anÁlises toxicolÓgicas
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INTRODUÇÃO AO PLANEJAMENTO DE ANÁLISES NOÇÕES PARA A PREPARAÇÃO DE AMOSTRAS. ANÁLISES TOXICOLÓGICAS. Paula Christiane Soubhia Laboratório de Toxicologia Centro de Controle de Intoxicações. Laboratório de Análises Toxicológicas – LAT Auxílio ao diagnóstico de intoxicações. - PowerPoint PPT PresentationTRANSCRIPT
ANÁLISES TOXICOLÓGICASANÁLISES TOXICOLÓGICAS
Paula Christiane Soubhia
Laboratório de Toxicologia
Centro de Controle de Intoxicações
INTRODUÇÃO AO PLANEJAMENTO DE ANÁLISESINTRODUÇÃO AO PLANEJAMENTO DE ANÁLISES
NOÇÕES PARA A PREPARAÇÃO DE AMOSTRAS NOÇÕES PARA A PREPARAÇÃO DE AMOSTRAS
Laboratório de Análises Toxicológicas – LATLaboratório de Análises Toxicológicas – LATAuxílio ao diagnóstico de intoxicaçõesAuxílio ao diagnóstico de intoxicações
Análises quali/quanti
Administração de antídotos
Diagnóstico diferencial
Prognóstico – nomogramas
Biomonitorização
Pesquisas: toxinologia, toxicocinética,
analíticas
InformaçõesInformações
História
Indivíduo: anamnese
Síndrome tóxica
Agente tóxico suspeito
Quantidade
Circunstância
Horário da intoxicação
PESQUISA DO AGENTE
PESQUISA DO AGENTE
TÓXICOTÓXICO
1) Direcionamento – o que pesquisar e onde?
2) Tipos de matrizes biológicas
3) Preparação da amostra
- Liberação dos analitos da matriz
- Remoção de interferentes endógenos
- Técnicas de extração
- Aumento da seletividade e sensibilidade
4) Técnicas
CCD
Cromatografia em fase gasosa
Cromatografia líquida
Planejamento da análise Planejamento da análise AMOSTRAAMOSTRA
MÉTODOMÉTODO
Tipos de Amostras Tipos de Amostras
UrgênciaUrgência Controle Controle terapêuticoterapêutico
ForenseForense OcupacionOcupacionalal
DopingDoping Amostras Amostras alternativasalternativas
SangueSangue SangueSangue VíscerasVísceras SangueSangue SangueSangue SuorSuor
UrinaUrina SalivaSaliva Produtos Produtos diversosdiversos
UrinaUrina UrinaUrina MecônioMecônio
Lav. GástricoLav. Gástrico Humor Humor vítreovítreo
SalivaSaliva UnhaUnha
ProdutoProduto CabeloCabelo
MedicamentMedicamentosos
Ar Ar exaladoexalado
SalivaSaliva
SangueSangue
Sangue total, soro e/ou plasmaSangue total, soro e/ou plasma
Matriz complexaMatriz complexa
AnticoagulanteAnticoagulante
HemóliseHemólise
Volume: menor disponibilidadeVolume: menor disponibilidade
Correlação com o efeito Correlação com o efeito
Período de detecção:Período de detecção:
Etanolemia: assepsia com degermante sem álcool.Etanolemia: assepsia com degermante sem álcool.
UrinaUrina
Triagens qualitativas Triagens qualitativas
Disponível em grandes volumesDisponível em grandes volumes
Coleta não invasivaColeta não invasiva
> Chance de encontrar a substância> Chance de encontrar a substânciaPresença de produtos de biotransformação Presença de produtos de biotransformação DulteraçãoDulteraçãoTriagemTriagemSó indicativo de uso Só indicativo de uso
Quantificação Quantificação
correção com creatininacorreção com creatinina
Conteúdo gástricoConteúdo gástrico
Análises qualitativas Análises qualitativas
Coletar a 1ª porçãoColetar a 1ª porção
Grande volume disponívelGrande volume disponível
Agente tóxico em grandes Agente tóxico em grandes
concentrações e não concentrações e não
biotransformadobiotransformado
Amostra Amostra
ESTABILIDADEESTABILIDADE
MatrizMatriz
Tipo de agente tóxico: medicamentos, metais, Tipo de agente tóxico: medicamentos, metais,
praguicidaspraguicidas
ARMAZENAMENTOARMAZENAMENTO
PeríodoPeríodo
Tubos especiais: mTubos especiais: metais (HNOetais (HNO33 10%, água deionizada) - 10%, água deionizada) -
complexaçãocomplexação
Praguicidas (acetona) - resíduosPraguicidas (acetona) - resíduos
ANÁLISES TOXICOLÓGICASANÁLISES TOXICOLÓGICAS
APLICAÇÃOAPLICAÇÃO ÁREASDiagnóstico clínico
Forense
Doping
Controle terapêutico
Biomonitorização
O QUE SE ESPERA ENCONTRARO QUE SE ESPERA ENCONTRAR
PROD INALTERADO/BIOTRANSFORMADOPROD INALTERADO/BIOTRANSFORMADO
QUALIQUALI
TRIAGEMTRIAGEM
QUANTIQUANTI
sensibilidadesensibilidade
TÉCNICAS DE PREPARAÇÃO DE AMOSTRAS EM TÉCNICAS DE PREPARAÇÃO DE AMOSTRAS EM ANÁLISES TOXICOLÓGICASANÁLISES TOXICOLÓGICAS
A preparação de amostras pode ser A preparação de amostras pode ser
considerada como uma série de operações considerada como uma série de operações
unitárias necessárias para que determinada unitárias necessárias para que determinada
substância (analito) possa ser detectada substância (analito) possa ser detectada
pela técnica analítica de escolha.pela técnica analítica de escolha.
ANÁLISES TOXICOLÓGICAS ANÁLISES TOXICOLÓGICAS Técnicas analíticasTécnicas analíticas
CromatográficasCromatográficas
EspectrométricasEspectrométricas
ImunoensaiosImunoensaios
EspectrotométricasEspectrotométricas
ColorimétricasColorimétricas
EQUIPAMENTOS DE CROMATOGRAFIAEQUIPAMENTOS DE CROMATOGRAFIA
Técnicas analíticas Finalidade
CCD/HPTLC Triagem medicamentos, drogas abuso, praguicidas
CG Medicamentos, drogas, praguicidas, solventes
HPLC Medicamentos, drogas, praguicidas, solventes
Espectrometria de Absorção Atômica (EAA)
Metais (Pb, Cd, As, Hg)
ICP Traços
Espectrometria de massas Peso molecular e características estruturais da amostra
Espectrofotometria Substância inalterada, produtos de biotransformação e indicadores biológicos
Colorimetria Medicamentos
Imunoensaios Triagem e confirmação
Eletroforese capilar Praguidas – glifosato, paraquat, drogas de abuso
Típicas operações em preparação de Típicas operações em preparação de amostras:amostras:
A) Liberação dos analitos da amostraA) Liberação dos analitos da amostra
B) Remoção de interferentes endógenosB) Remoção de interferentes endógenos
C) Técnicas de extraçãoC) Técnicas de extração
D) Aumento da seletividade e sensibilidadeD) Aumento da seletividade e sensibilidade
A) Liberação dos analitos da amostraA) Liberação dos analitos da amostra
Analito na matrizAnalito na matriz
- conjugado- conjugado
- livre- livre
BIOTRANSFORMAÇÃOMaconha - 9THC
CH3
OCH3
CH3
OH
C5H11
Delta-9-Tetraidrocanabinol (THC)
C
OCH3
CH3
OH
C5H11
OOH
Ácido 11-nor-delta-9-THC-COOH
C
OCH3
CH3
OH
C5H11
OO ác ido glicurônico
Ácido 11-nor- delta -9 -THC-COOH conjugado
SUBSTÂNCIAS CONJUGADAS SUBSTÂNCIAS CONJUGADAS
HidróliseHidrólise
- Alcalina- Alcalina
- Ácida- Ácida
- Enzimática- Enzimática
HIDRÓLISE ALCALINA HIDRÓLISE ALCALINA
Ácido 11-nor- delta -9 -THC-COOH conjugado
3CH
nicoC
OCH3
OH
C5H11
OO ácido glicurô
Ácido 11-nor-delta-9-THC-COOH
C
OCH3
CH3
OH
C5H11
OOH
60°C
NaOH
-Vantagens:
-processo mais rápido
-custo baixo
- Desvantagens:
-degradação de analitos
não estáveis
p.ex. benzodiazepínicos
-Vantagens:
-processo mais rápido
-custo baixo
- Desvantagens:
-degradação de analitos
não estáveis
p.ex. benzodiazepínicos
HIDRÓLISE ENZIMÁTICA HIDRÓLISE ENZIMÁTICA
Esteróides Anabólicosconjugados Esteróides Anabólicos
livres55°C/1 hora
Beta glucuronidase
-Vantagens:Vantagens:
-não degrada os analitos
- Desvantagens:- Desvantagens:
-custo mais alto
-maior tempo de reação
-controle mais rigoroso das condições
-enzimas podem ser inibidas por substâncias presentes nas
amostras
-Vantagens:Vantagens:
-não degrada os analitos
- Desvantagens:- Desvantagens:
-custo mais alto
-maior tempo de reação
-controle mais rigoroso das condições
-enzimas podem ser inibidas por substâncias presentes nas
amostras
B) B) Remoção de interferentes endógenosRemoção de interferentes endógenos
Uma matriz biológica consiste de muitos Uma matriz biológica consiste de muitos componentes, como proteínas, lipídios, componentes, como proteínas, lipídios, carboidratos que podem interferir na análise.carboidratos que podem interferir na análise.
B) B) Remoção de interferentes endógenos Remoção de interferentes endógenos - - PROTEÍNAS -PROTEÍNAS -
Matriz: sangue total/plasmaMatriz: sangue total/plasma
Determinação: fármacos (ligado/livre)Determinação: fármacos (ligado/livre)
Método: precipitação/desnaturaçãoMétodo: precipitação/desnaturação
Finalidades: precipitação em contato com a fase móvel Finalidades: precipitação em contato com a fase móvel
e obstruir a coluna cromatográficae obstruir a coluna cromatográfica
AgentesAgentes precipitantes- alteração da precipitantes- alteração da solubilidade na solução aquosasolubilidade na solução aquosa
Ácidos: formação de sais insolúveis com a forma catiônica ormação de sais insolúveis com a forma catiônica
das proteínasdas proteínas
Ácido tricloroacético e ácido perclórico
Solventes orgânicos: Solventes orgânicos: solventes que são miscíveis em água como acetona, metanol, etanol e acetonitrila podem abaixar a solubilidade de proteínas.
Sais: retirada da água de solvatação e diminuição da Sais: retirada da água de solvatação e diminuição da
solubilidade das proteínas – efeito salting-out : solubilidade das proteínas – efeito salting-out : ssulfato de amônio
C) Técnicas de extraçãoC) Técnicas de extração
1) Extração líquido-líquido (LLE)
2) Extração em fase sólida (SPE)
3) Extração por head space (HS)
4) Micro extração em fase sólida (SPME)
5) Derivação
C) Técnicas de extração C) Técnicas de extração
Transferir os analitos (matriz original) de
forma adequada para análise em
instrumentação cromatográfica
ExtraçãoExtração
Propriedades físico-químicas (analitos, interferentes e Propriedades físico-químicas (analitos, interferentes e
matriz)matriz)
PolaridadePolaridade
SolubilidadeSolubilidade
Estabilidade química e térmicaEstabilidade química e térmica
Clean-up – interferentes endógenos ou exógenosClean-up – interferentes endógenos ou exógenos
Concentração – sensibilidadeConcentração – sensibilidade
Tempo: 80% da análiseTempo: 80% da análise
1) Extração líquido-líquido (LLE)1) Extração líquido-líquido (LLE)
Extração direta do material biológico com um solvente imiscível com a água.Extração direta do material biológico com um solvente imiscível com a água.
Fenômeno: partiçãoFenômeno: partição
Coeficiente de partição/distribuição: Coeficiente de partição/distribuição: K= CK= C22/C/C11
pH fase aquosapH fase aquosa
proporção vol. das fasesproporção vol. das fases
↑↑ da fase extratorada fase extratora
2 ou mais extrações2 ou mais extrações
ELLELL
urina
Solvente orgânicourina
Drogas/ metabólitos
Agitação
Centrifugação Separação da fase orgânica
Extrato
Solvente extratorSolvente extrator
Solubilidade da substância (ordem de polaridade – série Solubilidade da substância (ordem de polaridade – série
eluotrópica)eluotrópica)
Baixa viscosidade – interação com a matrizBaixa viscosidade – interação com a matriz
Baixo ponto de ebuliçãoBaixo ponto de ebulição
Corrosão em equipamentosCorrosão em equipamentos
ToxicidadeToxicidade
Menos polares: matrizes biológicasMenos polares: matrizes biológicas
CustoCusto
Aditivos e estabilizadores de solventesAditivos e estabilizadores de solventes
ESCOLHA DOS SOLVENTES ESCOLHA DOS SOLVENTES
Drogas ácidas e neutras acetato de etila, diclorometano, éter-isopropanol 7:3,
n-hexano-éter 1:1, entre outros.
Drogas básicas e neutras álcool isoamílico 1 ou 2% em n-hexano, éter etílico,
diclorometano, n-hexano-acetato de etila 7:3, etc
Praguicidas n-hexano, éter de petróleo
Metais metil-isobutilcetona (Pb-pirrolidina ditiocarbamato de
amônia)
INFLUÊNCIA DO pH NA SOLUBILIDADEINFLUÊNCIA DO pH NA SOLUBILIDADE
Substâncias de caráter básico – extração básicaEx. anfetaminas
Matriz
Anfetamina
CH2 CH
CH3
NH
H
OH --Forma ionizada
neutro
CH2 CH
CH3
NH
H
Ajuste do pHAjuste do pHNaOH 2%NaOH 2%
Impurezas ácidasConvertidos em ânions
INFLUÊNCIA DO pH NA SOLUBILIDADEINFLUÊNCIA DO pH NA SOLUBILIDADE
Substâncias de caráter ácido – Extração ácida
Ex. ácido 11-nor-delta -9-THC-COOH
ácido 11-nor-delta -9-THC-COOH
C
OCH3
CH3
OH
C5H11
OOH
NeutroC
OCH3
CH3
OH
C5H11
OOH
H+
Ajuste do pHAjuste do pHHCl 5%HCl 5%
Impurezas Impurezas básicas cátionsbásicas cátions
AJUSTE DE pHAJUSTE DE pH
Drogas ácidas e neutras
Soluções ácidas (HCl diluido, NH4Cl saturado, tampão
acetato, tampão fosfato) Tampões sólidos (fosfato)
Drogas básicas e neutras
Soluções alcalinas (NaOH diluído, NH4OH diluido,
Na2CO3, Na3BO3, tampão fosfato, tampão borato)
Tampões sólidos (carbonato/bicarbonato)
ELLELL
= molécula de água
+ NaCl
Na+ Cl-
CH2 CHCH3
NH
H
+
Efeito Salting-outEfeito Salting-out
Melhora do coeficiente de Melhora do coeficiente de
partição/distribuição entre um solv. partição/distribuição entre um solv.
orgânico e a aquosaorgânico e a aquosa
Diminui a formação de emulsõesDiminui a formação de emulsões
Aumenta a recuperação do analitoAumenta a recuperação do analito
Melhora do coeficiente de Melhora do coeficiente de
partição/distribuição entre um solv. partição/distribuição entre um solv.
orgânico e a aquosaorgânico e a aquosa
Diminui a formação de emulsõesDiminui a formação de emulsões
Aumenta a recuperação do analitoAumenta a recuperação do analito
Vantagens - ELLVantagens - ELL
Fácil execuçãoFácil execução
Não requer instrumentação Não requer instrumentação
especialespecial
Boa seletividadeBoa seletividade
Grande variedade de sistemas Grande variedade de sistemas
de extraçãode extração
Desvantagens - ELLDesvantagens - ELL
Amostras com alta afinidade com a fase aquosaAmostras com alta afinidade com a fase aquosa
Impurezas do solventeImpurezas do solvente
Formação de emulsõesFormação de emulsões
Toxicidade do solvente extratorToxicidade do solvente extrator
Grandes volumes de amostra e solvente – resíduosGrandes volumes de amostra e solvente – resíduos
Procedimento trabalhoso e demoradoProcedimento trabalhoso e demorado
Difícil automaçãoDifícil automação
2) EXTRAÇÃO EM FASE SÓLIDA2) EXTRAÇÃO EM FASE SÓLIDA
Extração em Fase Sólida (SPE) A técnica de SPE é a mais utilizadas no preparo de amostras, tanto quando se quer pré-concentrar compostos de interesse, quanto em casos em que se pretende simplesmente separá-los de constituintes que possam interferir na análise.
Fluído biológico é misturado com um adsorvente e Fluído biológico é misturado com um adsorvente e posteriormente eluido com solvente apropriado.posteriormente eluido com solvente apropriado.
Mecanismo de retenção das substânciasMecanismo de retenção das substâncias AdsorçãoAdsorção PartiçãoPartição
Mecanismos de dessorçãoMecanismos de dessorção Solvente orgânicoSolvente orgânico Dessorção térmicaDessorção térmica
EXTRAÇÃO EM FASE SÓLIDAEXTRAÇÃO EM FASE SÓLIDA
ETAPASETAPAS
1.1.Condicionamento:Condicionamento: Umidificação e ativação dos Umidificação e ativação dos
2.2.Adição da amostraAdição da amostra: Retenção quantitativa do : Retenção quantitativa do
composto de interesse e remoção de parte da matrizcomposto de interesse e remoção de parte da matriz
3.3.LavagemLavagem: Remoção da maioria dos componentes : Remoção da maioria dos componentes
da matriz, o que aumenta a seletividadeda matriz, o que aumenta a seletividade
4.4.EluiçãoEluição: Eluição quantitativa do composto de : Eluição quantitativa do composto de
interesse na colunainteresse na coluna
Metanol +
tampão fosfato
1
Amostra + água + PI + tampão
fosfato
BE
PI
Interf.
COC
2
Água + HCl 0,1M + metanol
3
Diclorometano/ isopropanol / NH3
(80:20:2)
4
EXTRAÇÃO EM FASE SÓLIDAEXTRAÇÃO EM FASE SÓLIDA
EFS aparatoEFS aparato
PREENCHIMENTOPREENCHIMENTO
Fase sólida - Fase sólida - empacotada em coluna (cartuchos)empacotada em coluna (cartuchos)
NaturezaNaturezaPolímeros porososPolímeros porosos
Tipos de colunas (SPE)Tipos de colunas (SPE)
APOLARES/fase reversa: octadecil, octil, fenilAPOLARES/fase reversa: octadecil, octil, fenil
INTERAÇÕES NÃO-POLARES (Van der Waals)INTERAÇÕES NÃO-POLARES (Van der Waals)
SiC8
Octil
SiPH
Fenil
SiCHCiclohexil
Tipos de colunas (SPE)Tipos de colunas (SPE)
Si C N
H O
CNCianopropil
Si NH
H
H
O
NH2
Aminopropil
Si O
OH
O
H
H
NH
2OHDiol
POLARES/fase normal: cianopropil, diolPOLARES/fase normal: cianopropil, diol
INTERAÇÕES tipo hidrofílica: dipolo-dipolo, pontes HINTERAÇÕES tipo hidrofílica: dipolo-dipolo, pontes H
Tipos de colunas (SPE)
- TROCA IÔNICA- INTERAÇÕES IÔNICAS (Eletrostáticas)
SiC
O
O-+NH3 R
CBAÁcido
carboxílico
Si
SO3- +NH3
SCXÁcido
benzenosulfônico
Si N+(CH3)3-SO3 R
SAXTrimetil
aminopropil
FATORES QUE AFETAM A EXTRAÇÃO EM FATORES QUE AFETAM A EXTRAÇÃO EM FASE SÓLIDAFASE SÓLIDA
pHpHTipo de amostraTipo de amostraVolume de amostraVolume de amostraTratamento do adsorventeTratamento do adsorvente
CondicionamentoCondicionamentoLavagemLavagemDessorção (eluição)Dessorção (eluição)
EXTRAÇÃO EM FASE SÓLIDAEXTRAÇÃO EM FASE SÓLIDAVANTAGENS / VANTAGENS / DESVANTAGENSDESVANTAGENS
Redução do volume da amostra e do solvente extratorRedução do volume da amostra e do solvente extrator Maior rapidez na análiseMaior rapidez na análise Aumento de eficiência da extração (recuperação)Aumento de eficiência da extração (recuperação) Não formação de emulsõesNão formação de emulsões Volume de evaporação diminuídoVolume de evaporação diminuído Maior facilidade de automaçãoMaior facilidade de automação Maior seletividadeMaior seletividade Boa reprodutibilidadeBoa reprodutibilidade Várias possibilidades de adsorventes e solventesVárias possibilidades de adsorventes e solventes Alto custo, importaçãoAlto custo, importação Viscosidade da amostra afeta o fluxoViscosidade da amostra afeta o fluxo
3) EXTRAÇÃO POR 3) EXTRAÇÃO POR HEAD SPACEHEAD SPACE
DETERMINAÇÃO DE VOLÁTEIS
Amostra (urina, sangue ou saliva) + sulfato de sódio + PI
ESTUFA 70°C 30 min GC
seringa
4) MICRO EXTRAÇÃO EM FASE SÓLIDA 4) MICRO EXTRAÇÃO EM FASE SÓLIDA (SPME(SPME)
-Baseado na partição do analito entre a fibra de extração e a matriz (amostra)
61 2 3 4 5
SPMESPME
MICRO EXTRAÇÃO EM FASE SÓLIDA (SPME)MICRO EXTRAÇÃO EM FASE SÓLIDA (SPME) Fibras comercialmente disponíveis Fibras comercialmente disponíveis
Fase estacionária
(espessura do filme)
Abreviação Aplicação geral
Polidimetilsiloxano (100 m) PDMS Compostos não-polares, voláteis
Polidimetilsiloxano (30um) PDMS Não-polares, voláteis e semi-voláteis
Polidimetilsiloxano (7um) PDMS Não-polares, semi e não voláteis
Polidimetilsiloxano divinilbenzeno (65um)
PDMS-DVB Polar
Poliacrilato (85um) PA Polar, uso geral, voláteis
Carboxeno-polidimetilsiloxano (75um, 85um)
CAR-PDMS Voláteis
Carbowax- divinilbenzeno (65um, 75um)
CW-DVB Polar, voláteis
MICRO EXTRAÇÃO EM FASE MICRO EXTRAÇÃO EM FASE SÓLIDA (SPME)SÓLIDA (SPME)
Fatores que afetam a eficácia de extração por Fatores que afetam a eficácia de extração por
SPME:SPME:
Dimensões da fibra (comprimento, espessura);Dimensões da fibra (comprimento, espessura);
Temperatura de extração;Temperatura de extração;
Efeito da matriz (presença de sal, pH);Efeito da matriz (presença de sal, pH);
Velocidade de agitação;Velocidade de agitação;
Tempo de extração.Tempo de extração.
MICRO EXTRAÇÃO EM FASE SÓLIDA (SPME)MICRO EXTRAÇÃO EM FASE SÓLIDA (SPME)
Vantagens da SPME sobre a SPE e extração Vantagens da SPME sobre a SPE e extração
líquido-líquido:líquido-líquido:
SimplicidadeSimplicidade
PráticoPrático
RápidoRápido
Extração sem utilização de solventesExtração sem utilização de solventes
Pode ser automatizado.Pode ser automatizado.
5) Derivação5) DerivaçãoObjetivos:Objetivos:
- CG- CG
- Aumento da volatilidade e diminuição da - Aumento da volatilidade e diminuição da
polaridadepolaridade
- Redução da degradação térmica- Redução da degradação térmica
- Aumento da resposta do detector – adição de - Aumento da resposta do detector – adição de
grupamentos funcionaisgrupamentos funcionais
- Melhora da separação e a sensibilidade- Melhora da separação e a sensibilidade
DERIVAÇÃODERIVAÇÃO
N
C
CH3
OO H
O CO
N
C
CH3
OO CH2CF2CF3
O CO
PFP/PFPA
70°C 20 min
PFP: PentafluoropropanolPFPA: Anidrido pentafluoropropiônico
Ex. Benzoilecgonina: Aumento da sensibilidade para detectores detector
de captura eletrônica
REFERÊNCIASREFERÊNCIAS
1) MCDOWALL, R.D. Sample preparation for
biomedical analysis. J. Chromatogr. B, 492, p.3-58,
1989.
2) WONG, S.H., SUNSHINE, I. Handbook of Analytical
therapeutic drug monitoring and toxicology. CRC
Press, 1997.
3) THEODORIDIS, G., KOSTER, E.H.M., JONG, G.J. Solid
phase microextraction for the analysis of biological
samples. J. Chromatogr. B, 745, 49-82, 2000.