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Aus der Arbeitsgruppe Immunologie
der Tierärztlichen Hochschule Hannover
Untersuchungen zum Einfluss von parasitären
Antigenen auf die Typ-I-Allergie beim
Sommerekzem des Pferdes
INAUGURAL-DISSERTATION
zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin
(Dr. med. vet.)
durch die Tierärztliche Hochschule Hannover
Vorgelegt von
Julia Elisabeth Heselhaus
aus Bonn
Hannover 2005
Wissenschaftliche Betreuung: Univ.-Prof. Dr. Dr. h.c. W. Leibold
Erster Gutachter: Univ.-Prof. Dr. Dr. h.c. W. Leibold
Zweiter Gutachter: Apl.-Prof. Dr. med. vet. A. Tenter
Tag der mündlichen Prüfung: 30. Mai 2005
Zur Erinnerung an Faxa, Snaelda, Jaka und Drottning
Für meinen Vater,
der mir ermöglichte, das zu werden,
was ich bin.
Inhaltsverzeichnis
1 EINLEITUNG UND ZIELSETZUNG 13
2 LITERATURÜBERSICHT 15
2.1 DIE VERSCHIEDENEN ALLERGIEFORMEN 15
2.2 DAS SOMMEREKZEM – EINE TYP-I-ALLERGIE DES PFERDES 17
2.3 DER MECHANISMUS DER TYP-I-REAKTION 20
2.4 DAS TH1-TH2-MODELL 22
2.5 TYP-I-IMMUNMECHANISMEN DER PARASIT-WIRT-INTERAKTION 24
2.5.1 TYP-I-HYPERSENSITIVITÄTSREAKTION 25
2.5.2 „SELBSTHEILUNGREAKTION“, „SELF CURE“ 26
2.5.3 ANDERE FORMEN DER ANTIPARASITÄREN TYP-I-REAKTION 27
2.6 BEDEUTUNG DER IMMUNGLOBULIN-ISOTYPEN BEI DER HELMINTHENABWEHR 28
2.7 IMMUNMODULATION DER ALLERGISCHEN TYP-I-REAKTION DURCH HELMINTHEN 31
3 MATERIAL UND METHODEN 34
3.1 PROBANDEN 34
3.1.1 PROBANDEN DER ARBEITSGRUPPE IMMUNOLOGIE 34
3.1.2 ZUSÄTZLICHE PROBANDEN 35
3.1.3 HALTUNGS- UND FÜTTERUNGSBEDINGUNGEN 36
3.2 GERÄTE 36
3.3 MATERIAL 37
3.3.1 VERBRAUCHSMATERIALIEN 37
3.3.2 CHEMIKALIEN UND REAGENZIEN 38
3.3.3 ANTIKÖRPER UND SEREN 40
3.3.4 ALLERGENE 41
3.3.5 MEDIKAMENTE 42
3.3.6 PUFFER, GEBRAUCHSLÖSUNGEN UND NACHWEISREAGENZIEN 42
3.3.7 SOFTWARE ZUR DATENAUSWERTUNG 47
3.4 METHODEN 48
3.4.1 VERSUCHSAUFBAU 48
3.4.2 BLUTENTNAHME 50
3.4.3 FUNKTIONELLER IN-VITRO-TEST (FIT) ZUR BESTIMMUNG DER
SENSIBILISIERUNG BASOPHILER GRANULOCYTEN 50
3.4.4 IMMUNISIERUNG 56
3.4.5 ENTWURMUNG 56
3.4.6 ELISA (ENZYME-LINKED IMMUNOSORBENT ASSAY) 56
3.4.7 CORTISONAPPLIKATION 60
3.4.8 NEMATODENNACHWEIS 60
3.4.9 ALLERGENPRÄPARATION (CYATHOSTOMINAE SPP.) 61
4 ERGEBNISSE 63
4.1 MODULATION DER SENSIBILISIERUNG DER BASOPHILEN GRANULOCYTEN DURCH
IMMUNISIERUNG MIT DEN REKOMBINANTEN PROTEINEN „TCA“ UND „TCB“ 63
4.1.1 PARADOXE REAKTION DER VERSUCHSPFERDE AUF DIE IMMUNISIERUNG MIT
DEN REKOMBINANTEN PROTEINEN TCA UND TCB 64
4.1.2 AUSWIRKUNGEN DES THERAPEUTISCHEN METHYLPREDNISOLONS NACH
IMMUNISIERUNG 67
4.2 VERLAUF DER ALLERGEN- UND ANTIGENSPEZIFISCHEN SENSIBILISIERUNG ÜBER
EINEN LÄNGEREN ZEITRAUM 76
4.2.1 IMMUNISIERTE PFERDE 77
4.2.2 KONTROLLGRUPPE 79
4.3 ZUR ENTWICKLUNG DER NEMATODENBELASTUNG 81
4.4 MODULATION DER SENSIBILISIERUNG DER BASOPHILEN GRANULOCYTEN DURCH
ANTHELMINTHISCHE BEHANDLUNG 85
4.4.1 GESAMTHISTAMIN IN DEN ERSTEN DREI WOCHEN NACH ANTHELMINTHISCHER
THERAPIE 86
4.4.2 VERÄNDERUNGEN IN DEN FUNKTIONELLEN SENSIBILISIERUNGEN NACH
ANTHELMINTHISCHER BEHANDLUNG (FIT) 88
4.4.3 VERÄNDERUNGEN BEI EINEM SCHWACH BELASTETEN PFERD OHNE HOHEN
INFEKTIONSDRUCK 94
4.4.4 VERÄNDERUNGEN IN DEN FUNKTIONELLEN SENSIBILISIERUNGEN NACH
ANTHELMINTHISCHER BEHANDLUNG UND FOLGEND METHYLPREDNISOLON 96
4.4.5 VERÄNDERUNGEN IN DEN SENSIBILISIERUNGEN NACH METHYLPREDNISOLON
OHNE VORHERGEHENDE ANTHELMINTHISCHE BEHANDLUNG 101
4.5 SENSIBILISIERUNG GEGEN CYATHOSTOMINAE SPP. 105
4.6 ZUM ISOTYPEN-ELISA (ENZYME-LINKED IMMUNOSORBENT ASSAY) 107
4.6.1 ELISA ZUM NACHWEIS VON EQUINEN IMMUNGLOBULINEN GEGEN TCA UND
TCB 110
4.6.2 ELISA ZUM NACHWEIS VON EQUINEN IMMUNGLOBULINEN GEGEN
CYATHOSTOMINAE SPP. 112
4.6.3 ELISA ZUR UNTERSUCHUNG DES VERLAUFS DES GESAMT-IGE-TITERS BEI
AUSGEWÄHLTEN PFERDEN 117
4.6.4 VERHÄLTNIS VON SPEZIFISCHEM IGE ZU GESAMT-IGE 119
4.7 BEZIEHUNGEN ZWISCHEN SPEZIFISCHEN SENSIBILISIERUNGEN DER BASOPHILEN
GRANULOCYTEN UND ELISA-TITERN 120
4.7.1 BEEINFLUSSUNG DER FUNKTIONELLEN, SPEZIFISCHEN SENSIBILISIERUNG VON
BASOPHILEN DURCH IMMUNGLOBULINE BESTIMMTER SPEZIFITÄT 120
4.7.2 BEEINFLUSSUNG DER FUNKTIONELLEN SENSIBILISIERUNG VON BASOPHILEN
DURCH IGE-TITERVERHÄLTNISSE 122
5 DISKUSSION 124
5.1 ZUR PARADOXEN REAKTION DER PFERDE IM RAHMEN DER IMMUNISIERUNG MIT
DEN REKOMBINANTEN PARASITENPROTEINEN TCA UND TCB 124
5.2 ZUR MODULATION DER SENSIBILISIERUNG DER BASOPHILEN GRANULOCYTEN
DURCH ANTHELMINTHISCHE BEHANDLUNG DER PFERDE 126
5.3 ZUR MODULATION DER SENSIBILISIERUNG DER BASOPHILEN GRANULOCYTEN
DURCH METHYLPREDNISOLON 130
5.4 ZUM ISOTYPEN-ELISA 132
6 ZUSAMMENFASSUNG 136
7 SUMMARY 139
8 LITERATURVERZEICHNIS 142
Glossar und Verzeichnis der in Text und Abbildungen verwendeten Abkürzungen
+ Standardabweichung α anti- (gerichtet gegen) Abb. Abbildung Ag Antigen Allergen Ein Antigen, das in einem entsprechend sensibilisierten Individuum
eine Typ-I-Überempfindlichkeitsreaktion hervorruft Antigen Ein Fremdstoff, der eine Immunantwort induziert. Hier auch verwendet
als Synonym für TcA und TcB Ak Antikörper Aliquots aliquote Teile, gleiche Anteile einer Probe a. med. ante medicationem (vor Medikation) Aqua dest. Aqua destillata (destilliertes Wasser) Aqua tridest. Aqua tridestillata (dreifach destilliertes Wasser) B0 histaminfreie Probe im RIA; da es sich bei dem verwendeten System
um einen kompetitiven RIA handelt, wird hier durch den spezifischen Antikörper die maximal erfassbare Menge an 125J-markiertem Histamin bestimmt, ohne dass ein Probenhistamin konkurriert; dient als Bezugs-größe (100%) für die Probenwerte, in denen ggf. das zu bestimmende konkurrierende Histamin enthalten ist
Bq Becquerel, SI-Einheit für die Aktivität einer radioaktiven Substanz, 1 Bq = 1 Zerfall pro Sekunde; alte Einheit Curie, 1 Ci = 3,7 x 1010Bq
BSA Bovines Serumalbumin bzw. beziehungsweise ca. cirka °C Grad Celsius Challenge engl., Belastungsinfektion, Provokation, Konfrontation Cn Culicoides nubeculosus Coating Beschichtung, hier Beschichtung der Plastikoberfläche der
Mikrotiterplatte, erster Schritt im ELISA cpm counts per minute (Zählimpulse pro Minute) Cup Reaktionsgefäß D Dalton (1,66018 x 10-24g) d dies, lateinisch: Tag dl Deziliter (100 ml) DMSO Dimethylsulfoxid Dualmodus Messung der Extinktion von Flüssigkeiten im Photometer (ELISA) bei
zwei Wellenlängen (Testfilter und Referenzfilter). Ermöglicht die Elimination von Messfehlern durch Schmutz, Kratzer oder Feuchtigkeit auf der Mikrotiterplatte.
EDTA Ethylen-Diamin-Tetra-Acetat “Ekzemer” an Sommerekzem erkrankte Pferde (auch außerhalb der klinisch
manifesten Periode) ELISA Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (Enzym-gekoppelter
Immunadsorbtionstest) engl. englisch
Glossar
et al. et alii, lateinisch : und andere Eq/eq equines, equiner, equine evtl. eventuell Fa. Firma Fc fragment crystallizable; durch Disulfidbrücken verbundene C-terminale
Domänen (C2+C3 bzw. C2 - C4) der konstanten Immunglobulinkette, ein Teilbereich dieses Ig-Fragmentes kann an geeignete Fc-Zellrezeptoren binden.
FcεRI Fcε-Rezeptor I (Rezeptor, der den Fc-Teil von IgE mit hoher Affinität bindet, Bindungsaffinität 10-10 mol/l)
FcγRI Fcγ-Rezeptor I (Rezeptor, der den Fc-Teil von IgG mit hoher Affinität bindet, Bindungsaffinität 10-8 mol/l)
FcγRII Fcγ-Rezeptor II (Rezeptor, der den Fc-Teil von IgG bindet, Bindungsaffinität 10-7 bis 10-6 mol/l)
FcγRIII Fcγ-Rezeptor III (Rezeptor, der den Fc-Teil von IgG bindet, Bindungsaffinität 10-7 bis 10-6 mol/l)
FIT Funktioneller In-vitro-Test für Typ-I-Allergien g Gramm gαh, gah goat anti horse (Ziege-anti-Pferd)-Antikörper ggf. gegebenenfalls ggr. geringgradig h hora (Stunde) high responder Organismus, der auf ein bestimmtes Antigen mit einer starken
Immunantwort reagiert hgr. hochgradig H+L schwere (H=heavy) und leichte (L=light) Immunglobulinketten IFN Interferon Ig Immunglobulin IgA Immunglobulin A IgE Immunglobulin E IgG Immunglobulin G IL Interleukin i.v. intravenös kDa Kilodalton (103 Dalton) kg Kilogramm KGW Körpergewicht l Liter lfd. laufend log dekadischer Logarithmus low responder Organismus, der auf ein bestimmtes Antigen mit einer schwachen
Immunantwort reagiert µ mikro (x 10-6) µg Mikrogramm µl Mikroliter m milli (x 10-3) M mol/l mAk monoklonaler Antikörper mg Milligramm mgr. mittelgradig
Glossar
min Minuten ml Milliliter mmol Millimol Mo. Monate mOD milli optische Dichte, Einheit für im ELISA-Photometer gemessene
Extinktionen MW Mittelwert n Stichprobenumfang NHS-Biotin N-Hydroxysuccinimido-Biotin „Nichtekzemer“ nicht an Sommerekzem erkrankte Pferde NK-Zellen natürliche Killerzellen ng Nanogramm nm Nanometer (1x10-9m) Nr. Nummer NSB nicht spezifische Bindung; messbare Radioaktivität im RIA, die nicht
durch spezifische Bindung an Antiserum zustande kommt PBS phosphate buffered saline (phosphatgepufferte Kochsalzlösung) PEG Polyethylenglykol pH negativer dekadischer Logarithmus der Wasserstoff-Ionenkonzentration Pipes Piperazine-N,N´-bis[2-ethanesulfonic]acid (Piperazin-N,N’-bis[2-
ethansulfonsäure) pg Pikogramm (10-12 g) p. med. post medicationem (nach Medikation) post lateinisch: nach prae lateinisch: vor Pred. Prednisolon (hier für Methylprednisolon) Release Freisetzung, hier Histaminfreisetzung aus basophilen Granulozyten RIA Radioimmunoassay (Radioimmuntest) rpm rotation per minute (Umdrehungen pro Minute) RT Raumtemperatur s. siehe SE Sommerekzem sek. Sekunden spp. species (Arten) Tab. Tabelle TcA rekombinantes Protein „A“ aus dem Nematoden Trichostrongylus
colubriformis TcB rekombinantes Protein „B“ aus dem Nematoden Trichostrongylus
colubriformis TcA/TcB-Pferde mit TcA und TcB immunisierte Pferde TH-Zelle T-Helferzelle TH1-Zelle, TH2-Zelle Subpopulationen von T-Helfer-Zellen TMB Tetramethylbenzidin TNF Tumornekrosefaktor Tris Trishydroxymethylaminomethan U Unit (Einheit) u.a. unter anderem well Mikrotiterplattenvertiefung einer ELISA-Platte v.a. vor allem
Glossar
vergl. vergleiche Wo. Wochen Wk Wurmkur xg multipliziert mit der Erdbeschleunigung (9,81 m/sek2) z. B. zum Beispiel
Einleitung und Zielsetzung 13
1 Einleitung und Zielsetzung
Weltweit, jedoch insbesondere in den Industrieländern, nehmen Überempfindlich-
keitsreaktionen vom Soforttyp (Typ-I-Allergie) zu. Vielfältige Forschungen beschäftigen sich
mit dem Pathomechanismus, der einen oft harmlosen Fremdstoff als gefährlich einstuft und
überschießend darauf reagiert. Im Grunde handelt es sich um einen physiologischen
Schutzmechanismus des Körpers, der eine wichtige Rolle insbesondere in der Auslösung und
Koordination von Entzündungen, z. B. der Abwehr von Parasiten, spielt. Er ist einer – noch
weitgehend unbekannten – Regulation unterworfen. Diese Regulation scheint bei der Typ-I-
Allergie verändert oder entglitten zu sein. Dabei ist es kein „Entweder-oder-Prinzip“,
entweder Parasitenabwehr oder allergische Erkrankung, denn beide Formen können
gleichzeitig im selben Organismus vorkommen.
Auch beim Pferd treten Schutz und Pathologie der Typ-I-Immunreaktion nebeneinander auf.
Nahezu alle Pferde in Deutschland, insbesondere die auf der Weide und in einer Herde
gehaltenen Tiere, sind mit Magen-Darm-Parasiten befallen. Bei ihnen werden wie bei anderen
Tierarten und beim Menschen normalerweise Schutzmechanismen wirksam, die sich mit
diesen Parasiten ständig auseinandersetzen. Ein Teil dieser Pferde entwickelt aus bisher
unbekannten Gründen allergische Erkrankungen, z. B. das sog. „Sommerekzem“. Hierbei
handelt es sich zumeist um eine Überempfindlichkeitsreaktion vom Typ I gegen Bestandteile
blutsaugender Insekten, wobei die Gnitzenart Culicoides nubeculosus neben anderen Insekten
in Deutschland eine besonders prägnante Rolle spielt. Die betroffenen Pferde scheuern sich
aufgrund des starken Juckreizes, der durch die allergische Reaktion ausgelöst wird, an Mähne,
Schweif und anderen Lokalisationen oft blutig. Neben der erheblichen Beeinträchtigung des
Allgemeinbefindens der Tiere kann die Erkrankung zur eingeschränkten Nutzung der Pferde
führen. In den schlimmsten Fällen muss ein Tier aus Tierschutzgründen euthanasiert werden.
Aus der Humanmedizin ist bekannt, dass bei endemischen Helminthosen die Inzidenz von
Allergien signifikant erniedrigt ist (so z. B. in Entwicklungsländern) (BELL, 1996, COOKSON,
1997), während einer anthelminthischen Behandlung oft ein Neuauftreten von allergischen
Erkrankungen folgt (STEIN, 1999). Diese Beobachtung machten auch Pferdebesitzer, die stark
verwurmte Pferde behandelten und kurze Zeit später allergische Erkrankungen bei ihren
Tieren feststellten.
Bisher gibt es keine überzeugende Erklärung, warum ein prinzipiell gleicher Typ-I-
Mechanismus eine schützende Immunabwehr organisiert, ohne in Anwesenheit des
auslösenden Parasiten in eine überschießende Allergie auszuarten, während er im selben
Einleitung und Zielsetzung 14
Individuum gegen andere Antigene (z. B. Insektenkomponenten) zum klinischen Bild einer
Typ-I-allergischen Dermatitis führt.
Ziel dieser Arbeit war es daher, diese Zusammenhänge und Unterschiede zwischen der
physiologischen Helminthenabwehr und der allergischen Typ-I-Reaktion am selben
Organismus näher zu untersuchen. Es stellten sich in diesem Projekt folgende Kernfragen:
o Welchen Einfluss haben die Helminthenbelastung und ihre Beseitigung auf die Allergie
und auf die an ihr beteiligten Effektorzellen?
o Kann die Reaktionsfähigkeit von Effektorzellen der Typ-I-Reaktion gegenüber Allergenen
durch rekombinante Helminthenproteine, eine natürliche Helminthenbelastung oder
anthelminthische Behandlung verändert werden? Wenn ja, wie lange kann der
Organismus diesen Zustand aufrechterhalten?
o Lassen sich aus der Humanmedizin und bei anderen Tierarten gewonnene Daten auch auf
das Pferd übertragen?
o Welche Rolle spielen die verschiedenen Antikörper-Isotypen, die möglicherweise am
Mechanismus der Typ-I-Reaktion beteiligt sind?
Zur Beantwortung eines Teils dieser Fragen standen durch Zusammenarbeit mit der
Forschungsgruppe um R. Shaw und W. Hein in Neuseeland rekombinante Proteine aus
Trichostrongylus colubriformis zur Verfügung. In Vorversuchen konnte bereits gezeigt
werden, dass einige Pferde trotz des nur seltenen Vorkommens dieses Wiederkäuerparasiten
beim Pferd Antikörper gegen diese Proteine hatten.
Literaturübersicht 15
2 Literaturübersicht
2.1 Die verschiedenen Allergieformen
CLEMENS VON PIRQUET (1906) definierte den Begriff „Allergie“ als „eine veränderte
Fähigkeit des Körpers, auf eine Fremdsubstanz zu reagieren“. Diese sehr allgemeine
Definition wird heute deutlich eingegrenzt als „eine Krankheit, die durch eine überschießende
Immunreaktion gegenüber einem Antigen ausgelöst wird“ (JANEWAY ET AL., 2002). Mit
Allergie, Hypersensibilität oder Überempfindlichkeit werden nachteilige Immunreaktionen
bezeichnet, die eigene Gewebe schädigen und schwerwiegende Erkrankungen auslösen
können. GELL und COOMBS (1968) teilten die verschiedenen Überempfindlichkeitsreaktionen
in vier Typen ein; inzwischen wird eine fünfte Form postuliert.
Die Typ-I-Reaktion oder Sofortreaktion ist allgemein die bekannteste. Hierbei kann es bereits
in kürzester Zeit (wenige Minuten) nach Kontakt mit dem allergieauslösenden Stoff
(Allergen) zu den Symptomen der Hypersensitivität kommen. Typische Symptomatiken
dieser Allergieform sind z. B. Urticaria, Asthma, Juckreiz oder Gewebsschwellung. Bei dieser
Reaktion spielen Antikörper des Immunglobulinisotypen E (IgE) eine zentrale Rolle, jedoch
nur, wenn sie über Fcε-Rezeptoren an gewebsständige Mastzellen und im Blut zirkulierende
basophile Granulocyten gebunden sind. Freie IgE-Antikörper können keine allergischen
Reaktionen auslösen. Werden mindestens zwei oder mehrere Fcε-Rezeptoren I über ihre
gebundenen IgE-Moleküle durch ein Allergen, welches diese spezifisch erkennen,
kreuzvernetzt, lösen sie durch ihre transmembranalen γ-Ketten Signale in der Zelle aus, die
u.a. zur Freisetzung von Mediatoren führen. Zu diesen Mediatoren zählen neben Histamin und
Proteasen als entzündungsfördernde Botenstoffe auch Heparin, die zusammen mit neu
gebildeten Leukotrienen und Cytokinen (z. B. IL-4) für eine Verstärkung und
Aufrechterhaltung der Reaktion sorgen. Es kommt durch die Mediatorenfreisetzung zu einer
Entzündungsreaktion mit gesteigerter Durchblutung und Gefäßdurchlässigkeit, Ödemen,
Rötung und – bei einigen Allergieformen – histamininduziertem Juckreiz sowie
Einwanderung von eosinophilen Granulocyten und anderen Entzündungszellen an den Ort der
allergischen Reaktion. Bekannte Krankheitsbilder z. B. sind beim Menschen der
Heuschnupfen (allergische Rhinitis) oder beim Pferd das Sommerekzem (allergische
Insektendermatitis). Eine dramatische Form der Typ-I-Überempfindlichkeitsreaktion ist die
bei Mensch und Tier auftretende Anaphylaxie, bei der diese Reaktion nicht lokal, sondern
systemisch stattfindet und lebensbedrohend sein kann. Die ursprüngliche physiologische
Literaturübersicht 16
Funktion dieses Mechanismus ist die Warnung des Immunsystems vor „Gefahren“ und deren
Abwehr durch die Einleitung und Regulation von Entzündungsvorgängen. Dies ist
beispielsweise bei der Bekämpfung parasitärer Infektionen (z. B. Helminthosen) bekannt. Sie
ist prinzipiell auch gegenüber anderen „Fremdstrukturen“ und sogar gegen veränderte
körpereigene Strukturen möglich.
Bei der Typ-II-Reaktion stehen antikörpervermittelte Zytotoxizitätsmechanismen im
Mittelpunkt. Antikörper der Isotypen IgG und IgM binden spezifisch an zellgebundene
Antigene und aktivieren über ihren Fc-Teil Phagocyten, Natürliche-Killer-Zellen (NK-Zellen)
oder den klassischen Weg der Komplementkaskade. Diese führen zur Eliminierung
(hauptsächlich Phagocytose) der antigentragenden Zelle. Bekannte Beispiele für diese
Allergieform sind Penicillinunverträglichkeiten und Pemphigus vulgaris. Die
immunhämolytische Anämie oder die neonatale Isoerythrocytolyse beim Jungtier fallen
ebenfalls unter diesen Mechanismus. Dabei liegt eine Unverträglichkeit der Blutgruppen von
Blutspender und -empfänger bzw. Muttertier und Neugeborenen vor, bei der gegen andere
Blutgruppenantigene gerichtete Antikörper des Spenders bzw. des Kolostrums auf den
Erythrocyten binden und ihre Eliminierung einleiten.
Ebenso wie bei der vorhergehenden Reaktionsform spielen auch bei der Typ-III-
Immunreaktion Antikörper eine zentrale Rolle, jedoch binden sie hier primär an meist lösliche
Antigene und bilden initial lösliche Immunkomplexe. Diese Komplexe lagern sich in
Geweben und Gefäßwänden, insbesondere in den Basalmembranen kleinerer Gefäße, ab. Sie
binden an Zellen mit geeigneten Fc-Rezeptoren (hauptsächlich Granulocyten, Monocyten,
Makrophagen und Mastzellen) und aktivieren bei Beteiligung von komplementaktivierenden
Isotypen das Komplementsystem. Durch freigesetzte chemotaktische Peptide werden
neutrophile Granulocyten angezogen, die über freie Radikale, Enzyme und Cytokine
inflammatorisch wirken und das Gewebe schädigen. Es werden bei diesem Typ eine
systemische und eine lokale Form unterschieden. Die Serumkrankheit ist eine systemische
Typ-III-Reaktion, die mit Arthritiden und Glomerulonephritis einhergeht, während z. B. die
sog. Hay Sickness des Pferdes oder die Arthus-Reaktion lokale Ausprägungsformen
darstellen, bei der sich die Immunkomplexe lokal ablagern – im Falle der Hay sickness in der
Lunge, was zu einer Ansammlung von Flüssigkeit, Proteinen und Zellen in den
Alveolarwänden führt und den Gasaustausch behindert.
Immunreaktionen des Typs IV können Allergien vom verzögerten Typ bewirken. Hierbei sind
im Gegensatz zu den anderen Formen keine Antikörper beteiligt, sondern es handelt sich um
Literaturübersicht 17
rein zellvermittelte Mechanismen, die aus den Interaktionen von Antigen,
antigenpräsentierenden Zellen (APC) und T-Zellen resultieren. Antigenspezifische
inflammatorische CD4-T-Zellen, die nach dem Erstkontakt mit dem Allergen entwickelt
werden, lösen bei erneutem Kontakt nach Erkennung der Allergene, die durch APC
präsentiert werden, eine überschießende infiltrative Entzündung des Gewebes aus, deren volle
Ausprägung 24 bis 48 h in Anspruch nimmt. Neben der klassischen Tuberkulin- oder auch der
Mallein-Probe, bei der ein Organismus nach Infektion bereits spezifische CD4-T-Zellen
gegen Mycobacterium tuberculosis bzw. Burkholderia mallei gebildet hat und auf subcutan
injizierte Antigene mit einer lokalen Typ-IV-Reaktion antwortet, zählen auch
Kontaktallergien (z. B. Nickel) zu diesem Typ. Bei den Kontaktüberempfindlichkeiten binden
Haptene, die an sich zu klein sind, um als Allergen wirksam werden zu können, an
körpereigene Proteine und verbinden sich mit ihnen zu allergenen Hapten-Carrier-Komplexen
(JANEWAY ET AL., 2002, TIZARD, 2004).
Bei der Typ-V-Reaktion ist das „allergische“ Geschehen auf die alleinige Bindung von
Antikörpern auf eine körpereigene Struktur beschränkt. Es sind keine sekundären
Immunmechanismen beteiligt. Dabei bildet der Organismus möglicherweise kreuzreagierende
Antikörper, die auch körpereigene Epitope erkennen und an sie binden. Durch die Bindung
eines Antikörpers z. B. an einen Rezeptor kann es zur Aktivierung oder Hemmung dieses
Rezeptors kommen. Im Falle der Myasthenia gravis werden so die Acetylcholin-Rezeptoren
blockiert, bei der Basedow’schen Krankheit die TSH-Rezeptoren überstimuliert (LEIBOLD,
2004).
2.2 Das Sommerekzem – eine Typ-I-Allergie des Pferdes
Das Krankheitsbild des Sommerekzems ist schon lange bekannt. Der früheste Bericht stammt
von LECOQ, Frankreich, aus dem Jahre 1842 (Ref. in: UNKEL, 1985), ein anderer von DATTA
aus Indien (1936) (Ref. in: UNKEL, 1985). Durch die weite Verbreitung dieser saisonal
auftretenden Dermatitis ist sie unter vielen Bezeichnungen beschrieben (z. B. „Kasen“,
„Queensland itch“, „Sweet itch“, „Insect bite dermal hypersensitivity“, „Summer seasonal
recurrent dermatitis“, „Ardeurs“ oder „Dermite estivale recidivante“). Prädispositionen in
Alter, Fellfarbe oder Geschlecht der betroffenen Pferde lassen sich nach UNKEL (1985) und
MARTI (1992) nicht feststellen, obwohl LANGE (2004) ein selteneres, dafür aber umso
stärkeres Auftreten bei Füchsen feststellte. Das Sommerkezem wird bei allen Rassen
beobachtet. So erkranken ebenso Islandpferde wie arabische Vollblüter, Friesen, deutsche
Literaturübersicht 18
Warmblüter, Quarter Horses oder verschiedene Ponyrassen. Innerhalb einzelner
Pferdepopulationen tritt das Sommerekzem mit Prävalenzen von 11-60% auf (WILSON ET AL.,
2001). In Deutschland wird es insbesondere mit dem Islandpferd in Verbindung gebracht und
kommt hier mit unterschiedlich angegeben Prävalenzen vor. So berichtet RÜSBÜLDT (2001)
von 60-70 % der aus Island nach Deutschland importierten Tiere, andere Quellen von nur
25% (UNKEL, 1985), die nach dem Eintreffen in Deutschland an der saisonalen Dermatitis
erkranken. BROSTROM ET AL. (1987) geben an, dass aus Island exportierte Pferde signifikant
häufiger erkranken als nicht auf Island geborene Tiere (26,2% gegenüber 6,2% in Schweden).
Auch sollen die klinischen Symptome bei ihnen stärker ausgeprägt sein als bei den auf dem
Kontinent geborenen Tieren. Eine Rolle spielt neben den Umwelt- und Haltungsbedingungen
die Vererbung der Erkrankung, nach UNKEL (1985) und MARTI (1992) wird sie multifaktoriell
vererbt. LANGE (2004) gibt eine Heritabilität von 0,36 für das Auftreten und von 0,34 für den
Schweregrad des Ekzems an. Nach epidemiologischen Studien tritt die Dermatitis
insbesondere bei robust gehaltenen Rassen ab einem Alter von zwei Jahren auf. Die meisten
Tiere erkranken vor Erreichen des sechsten Lebensjahres, seltener in einem höheren Alter
(WILSON ET AL., 2001).
Die klinischen Symptome des Sommerekzems ergeben sich aus dem mehr oder weniger
starken Juckreiz, der durch Typ-I-Reaktionen verursacht wird, die wiederum von
Insektenstichen ausgelöst werden. Die entstehenden juckenden Pusteln werden von den
Pferden aufgescheuert, was zu Haarverlust, offenen Wunden und sekundären bakteriellen
Infektionen führen kann. Das Erkrankungsbild kann von Pferd zu Pferd variieren und tritt
bevorzugt an Mähne und Schweif auf. Aber auch an der Bauchnaht, am Kopf, am Rücken und
gelegentlich an den Beinen kann es zu schweren Veränderungen kommen. Bei nachlassendem
Juckreiz können sich Haut und Haar wieder regenerieren. Durch die sich wiederholenden
Entzündungsprozesse kommt es aber zu einer chronischen Pachydermie und Bildung großer
Hautfalten, in einigen Fällen zu chronischer Alopezie. Die Hautfalten sind auch außerhalb der
klinisch manifesten Periode vermehrt für bakterielle oder mykotische Infektionen anfällig
(RÜSBÜLDT, 2001, GEIBEN, 2003).
Die Symptomatik des Sommerekzems beginnt im allgemeinen jedes Jahr erneut im Frühjahr
mit dem Auftreten der ersten allergieauslösenden Insekten (s. u.) und heilt erst vollständig im
Herbst bzw. Winter aus, wenn die Insektenbelastung nicht mehr gegeben ist. Sie ist also auch
von Haltungs- und Witterungsbedingungen abhängig (z. B. Haltung in Stall oder auf der
Weide, für Insekten günstiges oder ungünstiges Klima etc.). Dabei unterliegt die Ausprägung
Literaturübersicht 19
starken inter- und intraindividuellen Schwankungen. GEIBEN (2003) konnte zeigen, dass Tiere
in verschiedenen Jahren ein unterschiedlich starkes klinisches Erscheinungsbild an
unterschiedlichen Lokalisationen zeigten, und dass die Symptomatik zusätzlich
Schwankungen innerhalb der klinisch manifesten Periode zeigen kann. Eine besonders starke
Ausprägung des Ekzems kann in drei Hochphasen im Frühjahr, Hochsommer und Herbst
festgestellt werden. Dazwischen kann eine Mäßigung, teilweise sogar eine Abheilung der
Dermatitis erfolgen. Die Symptomatik folgt also eher einem wellenartigen Verlauf, zeigt aber
über die Jahre hinweg eine deutliche Tendenz zur Verschlechterung. Neben der erheblichen
Beeinträchtigung des Allgemeinbefindens der Tiere kann die Erkrankung zur eingeschränkten
Nutzung der Pferde oder sogar zur Euthanasie aus Tierschutzgründen führen.
Als Auslöser des Sommerekzems sind in erster Linie blutsaugende Insekten der Gattung
Culicoides (Gnitzen) beschrieben (BRAVERMANN ET AL., 1983, HALLDORSDOTTIR ET AL.,
1989, ANDERSON ET AL., 1993, KAUL, 1998), die weltweit vorkommen, aber auch andere
Insekten, z. B. Stomoxys calcitrans, Simulidae spp. oder Tabanus spp. (BAKER und QUINN,
1978, GEIBEN, 2003). Durch ihren Stich bringen sie Stoffe, wahrscheinlich Speichelproteine,
in Kontakt mit Mastzellen in der Haut der Pferde und durch das Blutsaugen auch in den
Blutkreislauf. Auf diese Antigene reagieren einige Pferde mit einer Typ-I-Allergie (FADOK
und GREINER, 1990, KUROTAKI ET AL., 1994, KAUL, 1998, MARTI ET AL., 1992, BRUENNLEIN,
2001) und prägen das klinische Bild des Sommerekzems aus. Alle Pferde, die von Culicoides
spp. gestochen wurden, bilden Immunglobuline des Isotyps G (IgG) gegen
Speicheldrüsenbestandteile dieser Insekten. Bei Tieren mit Sommerekzem konnten jedoch
zusätzlich entsprechende Antikörper des Isotyps E (IgE) nachgewiesen werden (WILSON ET
AL., 2001).
Zur Diagnostik von Typ-I-Allergien und damit des Sommerekzems stehen derzeit neben
anderen indirekten Verfahren (z. B. dem allergenspezifischen IgE-Nachweis aus dem Serum)
als zuverlässigste Methoden der Intrakutantest und ein funktioneller In-vitro-Test zur
Verfügung (KAUL, 1998). Eine wirkungsvolle medikamentelle Therapie gibt es für das
Sommerekzem nicht. Symptomatisch kann kurzfristig mit Corticosteroiden behandelt werden,
die sich jedoch aufgrund der Nebenwirkungen nicht zur Dauertherapie eignen. Auch
Futterzusatzmittel, Insektenrepellentien oder alternative Heilverfahren zeigen in den meisten
Fällen keine zuverlässige Verbesserung (BRUENNLEIN, 2001, RÜSBÜLDT, 2001), so dass
zumeist nur das Eindecken oder Aufstallen der Pferde, also die Trennung von Allergen und
Tier, zu einer Besserung der Symptomatik führt.
Literaturübersicht 20
2.3 Der Mechanismus der Typ-I-Reaktion
Der Mechanismus der Typ-I-Reaktion ist am besten bei Mensch und Maus untersucht, jedoch
konnten Untersuchungen von KAUL (1998), BRUENNLEIN (2001), KOBELT (2001) und GEIBEN
(2003) deutliche Hinweise erbringen, dass dieselben Abläufe auch beim Pferd stattfinden.
Nach Erstkontakt mit Antigen können Th2-Zellen (siehe 2.4) bei B-Zellen durch Produktion
von IL-4, evtl. auch IL-13, sowie Bindung des Rezeptors CD-40 auf B-Zellen einen
Isotypklassenwechsel der daraufhin gebildeten, spezifischen Antikörper von IgM zu IgE und
IgG4 (beim Menschen) bzw. IgG1 (bei der Maus) bewirken. Diese Isotypen, insbesondere das
IgE, spielen in der Sensibilisierung von Basophilen und Mastzellen eine zentrale Rolle. Freie
IgE-Antikörper kommen im Serum und im Gewebe vor und werden schon in
nichtkomplexierter, nicht an Antigen gebundener Form über den hochaffinen Fcε-Rezeptor I
(FcεRI) an gewebsständige Mastzellen oder im Blut zirkulierende basophile Granulocyten
gebunden. Ungebunden hat es beim Menschen im Serum eine Halbwertszeit von zweieinhalb
Tagen und liegt nur in sehr geringen Mengen vor. Kommt es zu einem erneuten Kontakt mit
dem Antigen und wird dieses von den auf der Membran von Mastzellen und Basophilen
gebundenen spezifischen IgE-Antikörpern erkannt, führt die Bindung des Allergens zu einer
Zusammenlagerung der Fcε-Rezeptoren und dadurch zu einer zellaktivierenden
Kreuzvernetzung der an ihnen gebundenen Immunglobuline. Das setzt voraus, dass dieses
spezifische IgE in einer ausreichenden Dichte auf der Zelle vorhanden ist, um es und damit
seine Fcε-Rezeptoren durch ein Antigen zu vernetzen. Ein ausreichendes Vernetzen dieser
Rezeptoren, auch „bridging“ genannt, führt zu einer Aktivierung der Zelle und zu einer
Freisetzung von Mediatoren aus präformierten Granula. Zu diesen Mediatoren zählen u.a.
Histamin, Proteasen, Proteoglykane und Heparin. Weiterhin wird in den so aktivierten Zellen
die Produktion von Leukotrienen, Chemokinen und Cytokinen wie Interleukin-4 (IL-4) oder
IL-13 induziert. Diese freigesetzten Botenstoffe sorgen für Beginn und Steuerung einer
Entzündungsreaktion, deren Folgen im physiologischen Fall z. B. als Durchfall oder
Erbrechen (siehe 2.5), im pathologischen Fall als Symptome der Allergie wahrgenommen
werden. Der vasoaktive Mediator Histamin sorgt z. B. für eine gesteigerte
Kapillarpermeabilität und für eine Vasodilatation. Die Cytokine IL-4 und IL-13 sorgen für
eine Erhaltung der Th2-Reaktion (siehe auch 2.4), die Leukotriene für eine vermehrte
Kontraktilität der glatten Muskulatur (JANEWAY, 2002, TIZARD, 2004).
Reagiert ein Individuum auf ein Antigen mit einer überschießenden, pathologischen Typ-I-
Reaktion und entwickelt entsprechende allergische Symptome, wird das Antigen für dieses
Literaturübersicht 21
Individuum zum „Allergen“ (LEIBOLD, 2004).
Erste Hinweise auf eine Beteiligung mindestens eines weiteren Ig-Isotyps an der Typ-I-
Reaktion erhielt FAGAN (1982), der mit Anti-IgG4-Antikörpern eine Mediatorenfreisetzung
aus humanen basophilen Granulocyten erreichen konnte. KATZ ET AL. (1992) wiesen eine
Aktivierung von Mastzellen nach Kreuzvernetzung von IgG-tragenden Fcγ-Rezeptoren III
(FcγRIII) nach, OKAYAMA ET AL. (2000) konnten dies für den FcγRI zeigen. Auch TKACZYK
(2002) erreichte eine Degranulation von Mastzellen nach Aggregation der hochaffinen FcγRI
durch anti-Rezeptor-Antikörper bzw. Antikörper gegen rezeptorgebundenes IgG, so dass eine
Aktivierung von Mastzellen und Basophilen und somit eine Beteiligung von IgG an der Typ-
I-Reaktion als gesichert angesehen werden kann (TKACZYK ET AL., 2004). Bei der Maus
konnte das IgG1 (DOMBROWICZ ET AL., 1997), beim Menschen das IgG4 (KIEKENS ET AL.,
2000) als Aktivator der Typ-I-Effektorzellen identifiziert werden. Bei IgE-defizienten
Mäusen, die also kein IgE auf der Oberfläche von Mastzellen und Basophilen gebunden
haben konnten, ließ sich dennoch eine Mediatorenfreisetzung aus Mastzellen und
anaphylaktische Reaktionen nachweisen (OETTGEN ET AL., 1994). Auch bei equinen
Basophilen kann über eine Kreuzvernetzung von membrangebundenen IgG durch Anti-IgG-
Antikörper eine Freisetzung von Histamin bewirkt werden (KAUL, 1998, KOBELT, 2001,
BRUENNLEIN, 2001 und GEIBEN, 2003).
Die basophilen Granulocyten erhalten ihre spezifische Sensibilisierung, ihre Fähigkeit,
spezifisch auf Antigene – und im überschießenden Fall auf Allergene – zu reagieren, durch
einen Besatz ihrer membranständigen, aktivierenden Fc-Rezeptoren mit antigenerkennenden
Antikörpern. Aus dem Knochenmark kommende, naive Basophile tragen noch keine
Antikörper auf ihren hochaffinen Fcε- und Fcγ-Rezeptoren. Sobald sie in das Blut gelangen,
besetzen sensibilisierende Immunglobuline des passenden Isotyps die freien Fc-Rezeptoren
sofort. Aufgrund der hohen Affinität der Fcγ/ε-Rezeptoren I lösen sich diese
sensibilisierenden Antikörper nur sehr langsam wieder. Daher ändert sich das
Sensibilisierungsspektrum der Basophilengesamtheit nur sehr langsam über Wochen und
Monate (BRUENNLEIN, 2001, KOBELT, 2001, GEIBEN, 2003). Eine Anwendung von
Corticosteroiden in vivo eliminiert die Basophilen aus dem Blut (TIZARD, 2004, BRUENNLEIN,
2001), so dass die innerhalb kurzer Zeit neu gebildeten Basophilen das aktuelle Spektrum
freier sensibilisierender Antikörper aus dem Serum aufnehmen, sobald sie in das Blut
gelangen (BRUENNLEIN, 2001). Dadurch kann eine Sensibilisierung basophiler Granulocyten
nach einer Corticosteroidapplikation gegenüber der Ausgangssituation völlig verändert sein.
Literaturübersicht 22
Die aktuelle spezifische Sensibilisierung von equinen Basophilen kann in einem von KAUL
(1998) entwickelten Test (Funktioneller In-vitro-Test, FIT) erfasst werden.
2.4 Das Th1-Th2-Modell
MOSMANN ET AL. (1986) schlugen ein Modell von zwei verschiedenen Subpopulationen an T-
Helfer-Zellen (CD4-positive T-Zellen) vor. Je nach Art der produzierten Lymphokine
benannten sie die beiden Varianten als Th1- und Th2-Zellen. Diese beiden Unterpopulationen
werden durch verschiedene antigenpräsentierende Zellen aktiviert, die unterschiedliche
Costimulatoren besitzen. Th1-Zellen, die z. B. intrazelluläre Krankheitserreger bekämpfen,
werden optimal durch Antigen stimuliert, welches durch myeloide Dendritische Zellen und
durch B-Zellen unter Verwendung des Costimulators CD80 präsentiert wird (TIZARD, 2004).
Unter Einfluss von IL-12 und IL-18 produzieren aktivierte Th1-Zellen innerhalb weniger
Stunden IL-2, Interferon-γ (IFN-γ), Tumornekrosefaktor (TNF-β), IL-12 und IL-18 und
agieren primär als Helferzellen der zellvermittelten Immunantwort (T-Zell-Zytotoxizität,
Aktivierung von Makrophagen). Dadurch unterstützen sie die Abwehr intrazellulärer
Pathogene und Organismen wie z. B. Mykobakterien. Th2-Zellen hingegen, die bei der
Abwehr extrazellulärer Organismen eine wichtige Rolle spielen, reagieren optimal auf
Antigen, das durch lymphoide oder plasmacytoide Dendritische Zellen oder Makrophagen
präsentiert wird. Diese Dendritischen Zellen aktivieren die Th2-Zellen zusätzlich über das
Costimulatormolekül CD86 und durch die Sezernierung von IL-4, während Makrophagen
dazu IL-1 nutzen. Durch B-Zellen präsentierte Antigene hingegen aktivieren Th2-Zellen
deutlich schwächer. Aktivierte Th2-Zellen sezernieren IL-4, IL-5, IL-6, IL-10 und IL-13 über
mehrere Tage. Diese Cytokine regen B-Zellen zur Proliferation und Differenzierung sowie
zur Sekretion von Immunglobulinen an und haben keinen Effekt z. B. auf
Zytotoxizitätsmechanismen. Die freigesetzten Cytokine können eine Steigerung der IgG1-
und IgA-Produktion durch B-Zellen um das bis zu Zwanzigfache, die der IgE-Produktion
sogar um das bis zu Tausendfache bewirken (TIZARD, 2004). Eine dominierende Th2-Antwort
wird mit einer gesteigerten Immunität gegen extrazelluläre Parasiten in Verbindung gebracht,
aber durch die fehlende Unterstützung der Zytotoxizitätsmechanismen auch mit einer
verminderten Resistenz gegen Mykobakterien und andere intrazelluläre Pathogene.
Th1- und Th2-Zellen migrieren als Resultat einer unterschiedlichen Rezeptorexpression
vorrangig zu unterschiedlichen Formen entzündeten Gewebes und stellen so sicher, dass die
richtige T-Zell-Subpopulation auf die jeweilige Entzündungsursache reagiert (TIZARD, 2004).
Literaturübersicht 23
Beide Formen kommen gleichzeitig in einem Organismus vor – auch für das Pferd konnten
inzwischen Th1- und Th2-Zellen nachgewiesen werden (AGGARWAL und HOLMES, 1999) –
und halten sich die Waage, jedoch sind in einigen Situationen die Verhältnisse zugunsten des
einen oder des anderen Typs verschoben, z. B. während der Schwangerschaft bzw.
Trächtigkeit (HERZ ET AL., 1998) oder auch in der Kindheit (ERB, 1999) liegt eine lokale oder
auch systemische Th2-Dominanz oder Polarisation vor. Auch eine starke Parasitenbelastung
oder eine allergische Erkrankung sind in ihrem Entzündungsmechanismus von einem Th2-
Cytokinprofil geprägt.
ERB (1999) ist der Ansicht, dass das Th2-dominierte Cytokinspektrum des Neugeborenen
bzw. des Kleinkindes und Jungtieres im Laufe der ersten Lebensjahre auf ein Th1-Spektrum
wechselt. Kinder, die später Atopiker werden, sollen diesem Wechsel nicht unterliegen. Die
Suche nach der Ursache für die anhaltende dominante Th2-Prägung versuchte STRACHAN
(1986) mit der sog. „Hygienetheorie“ zu begründen. Sie besagt, dass eine übertriebene
Hygiene in der Kindheit und der fehlende Kontakt zu „Trainingsmöglichkeiten“ für das
Immunsystem zu einer fehlerhaften Reaktion führten. Auch COOKSON und MOFFAT (1997)
sowie ROOK und STANFORD (1998) postulieren, dass ein Mangel an schweren
Kindheitsinfektionen die Entwicklung einer starken Th1-Antwort verringert, was dem Th2-
Arm des Immunsystems ermöglichen soll, dominant zu werden und gegen Umweltallergene
allergisch zu reagieren. ROOK und STANFORD (1998) führen das auf eine inkorrekte
Cytokinbalance aufgrund eines inadäquaten Primings von Th1-Zellen durch fehlende oder
verminderte Th1-induzierende Infektionen zurück. Nach PRESCOTT (1998) haben womöglich
IFN-α- und damit Th1-induzierende Infektionen den größten Einfluss auf die Hemmung einer
Allergieentwicklung in der postnatalen oder frühkindlichen Phase, während Infektionen im
späteren Leben keinen unterdrückenden Einfluss mehr haben. SHIRAKAWA ET AL. (1997)
konnten in diesem Zusammenhang zeigen, dass deutliche Th1-Cytokinprofile, niedrige IgE-
Spiegel und geringe Inzidenz allergischer Erkrankungen mit einer positiven Reaktion im
Tuberkulin-Test korreliert waren. Analog dazu berichteten HERZ ET AL. (1998), dass eine
nasale Applikation von Mykobakterium bovis die Entwicklung einer allergeninduzierten
Atemwegsüberempfindlichkeit bei Mäusen verhindert, jedoch ein starkes Th1-Milieu in den
Atemwegen nicht eine systemische allergische Reaktion unterdrücken kann. KLINE ET AL.
(1998) kamen nach der Applikation von Th1-induzierenden CpG-Motiven zu einem ähnlichen
Ergebnis.
Th2-Zellen sind jedoch unabdingbar für die Bekämpfung parasitärer Infektionen. So zeigten
Literaturübersicht 24
ELSE ET AL. (1993) bei Mäusen eine starke negative Korrelation zwischen der Befallsstärke
mit Trichuris muris und Th2-Merkmalen wie Serum-Gesamt-IgE-Titer, In-vitro-Produktion
von IL-5 und IL-9 durch T-Zellen aus mesenterischen Lymphknoten, einer schnellen
parasitenspezifischen IgG1-Antwort und intestinaler Eosinophilie. Dagegen fanden sie eine
signifikante positive Korrelation zwischen der Wurmlast und parasitenspezifischen IgG2a-
Spiegeln, einem von dem Th1-Cytokin IFN-γ regulierten Ig-Isotyp bei der Maus. Ihre Daten
zeigen, dass ein Individuum in der Auseinandersetzung mit seiner Parasitenbürde entweder
eine protektive Th2-Antwort oder eine nur unzureichende, nicht protektive Th1-Antwort
aufbauen kann. Interessanterweise sind atopische Erkrankungen in Entwicklungsländern mit
hoher Helmintheninfektionsprävalenz lange nicht so verbreitet wie in den Industrieländern, in
denen die Rate der Allergien ständig steigt (BELL, 1996, COOKSON und MOFFAT, 1997).
Möglicherweise inhibieren Helminthen atopische Effektorfunktionen, obwohl beide von Th2
dominiert werden. KNOPF (2000) berichtet von einer hohen Asthmaprävalenz bei
schwarzhäutigen Kindern, deren Vorfahren aus parasitisch stark belasteten Regionen Afrikas
stammten. Ihre genetisch bedingte, stark Th2-lastige Immunantwort mit hohen IgE-Spiegeln
mochte ursprünglich ein wichtiger Schutz gegen eine erhebliche Parasitenlast sein. Ebenso
argumentieren SUTTON und GOULD (1993), dass aus der evolutionären Perspektive die
primäre Funktion der Th2-Antwort ein Teil der antiparasitären Schutzmechanismen war und
heute mit allergischen Erkrankungen in unerwünschter Weise gegen oft ungefährliche
Substanzen reagiert.
2.5 Typ-I-Immunmechanismen der Parasit-Wirt-Interaktion
Der Erfolg eines Parasiten wird nicht am Schaden gemessen, den er in seinem Wirt anrichtet,
sondern an seiner Fähigkeit, sich zu adaptieren und in den Wirt zu integrieren. Infektionen mit
Helminthen sind langfristige, chronische Infektionen, so dass manche Parasiten über lange
Zeit in einem Wirt persistieren. Idealerweise kann der erfolgreiche Parasit die
Immunantworten des Wirtes beeinflussen: auf der einen Seite unterdrückt er sie, um sein
eigenes Überleben sicher zu stellen, denn er braucht Zeit, um zu wachsen und seine
Zielorgane zu erreichen, andererseits darf die Unterdrückung nicht so weit gehen, dass andere
Infektionen seinen Wirt und damit auch ihn töten. Die Fähigkeiten, den Immunmechanismen
des Wirtes zu entgehen, sie zu manipulieren und metabolische Komponenten des Wirtes für
sich zu nutzen, spiegelt die lange Anpassungszeit wider (TIZARD, 2004, MAIZELS ET AL.,
1993). Für den Wirt stellt es sozusagen den „normalen“ Status dar, von Geburt an bis weit in
Literaturübersicht 25
das Erwachsenenalter zumindest mit Helminthen infiziert zu sein (BELL, 1996). So hat sich
ein System aus Abwehr- und Evasionsmechanismen entwickelt, das ein Gleichgewicht
zwischen Wirt und Parasit ermöglicht.
Die Unterschiede zwischen Individuen einer Spezies, ihre Parasitenlasten zu kontrollieren und
abzustoßen, sind auf genetisch determinierte Varianten, z. B. MHC-Varianten oder
unterschiedliche Aktivierungsempfänglichkeiten von Mastzellenvorläufern im Knochenmark,
zurückzuführen, die in einer mehr oder weniger hohen Empfänglichkeit für helminthische
Infektionen resultieren und sich auch züchterisch festigen lassen. Resistente und empfängliche
Tiere unterscheiden sich u.a. zu Beginn der Infektion in der zeitlichen Abstimmung und der
Stärke ihrer Th-Zellen-Reaktion. So sezernieren Th2-Zellen von resistenten Mäusen in vitro z.
B. früher und vermehrt IL-3 und IL-4 gegenüber Zellen von empfänglicheren Tieren
(WAKELIN, 1992). Stärker belastete Tiere unterliegen u.a. leichter einer Immunsuppression
durch den Parasiten.
2.5.1 Typ-I-Hypersensitivitätsreaktion
Der bereits unter 2.3 beschriebene Mechanismus der Typ-I-Hypersensitivitätsreaktion dient
physiologischerweise u.a. zur Bekämpfung insbesondere von gastrointestinalen Parasiten.
Statt auf ein Allergen reagieren Mastzellen und Basophile in diesem Fall auf parasitäre
Antigene, die von membranständigen IgE- und einigen IgG-Antikörpern gebunden werden,
diese kreuzvernetzen und so eine Degranulation der Zelle auslösen. Die von
Darmmucosamastzellen freigesetzten Mediatoren, vasoaktiven Substanzen und Proteasen
lösen eine vermehrte Durchblutung, eine gesteigerte Gefäßpermeabilität und eine aktive
Sekretion von osmotisch aktiven Substanzen (MILLER ET AL., 1996) aus. Die Stimulation der
glatten Muskulatur des Darmes führt zu einer gesteigerten Motilität. Zusammen mit dem
Flüssigkeitsefflux aus den intestinalen Kapillaren („leaky gut“) kann sie zu einer Ablösung
und Austreibung vieler Parasiten führen (TIZARD, 2004). So können sich z. B. schwere
Infektionen mit großen und kleinen Strongyliden bei Fohlen und Absetzern durch
intermittierende Diarrhoe ohne Koliksymptome äußern (THAMSBORG ET AL., 1998).
Literaturübersicht 26
2.5.2 „Selbstheilungreaktion“, „Self cure“
Dieses Phänomen der gesteuerten Typ-I-Reaktion ist auch unter dem Begriff
„Selbstheilungsreaktion“ oder „Self cure“ bekannt. HONG ET AL. (1989) beschrieben das
klinische Bild mit starkem Durchfall bei Schafen und brachten die Fähigkeit zur Selbstheilung
mit der durch Immunisierung induzierten Resistenz der Tiere in Verbindung. Dabei konnten
die Tiere sowohl durch wiederholte, mittels anthelminthischer Behandlung abgebrochene
Helmintheninfektionen als auch durch täglich verabreichte geringe Mengen infektiöser
Larven immunisiert werden. Die folgende Selbstheilungsreaktion bei Challenge mit einer
hohen Menge infektiöser Larven stößt auch nicht-verwandte Parasiten unspezifisch mit ab
(EMERY ET AL., 1993), nach HARRISON ET AL. (2002) jedoch nur, wenn kurz zuvor mit der zur
Immunisierung verwendeten Art oder einem entsprechenden Antigen geboostert wurde. UBER
ET AL. (1980) und MITCHELL ET AL. (1983) vermuteten, dass intestinale Mastzellen eine
wichtige Rolle bei der Selbstheilung spielen, denn sie stellten eine verminderte Fähigkeit zum
Ausstoß von Nematoden bei Mäusen mit Mastzelldefekten fest. MAYBERRY ET AL. (1993)
konnten diese Daten verifizieren. Bei immunisierten Schafen wird der Großteil einer
infektiösen Challenge-Dosis von Trichostrongylus-colubriformis-Larven bereits nach nur
zwei Stunden abgestoßen, der Rest innerhalb der nächsten drei bis vierzehn Tage (SHAW ET
AL., 1998). Appliziert man Schafen, bei denen gerade eine Selbstheilungsreaktion
stattgefunden hat, parasitäres Antigen, kann es zu einem anaphylaktischen Schock kommen
(TIZARD, 2004). Ein Anstieg im Gesamt-IgE sieben bis acht Tage nach Challenge und eine
Zunahme der Darmmucosamastzellen hat nach Ansicht von SHAW ET AL. (1998) den
Hintergrund, die Typ-I-Reaktion weiter zu steigern, um auch die letzten Parasiten abstoßen zu
können. Nach SHAW ET AL. (1998) sind die Faeces in dieser Phase auch ohne
Diarrhoesymptomatik deutlich weicher als normal. Auch ROTHWELL (1989) postulierte, dass
eine gesteigerte Anzahl von Mucosamastzellen und Eosinophilen mit der protektiven Antwort
auf intestinale Nematoden zusammenhängt. Dabei spielen sowohl IgE als auch IgG-Subtypen
eine Rolle bei Aktivierung der mucosaständigen Mastzellen, der Erzeugung der humoralen
(IgE, IgG, IgA, siehe 2.6) und der Cytokinantworten (z. B. IL-4) gegen Parasiten. So sind
IgE-defiziente Mäuse signifikant empfänglicher für eine Parasiteninfektion als nicht-
defiziente Kontrolltiere, entwickelten eine doppelt so große Wurmlast (KING ET AL., 1997)
und konnten diese weniger gut abstoßen. SHAW ET AL. (1998) konnten zeigen, dass eine
Infektion mit Trichostrongylus colubriformis zu einer Titererhöhung des gesamten als auch
des parasitenspezifischen IgE führte. MANJILI ET AL. (1999) beobachteten eine effektivere
Literaturübersicht 27
Immunität bei Meerschweinchen gegen Trichostrongylus colubriformis, wenn die Tiere eine
starke IgG1-Antwort gegen Antigene dieses Parasiten aufwiesen und leiteten daraus ab, dass
IgG1-Antikörper möglicherweise die Degranulation von Mastzellen und Basophilen
vermitteln können und so zu einer gesteigerten Immunität beitragen.
Die unterschiedliche Fähigkeit der Individuen einer Art, ihre Parasitenlast zu bekämpfen, ist
bei vielen Tierarten nachgewiesen (u.a. DOUCH ET AL., 1984, ROTHWELL ET AL., 1994,
MANJILI ET AL., 1999). Neben unterschiedlichen Immunglobulinantworten („high responder“
und „low responder“) (MANJILI ET AL., 1999, ROTHWELL ET AL., 1994) zeigt sich diese
Fähigkeit auch in der Parasiteneizahl im Kot der Tiere. So erreichen z. B. Mäuse (ELSE ET AL.,
1993, TIZARD, 2004) und Schafe (DOUCH ET AL., 1984) mit hohen Eizahlen vor
anthelminthischer Behandlung auch danach wieder hohe Zahlen, während Individuen mit
wenigen Eiern auf diesem niedrigen Niveau bleiben. DOUCH ET AL. (1984) konnten keine
Unterschiede im Histaminspiegel in Blut und Ingesta zwischen den Gruppen finden. Der
Histaminspiegel war bei beiden Gruppen während einer experimentellen Larval-Challenge am
höchsten.
2.5.3 Andere Formen der antiparasitären Typ-I-Reaktion
Ein Hinweis für eine Typ-I-Reaktion auf der Schwelle von der Physiologie zur Pathologie
findet sich bei PASS und BOLTON (1982). Sie beschrieben vier Fälle einer chronischen
eosinophilen Gastroenteritis bei Pferden, die mit Durchfall, Abmagerung und Malabsorption
einhergingen. Es fand sich eine chronische inflammatorische Reaktion mit diffusen und
fokalen eosinophilen Infiltraten im gesamten Magen-Darm-Trakt, was die Autoren als
anhaltende Typ-I-Reaktion unbekannter Ursache interpretierten.
BERHE ET AL. (1999) beschrieben gastrointestinale Symptome sowie das Auftreten von
Urticaria und Ödemen bei Kindern, die einer anthelminthischen Behandlung unterzogen
wurden. Einen Tag nach der Applikation des Anthelmintikums traten mit Durchfall, Übelkeit,
Erbrechen und abdominalen Krämpfen Symptome auf, die sich auf den Mechanismus der
Typ-I-Reaktion nach Freisetzung einer großen Menge parasitischen Antigens zurückführen
lassen könnten.
Viele Helmintheninfektionen gehen mit weiteren typischen Anzeichen einer Typ-I-Reaktion
wie z. B. Eosinophilie, Urticaria und asthmaartigen Atembeschwerden einher. TIZARD (2004)
berichtete von akuten anaphylaktischen Schocks nach Ruptur von Bandwurmcysten während
chirurgischer Eingriffe.
Literaturübersicht 28
Nach COLDITZ ET AL. (1994) hat die Typ-I-Reaktion nicht nur am Darm, sondern auch in der
Haut protektive Effekte. Schafe, die vermehrt IgE-positive Zellen in der Haut hatten, waren
resistenter gegen bakterielle Hautinfektionen und Belastung mit Ektoparasiten (Lucilia
cuprina).
2.6 Bedeutung unterschiedlicher Immunglobulin-Isotypen bei der Helminthenabwehr
Bei der primären Immunantwort gegen für das betreffende Individuum „neues“ Antigen wird
IgM als erster Immunglobulin-Isotyp produziert, da naive, bis dahin „antigenunerfahrene“ B-
Zellen mit ihrem membranständigen IgM als Antigenrezeptor dieses Antigen erkennen. Freies
IgM ist u.a. besonders effizient bei der Agglutination von Mikroorganismen und in der
Aktivierung des klassischen Weges des Komplementsystems, sobald ein IgM ein Antigen
gebunden hat und ein Immunkomplex vorliegt.
IgG stellt bei parasitären Infektionen die am stärksten vertretene Antikörperklasse dar und
wird insbesondere nach Zweitkontakt oder anhaltender Infektion mit diesen Parasiten stark
vermehrt. Wie IgM können einige IgG-Isotypen als Immunkomplexe das Komplementsystem
aktivieren und Mikroorganismen agglutinieren, jedoch weniger effizient als IgM. Außerdem
können IgG-Isotypen nach Antigenbindung über ihre Fc-Teile an geeignete Fcγ-Rezeptoren
von Makrophagen, Monocyten, Killerzellen sowie Granulocyten binden und so zur
Phagocytose opsonieren bzw. eine antikörperabhängigen, zellvermittelten Zytotoxizität
(ADCC) vermitteln.
IgA ist nicht nur im Serum, sondern auch in großen Mengen in der Darmmucosa und anderen
Schleimhäuten sowie in den entsprechenden Sekreten vorhanden. Neben seiner Funktion als
Opsonin im ADCC-System und Aktivator des Komplementsystems liegt der Schwerpunkt
dieses Immunglobulins auf der Adhärenzhemmung von Bakterien und Viren an
Epitheloberflächen. Können Bakterien und Viren aufgrund der Bindung von IgA nicht mehr
an Epithelzellen wie z. B. Enterocyten adhärieren, können sie auch keine Infektion
verursachen (ROMMEL ET AL., 2000, TIZARD 2004).
Antikörpervermittelte Reaktionen des Wirtes spielen eine große Rolle schon bei der
Verhinderung einer Neuetablierung parasitärer Larven (BAKER ET AL., 1994). Wie schon
erwähnt (2.3, 2.5.2 und 2.5.3), ist insbesondere das Th2-geförderte IgE als Vermittler von
Bedeutung. Da Helminthen sehr starke Induktoren der Th2-Antwort sind, haben
parasitenbelastete Tiere einen stark erhöhten Gesamt- und parasitenspezifischen IgE-Titer
(und erhöhte Eosinophilenzahlen). Die Induktion von IgE ist bei einer Erstinfektion
Literaturübersicht 29
gegenüber anderen Isotypen verzögert (nachweisbar ab Tag 20 nach Infektion beim Schaf),
reagiert aber bei weiteren Infektionen deutlich schneller (SHAW ET. AL., 1998). Dieses
Immunglobulin kann nicht nur über eine Kreuzvernetzung auf Mastzellen und Basophilen
eine Degranulation auslösen, sondern auch z. B. eine zytotoxische Aktivität von Eosinophilen
gegen Nematodenlarven vermitteln. Es trägt sowohl zur Induktion der humoralen Immunität
gegen Parasiten durch Förderung der Bildung von weiterem IgE, IgA und Th2-spezifischen
IgG-Isotypen als auch zu einer Steuerung der spezifischen Th2-Cytokinantwort gegen
Parasiten bei (KING ET AL., 1997). Dabei ist das Th2-Cytokin IL-4 obligatorisch für die
Induktion von IgE. Die Resistenz gegen Parasiten ist ohne dieses Immunglobulin deutlich
vermindert (KING ET AL., 1997). Ponies mit einer niedrigen zellulären IL-4-Produktion sind
stärker verwurmt als solche mit viel IL-4 (EDMONDS ET AL., 2001). Freies IgE kommt bei
Menschen im Gegensatz zu anderen Isotypen im Serum nur in Spuren vor und hat dort eine
Halbwertszeit von zweieinhalb Tagen. WAGNER ET AL. (2003) beschreiben für das Pferd
deutlich höhere Serumgehalte an IgE. Der größte Teil des vorhandenen IgE ist normalerweise
auf Mastzellen und basophilen, teilweise auch auf eosinophilen Granulocyten gebunden
(JANEWAY ET AL., 2002).
Ebenfalls Th2-geförderte Isotypen sind das IgA, IgG1 (Maus) und IgG4 (Mensch)
(WAKELIN, 1992), obwohl gegen Helminthen auch Antikörper anderer Isotypen gebildet
werden, deren Produktion von Th1-Zellen gefördert wird. Die Th2-Cytokine IL-4 und IL-6
verstärken die Produktion von murinem IgG1 (VAN OMMEN ET AL., 1994). Schafe, Mäuse und
Meerschweinchen mit einer effektiven Immunität gegen Nematoden haben mehr IgG1 (high
responder) als Tiere mit einer schwächeren Abwehr (low responder), ihr Gesamt- und
parasitenspezifischer IgG1-Titer korreliert negativ mit der Eizahl in den Faeces (DAWKINS ET
AL., 1988, ELSE ET AL., 1993, GILL ET AL., 1993, MANJILI ET AL., 1998). Die high responder
waren gut durch eine Immunisierung vor einer experimentellen Infektion zu schützen,
während das bei den low respondern nur unzureichend gelang (ROTHWELL ET AL., 1994).
MANJILI ET AL. (1998) leiteten daraus Hinweise auf eine Beteiligung von IgG1 an der
Degranulationsvermittlung von Mastzellen ab. HARRISON ET AL. (2003) konnten nachweisen,
dass IgG1 und IgA an ein Oberflächenmolekül einer L3-Larve von Trichostrongylus
colubriformis binden und so das Anheften der Larven an bevorzugten Stellen im Darm
verhindern, worauf die Larven aufgrund von mangelhafter Adhäsion ausgestoßen werden. So
spielt IgA auch eine Rolle bei der natürlichen Resistenz von Schafen gegen Haemonchus
contortus im Vergleich zu weniger resistenten Tieren (GILL ET AL., 1993), auch hier besteht
Literaturübersicht 30
ein deutlicher Zusammenhang zwischen hohen Serum-IgA-Titern auf Resistenz gezüchteter
Schafe und niedrigen Eiausscheidungszahlen. Bei in Filariose-Endemiegebieten lebenden
Menschen konnten deutlich IgE- und IgG4-Antikörper gegen ein rekombinates Protein aus
Brugia spp., mit dem das Immunsystem der untersuchten Personen fortlaufend Kontakt hatte,
nachgewiesen werden; die IgG1- und IgG3-Antwort auf dieses Protein ist geringer
(YAZDANBAKHSH ET AL., 1995). Beim Th1-geförderten Isotyp IgG2a der Maus konnte im
Gegensatz zu den Th2-unterstützten Isotypen eine deutlich positive Korrelation zwischen der
Anzahl der Nematoden im Intestinum und der Höhe des parasitenspezifischen Titer
festgestellt werden (ELSE ET AL., 1993). Unterschiede zwischen stark und schwach
verwurmten Schafen und Meerschweinchen konnten bei IgG2- und IgM-Titern nicht
ausgemacht werden (MANJILI ET AL., 1998, GILL ET AL., 1993).
Beim Pferd wurden bisher zumeist IgG(T)-Titer gegen Helminthen untersucht, allerdings ist
inzwischen bekannt, dass es bei dieser Spezies sieben verschiedene IgG-Subtypen gibt
(WAGNER ET AL., 1997 und 2004, WEGE, 2004). Dabei konnte ein deutlicher Anstieg des
IgG(T) bei experimentell mit Strongylus vulgaris infizierten Ponies festgestellt werden
(PATTON ET AL., 1978). Fohlen, die die erste Weidesaison draußen verbrachten, zeigten
ebenfalls einen IgG(T)-Anstieg auch auf kleine Strongyliden, während die erwachsenen
Stuten einen bereits hohen Titer unverändert hielten (WEILAND ET AL., 1991). Auch DOWDALL
ET AL. (2002 und 2004) konnten eine deutliche IgG(T)-Antwort nach Cyathostominae-
Infektionen auf intramucosale Larvenstadien und auf zwei spezifische parasitische Antigene
nachweisen. Ebenfalls besteht eine Korrelation zwischen dem spezifischen IgG(T)-Titer mit
der Infektionsschwere mit Anoplocephala (PROUDMAN ET AL., 1996). Hier sinkt der
spezifische IgG(T)-Gehalt nach Entwurmung. Er variiert auch je nach Alter des Pferdes und
IgG-Isotyp (IgG(a), IgG(b), IgG(c)) (PROUDMAN ET AL., 1997).
Die Nomenklatur der IgG-Subtypen des Pferdes wurde inzwischen den bei anderen Spezies
üblichen Bezeichnungen angeglichen (WEGE, 2004). IgG(a) wird jetzt mit IgG1, IgG(b) mit
IgG4 und das IgG(c) mit IgG6 bezeichnet. Das IgG(T) konnte als eine Mischung aus IgG3
und IgG5 identifiziert werden, während das neu exprimierte IgG2 noch nicht anderweitig
benannt war. Der genetisch angelegte Isotyp IgG7 konnte bisher weder aus dem Serum
isoliert noch exprimiert, jedoch auf mRNA-Ebene nachgewiesen werden (WAGNER ET AL.,
2004).
Literaturübersicht 31
2.7 Immunmodulation der allergischen Typ-I-Reaktion durch Helminthen
In Entwicklungsländern mit hoher Helmintheninfektionsprävalenz sind allergische
Erkrankungen lange nicht so bekannt wie in den Industrieländern (BELL, 1996, COOKSON und
MOFFAT, 1997). Es stellt sich die Frage, ob Helminthen möglicherweise atopische
Effektorfunktionen inhibieren, wobei vermutlich genetische Faktoren des Wirtes ebenfalls
eine Rolle spielen. So konnte bei Kindern, deren Vorfahren aus parasitisch stark belasteten
Regionen Afrikas ausgewandert waren, eine hohe Prävalenz von Asthma festgestellt werden
(KNOPF, 2000). Möglicherweise war eine starke, genetisch bedingte Th2-Dominanz des
Immunsystems ursprünglich dort wichtig im Schutz gegen eine zu hohe Parasitenlast. BELL
(1996) vertritt dazu die Ansicht, dass endemische Helminthosen das Th2-System in einer Art
aktivieren, die zu einer anderen Ebene des immunologischen Gleichgewichtes führt, als sie
derzeit in den Gesellschaften der Industrieländer vorkommt. Allergische Reaktionen sind
demnach eine rein pathologische Konsequenz der Störung dieser Gleichgewichts-
mechanismen und haben keinen protektiven Sinn. Dabei könnte eine Rolle spielen, dass
Helminthosen eine chronische Antigenchallenge darstellen. Reagierte das Immunsystem
dauerhaft mit entzündlichen Reaktionen gegen zahlreiche Parasiten, könnte es den eigenen
Organismus schädigen. Folglich könnte eine Herunterregulierung der Immunantwort eine
natürliche Antwort des Immunsystems auf kontinuierliche Antigenexposition sein
(YAZDANBAKHSH ET AL., 2001). Individuen mit chronischen Helmintheninfektionen könnten
starke anti-inflammatorische Netzwerke aufbauen, um Gewebsschäden zu unterbinden, die
sonst aus der kontinuierlichen Challenge des Immunsystems durch die parasitären Antigene
resultieren können (ALLEN und MAIZELS, 1997). So zeigen hyporesponsive Patienten mit
Filariose und einer hohen Parasitenlast generell schwächere Symptome der Erkrankung als
solche mit nur wenigen Parasiten, die trotz einer energischen Immunantwort die Parasiten
nicht eliminieren können und ein schwereres Krankheitsbild zeigen (MAIZELS ET AL., 1991).
Dieses anti-inflammatorische Netzwerk während der chronischen Parasiteninfektion könnte
der Schlüssel zur geringeren Prävalenz von allergischen Erkrankungen in Th2-dominierten
Populationen sein, denn dieses Netzwerk hemmt auch allergische Mechanismen. Dazu passt
die Beobachtung von VAN DEN BIGGELAAR ET AL. (2000), dass anti-inflammatorisches IL-10
bei chronischer Schistosomose eine zentrale Rolle bei der Unterdrückung der Allergie zu
spielen scheint. Allergiker bzw. Asthmatiker exprimieren der Bronchoalveolären Lavage und
in peripheren mononukleären Zellen bis zu zehnmal weniger IL-10 als Nicht-Allergiker
(BORISH ET AL., 1996). T-Zell-Populationen von Patienten mit chronischer Filariose weisen
Literaturübersicht 32
herabgesetzte proliferative Reaktionen auf Helminthenantigene, aber auch auf unverwandte
Antigene auf, so dass GALLIN ET AL. (1998) eine verminderte T-Zell-Antwort aufgrund von
Defekten in der T-Zell-Aktivierung postulieren.
Neben der Möglichkeit der Herabregulierung der Immunantwort gibt es noch weitere
Erklärungsansätze für das Phänomen der Modulation der allergischen Reaktion durch
Helminthen, die auf den Mechanismus der Typ-I-Reaktion abzielen. LYNCH ET AL. (1993a)
postulierten, dass polyclonale, hohe IgE-Spiegel aus der Helminthenbekämpfung die Fcε-
Rezeptoren auf Mastzellen und Basophilen absättigen und eine spezifische IgE-Produktion
unterdrücken. Eine Hemmung der Allergie trete auf, wenn eine inverse Beziehung zwischen
gesamtem und allergenspezifischem IgE bestehe. Die polyclonale IgE-Synthese anstelle einer
gezielten, parasitenspezifischen Synthese kann evtl. eine Verteidigungsstrategie des
Helminthen darstellen. Denn auch der Parasit löst seltener eine Typ-I-Abwehrreaktion aus,
wenn so viel Oberflächen-IgE auf Mastzellen und Basophilen gebunden ist, dass nicht mehr
ausreichend parasitenantigenspezifisches IgE kreuzvernetzt werden kann. Die polyclonale
Synthese von IgE reduziert so möglicherweise die Effektivität von spezifischem IgE (HAGEL
ET AL., 1993a). Eine anthelminthische Behandlung von Kindern mit Askarideninfektionen
resultierte in einem Absinken des IL-4 und damit auch des Gesamt-IgE-Titers im Serum
(HAGEL ET AL., 1993a, LYNCH ET AL., 1993b). Im Gegenzug stiegen die Reagibilität im
allergischen Hauttest und der allergenspezifische IgE-Spiegel gegen Umweltallergene. Mit
erneuten Parasiteninfektionen erhöhten sich die Gesamt-IgE-Titer wieder, während die
allergenspezifischen Spiegel und die Hauttestsensitivität sanken. KAUL (1998) berichtet von
zwei vorberichtlich an Sommerekzem erkrankten, aber im Allergietest (FIT) negativen
Pferden, die nach zweimaliger Entwurmung trotz Stallhaltung und wenig Kontakt zu
stechenden Insekten plötzlich eine deutliche Sensibilisierung der basophilen Granulocyten im
FIT gegen Culicoides nubeculosus zeigten. Äthiopische Emigranten in Israel zeigten nach
anthelminthischer Behandlung einen deutlichen Anstieg von allergischer Rhinitis und
Hauttestreaktionen (STEIN, 1999). FINKELMAN ET AL. (1991) vertraten die Theorie, dass einige
Helminthen die IL-4-abhängige polyclonale IgE-Produktion fördern, um über die Absättigung
der Fcε-Rezeptoren die spezifische Sensibilisierung der Mastzellen und Basophilen
herabzusetzen und so eine Auslösung des Typ-I-Mechanismus zu umgehen. Dagegen führen
YAMAGUCHI ET AL. (1997) als Gegenargumentation an, dass hohe IgE-Spiegel zu einer
drastischen, bis zu 32-fachen Heraufregulation von Fcε-Rezeptoren führen. Das löst
wiederum eine signifikante Steigerung der IL-4-Produktion bei Allergen- bzw.
Literaturübersicht 33
Antigenkontakt aus, die eine weitere Erzeugung von noch mehr IgE zur Folge hat. Es stellt
sich also die Frage, ob Fcε-Rezeptoren überhaupt abzusättigen sind und ab wann
Regulationsmechanismen zum Tragen kommen, die diese Induktionsspirale unterbrechen.
Die starke Korrelation zwischen IL-4 und IgE im Serum konnten HAGEL ET AL. (1993b) in
ihren Untersuchungen bestätigen, jedoch fanden sie auch eine negative Korrelation zwischen
der Höhe des IgE-Titers und der Sensibilität im Hauttest. Dabei scheint die spezifische Anti-
Helminthen-Antwort bei atopischen Kindern stärker zu sein als bei Nichtatopikern (LYNCH ET
AL., 1998). Letztere scheinen eher zu vermehrter polyclonaler IgE-Bildung zu neigen. HAGEL
ET AL. (1993a) konnten Zusammenhänge zwischen einer schnellen Reinfektion mit
Helminthen nach Entwurmung und einem hohen, jedoch unspezifischen IgE-Titer
nachweisen. Als Resultat hatten allergische Kinder im Schnitt geringere
Helmintheninfektionen als Nichtallergiker (LYNCH ET AL., 1998). LYNCH ET AL. (1998) deuten
daraufhin an, dass es sich hierbei ursprünglich um einen Evolutionsvorteil gehandelt haben
könnte (siehe auch BELL, 1996, KNOPF, 2000, YAZDANBAKHSH ET AL., 2001). Dazu passen
auch die Ergebnisse von EDMONDS ET AL. (2001), die bei stark verwurmten Ponies geringere
IL-4-Spiegel fand. Diese Tiere reagierten auch allgemein deutlich vermindert in ihrer
Antikörperbildung und Lymphoproliferation auf experimentelle Immunisierungen.
Material und Methoden 34
3 Material und Methoden
3.1 Probanden
Alle in dieser Studie in den Jahren 2003 und 2004 untersuchten Pferde befanden sich in
Privatbesitz und wurden der Arbeitsgruppe Immunologie der Tierärztlichen Hochschule
Hannover zu Forschungszwecken langfristig oder zeitweise zur Verfügung gestellt. Das Alter
der Tiere variierte zwischen drei Monaten und ca. siebzehn Jahren. Je nach Vorbericht und
Entwicklung während der Studie bezüglich der klinischen Ausprägung der Typ-I-Allergie
(Sommerekzem) wurden die Tiere als „Allergiker“ oder als „Nichtallergiker“ klassifiziert.
3.1.1 Probanden der Arbeitsgruppe Immunologie
Hier aufgeführt sind alle Pferde, die langfristig der AG Immunologie zur Verfügung standen.
Es handelte sich ausnahmslos um Islandpferde.
Probanden in den Untersuchungsjahren 2003 und 2004
Nr. Geschlecht Geburtsjahr
Klinisches
Sommerekzem,
„Ekzemer“
1 Stute 1992 positiv
2 Stute 1991 positiv 4 Stute 1992 positiv 5 Stute 1992 positiv 6 Stute 1988 positiv 7 Stute 1993 positiv 8 Stute 1993 positiv 9 Stute 1990 positiv 10 Stute 1990 positiv 11 Stute 1993 positiv 12 Stute 1993 positiv 16 Stute 1997 negativ
17 Stute 1997 negativ
Material und Methoden 35
18 Stute 1997 negativ
19 Stute 1993 negativ
20 Stute 1992 negativ
21 Stute 1988 negativ
22 Stute 1993 negativ
23 Stute 1993 negativ
24 Stute 1992 negativ
25 Stute 1993 negativ
27 Stute 1993 negativ
28 Hengst 2000 negativ
29 Hengst 2000 negativ
30 Stute 2000 negativ
31 Stute 2000 negativ
32 Hengst 2000 negativ
33 Hengst 2003 negativ
Tabelle 1: Probanden in den Untersuchungsjahren 2003 und 2004 Es sind hier die im Versuch eingesetzten Pferde in den Jahren 2003 und 2004 aufgeführt. Die Spalten enthalten von links nach rechts die Versuchsnummer des Tieres (Nr.), das Geschlecht, das Geburtsjahr und den vorberichtlich erhobenen klinischen Allergiestatus (Sommerekzem (SE) positiv oder negativ). Die Pferde Nr. 2 und 19 schieden am 10. November 2003 nach einem Unfall aus dem Versuch aus, ebenso Nr. 17 am 22. Mai 2003. Pferd Nr. 5 verendete am 17. März 2003. Die Pferde Nr. 28, 29 und 32 wurden im August 2003 kastriert und im Folgenden als Wallache weitergeführt.
3.1.2 Zusätzlicher Proband
Hierbei handelte es sich um ein Vollblutpferd in Privatbesitz ohne Sommerekzem, das zur
Blutgewinnung und Untersuchung verwendet werden konnte.
Material und Methoden 36
3.1.3 Haltungs- und Fütterungsbedingungen
Die Pferde wurden auf Weiden eines landwirtschaftlichen Betriebes in der Nähe des
Steinhuder Meeres bei Hannover gehalten. In den Wintermonaten standen sie auf einer
Waldwiese eines Landschaftschutzgebietes, im Sommer auf Moorwiesen. Alle Pferde (mit
Ausnahme des separat untersuchten Privatpferdes) wurden zusammen in einer Herde in
Weidehaltung gehalten. Die Junghengste bildeten für die ersten sechs Monate des Jahres 2003
eine eigene Herde, wurden jedoch nach Kastration mit den Stuten zusammen gehalten.
Die Fütterung erfolgte außer mit Gras bei Bedarf mit Stroh, Heu und Silage. Zur
Mineralstoffsupplementation standen Lecksteine den Tieren zur freien Aufnahme zur
Verfügung. Weidehygienische Maßnahmen (z. B. regelmäßiges Abmisten der Weiden)
erfolgten bis auf regelmäßige oder versuchsbedingte Entwurmungen nicht.
Alle Weideflächen hatten natürliche und künstliche Wasserläufe in unmittelbarer Nähe oder
wurden von ihnen durchzogen.
3.2 Geräte
Absaugpipette, 12 ml Sarstedt, Nürnbrecht
Analysenwaage, Typ B6 Mettler-Toledo, Zürich
Eismaschine, Typ UBE 30-10 Ziegra, Isernhagen
IKA®-Mikrotiterplattenschüttler MTS 4 IKA Labortechnik, Janke und Kunkel
GmbH & Co. KG, Staufen
IKA®-Minishaker MS1 IKA Labortechnik, Janke und Kunkel
GmbH & Co. KG, Staufen
Kochtopf Einzelhandel
Kühlzentrifuge Varifuge K mit Tragringrotor Heraeus-Christ, Osterode, Kontakt:
Kendro, Osterode
Mörser und Pistill Roth, Karlsruhe
Labor-pH-Meter Typ 27 Knick, Berlin
Laborwaage L310 Sartorius, Göttingen
LKB Wallac 1272 Clinigamma (Gamma-Counter) Wallac Oy, Turku, Finnland,
Kontakt: Perkin Elmer Instruments,
Rodgau
Magnetrührer mit Heizplatte, Modell IKAMAG® RH IKA Labortechnik, Janke und Kunkel
Material und Methoden 37
GmbH & Co. KG, Staufen
Durchlichtmikroskop, Modell variant Jenamed Carl Zeiss, Jena
Mikrotiterplatten-Filterphotometer ELISA-Reader
Dynatech MR 5000
Dynatech, Denkendorf, Kontakt:
Dynex Technologies, USA
Multi-Reagenz-Waschgerät, Version 1.6 Dynatech, Denkendorf, Kontakt:
Dynex Technologies, USA
Pinzette, anatomisch Heiland, Hamburg
Pipetten, einstellbar von 1-20 µl, 20-100 µ, 20-200 µl
und 100-1.000 µl
Abimed, Langenfeld
Pipettierball Labor- und Analyse-Technik GmbH,
Hannover
SG Reinstwassersystem RS 90-4UF SG (Steudten & Gideon), Barsbüttel
Rührstäbe Größe Roth, Karlruhe
UmkehrosmoseanlageTyp RO 50/14SMB SG (Steudten & Gideon), Barsbüttel
Wärmeschrank Heraeus, Hanau, Kontakt: Kendro,
Osterode
Zentrifuge Varifuge GL mit Tragringrotor Heraeus-Christ, Osterode, Kontakt:
Kendro, Osterode
3.3 Material
3.3.1 Verbrauchsmaterialien
BD Vakutainer® CAT, 10 ml Becton Dickinson, Heidelberg
BD Vakutainer® K2E 18 mg,10 ml Becton Dickinson, Heidelberg
BD Vakutainer® K2E 18 mg, 5 ml Becton Dickinson, Heidelberg
BD Vakutainer® CAT, 5 ml Becton Dickinson, Heidelberg
Deckgläser Roth, Karlruhe
Einmalkanülen Terumo Neolus, 24 G / 0,55 x 25 mm,
pyrogenfrei
Terumo Corporation, Leuven,
Belgien
Einmalkanülen Terumo Neolus, 24 G / 0,9 x 25 mm,
pyrogenfrei
Terumo Corporation, Leuven,
Belgien
ELISA-Mikrotiterplatten Nunc-Immuno-Plate
Maxisorb, F 96
Nunc, Wiesbaden
Material und Methoden 38
Eppendorf-Reaktionsgefäße, 1,5 ml Greiner, Frickenhausen
Fecalyzer®, Fecal Analysis System EVSCO Pharmaceuticals, New
Jersey, USA
Flüssigkeitenfilter, 0,45µm, 0,2 µm Renner, Dannstadt
Injektionsspritzen, 2 ml, 5 ml, 10 ml Braun Melsungen AG, Melsungen
Klebefolie für Elisa-Platten: plate sealers Corning Inc., NY, USA
Objekträger Roth, Karlsruhe
Papier, saugfähig Einzelhandel
PD10-Säulen Amersham Biosciences, Freiburg
Pipettenspitzen, blau und gelb Sarstedt, Nürnbrecht
RS-Röhrchen (RIA), 5 ml Greiner, Frickenhausen
Vacutainer Systems Precision Glide, 0,9 x 38 mm Becton Dickinson, Heidelberg
Vacutainer Systems, Halter Becton Dickinson, Heidelberg
Zellkultur-Mikrotiterplatten, Flachboden, 96 well,
steril, mit Deckel
Greiner, Frickenhausen
Zentrifugenröhrchen, 50 ml, steril Corning Inc., NY, USA
3.3.2 Chemikalien und Reagenzien
Alle verwendeten Reagenzien hatten einen Reinheitsgrad von mindestens 99%. Ammoniumhydrogencarbonat Roth, Karlsruhe
Aluminiumhydroxid Sigma-Aldrich, Taufkirchen
Aqua dest. Aus der Umkehrosmoseanlage (3.2)
der Arbeitsgruppe Immunologie der
TiHo Hannover
Aqua tridest. Aus dem SG Reinstwassersystem
(3.2) der Arbeitsgruppe Immunologie
der TiHo Hannover
BCA Protein Assay Kit Pierce / Peribo Science, Bonn
Calciumchlorid (CaCl2* 2 H2O) Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Kat# C-
3881
3-((3-Cholamidopropyl)diamethylammonio)-1- Omnilab, Bremen
Material und Methoden 39
propansulfat (CHAPS)
Citronensäure (x 1 H2O) Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Kat# C-
7129
Dimethylsulfoxid (DMSO) p.a. J.T. Baker, Groß-Gerau, Kat# 7033
Histamin, freie Base Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Kat# H-
7125 125Iod-Histamin-Tracer LDN, Nordhorn
Kaliumchlorid (KCl), kristallin Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Kat# P-
4504
Magnesiumchlorid (MgCl2 * 6 H2O) Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Kat#
M-0250
Natriumazid, (NaN3), 10%ig Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Kat# S-
2002
Natriumchlorid (NaCl) Roth, Karlsruhe, Kat# 9265
Natriumhydroxid (NaOH), wasserfrei Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Kat# S-
5881
Natriumcarbonat (Na2CO3 x 0 H2O) Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Kat# S-
2127
Natriumhydrogencarbonat (NaHCO3) Merck, Darmstadt, Kat# 6329
Natriumdihydrogenphosphat (NaH2PO4 x 2 H2O) Riedel-DeHaen AG, Seelze, Kat#
04269
Di-Natriumhydrogenphosphat (Na2HPO4) Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Kat# S-
0876
N-Hydroxysuccinimido-Biotin (NHS-Biotin) LDN, Nordhorn
Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS), ohne Ca²+
/ Mg²+ (Trockensubstanz)
Biochrom, Berlin, Kat# L182-10
Polyethylenglycol (PEG) 8000 Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Kat# P-
2139
Piperazine-N,N’bis[2-ethanesulfonic]acid (PIPES) Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Kat# P-
6757
Salzsäure (HCl), konzentriert (37%) J.T. Baker, Groß-Gerau, Kat# 6081
Streptavidin-Peroxidase Amersham Biosciences, Freiburg
Tris: Trisma® Base Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Kat# T-
Material und Methoden 40
(Tris[hydroxymethyl]aminomethan) 1503
Triton X (t-Octylphenoxypolyethoxyethanol) Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Kat# X-
100
Tween 20 (Polyoxyethylensorbitanmonolaurat) Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Kat# P-
1379
Schwefelsäure (H2SO4), 96% Roth, Karlsruhe, Kat# 93162
Tetramethylbenzidin (TMB) Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Kat# T-
2885
Wasserstoffperoxid (H2O2), 30%-Lösung Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Kat#
21676-3
Wright-Lösung Sigma-Aldrich, Taufkirchen
3.3.3 Antikörper und Seren
Donkey-anti-goat (Esel-anti-Ziege) IgG,
Antiserum Grade
Scantibodies Lab., Santee, CA, USA, Ak-
Konzentration: 14,5 mg/ml, Kat# 3AD497
Goat-anti-histamine (Ziege-anti-
Acylhistamin Nativserum) (gαAch)
Arbeitsgruppe Immunologie der TiHo Hannover
Goat-anti-horse (Ziege-anti-Pferd) IgG
(H&L)-Ak
Fa: Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.,
Proteinkonzentration: 2,4 mg/ml, Kat# 108-005-
003
Goat-anti-mouse (Ziege-anti-Maus) IgG +
IgM (H+L)-Ak, Peroxidase-conjugated
AffiniPure
Fa: Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.,
Proteinkonzentration: 0,8 mg/ml, Kat# 115-035-
044
Mouse-anti-EqIgA (Maus-anti-EqIgA)-
Ak (KlonA)
freundlicherweise zur Verfügung gestellt von Paul
Lunn, USA
Mouse-anti-EqIgE (Maus-anti-EqIgE)
(m(γ1)αEqIgE)-Ak, interne Labornr.
#134
Arbeitsgruppe Immunologie der TiHo Hannover
Proteinkonzentration: 4200 µg/ml bzw. naiver
Zellkulturüberstand
Mouse-anti-EqIgE (Maus-anti-EqIgE)
(m(γ1)αEqIgE)-Ak, interne Labornr.
#176
Arbeitsgruppe Immunologie der TiHo Hannover
Proteinkonzentration: 2200 µg/ml
Mouse-anti-EqIgG1 (Maus-anti-EqIgG1) Arbeitsgruppe Immunologie der TiHo Hannover
Material und Methoden 41
(mαEqG3-47)-Ak
Mouse-anti-EqIgG3-Ak (Maus-anti-
EqIgG5) (CVS 40)
freundlicherweise zur Verfügung gestellt von Paul
Lunn, USA
Mouse-anti-EqIgG4 (Maus-anti-EqIgG4)-
Ak (CVS 39)
freundlicherweise zur Verfügung gestellt von Paul
Lunn, USA
Mouse-anti-EqIgM (Maus-anti-EqIgM)-
Ak (mαEqM1-141)
Arbeitsgruppe Immunologie der TiHo Hannover
Mouse-anti-EqIgE-Ak (Maus-anti-Eq-
IgE), biotinyliert
freundlicherweise zur Verfügung gestellt von Dr.
R. E. Esch, Ph.D., USA
Ziegenserum, normal Arbeitsgruppe Immunologie der TiHo Hannover
3.3.4 Allergene
Culicoides nubeculosus (Gnitze) (Cn) Greer-Laboratories, USA, Aufreinigung über PD
10, Proteingehalt: 550 µg/ml
Culicidae spp. (Stechmücken) (Mosquito,
Mq)
Greer-Laboratories, USA, Aufreinigung über PD
10, Proteingehalt 2000 µg/ml
Tabanus spp. (Pferdebremse) (Horse fly,
HF)
Greer-Laboratories, USA, Aufreinigung über PD
10, Proteingehalt: 1100 µg/ml
Rekombinantes Protein „A“ aus Tricho-
strongylus colubriformis („Aspin“),
encoded Tco-API-1, Mol.Gew. 31 kDa,
hier benannt als „TcA“
freundlicherweise zur Verfügung gestellt von Drs.
R. Shaw und W. Hein, Upper Hut, Neuseeland
Rekombinantes Protein „B“ aus Tricho-
strongylus colubriformis, encoded Tco-
gbp-2, Mol.Gew. 34,6 kDa, hier benannt
als „TcB“
freundlicherweise zur Verfügung gestellt von Drs.
R. Shaw und W. Hein, Upper Hut, Neuseeland
Cyathostominae spp. (kleine Strongyli-
den, Arten nicht morphologisch weiter
bestimmbar)
Institut für Parasitologie der TiHo Hannover
Material und Methoden 42
3.3.5 Medikamente
Droncit® orales Gel 9%, Injektor zu 6,67 g,
Wirkstoff: Praziquantel
Bayer AG, Leverkusen, Ch.-B. KP00A0A
Equest® orales Gel, Injektor zu 11,5g,
Wirkstoff: Moxidectin
Fort Dodge, Würselen, Ch.-B.: 8404
Jernadex®, Injektor zu 24 ml, Wirkstoff:
Pyrantelpamoat
Virbac, Bad Oldesloe, Ch.-B. OD3Z
Urbason® solubile forte 250, Ampullen,
Wirkstoff: Methylprednisolon-21-
hydrogensuccinat
Euri-Pharm Arzneimittel, Piding, Ch.-B. A2001
3.3.6 Puffer, Gebrauchslösungen und Nachweisreagenzien
Alle Puffer und Lösungen wurden, wenn nicht anders angegeben, mit Aqua dest. oder Aqua
tridest. hergestellt und der angegebene pH-Wert bei Bedarf durch Zusatz von Salzsäure (HCl)
(3.3.2) oder Natriumhydroxid (NaOH) (3.3.2) eingestellt.
3.3.6.1 Für den Funktionellen In vitro-Test (FIT)
a) Puffer
Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS):
PBS-Trockensubstanz wird in Aqua tridest. gelöst. Die Konzentration der Bestandteile (3.3.2)
in der Lösung war:
NaCl 137,0 mmol/l
KC l2,7 mmol/l
Na2HPO4 8,1 mmol/l
KH2PO4 1,12 mmol/l
Der Puffer wurde auf einen pH-Wert von 7,4 eingestellt und bei einer Temperatur von 4°C
gelagert.
Material und Methoden 43
Pipes A:
Die Konzentration der Bestandteile (3.3.2) in der einfachen Lösung betrug:
NaCl 110 mmol/l
KCl 5 mmol/l
Pipes 25 mmol/l
NaOH 40 mmol/l
Die Pipes-A-Pufferlösung wurde als 10-faches Konzentrat angesetzt und bei einer Temperatur
von -20°C gelagert. Bei Bedarf wurde das Konzentrat aufgetaut und 1:10 mit Aqua dest.
verdünnt sowie die hergestellte Lösung auf einen pH von 7,2 eingestellt.
Pipes B:
MAASCH ET AL. (1984) entwickelte den Freisetzungspuffer (Pipes B), KAUL modifizierte ihn
1998. Ein Zusatz von Ca2+- und Mg2+-Ionen zum Puffer war für die Freisetzungsreaktion
notwendig, da bei der Gewinnung der Blutzellen die vorhandenen Calcium- und
Magnesiumionen durch den Gerinnungshemmer gebunden wurden. Diese Ionen sind aber für
die Zellaktivierung zur Histaminfreisetzung notwendig (MAASCH ET AL., 1984, MAGRO ET
AL., 1988). Die Bestandteile (3.3.2) waren:
Pipes A mit Zusatz von (final):
CaCl2 2 mmol/l
MgCl2 2 mmol/l
Der Puffer wurde bei einer Temperatur von 4°C aufbewahrt.
Tris-Puffer:
Der 0,5-molare Tris-Puffer diente der Pufferung der Acylierungsreaktion. Zur besseren Ver-
teilung der Acylierungslösungen wurde dem Puffer Tween 20 in einer Endkonzentration von
0,02 % zugesetzt.
Die Bestandteile (3.3.2) waren:
Aqua dest. 380 ml
Tris 30 g
Tween 20 0,1 ml
Die Pufferlösung wurde mit konz. HCL (3.3.2) auf einen pH-Wert von 8,5 eingestellt und
dann mit Aqua dest auf 500 ml aufgefüllt.
Material und Methoden 44
b) Gebrauchslösungen
Antikörper:
Die Antikörper (3.3.4) gegen die equinen Isotypen IgG und IgE, goat-anti-horse IgG(H+L)
und mouse-anti-horse IgE, wurden bei -20°C und bei 4°C gelagert und in folgenden
Finalkonzentrationen und -verdünnungen in Pipes B (3.3.6.3a) eingesetzt:
Goat-anti-horse IgG(H+L): 60 und 20 µg/ml
Nativer Zellkulturüberstand eines mouse-anti-horse-IgE-Zellklons (3.3.3):
Finalverdünnung 1:4
Allergene:
Die aufgereinigten Aliquots (3.3.4) in Pipes B (3.3.6.3) wurden bei -20° C gelagert. Zur
Histaminfreisetzung wurden Lösungen folgender Stammkonzentrationen in Pipes B (3.3.6.3)
verwendet:
Culicoides nubeculosus (Cn): 30 µg/ml, 10 µg/ml, 1 µg/ml sowie 0,1 µg/ml
Tabanus spp. (HF): 100 µg/ml bis 0,1 µg/ml in Zehnerschritten
Culicidae spp. (Mq): 100 µg/ml bis 0,1 µg/ml in Zehnerschritten
Rekombinantes Protein „A“ aus Trichostrongylus colubriformis („TcA“):
80 µg/ml bis 0,0008 µg/ml in Zehnerschritten
Rekombinantes Protein „B“ aus Trichostrongylus colubriformis („TcB“):
8 µg/ml bis 0,00008 µg/ml in Zehnerschritten
Cyathostominae spp. („kleine Strongyliden“):
2 µg/ml bis 0,00002 µg/ml in Zehnerschritten
Histamin-Standards:
Zur Erstellung einer Histamin-Referenzkurve wurden Histamin-Standards in 0,1 N HCl
(3.3.2) in den Finalkonzentrationen 100, 30, 10, 3, 1 und 0,3 ng/ml eingesetzt.
Das Histamin wurde als freie Base in kristalliner Form auf der Analysenwaage abgewogen
und in 0,1 N HCl gelöst. Die hergestellten Lösungen wurden in Aliquots zu 1 ml bei einer
Temperatur von -35°C gelagert. Die jeweils in Gebrauch befindlichen Aliquots wurden bei
einer Temperatur von 4°C aufbewahrt.
Material und Methoden 45
NHS-Biotin ( Acylierungsreagenz):
Das NHS-Biotin (3.3.2) wurde in einer Konzentration von 50 mg/ml in DMSO (3.3.2)
angesetzt und in Aliquots zu 1 ml bei -35°C gelagert. Das NHS-Biotin wurde zur Umsetzung
des nativen Histamins in N-Acyl-Histamin eingesetzt, da der im RIA verwendete Antikörper
nur N-Acyl-Histamin erkennt.
Dazu wurde das NHS-Biotin direkt vor Gebrauch 1:25 mit Pipes A (3.3.6.3) verdünnt.
c) Nachweisreagenzien
Ziege-anti-Acylhistamin-Serum:
Das Ziege-anti-Acylhistamin-Serum diente dem Nachweis von N-Acyl-Histamin.
Das native Ziege-anti-Acylhistamin-Serum wurde in einer Verdünnung von 1:1000 in PBS
mit einem Zusatz von 1% Ziegennormalserum bei einer Temperatur von -30°C gelagert.
Im RIA wurde das Serum in einer Stammverdünnung von 1:100.000 in einem Reagenz mit
folgenden Bestandteilen (3.3.2) eingesetzt:
PBS 97,8 ml
Ziege-anti-Acylhistamin Nativserum (1 :1000) 1 ml
Ziegenserum, normal 1 ml
Natriumazid, 10% 0,2 ml
Präzipitationsserum:
Die im RIA gebildeten Immunkomplexe (3.4.3.2) aus N-Acyl-Histamin bzw. 125Jod
markiertem Tracer-Histamin und Histamin-Antikörpern des Ziegenserums wurden mit Hilfe
eines zweiten Antikörpers aus dem Esel (donkey-anti-goat IgG) präzipitiert.
Das Präzipitationsserum (donkey-anti-goat final 1:200) wurde aus folgenden Bestandteilen
(3.3.2) angesetzt:
PBS 1000 ml
Donkey-anti-goat Serum 5 ml
PEG 50 g
Triton X 100, 25% 2 ml
Natriumazid, 10% 2 ml
Bis zum Verbrauch wurden die Nachweisreagenzien bei einer Temperatur von 4°C gelagert.
Material und Methoden 46
3.3.6.2 Für den ELISA
1. Puffer
Coatingpuffer (A-Puffer):
Der Puffer setzte sich aus folgenden Bestandteilen (3.3.2) zusammen:
Na2CO3 15 mmol/l
NaHCO3 35 mmol/l
Der Puffer wurde auf einen pH-Wert von 9,6 eingestellt und bei einer Temperatur von 4°C bis
zum Gebrauch gelagert.
Wasch- und Verdünnungspuffer (B-Puffer):
Die Bestandteile (3.3.2) dieses Puffers waren:
NaH2PO4 2,5 mmol/l
Na2HPO4 7,5 mmol/l
NaCl 145 mmol/l
Tween 20 0,1%
Der Puffer wurde als 10-faches Konzentrat angesetzt und bei einer Temperatur von 4°C bis
zum Gebrauch gelagert. Bei Bedarf wurde er 1:10 mit Aqua dest. verdünnt und auf einen pH-
Wert von 7,2 eingestellt
Substratpuffer (C-Puffer):
Die Zusammensetzung dieses Puffers war (3.3.2):
Citrat 33,3 mmol/l
Na2HPO4 66,7 mmol/l
Der Puffer wurde auf einen pH-Wert von 5,0 eingestellt und bei einer Temperatur von 4°C bis
zum Gebrauch gelagert.
2. Gebrauchslösungen
TMB in DMSO
Die Bestandteile der Lösung waren (3.3.2):
Tetramethylbenzidine (TMB) 150 mg
Dimethylsulfoxid (DMSO) 100 ml
Diese Lösung wurde in 1 ml-Aliquots bei -20°C bis zum Gebrauch gelagert.
Material und Methoden 47
Substratlösung:
Die Substratlösung wurde unmittelbar vor Gebrauch aus folgenden Substanzen hergestellt:
TMB in DMSO (s.o.) 1 ml
Substratpuffer (C-Puffer, 3.3.6.3) 10 ml
H2O2 (3%ig, 3.3.2) 40 µl
Schwefelsäure, 1 N (3.3.2)
3.3.6.3 Für den Nematodennachweis
Gesättigte Kochsalzlösung:
Zur Herstellung dieser Lösung (spezifisches Gewicht 1,2) wurden 360 g NaCl in 1000 ml
Aqua dest. gelöst.
3.3.6.4 Für die Allergenpräparation
Zur Herstellung der Allergenpräparation wurde ein 0,01 M Ammoniumhydrogen-
carbonatpuffer verwendet. Dazu wurden 0,395 g NH4HCO3 in 500 ml A. dest. gelöst und die
Lösung bei 4°C aufbewahrt.
3.3.7 Software zur Datenauswertung
Die Berechnung der ELISA-Units (3.4.6.3) wurde mit Microsoft® Excel 2002 durchgeführt,
die statistischen Berechnungen zur Signifikanz einer Gruppenbildung (4.5.2) mit Graph Pad
Prism 4® für Windows, Version 4.00, 2003.
Material und Methoden 48
3.4 Methoden
3.4.1 Versuchsaufbau
In den Versuchsjahren 2003 und 2004 wurden von allen Pferden regelmäßig Blut- und
Serumproben gewonnen, die zur Untersuchung des Gesamthistamingehaltes sowie des
Sensibilisierungsgrades von basophilen Granulocyten und von spezifischen Antikörpertitern
dienten.
3.4.1.1 Versuchsaufbau im Jahr 2003
Im Jahr 2003 sollte eine spezifische Sensibilisierung der equinen basophilen Granulocyten
gegen TcA und TcB induziert bzw. verstärkt werden. Zu diesem Zweck war eine gezielte
Immunisierung der Versuchsgruppe (n=14) mit je 100 µg dieser beiden Proteine pro Pferd
durch zweimalige intramuskuläre Applikation der Antigene in die Brustmuskulatur im
Abstand von 28 Tagen vorgesehen. Die Kontrollgruppe (n=10) erhielt nur das Lösungsmittel
mit Adjuvans ohne Antigene. Beide Gruppen sollten sechs Tage nach der zweiten
Immunisierung jeweils 1 mg Methylprednisolon (Urbason® solubile forte 250, 3.3.5) pro
Kilogramm Körpergewicht intravenös erhalten, da bekannt ist, dass eine ausreichende
intravenöse Applikation von Corticosteroiden zu einer Eliminierung basophiler Granulocyten
und dadurch zu einer drastischen Reduzierung des Gesamthistamins im Blut führt (siehe 2.3).
Neu aus dem Knochenmark auswandernde naive Basophile besetzen ihre Fc-Rezeptoren mit
im Serum frei verfügbaren Antikörpern, vornehmlich des Isotypes IgE, und erhalten so ein
dem aktuellen Antikörperverhältnis entsprechendes Antikörperspektrum auf ihren Fc-
Rezeptoren (sog. „Aktualisierungstest“). Durch die Immunisierung mit TcA und TcB sollte
der TcA- und TcB-spezifische Antikörpertiter angehoben werden, so dass die vermehrt im
Serum vorkommenden anti-TcA- und anti-TcB-Antikörper möglicherweise auch vermehrt
von den Fc-Rezeptoren der naiven Basophilen gebunden werden. Diese veränderte
Sensibilisierung kann im Funktionellen In-vitro-Test (FIT) (3.4.3) überprüft werden. Der
Versuchszeitpunkt wurde auf den Spätwinter gelegt, um einen relativen niedrigeren Titer der
gegen Insektenallergene gerichtete Antikörper im Pferd vorzufinden.
Der tatsächliche Versuchsablauf (4.1.1) jedoch bedingte mindestens eine Methyl-
prednisoloninjektion von 1-2 mg/kg KGW (Urbason® solubile) innerhalb der ersten zwölf
Stunden nach Immunisierung der Versuchsgruppe mit den rekombinanten Proteinen TcA und
TcB. Nur ein Pferd erhielt kein Corticosteroid.
Material und Methoden 49
Einteilung der Pferde in Versuchgruppen im Jahr 2003
Ekzemer Nichtekzemer
Versuchsgruppe (TcA/TcB-Pferde) #1, #2, #5, #12 #18, #20, #22, #27, #32
Kontrollgruppe #6, #8, #10, #11 #16, #17, #24, #25, #28#, #29
Tabelle 2: Einteilung der Pferde in Versuchgruppen im Jahr 2003 Dargestellt ist die Verteilung der Versuchspferde (3.1.1) nach Ekzemern und Nichtekzemern auf die in 3.4.1.1 vorgestellten Versuchsgruppen. 3.4.1.2 Versuchsaufbau im Januar 2004
Da eine erneute Immunisierung mit den rekombinanten Proteinen TcA und TcB nicht möglich
war (4.1.1), wurde der Antigenboost durch die massive Antigenfreisetzung im Zuge einer
Entwurmung der stark verwurmten Pferde zu induzieren versucht. Diese Antigenfreisetzung
sollte zu einer deutlichen Erhöhung der parasitenspezifischen (IgE) Antikörpertiter führen, um
dann einen erneuten Aktualisierungstest durch Applikation von Methylprednisolon
durchzuführen.
Es wurden drei etwa gleich große Gruppen gebildet. Gruppe I stellte die eigentliche
Versuchsgruppe dar. Sie wurde Ende Januar 2004 mit Moxidectin (Equest®) und Praziquantel
(Droncit®) entwurmt und sieben Tage später mit jeweils 1 mg Methlyprednisolon (Urbason®)
pro Kilogramm Körpergewicht behandelt.
Die erste Kontrollgruppe, Gruppe II, erhielt drei Wochen vor der Wurmkur das
Methylprednisolon, um die Effekte des Corticoides feststellen zu können. Gruppe III erhielt
kein Corticoid, nur die Anthelmintika. Tabelle 3 verdeutlicht den Versuchsaufbau.
Versuchsaufbau im Januar 2004
Gruppe I Gruppe II Gruppe III
05.01.04 Methylprednisolon
19.01.04 Entwurmung Entwurmung Entwurmung
26.01.04 Methylprednisolon
Tabelle 3: Versuchsaufbau im Januar 2004 Die Tabelle gibt den Versuchsaufbau zur Modulation durch anthelminthische Behandlung an. Es wurden drei Gruppen gebildet. Alle Gruppen wurden am 19.01.04 entwurmt. Gruppe II erhielt zur Untersuchung des reinen Cortisoneffektes am 5.01.04 1 mg/kg KGW Methylprednisolon, Gruppe I sieben Tage nach der Entwurmung dieselbe Dosierung. Gruppe III wurde entwurmt, aber weder vorher noch nachher mit Cortison behandelt.
Material und Methoden 50
Einteilung der Pferde in Versuchsgruppen im Jahr 2004
Ekzemer Nichtekzemer
Gruppe I #1, #6, #9, #11 #18, #23, #24, #25, #28
Gruppe II #7, #8, #12 #16, #20, #27, #29, #32
Gruppe III #4, #10 # 21, #22, #30, #31, #33
Tabelle 4: Einteilung der Pferde in Versuchsgruppen im Jahr 2004 Dargestellt ist die Verteilung der Versuchspferde (3.1.1) nach Ekzemern und Nichtekzemern auf die in Tabelle 3 vorgestellten Versuchsgruppen.
Jeweils vor den Cortisonapplikationen und der Entwurmung wurde ein Status des
Sensibilisierungsgrades (FIT) erhoben. Im 6-, 12-, 24-, 36-, 48-stündigem und danach
täglichem Abstand wurde über einen Zeitraum von jeweils zehn Tagen der
Gesamthistamingehalt der basophilen Granulocyten durch physikalische Freisetzung (3.4.3.1)
bestimmt. Gleichfalls wurden zu denselben Zeitpunkten Serumproben für eine
Antikörpertiterbestimmung gewonnen. Der Entwurmungserfolg wurde durch
Kotuntersuchungen vor und nach dem Versuch überprüft.
3.4.2 Blutentnahme
Für alle Blut- oder Serumuntersuchungen (FIT und ELISA) wurde den Versuchspferden bei
Bedarf wechselweise die rechte oder linke Vena jugularis unter Wahrung der medizinischen
Sorgfaltspflicht punktiert und eine Blutprobe mittels Vacutainer-System (3.3.1, FIT K2E, 10
ml oder 5ml, Serum CAT, 10 ml oder 5 ml) gewonnen.
3.4.3 Funktioneller In-vitro-Test (FIT) zur Bestimmung der Sensibilisierung
basophiler Granulocyten
Für diesen Test wurde den Versuchspferden steriles, mit EDTA gerinnungsgehemmtes Blut
entnommen und bei Raumtemperatur bis zur Bearbeitung gelagert. Die Verarbeitung der
Proben erfolgte innerhalb von drei bis vierundzwanzig Stunden nach der Entnahme. Die
Bestimmung des Sensibilisierungsgrades erfolgte nach dem von KAUL (1998) entwickelten
Verfahren. Dabei setzen basophile Granulocyten u.a. Histamin frei, wenn sie im Rahmen
einer Typ-I-Reaktion (2.3) durch Antikörper oder Allergene aktiviert werden. Histamin ist in
den anderen Zellen des Blutes nur in vernachlässigbaren Spuren vorhanden, so dass das in
diesem Test freigesetzte und gemessene Histamin aus aktivierten Basophilen stammen muss.
Material und Methoden 51
3.4.3.1 Histaminfreisetzung (Release)
Zur Entfernung von Serumbestandteilen wie freien Antikörpern und evtl. vorhandenem freien
Histamin wurden die Blutproben zunächst zweimal mit sterilem PBS (3.3.6.1) gewaschen.
Dazu wurde das EDTA-gerinnungsgehemmte Blut jedes Tieres in ein steriles 50-ml-
Zentrifugenröhrchen (3.3.1) übertragen und mit PBS auf 50 ml Gesamtvolumen aufgefüllt.
Die sorgfältig gemischte Probe wurde bei 10°C und 400 xg ohne Bremse zentrifugiert, der
Überstand abgenommen, abermals auf 50 ml mit PBS aufgefüllt, resuspendiert und wiederum
bei den vorgenannten Werten zentrifugiert. Der Überstand wurde erneut bis auf das
Aufgangsvolumen der Blutprobe abgenommen und verworfen, die gewaschenen Blutzellen
vor der weiteren Verarbeitung gründlich resuspendiert.
Die eigentliche Histaminfreisetzung (Histaminrelease) erfolgte in mehreren Ansätzen:
a) Spontanfreisetzung:
Dieser Ansatz dient als Kontrolle einer unspezifischen Aktivierung oder Schädigung und
damit einer nicht-allergen- oder nicht-antikörpervermittelten Histaminfreisetzung durch die
basophilen Granulocyten.
Hierbei werden 250 µl der gewaschenen Blutzellsuspension mit 250 µl des Freisetzungspuffer
Pipes B (3.3.6.1) versetzt.
b) Physikalische Maximalfreisetzung:
Bei der Maximalfreisetzung werden die histaminhaltigen basophilen Granulocyten durch
Hitzeinwirkung zerstört und so das enthaltene Histamin in den Überstand abgegeben.
Dazu wurden 200 µl der Blutzellsuspension zu 800 µl des Freisetzungspuffers Pipes B
pipettiert und für zehn Minuten im Wasserbad gekocht. Um einen Überdruck im
Reaktionsgefäß zu verhindern, wurde der Deckel des zu kochenden Gefäßes mit einer Kanüle
perforiert. Die gekochte Probe wurde anschließend bei 3000 xg für drei Minuten zentrifugiert
und der partikelfreie Überstand gewonnen.
c) Antikörpervermittelte Freisetzung:
Bei dieser Freisetzung kamen verschiedene Antikörper gegen zwei unterschiedliche equine
Ig-Isotypen zum Einsatz. Der Antikörper goat-anti-eqIgG(H+L) (goat-anti-horse, gαh-IgG,
3.3.6.1) soll an Fcγ-Rezeptoren gebundene Antikörper des Isotypen G auf basophilen
Granulocyten miteinander kreuzvernetzen und so eine Fc-Rezeptorvermittelte
Material und Methoden 52
Histaminfreisetzung bewirken. Der aus einem Zellkulturüberstand gewonnene monoklonale
mouse-anti-eqIgE-Antikörper soll ebenfalls auf basophilen Granulocyten an Fcε-Rezeptoren
gebundene IgE-Moleküle unabhängig von ihrer Spezifität binden und so die Fcε-Rezeptoren
kreuzvernetzen. Auch diese Vernetzung bewirkt eine Freisetzung des in den Granula
gespeicherten Histamins aus diesen Zellen.
Dazu wurden 250 µl der gewaschenen Blutzellen und 250 µl der gαh-IgG-Lösung in den
Finalkonzentrationen 60 und 20 µg/ml bzw. 250 µl der mouse-anti-eqIgE 1:4 final in Pipes B
zusammengegeben.
d) Allergen- und Antigeninduzierte Freisetzung:
Statt der Bindung der FcR-gebundenen IgE oder IgG auf den basophilen Granulocyten durch
Antikörper findet hier die Erkennung von spezifischen Proteinen, die als Allergen wirken,
durch die Fc-gebundenen Antikörper statt. Die Kreuzvernetzung der Fc-Rezeptoren durch
Bindung von mindestens zwei IgE (ggf. auch IgG) an ein Antigen (bzw. Allergen) bewirkt
wieder eine Aktivierung der Zelle und eine Histaminausschüttung.
Folgende als Allergene wirksame Antigenpräparationen (3.3.6.1) kamen zum Einsatz:
Culicoides nubeculosus (Cn): 15 µg/ml, 5 µg/ml, 0,5 µg/ml sowie 0,05 µg/ml
Tabanus spp. (HF): 50 µg/ml, 5 µg/ml, 0,5 µg/ml sowie 0,05 µg/ml
Culicidae spp. (Mq): wie Tabanus spp.
TcA: 40 µg/ml – 0,0004 µg/ml in Zehnerschritten
TcB: 4 µg/ml – 0,00004 µg/ml in Zehnerschritten
Cyathostominae spp.: 1 µg/ml – 0,00001 µg/ml in Zehnerschritten
Alle Präparationen enthielten kein Histamin.
Wie schon bei der antikörpervermittelten Freisetzung wurden auch hier 250µl der
gewaschenen Blutzellen mit 250 µl der in Pipes B verdünnten Allergenpräparation versetzt.
Der Freisetzungspuffer Pipes B ersetzte die durch die Blutprobengewinnung in EDTA-
Röhrchen gebundenen Ca2+- und Mg2+-Ionen, die die Basophilen zur Degranulation brauchen.
Die Finalkonzentration dieser Ionen betrug jeweils 1 mmol/l Ca2+ und 1 mmol/l Mg2+.
Alle Puffer und Allergenpräparationen wurden in Eppendorf-Cups zu 1,5 ml (3.3.1) vorgelegt
und bei -30°C eingefroren, um bei Bedarf aufgetaut und mit der entsprechenden Menge der
Material und Methoden 53
gewaschenen Blutzellen vermischt zu werden. Nach der gründlichen Vermischung wurden die
Releaseansätze mit Ausnahme des Ansatzes für die Maximalfreisetzung 60 Minuten bei 37°C
inkubiert, um den basophilen Zellen eine Degranulation zu ermöglichen. Nach dieser Stunde
wurden die Cups auf Eis auf 4°C für mindestens zwanzig Minuten heruntergekühlt, um die
Freisetzungsreaktionen zu stoppen. Anschließend erfolgte eine Zentrifugation bei 4°C und
400 xg für zehn Minuten. Die Überstände wurden vorsichtig abgenommen und bei -20°C bis
zur Weiterverarbeitung im RIA eingefroren. Die physikalische Maximalfreisetzung erfolgte
durch zehnminütiges Kochen im Wasserbad. Nach drei Minuten Zentrifugation bei 3000 xg
wurde auch hier der Überstand gewonnen und eingefroren.
3.4.3.2 Radio-Immuno-Assay (RIA)
Der Radio-Immuno-Assay diente zur Bestimmung des jeweiligen Gesamthistamingehaltes
des Probenüberstandes in Nanogramm pro Milliliter Vollblut. Der hier verwendete RIA war
ein kompetitiver Ansatz. Es konkurrierten hier das in der Probe enthaltene Histamin mit
einem mit Iod125-markierten Markerhistamin (Tracer, 3.3.2) um eine definierte Menge an
Histamin-erkennenden Antikörpern. Diese Antikörper erkannten jedoch kein natives
Histamin, da gegen dieses weitverbreitete Molekül keine Antikörper gebildet werden. Eine
Acylierung von Histamin führte zu Acylhistamin, gegen das in der Ziege Immunglobuline
erzeugt werden konnten (goat-anti-acylhistamine (gαAch), 3.3.3). Durch eine Acylierung des
Probenhistamins mittels NHS-Biotin (3.3.2) war es möglich, ein kompetitives System aus
dem durch die Markierung acylierten Iod125, dem Probenhistamin und dem gαAch-Antikörper
zu etablieren. Nach dem Massenwirkungsgesetz stellte sich ein dynamisches Gleichgewicht
zwischen den zwei Antigenen und dem Antikörper ein. Durch eine anschließende
Präzipitation der Antigen-Antikörper-Komplexe mittels eines gegen Ziegen gerichteten
Antikörpers aus dem Esel (donkey-anti-goat, 3.3.3) konnten die Komplexe abzentrifugiert,
der Überstand verworfen und die Radioaktivität im Präzipitat gemessen werden. Dabei
verhielt sich durch die Kompetition die gemessene Radioaktivität antiproportional zu dem in
der Probe vorhandenen Histamin. Eine Rückrechung der Messung auf den tatsächlichen
Histamingehalt war aufgrund einer in jedem RIA mitlaufenden Standardreihe möglich.
Ansatz und Acylierung des Probenhistamins:
Es wurden pro zu messender Probe in jeweils zwei Polystryrolröhrchen (3.3.1) je 100 µl des
Freisetzungsüberstandes vorgelegt sowie eine Standardreihe, ebenfalls in Doppelansätzen:
Material und Methoden 54
Standard: 100 ng/ml, 30 ng/ml, 10 ng/ml, 3 ng/ml, 1 ng/ml und 0,3 ng/ml
in 0,1 N HCl (3.3.6.3), jeweils 50 µl plus 50 µl Pipes B (3.3.6.3)
Für den Nullwert (B0, histaminfreie Probe) und die unspezifische Bindung (NSB):
50 µl 0,1 N HCl plus 50 µl Pipes B
Überstand aus der Releasereaktion: 100 µl
In zwei Röhrchen wurde nur Tracer pipettiert (Tracerkontrolle).
RIA:
Pro Röhrchen wurden nun jeweils 50 µl Tris-Puffer (3.3.6.1) und NHS-Biotin (3.3.6.1) als
Acylierungsreagenz hinzugegeben und bei Raumtemperatur für dreißig Minuten inkubiert.
Danach wurden 50 µl der goat-anti-Ach-Lösung (3.3.6.1) in jedes Röhrchen mit Ausnahme
der Tracerkontrolle und der NSB-Kontrolle pipettiert. Das radioaktiv markierte Iod125 wurde
mit einem Volumen von 25 µl zu jedem Röhrchen hinzugefügt. Es folgte eine Inkubationszeit
von sechzehn bis zwanzig Stunden bei 4°C.
Danach wurde jedes Röhrchen mit Ausnahme der Tracerkontrolle mit je 1 ml
Präzipitationsserum (donkey-anti-goat, 3.3.6.3) versetzt, 15 Minuten bei 4°C inkubiert und
weitere 15 Minuten bei 1500 xg zentrifugiert. Die Überstände wurden verworfen (nicht
jedoch die Tracerkontrolle) und die radioaktiven Präzipitate im Gamma-Counter (LKB
Wallac 1272 Clinigamma (3.2)) ausgewertet. Dieses Gerät zählte die Zerfallsimpulse pro
Minute und gab sie als counts per minute (cpm) an.
Auswertung:
Aus den gezählten Impulsen der Doppelansätze wurde zunächst ein Mittelwert gebildet, dann
diesem der Wert des NSB, der unspezifischen Bindung, abgezogen und das Resultat als
Prozentsatz der histaminfreien Probe (B0) ausgedrückt (B/B0%). Die bekannten
Histaminwerte der Standardlösungen wurden zur Erstellung einer Standardkurve
herangezogen und in einem Graphen auf der logarithmisch eingeteilten Abszisse aufgetragen.
Die entsprechenden B/B0%-Werte wurden auf der linearen Ordinate zugeordnet. Mittels einer
sigmoidalen Anpassungsfunktion konnten die B/B0% der Proben in Histaminkonzentrationen
umgerechnet werden.
Material und Methoden 55
Die Gleichung zur Erstellung der Anpassungsfunktion lautet:
2)0/(1
21 AxxAAy p +
+−
= mit:
A1 obere Asymptote
A2: untere Asymptote
x0: Wendepunkt
p: Potenz
x : Histaminkonzentration
y: B/B0%-Wert
Der Histamingehalt der maximalen Freisetzung einer jeden Blutprobe (physikalische
Freisetzung (Kochansatz) oder antikörpervermittelte Freisetzung (goat-anti-horse IgG (H+L)
(gαh) 60µl/ml) wurde gleich 100% gesetzt und die Histamingehalte der anderen Ansätze
derselben Blutprobe in Prozent der Maximalfreisetzung angegeben (nach KAUL, 1998).
Zur Auswertung kamen die Daten eines Tieres nur, wenn die Spontanfreisetzung unter 6% der
Maximalfreisetzung lag. Diese Grenze ergab sich aus den Untersuchungen von KAUL und
beruht auf dem Mittelwert aller gemessenen Spontanfreisetzungen zuzüglich der dreifachen
Standardabweichung. Ein Releaseansatz (antikörper- oder allergenvermittelt), in dem
mindestens 10% der Maximalfreisetzung oder mehr gemessen wurden, wurde als „positiv“
bewertet. Dieser Wert ergab sich aus den Mittelwerten aller gemessenen
Spontanfreisetzungen zuzüglich der sechsfachen Standardabweichung. War ein Ansatz nur in
der geringsten Verdünnungsstufe einer Allergenpräparation (3.3.6.1) positiv, wurde er mit
„1+“ (sensibilisiert) bewertet, war er in den ersten zwei Verdünnungstufen positiv, mit „2+“
(stark sensibilisiert), in den ersten drei mir „3+“ (hochgradig sensibilisiert), in vier mit „4+“
(höchstgradig sensibilisiert). Eine Ausnahme stellen die in sechs Verdünnungsstufen
eingesetzten Allergenpräparationen aus TcA, TcB und aus Cyathostominae (kleinen
Strongyliden) (3.3.6.3) dar, deren Sensibilisierungsgrad nur mit „1+“ bis „6+“ angegeben
wurde. Ein negatives Releaseergebnis (<10%) wurde mit „0“ bezeichnet.
Material und Methoden 56
3.4.4 Immunisierung
Im Versuch des Jahres 2003 (3.4.1) wurden neun Pferde mit den rekombinanten Proteinen
TcA und TcB (3.3.3) immunisiert. Dazu wurden jeweils pro Tier 100 µg TcA und TcB mit 5
mg Aluminiumhydroxid steril in PBS (3.3.2) verdünnt und mit PBS auf ein Volumen von 2
ml aufgefüllt.
Die Injektion erfolgte mit medizinischer Sorgfalt in die Brustmuskulatur der Pferde. Es
wurden zunächst zwei Tiere injiziert und für 30 Minuten beobachtet, ob sich möglicherweise
Unverträglichkeitsreaktionen zeigten. Danach wurden alle Tiere nach dem festgelegten
Versuchsplan immunisiert, jedoch erhielten nur neun von vierzehn Pferden die TcA/TcB-
Antigene (4.1.1).
3.4.5 Entwurmung
Neben den im Rahmen der Weidehygiene durchgeführten Entwurmungen wurde im Versuch
des Jahres 2004 (3.4.1.2) im Rahmen des Versuchs eine Entwurmung mit den Wirkstoffen
Moxidectin (Equest®, 3.3.5) (in der vorgeschriebenen Dosierung von 0,4 mg Moxidectin pro
Kilogramm Körpergewicht) und Praziquantel (Droncit® orales Gel, 3.3.5) (1 mg pro
Kilogramm Körpergewicht) durchgeführt.
In weiteren versuchsbeeinflussenden anthelminthischen Behandlungen der Tiere wurde
Pyrantelpamoat (Jernadex®, 3.3.5) in einer Dosierung von 19 mg pro Kilogramm
Körpergewicht eingesetzt.
Die Anthelmintika wurden oral verabreicht.
3.4.6 ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)
Zur Bestimmung der Antikörpertiter der verschiedenen Immunglobulinisotypen der Pferde
gegen die verwendeten Versuchsproteine TcA, TcB (3.3.4) und gegen Cyathostominae als
Stellvertreter der Nematoden war es notwendig, einen Isotypen-ELISA für die Isotypen
eqIgE, eqIgG1, eqIgG2, eqIgG4, eqIgG5, eqIgA und eqIgM zu entwickeln. Für die anderen
Isotypen, eqIgG3, eqIgG6 und IgG7, konnte kein ELISA etabliert werden, da die
entsprechenden Anti-Isotypen nicht oder nicht ausreichend zur Verfügung standen.
Ebenfalls wurde ein ELISA zur Bestimmung des eqIgE-Gesamttiters entwickelt.
Material und Methoden 57
3.4.6.1 Aufbau des Isotypen-ELISA
Es konnte das im Prinzip gleiche ELISA-System für alle verwendeten Versuchsproteine und
-präparationen genutzt werden. Als Antigen wurden jeweils 5 µg TcA bzw. TcB, (3.3.4) oder
5 µg der Strongylidenpräparation (3.3.4, 3.4.9) pro ml A-Puffer (3.3.6.2) als Coating-Lösung
eingesetzt. Mit dieser Lösung wurde jeweils die Hälfte einer 96-well-Mikrotiterplatte (3.3.1)
mit 50 µl pro Vertiefung beschichtet, die andere Hälfte nur mit A-Puffer als Negativkontrolle.
Die so beschichteten Mikrotiterplatten wurden mit Klebefolie abgedeckt und entweder für
zwei Stunden bei Raumtemperatur bei 500 rpm auf dem Mikrotiterplattenrüttler (3.2)
geschüttelt oder nach einer halben Stunde auf dem Plattenrüttler (ebenfalls 500 rpm, RT) über
Nacht bei 4°C im Kühlschrank aufbewahrt und am nächsten Morgen weiterverwendet.
Während dieser Zeit konnte über eine durch den hohen pH des A-Puffers induzierte
Polarisierung der Antigene eine Bindung an die stark polare Plattenvertiefung erreicht werden
(Coating). Dann wurden die Platten mit jeweils 400 µl B-Puffer (3.3.6.2) pro well von einem
ELISA-Washer (3.2) fünfmal gewaschen und dann von Hand trocken geschlagen. Die zu
untersuchenden Seren wurden in Zehnerschritten von 1:10 bis 1: 10.000 verdünnt und jeweils
50 µl pro Vertiefung in die Mikrotiterplatte pipettiert. Das zuvor ausgewählte und auf jeder
Platte mitlaufende Referenzserum wurde dabei als Standard jeder Mikrotiterplatte
hinzugefügt, um die Platten miteinander vergleichen zu können. Wieder mit Klebefolie
abgedeckt wurde der Ansatz für eine Stunde bei Raumtemperatur auf dem Rüttler (500 rpm)
inkubiert. Nun konnten im Serum vorhandene Antikörper jeden Isotyps an die gecoateten
Antigene binden, sofern sie für diese spezifisch waren. Diese Bindung ist stark genug, um
während der Dauer des Tests bestehen zu bleiben. Danach wurde der Waschvorgang
wiederholt (fünfmal 400 µl B-Puffer pro well, trockenschlagen) und der dem zu
untersuchenden Isotypen entsprechende Anti-Isotyp (mouse-anti-horse IgG1, mouse-anti-
horse IgG2, mouse-anti-horse IgG4, mouse-anti-horse IgG5, mouse-anti-horse IgA, 3.3.3,
Zellkulturüberstände, polclonales mouse-anti-eqIgE) in den Verdünnungen 1:30, im Falle des
Isotypen IgG2 1:10 und in dem des IgE 1:500, jedem well mit 50 µl zugesetzt. Diese
Antiisotyp-Antikörper konnten nun an die Immunglobuline binden, gegen deren Isotyp sie
gerichtet waren und die zuvor die plattengebundenen Antigene erkannt hatten. Nach einer
weiteren Stunde Inkubation auf dem Rüttler wurden die Platten erneut fünfmal mit B-Puffer
gewaschen, getrocknet und mit einem Peroxidase-gekoppelten goat-anti-mouse-IgG+IgM
(H+L)-Antikörper (3.3.3) in einer Finalverdünnung von 1:20.000 (50 µl pro Vertiefung) bzw.
im Falle des IgE bei der Untersuchung von Antikörpern gegen TcA und TcB Peroxidase-
Material und Methoden 58
gekoppeltes Streptavidin (Finalverdünnung 1:3000) (3.3.3) versetzt. Bei Untersuchung auf
IgE-Antikörper gegen die Cyathostominaepräparation wurde der Peroxidase-gekoppelte goat-
anti-mouse-Ak in der Verdünnung 1:10.000 eingesetzt. Da es sich bei allen Antiisotyp-
Antikörpern um Mäuseimmunglobuline handelte, konnte ein gegen Mäuseantikörper
gerichteter Antikörper (hier goat-anti-mouse) an alle Antiisotyp-Antikörper binden. Im Falle
der Untersuchung auf IgE gegen TcA oder TcB konnte eine Biotinylierung des polyclonalen
Mouse-anti-eqIgE ausgenutzt werden. Streptavidin bindet mit sehr hoher Affinität an
Biotinmoleküle, so dass es hier zu einer Bindung von Peroxidase-gekoppeltem Streptavidin
an den Anti-IgE-Antikörper kommen konnte. Nach 45 Minuten auf dem Schüttler (500 rpm,
RT) wurden die Mikrotiterplatten ein letztes Mal wie beschrieben gewaschen und mit 100 µl
Substratlösung (TMB mit Wasserstoffperoxid, 3.3.6.4) pro well versetzt. Bis zum
ausreichenden Farbumschlag (ca. 10 bis 20 Minuten) wurden die Platten im Dunklen bei RT
inkubiert. Der Farbumschlag wurde durch Sauerstoffradikale vermittelt, die von der an die
Anti-mouse-Antikörper gekoppelten Peroxidase aus Wasserstoffperoxid katalysiert wurden.
Je mehr Peroxidase im System ist, umso mehr H2O2 wird gespalten und umso mehr Radikale
sorgen für eine Farbreaktion des Substrates von farblos nach blau. Um die Umsetzreaktion zu
stoppen, wurden jeweils 50 µl 1 N Schwefelsäure (3.3.6.4) hinzugefügt. Dieses bewirkte
zusätzlich eine Farbänderung von blau nach gelb. Die Extinktion eines jeden wells wurde im
Dualmodus (Wellenlänge 570 nm (Referenzfilter) und 450 nm (Testfilter)) mit einem ELISA-
Photometer (3.2) gemessen und in „Millieinheiten optischer Dichte“ (mOD) ausgedrückt.
3.4.6.2 Aufbau des Gesamt-eqIgE-ELISA
Bei diesem ELISA handelte es sich um einen IgE-Sandwich-ELISA. Ein mouse-anti-eqIgE-
Antikörper (interne Labornummer #176, 3.3.3) wurde in einer Konzentration von 10 µg/ml in
A-Puffer (3.3.6.2) verdünnt und in einem Volumen von 50µl pro Vertiefung in eine 96-well-
Mikrotiterplatte gegeben. Die Mikrotiterplatte wurde mit einer Klebefolie verschlossen. Nach
zweistündigem Rütteln bei Raumtemperatur (500 rpm) auf dem Mikrotiterplattenschüttler
(3.2) oder 30-minütigem Rütteln bei ebenfalls 500 rpm und anschließender Aufbewahrung bei
4°C über Nacht im Kühlschrank wurde die Platte fünfmal mit B-Puffer (3.3.6.2) von einem
ELISA-Washer (3.2) gewaschen und anschließend trockengeklopft. Dann wurde das zu
untersuchende Pferdeserum in den Verdünnungsstufen 1:10 bis 10-6 in B-Puffer in Volumina
von 50µl pro well auf die Platte gegeben (mit Ausnahme der Negativkontrolle, hier wurde nur
B-Puffer einpipettiert), wieder mit der Klebefolie verschlossen und für eine Stunde auf dem
Material und Methoden 59
Plattenschüttler bei 500 rpm und Raumtemperatur inkubiert. Die an die Platte gebundene
Anti-eqIgE-Antikörper waren nun als Fänger-Ak in der Lage, alle in den Serumverdünnungen
vorhandenen Immunglobuline des Isotypen E zu binden, soweit es ihre Bindungskapazität
zuließ. Nach dieser Stunde wurde die Mikrotiterplatte abermals fünfmal gewaschen und
getrocknet (wie oben). Ein mit Biotin gekoppelter, polyclonaler anti-eqIgE-Antikörper (3.3.3)
wurde in einer Finalverdünnung von 1:1.000 in B-Puffer in die Platte gegeben (50 µl) und für
weitere 60 Minuten inkubiert. Diese polyclonale Antikörperpräparation konnte in dieser Zeit
an alle bereits aus dem Serum herausgefangenen und an den Fänger-Antikörper gebundenen
eqIgE binden. Nach Ablauf der Inkubationszeit wurde die Mikrotiterplatte erneut wie oben
gewaschen. Danach wurden je 50 µl einer Streptavidin-Peroxidase-Lösung (3.3.2, 1:3000
finalverdünnt) in jede Vertiefung geben und für eine weitere Stunde inkubiert (500 rpm, RT).
Das Streptavidin band mit einer hohen Affinität an das mit dem anti-eqIgE-Antikörper
gekoppelten Biotin. Nach einem weiteren Waschgang nach Ablauf der Inkubationszeit
wurden je 100 µl Substratlösung (TMB mit H2O2, 3.3.6.4) pro well in die Mikrotiterplatte
pipettiert und das System bei Raumtemperatur im Dunklen bis zu einem ausreichenden
Farbumschlag inkubiert (ca. 20-30 Minuten). Die an das Streptavidin gebundene Peroxidase
setzte das in der Substratlösung vorhandene Wasserstoffperoxid zu freiem Sauerstoff und
Wasser um, der freie Sauerstoff bewirkte eine farbige Umsetzung des Indikators Tetramethyl-
Benzidin (TMB) von farblos zu unterschiedlich kräftigem Blau. Diese Umsetzung konnte
durch pH-Wert-Erniedrigung mittels Schwefelsäure (1 N, 50 µl pro well, 3.3.6.2) gestoppt
werden, zusätzlich bewirkte die Säure einen Farbumschlag von blau zu gelb. Die Intensität
dieser Farbgebung (Extinktionen) konnte mittels Dualmodusmessung (ELISA-
Plattenphotometer, 3.2) bei Wellenlängen von 450 nm (Testfilter) und 570 nm (Referenzfilter)
quantifiziert und in „millioptischen Dichten“ (mOD) angegeben werden.
3.4.6.3 Auswertung der ELISA
Die Auswertung der ELISA-Ergebnisse erfolgte nach der Referenz-Standard-Methode
(PETERMANN, 1994). Als Standard für die Serumproben diente auf jeder Mikrotiterplatte
eine ausgewählte Serumprobe mit hohem Titer des zu detektierende Isotyps gegen das zu
untersuchende Antigen. Jede Probe wurde in vier bzw. fünf (Gesamt-IgE) aufeinander
folgenden Verdünnungsstufen gemessen. Zur Auswertung wurden die Hintergrundreaktionen
(Konjugatkontrolle, Messung von B-Puffer anstatt Serumprobe in zwei wells pro Platte)
Material und Methoden 60
abgezogen. Die Ergebnisse wurden mit denen des Standardserums als Titrationskurven in
einem Diagramm doppelt logarithmisch (x-Achse: log Titer, y-Achse: log der gemessenen
Extinktionen) aufgetragen, um die Kurven hinsichtlich ihrer Linearität und Parallelität ver-
gleichen zu können. Für alle Kurven wurde mit Hilfe einer linearen Regression eine
Geradengleichung nach der Formel y = ax + b erstellt, wobei a den Steigungsfaktor und b den
Schnittpunkt mit der y-Achse darstellt. Diese beiden Werte gingen in die Formel zur
Berechnung der relativen Titerhöhe in ELISA-Einheiten (ELISA-Units) ein:
log Titer Probe x 100
ELISA-Einheiten Probe = log Extinkt. Probe – log bs
log as 10
Die Abkürzung Extinkt. steht für Extinktion in mOD, as und bs sind nichtvariable
Komponenten der Geradengleichung der Standardkurve (Steigungsfaktor und Schnittpunkt
mit der y-Achse). Im zur Standardkurve parallelen Bereich der Kurven ergaben sich für jede
Probe in jeder Verdünnungsstufe entsprechende Einzelwerten, aus denen der Mittelwert
berechnet wurde. So ergab sich von jeder untersuchten Probe ein ELISA-Einheiten-Wert
(ELISA-Units) für die weitere Auswertung.
3.4.7 Cortisonapplikation
Das verwendete, in Trockensubstanz vorliegende Medikament Urbason® solubile (3.3.5) mit
dem Wirkstoff Methylprednisolon-21-hydrogensuccinat (Methylprednisolon) wurde zunächst
in Aqua dest. gelöst und auf 1 mg pro kg Körpergewicht dosiert. Die Injektion erfolgte mit
medizinischer Sorgfalt in die linke Vena jugularis.
3.4.8 Nematodennachweis
Der Grad der individuellen Nematodenbelastung jedes Pferdes wurde mehrmals jährlich
durch Kotuntersuchungen bestimmt. Im Rahmen des Versuches des Jahres 2004 wurden
jeweils vor und nach der anthelmitischen Behandlung parallel zu den Untersuchungen zur
Sensibilisierung der basophilen Granulocyten (FIT) Kotproben mittels Flotationsverfahren
untersucht. Dazu wurde zunächst eine Probe jedem Pferd rektal entnommen, kühl gelagert
und innerhalb der nächsten zwölf Stunden untersucht. Insgesamt 2 g Kot wurden von
Material und Methoden 61
verschiedenen Stellen der Probe entnommen und im „Fecalyzer“-System (3.3.1) mit
gesättigter Kochsalzlösung (3.3.6.3) gründlich vermischt. Das zum System gehörende Sieb
wurde eingeschraubt, der Behälter mit gesättigter Kochsalzlösung aufgefüllt und ein Deckglas
aufgelegt. Nach zwanzig bis dreißig Minuten wurde das Deckglas mit einer Pinzette auf einen
Objektträger überführt und das Präparat bei 50-facher Vergrößerung ausgezählt. Da es sich
um ein Übersichtsscreening zur Parasitenbelastung handelte, wurden nur Eier von Magen-
Darm-Strongyliden gezählt. In die Bewertung ging die rechnerische Eizahl pro Gramm Kot
ein.
3.4.9 Allergenpräparation (Cyathostominae spp.)
Fünfzig in Aqua dest. tiefgefrorene Nematoden (Cyathostominae spp.) wurden aus der
Flüssigkeit entfernt, getrocknet und in einem Mörser gründlich zerkleinert. 5 ml eines
Extraktionspuffers (0,01 M Ammoniumhydrogencarbonat, 3.3.6.4) wurden hinzugegeben und
die gründlich vermischte Suspension in ein Becherglas mit Rührstab überführt. Bei 4°C
wurden über Nacht unter ständigem Rühren Proteine aus den zerkleinerten Nematoden
extrahiert und in Lösung gebracht. Diese Lösung wurde am nächsten Tag bei ca. 5000 xg und
4°C abzentrifugiert. Das Pellet wurde abermals über Nacht in 5 ml 0,01 M
Ammoniumhydrogencarbonat extrahiert, diesmal mit einem Zusatz von 1 mM CHAPS
(3.3.2). Der Überstand beider Extraktionen wurde über eine PD10-Säule vom im FIT (3.4.3)
störenden Extraktionspuffer und evtl. vorhandenem, aus den Nematoden stammenden
Histamin gereinigt. Dazu wurde eine PD10-Säule zunächst mit 25 ml Freisetzungspuffer
(Pipes B, 3.3.6.1) gewaschen und 2,5 ml der Extraktionslösung über die Säule gegeben. Nach
Einsickern der Lösung in die Säule wurde mit 3,5 ml Pipes B nachgespült und die ablaufende
Flüssigkeit aufgefangen, die nun ca. 1:1,4 zur Ausgangspräparation verdünnt war. Nach
einem weiteren Spülen der Säule mit 15 ml Pipes B konnte der Vorgang so oft wiederholt
werden, bis das gesamte Volumen der Extraktionslösung aufgereinigt war. Jede
Extraktionsfraktion wurde separat aufgereinigt und anschließend über 0,45 µm- und 0,2 µm-
Sterilfilter filtriert. Über einen BCA-Assay (3.3.2) wurde der Proteingehalt beider
Extraktionslösungen bestimmt, die Lösungen aliquotiert und bei -30°C eingefroren.
Material und Methoden 62
3.4.10 BCA Protein Assay
Das Prinzip der Proteinbestimmung über einen BCA-Assay (vorgefertigt, 3.3.2) beruht auf
der sog. Biuret-Reaktion. Hierbei wird Cu2+ durch das Protein in einem alkalischen Medium
zu Cu1+ reduziert. Dieses Cu1+ reagiert unter Chelatbildung mit zwei Molekülen der BCA-
Lösung. Dieser Komplex ist farbig (violett) und kann je nach Menge der gebildeten
Komplexe über ein photometrisches System gemessen werden. Je höher der Proteingehalt der
zu testenden Lösung, umso schneller und intensiver erfolgt der Farbumschlag.
Die zu bestimmende Proteinlösung wird in Zweierschritten ebenso wie ein bekannter
Proteinstandard (BSA) bis 1:64 in PBS (3.3.2) verdünnt, dann 10 bis 25µl jeder Verdünnung
der zu bestimmenden Lösung und des BSA-Standards zu je 200µl einer vorgefertigten BCA-
Lösung (3.3.2) in Doppelansätzen in eine Mikrotiterplatte pipettiert und bis zu einem
ausreichenden Farbumschlag inkubiert. Die photometrische Auswertung erfolgt über ein
Photometer, z. B. einen ELISA-Reader (3.2), bei einer Wellenlänge von 562 nm.
Ergebnisse 63
4 Ergebnisse
4.1 Modulation der Sensibilisierung basophiler Granulocyten durch Immunisierung
mit den rekombinanten Proteinen TcA und TcB
Die basophilen Granulocyten sind mit einem heterogenen Antikörperspektrum besetzt, die
über Fc-Rezeptoren an die Membran gebunden sind. Für eine erfolgreiche Aktivierung dieser
Zellen ist eine Kreuzvernetzung rezeptorständiger, sensibilisierender Antikörper notwendig.
Dies setzt eine Mindestdichte von sensibilisierenden Antikörpern voraus, damit mindestens
zwei spezifische Antikörper „ihr“ Antigen erkennen und darüber kreuzvernetzt werden
können. Bei einem sehr vielfältigen Besatz aus einer Vielzahl von Antikörpern
unterschiedlicher Spezifitäten ist die Wahrscheinlichkeit einer Aktivierung des Basophilen
durch ein einzelnes Antigen aufgrund einer kompetitive „Ausverdünnung“ der spezifisch
erkennenden Antikörper geringer. Das Konzept, das in dieser Arbeit zugrunde lag, bestand in
einer selektiven Erhöhung der parasitenspezifischen Antikörper, insbesondere der gegen die
rekombinanten Proteine aus Trichostrongylus colubriformis „TcA“ und „TcB“, mittels einer
Immunisierung der Versuchspferde mit diesen Proteinen. Nach den Erfahrungen von
BRUENNLEIN (2001) ist es möglich, das Sensibilisierungsspektrum der Basophilen zu
„aktualisieren“, einer aktuellen Situation anzupassen. Nach der intramuskulären Injektion von
Methylprednisolon werden innerhalb weniger Stunden die Basophilen aus dem Blut eliminiert
und sind auch über ihren Histamingehalt (getestet in der physikalischen Freisetzung im
Funktionellen in-vitro-Test, FIT (3.4.3)) nicht mehr zu detektieren. Naive, neu aus dem
Knochenmark kommende Basophile besetzen ihre Fc-Rezeptoren mit passenden aktuellen
Antikörpern aus dem Serum, so dass alle dasselbe Sensibilisierungsmuster erhalten (sog.
„Aktualisierungstest“). In diesem Ansatz sollte eine Kompetition der TcA- und TcB-
spezifischen Antikörper mit allergen- bzw. insektenspezifischen Antikörpern auf den
Basophilen erreicht und so die Sensibilisierung moduliert werden. Der Antikörperbesatz sollte
also dahingehend verändert werden, dass hauptsächlich parasitenspezifische Antikörper (hier
Ak gegen die rekombinanten Proteine aus Trichostrongylus colubriformis, TcA und TcB) auf
den Fc-Rezeptoren der Basophilen binden und die Reaktionsbereitschaft gegen Allergene
(hier gegen Culicoides nubeculosus (Cn), Tabanus spp. (HF) und Culicidae spp. (Mq))
herabgesetzt, dagegen die gegen TcA und TcB induziert oder heraufreguliert werden.
In vorausgegangenen Tests konnte für einige Pferde eine vorhandene Sensibilisierung der
Basophilen gegen die rekombinanten Proteine beobachtet werden.
Ergebnisse 64
4.1.1 Paradoxe Reaktion der Versuchspferde auf die Immunisierung mit den
rekombinanten Proteinen TcA und TcB
Zur Erhöhung der Antikörpertiter gegen die rekombinanten Trichostrongylidenproteine TcA
und TcB (3.3.4) sollten vierzehn Pferde mit diesen Proteinen immunsiert werden (3.4.1.1). Es
wurden zunächst zwei Pferden, #22 und #32, Blutproben für FIT (3.4.3) und
Serumuntersuchungen (3.4.6) entnommen, die Pferde dann durch Injektion in die
Brustmuskulatur immunisiert und für mindestens dreißig Minuten beobachtet, ob sie
Unverträglichkeitsreaktionen zeigten. Da dies nicht der Fall war, wurden nach jeweiliger
Blutprobenentnahme sieben weitere Pferde daraufhin injiziert. Diese entwickelten in einem
Zeitrahmen von zehn Minuten bis zu sechs Stunden nach der Injektion unerwartet Symptome
einer Kolik mit hämorrhagischem Durchfall und sekundärem Schockgeschehen. Die beiden
Tiere, die zur Absicherung von Unverträglichkeitsreaktionen zuvor immunisiert worden
waren (# 22 und #32), blieben mit Ausnahme des Absatzes von wenig ungeformtem Kot bei
#22 sechs Stunden nach der Injektion völlig symptomlos. Tabelle 5 listet die Pferde mit ihren
individuellen Symptomen und Reaktionszeiten auf.
Individuelle Reaktionen der mit TcA und TcB immunisierten Pferde auf die Injektion
Pferd
Erste
Symptome
nach Symptome Erstversorgung Sonstiges
#1 60 min Durchfall, ruhige Brustlage Flunixin
#2 90 min ggr. Durchfall, ruhige
Brustlage
Flunixin
#5 20-30 min Wälzen, Schwitzen, Muskel-
tremor, hämorrhagischer
Durchfall, nach 2h Kreis-
laufschock, Herzfrequenz 90
Schläge /min, kapilläre
Füllungszeit ca. fünf Sek.,
bläuliche Schleimhäute,
kalte Hautoberfläche, Base
excess -11, Hämatokrit ca.
Keine Reaktion
auf Metamizol,
Scopolamin
oder Flunixin,
Infusion von 20
l Ringerlösung
Sektionsergebnis:
Hgr. akute nekro-
tisierende Typhlo-
colitis mit hgr.
Ödematisierung und
fokalen Blutungen in
Schleimhaut von
Colon und Caecum,
sekundäre Schock-
Ergebnisse 65
70% nach Infusion, Tod
nach ca. vierzig Stunden
trotz Intensivtherapie
symptome mit disse-
minierter intrava-
saler Gerinnung
#12 90 min Durchfall, Kolik,
Verschlechterung des
Kreislaufs innerhalb von drei
Stunden
Keine Reaktion
auf Metamizol
und Butyl-
scopolamin,
Besserung auf
Flunixin und
Infusion von 10
l Ringerlösung
#18 10 min Schubartige Koliksymptome
(Wälzen, Schwitzen),
hämorrhagischer Durchfall
Keine Reaktion
auf Metamizol
und Butyl-
scopolamin,
unter Flunixin
und Infusion (10
l Ringerlsg.)
Besserung ca.
drei Stunden
nach Beginn
#20 5-6 h starkes Schwitzen, flach auf
der Seite liegend, Durchfall
Keine Reaktion
auf Flunixin,
massive
Infusionstheapie
Langanhaltende
Schocksymptomatik,
intensivmedizinische
Betreuung
#22 (6h) (geringe Menge ungeformter
Kot), sonst keine Symptome
keine
Erstversorgung
#27 90 min Ggr.-mgr. Durchfall,
schwache Koliksymptome,
stabiler Kreislauf
Flunixin
#32 keine Symptome keine Therapie
Tabelle 5: Individuelle Reaktionen der mit TcA und TcB immunisierten Pferde auf die Injektion In dieser Tabelle sind die individuellen Reaktionen der erstmals mit den rekombinanten Proteinen TcA
Ergebnisse 66
und TcB (3.3.4) immunisierten Pferde bezüglich der Zeitdauer bis zum Einsetzen der ersten klinischen Symptome, der Art der Symptome sowie Informationen bezüglich der Erstversorgung und sonstiger Hinweise dargestellt.
Alle Pferde außer Tier #32 erhielten im Rahmen der klinischen Therapie u. a. einmalig
Methylprednisolon (Urbason® solubile, 1-2 mg/kg KGW intravenös) innerhalb von acht bis
zehn Stunden nach der Immunisierung.
Folgende Sensibilisierung gegen TcA oder TcB (getestet in Finalkonzentration von 40 und 4
µg/ml im FIT) war bei den immunisierten Pferden aus vorangegangenen Tests bekannt:
Bekannter Sensibilisierungsgrad der mit den rekombinanten Proteinen TcA und TcB
immunisierten Pferden
Pferd Nr. Sensibilisierung gegen TcA Sensibilisierung gegen TcB
#1 negativ negativ
#2 1+ unbekannt
#5 negativ negativ
#12 2+ unbekannt
#18 negativ negativ
#20 negativ negativ
#22 2+ unbekannt
#27 unbekannt 1+
#32 negativ negativ
Tabelle 6: Bekannter Sensibilisierungsgrad der mit den rekombinanten Proteinen TcA und TcB immunisierten Pferden
Die Tabelle gibt eine Übersicht über die Sensibilisierungsgrade (3.4.3) der Basophilen der mit TcA und TcB (3.3.4) immunisierten Pferde (4.1.1). Die dargestellten Sensibilisierungsgrade (3.4.3.2) beziehen sich auf im Reaktionsansatz im FIT (3.4.3) eingesetzte Proteinfinalkonzentrationen von 40 und 4 µg/ml. Negativ bedeutet keine nachweisbare Histaminfreisetzung im FIT bei Koinkubation mit den verwendeten rekombinanten Proteinen, 1+ bzw. 2+ die Verdünnungsstufe, bei der eine Histaminfreisetzung noch gemessen werden konnte (3.4.3.2).
Es war kein Zusammenhang zwischen der individuellen Reaktion der Pferde einer zuvor
bekannten Sensibilisierung gegen eines der beiden verwendeten rekombinanten Proteine TcA
oder TcB erkennbar.
Die generelle Symptomatik der klinischen Reaktionen auf die Applikation der rekombinanten
Proteine und das Ergebnis der Sektion deuten auf eine generalisierte Degranulation der
dickdarmständigen Mastzellen im Rahmen einer Typ-I-Hypersensitivitätsreaktion hin. Die
Ergebnisse 67
nach Bindung von TcA oder TcB freigesetzten Mediatoren führten zu einer Hypermotorik des
Darmes und zu einer verstärkten Gefäßdurchlässigkeit der Darmkapillaren, woraus der
Durchfall resultierte. Im Falle der Hämorrhagien war die Gefäßdurchlässigkeit so groß, dass
auch Blutbestandteile in das Darmlumen abgegeben wurden. Der Flüssigkeitsverlust in den
Darm und die Darmwand (Ödematisierung) führte zu einem Volumenverlust im Gefäßsystem
und somit zu einer Schocksymptomatik, die in einem Fall (Tier #5) nicht mehr zu
kompensieren war.
4.1.2 Auswirkungen des therapeutischen Methylprednisolons nach Immunisierung
Aufgrund der akuten allergischen Symptomatik im Darmbereich wurden alle betroffenen
Tiere (alle außer #32) mit 1-2 mg/ kg KGW Methylprednisolon behandelt. Es musste nun
überprüft werden, ob diese Applikation einen Einfluss auf die Basophilen und deren
Sensibilisierungsmuster gehabt hatte.
4.1.2.1 Veränderungen des Gesamthistamingehaltes
Die empfindlichste Form des quantitativen Nachweises der histaminhaltigen Basophilen im
Blut ist nach BRUENNLEIN (2001) die Bestimmung des zellulären Histamingehaltes nach
Zerstörung dieser Zellen (maximale bzw. physikalische Histaminfreisetzung, 3.4.3). Dies ist
möglich, da im Serum enthaltenes Histamin im Testverfahren entfernt wird und die
Basophilen die einzige Zellpopulation des Blutes sind, die gespeichertes Histamin enthalten.
Ein nicht mehr messbarer Histamingehalt des (gewaschenen, 3.4.3) Blutes (<0,3 ng
Histamin/ml Blut) ist daher ein Indikator für eine Basophilenpopulation unterhalb 300
Basophilen/ml Blut oder weniger als 0,01% der Leukocyten.
Es wurde daher die maximal aus dem Blut freisetzbare Histaminmenge durch eine
physikalische Freisetzung (3.4.3.1) bestimmt und so die Reduktion der Basophilen unter diese
Nachweisgrenze verifiziert. Zwölf Stunden nach Injektion des Methylprednisolons wurden
Blutproben von allen behandelten Pferden genommen und der Gesamthistamingehalt
bestimmt (3.4.3.1).
Tabelle 7 veranschaulicht den Gehalt vor und nach der Therapie im Vergleich mit #32, das als
einziges der immunisierten Pferde kein Methylprednisolon bekommen hatte.
Ergebnisse 68
Veränderung des maximal aus basophilen Granulocyten freisetzbaren Histamins vor
und 12h nach Methylprednisolon
Histamin ng/ml Histamin ng/ml Pferd prae Prednisolon post Prednisolon
#1 22,9 nicht nachweisbar #2 26,4 nicht nachweisbar #12 27,1 nicht nachweisbar #18 28,4 nicht nachweisbar #20 39,7 nicht nachweisbar #22 15,2 nicht nachweisbar #27 18,7 nicht nachweisbar #32 30,5 28,4
Tabelle 7: Veränderung des maximal aus basophilen Granulocyten freisetzbaren Histamins vor
und 12h nach Methylprednisolon Die Tabelle zeigt das nachweisbare Gesamthistamin aus Basophilen in ng/ml Blut aus der physikalischen Freisetzung (3.4.3.1) bei allen im TcA und TcB (3.3.4) immunisierten und im Rahmen der Notfalltherapie mit Methylprednisolon behandelten Pferden (4.1.1) vor und zwölf Stunden nach der Applikation. #32 wurde zwar immunisiert, erhielt aber kein Prednisolon. Die Nachweisgrenze liegt bei 0,3 ng Histamin (< 300 basophilen Granulocyten) / ml Vollblut.
Die Daten zeigen einen deutlichen Rückgang bis unter die Nachweisbarkeitsgrenze beim
Gesamthistamin an. Somit waren keine histaminhaltigen Basophilen mehr nachweisbar. Das
Pferd #32, dem kein Methylprednisolon injiziert wurde, veränderte sich in diesem Gehalt
kaum.
4.1.2.2 Veränderungen der spezifischen Sensibilisierungen der basophilen Granulocyten
Da die corticoidbedingte Eliminierung der basophilen Granulocyten aus dem Blut eine
Neurekrutierung von naiven Basophilen aus dem Knochenmark zur Folge hat, war nach der
Corticoidtherapie zu prüfen, ob die Sensibilisierung der neu eingewanderten Basophilen sich
von der der eliminierten Population unterschied. Dazu wurde mittels eines von KAUL (1998)
für das Pferd entwickelten Funktionellen In-vitro-Tests (FIT) die individuelle
Reaktionsbereitschaft jedes Pferdes gegen bestimmte Allergene bzw. Antigene (3.3.4) sowie
die „generelle“ Sensibilisierung durch IgG und IgE (3.3.3) bestimmt (3.4.3). Festzustellen
war, inwiefern sich das neue Sensibilisierungsmuster von dem ursprünglichen unterschied.
Blutproben wurden den Tieren vor und sieben Tage nach der Immunisierung entnommen und
auf die Reaktion der Basophilen gegen drei Allergene (Cn, Mq, HF, 3.3.4) und gegen die
Ergebnisse 69
beiden rekombinanten Antigene (TcA und TcB, 3.3.4) untersucht. Zur Erfassung der
„generellen“ Sensibilisierung, der Histaminfreisetzbarkeit aus Basophilen durch antigen-
unabhängige Kreuzvernetzung von IgG oder IgE, dienten Antiseren gegen eqIgG (goat-anti-
horse, gαh, 3.3.3) und eqIgE (3.3.3.).
Durch einen technischen Fehler waren die unmittelbar vor der Immunisierung und
Behandlung gewonnenen und bearbeiteten Proben nicht auswertbar. Daher wurden als
Vergleichswerte FIT-Ergebnisse eines ca. sechs Wochen älteren Tests verwendet. Dies war
zulässig und informativ, da sich die Sensibilisierungsmuster und -grade ohne (therapeutische)
Intervention nur über längere Zeiträume ändern (2.3). In diesem Testansatz waren nur zwei
hohe Konzentrationen der rekombinanten Proteine TcA und TcB getestet worden (40 und 4
µg/ml) statt vier (40-0,004 µg/ml). Es konnten deswegen keine Informationen über die
Ausgangssensibilisierungen der immunisierten Pferde in höheren Verdünnungsstufen erfasst
werden. Sie konnten nur aus den Daten der nicht immunisierten Kontrollgruppe extrapoliert
werden (Abbildung 8 und Abbildung 9).
Exemplarisch für die sieben überlebenden und mit Cortison behandelten Pferde sind in
Abbildung 1, Abbildung 3 und Abbildung 5 die Daten von dreien dieser Tiere vor und sieben
Tage nach Immunisierung und Methylprednisolon dargestellt.
Zu den Abbildungen 1-6: Allergenspezifische und „generelle“ Sensibilisierung vor und sieben
Tage nach Immunisierung mit TcA und TcB und Therapie mit Methylprednisolon bei den Pferden #1, #2 und #12
Dargestellt sind die Histaminfreisetzungen im FIT (3.4.3) auf drei Allergene (Cn, Mq und HF) in den Endkonzentrationen 50 µg/ml (bzw. 15 µg/ml bei Cn), 5 µg/ml und 0,05 µg/ml sowie auf zwei rekombinante Parasitenproteine (TcA und TcB) in den Endkonzentrationen 40, 4, 0,4 und 0,04 µg/ml vor. Weiterhin dargestellt sind die Freisetzungen auf die Anti-Isotyp-Antikörper anti-IgG (gαh 60) und anti-IgE. Die Freisetzungsraten sind in Prozent der physikalischen Histaminfreisetzung (maximale Freisetzung, 3.4.3.1) aus Basophilen dargestellt. Auf der jeweils linken Seite eines Allergens (vor Immun.) bzw. Antigens oder anti-Isotyps wurden die Ausgangswerte vor, auf der rechten Seite (nach Immun.) die Werte nach Immunisierung und Methylprednisolon abgebildet. Die eingezeichnete Linie markiert die Zehn-Prozent-Grenze, über der ein Releaseergebnis als positiv gilt (3.4.3.2). Alle drei Pferde sind klinische Ekzemer.
Ergebnisse 70
0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
vorImmun.
nachImmun.
vorImmun.
nachImmun.
vorImmun.
nachImmun.
vorImmun.
nachImmun.
vorImmun.
nachImmun.
Cn Mq HF TcA TcB
% d
er M
axim
alfr
eise
tzun
g50 µg/ml 5 µg/ml 0,5 µg/ml 0,05 µg/ml
Abbildung 1: Sensibilisierung vor und sieben Tage nach Immunisierung und Methylprednisolon
bei Pferd #1 Legende siehe oben
0%
20%
40%
60%
gah 60 a Ig E
% d
er M
axim
alfr
eise
tzun
g
vor Immun. nach Immun.
Abbildung 2: „Generelle“ Sensibilisierung gegen anti-IgG (gαh 60) und anti-IgE vor und sieben Tage nach Immunisierung und Methylprednisolon bei Pferd #1
Legende siehe oben
Ergebnisse 71
0%
20%
40%
60%
80%
100%
120%
vorImmun.
nachImmun.
vorImmun.
nachImmun.
vorImmun.
nachImmun.
vorImmun.
nachImmun.
vorImmun.
nachImmun.
Cn Mq HF TcA TcB
% d
er M
axim
alfr
eise
tzun
g50 µg/ml 5 µg/ml 0,5 µg/ml 0,05 µg/ml
Abbildung 3: Sensibilisierung vor und sieben Tage nach Immunisierung und Methylprednisolon
bei Pferd #2 Legende siehe oben
0%
20%
40%
60%
80%
gah 60 a Ig E
% d
er M
axim
alfr
eise
tzun
g
vor Immun. nach Immun.
Abbildung 4: „Generelle“ Sensibilisierung gegen anti-IgG (gαh 60) und anti-IgE vor und sieben
Tage nach Immunisierung und Methylprednisolon bei Pferd #2 Legende siehe oben
Ergebnisse 72
0%
20%
40%
60%
80%
100%
120%
140%
vorImmun.
nachImmun.
vorImmun.
nachImmun.
vorImmun.
nachImmun.
vorImmun.
nachImmun.
vorImmun.
nachImmun.
Cn Mq HF TcA TcB
% d
er M
axim
alfr
eise
tzun
g50 µg/ml 5 µg/ml 0,5 µg/ml 0,05 µg/ml
Abbildung 5: Sensibilisierung vor und sieben Tage nach Immunisierung und Methylprednisolon
bei Pferd #12 Legende siehe oben
0%
20%
40%
60%
80%
100%
gah 60 a Ig E
% d
er M
axim
alfr
eise
tzun
g
vor Immun. nach Immun.
Abbildung 6: „Generelle“ Sensibilisierung gegen anti-IgG (gαh 60) und anti-IgE vor und sieben
Tage nach Immunisierung und Methylprednisolon bei Pferd #12 Legende siehe oben Sieben Tage nach der Cortisonapplikation waren die Basophilen im Blut wieder deutlich
nachweisbar (27-39 ng Histamin/ml gewaschenes Vollblut). Ihre allergenspezifische und
generelle Sensibilisierung hatte sich im Vergleich zu den Ausgangswerten verändert. Die
Histaminfreisetzung durch anti-IgG (gαh) und anti-IgE war deutlich reduziert oder nicht mehr
messbar (Abbildung 2, Abbildung 4 und Abbildung 6). Bei allen zuvor gegen Allergene
sensibilisierten Pferden war die Sensibilität um mindestens ein bis zwei
Sensibilisierungsgrade zurückgegangen (3.4.3) oder nicht mehr vorhanden (Abbildung 3 und
Ergebnisse 73
Abbildung 5). Im Falle des TcB war sieben Tage nach Methylprednisolongabe bei vier von
sieben Pferden eine teilweise deutliche Sensibilisierung zu beobachten (zwei davon
dargestellt in Abbildung 3 und Abbildung 5). Auffällig dabei ist der inverse Verlauf der
Histaminfreisetzung, insbesondere in Abbildung 3: TcB setzte in niedrigeren Konzentrationen
mehr Histamin aus den Basophilen frei als in hohen. Dies zeigte sich bei vier von sieben
Pferden. Bei dem rekombinanten Protein TcA ließ sich dieses Phänomen bei zwei von sieben
Fällen finden (Abbildung 7). Zwei andere Pferde waren auf niedrigem Niveau positiv (1+).
Die anderen drei Pferde zeigten keinen Release auf TcA. Die Histaminfreisetzung auf dieses
Protein vor und nach Immunisierung und Cortison verhielt sich dosisabhängig, hohe
Proteinkonzentrationen lösten eine höhere Freisetzung aus als niedrigere.
0%
10%
20%
30%
40%
50%
#27 #22 #12 #2
% d
er M
axim
alfr
eise
tzun
g
40 µg/ml 4 µg/ml 0,4 µg/ml 0,04 µg/ml
Abbildung 7: Sensibilisierung gegen das rekombinante Protein TcA sieben Tage nach
Immunisierung und Methylprednisolonbehandlung bei vier Pferden, #22, #27, #12 und #2
Es sind die Histaminfreisetzungsraten der basophilen Granulocyten zweier Pferde im FIT (3.4.3) bei Kontakt mit vier verschiedenen Konzentrationen des rekombinanten Parasitenproteins TcA (3.3.4) dargestellt. Die Konzentrationen im Reaktionsansatz betrugen 40, 4, 0,4 und 0,04 mg/ml. Die Histaminfreisetzungen sind in Prozent der physikalischen Freisetzung angegeben (3.4.3). Die eingezeichnete Linie markiert die Zehn-Prozent-Grenze, über der ein Releaseergebnis als positiv gilt (3.4.3). Die Pferde wurden sieben Tage zuvor mit TcA und TcB immunisiert und innerhalb der nächsten zwölf Stunden danach mit Methylprednisolon behandelt (4.1.1).
Zwei der behandelten Pferde (#18 und #20) reagierten sieben Tage p. med. weder auf TcA
noch auf TcB. #32, das kein Corticoid erhalten hatte, veränderte seine Sensibilisierungen
nicht, es blieb in seiner Reagibilität gegen beide rekombinante Proteine negativ.
Der teilweise deutliche Rückgang der generellen und allergenspezifischen Sensibilisierung
der Pferde, die gegen TcA jedoch teilweise und gegen TcB deutlich vorhanden war, deutete
Ergebnisse 74
trotz der kurzen Zeit zwischen einmaliger Immunisierungsinjektion und
Methylprednisolonapplikation (die kaum zu einer Steigerung oder gar Induktion TcA- oder
TcB-spezifischer Antikörper ausreichen sollte) auf eine erfolgreiche Modulation der
Basophilenpopulation hin.
Ob jedoch von einem Erfolg auch in Bezug auf die Induktion einer spezifischen
Sensibilisierung gegen die rekombinanten Proteine TcA und TcB als Folge der
Immunisierung zu sprechen ist, sollte anhand der Kontrolltiere überprüft werden, die keine
Immunisierung erfahren hatten. Dazu wurden Ende März 2003 zehn Kontrollpferde (3.4.1.1)
ebenfalls gegen anti-IgG (gαh), anti-IgE, die Allergene Cn, Mq und HF sowie die zwei
rekombinanten Proteine TcA und TcB im FIT getestet wie die immunisierten Tiere (im
Folgenden „TcA-/TcB-Pferde“ genannt).
Eine Sensibilisierung gegen die rekombinanten Proteine TcA und TcB war auch bei fünf der
zehn unbehandelten Kontrollpferde zu erkennen. Vier dieser fünf TcB-positiven Pferde
reagierten auf TcA, drei davon in der allergentypischen, dosisabhängigen Abstufung
(Abbildung 8). Der inverse Verlauf der Histaminfreisetzungsreaktion auf TcB trat bei allen
fünf positiven Pferden auf, auf TcA nur bei einem Tier (#6, Abbildung 9). Die übrigen fünf
der zehn Kontrollpferde waren sowohl auf TcA als auch auf TcB negativ.
Alle Kontrollpferde veränderten ihre allergenspezifischen Sensibilisierungen in dem
Zeitraum, in dem die TcA/TcB-Pferde immunisiert und mit Methylprednisolon behandelt
wurden, nicht.
Exemplarisch für die fünf TcB-positiven Kontrolltiere sind in Abbildung 8 und Abbildung 9
die Sensibilisierungen der Kontrollpferde # 10 und #6 (beide klinische Ekzemer) gegen die
Allergene Cn, Mq, HF sowie gegen TcA und TcB dargestellt. Da die fünf anderen
Kontrolltiere sich bis auf die fehlende Sensibilisierung gegen TcA und TcB nicht von den
dargestellten Pferden unterschieden, werden ihre Daten hier nicht abgebildet.
Zu den Abbildungen 8 und 9: Allergen- und antigenspezifische Sensibilisierungen zweier Kontrollpferde (#10, #6) im März 2003
Die Abbildungen zeigen die Sensibilisierungen der basophilen Granulocyten der nicht mit TcA und TcB (3.3.4) immunisierten Pferde #6 und #10 im FIT (3.4.3) ohne den Einfluss durch Immunisierung mit TcA und TcB und durch Methylprednisolon (3.3.5) in Prozent der physikalischen Freisetzung (Maximalfreisetzung). Dabei sind jedem Allergen (Cn, Mq, HF) bzw. Antigen (TcA, TcB) vier Verdünnungsstufen zugeordnet (von links nach rechts 50 µg/ml (bzw. 15 µg/ml Cn), 5 µg/ml, 0,5µg/ml und 0,05 µg/ml. TcA und TcB lagen in den Endkonzentrationen 40, 4, 0,4 und 0,04 µg/ml vor.) (3.4.3). Die eingezeichnete Linie markiert die Zehn-Prozent-Grenze, über der ein Releaseergebnis als positiv gilt. Beide Tiere sind Sommerekzemer.
Ergebnisse 75
0%
10%
20%
30%
40%
50%
Cn Mq HF TcA TcB
% d
er M
axim
alfr
eise
tzun
g50/15 µg/ml 5 µg/ml 0,5 µg/ml 0,05 µg/ml
Abbildung 8: Sensibilisierung des Kontrollpferdes #10 im März 2003
Legende siehe oben
0%
10%
20%
30%
40%
Cn Mq HF TcA TcB
% d
er M
axim
alfr
eise
tzun
g
50/15 µg/ml 5 µg/ml 0,5 µg/ml 0,05 µg/ml
Abbildung 9: Sensibilisierung des Kontrollpferdes #6 im März 2003
Legende siehe oben Die Induktion der Sensibilisierung gegen TcA und TcB bei den behandelten Pferden war also
nicht auf die Immunisierung zurückzuführen, sondern auf ein entsprechend bereits
vorhandenes Antikörperspektrum im Serum der TcA-/TcB-Pferde, das einen Besatz der
neugebildeten basophilen Granulocyten zugunsten der sensibilisierenden TcA- und TcB-
spezifischen Antikörpern ermöglichte. Dies zeigten die natürlichen Sensibilisierungen der
unbehandelten Kontrollpferde.
Dennoch war eine Reduktion der allergenspezifischen Sensibilisierung sieben Tage nach
Methylprednisolon vorhanden. Möglicherweise war der allergenspezifische Antikörpertiter zu
diesem Zeitpunkt (noch keine neuen allergieauslösenden Insekten, Stallhaltung) niedrig, so
dass eine ausreichende Resensibilisierung nicht oder nur in einigen Fällen stattfand.
Ergebnisse 76
Entsprechend der Ausgangsfragestellung zur Modulation der basophilen Granulocyten konnte
zu diesem Zeitpunkt von einer erfolgreichen Modulation bezüglich der
Allergensensibilisierung gesprochen werden.
4.2 Verlauf der allergen- und antigenspezifischen Sensibilisierung über einen längeren
Zeitraum
Um auch von einem dauerhaften Erfolg der Modulation der Sensibilisierung gegen Allergene
sprechen zu können, musste sich diese allergenspezifische Sensibilisierung der TcA-/TcB-
Pferde auch über einen längeren Zeitraum als nur sieben Tage p. med. auf einem reduzierten
Niveau bewegen. Die Reagibilität der Basophilen gegenüber TcA und TcB konnte darüber
Auskunft geben, ob die andauernde Reduktion auf eine „Ausverdünnung“, auf einen
geringeren Besatz der Basophilen mit allergenspezifischen Antikörpern bei anteilsmäßig
hohem TcA- und TcB-spezifischen Besatz zurückzuführen war. Um diese Fragen zu
beantworten, wurden die TcA-/TcB-Pferde und die Kontrolltiere über das Jahr 2003 hinweg
wiederholt auf die verwendeten Allergene und Antigene (Cn, Mq, Hf, TcA, TcB, 3.3.4) im
FIT (3.4.3) getestet. Die folgenden Abbildungen stellen jeweils zwei immunisierte (TcA-
/TcB-Pferde, #2 und #12) und zwei nicht immunisierte Kontrollpferde (#8 und #10), alle
Ekzemer, bezüglich eines exemplarischen Allergens (Cn) und der zwei rekombinanten
Proteine (TcA und TcB) im Verlauf des Jahres 2003 dar.
Zu den Abbildungen 10-18: Sensibilisierungsverlauf zweier TcA-/TcB-Pferde (#2, #12) sowie
zweier Kontrollpferde (#8, #10) gegen Cn, TcA und TcB im Laufe des Jahres 2003
Die Abbildungen zeigen den zeitlichen Verlauf der Reaktionsbereitschaft der basophilen Granulocyten von vier Ekzemern, zwei TcA/TcB-Pferden (#2, #12, 4.1.1) und zwei Kontrollpferden (#8, #10, 3.4.1.1), auf ein Allergen (Cn) (3.3.4) und die rekombinanten Parasitenantigene TcA und TcB (3.3.4) im FIT (3.4.3). Dabei ist die Menge des freigesetzten Histamins in Prozent zur physikalischen Freisetzung angegeben (maximale Freisetzung). Die eingezeichnete Linie markiert die Zehn-Prozent-Grenze, über der ein Releaseergebnis als positiv gilt (3.4.3.2). Die vier Endverdünnungstufen der Cn-Präparation betrugen 15, 5, 0,5 und 0,05 µg/ml, die vier von TcA 40, 4, 0,4 und 0,04 µg/ml, während TcB in den acht Zehnerstufen 40 bis 4x10-6 µg/ml verdünnt waren (die Legendenbezeichnung z. B. 4-1 entspricht 4x10-1, 4-2 4x10-2 etc.). Von Pferd #2 lagen nur Daten bis Oktober 2003 vor, da das Tier im November 2003 aus der Beobachtung ausschied. Die dargestellten Daten für März 2003 der TcA-/TcB-Pferde wurden sieben Tage nach der therapeutischen Gabe von Methylprednisolon erhoben.
Ergebnisse 77
4.2.1 Immunisierte Pferde
0%
20%
40%
60%
80%
100%
März 03 Juni 03 Juli 03 Okt. 03
% d
er M
axim
alfr
eise
tzun
g
Cn 15 µg/ml Cn 5 µg/mlCn 0,5 µg/ml Cn 0,05 µg/ml
Abbildung 10: Sensibilisierungsverlauf gegen Cn bei Pferd #2 im Jahr 2003 (TcA/TcB-Gruppe)
0%
10%
20%
30%
40%
März 03 Juli 03 Okt. 03
% d
er M
axim
alfr
eise
tzun
g
TcA 40 µg/ml TcA 4 µg/mlTcA 0,4 µg/ml TcA 0,04 µg/ml
Abbildung 11: Sensibilisierungsverlauf gegen TcA bei Pferd #2 im Jahr 2003 (TcA/TcB-Gruppe)
0%
20%
40%
60%
80%
100%
120%
140%
März 03 Juni 03 Juli 03 Okt. 03
% d
er M
axim
alfr
eise
tzun
g
TcB 4 TcB 4-1 TcB 4-2 TcB 4-3 TcB 4-4
Abbildung 12: Sensibilisierungsverlauf gegen TcB bei Pferd #2 im Jahr 2003 (TcA/TcB-Gruppe)
Ergebnisse 78
0%
20%
40%
60%
80%
100%
März Juli Oktober Dezember
% d
er M
axim
alfr
eise
tzun
gCn 15 µg/ml Cn 5 µg/mlCn 0,5 µg/ml Cn 0,05 µg/ml
Abbildung 13: Sensibilisierungsverlauf gegen Cn bei Pferd #12 im Jahr 2003 (TcA/TcB-Gruppe)
0%
10%
20%
30%
40%
50%
März Juli Oktober Dezember
% d
er M
axim
alfr
eise
tzun
g
TcA 40 µg/ml TcA 4 µg/ml TcA 0,4 µg/ml TcA 0,04 µg/ml
Abbildung 14: Sensibilisierungsverlauf gegen TcA bei Pferd #12 im Jahr 2003 (TcA/TcB-
Gruppe)
0%
10%
20%
30%
40%
März Juli Oktober Dezember
% d
er M
axim
alfr
eise
tzun
g
TcB 40 µg/ml TcB 4 µg/ml TcB 0,4 µg/ml TcB 0,04 µg/ml
Abbildung 15: Sensibilisierungsverlauf gegen TcB bei Pferd #12 im Jahr 2003 (TcA/TcB-
Gruppe)
Ergebnisse 79
4.2.2 Kontrollgruppe
0%
20%
40%
60%
80%
100%
120%
140%
März 03 Juli 03 Okt. 03 Dez. 03
% d
er M
axim
alfr
eise
tzun
g
15 µg/ml 5 µg/ml 0,5 µg/ml 0,05 µg/ml
Abbildung 16: Sensibilisierungsverlauf gegen Cn bei Pferd #8 im Jahr 2003 (Kontrollgruppe)
0%
5%
10%
15%
20%
März 03 Juli 03 Okt. 03 Dez. 03
% d
er M
axim
alfr
eise
tzun
g
40 µg/ml 4 µg/ml 0,4 µg/ml 0,04 µg/ml
Abbildung 17: Sensibilisierungsverlauf gegen TcA bei Pferd #8 im Jahr 2003 (Kontrollgruppe)
0%
5%
10%
15%
20%
März 03 Juli 03 Okt. 03 Dez. 03
% d
er M
axim
alfr
eise
tzun
g
40 µg/ml 4 µg/ml TcB 4-1 TcB 4-2 TcB 4-3 TcB 4-4
Abbildung 18: Sensibilisierungsverlauf gegen TcB bei Pferd #8 im Jahr 2003 (Kontrollgruppe)
Ergebnisse 80
0%
20%
40%
60%
80%
100%
März 03 Juli 03 Okt. 03 Dez 03
% d
er M
axim
alfr
eise
tzun
gCn 15 µg/ml Cn 5 µg/mlCn 0,5 µg/ml Cn 0,05 µg/ml
Abbildung 19: Sensibilisierungsverlauf gegen Cn bei Pferd #10 im Jahr 2003 (Kontrollgruppe)
0%
20%
40%
60%
80%
März 03 Juli 03 Okt. 03 Dez 03
% d
er M
axim
alfr
eise
tzun
g
TcA 40 µg/ml TcA 4 µg/mlTcA 0,4 µg/ml TcA 0,04 µg/ml
Abbildung 20: Sensibilisierungsverlauf gegen TcA bei Pferd #10 im Jahr 2003 (Kontrollgruppe)
0%
10%
20%
30%
40%
50%
März 03 Juli 03 Okt. 03 Dez 03
% d
er M
axim
alfr
eise
tzun
g
TcB 4 TcB 4-1 TcB 4-2 TcB 4-3 TcB 4-4 TcB 4-5 TcB 4-6
Abbildung 21: Sensibilisierungsverlauf gegen TcB bei Pferd #10 im Jahr 2003 (Kontrollgruppe)
Ergebnisse 81
Anhand dieser Daten ist ersichtlich, dass die Reduktion der allergenspezifischen
Sensibilisierung gegen Cn nicht dauerhaft war, sondern spätestens im Juni bzw. Juli 2003
wieder stark ausgeprägt war. Alle Pferde zeigten zum Sommer hin einen deutlichen Anstieg
in der Reagibilität gegen Cn, möglicherweise eine Folge der vermehrten Exposition der Tiere
gegenüber den allergieauslösenden Insekten (hier Culicoides). Zum Oktober hin war bei den
meisten Ekzemern bzw. FIT-positiven, aber klinisch negativen Pferden, unabhängig von einer
zuvor erfolgten Immunisierung, ein Rückgang in der allergenspezifischen Sensibilisierung zu
beobachten. GEIBEN (2003) und KOBELT (2001) vermuteten dazu, dass über den Sommer
hinweg auch eine vermehrte helminthenspezifische Antikörperproduktion erfolgt, da durch
die Sommersaison der Helmintheninfektionsdruck steigt. Diese Antikörper könnten zu einer
Ausverdünnung der allergenspezifischen Antikörper auf den Basophilen und so zu einem
Rückgang der Sensibilisierung geführt haben (4.7).
Die Sensibilisierung gegen TcA und TcB blieb jedoch ebenfalls nicht erhalten, sondern
verschwand im Laufe des Sommers bei den Pferden. Von den neun im März 2003
sensibilisierten Pferden (vier TcA-/TcB-Pferde, fünf Kontrollpferde) waren im Juli nur noch
vier positiv (z. B.
Abbildung 12 und Abbildung 21). Möglich ist auch hier eine Verdrängung oder
Ausverdünnung durch allergenspezifische Antikörper, im Herbst auch durch vielfältige
andere parasitenspezifische Antikörper (4.6.2). In einigen Fällen ist eine Rückkehr der
Sensibilisierung gegen TcA und TcB zum Winter hin festzustellen (Abbildung 14, Abbildung
18 und Abbildung 21).
Warum sowohl z. B. bei dem im März 2003 immunisierten TcA-/TcB-Pferd #12 (Abbildung
14) als auch bei nicht immunisierten Kontrollpferden (z. B. #8, Abbildung 18, #10, Abbildung
21) im Dezember 2003 ein deutlicher Wiederanstieg der Sensibilisierung gegen TcA und TcB
zu sehen war, bliebe zu untersuchen. Möglicherweise könnte die individuelle
Auseinandersetzung der Pferde mit Helminthen über den Sommer und Herbst eine Rolle
spielen.
4.3 Zur Entwicklung der Nematodenbelastung
Um die Frage zu klären, ob ein Zusammenhang zwischen der individuellen
Helminthenbelastung und dem Reaktionsstatus gegen die Allergene und die rekombinanten
Proteine bestand, wurde der Verlauf der Verwurmung jedes Pferdes anhand der
Eiausscheidung über einen längeren Zeitraum beobachtet (3.4.8). Tabelle 8 und Tabelle 9
Ergebnisse 82
stellen die Eiausscheidung jedes Pferdes von Juli 2003 bis Mai 2004 dar. Es stand kein
anderes Readout-System für die Nematodeninfektionen der Tiere zur Verfügung.
Untersuchungen anderer Gruppen waren mit diesem System in den hier bearbeiteten
Fragestellungen bereits erfolgreich (siehe auch 2.4 - 2.7).
Zu Tabelle 8 und 9: Entwicklung der Ausscheidung von Strongylideneiern bei den einzelnen Pferden im Untersuchungszeitraum Juli 2003 bis Mai 2004 In dieser Tabelle ist die Entwicklung der Eiausscheidung für jedes der sieben- bzw. vierundzwanzig Versuchspferde abzulesen. Dabei ist die rechnerische Anzahl der zum Untersuchungszeitpunkt ausgezählten Magen-Darm-Strongylideneier pro Gramm Kot angegeben (3.4.8). Ist zu einem Zeitpunkt kein Eintrag vorhanden, lag keine Probe vor. Anthelminthische Behandlungen erfolgten nach Probennahme im Juli 2003 (mit Pyrantel) und im Januar 2004 (mit Moxidectin und Praziquantel) (3.3.5). Anhand der Eizahlen wurden die Pferde grob in zwei Gruppen eingeteilt, in „stark verwurmt“ und „schwach verwurmt“. Die Spalte „TcA-/TcB-immunisiert“ bezeichnet die Pferde, die mit den rekombinanten Proteinen immunisiert wurden (4.1.1). In der Spalte „Ekzemer“ sind die Tiere, die klinische Symptome des Sommerekzems zeigen (3.1.1), mit „ja“ bezeichnet, während die klinisch gesunden unabhängig von ihrem Sensibilisierungsstatus (3.4.3) mit „nein“ gekennzeichnet sind.
Ergebnisse 83
Entwicklung der Eiausscheidung bei Pferden mit geringer und hoher Ausscheidungsrate
im Versuchszeitraum
Schwach belastete Pferde
Pferd Nr.: Ekzemer TcA/TcB-
immunisiert Jul 03 Okt 03 Dez 03 Jan 04 Feb 04 Mai 04 #1 ja TcA/TcB 0 0 0 0 0 0 #2 ja TcA/TcB 0 0,5 #6 ja 1,5 0,5 2,5 1,5 0 0 #7 ja 0 0 0 0 0 #8 ja 0 0,5 1 0,5 0 0
#12 ja TcA/TcB 0 1 2,5 1 0 0 #19 nein 0 #20 nein TcA/TcB 0 0,5 1,5 0 0 #22 nein TcA/TcB 0 0 0,5 0 0 0 #23 nein 0 0,5 0 0 0 #24 nein 0 2 0 0,5 0 0 #25 nein 0 0 1 0 0 0 #27 nein TcA/TcB 0,5 0 0 0,5 0,5 0 #30 nein 0 0,5 2,5 0 0
Tabelle 8: Entwicklung der Eiausscheidung bei Pferden mit geringer Ausscheidungsrate im
Versuchszeitraum
Stark belastete Pferde
Pferd Nr.: Ekzemer TcA/TcB-
immunisiert Jul 03 Okt 03 Dez 03 Jan 04 Feb 04 Mai 04 #4 ja 8,5 14 8,5 0 0 #9 ja 21,5 22,5 23,5 0 0
#10 ja 17 3,5 10,5 7 0 0 #11 ja 20 8,5 12 14 0 0 #16 nein 7,5 1 6,5 4 0 0 #18 nein TcA/TcB 6,5 1,5 17,5 1 0 0 #21 nein 0 21,5 47,5 0 0 #28 nein 5 0,5 7 35,5 0 0 #29 nein 2,5 2 8 32,5 0 0 #31 nein 3 8 0 0 0 #32 nein TcA/TcB 4 1 17 42 0,5 0 #33 nein 14,5
Tabelle 9: Entwicklung der Eiausscheidung bei Pferden mit hoher Ausscheidungsrate im Versuchszeitraum
Ergebnisse 84
Ein direkter Zusammenhang zwischen der allergischen Erkrankung und der individuellen
Verwurmung ist aus den Daten der siebenundzwanzig- bzw. vierundzwanzigköpfigen Herde
in Tabelle 8 und Tabelle 9 nicht ersichtlich. Von vierzehn schwach verwurmten Pferden
waren sechs Ekzemer (Tabelle 8). Bei elf stärker belasteten Pferden gab es vier Ekzemer
(Tabelle 9). Pferd #33 sollte aufgrund seines geringen Alters (geboren Juni 2003) noch keine
Symptome des Sommerekzems zeigen (2.2) und somit noch nicht als klinischer Ekzemer oder
Nichtekzemer klassifiziert werden.
Die mit TcA und TcB immunisierten Pferde gehörten mit Ausnahme der #18 und #32 im
dargestellten Beobachtungszeitraum zur Gruppe der Geringbelasteten, zwei davon (#1 und
#12) hatten zuvor (außerhalb des hier dargestellten Zeitraumes) höhere Wurmbürden gehabt.
#18 hatte innerhalb der kürzesten Zeit heftig auf die rekombinanten Parasitenproteine TcA
und TcB (3.3.4) reagiert, #32 überhaupt nicht. Dieses Pferd erhielt auch kein Cortison (4.1.1).
Es ist denkbar, dass die Immunisierung einen Einfluss auf den Eiausscheidungsgrad hatte, da
die immunisierten Pferde deutlich weniger von einer schwereren Wurmlast betroffen waren
(Tabelle 8 und Tabelle 9). Bei den Kontrollpferden ließ sich aber kein Zusammenhang
zwischen einer Sensibilisierung im FIT gegen TcA oder TcB mit dem „Verwurmungsgrad“ in
Beziehung setzen. Auch stand die Rückkehr der Sensibilisierung nicht mit der individuellen
Nematodenlast in Beziehung (z. B. Abbildung 14, Abbildung 18, Abbildung 21, Tabelle 8
und Tabelle 9).
Das Ausschleichen der allergenspezifischen Antwort im Herbst und die Rückkehr der TcA-
und TcB-spezifischen Sensibilisierung im Winter legen jedoch den Schluss nahe, dass ein
steigender Infektionsdruck und ggf. eine steigende Verwurmung einen Anstieg der
helminthenspezifischen Antikörper induziert (4.6).
Die zum Winter hin deutlich ansteigende Eiausscheidungsrate der Pferde (Tabelle 8 und
Tabelle 9) ermöglichte einen erneuten Ansatz zur Modulation der spezifischen
Sensibilisierung der basophilen Granulocyten der Pferde.
Ergebnisse 85
4.4 Modulation der Sensibilisierung basophiler Granulocyten durch anthelminthische
Behandlung
Bei einer geeigneten anthelminthischen Behandlung werden Helminthen abgetötet und ihre
Antigene durch Verdauungs- und Zersetzungsprozesse freigesetzt. Dabei sollte umso mehr
Antigen frei werden, je mehr Parasiten sich im Wirt befanden. Das Immunsystem wird durch
den vermehrten Anfall an Antigenen zu einer Reaktion veranlasst, möglicherweise auch zu
einem Anstieg der spezifischen Antikörpertiter. Dieser Effekt sollte ausgenutzt werden, um
statt einer spezifischen Anhebung des TcA-/TcB-Antikörpertiters den gesamten
helminthenspezifischen Titer (und damit auch den gegen die rekombinanten Proteine) zu
boostern. Das Verhältnis zwischen den allergen- und den helminthenspezifischen
Immunglobulinen im Winter könnte eine ähnliche Modulation der Basophilen bewirken, wie
sie schon unter 4.1.2.2 festzustellen war – ein Absinken der allergenspezifischen Sensibilität
bei erhaltener TcA- bzw. TcB-Sensibilisierung.
Aber es gibt auch immer wieder Berichte von Pferdebesitzern, deren Tiere kurz nach einer
Entwurmung Allergien entwickelten oder eine Verschlimmerung der Symptomatik zeigten.
Dies könnte zusätzlich auf einen immunmodulatorischen Einfluss der anthelminthischen
Therapie auf die equinen basophilen Granulocyten hinweisen.
Daher stellten sich bezüglich der Modulation der Basophilen durch parasitäre Antigene die
Fragen, welchen Einfluss eine Entwurmung teilweise stark verwurmter Tiere auf die
Sensibilisierungen der Basophilen hat und ob man die Induktion starker anthelminthischer
Reaktionen des Organismus zu einer Beeinflussung der Basophilensensibilisierung nutzen
kann (3.4.1.2).
Um eine möglichst hohe und starke Antigenanflutung zu induzieren, wurden alle
vierundzwanzig Pferde mit hoher und niedriger Eiausscheidungsrate (Tabelle 8 und Tabelle 9)
gleichzeitig mit einem gegen ein breites Helminthenspektrum hochwirksamen
Anthelmintikum (Moxidectin (Equest® Gel), Praziquantel (Droncit® orales Gel), 3.3.5) oral
behandelt. Zudem wurde als Behandlungszeitpunkt der Monat Januar gewählt, in dem der
letzte Kontakt zu den meisten sensibilisierungsinduzierenden bzw. allergieauslösenden
Insekten bereits drei Monate und länger zurück lag, der gegen sie gerichtete Antikörpertiter
der freien Immunglobuline also möglicherweise einen Jahrestiefsstand erreicht hatte
(insbesondere für das kurzlebige IgE). Dazu wurde bei allen Pferden vor der
anthelminthischen Therapie ein Status der aktuellen Sensibilisierung im FIT (3.4.3) erhoben,
und es wurden die gleichen Allergene und Antigene wie in den Testansätzen zuvor (4.1, 4.2)
Ergebnisse 86
getestet: zur Prüfung der generellen Sensibilisierung die Antikörper anti-eqIgG (gαh) und
anti-IgE, zu der der spezifischen Sensibilisierung die Allergene Cn, Mq und HF und die
beiden rekombinanten Parasitenproteine TcA und TcB (3.3.4). Um eine mögliche Reaktion
der Pferde bezüglich der Basophilenzahl oder Histamingehalt erfassen zu können, wurde das
Verhalten des Gesamthistamins 6, 12, 24, 36, 48 h und danach im 24 h-Abstand nach
Entwurmung durch Blutentnahme und Bestimmung der physikalischen Freisetzungsmenge
bestimmt (3.4.3). Nach sieben Tagen sowie nach drei Wochen wurde ein erneuter
Sensibilisierungstest (FIT, 3.4.3) durchgeführt, um mögliche Veränderungen im
Reaktionsverhalten der Basophilen zu erheben.
4.4.1 Zellulärer Histamingehalt im Blut von Pferden vor und in den ersten drei
Wochen nach anthelminthischer Behandlung
Um einen direkten Einfluss der anthelminthischen Behandlung auf die Basophilen zu
untersuchen, wurde der Gesamthistamingehalt der Basophilenpopulation über drei Wochen
verfolgt. Exemplarisch für alle Pferde im Versuch sind in Abbildung 22 drei Pferde mit
unterschiedlich hohen Eiausscheidungszahlen (4.3) dargestellt.
0,0
10,0
20,0
30,0
40,0
50,0
60,0
0 h 6 h 12 h 24 h 36 h 48 h 7 d 21 d
ng H
ista
min
/ml
#1 #7 #9
Abbildung 22: Änderungen im zellulären Histamingehalt des Blutes vor und 6-48 h, 7 d und 21 d
nach Moxidectin und Praziquantel
Diese Grafik verdeutlicht den Verlauf des Histamingehaltes der Basophilen dreier Pferde in ng/ml Blut, bestimmt durch physikalische Freisetzung (3.4.3.1), vor sowie über einen Zeitraum von 6–48 h, 7 d und 21 d nach anthelminthischer Behandlung mit Moxidectin und Praziquantel (3.3.5). #1 und #7 schieden 2003 nur wenige Nematodeneier aus, #9 galt als stark verwurmt (4.3).
Innerhalb der ersten 48 h war bei keinem der Pferde eine signifikante Veränderung des
Ergebnisse 87
Gesamthistamingehaltes festzustellen (Abbildung 22). In den folgenden fünf Tagen konnte
(bis sieben Tage nach Entwurmung) bei neun von 23 Pferden ein Anstieg des
Histamingehaltes in den physikalischen Freisetzungen beobachtet werden. Dabei handelte es
sich bei drei Tieren um schwach verwurmte Pferde (von zwölf) und bei sechs um stark
belastete Tiere (von elf, #33 ging aufgrund seines geringen Alters zur Schonung nicht in die
Reihenuntersuchung mit ein) (4.3).
Die Histaminkinetiken innerhalb der drei Wochen unterschieden sich je nach Ausgangsstatus
der Pferde (Abbildung 23).
0
20
40
60
80
100
120
stark verw. Ekzemer stark verw.Nichtekz.
schwach verw.Ekzemer
schwach verw.Nichtekz.
His
tam
in in
ng/
ml
prae Wk post Wk
Abbildung 23: Veränderung des Gesamthistamingehaltes der Basophilenpopulation vor und
drei Wochen nach anthelminthischer Behandlung mit Moxidectin und Praziquantel.
Dargestellt sind die Mittelwerte der physikalischen Histaminfreisetzungen (3.4.3) in ng/ml Blut aller mit Moxidectin und Praziquantel (3.3.5) entwurmten Pferde (n=24) in Gruppen nach hoher oder niedriger Eiausscheidung (4.3) und nach allergischer Erkrankung (3.1) geordnet. Die linke Säule bezeichnet den Wert und seine Standardabweichung vor der Entwurmung, die rechte den drei Wochen nachher. Es bedeuten: verw.: verwurmt; Nichtekz.: Nichtekzemer, Wk: Wurmkur. Die Gruppengröße betrug bei den stark verwurmten Ekzemern n=4, bei den stark verwurmten Nichtekzemern n=7, die schwach verwurmten Ekzemer n=5 und die schwach verwurmten Nichtekzemer n=7. Eine Signifikanz konnte nicht festgestellt werden.
Vor der Entwurmung (schwarze Säule in Abbildung 23) unterschieden sich allein die stark
verwurmten Pferde mit klinischem Sommerekzem (n=4) mit durchschnittlich 70 ng Histamin
/ml gewaschenem Vollblut (3.4.3) deutlich von allen anderen Pferden mit 30 ng/ml ± 9 ng.
Drei Wochen nach der anthelminthischen Behandlung (graue Säulen in Abbildung 23) konnte
bei einem Teil der Tiere (stark verwurmte Tiere und schwach verwurmte Ekzemer) ein
Rückgang in der maximalen Histaminfreisetzung gegenüber den Ausgangswerten beobachtet
werden. Die Basophilen der schwach verwurmten Ekzemer enthielten nur noch 18,2 ng/ml
Ergebnisse 88
Blut ± 4,8 ng Histamin, die der schwach verwurmten Nichtekzemer 27,6 ± 9 ng, sie zeigten
also im Gegensatz zu den anderen Pferden zumeist keinen Rückgang. Die stärker belasteten
Isländer erschienen stark schwankend, sanken aber insgesamt auch deutlich ab. Nur drei (alle
Nichtallergiker) zeigten keinen Einbruch. Ihr Mittelwert lag bei 32 ng/ml, allerdings bei einer
Standardabweichung von 18 ng (inkl. der drei im Histaminwert nicht abgesunkenen Tiere,
exkl. 20,6 ng ± 4,5 ng).
Es konnte innerhalb der ersten zwei Tage keine Veränderung des Gesamthistaminspiegels
nachgewiesen werden, die Hinweise z. B. auf eine Aktivierung der Basophilen durch
freigesetztes und durch oberflächenständige Antikörper gebundenes parasitäres Antigen
ergeben hätte. Der Anstieg bei neun von 23 Pferden (Abbildung 22, #9) in den ersten sieben
Tagen deutet auf eine funktionelle Neusynthese von Histamin hin. Das Absinken des
Gesamthistaminspiegels bis drei Wochen p. med. (Abbildung 22 und Abbildung 23) weist auf
einen Rückgang der Helminthenbelastung und auf eine Reduktion der Basophilen auf ein
ausreichendes Abwehrniveau hin. Ein Zusammenhang mit dem allergischen Status (Ekzemer
oder Nichtekzemer) konnte nicht nachgewiesen werden.
4.4.2 Einfluss anthelminthischer Behandlung auf die funktionellen Sensibilisierungen
basophiler Granulocyten
Um zu prüfen, welchen Einfluss eine anthelminthische Behandlung auf die funktionelle
Sensibilisierung hat, wurde der Reaktionsstatus der Basophilen gegen die eingesetzten
Allergene, Antigene und Antikörper (3.3.4) im FIT (3.4.3) vor, sieben Tage und 21 Tage nach
der Entwurmung erfasst.
Alle Pferde wurden gleichzeitig entwurmt. Eine Negativkontrolle in Form einer nicht
behandelten Kontrollgruppe entfiel einerseits aus weidehygienischen Gründen und
andererseits wegen ausreichenden, zuvor in anderen Versuchen (z. B. GEIBEN, 2003)
erhobenen Verlaufsuntersuchungen, aus denen die Konstanz der FIT-Ergebnisse bekannt war.
Sieben Tage nach der Behandlung fiel eine deutliche Reduktion der
Histaminfreisetzungsraten gegenüber allen eingesetzten Antikörper-, Allergen- und
Antigenpräparationen bei fast allen Pferden auf.
In den folgenden Abbildungen sind die Ergebnisse der generellen Sensibilisierung (3.4.3) vor
der Entwurmung für jedes Tier auf 100% normiert und mit den Ergebnissen sieben Tage nach
der anthelminthischen Therapie verglichen (Abbildung 24 und Abbildung 25).
Ergebnisse 89
0%
20%
40%
60%
80%
Ekzemer, starkverwurmt
Nicht-Ekzemer,stark verwurmt
Ekzemer, schwachverwurmt
Nicht-Ekzemer,schwach
verwurmt
% d
es A
usga
ngsw
erte
s gah
60
*****
Abbildung 24: Abfall der gαh 60-vermittelten Histaminfreisetzung sieben Tage nach
Entwurmung Die Grafik stellt die Mittelwerte der Freisetzungen auf gαh 60 (3.4.3.1) der vier Gruppen stark verwurmte Ekzemer, stark verwurmte Nichtekzemer, schwach verwurmte Ekzemer und schwach verwurmte Nichtekzemer (4.3) in Prozent des individuellen Ausgangswertes vor der anthelminthischen Behandlung dar. Die Standardabweichung ist entsprechend angegeben, die Sternchen geben die Signifikanz an (* p< 0.05, ** p< 0.01, One-way-ANOVA, 3.3.7). Die Gruppengröße betrug bei den stark verwurmten Ekzemern n=4, bei den stark verwurmten Nichtekzemern n=7, die schwach verwurmten Ekzemer n=5 und die schwach verwurmten Nichtekzemer n=7.
0%
20%
40%
60%
80%
Ekzemer, starkverwurmt
Nicht-Ekzemer,stark verwurmt
Ekzemer, schwachverwurmt
Nicht-Ekzemer,schwach verwurmt
% d
es A
usga
ngsw
erte
s ant
i-IgE **
******
Abbildung 25: Abfall der anti-IgE-vermittelten Histaminfreisetzung sieben Tage nach
Entwurmung Die Grafik stellt die Mittelwerte der Freisetzungen auf anti-IgE (3.4.3.1) der vier Gruppen stark verwurmte Ekzemer, stark verwurmte Nichtekzemer, schwach verwurmte Ekzemer und schwach verwurmte Nichtekzemer (4.3) in Prozent des individuellen Ausgangswertes vor der anthelminthischen Behandlung dar. Die Standardabweichung ist entsprechend angegeben, die Sternchen geben die Signifikanz an (** p< 0,01, *** p< 0,001, One-way-ANOVA, 3.3.7). Die Gruppengröße betrug bei den stark verwurmten Ekzemern n=4, bei den stark verwurmten Nichtekzemern n=7, die schwach verwurmten Ekzemer n=5 und die schwach verwurmten Nichtekzemer n=7.
Ergebnisse 90
Diese vier Gruppen können anhand ihrer individuellen Reaktion auf gαh 60 und anti-IgE
unterschieden werden. Stark helminthenbelastete Ekzemer reagierten sowohl mit einem
deutlich verminderten anti-IgE- als auch gαh 60-Release, verwurmte Nichtekzemer mit einem
ähnlichen Einbruch in der anti-IgE-, aber mit einem deutlich geringeren in der gαh 60-
Freisetzung. Schwach verwurmte Ekzemer waren in der nur wenig zurückgehenden Reaktion
auf gαh 60 nicht von den wenig belasteten Nichtekzemern zu unterscheiden, waren aber dafür
in der Antwort auf anti-IgE gegenüber den Nichtekzemern signifikant reduziert.
Insgesamt ist die Reduktion der generellen IgE-spezifischen Sensibilisierung sieben Tage
nach Entwurmung deutlicher ausgeprägt als die generelle IgG-spezifísche Sensibilisierung.
Die statistische Auswertung (one-way-ANOVA, 3.3.7) ergab signifikante bis
höchstsignifikante Unterschiede zwischen den Gruppen für gαh 60 und anti-IgE (Abbildung
24 und Abbildung 25).
21 Tage nach der Entwurmung hatte die generelle Sensibilisierung gegen gαh 60 (anti-IgG)
und anti-IgE wieder ihre Ausgangswerte erreicht.
Die funktionellen Reagibilitäten gegen die Allergene (Cn, Mq, HF) und gegen TcA und TcB
verschwanden teilweise vollkommen oder waren nach der Entwurmung stark reduziert.
Exemplarisch für den Verlauf der Sensibilisierungsgrade gegen die eingesetzten Allergene
Cn, Mq und HF vor und nach anthelminthischer Behandlung für zwölf der fünfzehn Pferde
der Gruppen II und III (3.4.1.2) ist in Abbildung 26 die Reaktion eines Pferdes, #12 (Gruppe
II, 3.4.1.2), veranschaulicht.
0
1
2
3
4
vor Wk 7 d post Wk 3 Wo post Wk 3 Mo post Wk 6 Mo post Wk
Sens
ibili
sier
ungs
grad
Cn Mq HF
Abbildung 26: Verlauf der allergenspezifischen Sensibilisierung vor und nach Entwurmung bei Pferd #12 (Ekzemer)
In dieser Abbildung ist der Cn-, Mq- und HF-vermittelte Histaminrelease (3.4.3.1) des Pferdes #12
Ergebnisse 91
(Gruppe II, 3.4.1.2) in Sensibilisierungsgraden (3.4.3.2) vor, sieben Tage, drei Wochen sowie drei und sechs Monate nach einmaliger anthelminthischer Behandlung (3.4.5) mit Moxidectin und Praziquantel (3.3.5) aufgezeigt.
Die spezifischen (Cn, Mq, HF, TcA, TcB) Sensibilisierungen der Gruppen II und III (3.4.1.2)
waren in einigen Fällen noch drei Wochen nach der Wurmkur reduziert (Abbildung 26, Cn),
hatten sich aber bis zum nächsten Status drei Monate nach der Entwurmung wieder auf dem
Ausgangsniveau eingependelt.
In wenigen Fällen blieb die Reaktion unverändert (und dann auf nur eine
Allergenpräparation). Bei nur drei Tieren stieg die allergen- und antigenbegründete
Freisetzung um bis zu zwei Stufen an. Hierbei handelte es sich einerseits um Pferd #33, das
mit sieben Monaten jüngste Tier. Seine gαh- und anti-IgE-Antwort war unverändert. Die
Sensibilisierungsgrade gingen jedoch bis zum nächsten Status zwei Wochen später wieder auf
die Ausgangswerte zurück (Abbildung 27).
Zu den Abbildungen 27-29: Induktion bzw. Verstärkung einer funktionellen Sensibilisierung
gegen Cn, HF oder Mq bei drei Pferden nach anthelminthischer Behandlung
Die Abbildungen zeigen die Veränderungen in den allergenspezifischen (gegen Cn, Mq oder HF) (3.3.4) Sensibilisierungen (3.4.3) bei drei Pferden, #33, #22 und #27, vor und im Laufe von drei Monaten nach anthelminthischer Behandlung (3.4.5). Dargestellt ist jeweils der Sensibilisierungsgrad der basophilen Granulocyten (3.4.3). Bei den Tieren #22 und #27 handelte es sich um Pferde mit geringer Eiausscheidung und ohne allergische Symptome, #33 schied eine hohe Zahl an Strongylideneiern aus (4.3) und war mit sieben Monaten das jüngste Tier.
0
1
2
3
4
vor Wk 7 d post Wk 3 Wo post Wk 3 Mo post Wk
Sens
ibili
sier
ungs
grad
Cn Mq HF
Abbildung 27: Verstärkung von funktionellen Sensibilisierungen gegen Cn und HF bei Pferd #33 nach anthelminthischer Behandlung
Ergebnisse 92
Bei dem Tier, das seine induzierte Sensibilisierung auch nach drei Monaten nicht verloren
hatte, handelte es sich um Pferd #22. #22 blieb auf Cn und HF 2+ positiv (Abbildung 28),
zeigte aber einen deutlichen Einbruch der Reagibiliät gegen anti-IgE.
0
1
2
3
vor Wk 7 d post Wk 3 Wo post Wk 3 Mo post Wk
Sens
ibili
sier
ungs
grad
Cn HF und Mq
Abbildung 28: Induktion bzw. Verstärkung einer funktionellen Sensibilisierung gegen Cn, HF und Mq bei Pferd #22 nach anthelminthischer Behandlung
#27 erhöhte die Reagibilität gegen Cn von 1+ auf 4+ und von Mq und HF jeweils von null auf
1+ (Abbildung 29). Eine Veränderung der Antwort auf anti-IgE oder gαh 60 fand nicht statt.
Drei Monate nach der Behandlung war die vermehrte Sensibilisierung verschwunden und auf
das ursprüngliche Niveau zurückgegangen.
0
1
2
3
4
vor Wk 7 d post Wk 3 Wo post Wk 3 Mo post Wk
Sens
ibili
sier
ungs
grad
Cn Mq und HF
Abbildung 29: Induktion bzw. Verstärkung einer funktionellen Sensibilisierung gegen Cn, Mq
und HF bei Pferd #27 nach anthelminthischer Behandlung
Ergebnisse 93
Die Hemmung der Aktivierbarkeit der basophilen Granulocyten sieben Tage nach
Entwurmung bezog sich auch auf die TcA- und TcB- vermittelten Freisetzungen (z. B.
Abbildung 35) und folgte damit der Kinetik der allergenspezifischen und generellen
Sensibilisierung (z. B. Abbildung 26). Drei Wochen nach anthelminthischer Therapie zeigten
mit Ausnahme von sechs Pferden alle Tiere eine wiederkehrende oder neu induzierte
Sensibilisierung gegen TcA oder TcB (bis 2+ positiv, 3.4.3) (ähnlich wie in Abbildung 29 und
Abbildung 35). Dabei konnten eine TcA- und eine TcB-Sensibilisierung sowohl allein als
auch zusammen auftreten. Das inverse TcB-Phänomen, das unter 4.1 beobachtet werden
konnte (geringere TcB-Konzentrationen setzten im FIT höhere Histaminmengen frei als
stärker konzentrierte Antigenpräparationen), trat nicht mehr auf, die Histaminfreisetzung
verhielt sich dosisabhängig. Die Langzeitbeobachtung ergab, dass sechs Monate nach der
Wurmkur (Juli 2004) nur noch die Hälfte aller Pferde (sechs von zwölf untersuchten Tieren)
positiv auf TcA und TcB reagierte (jeweils 1+, nur ein Tier TcB 2+). Dabei erwiesen sich nun
durchgehend diejenigen als TcA-positiv, die auch TcB-positiv waren.
Die erhobenen Daten dieses Kapitels weisen auf eine funktionelle Hemmung der basophilen
Granulocyten eine Woche nach der Entwurmung hin. Der Nachweis des Gesamthistamins
(4.1.1) beweist, dass zu jedem Zeitpunkt ab sechs Stunden bis sieben Tage nach Entwurmung
Basophile vorhanden waren. Ihre herabgesetzte Reagibilität auf alle eingesetzten
Freisetzungsstimulantien aber zeigt die verminderte Fähigkeit der Basophilen, auf Antikörper
(anti-IgG (gαh), anti-IgE), Antigene (TcA, TcB) oder Allergene (Cn, Mq, HF) (3.3.4) zu
reagieren.
Es konnte also gezeigt werden, dass eine anthelminthische Behandlung zu einer Modulation
der generellen und der spezifischen Sensibilisierung beitragen kann. Diese Modulation ist
aber nicht von Dauer, sondern erlischt meistens innerhalb von drei Wochen (Abbildung 26).
In einigen, wenigen Fällen bleibt die Veränderung der Sensibilisierung bestehen und kann so
zu einer Entstehung (Abbildung 28 und Abbildung 29) als auch zu einem Verschwinden
(Abbildung 27) einer spezifischen funktionellen Sensibilisierung gegen bestimmte Antigene
führen. Der Anstieg im Gesamthistamin bei einem Drittel der Pferde (Abbildung 22) könnte
ein Hinweis auf einen erhöhten Umsatz und damit auf eine Neurekrutierung von basophilen
Granulocyten sein.
Das die beobachteten Effekte nicht auf eine direkte Medikamentenwirkung zurückzuführen
sind, lässt sich dadurch belegen, dass nicht alle Pferde trotz der gleichen Dosis gleich reagiert
Ergebnisse 94
haben, sondern eine deutliche Abhängigkeit von dem vorhergehenden Verwurmungsgrad
bestand (Abbildung 24 und Abbildung 25).
Ob die Induktion der Sensibilität gegen TcA und TcB auf eine erhöhte Antikörperbildung
gegen freigesetzte kreuzreaktive Proteine aus den bekämpften Helminthen zurückzuführen
sein könnte, muss noch untersucht werden (4.6). Das nicht mehr auftretende inverse Verhalten
der Histaminfreisetzung auf TcB könnte mit einem anteilsmäßig verschobenen
Antikörperbesatz der Basophilen gegen TcB oder mit einem anders gearteten
Rezeptorexpression begründet werden.
4.4.3 Einfluss anthelminthischer Behandlung auf die funktionellen Sensibilisierungen
basophiler Granulocyten bei einem schwach belasteten Pferd ohne hohen
Infektionsdruck
Im Versuch der Modulation der Basophilenreaktion durch anthelminthische Behandlung
(4.4.1, 4.4.2) konnte nicht erfasst werden, wann die Hemmung der Basophilen einsetzt, da
relativ große Untersuchungsabstände gewählt wurden (sieben und 21 Tage).
Zur näheren Bestimmung des genauen Zeitpunktes der Reduktion der generellen Reagibilität
gegen anti-IgG (gαh) und anti-IgE nach Behandlung mit Moxidectin und Praziquantel wurde
ein weiteres Pferd (3.1.2) untersucht. Ein Privatpferd (englisches Vollblut, 3.1.2), das nicht
mit den Versuchspferden zusammen gehalten wurde, sondern in einem Boxenstall mit
Weidegang in einer Herde, wurde mit den gleichen Anthelmintika (3.3.5) wie die Islandpferde
(4.4) behandelt und über sieben Tage hinweg täglich im FIT untersucht. Dabei wurden nur die
physikalische und die antikörpervermittelten Freisetzungen (anti-IgG (gαh) und anti-IgE)
bestimmt.
Ergebnisse 95
0%
20%
40%
60%
80%
100%
120%
d0 d1 d2 d3 d4 d5 d6
% d
er M
axim
alfr
eise
tzun
g
gah 60 anti-IgE
Abbildung 30: Anti-IgE- und gαh 60-vermittelte Freisetzungen nach Entwurmung eines Pferdes
mit niedrigem Infektionsdruck und geringer Eiausscheidung Gezeigt ist der Verlauf der Reagibilität der Basophilen eines Kontrollpferdes (3.1.2) über sieben Tage hinweg. Das Pferd wurde wie die Isländer mit Moxidectin und Praziquantel behandelt. Im 24h-Abstand wurden Blutproben entnommen und im FIT (3.4.3) die Basophilen auf ihre generelle Sensibilisierung gegen anti-IgE und anti-IgG (gαh 60) getestet. Die Freisetzungsraten sind in Prozent der physikalischen Freisetzung angegeben.
Ganz im Gegensatz zu den unter hohem Infektionsdruck stehenden Isländern (hoher
Tierbesatz einer Standweide) zeigte dieses Tier weder eine Veränderung der anti-IgE- noch
der gαh-vermittelten Freisetzungen über den gesamten Untersuchungszeitraum, sondern blieb
in allen Werten, auch im Gesamthistamin, konstant (Abbildung 30). Die leichten
Schwankungen der Freisetzungskurven lagen innerhalb der möglichen physiologischen
Variationsbreite.
Möglicherweise hat diese anders geartete Reaktion ihre Ursache in der schon vor der
Wurmkur schwachen Belastung und einem niedrigen Infektionsdruck aufgrund einer
sorgfältigen Weide- und Stallhygiene und regelmäßiger anthelminthischer Therapie.
Da das Pferd zwar mit den gleichen Medikamenten (Moxidectin und Praziquantel (3.3.5))
behandelt wurde, aber kein suppressiver Effekt beobachtet wurde, ist dies als weiterer
Hinweis auf eine nicht durch die Anthelmintika bedingte Hemmung bei den Islandpferden zu
betrachten.
Ergebnisse 96
4.4.4 Einfluss anthelminthischer Behandlung und nachfolgender Methyl-
prednisolongabe auf die funktionellen Sensibilisierungen basophiler
Granulocyten
Es hatte sich in den vorausgehendenen Versuchen gezeigt (4.4.1 - 4.4.3), wie sich die reine
anthelminthische Behandlung auf die generelle und spezifische Sensibilisierung der
Basophilen auswirken kann, ohne ihre Anzahl oder ihren Histamingehalt zu verringern. Nun
wurde vor dem Hintergrund der Modulation der basophilen Granulocyten die Fragestellung
aufgeworfen, ob man das durch die vermehrte Freisetzung des parasitären Antigens
möglicherweise veränderte Antikörperspektrum zu einer Neuprägung der Basophilen nutzen
kann, so, wie es ursprünglich für die Immunisierung mit TcA und TcB beabsichtigt war (4.1).
Zu diesem Zweck wurde einem Teil der Pferde, der Versuchsgruppe I (3.4.1.2, neun Pferde,
davon vier Ekzemer), sieben Tage nach der Behandlung mit Moxidectin und Praziquantel 1
mg Methylprednisolon pro kg KGW intravenös injiziert, um eine Eliminierung der basophilen
Granulocyten zu erreichen. Dieses wurde durch Verfolgung der physikalisch aus den
Basophilen freisetzbaren Histaminmenge überprüft (3.4.3).
0
10
20
30
40
50
60
70
0 h 6 h 12 h 24 h 36 h 48 h 72 h 96 h 120 h
His
tam
in in
ng/
ml
Abbildung 31: Änderungen im Gesamthistamingehalt des Blutes nach Methylprednisolon Die Abbildung zeigt den zeitlichen Verlauf der Mittelwerte des Histamingehaltes in ng/ml Blut, bestimmt durch physikalische Freisetzung (3.4.3.1), nach Injektion von Methylprednisolon bei den Pferden der Gruppe I (3.4.1.2, n=9) zu den Zeitpunkten 0, 6, 12, 24, 36, 48, 72, 96 und 120 h p. med. Die Standardabweichung ist entsprechend angegeben.
Ein deutlicher Rückgang des nachweisbaren Histamins war bereits sechs Stunden nach der
Injektion zu beobachten, nach weiteren sechs Stunden konnte je nach Pferd kein oder nur
noch sehr geringe Mengen Histamin nachgewiesen werden. Diese geringen Unterschiede
Ergebnisse 97
waren wahrscheinlich auf Dosierungsunterschiede bei geschätztem Körpergewicht oder
individuell unterschiedliche Reaktionen auf das Methylprednisolon zurückzuführen. Bei
dieser Dosierung stieg der Gehalt an Gesamthistamin im Blut (und damit die Zahl der
histaminhaltigen Basophilen) bereits 24 h nach der Applikation wieder an und übertraf 36 h
bis 48 h p. med. den Ausgangswert (Reboundeffekt). In einem Zeitraum von 72 bis spätestens
96 h p. med. hatte sich der Spiegel wieder dem Ausgangsniveau angeglichen.
Die Erfassung der generellen und der spezifischen Sensibilisierungen erfolgte vor der
Injektion des Methylprednisolons (sieben Tage nach der Entwurmung) und vierzehn Tage
danach. Exemplarisch für die Pferde der Versuchsgruppe sind die Sensibilisierungen gegen
anti-IgG (gαh) und anti-IgE in Abbildung 32 und Abbildung 33 der Tiere #11 (Ekzemer) und
#18 (Nichtekzemer) dargestellt.
0%
20%
40%
60%
80%
100%
vor Wk 7 d post Wk 3 Wo post Wk 3 Mo post Wk
% d
er M
axim
alfr
eise
tzun
g
gah 60 IgE
Pred.
Wk.
Abbildung 32: Verlauf der generellen Sensibilisierung vor und nach Entwurmung sowie
Methylprednisolongabe bei Pferd #11 (Ekzemer, stark verwurmt) In dieser Abbildung ist der anti-IgG (gαh 60) und anti-IgE-vermittelte Histaminrelease des Pferdes #11 (Gruppe I, 3.4.1.2) in Prozent der Maximalfreisetzung (3.4.3.2) vor, sieben Tage, drei Wochen und drei Monate nach anthelminthischer Behandlung mit Moxidectin und Praziquantel (Wk, 3.3.5) aufgezeigt. Am Tag 7 nach der Entwurmung wurde Methylprednisolon (3.3.5) intravenös injiziert (Pred.) und der Sensibilisierungsverlauf (3.4.3) durch wiederholte Untersuchungen im FIT (3.4.3) verfolgt.
Ergebnisse 98
0%
20%
40%
60%
80%
100%
vor Wk 7 d post Wk 3 Wo post Wk 3 Mo post Wk
% d
er M
axim
alfre
iset
zung
gah 60 IgE
Abbildung 33: Verlauf der generellen Sensibilisierung vor und nach Entwurmung sowie
Methylprednisolongabe bei Pferd #18 (Nichtekzemer, stark verwurmt) In dieser Abbildung ist der anti-IgG (gαh 60) und anti-IgE-vermittelte Histaminrelease des Pferdes #18 (Gruppe I, 3.4.1.2) in Prozent der Maximalfreisetzung (3.4.3.2) vor, sieben Tage, drei Wochen und drei Monate nach anthelminthischer Behandlung mit Moxidectin und Praziquantel (Wk, 3.3.5) aufgezeigt. Am Tag 7 nach der Entwurmung wurde Methylprednisolon (3.3.5) intravenös injiziert (Pred.) und der Sensibilisierungsverlauf (3.4.3) durch wiederholte Untersuchungen im FIT (3.4.3) verfolgt.
Die generellen Sensibilisierungen (anti-IgG (gαh) und anti-IgE) waren nach der
anthelminthischen Therapie vermindert (siehe auch Abbildung 24 und Abbildung 25) und
stiegen entweder innerhalb von zwei Wochen nach der Applikation von Methylprednisolon
(drei Wochen nach Entwurmung) wieder auf in die Bereiche der Ausgangswerte oder blieben
vermindert (Abbildung 32 und Abbildung 33). Sie stiegen nicht über das Ausgangsniveau
hinaus (siehe vergleichsweise 4.4.5, Abbildung 36 und Abbildung 37). Nach drei Monaten
war keine signifikante Veränderung zu den Sensibilisierungen vor der Entwurmung mehr zu
beobachten.
Auch die spezifischen Sensibilisierungen wurden vor der Injektion des Methylprednisolons
(sieben Tage nach der Entwurmung) und vierzehn Tage danach erhoben. Als Beispiel für den
allergenspezifischen Sensibilisierungsverlauf in diesem Versuchsansatz ist in Abbildung 34
Pferd #11, ein Ekzemer, aufgeführt.
Wk.
Pred.
Ergebnisse 99
0
1
2
3
4
vor Wk 7 d post Wk 3 Wo post Wk 3 Mo post Wk 6 Mo post Wk
Sens
ibili
sier
ungs
grad
Cn Mq HF
Abbildung 34: Verlauf der allergenspezifischen Sensibilisierung vor und nach Entwurmung
sowie Methylprednisolongabe bei Pferd #11 (Ekzemer, stark verwurmt) In dieser Abbildung ist der Cn-, Mq- und HF-vermittelte Histaminrelease des Pferdes #11 (Gruppe I, 3.4.1.2) in Sensibilisierungsgraden (3.4.3.2) vor, sieben Tage, drei Wochen, drei Monate und sechs Monate nach anthelminthischer Behandlung mit Moxidectin und Praziquantel (Wk, 3.3.5) aufgezeigt. Am Tag 7 nach der Entwurmung wurde Methylprednisolon (3.3.5) intravenös injiziert (Pred.) und der Sensibilisierungsverlauf (3.4.3) durch wiederholte Untersuchungen im FIT (3.4.3) verfolgt.
Mit einer Ausnahme (ein Allergen bei einem Pferd) blieben alle allergenvermittelten
Histaminfreisetzungen bis zwei Wochen nach Methylprednisolon reduziert oder ereichten nur
ihr Ausgangsniveau (Abbildung 34). Damit hielt die Reduktion deutlich länger an als bei den
Kontrollgruppen II und III (Abbildung 26). Nach drei Monaten war der Effekt der
Entwurmung und des Cortisons nicht mehr zu verzeichnen. Bei keinem Pferd wurde eine
Langzeitwirkung festgestellt, in der eine Reduktion der vorher vorhandenen
allergenspezifischen Sensibilisierung zu erkennen gewesen wäre. Während aber die
allergenbezogene Suppression der Basophilen zwei Wochen nach dem Corticoid noch
vorhanden war, ließ sich für die rekombinanten Proteine TcA und TcB keine Hemmung mehr
feststellen. Die Sensibilisierungsgrade stiegen in einigen Fällen sogar an oder ließen sich
induzieren (Abbildung 35).
Pred.
Wk
Ergebnisse 100
0
1
2
3
vor Wk 7 d post Wk, Pred. 3 Wo post Wk 3 Mo post Wk
Sens
ibili
sier
ungs
grad
#23 #25 #18
Abbildung 35: Verlauf der TcB-spezifischen Sensibilisierung vor und nach Entwurmung bei
drei Pferden der Gruppe I Die Grafik gibt die Entwicklung der TcB-spezifischen Sensibilisierung (3.4.3) der Basophilen im FIT (3.4.39 dreier Pferde vor der Entwurmung (Wk), sieben Tage danach (zu diesem Zeitpunkt wurden die Pferde mit Methylprednisolon behandelt (Pred.)) (3.4.1.2), drei Wochen nach der Entwurmung bzw. zwei Wochen nach Corticoid und drei Monate später wieder. Die Reagibilität ist in Sensibilisierungsgraden angegeben (3.4.3.2). Bei #23 und #25 handelt es sich um schwach parasitär belastete Pferde, bei #18 um ein stärker verwurmtes Pferd (4.3).
Die Induktion einer dauerhaften Sensibilisierung (länger als drei bis sechs Monate) gegen
TcA oder TcB gelang nicht. Von den Pferden der Gruppe I waren im Juli 2004 noch die
Hälfte TcA- und TcB-positiv und erreichten damit das gleiche Verhältnis wie die Tiere der
Kontrollgruppen II und III (3.4.1.2). Die für die rekombinanten Proteine positiven Pferden
waren im Sommer 2004 sowohl TcA als auch TcB-positiv (1+, ein Tier TcB 2+).
Die Eliminierung der basophilen Granulocyten konnte durch den beobachteten
Histamineinbruch, die Neurekrutiereung durch den Reboundeffekt nachgewiesen werden
(Abbildung 31). Nach einem Reboundeffekt etwa 36h nach der Injektion des Corticoides hat
sich der Gesamthistamingehalt nach spätestens 96h wieder auf dem Ausgangsniveau
eingependelt. Es wurden also neue Basophile aus dem Knochenmark rekrutiert, die
möglicherweise ein verändertes Sensibilisierungsspektrum aufwiesen.
Die Sensibilisierungen der Basophilen (Abbildung 34) nach Methylprednisolon stellten sich
im Vergleich mit den nur entwurmten Gruppen II und III (3.2.1.4) (Abbildung 26) als auch
noch drei Wochen nach der Entwurmung (zwei Wochen nach Cortisonapplikation) bezüglich
der Allergene deutlich reduziert dar. Bezüglich der rekombinanten Parasitenproteine TcA und
TcB konnte jedoch im Gegensatz zu den Allergenen keine anhaltende Hemmung, sondern
eine Rückkehr auf das Ausgangsniveau oder sogar eine Steigerung oder Induktion der
Wk Pred.
Ergebnisse 101
Sensibilität beobachtet werden (Abbildung 35). Dieses konnte von den Basophilen aber nicht
dauerhaft aufrechterhalten werden. Möglicherweise spielen hier wieder der zunehmende
Kontakt mit allergieauslösenden Insekten und ein entsprechend veränderter Antikörpertiter
eine Rolle. Dennoch kann für den Beobachtungszeitraum von zwei Wochen nach
Methylprednisolon (drei Wochen nach Entwurmung) bis teilweise drei Monate danach (April
2004) von einer Modulation der Sensibilisierungen gesprochen werden. Ein ähnliches Bild
(allergenspezifische Sensibilisierung ist supprimiert, TcA-/TcB-spezifische ist vorhanden
bzw. erhöht) konnte bereits bei der therapeutischen Anwendung von Methylprednisolon
beobachtet werden (4.1.2.2).
Es war aber in beiden Versuchansätzen (4.1 - 4.2, 4.4) keine grundsätzliche Änderung des
allergenspezifischen Sensibilisierungsspektrums zu beobachten.
4.4.5 Einfluss der Corticosteroidgabe auf die funktionellen Sensibilisierungen
basophiler Granulocyten ohne vorhergehende anthelminthische Behandlung
Es musste geklärt werden, welchen Einfluss das Corticoid alleine ohne zusätzlichen Effekt
durch Entwurmung oder Immunisierung hatte und ob die beobachteten Veränderungen in den
Sensibilisierungen der Basophilen (4.1.2 und 4.4.4) nicht nur auf das Methylprednisolon
zurückzuführen waren.
Dazu wurde im Rahmen des Modulationsversuchs durch anthelminthische Behandlung eine
Kontrollgruppe, Gruppe II (3.4.1.2), zwei Wochen vor der Entwurmung nach Entnahme einer
Blutprobe für die Bestimmung des Ausgangsstatus (FIT) der Sensibilisierungen mit 1 mg/kg
KGW Methylprednisolon behandelt. Der Erfolg der Basophileneliminierung wurde wie bei
der Gruppe I im sechs-, zwölf- und danach vierundzwanzigstündigen Abstand überprüft.
Da der Verlauf des Gesamthistamins nach Methylprednisolon der gleichen Kinetik folgte wie
bei Gruppe I (Abbildung 31), ist sie hier nicht erneut dargestellt. Auch bei dieser Gruppe war
zwölf Stunden nach Injektion kein oder nur noch wenig Histamin nach physikalischer
Freisetzung zu detektieren. Anderthalb bis zwei Tage später befanden sich die Tiere im
Rebound, nach vier Tagen waren die Histaminwerte auf das Ausgangsniveau
zurückgegangen. Die Kinetik belegte die Eliminierung und Neurekrutierung der basophilen
Granulocyten im Blut der Pferde.
Zwei Wochen nach der Corticosteriodinjektion (am Tag der anthelminthischen Behandlung)
wurde ein weiterer Sensibilisierungsstatus bezüglich der generellen und der spezifischen
Sensibilisierung erhoben.
Ergebnisse 102
Bei Betrachtung der generellen Sensibilisierung zeigten jeweils vier von acht Pferden zwei
Wochen nach Cortisonapplikation eine erhöhte Histaminfreisetzung gegen anti-IgE oder anti-
IgG (gαh) (Abbildung 36 und Abbildung 37), die anderen veränderten sich diesbezüglich
nicht. Mit Ausnahme von #27 reagierten aber alle Pferde der Gruppe II mit erhöhten
Sensibilitäten gegen entweder Antikörper, Antigene oder Allergene, auch die klinisch
gesunden Nichtallergiker. Dabei zeigten sich individuell unterschiedliche Bilder der
Veränderungen, dargestellt für die generellen Sensibilisierungen der basophilen Granulocyten
gegen anti-IgG (gαh) und anti-IgE (Abbildung 36 und Abbildung 37). So wies z. B. Tier #12
sowohl einen Anstieg in der anti-IgG- als auch in der anti-IgE-vermittelten
Histaminfreisetzung auf, Tier #29 veränderte sich nur bezüglich des gαh-vermittelten Release.
0%
20%
40%
60%
80%
100%
120%
#12 #27 #29
% d
er M
axim
alfr
eise
tzun
g
prae Pred. post Pred.
Abbildung 36: gαh-vermittelte Histaminfreisetzung vor und 14 Tage nach Methylprednislon Die Darstellung zeigt die durch anti-IgG-Ak (gαh 60 (3.4.3.1)) induzierte Histaminfreisetzung aus basophilen Granulocyten (FIT, 3.4.3) in Prozent der physikalischen Freisetzung bei drei Pferden der Gruppe II (#12, #27, #29, 3.4.1.2) vor (linke Säule) und vierzehn Tage (rechte Säule) nach einmaliger Behandlung der Tiere mit 1 mg/k KGW Methylprednisolon i.v.
Ergebnisse 103
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
#12 #27 #29
% d
er M
axim
alfr
eise
tzun
gprae Pred. post Pred.
Abbildung 37: anti-IgE-vermittelte Histaminfreisetzung vor und nach Methylprednisolon Gezeigt werden die Freisetzungen (FIT, 3.4.3) der Basophilen dreier Pferde der Gruppe II (#12, #27, #29, 3.4.1.2) nach Aktivierung durch anti-eqIgE-Antikörper (3.4.3) in Prozent der physikalischen Freisetzung vor (linke Säule) und vierzehn Tage (rechte Säule) nach einmaliger Injektion von 1 mg/kg KGW Methylprednisolon i.v. (3.3.5).
Im Gegensatz zur Gruppe I, die keine Steigerung oder eine Reduktion der generellen
Sensibilisierungen gegen anti-IgE oder anti-IgG (gαh) nach 14 Tage Cortisoninjektion
beobachten ließ (Abbildung 32 und Abbildung 33), war bei Gruppe II eine teilweise deutliche
Steigerung zu erkennen (Abbildung 36 und Abbildung 37).
Im allergenspezifischen Sensibilisierungsstatus hatten sich in Abbildung 38 für die Gruppe II
exemplarisch dargestellte Veränderungen ergeben.
0
1
2
3
prae Pred. 14 Tage post Pred.
Sens
ibili
sier
ungs
grad
Cn Mq HF
Abbildung 38: Veränderungen in den funktionellen Sensibilisierungen bezüglich Cn, Mq und HF bei Pferd #7 vor und 14 Tage nach Methylprednisolon
Die Grafik zeigt die Sensibilisierungsgrade (3.4.3.2) für drei im FIT (3.4.3) getestete Allergene (Cn,
Ergebnisse 104
Mq und HF, 3.3.4) bei Pferd #7 vor und 14 Tage nach Injektion von 1 mg/kg KGW Methylprednisolon. Das gezeigte Pferd ist ein Sommerekzemer, dessen Eiausscheidungsrate im Beobachtungszeitraum niedrig war („schwach verwurmt“, 4.3). Zwei Wochen p. med. erhöhte sich bei sechs von acht Pferden die allergenspezifische
Sensibilisierung um ein bis zwei Grade oder wurde bei vorher negativen Pferden induziert.
Eine Reduktion oder gar ein Erlöschen der Reagibilität gegen Allergene wurde bei keinem
Tier festgestellt (vergl. 4.4.4). Die Reaktionsbereitschaft gegen der rekombinanten Proteine
TcA und TcB stieg bei drei Pferden von null auf bis zu 3+ positiv. Das inverse
Reaktionsmuster auf TcB (4.1, 4.2) war auch hier nicht mehr festzustellen. Alle drei Pferde,
die auf TcA Histamin freisetzten, reagierten auch auf TcB. Fünf von acht Tieren blieben
negativ für TcA und TcB.
Zwei der acht Pferde (#27 und #29) in Gruppe II zeigten weder vor noch 14 Tage nach der
Injektion von Methylprednisolon eine funktionelle Sensibilisierung gegen die getesteten
Allergene Cn, Mq und HF.
Sieben Tage nach folgender anthelminthischer Therapie (3.4.1.2) (also insgesamt drei
Wochen nach Methylprednisolon) waren diese Muster der individuell erhöhten
Sensibilisierungen nicht mehr zu erkennen. Die vorhergehende Sensibilisierungssteigerung
hatte auch keinen Einfluss auf die Stärke der Veränderungen nach Entwurmung (4.4.2).
Diese Daten der Gruppe II weisen auf eine deutlich erhöhte generelle und spezifische
Sensibilisierung der basophilen Granulocyten bei sechs von acht Pferden zwei Wochen nach
der Behandlung mit Methylprednisolon ohne vorhergehende anthelminthische Behandlung
oder Immunisierung hin. Sie stehen damit im Kontrast zu den bisher erhobenen Daten
(TcA/B-Pferde, 4.1–4.2; Gruppe I, 4.4.4) nach Anwendung dieses Corticoides. Zwar ist bei
Vergleich mit den Beobachtungen nach therapeutischer Anwendung des Methylprednisolons
(4.1.2.2) zu bedenken, dass diese eine Woche post med. erfasst wurden, doch stellen die in
diesem Abschnitt dargestellten Sensibilisierungen einen deutlichen Unterschied zu den
ebenfalls nach vierzehn Tagen erhobenen Daten nach Entwurmung dar (4.4.4). Statt einen
hemmend-modulierenden Einfluss auf die Effektorzellen aufrecht zu erhalten, wie er in 4.4.4
festgestellt wurde, wurden die funktionellen Sensibilisierungen noch verstärkt („Rebound“).
Es waren also trotz des Winters noch ausreichend allergenspezifische Antikörper im Serum
der Pferde, um eine Sensibilisierung der neuen Basophilen nicht nur auf dem Ausgangsniveau
Ergebnisse 105
zu erhalten, sondern auch zu verstärken (vergl. z. B. Abbildung 34 mit Abbildung 38). Im
Falle der rekombinanten Parasitenproteine wird der hohe Infektionsdruck und die dadurch
teilweise große Antigenpräsenz ebenfalls zu einer Bereitstellung einer ausreichenden Anzahl
an sensibilisierenden Antikörpern geführt haben.
Die erhobenen Daten aus 4.4.4 und 4.4.5 lassen den Schluss zu, dass die durch die
Antigenanflutung nach anthelminthischer Therapie aktivierten Hemmmechanismen den
Reboundeffekt bei Gruppe I verhindern konnten (Abbildung 34) oder dass der Austausch der
sensibilisierenden Antikörper auf der Basophilenoberfläche und damit die allergen- und TcA-
/TcB-spezifische Modulation tatsächlich (zumindest für den Beobachtungszeitpunkt drei
Wochen nach der Entwurmung und zwei Wochen nach Prednisolon) erfolgreich war
(Abbildung 34 und Abbildung 35).
4.5 Sensibilisierung gegen Cyathostominae spp.
Da im Modulationsversuch durch anthelminthische Therapie vermutlich eine Vielzahl
unterschiedlicher parasitärer Antigene freigesetzt wurde, aber nur die Sensibilisierung gegen
zwei sehr spezifische, rekombinante Antigene (TcA und TcB) getestet werden konnte – die
einem ähnlichen Verdünnungseffekt wie andere sensibilisierende Antikörper unterworfen sein
konnten – hätte eine Mischung aus vielen verschiedenen Antigenen möglicherweise in diesem
Ansatz informativ sein können. Damit wäre die Erfassung der Reaktionsbereitschaft gegen die
Summe der Parasitenantigene bzw. eine Prüfung des breiten Spektrums von parasitären
Antigenen, die eine Typ-I-Reaktion auslösen können, möglich gewesen. Es ergab sich aber
erst im Frühjahr 2004 die Möglichkeit, aus kleinen Strongyliden (Cyathostominae spp.) eine
Antigenpräparation herzustellen (3.4.9) und diese im FIT (3.4.3) zu testen.
Es erwiesen sich ohne Ausnahme alle mit dieser Antigenpräparation getesteten Pferde als
positiv. Um eine unspezifische Degranulation der Basophilen durch Bestandteile der
Präparation auszuschließen, wurden humane Basophile dreier Freiwilliger im FIT mit der
Cyathostominenpräparation in den gleichen Endkonzentrationen wie die Pferde konfrontiert
(1µg/ml-1x10-5 µg/ml). In diesem Ansatz wurde kein Histamin freigesetzt. Eine
Degranulation der Basophilen dürfte also im Falle einer positiven Reaktion durch spezifische
Antikörper vermittelt sein.
Eine Ausverdünnung der Präparation verursachte bei einigen Pferden noch in einer
Konzentration von 1 ng/ml einen positiven Release. Konzentrationen von 1 und 0,1 µg/ml
erreichten in mehreren Fällen die gleiche oder höhere Histaminfreisetzung als die
Ergebnisse 106
physikalische Freisetzung. Daher wurde für die Untersuchungen im FIT als höchste
Konzentration 1µg/ml eingesetzt und in Zehnerschritten sechsmal weiter verdünnt (bis
0,00001 µg/ml oder 10pg/ml).
Die untersuchten Pferde waren im Schnitt 2+ bis 3+ positiv (0,1-0,01 µg/ml oder 100-10
ng/ml Strongylidenprotein). Dabei fiel bei zwölf getesteten Pferden im Juli 2004 auf, dass die
vier Pferde, die auch auf 10 ng/ml noch reagierten (3+), alle auch TcA- und TcB-positiv
waren. Zwei weitere TcA- und TcB-positive Tiere setzten ebenso wie die anderen, TcA- und
TcB-negativen Pferde, nur bis 100 ng oder 0,1 µg/ml der Präparation Histamin frei (2+).
Es ließen sich keine eindeutigen Zusammenhänge zwischen der Eiausscheidung (4.3, Tabelle
8 und Tabelle 9) der Tiere und dem individuellen Sensibilisierungsgrad gegen
Cyathostominae spp. feststellen (Tabelle 10).
Verhältnis der spezifischen Sensibilisierung gegen Cyathostominae spp. im FIT und individueller Ausscheidung von Strongylideneiern bei zwölf untersuchten Pferden
Pferd Nr.
Sensibilisierung gegen
Cyathostominae spp. Eiauscheidungsrate (4.3)
#4 2+ hoch
#7 2+ niedrig
#9 2+ hoch
#10 2+ hoch
#11 2+ hoch
#12 3+ niedrig
#23 2+ niedrig
#24 2+ niedrig
#25 3+ niedrig
#27 3+ niedrig
#28 1+ hoch
#32 2+ hoch
Tabelle 10: Verhältnis der spezifischen Sensibilisierung gegen Cyathostominae spp. im FIT und individueller Ausscheidung von Strongylideneiern bei zwölf untersuchten Pferden
Die Tabelle zeigt zwölf Pferde (mit und ohne Sommerekzem) und die spezifischen Sensibilisierungen ihrer basophilen Granulocyten gegen einen Extrakt aus kleinen Strongyliden (3.4.3) sowie die Höhe der individuellen Ausscheidung von Strongylideneiern (4.3). Die Bezeichnung „hoch“ bzw. „niedrig“ für die Eiausscheidungsrate wurde aufgrund der individuellen Eizahl in den Tabelle 8 und Tabelle 9 festgelegt. Die Pferde #4 bis #12 sind klinische Ekzemer, die Pferde #23 bis #32 klinisch gesund.
Ergebnisse 107
4.6 Zum Isotypen-ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)
Immunglobuline sind an der Vermittlung und der Hemmung der Typ-I-Reaktion und an der
Bekämpfung von Helminthenstadien zentral beteiligt (2.3, 2.6). Das Vorhandensein von
Antikörpern einer bestimmten Spezifität (z. B. Ak-anti-TcA oder -TcB) zu einem bestimmten
Zeitpunkt im Serum hat möglicherweise Auswirkungen auf den Antikörperbesatz der
basophilen Granulocyten (2.3). Es musste daher festgestellt werden, zu welchem Zeitpunkt
des Beobachtungszeitraumes Antikörper welchen Isotyps gegen die (sehr spezifischen)
rekombinanten Parasitenproteine TcA und TcB sowie, als Vertreter der Vielfalt der
endoparasitären Antigene, gegen einen Extrakt aus Cyathostominae spp. (3.3.4, 4.6)
vorhanden waren. Eine Untersuchung der allergenspezifischen Antikörper konnte trotz des
hohen Informationsgehaltes nicht durchgeführt werden, da derzeit noch keine isolierten
Allergene aus Culicoides nubeculosus, Tabanus spp. und Culicidae spp. zur Verfügung
stehen. Ein Nachweissystem gegen die Extrakte erbringt keine verwertbaren Daten, da alle
Pferde, die bereits Kontakt mit diesen Insekten hatten, IgG-Antikörper gegen die Bestandteile
des Speichels entwickelt haben (2.2). Die potentiellen Allergene sind in den verwendeten
Insektenextrakten nur in Spuren vorhanden, so dass die möglicherweise sensibilisierenden
Immunglobuline des Isotyps E nicht sensitiv genug nachgewiesen werden konnten (persönl.
Mitteilung T. GEIBEN, J. ROHWER).
Bei Betrachtung der im ELISA erhobenen Daten ist zu bedenken, dass in diesem System nur
Antikörper in ihrer Spezifität, jedoch nicht in ihrer Funktionalität erfasst werden können, da
die freien Serumantikörper nicht repräsentativ für die auf Zelloberflächen gebunden
Immunglobuline sein können. Es ist nicht möglich, über einen ELISA Informationen über die
tatsächlichen Bindungen von Antikörpern auf Effektorzellen zu erhalten. Es kann also keine
Aussage bezüglich einer basophilenaktivierenden Fähigkeit nach Bindung auf einen Fc-
Rezeptor getroffen werden.
Es wurden ELISA-Systeme entwickelt, die von zehn möglichen Isotypen (IgG1-IgG7, IgA,
IgE, IgM) gegen TcA, TcB und Cyathostominae spp. sechs detektieren konnten (IgG1, IgG2,
IgG4, IgG5, IgE und IgA) (3.4.6). Ein Nachweis der vier anderen gelang im Falle des IgM
aufgrund einer zu großen unspezifischen Bindung des Detektionsantikörpers nicht, im Falle
der Isotypen IgG3, IgG6 und IgG7 standen keine oder nicht ausreichende
Nachweisreagenzien zur Verfügung (2.6).
Um einen ausreichenden Überblick über die Titerverläufe zu erhalten, wurden neun
Zeitpunkte verteilt über den Beobachtungszeitraum ausgewählt:
Ergebnisse 108
Auswahl der im ELISA zu untersuchenden Seren nach Zeitpunkten des
Beobachtungszeitraumes
Datum
lfd.
Nr. Begründung für die Auswahl des Zeitpunktes
17.02.03 1
Vor der Immunisierung der TcA-/TcB-Pferde, Status der Eiausscheidung
und FIT vorhanden,
01.04.03 2 Zwei Wochen nach der Immunisierung mit TcA und TcB
24.07.03 3
Vor anthelminthischer Behandlung mit Pyrantel, Status der
Eiausscheidung und FIT vorhanden
05.08.03 4 Nach Entwurmung mit Pyrantel
06.10.03 5 Status der Eiausscheidung und FIT vorhanden
01.12.03 6 Status der Eiausscheidung und FIT vorhanden
19.01.04 7
Vor anthelminthischer Behandlung mit Moxidectin und Praziquantel,
Status der Eiausscheidung und FIT vorhanden
20.02.04 8
Nach Entwurmung mit Moxidectin und Praziquantel, Status der
Eiausscheidung und FIT vorhanden
19.04.04 9 Status der Eiausscheidung und FIT vorhanden
Tabelle 11: Auswahl der im ELISA zu untersuchenden Seren nach Zeitpunkten des Beobachtungszeitraumes
Die Tabelle gibt die neun Zeitpunkte wieder, an denen die Seren gewonnen wurden, die im ELISA (3.4.6) gegen TcA, TcB und eine Präparation aus kleinen Strongyliden (3.3.4 bzw. 3.4.9) getestet wurden, und die inhaltliche Begründung für die Auswahl dieser Zeitpunkte. Der Auswahlzeitraum erstreckt sich vom 17.02.03 bis zum 19.04.04. Den einzelnen Zeitpunkten sind zusätzlich die laufenden Nummern 1-9 zugeordnet.
Für die Untersuchungen wurden die Seren von sechs Pferden nach den Kriterien stark oder
schwach verwurmt (4.3) und TcA/TcB-immunisiert oder Kontrollpferd (3.4.1.1) ausgewählt,
für die Untersuchungen des Gesamt-IgE-Spiegels (4.6.3) elf Pferde nach Ekzem- und
Eiausscheidungsstatus.
Ergebnisse 109
Die im Isotypen-ELISA gegen TcA, TcB und Cyathostominae spp. untersuchten Pferde
Pferd # TcA-/TcB-immunisiert Eiausscheidungsstatus #1 ja gering #8 nein gering #10 nein hoch #16 nein hoch #20 ja gering #32 ja hoch
Tabelle 12: Die im Isotypen-ELISA gegen TcA, TcB und Cyathostominae spp. untersuchten Pferde
In dieser Tabelle sind die Pferde dargestellt, deren Seren (Tabelle 11) im ELISA (4.6.1 bzw. 4.6.2) gegen die rekombinanten Proteine TcA, TcB und gegen einen Extrakt aus kleinen Strongyliden (3.3.4 bzw. 3.4.9) auf die Isotypen IgE, IgA, IgG1, IgG2, IgG4 und IgG5 untersucht wurden. Zudem sind ihr Immunisierungsstatus gegen TcA und TcB (4.1.1) sowie ihr Grad der Eiausscheidung (4.3) angegeben. Bei den Tieren #1, #8 und #10 handelt es sich um klinische Ekzemer, bei #16, #20 und #32 um klinisch gesunde Tiere (3.1.1).
Auswahl von elf Pferden mit unterschiedlichem Ekzem- und Eiausscheidungsstatus
Pferd # Ekzemer/ gesund Eiausscheidungsstatus #1 Ekzemer gering #8 Ekzemer gering #10 Ekzemer hoch #11 Ekzemer hoch #12 Ekzemer gering #16 gesund hoch #20 gesund gering #24 gesund gering #27 gesund gering #28 gesund hoch #32 gesund hoch
Tabelle 13: Auswahl von elf Pferden mit unterschiedlichem Ekzem- und Eiausscheidungsstatus Die Tabelle zeigt die elf Pferde an, deren Seren im Gesamt-IgE-ELISA (3.4.6.2) über einen Zeitraum von vierzehn Monaten (Tabelle 11) untersucht wurden (4.6.3), zusammen mit Angaben zu ihrem allergischen (3.1.1) und parasitologischen (4.3) Status.
Ergebnisse 110
4.6.1 ELISA zum Nachweis von equinen Immunglobulinen gegen TcA und TcB
Die Seren der in Tabelle 12 angegebenen Pferde wurden nach dem in 3.4.6.1 angeführten
ELISA auf Antikörper gegen TcA und TcB (3.3.4) untersucht.
Es konnten bei allen immunisierten Pferden (#1, #20, #32) zwei Wochen nach der
Applikation Antikörper aller Isotypen gegen TcA mit Ausnahme des IgE nachgewiesen
werden, ebenso bei einem nicht immunisierten Kontrollpferd (#16) (Abbildung 39 und
Abbildung 40). Vor der Immunisierung hatten nur Kontrollpferd #16 geringe Mengen aller
untersuchten IgG-Isotypen und TcA-/TcB-Pferd #1 nur IgG5 gegen TcA. Exemplarisch für
den Titerverlauf aller Isotypen sind in Abbildung 39 und Abbildung 40 alle Pferde zum Isotyp
IgG1 dargestellt.
0
20
40
60
80
100
120
17.02.03 01.04.03 24.07.03 05.08.03 06.10.03 01.12.03 19.01.04 20.02.04 19.04.04
ELIS
A-U
nits
#1 #20 #32
Abbildung 39: IgG1-Antikörper gegen TcA bei immunisierten Pferden (TcA-/TcB-Pferde) im
Beobachtungszeitraum In dieser Grafik ist der Antikörpertiterverlauf des Isotyps IgG1 gegen das rekombinante Protein TcA (3.3.4) bei mit TcA immunisierten Pferden (3.4.1.1) über den Beobachtungszeitraum hinweg in ELISA-Units (3.4.6.3) dargestellt. Die Immunisierung (Pfeil) erfolgte zwei Wochen vor dem 01.04.03 (am 16.03.03).
Immunisierung
Ergebnisse 111
0
5
10
15
20
25
30
35
17.02.03 01.04.03 24.07.03 05.08.03 06.10.03 01.12.03 19.01.04 20.02.04 19.04.04
ELIS
A-U
nits
#8 #10 #16
Abbildung 40: IgG1-Antikörper gegen TcA bei nicht immunisierten Pferden (Kontrollpferden)
im Beobachtungszeitraum Diese Grafik zeigt den Antikörperspiegel des Isotyps IgG1 gegen das rekombinante Protein TcA (3.3.4) bei nicht immunisierten Pferden (Kontrollpferden) (3.4.1.1) über den Beobachtungszeitraum hinweg in ELISA-Units (3.4.6.3) dargestellt.
Die Induktion bzw. die Verstärkung der TcA-spezifischen Antikörper bei den am 16.03.03
immunisierten Tieren ist am 01.04.03 deutlich erkennbar. #32 konnte den Titer am längsten
halten (Abbildung 39), dieses Pferd hatte kein therapeutisches Cortison erhalten. Bei den
anderen zwei Pferden (#1, #20, Abbildung 39), die therapeutisch Methylprednisolon erhalten
hatten (4.1), fiel der Titer bis zum nächsten Untersuchungszeitpunkt (24.07.03) wieder ab.
Dieses Verhalten der Antikörperspiegel gegen TcA ließ sich bei den drei Pferden bei allen
Isotypen mit Ausnahme des IgE beobachten, da IgE gegen TcA im ELISA nicht nachweisbar
war. #20 zeigte zudem eine deutlich verzögerte Reaktion mit IgA und erreichte einen
gesteigerten Spiegel erst Ende Juli (24.07.03), der sich schnell wieder verlor. Die bei allen
drei Pferden schwächste Reaktion zeigten IgG5-Antikörper, die stärkste IgG4-Antikörper.
Bei den Kontrollpferden zeigte sich, dass ein TcA-Titer nicht durch Immunisierung bedingt
sein musste, sondern bereits vorher bestehen konnte (#16). Bei diesem Pferd waren – mit
Ausnahme von IgE – Antikörper aller untersuchten Isotypen gegen TcA nachweisbar. Die
beiden nicht immunisierten Kontrollpferde (#8 & #10) anderen wiesen keine bis (im Verlaufe
des Sommers) nur sehr wenige TcA-spezifische Immunglobuline auf.
Bei allen Tieren ist auffällig, dass sich der Serumtiter, unabhängig von einer durch
Immunisierung induzierten oder einer natürlichen Antikörperbildung, im Zeitablauf
ausschlich und auch weder durch eine Behandlung mit Pyrantel (zwischen dem 24.07. und
05.08.03) noch durch eine mit Moxidectin und Praziquantel (am 19.01.04) beeinflussen ließ.
Ergebnisse 112
Einzige Ausnahme stellte IgG4 bei dem Kontrollpferd #16 dar, das sich über den Sommer
verstärkte und gegen Herbst 2003 auf sein Ausgangsniveau reduzierte, sich aber nicht verlor.
#32 blieb auf einem niedrigen Niveau (20 Units) ebenfalls bis in das Frühjahr 2004 IgG4-
positiv. Es gab keinen Zusammenhang mit der individuellen Reaktionslage der Pferde gegen
Nematoden (4.3).
Gegen TcB ließen sich bei keinem der Pferde Antikörper der sechs untersuchten Isotypen
nachweisen, auch nicht zwei Wochen (01.04.03) nach der Immunisierung. Da die ELISA-
Ergebnisse durchweg negativ ausfielen, sind sie hier nicht grafisch dargestellt.
Es lässt sich also feststellen, dass ein Nachweis einer Induktion bzw. einer Verstärkung der
freien Antikörperantwort im Serum gegen TcA nach der Immunisierung erbracht werden
konnte, soweit die Isotypen IgA, IgG1, IgG2, IgG4 und IgG5 betroffen waren (Abbildung
39). IgE ließ sich zu keinem hier untersuchten Zeitpunkt nachweisen. Weiter kann gesagt
werden, dass eine Antikörperantwort gegen dieses rekombinante Protein auch
natürlicherweise entstehen konnte.
Freie Antikörper gegen TcB ließen sich für keinen der hier betrachteten Isotypen im Serum
nachweisen.
4.6.2 ELISA zum Nachweis von equinen Immunglobulinen gegen Cyathostominae spp.
Zur Bestimmung der nematodenspezifischen Antikörperverhältnisse und der
Isotypenverteilung wurde ein ELISA nach 3.4.6.1 mit den Seren der in Tabelle 12
aufgelisteten Pferde zu neun Zeitpunkten (Tabelle 11) durchgeführt.
Es konnten Antikörper jeden Isotyps gegen die Strongylidenpräparation nachgewiesen
werden, jedoch nicht bei jedem Pferd. Bis auf IgG1 und IgG4 verliefen die Titer individuell
uneinheitlich.
Ergebnisse 113
0
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17.02.03 01.04.03 24.07.03 05.08.03 06.10.03 01.12.03 19.01.04 20.02.04 19.04.04
ELIS
A-U
nits
#1 #8 #20
Abbildung 41: IgG1-Titerverlauf gegen Cyathostominae spp. im Beobachtungszeitraum bei drei
Pferden mit geringer Eiausscheidung Dargestellt sind die Titer des Isotyps IgG1 spezifisch gegen kleine Strongyliden (3.3.4) bei drei Pferden (#1, #8, #20) mit geringer Eiausscheidung (4.3) über den Beobachtungszeitraum, angegeben in ELISA-Units (3.4.6.3). Anthelminthische Behandlungen (Pfeile) erfolgten am 24.07.03 (Pyrantel, 3.3.5) und am 19.01.04 (Moxidectin und Praziquantel, 3.3.5), jeweils nach der Blutentnahme.
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17.02.03 01.04.03 24.07.03 05.08.03 06.10.03 01.12.03 19.01.04 20.02.04 19.04.04
ELIS
A-U
nits
#10 #16 #32
Abbildung 42: IgG1-Titerverlauf gegen Cyathostominae spp. im Beobachtungszeitraum bei drei
Pferden mit hoher Eiausscheidung Dargestellt sind die Titer des Isotyps IgG1 spezifisch gegen kleine Strongyliden (3.3.4) bei drei Pferden (#10, #16, #32) mit hoher Eiausscheidung (4.3) über den Beobachtungszeitraum, angegeben in ELISA-Units (3.4.6.3). Anthelminthische Behandlungen (Pfeile) erfolgten am 24.07.03 (Pyrantel, 3.3.5) und am 19.01.04 (Moxidectin und Praziquantel, 3.3.5), jeweils nach der Blutentnahme.
Im Falle des IgG1 zeigten zwei (#1 und #8) von drei Pferden mit geringer Eiausscheidung
vergleichsweise niedrige Antikörpertiter (Abbildung 41), dagegen zwei von drei Tieren (#10
und #16) mit hoher Eiausscheidung höhere Spiegel (Abbildung 42).
Bei fünf von sechs Pferden (mit Ausnahme des Tieres #1) konnte nach Behandlung mit
Moxidectin und Praziquantel ein Rückgang des Serum-IgG1-Titers festgestellt werden
Pyrantel
Mox./Praz.
Pyrantel Mox./Praz.
Ergebnisse 114
(Abbildung 41 und Abbildung 42).
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17.02.03 01.04.03 24.07.03 05.08.03 06.10.03 01.12.03 19.01.04 20.02.04 19.04.04
ELIS
A-U
nits
#1 #8 #20
Abbildung 43: IgG4-Titerverlauf gegen Cyathostominae spp. im Beobachtungszeitraum bei drei
Pferden mit geringer Eiausscheidung Dargestellt sind die Titer des Isotyps IgG4 spezifisch gegen kleine Strongyliden (3.3.4) bei drei Pferden (#1, #8, #20) mit geringer Eiausscheidung (4.3) über den Beobachtungszeitraum, angegeben in ELISA-Units (3.4.6.3). Anthelminthische Behandlungen (Pfeile) erfolgten am 24.07.03 (Pyrantel, 3.3.5) und am 19.01.04 (Moxidectin und Praziquantel, 3.3.5), jeweils nach der Blutentnahme.
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ELIS
A-U
nits
#10 #16 #32
Abbildung 44: IgG4-Titerverlauf gegen Cyathostominae spp. im Beobachtungszeitraum bei drei
Pferden mit hoher Eiausscheidung Dargestellt sind die Titer des Isotyps IgG4 spezifisch gegen kleine Strongyliden (3.3.4) bei drei Pferden (#10, #16, #32) mit hoher Eiausscheidung (4.3) über den Beobachtungszeitraum, angegeben in ELISA-Units (3.4.6.3). Anthelminthische Behandlungen (Pfeile) erfolgten am 24.07.03 (Pyrantel, 3.3.5) und am 19.01.04 (Moxidectin und Praziquantel, 3.3.5), jeweils nach der Blutentnahme. Das IgG4 gegen kleine Strongyliden, das bei allen untersuchten Tieren nachgewiesen werden
konnte, verhielt sich bei mit Magen-Darm-Strongyliden stark und schwach belasteten Pferden
Pyrantel Mox./Praz.
Pyrantel
Mox./Praz.
Ergebnisse 115
(4.3) ähnlich. Zum Sommer hin stieg der Titer deutlich an, um im Herbst wieder abzufallen
und im Winter den Tiefstpunkt zu erreichen (um die Monate Dezember und Januar). Im
folgenden Frühjahr war ein erneuter Anstieg zu verzeichnen.
Ein Zusammenhang zwischen der Höhe der Eiausscheidung oder einem Einfluss durch
anthelminthische Behandlung und der ELISA-Unit-Zahl für IgG4 konnte nicht festgestellt
werden.
Für das uneinheitlich verlaufende IgG2 ließ sich als einzige Gemeinsamkeit bei vier von sechs
Pferden ein Anstieg zum Winter (Zunahme der parasitären Belastung) erkennen, gefolgt von
einem Absinken nach Behandlung mit Moxidectin und Praziquantel.
Dieser Rückgang im Titer nach anthelminthischer Behandlung mit den vorgenannten
Präparaten konnte auch bei fünf der sechs untersuchten Pferde im Fall des IgG5 beobachtet
werden. Dem war bei vier Tieren ein Anstieg zum Januar 2004 (stärkste parasitische
Belastung des Beobachtungszeitraumes) vorausgegangen. Bei allen Pferden mit Ausnahme
des Tieres #32, das mit drei bis dreieinhalb Jahren jüngste Pferd, konnte IgG5 gegen kleine
Strongyliden nachgewiesen werden. #32 entwickelte erst zum Dezember 2003 einen dann
jedoch sehr hohen IgG5-Titer. Zwischen dem individuellen Eiausscheidungsstatus und der
ELISA-Unit-Zahl ließ sich keine Beziehung erkennen.
Beim strongylidenspezifischen IgE (Abbildung 45 und Abbildung 46) zeigten vier von sechs
Pferden einen Anstieg zum Januar 2004, drei sanken nach der zu diesem Zeitpunkt erfolgten
Entwurmung mit Moxidectin und Praziquantel (3.3.5) wieder ab. Die anthelminthische
Behandlung mit Pyrantel (3.3.5) im Juli 2003 hatte diesen Effekt nicht (Abbildung 45 und
Abbildung 46).
Ergebnisse 116
05
101520253035404550
17.02.03 01.04.03 24.07.03 05.08.03 06.10.03 01.12.03 19.01.04 20.02.04 19.04.04
ELIS
A-U
nits
#1 #8 #20
Abbildung 45: Cyathostominae-spezifischer IgE-Titer bei drei Pferden mit geringer
Eiausscheidung Dieser Grafik sind die Titer des gegen kleine Strongyliden (3.3.4) spezifischen IgE bei drei Pferden (#1, #8, #20) mit geringer Eiausscheidung (4.3) über den Beobachtungszeitraum zu entnehmen, sie sind in ELISA-Units angegeben (3.4.6.3). Es wurden Seren von neun Zeitpunkten untersucht (Tabelle 11). Anthelminthische Behandlungen (Pfeile) erfolgten am 24.07.03 (Pyrantel) und am 19.01.04 (Moxidectin und Praziquantel) (3.4.5), jeweils nach der Blutentnahme.
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ELIS
A-U
nits
#10 #16 #32
Abbildung 46: Cyathostominae-spezifischer IgE-Titer bei drei Pferden mit hoher
Eiausscheidung Dieser Grafik sind die Titer des gegen kleine Strongyliden (3.3.4) spezifischen IgE bei drei Pferden (#10, #16, #32) mit hoher Eiausscheidung (4.3) über den Beobachtungszeitraum zu entnehmen, sie sind in ELISA-Units angegeben (3.4.6.3). Es wurden Seren von neun Zeitpunkten untersucht (Tabelle 11). Anthelminthische Behandlungen (Pfeile) erfolgten am 24.07.03 (Pyrantel) und am 19.01.04 (Moxidectin und Praziquantel) (3.4.5), jeweils nach der Blutentnahme.
Zwei Pferde wiesen einen zusätzlichen Anstieg im Sommer 2003 auf (#10 und #20,
Abbildung 45 und Abbildung 46).
Die Höhe des in ELISA-Units angegebenen Titers korrelierte nach den erhobenen Daten nicht
direkt mit dem Eiausscheidungsstatus (4.3).
Pyrantel Mox./Praz
Pyrantel Mox./Praz.
Ergebnisse 117
Bei Pferd #32 ist auffällig, dass es bis zum Winter 2004, zum Zeitraum der höchsten
Eiausscheidungen, kein oder nur an der Nachweisgrenze vorhandenes, strongyliden-
spezifisches IgE hatte, dann aber einen sehr hohen Spiegel entwickelte (vor der
anthelminthischen Behandlung) (Abbildung 46).
Zusammenfassend kann gesagt werden, dass sich Antikörper aller untersuchten Isotypen
gegen kleine Strongyliden nachweisen ließen. Die Pferde zeigten teilweise sehr
unterschiedliche Antikörperantworten gegen die Nematoden. Eine deutliche jahreszeitliche
Abhängigkeit konnte beim IgG4 erkannt werden, eine partielle Abhängigkeit von dem
individuellen parasitologischen Status beim IgG1. IgG2 und IgG5 waren bei vier von sechs
Pferden zum Zeitpunkt der höchsten Eiausscheidung (Januar 2004) erhöht und sanken nach
anthelminthischer Behandlung.
Zum Termin der Methylprednisoloninjektionen (4.1.1, 16.03.2003; 4.4, 05.01. bzw.
26.01.2004) waren bei allen mit dem Medikament behandelten Pferden Immunglobuline aller
Isotypen – auch IgE – gegen Cyathostominae spp. nachweisbar (vergl. Abbildung 41 bis
Abbildung 46).
Das in 4.3 mit einem steigenden parasitenspezifischen Antikörpertiter und somit mit einem
entsprechend veränderten Basophilenbesatz begründete Ausschleichen der TcA-/TcB-
Antwort im Sommer 2003 (4.2) lässt sich mit den im ELISA erhobenen Daten nicht
bestätigen.
4.6.3 ELISA zur Untersuchung des Verlaufs des Gesamt-IgE-Titers bei ausgewählten
Pferden
In der Literatur wird beschrieben, dass sich der IgE-Titer bei allergischen oder stark
verwurmten gegenüber nicht verwurmten und gesunden Individuuen erhöht. Zudem spielt
zumindest beim Menschen (HAGEL ET AL, 1993a) das Verhältnis zwischen dem
parasitenspezifischem und dem Gesamt-IgE-Spiegel eine Rolle bei der individuellen
Fähigkeit, die Parasitenlast zu bekämpfen (2.7). Es wurden daher elf Pferde (Tabelle 13) auf
den IgE-Gehalt ihrer Seren im Beobachtungszeitraum (Tabelle 11) im ELISA (3.4.6.2)
untersucht.
Exemplarisch sind in den zwei folgenden Abbildungen jeweils drei stark (Abbildung 47) und
drei schwach (Abbildung 48) verwurmte Pferde dargestellt.
Ergebnisse 118
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17.02.03 01.04.03 24.07.03 05.08.03 06.10.03 01.12.03 19.01.04 20.02.04 19.04.04
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#10 #11 #28
Abbildung 47: Gesamt-IgE-Titer bei drei stark verwurmten Pferden Dargestellt sind die Total-IgE-Titerverläufe dreier Pferde (#10, #11, #28) mit hoher Eiausscheidung (4.3) im Beobachtungszeitraum über vierzehn Monate hinweg. Die Antikörperspiegel sind in ELISA-Units (3.4.6.3) angegeben. Bei den Pferden #10 und #11 handelte es sich um Sommerekzemer, #28 war klinisch gesund. Anthelminthische Behandlungen (Pfeile, 3.4.5) fanden am 24.07.03 (Pyrantel) und am 19.01.04 (Moxidectin und Praziquantel) statt, jeweils nach der Blutentnahme.
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ELIS
A-U
nits
#8 #20 #24
Abbildung 48: Gesamt-IgE-Titer bei drei schwach verwurmten Pferden Dargestellt sind die Total-IgE-Titerverläufe dreier Pferde (#8, #20, #24) mit niedriger Eiausscheidung (4.3) im Beobachtungszeitraum über vierzehn Monate hinweg. Die Antikörperspiegel sind in ELISA-Units (3.4.6.3) angegeben. Bei Tier #8 handelte es sich um einen Sommerekzemer, #20 und #24 waren klinisch gesund. Anthelminthische Behandlungen (Pfeile, 3.4.5) fanden am 24.07.03 (Pyrantel) und am 19.01.04 (Moxidectin und Praziquantel) statt, jeweils nach der Blutentnahme.
Es lässt sich anhand der Abbildungen feststellen, dass die Höhe des Total-IgE-Spiegels nicht
mit dem allergischen Status der Pferde, sondern vielmehr mit der Eiausscheidungsrate
korrelierte und die schwach belasteten Tiere deutlich geringere Titer hatten als die stärker
belasteten. Eine Ausnahme stellte dabei Pferd #12 dar, das trotz einer geringen Eizahl (4.3)
Pyrantel Mox./Praz.
Pyrantel Mox./Praz.
Ergebnisse 119
Titerwerte zwischen 103 und 240 ELISA-Units (3.4.6.3) aufwies. Dabei war bei acht von elf
Pferden ein Anstieg im Sommer festzustellen, bei fünf der elf zusätzlich ein Anstieg oder ein
hohes Niveau im Herbst (Oktober) (z. B. #28, Abbildung 47). Bei zehn von elf Tieren (außer
#11, Abbildung 47) konnte nach Entwurmung mit Moxidectin und Praziquantel (Januar 2004)
ein Rückgang im Gesamt-IgE beobachtet werden (Abbildung 47 und Abbildung 48).
Der Total-IgE-Spiegel der Pferde zeigte in dieser Untersuchung keinen Zusammenhang mit
dem Status als Ekzemer oder Nichtekzemer, sondern mit der individuellen Fähigkeit der
Tiere, ihre Nematodenlast zu bekämpfen (ausgedrückt in der Eiausscheidungszahl im
Beobachtungszeitraum).
4.6.4 Verhältnis von spezifischem IgE zu Gesamt-IgE
Aus der Literatur ist für den Menschen bekannt, dass der Quotient aus Gesamt-IgE und
parasitenspezifischen IgE bei Individuen mit unterschiedlichen Reaktionslagen gegen eine
Helminthenlast zusammenhängt (2.7). Dies wurde anhand der vorliegenden Daten für die hier
untersuchten Pferde überprüft.
Folgende dargestellte Quotienten wurden ermittelt: Verhältnis von Gesamt-IgE zu strongylidenspezifischem IgE
Pferd Nr. Eiausscheidungsgrad Quotient aus spezifischem und Gesamt- IgE
#1 niedrig 1 : 4,8
#8 niedrig 1 : 4,5
#20 niedrig 1 : 2,6
#10 hoch 1 : 11
#16 hoch 1 : 11
Tabelle 14: Verhältnis von strongylidenspezifischem IgE zu Gesamt-IgE Die Tabelle zeigt die Quotienten aus dem dem spezifischen IgE-Titer gegen Cyathostominae spp. (in ELISA-Units, 3.4.6.3) und dem Gesamt-IgE-Titer (ebenfalls in ELISA-Units) bei fünf Pferden über den Untersuchungszeitraum (Spezifischer Titer:Gesamt-Titer). Bei #1, #8 und #20 handelt es sich um Tiere mit geringer Eiausscheidung (4.3), bei #10 und #16 um solche mit hoher Eiausscheidung. Für #32 konnte kein Quotient ermittelt werden, da sich die IgE-Titerverhältnisse während des Beobachtungszeitraumes stark veränderten (Abbildung 45).
Es deutet sich für die Pferde mit einer geringeren Eiausscheidung ein deutlich engeres
Verhältnis aus Gesamt-IgE und strongylidenspezifischem IgE an als für Tiere mit einer hohen
Ergebnisse 120
Ausscheidungsrate.
Die Daten aus der Literatur für den Menschen konnten somit für die hier untersuchten Pferde
bestätigt werden.
4.7 Beziehungen zwischen spezifischen Sensibilisierungen der basophilen
Granulocyten und ELISA-Titern
Die ursprünglichen Fragestellungen nach einer Modulationsmöglichkeit der Basophilen durch
helminthenspezifische Antikörper erforderten eine Gegenüberstellung der funktionellen
Sensibilisierungen, ihrer Veränderungen und den entsprechenden Antikörperverhältnissen.
Dabei musste einerseits die Beeinflussung der allergen- und antigenspezifischen
Sensibilisierung durch die allergen- und antigenspezifischen Antikörpertiter untersucht
werden, andererseits eine mögliche Beeinflussung der Sensibilisierungsverhältnisse durch
nicht-antigenspezifische Immungobulinverhältnisse.
4.7.1 Beeinflussung der funktionellen, spezifischen Sensibilisierung basophiler
Granulocyten durch Immunglobuline bestimmter Spezifität
Die Modulation der Basophilen wurde durch eine Veränderung des spezifischen
Antikörpertiters angestrebt – einmal durch die Induktion oder Steigerung der
Immunglobulinproduktion gegen TcA und TcB (4.1), andererseits durch Freisetzung einer
großen Menge parasitären Antigens durch eine anthelminthische Behandlung stark
verwurmter oder unter hohem Infektionsdruck stehender Pferde (4.4). Die
Basophilenpopulation wurde durch Methylprednisolon ausgetauscht (4.1.1, 4.4.4), die
Immunglobulinrezeptoren der neuen Basophilen mit den aktuellen Antikörpern besetzt und
die neuen Sensibilisierungen (generell und spezifisch) im FIT geprüft (4.1.2, 4.2, 4.4)). Das
Antikörperspektrum wurde im ELISA auf die Titer gegen die Spezifitäten TcA, TcB und
Cyathostominae spp. (kleine Strongyliden) untersucht (4.6).
Tabelle 15 gibt fünf Pferde wieder, deren Immunglobulintiter gegen TcA und TcB zum
Zeitpunkt einer Prednisolonapplikation bekannt war.
Ergebnisse 121
Übersicht über die individuellen Sensibilisierungs- und Antikörpertiterverhältnisse bei fünf Pferden
Pferd Nr. Serumantikörper
gegen TcA Serumantikörper
gegen TcB
TcA-spezifische Sensibilisierung
nach Methylpredn.
TcB-spezifische Sensibilisierung
nach Methylpredn.
#1 IgG5: 24 U nicht nachweisbar TcA 3+ TcB 1+
#8 IgG5: 81 U nicht nachweisbar TcA 1+ TcB 1+
#16 IgG4: 17U, IgG1:14U, IgA: 37U
nicht nachweisbar TcA 3+ TcB 1+
#20 IgG4: 7U, IgG1: 9U nicht nachweisbar TcA 2+ TcB 1+
#32 IgG4: 20 U, IgG2: 12U, IgG1: 7U
nicht nachweisbar
keine spez. Sensibilisierung
keine spez. Sensibilisierung
Tabelle 15: Übersicht über die individuellen Sensibilisierungs- und Antikörpertiterverhältnisse bei fünf Pferden
Die Tabelle gibt Aufschluss über die vorherrschenden Titerverhältnisse gegen TcA und TcB (3.3.4) vor Injektion von Methylprednisolon (3.3.5, 19.01.04) und die folgende spezifische Sensibilisierung der equinen Basophilen gegen diese rekombinanten Nematodenproteine bei fünf Pferden (FIT (3.4.3) vom 09.02.04). U steht für Unit, ELISA-Einheit (3.4.6.3). Die Daten stammen aus dem Modulationsversuch durch anthelminthische Behandlung (4.4). Dabei sind nur Anti-TcA-Ak-Titer dargestellt, die eindeutig positiv – höher als 3 Units – waren.
Die Tabelle 15 zeigt, dass eine funktionelle Sensibilisierung der basophilen Granulocyten
auch möglich war, wenn die Titer der sensibilisierenden Antikörper unterhalb der
Nachweisgrenze lagen (z. B. für TcB bei den Tieren #1, #8, #16 und #20). Ein Nachweis von
freiem Serum-IgG4αTcA wie bei Pferd #32 musste nicht zu einer funktionellen
Sensibilisierung führen. Im Falle des TcB konnten zu keinem Zeitpunkt Antikörper
unabhängig welchen Isotyps nachgewiesen werden, trotzdem lagen sowohl nach der
therapeutischen (4.1.2.2) als auch nach der versuchsbedingten Prednisolongabe (4.4.4)
teilweise deutliche funktionelle TcB-Sensibilisierungen der Basophilen vor.
Aus der Höhe des in diesem System nachweisbaren Titers gegen TcA und TcB kann kein
Rückschluss auf die funktionelle Sensibilisierung gezogen werden.
Da zu den Modulationsuntersuchungen noch keine Histaminfreisetzungstests mit
Cyathostominae spp. durchgeführt worden waren, kann keine Aussage zu einer Veränderung
der diesbezüglichen spezifischen Sensibilisierung nach einer anthelminthischen Behandlung
und gegebenenfalls Methylprednisolon getroffen werden.
Ergebnisse 122
Da ein hoher strongylidenspezifischer Titer eines bestimmten Immunglobulinisotyps nach
Eliminierung und Neurekrutierung der Basophilen nicht zu einer anderen Kinetik der
funktionellen Sensibilisierungen führte als bei Tieren der gleichen Gruppe mit geringeren
Titern (4.4), wurde das Sensibilisierungsverhalten der Basophilen der in 4.4 mit
Methylprednisolon behandelten Pferde (Gruppe I und Gruppe II) nicht durch die Titerhöhe
der untersuchten Isotypen beeinflusst. Stattdessen war die Sensibilisierung von der
Vorbehandlung (vorhergehende Entwurmung oder nicht) abhängig. Dies trifft auch auf die
Sensibilisierungen nach therapeutischem Einsatz des Methylprednisolons nach der
Immunisierung zu (#1, #20) (4.1.2.2). Dass die spezifische Titerhöhe bei einer
Basophilensensibilisierung keinen entscheidenden Einfluss hat, zeigt sich ebenfalls in Tabelle
15.
Das Ausschleichen der TcA-/TcB-Antwort, das noch in 4.3 mit einer möglichen Steigerung
der parasitenspezifischen Antikörpertiter und so einer Ausverdünnung auf den Basophilen
begründet wurde, kann in dieser Form durch die im ELISA gewonnen Daten nicht bestätigt
werden, da ein Ig-Titeranstieg gegen die Cyathostominae-Antigenpräparation nach
anthelminthischer Behandlung bei den untersuchten Isotypen nicht beobachtet werden konnte.
Eine Steigerung des Titers der hier nicht untersuchten Isotypen und damit ihr Einfluss kann
jedoch nicht ausgeschlossen werden
4.7.2 Beeinflussung der funktionellen Sensibilisierungen basophiler Granulocyten
durch IgE-Titerverhältnisse
GEIBEN (2003) und KOBELT (2001) konnten jeweils im Herbst einen Rückgang der
funktionellen Sensibilisierungen gegen Cn feststellen; dieses konnte in den unter 4.3
dargestellten Untersuchungen für einige Pferde bestätigt werden. Beide Autoren vermuteten
einen über die Weideperiode parasiteninduzierten Anstieg des nicht-allergenspezifischen
Immunglobulinanteils (insbesondere IgE) auf den Basophilen und so eine Ausverdünnung der
allergenspezifischen Antikörper trotz andauerndem Kontakt mit den allergieauslösenden
Insekten.
Im Gesamt-IgE-ELISA (4.6.3) zeigten fünf von elf untersuchten Pferden im Oktober 2003
einen Anstieg oder einen erhöhten IgE-Titer (#10, #16, #24, #28, #32, Abbildung 47 und
Abbildung 48). Alle fünf waren zu diesem Zeitpunkt geringer oder nicht mehr gegen Cn
sensibilisiert als noch im Juli 2003. Pferde, die diesen Anstieg nicht aufwiesen, blieben in
ihrer Sensibilisierung unverändert (Tabelle 16).
Ergebnisse 123
Veränderungen in der funktionellen Sensibilisierung gegen Culicoides nubeculosus (Cn) von Juli bis Oktober 2003 bei sieben Pferden mit unterschiedlichen Gesamt-IgE-Titerverhältnissen
Pferd Nr.
Serum-
IgE in
Units im
Juli 2003
Cn-spezifische
Sensibilisierung
im Juli 2003
Serum-
IgE in
Units im
Okt. 2003
Cn-spezifische
Sensibilisierung
im Oktober
2003
#10 548 3+ 550 2+
#16 83 2+ 133 negativ (0)
#24 88 1+ 114 negativ (0)
#28 85 1+ 350 negativ (0)
#32 19 1+ 240 negativ (0)
#1 22 3+ 20 3+
#8 80 2+ 62 2+
Tabelle 16: Veränderungen in der funktionellen Sensibilisierung gegen Culicoides nubeculosus (Cn) von Juli bis Oktober 2003 bei sieben Pferden mit unterschiedlichen Gesamt-IgE-Titerverhältnissen
Die Tabelle zeigt fünf Pferde (#10, #16, #24, #28, #32) mit den Cn-spezifischen Sensibilisierungen ihrer basophilen Granulocyten (in Sensibilisierungsgraden, 3.4.3.2) und mit dem Gesamt-IgE-Titer in ELISA-Units (3.4.6.3) im Juli und im Oktober 2003, die im Oktober eine Erhöhung oder einen gleich bleibend hohen Gesamt-IgE-Titer aufwiesen (4.6.3). Zum Vergleich sind zwei weitere Pferde aufgeführt (#1, #8), bei denen kein Anstieg oder ein Absinken des Total-IgE-Spiegels beobachtet werden konnte. Bei den fett und kursiv gedruckten Pferden (#10, #1 und #8) handelt es sich um klinische Ekzemer, die anderen sind klinisch gesund, jedoch funktionell sensibilisiert.
Bei Tier #16 konnte zu diesem Termin auch ein Anstieg des Cyathostominae-spezifischen
IgE-Spiegels nachgewiesen werden (Abbildung 46).
Möglicherweise hat also der Anstieg des Gesamt-IgE-Titers im Herbst einen Einfluss auf die
eine Reduktion der Sensibilisierungsgrade der basophilen Granulocyten. Ein Anstieg im
Sommer hat keinen reduzierenden Effekt (#8, Tabelle 16 und Abbildung 48).
Diskussion 124
5 Diskussion
Der Mechanismus der Typ-I-Hypersensitivitätsreaktion tritt in zwei Formen auf: als
physiologisch reguliertes Mittel zur Bekämpfung von Parasiten und als pathologisch der
Kontrolle entglittene allergische Erkrankung. Dabei kommen beide Formen oftmals innerhalb
desselben Organismus vor. Vorhergehende Untersuchungen (LYNCH ET AL., 1993b, HAGEL ET
AL., 1993a, STEIN, 1999) ergaben eine mögliche gegenseitige Beeinflussung, die in dieser
Arbeit näher erforscht werden sollte. Dazu standen Islandpferde zur Verfügung, von denen
ein Teil unter den Symptomen des sog. „Sommerekzems“ litt, einer Typ-I-Allergie auf
Bestandteile blutsaugender Insekten, insbesondere Culicoides nubeculosus. Ihr
Sensibilisierungsstatus gegen verschiedene Insekten war durch einen Funktionellen in-vitro-
Test (FIT) bekannt und über einen längeren Zeitraum bereits dokumentiert (GEIBEN, 2003).
Da die Tiere in einer Herde in Weidehaltung gehalten wurden, war eine Belastung der Pferde
mit Helminthen gegeben. Mit dieser Ausgangslage sollten Zusammenhänge der gegenseitigen
Beeinflussung der Helminthen und der Sensibilisierung gegen die Auslöser des
Sommerekzems untersucht werden.
5.1 Zur paradoxen Reaktion der Pferde im Rahmen der Immunisierung mit den
rekombinanten Parasitenproteinen TcA und TcB
Durch Zusammenarbeit mit einer an Schafnematoden forschenden Gruppe (3.3.4) standen
zwei rekombinante Proteine aus Trichostrongylus colubriformis zur Verfügung („TcA“ und
„TcB“). Vorausgehende Tests hatten gezeigt, dass einige der Isländer im FIT auf diese
Proteine reagierten, sie also bereits Kontakt mit diesen oder kreuzreagierenden Proteinen
hatten, ohne darauf klinische Symptome einer „Wurmallergie“ zu zeigen. Da aus anderen
Arbeiten der basophileneliminierende Effekt von Glucocorticoiden bekannt war (TIZARD,
2004, BRUENNLEIN, 2001), sollten die Pferde gegen TcA und TcB immunisiert werden,
dadurch deren spezifischer Antikörperspiegel angehoben, durch Methylprednisolon die bereits
sensibilisierte Basophilenpopulation eliminiert und durch neue, naive Basophile ersetzt
werden. Die neuen Basophilen sollten dann durch ein verändertes Spektrum der Antikörper
auf der Oberfläche ein neues, möglicherweise anti-TcA- und anti-TcB-geprägtes
Sensibilisierungsmuster erhalten.
Die Pferde reagierten – im Gegensatz zu den beiden ersten Tieren, an denen die
Unschädlichkeit der Immunsisierung überprüft werden sollte – völlig unerwartet auf die
intramuskuläre Injektion der rekombinanten Proteine. Eine Hypermotorik des Darmes,
Diskussion 125
hämorrhagische Durchfälle und sekundäre Kreislaufschocks waren deutliche Hinweise auf
eine am Darm lokalisierte, dort generalisierte Mastzelldegranulation im Rahmen einer
überschießenden Typ-I-Reaktion. Durch die freigesetzten Mediatoren wurden eine verstärkte
Darmmotilität, ein Flüssigkeitsefflux aus den Darmkapillaren und weiterhin eine
hämorrhagische Diathese aus diesen Gefäßen verursacht. Das ausgedehnte Reaktionsgebiet
führte zu einem massiven Flüssigkeitsabzug aus dem Blutgefäßsystem und so zu sekundären
Schocksymptomen. Das Ergebnis der Sektion eines Pferdes (#5), das die Immunisierung trotz
Intensivtherapie nicht überlebte, unterstreicht dies. Das sehr schnelle Einsetzen der
Symptomatik (ab 10 min.) bei zwei der Pferde (#18 und #5) kann möglicherweise auf eine
Verletzung winziger Blutgefäße bei der intramuskulären Injektion zurückzuführen sein, so
dass die Immunisierungsproteine vergleichsweise schnell in den Kreislauf und damit zum
Darm gelangten. Bei einem Großteil der anderen behandelten Tiere erfolgte die Reaktion erst
bedeutend später (z. B. #20, ebenfalls mit schwerer Symptomatik, aber erst ca. sechs Stunden
p. med. beginnend).
Die Schwere der Antwort auf die vergleichsweise geringe Proteinmenge von je 100 µg TcA
und TcB pro Tier lässt sich eventuell mit einem im FIT beobachteten Phänomen begründen.
In diesem Test konnte bei vier von acht überlebenden und fünf von zwölf Kontrollpferden
eine Histaminfreisetzung in hohen TcB-Konzentrationen nicht induziert werden, dafür jedoch
mit steigender Verdünnung umso höhere Freisetzungen. Dabei konnten noch in
Konzentrationen von 4x10-4 oder sogar 4x10-5 µg/ml (dies entspricht 0,4 bzw. 0,04 ng/ml)
sehr hohe Freisetzungsraten erreicht werden (siehe auch 4.1.2.2). Setzte man ein
angenommenes Pferdegewicht von 350 bis 400 kg mit einer entsprechenden Menge Wasser
gleich, in der sich 100 µg TcB verteilten, entspräche dies in etwa der Größenordnung der
Konzentration, in der im FIT die stärksten Histaminfreisetzungen zu beobachten waren. So
könnten auch die geringen Mengen des Proteins noch eine dramatische Reaktion ausgelöst
haben. Es konnten für die mit TcA und TcB immunisierten Pferde (TcA/TcB-Pferde) zwar
keine Ausgangswerte im FIT erhoben werden, jedoch ist u. U. in Annäherung eine Folgerung
aus den unbehandelten Kontrollpferden erlaubt. Vier von neun Pferden zeigten ein schweres
klinisches Bild einer generalisierten Mastzelldegranulation an Colon und Caecum. Denkbar
ist, dass sie im FIT das inverse TcB-Phänomen präsentiert hätten, denn das Verhältnis der
Pferde mit schweren zu denen mit leichteren Symptomen der Unverträglichkeit entsprach dem
der Kontrollgruppe, in der fünf von zehn Tieren im FIT auf TcB invers (nicht oder schwach
auf höhere Antigenkonzentrationen, jedoch sehr stark auf niedrigere Antigenmengen)
Diskussion 126
reagierten. Vorstellbar ist daher eine Kreuzreaktion, da TcA und TcB hohe Homologien zu
Proteinen aus anderen Nematoden aufweisen (SHAW ET AL., 2003). Das Verschwinden des
inversen Phänomens bei TcB im FIT im Laufe des Sommers (4.3) lässt vermuten, dass ein
Immunisierungsversuch einige Monate später ohne klinische Symptomatik oder doch
bedeutend milder abgelaufen wäre, sollten die Typ-I-Reaktionen der Pferde auf TcB-
induzierte Mastzelldegranulationen zurückzuführen sein.
Ähnlich heftige Reaktionen auf injiziertes Parasitenantigen beschrieben JACOBSEN ET AL.
(1995), allerdings injizierten sie natürlich infizierten Schweinen einen Extrakt aus Ascaris
suum, keine definierten Proteine eines Parasiten. Mit rekombinanten Helminthenproteinen
sind erfolgreich Vakzinierungen an Tieren gelungen (z. B. TIZARD, 2004).
5.2 Zur Modulation der Sensibilisierung der basophilen Granulocyten durch
anthelminthische Behandlung der Pferde
Um die Pferde nicht in einem erneuten Immunisierungsversuch zu gefährden, sollte statt einer
Immunisierung gegen rekombinante Antigene eine anthelminthischen Behandlung der
teilweise stark mit Nematoden belasteten Tiere durchgeführt werden, um den
parasitenspezifischen Antikörpertiter noch weiter anzuheben. Die basophilen Granulocyten
sollten dann eine Woche später durch Methylprednisolon eliminiert und die aktuell
angepassten Sensibilisierungsspektren funktionell im FIT untersucht werden.
Bezüglich der antigen-, allergen- und antikörpervermittelten Histaminfreisetzungen konnte
festgestellt werden, dass bei fast allen Tieren die Sensibilisierungen deutlich zurückgegangen
war. Teilweise konnten sogar negative Releaseergebnisse beobachtet werden. Dabei ließen
sich anhand der Stärke des Reaktionsrückganges vier Gruppen unterscheiden, nämlich jeweils
stark und schwach verwurmte Tiere bei Ekzemern und Nichtekzemern. Die verminderte
Reaktionsfähigkeit muss keineswegs durch einen plötzlichen Verlust an sensibilisierenden
Antikörpern auf der Basophilenoberfläche (Hypo- oder Desensibilisierung) bedingt sein. Eine
Erklärung dieser Beobachtung ergibt sich aus der Aktivierung eines möglichen
Schutzmechanismus, der bei sehr hoher Antigenanflutung aktiv werden muss, um eine
überschießende Reaktion des Organismus auf die an Mastzellen und Basophilen
bindungsfähigen Parasitenantigene zu vermeiden. SATTI ET AL. (2004) und BERHE ET AL.
(1999) beschreiben Symptome solcher überschießender, nicht ausreichend kompensierter
Typ-I-Mechanismen bei Kindern, z. B. Urticaria, Ödeme oder Übelkeit.
Eine Möglichkeit der Hemmung der Typ-I-Reaktion besteht in der gleichzeitigen
Diskussion 127
Kreuzvernetzung eines an einen aktivierenden Fcε-Rezeptor I (FcεRI) gebundenen IgE-
Moleküls und eines IgG-Immunglobulins, das an einen inhibierenden Rezeptor mit der
Bezeichnung Fcγ-Rezeptor IIb (FcγRIIb) gebunden hat. Fcγ-Rezeptoren (FcγRI, FcγRII,
FcγRIII) sind Zelloberflächenmoleküle, die den aktivierten Fc-Teil von Immunglobulinen des
Isotyps G binden. Sie binden hauptsächlich immunkomplexiertes IgG, aber auch monomeres
IgG (FcγRI), und werden u.a. von Phagocyten, B-Zellen, NK-Zellen oder auch Mastzellen
und Basophilen exprimiert. DAERON ET AL. (1995) konnten bei Nagern nachweisen, dass eine
Coligation von FcεRI und FcγRIIb eine Degranulation von Mastzellen verhindern kann, auch
wenn sie über eine Kreuzvernetzung von FcεRI-ständigen Immunglobulinen induziert wird.
Dabei ist die Summe aus aktivierenden oder hemmenden Signalen entscheidend für die
Reaktion der Zelle. Außerdem kann nicht nur IgG an den niederaffinen FcγRIIb binden,
sondern auch IgE (UJIKE ET AL., 1999). Mäuse, die diesen inhibierenden Rezeptor nicht
besitzen, sind von Hypothermie und Tod im Rahmen einer IgG- und IgE-vermittelten
systemischen anaphylaktischen Reaktion schwerer betroffen als Tiere mit diesem Rezeptor
(TAKAI ET AL., 1996, UJIKE ET AL., 1999). Dieser Effekt der FcγRIIb-Defizienz bei IgE-
vermittelten Reaktionen spiegelt nach TAKIZAWA ET AL. (1992) die Fähigkeit von IgE wider,
auch in Immunkomplexen an FcγRIIb binden zu können. AGGARWAL und HOLMES (2000)
entdeckten Hinweise darauf, dass das Fcγ-Rezeptorensystem auch beim Pferd vorkommt.
Vor diesem Hintergrund ist es denkbar, dass die große Menge an therapiebedingt
freigesetztem Parasitenantigen nicht nur über parasitenspezifisches IgE oder IgG auf
aktivierenden Rezeptoren (FcεRI, FcγRI, FcγRIIa und III) gebunden wurde, sondern auch
über hemmende Rezeptoren wie den FcγRIIb. Es resultierte eine verminderte Aktivierbarkeit
oder gar „Stilllegung“ der basophilen Granulocyten und damit eine verminderte
Freisetzbarkeit von Histamin durch Stimuli in Form von Antikörpern (gαh(IgG), anti-IgE)
oder Allergenen bzw. Antigenen (z. B. Cn, TcA). Aus diesem Denkmodell ist eventuell auch
eine Begründung der Gruppenbildung in stark und schwach verwurmte Tiere bzw. in
Allergiker und klinische Nichtallergiker abzuleiten. Die Histaminfreisetzung über anti-IgG
(gαh, Abbildung 24) zeigte sieben Tage nach anthelmitischer Behandlung eine deutliche
Hemmung bei den stark verwurmten Ekzemern, die bei den stark belasteten Nichtallergikern
weniger stark ausgeprägt war. Schwach verwurmte Allergiker und gesunde Tiere
unterschieden sich in der vergleichsweise mäßigen Reduktion nicht. Bei den Tieren mit
geringer Eiausscheidung könnte die Immunkomplexbindung über hemmende Rezeptoren
aufgrund der geringeren Antigenmenge weniger stark ausgeprägt gewesen sein, so dass nach
Diskussion 128
Stimulation mit anti-IgG (gαh) die Aktivierungssignale über FcγRI und III gegenüber den
hemmenden überwogen und die Zellen nachweisbar degranulierten. Bei den stark verwurmten
Allergikern lag möglicherweise eine resultierende Hemmung durch eine hohe Anzahl von
gebundenen Komplexen über FcεRI und FcγRIIb vor, hier könnten der Einfluss der
aktivierenden Fcγ-Rezeptoren (aus dem allergischen Status bedingt) zugunsten der Fcε-
Rezeptoren verschoben gewesen sein, so dass eine Stimulation durch anti-IgG nicht erfolgen
konnte. Dafür spricht auch die höhere IgG-vermittelte Freisetzung bei den stark verwurmten
Nichtallergikern. Die Summe der aktivierenden Fc-Rezeptoren überwiegt eine Hemmung
durch Immunkomplexe (z. B. aufgrund einer niedrigeren Anzahl an FcγRIIb).
Betrachtet man die Veränderung des anti-IgE-vermittelten Release (Abbildung 25), so
bemerkt man eine bei verwurmten Ekzemern und Nichtekzemern gleichermaßen aufgetretene
Hemmung der Histaminfreisetzung. Die schwach verwurmten Ekzemer waren auf ein Drittel
der Ausgangsfreisetzungen bei unverändertem oder gesteigertem Gesamthistamingehalt
reduziert, während die kaum belasteten, nicht allergischen Pferde in ihrer Histaminfreisetzung
nur wenig vermindert waren. Auch hier kann das Modell der FcγRIIb-vermittelten Hemmung
angewandt werden. Die zahlreichen, über IgE komplexierten und an FcγRIIB gebundenen
Antigenkomplexe unterdrückten eine Aktivierung der Zelle bei den Tieren mit hoher
Eiausscheidungsrate, die eine dementsprechend hohe Antigenanflutung hatten. Bei den
schwach verwurmten Nichtallergikern war die Hemmung aufgrund der geringeren Anzahl der
gebundenen Komplexe nur schwach ausgeprägt, bei den Allergikern mit niedrigen Eizahlen
schien die Hemmung der an Fcγ-RIIb gebundenen Komplexe möglicherweise wegen einer
erhöhten Anzahl dieser Rezeptoren ausgeprägter zu sein. Nach TRIDANDAPANI ET AL. (2002)
werden Fcγ-Rezeptoren IIb durch IL-4, wie es auch in einer allergischen Situation vermehrt
vorkommt, heraufreguliert. In diesem Zusammenhang jedoch widersprach das Vorhandensein
einer erhöhten Anzahl von hemmenden Rezeptoren bei Allergikern dem klinischen Bild.
DOLEN (2003) weist in diesem Zusammenhang darauf hin, dass die bedeutenden Unterschiede
zwischen allergen- und antigenspezifischem IgE dazu führen, dass Allergiker möglicherweise
vergleichsweise mehr IgE an der Oberfläche ihrer Basophilen binden können. Im Falle der
Antigenanflutung nach Entwurmung könnten auch mehr IgE-Immunkomplexe gebunden
werden, die gegenüber nichtallergischen Tieren zu einer vermehrten Hemmung über Fcγ-
RIIb-Bindung führen, so dass eine Reduktion in der Stärke zwischen stark verwurmten
Pferden und nichtallergischen Schwachbelasteten entsteht.
Die Tatsachen, dass die Stärke der Freisetzungsminderung mit dem vorhergehenden
Diskussion 129
Eiausscheidungsstatus in Zusammenhang stand, und dass bei einem mit den gleichen
Anthelmintika behandelten Kontrollpferd überhaupt keine Veränderung in der Reagibilität
gegen anti-IgE oder anti-IgG (gαh) zu beobachten war, sprechen dafür, dass es sich bei den
festgestellten Effekten nicht um eine (Neben-)Wirkung der Medikamente, sondern um eine
Reaktion auf die Antigenfreisetzung durch die absterbenden Helminthen handelte. Dies
bestätigen auch SATTI ET AL. (2004) nach ähnlichen Beobachtungen beim Menschen.
Das Konzept der hemmenden Fcγ-Rezeptoren trägt auch zu einer Erklärung des inversen
Releasephänomens im Falle des TcB bei, bei dem in hohen Proteinkonzentrationen nur ein
schwacher bis gar kein, in steigenden Verdünnungen ein zunehmender Histaminrelease im
FIT zu sehen war. Eine Hemmung der Degranulation der Basophilen ist bei hohen
Konzentrationen durch Bindung des Proteins an relativ viele FcγRIIb-ständige, TcB-
spezifische oder kreuzreagierende Antikörper denkbar. Bei zunehmender Ausverdünnung
wird die Zahl der angesprochenen FcγRIIb-Rezeptoren innerhalb der Basophilenpopulation
geringer, der Einfluss der aktivierenden Rezeptoren überwiegt gegenüber den hemmenden,
und die Zahl der degranulierenden Effektorzellen und damit die Menge des ausgeschütteten
Histamins steigt. Nach Unterschreiten der optimalen Konzentration nimmt die
Freisetzungsrate wieder ab.
Das Verhalten der Basophilen des Pferdes #22, evtl. auch der Pferde #27 und #33, deren
allergenspezifische Sensibilisierungen sich nach der anthelminthischen Behandlung
kurzfristig oder dauerhaft verstärkten, lassen unter Umständen Rückschlüsse auf die Berichte
von Pferdebesitzern zu, die von neu auftretenden allergischen Erkrankungen nach
anthelminthischer Behandlung berichten. Zwar bedeutet die induzierte Sensibilisierung nicht,
dass das Tier an der allergischen Dermatitis erkrankt (KOBELT, 2001, GEIBEN, 2003),
allerdings kann eine Sensibilisierung die entscheidende Grundlage für eine Erkrankung
darstellen. Warum diese Pferde so anders als die anderen reagierten, ist nicht klar schlüssig.
Möglicherweise trat hier beim Pferd mit Induktion von Sensibilisierungen nach
anthelminthischer Behandlung ein Mechanismus in Erscheinung, von dem HAGEL ET AL.
(1993a), STEIN (1999) und LYNCH ET AL. (1997) bereits beim Menschen berichteten (2.7).
YAMAGUCHI ET AL. (1996) beschreiben auf Stimulation mit anti-IgE histaminfreisetzende und
nichthistaminfreisetzende Basophile (releasing und nonreleasing basophils) für den
Menschen. Durch Kultivierung dieser Zellen über drei bis sieben Tage mit IL-3 konnten
ursprünglich nichtfreisetzende Basophile in freisetzende moduliert werden. Eventuell
unterlagen die drei Pferde im Zuge der Entwurmung einem starken IL-3-Einfluss und so die
Diskussion 130
Basophilenpopulation einer (in zwei Fällen kurzfristigen) Umwandlung von ursprünglich
wenig reagiblen zu stärker reagiblen Zellen. Dazu könnten die Beobachtungen von LANTZ ET
AL. (1998) passen, die eine unterstützende Funktion von IL-3 in der erfolgreichen
Bekämpfung von Nematoden durch Förderung von basophilen Granulocyten beschrieben.
5.3 Zur Modulation der Sensibilisierung der basophilen Granulocyten durch
Methylprednisolon
Zu drei verschiedenen Zeitpunkten wurde den Pferden Methylprednisolon injiziert,
therapeutisch nach der Immunisierung mit den rekombinanten Proteinen TcA und TcB, zur
Modulation der Basophilen nach anthelminthischer Behandlung und zur Überprüfung des
reinen Cortisoneffektes ohne vorhergehenden Einfluss durch Immunisierung oder
Entwurmung. Jedes Mal konnte die Eliminierung der basophilen Granulocyten innerhalb von
sechs bis zwölf Stunden nachgewiesen werden (4.1.2.1, 4.4.4). Die Sensibilisierungen
unterschieden sich in allen drei Ansätzen von den Ausgangswerten.
Bei den Pferden der Kontrollgruppe II des Modulationsversuches durch anthelminthische
Behandlung (3.4.1.2, 4.4.5), die zur Überprüfung des Einflusses der Methylprednisolon-
injektion ohne vorhergehende Entwurmung das Corticosteroid erhalten hatte, wiesen die
basophilen Granulocyten zwei Wochen nach der Applikation eine erhöhte Reagibilität gegen
die eingesetzten Stimulantien (Ak, Ag, Allergene) auf, die nach den hemmenden Einflüssen
der anthelminthischen Behandlung nicht mehr vorhanden waren. Die vermehrte Sensibilität
kann sich unter Umständen aus einer Studie von YAMAGUCHI ET AL. (2001) ableiten lassen.
Die Gegenwart von Dexamethason und Methylprednisolon senkte die Anzahl der
oberflächenständigen Fcε-Rezeptoren I bei Mastzellen in vitro, auch in der Gegenwart von
IgE, das normalerweise die Expression von FcεRI fördert. Eine antigenvermittelte
Degranulation wurde deutlich vermindert oder verhindert. Nach Absetzen der Corticosteroide
lag bei Gegenwart von IgE ein Missverhältnis zwischen FcεRI und IgE vor, so dass die
Rezeptorexpression in einem Reboundphänomen hochgefahren wurde. Eine gesteigerte
Rezeptorexpression konnte möglicherweise im Falle der Kontrollgruppe II zu einer
gesteigerten Sensibilisierung durch vermehrt gebundene sensibilisierende IgE führen.
Dieser Reboundeffekt blieb bei der Versuchsgruppe I, die eine Woche nach der Entwurmung
Methylprednisolon bekam, aus. Dies kann zwei Ursachen haben. Einerseits ist denkbar, dass
die neue Sensibilisierung der Basophilen bei Ausverdünnung der allergenspezifischen
Antikörper in einem Rahmen erfolgreich war, in dem der Effekt des Rebound abgefangen
Diskussion 131
wurde (die vermehrten aktivierenden Rezeptoren wurden auch mit Ak gegen Parasiten
beladen). Fast ausnahmslos wurde das Sensibilisierungsniveau gegen diverse Allergene nicht
erhöht, sondern sank noch ab. Da keine Daten über die folgenden Wochen vorliegen, konnte
die Dauer dieser Erscheinung nicht erfasst und so darüber keine Aussage getroffen werden.
Eine zweite Interpretationsmöglichkeit besteht darin, dass die durch die freigesetzten
Parasitenantigene aktivierten Hemmmechanismen zum Schutz des Organismus ausreichten,
um die zum Rebound führenden Reaktionen zu unterbinden. JABARA ET AL. (1993)
beschreiben einen sequentiellen Isotypenklassenwechsel unter dem Einfluss von
Hydrocortison bei mit Il-4 behandelten B-Zellen. Diese Zellen veränderten ihre
Immunglobulinproduktion von IgM über IgG4 zu IgE. IgG4 wird als bedeutend in der
Modulation von Typ-I-Reaktionen auch im Sinne einer Hyposensibilisierung angesehen
(STERN ET AL., 2004, PLATT-MILLS ET AL., 2004). Möglicherweise hat die anthelminthische
Behandlung und die vergleichsweise hohe Menge parasitären Antigens zu einer kurzfristigen,
deutlichen IL-4-Steigerung geführt, so dass entsprechend beeinflusste B-Zellen unter dem
folgenden Methylprednisolon einen modulatorischen Klassenwechsel vollzogen und die
folgende verminderte Reagibilität sich auch auf die Allergene erstreckte. Eine Veränderung
des strongylidenspezifischen IgG4-Titers konnte im ELISA nicht nachgewiesen werden.
Die therapeutisch mit Methylprednisolon behandelten TcA-/TcB-Pferde (4.1.1) zeigten
ebenfalls kein Reboundphänomen, sondern eine deutlich verminderte oder ausbleibende
Reaktion auf Allergene bei erhaltender Reagibilität gegen anti-IgG (gαh), anti-IgE und
individuell TcA und TcB. Bedacht werden muss jedoch, dass diese Daten nicht vierzehn
Tage, wie in den anderen Fällen, sondern sieben Tage nach der Cortisonapplikation erhoben
wurden. Falls zu diesem Zeitpunkt die von YAMAGUCHI ET AL. (2001) beschriebene
Hemmung der FcεRI-Expression noch wirksam war, so könnte die TcA- und TcB- vermittelte
Degranulation auf eine Bindung über aktivierende Fcγ-Rezeptoren erfolgt sein.
Auch wenn die in den Modulationsversuchen erhobenen Daten in den ersten drei Wochen auf
eine erfolgreiche Modulation der Basophilen im Sinne einer reduzierten
Allergensensibilisierung schließen ließen (4.1.2.2, 4.4.4), so zeigten doch die
Langzeituntersuchungen (und im Falle der Immunisierung mit TcA und TcB die
Untersuchung der Kontrollpferde, 4.3), dass die veränderte Reagibilität nicht auf Dauer
erhalten werden konnte. Bezüglich der mindestens zwei Wochen lang reduzierten
Sensibilisierungsgrade bei den zuerst entwurmten und dann mit Methylprednisolon
behandelten Pferden wäre eine Information über die Reagibilität gegen die Cyathostominae-
Diskussion 132
Präparation interessant gewesen (4.5), ob sich im Gegensatz zu den Ausgangswerten die
Sensibilisierung gegen kleine Strongyliden tatsächlich verstärkt hatte und somit wirklich von
einem verschobenen Sensibilisierungsspektrum zu sprechen war.
Sowohl das Ausschleichen der TcA-/TcB-spezifischen als auch die schnelle Rückkehr der
allergenspezifischen Sensibilisierung kann auf den natürlichen Austausch von Basophilen
oder auf einen Wechsel im Antikörperspektrum auf der Oberfläche der Effektorzellen
zurückzuführen sein. Die Bindung zwischen IgE und Fcε-Rezeptor I ist zwar aufgrund der
hohen Affinität sehr hoch, MCDONNELL ET AL. (2001) beschrieben aber eine Halbwertszeit
von ca. zwei Wochen für über FcεRI gebundene Immunglobuline. Die mittlere In-vitro-
Überlebenszeit der Basophilen wird je nach Autor zwischen zwei Wochen (YAMAGUCHI ET
AL., 1992) und mehr als neunzig Tagen (FAVRE ET AL., 1990) angegeben, über In-vivo-
Verhältnisse liegen keine Daten vor. Dass auch im Winter trotz Allergenkarenz ausreichend
sensibilisierende allergenspezifische Antikörper vorhanden sind, zeigen die in 4.1.2.2 und 4.4
gewonnen Daten. Auch KOBELT (2001) berichtet in diesem Zusammenhang von an
Sommerekzem erkrankten Pferden, die auch nach fünfzehn Jahren Allergenkarenz noch
deutliche Sensibilisierungen der basophilen Granulocyten aufwiesen.
Die Tatsache, dass von den acht überlebenden Pferden sechs bis in das Jahr 2004 hinein nur
geringe Eimengen ausschieden, mag mit der Beobachtung von SHAW ET AL. (2003)
übereinstimmen, die eine erhöhte Resistenz von Schafen gegen Trichostrongylus
colubriformis feststellten, wenn diese vermehrt spezifisches IgE gegen TcA aufwiesen (dabei
zeigten sie keinerlei Anzeichen einer Typ-I-Reaktion gegen diesen Parasiten) (siehe auch 5.4).
Bezogen auf die Releasedaten der unbehandelten Kontrollpferde konnte kein Zusammenhang
zwischen Eiausscheidung und Sensibilisierung gegen TcA oder TcB gefunden werden.
5.4 Zum Isotypen-ELISA
In der Literatur sind zumeist nur Untersuchungen zu IgG(T) (inzwischen IgG3 und IgG5,
WEGE, 2004) bezüglich der Antikörperantwort gegen Helminthen zu finden (z. B. PATTON ET
AL., 1978, WEILAND ET AL., 1991, DOWDALL ET AL., 2002, 2004, PROUDMAN ET AL., 1996,
1997, siehe auch 2.7). In dieser Arbeit wurden ELISA-Systeme für den Nachweis der equinen
Isotypen IgG1, IgG2, IgG4, IgG5, IgA und IgE etabliert. Mit ihnen wurden Seren
ausgewählter Versuchspferde auf Antikörperantworten gegen die rekombinanten Proteine
TcA, TcB und einen Extrakt aus Cyathostominae spp. sowie auf ihren Gesamt-IgE-Gehalt im
Diskussion 133
ELISA untersucht.
Im Gesamt-IgE-ELISA konnte festgestellt werden, dass Pferde mit einer hohen
Eiausscheidungsrate (4.3) einen deutlich höheren Titer hatten als schwach verwurmte Pferde.
Es war kein Zusammenhang zwischen dem Status als klinischer Allergiker oder als
nichtallergisches Pferd erkennbar. Damit widersprechen die Daten für das Pferd der gängigen
Meinung in der Humanmedizin, dass Allergiker höhere IgE-Spiegel haben (JANEWAY ET AL.,
2002), auch wenn bekannt ist, dass mit Endoparasiten belastete Individuen ähnlich hohe Titer
haben wie Allergiker (SATTI ET AL., 2004). LYNCH ET AL. (1993a) und NIELSEN ET AL. (1994)
konnten jedoch bestätigen, dass das Verhältnis zwischen parasitenspezifischem und Gesamt-
IgE Einfluss auf die individuelle Fähigkeit zur Bekämpfung der Helminthenlast hat. Es
konnte ein enges Verhältnis zwischen IgE gegen kleine Strongyliden und dem Gesamttiter bei
schwach verwurmten Pferden beobachtet werden, dagegen ein weiteres bei den stark
verwurmten Pferden. Eine Beziehung zwischen verminderter Parasitenlast und allergischer
Erkrankung, wie sie LYNCH ET AL. (1998) beschrieben, konnte hier nicht erkannt werden.
KOBELT (2001) und GEIBEN (2003) vermuteten, dass es sich bei der auch in dieser Arbeit
festgestellten Verminderung der allergenspezifischen Sensibilisierungen im Herbst
möglicherweise um eine Ausverdünnung der sensibilisierenden Antikörper auf den
Basophilen durch andere, ebenfalls parasitenspezifische Antikörper handelt (oder eine
entsprechende langsame Änderung der Basophilenpopulation), die im Laufe des Sommers
aufgrund der steigenden Nematodenbürde induziert werden. Eine Erhöhung des Titers gegen
kleine Strongyliden konnte bei keinem Isotyp selektiv beobachtet werden, jedoch zeigte sich
bei fünf von elf Pferden eine Erhöhung des Gesamt-IgE-Spiegels. Dieselben fünf Pferde
präsentierten im FIT eine Reduktion der allergenspezifischen Sensibilisierungen, wogegen
Pferde mit unveränderten IgE-Spiegeln keine Verminderung der Reagibilität zeigten (Tabelle
16). Ein Zusammenhang, wie ihn KOBELT (2001) und GEIBEN (2003) vermuteten, ist somit
möglich.
Die IgG1-Spiegel gegen Cyathostominae spp. als Vertreter der Parasitenantigene verhielt sich
hier in vier von sechs Fällen umgekehrt als in der Literatur beschrieben (z. B. MANJILI ET AL.,
1998, GILL ET AL., 1993). Statt hohe spezifische Titer bei einer geringen Wurmbürde
aufzuweisen und niedrige bei einer starken Verwurmung, konnten für jeweils zwei der drei
viel oder wenig Eier ausscheidenden Pferde tendenziell das gegenteilige Verhalten beobachtet
werden. Allerdings ist es eher unwahrscheinlich, dass beim Pferd die mit IgG1, IgG2 etc.
bezeichneten Isotypen auch gleiche Funktionen aufweisen, wie die Isotypen gleicher
Diskussion 134
Bezeichnung bei anderen Spezies (WEGE, 2004). Für das IgG5, das bei den beschriebenen
Untersuchungen auf IgG(T) (eigentlich IgG3 und IgG5) untersucht wurde, konnten die Daten
von PROUDMAN ET AL. (1997) bestätigt werden. Bei fünf von sechs Pferden sank der Titer
nach einer anthelminthischen Behandlung und war bei vier von sechs zum Zeitpunkt der
stärksten Verwurmung erhöht. Die Entwicklung eines vorher nicht nachweisbaren IgG5-
Titers bei einem im Untersuchungszeitraum drei bis dreieinhalbjährigen Pferd widerspricht
den Bobachtungen von WEILAND ET AL. (1991), die bereits bei Fohlen einen IgG(T)-Titer
gegen kleine Strongyliden feststellten. Möglicherweise hat diese Gruppe IgG3 in diesem
Zusammenhang nachgewiesen, das hier nicht mit untersucht wurde.
Für das rekombinante Protein TcA konnten bei allen immunisierten Pferden zwei Wochen
nach der Immunisierung Antikörper aller Isotypen mit Ausnahme des IgE nachgewiesen
werden. Ein TcA-/TcB-Pferd und ein unbehandeltes Kontrollpferd hatten auch ohne
Immunisierung einen natürlich induzierten Titer. Möglicherweise war auch IgE-anti-TcA
nach der Immunisierung vorhanden, aber konnte im ELISA aufgrund einer Verdrängung
durch andere, in höheren Konzentrationen vorliegende TcA-spezifische Antikörpern nicht
nachgewiesen werden. Auffällig ist das sehr schnelle Abfallen der Titer bei den mit
Methylprednisolon behandelten TcA-/TcB-Pferden, bei der diesbezüglich unbehandelten #32
hielten sich die Titer länger. Vielleicht fand dies seine Ursache in einer durch das Cortison
verminderten Antikörperinduktion (UCHAKIN ET AL., 2002).
Die Verminderung der TcA-spezifischen Sensibilisierungen im FIT ist nur unwahrscheinlich
durch den Titerabfall bedingt, denn es konnten Sensibilisierungen auch ohne nachweisbaren
Titer induziert werden (Tabelle 15), sondern vermutlich durch eine langsam erfolgende
Ausverdünnung und Ersetzung durch Antikörper anderer Spezifitäten. Die Sensibilisierungen
und ihre Stärke sind also nicht abhängig vom Antikörpertiter im Serum. Dies wird auch durch
das rekombinante Protein TcB unterstrichen, für das in keinem Fall Antikörper nachgewiesen
werden konnten, gegen das aber eine teilweise sehr hohe Sensibilisierung vorhanden war.
Dass diese Aktivierung der basophilen Granulocyten unspezifisch erfolgte, kann dadurch
ausgeschlossen werden, dass nur ein Teil der Pferde in einem bestimmten
Konzentrationsbereich reagierte. Die Rückkehr der Reagibilitäten auf beide Antigene könnte
in einem steigenden Infektionsdruck oder Verwurmungsgrad begründet sein, was sich jedoch
nicht im Antikörpertiter widerspiegelt. Das Verschwinden der inversen Reaktion und die
Wiederkehr als „normale“ Reaktion der Basophilen auf die TcB-Verdünnungen hatte
Diskussion 135
eventuell im Titer oder in der Affinität zu bestimmten Rezeptoren seine Ursache. Wurden
zunächst viele hemmende Fc-Rezeptoren durch hohe Mengen TcB angesprochen (waren also
viele Antikörper an inhibierende Rezeptoren gebunden), die mit zunehmender Verdünnung
gegenüber den aktivierenden an Einfluss verloren, so wurden nach der Rückkehr der
Reagibilität möglicherweise nur in geringer Zahl vorliegende TcB-erkennende
Immunglobuline hauptsächlich an aktivierende Rezeptoren gebunden.
Der protektive Effekt, den SHAW ET AL. (2003) für erhöhte TcA-spezifische IgE-Titer bei
Schafen gegen Trichostrongylus colubriformis feststellen konnten (dabei zeigten die Tiere
keinerlei Anzeichen einer Typ-I-Reaktion gegen diesen Parasiten), konnte bezogen auf die
Eiausscheidungsrate und TcA-Titer aller Isotypen nicht bestätigt werden.
Zusammenfassung 136
6 Zusammenfassung
Untersuchungen zum Einfluss von parasitären Antigenen auf die Typ-I-Allergie beim
Sommerekzem des Pferdes
Julia E. Heselhaus
Die Typ-I-Reaktion beschreibt physiologische Alarm- und Immunregulationsmechanismen,
die auch bei der Kontrolle von Endoparasiten eine hervorragende Rolle spielen. Im Falle einer
Typ-I-allergischen Erkrankung scheinen diese Schutzmechanismus der physiologischen
Kontrolle entglitten zu sein. Dabei können beide Formen, die physiologisch-schützende und
die pathologische, parallel innerhalb desselben Individuums auftreten und sich
möglicherweise gegenseitig beeinflussen. So ist bekannt, dass allergische Erkrankungen beim
Menschen in Ländern mit endemischen Helminthosen bedeutend seltener vorkommen als in
den Industrieländern. In Weidehaltung gehaltene Pferde in Deutschland sind nahezu immer
mit Helminthen infiziert, und bei einem Teil dieser Tiere tritt u. a. das sog. Sommerekzem
auf, eine Typ-I-Allergie auf Speichelbestandteile verschiedener blutsaugender Insekten,
insbesondere Culicoides nubeculosus. In dieser Arbeit sollte mittels eines Funktionellen In-
vitro-Testes (FIT) anhand der Histaminfreisetzung untersucht werden, ob parasitäre Antigene
einen modulierenden Einfluss auf die allergen- und parasitenspezifische Sensibilisierung
equiner basophiler Granulocyten haben. Dafür standen neben einer Herde von 27
Islandpferden, davon elf mit klinischen Symptomen des Sommerekzems, zwei verschiedene
rekombinante Proteine aus einem Schafnematoden, Trichostrongylus colubriformis, („TcA“
und „TcB“) zur Verfügung. Vorversuche hatten gezeigt, dass einige Pferde im FIT auf diese
Proteine mit einer Histaminfreisetzung reagieren, ohne Symptome einer „Wurmallergie“ zu
zeigen.
In zwei verschiedenen Modulationsversuchen wurde eine Veränderung der allergen- und
parasiten- bzw- TcA-/TcB- spezifischen Sensibilisierungen der basophilen Granulocyten
angestrebt: durch eine Immunisierung mit den rekombinanten Proteinen TcA und TcB und
durch eine anthelminthische Behandlung der teilweise stark mit Nematoden belasteten Pferde.
Das danach veränderte Antikörperspektrum sollte die Sensibilisierungen von neu gebildeten
Basophilen möglicherweise zugunsten der parasitenspezifischen Sensibilisierungen
verschieben, nachdem zuvor die vorhandenen Basophilen mittels Corticosteroiden
eliminierten worden waren.
Schon die reine anthelminthische Behandlung (mit Moxidectin und Praziquantel) bewirkte
Zusammenfassung 137
zum Untersuchungszeitpunkt sieben Tage nach der Entwurmung eine starke, vom
individuellen Verwurmungsgrad abhängige Hemmung der allergen-, antigen- und
antikörpervermittelten Histaminfreisetzung bei nahezu allen Pferden. Diese Reduktion der
Stimulationsfähigkeit der Basophilen gab anhand der erhobenen Daten Hinweise auf eine
möglicherweise Fcγ-Rezeptor IIb-vermittelte Hemmung der Zellen als
Selbstschutzmechanismus vor einer überschießenden Reaktion auf die hohe
Antigenanflutung. Drei Wochen nach der Entwurmung konnte eine Reduktion der
allergenspezifischen Sensibilisierung nur noch in einigen wenigen Fällen festgestellt werden,
spätestens nach drei Monaten waren alle Tiere wieder auf ihre Ausgangswerte zurückgekehrt.
Drei der Pferde zeigten im Gegensatz zu den anderen sieben Tage nach der anthelminthischen
Behandlung eine verstärkte Sensibilisierung gegen Allergene, die in einem Fall auch über
mindestens drei Monate erhalten blieb.
Wurden die basophilen Granulocyten sieben Tage nach der Entwurmung (also zum Zeitpunkt
der festgestellten Hemmung der Histaminfreisetzungen) mittels einer Corticosteroid-
Behandlung „ausgetauscht“, konnte der allergenspezifische Reduktionseffekt für mindestens
zwei weitere Wochen erhalten werden. Nur eine Sensibilisierung gegen die Parasitenproteine
TcA und TcB war nicht supprimiert. Nach drei Monaten befanden sich die Sensibilisierungen
sowohl gegen die untersuchten Allergene als auch gegen die rekombinanten Parasitenproteine
wieder auf dem Ausgangsniveau vor der anthelminthischen Behandlung. Für einen kurzen
Zeitraum (mindestens zwei Wochen nach der Corticoidinjektion und drei Wochen nach der
Entwurmung) konnte möglicherweise von einem Modulationserfolg im Sinne der
Fragestellung gesprochen werden. Ein Langzeiterfolg konnte aber nicht erzielt werden. Bei
einer Anwendung des Corticoides ohne vorhergehende Parasitenantigenfreisetzung durch die
anthelminthische Behandlung konnte vierzehn Tage nach der Injektion eine deutliche
Steigerung der allergenspezifischen Sensibilisierung beobachtet werden.
Der Versuch, den TcA- und TcB-spezifischen Antikörpertiter durch eine Immunisierung mit
den rekombinanten Proteinen anzuheben und danach die Basophilen zu aktualisieren,
resultierte innerhalb kürzester Zeit (zehn Minuten bis sechs Stunden) in einer an Colon und
Caecum lokalisierten Mastzelldegranulation im Sinne einer überschießenden Typ-I-Reaktion,
zu hämorrhagischem Durchfall und zu einem sekundären hypovolämischen Kreislaufschock.
Die Pferde wurden im Rahmen der Erstversorgung auch mit einem Corticoid behandelt und
so auch hier die Basophilen eliminiert. Sieben Tage später wiesen sie ein ähnliches
Sensibilisierungsmuster auf wie die Pferde, die nach der anthelminthischen Behandlung das
Zusammenfassung 138
Corticoid erhalten hatten: die allergenspezifische Reagibilität war deutlich vermindert oder
hatte sich ganz verloren, die gegen TcA und TcB war vorhanden. Auch hier konnte
möglicherweise ein Erfolg der Modulation angenommen, aber kein Langzeiteffekt beobachtet
werden.
Im entwickelten Isotypen-ELISA gegen TcA, TcB und, als Vertreter der Gesamtheit der
Parasitenantigene, einen Extrakt aus Cyathostominae spp. wurden die Isotypen IgE, IgA,
IgG1, IgG2, IgG4 und IgG5 untersucht. Gegen TcB konnten bei deutlich vorhandener
funktioneller Sensibilisierung der Basophilen für keinen untersuchten Isotyp freie Antikörper
nachgewiesen werden. Gegen TcA waren Antikörper aller untersuchten Isotypen außer IgE
nachweisbar, sowohl bei den immunisierten als auch bei einem Teil der nicht immunisierten
Pferde. Bei einzelnen Pferden war auch ohne den ELISA-Nachweis freier Anti-TcA-
Antikörper eine deutliche TcA-Sensibilisierung der Basophilen zu beobachten. Die
funktionelle antigenspezifische Sensibilisierung der Basophilen war somit unabhängig vom
Nachweis freier Antikörper der untersuchten Isotypen im Serum. Dies legt entweder eine
Beteiligung von Antikörpern der hier nicht untersuchten Isotypen an der Sensibilisierung der
Basophilen nahe oder eine sehr selektive Affinität von Antikörpern, die unterhalb der
Nachweisgrenze des ELISA-Systems liegen, für die aktivierenden Fc-Rezeptoren.
Der strongylidenspezifische IgG1-Spiegel verhielt sich bei vier von sechs untersuchten
Pferden anders als in der Literatur beschrieben. Zwei Pferde mit geringer Eiausscheidung
zeigten niedrige, zwei mit hoher Ausscheidung hohe IgG1-Titer gegen Cyathostominae spp.
Eine Untersuchung des Gesamt-IgE-Spiegels bei elf Pferden ergab für fünf Pferde, dass sie
parallel zum Anstieg des Gesamt-IgE im Herbst eine Reduktion der allergenspezifischen
Sensibilisierung ihrer Basophilen aufwiesen, ein Zusammenhang, den schon andere Autoren
unserer Arbeitsgruppe gezeigt hatten. Andere Tiere, bei denen kein Anstieg festgehalten
werden konnte, zeigten keinen Rückgang der allergenspezifischen Sensibilisierung. Ein
Zusammenhang zwischen der Höhe des Gesamt-IgE-Titers und einer allergischen Erkrankung
wie beim Menschen konnte beim Pferd nicht festgestellt werden. Das auch aus der
Humanmedizin bekannte Absinken des Gesamt-IgE-Spiegels nach einer anthelminthischen
Behandlung zeigte sich aber auch in dieser Studie.
Summary 139
7 Summary
Studies on the influence of parasitic antigens on type I allergy (summer eczema) in
horses.
Julia E. Heselhaus
Type I reaction comprises essential physiological immunomechanisms providing alert
reactions and immunomodulatory influence as known e.g. for the control of intestinal
parasites. In case of type I allergic diseases this mechanism appears to be beyond
physiological control. Both forms of type I reactions, the physiological as well as the
pathological one, can occur in one individual and might influence one another. This may be
one reason why allergic diseases seem to be less frequent in areas with endemic helminthosis
than in industrial countries. Nearly all horses kept on pasture in Germany are infected with
helminths. In spite of that, however, some of them suffer form summer eczema, a type I
allergy against salivary components of various biting insects, one of which is Culicoides
nubeculosus. The aim of this study was to investigate the modulating influence of parasitic
antigens on allergen- and parasite-specific sensitisation of equine basophilic granulocytes in a
functional in-vitro-test (FIT) monitoring the amount of histamine released upon triggering the
basophils in vitro under controlled conditions. Main studies were performed on a herd of 27
Icelandic horses eleven of which had clinical signs of summer eczema. These studies included
two different recombinant proteins of sheep nematode Trichostrongylus colubriformis (called
“TcA” and “TcB”) as several of these horses showed sensitisation of their basophils for these
proteins in the FIT without those horses suffering from “worm allergy”.
Two approaches were taken in order to alter the profile of sensitizing antibodies for allergen
and parasitic antigen resp. TcA and TcB on the basophils: one by immunisation with both
recombinant proteins, and the other one by anthelmintic treatment of horses some of which
were partially heavily infected with nematodes. The aim was to shift the sensitisation pattern
of newly generated basophils away from allergen towards parasite specific antibodies,
particularly after elimination of previous basophils by corticosteroids.
Anthelmintic treatment with moxidetin and praziquantel induced a powerful inhibition of
allergen-, antigen- and antibody-induced histamine release from basophils monitored seven
days after treatment in nearly all horses. The magnitude of reduction depended on the
individual parasitic load. The reduced activity of basophils towards Fc-receptor mediated
triggering suggested a functional suppression via inhibitory Fcγ-receptors IIb. This might
Summary 140
resemble a mechanism of self-protection from overshooting immunoreactions caused by
excessive reactions to the high amount of released parasitic antigen. Three weeks after
anthelmintic treatment only very few horses still presented a reduced specific sensitivity for
single allergens. Latest three months after anthelmintic treatment latest all animals had
returned to their previous levels of reactivity in the FIT. In contrast to the general trend of
reduced reactivity three horses showed even an increased sensitivity to allergens seven days
post anthelmintic treatment. One of them maintained enhanced reactivity at least three
months.
If the basophils were eliminated from peripheral blood by a corticosteroid seven days after
deworming, thus, at the peak time of functional inhibition, the reduced reactivity towards
allergens was prolonged for at least another two weeks, while the triggering by TcA and TcB
was not suppressed. For a short period of time (at least two weeks after injection of corticoid
and three weeks after anthelmintic treatment) a kind of the intended down modulation of
allergen specific reactivity of basophils could be considered. No long term effect, however,
was achieved. Applying a corticosteroid without a preceding release of parasitic antigen by
deworming an increase of sensitisation for allergens was observed two weeks after injection.
An attempt to raise or induce antibody titres in the serum against the recombinant proteins
TcA and TcB by immunisation resulted in a sudden mast cell degranulation in the caecum and
the colon exerting an overshooting type I reaction in seven out of nine horses by means of
haemorrhagic diarrhoea and secondary hypovolaemic shock within ten minutes to six hours
after injection of the proteins. Emergency treatment included application of a corticosteroid,
thus eliminating the basophils. Seven days later the horses showed the same pattern of
sensitisation as those who had received the corticosteroid after anthelmintic treatment. The
basophil reaction towards allergens was reduced or had disappeared, but was fully maintained
for TcA and TcB. Again a kind of the intended modulation was achieved, but had no long
term effect.
Indirekt ELISA systems were developed for quantification of serum antibodies against the
recombinant proteins TcA, TcB and an extract of Cyathostominae spp., representing a high
amount of various nematode antigens. Antibodies were differentiated by the equine isotypes
IgE, IgA, IgG1, IgG2, IgG4 and IgG5 were tested. No free serum antibodies against TcB were
decetable, although basophils were functionally sensitized for TcB. Antibodies of all isotypes
but IgE were found against TcA in all immunized as well as in some control horses. Some of
the horses displayed a distinct functional sensitization of their basophils towards TcA without
Summary 141
any detectable anti-TcA antibodies in the serum. Thus, the sensitization of basophils was
obviously independent from the titre of free antibodies of the monitored isotypes determined
in the ELISA. This might be due to an involvement of not monitored isotypes in sensitization
of basophils or in a high selectivity of not detectable antibodies for the activating Fc-
receptors.
Cyathostominae-specific IgG1 titre of four out of six horses contradicted literature
documented findings in other species: two animals with a low number of faecal nematode
eggs had also low titres, while two others with high numbers of faecal nematode eggs had
also high titres of antibodies reacting with Cyathostominae spp.
Monitoring of total serum IgE in eleven horses revealed that five horses with an increase of
total IgE in autumn showed a decreased reactivity of their basophils towards allergens, a
finding confirming previous reports from other authors of our group. Horses which did not
show an increase of total IgE had no reduction of allergen-specific reactivity of their
basophils. There was no correlation between the total serum IgE and allergic dermatitis in the
investigated horses. The decrease of total IgE after anthelmintic treatment known in humans
could be confirmed in this study.
142
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Danksagung
An erster Stelle danke ich „meinen“ Pferden, klein, aber großartig – auch wenn ihnen mit
Sicherheit ein Apfel lieber wäre als hier erwähnt zu werden. Ohne ihr Vertrauen und ihre
Nachsicht (und ihre Verfressenheit…) wäre diese Arbeit nie zustande gekommen. Ich
wünsche ihnen, dass jedes einzelne von ihnen einen guten Platz findet, an dem es
pferdegerecht alt werden kann.
Und weil das Pferd immer wichtiger ist als der Reiter bzw. der Mensch, erwähne ich erst an
zweiter Stelle und nur, weil es die Form so gebietet, Herrn Prof. Dr. Dr. h.c. W. Leibold,
der Dissertationsthema, Arbeitsplatz und eine Herde Isländer stellte.
Diese Arbeit wäre ohne meinen Vater Dieter Heselhaus nicht geschrieben worden. Seine
Ermutigung, mich doch an das Abenteuer Dissertation zu wagen, und seine geduldige
Unterstützung haben mir drei wunderbare Jahre ermöglicht.
Für die vielen konstruktiven Diskussionen und Hilfeleistungen, für die regelmäßige Deckung
meines Erhaltungsbedarfs und für jede schöne Stunde schulde ich Frau Kathrin F.A.
Langner und Frau Patricia Traub, meinem „24h-Computer-Notdienst“, meinen Dank.
Unvergessen bleiben auch alle anderen Mitarbeiter und Doktoranden der Arbeitsgruppe
Immunologie, insbesondere Frau Silke Schöneberg, Herr Udo Rabe, Herr Jens Rohwer
und Herr Alexej Dronov. Spontane Hilfe à la Alexej zu jeder Tages- und Nachtzeit ist mit
nichts zu bezahlen. Für ausführliche Diskussionen mit einem unerschöpflichen Reservoir an
Geduld und Fachwissen stand Jens Rohwers Tür immer offen. Vielen Dank für die
konstruktive Hilfe u.a. durch das Korrekturlesen dieser Arbeit!
Herr Fridbert Njalson und seine Familie stellten der Arbeitsgruppe Immunologie und damit
mir ihre Islandpferde zur Verfügung, obwohl sie mich nicht kannten. Wer Pferde besitzt und
liebt, weiß, was das bedeutet.
Mein Dank geht auch an Herrn Heinrich Baldrich mit Familie und Mitarbeitern, die sich
den größten Teil meiner Zeit in der Immunologie um „meine“ Pferde gekümmert haben.
161
Fehlen darf hier natürlich auch weder Frau Dr. Tanja Geiben, die mich geduldig in die
Hohe Schule des FIT und der Immunologie einführte, noch Herr Karl-Heinz Hanneker, der
mir klar machte, dass Isländer keine gewöhnlichen Pferde sind.
Weiterhin danke ich Frau Kristin Stuke und Herrn PD Dr. med. vet. Georg v. Samson-
Himmelstjerna vom Institut für Parasitologie der TiHo Hannover für die Bereitstellung von
kleinen Strongyliden.
Dr. Wayne Hein und Dr. Richard Shaw aus Upper Hut, Neuseeland, überließen
dankenswerterweise der Arbeitsgruppe Immunologie zwei ihrer rekombinanten
Parasitenproteine.
Das Institut für Anatomie der Medizinischen Fakultät der Otto-von-Guericke-Universität
Magdeburg stellte mir schnell und unkompliziert eines ihrer Mikroskope als Leihgabe zur
Verfügung. Ich danke hierfür Herrn Prof. Dr. H. J. Rothkötter und Frau Dr. med. vet.
Diane Bimczok.
Der Unterstützung und dem Einsatz von Frau Prof. Dr. Astrid Tenter, meiner
Zweitgutachterin, und von Herrn Prof. Dr. Burkhard Meinecke, dem Vorsitzenden der
Promotionskommission, ist es zu verdanken, dass gegen alle Hindernisse meine Promotion
doch noch zu einem Abschluss gebracht werden konnte.
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