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MARCELO JOÃO AMADEI
TÍTULO: EXPRESSÃO IMUNO-HISTOQUÍMICA DE GALECTINA-3 EM
LESÕES FOLICULARES BENIGNAS E MALIGNAS DA TIRÓIDE
Tese apresentada à Universidade
Federal de São Paulo – Escola
Paulista de Medicina, para
obtenção do Título de Mestre em
Ciências da Saúde.
São Paulo
2006
MARCELO JOÃO AMADEI
TÍTULO: EXPRESSÃO IMUNO-HISTOQUÍMICA DE GALECTINA-3 EM
LESÕES FOLICULARES BENIGNAS E MALIGNAS DA TIRÓIDE
Tese apresentada à Universidade
Federal de São Paulo – Escola
Paulista de Medicina, para
obtenção do Título de Mestre em
Ciências da Saúde.
Orientador: Reinaldo P Furlanetto
Co-orientador: João Roberto Maciel Martins
São Paulo
2006
UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO PAULO
ESCOLA PAULISTA DE MEDICINA
DEPARTAMENTO DE MEDICINA
DISCIPLINA DE ENDOCRINOLOGIA
Chefe do Departamento: Emilia Inoue Sato
Coordenador do Curso de Pós-Graduação: Sérgio Atala Dib
iii
FICHA CATALOGRÁFICA
Amadei, Marcelo J
Expressão imuno-histoquímica de galectina-3 em lesões foliculares
benignas e malignas da tiróide
p. 51
Tese de Mestrado – Disciplina de Endocrinologia – Universidade Federal de
São Paulo, Escola Paulista de Medicina
Orientador: Reinaldo Perrone Furlanetto
Descritores: tiróide, neoplasia folicular, imuno-histoquímica, galectina-3
MARCELO JOÃO AMADEI
TÍTULO: EXPRESSÃO IMUNO-HISTOQUÍMICA DE GALECTINA-3 EM
LESÕES FOLICULARES BENIGNAS E MALIGNAS DA TIRÓIDE
BANCA EXAMINADORA
Profa. Dra. Maria Aparecida da Silva Pinhal
Profa. Dra. Edna Teruko Kimura
Profa. Dra. Rosalinda Yossie Asato de Camargo
Suplente:
Profa. Dra. Rosana Delcelo
iv
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO............................................................................................1
2. OBJETIVO..................................................................................................9
3. MANUSCRITO..........................................................................................10
4. CONSIDERAÇÕES FINAIS......................................................................38
5. BIBLIOGRAFIA.........................................................................................44
v
1. INTRODUÇÃO
Os nódulos de tiróide (NT) são extremamente comuns. A prevalência de
nódulos tiroidianos palpáveis nos estudos populacionais de Framingham,
Massachusetts e Whickham, Inglaterra foi 4,2% e 3,2%, respectivamente (1,2).
Esta prevalência é ainda maior ao se utilizarem métodos de imagem como ultra-
sonografia de alta resolução (3). Em um estudo populacional em Hyvinka,
Finlândia, usando transdutor com freqüência de 7,5 MHz, foram detectados
nódulos em 27% das mulheres e 15% dos homens (4).
O espectro clínico varia de nódulos incidentais, assintomáticos, pequenos e
solitários, nos quais a exclusão de neoplasia maligna é a principal preocupação,
àqueles grandes nódulos, parcialmente intra-torácicos que levam a sintomas
compressivos, necessitando de cirurgia independente da etiologia (5).
Em adultos, 80% dos nódulos são benignos (lesões colóides, cistos
degenerativos, adenomas foliculares, tiroidite). Em contraste, embora raros (0,22-
1,8%), nódulos de tiróide em pacientes menores de 21 anos têm uma alta
incidência de malignidade (33% crianças x 5% adultos) (6). Outros aspectos
clínicos, além da faixa etária, devem ser considerados para a possibilidade de
câncer em um nódulo de tiróide: sexo (a proporção de nódulos malignos em
homens é o dobro daquela em mulheres), presença de linfadenopatia regional,
lesão de rápido crescimento, história prévia de irradiação em cabeça e pescoço,
aparecimento de rouquidão, disfagia progressiva ou dispnéia, nódulo fixo, duro,
irregular à palpação e história familiar de câncer de tiróide ou de neoplasia
endócrina múltipla tipo 2 (7).
2
Os métodos disponíveis para avaliação dos nódulos de tiróide incluem a
citologia do material obtido por punção aspirativa com agulha fina (PAAF),
cintilografia e ultra-sonografia. A PAAF inicial é mais útil no diagnóstico e custo-
efetiva que as outras formas de investigação (8).
A PAAF oferece resultados diagnósticos úteis em cerca de 80% dos casos
(9), podendo ser maior ainda dependendo da experiência do puncionador e do
citopatologista, número de aspirações, características dos nódulos, critérios
diagnósticos utilizados e se associada com ultra-sonografia (10). A incidência de
resultados falso-negativos diminui com a experiência clínica e é estimada em torno
de 1% (11).
De maneira geral, a sensibilidade da PAAF varia de 68-98% (média 83%) e
a especificidade, de 72-100% (média 92%). A acurácia diagnóstica, contudo,
depende de como se classificam as lesões ditas foliculares ou suspeitas (12).
Há quatro possíveis resultados com PAAF: (1) maligno, (2) benigno, (3)
suspeito ou indeterminado e, (4) inadequado. A PAAF pode identificar com
confiança nódulos colóides, tiroidite, carcinomas papilífero, medular, anaplásico,
linfoma e, até mesmo, lesões metastáticas. A principal limitação técnica é a
diferenciação citopatológica de uma lesão folicular (13). Cerca de 15% das PAAF
mostram-se suspeitas ou indeterminadas, também referidas como lesões ou
neoplasias foliculares. De 20-25% destas lesões se confirmam malignas após a
cirurgia (14,15). Assim, pelo risco potencial de neoplasia maligna em NT com
PAAF suspeita, há indicação para tratamento cirúrgico em todos os casos (desde
que não seja nódulo autônomo, pois, neste caso a PAAF pode também ser
3
suspeita e a possibilidade de malignidade é muito menor que em nódulos não-
funcionantes).
Os diagnósticos mais freqüentes de neoplasias foliculares submetidas à
cirurgia são, em ordem decrescente de ocorrência: nódulos hiperplásicos,
adenoma folicular, tiroidite linfocítica, carcinoma papilífero variante folicular, bócio
colóide, carcinoma folicular e carcinoma folicular variante oncocítica. A distinção
entre adenoma e carcinoma folicular necessita de critérios histológicos para
confirmar ou excluir a invasão capsular tiroidiana e/ou vascular, impossibilitando
seu correto diagnóstico através da PAAF (16,17,18).
O diagnóstico de CPVF pode ser difícil no aspirado de material celular de
nódulos tiroidianos. A escassez de algumas características citológicas do
carcinoma papilífero, como corpos psamomatosos e inclusões intranucleares
tornam o diagnóstico citológico bastante difícil. Além disso, o aspirado pode
mostrar algumas características mais sugestivas de nódulo hiperplásico ou
adenoma folicular, a depender da presença e aspecto do colóide (19,20).
Vários estudos tentaram identificar critérios preditivos de malignidade em
pacientes com diagnóstico de neoplasia folicular à citologia. Sexo, tamanho do
nódulo e características da glândula à palpação foram os principais fatores
relacionados com risco de malignidade (18). Contudo, nem critérios clínicos,
cintilográficos ou ultra-sonográficos se mostram suficientemente sensíveis ou
específicos para distinguir confiavelmente se a neoplasia folicular identificada à
PAAF é benigna ou maligna.
As lesões foliculares de tiróide podem variar de alterações vistas nos
folículos difusamente, como ocorre no hipertiroidismo, até aquelas que formam um
4
ou mais nódulos. Adenoma folicular, carcinoma folicular e a variante folicular do
carcinoma papilífero normalmente ocorrem como nódulos solitários encapsulados
(21).
Adenomas se apresentam como nódulos solitários sem qualquer evidência
de invasão capsular ou vascular. Múltiplos nódulos encapsulados são
normalmente denominados como hiperplasia nodular. Os adenomas foliculares
são classificados de acordo com seu padrão de crescimento como macrofolicular,
simples, microfolicular, fetal, embrionário e trabecular. O tumor hialinizante-
trabecular é uma entidade distinta que alguns autores, baseados em estudos de
caracterização imunohistoquímica, acreditam tratar-se de uma forma de carcinoma
papilífero encapsulado (22).
O carcinoma folicular representa cerca de 5% dos casos de carcinoma de
tiróide em áreas suficientes em iodo. Tradicionalmente, dois tipos principais de
carcinoma folicular são reconhecidos: minimamente invasivo e grosseiramente
invasivo. O segundo tipo é um tumor diagnosticado clínica e cirurgicamente como
câncer. Tais lesões invadem grosseiramente vasos cervicais ou através da
cápsula da tiróide. São freqüentemente hipercelulares, normalmente
microfoliculares, e/ou focalmente sólidos. Alguns desses tumores podem ser
classificados, de acordo com sua morfologia, como “carcinoma insular” (22).
O carcinoma folicular minimamente invasivo lembra um adenoma folicular; a
lesão é bem definida e freqüentemente encapsulada. O diagnóstico patológico de
carcinoma folicular minimamente invasivo é feito quando há invasão capsular e/ou
vascular. A invasão capsular é normalmente vista como uma lingüeta de células
tumorais penetrando, num padrão semelhante a um gancho ou em cogumelo, a
5
cápsula tumoral. Pode ser limitado à cápsula ou atravessá-la, alcançando o
parênquima tiroidiano circunjacente (22).
O carcinoma papilífero é a neoplasia maligna mais comum de tiróide e seu
diagnóstico patológico é baseado na demonstração de características
citohistológicas típicas. Critérios “maiores”: cromatina frouxa, aumento do núcleo,
invaginações intranucleares e inclusões citoplasmáticas. Critérios “menores”:
colóide eosinofílico espesso, esclerose, nucléolo excêntrico e irregularidades na
membrana nuclear. Há muitas variantes histológicas descritas, baseadas na
morfologia celular (variante células altas), no padrão de crescimento (variante
folicular) e no estroma tumoral (variante esclerosante difuso) (22).
O CPVF é a segunda variante mais comum de carcinoma papilífero, após a
forma clássica, e até 15% destes tumores podem mostrar invasão capsular e
vascular. Contudo, desde sua descrição em 1960 por Lindsay, tem havido muita
controvérsia no diagnóstico do CPVF. As razões para tais divergências incluem os
seguintes: (1) uma grande proporção de CPVF surge em um “fundo” de bócio
nodular e lembram adenoma ou nódulos adenomatosos (que não apresentam
invasão capsular ou vascular); (2) alguns tumores mostram uma distribuição
multifocal ao invés de difusa das características nucleares do carcinoma papilífero
ou, às vezes, sequer as apresentam (22). Esta controvérsia no diagnóstico
histológico é complicada com estudos mostrando uma grande variabilidade entre
observadores no diagnóstico de CPVF, mesmo entre patologistas experientes
(23).
Avanços recentes em diagnóstico molecular como imunohistoquímica,
reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RT-PCR) quantitativo e ensaios
6
de atividade enzimática tornaram possível analisar tais nódulos com o objetivo de
identificar marcadores que possam distinguir lesões benignas e malignas de
tiróide (24).
As características ideais de um marcador molecular que seja útil para o
diagnóstico de NT e carcinoma de tiróide são: (1) distinguir confiavelmente
neoplasias benignas e malignas de tiróide, especialmente em nódulos suspeitos à
citologia; (2) deve ser confirmado por diferentes investigadores; (3) capaz de ser
mensurado a partir de material obtido por PAAF, através de imunocitoquímica,
ensaio funcional ou RT-PCR; (4) possuir significância prognóstica em pacientes
diagnosticados com carcinoma de tiróide, bem como acrescentar informações
sobre a patogênese e opções de tratamento destes pacientes (25).
Há mais de 50 marcadores moleculares analisados em pacientes com NT.
Novos marcadores potenciais aparecem na literatura com freqüência crescente,
embora não sejam usados na prática diária. Dentre os marcadores moleculares
com maior potencial está a galectina-3 (GAL-3) (25,26).
A GAL-3 faz parte de uma família de lectinas ligadoras de β-galactosídeo
com seqüências de aminoácidos relacionadas, às vezes referidas como lectinas
tipo S. As lectinas são proteínas que se ligam a estruturas específicas de
carboidratos e podem, assim, reconhecer glicoconjugados específicos entre uma
vasta amostra expressa em tecidos animais (27).
A expressão de lectinas solúveis é modulada durante a carcinogênese.
Alterações relacionadas à transformação maligna ocorrem na expressão de
lectinas celulares endógenas e a quantidade de lectinas celulares e de superfície
7
celular aumentam consideravelmente durante a progressão para um fenótipo
metastático.
As galectinas são proteínas com pelo menos um domínio de
reconhecimento de carboidratos que apresentam (1) homologia significante na
seqüência de aminoácidos e (2) afinidade demonstrada para β-galactosídeos (28).
Há, até o momento, 14 galectinas descritas em mamíferos e muitas destas foram
encontradas em outras espécies. As galectinas são todas pequenas proteínas
solúveis com peso molecular dos monômeros variando entre 14-36 KDa. Elas são
sintetizadas no citoplasma e freqüentemente permanecem neste compartimento,
embora possam ser secretadas para o meio extra-celular ou translocadas para o
núcleo (29).
As galectinas desempenham papel em diversos processos biológicos:
desenvolvimento, diferenciação e morfogênese, imunidade e apoptose. Além
destes, vários processos celulares como comunicação, adesão, transporte e
modulação parecem ser auxiliados pelo reconhecimento específico de
glicoconjugados (30).
A GAL-3 é expressa em vários tecidos epiteliais (cólon, mama, fígado, pele,
cérebro, ovários, estômago, rins e endotélio), monócitos, macrófagos, basófilos e
mastócitos, além de fibroblastos, condrócitos e osteoblastos. Em alguns tecidos, a
expressão de GAL-3 é regulada durante o processo de diferenciação. Também em
vários tecidos tumorais foi identificada expressão alterada de GAL-3: linfoma
anaplásico de grandes células, carcinoma de mama, cólon, melanoma e
carcinoma de tiróide, entre outros. Esta lectina tem vários ligantes conhecidos
8
celulares e extra-celulares, entre os quais membros da família laminina,
fibronectina fetal, mucina, IgE e Bcl-2 (31).
Vários estudos têm relacionado a expressão de GAL-3 com carcinoma de
tiróide. Contudo, resultados controversos em tipos histológicos de padrão folicular
(adenoma e carcinoma folicular e CPVF) foram obtidos.
9
2. OBJETIVO
Tendo em vista os resultados divergentes obtidos com o marcador
galectina-3 em diferentes centros, o objetivo deste estudo foi:
Avaliar, através de imunohistoquímica, a acurácia do marcador galectina-3
na capacidade de distinção entre carcinoma folicular, adenoma folicular,
carcinoma papilífero variante folicular e nódulo hiperplásico de tiróide.
10
Galectin-3 immunohistochemistry for follicular patterned thyroid lesions
Authors: Marcelo J Amadei1, Rosana Delcelo2, Ana PR Paiotti3, Ângela FL
Waitzberg2, Thais Heinke2, João RM Martins1, Reinaldo P Furlanetto1
1 Division of Endocrinology and Metabolism, Department of Medicine
2 Laboratory of Immunohistochemistry, Department of Pathology
3 Department of Pathology
Federal University of São Paulo
Address to correspondence: RUA BOTUCATU, 740 -2° ANDAR
VILA CLEMENTINO - CEP: 04023-900 - SÃO PAULO - BRASIL
TEL: 55 11 55719826/55764229 - FAX: 55 11 55748432
E-MAIL: rfurlanetto@terra.com.br
11
ABSTRACT
Follicular thyroid lesions represent a challenge for both cytological and histological
diagnosis. The more frequent follicular neoplasms are hyperplastic nodules (HN),
follicular adenoma (FA), follicular carcinoma (FC) and follicular variant of papillary
carcinoma (FVPC). The accuracy of galectin-3 immunohistochemistry in
distinguishing benign from malignant thyroid follicular patterned lesions will be
presented. One hundred and thirty six cases selected from the Pathology
Department were reviewed according to the World Health Organization
classification for thyroid neoplasms, including 28 cases of FVPC, 20 FC, 46 FA,
and 42 HN. Immunohistochemical method was streptavidin-biotin-peroxidase
complex with monoclonal antibody to galectin-3. Galectin-3 was negative for most
benign lesions (93.1%). Positivity for FC was 20%, and for FVPC it was 89%.
Overall capacity to distinguish benign from malignant follicular patterned lesions
was: sensitivity=0.60; specificity=0.93; negative predictive value=0.82; positive
predictive value=0.82; accuracy=0.81; odds ratio=21.71. In conclusion, galectin-3
is a good marker for follicular variant of papillary carcinoma and also has good
predictive values for follicular lesions. It could be a helpful marker in cytological
analysis and in borderline histological lesions thus minimizing unnecessary
surgery.
KEYWORDS: IMMUNOHISTOCHEMISTRY; GALECTIN-3; FOLLICULAR
NEOPLASM, THYROID
12
INTRODUCTION
Thyroid nodules (TN) are very common. Prevalence of palpable TN in
populational surveys are 3.2-4.2% (1,2). Using thyroid ultrasonography this
prevalence increases to 27% in women and 15% in men (3).
Initial fine needle aspiration biopsy (FNAB) is the most useful method to
evaluate TN. Its sensitivity and specificity is around 68-98% and 72-100%,
respectively (4).
However, an important technical limitation of FNAB is cytological distinction
between benign and malignant follicular lesions. Such distinction is only possible
during histological examination (5). The finding of thyroid capsular or vascular
invasion confirms diagnosis of carcinoma. Approximately 15% of FNAB are
suspicious or unable to be diagnostic. Of these, 20-25% are confirmed malignant
by histological examination (6). Because of potential risk of malignancy, all TN with
suspicious FNAB need surgical removal (7).
The more frequent histological diagnosis of suspicious FNAB are
hyperplastic nodule, follicular adenoma, Hashimoto’s thyroiditis, follicular variant of
papillary cancer, colloid goiter, follicular carcinoma, and oncocytic variant of
follicular carcinoma (8,9).
Recent advances in molecular studies involving immunohistochemistry,
reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) and enzyme activity
assays allowed evaluation of TN with suspicious FNAB. The main goal is to identify
molecular markers able to distinguish between benign and malignant thyroid
follicular lesions (10,11).
13
There are over 50 molecular markers analysed in the current literature. New
markers are becoming more and more frequent. However, its clinical use is still
very uncommon (12). Among these molecular markers, galectin-3 (GAL-3) has
emerged with greatest potential.
GAL-3 belongs to a family of β-galactoside-binding animal lectins. Lectins
are proteins able to bind specific structures of carbohydrates and can recognize
particular glycoconjugates expressed in animals (13).
GAL-3 is normally present in various epithelial tissues like colon, breast,
liver, skin, brain, stomach, kidneys and also in inflammatory cells like monocytes,
macrophages, mast cells and fibroblasts. In several tumoral types, GAL-3
presented an altered expression as found in anaplastic lymphoma, breast cancer,
melanoma, colon carcinoma and thyroid cancer (14).
Several papers showed increased expression of GAL-3 in thyroid
carcinoma, especially in the papillary type. However, controversial results were
obtained when evaluation of lesions commonly diagnosed as suspicious in FNAB
were included.
In face of different results found with galectin-3 at several centers, the
objective of this study was: to evaluate, using immunohistochemistry, accuracy of
GAL-3 to distinguish between benign (hyperplastic nodule and follicular adenoma)
and malignant (follicular variant of papillary carcinoma and follicular carcinoma)
thyroid lesions.
14
MATERIAL AND METHODS
1) SURGICAL SPECIMENS
Paraffin-embeded thyroid samples obtained from Pathology Department
Archive from May 1997 to April 2003 were retrieved. Cases with initial diagnosis of
follicular adenoma (FA), follicular carcinoma (FC), follicular variant of papillary
carcinoma (FVPC) and hyperplastic nodule (HN) were selected. Samples were
taken from Hospitals associated to Federal University of São Paulo. The present
study had previous approval of Local Ethical Committee.
Paraffin blocks unavailable or without conditions for new cut sections were
excluded. Selected cases had initial diagnosis reviewed in hematoxilin-eosin
stained slides according to the World Health Organization classification for thyroid
neoplasms: 46 FA (17 follicular adenomas, 07 microfollicular adenomas, 01 fetal
adenoma, 01 hyalinizing trabecular tumor, 02 trabecular/solid adenomas and 18
oncocytic variant follicular adenomas); 20 FC (06 highly invasive, 06 insular
carcinomas, 04 minimally invasive and 04 oncocytic variant), 42 HN and 28 FVPC,
totalizing 136 cases (15).
2) IMMUNOHISTOCHEMICAL METHOD
Surgical samples of thyroidectomy formalin-fixed and paraffin-embeded
were cut into 3µm sections in slides previously treated with 3-
aminopropyltrietoxisilane, deparaffinized with xylene and rehydrated in ethanol.
Heat-induced antigen retrieval was performed in microwave in a citrate buffer (pH
6.0) for 30 minutes. Endogenous peroxidase activity was inhibited by immersing
the sections in 3% hydrogen peroxidase for 20 minutes at room temperature. After
washes with phosphate-buffered saline (PBS), slides were incubated with
15
monoclonal antibody against galectin-3 (9C4 clone, IgG1 subclass, Novocastra
Laboratories Ltd, New Castle, UK), with a 1:150 dilution for 18 hours at 4oC. Once
again washed with PBS, sections were then incubated with the biotinylated
secondary antibody for 15 minutes at room temperature, followed by reaction with
streptavidin-biotin based immunoperoxidase detection system (LSAB+ System,
DAKO Corp, Carpinteria, CA, USA) for another 15 minutes. Finally, to visualize the
reaction we used a 3,3’-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB) and a 1%
hydrogen peroxidase solution. Slides were dehydrated with increasing alcohol
concentrations and counterstained with Harris hematoxilin.
Positive control of GAL-3 was classic variant of papillary carcinoma and
internal negative control was normal thyroid.
3) IMMUNOHISTOCHEMICAL EVALUATION
Two independent pathologists without access to initial and reviewed
diagnoses evaluated sections in optical microscopy. Semiquantitative criteria were:
• Negative (benign lesion) – no reactivity or a few neoplastic cells with
nuclear reactivity or <10% tumoral cells with cytoplasmatic positivity
• Positive (malignant lesion) – ≥ 10% neoplastic cells with reactivity in
cytoplasma or both in cytoplasma and nucleus.
Cases with discordant results were reviewed by both pathologists for final
decision.
4) STATISTICAL ANALYSIS
Histomorphological diagnosis was the gold standard. Sensitivity, specificity,
negative and positive predictive values, accuracy and odds ratio were assessed.
Sensitivity was defined on the basis of thyroid cancer detection using GAL-3
16
immunohistochemistry [true positive/(true positive + false negative)]. Specificity
was defined on the basis of benign thyroid neoplasms detection [true negative/(true
negative + false positive)]. Positive and negative predictive values were
respectively computed as [true positive/(true positive + false positive)] and [true
negative/(true negative + false negative)]. Diagnostic accuracy represents a
combination of sensitivity and specificity [(true positive + true negative)/(true
positive + false positive + true negative + false negative)]. Odds ratio was
calculated by the ratio of (true positive/false negative)/ (false positive/true negative)
(16).
17
RESULTS
Tables 1 and 2 show features of cases of follicular carcinoma and FVPC.
GAL-3 expression in neoplastic cells occurred mostly in cytoplasma (Figure
1). Nuclear reactivity was seen both in a few tumoral cells as in fibroblasts,
endothelium and histiocytes. In these non-tumoral cells, expression was present in
areas of thyroiditis (Figure 2).
In benign lesions, GAL-3 was negative in 93.1% (Figure 3). For FVPC, it
was positive in 89% of cases. However, positivity of FC was low (20%). Results of
reactivity for each histological type are presented in Table 3.
Of three positive cases of HN, two had controversial results between
pathologists, showing weak and focal expression, but fulfilling criteria of positivity.
In three positive cases of FA there was no controversy.
There were three negative cases of FVPC and controversy occurred in two
of these. Four cases of FC were positive: 02 poorly differentiated lesions, one
minimally invasive and one oncocytic variant. It was not possible to establish
association between histological subtype of FC and GAL-3 expression.
The presence of thyroiditis did not influence any result. It was present in
nine cases of FVPC (two negative cases for GAL-3) and other nine cases of FA.
Overall capacity to distinguish benign (FA and HN) from malignant (FC and
FVPC) lesions was: sensitivity 60%, specificity 93%, negative predictive value
82%, positive predictive value 82%, accuracy 81% and odds ratio 21.71.
Excluding cases of FC, sensitivity, specificity, positive and negative
predictive value and accuracy would be, respectively: 89%, 93%, 80%, 96% and
91%. Odds ratio would be 119.
18
DISCUSSION
Recent evidence confirms crucial importance of cancer cell interaction to
carbohydrate during tumoral progression. Lectins are carbohydrate-binding
proteins, excluding enzymes and antibodies (17).
Increased GAL-3 expression in cancer cells was initially found in breast
tumours. Thereafter, colon cancer, gastric tumours, liver cancer, hematological and
central nervous system malignancies were found to present altered GAL-3
expression (17). Specifically in thyroid cancer, since initial study of Xu et al, a
growing interest in the use of this lectin as a marker to distinguish follicular thyroid
lesions has emerged (18).
GAL-3 is implicated in many different biological functions of tumoral cells: (1)
cell-to-cell interaction; (2) adhesion, migration and invasion; (3) tumor growth and
metastasis; (4) proliferation and cell cycle regulation; (5) apoptosis and (6)
angiogenesis (19). In thyroid tumours, Yoshii et al analysed effects of anti-sense
GAL-3 complementary DNA transfection in papillary carcinoma cell lines in vitro.
Authors concluded that overexpression of GAL-3 is important for the maintenance
of transformed phenotype, probably due to the anti-apoptotic activity of the lectin
(20).
Another issue to be considered for GAL-3 is its localization in tumoral cell.
Normal thyroid cells do not express GAL-3 by immunohistochemistry (21). After
synthesis in cytoplasma GAL-3 usually reside in this compartment. However, it can
be secreted or translocated to the nucleus. In malignant neoplasms of thyroid,
GAL-3 expression is much more important in cytoplasma than in nucleus. For
colon cancer, an association between GAL-3 localization in tumoral cell and status
19
of cell differentiation was found. In thyroid malignancies, however, there is no
correlation of histological aggressiveness or dedifferentiation status with GAL-3
localization (22).
Capacity to distinguish follicular benign and malignant thyroid lesions using
GAL-3 immunohistochemistry is very controversial (Table 4). Therefore, diverging
results among different studies demand an analysis of some methodological
aspects: (1) utilization of distinct criteria for positivity in immunohistochemistry; (2)
use of different histological definitions for follicular lesions; (3) different origin of
monoclonal antibodies against GAL-3; (4) use of immunohistochemical detection
systems biotin-based or biotin-free.
Only one study compared monoclonal antibodies from different sources.
Authors evaluated follicular carcinoma cases and there was no interference in the
lectin expression (35). It is necessary to emphasize that this was not the objective
of the study. It was done with the purpose of make a comparison with other papers
which used different monoclonal antibodies.
Another relevant methodological issue is the detection system used for most
authors, including the present one. All of these detection methods are biotin based.
Oxyphilic cells in thyroid gland are rich in endogenous biotin. GAL-3
immunohistochemistry can present false-positive results in oxiphilic cells when
biotin based detection methods are used, especially when heat-induced antigen-
retrieval is necessary (39). Centers that regularly obtain best results with GAL-3
immunohistochemistry to distinguish follicular lesions use biotin-free detection
systems (40).
20
A few positive cases of GAL-3 immunohistochemistry in follicular adenomas
are present in all papers published. This find gave rise to a hypothesis that these
cases could represent, in fact, malignant lesions but evidence of vascular or
capsular invasion was still not identified (40). Despite that molecular mechanisms
of tumorigenesis are not completely understood, findings that benign lesions
express foci of clonal expansion suggest an evolutional process of goiters and
adenomas to carcinoma (41). Thus, positive cases of adenoma could indeed
represent malignant lesions in a stage where histological invasion is not found by
optical microscopy.
There is also a supposition that expression in adenomatous cells could be
influenced by cytokine secretion from lymphocytes in areas of thyroiditis (40).
However, none of three positive cases of follicular adenoma presented foci of
thyroiditis. We had 15 cases associated with areas of lymphocytic thyroiditis
among our 48 selected cases of carcinoma. There was no interference of presence
of thyroiditis in GAL-3 immunohistochemistry evaluation.
Martins et al, using a quantitative RT-PCR method, found GAL-3 expression
in 80% of multinodular goiter samples and in 60% of follicular adenomas (29).
Other reports, have also described GAL-3 expression in benign lesions and even in
normal thyroid tissue (42,43). It is known that GAL-3 is normally present in
endothelial cells and it can be increased in histiocytes and other inflammatory cells.
So, it is possible that a contamination of tissue sample could occur with non-
tumoral cells that express GAL-3 and a positive result would be obtained by RT-
PCR. By immunohistochemistry, we can identify tumoral cells and to consider, or
not, expression in different areas. Our cases presented GAL-3 reactivity in non-
21
tumoral cells only in thyroiditis areas (Figure 2) or histiocytes in an isolated pattern.
A recent study, by Feilchenfeldt et al, compared GAL-3 expression by the
quantitative RT-PCR and immunohistochemistry methods. They found a significant
increase in galectin-3 (at protein level and, to a lesser extent, at mRNA level) in
papillary carcinomas (44).
Follicular variant of papillary carcinoma is the second most common variant
after classic papillary carcinoma. Over 15% of these tumours can present capsular
or vascular invasion (45). However, diagnosis of this variant is not easy to perform.
There is a great variability of different diagnoses of this histological type even when
experienced endocrine pathologists analyse the samples (46). Features of this
tumour that make its diagnosis difficult are: (1) multifocal, rather than diffuse,
distribution of nuclear characteristics of papillary carcinoma and (2) the most
common occurrence of this tumour is the encapsulated form; a solitary lesion that
shows no invasive feature (45). Our results confirm that galectin-3
immunohistochemistry is a very good method to identify this variant of papillary
carcinoma. It could be used as a complement to histological evaluation of
suspicious thyroid nodules.
Considering only oncocytic variant of follicular adenoma and carcinoma,
Nascimento et al found increased expression of GAL-3 in carcinomas (59 x 7.1%)
(26). Volante et al, evaluating a large series of oncocytic cell tumours of the
thyroid, found a sensitivity for GAL-3 of 95.1% and specificity of 88% (47). In the
present study, we had one positive case among 14 oncocytic adenomas and
another among 04 oncocytic variant of follicular carcinomas.
22
A growing number of reports have been published evaluating GAL-3 utility in
FNAB. Bartolazzi et al, in a multicentric study, described values of sensitivity,
specificity and accuracy of 100%, 98% and 99%, respectively, in the capacity to
distinguish between benign and malignant thyroid lesions on fresh cytological
material from preoperative FNAB (25). However, in a recent report, Maruta et al
evaluated galectin-3 immunostaining of cytological material obtained from thyroid
follicular lesions on FNAB. Authors were unable to reproduce those results,
founding lower values of sensitivity (89%) and specificity (75%) to distinguish
between follicular adenoma and carcinoma (48).
Finally, recent studies have used panels of molecular markers, including
GAL-3, trying to improve accuracy. Some of these markers are thyroid peroxidase,
CITED-1, CK19, HBME-1, CD26, heparanase and many others (35, 37, 38, 49-51).
Association of different markers seems to be a promising area for evaluation of
suspicious thyroid lesions.
We concluded that galectin-3 is a good marker for follicular variant of
papillary carcinoma. It presents good positive and negative predictive values and
can be useful in histological evaluation of thyroid nodules with borderline features
of papillary carcinoma. It should not be used to distinguish follicular thyroid
adenoma and carcinoma.
23
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30
Table 1. Distribution by gender, age and TNM stage in the cases of follicular
variant of papillary carcinoma (FVPC)
Gender Age(y) TNM Gender Age(y) TNM
F+ 45 T1N0Mx F+ 41 T4aN1Mx
F 29 T1N0Mx M 36 T1N0M0
F 40 T3N0Mx F*+ 41 T1N0Mx
F 35 T1N0Mx F 33 T4aN1M0
M+ 40 T3N0M0 F+ 63 T3N0Mx
F+ 63 T3N0Mx F 16 T2NoMx
F 62 TxNxMx F*+ 58 T1N0Mx
F 62 T1NxMx F 52 T1N0Mx
F 67 T4aN0M1 F 69 T4aN0M1
F 34 T3N0Mx F 27 T1N0M0
F 12 T4aN1Mx F 74 T4bN0Mx
F* 57 T2N0M0 F NA T3N0Mx
F 24 T3N1M1 F NA T3N0Mx
F+ 57 T4aN0Mx F 55 T3N0M0
F+ 35 T1N0M0 F 27 T1N1M0
+ Cases with presence of areas of thyroiditis; *NEGATIVE cases for GAL-3; NA –
data not available
31
Table 2. Distribution by gender, age and TNM stage in the cases of follicular
carcinoma (FC)
Gender Age(y) TNM Gender Age(y) TNM
F 69 T4aN0M1 F 66 T2NoMx
F+ 17 T3N0M0 M* 75 T3N0M1
F+ 61 T2N0M0 F 47 T2N0M0
F+ 62 T2N0M0 F 75 T2N0Mx
F+ 39 T3N0M0 F+ 36 T2N0Mx
M 75 T2N0M0 F NA T3N0Mx
F* 60 T1N0M0 F+ 24 T2N0Mx
F 23 T1N0Mx F 69 T4bN0Mx
M 62 T4bN0Mx F* 86 T3N0Mx
M* 66 T2N0M0 F 39 T3N0M0
+ Cases with presence of areas of thyroiditis; + POSITIVE cases of GAL-3;
NA – data not available
32
Table 3. Positive results of GAL-3 according to histological subtype of benign and
malignant lesions of thyroid
Histological diagnosis Number of cases with ≥ 10% of
positive tumoral cells/Total cases
Benign
- Follicular adenoma 02/28
- Oncocytic variant adenoma 01/18
- Hyperplastic nodule 03/42
Malignant
- Follicular carcinoma 01/06
- Minimally invasive FC 01/04
- Poorly differentiated FC 01/06
- Oncocytic variant of FC 01/04
- Follicular variant of papillary CA 25/28
FC – follicular carcinoma; CA - carcinoma
33
Table 4. Previous studies with GAL-3 for follicular variant of papillary carcinoma
(FVPC), follicular carcinoma (FC), follicular adenoma (FA) and hyperplastic nodule
(HN) (positive results/total of samples evaluated)
First author, year FVPC FC FA HN Antibody origin
Xu, 1995 (18) - 7/7 0/10 - Boehringer-Mannheim
Fernandez, 1997 (23) 2/2 4/8 0/8 0/3 --
Gasbarri, 1999 (24) - 14/14 1/37 0/11 Boehringer-Mannheim
Bartolazi, 2001 (25) - 54/57 4/54 0/50 Novocastra
Nascimento, 2001 (26) - 11/14 1/9 - Research Diagnostics
Coli, 2002 (27) - 3/5 17/27 7/25 Ylem
Beesley,2002 (28) 3/4 12/12 2/18 - Novocastra
Martins, 2002 (29) - 18/20 14/31 - Affinity Bioreagents
Gaffney, 2003 (30) - 14/21 03/14 - Novocastra
Kovacs, 2003 (31) - 7/10 4/19 0/25 Novocastra
Jarubiak-Wielganowicz, 2003 (32) - 36/42 8/42 - Dako
Oeistreider-Kedem, 2004 (33) 15/18 7/11 2/19 - Affinity Bioreagents
Mehrotra, 2004 (34) - 14/19 18/19 - Novocastra
Weber, 2004 (35) - 4/9 4/13 - Research Diagnostics
De-Leon-Mazariegos, 2004 (36) - 5/21 4/44 - Novocastra
Prasad, 2005 (37) 13/13 04/06 2/21 - Novocastra
de Matos, 2005 (38) 13/25 8/38 2/18 1/12 Novocastra
34
FIGURE LEGENDS
Figure 1. Positive immunostaining for galectin-3 in a follicular variant of papillary
carcinoma showing cytoplasmatic expression, 10x optical microscopy.
Figure 2. Immunostaining for galectin-3 in a germinative center of thyroiditis area,
10x optical microscopy.
Figure 3. Negative immunostaining for galectin-3 in a follicular adenoma, 4x optical
microscopy
38
4. CONSIDERAÇÕES FINAIS
Evidências crescentes confirmam a importância crucial de interações
entre células cancerosas e resíduos de carboidratos durante a progressão
tumoral. As lectinas são definidas como proteínas ligadoras de carboidrato,
excluindo enzimas e anticorpos. As lectinas podem ser: (1) lectinas tipo C
(incluindo as selectinas); (2) lectinas tipo P; (3) pentraxinas e (4) galectinas (28).
A GAL-3 consiste de três domínios: (1) domínio N-terminal compreendendo
cerca de 20 aminoácidos; (2) domínio composto de 10 repetições de aminoácidos
com resíduo aromático conservado (domínio R), e (3) domínio de reconhecimento
de carboidrato na porção C-terminal composto de aproximadamente 140
aminoácidos. A expressão de GAL-3 ocorre em diferentes células e tecidos
normalmente, ou mesmo durante fases evolutivas. Assim, por exemplo, há
expressão em fibroblastos, macrófagos, basófilos, mastócitos, condrócitos e
osteoblastos, células endoteliais, além do cérebro, ovários, estômago, fígado,
cólon e pele (29).
A expressão aumentada de GAL-3 em células cancerígenas foi inicialmente
identificada em tumores de mama (32). Em seguida, foi descrita em
adenocarcinoma de cólon, tumores gástricos e carcinoma hepatocelular. Em
carcinoma de tiróide, desde o estudo de Xu et al, tem-se aprofundado no uso
desta lectina para distinção de lesões foliculares de tiróide (33).
A GAL-3 tem sido implicada em várias funções biológicas em células
tumorais: (1) interação célula-célula; (2) adesão, migração e invasão; (3)
crescimento tumoral e metástase; (4) proliferação e regulação de ciclo celular; (5)
apoptose; (6) angiogênese (29). Especificamente em tumores de tiróide, Yoshii et
39
al avaliaram os efeitos da transfecção de DNA complementar anti-sense de GAL-3
em carcinoma papilífero, que apresenta expressão elevada deste marcador.
Determinaram que a presença de GAL-3 era importante para manutenção do
fenótipo maligno transformado (34).
Na tentativa de associar o marcador com a agressividade tumoral, poucos
estudos correlacionaram a expressão de GAL-3 com a evolução dos pacientes.
Kawachi et al. encontraram expressão aumentada de GAL-3 nos tumores
primários com metástase, quando comparados com aqueles sem metástase.
Contudo, a expressão de GAL-3 nos linfonodos era menor que no tumor primário.
Sugerem que na continuidade da progressão tumoral, em estágios tardios, a
expressão diminuída de GAL-3 possa facilitar a liberação de células cancerosas
da lesão primária para invasão e metástase (35).
Outro aspecto também a ser considerado para GAL-3 é a sua localização
na célula tumoral. No tecido tiroidiano normal, a GAL-3 não é expressa (36).
Depois de sintetizada no citoplasma, freqüentemente permanece neste
compartimento, embora possa ser secretada ou translocada para o núcleo. Em
neoplasias malignas de tiróide, a expressão citoplasmática de GAL-3 ocorre de
maneira muito mais importante que a nuclear. Em adenocarcinoma de cólon foi
encontrada associação entre a localização de GAL-3 e o grau de diferenciação
celular. Contudo, nos tumores de tiróide, benignos ou malignos, há expressão
predominantemente citoplasmática, sem relação com agressividade
histopatológica ou estado de dediferenciação (37).
Quanto aos resultados tão divergentes entre os diferentes estudos para
distinção de lesões foliculares, alguns aspectos metodológicos merecem
40
consideração: (1) uso de diferentes critérios de positividade/malignidade entre os
estudos; (2) uso de critérios histológicos distintos para definição de lesões
foliculares; (3) obtenção de anticorpos monoclonais de diferentes fontes; (4)
utilização de sistemas de detecção imunohistoquímicos com e sem biotina.
Apenas um estudo comparou anticorpos monoclonais para GAL-3 de
diferentes empresas. Foram estudados casos de carcinoma folicular e não foi
encontrada diferença na expressão da lectina (38). Os autores descrevem apenas
a ocorrência de maior coloração de fundo com anticorpo da empresa Novocastra.
Vale ressaltar que este não era o objetivo do estudo e que foi feito na tentativa de
atenuar este efeito ao comparar seus resultados com os de outros centros.
Outro fator interferente pode ser o sistema de detecção utilizado pela
grande maioria dos autores, inclusive no presente estudo. São métodos de
detecção baseados em biotina. Na glândula tiróide, as células oxifílicas são ricas
em biotina endógena e a imunohistoquímica para GAL-3 pode promover
resultados falso-positivos em lesões celulares oxifílicas quando baseada em
métodos de detecção com biotina, especialmente quando é necessária a
recuperação antigênica induzida por calor (39,40). Os centros que obtêm os
melhores resultados com GAL-3 na diferenciação de lesões foliculares utilizam
sistemas de detecção sem biotina.
Martins et al, utilizando a técnica de RT-PCR quantitativa, mostraram
positividade de GAL-3 em 80% das amostras de bócio multinodular e em 60% das
amostras de adenoma folicular (41). Outros estudos também descreveram
expressão de GAL-3 em lesões foliculares benignas, em tiróide normal e doença
de Graves (42,43,44). Sabe-se que há expressão de GAL-3 no endotélio, e que
41
pode estar aumentada em histiócitos e outras células inflamatórias. Assim, é
possível que ocorra uma contaminação da amostra tecidual com células não
tumorais que expressam GAL-3 e, através da RT-PCR, seriam selecionados como
casos positivos para GAL-3. Na imuno-histoquímica, é possível identificar as
células tumorais e considerar, ou não, a expressão de áreas distintas. Nos casos
avaliados, houve expressão de GAL-3 em células não-tumorais apenas em áreas
de tiroidite ou em histiócitos, de maneira isolada. Estudo recente comparou a
expressão de GAL-3 através das técnicas de RT-PCR e imuno-histoquímica. Os
autores descrevem que a expressão em nível protéico foi pouco maior do que a
molecular, através da quantificação de mRNA, nos casos de carcinoma papilífero
(45).
Outro aspecto de interesse quanto à positividade para GAL-3 em alguns
casos de adenoma folicular é a especulação que possam representar lesões
malignas, mas ainda sem identificação de invasão capsular ou vascular. Embora
os mecanismos moleculares da tumorigênese não estejam completamente
elucidados, a observação de que lesões benignas como bócio multinodular
apresentam focos de expansão clonal, sugerem um estágio nas várias etapas da
possível evolução de bócios e adenomas para carcinoma (46). Assim, os
adenomas positivos para GAL-3 poderiam se tratar de lesões malignas em uma
etapa sem invasão histologicamente identificável.
Há, ainda, a hipótese de que a marcação nas células adenomatosas seja
influenciada por secreção de citocinas por linfócitos em áreas de tiroidite (47).
Contudo, em nenhum dos nossos três casos positivos de AF havia presença de
42
tiroidite. Não houve interferência da presença de tiroidite nas avaliações de
expressão de GAL-3, tanto nos casos benignos quanto nos malignos.
O diagnóstico da variante folicular do carcinoma papilífero não é fácil, como
demonstrada pela grande variabilidade entre observadores, mesmo entre
patologistas endócrinos experientes (48). As características deste tumor que mais
dificultam seu diagnóstico são: (1) um padrão de distribuição multifocal ao invés de
difuso das características nucleares de carcinoma papilífero, e (2) a forma mais
comumente encontrada é a encapsulada que é uma lesão solitária com ausência
de qualquer característica invasiva (22). A GAL-3 mostrou ser um ótimo marcador
para esta variante de carcinoma papilífero, podendo ser utilizada na
caracterização de nódulos suspeitos à histologia.
Considerando apenas a variante oxifílica de adenoma e carcinoma folicular,
Nascimento et al mostraram expressão maior de GAL-3 em carcinomas (59 x
7,1%) (49). Volante et al relatam em uma grande série de lesões oxifilicas valores
de sensibilidade de 94% e especificidade de 87% (50). Contudo, no presente
estudo, encontramos apenas um caso positivo entre 14 adenomas oxifílicos e
outro, dos 04 carcinomas foliculares variante oxifílica.
Alguns estudos têm sido publicados utilizando GAL-3 associada à PAAF,
por imuno-citoquímica, em nódulos de tiróide. Em estudo multicêntrico e
prospectivo, Bartolazzi et al descrevem valores de sensibilidade, especificidade e
acurácia de 100%, 98% e 99%, respectivamente, na distinção de lesões benignas
e malignas da tiróide de material citológico de PAAF (51). Porém, estudo recente,
não conseguiu reproduzir tais resultados, alcançando valores de sensibilidade de
89%, especificidade de 75% , VPP, 74% e VPN, 89%, avaliando PAAF de lesões
43
foliculares com diagnósticos histopatológicos de adenoma e carcinoma folicular
(52).
Finalmente, estudos mais recentes têm utilizado painéis de marcadores,
incluindo GAL-3, para tentar melhorar a sensibilidade e especificidade. Incluem-se
os marcadores CITED-1, CK19, HBME-1, CD26, heparanase, entre outros (53-58).
A associação de diferentes marcadores parece ser a área mais promissora para
avaliação de lesões suspeitas.
Concluímos que a galectina-3 é um bom marcador para CPFV e apresenta
elevados valores preditivos negativo e positivo. Pode ser útil, assim, na avaliação
de nódulos de tiróide que apresentem características citohistológicas típicas de
carcinoma papilífero, mas de maneira dispersa ou escassa. Não deve ser utilizada
para distinção de adenoma e carcinoma folicular da tiróide.
44
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