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Struktur- und Funktionsuntersuchungen
von Lichtsammelkomplexen aus dem
Dino�agellaten Amphidinium carterae
Dissertation
zur Erlangung des Grades
eines Doktors der Naturwissenschaften
in der Fakultät für Biologie und Biotechnologie
der Ruhr-Universität Bochum
vorgelegt von
Silke Johanningaus
Remscheid
Bochum
April 2009
Structural- and functional inquiries of Light
Harvesting comlexes from the Dino�agellate
Amphididnium carterae
Dissertation
to obtain the degree
Doctor of natural sciences
at the Faculty of Biology and Biotechnology
Ruhr-University Bochum
submitted by
Silke Johanningfrom
Remscheid, Germany
Bochum
April 2009
Erstgutachter: Prof. Eckhard Hofmann
Zweitgutachter: Prof. Dr. M. Rögner
iv
Keep calm and carry on
(Plakat 1939, Groÿbritannien)
Inhaltsverzeichnis v
Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung 1
1.1 Die Photosynthese . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1
1.2 Lichtsammelproteine . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3
1.2.1 Membrangebundene Lichtsammelkomplexe . . . . . . . . . . . 3
1.2.2 Wasserlösliche Lichtsammelproteine, die Phycobilliproteine . . 5
1.3 Pigmente . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6
1.4 Dino�agellaten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10
1.4.1 Die Chloroplasten der Dino�agellaten . . . . . . . . . . . . . . 11
1.4.2 Die Photosynthese von Dino�agellaten . . . . . . . . . . . . . 12
1.4.3 Lichtsammelproteine von Dino�agellaten . . . . . . . . . . . . 14
Der membrangebundene Lichtsammelkomplex LHC . . . . . . 14
Das lösliche Peridinin-Chlorophyll-a- Protein (PCP) . . . . . . 15
1.5 Ziel der Arbeit . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17
2 Material und Methoden 19
2.1 Material . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19
2.1.1 Chemikalien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19
2.1.2 Pu�er und Lösungen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21
2.1.3 Material und Geräte . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26
Material . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26
Geräte . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28
2.2 Methoden . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30
2.2.1 SDS-Polyacylamid-Gelelektrophorese (SDS-Page) . . . . . . . 30
2.2.2 UV/VIS Spektroskopie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31
2.2.3 Proteinmengenbestimmung von PCP und LHC über UV/VIS
Absorption . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33
2.2.4 Anzucht von Amphidinium carterae (A. c.) . . . . . . . . . . . 33
Inhaltsverzeichnis vi
2.2.5 Anzucht von A. c. unter verschiedenen Lichtbedingungen . . . 34
2.2.6 Ernte von Amphidinium carterae . . . . . . . . . . . . . . . . 35
2.2.7 Aufreinigung LHC aus Amphidinium carterae . . . . . . . . . 35
Membranpräparation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35
Solubilisierung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37
Anionenaustauschchromatographie . . . . . . . . . . . . . . . 37
Gel�ltration . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38
2.2.8 Aufreinigung von PCP aus Amphidinium cartreae . . . . . . . 38
Chromatofokussierung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 39
2.2.9 Gel�ltration . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 40
2.2.10 PCP Proben für Interaktionsstudien . . . . . . . . . . . . . . 40
2.2.11 Rekonstitution von LHC in Lipidvesikel . . . . . . . . . . . . . 40
2.2.12 Ober�ächenplasmonresonanzspektroskopie (SPR) . . . . . . . 42
2.2.13 ATR- FTIR-Spektroskopie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44
2.2.14 Kristallisation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 47
Kristallisation von LHC . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50
Kristallisation von PCP . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 52
2.2.15 Messungen der Proteinkristalle am Di�raktometer . . . . . . 53
2.2.16 Die Auswertung der Datensätze . . . . . . . . . . . . . . . . . 56
XDS Programmpaket . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 56
XDS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 56
XSCALE . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 57
XDSCONV . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 57
SHELX . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 57
CCp4i . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 57
COOT . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 58
3 Ergebnisse 59
3.1 Proteinmengenbestimmung von LHC über UV/VIS Spektren . . . . . 59
3.2 Zellkultur Amphidinium carterae . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 59
3.3 Belichtungstest von Amphidinium carterae . . . . . . . . . . . . . . . 60
3.4 Aufreinigung von LHC aus Amphidinium carterae (A. c.) . . . . . . . 62
3.5 Die Rekonstitution von LHC in Lipidvesikel . . . . . . . . . . . . . . 67
3.6 Interaktionsuntersuchung von LHC und PCP mit SPR . . . . . . . . 70
Inhaltsverzeichnis vii
3.7 FTIR-ATR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 74
3.8 Kristallisation von LHC aus Amphidinium carterae . . . . . . . . . . 78
3.9 Röntgenbeugungsexperimente an LHC Kristallen . . . . . . . . . . . 90
3.10 Die Aufreinigung von PCP . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 101
3.11 Hochaufgelöster Datensatz von PCP aus A. c. . . . . . . . . . . . . . 109
4 Diskussion 114
4.1 Belichtungstest von Amphidinium carterae . . . . . . . . . . . . . . . 114
4.2 Aufreinigung von LHC aus Amphidinium carterae . . . . . . . . . . . 115
4.3 Rekonstitution von LHC in Lipidvesikel . . . . . . . . . . . . . . . . . 116
4.4 Interaktionsuntersuchung von LHC und PCP mit SPR . . . . . . . . 117
4.5 FTIR-ATR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 119
4.6 Kristallisation von LHC aus Amphidinium carterae . . . . . . . . . . 121
4.7 Röntgenbeugungsexperimente an LHC Kristallen . . . . . . . . . . . 122
4.8 Aufreinigung von PCP aus A.c. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 124
4.9 Highresolution Datensatz von MFPCP . . . . . . . . . . . . . . . . . 126
5 Zusammenfassung 129
6 Summary 132
7 Ausblick 134
Literaturverzeichnis 136
Abbildungsverzeichnis 146
Abkürzungsverzeichnis 153
1.1 Die Photosynthese 1
1 Einleitung
1.1 Die Photosynthese
Die Photosynthese ist der Prozess bei dem Sonnenenergie in chemische Energie um-
gewandelt wird. Vereinfacht dargestellt in folgender Bruttoformel:
6 CO2 + 12 H2O + h * ν → C6H12O6 + 6 H2O + 6 O2
(1.1)
Hierbei entsteht der für lebende Organismen wichtige Sauersto�. Auch die klas-
sischen Energiequellen sowie fast alle natürlich vorkommenden organischen Sto�e
haben ihren Ursprung in der lichtgetriebenen CO2 Assimilation [dtv, 1992]. Alter-
nativen zur Energiegewinnung aus Kohle, Öl oder Erdgas nehmen durch die gerin-
ger werdenden natürlich vorkommenden Ressource an Bedeutung zu. Informationen
über die Struktur und Funktionsweise der Komplexe der Photosynthese könnten hier
zu Innovationen in diesem Bereich führen.
Der Ort der Photosynthese bei höheren P�anzen und Algen sind die Chloropla-
sten. Die Kompartimente der Plastiden, die Thylakoide sind bei höheren P�anzen
in Grana- und Stromathylakoide aufgeteilt und enthalten die für die Photosynthese
wichtigen Komplexe, Photosystem I (PSI), Photosystem II (PSII), Cytochrom b6f,
ATP-Synthase und die Lichtsammelkomplexe I und II (LHCI, LHC II)(Abb. 1.1).
Bei der Photosynthese wird Lichtenergie in chemische Energie umgewandelt. Dieser
Prozess wird in zwei Reaktionskaskaden aufgeteilt, der Lichtreaktion bei der ATP
1.1 Die Photosynthese 2
und NADPH gebildet werden (Abb. 1.1) und der Dunkelreaktion in Folge derer
energiereiche Verbindungen entstehen [Helmich, 2002; Kirchho� et al., 2004, 2007;
Nultsch, 1991].
LHC II
Chl a/b
P680 Phe QA QB
P680
PQ
PQH2
Cytb6
FeS
Cytf
LHC I
Chl a/b
P700 A0 A1
P700
Mn
H2O ½ O2 + 2 H+
2 e-
PC
2 H+FD
FD
2 H+
2 H+2 H+
Stroma
Lumen
FAD
2 H+
NADPH/H+NADP
ADP + Pi + ATP
3 H+
PSII PSICytb6f ATP-Synthase
Abbildung 1.1: Die schematische Darstellung der Elektronentransportkette und der ander Photosynthese beteiligten Proteinkomplexe
Bei der Lichtreaktion werden Lichtquanten, von den in den Komplexen gebunde-
nen Pigmenten absorbiert. Diese führen zu einer Anregung des Chlorophylls und
einer nachfolgenden Energieübetragung auf die Reaktionszentren der Photosysteme
[Iwata and Barber, 2004; Horton and Ruban, 2005; de Weerd et al., 2002]. Diese Re-
aktionszentren verfügen über Chlorophylle, die sogenannten special pairs [Ben-Shem
et al., 2003], die in der Lage sind bei Strahlung bestimmter Wellenlängen eine rever-
sible Absorptionsänderung zu erfahren. Die Absorptionsmaxima dieser Paare von
Chlorophyll a liegen im Fall des Photosystems II bei 680, die des Photosystem I
bei 700. Auf Grund dessen werden diese auch als P680 und P700 bezeichnet. Durch
die von den LHCs übertragene Anregungsenergie auf das Reaktionszentrum P680
des Photosystems II wird dieses in den angeregten Zustand überführt und es erfolgt
eine Elektronenübertragung auf ein Phaeophytin a Molekül [Holzwarth et al., 2006].
Das P680 ist ein starkes Oxidationsmittel und kann durch die Spaltung von Wasser
Sauersto� freisetzten, wodurch wieder der Ausgangszustand des Reaktionszentrums
erreicht wird [Ferreira et al., 2004; Rivas et al., 2007]. Das Elektron vom Phaeophy-
tin wird auf ein an das Photosystem gebundenes Plastochinon Qa übertragen. Von
Plastochinon Qa gehen die Elektronen auf Plastochinon Qb über [Demetriou et al.,
1.2 Lichtsammelproteine 3
1988; Iwata and Barber, 2004]. Nach Aufnahme von zwei Elektronen erfolgt eine Elek-
tronenübertragung an den in der Tylakoidmembran lokalisierten Pool von Plastochi-
nonen (ca.7). Nach zusätzlicher Aufnahme zweier Protonen wandert ein nicht an ein
Protein gebundenes Plastochinon (PQH2) innerhalb der Membran zum Cytochrom
b6f Komplex (Cytb6f) [Ben-Shem et al., 2003]. Durch Bindung an der PQ Binde-
stelle Qz werden zwei Elektronen übertragen und zwei Protonen freigesetzt. Diese
Protonen wandern wiederum in den Thylakoidinnenraum. Plastocyanin, ein periphe-
res Protein an der Innenseite der Thylakoidmembran wird durch Cytb6f reduziert
und überträgt die Elektronen auf das P700 im Reaktionszentrum des Photosystems
I. Das so angeregte P700 wirkt als starkes Reduktionsmittel auf den Komplex A0 des
Reaktionszentrums. Dieser überträgt nachfolgend die Elektronen auf den A1 Kom-
plex des Reaktionszentrums I. Dieser Redoxcarrier reduziert das an der Auÿenseite
der Thylakoidmembran liegende Ferredoxin. Von dort gehen die Elektronen auf das
Enzym Ferredoxin-Oxidoreduktase über, welches mittels zweier zusätzlicher Proto-
nen NADP zu NADPH+H+ umwandelt. Dieser gesamte Energietransport vom LHC
bis zur NADP Reduktion wird nichtzyklischer Elektronentransport genannt. Bei ei-
nem hohen NADPH+H+/ NADP Verhältnis erfolgt der zyklische Transport, bei
dem das durch das PS I reduzierte Ferredoxin seine Elektronen auf den Cytochrom
b6f Komplex überträgt [P.Sitte, 1999; Nultsch, 1991].
1.2 Lichtsammelproteine
Es existieren verschiedene Formen von Lichtsammelkomplexen, bei höheren P�anzen
kommen nur die membrangebundenen Lichtsammelkomplexe LHC vor. In Rotalgen
und Cyanobakterien sind die wasserlöslichen Phycobiliproteine die Lichtsammelkom-
plexe. Im Dino�agellaten Amphidinium carterae sind sowohl membrangebundene
LHC wie auch das wasserlösliche Peridinin-Chlorophyll a- Protein (PCP) für die
Lichtabsorption verantwortlich [Formaggio et al., 2001; Ruban et al., 2007].
1.2.1 Membrangebundene Lichtsammelkomplexe
Ein gemeinsames Merkmal aller membrangebundener Lichtsammelkomplexe sind die
drei Transmembranhelices [Kirchho� et al., 2004]. Die Lichtsammelproteine höherer
P�anzen kommen an PSI assoziiert als LHCI oder als Antennenkomplex LHCII vor
1.2 Lichtsammelproteine 4
[Hoober and Eggink, 1999]. Der LHCI leitet nach Lichtabsorption durch gebundene
Chlorophylle seine Energie auf das P700 weiter. Er bildet ein Trimer oder Dimer
aus Polypeptiden, die aus vier verschiedenen Genprodukten bestehen [Ben-Shem
et al., 2003]. Jedes Monomer hat eine Gröÿe von 21-24 kDa [Ben-Shem et al., 2003;
Dunahay and Staehelin, 1985]. Als Teil des PSI bindet er ca. 20 % des gesamten
in der Thylakoidmembran gebundenen Chlorophylls [Zolla et al., 2003]. Der LHCII
Komplex macht 30 % aller Proteine im Chloroplasten aus (Abb. 1.2). Das Trimer
ist ein Polypeptid aus 3 verschieden Genprodukten, LHCb1-3, wobei LHCb1 und
zwei nur im N-Terminus unterschiedlich ist [Kirchho� et al., 2004]. Jedes Monomer
hat ein 232 Aminosäuren umfassendes Polypeptid welches 14 Chlorophylle gebunden
hat.
Stroma
Lumen
Abbildung 1.2: Die Struktur des Lichtsammelkomplexes LHCII aus der Erbse[Standfuss2005]
Der LHCII Komplex überträgt absorbierte Energie auf die Photosysteme [Lyon
and Unwin, 1988]. In den Granathylakoiden erfolgt eine Übertragung der Energie
auf das PSII wodurch dieses Plastochinon reduziert [Nilsson et al., 1997]. Daraufhin
wird LHCII durch eine Phosphokinase phosphoryliert in Folge dessen die Beweg-
lichkeit des Komplexes innerhalb der Thylakoide erhöht wird. Eine Wanderung von
den Grana- in die Stromathylakoide macht eine Energieübertragung auf PSI mög-
lich. Nach einer solchen Energieübertragung erfolgt die Dephoshphorylierung und
ein Zurückwandern in die Granathylakoide [Nultsch, 1991]. Neben der Absorption
von Solarenergie und dessen Transfer haben die Antennenkomplexe auch eine Schutz-
1.2 Lichtsammelproteine 5
funktion durch die gebundenen Carotinoide bei Starklichtbedingungen.
Bislang wurden die Strukturen vom LHC der Erbse (Abb. 1.3) und des Spinates
[Liu et al., 2004] gelöst. Drei Helices durchspannen die Membran und verankern das
Protein in den Thylakoiden [Liu et al., 2004; Standfuss et al., 2005; Zigmantas et al.,
2002]. Die Struktur des Spinates hat eine maximale Au�ösung von 2,72 A und liegt
als Trimer in der Membran vor (Abb. 1.3). Jedes Monomer hat acht Chlorophyll a
und sieben Chlorophyll b Moleküle gebunden. Des Weiteren sind drei Carotinoide
und zwei Lipide gebunden [Helmich, 2002; Liu et al., 2004]. Bei den Carotinoiden
handelt es sich um Lutein, Neoxanthin und Violaxanthin [Peterman et al., 1995;
Salverda et al., 2003]. Das Phosphatidylglycerol und das charkteristische Thylako-
idlipid DGDG stellen die Lipide. Im Gegensatz dazu bindet ein LHC Monomer der
Erbse 14 Chlorophylle, von denen acht Chlorophyll a und sechs Chlorophyll b sind.
Auÿerdem sind hier auch vier statt drei Carotinoide gebunden. Die Au�ösung dieser
Struktur liegt bei 2,5 A (Abb. 1.3).
Abbildung 1.3: Die Struktur des Lichtsammelkomplexes LHCII aus dem Spinat[Liu2004](links) und der Erbse [Standfuss2005] (rechts)
1.2.2 Wasserlösliche Lichtsammelproteine, die Phycobilliproteine
Chromophyten und Rotalgen verfügen über sogenannte Phycobiliproteine die wie
das PCP der Dino�agellaten wasserlöslich sind. Die Grundeinheit ist ein 30-40 kDa
1.3 Pigmente 6
groÿes Monomer an dem z.B. Phycocyanobilin (blau) oder Phycoerythrobilin (rot)
kovalent gebunden ist. Neben diesen gibt es noch Phycobiliviolon und Phycourobilin
[Grossmann et al., 1993]. Sie bilden groÿe Aggregate, die Phycobilisomen, mit einem
Durchmesser von 40 nm und Massen bis zu 15.000 kDa. Die Phycobillisomen sind
stangenförmig auf der Thylakoidober�äche aufgelagert (Abb. 1.4) [Grossmann et al.,
1993; Jiang et al., 2001; P.Sitte, 1999]. Eine Untereinheit besteht aus 15-21 kDa und
hat 3-5 Phylibiline gebunden. Aufgrund unterschiedlicher Absorption von Licht zwi-
schen 450 und 600 nm wird in drei Hauptgruppen unterschieden, in Phycoerythrin
(PE), Phycocyanin (PC) und Allophycocyanin (APC) [Jiang et al., 2001].
PE PC APC
Abbildung 1.4: Schematische Darstellung eines Phycobilisoms
1.3 Pigmente
Zwei Gruppen lichtabsorbierender Pigmente spielen bei der Photosynthese eine groÿe
Rolle. Die Chlorophylle und Carotinoide. Alle Chlorophyllmoleküle haben als Grund-
gerüst ein Porphyrinringsystem mit Magnesium als Zentralatom. Charakteristisch
ist auch ein Propionsäurerest. Eine Unterscheidung in Chlorophyll a (Abb. 1.5), b
und c erfolgt durch Unterschiede in den Substituenten. So ist z.B. bei Chlorophyll
a und b der Propionsäurerest mit Phytol verestert. Das im LHC bei Dino�agellaten
vorkommende Chlorophyll c2 (Abb. 1.6) unterscheidet sich vom Chlorophyll a vor
allem durch das Fehlen des veresterten Phytols (Abb. 1.6) [Lehniger, 1994; Nultsch,
1991; P. Karlson, 1994; P.Sitte, 1999].
1.3 Pigmente 7
Abbildung 1.5: Chlorophyll a
Abbildung 1.6: Chlorophyll c2
Das Chlorophyll a ist das Hauptpigment der Photosynthese und ist in der Lage
nach Anregung Energie weiterzuleiten. Die Anregung von Chlorophyll kann durch
die Einstrahlung von Licht, erfolgen wobei bei einer Wellenlänge von 680 nm das
Pigment in den ersten Singulettzustand (S1)überführt wird. Aus diesem kann eine
Energieweiterleitung erfolgen (Abb. 1.7). Licht der Wellenlänge 440 nm überführt
es in den zweiten Singulettzustand (S2). Aus diesem fällt es schnell in den ersten
Singulettzustand (S1)unter Abstrahlung von Wärme zurück (Abb. 1.7). Das Zurück-
fallen auf den Grundzustand erfordert chemische Arbeit. Ein Zurückfallen vom S1 in
den Grundzustand kann zur Abstrahlung eines Photons führen (Fluoreszenz) oder
es erfolgt ein Übertreten in den Triplettzustand (Abb. 1.7). Dieser ist stabiler als die
1.3 Pigmente 8
anderen und wird bei isoliertem LHC genutzt, um diesen in Experimenten anzuregen
[P.Sitte, 1999; Wikipedia].
S0
S2
S1
Fluoreszenz
Triplett
Wärme
430 nm
680 nm
Abbildung 1.7: Schema der Anregungszustände des Chlorophyll a
Carotinoide sind Tetraterpene, deren konjugierte Doppelbindungen zu einer gel-
ben, roten oder purpurnen Färbung des Moleküls führen. Sie haben neben der Über-
tragung der Anregungsenergie auch eine Schutzfunktion gegen die Photoxidation
des Chlorophylls [Lohr and Wilhelm, 1999; Nultsch, 1991; P.Sitte, 1999]. Die Caroti-
noide werden in zwei Klassen aufgeteilt, den Carotinen und den Xanthophyllen. Die
Carotine sind reine Kohlenwassersto�e deren Grundgerüst immer aus acht Isopren-
einheiten aufgebaut ist. Ein Vertreter dieser Klasse ist das β-Carotin, das Hauptcaro-
tin der P�anzen. Xanthophylle sind Derivate der Carotine die Sauersto� enthalten
und überwiegend aus 40 Kohlensto�en aufgebaut sind [Lehniger, 1994; P. Karlson,
1994]. Ein Beispiel ist Fucoxanthin welches für die charakteristische Färbung der
Diatomeen verantwortlich ist. Die Xanthophylle Peridinin und Dinoxanthin sind für
Dino�agellaten spezi�sch (Abb. 1.8, 1.9) [Je�rey and Haxo]. Das Peridinin kommt
in den verschiedenen Lichtsammelproteinen vor und bestimmt neben Chlorophyll
die charakteristische Färbung der Komplexe.
1.3 Pigmente 9
O
O
O
OH
OH
O
O
Abbildung 1.8: Peridinin [Botanik online 2005]
Abbildung 1.9: Diadinoxanthin [Botanik online 2005]
Das Hauptcarotinoid der Dino�agellaten, das Peridinin ist auch durch eine kon-
jugierte Carbonylgruppe gekennzeichnet. Nach Anregung geht dieses Carotinoid in
den zweiten Anregungszustand S2 über. Aus dem S2 Zustand kann der S1 Zustand/
bzw. der hier angenommene intramolekulare Transfer ITC erreicht werden. Durch
Zurückfallen in den Grundzustand kommt es zu einer Emittierung von Licht in Form
von Fluoreszenz (Abb. 1.10) [Macpherson and Hiller].
Peridinin
S0
S2
S1/ITC
FluoreszenzFluoreszenz
Abbildung 1.10: Schema der Anregungszustände des Peridinin
1.4 Dino�agellaten 10
1.4 Dino�agellaten
Dino�agellaten (Dinophyta) bilden einen Teil des Phytoplanktons [Taylor, 1987]
und sind bekannt durch die red tides, ein verstärktes Wachstum von Zellen, welches
zu einer Rotfärbung der Wasserober�äche führt, die z.B an der Küste von Florida
vorkommen und für im Wasser lebende Tiere eine tödliche Bedrohung durch Aus-
scheidung von Toxinen darstellen [Schrope, 2008]. Es ist eine Gruppe verschiedener
eukaryotische Einzeller die in Süÿ- und Salzwasser vorkommen und sowohl freilebend
wie auch als Symbionten auftreten [Taylor, 1987]. Viele Vertreter sind photosynthe-
tisch aktiv. Die freischwimmende Zelle, die sogenannte Mastigote, ist eiförmig bis
birnenförmig mit zwei Flagellen (Abb. 1.11)[Taylor, 1987].
Abbildung 1.11: Schematische Darstellung einer freischwimmenden Dino�agellatenzelleLF: longitudinale Flagella, TF: transversale Flagelle, M: Mitochondrium, Cp: Chloroplast,Cr: Chromosom, N: Nucleus, Pu: Pusules, V: Vakuole [Taylor1998]
1.4 Dino�agellaten 11
Diese können an unterschiedlichen Positionen der Zelle sitzen, werden jedoch im-
mer in eine longitudinale, hauptsächlich für die Orientierung verantwortliche Flagelle
und eine transversale, eine Geiÿel für die Fortbewegung, unterschieden[Taylor, 1987].
Alle Zellen sind von einer Auÿenmembran umhüllt, die die Flagellen bindet[Taylor,
1987]. Die Auÿenmembran kann aus Zelluloseplatten bestehen die dann einen soge-
nannten Panzer bilden[Taylor, 1987]. Amphidinium gehört zur Gruppe der sogenann-
ten �nackten Zelle” bei denen dieser Panzer fehlt. Unter der äuÿeren Membran liegt
eine Einzelschicht �acher Vesikel unterhalb derer Mikrotubuli zu �nden sind[Taylor,
1987]. Als Zellkompartimente verfügen alle Dinophyta über einen Zellkern, Mitochon-
drien, einen Golgi Apparat, eine Vakuole und vakuolenähnliche Strukturen, den Pu-
sules [Taylor, 1987]. Der Zellkern ist von zwei mit Poren durchzogenen Membranen
umhüllt und enthält permanent kondensierte Chromosomen�brillen [Taylor, 1987].
Ein weiteres Charakteristikum dieser Art ist das Fehlen von Nukleosomen und die
nur bei diesen Eukaryoten vorkommende Nucleinbase 5-Hydroxymethyluracil (HO-
MeU) [Howe et al., 2008]. Alle photosynthesebetreibenden Arten besitzen Chloropla-
sten als Ort der Photosynthese. Einzigartig für diese Organismen ist das Carotino-
id Peridinin, welches im membrangebundenen Lichtsammelkomplex LHC und dem
löslichen Lichtsammelkomplex Peridinin-Chlorophylla Protein gebunden vorliegen
[Taylor, 1987]. Amphidinium carterae ist ein gut untersuchter Vertreter dieser Klas-
se und produziert das Toxin Haemolysin A [Nayak et al., 1997] und Cholinderivate,
die toxisch auf Fische und Mäuse wirken (Shimizu).
1.4.1 Die Chloroplasten der Dino�agellaten
Chloroplasten sind Organellen, die bei höheren P�anzen und Algen den Ort der
Photosynthese darstellen. Sie entstanden bei Dino�agellaten durch sekundäre Endo-
symbiose, besitzen jedoch nur drei statt vier Auÿenmembranen [Howe et al., 2008;
Patron et al., 2005; Wang et al., 2005]. Des Weiteren unterscheiden sich die Plastiden
aus der Klasse der Dino�agellaten grundsätzlich von denen anderer photosyntheti-
scher Organismen durch die starke Reduktion des Plastidengenoms [Barbrook et al.,
2006; Howe et al., 2008]. Anders als in höheren P�anzen, wo die Hälfte der Chloro-
plastenproteine durch dessen Genom kodiert werden, sind hier nur kleine Plasmide
vorhanden [Barbrook et al., 2006; Howe et al., 2003, 2008; Laatsch et al., 2004; von
Wettstein, 2001]. Diese enthalten Gene für den Cytochrom b6f-Komplex, die ATP-
1.4 Dino�agellaten 12
Synthase sowie für Untereinheiten der Photosysteme I und II [Howe et al., 2008].
Die Kompartimente der Chloroplasten werden Thylakoide genannt und bestehen
zum gröÿten Teil aus den Galactolipiden Monogalactosydiacylglycerol (MDGD) und
Digalactosyldiacylglycerol(DGDG) [Dörmann and Benning, 2002; Dörmann, 2005;
Heise and Jacobi, 1973; Ongun et al., 1968] und enthalten die Komplexe der Pho-
tosynthese. In höheren P�anzen sind diese in Grana- und Lammellenthylakoiden
organisiert. Die Plastiden der Dino�agellaten weisen nur Lammelenthylakoide auf.
Diese liegen parallel angeordnet im Chloroplasten und sind bei Amphidinium car-
terae aus jeweils drei nahe beieinanderliegenden Thylakoiden aufgebaut (Abb. 1.12)
[Taylor, 1987].
Abbildung 1.12: Der Chloroplasten von Amphidinium carterae [Taylor 1998]
1.4.2 Die Photosynthese von Dino�agellaten
Der Photosyntheseapparat entspricht bei Dino�agellaten prinzipiell dem von höhe-
ren P�anzen und Algen. Die Photosysteme sind �ankiert von membrangebundenen
Lichtsammelkomplexen (LHC) in die Membran eingebettet. Am LHC Komplex sind
lösliche Lichtsammelkomplexe assoziiert, die bei Dino�agellaten PCP Komplexe sind.
Ein Modell der Anordnung der Komplexe der Photosynthese ist in der Abbildung
1.4 Dino�agellaten 13
dargestellt (Abb. 1.13).
Abbildung 1.13: Der Photosyntheseapparat in der Thylakoidmembran vonDino�agellaten
In der photosynthetischen Einheit (Abb. 1.14) erfolgt die Anregung der Photosy-
steme über Lichtabsorption des LHCs, der die Energie auf die Chla des PSI und
PSII überträgt. Der integrale Membrananteil des Komplexes ist verbunden mit PSI
und II während der Teil im Lumen nahe dem PCP liegt.
Abbildung 1.14: Ein Modell der photosynthetischen Einheit PSU [Govindjee et all 1979]
1.4 Dino�agellaten 14
1.4.3 Lichtsammelproteine von Dino�agellaten
Photosynthetisch aktive Dino�agellateten verfügen neben einem membrangebunde-
nen Lichtsammmelkomplex, dem LHC, auch über einen löslichen Komplex, das PCP.
Beide Komplexe haben eine groÿe Anzahl an Pigmenten gebunden welche zu einer
charakteristischen Färbung der Komplexe wie auch der Zellen führt. Die Transkripti-
on der Lichtsammelkomplexe ist dahingehend von der einwirkenden Lichtintensität
abhängig, dass eine Steigerung der Transkriptionsrate bei Schwachlichtbedingungen
(20 µ E) um das dreifache im Vergleich zu Starklichtbedingungen (100 µE) erfolgt
[ten Lohuis MR and Miller, 1998; Roman et al., 1988; Samuelsson and Richardson,
1982]. Der Anteil des PCPs an der Gesamtproteinmenge kann daraufhin von 2 % auf
bis zu 50 % steigen, was auch Ein�uss auf die Färbung der Zellen hat [ten Lohuis MR
and Miller, 1998].
Der membrangebundene Lichtsammelkomplex LHC
Der membrangebundene Lichtsammelkomplex LHC von Amphidinium carterae ist
unabhängig von Photosystemen isolierbar und mit den LHCs von Chromophyten
und den CAb Proteinen verwandt. Die gröÿte Übereinstimmung �ndet sich mit dem
FcP von Phaedactylum [Hiller et al., 1995]. Er verfügt wie alle membrangebundenen
LHCs über drei die Membran durchspannende Helices. Der als Trimer vorkommen-
de Komplex wird durch eine Multigenfamilie kodiert. Das Apoprotein ist 19 kDa
groÿ [Hiller et al., 1995] und bindet 11 Chlorophylle und 10/12 Carotinoide. Des
Weiteren sind zwei Lipidmoleküle gebunden [Hiller et al., 1993]. Im Gegensatz zu
höheren P�anzen sind neben 7 Chlorophyll a Molekülen 4 Chlorophyll c anstelle
von Chlorophyll b Moleküle gebunden [Hiller et al., 1993]. Auch die groÿe Anzahl
von Carotinoiden unterscheidet diesen LHC gegenüber dem von höheren P�anzen.
Hierbei handelt es sich um das Xanthophyll Peridinin, welches neben der Schutz-
funktion im Komplex auch eine Lichtsammelfunktion übernimmt. Das Lipid ist das
für Dino�agellaten charakteristische Diadinoxanthin.
Innerhalb des LHC erfolgt ein Energietransfer vom Peridinin auf die Chlorophylle a
und c. Das angeregte Chlorophyll c überträgt seine Energie auf das Chlorophyll a.
Von hier erfolgt eine Übertragung auf die Photosysteme [Polívka et al., 2006].
1.4 Dino�agellaten 15
Peridinin Chlorophyll aS0 S0
Qy
S2
S1/ITC
Qx
Fluoreszenz FluoreszenzFluoreszenz
Chlorophyll c2S0
Qy
Qx
Abbildung 1.15: Energietransfer innerhalb des LHCs von A. c.
Das lösliche Peridinin-Chlorophyll-a- Protein (PCP)
Der lösliche Lichtsammelkomplex der photosynthetischen Dino�agellaten wird als
Peridinin-Chlorophyll-a-Protein (PCP) bezeichnet und liegt im Lumen der Thyla-
koide. Er liegt als Trimer vor und weist durch den hohen Anteil an Perdinin eine
rote Färbung auf. Die PCP Formen innerhalb der Klasse der Dino�agellaten sind in
ihrer DNA-Sequenz sehr ähnlich [Sharples et al., 1996]. PCP kann in verschiedenen
Zusammensetzungen vorkommen. Zum einen als Monomer mit einem 32 kDa groÿen
Apoprotein, mit gebundenen acht Peridininen, zwei Chlorophyll a Molekülen und
zwei Lipiden [Sharples et al., 1996]. Andererseits als Homodimer mit einem Apo-
protein von 16 kDa. Das nur bei Amphidinium carterae auftretende High salt PCP
(HSPCP) mit einem Apoprotein von 34 kDa unterscheidet sich in der Pigmentzu-
sammensetzung und in der Absorption im UV/VIS Spektrum [Ilagan et al., 2004;
Schulte et al., submitted]. Die Hauptform von PCP ist aus Monomeren mit einer
Gröÿe von 32 kDa aufgebaut und hat einen pI von 7,5. Sie stellt 90 % des gesam-
ten PCPs (Abb. 1.16). Neben dieser Hauptform existieren Isoformen des Komplex
mit einem pI von 4,0 bis 8,0 [Haxo et al., 1976]. Neben dem gleichen Gewicht sind
auch die Aminosäuresequenzen und die gebundenen Chromophoren nicht signi�kant
1.4 Dino�agellaten 16
unterschiedlich. Im UV/VIS Spektrum sind keine Unterschiede feststellbar. Eine Un-
terscheidung ist nur im pI möglich [Haxo et al., 1976]. Alle sind reich an Alaninen
und besitzen keine Cysteine.
Abbildung 1.16: Die Struktur der Hauptform von PCP [Hofmann et al., 1996].
Der Energietransfer innerhalb von PCP erfolgt vom Peridinin zum Chlorophyll
[Linden et al., 2004; Polívka et al., 2007; Zigmantas et al., 2002]. Nach Anregung
durch Licht wird das Peridinin in den zweiten Singulettzustand angehoben[Polívka
et al., 2007; Zigmantas et al., 2002]. Von hier aus erfolgt eine Energieübertragung auf
das Qx des Chlorophylls, welcher 25 % des gesanmten Energietransfers ausmachen.
Aus dem S2 Zustand kann das Peridinin in den S1/ITC Zustand zurückfallen [Linden
et al., 2004; Polívka et al., 2007; Zigmantas et al., 2002]. Aus diesem wird wieder-
um Energie auf Chlorophyll übertragen, hier auf den Qy- Anteil des Chlorophylls
[Polívka et al., 2007; Zigmantas et al., 2002]. Eine Weiterleitung von Energie auf
das Chlorophyll a in den membrangebundenen Lichtsammelkomplex ist aufgrund
1.5 Ziel der Arbeit 17
der Anordnung der Proteine zueinander sehr wahrscheinlich.
Peridinin Chlorophyll aS0 S0
S2
S1/ITC
Fluoreszenz FluoreszenzFluoreszenz
Abbildung 1.17: Energietransfer innerhalb des PCP
Die Struktur der Hauptform bei 2 A (Abb. 1.16) zeigt eine enge Assoziation von
Peridininen und Chlorophylllen und hat die oben beschriebene Zusammensetzung
[Hofmann et al., 1996]. Die HSPCP Struktur hat eine Au�ösung von 2,1 A und
zeigt die auch in MFPCP vorkommende pseudozweizählige Symmetrie [Schulte et al.,
submitted]. Trotz der geringen Sequenzidentität zeigt die Struktur groÿe Ähnlichkeit
mit der Hauptform[Schulte et al., submitted]. Der gröÿte Unterschied liegt in dem
Verlust eines Peridinins bei HSPCP [Schulte et al., submitted].
1.5 Ziel der Arbeit
Im Rahmen dieser Arbeit sollten mehr Informationen über Grundlagen der Photo-
synthese am Beispiel von Lichtsammelkomplexen aus A.c. erhalten werden.
Neue Erkenntnisse über den Enerieübertragungsweg sollten durch eine biochemische
Charakterisierung der molekularen Interaktion zwischen dem löslichen und dem int-
rinsischen Lichtsammelkomplex gewonnen werden. Hierzu war eine Etablierung und
1.5 Ziel der Arbeit 18
nachfolgende Optimierung der Rekonstitution von LHC in Lipidvesikeln nötig.
Auch sollte der Ein�uss von Licht auf die Zellen und die Bildung der Lichtsammel-
komplexe durch Belichtungstest an Zellkulturen untersucht werden.
Voraussetzung für Informationen der Lichtsammelkomplexe auf atomarer Ebene
durch Röntgenstrukturanalyse sind Proteinkristalle. Innerhalb der vorangegangenen
Diplomarbeit konnten Kristallschauer oder stark verwachsene Kristalle von LHC ge-
züchtet werden. Auf diesen Ergebnis aufbauend sollten Einkristalle gezüchtet werden,
die zu Datensätzen für die Strukutraufklärung führen sollten. Eine Verbesserung
der Strukturinformationen der Pigmente sollten über eine hochaufgelöste MFPCP
Struktur erhalten werden. Der dafür benötigte optimierte Screen wurde während der
Diplomarbeit entwickelt.
Weitere Informationen über Anzahl und Art der Isoformen von PCP sollte zum einen
durch eine Optimierung der Aufreinigung aus der Diplomarbeit erreicht werden. Zum
anderen sollten Gröÿenbestimmungen und die Untersuchung durch UV/VIS Spek-
troskopie Informationen über durch die Chromatofokussierung erhaltenen Peaks hin-
sichtlich der Isoformen liefern.
2.1 Material 19
2 Material und Methoden
2.1 Material
2.1.1 Chemikalien
Acrylamidstock (30 %) AppliChem, Darmstadt
ADA Sigma, Steinheim, Lotnr.:121K5430
Al�s Öl Hamton Research, Aliso Viejo (USA),
Lotnr.:341712
Aluminiumkaliumsulfatdodecahydrat
(AlKSO4x12H2O)
Merck, Darmstadt
Ammoniumperoxodisulfat (APS) Merck, Darmstadt
Ammoniumacetat Fluka, Neu-Ulm, Lotnr.:424076/144701
B12 (Vitamin) Fluka, Neu-Ulm
Biobeads SM2 Biorad, München
Biotin Fluka, Neu-Ulm
Bis-Tris Propane Sigma, Steinheim, Lotnr.:085K5450
Borsäure J.T. Baker, Groÿ-Gerau
Bromphenolblau Merck, Darmstadt
BSA (Albumin Fraktion V, biotinfrei) Roth, Karlsruhe
Cadmiumsulfat Fluka, Neu-Ulm,
Lotnr.:455190/110807023
Calciumchlorid Fluka, Neu-Ulm,
Lotnr.:125183823807054
Coomassieblue AppliChem, Darmstadt
β-n-Decylmatosid Biomol, Hamburg
EDTA (Titriplex III ) Merck, Darmstadt
Eisen-(II)-sulfat Riedel-de Haen, Seelze
2.1 Material 20
Essigsäure J.T. Baker, Groÿ-Gerau
Ethanol J.T. Baker, Groÿ-Gerau
Glycerin J.T. Baker, Groÿ-Gerau
HEPES Natriumsalz Sigma, Steinheim, Lotnr.:076K5429
JBScreen Heavy Jenabbioscience, Jena
Kaliumchlorid (KCl) J.T. Baker, Groÿ-Gerau
Kobaldchlorid (CoCl2x 6H2O) Merck, Darmstadt
Lithiumsulfat Fluka, Neu-Ulm, Lotnr.:131981212807167
Low Range Marker Biorad, München
Magnesiumacetat Fluka, Neu-Ulm, Lotnr.:135577723507149
Magnesiumchlorid (MgCl2x 6H2O) J.T Baker, Groÿ-Gerau
Magnesiumchlorid Fluka, Neu-Ulm, Lotnr.:133280833907273
Manganchlorid (MnCl2x 4H2O) Merck, Darmstadt
β-Mercaptoethanol Merck, Darmstadt
MPD Fluka, Neu-Ulm
Natriumacetat Fluka, Neu-Ulm, Lotnr.:135320943707195
Natriumchlorid Fluka, Neu-Ulm, Lot.:134432343107167
Natriumcacodylat Fluka, Neu-Ulm, Lotnr.:132123224507201
Natriumcacodylat Sigma, Steinheim, Lotnr.:103K0036
Natriumcitrat Fluka, Neu-Ulm
Natriumglycerinsulfat Sigma Aldrich, Taufkirchen
Natriumglycerolphosphat Sigam, Taufkirchen
Natriumnitrat J.T.BAker, Groÿ-Gerau
Natrumphosphat Fluka, Neu-Ulm, Lotnr.:135267913607074
Para�nöl Hamton Research, Aliso Viejo (USA), Lot-
nr.:341712
Phenylsulfonyl�uorid (PMSF) AppliChem, Darmstadt
Phosphatidylcholin siehe Sojalecithin
Phosphorsäure J.T Baker, Groÿ-Gerau
Polypu�er 96 Ge Healthcare, München
Polyethylenglykol (PEG) 400 Fluka, Neu-Ulm
Polyethylenklygol 600 Fluka, Neu-Ulm
Polyethylenglykol 1500 Fluka, Neu-Ulm
Polyethylenglykol 2000 Fluka, Neu-Ulm
2.1 Material 21
Polyethylenglykol 8000 Fluka, Neu-Ulm
Reef Salt Aqua medic, Bissendorf
Serva Blue G250 AppliChem, Darmstadt
Sodiumdodecylsulfat(SDS) AppliChem, Darmstadt
Sojalecithin aus der Sojabohne Applichem, Darmstadt
Sticksto�(�üssig) Chemikalienlager, Bochum
Stickso� (gasförmig) Chemikalienlager, Bochum
Sucrose AppliChem, Darmstadt
Temed Merck, Darmstadt
Thiamine HCL Sigma Aldrich, Taufkirchen
Tricine AppliChem, Darmstadt
Trilon B (Na4EDTA) BASF, Ludwigshafen
tri-Natrium citrate Fluka, Neu-Ulm, Lotnr.:134165243107170
TRIS-HCL Sigma, Seelze, Lotnr.:116K5446
Tris (Trizima base) Sigma Aldrich, Taufkirchen
Zinksulfat (ZnSO4x7H2O) Riedel-de Haen, Seelze
QSepharoseXL Ge-Healthcare, München
2.1.2 Pu�er und Lösungen
APS 10 % 0,01 l
1 g APS
Bradfordreagenz 1 l
0,1 g Serva Blue G250
0,1 l 85 % (v/v) ortho-Phosphorsäure
0,0467 l Ethanol
Lösung mischen und dann durch einen
Whatmannpapier�lter �ltrieren. Lagerung in
brauner Glas�asche bei Raumtemperatur
Coomassiefärbelösung 1 l
20 % Essigsäure
0,2 % Coomassieblue
80 % A.dest
2.1 Material 22
Eisenchelatlösung 0,9 l
7,45 g EDTA
0,9 l A.dest
20 min. rühren
3,02 g Eisen(II)sulfat zugeben
rühren bis die Lösung klar ist, steril�ltrieren, La-
gerung unter Lichtausschluÿ bei RT
Elektrophoresepu�er
zehnfach
1 l
144 g Glycin
30 g Tris pH 8,6 -8,8
10 g SDS
Elutionspu�er 0,49 l
0,035 l Polypu�er 96
0,455 l A.dest
Entfärber
10 % Essigsäure
10 % Ethanol
80 % A.dest
LHCP1 1 l
50 mM Tricine pH 7,5
20 mM KCl
LHCP2 1 l
20 mM Tricine pH 7,5
20 mM KCl
LHCP3 0,5 l
20 mM Tricine pH 7,5
0,16 % DM
LHCP4 0,25 l
20 mM Tricine pH 7,5
500 mM KCl
0,16 % DM
LHCP5 0,5 l
20 mM Tricine pH 7,5
150 mM KCl
0,16 % DM
2.1 Material 23
Meerwasser 10 l
10 l A.dest
333,33 g reef salt
über Nacht mit Aquariumpumpe gelöst und be-
gast, autoklaviert
Macronutriens 1 l
5,5 g Natriumnitrat
8,0 g Tris pH 8,2
0,54 g Natriumglycerolphosphat
Lösung autoklavieren
Micronutriens 1 l
1,145 g Borsäure
0,00788 l Eisenchelatlösung
0,004 g Kobaldchlorid
0,144 g Manganchlorid
1,120 g Trilon B
0,023 g Zinksulfat
Lösung autoklavieren
Parvasoli�s enriched sea
water (PES)
1 l
1 l Meerwasser
0,01 l Macronutriens
0,01 l Micronutriens
0,00001 l Vitamine
0,00032 l Eisenchlelatlösung
2.1 Material 24
PCPP1 1 l
1 mM Tris pH 8,3
PCPP2 1 l
1 mM Tris pH 8,3
250 mM NaCl
PMSF-Stocklösung
0,05 g PMSF
0,001 l Ethanol p.a.
Sammelgelpu�er 1 l
0,5 M Tris pH6,8
Sammelgel 2 Gele
1,25 ml Sammelgelpu�er
0,05 ml 20 %SDS
0,65 ml Acrylamidstock
3,10 ml A.dest
0,005 ml Temed
0,025 ml 10% APS
Säulenreinigunslösung 1 l
2 % LDAO
0,5 M NaOH
2 M NaCl
20 % Ethanol
2.1 Material 25
Startpu�er 1 l
25 mM Tris pH 10
SDS-Lösung 20% 0,1 l
20 g Sodiumdodecylsulfat
in 100ml A.dest lösen
SDS-Marker Probenpu-
fer Stammlösung
4,8 ml A.dest
1,2 ml 0,5 M Tris-HCl pH 6,8
1 ml Glycerin
10 % (w/v) SDS
0,1 % (w/v) Bromphenolblau
1: 20 mit β-Mercaptoethanol mischen
SDS-Probenpu�er zwei-
fach
0,095 l
0,02 l 20 % SDS
0,025 l Sammelgelpu�er
0,04 l Glycerin
1 Spatelspitze Bromphenolblau
SDS-Probenpu�er zwei-
fach + β Me
0,5 ml
0,475 ml 2x SDS-Probenpu�er
0,025 ml β-Mercaptoethanol
Sucrosegradienten 30%
120 g Sucrose
280 g Pu�er LHCP2
32 ml Lösung in SW28 Röhrchen überführt und
bei -20°C eingefroren und gelagert
vor Gebrauch bei Raumtemperatur aufgetaut
2.1 Material 26
Trenngelpu�er 1 l
1,5 M Tris pH 8,8
Trenngel 2Gele
3,75ml Acrylamid
3,6ml A.dest
0,037ml 10% APS
0,075ml 20%SDS
0,0015ml Temed
3,75ml Trenngelpu�er
Vitaminlösung 100ml
0,016 g Biotin
0,200 g Thiaminhydrochlorid
0,016 g Vitamin B12
Lösung steril�ltriert
2.1.3 Material und Geräte
Material
CryoCap mit DatenMatrix Molecular DimensionLimited, Su�olk
(GB)
Crystalwand Hamton Reasearch, Aliso Viejo(USA)
Erlenmeyerkolben Schott, Mainz
Falkontubes Corning, Hagen
Filter 0,2µm Sarstedt, Nümbrecht
Fleischerkisten 35l Korten, Bochum
Gel�ltrationssäule HR10/60 Amersham Biosciences, Freiburg
Germaniumkristall ACM, Paris (Frankreich)
Glas�aschen (Blue cap) Schott, Mainz
Kristallisationsplatten
24well Hampton Research, Aliso Viejo (USA)
Stripes Douglas Instruments, Hungford (USA)
3550 corning (Roboter) Corning Incorporated, Corning(USA
Konzentratoren MiliQ Milipore, Schwalbach
Konzentratoren Vivaspin Sartorius, Göttigen
2.1 Material 27
Kristallisationsscreens:
MB class Quiagen, Hilden
MB class II Quiagen, Hilden
PEG Quiagen, Hilden
Cryo Quiagen, Hilden
Classic Quiagen, Hilden
SM1 Quiagen, Hilden
SM2 Quiagen, Hilden
JCSG Quiagen, Hilden
Memfac Hamton Research, Aliso Viejo (USA)
Lampen: 34883 F18W/54 daylight (An-
zucht)
GE Healthcare, München
Loops Nylon Hamton Research, Aliso Viejo(USA)
Litholoops Molecular Dimension Limited, Su�olk
(GB)
Loops Micromounts MiTeGen, Ithaca (USA)
Magnetic Cryovial Molecular DimensionLimited, Su�olk
(GB)
Quarzküvetten Hellma, Mülheim
Säule Superdex 200 HR 16/60 GE Healthcare, München
Säule Superdex 200 HR 16/30 GE Healthcare, München
Säule XK 16/20 Leersäule GE Healthcare, München
Säule XK 26/20 Leersäule GE Healthcare, München
Säule C 16/100 Leersäule GE Healthcare, München
Säule C 16/40 Leersäule GE Healthcare, München
Säule Hitrap-QXL 1 ml GE Healthcare, München
Säule Hitrap-DEAE 1 ml GE Healthcare, München
Säule Hitrap-Source15S 1 ml GE Healthcare, München
Säulenmaterial DEAE GE Healthcare, München
Säulenmaterial PBE94 Polypu�erAustau-
scher
GE Healthcare, München
Säulenmaterial Sephacryl S300 GE Healthcare, München
Säulenmaterial Sepharose QXL GE Healthcare, München
Silikonschläuche Chemikalienlager, Bochum
2.1 Material 28
Spritze 50 ml Luer-Lok BD,Heidelberg
Spritze 2 ml BD, Heidelberg
Sprudelsteine Hagen, Bönen
Zentrifugentubes:
Ti45 Beckmann, München
SS34 Sorvall, Bad Homburg
SW28 Beckmann, München
SLC600 Sorvall, Bad Homburg
Viskosetuch Rewe, Bochum
Geräte
Äkta Puri�er GE Healthcare, München
Aquariumpumpe WS2 Schego, O�enbach
Autoklav Modell C Webco, Bad Schwartau
Becherresonanzsoni�er Branson, Raleigh (USA)
Becherresonanzsoni�er-Kühlung FE Haake, Berlin
Biofuge pico Heraeus, Hanau
Cell disrupter TS constant Sytsmes Ltd, Königswinter
Distille:Aquatron A 4000 Bibby, Stone (GB)
Emulsi�ex-C5 Avestin, Mannheim
Feinwaage CP225 Sartorius, Göttingen
French Press Cell Press Thermo Spectronic, Rochester (USA)
Fluidizer 110L Micro�uidics, Newton (USA)
Glashomogenisator nach Dounce (Glaspi-
still)
Glasbläserei, Bochum
Glashomogenisator nach Potter-Elvehjem
(Te�onpistill)
KIMBLE KONTEs, Vineland (USA)
JBSC Heavy atom screen Jena Biosciences, Jena
Kristallisationsschrank WBK200 Mytrom, Heiligenstadt
Kristallisationsroboter Phoenix Dunn, Asbach
Kühlbrutschrank memmert, Schwabach
2.1 Material 29
Kühlge�rekombination Liebherr, Ochsenhausen
Kühlzentrifuge 5415R Eppendorf, Wesseling-Berzdorf
Lagerdewar VHC35 (Kristalle) Taylor-Wharton, Husum
Mikroskop SZX2FOF Olympus, Hamburg
Kaltlichtquelle KL 2500LCD Olympus, Hamburg
Mikroskop CX41RF Olympus, Hamburg
Mini-Extruder Avanti Polar Lipids, Alabaster (USA)
Mini-Protean II Zelle (SDS-Gele) Biorad Laboratories, München
MiliQ-Anlage Millipore, Schwalbach
Peristaltikpumpe Ismatec, Wertheim-Mondfeld
Plasma cleaner Harrick Plasma, Ithaca (USA)
Power Supply PPS 200-1D(SDS-Gele) Biorad, München
Power PAck 300 (SDS-gele) Biorad, München
Particle Sizer Malvern, Worcestershire (GB)
pH-Meter 766 Knick, Berlin
Phometer:Ultrocpec 3000pro Amersham Biosciences, Freiburg
Plexiglasdeckel für Anzuchtkästen Universitätswerkstatt, Bochum
Puri�er Amersham Biosciences, Freiburg
Rollerrad Universitätswerkstatt, Bochum
Röntgendi�raktometer:
FR-591 Bruker AXS, Rheinstetten
Cryostream Oxford Cryosystems, Oxford (GB)
Imageplate Mar345DTB Mar Research, Norderstedt
Schüttelinkubator 3017 GFL, Burgwedel
Tensor 27 Bruker, Ettlingen
Thermomixer Eppendorf, Wessling-Berzdorf
Tischzentrifuge Eppendorf, Wesseling-Berzdorf
Tischkühlzentrifuge 5415R Eppendorf, Wesseling-Berzdorf
Ultrazentrifuge Optima Beckmann, München
2.2 Methoden 30
Rotoren:
Ti45 Beckmann, München
SW28 Beckmann, München
Zentrifuge Evolution Sorvall,Bad Homburg
Rotoren:
SS34 Sorvall, Bad Homburg
SLC6000 Sorvall, Bad Homburg
Vortex Yelow line Ika Works, Wilmington (USA)
Waage SBA 41 Scaltec
2.2 Methoden
2.2.1 SDS-Polyacylamid-Gelelektrophorese (SDS-Page)
In der SDS-Page werden Proteine aufgund ihrer unterschiedlichen Molekulargewich-
te getrennt. Zuerst wird Sodiumdodecylsulfat (SDS), ein anionisches Detergenz zu
den Proben gegeben. Es überdeckt die Eigenladung der Proteine. Das Gel besteht
aus zwei Teilen, dem Sammelgel und dem Trenngel. Im Sammelgel kommt es bei
angelegter Spannung durch den pH-Wert 6,8 zu einem �Stapele�ekt” in einem he-
terogenen Pu�er aus Glycin und Chloridionen. Aufgrund seiner geringen Mobilität,
wandert Glycin in diesem pH-Bereich hinter der Proteinfront, während das Chloridi-
on als Leition vor der Front läuft. Während der Wanderung durch das Gel stapeln
sich die Proteine dabei in Reihenfolge ihrer Mobilität. Beim Eintritt in das Trenngel
kommt es jedoch zu einem Staue�ekt, da hier der Reibungswiderstand im Gegen-
satz zum Sammmelgel aufgrund der höheren Acrylamidkonzentration sehr hoch ist.
Das Glycin überholt hier aufgrund des pH Wechsels die Proteinfront und es ent-
steht ein homogener Pu�er, in dem die Proteine in Abhängigkeit von ihrer Gröÿe
wandern. Zur elektrophoretischen Auftrennung von Proteinen wurden 15 % ige SDS-
Polyaacrylamidgele verwendet [Laemmli, 1970]. Die Elektrophorese wurde mit einer
Mini-Protean II Zelle durchgeführt. Als Marker wurde der Low Range Marker von
Biorad verwendet. Der Sammelgelpu�er war ein 0,5 M Trispu�er mit einem pH Wert
von 6,8. Als Trenngelpu�er wurde ein 1,5 M Trispu�er mit einem pH Wert von 8,8
verwendet. Die Färbung der Gele wurde mit Coomassiefärbelösung durchgeführt.
2.2 Methoden 31
Das Entfärben erfolgte mit einer Entfärberlösung. Die Proben wurden eins zu eins
mit 2 X SDS-Probenpu�er gemischt, der 4 % reduzierendes SDS enthielt.
2.2.2 UV/VIS Spektroskopie
Die UV/VIS Spektroskopie ist ein Verfahren, bei dem Strahlung mit einer Wellen-
länge von 230 nm bis 800 nm auf eine Probe tri�t. Durch die in der Probe enthal-
tenen Teilchen wird ein Teil der einfallenden Strahlung absorbiert. Die Beziehung
zwischen der Intensität der einfallenden und ausfallenden Strahlung wird durch das
Lambert-Beersche Gesetz beschrieben. Dabei hängt die Extinktion von Konzentrati-
on der Moleküle, Wellenlänge des Strahls und dem molaren Extinktionskoe�zienten
ab [Lehniger, 1994].
log I0/I = Extinktion (Absorption)
I0 = einfallende Strahlung
I = ausfallende Strahlung
(2.1)
Absorption = ε× c× d
(2.2)
ε = Extinktionskoe�zient
c = Konzentration
d = Schichtdicke der Küvette
Es wurden Spektren zwischen 250 nm und 800 nm aufgenommen. Im UV Bereich
zwischen 260 nm und 280 nm absorbieren DNA und RNA, sowie aromatische Amino-
2.2 Methoden 32
säuren. Die Pigmente von LHC und PCP absorbieren im sichtbaren Bereich (Abb.
2.1). PCP absorbiert aufgrund des hohen Peridiningehaltes vorwiegend zwischen
460 nm und 560 nm, wobei das Maximum bei 478 nm liegt. LHC enthält neben
Perdinin Chlorophylla und Chlorophyllb, die das Absorptionsspektrum bestimmen.
Chlorophylla hat in LHC bei 440 nm und bei 672 nm jeweils ein Absorptionsmaxi-
mum, das Absorptionsmaximum von Chlorophyll c2 liegt bei 461 nm [Sharples et al.,
1996].
0
0,1
0,2
0,3
0,4
300,0 400,0 500,0 600,0 700,0
Wellenlänge [nm]
Abs
orpt
ion
Abbildung 2.1: UV/VIS Spektren von LHC und PCP aus Amphidinium carterae.Schwarz : LHC, rot: PCP
Das Spektrum von denaturiertem LHC unterscheidet sich in der Absorption der
Chlorophylle signi�kant von nativem LHC. Die zwei Peaks von Chlorophyll a und c
im Bereich von 400 nm bis 480 nm verschmelzen zu einem Peak, dessen Maximum
bei ca. 450 nm liegt [Sharples et al., 1996].
2.2 Methoden 33
2.2.3 Proteinmengenbestimmung von PCP und LHC über UV/VIS
Absorption
Die oben beschriebene UV/VIS Spektroskopie konnte auch zur Proteinmengenbe-
stimmung genutzt werden. Die Berechnung der PCP Konzentration erfolgte nach
folgender Formel:
PCP [mg/ml]= A478 nm x 0,046 mg/ml [Hofmann, 1996]
(2.3)
Auch die Berechnung der LHC Konzentration sollte über Spektren erfolgen. Hierzu
wurde die Proteinkonzentration von aufgereinigtem LHC mit der Bradfordmethode
(595 nm) bestimmt und dann die OD der Probe bei 672 nm im Spektrum ermittelt.
Die Bestimmung mit dem Bradfordreagenz erfolgte in sechs Doppelmessungen. Die
OD Messungen mit UV/VIS Spektren wurden zweimal mit der 1:100 verdünnten
Probe durchgeführt. Dadurch sollte der Extinktionskoe�zient für die Konzentrati-
onbestimmung von LHC mit UV/VIS Spektroskopie ermittelt werden.
2.2.4 Anzucht von Amphidinium carterae (A. c.)
Die Anzucht der Dino�agellaten erfolgte unter Schwachlicht, da hier die Translations-
raten der Lichtsammelkomplexe und die produzierte Proteinmenge erhöht sind [ten
Lohuis MR and Miller, 1998; Roman et al., 1988; Samuelsson and Richardson, 1982].
Als Medium wurde Provasoli enriched sea media (PES) verwendet. Aus Dauerkultu-
ren von Amphidinium carterae wurden für Vorkulturen wöchentlich 5 ml entnommen
und zusammen mit 35 ml PES in einen 200 ml Erlenmeyerkolben überführt. Diese
wurden drei Wochen bei 19 - 20 °C und 20 µ E m−2 s−1 inkubiert. Die Anzucht
der Groÿkulturen der Zellen erfolgte in 35 l Fleischerkästen mit Plexiglasdeckel bei
19 - 20 °C unter semisterilen Bedingungen (Abb. 2.2). Für eine Groÿkultur wurden
zweimal 15 l PES mit je 20 ml Vorkultur angeimpft. Nach drei Wochen wurde die
2.2 Methoden 34
Kultur durch Zugabe von 1,7 l 2x PES mit Nährsto�en versorgt. Die Ernte erfolgte
nach insgesamt vier Wochen Wachstum.
Abbildung 2.2: Anzuchtkästen von Amphidinium carterae
2.2.5 Anzucht von A. c. unter verschiedenen Lichtbedingungen
Die Produktion von Translationsprodukten der Lichtsammelkomplexe in A. c. ist
abhängig von der Belichtung der Kulturen [ten Lohuis MR and Miller, 1998; Roman
et al., 1988; Samuelsson and Richardson, 1982]. Je höher die Lichtintensität desto we-
niger Produkt ensteht. Um den Ein�uss der Belichtung auf die Zellen zu beobachten
wurden Kulturen bei verschiedenen Lichtbedingungen inkubiert. Die Anzucht erfolg-
te in 0,05 l, 0,25 l und 2 l Erlenmeyerkolben. Das Volumen der Proben betrug 50 ml
im kleinen Kolben und 100 ml, 500 ml in den gröÿeren. Die Animpfung der Proben
erfolgte mit 1-2 ml Vorkultur (siehe Anzucht). Als Medium wurde PES verwendet.
Nach zweiwöchigem Wachstum bei ca. 100 µE (Starklicht), 20 µE (Schwachlicht)
oder ca. 5 µE (Schatten) (Abb. 2.3) erfolgte die Begutachtung. Durch Zugabe von
AlkSO4 konnten die Zellen geerntet werden. Die Zellsedimente wurden mit dem Puf-
fer LHCP1 gewaschen und mit dem Soni�er aufgeschlossen. Der Überstand und die
Membranpellets wurden begutachtet.
2.2 Methoden 35
A B
Abbildung 2.3: Anzucht unter verschiedenen Belichtungen A: vorne sind die Kuturenunter Schwachlichtbedingungen abgebildet, direkt vor den Lampen sind die Starklichtan-zuchten, B: die Anzucht im Schatten
2.2.6 Ernte von Amphidinium carterae
Die Zellen wurden durch ein Viskosetuch in drei 10 l Glas�aschen �ltriert und dann
mit Aluminiumkaliumsulfatdodecahydrat (AlKSO4 x 12 H2O) gefällt. Nach Zugabe
des Fällungsmittels wurde die Suspension gemischt. Nach ca. einer Stunde hatten
sich die Zellen abgesetzt und der klare Überstand wurde abgenommen und verworfen.
Die verbliebenen Kulturen wurden vereinigt nach einer weiteren Stunde Absetzzeit
wurde erneut der klare Überstand verworfen und die Suspension in SLC 6000 Tubes
überführt. Danach erfolgte eine Zentrifugation bei 3700 rpm für 10 Minuten. Als
Rotor wurde der SLC 6000 verwendet. Der Überstand wurde verworfen und das
Zellsediment wurde mit Pu�er LHCP1 gewaschen (Zentrifugation: 10 min, 3700 rpm,
SLC 6000). Das erhaltene Pellet wurde in ein 50 ml Falkontube überführt und bei
-20 °C eingefroren und gelagert.
2.2.7 Aufreinigung LHC aus Amphidinium carterae
Membranpräparation
Für die Isolierung von LHC aus den Thylakoidmembranen sollte die Vorschrift aus
der Diplomarbeit optimiert werden.
Das Zellsediment wurde bei 18 °C aufgetaut, dann im Pu�er LHCP1 aufgenommen
und mit einem Glashomogenisator homogenisiert. Die weiteren Arbeitsschritte er-
folgten auf Eis bei Rotlicht und unter Zugabe von PMSF als Proteaseinhibitor in
der Endkonzentration von 0,1 mg/ml. Das Homogenisat wurde bei 10.000 rpm bei
4 °C im SS34 Rotor zentrifugiert. Das Zellsediment wurde in Pu�er LHCP1 aufge-
2.2 Methoden 36
nommen und homogenisiert. Der Aufschluss der Zellen erfolgte mit verschiedenen
Aufschlussgeräten bei der die Zellen mittels Druck durch eine enge Ö�nung gepresst
wurden. Die dabei entstehenden Scherkräfte sollten die Zellen zerstören. Der Auf-
schluss erfolgte mit French Press, Fluidizer, Emulsi�ex und Cell disrupter (Tab. 2.7).
Beim Emulsi�ex musste um Verstopfungen der Apparatur zu verhindern die Probe
stark verdünnt werden. Durch Zugabe von ca. 3 µl Antifoam auf 60 ml Zellsuspension
konnte eine Schaumbildung beim Zellaufschluss mit dem Cell Disrupter vermieden
werden.
Gerät Druck Anzahl der Durchgänge Probenvolumen
French Press 96 MPa 2 60 mlFluidizer 69 MPa 3 60 mlEmulsi�ex 50- MPa 4-7 300 ml
Cell Disrupter 100 MPa 3 60 mlTabelle 2.7: Die verschiedenen Aufschlussgeräte
Durch Zugabe von PMSF in der Endkonzentration von 0,1 mg/ml sollten Pro-
teasen, die LHC und PCP abbauen können, inhibiert werden. Die Membranen wur-
den von den löslichen Bestandteilen der aufgeschlossenen Zellen durch Ultrazen-
trifugation mit 22.000 rpm bei 4 °C im Ti45 Rotor 30 min. getrennt. Der rote
Überstand enthält PCP. Das Membransediment wurde in LHCP1 Pu�er aufgenom-
men und homogenisiert. Durch eine nachfolgende zwanzigminütige Zentrifugation
bei 10.000 rpm im SS34 Rotor bei 4 °C sollten Nicht-Membranbestandteile ausgewa-
schen werden. Der rötliche Überstand wurde für weitere Versuche bei 4°C gelagert.
Es erfolgte ein weiterer Waschschritt mit LHCP2 (Zentrifugation: 10.000 rpm im
SS34, 4 °C). Die Membranen wurden in ca. 20 ml Pu�er LHCP2 aufgenommen und
homogenisiert. Das Homogenisat wurde auf sechs 30 % Saccharosegradienten ver-
teilt und 17 h bei 22.000 rpm und 4 °C im SW28 Rotor zentrifugiert um verbliebene
lösliche Bestandteile von den Membranen zu trennen. Die Membranen setzten sich
am Boden der Gradienten ab und wurden weiter verwendet. Der klare Überstand
wurde verworfen. Die nach der Dichtezentrifugation erhaltenen Pellets wurden in
Pu�er LHCP2 aufgenommen und homogenisiert.
2.2 Methoden 37
Solubilisierung
Membranproteine wie LHC können normalerweise nur durch Detergenzien aus der
Membran in Lösung gebracht werden. Detergenzien wie z.b. Beta-n-Decylmaltosid
(DM) sind amphiphile Moleküle, die einen polaren hydrohpilen und einen unpolaren
hydrophoben Anteil besitzen. Sie bilden Micellen aus, bei denen der hydrophobe Teil
nach innen und der hydrophile Teil nach auÿen gerichtet ist. Die Membranproteine
werden in diese Micellen eingebaut und so aus der Membran gelöst [Blaicher, 2005].
Für die Solubilisierung des intrinsischen Lichtsammmelkomplexes wurde die Protein-
konzentration des Homogenisats aus der Membranpräparation mit der Bradfordbe-
stimmung ermittelt und dann auf 2 mg/ml eingestellt. Durch Zugabe von 1 % DM
sollte der LHC Komplex aus der Membran herausgelöst werden. Die Solubilisierung
erfolgte für 135 min. bei 190 rpm auf einem Schüttelinkubator ohne LichtEin�uss
bei ca. 8 °C. Zur Trennung der solubierten Proteine von den Membranen wurde
eine Ultrazentrifugation bei 14.000 rpm und 4 °C im Ti45 Rotor durchgeführt. Der
dunkelbraune Überstand wurde zur weiteren Reinigung mit einem Filter (0,2 mm
Porengröÿe) �ltriert.
Anionenaustauschchromatographie
Bei der Anionenaustauschchromatographie erfolgt die Trennung eins Proteingemi-
sches aufgrund der unterschiedlichen Ladungen. Die geladenen Proteine binden
durch elektrostatische Wechselwirkungen reversibel an die geladenenen Gruppen
der Säulenmatrix. Die Elution der Proteine erfolgt durch einen steigenden Salzgra-
dienten, da die Salzionen eine höhere A�nität zum Säulenmaterial besitzen und die
Proteine von der Säule verdrängen [Risch and Seitz, 1989]. Der aus der Aufreinigung
erhaltene Überstand wurde auf eine XK16/20 QSepharoseXL Säule aufgetragen. Die
Equilibrierung der Säule erfolgte mit dem Pu�er LHCP3 (20 mM Tricine pH 7,5,
0,16 % DM). Der Salzgradient wurde durch Mischung des Equilibrierungspu�ers
mit dem Pu�er LHCP4 (20 mM Tricine pH 7,5, 500 mM KCl, 0,16 % DM) erhalten.
Die Anionenaustauschchromatographie mit linearem Salzgradienten wurde mit dem
Äkta Puri�er-FPLC System bei 4 °C und Rotlicht durchgeführt. Der Verlauf der
Reinigung wurde durch SDS-Gele und UV/VIS Spektren verfolgt. Die braungrün
gefärbten LHC haltigen Fraktionen aus der Anionenaustauschchromatographie wur-
den vereinigt.
2.2 Methoden 38
Gel�ltration
Bei der Gel�ltration erfolgt die Trennung von Molekülen aufgrund der Gröÿe. Die
Probe wird auf eine Säule aus porösen Kügelchen mit de�nierter Porengröÿe aufge-
tragen, die aus einem unlöslichen, aber stark hydratisierten Polymer, wie Sepharo-
se besteht. Kleinere Moleküle können in die Poren eindringen. Je kleiner sie sind,
desto länger ist ihre Aufenthaltsdauer in den Poren. So passieren groÿe Moleküle
die Säule schneller als kleine. Die mobile Phase dient nur als Lösungsmittel, und
somit antikorrelliert die Verweildauer der Moleküle in der Matrix mit ihrem Mole-
kulargewicht [Lottspeich and Zorbas, 1998]. Die Gel�ltrationssäulen wurden mittels
einer Mischung aus dem High Molecular Weight und dem Low Molecular Weight Ka-
librierungskits (GE Healthcare) nach Anleitung des Herstellers kalibriert. Für den
Auftrag auf eine High Load HR16/60 Superdex 200 Säule wurden die LHC hal-
tigen Fraktionen der Anionenaustauschchromatographie vereinigt und mit einem
Milipore/Vivaspinkonzentrator mit einer Aufschlussgröÿe von 50 kDa oder 100 kDa
eingeengt. Der Auftrag erfolgte über eine 2 ml Schleife. Als Laufmittel wurde Pu�er
LHCP5 (20 mM Tricine pH 7,5, 150 mM KCl, 0,16 % DM) verwendet. Die Gel�ltra-
tion wurde mit dem Äkta Puri�er-FPLC System bei 4 °C und Rotlicht durchgeführt.
Der Verlauf der Reinigung wurde durch SDS-Gele und UV/VIS Spektren verfolgt.
Für weitere Experimente wurden die LHC-haltigen Fraktionen verwendet.
2.2.8 Aufreinigung von PCP aus Amphidinium cartreae
Innerhalb dieser Arbeit sollte die Aufreinigung im Vergleich zur Vorherigen [Johan-
ning, 2005] optimiert werden.
Eine bessere Auftrennung von PCP Isoformen sollte durch den Einsatz einer Io-
nenaustauschchromatographie, statt der ursprünglich verwendeten Chromatofokus-
sierung [Johanning, 2005] erfolgen. Es wurden neben der für die Aufreinigung von
PCP bekannten Matrix, DEAE [Haxo et al., 1976], auch die Säulenmaterialien Hi-
trapQXL und Source15S auf ihre Auftrennungseigenschaften getestet. Für den Auf-
trag wurden die PCP haltigen Überstände aus der LHC Aufreinigung verwendet und
mit einem 10 kDa Konzentrator eingeengt. Die Umpu�erung in PCPP1 (1 mM Tris
pH 8,3) erfolgte über eine PD10 Säule. Das Protein wurde mit einer 2 ml Schleife
aufgetragen. Der Salzgradient wurde durch Mischung des PCPP1 mit dem Pu�er
PCPP2 (1 mM Tris pH 8,3, 250 mM NaCl) gebildet. Der Säulenverlauf wurde mit
2.2 Methoden 39
dem Äkta Puri�er-FPLC System bei 4 °C und Rotlicht durchgeführt. Der Verlauf
der Reinigung wurde durch SDS-Gele und UV/VIS Spektren verfolgt. Das am besten
geeignete Material wurde weiterverwendet und die Anionenaustauschchromatogra-
phie wurde mit einer XK 26/20 Säule mit den oben genannten Pu�ern durchgeführt.
Der Auftrag erfolgte über eine 2 ml Schleife.Der Säulenlauf wurde mit dem Äkta
Puri�er-FPLC System bei 4 °C und Rotlicht durchgeführt. Der Verlauf der Reini-
gung wurde durch SDS-Gele und UV/VIS Spektren verfolgt.
Eine Vorreinigung der PCP Probe vor Auftrag auf die Chromatofokussierung und
die Anionenaustauschchromatographie (XK 26/20) erfolgte durch den Auftrag auf
eine Gel�ltrationssäule, Sepharose S300 XK 16/100. Bei der Gel�ltration erfolgt
die Trennung von Molekülen aufgrund der Gröÿe (siehe LHC Aufreinigung). Die
rötlichen Überstände aus der LHC Aufreinigung wurden �ltriert (Filter 0,2 mm Po-
rengröÿe) und mit einem 10 kDa oder 30 kDa Konzentrator eingeengt. Als Laufpu�er
wurde der Startpu�er (25 mM Tris pH 8,5) oder der PCPP1 Pu�er (1 mM Tris pH
8,3) verwendet. Der Säulenlauf wurde mit dem Äkta Puri�er-FPLC System bei 4 °C
und Rotlicht durchgeführt. Der Verlauf der Reinigung wurde durch SDS-Gele und
UV/VIS Spektren verfolgt.
Chromatofokussierung
Proteine enthalten geladene Gruppen, deren Ladung sich in Abhängigkeit vom pH-
Wert ändert. Der isolelektrische Punkt ist der pH-Wert, bei dem keine elektrische
Nettoladung vorhanden ist. Das Protein wandert nicht mehr in einem elektrisch ge-
ladenen Feld. Chromatofokussierung ist eine Auftrennung nach dem isoelektrischen
Punkt (pI): hierbei wird ein pH-Gradient erzeugt, indem die Säule mit Startpu�er
equilibriert wurde und die Proteine mit einem Pu�er mit geringem pH-Wert ihrem
pI nach getrennt wurden.
Für den Auftrag auf die PBE 94 Polypu�er Exchanger C16/40 Säule wurde das
aus der Gel�ltration konzentrierte PCP verwendet. Als Anfangspu�er wurde der
Startpu�er verwendet. Der pH-Gradient wurde mit dem Elutionspu�er gebildet. Die
Chromatofokussierung wurde mit dem Äkta Puri�er-FPLC System bei 4 °C und Rot-
licht durchgeführt. Der Verlauf der Reinigung wurde durch SDS-Gele und UV/VIS
Spektren verfolgt.
2.2 Methoden 40
2.2.9 Gel�ltration
Eine Untersuchung der Peaks der Chromatofokussierung erfolgte über eine Superdex
200 HR16/30 Säule. Die Proteine werden mit dieser Methode nach Gröÿen getrennt
(siehe LHC Aufreinigung) Die einzelnen Peakfraktionen wurden vereinigt und mit
einem 30 kDa Konzentrator eingeengt. Es erfolgte über eine 2 ml Schleife der Auftrag
auf eine Superdex 200 HR10/30 Säule. Als Laufpu�er wurde der LHCP2 Pu�er
(20 mM Tricine pH 7,5, 20 mM KCl) verwendet. Die Gel�ltration wurde mit dem
Äkta Puri�er-FPLC System bei 4 °C und Rotlicht durchgeführt. Der Verlauf der
Reinigung wurde durch SDS-Gele und UV/VIS Spektren verfolgt. Eine Eichung der
Säule erfolgte mit den HMW und LMW Kits nach Herstellervorschrift.
2.2.10 PCP Proben für Interaktionsstudien
Für Interaktionsstudien wurde der PCP Überstand aus der Aufreinigung von LHC
mit ZellAufschluss durch Fluidizer vereinigt, �ltriert und mit einem Filter mit
0,2 mm Porengröÿe �ltriert. Das erhaltene Filtrat wurde mit einem 30 kDa Kon-
zentrator eingeengt und über eine 2 ml Schleife auf eine Superdex200 Hr16/60 Säule
aufgetragen. Als Laufpu�er wurde der LHCP2 Pu�er oder der LHCP2 Pu�er mit
zugegebenen 20 mM MgCl2 verwendet.
2.2.11 Rekonstitution von LHC in Lipidvesikel
Die natürliche Umgebung von Membranproteinen ist eine Lipiddoppelschicht die
aus verschiedenen Phospholipiden aufgebaut ist [Vogel and Angermann, 1994]. Die
Zusammensetzung der Membran ist in verschiedenen Organellen und Organismen
unterschiedlich. Damit Membranproteine aus diesem Bilayer in Lösung gebracht wer-
den können werden Detergenzien verwendet. Für Untersuchungen der Funktion von
intergralen Membranproteinen müssen diese in künstlich hergestellte Lipiddoppel-
schichten eingebaut (rekonstituiert) werden. Dies kann unter anderem Detergenz-
vermittelt erfolgen [Rigaud et al., 1995]. Der anschlieÿende Entzug des Detergenz
erfolgt über Dialyse [Alpes et al., 1988; Rigaud et al., 1995] oder Biobeads [Rigaud
et al., 1995]. Eine sorgfältige Entfernung von nicht eingebautem Protein erfolgt über
einen Sukrosegradienten [Rigaud et al., 1995].
Da PCP durch das Detergenz DM denaturiert wird mussten für Interaktionsstudien
2.2 Methoden 41
von LHC mit PCP LHC in Phosphatidylcholinvesikeln rekonstituiert werden und
die bestehende Vorschrift [Johanning, 2005] optimiert werden. Dazu sollten unter
anderem zwei Methoden der Vesikelbildung gegenübergestellt werden. Die Herstel-
lung von Liposomen mittels Ultraschall [Sprague et al., 1985] und das ursprünglich
[Johanning, 2005] verwendete Verfahren.
Für das Verfahren mit hochfrequentem Schall wurden 20 mg Sojalecithin in einem
Milliliter LHCP2 aufgelöst. Zur Bildung von Liposomen wurde diese Lösung dann im
Becherresonatorsoni�er mit 40 % Beschallung und einer von der Spitze anhängigen
Amplitude (75 oder 20) in einem gekühlten System für zehn Minuten beschallt. Es
war darauf zu achten, dass die Amplitude für jede Spitze neu ausgetestet wurde, da
es bei einer zu hoher Amplitude zur Ausbildung sehr kleiner Vesikel (Durchmesser
unter 100 nm) kam. Die erhaltene Probe wurde dann mit dem Pu�er LHCP2 auf
10 mg/ml Phosphatidylcholin verdünnt. Bei der bestehenden Vorschrift erfolgte die
Vesikelbildung mit einer auf 10 mg/ml verdünnten Sojalecithinlösung. Die Bildung
der Liposomen erfolgte durch dreimaliges Schockgefrieren in �üssigem Sticksto� mit
anschlieÿendem langsamen Auftauen bei Raumtemperatur. Die mit beiden Metho-
den erhaltenen Vesikel wurden durch zehnmaligen Durchgang durch eine 200 nm
Membram mit dem Extruder auf eine Gröÿe zwischen 150-200 nm gebracht. Die
Gröÿe wurde über dynamische Lichtstreuung bestimmt. Sofort nach dem Extru-
der wurde den Vesikeln DM in der Endkonzentration von 0,16 % zugegeben und
die Liposomenlösung mit einer konzentrierten Proteinlösung gemischt. Das einge-
setzte Volumen der Proteinprobe betrug immer 0,5 ml. Nach einer Inkubation der
Vesikel-LHC-Mischung von fünfzehn Minuten bei 20 °C und 600 rpm im Thermo-
mixer wurden die Ansätze über Nacht bei 8 °C auf einem Rollinkubator gemischt.
Das Detergenz wurde durch SM2Biobeads entfernt [Rigaud et al., 1995]. Zur Vor-
bereitung der Biobeads wurden diese erst mit Methanol und danach zweimal mit
A. dest gewaschen (Zentrifugation: 10 min, 13.000 rpm, 4 °C in Eppendorftisch-
zentrifuge). Die Ansätze wurden mit 400 mg/ml Biobeads versetzt und für 6-7 h
bei 18 °C auf einem Rollerrad inkubiert. Nach zweiminütiger Zentrifugation mit
7.200 rpm in einer Eppendorftischzentrifuge bei 8 °C wurden die Überstände auf
30 %ige Sucrosegradienten aufgetragen und 17 h bei 22.000 rpm und 4 °C im SW28
Swingoutrotor zentrifugiert. Als Kontrolle wurden LHC ohne Vesikel, LHC ohne
Vesikel und Biobeadzugabe und leere Vesikel verwendet. Die entstandenen Banden
des rekonstituierten LHCs wurden abgenommen und ca. zehnfach mit Pu�er LHCP2
2.2 Methoden 42
verdünnt. Das Pelletieren erfolgte im Ti45 Rotor für 30 min bei 4 °C und 22.000 rpm
pelletiert. Das Pellet wurde in ca. 500 µl LHCP2 aufgenommen und die Qualität
der Probe durch ein UV/VIS Spektrum überpüft. Wurde die Lösung nicht sofort
weiter verwendet, erfolgte eine erneute Zentrifugation bei 4 °C und 10.000 rpm in
einer Eppendorftischzentrifuge. Der Überstand wurde abgenommen und das Pellet
bei 4 °C gelagert.
Für die Optimierung der Rekonstitution wurden LHC Konzentration von 1,5 mg/ml,
5 mg/ml und 10 mg/ml verwendet. Des Weiteren wurden verschiedene Lipid: Pro-
teinverhältnisse (1:1, 4:1, 10:1, 1:10) getestet. Die Durchführung der Rekonstitution
erfolgte mit verschiedenen Salzkonzentrationen von Kaliumchlorid wie auch mit zwei
verschiedenen Salzen (KCl, MgCl2).
2.2.12 Ober�ächenplasmonresonanzspektroskopie (SPR)
Die Ober�ächenresonanzspektroskopie wird unter anderem zum Nachweis und der
Untersuchung der Kinetik von Protein-Protein Interaktionen genutzt. Das Messprin-
zip beruht auf der Totalre�ektion eines einfallenden Lichtstrahls an der Grenz�äche
zweier Medien. Voraussetzung hierfür ist, dass das Medium an der Einstrahlseite
einen niedrigeren Brechungsindex aufweist als das zweite Medium, um bei einem
Einfallswinkel der Strahlung, die zu einem Brechungswinkel von 90 ° führen würde,
nur Re�exion auf zu weisen. Die in der SPR genutzten Sensorchips bestehen aus einer
mit Gold bedampften Glasschicht an der ein Lichtstrahl re�ektiert wird [Fägerstam
et al., 1992; Meyer]. Gold besitzt einen groÿen Brechungsindex, so dass an der Grenz-
schicht zwischen Glas und Medien mit geringerem Brechungsindex, wie Luft oder
lösliche Pu�er, ein Winkelbereich der Totalre�ektion existiert. Das elektrische Feld
der Lichtphotonen durchdringt trotz dieser Totalre�ektion die Goldschicht und regt
hier Elektronen an die zu elektromagnetischen wellen führen, den sog. Ober�ächen-
plasmonen [Eva-Kathrin Sinner, 2003; Schneider].Von der Goldschicht treten elektri-
sche Feldkomponenten bis oberhalb der Glasschicht heraus (evaneszentes Feld), wo
sie mit dort gebunden Partikeln interagieren [Schneider]. Dort können sie absorbiert
oder Phasenverschoben werden welches Auswirkungen auf den Totalre�ektionswin-
kel hat. Die Änderung ist abhängig von der Masse der gebundenen Partikel (Abb.
2.4) [Schneider].
2.2 Methoden 43
GlasträgerAufgedampfte Goldschicht
Fließkanal
Reaktionspartner
Immobilisierte Proteine
Licht Detektor
Abbildung 2.4: Die schematische Darstellung einer in der SPR genutzten Flieÿzelle
Bei einer Protein-Protein Interaktion erfolgt eine Massenänderung die zu einer
Änderung des Winkel führt. Kinetische Daten zu dieser Reaktion sind durch Aufnah-
me der Winkel über die Zeit möglich [Malmqvist, 1993], [Raghavan and Bjorkman,
1995].
Mit der SPR sollte die Interaktion zwischen LHC und PCP aus Amphidinium car-
terae nachgewiesen und untersucht werden. Die Experimente wurden an einem
Biacore T100 (GE Healthcare) in Kooperation mit Alexander Wolf vom BMZ in
Dortmund durchgeführt. Die bei der Rekonstitution hergestellten Vesikel mit ein-
gebautem LHC wurden in 0,5 ml LHCP2-MgCl2 aufgenommen und sollten auf der
Ober�äche eines L1 Chips (GE Healthcare) immobilisiert werden. Dieser L1 Chip
hat als Matrix lipophile Gruppen kovalent an kaboxmethyliertes Dextran gebun-
den [Erb et al., 2000], [Stenlund et al., 2003] wodurch eine Ober�äche entsteht,
die besonders für die Membranen- und Lipidvesikelanheftung konzipiert wurde. Als
Laufpu�er wurde der �ltrierte und entgaste LHCP2-MgCl2 Pu�er(20 mM Tricine
2.2 Methoden 44
pH 7,5, 20 mM KCl, 20 mM MgCl2) verwendet. Als Negativkontrolle dienten Phos-
phatidylcholinvesikel mit ca. 150 nm Durchmesser. Als Ligand wurde PCP als Pool
aus den Peakfraktionen der Gel�ltration in Pu�er LHCP2 verwendet. Kurz vor der
Messung wurde MgCl2 in der Endkonzentration 20 µM zugegeben. Es wurden zwei
Konzentrationsreihen mit PCP Konzentrationen von 8,7 µM, 20 µM, 40 µM und
60 µM durchgeführt. Eine Langzeitdissoziationsmessung erfolgte mit 60 µM PCP.
Alle Messungen wurden bei 20 °C durchgeführt. Zur Reinigung des L1 Chips wurden
dieser mit 0,05 % SDS gespült und anschlieÿend mit einem Isopropanol : 50 mM
Natriumhydroxidgemisch im Verhältnis 2 zu 3 gewaschen um alle Vesikelreste zu
entfernen. Die Sensogramme wurden mit der Biacore control softwareT1001.1.1 auf-
genommen. Als Hintergrund diente die Negativkontrolle. Diese wurde von den ge-
messenen Sensogrammen vor der Auswertung subtrahiert. Die Analyse erfolgte mit
der Biacor evaluation 4.1 Software. Dabei wurden die Daten an eine Reaktion erster
Ordnung ge�ttet: A+B AB. Als Maÿ für die A�nität zweier Proteine gilt die
Dissoziation KD die aus dem Quotienten der Dissozitationsrate und der Assoziati-
onsrate berechnet wird. Unter der Annahme einer Reaktion erster Ordnung kann
die Dissoziationsrate koff aus der Gleichung Rt = R0 · e−koff (t−t0) erhalten werden
[O'Shannessy et al., 1993; de Keyzer et al., 2003]. Hierbei ist Rt die Resonanz zum
Zeitpunkt t, und die Resonanz zum Zeitpunkt t0 ist R0 [de Keyzer et al., 2003]. Die
Assoziationsrate kon ist abhängig von der Konzentration des Liganden und kann aus
folgender Gleichung abgeleitet werden: Rt = Requ(1− e−(kon(C)+koff )(t−t0) [de Keyzer
et al., 2003]. Sie wurde durch Anlegen einer monoexponentiellen Funktion an die
Anbindung ge�ttet. Für den Fit wurde nur der Anfangsbereich verwendet, indem
koff vernachlässigbar war. Die daraus erhaltene Geschwindigkeit stand im direkten
Zusammenhang mit der eingesetzten PCP Konzentration.
2.2.13 ATR- FTIR-Spektroskopie
Die Fourier-Transformations-Infrarot Spektroskopie (FTIR) in Kombination mit der
abgeschwächten Totalre�ektion (ATR) ist eine Methode, die neben der Sekundär-
strukturanalyse auch zur Untersuchung von Funkionsbeziehungen membrangebun-
dener Proteine genutzt werden kann. Das Meÿprinzip beruht wie die Methode bei
Bioacore auf der Totalre�ektion eines einfallenden Lichtstrahls an der Grenz�äche
zweier Medien. Hierfür muss das Medium an der Einstrahlseite einen höheren Bre-
2.2 Methoden 45
chungsindex besitzen als das zweite Medium. Der einfallende Lichtstrahl erfährt
während der Re�ektion eine Versetzung und erhält damit formal einen gekrümmten
Strahlenverlauf [Kellner and Gida�ly, 1978]. Es kommt zur Ausbildung von evanes-
zenten Wellen an der Grenz�äche [Harrick, 1967,]. Eine Probe die an der Ober�äche
des internen Refelektions Element (IRE) immobilisiert wurde kann mit dem evanes-
zenten Feld wechselwirken und es erfolgt eine wellenlängenabhängige Abschwächung
der Totalre�ektion [Kellner and Gida�ly, 1978; Per]. Zur Verstärkung des E�ektes
werden IRE�s aus z.B. Germanium oder Thalliumbromoiodid verwendet, an deren
Ober�äche Mehrfachre�ektionen möglich sind [Kellner and Gida�ly, 1978] (Abb.
2.5).
immobilisierte Probe
Infrarotstrahl
ATR-Kristall zum Detektor
Abbildung 2.5: Schematische Darstellung einer ATR Flieÿzelle
Die Wellenlängen des verwendeten Lichts liegen im Infraroten. Durch die Verwen-
dung eines Interferometeres ist eine Simultanaufnahme aller Wellenlängen möglich.
Das erhaltene Interferogramm wird durch die Fourier-Transformation in ein Infra-
rotspektrum umgerechnet. Die einzelnen Banden im Spektrum sind verschiedenen
Molekülschwingungen zuzuordnen. Im wesentlichen sind dies die C=O Streckschwin-
gung, und die N-H Biegeschwingung des Proteinrückgrades. Spezi�sch für Proteine
sind die Amid I- (ca. 1700 - 1600 cm−1) und Amid II-Bande (ca. 1600- 1500 cm−1),
2.2 Methoden 46
wobei die die der ersten stark durch die Bande der OH2- Biege-Schwingung überla-
gert wird.
Mit der ATR-FTIR-Spektroskopie sollte die Interaktion zwischen LHC und PCP un-
tersucht werden. Auch die Zusammensetzung des Rekonstitutionskonstruktes sollte
hier untersucht werden. Die Experimente und deren Auswertung wurden in Zusam-
menarbeit mit Jörn Güldenhaupt vom Lehrstuhl für Biophysik durchgeführt. Es
wurden IRE�s aus Germanium verwendet. Der Kristall wurde zur Vorbereitung ge-
reinigt und dann für 10-20 min. in konzentrierter Schwefelsäure inkubiert. Dies führte
zur Herstellung einer hydrophilen Ober�äche. Nach dem Abspülen mit A. dest und
trockenen des Kristalls mit Stickso�gas erfolgte eine Inkubation für 5 min in einem
Plasma Cleaner. Organische Verunreinigungen der Ober�äche konnten somit ent-
fernt werden. Danach erfolgte der Einbau des Kristalls in die Messzelle des Tensors
27 (Abb. 2.6).
Abbildung 2.6: ATR Meÿzelle mit eingebautem Germaniumkristall
Das System wurde mit LHCP2 + 20 mM MgCl2 equilibriert. Als Kontrolle wur-
den zum einen 0,5 ml Sojalecithinvesikel ohne rekonstituiertem LHC verwendet. Zum
anderen wurde eine Messung nur mit BSA immobilisiert auf der Ober�äche durch-
geführt. Für Absättigungen mit Rinderserumalbumin wurden 2,5 µl einer 40 mg/ml
Lösung BSA in 500 µl Pu�er mit MgCl2 aufgelöst. Die Pellets der Liposomen mit
2.2 Methoden 47
LHC wurden kurz vor der Messung in Pu�er LHCP2+20 mM MgCl2 aufgenom-
men. Als Ligand wurde der Pool aus den Fraktionen der Gel�ltration (Superdex 200
HR16/60) in Ausgangskonzentrationen von 87 µM und 60 µM verwendet. Kurz vor
der Messung wurde MgCl2 zugegeben. Es wurde immer ein Probenvolumen 0,5 ml
eingesetzt. In Abhängigkeit der Küvette betrug das Volumen im Gesamtsystem 2 ml.
Der Probenauftrag erfolte über eine Peristaltikpumpe mit einem Kreislaufsystem.
Das Waschen zwischen den Anlagerungen erfolgte im Durch�uss. Zunächst erfolgte
die Anbindung der Vesikel. Eventuell noch freie Stellen des Kristalls wurden dann
mit BSA abgesättigt. Danach sollte die Bindung von PCP untersucht werden. Die
erhaltenen Spektren wurden mit dem Programmm OPUS ausgewertet. Die Spek-
tren wurden Basislinien korrigiert. Der Verlauf der Vesikelanbindung wurde durch
die Änderung der CH Bande verfolgt. Der Verlauf der Proteinbande wurde mit der
Änderung in der Amid II-Bande untersucht.
2.2.14 Kristallisation
Für die Strukturanalyse mittels Röntgenbeugung werden Proteinkristalle benötigt.
Diese sollten in dieser Arbeit von PCP und LHC hergestellt werden. Dabei sollten
die Bedingungen aus vorherigen Experimenten [Johanning, 2005] verfeinert werden.
Kristallisation ist der Vorgang, bei dem Moleküle aus einer übersättigten Lösung
in einen kristallinen Zustand übergehen. Dieser Übergang kann durch Verdunstung
des Lösungsmittels, Zugabe eines Präzipitans, Änderungen des pH-Wertes, der Tem-
peratur oder einer Kombination aus diesen Faktoren erreicht werden. Salze wie z.B.
Ammoniumsulfat, organische Verbindungen wie z.B. Polyethylenklykol (PEG) oder
auch organische Lösungsmittel wie Ethanol können dabei als Präzipitant wirken.
Das Präzipitans verdrängt bei einer bestimmten Konzentration das Protein aus der
Lösung. Es gibt dabei verschiedene Phasen, in denen sich das Protein be�nden kann.
Diese hängen vom Verhältnis der Proteinkonzentration zur Fällungsmittelkonzen-
tration ab (Abb. 2.7). Ein Ausfall an Protein tritt dann auf, wenn die Fällung zu
schnell erfolgt. In der metastabilen Zone entstehen keine neuen Kristallen bestehende
Kristalle können aber hier weiter wachsen. Kristalle entstehen erst in der Nukleati-
onszone, wobei das Protein aus der Lösung entfernt wird (Abb. 2.7).
2.2 Methoden 48
Abbildung 2.7: Löslichkeitsdiagramm von Proteinen
Die zwei gebräuchlichsten Methoden der Kristallisation sind sitting drop (Abb.
2.8) und hanging drop (Abb. 2.8). Bei beiden verringert sich durch Dampfdi�usion
das Tropfenvolumen und die Konzentration im Tropfen steigt an der Unterschied
der beiden Verfahren liegt darin, dass bei dem hanging drop Verfahren der Tropfen
über der Reservoirlösung hängt und bei der sitting drop Methode in einer Mulde
oberhalb des Reservoirs sitzt [Ham, 2009].
H2O
Deckglas Kristallisationstropfen
H2O
Deckglas Kristallisationstropfen
Reservoir(700 µl)
H2O
Abbildung 2.8: Schmatische Darstellung der Kristallisation mit hanging drop und sittingdrop
2.2 Methoden 49
Weitere Arten der Kristallisation sind die kubischen Phasen und die Kristallisa-
tion unter Öl. Bei kubischen Phasen wird ausgenutzt, dass sich Lipide spontan zu
sogenannten Mesophasen zusammenlagern. Eine Art der Mesophase ist die wässri-
gen Mediums abhängig [Ca�rey, 2003]. Proteine interagieren mit diesen kubischen
Phasen indem sich Lipid-Proteinmicellen ausbilden die sich in das Kubische Gitter
einlagern und umgeben sind von Wasser. Es können auch Bikontinuierliche kubische
Phase ausgebildet werden. Dies sind dreidimensionale kontinuierliche Membranbi-
layer mit einem System aus zwei Wasserkanälen (Abb. 2.9) [Ca�rey, 2003; Landau
and Rosenbusch, 1996; Rummel et al., 1998].
Abbildung 2.9: Ein schematisches Modell bicontinuierlicher kubischer Phasen [Landauand Rosenbusch, 1996]
Das Verfahren der Kristallisation unter Öl beruht auf dem gleichen Prinzip wie
das der gebräuchlichsten Methoden, jedoch wird hier das Kristallisationslösung-
Proteingemisch unter eine Ölschicht plaziert (Abb. 2.10). Flüssigkeit verdampft
durch das Öl und die Konzentrationen im Tropfen nehmen zu. Die Geschwindig-
keit der Flüssigkeitsdi�usion nach auÿen ist abhängig von der Zusammensetzung
des Öles [Ham, 2009].
2.2 Methoden 50
Kristallisationstropfen
H2O
Öl
Abbildung 2.10: Schematische Darstellung der Kristallisation unter Öl
Für die Kristallisation mit der hanging drop und sitting drop Methode wurden 24
well Platten, 96 well Platten und Stripes mit acht Vertiefungen verwendet. Bei den
24 well Platten wurden die Ränder der einzelnen Vertiefungen mit Vaseline bedeckt.
Die Deckgläser wurden vor Gebrauch silikonisiert, indem sie in eine Silikonisierlö-
sung getaucht und eine halbe Stunde bei 160°C gebacken wurden. Das Reservoir
war mit 700 µl Kristallisationslösung gefüllt. Die Protein- und die Kristallisations-
lösung wurden gemischt und auf das Deckglas, oder bei sitting drop in der Vertie-
fung abgesetzt. Die Abdeckung der Reservoire erfolgte mit Deckgläsern. Die 96 well
Platten wurden für die Arbeit mit dem Phoenix Roboter verwendet. Das Reservoir
wurde mit 100 µl Kristallisationslösung gefüllt. Die Tropfen setzen sich aus 100 nl
Kristallisationslösung und 100 nl Proteinlösung zusammen. Die Platten wurden mit
einer Folie abgedichtet. Für den Roboter wurden kommerzielle Screens der Firma
Quiagen verwendet. Die Ansätze mit Stripes erfolgte mit 100 µl Reservoir und einer
Tropfenzusammensetzung von 1 µl Proteinlösung gemischt mit 1 µl Reservoirlösung.
Eine Abdichtung erfolgte mit Folie. Die Kristallisationsansätze wurden bei 18 °C und
Rotlicht pipettiert und bei 18 °C ohne Lichtein�uss inkubiert. Begutachtet wurden
die Bedingungen mit dem Stereomikroskop bei 18 °C und Kaltlicht.
Kristallisation von LHC
Innerhalb dieser Arbeit sollten die Bedingungen aus vorherigen Kristallisationsexpe-
rimenten [Johanning, 2005] optimiert werden und Kristalle für die Vermessung mit
2.2 Methoden 51
Röntgenstrahlung hergestellt werden. Es wurden Ansätze in 24 well Platten, 96 well
Platten und Stripes durchgeführt. Die Ansätze wurden mit unterschiedliche Trop-
fengröÿen und Mischungsverhältnisse erstellt.
Für die Kristallisation des intrinsischen Lichtsammelkomplexes wurden die LHC
haltigen Fraktion der Gel�ltration von 0,56 CV bis 0,61 CV (der erste Peak im Elu-
tionspro�l) vereinigt und mit einem Vivaspin /MilliQ Konzentrator in der Gröÿe
von 50 kDa oder 100 kDa eingeengt. Für Proben aus der Anionenaustauschchroma-
tographie wurden ebenfalls die LHC-haltigen Fraktionen vereinigt und mit einem
Konzentrator eingeengt.
Auch Experimente in kubischen Phasen sollten zur Kristallausbildung führen. Hierzu
wurden 300 mg 1-Oleoyl-rac-glycerol bei 60 °C erwärmt bis sich das Lipid ve�üssigte.
Es erfolgte die Aliquotierung in 5 µl. Jeweils eine Lipidprobe wurde mit gleichem Vo-
lumen an LHC in einem 250 µ l Reaktionsgefäÿ versetzt. Hierzu wurde der Komplex
aus der Gel�ltration verwendet und auf 10 mg/ml und 100 mg/ml konzentriert. Es
erfolgten mehrere Zentrifugationen bei 22 °C in der Kühlzentrifuge (Tab. 2.8). Nach
jedem Schritt erfolgte die Drehung der Eppendorfreaktionsgefäÿe um 90 Grad.
Zeit Drehzahl1 min 10.000 rpm10 min 5.000 rpm10 min 6.000 rpm10 min 7.000 rpm10 min 8.000 rpm10 min 9.000 rpm10 min 10.000 rpm
Tabelle 2.8: Zentrifugationen bei der Kristallisation mit kubischen Phasen
Nach einer Inkubation von 24 h bei 22 °C wurde Ansätzen Kaliumchlorid oder
Magnesiumchlorid in den Konzentrationen von 0,2 M, 0,4 M, 0,6 M, 0,8 M, 1,0 M,
1,5 M, 2,0 M, 2,5 M, 3,0 M und 4, M zugegeben. Es erfolgten Zentrifugationen (Tab.
2.8) bei denen die Reaktionsgefäÿe nach jedem Schritt um 90 ° gedreht wurden. Der
Ansatz in kubischen Phasen erfolgte jeweils in Doppelbestimmung.
2.2 Methoden 52
Kristallisation von PCP
Es sollte eine hochau�ösende Struktur der Hauptform von PCP bei einem pI von 7,5
erhalten werden. Dazu war die Produktion von Einkristallen essentiell. Die Kristal-
lisation erfolgte mit zwei aus der Diplomarbeit entwickelten Screens (Tab. 2.9, 2.10)
mit der hanging drop Methode in 24 well Platten. Die Tropfen setzten sich aus 3 µl
Proteinlösung gemischt mit 3 µl Reservoirlösung zusammen. Für die Kristallisation
von PCP wurden die Peaks Gel�ltration oder der ungetrennte �ltrierte Überstand
verwendet und auf 5 mg/ml konzentriert.
Nr. PEG 8000 CAPSpH 10,5
CHESpH 9,5
Tris-HClpH 8,5
Tris-HClpH 7,5
MgCl2
1 12 % 0,1 M - - - 0,2 M2 14 % 0,1 M - - - 0,2 M3 16 % 0,1 M - - - 0,2 M4 12 % - 0,1 M - - 0,2 M5 14 % - 0,1 M - - 0,2 M6 16 % - 0,1 M - - 0,2 M7 12 % - - 0,1 M - 0,2 M8 14 % - - 0,1 M - 0,2 M9 16 % - - 0,1 M - 0,2 M10 12 % - - - 0,1 M 0,2 M11 14 % - - - 0,1 M 0,2 M12 16 % - - - 0,1 M 0,2 MNr. PEG 8000 CAPS
pH 10,5CHESpH 9,5
Tris-HClpH 8,5
Tris-HClpH 7,5
NaCl
13 12 % 0,1 M - - - 0,2 M14 14 % 0,1 M - - - 0,2 M15 16 % 0,1 M - - - 0,2 M16 12 % - 0,1 M - - 0,2 M17 14 % - 0,1 M - - 0,2 M18 16 % - 0,1 M - - 0,2 M19 12 % - - 0,1 M - 0,2 M20 14 % - - 0,1 M - 0,2 M21 16 % - - 0,1 M - 0,2 M22 12 % - - - 0,1 M 0,2 M23 14 % - - - 0,1 M 0,2 M24 16 % - - - 0,1 M 0,2 M
Tabelle 2.9: Screen 1a für die Kristallisation von PCP
2.2 Methoden 53
Nr. PEG 8000 CAPSpH 10,5
CHESpH 9,5
Tris-HClpH 8,5
Tris-HClpH 7,5
MgCl2
25 15 % 0,1 M - - - 0,1 M26 15 % 0,1 M - - - 0,2 M27 16 % 0,1 M - - - 0,1 M28 16 % 0,1 M - - - 0,2 M29 13 % - 0,1 M - - 0,1 M30 13 % - 0,1 M - - 0,2 M31 14 % - 0,1 M - - 0,1 M32 14 % - 0,1 M - - 0,2 M33 15 % - 0,1 M - - 0,1 M34 15 % - 0,1 M - - 0,2 M35 16 % - 0,1 M - - 0,1 M36 16 % - 0,1 M - - 0,2 M37 15 % - - 0,1 M - 0,1 M38 15 % - - 0,1 M - 0,2 M39 16 % - - 0,1 M - 0,1 M40 16 % - - 0,1 M - 0,2 M41 15 % - - - 0,1 M 0,1 M42 15 % - - - 0,1 M 0,2 M43 16 % - - - 0,1 M 0,1 M44 16 % - - - 0,1 M 0,2 M
Tabelle 2.10: Screen 1b für die Kristallisation von PCP
2.2.15 Messungen der Proteinkristalle am Di�raktometer
Von den gebildeten PCP und LHC Kristallen sollten mittels eines Rötgendi�rakto-
meters Datensätze aufgenommen und nachfolgend ausgewertet werden.
Röntgenstrahlung kann im Vakuum durch Beschuss eines Metallziels mit hoch ener-
getischen Elektronen erzeugt werden. Am Synchotron entsteht die für die Röntgen-
strukturanalyse benötigte Strahlung in Elektronenspeicherringen mit einer hohen
Intensität. Es ist auch möglich am Synochtron Messungen mit verschiedene Wel-
lenlängen zwischen 1,6 A und 0,5 A durch zu führen. Welches MAD oder SAD
Messungen zur experimentellen Bestimmung der Phasen möglich macht.
Ein Kristall besteht aus mehreren identisch aufgebauten Einheiten, den Einheitszel-
len. Diese werden im Raum durch die drei Vektoren a, b und c aufgespannt, mit
den Winkeln α, β und γ. Aufgrund der Rotationssymmetrie und Zentrierung der
2.2 Methoden 54
Einheitszelle kann in die 14 Bravaigitter unterschieden werden. Jeder Gitterpunkt
in diesem Grundmuster kann noch weiter Symmetrien aufweisen (Punktsymmetrie).
Aus diesen und aus den anderen das Grundmuster bestimmenden Faktoren ergeben
sich die sogenannten asymmetrischen Einheiten. Daraus erfolgt eine weitere Eintei-
lung in Punktklassen. Die Kombination aus Bravaigitter und Punktklassen führt
zu 230 verschieden Arten des Kristallaufbaus. Aufgrund dessen das Aminosäuren
in Proteinen nur in der L-Form vorkommen und damit verbunden keine Spiegelung
und Inversion möglich ist, wird die Anzahl der Raumgruppen auf 65 möglichen be-
schränkt.
Tri�t ein Röntgenstrahl auf einen Kristall so ist es möglich ein spezi�sche Muster an
Beugungre�exen zu beobachten. Mit dem Bragg�schen Ansatz lässt sich die Positi-
on der Re�exe erklären. Die Basis ist das Konzept der Gitterebenen. Diese werden
durch Gitterpunkte aufgespannt, die über die Indizies h,k und l in Klassen einge-
teilt werden. Ebene einer Klasse haben den Abstand dhkl zueinander. Eine Re�exion
an den Gitterebenen entspricht der Beugung am Kristall. Es ergibt sich folgende
Beziehung für Re�exe:
nλ = 2∆x = 2d_hklsinϑ
(2.4)
Strahl 1
Strahl 2
è
è
dhkl
Abbildung 2.11: Re�exbedingung für die Beugung am Kristlall (Bragg).
2.2 Methoden 55
Strahlung, wie z.B Röntgenstrahlung kann als eine Wellenfunktion beschrieben wer-
den. Gestreute Wellen haben die gleiche Wellenlänge wie der einfallende Strahl,
jedoch hat der gestreute Strahl eine von der Einheitszelle abhängige Phase und
Amplitude. An einem Kristall, der aus vielen Einheitszellen aufgebaut ist erfolgt
eine vielfache Streuung des Strahls. Solche sich wiederholenden Wellenfunktionen
können durch eine Fourieranalyse untersucht werden. Unter Berücksichtigung der
Laue-Bedingung ergibt sich daraus für die Elektronendichte:
ρ~r = 1VΣhkl Fhkl x e−π∗~s∗~r
(2.5)
Der Strukturfaktor Fhkl setzt sich aus der Amplitude und der Phase zusammen. Die
Amplituden sind durch Messungen des Rötgendetektors bestimmbar. Die Phasenin-
formation kann so nicht berechnet werden. Eine Bestimmmung ist durch multiplen
isomorphen Ersatz (MIR) oder molekularem Ersatz (MR) möglich. Für MIR werden
Schwermetallen in den Kristall eingebaut. Durch die Harkerkonstruktion ist dann
eine Berechnung der Phasen für die Elektronendichte des Proteins möglich. Beim
molekularen Ersatz wird ein verwandtes Molekül dessen Struktur schon gelöst wer-
den konnte als Modell benutzt um die Phasen für die zu lösende Struktur berechnen
zu können. Dieses Verfahren basiert darauf, das kleine Änderungen in der Struktur
auch geringe Änderungen der Phase zur Folge haben. Wird das Modell auf die ex-
akt gleichen Koordinaten wie die reale Einheitszelle verschoben so sind die Phasen
die berechnet werden können den realen sehr ähnlich. Das Problem hierbei ist die
richtige Plazierung des Modells. Das angewandte Verfahren ist die Pattersonsythese.
Hierbei erfolgt eine Zerlegung der sechdimensionalen Suche in zwei dreidimensiona-
le. Durch die Rotation wird die richtige Orientierung gefunden. Danach erfolgt die
Translationssuche, bei der das Modell in der Zelle verschoben wird bis eine Überein-
stimmung mit dem gemessenen Daten erfolgt.
Nachdem die Phase bestimmt wurde wird das Ergebnis manuell wie auch durch ver-
schiedene Programme verfeinert. Zur Kontrolle wird dabei ein Teil des Datensatzes
2.2 Methoden 56
bei der Verfeinerung nicht berücksichtigt und der hier erhaltene Wert R-free ist ein
Maÿ für den Fit. Mathematisch ist es möglich eine Struktur zu über�tten, so das
sie realen Proteinen nicht mehr entspricht. Eine starke Abweichung des R-free vom
R-faktor ist eine Möglichkeit eine Über�ttung zu vermeiden.
Für Aufnahme von Re�exmustern bei Tiefentemperaturen müssen die Kristalle ge-
�scht und in �üssigem Sticksto� schockgefroren werden. Um die Bildung von Eis zu
verhindern sollten optimierte Einfrierlösungen verwendet werden. Es wurden LHC
und PCP Kristalle ge�scht. An der Homesource wurden Testmessungen durchge-
führt. Datensätze wurden am ESRF und SLS aufgenommen. Als optimierte Einfrier-
lösung für LHC Kristalle hatte folgende Zusammensetzung: 30 % PEG400, 0,05 M
MgCl2, Na-cacodylate pH 6,5 und 0,16 % DM.
2.2.16 Die Auswertung der Datensätze
Die Auswertungen der Datensätze erfolgte mit dem im folgenden aufgeführten Pro-
grammen.
XDS Programmpaket
Das Programmpaket XDS wurde von Wolfgang Kabsch [Kabsch, 1988] entwickelt für
die Auswertung von Rohdaten von Einkristallen. Alle erhaltenen Datensätze wurden
mit dem XDS Porgrammpaket prozessiert. Die hier benutzen Programme waren:
XDS
Rohdaten werden durch das Programm XDS induziert, integriert und reduziert. Bei
der Induzierung erfolgt eine Analyse der Positionen der Peaks (Re�exe) und deren
Projektion im reziproken Gitter. Daraus ergeben sich Einheitszellparameter sowie
die Orientierung der Kristalls und die Bestimmung des Bravaisgitters ist möglich.
XDS zeigt eine Liste aller möglichen Gittertypen mit den dazugehörenden Zellach-
sen an, die von der die Gruppe mit der höchsten Geometrie und dem niedriegsten
Fehler angeführt wird. Im weiteren Verlauf der Prozessierung werden der Kristall-
parameter, der Detektorabstand und die Strahlparameter verfeinert. Bei der dar-
au�olgenden Integration werden Re�expositionen vorhergesagt und die Intensität
der Peaks abgeschätzt, ebenso der Fehler der Intensität. Unzuverlässige Re�exe wer-
den ausgesondert. Zuletzt erfolgt eine Skalierung der Refelxintensitäten, welche der
2.2 Methoden 57
Raumgruppensymmetrie entsprechend gemittelt werden. Die R-Faktoren als Maÿ
für eine Datenkonsistenz wie auch ein reduzierter Datensatz werden ausgegeben.
XSCALE
In XSCALE ist es möglich verschiedene Datensätze zu vereinen. Hierbei werden die
unterschiedlichen Messungen aneinander skaliert und gemittelt. Die Korrelation und
die R-faktoren erlauben eine Beurteilung ob Datensätze zusammen skaliert werden
sollten und wie die Datenqualität vor und nach dem Mitteln ist.
XDSCONV
Die aus XDS erhaltenen Daten�les sind nicht immer mit den weiteren Programme
zur Auswertung der Struktur verwendbar. Deshalb müssen diese z.B in CCP4i oder
Shelx kompatible �les konvertiert werden. Dies übernimmt das Programm XDS-
CONV welches auch gleichzeitig in der Lage ist eine R_free zu generieren, bzw.
Re�exe für die Berechnung von R_free zu markieren.
SHELX
Das Programm SHELX wurde ursprünglich zur Verfeinerung kleiner Moleküle ent-
wickelt und beruht auf dem Least Squares (LS) Verfahren. Es wird heutzutage auch
zur Verfeinerung hochaufgelöster Makromolekülstrukturen verwendet. Aus dem Pro-
grammpaket wurden nur SHELXH für groÿe Moleküle und SHEXPRO ein Umfor-
mungsprogramm verwendet. Es sind wie die XDS Programme Skriptprogramme
die es aber erlauben viele verschiedene Parameter zu variieren. Über einen durch
SHELXPRO generierten Input�le erfolgt die Steuerung.
ShelX wurde für die Verfeinerung der PCP Struktur der Hauptform verwendet.
CCp4i
Das Programmpaket CCp4i ist eine Sammlung verschiedener Programme zur Aus-
wertung eines Datensatzes. In dieser Arbeit wurde das Programme Molrep und Pha-
ser für den molekularen Ersatz bei LHC verwendet.
2.2 Methoden 58
COOT
Das hier verwendete Programm COOt dient dazu eine Vefeinerung der Aminosäuren
durchzuführen. Dabei wird die Aminosäuresequenz mit ihrer Anordnung im Raum
als PDb �le aufgerufen und die aus den gemessenen Daten ermittelte Dichtekarte
untergelegt. Die Vefeinerung erfolgt manuell und ermöglicht es visuell Abweichungen
der Dichte von der Anordnung der Aminosäuren aus der Sequenz zu ermitteln und
zu verfeinern. Diese Verfeinerung anhand der einzelnen Aminosäuren wurde für alle
gelösten Datensätze mit COOT durchgeführt.
3.1 Proteinmengenbestimmung von LHC über UV/VIS Spektren 59
3 Ergebnisse
3.1 Proteinmengenbestimmung von LHC über
UV/VIS Spektren
Es konnte eine Formel für die Proteinkonzentrationsbestimmung von LHC mit
UV/VIS Spektroskopie ermittelt werden. Aus der Proteinbestimmung mit der Brad-
fordmethode wurde die Konzentration von LHC auf 4 mg/ml bestimmt. Die Spek-
tren ergaben einen Mittelwert bei der OD bei 672 nm von 0,307 mit einer 1:100
Verdünnung der Probe. Die Schichtdicke der Küvette betrug einen Zentimeter. Dar-
aus ergab sich für den Extinktionskoe�zienten ε der Bruch zwischen der Absorption
bei 672 nm und der Proteinkonzentration 0,04 mg/ml. Demnach kann die LHc Kon-
zentration wie folgt berechnet werden:
LHC [mg/ml]= (OD672nm x 0,130 mg/ml
(3.1)
3.2 Zellkultur Amphidinium carterae
Durch die eigene Aufzucht in Bochum war eine kontinuierliche Produktion von Zell-
sediment zur Aufreinigung der Lichtsammelkomplexe gewährleistet. Die Ausbeute
an Zellsediment betrug zwischen 30 und 45 g pro 30 l Zellkultur. Die Schwankun-
gen zwischen den Groÿkulturen sind in Temperaturschwankungen und durch leicht
unterschiedlich stark gewachsene Vorkulturen als Ausgangsmaterial begründet.
3.3 Belichtungstest von Amphidinium carterae 60
Die Anzuchten mit einem Tag/Nacht Rhythmus wuchsen langsamer, waren jedoch
Zentrifugationen gegenüber unemp�ndlicher. Eine Zentrifugation von Zellen mit kon-
tinuierlicher Belichtung führte immer zu deren Zelltod. Die Zellen mit diskontinuier-
licher Belichtung überlebten zu 75 % Geschwindigkeiten bis zu 2.000 rpm im SLC
6000 Rotor. Diese Eigenschaft ermöglicht die Überführung der Kulturen in Zellsus-
pensionen mit hoher Zelldichte.
3.3 Belichtungstest von Amphidinium carterae
Es sollte der Ein�uss der Belichtung auf die Zellen untersucht werden. Die Licht-
stärke bei der Anzucht hatte einen direkten Ein�uss auf die Färbung der Kultur. So
waren die Zellen bei 100 muE mehr grün-gelblich, währenddessen die Zellen die un-
ter den hier sonst verwendeten Bedingungen inkubiert die typische braune Färbung
aufwiesen (Abb. 3.1). Das Wachstum von Amphidinium carterae bei Schwachlicht
(ca. 5 µE) war stark eingeschränkt (Abb. 3.1).
A
Abbildung 3.1: Zellkulturen bei unterchiedlicher Belichtung
Die nach Aufschluss der Zellen erhaltenen Pellets zeigten ähnliche Farbunterschie-
de (Abb. 3.2).
Der Überstand der bei 20 µE angezogenen Zellen enthielt PCP. Dieser Lichtsammel-
komplex konnte bei den anderen Anzuchtbedingungen nicht im Überstand nachge-
wiesen werden (Abb. 3.2, 3.4). Augfrund der geringen Zelldichte der Schwachlicht-
kultur wurden nur die Spektren der Schwachlicht- und Starklichtanzucht verglichen.
3.3 Belichtungstest von Amphidinium carterae 61
A CB
Abbildung 3.2: Membransedimente nach Zellaufschluss. A: Starklicht, B: Schwachlicht,C: Schatten
A C C
Abbildung 3.3: Überstände nach Zellaufschluss. A: Starklicht ( ca. 100 µE), B: Schwach-licht ( 20 µE), C: Schatten, (ca. 5 µE)
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
250,0 350,0 450,0 550,0 650,0 750,0
Wellenlänge [nm]
Abs
orpt
ion
Abbildung 3.4: UV/VIS Spektren der Überstände nach ZellAufschluss. Blau: Starklicht,pink: Schwachlicht
Es konnte keine Veränderung in der Mobilität der Zellen festgestellt werden.
3.4 Aufreinigung von LHC aus Amphidinium carterae (A. c.) 62
3.4 Aufreinigung von LHC aus Amphidinium
carterae (A. c.)
Innerhalb dieser Arbeit sollte die Aufreinigung im Vergleich zur Vorherigen [Johan-
ning, 2005] optimiert werden. Der Aufschluss der Dino�agellatenzellen war neben
optimierten Parametern für die Solubilisierung entscheident für die Ausbeute an
LHC. Diese konnte von ursprünglich erhaltenen 0,05 - 0,07 mg LHC pro Liter Groÿ-
kultur auf 1 - 2 mg LHC pro Liter Groÿkultur erhöht werden. Dies entspricht einer
Steigerung der LHC-menge von 30 %.
Die göÿere Ausbeute wurde durch die Umstellung von einem Glas- auf einen Te�on-
homogenisator und ebenso durch die Festlegung von 60 ml als Aufschlussvolumen
pro Groÿkultursediment erreicht. Beides hatte eine besseren Zerstörung der Zellen
und eine gute Reproduzierbarkeit zur Folge. Die Verwendung von Sucrosegradienten
anstelle einer Dialyse zur Entfernung von Nicht-Membranbestandteilen führte zu ei-
ner optimierten Solubilisierung des LHCs, da neben DNA Verunreinigungen auch
noch vorhandene PCP Reste entfernt werden konnten (Abb. 3.5).
Abbildung 3.5: Gradient mit PCP Bande (rötlich) und Membranpellet (braun) am Bo-den des SW28 Röhrchen
Die Einstellung auf 2 mg/ml Proteinmenge anstelle einer von 0,15 mg/ml Chlo-
rophyllmenge [Johanning, 2005] entsprach einer Proteinmenge von 1,65 mg/ml und
3.4 Aufreinigung von LHC aus Amphidinium carterae (A. c.) 63
ergab eine Steigerung der LHC-Menge. Eine vollständige Herauslösung des Komple-
xes aus den Membranen war selten möglich (Abb. 3.6).
21,5 kDa
31,0 kDa
66,2 kDa
45,0 kDa
97,4 kDa
1 2 3 4 5 7 8 9 106 11 12 13
Abbildung 3.6: SDS Gel der Aufreinigung. 1: Marker, 2: Waschen der Zellen, 3: vor Zel-laufschluss , 4: Überstand nach UZ, 5: Homogenisat nach UZ, 6: Überstand nach Waschender Membranen, 7: Homogenisat nach Waschen der Membranen, 8: Überstand nach Wa-schen der Membranen, 9: Homogenisat nach Waschen der Membranen, 10: Homogenisatnach Saccharosegradient, 11: nach Solubilisierung, 12: Pellet nach UZ, 13: Auftrag aufAnionenaustauschchromatographie
Die Qualität des Aufschlusses von A. c. war unabhängig vom verwendeten Gerät.
Die Anzahl aufgeschlossener Zellen war nach Beobachtung unter dem Mikroskop
gleich. Die Elutionspro�le der Anionenaustauschchromatographie und der Gel�ltra-
tion sind ähnlich. Unterschiede resultieren nicht aus der Aufschlussart, sondern le-
diglich in der aufgetragenen Menge an LHC (Abb. 3.7). Im Fall des Fluidizers lag
jedoch eine Zeitersparnis vor, weshalb diese Apparatur bevorzugt angewendet wur-
de.
Die Graphen der Anionenaustauschchromatographie befanden sich meist in der Sät-
tigung und zeigten einen breiten Proteinpeak. Die Elution erfolgte bei einem Salzge-
halt von ca. 30 % bis ca. 65 %. Denaturiertes Protein wurde nicht an die Säulema-
trix gebunden. Es wurden die LHC-haltigen Fraktionen von 10 CV bis 14 CV weiter
verwendet. In diesen konnten keine Proteinverunreinigungen nachgewiesen werden
(Abb. 3.8). Das Protein lag in reiner Form vor und wurde auf Grund dessen auch
für die Kristallisation genutzt.
3.4 Aufreinigung von LHC aus Amphidinium carterae (A. c.) 64
0
50
100
150
200
250
10 1,60 3,26 4,91 6,56 8,22 9,87 11,52 13,18 14,83
Säulenvolumen CV
AU
0
10
20
30
40
50
60
70
% S
alz
Abbildung 3.7: Elutionspro�l der Anionenaustauschchromatographie.
1 2 3 4 5 8 9 10 117 12 13 14 15 16 17 18 2019 21 22
21,5 kDa
31,0 kDa
66,2 kDa
45,0 kDa
97,4 kDa
Abbildung 3.8: SDS-Gel der Anionenaustauschchromatographie. 1, 11: Marker, 2-4 Frak-tionen bis zu Elution, 5-10 und 12-18: Elution des Proteins, 19-21 Fraktionen nachProteinelution
Die einzelnen Gel�trationsläufe unterschieden sich in der Elutionsbreite des Pro-
teins. Diese war von dem einzukonzentrierenden Volumen für den Auftrag auf die
Gel�ltration in der Weise abhängig, dass mit stärkerer Konzentrierung die Breite
zunahm. Die Graphen befanden sich meist in der Sättigung, weshalb eine Unter-
scheidung in einzelne Peaks hier schwierig war. Je nach Breite konnten zwei bis
3.4 Aufreinigung von LHC aus Amphidinium carterae (A. c.) 65
drei Peaks zugrunde gelegt werden, deren Maxima bei ca. 0,6 Säulenvolumen (CV),
0,62 CV und 0,68 CV lagen (Abb. 3.9).
0,00
100,00
200,00
300,00
400,00
500,00
600,00
0,45 0,50 0,55 0,60 0,65 0,70 0,75 0,80
Säulenvolumen (CV)
AU
Abbildung 3.9: Auschnitt des Elutionspro�ls der Gel�ltration, gezeigt wird die Proteine-lution von LHC bei einer Wellenlänge von 672 nm
Das Protein lag in reiner Form vor, Banden oberhalb von 19 kDa sind eher durch
nicht vollständig durch SDS denaturiertes Protein zu erklären. Die Bande unterhalb
von 19 kDa zeigte wahrscheinlich ein Abbauprodukt von LHC.
Die UV/VIS Spektren zeigten annähernd den gleichen Verlauf wie das Elutionspro�l,
1 2 3 4 5 8 9 10 117 12 13 14
21,5 kDa
31,0 kDa
66,2 kDa
45,0 kDa
97,4 kDa
Abbildung 3.10: SDS-Gel der Gel�ltration. 1: Marker, 2-4: Fraktionen vor Proteinelution,5-8 Proteinelution, 9-11:Fraktionen nach Proteinelution, 12: Auftrag Gel�ltration
3.4 Aufreinigung von LHC aus Amphidinium carterae (A. c.) 66
mit der Unterscheidung in drei Peaks (Abb. 3.11). Es wurde nachgewiesen, dass bei
ca. 0,59 CV ein Maximum vorlag.
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1,0
0,5 0,55 0,6 0,65 0,7 0,75 0,8
Säulenvolumen
Abs
optio
n be
i 461
nm
Abbildung 3.11: Absorption bei 461 nm (Chlorophyll c) der Elutionsfraktionen der Gel-�ltration, Volumen der Fraktionen wurde in CV umgerechnet
Die UV/VIS Spektren der vermuteten Peaks waren nahezu deckungsgleich (Abb.
3.12).
0,0
1,0
2,0
3,0
250 350 450 550 650 750Wellenlänge [nm]
Abs
orpt
ion
Abbildung 3.12: UV/VIS Spektren der Proteinpeaks der Gel�ltration normiert auf672 nm. Blau: Peak1 (0,6 CV), rot: Peak2 (o,62 CV) und grün: Peak3 (0,68CV)
3.5 Die Rekonstitution von LHC in Lipidvesikel 67
Durch Eichung der Säule mit den Markerkits konnte den einzelnen Peaks anhand
der Eichgeraden molekulare Massen zugeordnet werden. Die Maxima der Kurven
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
10 100 1000
kav
Molekulargewicht [kDa]
Abbildung 3.13: Eichunggerade der Gel�ltrationssäule Superdex 200 HR16/60
entsprachen Gröÿen von ca.110 kDa, 74 kDa und 40 kDa. Aufgrund der molekula-
ren Zusammensetzung von LHC [Hiller et al., 1993] konnte die Gröÿe des Monomers
ohne Detergenzmicelle mit 35,1 kDa berechnet werden. Die Gröÿe der reinen De-
tergentmicelle in Lösung ist bei DDM 50 kDa, Daten für DM sind nicht erhältlich.
Sie wurde auf ca. 40 kDa abgeschätzt. Unter Berücksichtigung der Ungenauigkeit
der Gröÿenbestimmung durch die Gel�ltration handelt es sich damit hierbei um das
Trimer, das Dimer und das Monomer von LHC.
3.5 Die Rekonstitution von LHC in Lipidvesikel
Der LHC Komplex konnte in Phosphatidylcholinvesikel rekonstituiert werden und
die Vorschrift wurde optimiert. Es konnten 10 % bis 17 % der eingesetzten LHC
Menge in die erstellten Vesikel eingebaut werden.
Liposomen konnten mit den beiden verwendeten Methoden hergestellt werden. Auch
eine Kombination der Schockgefriermethode mit anschlieÿender Ultraschallbehand-
lung führte zur Bildung von Vesikeln. Im Fall der ausschlieÿlichenVerwendung des
Bechersoni�ers lag jedoch eine erhebliche Zeitersparnis vor, so dass diese Methode
bevorzugt wurde.
Die Charge der vewendeten SM2 Biobeads (Biorad) stellte sich als essentiell für
3.5 Die Rekonstitution von LHC in Lipidvesikel 68
die Reproduzierbarkeit heraus, da verschiedene Biobeadschargen zu einem unter-
schiedlich guten Detergenzentzug führten. Nur Biobeads einer älteren Charge (SM2,
Biorad, Lotnr.:24030) zeigten einen reproduzierbaren guten Detergenzentzug.
Es stellte sich heraus das ein Lipid:Proteinverhältnis von 1:1 bei einer Proteinkon-
zentration von 10 mg/ml am Besten für den Einbau geeignet war. Andere Protein-
konzentrationen sowie auch andere Mischungsverhältnisse führten meist zu keiner
oder nur zu einer geringen Rekonstitution des Komplexes in die Liposomen. Die Ver-
wendung von Salzkonzentrationen, die von der im Pu�er LHCP2 abwichen führten
ebenfalls nicht zum Einbau von LHC in Vesikel. Auch Magnesiumchlorid als Salz
stellte sich für die Herstellung LHC haltiger Liposomen als unbrauchbar heraus. Die
Banden dieser verschiedenen Ansätze lagen im Saccharosegradienten entweder auf
Höhe der PC Vesikel oder des LHCs nach Detergenzentzug (Abb. 3.14). Die auf die
Gradienten aufgetragenen leeren Liposomen waren älter als 24 h. Dadurch kam es
zu einer Fusion der Lipidvesikel die zu einem gröÿeren Durchmesser führten. Ein
Durchmesser bis zu 1000 nm konnte bei älteren Liposomen mit dem Particle sizer
nachgewiesen werden. Die Dichte der Probe verringerte sich, da es zu einer geringen
Massen- im Gegensazt zu einer erheblichen Volumenänderung kam. Somit be�ndet
sich die Bande weit oben im Gradienten.
Abbildung 3.14: Gradienten der Rekostitution. Von links nach rechts: nicht erfolgreicherEinbau von LHC in PC Vesikel, denaturiertes LHC, PC Vesikel
3.5 Die Rekonstitution von LHC in Lipidvesikel 69
Die Bande des rekonstituierten LHCs liegt tiefer oder auf gleicher Höhe wie die
des freien LHCs (Abb. 3.15). Da denaturiertes LHC eine Bande im unteren Viertel
des Gradienten aufweist, handelt es sich hierbei um LHC eingebaut in PC Vesikel.
Abbildung 3.15: Gradienten der Rekonstitution. Von links nach rechts: LHC rekonstitu-iert in PC Vesikel, LHC rekonstituiert in PC Vesikel, LHC
Durch das UV/VIS Spektrum wird dies bestätigt, da hier im Gegensatz zum freien
LHC ein Vesikelstreukurveanteil zu sehen war (Abb. 3.16).
0
1
2
250,0 350,0 450,0 550,0 650,0 750,0
Wellenlänge [nm]
Abs
optio
n
Abbildung 3.16: Spektren des freien LHCs ,des LHCs in Vesikeln und der Liposomen-streukurve. Es erfolgte eine Normierung der Proteinkurven auf den Chlorophyllpeak bei671 nm
3.6 Interaktionsuntersuchung von LHC und PCP mit SPR 70
Auch konnte anhand des Spektrums gezeigt werden, dass es sich um intaktes LHC
handelte [Hiller et al., 1993]. Somit wurde die Grundlage für Interaktionsstudien
zwischen LHC und PCP gelegt, da PCP in Anwesenheit von DM denaturiert.
3.6 Interaktionsuntersuchung von LHC und PCP
mit SPR
Mit der Ober�ächenplasmonenresonanzspektroskopie sollte der Nachweis einer In-
teraktion zwischen dem intrinsischen Lichtsammelkomplex LHC und dem löslichen
PCP erbracht werden. Die Phosphatidylcholinvesikel (PC Vesikel), mit und ohne
rekonstituiertem LHc wurden an der Ober�äche des L1 Chips immobilisiert. Es er-
folgte keine Anbindung von PCP an die PC Vesikel, weshalb diese als Messungen
des Hintergrundes verwendet werden konnten. Eine Anbindung und Ablösung des
PCP an die an die Ober�äche des Chips gebundenen Vesikel mit eingebautem LHC
wurde in Abhängigkeit der Zeit aufgenommen (Abb. 3.17, 3.18).
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
0 300 600 900 1200Zeit [s]
RU
Abbildung 3.17: Konzentrationsreihe 1 der Interaktion zwischen PCP und dem immo-bilisierten LHC. Die einzelnen Konzentrationen sind farblich unterschiedlich dargestellt:türkis: 60 µM PCP, gelb: 40 µM PCP, rosa:20 µM PCP und blau: 8,7 µM PCP.
3.6 Interaktionsuntersuchung von LHC und PCP mit SPR 71
Die Graphen der Konzentrationsreihen zeigen, dass die Anbindung des PCPs an
LHC von der Konzentration an PCP abhängig war, da die Geschwindigkeit mit an-
steigender Konzentration zunahm (Abb. 3.17, 3.18).
0
500
1000
1500
2000
0 300 600 900 1200Zeit [s]
RU
Abbildung 3.18: Konzentrationsreihe 2 der Interaktion zwischen PCP und dem immobili-sierten LHC. Die einzelnen Konzentrationen sind farblich unterschiedlich dargestellt: türkis:60 µM PCP, gelb: 40 µM PCP, rosa:20 µM PCP und blau: 8,7 µM PCP. Die schwarzenLinien zeigen die ge�tteten Kurven
Die unterschiedlichen Signalhöhen der beiden Konzentrationsreihen sind mit un-
terschiedlichen Vesikelchargen zu erklären. Dabei sind unterschiedliche Mengen an
LHC in die PC Vesikel rekonstituiert worden. Unter der Annahme einer Reaktion
erster Ordnung zwischen PCP und LHC ( LHC + PCP = LHC-PCP), wurden die As-
soziation mit einer monoexponentiellen Funktion ge�ttet. In dem hier verwendeten
Anfangsbereich konnte kon vernachlässigt werden und es ergab sich für die jeweilig
eingesetzte Konzentration von PCP eine Geschwindigkeit. Diese wurden logarith-
misch gegen die Zeit aufgetragen und eine Gerade durch die erhaltenen Messpunkte
gelegt (Abb. 3.19, 3.20). Aus der Steigung der Geraden konnte die Geschwindigkeits-
konstante kon berechnet werden. Die kon aus den Konzentrationsreihen betrugen
3.6 Interaktionsuntersuchung von LHC und PCP mit SPR 72
3,6*102 mol−1s−1 und 4,8*102 mol−1 s−1.
y = 0,0004x + 0,0239
0
0,01
0,02
0,03
0,04
0,05
0 10 20 30 40 50 60 70Konzentration [µM]
Ges
chw
indi
gkei
t [µM
/s]
Abbildung 3.19: Die Anbindungsgeschwindigkeiten abhängig von der PCP Konzentrati-on (Konzentrationsreihe 1) in logarithmischer Auftragung. Aus der durch die Messpunkteangelegten Geraden wurde kon berechnet
y = 0,0005x + 0,0236
0
0,01
0,02
0,03
0,04
0,05
0,06
0 10 20 30 40 50 60 70Konzentration [µM]
Ges
chw
indi
gkei
t [µM
/s]
Abbildung 3.20: Die Anbindungsgeschwindigkeiten abhängig von der PCP Konzentrati-on (Konzentrationsreihe 2) in logarithmischer Auftragung. Aus der durch die Meÿpukteangelegten Geraden wurde kon berechnet
3.6 Interaktionsuntersuchung von LHC und PCP mit SPR 73
Die Konzentrationsreihen zeigten auch eine schnelle Dissoziation des PCP wo-
durch zur Berechnung der koff , der Anteil der Dissoziation aus den Konzentrati-
onsreihen und eine Langzeitmessung verwendet wurden. Für die Berechnung der
Koff wurde auch hier eine monoexponentielle Kurve an die Dissoziationskurve
angelegt (Abb. 3.21, 3.23). Die aus diesen Kurven berechneten koff betrugen
0
500
1000
1500
0,00 300,00 600,00 900,00 1200,00Zeit [s]
RU
Abbildung 3.21: Dissoziation des PCP vom LHC als Langzeitmessung
Abbildung 3.22: Dissoziationskurve des PCP vom LHC mit angelegtem Fit (monoexpo-nentiellen Funktion
Abbildung 3.23: gdsgsg
3.7 FTIR-ATR 74
1,39*10−2 s−1, 1,56*10−2 s−1 und 1,42*10−2 s−1. Hieraus ergab sich ein Mittelwert
von 1,46 *10−2 s−1. Die Fits für die Anbindung wie auch die Ablösung von PCP an
LHC zeigten Abweichungen von den gemessen Graphen die darauf hinweisen das es
sich hier um eine Liposomenschicht gehandelt haben könnte. Die Anlagerung und
Ablösung von PCP an LHC in den Zwischenräumen der einzelnen Liposomen führte
durch die veränderte Erreichbarkeit zu einem von der monoexponentiellen Funktion
abweichenden Verhalten. Für die Berechnung der A�nität wurden jeweils die konund koff gemittelt. Als Maÿ für die A�nität zweier Reaktionspartner gilt die Disso-
ziationskonstante. Diese ist der Quotient aus koff und kon und betrug hier 35 µM.
Somit konnte eine Interaktion zwischen LHC und PCP im zweistelligen mikromola-
ren Bereich nachgewiesen werden.
3.7 FTIR-ATR
Mit der FTIR-ATR Methode sollte die Interaktion zwischen LHC und PCP unter-
sucht werden. Auch die Vesikelzusammensetzung des Rekonstitutionsproduktes soll-
te hier untersucht werden. Die Spektren der Anbindung von Vesikeln aus der Rekon-
stitution von LHC zeigten eindeutige Amid-I und Amid-II Banden die hier das Signal
vom LHC darstellen. Auch die Lipidbanden waren deutlich erkennbar (Abb. 3.24).
Bei den Lipidbanden handelt es sich um die Asymmetrische CH2 Streckschwingung,
die symmetrische CH2 Streckschwingung und die C=O-Schwingung. Die CO-Bande
bei 2.400 Wellenzahl ist ein Messartefakt, da sie den Rest an CO2 in der Trockenluft
darstellt und kein Signal der Proben ist. Es konnte mit dem Spektrum nicht gezeigt
werden ob der Einbau von LHC in die Lipidbilayer oder in das Lumen der Vesikel
erfolgte. Da zwischen den Messungen hier keine Verschiebung stattfand, konnten
alle Graphen bei den gleichen Wellenzahlen untersucht werden. Für die Auswertung
der Lipidanbindung wurde die Änderung in der Intensität der asymmetrischen CH-
Schwingung bei einer Wellenzahl von 2926 beobachtet. Die Anbindung von Protein
wurde nach Basislinienlorrektur bei einer Wellenzahl von 1547, der Amid-II Bande
untersucht. Es wurde mit einem wässrigen System gearbeitet, weswegen keine Aus-
wertung mit der Amid I Bande erfolgen konnte, da H2O hier stark absorbiert (Abb.
3.24).
3.7 FTIR-ATR 75
Wellenzahl [cm-1]
Abs
orpt
ion
100015002000250030003500
-0.0
10-0
.005
0.00
00.
005
0.01
0
symmetrische CH2 Streckschwingung Amid II
Amid I
asymmetrsicheCH2 Streckschwingung
Differenzsignal CO2-Bande
C=O
Abbildung 3.24: Infrarotspektrum der angebunden LHC-haltigen Vesikel. Zu sehen sinddie Amid I und II Bande des Proteins und die Banden die von den Liposomen herrühren.Die Banden der Liposomen sind: die Asymmetrische CH2 Streckschwingung, die symme-trische CH2 Streckschwingung und die C=O-Schwingung
Es wurde nachgewiesen, dass PCP nicht an BSA bindet weshalb dieses Protein
zur Absättigung der Kristallober�äche verwendet werden konnte (Abb. 3.25).
0,000
0,005
0,010
0,015
0,020
0 100 200 300 400
Zeit [min]
Extin
ktio
n
Abbildung 3.25: Änderung der Intensität bei einer Wellenzahl von 1547
Die Anbindung der Lipsomen ist stark von ihrer Gröÿe abhängig, so konnten Lipid-
vesikel die nach gleicher Vorschrift wie die Rekonstitutionprodukte erstellt wurden,
3.7 FTIR-ATR 76
nach der Aufnahme des Lipidpellets in Pu�er LHC2MgCl2 kaum noch an die Ober-
�äche gebunden werden. Auch Vesikel mit gröÿerem Durchmesser konnten nicht
angebunden werden (Abb. 3.26).
0,000
0,005
0,010
0,015
0,020
0,025
0,030
0 100 200 300 400
Zeit [min]
Abs
orpt
ion
Abbildung 3.26: Anbindungskurve von Vesikeln mit einem Durchmesser von mehr als200 nm
Die Liposomen aus der Rekonstitution von LHC konnten an der Ober�äche des
Germaniumkristalls immobilisiert werden. Für die Anbindung war die Anwesenheit
zweiwertiger Ionen, hier Magnesium essentiell (Abb. 3.27, 3.28).
LHC BSA PCP
Abbildung 3.27: Messung 1 zur Interaktion von LHC und PCP. Blau: Proteinsignal bei1547 cm1, pink: Lipidsignal bei 2926 cm1. Die PCP Konzentration im System betrug 15 µM
3.7 FTIR-ATR 77
LHC PCPBSA
Abbildung 3.28: Messung 2 zur Interaktion von LHC und PCP. Blau: Proteinsignal bei1547 cm1, pink: Lipidsignal bei 2926 cm1. Die PCP Konzentration im System betrug 22 µM
Es enstand jedoch keine gechlossene Schicht, da eine Anbindung von BSA erfolgte
(Abb. 3.27, 3.28, 3.29). BSA bindet nicht an Liposomen aber an Germanium. Es
war ein direkter Zusammenhang zwischen der Qualität der Vesikelimmobilisiation
und der Menge des angebunden BSA zu beobachten. Bei einer geringen Anbindung
der Vesikel wurde eine gröÿere Menge BSA immobilisiert (Abb. 3.29)
LHC PCPBSA
Abbildung 3.29: Messung 1 zur Interaktion von LHC und PCP. Blau: Proteinsignal bei1547 cm1, pink: Lipidsignal bei 2926 cm1. Der Peak bei ca. 75 min. ist auf das Eindringenvon Wasserdampf zurück zu führen.
3.8 Kristallisation von LHC aus Amphidinium carterae 78
Eine vollstängige Absättigung mit Rinderserumalbumin wurde in allen drei Mes-
sungen hier nicht erreicht. An dieser so erhaltenen Ober�äche fand eine Bindung von
PCP statt, die nicht von der Menge des gebunden BSA abhing. Die Steilheit der
Anbindung von PCP nahm mit zunehmender PCP Konzentration zu (Abb. 3.27,
3.28)Eine Interaktion von PCP mit den Lipiden der Vesikel kann ausgeschlossen
werden. Eine Anheftung an den Kristall kann nicht ausgeschlossen werden, da die
Anbindung von BSA nicht konstant wurde und so noch freie Stellen auf dem Kristall
sein konnten. Jedoch ist dieser Anteil bei allen Messungen hier gering. Nach erfolgter
Anlagerung von PCP konnte eine Dissoziation des Komplexes gezeigt werden. Die
Graphen zeigen auch das die Anbindung von PCP während des Experimentes noch
nicht vollständig abgeschlossen war.
Die Untersuchungen mit FTIR-ATR haben gezeigt, dass LHC mit PCP interagiert.
Somit muss LHC auch in die Membran integriert sein, da sonst keine Anbindung
von PCP an LHC möglich gewesen wäre. Es konnte hier bestätigt werden, dass die
Rekonstitution von LHC in die Vesikelbilayer erfolgreich war.
3.8 Kristallisation von LHC aus Amphidinium
carterae
Zur Au�ösung einer Proteinstruktur mittels Röntgenbeugung sind Proteinkristalle
nötig. Innerhalb dieser Arbeit sollten diese in Kristallisationsexperimenten von LHC
hergestellt werden. Erste Experimente wurden schon während der Diplomarbeit [Jo-
hanning, 2005] durchgeführt und die dort erhaltenen erfolgreichen Bedingungen soll-
ten auf die Bildung göÿerer Einkristalle optimiert werden
Bei der Kristallisation mit den kommerziellen Screens CryoI (Emerald BioStructu-
res), CryoII (Emerald BioStructures), Membfac(Hamilton), CrystalI(Hamilton) und
CrystalII in Strips erfolgte bei zwei Bedingungen ein Kristallwachstum (Abb. 3.30).
Hierbei handelte es sich um die Bedingung 19 des CryoII Screens (Acetat pH 4,5,
40 %PEG 600, 0,2 M MgCl2 und der Bedingung 15 des Crystal I Screens (0,2 M
Ammonoumsulftat, Na-cacodylate pH 6,5, 30 % PEG 8000). Die gebildeten Kristalle
waren kleiner als 50 µm und meist verwachsen.
3.8 Kristallisation von LHC aus Amphidinium carterae 79
A B
50 µm50 µm
Abbildung 3.30: Kristalle nach kommerziellen Screens. A: Crystal I Screen, B: Cryo II
Screen
Basierend auf diesen Kirstallisationslösungen und aus den Bedingungen der Di-
plomarbeit [Johanning, 2005] wurde ein Screen entwickelt, der eine Variation der
Magnesiumchloridkonzentraztion von 0,05 M bis 2 M beinhaltete. Die PEG 400
Konzentration betrug 20 %, 30 % oder 40 %. Es wurden verschiedene Pu�er einge-
setzt, Hepes pH 7,5. Na-cacodylate pH 6,5 und Na-acetat pH 4,5. Dies führte bei
drei Bedingungen zur Ausbildung von Kristallen (Abb. 3.31).
A CB
500 µm500 µm500 µm
Abbildung 3.31: LHC Kristalle nach 6 Monaten Inkubation bei 18 °C. A: 30 % PEG400,0,05 M MgCl2, 0,1 M Hepes pH 7,5. Kristallhaufen, B: 30 % PEG400, 0,1 M MgCl2, 0,1 MHepes pH 7,5. Kleine Kristalle, C: 30 % PEG400, 0,05 M MgCl2, 0,1 M Na-cacodylate pH6,5 Kristalle bis 700 µm Länge
Jedoch nur die Zusammensetzung von 30 % PEG400, 0,05 M MgCl2 und 0,1 M
Na-cacodylate pH 6,5 ergab nach einem Monat Inkubation Einkristalle von 100 µm
Gröÿe. Diese wuchsen im Laufe von 6 Monaten bis zu einer Kantenlänge von 700 µm.
Diese Kristalle wurden ge�scht und es konnten Datensätze von einem Kristall am
Synchotron aufgenommen werden. Im Verlauf der Auswertung stellte sich heraus,
dass die gemessenen Daten nicht für die Au�ösung der Struktur ausreichten. Die
3.8 Kristallisation von LHC aus Amphidinium carterae 80
dafür notwendige Reproduktion der Kristalle mit dem Screen schlug fehl, weshalb
neue Variationen getestet wurden.
Der Austausch von PEG 400 zu PEG 600 in den Kristalllisationslösungen führte
nicht zur Ausbildung von Kristallen. Das Verfeinern der PEG 400 Konzentration in
1 % Schritten von 25 % bis 35 % führte ebenfalls nicht zur Ausbildung von Kristallen.
Die Variation durch Zusatz von verschiedenen Salzen (NaCl, LiSO4, Na-citrat und
MgCl2) und der Einsatz verschiedener Pu�er, Tris pH 8,5 Hepes pH 7,5 Na cacodyla-
te pH 6,5 führte erst ab einer Proteinkonzentration von 4,65 mg/ml in Kombination
von min. 28 % PEG 400 zur Kristallbildung. Hierbei war die Detergenzkonzentration
ebenso entscheident wie die Salzkonzentration in der Proteinprobe. Proteinproben
bei denen durch Dialyse gegen LHCP2 das Salz entfernt wurde und die mit einer
2 ml Q-SepharoseXL Tropfsäule (PD10) in LHCP3 umgepu�ert wurden entstanden
nur bei einer Zusammensetzung von 30 % PEG 400, 0,1 M Tris-HCL pH 8,5 und
0,2 M Na-citrat Kristalle. Diese erreichten eine maximale Kantenlänge von 30 µ m
und lagen nicht eindeutig als einzelne Kristalle vor.
50 µm
A
Abbildung 3.32: Kristalle von Proteinprobe nach Salz- und Detergenzentzug
Erst durch Zugabe von min. 0,5 % DM zur Reservoirlösung kam es mit min 28 %
PEG als Fällungsmittel zur Bildung von Einkristallen (Abb. 3.33, 3.34). Die bei den
verschiedenen erfolgreichen Bedingungen die gleiche Form zeigten.
3.8 Kristallisation von LHC aus Amphidinium carterae 81
CB
500 µm500 µm500 µm
A
50µm 50µm 50µm
500 µm500 µm
Abbildung 3.33: Kristalle die enstanden durch Zugabe von Detergenz zur Reservoirlö-sung. A: 29 % PEG400, 0,1 M Na-cacodylate pH 6,5, 0,1 M MgCl2, 0,5 % DM , B: 32 %PEG400, 0,1 M Na-cacodylate pH 6,5, 0,1 M MgCl2, 0,5 % DM , C:28 % PEG400, 0,1 MNa-cacodylate pH 6,5, 0,1 M MgCl2, 1,0 % DM
CB
500 µm500 µm500 µm
A
500 µm500 µm
50µm150 µm 150µm50µm150 µm
500 µm500 µm
Abbildung 3.34: Kristallbildung durch Zugabe von Detergenz. A: 31 % PEG400, 0,1 MNa-cacodylate pH 6,5, 0,1 M MgCl2, 0,5 % DM, B: 35 % PEG400, 0,1 M Tris-HCl pH 8,5,0,2 M NaCl, 0,5 % DM , C:30 % PEG400, 0,1 M Hepes pH 7,5, 0,1 M NaCl, 1,0 % DM
Unterschiede waren hier in der Anzahl und Dicke der Kristalle zu beobachten. Alle
wiesen ein gegenüber dem ersten Kristall, von dem ein Datensatz aufgenommen wur-
3.8 Kristallisation von LHC aus Amphidinium carterae 82
de, abweichendes Längen- zu Breitenwachstum auf. Bis auf die Bedingung mit 35 %
PEG400, 0,1 M Tris-HCl pH 8,5, 0,2 M NaCl, und 0,5 % DM war ein 4: 3 statt einem
10:1 Verhältnis zu beobachten(Abb. 3.33, 3.34). Die oben genannte Kristallisations-
lösung führte sogar zu einem 2:1 Wachstum (Abb. 3.34). Kristalisationsansätze mit
Proteinlösungen, ohne vorherigem Salz- und Detergenzentzug, zeigten bei Magnesi-
umchlorid keine Bildung von Kristallen. Dieser erfolgte nur bei Natriumchlorid, Na-
triumcitrat und Lithiumsulfat als Salzzusatz. Ansätze mit Protein aus der Anionen-
austauschchromatographie wiesen ein Kristallwachstum bei LHC-Konzentrationen
von 5 und 10 mg/ml auf, wohingegen die Proben aus der Gel�ltration erst bei der
höheren Konzentration in die Nucleationszone übergingen (Tab. 3.1). Die hier en-
standenen Kristalle zeigten bis auf Bedingung 8 keine neue Kristallform (Abb. 3.35).
Nr. PEG 400 Tris-HCl pH 8,5 Nacitrat Probe1 35 % 0,1 M 0,1 M Anion. 5 mg/ml2 35 % 0,1 M 0,2 M Anion.10 mg/mlNr. PEG 400 Na-cacodylate pH 6,5 Nacitrat Probe3 35 % 0,1 M 0,2 M Anion. 10 mg/mlNr. PEG 400 Tris-HCl pH 8,5 NaCl Probe4 30 % 0,1 M 0,2 M Anion. 5 mg/ml5 35 % 0,1 M 0,2 M Anion. 5 mg/ml, Gelf. 10 mg/mlNr. PEG 400 Hepes pH 7,5 NaCl Probe6 30 % 0,1 M 0,2 M Gelf. 10 mg/mlNr. PEG 400 Na-cacodylate pH 6,5 NaCl Probe7 30 % 0,1 M 0,2 M Anion. 5 mg/mlNr. PEG 400 Hepes pH 7,5 LiSO_4 Probe8 30 % 0,1 M 0,2 M Gelf. 10 mg/ml
Tabelle 3.1: Erfolgreiche Kristallisationsbedingungen
BA
150µm150µm
Abbildung 3.35: Kristalle der Bedingung 8 A: verwachsene Kristalle, B: Einkristalle
3.8 Kristallisation von LHC aus Amphidinium carterae 83
Es konnten jedoch nur Datensätze von Kristallen der Bedingung 6 aufgenommen
werden. Diese führten wiederum trotz erhöhter Datenmenge nicht zur Strukturauf-
klärung. Eine weitere Optimierung war deshalb notwendig.
Aufgrund des Ein�usses der Detergenzmenge auf die Kristallisation wurden kommer-
zielle Screens (CryoI ,CryoII, Crystal I, Crystal II, Wizrad I, Wizard II, PEGIon
und Memstart Memfac) mit dem Roboter unter Zugabe von 0,5 % und 1 % DM
zur Proteinlösung durchgeführt. Es wurden die gepoolten und konzentrierten Frak-
tionen der Anionenaustauschchromatographie und der Gel�ltration ohne Salz- und
Detergenzentzug verwendet. Neben den schon bekannt erfolgreichen Zusammenset-
zungen wurden zwei neue Mischungen für die Ausbildung von Kristallen entdeckt.
Hierbei handelt es sich um die Bedingung 25 (0,1 M Magnesiumchlorid, 0,1 M ADA
pH 6,5 und 12 % (w/v) PEG 6000)und 26(0,1 M ADA pH 6,5, 12 % MPD) aus dem
Memstart+Memfac Screen(Abb. 3.36).
500 µm500 µm
A
50µm
500 µm500 µm
50µm
B
Abbildung 3.36: LHC Kristalle mit der neuen Kristallisationslösungen aus dem Screen.A: Memstart+Memfac;25, B: Memstart+Memfac;26
Es entstand keine neue Kristallform. Der Ersatz von Na-cacodylate durch ADA
verbesserte die Kristallisation nicht. Die Variation aus den Bedingung 25 und 26,
mit 10 % bis 30 % MPD bei ADA pH 6,5 als Pu�er sowie dem Zusatz von 0,1 M
oder 0,2 M MgCl2 führte zu keiner Optimierung.
Andere Detergenzmengen die der Proteinlösung zugegeben wurden (0,8 % und 1,5 %)
führten ebensowenig bei den ursprünglich verwendeten Variationen, mit verschiede-
3.8 Kristallisation von LHC aus Amphidinium carterae 84
nen Salzen (NaCl, LiSO4, Na-citrat und MgCl2) und dem Einsatz verschiedener
Pu�er (Tris pH 8,5 Hepes pH 7,5 Na cacodylate pH 6,5) bei einer PEG Konzen-
tration von 10 - 35 % zu einer Verbesserung, wie die Verwendung anderer Pu�er
(CHAPS pH 9,5, MES pH 6,5,). Es enstanden immer kleine längliche Kristalle mit
geringer Di�raktion.
Auch die Einführung eines Konzentrators mit 100 kDa Ausschlussvolumen und die
Erhöhung der Ausgangssalzkonzentration in der Probe auf 500 mM KCl optimierte
die Kristallisation nicht. Um Kristalle mit gröÿerer Kantenlänge zu erhalten erfolgte
daraufhin die Inkubation bei 4 °C anstelle von 18 °C. Die in diesen Ansätzen gebilde-
ten Kristalle (Abb. 3.37) wiesen schlechte Beugungseigenschaften bei Testmessungen
am Synchotron auf.
A
100µm
Abbildung 3.37: Beispiel für die gebildeten Kristalle.
Im weiteren Verlauf wurde nur noch der erste Peak der Gelilftration von LHC
verwendet, da hier eine konstante Salzkonzentration vorlag und die Gröÿe des LHC
in den Ausgangsfraktionen bekannt war.
Da PCP ein stabiles Protein darstellt, welches leichter in eine kristalline Form über-
geht, wurde der Versuch einer Kokristallisation gemacht. Das Experiment wurde mit
LHC und PCP in 10 mg/ml Proteinkonzentrationen mit verschiedenen Zusammen-
setzungen (LHC:PCP: 1:1; 2:1; 3:1) und Screens (MBclassic (Quiagen), MB II classic
(Quiagen), PEG (Quiagen)) mit dem Phoenix Roboter durchgeführt. Diese Ansätze
führten trotz Detergenz aus der LHC Proteinlösung nur zu einer Ausbildung von
PCP Kristallen. Der LHC Komplex �el in allen Fällen aus. Auch die Verwendung
eines LHC und des PCP Kristallisationsscreens führte nur beim PCP Screen (siehe
Material und Methoden Kristallisation PCP) zur Ausbildung von Kristallen. Hierbei
3.8 Kristallisation von LHC aus Amphidinium carterae 85
handelte es sich wieder um PCP Kristalle. Eine Ausbildung von Kokristallen oder
LHC Kristallen konnte nicht beobachtet werden (Abb. 3.38).
Abbildung 3.38: Kokristallisationsversuch von LHC mit PCP. Von links nach rechtsLHC-Ausfall und PCP Kristalle, PCP Kristalle, LHC-Ausfall und PCP Kristalle
Die Verwendung eines anderen Detergenz bei Kristallisationsexperimenten als bei
der Aufreinigung kann zur Bildung neuer Kristallformen und Verbesserung der Kri-
stallisation insgesamt führen. Der Austausch von DM gegen DDM oder β-OG über
eine Anionenaustauschersäule (QXL 1 ml Testsäulen) schlug jedoch fehl. Die Um-
pu�erung in DDM führte zum Ausfall des Proteins auf der Säule. Die Verwendung
von β-OG führte zur Denaturierung des Proteins (Abb. 3.39).
0,000
1,000
2,000
3,000
250,0 350,0 450,0 550,0 650,0 750,0Wellenlänge [nm]
Abs
orpt
ion
Abbildung 3.39: Detergenzaustausch mit β-OG. Spektrum des eluierten Proteins nor-miert auf 672 nm.
3.8 Kristallisation von LHC aus Amphidinium carterae 86
Die Zugabe von Tween 80 und Triton X100 führte nach 30 min. zu einer leichten
Denaturierung des LHC Komplexes, da die Peaks bei 440 nm und 461nm auf nahezu
gleicher Höhe liegen (Abb. 3.40). Deshalb wurde dieser Ansatz nicht weiter verfolgt.
0,000
1,000
300,0 400,0 500,0 600,0 700,0 800,0Wellenlänge [nm]
Abs
orpt
ion
Abbildung 3.40: Spektren des LHCs , 30 min. nach Zugabe von Triton X100 (2xCMC)oder Tween 80 (2xCMC). Schwarz: Tween80, Pink: TritonX100
Da eine erhöhte Proteinkonzentration von 5-10 mg/ml zu besseren Ergebnissen
führte wurden Kristallansätze mit dem Phoenix Roboter durchgeführt. Es wurden
die kommerziellen Screens JSCG, MBclassic, MBclassic II, Classic, Cryo, PEG, SM1
und SM2 verwendet und die Proteinkonzentrationen 5 mg/ml und 10 mg/ml. Es wur-
de eine konzentrierte Probe und eine nach Dialyse gegen LHCP2 erhaltene konzen-
trierte Proteinlösung verwendet. Es erfolgte bei 10 mg/ml neben der 1:1 Mischung
auch eine 2:1 Mischung. Bei verschiedenen Bedingungen erfolgte ein Kristallwachs-
tum (Tab. 3.41, 3.42).
Screen Bedingung Salz Puffer
Classic 7 0,1 M tri-Natriumcitrate pH5,6
Mbclassic 42 0,35 M Natriumchlorid 0,1 M Tricine pH 8,0
Mbclassic 36 0,05 M Magensiumacetat 0,05 M Natriumacetat pH 4,6
Mbclassic II 30 0,1 M Lithiumsulfat 0,1 M Hepes pH 7,5
0,1 M Natriumchlorid
PEG 73 0,2 M Magnesiumacetat
Cryo 74 0,19 M Calciumchlorid 0,095 M pH7, 5
Abbildung 3.41: Bedingen bei denen Kristalle entstanden. A: LHC aus der Gel�ltration,B: LHC aus der Gel�ltration vor Kristallisation gegen Pu�er 3 dialysiert
3.8 Kristallisation von LHC aus Amphidinium carterae 87
Screen Bedingung Salz Puffer
Classic 39 0,05 M Kadmiumsufat 0,1 M Hepes pH 7,5
40 Natriumcacodylat pH 6,5
46 0,1 M Hepes pH 7,5
77 0,2 M Natriumcitrat 0,1 M Tris pH 8,5
Mbclassic 25 Bis-Tris Propane pH 7,0
28 0,3 M Lithiumsulfat 0,1 M ADA pH 6,5
32 0,1 M Magnesiumchlorid 0,1 M Natriumacetat pH 4,6
36 0,05 M Magnesiumacetat 0,05 M Natriumacetat pH 4,6
38 0,2 M Calciumchlorid 0,1 M Hepes pH 7,5
41
43 0,1 M Magnesiumchlorid
44
96
JSCG 95 0,2 M Magensiumchlorid 0,1 M Bis-Tris pH 5,5
Abbildung 3.42: Bedingen bei denen Kristalle entstanden. A: LHC aus der Gel�ltration,B: LHC aus der Gel�ltration vor Kristallisation gegen Pu�er 3 dialysiert
Neue Zusätze waren Kalciumchlorid, Ammoniumsulfat, Magnesiumacetat und
Kadmiumsulfat als Salz sowie Bicine pH 9,0 und Bis-Tris Propane pH 7,0 als Puf-
fer sowie Natrium- und Kaliumphosphat als Fällungsmittel. Eine neue Kristallform
wurde nicht gefunden. Die meisten Lösungen enthielten PEG 400. Daraufhin wur-
den diese Bedingungen hinsichtlich ihrer PEG Konzentration und Salzkonzentration
variiert. Es entstand immer eine rechteckige Kristallform unabhängig von Salz und
Pu�er. Da keine Kristallform entstanden war, die bei Messungen an die Qualität
des ersten Datensatzes heranreichte wurde die Bedingung 30 % PEG 400, 0,05 M
MgCl_2 und 0,1 M Na-cacodylate pH 6,5 wieder als Ausgang für weitere Experi-
mente verwendet. Durch eine Erhöhung der Proteinkonzentration auf min. 20 mg/ml
konnten Kristalle mit einer Kantenlänge von 100 µ m erhalten werden. Daraufhin
wurde die Reservroirlösung von 25-16 % PEG 400 in 0,5 % Schritten variiert. Als
Pu�er wurde Na-cacodylate pH 6,5 (0,1 M) verwendet und das Salz war MgCl2(0,05 M). Die Anfangs PEG 400 Konzentration im gemischten Tropfen wurde auf
15 % gesetzt. Dies führte zum Wachstum von Kristallen, die am Synchotron Re�ex-
muster bis 3,5 Angström zeigten (Abb. 3.43). Eine Verfeinerung auf einen Screen
mit 18-16 % PEG 400 führte reproduierbar zum Wachstum von Kristallen mit bis
zu 200 µm Kantenlängen (Abb. 3.43)
In Tropfen mit verringertem Volumen (0,5 µl)kam es zu einem schnelleren Kristall-
waschtum. Diese Tropfen gelangten früher in die Nucleatiosnzoine als die gröÿeren.
Neben der Tropfengröÿe beEin�usste auch die Proteinkonzentration die Geschwin-
digkeit der Kristallbildung. So konnte die Ausbildung von Kristalle, bei einer Protein-
3.8 Kristallisation von LHC aus Amphidinium carterae 88
konzentration von 100 mg/ml schon nach fünf Tagen beobachtet werden wohingegen
eine Konzentration von 20 mg/ml erst nach drei Wochen zur Bildung nachweisbarer
Kristalle zur Folge hatte. Deshalb wurde im folgenden nur der Screen von 25-16 %
PEG 400 verwendet.
A
500 µm
Abbildung 3.43: Beispiel von Kristallen, die beim optimierten Screen wuchsen
Aufgrund dessen, dass die PEG 400 Konzentration in der Reservoirlösung und im
Tropfen zu Beginn der Kristallisation nahezu gleich waren wurde eine Kristallisation
unter Öl durchgeführt. Hierbei wurden verschiedene Tropfengröÿen verwendet (1 µl,
3 µl, 6 µl) und zwei verschiedene Ölzusammensetzungen verwendet (Al�s Öl, Paraf-
�nöl). Die Proteinkonzentration betrug 100 mg/ml. Es kam nur zur Ausbildung von
Ausfall und Phasentrennung (Abb. 3.44). Ein Einkristallwachstum oder das Auftre-
ten einer neuen Kristallformen als Verbesserung der hanging drop Versuche konnte
nicht beobachtet werden weshalb dieser Ansatz nicht weiter verfolgt wurde.
A CB
Abbildung 3.44: Kristallisation unter Öl. A: 1 µl Tropfen, B: 3 µl Tropfen, C: 6 µlTropfen
Der membrangebunden LHC Komplex ist im Chloroplasten eingebettet in eine Li-
piddoppelschicht. Deshalb wurde auch eine Kristallisation in kubischen Phasen nach
3.8 Kristallisation von LHC aus Amphidinium carterae 89
dem bR Vorbild durchgeführt [Landau and Rosenbusch, 1996; Rummel et al., 1998].
Bei den Kristallisationsansätzen in kubischen Phasen war ein Ausfall des Proteins
sowie die Ausbildung von Salzkristallen zu beobachten. Ein Wachstum von Protein-
kristallen erfolgte nicht (Abb. 3.45).
A B C
Abbildung 3.45: Kirstallisation von LHC in kubischen Phasen. A: klare Protein-Lipidlösung mit Salzkristallen, B: Ausfall, C: Ausfall mit Salzkristallen
Es war nun möglich mit einem optimierten Screen Kristalle gleicher morphologoi-
scher Form bis zu einer Kantenlänge von 200 µm reproduzierbar zu erstellen die
alle ein ähnliches Beugungsverhalten zeigten. Die Au�ösung der Re�exe betrug bis
zu 3,5 Angström. Es konnten insgesamt 4 verschiedene Kristallformen bei verschie-
denen Bedingungen beobachtet werden die als Grudnform ein Rechteck aufwiesen.
Unterschiede lagen im Längen- Breitenwachstumsverhältnis (von 2:1 bis 10:1). Die
Benutzung eines Konzentrators mit einem Ausschlussvolumen von 100 kDa statt
50 kDa führte nicht zu einer Optimierung. Aussschlaggebend für die reproduzierba-
re Bildung von Kristallen war die PEG 400 Konzentration und die Proteinkonzen-
tration. Eine zu hohe Konzentration an PEG führt eher zum Ausfall des Proteins.
Die Zusammensetzung des Tropfens im Vergleich zum Reservoir ist entscheident für
die Geschwindigeit des Kristallwachstums von LHC. Ebenso die Tropfengröÿe. So
konnte die Wachstumszeit von 6 Monate auf ca. 2 Monate bis zur Endgröÿe der
Kristalle verringert werden
Da die Gel�ltration reproduzierbar min. zwei Peaks zeigte, wurden vom zweite Peak,
der das Dimer von LHC darstellt, Kristallisationsansätze mit dem Phoenixroboter
hergestellt. Es wurden die Screens MB class II, Cryo und Classic (alle Quiagen) ver-
wendet. Die verwendeten Proteinkonzentrationen wurden aufgrund der Erfahrungen
in der Kristallisation vom Trimer auf 10 mg/ml, 30 mg/ml und 60 m/ml eingestellt.
Die Konzentrierung erfolgte mit dem 50 kDa Konzentrator. Das Protein konnte auch
hier erfolgreich kristallisiert werden (Abb. 3.46) (Tab. 3.47).
3.9 Röntgenbeugungsexperimente an LHC Kristallen 90
A B C
E F
D
50µm50µm10µm 50µm
50µm 50µm60µm 50µm
G H
Abbildung 3.46: Kristall der Dimerkristallisation. A: classic 7, B: classic 74, C: classic89, D: classic 92, E: MBclass II 21, F: MBclass II 25, G: MB class II 31. MB class II 44
Screen Nr. Salz Puffer
MB class II 21 0,1 M Natriumchlorid 0,1 M MES pH6,5
MB class II 25 0,1 M Natriumchlorid 0,1 M Hepes pH7,5
MB class II 31 0,1 M Natriumchlorid 0,1 M Tris pH8,5
0,1 M Litiumsulfat
MB class II 44 0,1 M Ammoniumsulfat 0,1 M Hepes pH7,5
classic 7 0.1 M tri-Sodium citrate pH 5.6
classic 74 0,2 M Calciumchlorid 0,1 M Hepes pH7,5
classic 89 0,2 M Litiumsulfat 0,1 M Tris pH8,5
classic 92 0,2 M Ammoniumsulfat 0,1 M MES pH6,5
Abbildung 3.47: Erfolgreiche Kristallisationsbedingungen des LHC �Dimers”
Ebenso wie beim Trimer ist auch hier der Einsatz von PEG 400 entscheident für die
Bildung von Kistallen. Auch die Pu�ersubstanzen und Salze sind aus erfolgreichen
Kristallisationsbedingungen des Trimers bekannt.
3.9 Röntgenbeugungsexperimente an LHC
Kristallen
Die Struktur von LHC sollte mittels Röntgenbeugung gelöst werden. Hierzu wurden
insgesamt 220 Kristalle ge�scht und es erfolgten Messungen mit einem Röntgendif-
fraktometer. Von diesen wurden 87 Kristalle mit dem optimierten Screen hergestellt.
Es wurden 170 Kristalle an einem Synchotron getestet. Die meisten Kristalle zeigten
nur wenige Re�exe und diese waren teilweise noch verschmiert (Abb. 3.48). Wie in
3.9 Röntgenbeugungsexperimente an LHC Kristallen 91
Abschnitt Kristallisation von LHC beschrieben, wurden aufgrund qualitativ minder-
wertiger Beugungmuster die Kristallisationslösungen weiter verändert oder Zusam-
mensetzungen wurden nicht weiter verfolgt.
12 Å
Abbildung 3.48: Beispiel eines Beugungsbildes eines Kristalls mit schlechtenBeuhungseigenschaften
Von 11 Kristallen wurden Datensätze aufgenommen (Tab. 3.2). Allen gemeinsam
war eine Aniosotropie der Beugunsmuster und das Auftreten von Re�exen bis maxi-
mal 3,5 A (Abb. 3.48).
Abbildung 3.49: Beugungsbilder von Kristall 4. Rechts schlechter Beugungsbereicht,links: guter Beugunbgsbereich
3.9 Röntgenbeugungsexperimente an LHC Kristallen 92
Kristall. Bedingung Anzahl GradNr. Messungen4 30 % PEG 4000, 1 M Na-cacodylate pH 6,5,
0,05 M MgCl22 highres:
180,lowres:60lowres:60
55 30 % PEG 400, 0,1 M Hepes pH 7,5, 0,2 M NaCl,1 % DM2
4 highres:230, 180,81lowres:180
56 30 % PEG 400, 0,1 M Hepes pH 7,5, 0,2 M NaCl,1 % DM2
3 138, 23,24
135 Tropfen: 30 % PEG 400, 0,1 M Na-cacodylatepH 6,5, 0,05 M MgCl2
2 60, 30
Reservoir: 15 % PEG 400, 0,1 M Na-cacodylatepH 6,5, 0,05 M MgCl2
138 Tropfen: 30 % PEG 400, 0,1 M Na-cacodylatepH 6,5, 0,05 M MgCl2
1 60
Reservoir: 15 % PEG 400, 0,1 M Na-cacodylatepH 6,5, 0,05 M MgCl2
139 Tropfen: 30 % PEG 400, 0,1 M Na-cacodylatepH 6,5, 0,05 M MgCl2
2 175, 90
Reservoir: 15 % PEG 400, 0,1 M Na-cacodylatepH 6,5, 0,05 M MgCl2
146 Tropfen: 30 % PEG 400, 0,1 M Na-cacodylatepH 6,5, 0,05 M MgCl2
1 180
Reservoir: 15 % PEG 400, 0,1 M Na-cacodylatepH 6,5, 0,05 M MgCl2
151 Tropfen: 30 % PEG 400, 0,1 M Na-cacodylatepH 6,5, 0,05 M MgCl2
1 89
Reservoir: 15 % PEG 400, 0,1 M Na-cacodylatepH 6,5, 0,05 M MgCl2
161 Tropfen: 30 % PEG 400, 0,1 M Na-cacodylatepH 6,5, 0,05 M MgCl2
3 230 SLS,360, 360ESRF
Reservoir: 18 % PEG 400, 0,1 M Na-cacodylatepH 6,5, 0,05 M MgCl2
196 Tropfen: 30 % PEG 400, 0,1 M Na-cacodylatepH 6,5, 0,05 M MgCl2
2 360,360
Reservoir: 16,6 % PEG 400, 0,1 M Na-cacodylate pH 6,5, 0,05 M MgCl2Tabelle 3.2: Kristalle von denen Datensätze aufgenommen wurden
3.9 Röntgenbeugungsexperimente an LHC Kristallen 93
Abbildung 3.50: Beugungsbilder von Kristall 56. Rechts schlechter Beugungsbereicht,links: guter Beugunbgsbereich
Abbildung 3.51: Beugungsbilder von Kristall 161 als Beispiel. Rechts schlechter Beu-gungsbereich, links: guter Beugungsbereich
Es konnten ein Highresolution und Lowresolution-Datensatz des gröÿten Kristalls
(4) aufgenommen werden. Die Messung erfolgte am SLS in 1° Schritten. Die Re-
duktion der Daten erfolgte mit XDS [Kabsch, 1988]. Als Raumgruppe wurde P2
(monoklin zentriert) bestimmt. Die nachfolgenden Tabellen zeigen die Statistik der
beiden Datensätze. Die maximale Au�ösung der Daten wurde aufgrund eines Inten-
sitäts zu Rauschen Wertes von min. 3 A und einem R-meas Wert von unter 40 %
ermittelt. So ergab sich für den Highresdatensatz eine maxmale Au�söung von 3,5 A
und für den Lowresdatensatz von 6 A.
3.9 Röntgenbeugungsexperimente an LHC Kristallen 94
A AnzahlRe�exe
Vollst. R-faktor
I/Sigma R- R
gesamt red. möglich meas mrgd-F8.99 5221 1461 1573 92.9 % 3.9 % 24.48 4.5 % 2.7 %6.41 10076 2676 2688 99.6 % 5.9 % 20.76 6.9 % 4.3 %5.25 13161 3442 3449 99.8 % 6.5 % 14.33 7.5 % 6.3 %4.56 15573 4057 4063 99.9 % 7.5 % 10.71 8.8 % 9.3 %4.08 17579 4565 4577 99.7 % 12.0 % 7.78 14.0 % 15.2 %3.73 19443 5049 5061 99.8 % 21.0 % 4.85 24.4 % 25.0 %3.45 21127 5493 5497 99.9 % 36.4 % 3.13 42.3 % 38.6 %3.23 20624 5870 5870 100.0 % 60.4 % 1.80 71.4 % 81.6 %3.04 9762 5577 6290 88.7 % 272.6 % 0.07 383.2 % 979.6 %total 132566 38190 39068 97.8 % 10.2 % 7.13 12.0 % 23.2 %
Tabelle 3.3: Kristall4: Highresolution Datensatz.
A AnzahlRe�exe
Vollst. R-faktor
I/Sigma R- R
gesamt red. möglich meas mrgd-F12.43 1294 529 624 84.8 % 4.3 % 15.40 5.5 % 4.2 %8.94 2312 927 1025 90.4 % 6.4 % 12.68 8.1 % 6.6 %7.34 3104 1207 1300 92.8 % 10.2 % 8.46 12.8 % 12.5 %6.37 3667 1428 1535 93.0 % 15.9 % 5.75 19.9 % 22.3 %5.71 4174 1626 1725 94.3 % 26.2 % 3.40 32.9 % 39.4 %5.22 4694 1825 1904 95.9 % 39.4 % 2.40 49.4 % 59.9 %4.83 5005 1944 2043 95.2 % 43.6 % 1.97 54.7 % 74.7 %4.53 4265 2074 2193 94.6 % 54.4 % 1.34 70.2 % 92.5 %4.27 2310 1815 2337 77.7 % 65.1 % 0.81 92.0 % 126.2 %total 30825 1375 14686 91.1 % 14.1 % 4.21 17.8 % 33.7 %
Tabelle 3.4: Kristall 4 Lowresolution Datensatz
Durch XSCALE wurden die Datensätze zusammen skaliert und gemittelt. Die
Korrelation der beiden Datensätze lag bei 0,87. Da es sich jedoch um Messungen am
gleichen Kristall bei gleicher Position handelte wurden die aus XSCALE erhaltene
Daten weiter verwendet. Es wurde ein vollständiger Datensatz erhalten.
3.9 Röntgenbeugungsexperimente an LHC Kristallen 95
A AnzahlRe�exe
Vollst. R-faktor
I/Sigma R- R
gesamt red. möglich meas mrgd-F10.00 6116 1118 1166 95.9 % 5.3 % 26.27 5.9 % 2.8 %7.00 13140 2183 2186 99.9 % 8.8 % 22.86 9.6 % 4.0 %5.20 22620 4761 4773 99.7 % 11.5 % 15.07 2.7 % 6.1 %4.50 16423 4290 4308 99.6 % 7.7 % 10.33 9.0 % 9.6 %4.00 19956 5206 5249 99.2 % 13.4 % 7.33 15.7 % 16.4 %3.70 17650 4598 4619 99.5 % 24.2 % 4.53 28.2 % 28.3 %3.50 15301 3984 4004 99.5 % 37.5 % 3.27 43.7 % 38.9 %total 111206 26140 26305 99.4 % 9.8 % 10.23 11.1 % 12.6 %
Tabelle 3.5: Kristall 4, XSCALE der zusammengefügten Datensätze
Die fehlenden Phasen sollten durch molekularen Ersatz mit der Struktur der Erb-
se [Standfuss et al., 2005] als Modell erhalten werden. Dies schlug jedoch mit dem
Trimer des Erbsen-LHCs ebenso wie mit dem Monomer, mit und ohne Wasser im
Modell, fehl. Auch eine Entfernung der Pigmente aus der gelösten LHC Struktur
führte nicht zur Lösung des Phasenproblems. Das von Eckhard Hofmann angefer-
tigte Homologiemodell des LHCs aus A. c. hatte keine Lösung in Molrep zur Folge.
Für die Strukturlösung mit isomorphen Ersatz oder durch MAD Experimnete sollten
neue Kirstalle gezüchtet werden und Datensätze über einen gröÿeren Winkelbereich
aufgenommen werden. Nachfolgend wurde die Zusammensetzung der eingesetzen
Kryolösung optimiert, da Kristalle aus dem Ansatz wie Kristall 4, die über einen
längeren Zeitraum in der eingesetzten Lösung verblieben, sich au�östen.
A
500 µm 500 µm 500 µm
B C
Abbildung 3.52: Au�ösung der LHC Kristalle in der Einfrierlösung. A: t = 0 min., B: t= 10 min., C: t = 30 min.
3.9 Röntgenbeugungsexperimente an LHC Kristallen 96
Die Verwendung eines anderen Pu�ers sowie die Zugabe von 1 % DM, zur ge-
gen Pu�er LHCP3 dialysierten Proteinlösung führte zur Ausbildung von Kristallen
mit einer maximalen Au�ösung von 3,8 A (Kristall 55,56). In höheren Au�ösungs-
schalen waren keine eindeutigen Re�exe vorhanden, da hier der I/Sigma Wert nur
maximal 1,13 war. Die einzelnen Messungen wiesen keine Vollständigkeit über 90 %
auf. Die Kristalle wurden an verschiedenen Stellen gemessen, die einzelnen Datensät-
ze wiesen eine trikline Raumgruppe auf. Für einen vollständigen Datensatz in dieser
Raumgruppe sind Messungen über den ganzen Winkelbereich notwendig. Für eine
bessere Redundanz der erhaltenen Daten sollten die einzelnen Messungen der bei-
den Kristalle miteinander skaliert und gemittelt werden. Die Korrelattion zwischen
den Datensätzen des Kristalls 55 war jedoch zu gering für eine weitere Auswertung
(Tab. 3.6). Möglicherweise lagen hier verschiedene Kristalle miteinader verwachsen
vor und abhängig von der Position im Strahl wurde jeweils ein anderer Kristall ge-
messen. Die Daten von LHC 56 konnten zusammengefügt werden(Tab. 3.6). Die
Tabelle aus XSCALE zeigt auch durch die erhaltenen Statistik das die Messungen
jedoch bei der Raumgruppe P1 nicht ausreichend für die Lösung der Struktur (Tab.
3.7). Messungen über einen Winkelbereich von min. 360 Grad wären hier notwendig
gewesen.
Kristall 55Datensatz gemeinsame Re�exe Korrelation
1 2 2768 0.4681 3 644 0.1582 3 797 0.1941 4 1023 0.8442 4 1819 0.7883 4 677 0.863
Kristall 56Datensatz gemeinsame Re�exe Korrelation
1 2 123 0.9541 3 144 0.9442 3 446 0.979
Tabelle 3.6: Skalierung der Datensätze von Kristalle 55 und 56
3.9 Röntgenbeugungsexperimente an LHC Kristallen 97
A AnzahlRe�exe
Vollst. R-faktor
I/Sigma R- R
gesamt red. möglich meas mrgd-F10.00 2029 955 1146 83.3 % 2.4 % 38.56 3.1 % 2.2 %7.00 4178 1969 2164 91.0 % 4.2 % 22.67 5.5 % 6.1 %6.00 3782 1785 1927 92.6 % 7.4 % 14.02 9.7 % 14.5 %5.00 5721 3171 3842 82.5 % 5.7 % 10.09 8.0 % 16.9 %4.50 4948 2780 3373 82.4 % 6.7 % 8.12 9.5 % 23.6 %3.80 11355 6511 8201 79.4 % 12.5 % 4.80 17.7 % 43.6 %total 32013 17171 20653 83.1 % 5.8 % 11.20 8.0 % 18.9 %
Tabelle 3.7: Die gemittelten Datensätze von Kristall 56
Die durch die Optimierung der Kristallisation reproduzierbar gezüchtete Kristalle
zeigten Re�exmuster bis zu einer Au�ösung von maximal 3,5 Angström. Für eine
eindeutige Raumgruppenbestimmung waren Messungen über min. 180 ° notwendig.
Die höchste Redundanz wurde bei Kristall 161 erreicht. Hier wurden zwei Daten-
sätze über 360 ° am ESRF aufgenommen und eine Messung über 230 ° am SLS
durchgeführt (Tab. 3.8, 3.9, 3.10). Die Datenreduktion erfolgte mit XDS [Kabsch,
1988]. Als dem Re�exmuster zugrunde liegende Raumgruppe wurde P2 bestimmt.
A AnzahlRe�exe
Vollst. R-faktor
I/Sigma R- R
gesamt red. möglich meas mrgd-F10.19 2149 333 344 96.8 % 10.1 % 14.27 11.0 % 8.6 %7.32 4043 565 571 98.9 % 15.6 % 10.30 16.8 % 15.8 %6.01 5248 711 715 99.4 % 25.0 % 7.39 26.9 % 22.2 %5.22 6239 836 843 99.2 % 32.2 % 5.88 34.6 % 30.7 %4.67 7063 941 946 99.5 % 36.5 % 5.37 39.2 % 32.5 %4.27 7541 1034 1038 99.6 % 41.0 % 4.98 44.2 % 35.4 %3.96 8242 1124 1129 99.6 % 44.4 % 4.49 47.7 % 41.5 %3.70 8509 1198 1206 99.3 % 77.0 % 2.69 83.1 % 72.2 %3.49 8353 1258 1304 96.5 % 102.4 % 2.01 111.2 % 95.3 %total 57389 8001 8096 98.8 % 39.4 % 5.22 42.5 % 39.9 %
Tabelle 3.8: Die 1. Messung des Kristalls 161, 360 Grad ESRF
3.9 Röntgenbeugungsexperimente an LHC Kristallen 98
A AnzahlRe�exe
Vollst. R-faktor
I/Sigma R- R
gesamt red. möglich meas mrgd-F10.19 2172 331 343 96.5 % 7.6 % 19.60 8.3 % 5.1 %7.32 4018 564 569 99.1 % 10.1 % 14.29 10.9 % 9.8 %6.01 5210 712 716 99.4 % 14.3 % 11.32 15.4 % 12.3 %5.22 6153 827 834 99.2 % 17.9 % 9.40 19.2 % 15.5 %4.67 7060 941 947 99.4 % 19.4 % 8.98 20.9 % 16.5 %4.27 7514 1033 1037 99.6 % 22.1 % 8.48 23.8 % 18.7 %3.96 8381 1123 1131 99.3 % 24.1 % 7.80 25.9 % 21.3 %3.70 8363 1151 1186 97.0 % 38.2 % 5.48 41.2 % 35.2 %3.49 8917 1250 1296 96.5 % 48.6 % 4.30 52.4 % 45.1 %total 57789 7933 8059 98.4 % 22.0 % 8.58 23.7 % 20.9 %
Tabelle 3.9: Die 2. Messung des Kristalls 161, 360 Grad ESRF
Die Messungen am SLS konnten aufgrund der starken Anisotropie der Daten nur
durch eine Einschränkung in Spotrange auf zwei Bereiche 1-71 ° und 180 ° bis 230 °
ausgewertet werden.
A AnzahlRe�exe
Vollst. R-faktor
I/Sigma R- R
gesamt red. möglich meas mrgd-F8.92 2279 500 511 97.8 % 10.6 % 2278 11.9 % 7.5 %6.34 4172 891 901 98.9 % 12.4 % 4171 13.8 % 11.6 %5.18 5357 1129 1137 99.3 % 15.8 % 5355 17.7 % 15.5 %4.49 6272 1314 1320 99.5 % 17.2 % 6270 19.3 % 16.5 %4.02 7132 1514 1524 99.3 % 18.7 % 7128 20.9 % 21.3 %3.67 7666 1646 1657 99.3 % 25.8 % 7664 29.0 % 34.3 %3.40 8271 1803 1808 99.7 % 38.3 % 8268 43.2 % 51.6 %3.18 8528 1926 1937 99.4 % 73.4 % 8522 83.5 % 91.1 %3.00 7812 1992 2044 97.5 % 119.6 % 7737 138.6 % 169.0 %total 57489 12715 12839 99.0 % 24.1 % 57393 27.2 % 37.0 %
Tabelle 3.10: Die 3. Messung des Kristalls 161, 230 Grad SLS
In Bereichen schlechter Beugunsqualität konnte kaum Übereinstimmung mit den
vorhergesagten Re�exen auf der Grundlage von P2 festgestellt werden. Die Bereiche
guter Qualität entsprachen dem Beugungsmuster eines monoklinen Kristalls. Die
Statistiken zeigen einen hohen R-meas auch bei geringer Au�ösung (Tab. 3.8, 3.9,
3.9 Röntgenbeugungsexperimente an LHC Kristallen 99
3.10). Bei Datensätzen deren Messbereich im guten Beugungsbereich an�ng sind die
Werte für R-meas niedriger (Tab. 3.9). Die einzelnen Datensätze wurden mit dem
Programm XSTATT aus XDS untersucht und es konnte kein Strahlenschaden am
Kristall festgestellt werden. Diese Form der Kristalle war daher stabil genug um
ausreichend Daten sammeln zu können. Es wurde kein Hinweis auf eine fehlerhafte
Auswertung bzw. Problemen bei dieser mit XDS gefunden.
Die mit XDS ausgewerteten Messungen wurden miteinander in XSCALE zu einem
Datensatz mit einer maximalen Au�ösung von 3,7 A skaliert und gemittelt. Es wur-
den die Daten der ersten Messung aufgrund des Ergebnisses bei XDS bis zu einer
Au�ösung von 4,0 A verwendet. Die Daten der zweiten und dritten Messung bis
3,7 A (Tab. 3.11 3.12). Aufgrund der hohen Korreleation zwischen den Datensätzen
und der Statistik aus XSCALE der wurde das Ergebnis für den molekularen Ersatz
verwendet.
Datensatz gemeinsame Re�exe Korrelation1 2 123 0.9741 3 144 0.9522 3 446 0.967
Tabelle 3.11: Skalierung der Datensätze von Kristalle 161
A AnzahlRe�exe
Vollst. R-faktor
I/Sigma R- R
gesamt red. möglich meas mrgd-F10.00 6149 355 365 97.3 % 12.4 % 21.27 12.8 % 4.9 %7.00 12781 670 676 99.1 % 16.2 % 16.10 16.6 % 6.9 %5.80 15056 772 777 99.4 % 22.1 % 12.83 22.7 % 9.1 %5.20 13287 673 678 99.3 % 26.5 % 11.11 27.3 % 11.6 %4.80 13152 661 660 100.2 % 27.4 % 11.09 28.1 % 11.2 %4.50 12922 661 667 99.1 % 31.4 % 10.21 32.3 % 13.2 %4.20 16615 850 854 99.5 % 30.7 % 10.33 31.5 % 12.7 %4.00 14537 743 746 99.6 % 32.2 % 9.53 33.0 % 15.2 %3.70 16549 1384 1399 98.9 % 39.9 % 6.09 41.7 % 28.0 %total 121048 6769 6822 99.2 % 25.7 % 10.95 26.4 % 13.4 %
Tabelle 3.12: XSCALE von Kristall 161 alle Messungen zusammen
3.9 Röntgenbeugungsexperimente an LHC Kristallen 100
Trotz der hohen Datenredundanz bei Kristall 161 konnte auch hier keine Bestim-
mung der Phasen durch molekularem Ersatz in Molrep erreicht werden. Auch mit
dem um die Loopregionen reduzierten Modell der Erbse kam es zu keiner Lösung in
Molrep.
Der Vergleich der Zellparameter in Raumgruppe P1 zwischen den Kristallen der Da-
tensätze ergab, das der erste Kristall (4) wie auch Kristall 55 eine stark verlängerte
Achse aufwiesen.
Kristall EinheitszellkonstantenNr. a b c alpha beta gamma4 80,83 99,65 136,33 89,9 89,64 75,6655 84,20 102,65 142,70 104,57 99,76 110,8356 72,12 84,12 102,82 110,92 103,81 100,54135 72,97 72,97 79,60 64,27 64,27 69.51138-3 76,01 76,08 76,10 98,41 113,55 116,87138-6 15,85 64,88 65,28 79,62 89,95 89,98139 72,75 73,12 79,48 64,53 64,74 69,56146 75,53 76,11 76,98 98,80 117,46 112,14151 15,84 65,40 65,44 100,79 90,00 90,05161 70,76 70,77 77,47 65,41 65,74 71,52196 72,53 72,99 78,19 64,90 64,95 69,64
Tabelle 3.13: Zellparametervergleich bei Raumgruppe P1 (trikline) der gemessenenKristalle
Hingegen hatten LHC-138 Datensatz 6 und 151 eine stark verkürzte Achse. Die
deutet auf eine falsche Indizierung hin. Bei beiden Messungen wurde nur ein geringer
Winkelbereich gemessen.Die Zellparameter der anderen Kristalle sind ähnlich (Tab.
3.13). Den Kristallen der opimierten Bedingungen lag somit nicht nur morphologisch
sondern auch nach Auswertung die gleiche Kristallsymmetrie zugrunde.
Das Phasenproblem konnnte nicht mit dem molekularen Ersatz gelöst werden. Eine
experimentelle Bestimmung ist mit SAD Messungen möglich. Durch die Reprodu-
zierbarkeit der Kristalle war es nun möglich Kristalle in Schwermetallösungen zu
soaken um SAD Experimente durchführen zu können. Es wurden die Schwermetall-
verbindungen Cl4K2Pt, KAu(CN)2, HgCl2, K2Pt(NO2)4 und KAuCl4 des Schwerme-
tallscreen von Jena Biosciences verwendet. Die Konzentration in der Kristallisations-
lösung mit 0,16 % DM betrug 10 mM. Die Kristalle wurden in die schwermetallhal-
tige Kristallisationslösung mit einem Loop überführt und für 1 h inkubiert. Danach
3.10 Die Aufreinigung von PCP 101
erfolgte das backsoaken in der Kristallisationslösung mit 0,16 % DM ohne Schwer-
metall. Die Dauer des soaken von 1 h Stunde führte zu einem Schwermetallsignal
bei Messungen am Synchotron. Es konnte ein Qualitätsverlust der Beugung festge-
stellt werden. Daraufhin wurde die Vorschrift für das soaken von Kristallen in Gold
optimiert und es wurde ein Datensatz eines LHC Kristalls an der Goldkante aufge-
nommen werden. Ob Gold in den Kristall eingebaut wurde konnte am ESRF nicht
gezeigt werde, es wurde nur ein Goldsignal der montierten Probe nachgewiesen. Für
den Vergleich mit den schon gemessenen Daten wurde ein nativer Datensatz dieses
Kristalls aufgenommen.
3.10 Die Aufreinigung von PCP
Innerhalb dieser Arbeit sollte das Protokoll für die Aufreinigung von PCP optimiert
werden. Die Auftrennung von PCP in die einzelnen Isoformen sollte im Vergleich zur
Diplomarbeit[Johanning, 2005] verbessert werden. Die einzelnen Peaks der Chroma-
tofokussierung sollten näher untersucht werden.
Eine Optimierung sollte die Umstellung auf eine Anionenaustauschchromatographie-
säule statt der Chromatofokussierung sein. Die beste Auftrennung des PCP Gemi-
sches wurde durch die DEAE Matrix erreicht. Die Elution erfolgte in zwei Peaks , die
bei der Verwendung des QXL und des Materials weniger gut getrennt wurde (Abb.
3.53). Eine Anbindung an die Matrix Source15S erfolgte nicht (Abb. 3.53). Das in
anderen Arbeiten verwendete Material DEAE [Haxo et al., 1976; Song et al., 1976]
war auch für eine Aufreinigung mit dem isolierten PCP aus der eigenen Anzucht
von A.c. am besten geeignet.
Die Verwendung des Anionenaustauschers führte jedoch nicht zu einer besseren Auf-
trennung der Isoformen. Die Elution bei Verwendung der XK26/20 Säule erfolgte in
ein oder drei Peaks in Abhängigkeit des Gradienten. Ein �acherer Gradient führte
zu einer besseren Auftrennung (Abb. 3.54). Das UV/VIS Spektrum der Peaks zeigte
das es sich nicht um drei Isoformen handelte, da der zweite Peak weniger Pigmente
gebunden hatte (Abb.3.55). Der erste und zweite Peak waren nahezu deckungsgleich
und es könnte sich hierbei um zwei Isoformen gehandelt haben. Dies stellte keine
3.10 Die Aufreinigung von PCP 102
Verbesserung im Vergleich zur Chromatofokussierung dar.
1000
1500
2000
500
3000
0
10 30 ml
AU
4020
2500
3500
50
%B
80
60
40
20
0
Abbildung 3.53: Elutionspro�le der Anionaustauschchromatographiesäulen. Pink: Sour-ce15S, grün: DEAE, schwarz: QXL
0
1 3 CV
AU
62
500
7
%B
80
60
40
20
0
400
300
200
100
0 4 5
Abbildung 3.54: Elutionspro�l der Anionenaustauschchromatographie DEAE �acherGradient. Schwarz: 478 nm, blau: 280 nm, pink: 672 nm
3.10 Die Aufreinigung von PCP 103
0,00
1,00
2,00
3,00
4,00
5,00
250 350 450 550 650 750Wellenänge [nm]
Abs
orpt
ion
Abbildung 3.55: UV/VIS Spektren der drei Peaks der Anionenaustauschchromatogra-phie mit der XK26/20 DEAE Säule. Blau: Peak 1, pink: Peak 2, grün: Peak 3
Die Reinigung über eine Gel�ltration mit dem Säulenmaterial SepharoseS300 führ-
te zu Elutionspro�len mit ein, zwei oder fünf Peaks unabhängig von der Art des
Aufschlussgerätes (Abb. 3.56).
Abbildung 3.56: Beispiele der Elutionspro�le der Gel�ltration mit dem SäulenmaterialSepharoseS300
3.10 Die Aufreinigung von PCP 104
Es konnte auch keine Korrelation der Elution mit der Lagerzeit des PCP Gemi-
sches fest gestellt werden. Die Auftrennung in fünf Peaks erfolgte nur bei einem
Pu�er 1 mM Tris pH 8,4. Die Reproduzierbarkeit des Ergebnisses war schwierig.
Für die Chromatofokussierung wurde meist ein Pool aus PCP von CV 0,52 bis 0,57
verwendet. Alle Chromatofokussierungsläufe zeigten eine Auftrennung des PCP in
neun Proteinpeaks. Die Elutionspro�le sind in Ahängigkeit von der Steilheit des pH-
Gradienten verschoben (Abb. 3.57). Die Ausprägung der einzelnen Peaks variierte
in den Säulenläufen. Dies ist durch unterschiedliche Chargen an PCP begründet, da
PCP gleicher Gröÿe aufgetragen wurde.
1
2
3
3
4
4
5
5
6
6
7
7
8899
1000
1500
2000
AU
500
0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 CV
6,0
6,5
7,0
7,5
8,0
8,5
pH
Abbildung 3.57: Elutionspro�le der Chromatofokussierung bei unterschiedlich steilen pHGradienten. Blau: �acher Gradient, Pink: steiler Gradient
Den hier getrennten PCP Peaks hatten unterschiedliche Molekulare Gröÿen in
der Gel�ltration (Abb. 3.58). Der Peak sechs zeigt in der Gel�ltration ebenso zwei
Peaks wie der Peak 4. Der Pool für die einzelnen Peaks war aufgrund der geringen
Trennung schwierig und so können Gemische entstanden sein.
3.10 Die Aufreinigung von PCP 105
4
1000
1500
2000
500
2500
0
0,5 0,55 0,60 0,65 0,70 CV
3000
AU6
9
8 34
1
7
2
Abbildung 3.58: Die Gel�ltration der einzelenen Peaks der Chromatofokussierung
Durch die Eichung der Gel�ltration (Abb. 3.59) konnten die Molekülmassen be-
stimmt werden (Tab. 3.14. Nur die Gröÿe des Peak sechs entspricht dem Trimer von
PCP. Der pI war nach dem Gradienten der Chromatofokussierung 6,8. Das PCP der
Hauptform hat einen pI von 7,5 hier konnte nur Protein in die Gröÿe eines Dimer
nachgewiesen werden (Peak5).
Peaknr. kav ca. Masse kDa Peaknr. kav ca. Masse kDa1 0,44 55 6 0,33 0,42 103, 632 0,44 55 7 0,41 703 0,43 61 8 0,4 694 0,38, 0,42 80, 63 9 0,41 705 0,39 78Tabelle 3.14: Gröÿenverteilung der Peaks der Chromatofokussierung
3.10 Die Aufreinigung von PCP 106
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
10 100 1000Molekulrgewicht [kDa]
kav
Abbildung 3.59: Eichegrade der Gel�ltration Superdex200 HR10/30 für die Gröÿenbe-stimmung der Peaks
Alle Peaks hatten ein 32 kDa groÿes Approtein. Die UV VIS Spektren zeigten
leichte Unterschiede der einzelnen Peaks in der Peridinin und Chlorophyll a Absorp-
tion.
0,00
1,00
2,00
3,00
4,00
5,00
250 350 450 550 650Wellenlänge [nm]
Abs
orpt
ion
Peak2Peak3Peak4Peak5Peak7Peak8Peak9Peak6
Abbildung 3.60: UV/VIS Spektren der einzelnen Peaks. Verwendet wurde jeweils dieFraktion mit dem Absorptionsmaximum in der Gel�ltration.
3.10 Die Aufreinigung von PCP 107
Durch die Chromatofokussierung konnte keine Auftrennung von PCP Isoformen
als Trimere gezeigt werden. Den Peaks der Chromatofokussierung lagen Dimere oder
Monomere zugrunde die Unterschiede in der Peridinin und Chlorophyllabsorption
aufwiesen.
Für Studien zur Interaktion von LHC und PCP sollte das Trimer von PCP aufgerei-
nigt werden. Es konnte gezeigt werden, das der Zusatz von Magnesiumchlorid zur
Elution in zwei Peaks führte (Abb. 3.61). Das Elutionvolumen von 0,6 CV für den
ersten und ca. 0,7 CV für den zweiten Peak entsprach, unter Berücksichtigung der
Ungenauigkeit der Eichung der Gel�ltration, dem Trimer und dem Monomer von
PCP. Es konnte mehr Trimer im Verhältnis zum Monomer eluiert werden. Säulen-
läufe ohne Magnesiumchlorid wiesen einen Peak bei ca. 0,7 CV auf und einen bei
0,61 CV oder 0,63 CV auf (Abb. 3.61)Der Peak bei 0,61 CV entspricht ca. 70 kDa
und der bei 0,63 CV ca. 60 kDa. Hierbei handelt es sich um Dimere oder Abbau-
produkte des PCP. Der Peak bei 0,7 CV entsprach wieder dem Monomer des PCP.
Der Unterschied in der Signalhöhe ist geringer als bei der Elution mit zweiwertigen
Ionen im Pu�er. Das SDS Gel zeigte (Abb. 3.62), dass den Monomerfraktionen auch
Peptide unter 32 kDa auftraten. Somit handelt es sich beim zweiten Peak um ein
Monomer- Abbauproduktgemisch.
1000
1500
2000
500
2500
0
0,2 0,60 CV
AU
0,800,4
Abbildung 3.61: Elutionspro�le der Gel�ltration mit Superdex200 HR10/60. Pink: mit20 mM MgCl2 im Laufpu�er, grün und blau: Laufpu�er ohne MgCl2
3.10 Die Aufreinigung von PCP 108
21,5 kDa
31,0 kDa
66,2 kDa
45,0 kDa
97,4 kDa
1 2 3 4 5 7 8 9 106 11 12 13
14,4 kDa
14 15
Abbildung 3.62: SDS-Gel der Gel�ltration mit einem PEak bei 0,37 CV. 1-2:vor Protei-nelution 3: Peak bei 0,37 CV,4: Fraktion nach Peak1, 5 und 7-11: Proteinelution, 6: Marker,12-15 Fraktionen nach Proteinelution
Teilweise konnte ein Peak bei 0,37 CV beobachtet werden. Dieser trat nur bei
Zellaufschlüssen mit dem Fluidizer unregelmäÿig auf.Das Elutionsvolumen lagt ge-
ringfügig über dem Auschlussvolumen der Säule. Das eluierte Protein wies damit
eine Gröÿe über 1000 kDa auf.Die Fraktionen waren grünbraun gefärbt und wiesen
das Spektrum von LHC auf (Abb. 3.63). Im SDS-Gel trat eine Bande bei 19 kDa
auf (Abb. 3.62).
0,000
0,100
0,200
0,300
0,400
0,500
250,0 350,0 450,0 550,0 650,0 750,0Wellenlänge [nm]
Abs
orpt
ion
Abbildung 3.63: Spektrum des Peaks bei 0,37 CV.
Ein ATR Spektrum der Probe zeigte die AmidI und die Amid II Banden sowie
kleine Lipidbanden
3.11 Hochaufgelöster Datensatz von PCP aus A. c. 109
100015002000250030003500Wavenumber cm-1
-0.0
2-0
.01
0.00
0.01
0.02
Abs
orba
nce
Uni
ts
Amid I
C=O, Lipid
AmidII
symmetrische CH2 Streckschwingung
asymmetrsiche CH2 Streckschwingung
Abbildung 3.64: ATR-Spektrum des Peaks bei 0,37 CV
3.11 Hochaufgelöster Datensatz von PCP aus A. c.
Das aus der Aufreinigung von LHC erhaltene PCP im Überstand besteht zu 90 %
aus der Hauptform von PCP und wurde nach beschriebenem Protokoll kristallisiert.
Die erhaltenen Kristalle wuchsen bis zu einer Gröÿe von 300 mum Kantenlänge.
Die native Datensätze wurden am SLS aufgenommen. Aufgrund der Kenntnisse über
PCP Kristalle wurden Messungen mit min. 180 Grad vorgenommen. Um in allen
Au�ösungsbereichen vollständige Daten zu erhalten wurde ein Highresolution und
eine Lowresolution Datensatz aufgenommen. Zur Minimierung eines Strahlenscha-
dens wurden die Messungen bei 100 K durchgeführt.
Belichtungszeit 1.0 sGrad pro Bild 0,75
Anzahl aufgenommener Bilder 239Wellenlänge 0,980 Angström
Detektorabstand 120 mmTabelle 3.15: Highresolution-Daten der Messung am SLS
3.11 Hochaufgelöster Datensatz von PCP aus A. c. 110
Belichtungszeit 1.0 sGrad pro Bild 1.0
Anzahl aufgenommener Bilder 239Wellenlänge 0,980 Angström
Detektorabstand 400 mmTabelle 3.16: Lowresolution-Daten der Messung am SLS
Mit dem Programm XDS [Kabsch, 1988] erfolgte die Datenreduktion (Tab. 3.17,
3.18). Die Statistik zeigte eine maximale Au�ösung von 1,27 A im Highresolution
Datensatz. Die Raumgruppe wurde auf mC bestimmt.
A AnzahlRe�exe
Vollst. R-faktor
I/Sigma R- R
gesamt red. möglich meas mrgd-F3.53 59180 31473 35592 88.4 % 3.5 % 16.00 4.8 % 3.7 %2.50 115942 60201 64807 92.9 % 4.0 % 15.24 5.5 % 4.5 %2.04 150379 78987 83893 94.2 % 4.8 % 13.61 6.6 % 5.5 %1.77 182230 96117 99300 96.8 % 6.2 % 10.60 8.4 % 8.1 %1.58 209790 111063 112641 98.6 % 8.7 % 7.68 11.7 % 12.6 %1.44 229997 123083 124568 98.8 % 14.0 % 5.10 18.7 % 21.8 %1.34 241292 131917 135493 97.4 % 22.9 % 3.19 30.6 % 37.5 %1.25 164563 99043 145320 68.2 % 31.3 % 2.17 42.6 % 53.8 %1.18 69001 48353 154710 31.3 % 40.5 % 1.51 56.0 % 73.8 %total 1422374 780237 956324 81.6 % 5.2 % 7.31 7.1 % 11.6 %
Tabelle 3.17: PCP Kristall: Highresolution Datensatz.
Die Daten konnten miteinander in XSCALE skaliert werden, mit einer Korrela-
tion von 0,993 Die erhaltene Statistik zeigt für die zugrunde gelegte Raumgruppe
vollständige Daten.
3.11 Hochaufgelöster Datensatz von PCP aus A. c. 111
A AnzahlRe�exe
Vollst. R-faktor
I/Sigma R- R
gesamt red. möglich meas mrgd-F8.66 4026 2113 2413 87.6 % 1.6 % 35.87 2.2 % 1.8 %6.15 7899 4032 4327 93.2 % 2.0 % 31.57 2.8 % 2.3 %5.03 10262 5221 5565 93.8 % 2.2 % 29.70 3.0 % 2,5 %4.36 11866 6062 6573 92.2 % 2.2 % 30.35 3.0 % 2.5 %3.90 13510 6937 7482 92.7 % 2.4 % 28.88 3.3 % 2.7 %3.56 13597 7458 8261 90.3 % 2.6 % 26.08 3.6 % 3.0 %3.30 10878 6953 8950 77.7 % 2.7 % 21.40 3.8 % 3.3 %3.09 7024 5072 9630 52.7 % 2.7 % 17.25 3.9 % 3.5 %2.91 2627 2156 10309 20.9 % 3.5 % 14.31 5.0 % 4.5 %total 81689 46004 63510 72.4 % 2.3 % 26.17 3.2 % 2.7 %
Tabelle 3.18: PCP Kristall: Lowresolution Datensatz.
A AnzahlRe�exe
Vollst. R-faktor
I/Sigma R- R
gesamt red. möglich meas mrgd-F10.00 3913 759 843 90.0 % 2.3 % 70.96 2.5 % 1.1 %5.00 37726 5531 5637 98.1 % 3.4 % 55.16 3.6 % 1.4 %3.00 137207 22753 23103 98.5 % 4.1 % 38.66 4.4 % 2.1 %2.30 127374 34747 35772 97.1 % 3.9 % 25.06 4.6 % 3.0 %2.00 120099 33197 33834 98.1 % 4.7 % 20.42 5.5 % 3.9 %1.80 133289 36433 36718 99.2 % 6.0 % 16.63 7.1 % 5.5 %1.65 148963 40237 40334 99.8 % 7.7 % 13.58 9.1 % 7.5 %1.55 134030 36219 36239 99.9 % 10.6 % 10.64 12.5 % 10.9 %1.45 171608 46792 46864 99.8 % 15.3 % 7.93 17.9 % 16.3 %1.40 105016 28665 28691 99.9 % 21.4 % 5.94 25.1 % 23.4 %1.35 116616 33088 33134 99.9 % 25.9 % 4.91 30.5 % 29.4 %1.27 57395 56811 64323 88.3 % 32.0 % 3.43 38.9 % 43.1 %total 1393236 375232 385492 97.3 % 4.8 % 13.92 5.4 % 8.1 %
Tabelle 3.19: XSCALE der PCP Datensätze
Mit XDSCONV wurden die Daten in andere Formate konvertiert um in Shelx und
CCp4i für die Auswertung genutzt werden zu können.
Die Phasen wurde durch molekularen Ersatz mit Molrep erhalten. Als Modell diente
die bekannte Struktur der Hauptform von PCP [Hofmann, 1996]. Die Verfeinerung
der Daten erfolgte mit Shelx H für groÿe Proteine und manuell mit COOT in mehre-
3.11 Hochaufgelöster Datensatz von PCP aus A. c. 112
ren Zyklen. Daten für Rfree wurden mit Shelx generiert. Die Restraints für DGDG,
PID und CLA wurden aus dem PDB �le der Struktur von MFPCP [Hofmann, 1996]
bei 2 A mit ShelX H erstellt. Nach dem Verfeinerungslauf sechs wurden die Res-
traints für DGDG mit PRODRG [Schuettelkopf and van Aalten, 2004] generiert.
Die R-faktoren verringerten sich mit jeder Verfeinerung. Die Kontrolle durch den
Run Programm Rfree Rfac1 Shelx rigid body 33,97 % 34,01 %2 Shelx restaindes 27,1 % 25,53 %3 Coot4 Shelx restrained 26,8 % 25,2 %5 Coot6 Shelx restrained 26,44 % 24,87 %7 Coot Einbau von Wasser8 Shelx 23,93 % 22,37 %
Tabelle 3.20: Verfeinerung der Daten von PCP mit Shelx und Coot
Rfree zeigt das keine Über�ttung der Daten stattfand. Folgenden Pigmente und
Aminosäuren sind noch fehlerhaft positioniert:
Monomer 1 Monomer 2 Monomer 3DGDG 1615 DGDG 2615 DGDG 3615Glu 1227 Glu 3227
Thr 2159Lys 2148Ile 2073
Lys 3223Lys 3148
Die hier erhaltene Struktur entsprach der publizierten [Hofmann, 1996] (Abb.
3.65).
3.11 Hochaufgelöster Datensatz von PCP aus A. c. 113
Abbildung 3.65: Die Struktur von MFPCP bei 1,27 A
4.1 Belichtungstest von Amphidinium carterae 114
4 Diskussion
4.1 Belichtungstest von Amphidinium carterae
Es konnte nachgewiesen werden, das die Lichtintensität das Wachstum, wie auch die
Färbung der Zellen beein�usste.
Die Veränderung der Zellfarbe nach grünlich-gelb bei steigender Belichtung und da-
mit die Verringerung der zur Braunfärbung führenden Peridinine wies daraufhin
das nicht nur die Transkriptionsraten der Lichtsammelkomplexe durch steigende
Belichtung sinken [ten Lohuis MR and Miller, 1998][Roman et al., 1988], sondern
auch die Bildung der gesamten Komplexe. Auch das kein PCP bei Starklichtanzuch-
ten nachweisbar war unterstützt dies. Der fehlende Nachweis von PCP bei Zellen
die im Schatten wuchsen ist hier auf die geringe Zellzahl zurückzuführen. Neben
den Lichtsammelkomplexen existieren auch andere Chlorophyll-haltige Komplexe
[Boczar and Prezelin, 1987], die die Photosysteme darstellen. Diese enthalten weniger
Karotinoide. Durch die Verringerung der Lichtsammelkomplexmenge bei Starklicht-
anzuchten könnte die Färbung der Zellen dann vorwiegend von den Photosystemen
hervorgerufen werden. Wenige LHC Moleküle �ankieren die Photosysteme und über-
tragen nach Anregung Energie auf diese. Bei einer Belichtung von 20 µE ändert sich
dieser Zustand. Die Bildung der Lichtsammelkomplexe LHC und PCP wird gestei-
gert und die Zellen erhalten eine braune Färbung. Es kommt zu einer optimalen
Ausnutzung des einstrahlenden Lichts. Der Energietransfer erfolgt PCP vorwiegend
zum LHC und nachfolgend zu den Photosystemen.
4.2 Aufreinigung von LHC aus Amphidinium carterae 115
4.2 Aufreinigung von LHC aus Amphidinium
carterae
Die Ausbeute an LHC konnte stark gesteigert werden, so dass dies kein limitierender
Faktor bei weiteren Experimenten ist.
Nicht alles LHC konnte aus den Zellen isoliert werden, da keine vollständige So-
lubilisierung stattfand. Trotz des schon verbesserten Systems kann hier noch eine
Optimierung in Bezug auf die Proteinmengeneinstellung für die DM Zugabe erfolgen
um die Ausbeute an LHC noch zu erhöhen.
Die Anionenaustauschchromatographie trennte andere Proteine von LHC. Das Elu-
tionspro�l zeigte einen breiten Peak der sich möglicherweise in zwei bis drei Peaks
aufgespalten werden könnte. Die Verwendung eines �acheren Gradienten könnte hier
mehr Aufschluss geben. Möglicherweise lag das Protein hier schon als Trimer und
Dimer oder als Trimer-, Dimer- und Monomer-gemisch vor. Dies kann anhand des
Elutionspro�ls nicht beurteilt werden. Eine nachfolgende Gel�ltration war deshalb
unerlässlich.
Das LHC aus dem Spinat und der Erbse liegen als Trimer [Liu et al., 2004; Salverda
et al., 2003] vor. Da LHC aus A. c. einen ähnlichen Aufbau besitzt kann davon ausge-
gangen werden dass die Organisation von LHC in der Membran ebenfalls ein Trimer
ist. Die Elutionspro�le der Gel�ltration zeigten, das der Komplex in Abhängigkeit
der Konzentrierung zerfällt. Durch die Verwendung von 50 kDa Konzentratoren er-
höht sich die Detergenzmenge während der Einengung [Strop and Brunger, 2005].
Diese führt nicht zur Denaturierung des Komplexes, da die Spektren der Peakfrak-
tionen der Gel�ltration deckungsgleich sind, sondern zu einer Dissoziation. Da dem
LHC Komplex eine Multigenfamilie zugrunde [Hiller et al., 1995] liegt ist eine He-
terogenität des Trimers wahrscheinlich. Es ist daher möglich, dass es innerhalb des
Trimers unterschiedlich starke Bindungen zwischen den Monomeren gibt. Das erklärt
den Zerfall zuerst in Dimere. Ein Monomerpeak ist bei dem Zerfall von Trimer zum
Dimer nicht zu beobachten. Möglich ist, dass das abgespaltene Monomer Dimere
mit sich selbst ausbildet. Das aufgrund stärkerere Bindung entstandene Dimer wird
erst durch weitere Erhöhung der Detergenzkonzentration aufgespalten.
4.3 Rekonstitution von LHC in Lipidvesikel 116
4.3 Rekonstitution von LHC in Lipidvesikel
Das LHC aus Amphidinium carterae konnte zum ersten Mal intakt in Liposomen mit
einem maximalen Durchmesser von 200 nm rekonstituiert werden. Das verwendete
Lipid, Phosphatidylcholin ist auch für die Rekonstitution anderer Lichtsammelkom-
plexe beschrieben [Sprague et al., 1985; Staehelin et al., 1984]. Hier wurde ein Lipid:
Chlorophyll Verhältnis von 10:1 verwendet [Sprague et al., 1985; Staehelin et al.,
1984]. Das in dieser Arbeit am besten geeignete Verhältnis war eine Lipid:LHC Mi-
schung von 1:1. Aufgrund des Chlorophyllanteils im LHC von ca. 25 % [Hiller et al.,
1993] stellt dies ein 5:1 Verhälntis von Lipid zu Chlorophyll dar. Eine Erhöhung des
Proteinanteils stellte sich beim Einbau von LHC in diesem System als weniger gut
heraus.
Der Lichtsammelkomplex LHC ist denen von höheren P�anzen ähnlich, so das de-
ren Gröÿe von Oligomeren Partikeln, wie dem Trimer, von 7,5 nm [Sprague et al.,
1985; Varga and Staehelin, 1985] auch hier angenommen werden kann. Auch unter
Berücksichtigung der Detergenzmicellen ergab sich hier eine gröÿere Dichte als bei
den aufgetragenen freien Liposomen. Dadurch liegt die Bande des freien LHCs tiefer
als die der freien Vesikel. Die bei der Rekonstitution eingesetzen Vesikel besaÿen
eine Gröÿe von durchschnittlich 175 nm. Diese Gröÿe wurde durch den Einbau von
LHC verändert. Die Zunahme der Gröÿe mit der Massenzunahme durch das LHC
führte zu einer dem LHC ähnlichen, oder höheren Dichte in Abhägigkeit der Göÿe
der eingesetzten Vesikel.
Durch die Bande im Gradienten und das UV/VIS Spektrum konnte nicht gezeigt
werden in welcher Form das Protein in die Vesikel eingebaut wurde. Durch die Ver-
meidung von zweiwertigen Kationen bei der Rekonstitution kann jedoch davon aus-
gegangen werden, dass es nur zu einem geringen Anteil von Aggregatbildung kam
[Sprague et al., 1985].
Da PC nur einen kleinen Bestandteil der Chloroplastenmembran ausmacht [Sprague
et al., 1985] könnte die E�zienz des Einbaus durch die Verwendung von DGDG,
MDGD oder einem Gemisch dieser Lipide erhöht werden. Die hier optimierte Vor-
schrift zum Einbau von LHC in Vesikeln könnte zukünftig für Experimente mit den
Chloroplastenlipiden MDGD und DGDG verwendet werden um so ein mehr physio-
logisches System für weitere Untersuchungen an LHC oder Interaktionsstudien zu
erhalten.
4.4 Interaktionsuntersuchung von LHC und PCP mit SPR 117
4.4 Interaktionsuntersuchung von LHC und PCP
mit SPR
Mit der Ober�ächenplasmonresonanzspektroskopie konnte hier erstmals eine Interak-
tion zwischen dem intrinsischen Lichtsammelkomplex LHC und dem löslichen Licht-
sammelkomplex PCP aus Amphidinium carterae nachgewiesen werden. Dadurch
konnte auch nachgewiesen werden das bei der Rekonstitution LHC in die Lipiddopp-
leschicht eingebaut wurde, da sonst keine Interaktion nachweisbar gewesen wäre. Die
A�nität der Komplexe zueinander liegt im zweistelligen mikromolaren Bereich. Die
Annahme einer einfachen 1:1 Reaktion zwischen den beiden Lichtsammlern konnte
bestätigt werden, da die monoexponentiellen Fits weitgehend dem Kurvenverlauf
der Sensogramme folgten. Abweichungen liegen eher in der Annahme begründet,
dass die Vesikel hier als Liposomen und nicht als Bilayerschicht vorlagen. Durch den
Verlauf der Sensogramme und der Konzentrationsabhängigkeit der Anbindungsge-
schwindigkeit kann auch eine unspezi�sche Anbindung ausgeschlossen werden.
Das in den Biacoreexperimenten verwendetet PCP ist ein PCP Gemisch mit gleichen
molekularen Massen, wovon über 90 % der Hauptform entsprechen. Deswegen ist hier
auch davon auszugehen, dass die gemessene Interaktion zwischen der Haupform von
PCP und dem LHC Komplex ist. Inwieweit oder ob eine der PCP Isoformen eine
andere A�nität zu LHC hat, konnte hier noch nicht gezeigt werden.
Nach erfolgter Bindung des aus dem Lumen der Thylakoide kommenden PCPs mit
dem membrangebundenen LHC ist eine Energieübertragung vom löslichen auf den
intrinsischen Komplex sehr wahrscheinlich. Innerhalb der Komplexe konnte die Ener-
gieweiterleitung aufgeklärt werden [Linden et al., 2004; Polívka et al., 2007; Zigman-
tas et al., 2002]. Hierbei erfolgt eine Energieweiterleitung innerhalb der PCP Haupt-
form vom angeregten Peridinin auf Chlorophyll a. Beim LHC ist neben dem Peridinin
auch das Chlorophyll c2 in der Lage Energie auf das Chlorophyll a zu übertragen.
Der Energieübertragungsweg zwischen den Komplexen wurde noch nicht aufgeklärt.
Wahrscheinlich ist, das auch hier eine Übertragung der Energie vom angeregten Chlo-
rophylla des PCP auf das Chlorophyll a des LHCs erfolgt (Abb. 4.1). Vom LHC aus
wird die Energie dann auf die Photosysteme weitergeleitet.
4.4 Interaktionsuntersuchung von LHC und PCP mit SPR 118
O
O
O
OH
OH
O
O
O
O
O
OH
OH
O
O
PCP
LHC
Abbildung 4.1: Schematische Darstellung eines Energietransfers von PCP auf LHC
4.5 FTIR-ATR 119
Ein Modell wie die Anbindung von PCP an LHC aussehen könnte zeigt ein Mo-
dell der LHC Struktur von Eckhard Hofmann in Zusammenhang mit der von ihm
gelösten PCP Struktur (Abb. 4.2).
Abbildung 4.2: Darestellung von LHC und PCP
Eine mögliche Interaktion des PCPs mit den Photosystemen kann aufgrund dieser
Ergebnisse nicht ausgeschlossen werden. Er stellt jedoch, aufgrund der hier nach-
gewiesenen starken Interaktion zwischen PCP und LHC, wahrscheinlich nicht den
Hauptenergieübertragungsweg dar. Ein Nachweis dessen könnte durch Messungen
mit PCP an immobilisierten Photosystemen erfolgen. Eine Interaktion zwischen
LHC und PCP wurde nachgewiesen, jedoch ist nicht aufgeklärt worden inwieweit
die Isoformen hier eine Rolle spielen.
4.5 FTIR-ATR
Mit der FTIR-ATR Methode sollte die Interaktion zwischen LHC und PCP un-
tersucht werden. Auch die Vesikelzusammensetzung des Rekonstitutionsproduktes
sollte hier untersucht werden.
Durch die FTIR-ATR konnte wie auch mit SPR eine Interaktion zwischen LHC und
PCP nachgewiesen werden. Eine Berechnung der kon und koff ist hier nicht möglich,
da in diesem System Massentransporte�ekte dazu führen, dass erst nach ca. 20 min
ein stabiles System entsteht. Die aus Biacore erhaltene Anbindungsgeschwindigkeit
4.5 FTIR-ATR 120
ist aber so hoch, dass der Anfangsbereich aus dem die kon bestimmt wird hier nicht
aufgelöst wurde. Gleiches gilt für die Dissoziation. Es ist möglich eine Abhängigkeit
der maximalen Höhe des Anbindungssignals von der eingesetzen Konzentration des
Bindungspartners nachzuweisen. Da die Reproduktion der Rekonstitution schwierig
war konnten diese Versuche noch nicht durchgeführt werden. Es ist zu erwarten
das hier eine Bestätigung der Ergebnisse, von der für diese Art der Untersuchung
etablierten Methode der SPR mit Biacore erhalten wird. Es ist hierbei zu berück-
sichtigen, dass bei Biacore eine für die Anbindung der Vesikel optimierte Ober�äche
zur Verfügung stand, während bei ATR die Qualität der Messung stark vom Kristall
und dessen Vorbereitung der Ober�äche anhängig war.
Die Kontrolle, dass keine Anbindung von PCP an BSA erfolgte zeigt im Spektrum
bei der ersten Anbindung von BSA ein Abwaschen des Proteins während der An-
bindung. Dies ist auf Luft im System zurückzuführen, welche hier zu einem starken
Hintergrund geführt hat, der die Bandenhöhe stark beein�usste. Die zweite Anbin-
dung von BSA zeigte den normalen Anbindungsverlauf.
Die Anbindung von BSA trotz erfolgreicher Vesikelimmobilisation spricht auch da-
für das hier kein vollständiges Spreiten der Liposomen stattfand sondern teilweise
nur eine Anlagerung der Vesikel an der Kristallober�äche. Für ein Spreiten der Ve-
sikel wären höhere Temperaturen als Raumtemperatur von Nöten, die aber zu einer
Zerstörung des Komplexes führen würden( Efremov). Eine vollständige Absättigung
der freien Stellen mit BSA würde ein Hintergrundsignal der PCP Bindung an den
Kristall vermeiden. Die Spreitung der Vesikel ist stark von deren Gröÿe abhängig. Je
kleiner die Vesikel desto besser deren Spreitung. Die pelletrierten Liposomen ohne
LHC konnten kaum an die Ober�äche angebunden werden, da durch die Pelletie-
rung eine Fusion der kleinen Vesikel stattfand. Nicht pelettierte Vesikel von max.
200 nm konnten erfolgreich immobilisiert werden. Die Rekonstitutionprodukte schei-
nen durch die Einlagerung von LHC eine geringere Varianz in der Vesikelgröÿe zu
besitzen, da hier eine Anlagerung nachgewiesen werden konnte.
4.6 Kristallisation von LHC aus Amphidinium carterae 121
4.6 Kristallisation von LHC aus Amphidinium
carterae
Innerhalb dieser Arbeit sollten Kristalle von LHC hergestellt werden die zur Auf-
nahme von Datensätzen mittels eines Röntgendi�raktiometers führen sollten.
Nach dem anfänglichen Kristallisationserfolg konnte dieser nicht reproduziert werden
und es bedurfte zahlreicher Kristallisationsexperimente bis ein Set von Bedingungen
gefunden wurde, die reproduzierbar zu Kristallen führten mit denen es möglich und
sinnvoll war Datensätze auf zu nehmen.
Die Entstehung der jeweilige Kristallform war mehr abhängig von der Charge an
LHC als von der Zusammensetzung der Kristallisationslösung. Immer jedoch ent-
standen Kristalle mit einer morphologisch rechteckigen Form. Diese Form ist auch
für andere LHC Kristalle bekannt. Dadurch das eine starke Konzentrierung statt-
fand und es bekannt ist das der 50 kDa Konzentrator zur Aufkonzentrierung von
Detergenzien führt [Strop and Brunger, 2005] ist die Möglichkeit gegeben das es sich
bei Kristallisation des Trimers in Wahrheit immer um Kristalle des Dimers oder so-
gar des Monomers handelte. Da gezeigt werden konnte, dass das Dimer Kristalle
bei ähnlichen Bedingungen ausbildet und über die gleiche Kristallform verfügt ist
es sehr wahrscheinlich das das Protein in den erhaltenen Kristallen ein Zerfallspro-
dukt des Trimers war. Auch die Experimente mit dem Dimer wurden mit stark
aufkonzentrierten Proben durchgeführt. Das Elutionspro�l der Gel�ltration zeigte
schon, das mit steigender Konzentrierung des Proteins auch das Auftreten mehrerer
Peaks einhergeht. Dies könnte auch die Verkürzung der Zeit bis zum Auftreten der
ersten Kristalle erklären. Mit dem stark konzentrierten Proben lag schon zu Beginn
der Kristallisation ein Teil des LHC-Komplexes als Monomer vor. Bei weniger stark
konzentrierten Proben war nur ein geringer Anteil des Monomers vorhanden und
die verbliebenen Trimere zer�elen erst im Laufe der Zeit durch die durch Dampf-
di�usion erfolgte Erhöhung der Detergenzkonzentration. Wenn nur das Monomer
Kristalle ausbildet, erfolgte so bei hohen Proteinkonzentrationen schneller der Über-
gang in die Nucleationszone. Dies wurde durch die Ergebnisse mit dem 100 kDa
Konzentrator gestützt da hier keine oder nur sehr kleine Kristalle gebildet wurden.
Die Detergenzkonzentration wurde durch diese Einengung nicht erhöht somit konnte
nur durch Verdunstung von Wasser aus dem hängenden oder sitzenden Tropfen eine
4.7 Röntgenbeugungsexperimente an LHC Kristallen 122
Erhöhung statt �nden. Andrerseits besteht die Möglichkeit das alle Formen gleich
gut kristallisieren und nur die hohe Proteinkonzentration einen schnellen Übergang
in die Nucleationszone zur Folge hatte. Ein natives Gel könnte hier neben dem Auf-
trag der Kristallisatonsprobe auf eine Gel�ltration mehr Aufschluss geben.
Des Weiteren könnten Kristallisationsexperimnete durch Zugabe von Lipiden zur
Proteinlösung, durch die neue Zusammensetzung des Ausgangsmaterials neue Kri-
stallformen zur Folge haben. Da LHC Komplexe in der Membran als Trimere vorlie-
gen [Standfuss et al., 2005; Liu et al., 2004] könnte die Lipidzugabe zur Stabilisierung
des Trimers führen, die dann auch zu dessen Kristallisation führen könnte. Erste Ver-
suche durch Zugabe von einem nicht näher de�nierten Lipid/Pigmentgemisch aus
ganzen Zellen (Isolierung nach Blythe und Dyer) zeigte ein Wachstum von Kristallen,
die aber nicht für die Aufnahme eines Datensatzes geeignet waren. Es ist möglich,
dass eine Zugabe von nur DGD, MDGD oder einem Gemisch aus beiden die Art der
Kristalle und deren Beugungsqualität verändern.
Die Kristallisation in kubischen Phasen ist nur für wenige Proteine erfolgreich be-
schrieben worden. Durch die Verwendung einer Lipidumgebung sollen Membranpro-
teine stabilisiert werden. Dies stellt zwar eine mehr physiologische Umgebung dar
ist aber bisher für nur wenige Proteine erfolgreich beschrieben worden. Bei dem für
diese Art von Versuchen meist verwendetet bR handelt es sich um ein in fast al-
len Lösungen stabiles Protein. Der LHC-Komplex ist wie der Detergenzaustausch
schon gezeigt hat emp�ndlicher. Die Bildung der kubischen Phasen mit dem Chlo-
roplastenlipid MDGD/DGDG könnte somit eher erfolgversprechend sein als weitere
Verfeinerungen des bestehenden Protokolls mit Monoolein.
4.7 Röntgenbeugungsexperimente an LHC
Kristallen
Es konnten zum ersten Mal Datensätze des membrangebundenen LHC Komplexes
aus Amphidinium carterae bis zu einer Au�ösung von 3,5 A aufgenommen werden.
Die Verwendung von Hepes pH 7,5 in der Kristallisationslösung führte zu Kristallen,
denen keine höhere Raumgruppensymmetrie als triklin zuzuordnen waren. Hier lag
auch ein anderes Breiten- zu Längenverhältnis der Kristalle vor (siehe Kristallisation
4.7 Röntgenbeugungsexperimente an LHC Kristallen 123
von LHC). Allen anderen Kristallen konnte die Raumgruppe P2 zugeordnet werden.
Es ist auch möglich das ein triklines Gitter zugrunde lag welches monoklin ähnlich
war.
Die Qualität der Kryolösung kann das Beugungsverhalten eines Kristalles erheblich
beein�ussen so ist es möglich das die Daten bei Kristall 4 durch das Einfrieren
beinträchtigt wurden. Diese Kristall zeigte trotz suboptimaler Einfrierlösung die
geringste Anisotropie der Daten und wies Re�exe mit hoher Intensität auf. Die Aus-
wertung über den ganzen Messbereich führte hier nicht zu hohen R-meas faktoren.
Die Auswertung zeigte das für eine sinnvolle Raumgruppenbestimmung Daten über
30 Grad nicht ausreichend waren. Da im Verlauf dieser Arbeit 360 ° Datensätze
aufgenommen werden konnten war es möglich die Raumgruppe der LHC Kristalle
zu bestimmen. Eine hohe Redundanz der Daten verbesserte die Auswertung und
es konnte gezeigt werden das die verwendeten Kristalle eingefroren mit optimierter
Kryolösung keinen Strahlenschaden auch bei insgesamt 950 gemessen Grad aufwie-
sen. Die Kristallform ist somit sehr stabil. Messungen mit hoher Redundanz sind
möglich. Alle gezüchteten Kristalle zeigten ein stark anisotropes Beugungsverhalten.
Dieses Beugungsverhalten tritt bei Membranproteine häu�g auf. Eine Erhöhung der
aufgenommenen Datenmenge pro Kristall mit mehr als 720° an verschiedenen Stel-
len eines Kristalls könnten die Prozessierung verbessern.
Die starke Anisotropie könnte auch ein Grund für die hohen Rmeas Faktoren bei
der Auswertung über den gesamten Datenbereich gewesen sein. Die XDS Statistik
bei der die Messungen in einem guten Beugungsbereich begannen zeigten hier nied-
rigere Rmeas Faktoren. Eine hohe Redundanz in diesem Bereich würde hier eine
Verbesserung der Ausgangsdaten für den Versuch des molekularen Ersatzes zur Fol-
ge haben, da die schlechten Bereiche die Indizierungsmatrix veränderten und somit
das Gesamtergebnis verschlechtert wurde. Die Ergebnisse der Messungen 138-6 und
151 untermauern dies, da hier nur ein kleiner Bereich mit hohem Anteil an wenig
beugenden Bereichen gemessen wurde. Aufgrund der geringen Datenmenge konnte
hier keine sinnvolle Indizierung erfolgen welches sich in der geringen Achsenlänge
wiederspiegelte.
Die Lösung des Phasenproblems mit molekularem Ersatz war nicht möglich. Das
hierfür verwendete Strukturmodell des LHCs der Erbse besitzt nur eine Sequen-
zidentität mit LHC aus A. c. von 18 %. Die könnte für den molekularen Ersatz
unzureichend sein. Auch kann aufgrund der unterscheidlichen Pigmentzusammen-
4.8 Aufreinigung von PCP aus A.c. 124
setzung die Struktur des LHC aus A.c. stark abweichend sein, so das ein Modell aus
der Erbse nicht für den molelkularen Ersatz geeigent war. Dies würde auch erklären
warum das Homologiemodel nicht erfolgreich als Model verwendet werden konnte.
Die Daten des Modells könnten hier auch von zu geringer Qualität für einen mo-
lekularen Ersatz gewesen sein. Sequenzanalysen des LHC ergaben eine Voraussage
von drei Transemembranhelices. Diese sind auch in der gelösten Stuktur des LHC
der Erbse zu �nden. Die Anordnung im Raum scheint sich jedoch stark von denen
im LHc zu unterscheiden, da auch die Struktur der Erbse als Monomer und nach
Entfernung der Loopregionen nicht als Modell erfolgreich war.
Die Aminosäuresequenz von LHC weist nur wenige Methionine auf, und es existiert
kein Protokoll für die Suppression der Methioninproduktion, so dass für die expe-
rimentelle Bestimmung der Phasen ein soaken der Kristalle mit schweren Atomen
nötig war. Die Verwendeten Verbindungen enthielten Schwermetalle der Klasse B
die in dem pH-Bereich der Kristallisationslösung an polare Gruppen wie Phosphate
und Sulfate binden. Es konnte ein Goldsignal gemessen werden, ob ein Einbau in den
Kristall stattfand kann nur die Auswertung der Daten hinsichtlich eines anormalen
Signals ergeben.
Die erreichte Reproduzierbarkeit der Bildung von Kristallen die zu Datensätzen bis
zu 3,5 Angström führten und die Entwicklung einer Vorschrift für das soaken dieser
Kristall mit Schwermetallen sind die Voraussetzung für die Aufklärung der Protein-
struktur von LHC. Die Lösung ist nun nicht mehr abhängig von der Kristallbildung,
sondern von der Lösung des Phasenproblems. Kristalle mit geringerer Anisotropie
im Beugungsverhalten können die Auswertung verbessern, so dass der molekulare
Ersatz für die Phaseninformation genutzt werden kann. Eine weitere Optimierung
der Kristallisation in Bezug auf das Dimer oder Monomer von LHC sind daher viel-
versprechend, denn möglicherweise werden hier Kristalle mit geringerer Anisotropie
gebildet.
4.8 Aufreinigung von PCP aus A.c.
Mit der Anionenaustauschchroamtographie konnten zwei unterschiedliche PCP ge-
trennt werden. Ob es sich hierbei um Isoformen des PCP-Trimers handelte konnte
4.8 Aufreinigung von PCP aus A.c. 125
nicht gezeigt werden. Eine Elution in einem Hauptpeak und mehreren kleinen Peaks
[Haxo et al., 1976] erfolgte nicht. Das in dieser Arbeit verwendetet Verfahren des
Zellaufschlusses kann möglicherweise teilweise zur Zerstörung des PCP geführt ha-
ben. Ein Aufschluss durch Zermahlen der Zellen unter Sticksto�kühlung [Haxo et al.,
1976] könnte eine schonendere Methode darstellen.
PCP zeigte in verschiedenen Chargen unterschiedliche Gröÿeverteilungen. Es konnte
hier kein direkter Zusammnenhang zwischen Aufschlussgerät und Lagerzeit festge-
stellt werden. Jedoch wurde nachgewiesen, dass Magnesiumchlorid stabilisierend auf
das Trimer wirkte. Da die üblicherweise verwendeten Pu�er keine zweiwertigen Ka-
tionen enthielten ist eine Destabilisierung des Trimers nicht aus zu schlieÿen. Ein
stabiles natürlich vorkommendes Dimer ist für Amphidinium carterae nicht bekannt.
Das erhaltene Protein mit dem Molekulargewicht des Dimers ist eher durch eine
Dissoziation des Komplexes und dem Verlust von Pigmenten zu erklären. Eine Zu-
gabe von anderen Proteasen als PMSF könne möglicherweise auch die Dissoziation
des Komplexes verhindern, da Peptide des zweiten Peaks der Gel�ltration auch vom
Apoprotein von 32 kDa abweichende Gröÿen aufwiesen. Möglicherweise kann durch
auch eine nachträgliche Zugabe von MgCl2 eine Zusammenlagerung des Monomers
zum Trimer erfolgen.
Alle Interaktionsstudien wurden in Anwesenheit von Magnesiumchlorid durchge-
führt, somit kann davon ausgegangen werden das PCP hier als Trimer vorlag.
Es war möglich das Trimer durch Zugabe von 20 mM MgCl2 zum Laufpu�er aus
dem Überstand nach dem Zellaufschluss durch eine Gel�ltration zu isolieren. Dieses
wurde für die Interaktionsstudien verwendet.
Über die Chromatofokussierung wurden PCPs mit verschiedenen pI getrennt. Die
Analyse durch eine Gel�ltration zeigte das es sich hierbei nicht um verschieden Trime-
re des Komplexes handelte sondern meist um Dimere oder Monomere. Die UV/VIS
Spektren waren nicht vollständig deckungsgleich was auf den Verlust von Pigmenten
hinweist. Es ist möglich das durch das Umpu�ern in LHCP2 eine Destabilisierung
des PCP stattfand. Gel�ltrationsläufe mit anderen Pu�erzusammensetzungen könn-
ten hier Aufschluss geben, ob es sich um Trimere in der Chromatofokussierung han-
delte. Eine Zugabe von zweiwertigen Kationen zu den Pu�ern kann die Stabilität
des Trimers erhöhen. Es ist somit unklar ob die verschiedenen Isoformen immer auf
dem Trimer basierten. Es ist auch vorstellbar, das einzelne Monomere die Isoformen
stellen. Eine Unterscheidung in Monomer und Trimer ist über SDS-Gele und Spek-
4.9 Highresolution Datensatz von MFPCP 126
tren nicht möglich. Untersuchungen der Peaks mit Massenspektrometrie könnte hier
mehr Informationen liefern.
Teilweise trat ein Peak in der Aufreinigung mit der Gel�ltration auf der eine grün-
braune Färbung aufwies. Es konnte gezeigt werden das es sich hierbei spektrosko-
pisch wie auch in der Gröÿe des Apoproteins um LHC handelte. LHC ist bisher nur
als Membranprotein beschrieben worden, welches in wäÿrigen Lösungen unlöslich
ist. Die Gröÿe des eluierten Proteins lieÿ die Vermutung zu, dass es sich hierbei
um kleine Membranvesikel handelte die bei der Präparation entstanden. Das ATR
Spektrum zeigte jedoch nur geringe Lipidsignale im Vergleich zum Proteinsignal.
Erste Kristallisationsversuche unter Verwendung des optimierten LHC Screens führ-
ten nur zu einer Phasentrennung. Die Art dieser Phasentrennung deutete auch auf
Lipide in der Proteinlösung hin. Es könnte sich auch um Oligomere des LHCs han-
deln die durch die verwendteten Pu�er entstanden. Zweiwertige Ionen stabilisieren
das trimer von PCP und es ist nicht aus zu schlieÿen das auch dieses in Lösung
nachgewiesene LHC durch diese Kationen in einer Trimeren form vebleibt und es
nicht zu einer Aggregatbildung kommt. Es konnte nicht genau geklärt werden unter
welchen Umständen dieses Phänomen des �löslichen” LHC auftrat es scheint jedoch
mit dem Aufschluss der Zellen zusammen zu hängen. Eine weitere Untersuchung ist
vieversprechend, eventuell handelt es sich hierbei um eine neue Form von LHC oder
die vollständige Bildung des Komplexes �ndet bei A. c. nicht erst in der Membran
statt.
4.9 Highresolution Datensatz von MFPCP
Es konnte ein hochaufgelöster Datensatz von der Hauptform von PCP augenommen
werden. Die maximale Au�ösung betrug 1,27 A. Der Rmeas liegt bei 39 % doch da
I/Sigma einen Wert über drei annahm wurden die Daten erst hier geschnitten und
nicht bei 1,35 A. Der R-faktor über 20% nach Einbau von Wassermolekülen deutete
daraufhin das Teile der Proteinstruktur einer weiteren Verfeinerung bedürfen. Auch
kann nicht ausgeschlossen werden, das die Wahl des cutes der Daten bei 1,27 A die
Qualität hier verminderte. Eine Auswertung mit Daten bis zu einer maximalen Auf-
lösung von 1,35 A könnten zu einer stärkeren Verringerung des R-fakros im Vergleich
zu den verwendeten führen.
4.9 Highresolution Datensatz von MFPCP 127
Loopbereiche sind beweglicher als die Aminosäuren im Inneren des Protein und die
Dichte zeigte auf Grund dessen mitunter zwei mögliche Anordnungen einer Amino-
säure im Raum (Abb. 4.3).
Abbildung 4.3: Aminosäure im äuÿeren Bereich des Proteins mit zwei möglichen Positio-nen im Raum
Es wurde keine Übereinstimmung der Restaints für das DGDG 615 in Shelx H
gefunden. Die Elektronendichtekarte ist hier im Vergleich zu DGDG 625 weniger gut
(Abb. 4.4).
DGDG625 DGDG615
Abbildung 4.4: DGDG 625 und DGDG 615
4.9 Highresolution Datensatz von MFPCP 128
Zum einen war das DGDG mehr dem Lösungsmittel exponiert als das DGDG 625
weshalb dieses �exibler war und somit die Elektronendichte weniger de�niert war.
Andererseits wurden die Restraints für DGDG aus dem PDB �le mit PRODRG
generiert. Eine Erstellung von Restraints auf der Basis der Molekülstruktur mit
PRODRG könnte hier eine Verbesserung zur Folge haben.
Die Elektronendichte ist schon zu diesem Zeitpunkt der Verfeinerung für Chlorophyll
und Peridinin gut de�niert. Weitere re�nement Zyklen sind jedoch notwendig um
hier eine genaue Postitonsbestimmung zu ermöglichen. Zu diesem Zeitpunkt der
Verfeinerung sind Aussagen hinsichtlich der Postion der Pigmente im Vergleiche
zur Struktur bei 2 A nicht sinnvoll, da weitere Zyklen die Position noch verändern
können.
4.9 Highresolution Datensatz von MFPCP 129
5 Zusammenfassung
Die Photosynthese ist essentiell für ein Leben auf der Erde. Als Nebenprodukt ent-
steht hier bei der Umwandlung von Lichternergie in chemische Energie der für Le-
ben wichtige Sauersto�. Auch die meisten genutzten Energiequellen haben ihren
Ursprung in der Photosynthese. Lichtsammelkomplexe sind ein Teil dieses Systems.
Im Rahmen dieser Arbeit sollten mehr Informationen über Grundlagen der Photo-
synthese am Beispiel von Lichtsammelkomplexen aus A.c. erhalten werden. Dino-
falgellaten besitzen neben membrangebundenen Lichtsammelkomplexen auch einen
löslichen Lichtsammelkomplex, das PCP. Die Anzahl der Karotinoide ist in beiden
Komplexen höher als in denen von höheren P�anzen. Auch hat der intrinsische Kom-
plex Chlorophyllc anstelle von Chlorophyll b gebunden. Das gebundene Karotinoid
Perdinin ist spezi�sch für Dino�agellaten. Der lösliche Lichtsammelkomplex PCP
tritt in verschiedenen Isoformen auf, die nur in ihrem pI unterschieden werden.
Neue Erkenntnisse über den Enerieübertragungsweg sollten durch eine biochemi-
sche Charakterisierung der molekularen Interaktion zwischen dem löslichen und dem
intrinsischen Lichtsammelkomplex gewonnen werden. Hierzu war eine Etablierung
und nachfolgende Optimierung der Rekonstitution von LHC in Lipidvesikeln nötig.
Auch sollte der Ein�uss von Licht auf die Zellen und die Bildung der Lichtsammel-
komplexe durch Belichtungstest an Zellkulturen untersucht werden. Voraussetzung
für Informationen der Lichtsammelkomplexe auf atomarer Ebene durch Röntgen-
strukturanalyse sind Proteinkristalle. Innerhalb der vorangegangenen Diplomarbeit
konnten Kristallschauer oder stark verwachsene Kristalle von LHC gezüchtet wer-
den. Auf diesen Ergebnis aufbauend sollten Einkristalle gezüchtet werden, die zu
Datensätzen für die Strukutraufklärung führen sollten. Eine Verbesserung der Struk-
turinformationen der Pigmente sollten über eine hochaufgelöste MFPCP Struktur
erhalten werden. Der dafür enötigte optimierte Screen wurde während der Diplomar-
beit entwickelt. Weitere Informationen über Anzahl und Art der Isoformen von PCP
sollte zum einen durch eine Optimpierung der Aufreinigung aus der Diplomarbeit
4.9 Highresolution Datensatz von MFPCP 130
erreicht werden. Zum anderen sollten Gröÿenbestimmugen und die Untersuchung
durch UV/VIS Spektroskopie Informationen über durch die Chromatofokussierung
erhaltenen Peaks hinsichtlich der Isoformen liefern
Die Lichtintensität hatte einen direkten Ein�uss auf die Färbung der Zellen. Schwach-
licht führte zu einer stark erhöhte Produktion von Lichtsammelkomplexen wohinge-
gen bei Starklichbedingungen kein PCP mehr nachweisbar war.
Die Aufreingung von LHC konnte optimiert werden und die erhalten Menge an LHC
wurde um 30% gesreigert. Somit war dies keine limitierenden Faktor mehr bei der
weiteren Experimentplanung.
Der intrinsische Lichtsammelkomplex konnte zum ersten mal erfolgreich in 200 nm
Sojalecithinvesikel rekonstituiert werden mit einer Einbaurrate von 10 bis 17%. Die
Vorschrift für die Rekonstitution wurde etaliert und optimiert. Eine Bindung zwi-
schen PCP und LHC konnte erstmalig mit Biacore und ATR nachgewiesen werden.
Die A�nität der Komplexe zueinader lag im mikromolaren Bereich. Ein Energie-
transfer vom PCP zum LHC ist somit sehr wahrscheinlich.
Es konnten zum ersten mal Proteikristalle erzeugt werden, die eine Au�ösung bis
zu 3,5 A aufwiesen. Die ursprünglich in dieser Arbeit hergestellten Kristalle mit
einer Kantenlänge von 700 µm konnten nicht reproduziert werden. Viele verschiede-
ne Bedingungen wurden getestet bis ein Screen entwickelt werden konnte bei dem
Kristalle mit einer Beugung bis zu 3,5 A reproduzierbar gezüchtet wurden. Hier war
die PEG Konzentration und die Proteinmenge entscheident. Da der Komplex bei
hoher Detergenzkonzentration zerfällt ist es möglich das den erhaltenen Kristallen
das Dimer oder Monomer und nicht das Trimer zugrunde lag.
Von 230 ge�schten Kristallen wurden von elf Kristallen Datensätze aufgenommen.
Allen gmeinsam war eine Anisotropie im Beugungsmuster. Messungen über 360 Grad
führten zu einer Raumgruppenbestimmung. Trotz hoher Datenredundanz konnten
die Phasen nicht durch molekularem Ersatz mit verschiedenen Modellen bestimmt
werden. Die experimentelle Berechnung der Phasen ist nur durch MIR möglich. Ein
Protokoll zum Schwermetallsoaken wurde erstellt und erste Datensätze wurden an
der Goldkante aufgenommen.
PCP kommt in verschiedenen Isoformen vor die sich nur im pI unterscheiden. Es
war nicht nachweisbar, das die PCP mit unterschiedlichen pI Isoformen der Haupt-
form waren, da das Protein nicht stabil war. Es wurde festgestellt, das zweiwertige
Kationen das Trimer stabilisierten. Bei der Aufreinigung von PCP wurde LHC ohne
4.9 Highresolution Datensatz von MFPCP 131
Detergenz in einer wäÿrigen Lösung nachgewiesen. Möglicherweise handelt es sich
hierbei um eine noch nicht beschriebene Form von LHC.
Es konnte ein hochaufeglöster Datensatz von der PCP Hauptform aufgenommen
werden. Die maximale Au�ösung betrug 1,27 A wodurch eine genaue Positionsbe-
stimmung der Pigmente im Raum möglich wurde. Für eine genaue Aussage sind
weiter Verfeinerungszyklen notwenid, doch konnte schon jetzt eine gute Qualität der
Daten nachgewisen werden.
4.9 Highresolution Datensatz von MFPCP 132
6 Summary
Photosynthesis is essentiell for life on earth. During the transformation of solar
energy into chemical energy the lifedepending Oxygen will be produced. Also most
energy sources have their basis in photosynthesis. The Light Harvesting Complexes
are part of this system. On the example of the Dino�agellate Amphidinium carterae
the aim of this work was to gain more information about basics of the photosynthesis.
Dino�agellates have next to the membrane bound LHC soluble antenna complexes,
the PCP. The amount of carotenoids di�ers from the LHC of higher plants. Also the
binding of Chlorophyll c instead of chlorphyll b in the intrinsic LHC divides them.
The bound Perdinin is a carotenoid which occours only in Dino�agellates. PCP ap-
pears in di�erent Isoforms wich di�er only in the pI.
To achieve more knowledge about the energytransferpathway the interaction bet-
ween the soluble light harvesting complex and the membrane bound LHC should be
examinated with biochemical characterization. For that, the reconstituion of LHC
in lipisveciles was to be established and optimized.
The in�uence of light on the cells and production of light harvesting complexes
should be examinated with lightintensitiy test on whole A.c cells. To get structural
information of the light harvesting complexes on atomar basis, proteincrystals are
essential. Showers of crystals and adnate crystals were produced during the previous
diploma thesis. Single crystals were to be breed based on this result. These should
lead to datasets for a structural solution. An improvement of structural information
about the pigments in MFPCP should be gained with an high resolution structure.
An optimized screen was established during the diploma work. To gain more infor-
mation about the PCP Isofoms an optimization of the puri�cation was necessary.
The determination of the proteinweight and the UV/VIS spectroskopy should lead
to more information about the PCPs after Chromatofocussing.
The cells are in�uenced by the light intensity. On low light conditions a huge amount
of light harvesting complexes was produced. The increase of light ernergy lead to an
4.9 Highresolution Datensatz von MFPCP 133
decrease of LHC production. PCP was not detectable under this growth condition.
The pu�citaion of the LHC complex had been increased by 30% and the amount of
LHC is no longer an breaking point for experiments especially the crystallization.
The puri�ed intrinsic LHC had been reconstituted in PC vesicles with an incorporati-
on rate of 10-17 %. An protocl for the reconstitution was established and optimized.
This was the basis for further experiments to analyze the interaction between LHC
and PCP. A binding beween PCP and LHC has been proven by Biacore and ATR
measurements. The mycromolar A�nity between these complexes underlined the
theory of an energtransfer from PCP to the LHC.
For the �rst time LHC crystals with a maximal difrcation of 3.5 A were produced.
The reproduction of the original crystals with an length of 700 µm was not possible
and several conditoins were tested until a setup was made which lead to a reproduci-
ble growth of crystals with a maximal di�ract of 3.5 A. It was unclear if this crystals
are made of dimers, monomers or trimers, because huge detergent concentrations
disintegrated the protein. The way to get the needed proteinconcentration of min.
20 mg/ml could result in high detergentconcentrations.
From eleven crystals out of 230 �shed datasets were measured. The LHC complex
has been crystalized and several datasets with a maximum resolution of 3,5 A were
measured. The re�ection patterns showed alsways an anisotropy of the di�ration.
Measuremnt of more than 360 degree were necessary for an secure spacegroup deter-
mination. The MR with di�erent models failed. The similarity was not good enough
to get the phase information for the structure solution. Experiments to get the pha-
ses experimental had been made and �rst datasets were measured.
The PCP appears in di�enrent isoform. It was not possible to determine the trimeric
Isoforms of PCP with Chromatofokussing. Gel�ltration showed sizes of dimeric or
monomeric PCP. The experiments showed, that Magnesiumchlorid was essential for
the stability of the trimeric form of PCP. Without kations like this a loss of pigments
had ben observed and the decay into dimeric forms.
During the PCP puri�cation a LHC in solution without any detergent had been
detected. It is possible that this is a new form of LHC which had not been described
before. A high resolution dataset of the MFPCP had been measured. The resolutoin
maximum of 1.27 A will lead to precise coordinates of the bound pigments. In this
state of re�nement a conclusion and comparison with the published structure of 2 A
was not maeningful.
4.9 Highresolution Datensatz von MFPCP 134
7 Ausblick
Mit Belichtungstest wurde der Ein�uss von Licht auf ganze Zellen von A. c. gezeigt
. Eine genaue Analyse der Raten der Lichtsammelproduktion über SDS Gele und
Bestimmung der gebildeten Mengen könnten genauere Information über die Regula-
tion ergeben.
Die Aufreingung wurde optimiert jedoch kam es in Abhängigkeit der Detergenzkon-
zentration zum Zerfall des Trimers in Dimere und Monomere. Aufgrund dessen dass
die Kristalbildung erst bei Konzentrationen ab 20 mg/ml reproduzierbar war ist
es warhscheinlich, das den Kristallen das Dimer oder Monomer zugrunde lag. Ei-
ne Kristallisation des Dimers war erfolgreich und eine Optimierung könnte hier zu
Kristallen mit einer besseren Au�ösung führen. Auch die Kristallisation des in der
Gel�ltration nachgewiesenen Monomers könnte zu einem Wachstum von Kristallen
führen, die neben einer besseren Au�ösung eventuell auch eine geringere Anisotro-
pie aufweisen. Das Protokoll für die Kristallisation des Trimers aus der Gel�ltration
wurde optimiert und somit können Schwermetallsoaks von diesen durchgeführt wer-
den um experimentell die Phasen zu bestimmen. Auch Aufgrund der Stabilität der
Kristalle können nun Messungen mit hoher Redundanz erfolgen die die Qualität der
Daten nach XDS verbessern könnten. Die Kristallisation mit Zusatz von stabilisie-
renden Lipiden ist vielversprechend um eine Struktur des Trimers zu erhalten.
Das in dieser Arbeit für die Rekonstitution verwendete PC ist nur in geringer Men-
ge im Chloroplasten vorhanden. Rekonstituionsexperiment mit den Lipiden DGDG
und MDGD würden eine physiologischeres System darstellen. Auch die Isolierung
des Photosystems zur Untersuchung der Interaktion zwischen PCP und den PS wä-
re ein weiterer Ansatz um den Energieübertragungsweg bei Amphidinium carterae
vollständig auf klären zu können.
Das Trimer von PCP wird durch Magnesiumchlorid stabilisiert. Aufreinigungen in
Anwesenheit dieser Kationen könnte eine Di�erenzierung der Isofomen des Trimers
ermöglichen. Auch könnte dadurch mit der Methode der Chromatofokussierung ei-
4.9 Highresolution Datensatz von MFPCP 135
ne Trennung der Isoformen des Trimers erfolgen. Weiterhin ist eine schonendere Art
des Zellaufschlusses ein Ansatz dieses Ziel zu erreichen. Die erhaltenen verschiedenen
Formen sollten durch Massenspektrometrie untersucht werden um die Unterschiede
zu analysieren.
Eine weitere Vefeinerung der hochaufgelösten Daten der MFPCP ist norwendig für
eine genaue Positionsbestimmung der Pigmente im Raum.
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Abbildungsverzeichnis 146
Abbildungsverzeichnis
1.1 Die schematische Darstellung der Elektronentransportkette und der
an der Photosynthese beteiligten Proteinkomplexe . . . . . . . . . . . 2
1.2 Die Struktur des Lichtsammelkomplexes LHCII aus der Erbse [Stand-
fuss2005] . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4
1.3 Die Struktur des Lichtsammelkomplexes LHCII aus dem Spinat
[Liu2004](links) und der Erbse [Standfuss2005] (rechts) . . . . . . . . 5
1.4 Schematische Darstellung eines Phycobilisoms . . . . . . . . . . . . . 6
1.5 Chlorophyll a . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7
1.6 Chlorophyll c2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7
1.7 Schema der Anregungszustände des Chlorophyll a . . . . . . . . . . . 8
1.8 Peridinin [Botanik online 2005] . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9
1.9 Diadinoxanthin [Botanik online 2005] . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9
1.10 Schema der Anregungszustände des Peridinin . . . . . . . . . . . . . 9
1.11 Schematische Darstellung einer freischwimmenden Dino�agellatenzel-
le LF: longitudinale Flagella, TF: transversale Flagelle, M: Mitochon-
drium, Cp: Chloroplast, Cr: Chromosom, N: Nucleus, Pu: Pusules, V:
Vakuole [Taylor1998] . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10
1.12 Der Chloroplasten von Amphidinium carterae [Taylor 1998] . . . . . . 12
1.13 Der Photosyntheseapparat in der Thylakoidmembran von Dino�agel-
laten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13
1.14 Ein Modell der photosynthetischen Einheit PSU [Govindjee et all 1979] 13
1.15 Energietransfer innerhalb des LHCs von A. c. . . . . . . . . . . . . . 15
1.16 Die Struktur der Hauptform von PCP [Hofmann et al., 1996]. . . . . 16
1.17 Energietransfer innerhalb des PCP . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17
2.1 UV/VIS Spektren von LHC und PCP aus Amphidinium carterae.
Schwarz : LHC, rot: PCP . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32
Abbildungsverzeichnis 147
2.2 Anzuchtkästen von Amphidinium carterae . . . . . . . . . . . . . . . 34
2.3 Anzucht unter verschiedenen Belichtungen A: vorne sind die Kuturen
unter Schwachlichtbedingungen abgebildet, direkt vor den Lampen
sind die Starklichtanzuchten, B: die Anzucht im Schatten . . . . . . . 35
2.4 Die schematische Darstellung einer in der SPR genutzten Flieÿzelle . 43
2.5 Schematische Darstellung einer ATR Flieÿzelle . . . . . . . . . . . . . 45
2.6 ATR Meÿzelle mit eingebautem Germaniumkristall . . . . . . . . . . 46
2.7 Löslichkeitsdiagramm von Proteinen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 48
2.8 Schmatische Darstellung der Kristallisation mit hanging drop und
sitting drop . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 48
2.9 Ein schematisches Modell bicontinuierlicher kubischer Phasen [Land-
au and Rosenbusch, 1996] . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 49
2.10 Schematische Darstellung der Kristallisation unter Öl . . . . . . . . . 50
2.11 Re�exbedingung für die Beugung am Kristlall (Bragg). . . . . . . . . 54
3.1 Zellkulturen bei unterchiedlicher Belichtung . . . . . . . . . . . . . . 60
3.2 Membransedimente nach Zellaufschluss. A: Starklicht, B: Schwach-
licht, C: Schatten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 61
3.3 Überstände nach Zellaufschluss. A: Starklicht ( ca. 100 µE), B:
Schwachlicht ( 20 µE), C: Schatten, (ca. 5 µE) . . . . . . . . . . . . . 61
3.4 UV/VIS Spektren der Überstände nach ZellAufschluss. Blau: Stark-
licht, pink: Schwachlicht . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 61
3.5 Gradient mit PCP Bande (rötlich) und Membranpellet (braun) am
Boden des SW28 Röhrchen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 62
3.6 SDS Gel der Aufreinigung. 1: Marker, 2: Waschen der Zellen, 3: vor
Zellaufschluss , 4: Überstand nach UZ, 5: Homogenisat nach UZ, 6:
Überstand nach Waschen der Membranen, 7: Homogenisat nach Wa-
schen der Membranen, 8: Überstand nach Waschen der Membranen,
9: Homogenisat nach Waschen der Membranen, 10: Homogenisat nach
Saccharosegradient, 11: nach Solubilisierung, 12: Pellet nach UZ, 13:
Auftrag auf Anionenaustauschchromatographie . . . . . . . . . . . . . 63
3.7 Elutionspro�l der Anionenaustauschchromatographie. . . . . . . . . . 64
Abbildungsverzeichnis 148
3.8 SDS-Gel der Anionenaustauschchromatographie. 1, 11: Marker, 2-4
Fraktionen bis zu Elution, 5-10 und 12-18: Elution des Proteins, 19-
21 Fraktionen nach Proteinelution . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 64
3.9 Auschnitt des Elutionspro�ls der Gel�ltration, gezeigt wird die Pro-
teinelution von LHC bei einer Wellenlänge von 672 nm . . . . . . . . 65
3.10 SDS-Gel der Gel�ltration. 1: Marker, 2-4: Fraktionen vor Proteine-
lution, 5-8 Proteinelution, 9-11:Fraktionen nach Proteinelution, 12:
Auftrag Gel�ltration . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 65
3.11 Absorption bei 461 nm (Chlorophyll c) der Elutionsfraktionen der
Gel�ltration, Volumen der Fraktionen wurde in CV umgerechnet . . . 66
3.12 UV/VIS Spektren der Proteinpeaks der Gel�ltration normiert auf
672 nm. Blau: Peak1 (0,6 CV), rot: Peak2 (o,62 CV) und grün: Peak3
(0,68CV) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 66
3.13 Eichunggerade der Gel�ltrationssäule Superdex 200 HR16/60 . . . . . 67
3.14 Gradienten der Rekostitution. Von links nach rechts: nicht erfolgrei-
cher Einbau von LHC in PC Vesikel, denaturiertes LHC, PC Vesikel . 68
3.15 Gradienten der Rekonstitution. Von links nach rechts: LHC rekonsti-
tuiert in PC Vesikel, LHC rekonstituiert in PC Vesikel, LHC . . . . . 69
3.16 Spektren des freien LHCs ,des LHCs in Vesikeln und der Liposomen-
streukurve. Es erfolgte eine Normierung der Proteinkurven auf den
Chlorophyllpeak bei 671 nm . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 69
3.17 Konzentrationsreihe 1 der Interaktion zwischen PCP und dem im-
mobilisierten LHC. Die einzelnen Konzentrationen sind farblich un-
terschiedlich dargestellt: türkis: 60 µM PCP, gelb: 40 µM PCP, ro-
sa:20 µM PCP und blau: 8,7 µM PCP. . . . . . . . . . . . . . . . . . 70
3.18 Konzentrationsreihe 2 der Interaktion zwischen PCP und dem im-
mobilisierten LHC. Die einzelnen Konzentrationen sind farblich un-
terschiedlich dargestellt: türkis: 60 µM PCP, gelb: 40 µM PCP, ro-
sa:20 µM PCP und blau: 8,7 µM PCP. Die schwarzen Linien zeigen
die ge�tteten Kurven . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 71
3.19 Die Anbindungsgeschwindigkeiten abhängig von der PCP Konzentra-
tion (Konzentrationsreihe 1) in logarithmischer Auftragung. Aus der
durch die Messpunkte angelegten Geraden wurde kon berechnet . . . 72
Abbildungsverzeichnis 149
3.20 Die Anbindungsgeschwindigkeiten abhängig von der PCP Konzentra-
tion (Konzentrationsreihe 2) in logarithmischer Auftragung. Aus der
durch die Meÿpukte angelegten Geraden wurde kon berechnet . . . . . 72
3.21 Dissoziation des PCP vom LHC als Langzeitmessung . . . . . . . . . 73
3.22 Dissoziationskurve des PCP vom LHC mit angelegtem Fit (monoex-
ponentiellen Funktion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 73
3.23 gdsgsg . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 73
3.24 Infrarotspektrum der angebunden LHC-haltigen Vesikel. Zu sehen
sind die Amid I und II Bande des Proteins und die Banden die von den
Liposomen herrühren. Die Banden der Liposomen sind: die Asymme-
trische CH2 Streckschwingung, die symmetrische CH2 Streckschwin-
gung und die C=O-Schwingung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 75
3.25 Änderung der Intensität bei einer Wellenzahl von 1547 . . . . . . . . 75
3.26 Anbindungskurve von Vesikeln mit einem Durchmesser von mehr als
200 nm . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 76
3.27 Messung 1 zur Interaktion von LHC und PCP. Blau: Proteinsignal bei
1547 cm1, pink: Lipidsignal bei 2926 cm1. Die PCP Konzentration im
System betrug 15 µM . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 76
3.28 Messung 2 zur Interaktion von LHC und PCP. Blau: Proteinsignal bei
1547 cm1, pink: Lipidsignal bei 2926 cm1. Die PCP Konzentration im
System betrug 22 µM . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 77
3.29 Messung 1 zur Interaktion von LHC und PCP. Blau: Proteinsignal bei
1547 cm1, pink: Lipidsignal bei 2926 cm1. Der Peak bei ca. 75 min.
ist auf das Eindringen von Wasserdampf zurück zu führen. . . . . . . 77
3.30 Kristalle nach kommerziellen Screens. A: Crystal I Screen, B: Cryo II
Screen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 79
3.31 LHC Kristalle nach 6 Monaten Inkubation bei 18 °C. A: 30 % PEG400,
0,05 M MgCl2, 0,1 M Hepes pH 7,5. Kristallhaufen, B: 30 % PEG400,
0,1 M MgCl2, 0,1 M Hepes pH 7,5. Kleine Kristalle, C: 30 % PEG400,
0,05 M MgCl2, 0,1 M Na-cacodylate pH 6,5 Kristalle bis 700 µm Länge 79
3.32 Kristalle von Proteinprobe nach Salz- und Detergenzentzug . . . . . . 80
Abbildungsverzeichnis 150
3.33 Kristalle die enstanden durch Zugabe von Detergenz zur Reservoirlö-
sung. A: 29 % PEG400, 0,1 M Na-cacodylate pH 6,5, 0,1 M MgCl2,
0,5 % DM , B: 32 % PEG400, 0,1 M Na-cacodylate pH 6,5, 0,1 M
MgCl2, 0,5 % DM , C:28 % PEG400, 0,1 M Na-cacodylate pH 6,5,
0,1 M MgCl2, 1,0 % DM . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 81
3.34 Kristallbildung durch Zugabe von Detergenz. A: 31 % PEG400, 0,1 M
Na-cacodylate pH 6,5, 0,1 M MgCl2, 0,5 % DM, B: 35 % PEG400,
0,1 M Tris-HCl pH 8,5, 0,2 M NaCl, 0,5 % DM , C:30 % PEG400,
0,1 M Hepes pH 7,5, 0,1 M NaCl, 1,0 % DM . . . . . . . . . . . . . . 81
3.35 Kristalle der Bedingung 8 A: verwachsene Kristalle, B: Einkristalle . . 82
3.36 LHC Kristalle mit der neuen Kristallisationslösungen aus dem Screen.
A: Memstart+Memfac;25, B: Memstart+Memfac;26 . . . . . . . . . . 83
3.37 Beispiel für die gebildeten Kristalle. . . . . . . . . . . . . . . . . . . 84
3.38 Kokristallisationsversuch von LHC mit PCP. Von links nach rechts
LHC-Ausfall und PCP Kristalle, PCP Kristalle, LHC-Ausfall und
PCP Kristalle . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 85
3.39 Detergenzaustausch mit β-OG. Spektrum des eluierten Proteins nor-
miert auf 672 nm. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 85
3.40 Spektren des LHCs , 30 min. nach Zugabe von Triton X100 (2xCMC)
oder Tween 80 (2xCMC). Schwarz: Tween80, Pink: TritonX100 . . . . 86
3.41 Bedingen bei denen Kristalle entstanden. A: LHC aus der Gel�ltra-
tion, B: LHC aus der Gel�ltration vor Kristallisation gegen Pu�er 3
dialysiert . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 86
3.42 Bedingen bei denen Kristalle entstanden. A: LHC aus der Gel�ltra-
tion, B: LHC aus der Gel�ltration vor Kristallisation gegen Pu�er 3
dialysiert . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 87
3.43 Beispiel von Kristallen, die beim optimierten Screen wuchsen . . . . . 88
3.44 Kristallisation unter Öl. A: 1 µl Tropfen, B: 3 µl Tropfen, C: 6 µl
Tropfen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 88
3.45 Kirstallisation von LHC in kubischen Phasen. A: klare Protein-
Lipidlösung mit Salzkristallen, B: Ausfall, C: Ausfall mit Salzkristallen 89
3.46 Kristall der Dimerkristallisation. A: classic 7, B: classic 74, C: classic
89, D: classic 92, E: MBclass II 21, F: MBclass II 25, G: MB class II
31. MB class II 44 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 90
Abbildungsverzeichnis 151
3.47 Erfolgreiche Kristallisationsbedingungen des LHC �Dimers” . . . . . . 90
3.48 Beispiel eines Beugungsbildes eines Kristalls mit schlechten Beuhungs-
eigenschaften . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 91
3.49 Beugungsbilder von Kristall 4. Rechts schlechter Beugungsbereicht,
links: guter Beugunbgsbereich . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 91
3.50 Beugungsbilder von Kristall 56. Rechts schlechter Beugungsbereicht,
links: guter Beugunbgsbereich . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 93
3.51 Beugungsbilder von Kristall 161 als Beispiel. Rechts schlechter Beu-
gungsbereich, links: guter Beugungsbereich . . . . . . . . . . . . . . . 93
3.52 Au�ösung der LHC Kristalle in der Einfrierlösung. A: t = 0 min., B:
t = 10 min., C: t = 30 min. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 95
3.53 Elutionspro�le der Anionaustauschchromatographiesäulen. Pink:
Source15S, grün: DEAE, schwarz: QXL . . . . . . . . . . . . . . . . . 102
3.54 Elutionspro�l der Anionenaustauschchromatographie DEAE �acher
Gradient. Schwarz: 478 nm, blau: 280 nm, pink: 672 nm . . . . . . . . 102
3.55 UV/VIS Spektren der drei Peaks der Anionenaustauschchromatogra-
phie mit der XK26/20 DEAE Säule. Blau: Peak 1, pink: Peak 2, grün:
Peak 3 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 103
3.56 Beispiele der Elutionspro�le der Gel�ltration mit dem Säulenmaterial
SepharoseS300 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 103
3.57 Elutionspro�le der Chromatofokussierung bei unterschiedlich steilen
pH Gradienten. Blau: �acher Gradient, Pink: steiler Gradient . . . . . 104
3.58 Die Gel�ltration der einzelenen Peaks der Chromatofokussierung . . . 105
3.59 Eichegrade der Gel�ltration Superdex200 HR10/30 für die Gröÿenbe-
stimmung der Peaks . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 106
3.60 UV/VIS Spektren der einzelnen Peaks. Verwendet wurde jeweils die
Fraktion mit dem Absorptionsmaximum in der Gel�ltration. . . . . . 106
3.61 Elutionspro�le der Gel�ltration mit Superdex200 HR10/60. Pink: mit
20 mM MgCl2 im Laufpu�er, grün und blau: Laufpu�er ohne MgCl2 . 107
3.62 SDS-Gel der Gel�ltration mit einem PEak bei 0,37 CV. 1-2:vor Pro-
teinelution 3: Peak bei 0,37 CV,4: Fraktion nach Peak1, 5 und 7-11:
Proteinelution, 6: Marker, 12-15 Fraktionen nach Proteinelution . . . 108
3.63 Spektrum des Peaks bei 0,37 CV. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 108
3.64 ATR-Spektrum des Peaks bei 0,37 CV . . . . . . . . . . . . . . . . . 109
Abbildungsverzeichnis 152
3.65 Die Struktur von MFPCP bei 1,27 A . . . . . . . . . . . . . . . . . . 113
4.1 Schematische Darstellung eines Energietransfers von PCP auf LHC . 118
4.2 Darestellung von LHC und PCP . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 119
4.3 Aminosäure im äuÿeren Bereich des Proteins mit zwei möglichen Po-
sitionen im Raum . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 127
4.4 DGDG 625 und DGDG 615 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 127
Abkürzungsverzeichnis 153
Abkürzungsverzeichnis
Angström Angström (1 A = 0,1 nm)
Abb. Abbildung
APS Ammoniumperoxodisulfat
AS Aminosäure
BSA Rinderserumalbumin
cm−1 Wellenzahl (Anzahl der Wellen pro cm)
CV colum volumen = Säulenvolumen
Da Dalton
FTIR Fourier-Transformations-Infrarot
IR Infrarot
PEG Polyethylenglykol
PMSF 6 Phenylmethylsulfonyl�uorid
red reduziert
rpm Umdrehung pro Minute
SDS-Page Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgelelektrophorese
sym symmetrische
Tab. Tabelle
TEMED N, N, N' , N' - Tetramethylethylendiamin
v/v Volumen pro Volumen
w/v Gewicht pro Volumen
z. B. zum Beispiel
154
Lebenslauf
Name: Silke Johanning
Geburtsdatum: 08.11.1974
Geburtsort: Remscheid
Schulausbildung:
1981 - 1985 Grundschule Remscheid
1985 - 1994 Leibniz-Gymnasium Remscheid
Abschluss: Abitur
Note: 2,5
Ausbildung:
1994 - 1996 Rheinischen Akademie e.V. Köln
Ausbildung zur BTA
Abschluÿ: staatlich geprüfte Biologisch-
technische Assistentin
Hoschulausbildung:
1996 Ruhr-Universität Bochum
Fachrichtung Biochemie
1999 Wechsel zur Fachrichtung Biologie
2005 Abschluÿ des Studienfachs Biologie
Abchluÿ: Diplom
Note: gut
ab 2005 Ruhr-Universität Bochum
Doktorarbeit am Lehrstuhl für Biophysik
155
Publikationen:
Verö�entlichungen:
� S. Wörmke, S. Mackowski, A. Schaller, T.H.P. Brotsudarmo, S. Johanning,
H. Scheer, C. Bräuchle �Single Molecule Fluorescence of Native and Refolded
Peridinin�Chlorophyll�Protein Complexes� J Fluoresc, 2008, 18, 611-617
Posterbeiträge:
� S. Johanning, E. Schuhmacher, F.P. Sharples, R. G. Hiller, E. Hofmann �Struc-
ture Analysis of Light Harvesting complexes from the Dino�agellate Amphidini-
um carterae�23rd European Crystallographic Meeting 2006, Leuven, Belgien)
� S. Johanning, E. Schuhmacher, F.P. Sharples, R. G. Hiller, E. Hofmann �Struc-
ture Analysis of Light Harvesting complexes from the Dino�agellate Amphi-
dinium carterae�14th Internatinal Congress on Photosynthesis 2007,Glasgow,
GB
� S. Johanning, T. Schulte, E. Schuhmacher, E. Hofmann �C6: Struktur und
Funktion der Lichtsammelproteine von Dinofalgellaten (1)� SFB480 Tagung
2006, Wolfsburg
� T.Schulte S. Johanning, E. Schuhmacher, E. Hofmann �C6: Struktur und Funk-
tion der Lichtsammelproteine von Dinofalgellaten (2)� SFB480 Tagung 2006,
Wolfsburg
156
Danksagung
An dieser Stelle möchte ich mich bei all denen bedanken, die durch ihre Unterstüt-
zung den Erfolg dieser Arbeit erst möglich gemacht haben:
Professor Dr. Eckhard Hofmann für die Vergabe des Themas, seinem Engagement
bei der Betreuung meiner Arbeit und der Unterstützung bei fachlichen Problemen,
spezieller Dank auch für die �Wunscherfüllung�, die Anscha�ung des wunderbaren
Fluidizers
Prof. Dr. Matthias Rögner, für die Kore�erenz meiner Arbeit und die Bereitstellung
der French Press
Prof. Dr. Klaus Gerwert dafür, das ich die Arbeit am Lehrstuhl für Biophysik durch-
führen konnte
Alexander Wolf vom BMZ in Dortmund für die Kooperation bei den Biacore Versu-
chen
dem DFG für die �nanzielle Unterstüzung durch den SFB 480
Roger Hiller in Australien für den Austausch und die Diskussionen
dem gesamten Lehrstuhl für Biophysik für das angenehme Arbeitsklima
hier besonders Jörn Güldenhaupt für die e�ektive Zusammenarbeit bei den ATR
Experimenten
Eva für die Unterstützung bei den Anzuchten der Dino�agellaten und bei den Auf-
reinigungen
dem Lehrstuhl für Molekularbiologie für die unkomplizierte und kurzfristige Un-
terstützung durch die Nutzung der Zentrifugen, besonders der UZ und der French
Press wenn die normal verwendeten Geräte aus�elen
hier besonders auch meinen Dank an Meriyem für die Gespräche über Frust und
157
Lust der Dissertation
dem Lehrstuhl für die Biologie der P�anzen für die Dauerleihgabe des Extruders
und Hilfe beim Ausfall unseres Autoklaven
dem Lehrstuhl für Biochemie für die Nutzung des Fluidizers bis der Lehrstuhleigene
vorhanden war
allen Freunden die ich zum Teil am Lehrstuhl fand für die unzähligen Gespräche, die
Aufmunterungen, den Glauben an mich und ihre ehrliche Kritik, eure wunderbare
Freundschaft war mein Rückrat in dieser Zeit und meine Dankbarkeit �ndet keine
wirklichen Worte.
Erklärung
Hiermit erkläre ich, dass ich die Arbeit selbstständig verfasst und bei keiner anderen
Fakultät eingereicht und dass ich keine anderen als die angegebenen Hilfsmittel
verwendet habe. Es handelt sich bei der heute von mir eingereichten Dissertation
um fünf in Wort und Bild völlig übereinstimmende Exemplare.
Weiterhin erkläre ich, dass digitale Abbildungen nur die originalen Daten enthalten
und in keinem Fall inhaltsverändernde Bildbearbeitung vorgenommen wurde.
Bochum, den 15.4.2009
(Unterschrift)
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