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Técnicas de Imuno-Citoquímica

e Imuno-Histoquímica

Identificação de linfócitos T e B:

Marcadores CD4+, CD8+, IgM e

IgG

Doutoranda: Priscila Diniz Lopes

Prof. Hélio José Montassier

Disciplina: Imunologia Veterinária

Linfócitos T

Seleção e maturação de células T

TCR αβ se transformam em CD4+ ou

CD8+ na medula tímica

T CD4+ virgem : MHC de classe II-

antígenos exógenos

T CD8+ virgem : MHC de classe I –

antígenos endógenos

Linfócitos B

Linfócitos B são ativados pelo antígeno e secretam anticorpos para eliminá-los

Em resposta ao CD40 e às citocinas sofre mudança de isótipo da cadeia pesada, levando a produção de anticorpos com cadeias pesadas de diferentes classes

Citocinas produzidas pelas céls T auxiliares que são ativadas por patógenos regulam a mudança do isótipo

Marcadores

Técnica - definição

Utilização de Acs para detecção do

antígeno distribuído no tecido ou no

compartimento de uma célula

Histoquímica

◦ Corte de tecido congelado ou parafinado

Citoquímica

◦ Esfregaço sanguíneo, aspirados ou suabes

Principais fatores

Qualidade da marcação:

A. Fase pré-analítica (destacando-se

fixação do tecido e processamento);

B. Recuperação antigênica de

epítopos;

C. Sensibilidade do sistema de

detecção.

História

Coons, Creech e Jones em 1941

◦ Conjugaram um anticorpo com um corante

fluorescente.

Novos compostos marcadores como as

enzimas horseradish peroxidase (HRP)

em 1966 e fosfatase alcalina em 1978

Aplicações

Pré-requisitos

Antígeno - Anticorpo

Antígeno: molécula que se une de

maneira específica a um anticorpo

Epítopo: sítios de reconhecimento ou

de ligação

Imunógeno: molécula que pode

desencadear uma reposta

◦ Peptídeos sintéticos

◦ Antígeno purificado

Antígeno - Anticorpo

Anticorpo: molécula proteica que se

liga de maneira específica a uma

substância, o antígeno

Especificidade e afinidade

Soros

Reagente da técnica

Imunização de animais-alvo

Soros policlonais e monoclonais

Soros policlonais

Vários plasmócitos

◦ Reage com diversos epítopos de um

antígeno

Coelho, cabra, porco, equino ou

ovelha

◦ Facilidade na manutenção

◦ Anticorpos de coelhos precipitam com

proteínas de humanos

◦ Pool de anticorpos de diferentes coelhos

10 a 200 µg

Intradérmico ou subcutâneo

Músculo da pata ou cavidade peritoneal

Adjuvante completo ou incompleto de Freund’s

Soros monoclonais

Produto de um único clone de

plasmócitos

Uniforme em estrutura, especificidade e

afinidade

Anticorpos de um clone -

imunoquimicamente idênticos e reagem

com um epítopo específico

Ratos

Produção de soros

monoclonais A. Imunização de um animal

B. Colheita de plasmócitos no baço desse animal.

C. Fusão desses plasmócitos (curto tempo de vida)

com células de mieloma (longo tempo de vida).

D. Colocação individual das células resultantes da

fusão em cultura de modo a poder recolher-se os

anticorpos por elas produzidos.

E. Testes para saber suas características.

F. Manutenção das culturas (clones) que demonstrem

características úteis e destruição das restantes.

G. Recolha sistemática dos anticorpos produzidos

pelo clone que passam a constituir o soro monoclonal

Monoclonais x Policlonais

Imunienzimologia

É o método de imunohistoquímica que

utiliza enzimas como substâncias

propiciadoras da visualização do

antigênio

Métodos Imunohistoquímicos

Métodos diretos

AC primário possui o marcador

Simples, rápido

Pouca ampliação de sinal

Métodos indiretos

Método indireto simples

Anticorpo primário

Anticorpo secundário possui o

marcador

Mais sensível que o método direto,

maior versatilidade, mais econômico

Mais demorado e complexo do que o

direto

Método Peroxidase Anti-Peroxidase

(PAP)

Anticorpo primário e secundário

Complexo Peroxidase Anti-Peroxidase

(PAP)

Mais sensível, menos

marcações inespecíficas

Mais demorado e mais

complexo

Métodos indiretos

Métodos indiretos

Método APAAP (Alkaline phosphatase

anti Alkaline phosphatase)

Método semelhante ao PAP, mas que

utiliza como marcador a fosfatase

alcalina em vez da peroxidase

Imunocitoquimica (eritrócitos)

Métodos de avidina-biotina

Detecta pequenas quantidade de

antígenos

Alta sensibilidade (1 molécula de

anticorpo se liga a 150 moléculas de

biotina )– diminui o “fundo”

Técnica mais rápida

Alta versatilidade

Métodos de avidina-biotina

Avidina-biotina se baseiam em 4 princípios gerais:

A. A extraordinária afinidade existente entre a avidina e a biotina que se ligam formando um complexo praticamente indissociável

B. A possibilidade existente de ligação entre a biotina e outras moléculas, como enzimas e anticorpos (anticorpos biotinilados)

C. Possibilidade de se marcar a avidina com uma variedade de substâncias como enzimas, metais pesados ou fluorocromos

D. Possibilidade de utilização da avidina como ponte entre duas moléculas biotini-ladas (e.g. um anticorpo e uma enzima)

Métodos de avidina-biotina

Técnica streptABC

Anticorpo primário

Anticorpo secundário biotinilado

Aplicação do complexo streptavidina-

biotina (marcado com substância

propiciadora da visualização -

normalmente HRP).

Métodos de avidina-biotina

Técnica LSAB

Anticorpo primário

Anticorpo secundário biotinilado

Aplicação da streptavidina marcada

com substância propiciadora da

visualização (normalmente HRP).

Métodos de polímero

Técnica mais sensível e permite

detectar a quantidade mínima do

antígeno

Não utiliza estreptoavidina e biotina

Simples e rápida execução

Reprodutibilidade

Facilidade da padronização

Métodos de polímero

Polímero de esqueleto interno

Esqueleto central que estão acoplados

anticorpos secundários (20) e moléculas

propiciadoras da visualização (100

moléculas) (Ex: HRP)

Molécula utilizada para a formação do

esqueleto é dextrano (polissacarídeo

hidrofílico)

Métodos de polímero Polímero de esqueleto interno direto

Esqueleto de dextrano

Anticorpo primário e HRP acoplados

Extremamente rápido e fácil, diminuindo

fatores de erros

Pouco poder de amplificação e

relativamente dispendioso e existem

poucos anticorpos primários

comercializados desta forma

Métodos de polímero

Polímero de esqueleto interno indireto

Anticorpo primário

Anticorpos secundários e HPR

acoplados ao polímero

Fácil e rápido, diminui erros,

amplificador de sinais

Relativamente dispendioso

Aspecto prático dos

reagentes Cuidado com material e reagentes

Diluição do anticorpo

Testar diluições diferentes

Pipetagem

Tempo e temperatura de incubação

Higiene e segurança do laboratório

Preparação de amostras

Fixação

Preservação

Estabilização

Proteção

Preparação de amostras

Formaldeído

Econômico, mais utilizado, penetra nos tecidos ◦ Pontes de metileno entre os aminoácidos de

várias proteínas

◦ “Máscarar” antígenos

◦ Algumas alterações estruturais nas biomoléculas, principalmente nas proteínas

◦ Recuperação antigênica

◦ O tempo de espera entre colheita de material e fixação, pH, temperatura, tamanho dos fragmentos a fixar (10*10*3 mm), duração da fixação

Preparação de amostras

Fixação para cortes de criostato

> preservação dos tecidos

Fixadores: álcool, acetona

Microtomia

Cortes finos, sem pregas ou estrias

Não desbastar os cortes entre HE e

IHQ

Recuperação antigênica

Cortes parafinados

Digestão enzimática proteolítica

Recuperação antigênica de origem

térmica por alta temperatura

◦ Forno de micro-ondas, autoclave, panela

de pressão, banho de água quente e vapor

quente

Inibição de partículas

endógenas Peroxidase endógena

Baço, Rins, Fígado, Medula óssea e

em áreas de necrose

◦ Bloqueada por um excesso de substrato (

H2O2) que leva à saturação da atividade

enzimática

Fosfatase alcalina

Rim, fígado e osso

Figura 92 - Receptores de

Estrogênio

Figura 112 - CD3 (negro) e CD20

(castanho) em gânglio linfático