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Validation des méthodes d'analyse
Journées Qualité et Chimie 2010 Une démarche qualité au service de la chimie
Autrans - 14 octobre 2010
Marie-Dominique Blanchin Laboratoire de Chimie Analytique
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Référentiels
ISO 5725 : 1994 - Exactitude et fidélité d'une méthode de mesure
ISO 17025 : 2005 - Prescriptions générales concernant la compétence des laboratoires d'essai et d'étalonnage Compétences management de la qualité Compétences techniques
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Référentiels/Industrie Pharmaceutique
ICH : International Conférence on Harmonisation Q2(R1) 2005 : validation of analytical procedures
test and methodology Pharmacopée américaine, USP33-NF28
<1225> Validation of compendial methods FDA guidance for industry.
Analytical procedures and method validation Eurachem
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ICH /Définitions
Méthode d'analyse Document écrit "Moyen de réaliser l'analyse" "Description détaillée des différentes opérations
nécessaires pour effectuer l'analyse de la substance à examiner"
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ICH / Définitions
Validation
"Le but de la validation d'une méthode d'analyse est de démontrer qu'elle correspond à l'usage pour lequel elle est prévue"
Ensemble des opérations nécessaires pour prouver que le protocole est suffisamment exacte et fiable pour avoir confiance dans les résultats fournis et ceci pour un usage déterminé
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Définitions
Validation
Application déterminée Niveau de la validation
Fonction de l'application Objectif clairement déterminé
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Critères de validation
Spécificité Linéarité Exactitude Fidélité Intervalle d'application Limite de détection Limite de quantification Robustesse Stabilité des solutions
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Spécificité Specificity
"Capacité de la méthode de permettre une évaluation non équivoque de l'analyte en présence de composants qui sont susceptibles d'être présents"
Capacité de faire la discrimination analyte /substances interférentes
Garantir que le résultat de l'analyse analyte Absence d'interférences
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Spécificité Specificity
Impuretés Ajouts dosés impuretés disponibles sur composé ou
formulation Comparaison avec résultats obtenus sur des
échantillons contenant des impuretés ou des produits dégradation (lumière, t°, humidité, hydrolyse acide ou alcaline, oxydation)
Profil impuretés
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Spécificité Specificity Si méthode CLHP, vérifiée par
Injection placebo analytique = matrice (dégradé, non dégradé) composés interférents potentiels, produits de décomposition,
intermédiaires, précurseurs de synthèse échantillons dégradés (lumière, t°, acide, alcalin, oxydant)
Observation des chromatogrammes obtenus Vérification homogénéité des pics
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Linéarité Linearity
"Capacité dans un intervalle donné d'obtenir des résultats de dosage directement proportionnels à la concentration ou à la quantité d'analyte dans l'échantillon"
Relation linéaire signal - concentration
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Linéarité Linearity
Exemple méthode CLHP, vérifiée par injection de
solutions étalons d’analyte : linéarité de la gamme d'étalonnage
Solutions échantillons reconstitués concentrations d'analyte différentes : linéarité de la méthode
n ≥ 5 concentrations n ≥ 3 répétitions de chaque niveau
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Linéarité Linearity
Intervalle de linéarité fonction de Analyte (impureté, principe actif, conservateur,…) Application (formulation, test de dissolution,…)
Vérifiée : examen de la courbe, analyse de variance Exprimée : Équation de la droite avec intervalle de
confiance sur pente, ordonnée à l’origine, coefficient de détermination r2
Si linéarité + ordonnée origine =0 : 1 seul point étalon en routine
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Exactitude (justesse) Accuracy
"Etroitesse d’accord entre la valeur trouvée et la valeur acceptée soit comme valeur conventionnellement vraie soit comme valeur de référence"
ISO 5725 Exactitude : étroitesse d'accord entre la résultat d'essai et la
valeur de référence acceptée Justesse : étroitesse d’accord entre la valeur moyenne obtenue à
partir de larges séries d'essais et une valeur de référence acceptée
écart d'une valeur obtenue / valeur considérée comme exacte
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Exactitude (justesse) Accuracy
Inexact, fidèle Exact, fidèle
Inexact, non fidèle Exact, non fidèle
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Exactitude (justesse) Accuracy
Exactitude erreur systématique (biais) d'une valeur obtenue / valeur considérée comme exacte
Vérifiée par comparaison méthode de référence préparation échantillons reconstitués (matrice + quantité
connue d’analyte) et étalons n ≥ 3 x 3 concentrations différentes en analyte
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Exactitude (justesse) Accuracy
Tracé droite qté trouvée - qté ajoutée (= théorique ou vraie)
Méthode exacte si pente=1 ordonnée origine =0
Tracé droites réponse-qté ajoutée et réponse- quantité étalons Méthode exacte si pente et ordonnée origine =0
identiques Taux de recouvrement ou erreur relative %
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Fidélité Precision
" Etroitesse d’accord entre une série de mesures obtenues dans des conditions prescrites à partir de prises d’essais multiples provenant d’une même échantillon homogène"
ou degré de dispersion des résultats ou écart aléatoire de valeurs / valeur moyenne
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Fidélité Precision
Fidèle, inexact
Fidèle, exact
Non fidèle, inexact
Non fidèle, exact
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Fidélité Precision
Fidélité erreurs aléatoires
Répétabilité Fidélité intermédiaire Reproductibilité
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Fidélité, répétabilité Repeatability
"La répétabilité exprime la fidélité évaluée dans des conditions opératoires identiques et dans un court intervalle de temps"
Déterminée à partir d'un même échantillon, évaluée dans des conditions opératoires identiques (même analyste, même équipement, même laboratoire,…) et dans un court intervalle de temps
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Fidélité, répétabilité Repeatability
Répétabilité de la mesure : n ≥ 6 même échantillon
Répétabilité de la méthode : n ≥ 6 ou n ≥ 3x3
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Fidélité, fidélité intermédiaire Intermediate precision
"La fidélité intermédiaire exprime la variabilité intra-laboratoire : jours différents, analystes différents, équipements différents, etc… "
Détermination à partir d'un même échantillon → bien spécifier les conditions → plan expériences
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Fidélité, reproductibilité Reproductibility " La reproductibilité exprime la variabilité inter
laboratoires (études collaboratives) habituellement appliquées à la standardisation de la méthodologie"
Déterminations à partir d’un même échantillon
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Fidélité, expression Precision
Écart-type s (standard deviation) Variance s2 Coefficient de variation, s/m*100 ( relative
standard deviation) %
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Intervalle de validité Range
"Intervalle compris entre la concentration (quantité ) la plus élevée et la plus faible de l'échantillon dans lequel il a été démontré que la méthode d'analyse présente une fidélité, une exactitude et une linéarité satisfaisante."
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Limite de détection Detection Limit
" La limite de détection d'une méthode d'analyse est la plus petite quantité d’analyte qui peut être détectée mais pas nécessairement quantifiée comme une valeur exacte"
Exprimée en quantité injectée ng, µg
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Limite de détection Detection Limit
Évaluation visuelle Évaluation signal/bruit Évaluation pente et écart-type
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Limite de détection Detection Limit
Exemple méthode CLHP Masse ou concentration d’analyte qui donne un
rapport S/B = 3 Bruit pic à pic Vérifiée dans matrice par injection à la
concentration retenue comme LD
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Limite de quantification Quantification Limit
"Quantité la plus faible d’analyte dans un échantillon qui peut être déterminée quantitativement avec une fidélité et une exactitude appropriée"
Exprimée en ng ou µg
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Limite de quantification Quantification Limit
Évaluation visuelle Évaluation signal/bruit Évaluation pente et écart-type
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Limite de quantification Quantification Limit
Évaluée : quantité ou concentration d’analyte S/B = 10
Vérifiée en injectant des solutions de conc. =LQ
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Robustesse Robustness
"Capacité du protocole de rester non affectée par des variations faibles mais délibérément introduites dans les paramètres de la méthode; fournit une indication sur sa fiabilité dans des conditions normales d’utilisation"
Variations faibles : modifications contrôlées des conditions d'application (changements délibérés mais limités facteurs indépendants)
étude de l'effet de chaque facteur sur le résultat de l'analyse
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Robustesse Robustness
Vérifiée par approche multivariée ou univariée (plan d'expériences)
Permet de fixer les limites des tests de conformité Donne une idée sur variations entre jours, entre
laboratoires étape préliminaire avant de transférer les méthodes, avant les études collaboratives
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Robustesse Robustness
Exemples de facteurs Temps d'extraction Temps d' agitation CLHP
pH de la phase mobile Composition de la phase mobile Débit Colonne Température ….
Permet de fixer les limites des tests de conformité
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Stabilité des solutions
Vérifiée sur solutions étalons et échantillons Vérifiée par comparaison des facteurs de
réponse
Exemple méthode CLHP Solution « vieillie » Solution « fraîche » Temps > 16h (injecteur automatique)
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Conclusion
Validation initiale Pas de règles Recommandations; lignes directrices Pas de protocole figé Adaptation à l'usage, aux exigences
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Conclusion
Routine Validation in situ : confirmation validation initiale
applicable ( suivi des paramètres, CQ,…)
Tests de conformité HPLC Paramètres chromatographiques Tr, Rs, N Répétabilité injections successives (n = 6)
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TEST PARAMETRE CRITERE D’ ACCEPTATION
Identification Spécificité Test garantissant l’identité de l’analyte
Tests quantitatifs majeurs
Exactitude/TR Répétabilité Fidélité intermédiaire Linéarité Spécificité
Robustesse
95 à 105 % qté théorique Doit être prouvée RSD ≤ 3 % R2 ≥ 0,98 ou R ≥ 0,99 Rs satisfaisante entre les pics PA et pdts de dégradation connus; évaluation de l’interférence du placebo
Doit être démontrée
Dosage de faibles conc. (pdts de dégradation, impuretés)
Exactitude/TR Répétabilité Linéarité Spécificité
LD LQ
70 à 130 % de la qté tolérée RSD ≤ 10 % R2 ≥ 0,95 ou R ≥ 0,97 Rs satisfaisante entre pics PA et pdts de dégradation connus; évaluation de l’interférence du placebo Pour tests limites uniquement Doit être démontrée
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Quelques livres
Validation and Qualification in Analytical Laboratories – L. Huber – Interpharm / CRC 1999
L'assurance qualité dans les laboratoires agro-alimentaires et pharmaceutiques – M. Feinberg, coordonnateur – Ed TEC&DOC 2001
Analytical method validation and instrument performance verification – Ed Chung Chow Chan, H. Lam, Y.C. Lee, X.M. Zhang – John Wiley&Sons, 2004
Validation of chromatography data systems – Meeting business and regulatory requirements – R.D. McDowall – Ed Royal Society of Chemistry, 2005
Method validation in pharmaceutical analysis – a guide to best practice – Ed J. Ermer and J.H. McB. Miller – Wiley- VCH, 2005
……
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