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UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS

INSTITUTO DE PATOLOGIA TROPICAL E SAÚDE PÚBLICA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA TROPICAL

SUELI MEIRA DA SILVA DIAS

Estudo bio-molecular de três estoques mistos de

Trypanosoma cruzi/ Leishmania spp isolados de

pacientes chagásicos crônicos após terapêutica

específica para a doença de Chagas

Orientação: Profª. Drª. ANA MARIA DE CASTRO

Co-orientação: Profª. Drª. JOANNA D’ÁRC A. HERZOG SOARES

Colaboradora: Profª Drª MIRIAM LEANDRO DORTA

GOIÂNIA – 2006

TERMO DE CIÊNCIA E DE AUTORIZAÇÃO PARA DISPONIBILIZAR AS TESES E

DISSERTAÇÕES ELETRÔNICAS (TEDE) NA BIBLIOTECA DIGITAL DA UFG

Na qualidade de titular dos direitos de autor, autorizo a Universidade Federal de Goiás (UFG) a disponibilizar,

gratuitamente, por meio da Biblioteca Digital de Teses e Dissertações (BDTD/UFG), sem ressarcimento dos direitos autorais, de acordo com a Lei nº 9610/98, o documento conforme permissões assinaladas abaixo, para fins de leitura, impressão e/ou download, a título de divulgação da produção científica brasileira, a partir desta data.

1. Identificação do material bibliográfico: [X ] Dissertação [ ] Tese 2. Identificação da Tese ou Dissertação

Autor (a): Sueli Meira da Silva Dias

E-mail: Suelimeira6@hotmail.com

Seu e-mail pode ser disponibilizado na página? [x ]Sim [ ] Não

Vínculo empregatício do autor Universidade Federal de Goiás/ Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública

Agência de fomento: Sigla:

País: Brasil UF: Goiás CNPJ:

Título: Estudo bio-molecular de três estoques mistos de Trypanosoma cruzi-Leishmania spp isolados de pacientes chagásicos crônicos após terapêutica específica para doença de Chagas

Palavras-chave: Trypanosoma cruzi, Leishmania spp, Infecção mista, Biologia molecular, Chagas, doença de

Título em outra língua: Bio-molecularstudy of three stocks mixed Trypanosoma cruzi-Leishmania spp isolated from chronic chagasic patients after specific therapy for Chagas desease

Palavras-chave em outra língua: Trypanosoma cruzi, Leishmania spp, Mixed infection, Molecular biology, Chagas disease

Área de concentração: Parasitologia

Data defesa: (dd/mm/aaaa) 28/06/2006

Programa de Pós-Graduação: Medicina Tropical

Orientador (a): Profª Drª Ana Maria de Castro - CPF: 331.086.501-06

E-mail: amaria.ana@gmail.com

Co-orientador (a):* Profª Drª Joanna D’arc A. Herzog Soares - CPF : 764.227.207-34

E-mail: joanna@iptsp.ufg.br

*Necessita do CPF quando não constar no SisPG 3. Informações de acesso ao documento:

Concorda com a liberação total do documento [ X ] SIM [ ] NÃO1

Havendo concordância com a disponibilização eletrônica, torna-se imprescindível o envio do(s) arquivo(s) em formato digital PDF ou DOC da tese ou dissertação.

O sistema da Biblioteca Digital de Teses e Dissertações garante aos autores, que os arquivos contendo eletronicamente as teses e ou dissertações, antes de sua disponibilização, receberão procedimentos de segurança, criptografia (para não permitir cópia e extração de conteúdo, permitindo apenas impressão fraca) usando o padrão do Acrobat.

Sueli Meira da Silva Dias Data: 19/ novembro/2013

Assinatura do (a) autor (a)

1 Neste caso o documento será embargado por até um ano a partir da data de defesa. A extensão deste prazo suscita

justificativa junto à coordenação do curso. Os dados do documento não serão disponibilizados durante o período de

embargo.

UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS

INSTITUTO DE PATOLOGIA TROPICAL E SAÚDE PÚBLICA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA TROPICAL

SUELI MEIRA DA SILVA DIAS

Estudo bio-molecular de três estoques mistos de Trypanosoma

cruzi/ Leishmania spp isolados de pacientes chagásicos crônicos

após terapêutica específica para a doença de Chagas

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em

Medicina Tropical do INSTITUTO DE PATOLOGIA

TROPICAL E SAÚDE PÚBLICA da UNIVERSIDADE

FEDERAL DE GOIÁS, como requisito parcial para a

obtenção do Grau de Mestre em Medicina Tropical.

Área de Concentração: Parasitologia

Goiânia-GO, 2006.

Dados Internacionais de Catalogação-na-Publicação (CIP)

(GPT/BC/UFG)

Dias, Sueli Meira da Silva.

D541e Estudo bio-molecular de três estoques mistos de

Trypanosoma cruzi/ Leishmania spp isolados de paci-

entes chagásicos crônicos após terapêutica específica

para a doença de Chagas / Sueli Meira da Silva Dias.

- Goiânia, 2006.

xii,47f. : il., color., figs., tabs.

Orientadora: Ana Maria de Castro; Co-Orienta-

dora: Joanna D’Arc A. Herzog Soares; Colaboradora:

Miriam Leandro Dorta.

Dissertação (Mestrado) – Universidade Federal

de Goiás, Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pú-

blica, 2006.

Bibliografia : f.39-47.

Inclui listas de abreviaturas, figuras e tabelas.

1. Trypanosoma cruzi 2. Leishmania spp 3. Infec-

cão mista 4. Biologia molecular 5. Chagas, Doença

de I. Castro, Ana Maria de II. Soares, Joanna D’Arc

A. Herzog III. Dorta, Miriam Leandro IV. Universi-

dade Federal de Goiás, Instituto de Patologia Tropi-

cal e Saúde Pública V. Título.

CDU : 616.937-022.1

DEDICATÓRIA

Aos meus pais, Miguel José da Silva e Maria Benedita Meira, pela boa criação que me deram,

ensinando-me com sabedoria a importância de viver com moral, honestidade e decência, me

acolhendo nos momentos difíceis, incentivando quando bate o desânimo, acreditando, quando nem

eu mesma acredito e se alegrando intensamente a cada vitória alcançada.

Aos meus irmãos e demais familiares, pelo orgulho que sentem ao presenciar a minha luta no sentido

de alcançar meus objetivos.

Ao meu esposo, Luiz Kennedy Dias, pela paciência, pelo incentivo e pela alegria e orgulho que

demonstra sempre que se refere aos meus estudos.

Aos meus filhos Luiz Felipe Dias e Ignes Valessa Dias, por me ensinarem tantas coisas sendo ainda

tão pequeninos, por me incentivarem mesmo sem compreender direito o que estou fazendo e por me

fazerem companhia em minhas longas horas de estudo.

A minha sogra Maria Alves Dias pelo exemplo de sinceridade, força e lucidez, pois completados

mais de oitenta anos de vida, ainda vem me visitar e trazer palavras de conforto e amizade, me

tratando como filha.

AGRADECIMENTOS

Primeiramente agradeço a Deus, por tudo que tem feito na minha vida, sem O qual, nada do que se

fez teria sido possível!

As minhas amigas e orientadoras: Profª Drª Ana Maria de Castro e Profª Drª Joanna D´arc Aparecida

Herzog Soares, que andaram comigo durante esse importante período de minha vida, ensinando não

somente os fundamentos da ciência, mas também os fundamentos da amizade, da confiança, da

parceria e do respeito.

Ao meu amigo Profº Evandro Leão Ribeiro, do DMIPP/ Setor de Micologia, pela sua amizade

incondicional que para mim é um presente, pela paciência e disposição com que sempre me atendeu

todas as vezes que precisei de algum auxílio ou conselho.

Ao meu amigo Profº Drº Marco Tulio Antonio García-Zapata, do NUPEREME/ IPTSP/ DMIPP/

Setor de Protozoologia, que desde o primeiro dia, apostou em minha capacidade, acreditou em meus

objetivos, compreendeu as minhas dúvidas e muito respeitosamente me ajudou na tomada de

importantes decisões.

Ao meu amigo Profº Drº José Clecildo Barreto Bezerra, do DMIPP/ Setor de Protozoologia, pela

amizade, incentivo, alegria e por ter acreditando em mim, mais do que eu mesma acreditava.

Conhecer você fez toda a diferença, e representou um marco não só na minha vida, mas na de

muitos!

Ao meu amigo Profº Dr° Ionizete Garcia da Silva, do DMIPP/ Setor de Entomologia, pelas boas

palavras nas horas difíceis, pelas lições de vida, pelo exemplo de honestidade, integridade e moral e

por me ensinar à importância do amor ao próximo.

A Profª Drª Regina Maria Bringel, do DMIPP/ Setor de Virologia, pela oportunidade que me

concedeu no momento em que eram necessárias as mudanças, me recebendo de braços abertos em

seu grupo de trabalho, onde muito aprendi devido a sua extrema dedicação e competência em tudo o

que faz.

A Profª Drª Dulcinéia Maria Barbosa Campos, do DMIPP/ Setor de Helmintologia, pelos bons

conselhos em um determinado momento de grandes dúvidas.

A Profª Drª Miriam Leandro Dorta, do DMIPP/ Setor de Imunologia, pela prestimosa colaboração

nos ensaios de biologia molecular.

As Professoras Ana Candido Czerewuta e Osvaldira Seabra de Oliveira, representantes da saudosa

Unidade de Investigação Gaspar Viana, por ter me ensinado muito do que sei sobre Leishmaniose.

Aos meus amigos funcionários do IPTSP como um todo, e em especial os do laboratório Profª

Margarida Dobler Komma (IPTSP/UFG) pela amizade, o incentivo e pelo prazer da convivência,

compartilhando bons e maus momentos rumo a superação das dificuldades do dia-a-dia: Esterde

Morais, Lívia Paula S. Figueiredo, Solimar Almeida Oliveira, Eliane de Paiva e Silva, Antonella Del

Buono Guimarães, Ailton José Soares, Luismar Pereira Cardoso, Anne Lucione M. Pereira,

Rosemary Alves dos Santos, Mariêta Pereira de M. Souza, Hildene Menezes e Silva, Elcy Pereira de

Jesus, Ágabo Macedo da C. e Silva Ana Maria Farias, Nair Marques Martins, Jildamáris de Araújo

Silva, Valéria Paulo Palhares, José Reis S. C.Junior, James Frank Costa Martins Dulce Helena

rebouças e em especial a Maria de Lourdes Paiva, que muito me ajudou no desempenho de minhas

funções, sempre prestativa e disponível, me fazendo companhia em um período de muitas andanças.

A querida amiga e funcionária do IPTSP, Divina Helena de Rezende, que se revelou uma grande

amiga, além de me tratar como a uma irmã.

Aos demais funcionários do IPTSP, meus colegas e incentivadores, em especial: José Clementino O.

Netto (Zezinho), Sr. Fernando Koslowsky, Maria Aparecida L. Alves, Dona Lenita, Cláudio

Maranha, Vanda Maria de M. Oliveira, Wanderley Soares de Andrade...

A todos os colegas do curso de mestrado, pela amizade e companheirismo, em especial ao colega

Marcos Gontijo, pela prestimosa participação durante toda a fase experimental deste trabalho.

A nova mestranda do DMIPP/ Setor de Imunologia, Rosidete Bastos, por ter sido tão prestativa,

atenciosa e competente, me auxiliando nos ensaios de biologia molecular.

Enfim, devo dizer que a realização deste trabalho é a concretização do esforço de muitos. Expressar

minha gratidão a todos aqueles que direta ou indiretamente colaboraram, contribuindo para execução

do mesmo, não é tarefa das mais fáceis. A todos os que me incentivaram, apoiaram, até mesmo

criticaram, porém acreditando nos meus esforços; a todos os que nas horas difíceis, me dirigiram

uma palavra de ânimo e nas horas fáceis sorriram comigo, a todos aqueles que não tiveram seus

nomes mencionados, mas desejaram de coração que eu lograsse êxito em meus esforços, muito

obrigado!

SUMÁRIO

RESUMO XI

ABSTRACT XII

ABREVIATURAS XIII

LISTA DE FIGURA E TABELAS XIV

1. INTRODUÇÃO 01

1.1 – Tripanossomíase americana 01

1.2 – Leishmaniose 04

1.3 – Co-infecção 07

1.4 – Características bio-moleculares dos tripanossomatídeos 08

1.4.1 - Trypanosoma cruzi 08

1.4.2 – Leishmania spp 10

1.5 – Diagnóstico laboratorial das tripanossomíases 13

1.5.1 - Doença de Chagas 13

1.5.2 – Leishmaniose 14

1.5.3 - Reação cruzada na sorologia 16

2 - OBJETIVOS 18

2.1 – Objetivos gerais 18

2.1.1 – Objetivos específicos 18

Delineamento experimental 19

3 – MATERIAL E MÉTODOS 20

3.1 – Origem dos estoques mistos 20

3.2 – Estudo biológico experimental 22

3.2.1 – Reativação dos estoques mistos em meio LIT 22

3.2.2 – Inoculação em camundongos isogênicos 22

3.2.3 - Hemocultura experimental 24

3.2.4 – Histopatologia 24

3.2.5 – Análise sorológica experimental por técnica de imunofluorescência indireta (IFI) 25

3.2.5.1 – Obtenção do antígeno de IFI 25

3.2.5.2 – Imunofluorescência indireta (IFI) para T. Cruzi e Leishmania spp em soro de

camundongo 25

3.3 - Confirmação da co-infecção T. Cruzi/ Leishmania spp através da reação em

cadeia da polimerase (PCR) 26

3.3.1 – Reação em cadeia da polimerase (Polimerase Chain Reaction, PCR)

para identificação do subgênero Leishmania 26

3.3.1.1 – Extração do DNA das amostras 26

3.3.1.2 – Amplificação 27

3.3.1.3 – PCR-RFLP (RFLP, “Restriction Fragment Length Polimorphism”)

para identificação do subgênero Viannia 28

4 – RESULTADOS 29

4.1 – Perfil dos pacientes chagásicos crônicos dos quais foram isolados os estoques mistos 29

4.2 – Estudo biológico experimental 29

4.2.1 – Infecção experimental 29

4.2.2 – Hemocultura experimental 30

4.4 – Histopatologia 31

4.5 – Diagnóstico sorológico por IFI 32

4.6 – Confirmação da co-infecção T. Cruzi/ Leishmania spp através a técnica de PCR 32

5 – DISCUSSÃO 34

6 – CONCLUSÕES 38

7 - REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 39

RESUMO

Trinta pacientes chagásicos crônicos foram submetidos ao tratamento específico para a

doença de Chagas. A droga utilizada foi o Benznidazol. Após o tratamento foram realizados exames

laboratoriais compreendendo análises parasitológicas e imunológicas, com a finalidade de validação

terapêutica. A análise parasitológica representada pela hemocultura evidenciou a presença

concomitante de promastigotas e epimastigotas em 10% (3/30) delas, caracterizando uma provável

infecção mista. Essas hemoculturas foram denominadas 371, 437 e 438. Dos três pacientes, dois são

procedentes do estado de Goiás (GO) e um do estado de Minas Gerais (MG), regiões endêmicas

tanto para a doença de Chagas como para a leishmaniose, o que justificou o estudo desta provável

co-infecção. O presente trabalho foi desenvolvido em duas etapas. Na primeira etapa, foi realizado o

estudo biológico experimental dos estoques mistos e na segunda, a confirmação do gênero

Leishmania spp nos estoques mistos, através da técnica de PCR. No estudo biológico experimental,

foram utilizados como modelos camundongos Balb/c isogênicos, realizando-se inoculação

intraperitoneal dos estoques. Posteriormente foi analisada a parasitemia, hemocultura, sorologia por

IFI e histopatologia. A observação da parasitemia ocorreu a cada 48 horas pelo período de 90 dias, e

a hemocultura foi analisada semanalmente por 120 dias, resultando positiva apenas nos

camundongos inoculados com o estoque 371. A IFI detectou apenas anticorpos anti-T. cruzi, nos

camundongos inoculados com os estoques 371 e 437. A análise histopatológica revelou presença de

ninhos de amastigotas nos cortes cardíacos dos camundongos inoculados com o estoque 437,

demonstrando no conjunto dessas análises, que apenas as formas epimastigotas presentes nos

estoques mistos se mostraram viáveis em infectar o modelo experimental utilizado. A presença de

protozoários do gênero Leishmania nos estoques foi confirmada mediante realização de PCR. Na

PCR-RFLP, o produto da amplificação foi tratado com a enzima de restrição Hae III que tem sítios

específicos de clivagem para o subgênero L. (Viannia). As amostras representadas pelos estoques

371, 437 e 438 e os controles de L. (L.) amazonensis e L. (L.) chagasi não sofreram clivagem de seus

segmentos amplificados na PCR. Apenas o controle constituído de L. (V.) braziliensis sofreu

clivagem, resultando fragmentos de aproximadamente 40 e 80 pb, confirmando inequivocamente

que as amostras representadas pelos estoques mistos 371, 437 e 438 isoladas de pacientes chagásicos

crônicos realmente continham L. (Leishmania) spp.

ABSTRACT

Thirty cronic chagasic pacients were submitted to specific treatment against Chaga’s disease.

The drug of choice was Benznidazole. After treatment laboratorial exams such as parasitological and

imunological aiming terapheutic validation were performed. The parasitological analysis is

represented by post-treatment hemoculture of 30 cronic chagasic pacients and demonstrated the

presence of promastigotes and epimastigotes in 10% (3/30) of pacients, probably characterizing a

mixed infection. These hemocultures were named 371, 437 and 438. From these three pacients two

were from Goias (GO) and one from Minas Gerais (MG) which are endemic regions to Chaga’s

disease as well as to Leishmaniasis which justified the study of this probable co-infection. The work

was developed in two phases: in the first phase it was made the biological experimental study of the

mixed sotck and in the second phase it was made the confirmation of the Leishmania spp gender

through PCR technique. In the experimental biological study the model used was Balb/c isogenic

mice and we made an intraperitoneal inoculation of the stocks and we analysed the following

parameters: parasitism, hemoculture, sorology by IFI and histopathology. The parasitism observation

occured between 48 hours periods through 90 days, and the hemoculture observations occured

weekly through 120 days and resulted positive only in mice innoculated with stock 371. The

sorology showed anti-T. cruzi antibodies titers in mice innoculated with stocks 371 and 437. The

histopathology revealed the presence of amastigotes in tissues cardiac slides from mice innoculated

with stock 438, showing that only the epimastigotes forms are present in the mixed stocks and are

viable to infect the experimental model used in this work. The confirmation of the Leishmania

subgenus envolved in this co-infection was possible through molecular biology techniques. In PCR-

RFLP, after digestion of PCR products by Hae III restriction enzymes which has specific clivage

sites for L. (Viannia) subgender. The samples represented by 371, 437 and 438 stocks and the

controls of L. (L.) amazonensis and L. (L.) chagasi did not suffer clivage of its amplified segments in

PCR. Only the control constituted by L. (V.) braziliensis suffered clivage resulting in fragments of

aproximately 40 and 80 bp confirming undoubtfully that the samples represented by the mixed

stocks 371, 437 and 438 isolated from cronic chagasic pacients cantained L. (Leishmania) spp.

ABREVIATURAS

DNA Ácido Desoxiribonucléico

ELISA Enzyme Linked Immunosorbent Assay

µm Micrômetro

µL Microlitros

gp glicoproteína

HAI Hemaglutinação indireta

HE Hematoxilina-eosina

IFI Imunofluorescência indireta

IDR Intradermoreação

IgM Imunoglobulina da classe M

Kg Kilograma

kDNA DNA do cinetoplasto

kb Kilobase

LPG Lipofosfoglicose

LIT Liver Infusion Tryptose

Mg Miligrama

NNN Novy, Mc Neal e Nicolle

OMS Organização Mundial de Saúde

PH Potencial hidrogeniônico

PCR Reação em Cadeia da Polimerase

SMF Sistema Monocítico Fagocitário

T.a. Temperatura ambiente

V/V volume a volume

LISTA DE FIGURAS E TABELAS

Figura 1. Distribuição geográfica mundial da tripanossomíase americana, segundo a

Organização Mundial de Saúde (OMS) 3

Figura 2. Distribuição mundial das leishmanioses cutânea e visceral (OMS) 5

Figura 3. Distribuição dos casos de leishmaniose visceral notificados, segundo região

de ocorrência no Brasil na última década (Ministério da Saúde) 6

Figura 4. Ciclo evolutivo do Trypanosoma cruzi. 9

Figura 5. Ciclo evolutivo da Leishmania spp 12

Figura 6. Formas evolutivas promastigotas, coradas pelo Giemsa, isoladas pela

hemocultura (LIT) de pacientes chagásicos crônicos após terapêutica específica 21

Figura 7. Corte histopatológico de coração de camundongo inoculado com o estoque

misto 437 31

Figura 8. Produto amplificado da PCR para caracterização do gênero Leishmania spp 33

Figura 9. Produto da PCR tratado com enzima de restrição Hae III para caracterização do

Subgênero L. (Leishmania) 33

Tabela I. Perfil clínico-epidemiológico de três pacientes chagásicos crônicos após tratamento

específico para a doença de Chagas 29

Tabela II. IFI do sangue dos camundongos inoculados 31

1 - INTRODUÇÃO

1.1 – TRIPANOSSOMÍASE AMERICANA

A doença de Chagas, também denominada Tripanossomíase Americana, é uma

zoonose prevalente em larga extensão do Continente americano, abrangendo desde o sul

dos Estados Unidos até a Patagônia, no extremo sul da Argentina (Ferreira & Ávila 2001)

(Fig 1). Esta doença constitui uma das mais importantes endemias do Brasil e da América

latina, afetando em torno de 18 milhões de indivíduos (Portela-Lindoso & Shikanai-Yasuda

2003). Todavia, dados epidemiológicos da década de 80 do Ministério da Saúde, já faziam

referência a uma estimativa populacional cinco vezes maior exposta ao acometimento desta

parasitose nos países americanos.

Figura 1-Distribuição geográfica mundial da tripanossomíase americana, segundo a Organização

Mundial de Saúde, http://nsn1.utdallas.edu/.../Parasite/chagas.htm

O mal de Chagas é transmitido via vetorial, por triatomíneos hematófagos

conhecidos vulgarmente como “barbeiro”, “chupão”, “fincão”, dentre outras denominações

regionalizadas. Pode também ser veiculado homem a homem por transfusão de sangue, via

placentária e transplantes de órgãos. Outros mecanismos excepcionais, como acidentes de

laboratório e contaminação pela via oral também podem ocorrer (Marcondes 1987; Araújo-

Jorge & Castro 2000; Portela-Lindoso & Shikanai-Yasuda 2003). Nos últimos anos, com o

sucesso do programa de erradicação do Triatoma infestans no Cone Sul, o principal

mecanismo de transmissão tem sido representado pelas transfusões sanguíneas. Este fato

ocorreu em decorrência dos processos migratórios brasileiros, impulsionados pelo

desenvolvimento industrial das grandes capitais favorecendo a chamada “urbanização” da

doença (Moncayo 1999).

O aspecto clínico-laboratorial da doença de Chagas compreende duas fases: aguda e

crônica. A fase aguda que é caracterizada pela parasitemia alta, estado febril não acentuado

e de curta duração, perdura por apenas algumas semanas. É descrita nesta fase a ocorrência

de um complexo oftalmo-ganglionar, considerado por diversos estudiosos, como um típico

sinal de porta de entrada da doença de Chagas, decorrente de infecção via ocular, recebendo

a denominação de “Sinal de Romaña”. Quando a porta de entrada é cutânea, pode ocorrer

uma reação de hipersensibilidade denominada “chagoma de inoculação” (Dias 1997;

SINAN 2001).

A fase crônica de modo geral se inicia com a remissão dos sintomas agudos, onde

importantes fenômenos de imunomodulação estão envolvidos, como declínio acentuado da

parasitemia, progressiva redução dos fenômenos inflamatórios e eficiente resposta humoral

com formação de anticorpos da classe IgG. Esta fase é subclínica e aparenta um equilíbrio

entre o hospedeiro e o parasito, com formação de resposta imune celular e humoral,

estimulando o surgimento de anticorpos líticos, responsáveis pelo controle da parasitemia.

Este período prolonga-se por muitos anos, sem evidências de sintomatologia ou alterações

relevantes, caracterizando a forma indeterminada da doença de Chagas, também conhecida

como fase latente, subclínica ou inaparente. Nesta fase de evolução da doença, a maioria

dos pacientes (60-70%) permanece sem qualquer manifestação clínica, apresentando

eletrocardiograma, Raios-X do coração, cólon e esôfago normais. Aproximadamente 20-

25% dos indivíduos infectados evoluem para cardiopatia chagásica crônica e 5-10% são

acometidos de síndromes digestivas, com destaque para a esofagopatia e colopatia (Cunha-

Neto et al. 1995). Esta fase que é afebril apresenta poucos parasitos circulantes no sangue,

embora sejam altos os níveis de anticorpos. O diagnóstico laboratorial apresenta limitações

devido à baixa parasitemia e á pouca especificidade das reações sorológicas usuais

resultando na ocorrência de reações cruzadas com outras doenças. Apesar disto, as diversas

técnicas existentes podem ser utilizadas em conjunto no intuito de avaliar a evolução

clínica da doença crônica. Recentemente, a reação em cadeia da polimerase (PCR) tem

possibilitado, com sensibilidade cada vez maior, a detecção de ácido desoxirribonucléico

(DNA) de T. cruzi nas amostras dos pacientes neste estágio da doença. (Portela-Lindoso &

Shikanai-Yasuda 2003).

1.2 – LEISHMANIOSE

A leishmaniose é uma doença infecciosa inicialmente silvestre, causada por

diferentes espécies do protozoário dimórfico do gênero Leishmania, que constitui um

complexo de enfermidades com prevalência nos quatro continentes. Compreendem uma das

sete endemias mundiais de prioridade absoluta da Organização Mundial de Saúde, em

função de seu caráter endêmico em várias regiões do mundo, encontrando-se ainda entre as

seis doenças infecto-parasitárias de maior importância no Brasil e na América Latina.

Estima-se que, anualmente, 500.000 casos são diagnosticados no mundo, ressaltando-se os

territórios do subcontinente indiano, o leste africano, o litoral do Mediterrâneo e Portugal,

Rússia, Arábia Saudita, Iraque, Irã, China e América Latina (Fig. 2). O Brasil apresentou no

período de 1982 a 2002 coeficientes de detecção crescentes, oscilando entre 4,75 e 22,94

casos por 100.000 habitantes, para a forma tegumentar. Foi observada uma expansão

geográfica a partir da década de 80 quando foram registrados casos em 22 unidades

federadas, e em 2002 todos os estados brasileiros apresentaram casos autóctones da doença

(WHO 2002). Quanto à leishmaniose visceral, atualmente 19 unidades federadas

apresentam casos, principalmente os estados da Região Nordeste, onde se concentram 87%

dos casos, com expansão nos últimos anos para as regiões Centro-Oeste, Norte e Sudeste.

No período de 1982 a 2002, os coeficientes de incidência da forma visceral da doença

variaram de 0,96 a 2,66 casos por 100.000 habitantes, sendo também observado o

fenômeno de periurbanização e urbanização da mesma, com destaque para os surtos

ocorridos em cidades como Rio de Janeiro (RJ), Belo Horizonte (MG), Araçatuba (SP),

Santarém (PA), Corumbá (MS), Teresina (PI), Natal (RN), São Luís (MA), Fortaleza (CE),

Camaçari (BA) e mais recentemente, as epidemias ocorridas nos municípios de Três

Lagoas (MS), Campo Grande (MS) e Palmas (TO) (Ministério da Saúde Brasil 2004).

A doença tem como vetores, flebotomíneos fêmeas e apresenta basicamente quatro

formas clínicas no homem: cutânea, mucocutânea, difusa e visceral. Em geral, uma

determinada espécie de Leishmania está associada a uma das manifestações clínicas,

embora alguns estudos realizados na espécie humana relatam ocorrência ou suspeita de

associação de duas espécies em um mesmo hospedeiro (Oliveira-Neto et al. 1985,

Mebrahtu et al. 1991, Ibrahim et al. 1994).

As espécies de Leishmania reconhecidas como agentes etiológicos das

leishmanioses, são morfologicamente similares e podem produzir amplo espectro de

manifestações clínicas, que têm sua dinâmica correlacionada a variáveis como local de

ocorrência, vetores, ecossistemas e forma de utilização do meio ambiente nos processos

sociais de produção. No Brasil, as formas tegumentares se caracterizam pela diversidade de

apresentações clínicas e das espécies causadoras da doença, sendo as principais espécies

pertencentes a dois subgêneros: Viannia, representado pelas espécies L. (Viannia)

brasiliensis e L. (Viannia) guyanensis, associadas com lesões cutâneas localizadas ou

disseminadas e lesões mucocutâneas e subgênero Leishmania, representado pela espécie L.

(Leishmania) amazonensis, associadas com lesões cutâneas localizadas ou com a forma

difusa (FUNASA 2000; Gontijo & Carvalho 2003).

Figura 2-Distribuição mundial da leishmaniose Cutânea (A) e visceral (B), segundo a

Organização Mundial de Saúde. http://nsn1.utdallas.edu/.../Parasite/leishmaniasis.htm

Atualmente, a leishmaniose visceral, também denominada calazar, representa o

protótipo de uma disfunção imunológica específica resultante do parasitismo das

leishmanias nos macrófagos, produzindo de acordo com a idade, o estado nutricional e as

características imunogenéticas do indivíduo acometido, um amplo espectro de

manifestações clínicas e imunológicas. Estas manifestações podem ser reversíveis em

presença do tratamento específico ou no caso dos indivíduos imunocompetentes podem

sofrer regressão espontânea.

A forma visceral da leishmaniose causa no homem parasitismo acompanhado ou

não de patologia no fígado, baço e medula óssea, podendo causar infecção crônica

persistente por toda a vida do hospedeiro. A forma clássica, clinicamente mais grave se

caracteriza por acometimento do sistema monocítico fagocitário levando a um quadro de

hepato-esplenomegalia febril, marcado por emagrecimento e enfraquecimento progressivos,

levando a óbito os casos não tratados. A leishmaniose visceral acarreta ainda elevados

custos sociais, medidos em anos potenciais perdidos, devido a maior ocorrência de óbitos

em grupos etários mais jovens (Caldas et al. 2001). Entretanto, na maioria dos casos e mais

freqüentemente nas zonas endêmicas, é considerada uma parasitose subclínica, devido à

ausência de processo patológico. Na América do sul é causada essencialmente por uma

única espécie, Leishmania (Leishmania) chagasi. Estima-se que 20% dos indivíduos

infectados em regiões endêmicas desenvolvam a forma clássica desta doença (fase

sindrômica). Os 80% restantes das pessoas infectadas por L. (L.) chagasi, apresentam-se

assintomáticas, não desenvolvendo a doença, fato que dificulta a suspeita de leishmaniose

visceral nos indivíduos chagásicos (Ministério da Saúde, Brasil 2004).

Figura 3. Distribuição dos casos de leishmaniose visceral notificados, segundo região de

ocorrência no Brasil na última década.

1.3 – CO-INFECÇÃO

A co-infecção T.cruzi/ Leishmania spp pode ocorrer em hospedeiros vertebrados,

uma vez que as zonas endêmicas para tripanossomíase americana e leishmaniose se

sobrepõem e os parasitos envolvidos pertencem à mesma família Trypanosomatidae,

possuindo, portanto muitas características antigênicas comuns. Esta família possui nove

gêneros e cada um deles apresenta várias formas de evolução durante seu ciclo de vida,

compreendendo basicamente: amastigota, promastigota, epimastigota e tripomastigota.

A associação dessas duas infecções já foi citada por alguns autores, porém até o

momento, pouco se registrou quanto à importância epidemiológica, a distribuição

geográfica e o registro de dados pertinentes, bem como o estudo das espécies envolvidas

(Barbosa et al. 1984; Chiaramonte et al. 1996; Chiaramonte et al. 1999; Bastrenta et al.

2003). Entretanto a co-infecção HIV-Leishmania tem despertado o interesse das

instituições de saúde pública, devido ao caráter oportunista da leishmaniose visceral, sendo

este assunto extremamente explorado. Porém a associação de T. cruzi com a Leishmania

spp tem sido objeto de poucos estudos, necessitando maiores esclarecimentos.

1.4 – CARACTERÍSTICAS BIO-MOLECULARES DOS

TRIPANOSSOMATÍDEOS

1.4.1 - Trypanosoma cruzi

O T. cruzi, agente da moléstia de Chagas, é um protozoário flagelado da ordem

Kinetoplastida, família Trypanosomatidae, caracterizado pela presença de um flagelo e uma

única organela mitocondrial denominada cinetoplasto, onde está contido ¼ de todo o DNA

do parasito. O estudo do genoma do T. cruzi evidencia a presença de DNA nuclear e DNA

do cinetoplasto (kDNA). Este é constituído por moléculas circulares, catenadas de

tamanhos diferentes: os maxi e os minicírculos (Romanha 1992; Weiss 1995). Esse kDNA

está representado por uma rede fibrosa, constituída de aproximadamente 50 cópias de

maxicírculos, apresentando em torno de 20 kb e de 5-10.000 cópias de minicírculos de 1,4

kb (Simpson 1987). Os minicírculos de T. cruzi apresentam diversas seqüências de

nucleotídios e representam 95% do DNA total do cinetoplasto (Romanha 1992; Simpson &

Silva 1971). Cada parasito apresenta cerca de 30.000 minicírculos; cada minicírculo tem

determinada seqüência nucleotídica que se repete espaçada e regularmente por quatro

vezes, o que faz com que cada parasito apresente cerca de 120.000 cópias desse

determinado segmento. Estas seqüências representariam, portanto, importantes segmentos

de DNA alvos para a detecção de T. cruzi (Romanha 1992).

Ao infectar o homem através da deposição de fezes e urina no local próximo à

picada, os tripomastigotas metacíclicos são internalizados nos macrófagos do tecido

dérmico e subcutâneo através de fagocitose induzida (Sibley & Andrews 2000). Dentro

dessas células se diferenciam em amastigotas, multiplicando-se intensamente por divisão

binária, até o rompimento da célula parasitada, quando são liberados sob a forma

tripomastigota; essas caem na circulação sanguínea, promovendo a disseminação da doença

pelo organismo do hospedeiro. Nesse momento a parasitemia começa a intensificar-se,

culminando por volta do 10º ao 15º dia após a contaminação, caracterizando a fase aguda

da doença. As formas tripomastigotas liberadas podem penetrar em outras células pela via

hematogênica, ou serem ingeridas pelo triatomíneo no ato do repasto sanguíneo (Schuster

& Sullivan 2002). Do intestino anterior do inseto estas formas tripomastigotas migram para

o intestino médio, se diferenciam em epimastigotas, que se multiplicam intensamente por

divisão binária. Ao alcançarem o intestino posterior, essas epimastigotas se diferenciarão

em tripomastigotas metacíclicas, que serão eliminadas juntamente com a urina e as fezes,

estando aptas a penetrarem as células do hospedeiro vertebrado (Ferreira & Ávila 2001)

(Fig.4).

Figura 4- Ciclo evolutivo –Trypanosoma cruzi

1.4.2 – Leishmania spp

As leishmanias são protozoários dimórficos pertencentes à família

Trypanosomatidae. São parasitos intracelulares obrigatórios e se reproduzem por divisão

binária dentro das células do sistema mononuclear fagocitário, em especial os macrófagos

de mamíferos suscetíveis. As formas amastigotas, que em geral são arredondadas, medem

de 3 a 6 µm de diâmetro e não têm o flagelo exteriorizado. As promastigotas têm uma

forma losangular adelgaçada de 10-15 µm com um longo flagelo na extremidade, que

emerge da base e mede de 15 a 28 µm de comprimento. É bastante móvel e tem função de

impulsionar para frente o parasito. Nas colorações de Romanovsky, o citoplasma aparece

em azul, o núcleo é relativamente grande, excêntrico e cora-se em vermelho.

O genoma da Leishmania spp é constituído por dois tipos de DNA:

1) DNA Nuclear - A estrutura cromossômica de Leishmania spp é semelhante à de

outros protozoários, apresentando núcleo central de seqüências de nucleotídeos únicos ou

que se repetem poucas vezes no genoma (Winker et al. 1996). Neste gênero, é comum a

existência de uma variabilidade genética ocasionando diferenças cromossomais. Essa

variabilidade é gerada por diversos mecanismos que têm sido bastante estudados. Entre

esses mecanismos citam-se as seguintes hipóteses: heterogeneidade ligada à estrutura

populacional clonal (Tybairenc & Ayala 1998), como acontece em T. cruzi, recombinação

ou troca genética (Cupolillo et al. 1997) e variação no número de repetições dos

microssatélites (os microssatélites são repetições em seqüências lineares curtas de 1 a 6

nucleotídios que ocorrem no genoma dos eucariotos e que são altamente polimórficos)

(Beckman & Weber 1992).

2) DNA do Cinetoplasto - A estrutura mitocondrial que é característica nos

representantes da ordem Kinetoplastida é uma estrutura única, denominada cinetoplasto.

Contém uma quantidade substancial de DNA extranuclear que aparece organizado em mini

e maxicírculos justanucleares (Shaw 1994). O cinetoplasto é constituído por uma enorme

rede de DNA formado por milhares de moléculas circulares, em um arranjo concatenado

semelhante à malha de ferro das armaduras medievais (Shapiro & Englud 1995). O DNA

presente no cinetoplasto é denominado kDNA e é semelhante ao DNA mitocondrial, sendo

constituído por dois tipos de moléculas: os maxicírculos e os minicírculos. Os maxicírculos

são moléculas grandes e circulares que contém genes que codificam algumas enzimas e

estão presentes em torno de 30-50 cópias por parasito. Os minicírculos são moléculas

menores, presentes em cerca de 10.000 a 20.000 cópias por parasito (Rodgers et al. 1990) e

que apresentam uma região denominada região conservada, detentora de grande homologia

de nucleotídeos entre as diferentes espécies de Leishmania, possuindo aproximadamente

150-200 pares de base (pb). Dentro da região conservada existe uma seqüência de 12 pb

que representa a origem de replicação do minicírculo. Devido ao alto número de cópias por

células, os minicírculos do kDNA de Leishmania spp se tornaram um alvo para as técnicas

de detecção e diferenciação molecular das leishmanias (Lopez et al. 1993; Degrave et al.

1994). A outra região presente nos minicírculos, denominada região variável, pode ter

tamanho variando entre 650-800 pb dependendo da espécie (Degrave et al. 1994). A

seqüência de nucleotídeos da região variável apresenta um alto grau de heterogeneidade

não só entre cepas ou isolados, como também entre minicírculos de um mesmo parasito.

Quanto ao ciclo biológico das leishmanias, é do tipo heteroxênico, envolvendo um

flebotomíneo hematófago do gênero Lutzomyia nas Américas e Phlebotomus no Velho

Mundo. Estes, no ato da hematofagia transferem para o hospedeiro vertebrado as forma

promastigotas, que apresentam grande mobilidade. Uma vez inoculadas no hospedeiro, se

ligam a receptores específicos dos macrófagos (SMF) e sofrem fagocitose mediada por

receptores, envolvendo uma multiplicidade de eventos imunológicos que vão interagir o

parasito ao macrófago (Mauel 1996, Domínguez & Torano 2001). Uma vez internalizado

na célula do SMF, transforma-se em amastigota e se multiplica intensamente por divisão

binária até romper a célula e serem liberadas. Então são novamente fagocitadas, onde se

multiplicam por divisão binária e rompem as células, acontecendo nova fagocitose pelo

SMF. Quando o hospedeiro é picado, o inseto vetor ingere juntamente com o sangue essas

formas amastigotas que se multiplicam por divisão binária invadem todo o intestino

anterior do inseto após se diferenciar em promastigotas. Essa forma flagelada altamente

móvel por sua vez alcança a probóscida do inseto, onde se diferenciam em formas

infecciosas metacíclicas e são inoculados no hospedeiro por regurgitações juntamente com

a saliva durante o repasto sanguíneo. No hospedeiro vertebrado, as formas promastigotas

metacíclicas são fagocitadas por macrófagos e se diferenciam em amastigotas, rompem as

células do foco inicial ou primário da infecção chegando aos órgãos-alvo (Fig. 5).

Figura 5- Ciclo evolutivo – Leishmania spp

1.5 – DIAGNÓSTICO LABORATORIAL DAS TRIPANOSSOMÍASES

1.5.1 - DOENÇA DE CHAGAS

O diagnóstico laboratorial deverá ser adequado à forma evolutiva da doença. Tanto

na fase aguda como na crônica podem ser realizados testes parasitológicos e imunológicos.

Os testes parasitológicos compreendem métodos diretos de detecção do parasito, podendo

ser utilizados exame de sangue a fresco, análise de gota espessa e métodos de coloração

pelo Giemsa. Estes métodos são os mais adequados à fase aguda da doença de Chagas por

serem de rápida execução, possibilitando a liberação dos resultados em tempo hábil e

aproveitando o período de alta parasitemia, aumentando com isso a probabilidade do

encontro do parasito no espécime examinado. Entretanto, métodos parasitológicos indiretos

como a cultura de sangue ou material de biópsia em meios de cultura apropriados como o

LIT (Liver Infusion Tryptose) e NNN (Novy, Mc Neal e Nicolle) e o xenodiagnóstico

podem também ser utilizados, porém devido ao tempo de execução dos mesmos, não são

apropriados (Ferreira & Ávila 2001). Quanto aos exames imunológicos utilizados para

diagnóstico na fase aguda do mal de Chagas, utiliza-se a pesquisa de anticorpos anti-T.

cruzi da classe IgM que poderá ser realizado a partir do 15º dia após a infecção, sendo as

metodologias mais utilizadas a reação de imunofluorescência indireta (IFI),

Hemaglutinação Indireta (HAI) e o ensaio imunoenzimático-EIE/ELISA (Enzyme Linked

Immunosorbent Assay)( Ferreira & Ávila 2001).

Já o diagnóstico laboratorial da fase crônica da doença de Chagas, tem como

métodos parasitológicos mais adequados os que utilizam exames indiretos de detecção do

T.cruzi, devido à baixa parasitemia circulante, compreendendo: a hemocultura e

xenodiagnóstico, técnicas que apresentam sensibilidade em torno de 50% (Portela-Lindoso

& Shikanai-Yasuda 2003; Ferreira & Ávila 2001).

Os métodos imunológicos são os mais indicados para o diagnóstico da fase crônica,

uma vez que os níveis de anticorpos se encontram elevados. Na atualidade, os testes

disponíveis são bastante sensíveis, de fácil execução, possibilitando com isso, resultados

mais rápidos. Entretanto, apresentam limitações de desempenho em função dos reagentes

utilizados, dos procedimentos técnicos e critérios de avaliação. A Reação de IFI, HAI e

ELISA são as técnicas de rotina mais freqüentemente utilizadas (Luquetti & Castro 1997).

O inconveniente vem do fato de que os antígenos utilizados são representados por parasitos

íntegros, ou ainda extratos totais ou suas frações (Passos 1997; Ferreira & Ávila 2001),

detectando anticorpos dirigidos contra componentes internos interespecíficos ou estruturas

da superfície do T.cruzi, resultando com isso, reações cruzadas, responsáveis pelos falso-

positivos no caso de infecção por outros tripanossomatídeos como Leishmania spp (Araújo

1986; Umezawa & Silveira 1999) e Trypanosoma rangeli (Basso et al. 1991, Ramirez et al.

1998). Ainda assim, o diagnóstico sorológico é amplamente utilizado com muitos testes

padronizados e de uso comum nos laboratórios de rotina, bem como nos bancos de sangue

com a finalidade de selecionar doadores.

Nas últimas décadas, o aprimoramento dos métodos para obtenção de antígenos

purificados de T.cruzi, obtidos por técnica de DNA recombinante, têm melhorado a

especificidade e a sensibilidade de alguns testes sorológicos (Umezawa & Silveira 1999).

As técnicas de biologia molecular prometem conjuntamente com as anteriores, viabilizar e

aprimorar o diagnóstico desta doença.

1.5.2 – LEISHMANIOSE

Na suspeita de infecção, o diagnóstico principal consiste no isolamento ou na

identificação do parasito em tecidos apropriados. O exame microscópico direto corado pelo

“Giemsa” ou “Leishman” é a forma mais simples e rápida de fazer o diagnóstico de

leishmaniose, utilizando-se para isso, no caso de leishmaniose cutânea e muco-cutânea,

amostras dos tecidos como o raspado das bordas das lesões, aspirado de lesões cutâneas,

esfregaços (“imprints”), e biópsias obtidas por “punch” ou bisturi (Romero et al. 1999;

Navin et al. 1990; Marzochi et al. 1993) e no caso da leishmaniose visceral, material

proveniente da punção de medula óssea, biópsia ou punção de órgãos do sistema fagocítico-

mononuclear como o baço, fígado, linfonodos e ainda, amostra obtida do creme

leucocitário do sangue periférico (Ministério da Saúde, Brasil 2004). Os esfregaços

apresentam positividade que variam de 50% a 80%, dependendo da fase evolutiva da

doença, da técnica utilizada e do investigador, e representam exame essencial no

diagnóstico das leishmanioses (Ferreira & Ávila 2001). Nos casos esplênicos, sua

positividade pode chegar até 100% (Chulay & Bruceson 1983). Seqüencialmente, utiliza-se

o isolamento em cultivo in vitro do parasito. O crescimento se dá dependendo tanto da

espécie do parasito quanto do meio de cultura utilizado (Navin et al. 1990). Vários meios

de cultura estão hoje á disposição dos laboratórios para o isolamento das leishmanias, como

o NNN, o meio LIT, o meio Grace (GRACE´S Insect Médium, Sigma Chemical Co., St

Louis, MD, EUA) e o meio de Drosophila de Schneider, proposto em 1979 por Hendrix &

Wright suplementado por soro fetal bovino. Exames histopatológicos das lesões podem ser

sugestivos, porém pouco específicos, pois não permitem fazer a identificação da forma

amastigota, devido a impossibilidade de visualizar seu cinetoplasto tendo utilidade no

sentido de excluir outras patologias, como doenças granulomatosas, infecções fúngicas e

outras. O diagnóstico imunológico de rotina consiste na realização de testes sorológicos e

do Teste de Montenegro. Este pode ser altamente específico e sensível para a confirmação

do diagnóstico da leishmaniose cutânea e mucosa ativas (Freire et al 2001). O teste de

Montenegro é um teste de hipersensibilidade tardia, com resultado dependente da espécie

de Leishmania utilizada na preparação do extrato antigênico e o conjunto de interações eco-

bio-geográficas do paciente testado (Ferreira & Ávila 2001; Ministério da Saúde 2004).

Este teste que foi introduzido na prática médica em 1926 por Montenegro (Montenegro

1926; Melo et al. 1977), apresenta sensibilidade variando entre 80 e 100% e especificidade

aproximando-se de 100%, daí sua importante aplicabilidade em estudos diagnósticos

retrospectivos e em inquéritos epidemiológicos (Pellegrino & Furtado 1960; Pessoa &

Pestana 1941). A ressalva é feita com relação ao pequeno percentual de inespecificidade

que pode resultar em falso-positivos no caso de pacientes portadores de patologias

alergizantes como a hanseníase (Arantes 1941) e a tuberculose (Correa 1941). Em se

tratando de fase aguda da leishmaniose visceral, o teste de Montenegro resulta sempre

negativo, porém poderá ser utilizado no controle de tratamento, quando haverá positivação

dos resultados.

Os testes sorológicos utilizados para detecção de anticorpos anti-leishmania,

apresentam valores de sensibilidade e especificidade variáveis dependendo da forma

clínica e evolutiva da doença. Na rotina laboratorial, a técnica mais utilizada para

diagnóstico das leishmanioses é a reação de Imunofluorescência indireta, que utiliza

antígenos particulados e apresenta sensibilidade variando de 80 a 95% na leishmaniose

visceral; entretanto, reações cruzadas são freqüentemente verificadas com soros de

pacientes chagásicos, portadores de tuberculose e hanseníse (Camargo & Rebonato 1969,

Ministério da Saúde 2004).

1.5.3 - REAÇÃO CRUZADA NA SOROLOGIA

O diagnóstico sorológico das leishmanioses conta com testes de utilidade clínica

limitada, com baixa especificidade e sensibilidade no caso da forma cutâneo-mucosa,

entretanto de alta sensibilidade no diagnóstico da leishmaniose visceral. O fator limitante se

dá quanto à especificidade, onde podem ocorrer resultados falso-positivos em casos de

infecções assintomáticas por Leishmania spp e também no caso de outras doenças

infecciosas.(Ministério da Saúde 2004).

O diagnóstico sorológico diferencial realizado com antígenos convencionais tem se

tornado difícil em função dos fenômenos de reações cruzadas. A principal conseqüência é a

possibilidade de erro no diagnóstico sorológico de rotina, que apresenta altos percentuais de

reatividade cruzada nas técnicas usuais de IFI, HAI e ELISA (Camargo & Rebonato 1969;

Chiaramonte et al. 1996; Bastrenta et al. 2003).

O desenvolvimento de antígenos específicos com capacidade para distinguir

especificamente soros de pacientes chagásicos crônicos de pacientes com leishmaniose tem

motivado muitas pesquisas. Também têm sido empreendidos estudos no sentido de se

desenvolver técnicas que permitam o diagnóstico com segurança dessas protozooses. Nos

últimos anos, tendo em vista o conhecimento do genoma das leishmanias e do

Trypanosoma cruzi, as técnicas de biologia molecular têm apresentado grandes

perspectivas no avanço diagnóstico, sendo que a possibilidade concreta de amplificação do

DNA pela PCR representa um marco na era dos métodos diagnósticos baseados em DNA

(Romanha 1992). Tornou-se possível a detecção e identificação das formas amastigotas

pelas técnicas moleculares atuais, mesmo estando em pequenas quantidades na amostra a

ser analisada, devido a capacidade de se detectar quantidades mínimas de DNA específico

(Gomes et al. 1998).

Nos métodos diagnósticos imunológicos de rotina, temos como molécula alvo o

antígeno, que é primeiramente identificado pelo anticorpo e somente depois, por uma

seqüência de reações tem o seu sinal amplificado possibilitando assim a sua visualização e

detecção. Na PCR, a molécula alvo é o DNA e parte dele é inicialmente amplificado

milhões de vezes por uma repetição de ciclos de reações. Após este estágio, dá-se o seu

fracionamento em gel e por coloração direta, é então visualizado, aumentando em muito, a

especificidade e sensibilidade diagnóstica (Romanha 1992).

A PCR tem sido utilizada como alternativa diagnóstica tanto em doença de Chagas

quanto em leishmaniose, porém tem seu emprego restrito na rotina, devido à necessidade de

infra-estrutura adequada, reveses relacionados à facilidade de contaminação do DNA e

custo elevado, somando-se a isso a variabilidade de resultados observados em diferentes

regiões do Brasil. No entanto, inovações no protocolo de PCR têm sido apresentadas no

sentido de se adaptar o resultado esperado com o mínimo de equipamentos, à possibilidade

de se trabalhar em sítios distantes dos grandes laboratórios e padronização de técnicas

(Lopez et al. 1993).

Enfim, os procedimentos disponíveis para o diagnóstico dessas protozooses são

baseados em um conjunto de informações que compreendem o tipo de apresentação clínica

da doença e a história epidemiológica do paciente. Na maioria das vezes estes testes

apresentam inconvenientes como consumo elevado de tempo para realização da

metodologia, baixa sensibilidade e requerem condições especiais para a manutenção dos

parasitos. Assim, vários testes bioquímicos, imunológicos e moleculares têm sido

desenvolvidos com a finalidade de detectar e caracterizar espécies de Leishmania em

amostras clínicas. Entre eles, a análise baseada no perfil eletroforético de isoenzimas,

anticorpos monoclonais, análise do kDNA, sondas moleculares específicas para o genoma

nuclear ou mitocondrial (Degrave et al. 1994; Harris et al. 1998).

2. OBJETIVOS

2.1 – OBJETIVOS GERAIS

Estudar o comportamento biológico e molecular de três estoques mistos de Trypanosoma

cruzi/ Leishmania spp isolados de pacientes chagásicos crônicos após terapêutica específica

para a doença de Chagas

2.1.1 – OBJETIVOS ESPECÍFICOS

a) Infectar camundongos Balb/c com os estoques mistos por meio da inoculação

intraperitonial.

b) Confirmar a co-infecção experimental com análise da parasitemia e da hemocultura dos

camundongos inoculados.

c) Confirmar a presença de T. cruzi e Leishmania spp após infecção experimental através

da análise histopatológica dos órgãos necropsiados dos camundongos e através da análise

da sorologia pela IFI.

d) Confirmar a presença de Leishmania spp nos pacientes chagásicos crônicos pós-tratados

para a doença de Chagas, através de sua detecção nas hemoculturas mistas dos pacientes

por meio do método de PCR, caracterizando-a.

DELINEAMENTO EXPERIMENTAL

INOCULAÇÃO EM CAMUNDONGOS

HISTOPATOLOGIA

PARASITEMIA

SUB-GÊNERO

CARACTERIZAÇÃO

MOLECULAR

HEMOCULTURA

SOROLOGIA

PCR - RFLP

GÊNERO

TRÊS ESTOQUES MISTOS T. cruzi/ Leishmania spp

3 – MATERIAL E MÉTODOS

3.1 – ORIGEM DOS ESTOQUES MISTOS

Os estoques utilizados neste estudo foram originados de 60 pacientes chagásicos

crônicos, diagnosticados pela sorologia convencional (IFI, HAI e ELISA). Desses, 38

foram selecionados após avaliação clínica e laboratorial e encaminhados para tratamento

específico que foi realizado no Hospital São Salvador, Goiânia/GO, utilizando-se o

Benznidazol (N-benzil-2-nitro-1-imidazolacetamida), que se encontra no comércio sob o

nome de Rochagan (Roche-Lab. Prod. Químicos e Farmacêuticos S.A.). A administração

foi feita por via oral, na dose de 5-7 mg/Kg/dia durante 60 dias, de acordo com a indicação

da Gerência Técnica do Ministério da Saúde, FUNASA (1997).

Trinta pacientes completaram o tratamento, sendo acompanhados por hemoculturas

seriadas. Durante o exame das hemoculturas, em três delas foram observadas

simultaneamente formas epimastigotas e promastigotas características do Trypanosoma

cruzi e Leishmania spp respectivamente. Estas hemoculturas que apresentaram as formas

mistas de tripanossomatídeos foram numeradas em ordem crescente de acordo com a coleta

de sangue dos pacientes, recebendo as numerações 371, 437 e 438 (Fig. 6). Estas amostras

foram mantidas em meio LIT e criopreservadas. Todos os pacientes envolvidos neste

projeto foram esclarecidos quanto aos objetivos do mesmo, participando somente aqueles

que forneceram autorização para a coleta e utilização do seu sangue e subprodutos. Este

projeto de pesquisa foi submetido ao comitê de ética do Hospital São Salvador–

Goiânia/GO.

No seguimento clínico desses pacientes, foi observado que nenhum deles

apresentava lesão cutânea e/ou sintomatologia compatível com leishmaniose. Foi ainda

realizado o teste de IDR-Montenegro resultando negativo nos três casos.

Figura 6 - Formas evolutivas promastigotas (a e b), coradas pelo Giemsa, isoladas

pela hemocultura (LIT) de pacientes chagásicos crônicos após terapêutica

específica.

3.2 – ESTUDO BIOLÓGICO EXPERIMENTAL

3.2.1 – REATIVAÇÃO DOS ESTOQUES MISTOS EM MEIO LIT

Os estoques mistos, isolados dos pacientes chagásicos crônicos, que estavam

mantidos criopreservados foram retirados do N2 líquido e transferidos diretamente para o

banho-maria a 37ºC e assim permaneceram até o total descongelamento. Em seguida, os

tubos foram abertos e os parasitos observados ao microscópio óptico para análise da

motilidade, como indicativo do sucesso na criopreservação. Esses estoques foram então

distribuídos em tubos Falcon de 10 mL contendo 1,0 mL de meio de cultura LIT na

proporção de 1:1, homogeneizados e mantidos em estufa BOD-FANEM a 26ºC. A

observação do crescimento se deu a cada 48 horas.

3.2.2 – INOCULAÇÃO DOS ESTOQUES MISTOS EM CAMUNDONGOS

Foram utilizados camundongos isogênicos da linhagem Balb/c com idade de 30

dias. Todos do sexo masculino, provenientes do Biotério do Instituto de Patologia Tropical

e Saúde Pública da Universidade Federal de Goiás (IPTSP/UFG/GO).

Os estoques mistos 371, 437 e 438 foram inoculados utilizando-se grupos de três

camundongos Balb/c com idade média de 30 dias em duas etapas.

Na primeira etapa, foram inoculados os estoques mistos que estavam mantidos em

cultura LIT por dois anos em estufa BOD-Fanem a 26ºC.

Na segunda etapa, foram inoculados os estoques mistos que haviam sido

originalmente criopreservados, quando de seu isolamento.

Como controle, foram utilizadas leishmanias de referência da Organização Mundial

de Saúde (OMS): Leishmania (V.) braziliensis (MHOM/BR/1975/M2903) e L. (L.)

amazonensis (IFLA/BR/1967/PH8) e cepa Y de T. cruzi.

Os estoques mistos, cultivados em meio LIT, foram lavados três vezes com solução

fisiológica estéril, centrifugados a 2500 rpm por 10 minutos (T.a.), em seguida

ressuspendidos em salina estéril e os parasitos quantificados em câmara de Neubauer.

Desse material foram inoculados 200 µL por via intraperitonial, o que equivale a

aproximadamente 1,0x105 protozoários. O desenvolvimento de infecção foi avaliado pela

observação da parasitemia tanto qualitativa quanto semiquantitativa (expressa em

quantidade de parasitas por campo microscópico) a cada 48 horas por um intervalo de 90

dias. Tal procedimento foi realizado através do seccionamento da ponta da cauda do

camundongo, com coleta de 10 µL de sangue, que era transferido para uma lâmina de

vidro, coberto pela lamínula 18x18 mm e observado ao microscópio óptico com aumento

de 400X, para acompanhamento da parasitemia (Brenner 1961).

A parasitemia foi observada considerando-se a presença ou não de protozoários uma

vez que o método de observação a fresco não nos permite diferenciar as formas evolutivas

dos parasitos. Entretanto foram feitos esfregaços sanguíneos, corados pelo Giemsa com a

finalidade de posterior análise morfológica dos protozoários em estudo.

3.2.3 - HEMOCULTURA EXPERIMENTAL

Decorridos 90 dias após o inóculo, foi realizada sangria total dos camundongos

através de punção intracardíaca, utilizando-se técnica adaptada no próprio laboratório. Para

o procedimento da punção intracardíaca, os animais foram anestesiados, colocados em

posição de decúbito dorsal e a região torácica desinfetada com álcool iodado. Foi utilizada

seringa heparinizada de 1,0 mL e agulha 13x3 descartáveis. A agulha foi introduzida em

posição paralela à linha do esterno em direção ao lado esquerdo do animal, no

antepenúltimo espaço intercostal, em ângulo de 45º com objetivo de conseguir aspirar do

coração a maior quantidade de sangue possível. Após punção total do sangue, os animais

mortos foram necropsiados, sendo retirados coração, baço e fígado que foram transferidos

para tubos identificados contendo formol 10% e reservados para realização posterior da

histopatologia.

O sangue coletado pela técnica descrita acima, foi centrifugado a 2.500 rpm durante

20 min a 4ºC em centrífuga (Janetzki–K24). O plasma foi removido e mantido sob

refrigeração para se proceder às provas imunológicas. O creme leucocitário foi coletado

com parte do sedimento de hemáceas e semeado em tubo contendo meio de cultura LIT na

proporção de 1/1. Ao sedimento de hemácias foi adicionado igual volume de meio de

cultura LIT. Esses tubos de hemocultura foram mantidos em estufa BOD-FANEN a 26ºC.

Neste momento procedeu-se ainda á realização de esfregaços sanguíneos, com o intuito de

se realizar a pesquisa diferencial de tripanossomatídeos (Chiari et al 1989).

3.2.4 – HISTOPATOLOGIA

De cada camundongo foram obtidos coração, fígado e baço. Estes foram cortados ao

meio no sentido longitudinal com espessura de 5,0 mm e fixados em álcool 70% por 24 h e

então transferidos para o formaldeído tamponado a 10%.

Em seguida, foram desidratados em álcoois, diafanizados em xilol, incluídos em

parafina a quente e confeccionados os blocos. Realizaram-se cortes histológicos seriados

com espessura de 5 m, que foram colocados em lâminas de vidro. Foram feitos dez cortes

de cada órgão. O restante do bloco foi arquivado para estudos futuros. Os cortes foram

corados pela técnica de hematoxilina-eosina (HE) (Junqueira 1983).

As lâminas foram examinadas ao microscópio de luz (Olympus CX-31), com

objetivas de 10, 40, e 100X.

3.2.5 – ANÁLISE SOROLÓGICA EXPERIMENTAL POR TÉCNICA DE

IMUNOFLUORESCÊNCIA INDIRETA (IFI)

3.2.5.1 – OBTENÇÃO DO ANTÍGENO DE IFI

Inicialmente, foi feito o repique da cepa de Leishmania PH8 e da cepa Y de T. cruzi

em meio LIT. Após 72 horas, foi observado o crescimento, e realizada a contagem na

câmara de Neubauer, obtendo o valor em torno de 4,6x108 parasitos/mL. Foi adicionado à

cultura formol 2% em seguida foi incubada em estufa 37ºC por 30 minutos, centrifugados a

3.000 rpm por 15 minutos, o sobrenadante desprezado e o sedimento lavado com tampão

fosfato pH 7.2 por quatro vezes a 3000 rpm por 5 minutos e em seguida, ressuspendido em

tampão. Logo após foram observadas a forma, quantidade e distribuição de parasitos por

campo. Depois, foi distribuído 10 µL em cada orifício das lâminas de vidro demarcadas. As

lâminas foram incubadas a 37ºC por 24 horas com a finalidade de secagem (Camargo

1974). Após a secagem, foram embaladas individualmente em papel alumínio. Cada grupo

de cinco lâminas já embaladas foi envolvido em papel absorvente e armazenadas sob

temperatura de -20ºC em caixa de isopor.

3.2.5.2 – IMUNOFLUORESCÊNCIA INDIRETA (IFI) PARA T. cruzi E

Leishmania spp EM SORO DE CAMUNDONGO

A reação de Imunofluorescência Indireta, segundo Camargo, 1974, foi realizada

com antígenos de T. cruzi, e Leishmania, com a finalidade de detecção dos anticorpos. A

IFI foi realizada com os soros dos camundongos infectados com os diferentes estoques

mistos, em diluição seriada, a partir de 1:5 para detecção de anticorpos da classe IgM e 1:10

para detecção de IgG. Foi usado conjugado fluorescente anti-camundongo (Anti-cadeia

pesada com isotiocianato de fluoresceína - SIGMA) na diluição de 1:200 para o conjugado

anti-IgM e anti-IgG de camundongo.

3.3 - CONFIRMAÇÃO MOLECULAR DA CO-INFECÇÃO

T. cruzi/Leishmania spp

3.3.1 – REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE (Polimerase Chain Reaction,

PCR) PARA IDENTIFICAÇÃO DO SUBGÊNERO Leishmania

3.3.1.1 –EXTRAÇÃO DO DNA DAS AMOSTRAS

As hemoculturas das amostras dos pacientes em meio LIT que se positivaram foram

armazenadas com guanidina na proporção de 1:1 (v/v). A guanidina tem a função de lisar as

células, mas mantém a integridade do DNA. Duas alíquotas de 1,5 mL de cada amostra dos

estoques 371, 437 e 438 foram centrifugadas a 3.000 g por 10 minutos em T.a. Em seguida

foi retirado o sobrenadante com uma micropipeta e acrescentado ao centrifugado 150 µL de

TELT (Tris: 50 mM, pH: 8,0: EDTA: 62,5 mM; pH:9,0; LiCl 2,5 M; Triton X-100 4%).

Foi homogeneizado cuidadosamente e incubado a T.a. por 5 minutos para que o Telt

realizasse sua função de lise celular com rompimento das membranas celulares. Em

seguida, foi adicionado 150 µL de fenol:clorofórmio:álcool isoamílico (25:24:1, Gibco

BRL, Grand Island, NY, EUA), homogeneizou-se no vórtex, agitando-se por 5 minutos,

em seguida centrifugou-se a 14.000 rpm durante 5 min. em T.a. (± 25 °C), para que se

separasse o DNA das proteínas. A fase aquosa contendo o DNA foi coletada e transferida

para tubos novos previamente identificados e a ela foi acrescentado etanol absoluto (Merck,

Rio de Janeiro, RJ, Brasil) na proporção de 1:2 (v/2v), procedeu-se à inversão dos tubos

pelo tempo de 2 minutos. Seqüencialmente incubaram-se os tubos por 60 minutos para que

o DNA se precipitasse. Após esse tempo centrifugou-se por 10 minutos a 3.000 g em T.a.,

depois se procedeu à lavagem, desprezando-se o sobrenadante e adicionando 1,0 mL de

etanol 70% (4.000 g por 5 min. T.a.). Houve nova centrifugação a 4.000 g durante 5

minutos, após o qual desprezou-se o sobrenadante e deixou-se o DNA secar por 10 minutos

a 37°C. A este sedimento foram acrescentados 30 µL de TE (Tris-HCl 10 mM, EDTA 1

mM, pH 8,0) contendo RNAse numa concentração de 50 µg/mL (USB™, Cleveland, OH,

EUA). Seguiu-se incubação das amostras por 60 minutos a 37°C. Procedeu-se a

conservação, sob temperatura de -20°C (Volpini et al. 2004).

3.3.1.2 – AMPLIFICAÇÃO

De acordo com Volpini et al. (2004), procedeu-se o ensaio de amplificação pela

PCR, onde foram utilizados iniciadores que amplificam regiões conservadas, os

minicírculos, do DNA do cinetoplasto (kDNA) de Leishmania spp, produzindo fragmentos

de 120 pb para subgênero Viannia e cerca de 116 pb para subgênero Leishmania; foram

utilizados na reação 1 mM de cada iniciador (150: 5’

GGG(G/T)AGGGGCGTTCT(C/G)CGAA 3’ e 152: 5’ (C/G)(C/G)

(C/G)(A/T)CTAT(A/T)TTACACCAACCCC 3’), 200 mM de dNTPs (utilizando dUTP),

0,4 U de Taq polimerase (Invitrogen, São Paulo, SP, Brasil), tampão composto com Tris-

HCl 10 mM, PH 8,6: KCl 50 mM; MgCl2 1,5 mM e 1 µL da amostra de DNA diluída 1/10

em água milliQ. Procedeu-se a amplificação que foi realizada em termociclador

Mastercycler personal (Eppendorf Reserch,Hamburg, Germany), segundo estudos prévios

(Volpini et al, 2004) que determina as seguintes condições: Nos primeiros 5 minutos, sob

temperatura de 95°C induziu-se a desnaturação inicial da amostra de DNA, seguindo de 34

ciclos de desnaturação a 95°C por 1 minuto, anelamento a 55°C por 30 segundos e extensão

(síntese da fita) a 72°C por 10 segundos, e extensão final a 72°C por 5 minutos. As

amostras amplificadas foram mantidas a 4°C até o momento de sua aplicação em gel de

poliacrilamida 10% (Gibco, EUA) após mistura com o tampão de amostra (Xylenocianol

0,25%, azul de bromofenol 0,25 % e sacarose 40%) na proporção 1:1 (v/v). A migração

eletroforética se deu por 70 minutos a 80 V utilizando o sistema Mini-Protean®3cell

(BioRad, Hercules, CA, EUA). Em seguida procedeu-se a revelação da reação pela

coloração de nitrato de prata. Antes, porém, o gel foi fixado por 10 minutos (solução

fixadora: ácido acético 0,5% em etanol 10%) e depois, corado com solução de nitrato de

prata 0,2% por 15 minutos sob agitação e lavado em seguida com água. Neste momento foi

adicionada a solução reveladora (formaldeído a 0,3% em hidróxido de sódio 0,75 M) para

possibilitar a visualização das bandas.

3.3.1.3 – PCR-RFLP (RFLP, “Restriction Fragment Length Polimorphism”) PARA

IDENTIFICAÇÃO DO SUBGÊNERO Viannia

De modo geral, a PCR-RFLP consiste na associação da PCR com a RFLP, ou seja,

após amplificação de uma região do kDNA na PCR, cortam-se os produtos da amplificação

com enzimas de restrição, gerando perfis que podem ser visualizados em géis.

Procedeu-se à digestão dos produtos positivos na PCR, adicionando-se 1 U da

enzima de restrição Hae III (Invitrogen), por 3 horas a 37ºC. A enzima citada é específica

para o subgênero L. (Viannia) que apresenta sítios de restrição para esta enzima que cliva o

DNA em fragmentos com cerca de 40 e 80 pb. Após a restrição, o produto obtido foi

separado em gel de poliacrilamida 15% no sistema Mini-Protean®3cell (BioRad) e corado

pela prata, conforme descrito no final do item anterior.

4 – RESULTADOS

4.1 – PERFIL DOS PACIENTES CHAGÁSICOS CRÔNICOS DOS

QUAIS FORAM ISOLADOS OS ESTOQUES MISTOS

Os indivíduos em estudo são dois do sexo feminino e um do sexo masculino, com

idade variando de 41 a 57 anos, e de regiões endêmicas para leishmaniose tegumentar e

visceral (Tab. I). A avaliação clínica evidenciou cardiopatia nível I, segundo diagnóstico

realizado pelo Dr. Anis Rassi, no Hospital São Salvador, Goiânia, Goiás, cardiologista,

responsável clínico pela triagem, tratamento e acompanhamento dos pacientes.

Tabela I - Perfil clínico-epidemiológico de três pacientes chagásicos crônicos após-

tratamento específico para doença de Chagas.

PACIENTE

(Estoque misto)

SEXO IDADE PROCEDÊNCIA FORMA CLÍNICA DA

DOENÇA DE

CHAGAS

371 Feminino 41 Ubaí-MG Cardiopatia-I

437 Feminino 56 Anicuns-GO Cardiopatia-I

438 Masculino 52 Ceres-GO Cardiopatia-I

4.2 – ESTUDO BIOLOGICO EXPERIMENTAL

4.2.1 – INFECÇÃO EXPERIMENTAL

Não foi possível detectar parasitos circulantes nos camundongos inoculados com os

estoques mantidos por dois anos em meio LIT, como proposto na primeira etapa do estudo.

Com os estoques inoculados após o descongelamento, foi possível detectar

parasitemia nos animais inoculados com o estoque 371 e nos camundongos inoculados com

a cepa Y, utilizada como controle. Nos camundongos inoculados com a cepa PH8, e a cepa

M, não foi observado parasitemia, alteração clínica, nem morbidade.

A parasitemia nos camundongos inoculados com o estoque 371 ocorreu no 14º dia

pós-inóculo, permanecendo positivo até aos 90 dias, quando foram sacrificados. A cepa Y

de T. cruzi positivou no 7º dia após o inóculo e assim permaneceu até o 16º dia.

4.2.2 – HEMOCULTURA EXPERIMENTAL

Após a sangria intracardíaca, o sangue dos camundongos inoculados com os

estoques mistos em estudo foi semeado em meio de cultura LIT. Todas as hemoculturas

foram observadas semanalmente por 120 dias. Dos três estoques em estudo, somente a

hemocultura do estoque 371 positivou, sendo a positivação observada após 105 dias de

cultivo. Na microscopia, apenas formas epimastigotas foram observadas através de lâminas

coradas pelo Giemsa.

4.2.3– HISTOPATOLOGIA

A microscopia de luz mostrou que na pós-infecção não foi possível detectar

amastigotas nos cortes histopatológicos do coração, fígado e baço dos camundongos

inoculados com os estoques 371 e 438. Entretanto, aqueles infectados com o estoque misto

437 apresentaram ninhos de amastigotas nos cortes cardíacos, característicos de infecção

por T. cruzi (Fig. 7).

Figura 7 – Corte histopatológico de coração de camundongo inoculado com o estoque misto 437.

Seta indicando ninho de amastigotas. Corado pelo HE.

4.2.4 – DIAGNÓSTICO SOROLÓGICO POR IFI

Os níveis séricos de anticorpos produzidos pelos camundongos infectados foram

avaliados por IFI. Houve produção de baixos níveis de anticorpos específicos anti-T.cruzi

pelos camundongos inoculados com os estoques 371 e 437, não foi possível detectar

anticorpos anti-Leishmania em nenhum dos camundongos inoculados, inclusive dos

controles (Tabela II). Os camundongos inoculados com o estoque misto 438 não

produziram anticorpos em quantidades suficientes para serem detectados por IFI.

Tabela II - IFI do sangue dos camundongos inoculados com os estoques

mistos 371, 437 e 438

Estoques

Controles

T.cruzi Leishmania spp

IgM IgG IgM IgG

371 NR 1/80 NR NR

437 1/20 1/40 NR NR

438 NR NR NR NR

PH8 NR NR NR NR

M NR NR NR NR

Y 1/40 NR NR NR

NR - Não Reagente.

4.3 – ESTUDO MOLECULAR DOS ESTOQUES MISTOS

4.3.1 – CONFIRMAÇÃO DA CO-INFECÇÃO T. cruzi/ Leishmania spp

ATRAVÉS DA TÉCNICA DE PCR

A técnica de PCR-RFLP foi utilizada para confirmar a co-infecção T.cruzi/

Leishmania spp a partir dos estoques mistos, 371, 437 e 438 originárias dos pacientes

chagásicos. Inicialmente foi feita PCR para identificar a presença do gênero Leishmania.

Foram utilizados iniciadores que amplificam regiões conservadas dos minicírculos do

kDNA de Leishmania spp, produzindo fragmentos em torno de 120 pb. A visualização dos

fragmentos amplificados foi feita em gel de poliacrilamida 10% após a coloração pela prata

(Fig. 8). Foram utilizados como controles leishmanias de referência da OMS: L. (V.)

braziliensis MHOM/BR/1975/M2903, L. (L.)amazonensis IFA/BR/1967/PH8, L. (L.)

chagasi MHOM/BR/74/PP75, além do controle de T. cruzi cepa Y e controle negativo da

reação. Em seguida, o produto amplificado na PCR sofreu digestão pela enzima Hae III que

possui sítios de restrição específicos para o subgênero Viannia e cliva o DNA em

fragmentos de aproximadamente 40 pb e 80 pb. Na figura nove observamos que L. (V.)

braziliensis foi clivada em dois fragmentos com cerca de 40 pb e 80 pb e que as demais

amostras não foram clivadas, caracterizando que pertencem ao subgênero L. (Leishmania).

Figura 8 – Produto amplificado da PCR para caracterização do gênero Leishmania sp.

Gel de poliacrilamida 10% corado pela prata, 1- Padrão de peso molecular de 25 pb

(Invitrogen), 2 – L. (V.) braziliensis MHOM/BR/1975/M2903, referência da OMS, 3 –

L.(L.)amazonensis IFA/BR/1967/PH8, referência da OMS, 4 – L.(L.)chagasi

MHOM/BR/74/PP75, referência da OMS, 5 - estoque misto 371, 6 - estoque misto 437, 7 -

estoque misto 438, 8 – Controle de T. cruzi, 9 – Controle negativo.

Figura 9 - Produto da PCR tratado com enzima de restrição Hae III para

caracterização do Subgênero L. (Leishmania). Gel de poliacrilamida 15% corado pela

prata. 1 - Padrão de peso molecular de 25 pb (Invitrogen), 2 – L. (V.) braziliensis

MHOM/BR/1975/M2903, referência da OMS, 3 – L. (L.) amazonensis IFA/BR/1967/PH8,

referência da OMS 4 – L. (L.) chagasi MHOM/BR/74/PP75, referência da OMS, 5 –

estoque misto 371, 6 – estoque misto 437, 7 – estoque misto 438.

~120 pb

~80 pb

~40 pb

1 2 3 4 5 6 7 8 9

1 2 3 4 5 6 7

5 - DISCUSSÃO

O nosso país, detentor de grande extensão territorial, com diferenças geográficas,

climáticas e culturais, oferece condições para que cada doença infecto-parasitária tenha um

comportamento próprio de acordo com a localidade onde é notificada.

Muitas vezes, uma determinada região geográfica detém diversas espécies de

vetores e microrganismos convivendo conjuntamente, favorecendo assim a ocorrência de

infecções mistas. Um exemplo disso é a presença simultânea de T. cruzi e Leishmania spp

em zonas endêmicas tanto para a doença de Chagas como para leishmaniose (Barbosa et al.

1984; Chiaramonte et al. 1996; Chiaramonte et al. 1999; Bastrenta et al. 2003).

No presente trabalho, foram estudados três estoques mistos de Trypanosoma cruzi e

Leishmania spp isolados de três pacientes chagásicos crônicos após terapêutica específica

para a doença de Chagas. Esses pacientes apresentavam cardiopatia chagásica nível I, e

eram procedentes das regiões Sudeste e Centro Oeste do Brasil, áreas geográficas comuns

tanto aos triatomíneos quanto aos flebotomíneos. O diagnóstico clínico-laboratorial não

gerou suspeita de co-infecção visto que nenhum dos pacientes apresentava lesões cutâneas

ou qualquer sintomatologia de leishmaniose. Os três receberam tratamento específico para a

doença de Chagas crônica, completando todo o esquema terapêutico proposto. Somente

após o tratamento, ao se realizar a hemocultura para validação terapêutica é que foi

evidenciada a presença simultânea de promastigotas e epimastigotas nessas hemoculturas.

Assim, essas observações iniciais, acompanhadas dos dados clínico-epidemiológicos dos

três pacientes, constituíram no achado determinante que motivou este trabalho que teve

como objetivo a confirmação molecular da infecção mista e o estudo das características

biológicas destes tripanossomatídeos.

As características biológicas dos estoques mistos de T. cuzi/ Leishmania spp foram

avaliadas mediante tentativa de reprodução experimental do ocorrido nos pacientes.

Algumas limitações surgiram no decorrer deste estudo como, por exemplo, o insucesso da

infecção experimental quanto à recuperação de ambos os gêneros envolvidos. Após análise

dos resultados obtidos, verificou-se que somente o gênero Trypanosoma mostrou-se viável

em infectar camundongos Balb/c isogênicos, e ainda assim, apenas quanto aos estoques 371

e 437. Com relação a esse achado, supõem-se alguns fatores envolvidos como,

suscetibilidade do modelo experimental utilizado, adaptação dos parasitos, ou baixa

virulência das espécies envolvidas (Scott 1989). O estoque 438 parece ser de baixa ou nula

infectividade para o camundongo Balb/c isogênico, uma vez que não foi possível a

confirmação parasitológica e imunológica realizada, tanto para doença de Chagas como

para leishmaniose.

O modelo murino Balb/c têm demonstrado eficiência quando se trata de estudos que

avaliam a resposta imune natural envolvendo os gêneros Leishmania e Trypanosoma.

(Scott 1989). Com relação à análise sorológica dos camundongos inoculados com os

estoques mistos ficou evidenciado que em camundongos isogênicos da linhagem Balb/c

inoculados com os estoques 371 e 437 houve formação de anticorpos específicos para a

doença de Chagas, o que foi demonstrado pelos títulos obtidos na IFI. Uma vez que não foi

detectada a presença de anticorpos anti-Leishmania, descartou-se a possibilidade de reações

cruzadas. Os camundongos isogênicos foram inoculados com carga parasitária

potencialmente antigênica para ambas as infecções, representados por inóculos contendo

em torno de 1,0x105 parasitos por mL de amostra provenientes dos estoques mistos.

Apesar de relatos de que o uso da sorologia no diagnóstico da leishmaniose visceral

apresenta como inconveniente o quesito especificidade, devido à possibilidade da

ocorrência de resultados falso-positivos em infecções assintomáticas por Leishmania spp ou

em outras doenças infecciosas, como na doença de Chagas e em pacientes infectados pelo

Trypanosoma rangeli (Ramirez et al. 1998), isto não foi observado neste estudo.

A análise histopatológica dos órgãos necropsiados dos camundongos, não

evidenciou macrófagos parasitados, nem outras células do SMF, o que era esperado, já que

os camundongos não se infectaram com Leishmania spp. A análise dos cortes de fígado e

baço não evidenciou presença de parasitos, entretanto, a análise dos cortes cardíacos dos

animais inoculados com o estoque 437 evidenciou ninhos de amastigotas, característicos da

infecção pelo Trypanosoma cruzi.

Após o insucesso na confirmação de infecção mista através do estudo biológico

experimental, onde foi possível evidenciar somente o gênero Trypanosoma, utilizamos a

PCR técnica otimizada por Volpini et al (2004), específica para confirmação e

caracterização do subgênero L. (Leishmania) e L. (Viannia).

Foi utilizada a técnica de PCR-RFLP (Polimorfismo de comprimento dos

fragmentos de restrição) técnica que tem sido bastante difundida e utilizada desde a década

de 80 para análise de kDNA de tripanossomatídeos (Morel et al. 1980). Esta técnica foi

utilizada com sucesso no presente trabalho, resultando após a digestão dos produtos de

PCR, um perfil que possibilitou diferenciar L. (Leishmania) representado pelos três

estoques mistos e pelo controle de L. (L.) amazonensis e L. (L.) chagasi do controle de L.

(Viannia) que teve seu segmento que foi amplificado na PCR clivado em fragmentos de

aproximadamente 40 e 80 pb, confirmando inequivocamente que o subgênero presente nos

estoques mistos realmente é o subgênero Leishmania. Em comparação, Volpini et al (2004)

testaram diferentes variações da PCR e a análise do perfil específico obtido para L. (L.)

chagasi permitindo a distinção desta espécie em meios de cultura, confirmando ser a

técnica de PCR-RFLP bastante promissora para a utilização em estudos que tenham como

alvo o DNA de Leishmania de amostras clínicas.

Situação similar à apresentada neste trabalho foi observada por Barbosa et al (1984),

que descreveram o isolamento ocasional e uma leishmania do sangue periférico de um

paciente chagásico crônico pós-tratado, no estado de Goiás durante a tentativa de

isolamento de T.cruzi em meio LIT. O grupo observou essa ocorrência em um dentre 250

pacientes chagásicos acompanhados.

A associação entre o T. cruzi e a Leishmania spp já foi comprovada por alguns

autores (Barbosa et al. 1984; Chiaramonte et al. 1996; Bastrenta et al. 2003), demonstrando

que a circulação de Leishmania em indivíduos chagásicos crônicos não é fato raro.

Bastrenta et al (2003) confirmam essa infecção mista pela caracterização de Leishmania

spp através de método de PCR, hibridização e isoenzimas. Este assunto, entretanto, têm

sido motivo de poucos estudos constituindo importante tema de pesquisa, uma vez que o

paciente portador da leishmaniose visceral assintomática, em presença de algum processo

de imunossupressão como a co-infecção com o vírus HIV, tratamento com quimioterápicos

ou mesmo em virtude do tratamento para a doença de Chagas, poderá sofrer agudização da

infecção por Leishmania spp com o desenvolvimento de formas graves da doença. Esse

caráter oportunista poderá ocorrer nos indivíduos imunocomprometidos, justificando uma

investigação mais profunda nos pacientes chagásicos oriundos de regiões endêmicas para

ambas as protozooses, uma vez que o índice de co-infecção observado no presente trabalho,

levando-se em consideração a análise das hemoculturas mistas, foi de 10%, número este

considerável.

A escassez de resultados publicados quanto á infectividade dos estoques mistos de

T. cruzi/ Leishmania spp oriundos de pacientes co-infectados dificulta a comparação dos

resultados obtidos neste trabalho, embora tenha ficado clara a presença concomitante de

ambos os gêneros, infectando um mesmo paciente. A co-infecção T. cruzi/ Leishmania spp

foi confirmada pela caracterização molecular do gênero e espécie L. (Leishmania) presente

nas hemoculturas mistas.

Todavia, ainda não foi possível fazer uma correlação entre os dados obtidos nos

trabalhos que já foram realizados e o estudo das espécies envolvidas ainda é desconhecido.

Estudos futuros de caracterização das espécies envolvidas nas áreas em que a doença de

Chagas e a leishmaniose co-existem possibilitarão maior conhecimento da epidemiologia,

permitindo a avaliação dessa associação T. cruzi/ Leishmania spp relacionando-se os dados

clínicos às espécies prevalentes.

6 – CONCLUSÕES

O gênero Leishmania presente nos três estoques mistos mostrou nula

infectividade para o modelo experimental utilizado, uma vez que não foi

possível recuperar Leishmania, após inoculação dos camundongos

isogênicos Balb/c.

T. cruzi presente nos estoques mistos 371 e 437, mostrou-se infectante

para o modelo experimental utilizado.

A análise da sorologia confirmou a não infecção dos camundongos por

Leishmania spp, devido à ausência de títulos de anticorpos anti-

Leishmania no sangue dos camundongos infectados com os estoques

mistos em estudo.

A presença de Leishmania nos estoques mistos isolados dos pacientes

chagásicos crônicos pós-tratados foi confirmada pela técnica de PCR.

O subgênero L. (Leishmania) estava presente nos três estoques mistos

originados de pacientes chagásicos crônicos pós-tratados para a doença de

Chagas.

7 - REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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