análise diferencial do proteoma da polpa do mamão durante o

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  • UNIVERSIDADE DE SO PAULO FACULDADE DE CINCIAS FARMACUTICAS Programa de Ps-Graduao em Cincia dos Alimentos

    rea de Bromatologia

    Anlise diferencial do proteoma da polpa do mamo

    durante o amadurecimento utilizando eletroforese

    bidimensional

    Silvia Beserra Nogueira

    Tese para obteno do ttulo de

    DOUTOR

    Orientador:

    Prof. Dr. Joo Roberto Oliveira do Nascimento

    So Paulo 2010

  • UNIVERSIDADE DE SO PAULO FACULDADE DE CINCIAS FARMACUTICAS Programa de Ps-Graduao em Cincia dos Alimentos

    rea de Bromatologia

    Anlise diferencial do proteoma da polpa do mamo

    durante o amadurecimento utilizando eletroforese

    bidimensional

    Silvia Beserra Nogueira

    Tese para obteno do ttulo de

    DOUTOR

    Orientador:

    Prof. Dr. Joo Roberto Oliveira do Nascimento

    So Paulo 2010

  • 100p.

  • Silvia Beserra Nogueira

    Anlise diferencial do proteoma da polpa do mamo durante

    o amadurecimento utilizando eletroforese bidimensional

    Comisso Julgadora da

    Tese para obteno do grau de Doutor

    Prof. Dr. Joo Roberto Oliveira do Nascimento Presidente/Orientador

    1 Examinador

    2 Examinador

    3 Examinador

    4 Examinador

    So Paulo, de de 2010.

  • AGRADECIMENTOS

    Deus por guiar meus passos em todos os momentos.

    Ao meu marido, Thiago Kanyo Dutra, por acreditar em mim, me apoiar sempre

    e fazer minha vida mais feliz.

    Aos meus queridos pais Ademiro da Silva Nogueira e Maria das Graas

    Beserra Nogueira pelo amor e por toda uma vida de luta para que eu chegasse

    at aqui.

    Ao meu irmo Leandro Beserra Nogueira pelo amor e amizade.

    minha famlia e parentes que torcem por mim mesmo a distncia.

    Faculdade de Cincias Farmacuticas da Universidade de So Paulo por

    possibilitar a realizao deste trabalho.

    Ao Prof. Dr. Joo Roberto Oliveira do Nascimento pela confiana depositada,

    pacincia e orientao durante o curso.

    Ao CNPq pela concesso da bolsa e FAPESP pelos auxlios financeiros

    (02/12452-9 e 2008/52447-0).

    Ao Prof. Dr. Carlos Alberto Labate que prontamente permitiu a utilizao de seu

    laboratrio para a realizao de algumas anlises.

    Ao Prof. Dr. Fbio Cesar Gozzo por possibilitar a realizao de algumas

    anlises.

    Aos demais professores do Programa de Ps-Graduao em Cincia dos

    Alimentos, em especial a Prof. Dra. Beatriz Rosana Cordenunsi e ao Prof. Dr.

    Eduardo Purgatto pelo carinho e colaborao.

  • s tcnicas do laboratrio de qumica e bioqumica de alimentos por facilitarem

    nosso trabalho, em especial a Tnia Misuzu Shiga pelo carinho e amizade.

    todos os amigos de laboratrio Luiz Marcelo Eugnio, Renato Astorino Filho,

    Tatiana Torres Toledo, Roberta Ghedine der Agopian, Claudineia Aparecida

    Soares, Cntia e tantos outros que passaram e deixaram saudade, pelo

    convvio agradvel e amizade.

    E a todos que de alguma forma contriburam para a realizao deste trabalho,

    Muito Obrigada!

  • NOGUEIRA, S.B. Anlise diferencial do proteoma da polpa do mamo durante o amadurecimento utilizando eletroforese bidimensional. Tese de Doutorado, 2010, 100p. [Faculdade de Cincias Farmacuticas da Universidade de So Paulo].

    RESUMO O mamo papaia (Carica papaya L.) uma fruta tropical de grande relevncia

    comercial uma vez que o Brasil o maior produtor mundial e terceiro maior

    exportador da fruta. Contudo, por ser uma fruta climatrica, tem uma vida ps-

    colheita limitada, devido ao rpido amaciamento da polpa. Neste trabalho foi

    realizada uma investigao protemica comparativa de polpa do mamo verde

    e maduro. Vrias centenas de componentes proticos (spots) foram resolvidos

    em gis 2-DE (faixa de pH 4-7) utilizando a eletroforese diferencial em gel

    (DIGE) e posteriormente as imagens geradas foram analisadas pelo programa

    PDQuest. Os spots diferencialmente expressos foram retirados do gel, digeridos e

    sequenciados (ESI-Q-TOF-MS/MS). Em geral, as protenas diferencialmente

    expressas foram associadas ao metabolismo do etileno, resposta ao estresse,

    metabolismo de carbono e outros importantes processos fisiolgicos. Os papis

    de algumas das protenas identificadas foram discutidos em relao

    qualidade dos frutos do mamo. Este estudo fornece a primeira caracterizao

    das mudanas no proteoma da polpa do mamo durante o amadurecimento.

    Deste modo a identificao de protenas envolvidas na instalao ou

    desenvolvimento do amadurecimento pode contribuir para o entendimento

    deste processo e, tambm, gerar subsdios para avanos tecnolgicos visando

    qualidade e diminuio das perdas ps-colheita.

    Palavras-chave: Amadurecimento dos frutos, Proteoma diferencial, DIGE, Carica papaya L.

  • NOGUEIRA, S.B. Differential analysis of papaya fruit proteome during ripening using two-dimensional electrophoresis. Tese de Doutorado, 2010, 100p. [Faculdade de Cincias Farmacuticas da Universidade de So Paulo].

    ABSTRACT

    Papaya (Carica papaya L.) fruit is a relevant tropical crop since Brazil is the

    world's largest producer and third largest exporter of fruit. However being a

    climacteric fruit, has a limited green life due to the rapid pulp softening. We

    report here a comparative proteomic investigation of fruit pulp from unripe and

    ripe papayas. Several hundreds of protein components were resolved on 2-DE

    gels (pH range 47) using the differential gel electrophoresis (DIGE) approach,

    and images were analyzed by PDQuest. The variable components were

    excised, in-gel digested and were analyzed by ESI-Q-TOF-MS/MS. In general,

    the differentially expressed proteins were associated to ethylene metabolism,

    stress response, carbon metabolism and other important physiological

    processes. The roles of some of the identified proteins were discussed in

    relation to papaya fruit quality. To the best of our knowledge, this investigation

    provides the first characterization of the changes in papaya fruit pulp proteome

    during ripening. Thus the identification of proteins involved in the installation or

    development of the ripening may contribute to the understanding of this process

    and also provide subsidies for technological advances aimed at quality and

    reduction of post harvest losses.

    Keywords: Fruit ripening, Differential proteome, DIGE, Carica papaya L.

  • ABREVIATURAS

    1-MCP 1-Metilciclopropeno

    2DE eletroforese bidimensional

    CCD dispositivo de carga acoplada (charge-coupled device)

    CBB coomassie brilliant blue

    DIGE eletroforese diferencial em gel (difference gel electrophoresis)

    DPC dias ps-colheita

    DTT ditiotreitol (tio-1,4-dimercapto-2,3-butanodiol)

    EDTA cido etilenodiamino tetra-actico (ethylenediaminetetraacetic acid)

    ESI ionizao por electrospray (electrospray ionization)

    EST expressed sequence tags

    FID detector de ionizao de chama (fire ionization detector)

    FT-MS ressonncia de on ciclotron de transformada (fourier transform on cyclotron)

    IEF focalizao isoeltrica (isoeletric focusing)

    IPG gradiente imobilizado de pH (immobilized pH gradient)

    IPP isopentenil-difosfato

    kDa quilodalton

    LC-MS cromatografia lquida acoplada a espectrometria de

    massa

    LED diodo emissor de luz

    MALDI espectrometria de massa por desoro e ionizao a

    laser assistida

    (matrix-assisted laser desorption/ionization)

    MSDB mass spectrometry protein sequence data base

    MS espectrometria de massas

  • m/z razo massa carga

    PAGE eletroforese em gel de poliacrilamida (polyacrylamide gel electrophoresis)

    pI ponto isoeltrico

    PG poligalacturonase

    PL pectate liase

    PME pectiname7tilesterase

    ppm Partes por milho

    SDS dodecil sulfato de sdio (sodium dodecyl sulfate)

    TCA cido tricloroactico

    TCD detector de condutividade trmica (thermal conductivity detector)

    TOF Tempo de vo (time-of-flight)

    TRIS (hidroximetil) aminometano (hydroxymethylaminomethane)

    V Voltagem

    Vh volts-hora

  • SUMRIO

    Pg.

    1. INTRODUO .................................................................................... 01

    1.1 Expresso gnica e amadurecimento............................................... 03

    1.2 Protemica......................................................................................... 05

    2. OBJETIVO........................................................................................... 13

    3. MATERIAL E MTODOS.................................................................... 14

    3.1 Amostras........................................................................................... 14

    3.2 Caracterizao das amostras............................................................ 14

    3.3 Extrao de protenas........................................................................ 16

    3.4 Eletroforese SDS-PAGE.................................................................... 17

    3.5 Eletroforese bidimensional-2DE........................................................ 17

    3.6 Anlise das imagens dos gis corados com coomassie brilliant blue... 22

    3.7 Anlise das imagens dos gis de protenas marcadas por fluorescncia-DIGE..................................................................................

    23

    3.8 Digesto de protenas........................................................................ 25

    3.9 LC-MS/MS......................................................................................... 26

    4. RESULTADOS E DISCUSSO.......................................................... 27

    4.1 Amostragem....................................................................................... 27

    4.2 Extrao de protenas ....................................................................... 30

    4.3 Eletroforese bidimensional: gis corados com coomassie brilliant blue 33

    4.4 Anlise DIGE............................................................................................ 42

    4.5 Seleo dos spots para digesto............................................................. 50

    4.6 Espectrometria de massas ..................................................................... 51

    4.6.1 Taxa de identificao de protenas em Carica papaya L..................... 51

    4.7 Classificao funcional das protenas..................................................... 57

    4.7.1 Sntese e regulao de etileno............................................................. 57

    4.7.2 Hidrolases....................................................................................... 64

    4.7.3 Metabolismo secundrio................................................................. 66

    4.7.4 Metabolismo energtico........................................................................ 68

    4.7.4.1 Metabolismo de carbono.................................................................... 70

  • 4.7.5 Sntese e armazenamento de protenas.............................................. 72

    4.7.6 Protenas de resposta ao estresse....................................................... 73

    4.7.7 Protenas de estresse oxidativo............................................................ 77

    4.7.8 Mltiplos spots de uma mesma protena.............................................. 79

    5. CONCLUSO............................................................................................ 81

    6. REFERNCIAS......................................................................................... 83

    7. ANEXOS ................................................................................................... 97

  • LISTA DE TABELAS

    Pg.

    Tabela 1. Esquema de marcao com as cianidinas (Cy2, Cy3 e Cy5) dos dois pontos de maturao para cada amostragem........................................................................

    20

    Tabela 2. Anlise qualitativa da presena de spots de protenas nos extratos dos grupos de amostras representativas do mamo papaia nos estdios de maturao verde e maduro. Os valores correspondem s mdias das densidades ticas encontradas para a triplicata de gis e a razo entre esses valores...............................................

    39

    Tabela 3. Anlise quantitativa da presena de spots de protenas nos extratos dos grupos de amostras representativas do mamo papaia nos estdios de maturao verde e maduro. Os valores correspondem s mdias das densidades ticas encontradas para a triplicata de gis e a razo entre esses valores...............................................

    41

    Tabela 4. Anlise qualitativa da presena de spots de protenas nos extratos dos grupos de amostras representativas do mamo papaia nos estdios de maturao verde e maduro. Os valores correspondem s mdias das densidades ticas encontradas para a triplicata de gis e a razo entre esses valores...............................................

    46

    Tabela 5. Anlise qualitativa da presena de spots de protenas nos extratos dos grupos de amostras representativas do mamo papaia nos estdios de maturao verde e maduro. Os valores correspondem s mdias das densidades ticas encontradas para a triplicata de gis e a razo entre esses valores...............................................

    47

    Tabela 6. Protenas de Carica papaya L. identificadas atravs da anlise DIGE durante o amadurecimento do fruto...................

    53

  • LISTA DE FIGURAS

    Pg.

    Figura 1. Caracterizao fisiolgica de trs distintas amostragens do mamo papaia. As amostragens I (linhas pretas) e II (linhas vermelhas) e III (linhas azuis) tiveram o amadurecimento acompanhado pelos seguintes parmetros: A) quantidade de CO2 produzido pela respirao dos frutos, B) etileno produzido pelos frutos, C) firmeza da polpa. As barras verticais representam o erro padro das mdias n=6 amostragens I e II, n= 9 amostragem III)..................................................................

    28

    Figura 2. Caracterizao fisiolgica de trs amostragens distintas do mamo papaia. Imagens dos frutos mostrando as mudanas tpicas na cor da casca e da polpa para as amostragem I (a), II (b) e III (c) (DPC dias ps-colheita)...

    29

    Figura 3. Eletroforese sob condies desnaturantes (SDS-PAGE) de protenas extradas da polpa do mamo papaia. As letras A, B e C indicam os extratos de amostras pr-climatricas obtidas das amostragens I, II e III, respectivamente, enquanto as letras D, E, e F indicam os extratos de amostras climatricas das amostragens I, II e III, respectivamente, separadas em gel de poliacrilamida 12% (SDS-PAGE). As protenas foram coradas utilizando-se coomassie brilliant blue. Os nmeros esquerda indicam o tamanho das bandas do padro de peso molecular, em KDa...................................

    32

    Figura 4. Eletroforese bidimensional de protenas da polpa do mamo papaia verde (a) e maduro (b). As protenas foram separadas em um gradiente de pH 3-10 na primeira dimenso e em SDS-PAGE 12% na segunda dimenso. As protenas foram coradas utilizando a colorao com coomassie brilliant blue. Os nmeros a esquerda indicam o tamanho da banda do padro de peso molecular em KDa.....................................................

    34

    Figura 5. Imagens dos gis resultantes das anlises DIGE do mamo papaia verde e maduro. A coluna verde 1,2,3 representa as imagens do mamo verde foram marcados com Cy3 e 4,5,6 as que foram marcados com Cy5. A coluna pool todas as imagens foram marcadas com Cy2. A coluna maduro 1,2,3 representa as imagens de mamo maduro que foram marcadas com Cy5 e 4,5,6 as que foram marcadas com Cy3. As linhas representam as trs imagens pertencentes ao mesmo gel................................

    44

  • Figura 6. Imagem multicanal da anlise DIGE obtida atravs da sobreposio de canais de fluorescncia da Cy2 (pool), Cy3 (pr-climatrico), e Cy5 (climatrio). As setas indicam spots de protenas diferencialmente expressos selecionados aps anlise de teste T de Student (p 0,05), juntamente com seus respectivos nmeros de identificao. A escala de pH de separao da IEF (pH 4-7) est localizada na parte superior, e da posio do peso molecular est esquerda da imagem...............

    49

    Figura 7. Classificao funcional das 37 protenas da polpa do mamo papaia identificadas como diferencialmente expressas durante o amadurecimento...............................

    58

  • 1. Introduo _________________________________________________________________________

    ____________________________________________________________________________________

    NOGUEIRA, S.B.

    1

    1. INTRODUO

    O mamo papaia (Carica papaya L.) um fruto de grande importncia

    comercial para o Brasil, uma vez que o pas o maior produtor mundial da

    fruta, com 24% da produo total mundial e o terceiro maior exportador, sendo

    que a produo em 2006 representou um recorde nacional, com 1.897.639

    toneladas (IBGE, 2006). Alm disso, est entre as frutas mais apreciadas e

    consumidas no Brasil (EMBRAPA, 2009), sendo uma excelente fonte de

    nutrientes, vitaminas (vitamina C e pr-vitamina A) e minerais (magnsio)

    (WALL, 2006).

    O mamo papaia uma fruta climatrica, que apresenta comportamento

    tpico durante o amadurecimento, com aumento da respirao e da produo

    de etileno (SEYMOUR, TAYLOR e TUCKER, 1993). As principais alteraes

    fsico-qumicas como a mudana na colorao, na textura, acmulo de

    acares e de compostos volteis, ocorrem durante o amadurecimento e so

    finalizadas na senescncia (GIOVANNONI, 2001). Estas transformaes

    resultam em um fruto final com caractersticas atrativas para os consumidores,

    alm de determinar caractersticas nutricionais importantes, como quantidade e

    composio de fibras, lipdeos, vitaminas e composio de antioxidantes

    (BRAMLEY, 2002).

    Nos frutos climatricos as transformaes fsico-qumicas ocorrem

    rapidamente aps a colheita, tornando-os muito perecveis, o que exige

    medidas de controle apropriadas do amadurecimento, de forma a aumentar a

    vida til do produto. No caso do mamo, as alteraes que ocorrem na

  • 1. Introduo _________________________________________________________________________

    ____________________________________________________________________________________

    NOGUEIRA, S.B.

    2

    colorao da casca, passando da cor verde para amarela, so resultantes,

    principalmente, da degradao da clorofila e do aumento da sntese de

    pigmentos, como os carotenides (CHITARRA e CHITARRA, 1990). De acordo

    com Fabi (2007) a concentrao de alguns carotenides como: all-trans-

    licopeno, all-trans--criptoxantina e all--caroteno, aumentaram durante o

    amadurecimento da polpa de frutos de mamoeiro.

    A diminuio da firmeza da polpa um indicativo importante do

    amadurecimento do mamo e um dos principais fatores que contribuem para

    torn-lo extremamente perecvel. Em frutos a degradao de polissacardeos

    da parede celular, como celulose, hemicelulose e pectina levam as alteraes

    na parede celular e, consequentemente, ao amaciamento da polpa

    (SEYMOUR, TAYLOR e TUCKER, 1993). As alteraes na parede celular

    resultam, muito provavelmente, da ao de enzimas hidrolticas como:

    poligalacturonase (PG), pectinametilesterase (PME) e pectate liase (PL), entre

    outras. A atividade de PME aumenta gradualmente ao longo do

    amadurecimento permitindo a atividade da PG atravs da demetilao das

    pectinas. No caso da PG o aumento bem significativo, concomitante com o

    aumento da produo de etileno no mamo papaia (PAULL e CHEN, 1983).

    Genes que codificam para PG j foram caracterizados em muitas outras frutas,

    e alguns estudos tm revelado a expresso deste gene induzido pelo etileno.

    De acordo com Fabi e colaboradores (2009) em mames o gene da PG

    induzido pelo etileno. Porm, a inibio do mesmo por 1-MCP no impediu o

    amadurecimento total do fruto. Estes resultados podem ser um indicativo de

  • 1. Introduo _________________________________________________________________________

    ____________________________________________________________________________________

    NOGUEIRA, S.B.

    3

    que outras enzimas etileno independentes participam do processo do

    amadurecimento.

    A rpida diminuio da firmeza da polpa do mamo predispe o fruto a

    injrias mecnicas e a presena de microorganismos. Foi estimada uma perda

    ps-colheita mundial de 40 a 100% do mamo (PAULL et al., 1997). Apesar

    disso, as tcnicas de manejo ps-colheita como o uso de embalagens

    especiais, o tratamento trmico e a aplicao de inseticidas ainda no

    provaram ser completamente eficazes para minimizar e prevenir as perdas

    (SAUCEDO-VELOZ, 1997). Portanto, importante conhecer os mecanismos

    moleculares de controle do processo de maturao da fruta e o amaciamento

    da polpa e identificar eventuais pontos em seu metabolismo que possam ser

    trabalhados com o intuito de reduzir as perdas econmicas e nutricionais.

    1.1 Expresso gnica e amadurecimento

    A expresso gnica desempenha papel importante no amadurecimento

    de frutos uma vez que, genes especficos parecem ser necessrios durante

    esse processo (GIOVANNONI, 2004). Porm, estes estudos esto limitados a

    poucos frutos como no estudo de genes envolvidos no processo de

    amadurecimento de tomate (GIOVANNONI, 2001; MATAS et al., 2009) no

    estudo de genes envolvidos na sinalizao de etileno durante o

    amadurecimento em banana (MBGUI et al., 2008) e nos estudos

    relacionando o cido ascrbico com o inicio do amadurecimento de uvas

    (LUND et al., 2008).

  • 1. Introduo _________________________________________________________________________

    ____________________________________________________________________________________

    NOGUEIRA, S.B.

    4

    A obteno da sequncia de nucleotdeos do genoma de plantas

    constitui o incio da realizao de muitos outros estudos. Embora os dados

    obtidos pela genmica sejam relevantes, eles so limitados, uma vez que, o

    conhecimento de todo o cdigo gentico pode ter pouco valor caso no haja

    informaes sobre a regulao espao-tempo dos genes. Estas limitaes

    esto associadas dificuldade de obteno de informaes sobre o nvel de

    expresso dos genes, ou sobre as caractersticas das protenas expressas, tais

    como a sua localizao subcelular, eventuais modificaes ps-traduo como

    glicosilaes e fosforilaes, interaes protena-protena e protena-DNA, bem

    como a estrutura e a funo biolgica das protenas (TYERS e MANN, 2003).

    Uma maneira de complementar a pesquisa genmica o estudo do seu

    produto final (as protenas). Assim, grande nfase tem sido dada genmica

    funcional, que visa identificar a funo dos genes e das protenas atravs de

    estudos do transcriptoma, da proteoma e da metaboloma dos organismos.

    Embora a expresso do gene a nvel transcripcional fornea informaes

    importantes sobre a transcrio da fase inicial do genoma para a maquinaria

    celular, os nveis de mRNA no so sempre compatveis com a abundncia de

    protenas. Alm disso, devido ao splicing alternativo, processamento de mRNA,

    protelise de protenas e modificaes ps-traducionais, um gene pode

    produzir muitas protenas diferentes. No sendo isso bastante, as funes da

    protena so definidas pela classificao subcelular, a interao com outras

    molculas e a regulao via sinalizao celular e ambientais (CHEN e

    HARMON, 2006). A protemica complementa outras abordagens da genmica

    funcional, incluindo perfis de expresso baseados em microarray, sistemtica

    de perfis fenotpicos na clula e no nvel de organismo. A integrao desses

  • 1. Introduo _________________________________________________________________________

    ____________________________________________________________________________________

    NOGUEIRA, S.B.

    5

    conjuntos de dados atravs da bioinformtica pode criar um banco de dados

    global da funo do gene, que servir como referncia poderosa das

    propriedades e das funes da protena.

    Deste modo, estudos sobre os produtos finais dos genes, as protenas,

    podem complementar aqueles sobre as sequncias de genes, alm de fornecer

    informaes importantes acerca da expresso gnica.

    1.2 Protemica

    O termo proteoma definido como conjunto de todas as protenas

    codificadas pelo genoma em um determinado momento metablico (WILKINS

    et al., 1996). O proteoma altamente dinmico e dependente do estado atual

    da clula, mudando com o desenvolvimento do organismo e em resposta a

    qualquer alterao no seu ambiente (TYERS e MANN, 2003). Devido ao

    dinamismo da expresso gnica das clulas, a protemica consiste numa

    ferramenta importante para descrever as protenas totais de organelas, rgos

    ou tecidos em diferentes condies biolgicas e contribui para entender o

    funcionamento dos genes (CHEN e HARMON, 2006). As informaes obtidas

    como nvel de expresso e ponto isoeltrico so informaes complementares

    ao mecanismo de regulao, quantidade, atividade, isoformas de protenas,

    modificaes ps-traducionais e interaes de cada protena no interior da

    clula. Isto faz com que essa tcnica seja uma ferramenta extremamente til

    para os estudos da genmica funcional (TYERS e MANN, 2003).

  • 1. Introduo _________________________________________________________________________

    ____________________________________________________________________________________

    NOGUEIRA, S.B.

    6

    A obteno do extrato protico a primeira fase antes da separao das

    protenas, sendo uma etapa crtica na produo dos resultados finais da

    anlise. A qualidade do extrato depende da quantidade de protenas obtidas,

    ausncia de contaminantes como pigmentos, carboidratos e compostos

    fenlicos e variedade de protenas extradas para uma resoluo de qualidade

    e boa separao das mesmas no gel (NEBRICH et al., 2009).

    O tecido vegetal de frutos considerado de difcil extrao de protenas

    devido sua baixa concentrao (SONG et al., 2006) e presena de grande

    quantidade de substncias interferentes como sais, carboidratos e polifenis

    (WANG et al., 2006). Recentemente muitos trabalhos foram realizados com o

    intuito de estabelecer o melhor protocolo para extrao de protenas de tecido

    vegetal como nos trabalhos com morango (ZHENG et al., 2007), meristema de

    banana (CARPENTIER et al., 2005) e uva (VINCENT, WHEATLEY e CRAMER,

    2006). Os protocolos para extrao utilizando TCA/acetona e extrao fenlica

    com precipitao em acetato de amnia e metanol (ISAACSON et al., 2006)

    tm sido testados com maior frequncia, sendo que, a extrao fenlica parece

    ser o que obtm melhor qualidade de extrato.

    Aps a extrao de protenas, a separao da mistura protica

    realizada tanto por 2-DE (GORG et al., 1999), ou diferentes tipos de LC

    (DAHER et al., 2010). A eletroforese bidimensional tem sido a estratgia mais

    utilizada para anlise do proteoma em plantas (CARRETTE et al., 2006).

    A eletroforese bidimensional (2-DE) pode resolver em um nico gel mais

    de 5.000 protenas simultaneamente, e detectar 1 ng de protena por spot.

  • 1. Introduo _________________________________________________________________________

    ____________________________________________________________________________________

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    7

    Alm disso, ela estabelece um mapa das protenas intactas, o que reflete as

    mudanas no nvel de expresso, isoformas ou modificaes ps-traducionais.

    Outro ponto da protemica, baseada na eletroforese bidimensional, que esta

    permite o acesso a dados qualitativos que mostram apenas se uma protena

    est presente ou no na amostra estudada e, dados quantitativos, que revelam

    as concentraes de determinada protena nas diferentes condies analisadas

    (GORG, WEISS e DUNN, 2004).

    A eletroforese bidimensional (2-DE) dividida em duas etapas principais

    onde, na primeira dimenso, as amostras so separadas de acordo com seus

    pontos isoeltricos (pI) isto , o valor do pH no qual a protena tem carga

    residual nula. No pI no ocorre migrao sob a ao de um campo eltrico.

    Aps a amostra ser misturada com uma srie de reagentes, denominados

    anflitos carreadores, que possuem boa capacidade tamponante em seus

    valores individuais de pI, um gradiente de pH obtido quando, ao se aplicar um

    campo eltrico. Isto faz com que ocorra a migrao da amostra, de acordo

    com o seu valor de pH. Desta forma, em valores de pH mais baixos que o pI

    das amostras migram para o catodo, pois esto positivamente carregados. Em

    pH mais alto, elas migram para o anodo, pois esto carregados negativamente.

    J na segunda dimenso, a separao se d de acordo com suas

    massas moleculares a sua mobilidade electrofortica, na qual as protenas

    menores iro migrar mais rpido que as protenas maiores. Aps a obteno

    dos gis as protenas podem ser visualizadas atravs da utilizao de corantes

    como coomassie brilliant blue (CBB), prata ou fluorescncia que permitem

    visualizar as protenas no gel (CANDIANO et al., 2004).

  • 1. Introduo _________________________________________________________________________

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    NOGUEIRA, S.B.

    8

    DIGE um sistema de marcao de protenas que permite a separao

    quantitativa protemica de duas ou mais amostras por deteco de

    fluorescncia ptica de protenas diferencialmente marcadas que so

    separadas eletroforeticamente no mesmo gel. DIGE uma alternativa para a

    quantificao de metodologias baseadas em MS e pode contornar suas

    limitaes analticas. Por exemplo, consegue analisar as protenas, mantendo-

    as intactas, alm de detectar uma gama ampla de protenas sendo interessante

    em aplicaes onde a sensibilidade extrema necessria (UNLU, MORGAN e

    MINDEN, 1997). Na eletroforese bidimensional diferencial em gel possvel

    analisar em um mesmo gel duas condies experimentais diferentes,

    eliminando as variaes resultantes de diferenas de corrida dos gis

    independentes. As amostras de protenas so marcadas antes da eletroforese

    com corantes fluorescentes, as cianidinas Cy2, Cy3, Cy5. As cianidinas tm um

    grupo NHS-ster reativo que forma uma ligao covalente com o grupo -amino

    de resduos de lisina das protenas (ALBAN et al., 2003). Essa tcnica

    apresenta uma sensibilidade maior quando comparada com a colorao com

    prata ou com coomassie brilliant blue, uma vez que capaz de detectar uma

    quantidade muito pequena de protenas. Alm disso, diminui a variao de gel

    para gel (ALBAN et al., 2003).

    Para a anlise DIGE o extrato de protenas de cada grupo marcado

    com corante fluorescente que exibe comprimento de onda especfico para

    excitao e emisso. Assim, trs amostras diferentes (amostra controle

    marcada com Cy3, amostra experimental marcada com Cy5 e, uma mistura de

    todas as amostras utilizadas na anlise marcadas com Cy2) so misturadas

    aps a marcao para a focalizao isoeltrica e resolvidas no mesmo gel

  • 1. Introduo _________________________________________________________________________

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    NOGUEIRA, S.B.

    9

    bidimensional. O padro interno constitudo a partir do pool (mistura) de

    alquotas de quantidades iguais de todas as amostras que sero analisadas e

    aplicado junto com as outras duas amostras marcadas com os outros dois

    fluorforos em cada gel. Isso permite o calculo das razes para a mesma

    protena entre as amostras no mesmo gel bem como entre gis, de forma a

    diminuir a variao experimental e propiciar o aumento da confiana da

    quantificao das protenas entre as amostras dos diferentes gis. Alm disso,

    reduz o nmero de repeties de gis por experimento, uma vez que, no

    mesmo gel esto duas amostras mais o pool (UNLU, MORGAN e MINDEN, 1997).

    A digitalizao e a anlise das imagens so as etapas seguintes, aps a

    separao das protenas nos gis. Primeiramente, a imagem digitalizada e,

    para isso, esto disponveis vrios equipamentos para a aquisio da imagem

    do gel 2-DE, incluindo scanners, densitmetros a laser e cmeras charge-

    coupled device (CCD). Em seguida, as imagens so analisadas utilizando-se

    programas de anlise de imagem (Delta2D, DECODON, BioRad, GE

    Helthcare) para obter informaes sobre a variao das protenas, de

    modo a poder selecionar os spots (protenas) diferencialmente expressos

    quantitativamente e qualitativamente (NEBRICH et al., 2009). A identificao

    dos spots selecionados feita atravs de sua remoo do gel, seguida por

    digesto enzimtica (como a tripsina, por exemplo) e posterior identificao dos

    peptdeos por espectrometria de massas.

    A espectrometria de massas (MS) mede a razo massa/carga (m/z) da

    amostra ionizada a ser analisada e consistem em uma fonte de ons, um

    analisador de massas e um detector que registra o nmero de ons de cada

  • 1. Introduo _________________________________________________________________________

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    NOGUEIRA, S.B.

    10

    valor m/z. A ionizao por electrospray (ESI) e a ionizao/dessoro por

    matriz assistida a laser (MALDI) esto entre as tcnicas mais utilizadas para

    volatilizar e ionizar as protenas ou peptdeos. Na ionizao por electrospray o

    analisador de massas gera a informao do espectro da massa do on do

    fragmento do peptdeo. Os principais analisadores utilizados em protemica

    so time-of-flight (TOF), on trap, quadrupolo e fourier transform on cyclotron -

    FT-MS (AEBERSOLD e MANN, 2003) Cada um desses analisadores possui

    um desempenho diferente e podem ser utilizados separadamente ou em

    conjunto. Com os dados obtidos pela espectrometria de massas existe a

    possibilidade de identificao das protenas atravs da comparao com os

    bancos de dados de sequncias de genes e protenas j disponveis, como

    Genebank e SwissProt (NEBRICH et al., 2009).

    Em plantas, as anlises protemicas foram iniciadas com milho

    (TOUZET et al., 1996) e Arabidopsis thaliana (SAHNOUN et al., 2000). De

    acordo com os trabalhos iniciais, existem algumas dificuldades quanto

    anlise protemica vegetal como a obteno de um extrato protico adequado

    para a anlise. Isto , sem a presena de compostos interferentes como

    pigmentos e carboidratos que afetam a eletroforese bidimensional produzindo

    estrias verticais e/ou horizontais (WANG et al., 2006). Alm disso, a

    identificao de protenas de espcies cujos genomas ainda no foram

    sequenciados tambm dificulta a anlise uma vez que, a identificao e a

    caracterizao das protenas; possvel pela disponibilidade de sequncias

    genmicas e de sequncias expressas (Expressed Sequence Tags - EST)

    (CANOVAS et al., 2004).

  • 1. Introduo _________________________________________________________________________

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    11

    A compreenso de alguns processos como o amadurecimento tem sido

    possvel devido unio de tcnicas complementares a genmica, como a

    protemica. O conhecimento a respeito do amadurecimento pode levar a

    descoberta de pontos de controle desse processo, possibilitando, assim, o

    aprimoramento do manejo ps-colheita atravs da tecnologia ou do uso do

    melhoramento gentico, propiciando aumento da qualidade final e aumento da

    vida de prateleira dos frutos. Existem estudos sobre o amadurecimento de

    frutos utilizando a protemica como ferramenta, como no caso de: tomate

    (ROCCO et al., 2006), uva (DEYTIEUX et al., 2007) e morango (BIANCO et al.,

    2009). Porm, para o mamo papaia ainda no existe nenhum trabalho que

    aborde o amadurecimento utilizando a anlise protemica.

    Apesar de ainda no existir acervo completo com sequncias de genes

    ou protenas do mamoeiro, possvel prosseguir a anlise a partir de buscas

    baseadas na homologia entre protenas de outras espcies vegetais j

    seqenciadas, como Arabidopsis thaliana. Isso possvel, pois, as protenas

    so mais conservadas nas plantas, o que facilita sua identificao em um

    organismo que no teve o seu genoma completamente sequenciado (como no

    caso da Carica papaya L.) pela sua comparao com protenas bem conhecidas,

    como as de Arabidopsis thaliana (LISKA e SHEVCHENKO, 2003). As identificaes

    e caracterizaes de protenas tambm so possveis atravs de sequncias

    expressas j disponveis para o mamo papaia (DEVITT et al., 2006).

  • 1. Introduo _________________________________________________________________________

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    A rpida mudana do estdio de maturao verde para o estdio

    maduro demonstra uma situao em que o estabelecimento e a comparao

    de mapas proticos dos perfis de protenas entre ambos estdios de maturao

    poderia resultar na identificao de protenas associadas com essa transio.

  • 2. Objetivo ___________________________________________________________________________

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    NOGUEIRA, S.B.

    13

    2. OBJETIVO

    Estabelecer mapas proticos da polpa do mamo papaia (Carica papaya

    L.) nos estdios de maturao verde e maduro e, a partir das comparaes

    entre esses mapas, identificar spots de protenas diferentemente expressas.

  • 3. Material e Mtodos ___________________________________________________________________

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    3. MATERIAL E MTODOS

    3.1 Amostras

    Foram utilizadas trs amostragens biolgicas diferentes nos

    experimentos. Deste modo foram utilizados frutos de mamoeiro (Carica papaya

    L. cv. Golden) para duas amostragens caracterizadas neste trabalho

    (amostragens I e II) e frutos previamente caracterizados por Fabi (2007)

    denominada amostragem III. Os frutos das trs amostragens foram cedidos

    pela empresa Agra Pex Comrcio Exterior LTDA (www.agrapapaya.com) cuja

    fazenda est localizada no estado do Esprito Santo, Brasil.

    3.2 Caracterizao das amostras

    A caracterizao das amostragens I e II foi iniciada com um dia aps a

    colheita, com frutos em boas condies fito-sanitrias, pesando entre 200 e

    300 g. Essas frutas foram mantidas em incubadora com temperatura e umidade

    controladas e tiveram o amadurecimento monitorado atravs de medidas

    dirias de CO2, etileno, textura e mudana na cor da casca e da polpa.

    Do total de 200 frutos obtidos, 6 frutos foram diariamente selecionados

    ao acaso para compor as amostragens I e outros 6 frutos para compor a

    amostragem II. Para as medidas de CO2 e etileno, os frutos foram

    acondicionados durante 1 hora em frascos individuais (1,4 L e 1,1 L,

    respectivamente) hermeticamente fechados. Ao trmino desse perodo

  • 3. Material e Mtodos ___________________________________________________________________

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    15

    amostras de ar para medida de etileno (10 mL) e CO2 (1 mL) foram coletadas

    do ambiente interno dos frascos para a anlise. A composio de gases foi

    determinada por cromatografia gasosa (HP-6890) utilizando uma coluna HP-

    Plot Q (30 m, I.D. 0,53 mm), com injetor e detector a 250 C e corrida

    isotrmica a 30 C. Para a anlise de etileno foi utilizado o detector de

    ionizao de chama (FID), enquanto que para a anlise do CO2 foi utilizado o

    detector de condutividade trmica (TCD). As medidas foram feitas 1 hora aps

    a chegada dos frutos ao laboratrio e diariamente a intervalos de 24 horas.

    Para o clculo da medida dos gases, foram levados em considerao o

    volume do frasco de armazenamento, a massa dos frutos e o tempo de

    acmulo dos gases (FABI, 2007).

    Aps as medidas de CO2 e etileno, os frutos foram submetidos anlise

    da firmeza das polpas, de acordo com o mtodo descrito por Fabi (2007). As

    polpas foram perfuradas com uma sonda de penetrao (3 mm de dimetro) de

    um texturmetro, sendo a medida expressa em N.cm2. Para isso, foram retiradas

    da polpa de cada fruto trs sees cilndricas de 1 cm de altura e 3 cm de

    dimetro distando 0,5 cm da casca. Aps essa anlise, as fraes remanescentes

    dos frutos foram imediatamente congeladas em nitrognio lquido e armazenadas

    a -80 C. Os frutos pr-climatricos foram denominados de frutos verdes e os

    frutos climatricos de frutos maduros.

  • 3. Material e Mtodos ___________________________________________________________________

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    3.3 Extrao de protenas

    A extrao de protenas foi feita de acordo com o procedimento

    descrito por Carpentier e colaboradores (2005) com algumas modificaes.

    Aproximadamente 1 g da polpa armazenada -80 C foi macerada e ressuspendida

    com 5 mL de tampo de extrao (50 mM de Tris HCl pH 8,5; 5 mM de

    EDTA, 100 mM de KCL, 1% de DTT, 30% de sacarose e 0,01 L coquetel inibidor

    de protease para tecidos vegetais (Sigma-P9599) e 0,01 L de coquetel inibidor

    fosfatase I e II Sigma-P2850 e P5726, respectivamente) e homogeneizados

    com agitao por 30 segundos. Igual volume de fenol com pH ajustado para

    8,5 foi adicionado aos tubos contendo as amostras. Estas foram ento

    deixadas sob agitao por 15 minutos a 4 C.

    Aps centrifugao (6.000 g) a 4 C por 10 minutos, os sobrenadantes

    foram transferidos para novos tubos. A fase orgnica coletada foi re-extrada

    com tampo de extrao e mantida sob agitao novamente por 15 minutos

    a 4 C. Aps nova centrifugao (6.000 g) a 4 C por 10 minutos, a fase orgnica

    foi coletada e adicionada de 5 volumes de acetato de amnio 100 mM. Aps 12

    horas a -20 C, procedeu-se centrifugao (16.000 g) por 30 minutos a 4 C.

    O precipitado foi submetido a uma lavagem com acetona adicionada de

    DTT (0,2%) durante 15 minutos a -20 C. Aps a secagem a temperatura

    ambiente por 30 minutos o precipitado de protenas resultante da extrao foi

    solubilizado em 1 mL de tampo de extrao (7 M de uria, 2 M de tiouria, 4%

    de CHAPS, 1% de DTT) por agitao constante a temperatura ambiente por

  • 3. Material e Mtodos ___________________________________________________________________

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    17

    1 hora. A concentrao de protenas totais foi determinada utilizando o 2-D

    Quant Kit (GE Healthcare), de acordo com as instrues do fabricante.

    3.4 Eletroforese SDS-PAGE

    Amostras contendo 15 g do extrato de protenas de cada ponto de cada

    amostragem foram desnaturadas separadamente em soluo desnaturante de

    amostra (2% SDS, 5% -mercaptoetanol, 10% glicerol, 0,5 M Tris pH 6,8 e

    0,05% azul de bromofenol) e fervidas por 5 minutos (LAEMMLI, 1970).

    Posteriormente foi feito um gel desnaturante com 12% de acrilamida e a

    soluo contendo as protenas foi aplicada neste gel. E para a corrida foi

    utilizada uma voltagem de 200 V. As bandas separadas foram visualizadas por

    colorao com coomassie brilliant blue (CBB) G-250 (NEUHOFF et al., 1990).

    3.5 Eletroforese bidimensional-2DE

    Alquotas de soluo contendo 1 mg de protena, extradas dos

    diferentes estdios de maturao da amostragem I foram solubilizadas em

    DeStreak Rehydration Solution (GE Healthcare) e 0,5% de IPG buffer. Para a

    eletroforese bidimensional das amostras coradas foram feitas triplicas de gis

    das amostras verde e madura da amostragem I.

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    18

    Para a focalizao isoeltrica tiras de gis com gradiente de pH

    imobilizado (Immobiline DryStrip gels - GE Healthcare) de 24 cm e pH 3-10

    foram reidratadas nessa soluo por 20 horas a temperatura ambiente. A

    focalizao foi realizada no sistema Ettan IPGphor System (GE Healthcare)

    com a seguinte programao: 1 hora a 500 V, 8 horas a 1.000 V, 3 horas a

    8.000 V (gradiente), 4 horas e 45 minutos a 8.000 V.

    Para a separao na segunda dimenso, as tiras de gis foram

    incubadas por 15 minutos em soluo de equilbrio (6 M de uria, 50 mM de

    Tris-HCL pH 8,8, 30% de glicerol, 2% de SDS e 0,002% de azul de bromofenol)

    contendo 1% de DTT e posteriormente incubadas em soluo de equilbrio

    contendo 2,5% de iodoacetamida por mais 15 minutos. A separao das

    protenas na segunda dimenso foi realizada em gel de poliacrilamida a 12,5%

    com 1,5 mm de espessura utilizando-se o sistema Ettan DALT Six (GE Healthcare).

    As protenas foram visualizadas por colorao com coomassie brilliant

    blue (CBB) G-250 (NEUHOFF et al., 1990). Os gis foram enxaguados com

    gua destilada e corados por 12 horas com a soluo de colorao (10% de

    sulfato de amnio, 25 de cido fosfrico e 5% de CBB). Posteriormente os gis

    foram transferidos para uma soluo neutralizadora (0,1 M de Tris-HCL pH 6,5

    ajustado com cido fosfrico) por 3 minutos e em seguida lavados com 50% de

    etanol por 1 minuto. Os gis foram transferidos para a soluo fixadora (20%

    de sulfato de amnio) e posteriormente foram corados novamente com a soluo

    de colorao por mais 12 horas e descorados como descrito anteriormente para

    uma melhor visualizao dos spots. Aps a descolorao, os gis foram

    mantidos em soluo de fixao a 4 C at a aquisio da imagem.

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    Para a eletroforese diferencial em gel (DIGE) foram utilizadas alquotas

    das solues de protenas obtidas na extrao dos dois pontos de maturao,

    verde e maduro, das trs amostragens (Tabela 1) e foram feitas duplicatas de

    cada gel. Antes da marcao as amostras foram purificadas usando 2-D Clean-

    Up Kit, como descrito pelo fabricante para a remoo de contaminantes que

    pudessem comprometer a marcao. Aps a purificao as amostras foram

    solubilizadas em tampo de reidratao para DIGE (7 M de uria, 2 M de

    tiouria, 4% de CHAPS, 10 mM de Tris pH 8,0).

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    Tabela 1. Esquema de marcao com as cianidinas (Cy2, Cy3 e Cy5) dos dois pontos de maturao para cada amostragem.

    Gel 1 Gel 2 Gel 3 Gel 4 Gel 5 Gel 6

    Padro interno (pool) Cy2 Cy2 Cy2 Cy2 Cy2 Cy2

    Verde (V) Cy3 V1 Cy3 V2 Cy3 V3 Cy3 V1 Cy3 V2 Cy3 V3

    Maduro (M) Cy5 M1 Cy5 M2 Cy5 M3 Cy5 M1 Cy5 M2 Cy5 M3

    V1,M1: amostragem I

    V2,M2: amostragem II

    V3,M3: amostragem III

    pool: V1+M1+V2+M2+V3+M3 Gis 4, 5 e 6 so duplicatas dos gis 1. 2 e 3

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    21

    Os extratos de protenas foram marcados com o sistema de marcao

    fluorescente mnima (Amersham CyDye DIGE Fluors minimal dyes for Ettan

    DIGE, da GE Healthcare) de acordo com as instrues do fabricante. Os gis

    que continham as amostras de frutos verdes das trs amostragens que foram

    marcadas com o corante Cy3, as maduras que foram marcadas com o corante

    Cy5 e o pool marcado com o corante Cy2. Assim, 50 g de extrato de protena

    de cada amostra foram marcadas com 400 pmol de corante fluorescente e

    incubadas no escuro e no gelo por 30 minutos. A reao foi interrompida pela

    adio de 1L de lisina 10 mM e incubada por 10 minutos no escuro e em gelo.

    As amostras de protenas marcadas com as cianidinas foram diludas em

    DeStreak Rehydration Solution (GE Healthcare) e 0,5% de IPG buffer.

    Tiras de gis com gradiente de pH imobilizado (Immobiline DryStrip gels -

    GE Healthcare) de 24 cm e pH 4-7 foram reidratadas nessa soluo por 20

    horas a temperatura ambiente. A focalizao foi realizada com o sistema Ettan

    IPGphor System (GE Healthcare) com programao de: 1 hora a 500 V, 7

    horas a 1.000 V, 3 horas a 8.000 V (gradiente), 5 horas e 36 minutos a 8.000 V.

    Para a separao na segunda dimenso, as tiras de gis foram

    incubadas por 15 minutos em soluo de equilbrio (6 M de uria, 50 mM de

    Tris-HCl pH 8,8, 30% de glicerol, 2% de SDS e 0,002% de azul de bromofenol)

    adicionada de 1% de DTT e posteriormente incubadas em soluo de equilbrio

    adicionada de 2,5% de iodoacetamida por mais 15 minutos. A separao das

    protenas na segunda dimenso foi realizada em gel de poliacrilamida a 12,5%

    com 1,5 mm de espessura utilizando-se o sistema Ettan DALT Six (GE

    Healthcare) em placas de vidro de baixa fluorescncia.

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    22

    3.6 Anlise das imagens dos gis corados com coomassie brilliant blue

    As imagens das triplicatas de gis corados com coomassie brilliant blue

    foram digitalizadas no scanner LabScan III, verso 6.0 (GE Healthcare)

    utilizando a resoluo de 200 dpi e filtro transparente e arquivadas em formato

    tagged image file format (TIFF) para posterior anlise com o programa

    PDQuest 8.0.1 (Bio-Rad). A triplicata de gis das amostras de frutos, verde e

    maduro, foi ento analisada usando o programa PDQuest (Bio-Rad).

    Primeiramente as imagens foram ajustadas para estarem do mesmo

    tamanho e formato e assim poderem ser comparadas e em seguida foram

    filtradas para remover qualquer tipo de rudo (sinal de fundo), porm sem afetar

    os spots. Em seguida os spots de protenas de cada imagem foram detectados

    automaticamente usando o Spot Detection Parameter Wizard aps os

    parmetros anteriores de formatao ter sido ajustados. Os spots foram

    editados manualmente adicionando ou excluindo aqueles spots que repetiam

    ou eram ausentes em mais de um gel. Os gis com separao de amostras

    obtidas de frutas de um mesmo estdio de maturao foram comparados entre

    si e agrupados a fim de atribuir uma identidade comum para os mesmos spots

    derivados de imagens diferentes. A normalizao foi feita com o mtodo de

    densidade total na imagem do gel, em que a intensidade em pixels de cada

    spot de um gel dividida pelo valor de intensidade total de todos os pixels da

    imagem, e os resultados foram expressos em ppm (partes por milho).

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    23

    Os volumes dos spots normalizados das triplicatas de gis dos dois

    estgios de maturao foram comparados, e analisados de acordo com o teste-

    T de Student para verificar se eles foram significativamente diferentes (p < 0,05). Os

    spots foram analisados qualitativamente e quantitativamente. A anlise qualitativa

    correspondeu deteco de spots presentes em apenas um grupo, mas no

    no outro, empregando como critrio definidor da presena de um spot no gel o

    valor de intensidade acima de 1,5 vezes o valor de fundo observado no gel. A

    anlise quantitativa correspondeu aos spots que apresentaram aumento, ou

    reduo, de 50% da intensidade tendo com referncia o valor dado pela

    amostra verde.

    3.7 Anlise das imagens dos gis de protenas marcadas por fluorescncia-DIGE

    As imagens dos seis gis DIGE foram digitalizadas utilizando-se o

    equipamento VersaDoc MP 4000 (Bio-Rad) que emprega uma cmera charge

    coupled device (CCD) para a captao da imagem dos gis. Primeiramente

    padronizou-se o ajuste do zoom, do diafragma e do foco para o tamanho e

    distncia do gel para melhor captura da imagem e visualizao dos spots.

    Posteriormente o mtodo de captura de imagem apropriado para cada

    cianidina foi selecionado, de modo que para a cianidina Cy2 foi utilizado como

    fonte de excitao: diodo emissor de luz (LED) azul e filtro de emisso 530BP,

    para a cianidina Cy3 LED verde e filtro de emisso 605BP e para a cianidina

    Cy5 LED vermelho com filtro de emisso 695BP. Cada gel foi colocado dentro

  • 3. Material e Mtodos ___________________________________________________________________

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    NOGUEIRA, S.B.

    24

    do compartimento da cmera e exposto luz especfica por 30 segundos para

    a captura de cada uma das trs imagens geradas a partir da florescncia das

    trs cianidinas.

    As imagens foram ajustadas para estarem com o mesmo tamanho e

    formato e assim poderem ser comparadas utilizando-se o programa PDQuest.

    verso 8.0. Posteriormente foram filtradas para remover qualquer tipo de rudo

    (sinal de fundo), porm sem afetar a qualidade dos spots. Os spots foram

    detectados, editados manualmente, o volume do spot quantificado e a

    normalizao dos volumes dos spots foram baseadas no padro interno

    marcado com Cy2.

    As protenas diferencialmente expressas foram selecionadas pela

    anlise com teste-T de Student (p < 0,05). O programa permitiu identificar

    protenas que tiveram variao quantitativa, ou seja, aquelas correspondentes

    a spots que aumentaram ou diminuram de intensidade entre os grupos

    (triplicatas de gis de amostras de frutos verde e maduro) baseados em limites

    prselecionados, ou seja, spots que apresentaram aumento, ou reduo, de

    50% da intensidade do valor de referncia dado pela amostra verde. Tambm

    foi realizada a anlise qualitativa que faz deteco de spots presentes em

    apenas um grupo, mas no no outro, empregando como critrio definidor da

    presena de um spot no gel, o valor de intensidade acima de 1,5 vezes o valor

    de fundo observado no gel.

  • 3. Material e Mtodos ___________________________________________________________________

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    NOGUEIRA, S.B.

    25

    3.8 Digesto de protenas

    Para a retirada desses spots do gel, foi feito um gel bidimensional

    preparativo contendo 750 mg de protenas e a metodologia utilizada para o seu

    preparo foi de acordo com a eletroforese bidimensional descrita em mtodos,

    conforme item 3.5.

    Os spots foram isolados de cada uma das repeties do gel e aps

    serem fragmentados com o auxlio do bisturi, foram imersos em soluo de

    descolorao (50% de acetonitrila e 25 mM de bicarbonato de amnio) at total

    remoo do corante. Aps desidratao com acetonitrila 100%, os fragmentos

    de gel foram reidratados e as protenas foram reduzidas em 50 mM de

    bicarbonato de amnio e 20 mM de DTT a 56 C por 40 minutos.

    Posteriormente, as protenas foram alquiladas com 55 mM de

    iodoacetamida em 50 mM de bicarbonato de amnio por 30 minutos ao abrigo

    da luz. Os fragmentos dos gis foram desidratados com acetonitrila 100%

    seguida de reidratao com 25 mM de bicarbonato de amnio contendo 10 L

    de tripsina (Promega) por 14 horas a 37 C. A ao da tripsina foi interrompida

    pela adio de soluo bloqueadora (50% acetonitrila e 5% de cido frmico) e

    os peptdeos obtidos foram eludos por duas extraes com mistura de 50% de

    acetonitrila, 1% de cido frmico, seguida de extrao com mistura de 60% de

    metanol, 1% de cido frmico e finalmente acetonitrila pura.

  • 3. Material e Mtodos ___________________________________________________________________

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    NOGUEIRA, S.B.

    26

    Em todas as etapas de eluio os fragmentos de gel foram mantidos em

    banho de ultra-som por 20 minutos a 40 C. Todas as fraes de eluio resultantes

    de cada spot foram combinadas no mesmo tubo e submetidas secagem em

    concentrador a vcuo sob temperatura ambiente (CELEDON et al., 2007).

    3.9 LC-MS/MS

    Os peptdeos resultantes da digesto foram solubilizados em 1% de

    cido frmico e transferidos para tubos especficos para realizao da

    espectrometria de massas. O sequenciamento das protenas foi conduzido

    em plataforma cromatografia lquida associada a espectrometria de massa

    (LC-MS/MS) com fonte de ionizaco por ESI e analisador de massas Q-TOF

    Ultima API (Waters, Micromass), acoplado a um sistema online de HPLC

    capilar CaplC XE Pump (Waters).

    Os espectros MS/MS gerados pelo sequenciamento dos peptdeos

    pelo programa ProteinLynx v2.1 (Waters) de cada amostra foram

    processados posteriormente pelo programa MASCOT MS/MS Ion Search

    (www.matrixscience.com) que comparou as seqncias obtidas com os dados

    depositados nos bancos de dados do SwissProt e NCBI. As modificaes fixam

    e varivel, carbamidometil (C), oxidao (M), respectivamente, foram

    selecionadas para a anlise. A identificao dos espectros e possveis

    similaridades com protenas j seqenciadas e depositadas em bancos de

    dados foi feita automaticamente.

  • 4. Resultados e Discusso_______________________________________________________________

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    27

    4. RESULTADOS E DISCUSSO

    4.1 Amostragem

    As medidas de etileno, CO2 e textura para as amostragens I e II

    iniciaram-se com um dia aps a colheita (DPC) e encerram-se no sexto dia

    ps-colheita enquanto que a anlise da amostragem III iniciou-se no segundo

    dia aps a colheita e terminou no dcimo dia. Os frutos das trs amostragens

    (I, II e III) apresentaram mudanas semelhantes, na sntese de etileno, no

    aumento da taxa respiratria e na diminuio da firmeza da polpa (Figura 1 a,

    b, c, respectivamente). Essas modificaes correspondem mudana

    caracterstica e esperada de frutos climatricos.

    Os frutos apresentaram mudanas nas cores da casca e da polpa, como

    pode ser observado na Figura 2 a, b, c, sendo que do quarto dia em diante a

    casca j estava totalmente amarela para as amostragens I e II. Para as

    amostragens I e II as anlises foram encerradas no sexto dia ps-colheita, pois

    aps esse perodo os frutos apresentaram sinais evidentes de senescncia ou

    podrido. As mudanas observadas na amostragem III (FABI, 2007) foram

    similares s observadas nas amostragens I e II, sendo que o aumento da taxa

    respiratria, o pico de etileno e a diminuio da firmeza da polpa ocorreram no

    quarto dia aps a colheita.

    As trs amostragens apresentam as transformaes caractersticas do

    amadurecimento, com pico de etileno, CO2 e diminuio da textura semelhantes,

    assim como as mudanas de cor da casca do fruto.

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    Figura 1. Caracterizao fisiolgica de trs distintas amostragens do mamo papaia. As amostragens I (linhas pretas) e II (linhas vermelhas) e III (linhas azuis) tiveram o amadurecimento acompanhado pelos seguintes parmetros: A) quantidade de CO2 produzido pela respirao dos frutos, B) etileno produzido pelos frutos, C) firmeza da polpa. As barras verticais representam o erro padro das mdias n=6 amostragens I e II, n= 9 amostragem III).

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    Figura 2. Caracterizao fisiolgica de trs amostragens distintas do mamo papaia. Imagens dos frutos mostrando as mudanas tpicas na cor da casca e da polpa para as amostragens I (a), II (b) e III (c) (DPC dias ps-colheita).

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    Uma das poucas diferenas notadas foi que nas amostragens I e II o

    perodo de amadurecimento foi mais breve do que na amostragem III. Esses

    resultados mostram que apesar de serem amostragens de colheitas diferentes

    as trs amostragens apresentam as mesmas caractersticas durante o

    amadurecimento, seja pelo aumento da taxa respiratria seja pela diminuio

    da textura, demonstrando assim que esto adequadas para o trabalho uma vez

    que o objetivo de obter replicatas biolgicas de frutas representativas dos

    estdios pr-climatricos e climatrico para as anlises posteriores foi

    alcanado.

    Com base nas mudanas fisiolgicas observadas, os frutos das

    amostragens I e II escolhidos para as anlises dos perfis de protenas foram

    aqueles com 1 dia aps a colheita (DPC) e com 3 DPC, representativos de

    frutas pr-climatricas e climatricas, doravante verdes e maduras. J para a

    amostragem III foram selecionados os frutos amostrados no 2 DPC (verdes) e

    4 DPC (maduras), correspondentes aos mesmos estdios de maturao das

    frutas verdes e maduras das amostragens I e II.

    4.2 Extrao de protenas

    Embora muitos protocolos tenham sido descritos para extrao de

    protenas em tecidos vegetais, no existe na literatura um mtodo de extrao

    de protenas especfico para a polpa do mamo. De acordo com Wang et al.

    (2006) a extrao fenlica produz uma amostra de alta qualidade para tecidos

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    recalcitrantes, como o mamo papaia, uma vez que os compostos

    interferentes, que comumente provocam manchas e estrias na eletroforese

    bidimensional so removidos ao ficarem retidos na fase aquosa.

    As protenas foram extradas das frutas das trs amostragens e dos dois

    estdios de maturao utilizando-se a extrao fenlica e a precipitao das

    protenas com acetato de amnio (CARPENTIER et al., 2005). Os extratos

    proticos obtidos foram quantificados e apresentaram um rendimento total de

    protenas de 1 mg de protena por grama de polpa, que semelhante aos valores

    encontrados no experimento utilizando meristema de banana (CARPENTIER et al.,

    2005). Aps a quantificao das protenas, procedeu-se a SDS-PAGE dos dois

    pontos de maturao da amostragem I e II para verificar a qualidade do extrato.

    Foram aplicados no gel 15 g de protenas de cada extrato com o intuito

    de verificar a qualidade dos mesmos (Figura 3). A extrao mostrou-se

    eficiente, pois as amostras no apresentaram sinais de contaminao de

    impurezas como carboidratos, pigmentos, compostos fenlicos, ou degradao,

    pois as bandas estavam bem definidas e sem arraste. O fato de aplicar

    quantidades iguais e os extratos apresentarem aspecto semelhante tem

    importncia, pois quanto mais semelhante a amostras do mesmo estdio mais

    fcil de encontrar diferenas entre os estdios diferentes. A anlise SDS-PAGE

    sugere que as amostras dos diferentes estdios so semelhantes, porm, j

    perceptvel a diferena de expresso de algumas bandas.

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    Figura 3. Eletroforese sob condies desnaturantes (SDS-PAGE) de protenas extradas da polpa do mamo papaia. As letras A, B e C indicam os extratos de amostras pr-climatricas obtidas das amostragens I, II e III, respectivamente, enquanto as letras D, E, e F indicam os extratos de amostras climatricas das amostragens I, II e III, respectivamente, separadas em gel de poliacrilamida 12% (SDS-PAGE). As protenas foram coradas utilizando-se coomassie brilliant blue. Os nmeros esquerda indicam o tamanho das bandas do padro de peso molecular, em KDa.

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    4.3 Eletroforese bidimensional (gis corados com coomassie brilliant blue)

    Aps a obteno de um extrato protico que se mostrou adequado para a

    SDS-PAGE, o mesmo extrato foi utilizado para separao por eletroforese

    bidimensional com o objetivo de visualizar a distribuio das protenas ao longo

    do gel quanto ao ponto isoeltrico e massa molecular, bem como se a

    resoluo dos spots estaria adequada, isto , sem a presena de estrias

    resultantes de baixa solubilidade das protenas durante a focalizao

    isoeltrica, o que prejudicaria a deteco e quantificao de spots.

    Inicialmente, as protenas dos dois estdios de maturao da amostragem

    I foram primeiramente separadas em tiras de gis de gradiente de pH

    imobilizado (tiras de gis de 7 cm de comprimento) com intervalo de pH 3-10, a

    fim de se testar a eletroforese bidimensional para os extratos de protenas dos

    dois estdios de maturao. Na Figura 4 as amostras dos dois estdios de

    maturao apresentaram-se distribudas predominantemente na faixa de pH 4-7

    com a presena de poucos spots nos extremos da faixa de pH utilizada.

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    Figura 4. Eletroforese bidimensional de protenas da polpa do mamo papaia verde (a) e maduro (b). As protenas foram separadas em um gradiente de pH 3-10 na primeira dimenso e em SDS-PAGE 12% na segunda dimenso. As protenas foram coradas utilizando a colorao com coomassie brilliant blue. Os nmeros a esquerda indicam o tamanho da banda do padro de peso molecular em KDa.

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    Os gis no apresentaram estrias verticais mostrando que o extrato estava

    livre de sal e outros agregados proticos (GORG et al., 1999) apresentando

    algumas estrias horizontais, possivelmente devido insuficiente solubilizao de

    algumas protenas mais abundantes ou com maior massa molecular, mas que

    no comprometeriam a qualidade geral da anlise.

    O mtodo de colorao utilizando coomassie brilliant blue foi

    padronizado, uma vez que os gis apresentavam muitas diferenas de

    intensidade da colorao, bem como manchas e spots mais corados que outros

    na mesma triplicata de corrida o que interfere na anlise das imagens. Foi

    observada uma certa inconsistncia na colorao, o que, de fato, uma das

    desvantagens da colorao como CBB. Devido a isso, foi feita uma otimizao

    da colorao, para aumentar a sensibilidade e no ter diferenas de intensidade

    dos mesmos spots por causa da variao da colorao de um gel para o outro.

    Ficou estabelecida a colorao com coomassie brilliant blue

    (WESTERMEIER, 2006) na qual os gis foram corados por 12 horas e

    descorados como descrito no item 3.5, sob agitao constante. Aps a

    descolorao os gis foram submetidos a um novo ciclo de colorao por 12

    horas, o qual teve por objetivo aumentar a instensidade dos spots visveis em

    comparao com a primeira colorao, alm de possibilitar a visualizao de

    spots que no apareciam com apenas um ciclo de colorao. A adio desse

    novo ciclo aumentou a sensibilidade uma vez que h a maior deposio de

    coomassie brillant blue e maior fixao. A agitao constante fez com que os

    gis no ficassem manchados devido a precipitao do CBB. Somente aps o

    segundo ciclo de colorao os gis foram ento digitalizados. Com essa

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    padronizao os spots apresentaram intensidades similares entre as triplicatas,

    houve aumento no nmero de spots visveis e apresentou uma melhor

    reprodutibilidade, pelo fato da colorao ter sido aplicada por tempo suficiente,

    ou repetidamente e sob agitao, especialmente para gis com tamanho maior

    (24 cm, por exemplo).

    Aps terem sido encontradas as condies que propiciavam a obteno

    de gis de boa qualidade em escala de separao reduzida (tiras de separao

    isoeltrica com 7 cm de comprimento), foram realizadas triplicatas de eletroforese

    bidimensional a partir da separao em tiras de 24 cm de comprimento com

    pH 3-10 para cada estdio de maturao. Essa faixa de pH mais ampla foi

    escolhida como avaliao preliminar para poder visualizar a distribuio dos

    spots no gel. A escolha da faixa de pH um dos fatores que afetam a

    visualizao das mudanas de expresso de protenas (GORG et al., 1999), e

    apesar de uma faixa muito ampla poder dificultar uma maior resoluo de spots

    muito prximos, resultando em sobreposio de protenas (overlapping) o uso

    de um gradiente de pH mais abrangente oferece uma viso geral do estado do

    mapa protico.

    A triplicata de gis dos dois grupos de amostras, verde e maduro, foi

    ento analisada usando o programa PDQuest. Primeiramente as imagens

    foram ajustadas para estarem do mesmo tamanho e formato e assim poderem

    ser comparadas e filtradas para remover qualquer tipo de rudo (sinal de

    fundo), porm sem afetar os spots. Em seguida os spots de protenas de cada

    imagem foram detectados usando o Spot Detection Parameter Wizard, sendo

    necessrio ajustar os seguintes parmetros: tamanho do menor spot,

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    intensidade do spot mais fracamente corado e do maior local de maior

    agrupamento de protenas com ntido overlapping.

    Aps a deteco dos spots a sensibilidade tambm foi ajustada, pois

    muitos spots menos intensos no foram detectados automaticamente, porm,

    isso tambm levou ao aumento de falsos positivos, uma vez que o parmetro

    ficou mais sensvel aos rudos da imagem. Deste modo foi feita a opo de

    diminuir a sensibilidade e adicionar manualmente os spots visveis, porm que

    no foram detectados automaticamente pelo programa. O critrio utilizado para

    a edio manual foi que, caso houvesse repetio de spot em pelo menos dois

    gis da triplicata, este seria adicionado no terceiro gel caso no estivesse

    presente. De maneira inversa, se um spot estivesse presente em apenas um

    gel ele no seria considerado como presente na amostra.

    A etapa seguinte foi a de estabelecer correspondncia entre os mesmos

    spots identificados nos diferentes gis (matching) e para isso foi utilizada

    primeiramente a ferramenta automtica do programa e, posteriormente, foi feita

    a edio manual utilizando os mesmo critrios citados acima. Todas essas

    edies foram feitas utilizando como referncia o gel master, que consiste

    numa imagem virtual que compreende todos os spots presentes em todos os

    gis da anlise. Todas as comparaes entre spots e entre os gis, assim como a

    edio e o agrupamento de spots, foram coordenadas atravs do gel master.

    De modo a eliminar as interferncias das variaes no-relacionadas

    com a expresso diferencial das protenas as quantidades de spots de todos os

    gis foram normalizadas. A normalizao foi feita com o mtodo de densidade

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    total na imagem do gel, em que a intensidade em pixels de cada spot de um

    gel dividida pelo valor de intensidade total de todos os pixels da imagem, e os

    resultados foram expressos em partes por milho (ppm). O programa gera uma

    tabela final com densidade tica mdia para dados quantitativos ou qualitativos

    de cada spot de cada grupo de amostras. A partir disso, foi possvel identificar

    as protenas que tiveram variao na anlise qualitativa que corresponde

    deteco de spots presentes (Tabela 2) em apenas um grupo, mas no no

    outro. Na Tabela 2 a coluna spot corresponde ao nmero de identificao do

    spot, e as colunas denominadas verde e maduro indicam a intensidade tica

    mdia de cada spot para cada grupo de amostras. A coluna razo indica

    quantas vezes a intensidade do spot aumentou ou diminuiu com o

    amadurecimento em relao ao valor observado no grupo de amostras verde.

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    Tabela 2. Anlise qualitativa da presena de spots de protenas nos extratos dos grupos de amostras representativas do mamo papaia nos estdios de maturao verde e maduro. Os valores correspondem s mdias das densidades ticas encontradas para a triplicata de gis e a razo entre esses valores.

    Spot Verde Maduro Razo Spot Verde Maduro Razo

    13 2,5 403,7 158,7 6803 2,5 109,7 43,13 110 2,5 366,1 143,92 6808 2,5 48,5 19,08 208 2,5 1039,3 408,63 6906 2,5 229,5 90,22 2305 2,5 325,8 128,08 6907 2,5 112,2 44,12 2504 2,5 401,8 157,98 7003 2,5 470,9 185,14 2608 2,5 552,7 217,32 7402 2,5 1205,4 473,92 3206 2,5 1876,2 737,66 7405 2,5 324,9 127,73 3303 2,5 702,2 276,08 7407 2,5 3322,7 1306,37 3503 2,5 824,0 323,97 7602 2,5 527,6 207,42 3505 2,5 738,6 290,39 7612 1246,1 3,1 0,00 3511 1308,3 3,1 0,00 7709 287,0 3,1 0,01 3704 2,5 236,0 92,77 7714 2,5 45,9 18,03 3705 2,5 282,8 111,17 7903 2,5 196,2 77,15 3709 2,5 587,8 231,12 7904 2,5 116,3 45,71 4306 328,5 3,1 0,01 8206 1904,7 3,1 0,00 4502 2,5 477,9 187,88 8803 2,5 365,3 143,61 4511 155,9 3,1 0,02 4606 1011,0 3,1 0,00 4607 977,6 3,1 0,00 4709 2,5 230,0 90,44 4804 2,5 351,0 138,01 4805 2,5 198,3 77,96 4806 212,6 3,1 0,01 4807 2,5 606,7 238,54 5301 2,5 562,8 221,27 5303 2,5 155,5 61,12 5404 317,8 639,7 2,01 5702 2,5 249,0 97,91 5706 2,5 85,9 33,79 5801 2,5 177,5 69,79 5804 2,5 96,7 38,02 5807 2,5 137,8 54,17 5809 2,5 126,4 49,71 6403 2,5 689,0 270,88 6601 2,5 338,7 133,16 6708 2,5 79,2 31,15 6801 2,5 170,2 66,91

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    40

    Para as anlises qualitativas o programa atribuiu um valor mnimo de

    intensidade para os spots ausentes a fim de efetuar os clculos posteriores da

    anlise estatstica (atribuiu 2,5 para ausncia de spots nas amostras verdes e

    3,1 para ausncia em amostras maduras). A anlise quantitativa revelou os

    spots de protenas presentes em ambos os estdios, mas que apresentaram

    aumento ou diminuio corresponde aos spots que aumentaram ou diminuram

    de intensidade, e os resultados podem ser vistos na Tabela 3. Na coluna

    razo est indicado quantas vezes a intensidade do spot aumentou ou

    diminuiu em relao ao valor observado no grupo verde, tomado como

    referncia na anlise quantitativa. Estas variaes foram validadas atravs do

    teste T de Student, com nvel de significncia de 95% e somente os spots que

    passaram nesse teste foram considerados na composio da lista final de

    spots de protenas diferencialmente expressas.

    Dos 378 spots detectados com aparente diferena de expresso entre

    os estdios de amadurecimento, apenas 74 spots foram considerados

    estatisticamente significativos. Dentre esses, nove spots foram considerados

    presentes apenas nas frutas verdes e 43 spots foram considerados presentes

    apenas nas frutas maduras, mostrando que, aparentemente, existem mais

    protenas associadas exclusivamente com o estdio de maturao maduro, o

    que reflete o aumento de sntese protica que acompanha o amadurecimento.

    Para a anlise quantitativa, o teste T de Student confirmou variao significativa

    para 22 protenas, sendo que a maior parte das alteraes correspondeu ao

    aumento da intensidade dos spots em frutas maduras em relao s verdes.

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    41

    Tabela 3. Anlise quantitativa da presena de spots de protenas nos extratos dos grupos de amostras representativas do mamo papaia nos estdios de maturao verde e maduro. Os valores correspondem s mdias das densidades ticas encontradas para a triplicata de gis e a razo entre esses valores.

    Spot Verde Maduro Razo

    9 187,9 1294,2 6,89 1003 150,0 619,4 4,13 2303 1271,8 3652,0 2,87 2601 5306,7 2478,0 0,47 2602 1752,5 689,6 0,39 3501 2918,4 1219,7 0,42 3604 257,5 111,5 0,43 4504 955,8 255,1 0,27 4508 985,6 2787,1 2,83 4509 461,7 973,9 2,11 4604 2514,5 656,1 0,26 4710 583,1 233,4 0,40 5502 1042,0 2441,2 2,34 5808 329,8 161,5 0,49 5901 479,8 238,4 0,50 6406 534,3 1259,4 2,36 7408 663,6 2744,9 4,14 7609 475,5 332,2 0,38 7610 598,9 76,5 0,13 7804 6366,2 2488,3 0,39 7906 74,4 282,3 3,79 8310 200,1 614,0 3,07

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    Os resultados obtidos com os gis corados com coomassie brilliant blue

    foram preliminares, pois foi utilizada apenas uma amostragem biolgica, a

    amostragem III. Isso resultou em um baixo poder de anlise, uma vez que

    mais fcil perceber mudanas quando existem mais modelos de comparao

    do que quando h apenas um (HUNT et al., 2005). Por isso existe uma grande

    importncia de usar maior nmero de replicatas biolgicas. Por exemplo, se a

    anlise fosse feita para as trs replicatas teria de ser feito um nmero muito

    grande de gis, alm disso, a colorao com coomassie brilliant blue e a

    separao so etapas que introduzem grande variabilidade na anlise. Apesar

    disso, essa caracterizao das protenas na faixa de pH 3-10 confirma a

    observao inicial de que a maior parte das protenas extradas parecem estar

    concentradas na faixa de pH 4-7, para os dois estdios de maturao. Assim,

    para as anlises seguintes decidiu-se pelo uso da faixa de pH 4-7 na

    separao dos extratos das trs amostragens.

    4.4 Anlise DIGE

    O sistema de anlise DIGE, eletroforese diferencial em gel, foi utilizado a

    por possibilitar maior sensibilidade de deteco de protenas e menor variao

    tcnica ou experimental devido s diferenas nas condies da corrida da

    eletroforese. Alm disso, por permitir a incorporao de um padro interno

    permite a normalizao individualizada de cada spot, diminuindo assim o

    nmero de corridas necessrias e aumentando a qualidade dos dados para a

    anlise estatstica. Valcu e Valcu (2007) descreveram que as fontes de

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    variabilidade que influenciam os resultados 2-DE so principalmente:

    variabilidade biolgica (como variedade gentica e fatores ambientais) e

    variabilidade tcnicas (pode resultar de qualquer fase do experimento desde a

    coleta e o armazenamento da amostra, at a anlise das imagens e a variao

    do manipulador a qualidade dos reagentes). A fim de detectar apenas as

    protenas com variao de expresso durante o amadurecimento do mamo

    papaia e no variaes tcnicas e biolgicas, o sistema DIGE foi utilizado para

    a comparao dos extratos proticos dos dois estdios de maturao das trs

    amostragens. As trs amostragens foram utilizadas para que o experimento

    tivesse maior confiabilidade a fim de diminuir a variao biolgica nos

    experimentos posteriores e aumentar a confiabilidade da anlise. Tambm

    foram feitas duplicatas de gis para cada experimento, a fim de diminuir a

    variabilidade tcnica.

    Inicialmente as protenas de todas as amostras foram marcadas com o

    fluorforo Cy5 e procedeu-se a eletroforese unidimensional para verificar a

    qualidade da marcao que mostrou que o extrato estava adequado para a

    marcao DIGE. A etapa seguinte foi a preparao dos seis strips de 24 cm de

    comprimento e pH 4-7, sendo que em cada gel foram aplicadas trs amostras:

    os gis com as amostras verdes das trs amostragens que foram marcadas

    com o corante Cy3, as maduras que foram marcadas com o corante Cy5 e o

    pool marcado com o corante Cy2. Neste experimento trs amostras biolgicas

    diferentes (amostragem I, II e III) para os dois pontos de maturao (verde e

    maduro) foram comparadas e analisadas (Figura 5).

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    .

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    Aps obter a mdia da intensidade dos spots foi necessria a

    normalizao a fim de compensar as variaes tcnicas como quantidades

    diferentes de protenas aplicadas nos gis e as possveis diferenas entre a

    marcao das amostras. Dessa maneira, os volumes dos spots de todos os

    gis foram normalizados para remover as variaes no-relacionadas com a

    expresso diferencial das protenas. A normalizao com base no padro

    interno (imagem com spots marcados com Cy2) foi feita para cada valor de

    intensidade de cada spot marcado com as cianidinas Cy3 e Cy5 e os

    resultados foram expressos em ppm. As variaes entre os spots obtidas pelas

    anlises quantitativas e qualitativas, assim com descrito para as anlises dos

    gis corados com coomassie brillant blue, foram validadas atravs do teste T

    de Student, com nvel de significncia de 95% e somente os spots que

    passaram nesse teste foram considerados na composio da lista final de

    spots de protenas diferencialmente expressas.

    Dos 426 spots validados, apenas 37 spots foram considerados

    diferencialmente expressos com p < 0,05. Desses 37 spots, 10 foram

    identificados como spots de protenas presentes apenas na amostra do mamo

    maduro (Tabela 4), mostrando que existem mais protenas presentes apenas

    no estdio de maturao maduro que no verde, o que reflete o aumento de

    sntese protica que acompanha o amadurecimento.

    Os outros vinte e sete spots foram indicados pela anlise quantitativa

    (Tabela 5) compreendendo as protenas com aumento de expresso de pelo

    menos 1,5 vezes, no estdio maduro.

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    Tabela 4. Anlise qualitativa da presena de spots de protenas nos extratos do