 1,03 14 D -5,24-stigmast adienolo [24R,S]-24-etil-D -5,24-colestadien-3b -olo 1,08 1,08 15 D -7-stigmastenolo [24R,S]-24-etil-D -7-colesten-3b -olo 1,12 1,12 16 D -7-avenasterolo [24Z]-24-etiliden-D -7-colesten-3b -olo 1,16 1,16


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00.5 ANALISI DEI FITOSANITARI/PESTICIDI Ricerca dei prodotti fitosanitari, pesticidi , in matrici agroalimentari (olive); controllo dei residui principi attivi, attualmente circa 300, rilevandone la presenza fino a 10 microgrammi/Kg (limite di contaminazione ambientale), secondo il metodo di lavoro Arpat.

Schema delle fasi di analisi

Colonne di purificazione rotovap Gascromatografi Le varie fasi dell’analisi sono indicate nello schema disegnato. La fase 7 è cromatografica in HPLC. Il metodo cromatografico è quello già descritto in precedenza. Gli standard da usare e nella concentrazione giusta sono da riferirsi al tipo di pesticida o fitofarmaco in esame.


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00.6 Determinazione del tempo di induzione

IL METODO Il metodo AOM , active oxigen method, è una procedura analitica che serve per la determinazione del tempo di induzione (capacità di autoconservazione) di oli e grassi: gli acidi organici volatili prodotti per autoossidazione degli oli sono assorbiti in acqua e servono come indice del tempo di induzione. Questa determinazione sta prendendo sempre più importanza negli standard di qualità degli oli, anche a livello internazionale.

MOTIVAZIONI Come tutte le sostanze grasse, anche l'olio va incontro a fenomeni di ossidazione, o irrancidimento, dal momento della produzione (sistemi di frangitura, gramolazione) fino al periodo di conservazione (esposizione a luce, a variazioni di temperatura, a contatto con l'aria.) e commercializzazione (travasi, filtraggio, imbottigliamento ...), con alterazione della qualità e dei caratteri di classificazione (olio non più extravergine, difetto di rancido, morchia, putrido...). La capacità di autoconservazione, e la conservabilità dell'olio, è legata alla composizione iniziale (acidi grassi insaturi, antiossidanti), ed è influenzata dalle varie fasi di lavorazione nella filiera dell'olio; da qui deriva l'importanza di un metodo che fornisca una risposta attendibile per migliorare la qualità dell'olio.

00.6.1 IL METODO RANCIMAT DELLA METROHM

Con il nuovo Rancimat 743, test di ossidazione accelerata a 110°C, la determinazione della stabilità ossidativa di oli e grassi avviene a livelli tecnici e qualitativi ancora più elevati:

• 8 stazioni di misura in 2 blocchi riscaldanti indipendenti;

• start individuale per ogni canale; • controllo completo dello strumento,

dall'acquisizione dei dati alla valutazione via PC dei risultati.

Le determinazioni sono memorizzate in un database. • Fino a 4 blocchi di misura Rancimat per PC. • Fino a 32 campioni ad 8 differenti livelli di

temperatura. • Valutazione "ottimale" automatica con la

possibilità di valutazione manuali via PC, utilizzando il metodo della "tangente".

• Conversione per estrapolazione dei tempi di induzione a differenti temperature.

• Test GLP integrato.

analisi chimico-fisiche e strumentali degli olixoomer.virgilio.it/espraf/chimica alimentare/olio/cap...

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