regulátoros t sejtek és sejtes környezetük immunmediált...
Post on 16-Jun-2019
222 Views
Preview:
TRANSCRIPT
Regulátoros T sejtek és sejtes környezetük immunmediált gyermekkori
gasztroenterológiai kórképekben
Doktori értekezés
Dr. Cseh Áron
Semmelweis Egyetem Klinikai Orvostudományok Doktori Iskola
Témavezető: Dr. Veres Gábor, Ph.D., egyetemi docens
Hivatalos bírálók: Dr. Juhász Márk, Ph.D., egyetemi adjunktus Dr. Kriván Gergely, Ph.D.
Szigorlati bizottság elnöke: Dr. Szalai Csaba, Ph.D., az MTA doktora
Szigorlati bizottság tagjai: Dr. Nobilis András, Ph.D., egyetemi docens Dr. Sebe Attila, Ph.D.
Budapest, 2011
Tartalomjegyzék
2. oldal
1. Tartalomjegyzék
1. Tartalomjegyzék 2
2. Rövidítések jegyzéke 5
3. Bevezetés 7
3.1. Immunmechanizmusú kórképek 8
3.1.1. Crohn betegség 8
3.1.2. Cöliákia 11
3.1.3. Allergiás kolitisz 13
3.2. Az immunrendszer sejtes elemei 15
3.2.1. Regulátoros T sejtek (Treg) 15
3.2.1.1. Treg típusok 15
3.2.1.2. Treg-ek azonosítása 17
3.2.1.3. Treg sejtek működése 19
3.2.1.4. Treg terápia 21
3.2.2. Treg szabályozó sejtek 24
3.2.2.1. A DC sejtek 25
3.2.2.2. Monociták 29
3.2.3. Treg célsejtek 30
3.2.3.1. NK és NKT sejtek 30
Tartalomjegyzék
3. oldal
3.2.3.2. CD4 és CD8 limfociták 34
4. Célkitűzések 38
4.1. Crohn betegség 38
4.2. Cöliákia 38
4.3. Allergiás kolitisz 38
5. Betegek és módszerek 39
5.1. Egészséges és beteg csoportok 39
5.1.1. Crohn betegek 39
5.1.2. Cöliákia 41
5.1.3. Allergiás kolitisz 42
5.1.4. Egészséges kontrollok 43
5.2. Módszerek és statisztika 44
5.2.1. Minta előkészítés 44
5.2.2. Immunsejt markerek 46
5.2.3. Áramlási citométeres mérések 52
5.2.4. Citokin chip 55
5.2.5. Statisztika 55
6. Eredmények 57
6.1. Crohn betegség 57
Tartalomjegyzék
4. oldal
6.2. Cöliákia 63
6.3. Allergiás kolitisz 68
7. Megbeszélés 70
7.1. Crohn betegség 70
7.2. Cöliákia 74
7.3. Allergiás kolitisz 78
8. Következtetések 81
9. Összefoglalás 83
9.1. Összefoglaló 83
9.2. Summary 85
10. Irodalomjegyzék 87
11. Publikációk 102
11.1. A disszertáció alapjául szolgáló publikációk 102
11.2. A disszertációhoz kapcsolódó publikációk 103
11.3. Egyéb publikációk 104
12. Köszönetnyilvánítás 106
Rövidítések jegyzéke
5. oldal
2. Rövidítések jegyzéke
5-ASA 5-aminoszalicilát
AC allergiás kolitisz
APC antigén prezentáló sejt
AZT azathioprin
BMI testtömeg-index
CD Crohn betegség
CRP C-reaktív protein
CTLA-4 citotoxikus T limfocita antigén-4 (CD152)
DC dendritikus sejt
DNS dezoxiribonukleinsav
EC eozinofil kolitisz
FACS áramlási citométer
FoxP3 forkhead box P3 transzkripciós faktor
GCSF granulocita kolónia-stimuláló faktor
GFD gluténmentes diéta
GITR glükokortikoid indukálta tumor nekrózis faktor receptor gén
GMCSF granulocita-makrofág kolónia-stimuláló faktor
HC hematokézia
IBD gyulladásos bélbetegség
ICS inhalált kortikoszteroid
IDO indolamin 2,3-dioxigenáz
IEL intraepiteliális limfociták
IFNα interferon-alfa
IFN-γ interferon-gamma
IFX infliximab
Ig immunglobulin
IL interleukin
iNKT invariáns természetes T ölő sejt
LAG-3 limfocita aktivációs gén 3
LPS lipopoliszacharid (endotoxin)
Rövidítések jegyzéke
6. oldal
MCP-1 monocita kemoattraktáns protein-1
mDC mieloid dendritikus sejt
MHC fő hisztokompatibilitási komplex
MIP-1β makrofág inflammatórikus protein-1β
NK természetes ölő sejt
NKT természetes ölő T sejt
PBMC perifériás vér mononukleáris sejt
PBS foszfát-pufferelt fiziológiás sóoldat
pDC plazmocitoid dendritikus sejt
RA reumatoid artritisz
Tc citotoxikus T sejt (CD8)
TCR T sejt receptor (CD3)
TG transzglutamináz
TGF-ß transzformáló növekedési faktor béta
Th helper T sejt (CD4)
TLR Toll-like receptor
TNFα tumor nekrózis faktor alfa
Treg regulátoros T sejt
UC kolitisz ulceróza
Bevezetés
7. oldal
3. Bevezetés
A csecsemő-, és gyermekkori megbetegedések jelentős csoportját alkotják a
gasztroenterológiai kórképek. Ezek a kórképek kialakulásuk szerint alapvetően három
csoportba sorolhatóak: a fejlődési rendellenességgel járók, a felszívódási zavarok,
illetve azok, amelyekben gyulladásos folyamat játszik szerepet. A gyulladás hátterében
fertőzés, illetve autoimmun reakció állhat. A fertőzések pathomechanizmusa általában
ismert, lefolyásuk többnyire akut, kezelésük tüneti, ill. a bakteriális fertőzések egy
részében antibiotikumok adása szükséges. Az autoimmun betegségek ezzel szemben
krónikus jellegűek, kezelésük során a cél az immunrendszer kóros működésének a
modulációja. Az autoimmun betegségek kialakulásának módja kevéssé ismert, de egyre
több adat áll rendelkezésre arról, hogy az immunszabályozás zavara miként vesz részt a
létrejöttükben.
Munkám során azzal kapcsolatban kívántam adatokat gyűjteni, hogy a
vizsgálandó kórképek hátterében milyen immunfenotípus változások állnak, illetve az
általunk eddig ismert kezelési módok hogyan befolyásolják ezeket az esetleg fennálló
eltéréseket. A vizsgált gasztroenterológiai kórképek a Crohn betegség (CD), cöliákia, és
az allergiás kolitisz (AC) a csecsemő-, és gyermekkor eltérő időszakában és más-más
okokból alakulnak ki. Közös bennük azonban, hogy immunmediálta kórképek.
Feltételezések szerint a túlzott immunválasz gátlásában fő szerepet játszanak a
regulátoros T sejtek (Treg), ezért ez a sejtcsoport állt vizsgálatunk középpontjában.
Ugyanakkor az immunsejtek nem önállóan, hanem egymással szoros együttműködésben
és bonyolult kölcsönhatásban alakítják az immunválaszt, ezért a Treg sejteken túl sejtes
környezetük is vizsgálatra került.
Célunk volt olyan vizsgálati módszer kidolgozása és alkalmazása is, amely a
legkevesebb megterhelést jelenti a gyermekkorú betegek számára. Az áramlási
citométeres (FACS) vizsgálatokhoz igen kevés vérminta is elegendő, és a perifériáról
vett minta a rutin vérvételeken túl alig jelent a betegnek többletterhelést.
Dolgozatomban a vizsgált kórképekről, majd az immunrendszerről szóló irodalmi
áttekintés után ismertetem a vizsgálati módszereket és a betegeket, majd végül az
Bevezetés
8. oldal
eredményeket és az azokból levonható következtetéseket. A dolgozat megírásánál a
magyar orvosi nyelvvel kapcsolatos magyarító és egységességre törekvő ajánlásoknak
megfelelő irányelveket követtem. [1]
3.1. Immunmechanizmusú kórképek
3.1.1. Crohn betegség
A Crohn betegség (CD) a kolitisz ulcerózával (UC) együtt a krónikus gyulladásos
bélbetegségek (IBD) csoportját alkotja. A CD krónikus gyomor-bélrendszeri
megbetegedés, amit a bélrendszer nyálkahártyájának gyulladása jellemez, és a
genetikailag fogékony egyénekben az immunrendszer egyébként ártalmatlan luminális
antigénekre adott rendellenes válaszának következményeként alakul ki. [2] A betegség
az esetek 10-15%-ában 18 éves életkor előtt kerül felismerésre. [3] Prospektív hazai
adatok alapján a Crohn betegség incidenciája 3,8/100 000, amely megegyezik az
európai és észak-amerikai adatokkal. [4] A gyermekkori Crohn betegség számos
különbséget mutat a felnőttkori változathoz képest, így eltérő a betegség lokalizációja,
az immunszuppresszív terápiára adott válasz, és feltételezhetően különbözik a genetikai-
és immunfenotípus is. [5] A legelfogadottabb elméletek szerint az immunrendszer hibás
működése az, ami felnőttekben döntően hozzájárul a betegség kialakulásához, mind az
adaptív, mind a veleszületett immunitás érintettségével. [6-9]
Ismert, hogy az adaptív immunitás elemei közül felnőttkori CD-ben a perifériás
Treg szám alacsony terápia-naív (még nem kezelt) betegekben, és megemelkedik a
kezelés hatására vagy remisszióban. [10-12] Ugyanakkor a központi Treg-ek száma a
bélben megnövekszik a betegség aktív fázisában [11-13]. A Treg-ek célsejteiként
számon tartott effektor [14-16] és aktivált T sejtek [17-19] száma emelkedett a
periférián aktív CD-s betegekben. Régóta ismert az a tény is, hogy IBD-ben mind a
perifériás, mind a centrális T helper (Th) sejtek Th1 irányba polarizálódnak. [7] A
felnőttkori betegekben a veleszületett immunitás sejtjei közül az antigén prezentáló
sejtek (APC), ezen belül is a dendritikus sejtek (DC) száma csökken remisszióban és
relapszusban a periférián, míg a ezek a sejtek a szövetekben felszaporodnak. Ezzel
együtt az APC-k Toll-like receptor (TLR) 2 és 4 expressziója mind terápia naív, mind
kezelt betegekben magasabb az egészségeseknél. [20-22] Az APC-k másik
Bevezetés
9. oldal
csoportjának, a monocitáknak a prevalenciája nem változik a periférián, de magasabb
biopsziában, magasabb TLR-2 és 4 expressziót mutatva aktív fázisban és remisszióban
is. [23-26]
Jóval kevesebb adat áll ugyanakkor rendelkezésre arról, hogy gyermekkorban
milyen immunelváltozások állnak a CD hátterében. A legtöbb közlemény, ami erről a
korcsoportról eddig megjelent, főleg a kezelt beteg gyermekeket vizsgálta. Ugyanakkor
az a kevés adat, ami kezeletlen beteg gyermekektől származik, az adaptív immunitás
eltérő viselkedését írta le, így a Th1/Th2 arány Th2 felé való eltolódását, szemben a
felnőttekben megfigyeltekkel. [27-30] Újabban azonban a veleszületett immunitásnak
életkori sajátosságok miatt nagyobb szerepet tulajdonítanak ebben a korcsoportban,
ugyanis minél fiatalabb életkorra esik a betegségkezdet, annál nagyobb lehet a
veleszületett immunitás jelentősége. [3] Kevés adat áll rendelkezésre ebből az
életkorból, de ismert, hogy nem kezelt CD beteg gyermekekben a szöveti makrofágok
prevalenciája emelkedett [31], akárcsak a TLR-2 és TLR-4 expresszió [32].
A betegség kezelésére használt hagyományos és biológiai terápiát jelentő
gyógyszerekkel ezt a zavart immunműködést próbálják meg helyreállítani. A
hagyományos, első vonalbeli aminoszalicilátoknak (ASA), szteroidoknak és
immunszuppresszív szereknek, amik a leggyakrabban alkalmazottak a terápiában,
régóta ismert az immunrendszert befolyásoló hatásuk. [33] A kezelés következő
lépcsőjét jelentő biológiai terápiának, így a tumor nekrózis faktor-alfa (TNFα) inhibitor
infliximabnak (IFX) újabban kezdjük megismerni a pontos hatásmechanizmusát
(többnyire reumatoid artritiszes (RA) betegcsoportban), valamint leírták az egyes
sejtcsoportokra kifejtett hatását. [34] Az IFX fokozza mind a perifériás, mind a centrális
Treg [10,35], effektor és aktivált T [36,37] és Th1 sejtek [37,38] prevalenciáját. Az IFX
ugyanakkor csökkenti a természetes ölő (NK) sejtek [36], DC-k [39,40], és monociták
prevalenciáját [41,42], valamint a TLR-2 és 4 expressziót [43] a periférián.
Gyermekkorban ugyanakkor kevéssé ismert akár a konvencionális, akár pedig a
biológiai terápiának az immunsejtekre gyakorolt hatása.
Bevezetés
10. oldal
1. ábra A Crohn betegség feltételezett immunpatomechanizmusa. A tápcsatorna
immunrendszere közvetlen kapcsolatban van a béltartalom antigénjeivel, a lamina propriát csak
egy sejtsornyi epitél választja el a lumentől. Az epitél tartalmazza a Paneth és Goblet sejteket is,
ez utóbbiak hozzák létre a védőréteget a bélfalon. A dendritikus sejtek mintát vesznek a
béltartalom antigénjeiből. Ha magasabb az antigének száma vagy sérül az epitélium, akkor a
dendritikus sejtek a naív T sejteket aktiválják. Ezek a sejtek aztán tovább differenciálódnak T
helper 1, T helper 2, T helper 17 vagy regulátoros T sejt irányba, ezáltal kialakítva a jellemző
immunválaszt. [44]
Bevezetés
11. oldal
3.1.2. Cöliákia
A cöliákia világszerte a populáció közel egy százalékát érintő
vékonybélgyulladás. [45] A rendelkezésekre álló szűrő tesztekkel egyre gyakrabban
ismerik fel a néma cöliákiát is, így magyar adatok alapján a betegség prevalenciája 1:85.
[46] Gyermekkorban a tünetek intesztinális (széklet habitusának megváltozása, krónikus
hasi fájdalom, malabszorpciós tünetegyüttes) és extraintesztinális (vas háztartás zavara,
hepatitisz, oszteopénia, migrén, occipitális epilepszia) megjelenésűek lehetnek. [47] A
genetikailag fogékony egyénben a cöliákia tüneteit a táplálékkal felvett bizonyos
fehérjékre adott fokozott adaptív immunválasz okozza. [48] Újabban azonban a
veleszületett immunitás szerepét is feltételezik a betegség patomechanizmusában. [49-
51] A betegség kezelésében döntő jelentőségű a kiváltó okot jelentő antigének
eliminációja az étrendből (gluténmentes diéta, GFD), így a búza, rozs és árpa teljes
tilalma. A diéta a tünetek javulását hozza napokon vagy heteken belül, míg a
hisztológiai javulás hónapokon vagy éveken belül figyelhető csak meg. Amennyiben a
diéta hatására javulás nem következik be, ritkán szteroid vagy immunszuppresszáns
adása is szükséges lehet. Megfigyelték, hogy míg aktív cöliákiában az intraepiteliális
limfociták (IEL) többnyire CD3+CD8+, addig ezekben a diétára nem reagáló
refraktórikus esetekben CD3+CD8- immunfenotípusúak. [52]
Bár úgy tűnhet, hogy a kiváltó okot már régóta jól ismerjük, de a következményes
immunzavar egyes elemeinek a pontos szerepe, mind a mai napig nem egészen
tisztázott. A rendelkezésre álló adatok többsége az adaptív immunitás zavarát írja le
cöliákiában. Az összes T limfocita prevalenciáját alacsonyabbnak találták a periférián
[53], míg a biopsziás mintákban emelkedett volt arányuk az egészségesekhez képest
[48,54]. Az aktivált T sejtek prevalenciája ugyanakkor mind a periférián [53,55-58],
mind a biopsziás mintákban [59,60] megnövekedett. Ezzel együtt az egyik legfőbb, az
adaptív immunválaszt szabályozó Treg sejtek zavaráról is beszámoltak cöliákiában [61-
63].
Bevezetés
12. oldal
2. ábra A cöliákia immunpatomechanizmusa. A glutén a bélrendszer enzimjei hatására 33
aminósavból álló peptidre bomlik. Ez a peptid a vékonybél epitéliumán át felszívódik, és a
lamina propriánál a szöveti transzglutaminázok révén deaminálódik. A deaminált peptid az
antigén prezentáló sejtek révén felismerésre kerül. Ezt követően a T-sejt receptorok révén
autoreaktív CD4+ sejtek valamint T helper 1 és természetes ölő sejtek aktivációját okozzák. A
következményes gyulladás intraepiteliális limfociták felhalmozódását és a jellegzetes bélboholy
atrófiát eredményezi. [52]
A veleszületett immunitás sejtes elemeinek szerepe még kevésbé tisztázott a
cöliákia patomechanizmusában. [49,50,64] Az NK, természetes ölő T (NKT) és
invariáns természetes ölő T (iNKT) sejtek száma csökkent a betegek vérében [53,65-
67], és bélmintáiban [59,66]. Kevés és ellentmondásos adat áll rendelkezésre az APC-k
Bevezetés
13. oldal
eltéréseiről, mivel egy közlemény szerint a perifériás DC-k száma csökkent [67], míg
egy másik nem írt le változást ebben a sejtcsoportban [68]. A veleszületett immunitás
receptorai, így a TLR-2 és 4 expressziója ugyanakkor fokozódik a betegekből származó
biopsziákban. [69]
3.1.3. Allergiás kolitisz
A fejlett országokban az anyatejjel táplált csecsemőkben az allergiás kolitisz (AC)
az egyik leggyakoribb oka a hematokéziának (HC). [70] A HC friss vér megjelenése a
székletben, amely az egyébként egészségesnek imponáló csecsemőkben a fertőzések és
végbélrepedés után a leggyakoribb megjelenési formája a rektális vérzésnek. Az AC
jelenlegi tudásunk szerint az anyatejben kiválasztott antigénekkel szembeni
hiperszenzitivitás révén jön létre, és így az ételallergiák egy fajtájának tartjuk.
Súlyosabb formája az eozinofil kolitisz (EC), mivel az AC és EC elkülönítése biopsziás
mintában látható eozinofil számon alapul, és utóbbiban több, mint húsz eozinofil sejt
látható látóterenként a nagy nagyítású mikroszkópban. Az AC és EC kialakulásában
döntő szerepe van a tehéntej-fehérjéknek, amelyek az allergiás válasz leggyakoribb
kiváltó okai csecsemőkben, ugyanis a minden más tekintetben egészséges csecsemők
esetében 0,3-7,5%-ban okozói a HC-nek. [71] A HC-s csecsemők esetében az anyatejes
táplálás elhagyására gyakran megszűnnek a tünetek. Újabb adatok szerint azonban a
HC-s gyermekek mindössze 18%-ában áll fent valódi tehéntejallergia. [72]. A betegek
egy részében az anyai eliminációs diéta (tehéntej, tojás, szója, olajos magvak elhagyása)
nem segít, és súlyos esetben csak elementáris tápszerre való váltással szüntethetőek meg
a panaszok. A kórkép speciális sajátossága, hogy az esetek döntő részében a HC
spontán javul, amelynek pontos oka ismeretlen.
Egyre több adat utal arra, hogy az ételallergiák kialakulásában a
gyomorbélrendszer immunitásának késedelmes érése játszhat szerepet. [73] A higiénia
hipotézisnek megfelelően a szuboptimális mikroorganizmus expozíció miatt az adaptív
immunitás zavart szenved az ételallergiás egyénekben. [74] Az effektor T sejtek és
aktivált limfociták [75], valamint a Treg sejtek prevalenciája [76] alacsonyabb
ételallergiás gyermekek perifériás vérében. A sejtszámok változásával együtt a Th1/Th2
Bevezetés
14. oldal
arány Th2 irányba tolódik a betegekben, mind a sejtfelszíni markerek, mind a citokin
expresszió alapján. [77]
3. ábra A gyomorbélrendszeri hiperszenzitivitás kialakulása. Egészséges egyénben orális
tolerancia alakul ki a táplálék allergénekkel szemben. Allergiás egyénekben allergén specifikus
T helper (Th) 2 sejtek keletkeznek a naív Th0 sejtekből. Aktiválódásuk után a Th2 sejtek
különböző interleukineket (IL), így IL-4, IL-10 és IL-13-at termelnek. A regulátoros T sejtek
képesek a Th2 limfociták aktiválódását gátolni. [78]
Bevezetés
15. oldal
3.2. Az immunrendszer sejtes elemei
3.2.1. Regulátoros T sejtek (Treg)
A Treg sejtek az adaptív immunitásban központi szabályozó szerepet játszanak.
Humán perifériás vérmintában arányuk csak kb. 1-2%-a az összes fehérvérsejtnek, de
mégis az immun homeosztázis egyik legfontosabb fenntartói. A Treg-ek képesek más
immunsejtek működését gátolni, és így szabályozni az immunválaszt. Csökkent Treg
számot és működést számos autoimmun kórképben (szklerózis multiplex, reumatoid
artritisz, 1-es típusú diabétesz) leírtak. A Treg sejtek magas számát azonban
rosszindulatú daganatos betegségekben (tüdő-, hasnyálmirigy-, mellrák) figyelték meg.
[79]
1. táblázat A regulátoros T sejtek feltételezett funkciói. A táblázat az eddig in vivo és in vitro
bizonyított szabályozó feladatokat sorolja fel. [80]
1. Autoimmun folyamatok megakadályozása saját tolerancia kialakításával
2. Allergiás típusú immunfolyamatok gátlása
3. Orálisan bekerülő antigénekkel szembeni tolerancia kialakítása
4. Anyai tolerancia kialakítása a magzattal szemben
5. Patogén indukálta immunfolyamatok gátlása
6. Az effektor immunműködés szabályozása az immunválaszban
7. Gyenge stimulus által aktivált immunválasz gátlása
8. Kis affinitású autoreaktív limfociták gátlása
9. Effektor immunválasz nagyságának befolyásolása
10. Kommenzális baktériumok védelme az immunrendszerrel szemben
3.2.1.1. Treg típusok
A Treg-eket két csoportba osztják: megkülönböztetnek CD4 Treg és CD8 Treg
sejteket. A CD4 Treg-ek kialakulásuk alapján két típusra bonthatóak, a természetes
Treg-ekre (nTreg), amelyek folyamatosan expresszálnak CD25-öt és forkhead box P3
(FoxP3) transzkripciós faktort, valamint az ún. adaptív vagy indukált Treg-ekre (iTreg).
Bevezetés
16. oldal
2. táblázat Regulátoros T sejt (Treg) típusok jellemzői. Rövidítések: CTLA-4: citotoxikus T
limfocita antigén-4; GITR: glükokortikoid indukálta tumor nekrózis faktor receptor gén;
FoxP3: forkhead box P3 transzkripciós faktor; TGF-ß: transzformáló növekedési faktor béta;
APC: antigén prezentáló sejt; IL: interleukin. [81]
Természetes Treg
(nTreg) Indukált Treg
(iTreg) nTreg Tr1 Th3
Fenotípus CD4+CD25int/high,
CD127low CD4+CD25- CD4+CD25+
Egyéb markerek CTLA4+, GITR+,
FoxP3+, CD127low CD25low-variable,
CD45RBlow, FoxP3- CD25low-variable,
CD45RBlow, FoxP3+
Hatásmechanizmus kontaktus függő, granzim B-függő,
TGF-β termelő
citokinek révén, IL-10 termelő
TGF-β termelő
Célsejtek APC és effektor
T sejtek effektor T sejtek nem ismert
In vivo szerep autoreaktív T sejtek
gátlása
mukozális immunitás,
gyulladásos válasz
mukozális immunitás,
gyulladásos válasz
In vivo aktiváció CD3 és CD28, IL-2 hatására
CD3, IL-10 hatására CD3, TGF-β
hatására
Az nTreg-ek a csecsemőmirigyből származnak, és nagy mennyiségben
expresszálják a CD25 sejtfelszíni markert, vagyis az interleukin (IL) 2 receptort,
valamint intracellulárisan a FoxP3 transzkripciós faktort. Az nTreg-ek a CD4 pozitív
sejtpopuláció átlagosan 5-10%-át alkotják, egyszeres CD4 pozitív sejtekként már
különválnak, és pozitív szelekciójuk során a saját antigének iránt nagy affinitással
rendelkező sejtekként maradnak meg. [82] A limfociták Treg irányba való fejlődését a
feltételezések szerint a csecsemőmirigyben a saját antigénekkel való találkozás a T sejt
receptor (TCR) és a fő hisztokompatibilitási komplex II (MHC II) közötti kapcsolat
révén befolyásolja. [83]
Az iTreg-ek szintén a csecsemőmirigyből származnak, CD4 pozitív sejtekként
tovább differenciálódnak az adekvát antigén hatásra a veleszületett antigének, valamint
transzformáló növekedési faktor béta (TGF-ß), IL-4, és IL-10 stimuláció hatására CD25
és FoxP3 expresszáló sejtekké. [84]
Bevezetés
17. oldal
3.2.1.2. Treg-ek azonosítása
A régebben szuppresszor T sejteknek nevezett immunsejtek koncepciója az 1980-
as évek vége felé az alapján dőlt meg, hogy nem találtak olyan markert, amivel
egyértelműen azonosítani lehetett volna a populációjukat. [80] A Treg sejtek
azonosítására jelenleg is számos marker áll rendelkezésünkre, így a CD25 (IL-2R),
CTLA-4, GITR, LAG-3, CD127 (IL-7R), és a FoxP3. Mindegyikről ismert, hogy az
aktivált T sejtekre is jellemző marker, ezért úgy tartják, hogy a szuppresszor hatás
létrejöttéhez szükséges a sejtek aktivációja.
Az összes Treg marker közül a FoxP3 a jelenleg ismert legszélesebb körben
elfogadott, annak ellenére, hogy tudott az, hogy a Treg-ek kis százaléka FoxP3-ra
negatív. [80] A FoxP3 a limfoid szövetekben expresszálódik legnagyobb számban, ezen
belül az a αß T sejtekre jellemző, míg a B sejtekben, γδ T sejtekben, NK sejtekben,
makrofágokban és DC-kben alig detektálható. A FoxP3-at a CD4+ sejtek expresszálják a
legnagyobb számban, de CD8+ sejtekben is megtalálható kis számban. A klasszikus
Treg markerrel, a CD25-el nem teljes az expressziós átfedés, mert a nyirokcsomókban
és a lépben a kettős pozitív sejteken túl igen kis számban ugyan, de előfordulnak CD25-
FoxP3+ sejtek is.
A FoxP3 (Scurfin, IPEX, JM2) a regulátoros aktivitással bíró CD4 pozitív
sejtekben expresszálódik, mint a forkhead családba tartozó transzkripciós faktor. [85]
Genomiális analízisekben kimutatták, hogy bár pontos szerepe nem ismert, de nagyjából
700-1100 gén promoter régiójához kötődik, és minden esetben a TCR-en keresztüli
szignáltranszdukciót befolyásolja. [80] Mint minden transzkripciós faktor, a
transzkripciót mind aktiválni, mind gátolni képes, ahogy ezt ki is mutatták a Treg sejtek
esetében. A legfőbb bizonyíték a FoxP3 jelentőségére az, hogy naív T sejtekbe
retrovirális úton FoxP3-at juttatva szuppresszor funkciót nyernek. Ugyanakkor az in
vivo vagy in vitro generált Treg sejtek nem mindegyike expresszál FoxP3-at, hasonlóan
az IL-10 indukálta és IL-10-et is termelő Tr1 típusú Treg sejtekhez. Ezzel
összefüggésben megfigyelték, hogy bizonyos tartós citokin hatásokra képesek a Treg
sejtek T helper sejtekké alakulni, és a FoxP3 pozitivitásuk ebben az esetben elveszhet.
Bevezetés
18. oldal
4. ábra A regulátoros T (Treg) sejtek populációinak eredete. A forkhead box P3 transzkripciós
faktor (FoxP3) expressziója a jelenleg legelfogadottabb marker a Treg sejtek azonosítására. A
természetes Treg sejtek prekurzoraikból alakulnak ki nem ismert módon a csecsemőmirigy
kortexében és medullájában lévő epiteliális és dendritikus sejtek hatására. Citokinek, így az
interleukin-2 (IL-2) és feltehetően a transzformáló növekedési faktor béta (TGF-β) szintén
szerepet játszanak a sejtvonal kialakulásában és élethosszig tartó FoxP3 expressziójuk
fenntartásában. A periférián a naív FoxP3+ Treg sejtek effektor Treg sejtekké alakulnak,
valamint de novo is keletkezhetnek naív FoxP3- sejtekből. In vitro TGF-β hatására alakulhatnak
ki nem stabilan FoxP3+ Treg sejtek. [86]
Bevezetés
19. oldal
A FoxP3 mutációja egerekben a Scurfy, míg emberekben az IPEX nevű
tünetegyüttest okozza (immun diszreguláció, poliendokrinopátia, enteropátia, X-
kromoszómához kapcsolt szindróma). (Sakaguchi 2005) Miután a FoxP3 intracelluláris
marker, azonosításához a sejtet fixálni és permeabilizálni kell, ezért élő sejtek
izolálására nem alkalmas. Régebben a CD4+CD25high sejtekként azonosították a Treg-
eket, ami csak megközelítőleg (kb. 90%) volt pontos eljárás, de élő sejtek vizsgálatát is
lehetővé tette. A CD25 az IL-2 receptor alfa lánca, és mivel az IL-2 elengedhetetlen a T
sejtek klonális expanziójához, minden aktivált T limfocitára jellemző. [80]
Újabban, a FoxP3+ sejtek elkülönítésével azonosították a CD127 (IL-7R) markert.
[87] A CD127 expresszió inverz módon korrelál a FoxP3 expresszióval, és a CD127 a
CD25 pozitív sejtek nagy részén jelen van. [88,89] A CD127 a heterodimér IL-7
receptor része, a sok más citokin receptort (IL-2R, IL-4R, IL-9R, IL-15R, IL-21R) is
alkotó gamma lánc mellett. A CD127 a timocitákon, T- és B- progenitor sejteken, érett
T sejteken, monocitákon, és egyéb limfoid és mieloid sejteken van jelen. Az IL-7R
fontos szerepet játszik az érett T sejtek proliferációjában és differenciációjában, és in
vitro megfigyelések alapján a CD127 expresszió csökken a T sejt aktivációt követően.
Feltételezések szerint a FoxP3 transzkripciós faktor a CD127 promoterére is hatással
van, és így csökkenti Treg-ekben a CD127 expressziót. [90]
3.2.1.3. Treg sejtek működése
A Treg-ek képesek számos immunsejt – így a CD4+, CD8+ limfociták, NK és
NKT sejtek, B sejtek és APC-k – aktivációját, proliferációját és effektor funkcióját, így
citokin termelését is szabályozni. [90] Gátló működésük döntően két mechanizmussal
valósulhat meg, egyrészt közvetlen sejt-sejt kontaktussal (CD39, CD73, és LAG-3-on
keresztül, vagy az APC-k és effektor T sejtek elpusztításával granzimek és perforinok
révén), másrészt szolubilis faktorokkal (immunszuppresszív citokinekkel, mint az IL-
10, TGF-ß, IL-35 és galectin-1, vagy a limfociták éréséhez szükséges IL-2 gátlása
révén). [91]
Bevezetés
20. oldal
5. ábra A Treg sejtek hatásmechanizmusai az effektor T sejteken. A Treg sejtek hatása közvetett
úton gátló citokinek (transzformáló növekedési faktor béta, TGF-β; interleukin 10, IL-10),
citolízis (granzimek), metabolikus gátlás (IL-2 abszorpció) és a DC-k (indolamin 2,3-
dioxigenáz, IDO) révén valósulhat meg. [92]
Nem ismert, hogy melyik mechanizmus a döntő, mert feltételezhetően az egyes
gátló hatások egymást erősítik, de a CTLA-4 függő szuppressziót tartják az egyik
legfontosabbnak. Először is a FoxP3-at expresszáló Treg sejtek konstitutívan és nagy
mennyiségben expresszálnak CTLA-4-et. [91] Másodszor, a CTLA-4 gátlásával szerv-
specifikus autoimmun betegségek, IBD, és cukorbetegség fellángolása érhető el
állatmodellben [93]. Harmadszor pedig a FoxP3 más transzkripciós faktorokkal együtt
fokozza a CTLA-4 expresszióját, ezáltal a CTLA-4 hiányos állatmodellekben a FoxP3
hiányhoz hasonló betegségek indukálhatóak. A Treg sejtek CTLA-4 dependens gátló
hatása döntően az APC-ken keresztül valósul meg. [94] In vitro a Treg sejtek az éretlen
DC-k körül összegyűlnek és a CTLA-4-nek a CD80 vagy CD86-hoz történő
Bevezetés
21. oldal
kapcsolódásuk révén a DC-k citokin termelését befolyásolják. In vivo pedig a Treg
sejtek két-foton mikroszkóppal leírt módon megakadályozzák az antigén-aktivált sejtek
és a DC-k közötti stabil kapcsolódás létrejöttét. Emellett ismert, hogy a FoxP3+ Treg
sejtek képesek bizonyos környezeti hatásokra differenciálódni, és további interleukinok
termelésével befolyásolni az immunválaszt (Th1, Th2, Th17 irányába). [95]
Arról, hogy pontosan hogyan különbözteti meg a Treg sejt a kórokozóra
specifikus és a saját szervezetre reaktív limfocitákat, nincsenek pontos ismereteink. [80]
A keresztregulációs modell szerint a Treg sejt szuppresszió antigén specifikus. A Treg
sejtek ezen felfogás szerint autoreaktívak, és a hasonló antigenitású T sejteket az APC-k
révén gátolják. A TCR szignál-erősség modell azt feltételezi, hogy a periférián lévő
autoreaktív T sejtek kis affinitású TCR-el rendelkeznek, mert a nagy affinitásúak
szelektálódtak a csecsemőmirigyben. A Treg-ek ezeket a kis affinitású TCR-eket
ismerik fel és ártalmatlanítják. A TLR-mediálta Treg blokád modellben a DC-k
aktivációja gátolja a Treg sejtek szuppresszor hatását, így képes aztán a patogén
specifikus adaptív immunválasz kialakulni. Az effektor regulációs modellben ezzel
szemben a DC-k átmenetileg információs hidat képeznek az orálisan immunizált Treg
és a naív CD4 sejtek között. Az immunizált T limfociták ezek alapján interleukinek
révén megtanítják a DC-knek, hogy milyen mintázatot adjanak tovább a naív sejteknek,
amelyek így hasonlítanak az immunizált Treg sejtekhez. Az asszociatív antigén
felismeréses modellben ezekkel ellentétben a Treg sejtek nem különböztetik meg a saját
vagy idegen antigenitású limfocitákat. Ezen elképzelés szerint a Treg sejtek csak az
adott immunválasz erősségét befolyásolják a Th sejtek révén, de egyformán reagálnak
mind az idegen, mind a saját immunhatásra.
3.2.1.4. Treg terápia
A Treg sejtek deficienciájából eredő kórképek jól ismertek, de az nem pontosan
ismert, hogy a sejteknek mi a pontos szerepe az immunmediálta betegségek
kialakulásában. [96] Állatmodellben a CD4+ sejtek interferon-gamma (IFN-γ) és DC-k
jelenlétében FoxP3+ sejtekké alakulnak, amik bőr és szigetsejt transzplantátumok
rejekcióját képesek megakadályozni. [97] Ugyanakkor a transzplantáció során
Bevezetés
22. oldal
alkalmazott immunszuppresszív szerek némelyikéről, így kalcineurin inhibitorokról
(főleg a ciklosporin A-ról) ismert, hogy gátolják a Treg működését, míg a rapamicin a
Treg-ek in vivo képződését és aktivitását fokozza állatmodellben. Rapamicinnel együtt
adva a Treg-ek lehetővé tették állatmodellekben a szívtranszplantátum hosszútávú
megmaradását, különösen nagy effektivitással az olyan esetekben, ahol mind a donor,
mind a recipiens APC-kre specifikusak Treg-eket alkalmaztak. [98]
A humán Treg sejtek azonosításával kapcsolatos nehézségek miatt nincs egységes
konszenzus abban a tekintetben, hogy melyik Treg populáció lenne optimális
sejtterápiás alkalmazásra. [97] Több országban lezajlott klinikai kutatás során
hemopoetikus őssejt transzplantációnál a graft versus host betegség kivédésére
eredményesen és mellékhatásoktól mentesen alkalmazták a Treg sejteket. [99] Ezentúl a
már kialakult rejekció gátlására és a tünetek enyhítésére is hatékonynak bizonyultak a
Treg sejtek. Az alkalmazott Treg sejtek anti-CD3/anti-CD28 aktivált CD25+CD127low
sejtek voltak, és nagyjából 1x105 Treg sejt/kg dózisban voltak klinikailag is hatásosak.
Mindezek az adatok, együtt a jelenleg is folyó kísérletekkel együtt alátámasztják a Treg
terápia klinikai hasznát, azonban technikai nehézségek még fennállnak. [100]
Mind gyakorlati, mind elméleti problémák megnehezítik a Treg terápia
bevezetését. Gyakorlati nehézséget jelent a Treg terápia bevezetésével kapcsolatosan
számos jelenség. [81] Először is a FoxP3+ populáció heterogenitása miatt a tovább
tenyésztendő sejtek pontos azonosítása szükséges. A CD25 és CD127 sejtfelszíni
markerek segítségével kiválogatott sejtek között kis számban lehetnek
CD45RO+FoxP3low nem regulátoros tulajdonságú sejtek is, amik proinflammatórikus
citokineket termelhetnek és tovább szaporítva ezeket súlyosbíthatják az adott kórkép
lefolyását. Bizonyos tanulmányok szerint a CD45RA+FoxP3low sejtekre kell esnie a
választásnak, mert ezek képesek az expanzió után leginkább megtartani FoxP3
expresszáló képességüket. Másodszor kimutatták, hogy a Treg sejtek hajlamosak az
apoptózisra és nehezen szaporodnak magas dózisú IL-2 jelenlétében is. Ugyanakkor a
naív T sejtek könnyen FoxP3+ Treg-ekké képesek alakulni, ez is az előbb említett
CD45RA+ sejtcsoport használatát támasztja alá. IL-2 hatására ugyanakkor a Treg-ek
gyulladásos citokinek termelésére lesznek képesek, ezért meg kell alkotni a
tenyészéshez tökéletes citokin miliőt is. A rapamicin (sirolimus) nagymértékben képes
Bevezetés
23. oldal
fokozni a Treg tisztaságot azáltal, hogy elpusztítja a nem Treg sejteket. Harmadszor
pedig, ha in vitro még sikerül is kitenyészteni a megfelelő minőségű és mennyiségű
Treg sejtet tartalmazó populációt, in vivo használhatósága akkor is kérdéses, különösen
proinflammatórikus környezetben. Állatmodellben leírták a Treg sejtek plaszticitását
Th1, Th2, Th17 irányban, patológiás körülmények között. Ugyanakkor állatmodellekből
az is ismert, hogy a Treg sejtek hónapokig képesek a túlélésre, de emberben még nem
ismert pontos élettartamuk. Nem ismert továbbá a FoxP3 expresszió stabilitása sem, de
a FoxP3 gén stabilitását hiszton deacetiláz gátlókkal, így például vorinostattal lehetne
befolyásolni. T sejtes limfómában már használják ezt a szert, de nem ismert még, hogy
Treg specifikus lenne-e a hatása.
Elméleti ellentmondások is megnehezítik a Treg terápiák bevezetését. Egyrészről
a Treg sejtek a már említett módon képesek Th irányban differenciálódni, és így például
Th17 típusú citokineket termelni. Ezek a sejtek pont az ellenkező hatást válthatják ki,
mint amire eredetileg a Treg sejteket bejuttatták, így fontos a minél tisztább és
homogénebb Treg populáció terápiás alkalmazása. [97] További megoldás lehet a már
említett rapamicin, vagy a retinolsav, amiről kimutatták, hogy gátolja az IL-17
polarizációt és fokozza a FoxP3 expressziót. Másrészről komoly gondot jelenthet az,
hogy egy autoimmun folyamat terápiájaként bejuttatott nagy mennyiségű szuppresszor
hatású immunsejt gátolhatja egy esetleges infekcióval szemben kialakítandó
immunválasz hatékonyságát éppúgy, mint a daganatmegelőző reakciókat. Irodalmi
adatok alapján ugyanis a Treg sejtek nagy száma hozzájárulhat fatális herpesz szimplex
vírusfertőzésekhez, és vesetranszplantáltakban új daganat kialakulásához. Éppen ezért
egy jövőbeni alkalmazás során fokozott megfigyelés lenne szükséges minden Treg
terápián átesett beteg esetében.
Bevezetés
24. oldal
3. táblázat A regulátoros T sejt (Treg) működés befolyásolásának klinikai lehetőségei.
Rövidítések: citotoxikus T limfocita antigén-4: CTLA-4; interleukin: IL. *Korlátozott
felhasználás bizonyos graft-versus-host reakciók esetében. [81]
Felhasználási terület
Használatban lévő módszerek
Lehetséges módszerek
Mellékhatások és hátrányok
Fertőzések Treg gátló molekulák
(CTLA-4 antitest, Ipilimumab)
Treg működés és differenciáció gátlás
Alacsony hatékonyság
Daganatok Treg gátló molekulák
(DAB389-IL-2, Denileukindifitox)
Treg gátló további molekulák
Autoimmunitás fokozódása
Autoimmunitás Treg expanziós
sejtterápia
Allergia
Treg szuppressziót utánzó molekulák (CTLA-4 Ig,
Abatacept) Treg szuppressziót utánzó molekulák
Daganat megelőző és egyéb immun-mechanizmusok
gátlása
Terhesség
Transzplantáció
Treg túlélést és fejlődést segítő molekulák
(rapamicin, Sirolimus)
Treg hatékonyságot és élettartamot fokozó
molekulák
Terhességben való használhatósága
kétséges
3.2.2. Treg szabályozó sejtek
A Treg sejtek hálózatban működnek az adaptív és veleszületett immunitás sejtes
elemeivel együtt. A veleszületett immunitás sejtes elemei közé tartoznak az antigén
prezentáló sejtek (APC). [101] Előbbiek közé tartoznak a dendritikus sejtek (DC,
mieloid és plazmocitoid) és a monociták (makrofágok). Ide soroljuk még a hízósejteket
és a granulocitákat is, valamint a komplement rendszer fehérjéit is. A szerzett (adaptív)
immunitás elemei a T (CD4, T helper és CD8, citotoxikus T) valamint a B sejtek, és az
utóbbi által termelt antitestek. Egyes szerzők ide sorolják még a természetes ölő (NK)
sejteket is. A két immunrendszer határán állnak a természetes ölő T sejtek (NKT),
valamint az olyan speciális csoportba tartozó T sejtek, mint a γδ T sejtek. A Treg sejtek
ezen sejtekre való hatása csak részben ismert, mi a munkánk során az eddigi irodalom
alapján a limfocita aktivációban felmerült célsejteket vizsgáltuk.
Bevezetés
25. oldal
6. ábra Treg sejtek, szabályozó és céljsejteinek kölcsönhatása a limfocita aktiváció
folyamatában. A nyilak aktivációt, a tompa végű vonalak gátlást fejeznek ki. Az egyes
sejttípusok nevei alatt azonosításukhoz használatos, illetve az általuk expresszált markerek
szerepelnek. A részleteket és a rövidítéseket ld. a szövegben.
3.2.2.1. A DC sejtek
A DC sejtek a legfőbb APC-k, vagyis az antigén feldolgozására és bemutatására
szolgáló sejtek az immunrendszerben. A szervezet olyan pontjain helyezkednek el, ahol
az antigénnel közvetlenül találkozhatnak (bőr, légzőrendszer, tápcsatorna). Bár éretlen
Bevezetés
26. oldal
formában is megtalálhatóak a vérben, aktiválódásuk során a nyirokcsomókba
vándorolnak, ahol a T és B sejtekkel kapcsolódva az adaptív immunválasz elindításában
játszanak szerepet. [102] Azonosításukban segít, hogy egy sor limfocita érési markert
nem (Lin1: CD3, CD14, CD16, CD19, CD20 és CD56), míg egy aktivációs markert, a
HLA-DR-t erősen expresszálják. Hagyományosan két csoportra osztjuk őket, az egyik a
mieloid DC (mDC, DC1), a másik a plazmocitoid DC (pDC, DC2). A mDC-k a
monocitákhoz hasonlatosak, IL-12 termelésre képesek, és két alcsoportjuk a gyakoribb
és legfőbb stimulátorként működő mDC-1, és a nagyon ritka, feltehetőleg
sebfertőzésekben szerepet játszó mDC-2. A pDC-k plazmasejthez hasonlatosak
kinézetre, régebben az interferon-alfa (IFNα) termelő képességük alapján interferon
produkáló sejtnek nevezték őket. [103]
Az mDC sejtekre jellemző, hogy az elkülönítésüket lehetővé tévő CD11c
(integrin) mellett TLR-2 és TLR-4-et is expresszálnak. [104] A TLR-ek a
sejtmembránon átérő molekulák, nem katalítikus receptor résszel és az IL-1R-al egyező
citoplazmatikus doménnel. Ezek a proteinek a veleszületett immunitás fő mediátorai,
amik a lipopoliszacharidokat (LPS), lipoproteineket, lipopeptideket, bakteriális
proteineket, virális ribonukleinsavat (RNS), és bakteriális vagy virális
dezoxiribonukleinsavat (DNS) képesek megkötni. Ezen kívül endogén ligandjaik
lehetnek a fibrinogén, a hősokk protein és a saját DNS is. Az antigén bekötődésével a
TLR aktiválódik és adapter molekulákat (MyD88, Tirap (Mal), Trif, és Tram) vonz a
citoplazmához, amelyek aztán protein kinázokon (IRAK1, IRAK4, TBK1, és IKKi)
keresztül a jel amplifikálódásához vezetnek, és végül akár több ezer gén aktiválódását
vagy gátlását eredményezik. A folyamat eredménye lehet a mikrobiális antigén
prezentációja más T sejteknek, vagy citokinek termelése is. Az aktivált Treg sejtek
képesek ezt a TLR függő mDC aktivációt gátolni, egyrészt a kostimulátoros molekulák
fokozott expressziójának, másrészt pedig a gyulladásos citokinek gátlása révén. [105]
Ugyanakkor kimutatták, hogy nagymennyiségű bakteriális LPS vagy DNS hatására
(sorrendben TLR-4 vagy TLR-9 révén) Treg jelenlétében is bekövetkezik a T sejt
proliferáció. [106]
A TLR-ek azonban nem csak az APC-ken, hanem mind a hagyományos, mind a
regulátoros T sejteken is megtalálhatóak. A TLR-2 ligáció a szuppresszor hatást
Bevezetés
27. oldal
csökkenti, részben az IL-2 termelés révén magán a Treg sejteken is. Ez a hatás
ugyanakkor csak átmeneti, mert a TLR-2 hatás elmúltával a Treg sejtek visszanyerik
szuppresszor hatásukat. Érdekes ugyanakkor, hogy a Treg működésre való hatás
(aktiválás vagy gátlás) mind magától a TLR típusától, mind pedig az antigén jellegétől
is függhet. [106] A legfrissebb adatok alapján a legtöbb hagyományos immunsejten is
expresszálódó TLR-eknek legalább egy része biztosan funkcionálisan aktív, mert ezen
sejtek stimulálása TLR agonistákkal APC hiányában is az effektor, ill. regulátoros
működésüket fokozza. [107] Ez a terület további kutatásokat igényel, de ilyen alapon
felvetődhet a TLR-ekre ható esetleges terápiás alkalmazások kifejlesztésének a
lehetősége is.
A pDC-k az mDC-kkel szemben CD11c-t vagy a monocitákkal szemben CD14-et nem
expresszálnak, de CD123-at (IL-3R) igen. Fontos szerepet játszanak az immunológiai
tolerancia létrejöttében. Az orális tolerancia kialakításában is a pDC-k a
kulcsfontosságúak. Ezek hiányában a bejuttatott antigénekkel szemben nem alakul ki a
T sejt mediálta tolerancia. [108] A külsőleg bejuttatott gasztrointesztinális eredetű orális
antigénnel találkozott pDC-k képesnek bizonyultak állatmodellben az antigén indukálta
CD4 és CD8 sejtes válasz szuppressziójára. [109] Ugyanígy, inhalatív antigének
hatására, ha pDC sejtek gátlásra kerülnek, akkor az asztmára jellemző tünetegyüttes
alakul ki, Th2 túlsúlyú immunválasszal. A pDC-k transzplantációs terápiában való
esetleges haszna az újabb kutatások alapján merült fel. Májtranszplantáció után
megfigyelték, hogy az immunszuppreszió hatékonysága összefügg a perifériás pDC
sejtszámmal, és a nagyobb pDC arány az mDC-kkel szemben jobb tolerálhatóságot
jelent a grafttal szemben. A donor antigénnel találkozott pDC sejtek a nyirokcsomókba
migrálnak, ahol alloantigén specifikus Treg választ indukálnak, és ezzel
immuntoleranciát fejlesztenek ki. Megfigyelték tovább, hogy a pDC sejtek expressziója
szoros összefüggést mutatott a FoxP3+ Treg sejtek számával olyan páciensekben,
akikben transzplantáció után kialakult az immuntolerancia. [109] Az autoimmun
folyamatokban szintén leírták a pDC sejtek jelentős szerepét. [102] Alacsony aktivitású
RA-ban leírták például, hogy a pDC-k a naív T sejtek IL-10 szekretáló Treg sejtekké
való differenciálódását segítik, és a pDC-k hiánya fokozza az autoimmun izületi
gyulladást. [110] A pDC-kre jellemző TLR-7 és TLR-9 közül a TLR-9-ről ismert, hogy
normál körülmények között szubcelluláris lokalizációban helyezkedik el, és más
Bevezetés
28. oldal
körülményekkel együtt ez hozzájárul ahhoz, hogy a szervezet a saját DNS-t ne ismerje
fel. [109] Bizonyos faktorok, így többek között antimikrobiális peptidek hatására
azonban a pDC-k felismerik a sajátot is, így a szervezet saját DNS szakaszát képesek
megkötni a pDC-k, és ezáltal az mDC-k aktiválódását okozhatják.
7. ábra A tolerogén dendritikus sejtek (DC) és regulátoros T sejtek (Treg) közötti kapcsolat
sematikus ábrázolása. A Treg sejtek a DC-k szabályozása révén az immunválaszt elősegítő
miliőt képesek kialakítani, de a DC-k szintén képesek a Treg érést befolyásolni. Rövidítések:
TGF-β: transzformáló növekedési faktor-béta; IL: interleukin; IDO: indolamin 2,3-dioxigenáz.
[110]
Bevezetés
29. oldal
A legújabb adatok alapján a Treg-ek befolyásolják a DC-k működését, de a DC-k
szintén fontosak a Treg-ek szabályozásában, tehát a kapcsolatuk kétirányú. [92] Egyik
irányban a Treg-ek és DC-k együtt tenyésztése során a DC-k CD80 és CD86 T sejt
kostimulátoros ligandok expressziója csökken, míg az immunszuppresszív hatású B7-
H3 és B7-H4 expressziója fokozódik, ezzel a Treg-ek a DC-k érését gátolhatják. [103]
Treg-ek nélkül a DC-k IL-6 proinflammatórikus citokint termelnek, míg Treg-ek
jelenlétében az immunszuppresszív hatású IL-10 termelés a jelentős. [94] Ugyanakkor
gyulladásos hatásra (így pl. LPS jelenlétében) ismét a proinflammatórikus citokin
termelés lesz a döntő. [103] Másik irányban viszont, a Treg-hez hasonlatos funkciójú
DC fajta, a pDC, képes a Treg sejtek serkentésére és így a perifériás tolerancia
fenntartására. Mind állatmodellben, mind humán ex vivo kísérletekben ezek a pDC-k
alkalmasnak bizonyultak a CD4+CD25+FoxP3+ sejtek indukálására, és így T sejt
populációk proliferációjának gátlására. [100] Ismert továbbá, hogy bakteriális triggerre
naív T sejtekből képesek szuppresszor tulajdonságú Treg sejtek képzését elősegíteni,
míg vírusok vagy CD40L hatására Th1 immunválaszt generálni. Ugyanakkor korábban
leírták, hogy IL-10 termelésre is képesek a pDC-k, ezért úgy tűnik, hogy a kiváltó
hatástól függően befolyásolják az immunválaszt. [103] Összességében tehát a Treg-ek
képesek a számukra kedvező immunszuppresszív miliőt kialakítani a velük találkozó
DC-k sejtfelszíni mintázat és citokin termelésének befolyásolásával, de a DC-k is
befolyásolni képesek visszacsatolás révén az immunszuppresszió mértékét.
3.2.2.2. Monociták
A monociták a perifériás vérben rövid ideig vannak jelen, a szövetekben
makrofágokká vagy DC-vé alakulhatnak. Fő feladatuk az antigén prezentálás (APC),
citokin termelés és fagocitózis. A monociták felszínén korlátozott a kostimulátoros
molekulák expressziója, ezért az effektor és memória T sejteket citokinek révén
stimulálják. [103]
A monociták két főbb csoportját különböztetjük meg. A klasszikus monociták az
összes keringő monocita 90-95%-át teszik ki, és CD14 expressziójuk alapján
különböztetjük meg őket. A szöveti makrofágokhoz hasonló többi monocitán viszont
Bevezetés
30. oldal
alacsonyabb a CD14 expresszió, de leírtak egy átmeneti csoportot is, ahol a CD14
expresszió közepes mértékű. A humán monociták több TLR-t is expresszálnak, de
legnagyobb mértékben TLR-2 és TLR-4-et. [111] A TLR-2 peptidoglikán, míg a TLR-4
LPS ligandja hatására indukálja a monocitákat és serkenti a gyulladásos citokinjeinek
termelését.
A monociták aktiválódása két útvonalon mehet végbe, ezek közül a régebb óta
ismert klasszikus folyamat mellett újabban leírták a gátló jellegű alternatív útvonalat is.
Az aktiválódás klasszikus útján a monociták proinflammatórikus szerepűek, és IFN-γ és
TNFα jelenlétében az antigén specifikus T sejt választ az antigén prezentálással és IL-
12 termelésével segítik elő. Az alternatív útvonalon azonban IL-4 és immunglobulin G
(IgG) immun komplexek jelenlétében nem képesek antigén prezentálásra, és IL-10-et
szekretálnak, ezáltal szuppresszív hatásúak. Ezek a sejtek képesek a Treg-ek
indukálására, és így a T sejt proliferáció gátlására is. Bakteriális fertőzés esetén az LPS
a szervezetben nagy mennyiségben jelenik meg, és a CD14 monocitákhoz kapcsolódva
kiváltja a T sejt választ. Szeptikus sokk esetén azonban a monociták váratlanul
abbahagyják az antigén bemutatását, és apoptózison mennek át. A legújabb adatok
alapján, ez a folyamat a Treg sejtek közvetítésével valósul meg. [112] Megemlítendő,
hogy néhány adat arra utal, hogy a DC-khez hasonlóan a monociták is képesek viszont
befolyásolni a Treg működést. [92]
3.2.3. Treg célsejtek
Habár az előzőekben több alkalommal is történt utalás arra, hogy a Treg sejtek és
sejtes környezetük között soha nem egyirányú a kapcsolat, most a hagyomány kedvéért
itt kerül tárgyalásra a klasszikusan a Treg sejtek által szabályozottnak mondott
immunsejtek csoportja (NK és NKT sejtek, CD4 és CD8 limfociták).
3.2.3.1. NK és NKT sejtek
Az NK és NKT sejtek az adaptív és veleszületett immunitás határán helyezkednek
el, szabályozott kapcsolatot teremtve a két rendszer között. Kezdetben az NK sejtek
onnan kapták a nevüket, hogy képesek voltak aktiválás nélkül is elpusztítani a sajátot
Bevezetés
31. oldal
jelentő MHC-I mintázattal nem rendelkező sejteket. Mindkét sejttípus azonosításában
segít az NK asszociálta marker (CD161) expresszió, de ezentúl az NKT sejtekre
jellemző, hogy TCR-t (CD3) is expresszálnak. Az NKT sejtek gyűjtőfogalmát azokra a
sejtekre szokták alkalmazni, amelyek egyrészt a CD161-et, másrészt egy meghatározott
TCR-t expresszálnak, amikkel az MHC-szerű CD1d által bemutatott glikolipideket
ismerik fel. A Cd1d függő NKT-k egy része félig-invariáns TCR-t (invariáns α láncot)
hordoz, ami a törzsfejlődés során érintetlen maradt, ezért ezeket szokták iNKT
sejteknek is nevezni. [113]
Az NK sejteket a veleszületett rendszer effektor sejtjeinek tartják, a vírusok,
paraziták, baktériumok és megváltozott sejtek elleni védekezésben vesznek részt. [114]
Egyrészről citokinek (IFNγ, TNFα, kolónia stimuláló faktorok és kemokinek)
termelésével, másrészről célsejtek elleni citotoxicitássukkal (perforinok, granzimek és
extrinsic apoptózis) hatnak. Az idegen vagy káros sejtek felismerését számos receptora
segíti, többek között a TLR-ek is. Az NK sejtek hiánya gyermekkorban ismerten az
Epstein-Barr vírusfertőzések és limfoproliferatív kórképekkel állhat összefüggésben.
Felnőttekben feltehetőleg szolíd tumorok jelenlétével függ össze ezen sejtek
deficienciája, így a legismertebb Chediak-Higashi szindrómában. Ebben a kórképben
hibás az NK sejtek citotoxicitása, így a malignus folyamatok kialakulásának
kétszázszorosára nő az esélye.
Az Treg sejtek képesek az NK sejteket mind in vivo, mind in vitro gátolni. [114]
Számos kutatás rávilágított, hogy ez a hatás döntően a TGF-ß segítségével valósul meg,
ugyanakkor az aktivált NK sejtek ellenállhatnak ennek a szuppresszor hatásnak. [115] A
DC-k szintén képesek az NK sejtek működését szabályozni. A DC-k az NK aktiválódás
kezdeti szakaszában hatva, annak a citolítikus hatását befolyásolják. [116] Ugyanakkor
az NK sejtek a DC-k érésében döntőek, valamint az érett DC-k citokin termelésének a
szabályozásában. Az NK sejtek számos úton befolyásolhatják a DC-k működését.
Elsősorban azáltal, hogy az NK sejtek sejtlízist okoznak, a folyamat során keletkező
antigéneket a DC-k ismerik fel, és így aktiválódnak. Másodsorban a nem hatásos,
éretlen DC-k szintén elpusztításra kerülnek az NK-k által, ezzel fokozva az
immunválasz hatékonyságát. Harmadsorban az NK-k által termelt Th1 citokinek
fokozzák magát az APC működést. Negyedrészt az NK sejtek fokozzák a DC-k érését az
Bevezetés
32. oldal
IL-12 citokin termelése révén. Végül ötödrészt, az NK sejtek által termelt granulocita-
makrofág kolónia stimuláló faktor a DC-k túlélését és a monocita prekurzorok DC-vé
érését serkentik. Újabban azonban kimutatták, hogy az NK sejtek hasonló
mechanizmusokkal nemcsak serkenteni, hanem gátolni is képesek a DC-k, és ezáltal az
immunválasz működését. Ha az NK/DC arány az NK sejtek felé tolódik el, akkor a
citolítikus hatás révén a DC-k működése is alapvetően gátolt lesz az NK sejtek által.
[116] Továbbá az NK sejtek direkt gátló hatását is leírták már az effektor T sejtekre,
ami részben az NKT sejtek hatására vezethető vissza.
A természetes ölő sejtek másik csoportjába tartozó NKT sejtek nem MHC-hoz
kapcsoltan ismerik fel az antigéneket, hanem a CD1d segítségével a többnyire invariáns
TCR-hez kötődve. A felismert glikolipidek mind endogén, mind exogén származásúak
lehetnek. [117] Két fajtájukat különböztetjük meg, az NKT I-ek expresszálják az
invariáns TCR-t, míg az elenyésző számú NKT II-k a nem invariáns TCR-t. Aktiváció
után az NKT-k képesek mind Th1 (IFN-γ), mind Th2 citokinek (IL-4) termelésére az
aktiváló ligand, az APC-val való kapcsolat és a citokin miliőnek megfelelően. Az NKT
sejteket, a Treg sejtek veleszületett immunitás részéről megjelenő segítőinek is tartják.
Az NKT-k által termelt IL-2 döntő jelentőségű a Treg-ek proliferációjában, viszont az
NKT-k nem képesek a Treg-ek szuppresszor funkcióját befolyásolni, csak a
proliferációját. Ugyanis, ha DC által aktivált Treg-eket NKT sejtek jelenlétében vagy
nélkülük tartották, a szuppresszió mértéke azonosnak bizonyult.
Az NKT sejtek sajátossága, hogy gyors citokin válaszra képesek, egyben azt is
jelenti, hogy ezzel az effektor immunválasz irányát képesek befolyásolni pro- vagy
antiinflammatórikus irányba. [117] Különlegességük még az, hogy igen ellenállóak az
apoptózissal szemben, köszönhetően a nagy mennyiségben expresszálódó
antiapoptotikus fehérjéknek (Bcl-2). Az NKT sejtek jelentőségét számos autoimmun és
daganatos folyamatban leírták már, legújabban az asztma patogenezisében
tulajdonítanak nagy szerepet ennek a sejtcsoportnak. Állatmodellben az NKT sejtek
képesnek bizonyultak csontvelő transzplantáció után a graft versus host betegség
kivédésére, míg hiányukban halálos kimenetelű lett a betegség. Az NKT sejtek tehát a
Treg-ekhez hasonlatos szabályozó szereppel bírnak. [118] Ugyanakkor döntő
különbségek is vannak a két sejtcsoport között. Egyrészt a Treg-ek MHC II
Bevezetés
33. oldal
bemutatásában ismerik fel az antigént, míg az NKT-k az MHC I-szerű CD1d-vel. A
Treg-eknek változatos TCR készletük van, míg az NKT-knak konzervatívabb. A Treg-
ek számtalan típusú antigént képesek felismerni, míg az NKT-k csak glikolipid
sajátosságúakat.
8. ábra A természetes ölő T sejtek (NKT) és regulátoros T sejtek (Treg) kapcsolata. A Treg-ek
képesek az NKT sejtek gátlására kontakt-dependens úton, míg az NKT-k a Treg működést
képesek serkenteni citokinek révén. A Treg-ek a T helper (Th) 1 és Th2 választ, míg az NKT-k
klasszikusan a CD8 valamint a Th1 és Th2 választ is befolyásolhatják. Az NKT-k közvetlenül a
dendritikus sejtek (DC) indukálásával is aktiválhatják a Treg működést. A serkentést nyíl, míg a
gátlást tompa végű vonal jelzi az ábrán. [118]
Bevezetés
34. oldal
3.2.3.2. CD4 és CD8 limfociták
Az effektor T sejtek két csoportját a helper T (Th) és citotoxikus T (Tc)
limfocitákat CD4 és CD8 expressziójuk alapján különböztetjük meg. [119,120] A CD4
glikoprotein az immunglobulin szupercsalád része, a TCR egyik koreceptora, ami az
APC-kkel való kapcsolódást segíti elő. A CD4 az intracelluláris részével a TCR által
generált szignált erősíti fel egy tirozin kináz révén, de közvetlenül is kapcsolatba lép
extracelluláris része segítségével az MHC II-vel. A CD8, ami szintén transzmembrán
glikoprotein és a TCR koreceptora, ezzel szemben az MHC I-hez kötődik. [119]
A Th sejtek prekurzor sejtjei a naív T sejtek (Th0), amik stimulus hatására
képesek pro- (Th1) vagy antiinflammatórikus (Th2) irányba differenciálódni. Naív T
sejtnek akkor nevezzük a limfocitát, ha még nem találkozott antigénnel, memória T
sejtnek a már stimulussal találkozott sejtet nevezzük. A két sejtcsoport elkülönítésére
lehetőséget ad a régebbi nevén közös fehérvérsejt antigénnek (CD45) nevezett marker
expressziója. [121] A naív sejtek ennek a protein tirozin foszfatáz kostimulátornak a
nagyobb CD45RA formáját expresszálják, míg az aktivált effektor vagy memória sejtek
a kisebb CD45R0 formát, amiből hiányzik az RA, RB, és RC exon. Ez a rövidebb forma
segíti elő az aktiválódást, a citoplazmatikus doménje egy tirozin kináz (Lck)
defoszforilálásával annak aktiválódását okozza. [119]
A Th1 és Th2 egyébként morfológiailag egyező sejtek csupán az általuk termelt
citokinekben különböznek. [122] A Th1 sejtek többek között IL-2-t termelnek, ami a T
sejtek proliferációját, és autokrin módon saját túlélésüket is segíti. Az IL-2 ezentúl a Tc
sejtek citotoxikus működését is stimulálja azáltal, hogy az aktivációs küszöbüket
csökkenti. A Th1 sejtek által termelt IFN-γ a makrofágokat aktiválja, az IFN-γ receptor
hiánya súlyos fertőzésekhez vezet. Az említett citokinek pozitív visszacsatolással
serkentik a Th0 sejtek differenciálódását, ezáltal a saját válasz erősítését. Az IFN-γ által
stimulált makrofágok termelte IL-12 ugyanis fokozza a T sejtek IFN-γ termelését. A
Th1 válasz tehát elsősorban a patogének elleni sejtes védekezésben fontos, de szerepe
van az autoimmun betegségek kialakulásában is. A Th2 sejtek ezzel szemben IL-4, IL-5,
IL-10, IL-13-at termelnek, ami az antitestes védekezést serkenti. Az IL-4 a B sejtek IgE
termelését fokozza, míg az IL-5 az eozinofil granulociták növekedését serkenti. Az IL-4
Bevezetés
35. oldal
ezek mellett pozitív visszacsatolással az immunválaszt a Th2 irányba tolja, elsősorban
az allergiás kórképek kialakulásának kedvezve. [123]
A Tc sejtek az NK sejtekhez hasonlóan az idegen antigénnel rendelkező sejtekhez
kötődnek és perforinokat juttatnak a sejtmembránjukba. [124] A Tc sejtek granzimeket
tartalmazó citoplazmatikus granulumai átjutnak a megtámadott sejtbe, ahol kaszpázokat
aktiválnak, amik a DNS fragmentálódását és apoptózist indukálnak. A Tc sejtek a
célsejt Fas halál ligandjaihoz is kapcsolódnak, ezen az úton is elősegítve az apoptózist.
A Th sejtekhez hasonlóan a Tc sejtek is differenciálódhatnak Tc1 és Tc2 altípusra, de
ezeknek a citokin termelő képessége korlátozott, és pontos szerepük sem ismert még.
[123] Ezentúl a CD8+ sejtek egy részének lehet szuppresszor hatása is, ezek szerepe
daganatos kórképekben vetődött fel, de pontos ismereteink még nincsenek
működésükről.
Az immunológiai tolerancia, vagyis az immunrendszer sajáttal szembeni
védelmének a kialakulásában két mechanizmus vesz részt. [125] Centrális
toleranciának nevezzük azt a folyamatot, amelyben az autoreaktív T sejtek a
csecsemőmirigyben negatív szelekción mennek át. Ismert azonban, hogy ezen a
folyamaton átjuthatnak olyan limfociták, amelyek MHC expressziója a feltételezések
szerint nem elég erős a kiválogatáshoz. Ugyanakkor valószínű az is, hogy nem minden
saját antigén kerül bemutatásra. A perifériás toleranciának köszönhetően mindezek
ellenére az autoreaktív T sejtek normálisan nem váltanak ki autoimmun reakciót a
szervezetben. A saját antigént prezentáló DC-k ugyanis nem aktiválódnak,
köszönhetően a kis számban expresszálódó kostimulátoroknak. Emiatt és az IL-10
termelő képességük hatására anergizálódnak és nem kerülnek aktivációra. A saját
antigének kostimulátorok nélküli prezentációja apoptózis révén okozza a limfociták
klonális delécióját. Az autoreaktív T sejtek a periférián a Treg sejtek által kerülnek
gátlásra a fentiekben már részben említett módon. Ezek a sejtek IL-10 és TGF-β
termelésük révén gátolják az autoreaktív sejtek proliferációját. [126]
Bevezetés
36. oldal
9. ábra A regulátoros T sejtek (Treg) különböző immunszuppresszív mechanizmusai. A Treg
sejtek mind a CD4+, mind pedig a CD8+ sejtek működését képesek gátolni kontakt dependens és
citokin útvonalon is. A dendritikus sejtek érését gátolják, de az érett dendritikus sejteket el is
pusztíthatják. Egyéb, nem limfoid sejtekre gyakorolt hatásuk elsősorban citokinek révén valósul
meg. [95]
A Treg sejtek és az effektor T sejtek kapcsolata akkor került az érdeklődés
középpontjába, amikor kimutatták, hogy a CD4+CD25+ sejtek depléciójával autoimmun
betegségek sorát képesek kialakítani, míg visszaadásuk megakadályozza azokat. [127]
A Treg kutatások során a célsejteket kétféle módon próbálták meg azonosítani. Egyrészt
APC-k hozzáadásával, mind az APC-k és az effektor sejtek, míg APC hiányában csak
Bevezetés
37. oldal
az effektor sejtekre való hatásuk vizsgálható. Habár a kölcsönös hatás miatt kissé
önkényes ez a felosztása a Treg célsejteknek, de az APC sejtekkel való kapcsolatot az
előzőekben már tárgyaltuk, ezért most csak a közvetlen effektor hatást foglaljuk össze.
A legtöbb kutatás rávilágított arra, hogy a Treg-ek hatásukat részben az IL-2 mRNS (és
más citokinek mRNS-ének) transzkripcionális gátlásával érik el. [128] Külső IL-2
adagolásnak nem volt hatása a szuppresszióra. A legelterjedtebb elképzelés szerint a
Treg-ek gátolják az IL-2 termelést még pontosan nem ismert módon. Egy másik
feltételezés szerint a Treg sejtek a magas affinitású receptoraikkal (CD122, CD132)
kompetitíven gátolják az IL-2 hatását az effektor sejteken, de erre nincs közvetlen
bizonyíték. A Treg sejtek más citokinek révén is kifejthetik hatásukat, az IL-10 és TGF-
β mellett újabban az IL-35 szerepét vetik fel. Más szekretált molekula révén is hatnak,
így a galektin-1 által, ami apoptózist és a gyulladásos citokinek termelésének gátlását
okozza, nem egyértelmű azonban, hogy szolúbilis citokinként vagy direkt sejt-
kölcsönhatás révén. Továbbá a Treg sejtek granzim A által perforin dependens úton az
aktivált CD4 és CD8 sejteket, míg granzim B révén perforin independens úton szintén
az effektor sejteket pusztítják.
Célkitűzések
38. oldal
4. Célkitűzések
Célkitűzésünk volt, hogy olyan kis mintaigényű FACS-módszert dolgozzunk ki a
Treg sejtek és sejtes környezetük vizsgálatára, amivel jellemezni lehet a csecsemő- és
gyermekkori gasztrointesztinális megbetegedéseket érintő immunfenotípust. Szempont
volt az is, hogy a kidolgozott módszert más immunmediálta kórképek vizsgálatára is fel
lehessen a későbbiekben használni (ld. disszertációhoz csatolt közlemények).
4.1. Crohn betegség
Célunk volt prospektív vizsgálatban meghatározni, hogy milyen immunfenotípus
eltérések vannak jelen frissen diagnosztizált, még nem kezelt Crohn beteg
gyermekekben, mind a veleszületett, mind a szerzett immunitás elemeiben. Crohn
betegségben szenvedő gyermekekben jellemeztük az adaptív és veleszületett
immunitásának fenotípusát. A konvencionális terápiában (aminoszalicilát, azathioprin,
szteroid) és a biológiai terápiában (IFX) részesülő betegekben szintén meghatároztuk az
immunfenotípust eltéréseit. Célkitűzésünk volt továbbá, a hagyományos terápiára
reagáló és remisszióba került, illetve a csak IFX terápiára reagáló, relapszusban lévő
betegek perifériás immunfenotípusának összehasonlítsuk.
4.2. Cöliákia
Meghatároztuk cöliákiás gyermekek perifériás immunsejt prevalenciáját. Egyrészt
frissen diagnosztizált gyermekekben vizsgáltuk az immunfenotípust, másrészt a diéta
hatására a tünetek és panaszok megszűntével is jellemeztük az immunrendszer sejtes
elemeinek prevalenciáját.
4.3. Allergiás kolitisz
A vizsgálat során frissen diagnosztizált AC-s gyermekek perifériás
immunfenotípusát vizsgáltuk. Vizsgálatunk tárgyát képezte az allergének elhagyása
utáni tünetmentes állapotban talált fenotípusváltozás jellemzése is.
Betegek és módszerek
39. oldal
5. Betegek és módszerek
5.1. Egészséges és beteg csoportok
Mindegyik vizsgálat rendelkezett etikai engedéllyel, és írásos beteg – kiskorúak
esetén szülői – beleegyező nyilatkozattal. A vérvételek időzítése úgy történt, hogy a
szokásos rutin vérvételekkel egyidőben történjenek, és külön megterhelést ne
jelentsenek a betegeknek és az egészséges kontrolloknak.
5.1.1. Crohn betegek
2007 szeptembere és 2009 augusztusa között az I. Sz. Gyermekklinika Gyermek-
gasztroenterológiai Szakrendelésén megjelent betegeket vontuk be a vizsgálatokba. Első
csoportként tizennégy kezeletlen, terápiában még nem részesült beteget vettünk fel.
Ezek a betegek semmilyen gyógyszert nem szedtek a diagnózis időpontjában. A CD
diagnózisát a Porto kritériumok alapján [129], az aktivitás indexet pedig a PCDAI
szerint (Pediatric Crohn’s Disease Activity Index) [130] határoztuk meg. Második
csoportját képezte a vizsgálatnak az a tíz gyermek, aki a hagyományos terápiára
(szteroid, azathioprin, (AZT) és 5-aminoszalicilát (5-ASA)) reagált. Ezek a betegek,
akinek a PCDAI értékük kezelés után kevesebb, mint 10 volt, alkották a remisszióba
került betegek csoportját. Harmadik populációba az a tizenkét beteg tartozott, akik a
hagyományos terápiára nem reagáltak, ezért infliximab (IFX) kezelést kaptak (5mg/ttkg
a 0., 2., és 6. héten). Ők alkották a relapszusos betegek csoportját, mert a PCDAI
pontszámuk magasabb volt, mint 30. Negyedik csoportba soroltuk a kontrollok tizenöt
fős populációja, akik életkorban és nemben illeszkedtek a betegekhez, és funkcionális
hasfájás miatt kerültek kivizsgálásra, de organikus betegség, gyulladás, laboratóriumi
eltérés nem igazolódott náluk.
Betegek és módszerek
40. oldal
4. táblázat A vizsgálatba bevont betegek és egészséges kontrollok klinikai adatai. Rövidítések:
IFX: infliximab; PCDAI: Pediatric Crohn's Disease Activity Index; L1: vékonybél, L2:
vastagbél, L3: vékony- és vastagbél lokalizáció a montreáli kritériumok alapján. (Satsangi
2006). Statisztika: vs. kontroll: *p<0,05, **p<0,01; ***p<0,01; vs. kezeletlen: +p<0,05,
+++p<0,01; vs. első remisszió: #p<0,01, ###p<0,01; vs. relapszus: ×p<0,05, ××p<0,05, ×××
p<0,001.
medián [interkvartilis
tartomány] kontroll
kezeletlen (hagyományos terápia előtt)
első remisszió (hagyományos terápia után)
relapszus (IFX
kezelés előtt)
IFX terápia
(2. kezelés előtt)
IFX terápia
(3. kezelés előtt)
Klinikai adatok n (fiú/lány) 15 (6/9) 14 (6/8) 10 (4/6) 12 (5/7)
életkor (év) 12
[8-16] 10
[8,5-13] 11,5
[9,5-15,5] 14
[11-16]
14.5 [11.5-
16]
14.5 [12-16]
testtömeg-index (kg/m2)
19,5 [16,5-22,3]
13,9 [12,5-15,8]***
18,6 [14,4-19,2]+
17,4 [14,1-19,5]*
18.8 [14.6-21.3]
19.25 [16.1-22.1]
testsúly (percentilis)
58 [35-79]
13 [4-23]***
24 [19-44]+
21 [7-28]*
23 [15-63]
35 [10-74]
betegség-tartam (hónap)
- 10
[8,5-13] 10,5
[8,5-15,5] 11,5
[9,25-15]
12 [9.5-15]
12 [10-15]
betegség aktivitás (PCDAI)
- 45
[39-58] 0
[0-5]+++ 45
[25-48]###
20 [7-
28]××
13 [2-
22]××× lokalizáció (n, montreáli kritérium)
- L1 (1), L2 (2), L3 (11)
L1 (0), L2 (2), L3 (8)
L1 (1), L2 (2), L3 (9)
Laboratóriumi adatok
fehérvérsejt szám (G/l)
7,9 [5,7-10,1]
12,4 [9,4-14,2]**
11,7 [8,4-14,4]
10,0 [8,2-11,2]
7,9 [5,5-10,6]
6,7 [4,5-
10,4]×
vérlemezke szám (G/l)
346 [288-375]
657 [451-746]**
442 [308-624]
479 [396-750]**
392 [293-523]
383 [308-483]×
szérum vas (μmol/l)
16 [14-21]
4 [2-12]*
8 [4-10]*
4 [2-7]***
5 [4-7]***
8 [6-8]**, ×
szérum albumin (g/l)
45 [44-49]
37 [34-39]***
42 [42-45]+
40 [36-41]***
41 [38-45]**
42 [38-45]**
C-reaktív protein (mg/l)
0 [0-1]
21 [5-65]***
7 [2-11]**, +
27 [9-55]#, ***
9 [3-
11]***
5 [1-
14]***, ×
Betegek és módszerek
41. oldal
Tizennégy kezeletlen, terápia naív betegből biopsziával igazoltan tizenegy esetben
mind a vékonybél, mind a vastagbél érintett volt, ami a montreáli kritériumok szerint L3
lokalizációnak felel meg. [131] A kezeletlen és a relapszusos CD betegekben
alacsonyabb volt a testtömeg-index és a testsúly. Az alacsonyabb testtömeg-index és
testsúly egy gyakori kórjelző tünet Crohn betegségben. [132] A csökkent
táplálékbevitel, étkezések utáni hasi görcsök, szisztémás citokin felszabadulás, és
malabszorptív hasmenés a lehetséges okai ennek a tünetnek. [33]
A rutin vérvételekkel egyidőben 6 ml heparinizált perifériás vér vétele történt a
kezeletlen betegektől a diagnózis és az első remisszió időpontjában a remisszióba
kerültek csoportjában, valamint az IFX terápia kezdete előtt, illetve 2 és 6 héttel később
a relapszusos populációban. Ebből a perifériás vérmintából lett meghatározva a
különböző fehérvérsejt populációk gyakorisága áramlási citométerrel.
5.1.2. Cöliákia
A vizsgálatba tíz gyermeket vontunk be az I. Sz. Gyermekklinika Gyermek-
gasztroenterológiai Szakrendelésén 2007 decembere és 2009 decembere között. A
cöliákia diagnózisa az érvényben lévő protokolloknak [133] és a Marsh kritériumoknak
megfelelően került felállításra [134]. Mindegyik betegben a transzglutamináz (TG) IgA
szint 200 U/l fölött volt, és a biopszia szövettani vizsgálata szubtotális vagy totális
bélboholy atrófiát és az IEL-k 40% fölötti emelkedett számát igazolta. Mindegyik
cöliákiával diagnosztizált gyermekben GFD-t indítottunk. A tünetek elmúltával, amikor
a TG IgA szint normalizálódott (10-40 U/l), ismételt vérvétel történt. Kontroll
populációnak 15, korban és nemben egyező gyermek szolgált, akik nem organikus
hasfájás miatt kerültek felvételre.
Mind a diagnózis felállításakor, mind a tünetek elmúltával, a rutin vérvételekkel
egyidőben 6 ml heparinizált perifériás vért vettünk, és immunfenotípizáltuk a betegeket
és az egészségeseket.
Betegek és módszerek
42. oldal
5. táblázat A vizsgálatban résztvevő betegek és egészségesek adatai. Rövidítések: GFD:
gluténmentes diéta; TG: transzglutamináz; Ig: immunglobulin. Statisztika: vs. kezeletlen
cöliákiás: **p<0,01; ***p<0,01.
medián [interkvartilis tartomány]
kontroll kezeletlen cöliákiás
(GFD előtt) kezelt cöliákiás
(GFD után) n (fiú/lány) 15 (6/9) 10 (4/6)
életkor (év) 3
[2-6] 3
[2-5] 4
[2,5-6,5] betegségtartam (hónap)
- 3,5
[2,5-5] 4
[3-6,5]
testsúly (kg) 15,5
[11-17,6] 16,5
[11,8-18,6]
TG (IgA, egység) - 264
[205-298] 29
[10-40]***
TG (IgG, egység) - 38
[21-56] 14
[7-34]**
5.1.3. Allergiás kolitisz
2006 szeptembere és 2008 januárja között az I. Sz. Gyermekklinika Gyermek-
gasztroenterológiai Szakrendelésén megjelent csecsemők közül 34 esetében volt a
panasz véres széklet (hematokézia, HC). A leggyakoribb okok, így a fertőzés és a
sérülés kizárása után anyai eliminációs étrend került bevezetésre (tehéntej és tojás
elhagyása az anyai étrendből). Egy hónap múlva ezek után már csak tizenegy
gyermeknél maradtak meg a HC-s tünetek. Ezeknél az anyatejet fogyasztó
gyermekeknél kolonoszkópia történt, ami alapján egy csecsemő Crohn betegnek
bizonyult. A maradék tíz gyermek került beválasztásra a vizsgálatba, akiknél AC volt a
végső diagnózis. Az AC diagnózisát a kolonoszkópia során látott jellegzetes képek
(limfonoduláris hiperplázia, LNH, vagy aftás lézió, APH), a biopsziás mintában
jelenlévő eozinofília (>6 egy nagy nagyítású látótérben), és az alapján állítottuk fel,
hogy a hosszabb utánkövetés (13-24 hónap) után sem tért vissza a HC a tartós anyai
eliminációs diéta (tej, tojás), illetve elementáris tápszerre való áttérés után (Neocate;
SHS Int, Liverpool, UK). Tíz, életkorban és nemben illő, anyatejet fogyasztó gyermek
szolgált kontrollként, akiknél a panaszok hátterében funkcionális hasfájás volt
igazolható.
Betegek és módszerek
43. oldal
6. táblázat Az allergiás kolitiszes (AC) gyermekek alap klinikai karakterisztikája. Rövidítések:
HC: hematokézia; AC: allergiás kolitisz; NNL: nagy nagyítású látótér; LNH: limfonoduláris
hiperplázia; APH: aftás lézió; AD: atópiás dermatitisz; n.a.: nincs adat; F: fiú; L: lány.
beteg
(nem)
kor
(hó)
HC
tartam
(hó)
atópia
(családi)
eozinofil sejtek
aránya a
TVK-ben
kolonoszkópia
(kép)
eozinofil (40x-
es nagyítás /
látótér)
1 (F) 6,5 2 nincs 6% LNH, APH 17
2 (L) 4 2 AD 6,2% LNH, APH 14
3 (F) 3 2 AD 2,5% LNH 7
4 (F) 1 1 nincs 2% eritéma 20
5 (L) 6 2 nincs 2,1% LNH 9
6 (F) 4 2 AD 3% LNH 20
7 (F) 5 1 nincs 3,4% LNH 9
8 (F) 4 2 AD 12,8% LNH 41
9 (F) 6 3 nincs 3,4% LNH 38
10 (F) 5 1.5 nincs 1,4% LNH 18
A diagnózis időpontjában 2 ml heparinizált vért vettünk a rutin vizsgálatokkal
egyidőben. A második vérmintát a HC-s tünetek megszűnte után (2 [1-3] hónap múlva)
gyűjtöttük. Széklet hemoteszttel (HSV10; Diagnosticum Zrt, Budapest, HU) igazoltuk a
vérzés megszűntét. Az immunfenotípus vizsgálatokkal egyidőben a plazmából citokin
chip (Bio-Plex Protein Array system, Bio-Rad, Hemel Hempstead, UK) segítségével
meghatároztuk az IFN-γ/IL-4 arányt.
5.1.4. Egészséges kontrollok
Összesen 40 egészséges kontrollt vontunk be a vizsgálatokba, akiktől a rutin
vérvételek során egy csőnyi vérmintát vettünk az immunfenotípus meghatározáshoz.
CD vizsgálatához 15, cöliákiához 15, AC-hez 10 csecsemő, illetve gyermek szolgált
kontroll populációként. Az egyes esetekben alkalmazott kontrollok adatai a fenti
táblázatokban kerültek feltüntetésre.
Betegek és módszerek
44. oldal
5.2. Módszerek és statisztika
5.2.1. Minta előkészítés
Az immunsejt fenotípus vizsgálathoz 2-6 ml heparinizált perifériás vérmintát
gyűjtöttünk (BD Vacutainer, Beckton Dickinson & Co, Plymouth, UK), amit legfeljebb
12 órán át szobahőmérsékleten tároltunk. A vérvételek mindig a betegek rutin
kivizsgálásának részeként történtek, a megfelelő etikai engedélyek és írásos
beleegyezések birtokában. A levett vérmintát mostuk (23 °C, 200 g, 5 perc), a
vérplazmát leszívtuk, majd a minta fagyasztva került tárolásra (-80 °C) a citokinszint
méréshez. A maradék vérből a perifériás vér mononukleáris sejteket (PBMC) grádiens
centrifugálással szeparáltuk (Ficoll-Paque Plus, GE Healthcare Bio-Sciences, Uppsala,
Sweden). A vérmintát és a vérvételi csőből a maradék mintát foszfát-pufferelt
fiziológiás sóoldattal (PBS, Semmelweis Egyetem Központi Gyógyszertár, Budapest) 3
ml Ficoll oldatra óvatosan rárétegeztük. Ezután a mintát mostuk (23 °C, 400 g, 27 perc),
majd a határréteget (buffy coat) óvatosan leszívtuk, és PBS oldatban két alkalommal
ismét mostuk (23 °C, 200 g, 7 perc). Amennyiben a minták nem kerültek azonnal a
kvantitatív mérési fázisba, úgy a PBMC-t fagyasztva tároltuk a mérés időpontjáig
(-80°C). A fagyasztáshoz a PBMC-t 0,5 ml magzati borjúsavóban (FCS, Sigma-Aldrich,
St. Louis, MO, USA) reszuszpendáltuk. Ezek után 0,4 ml magzati borjúsavó és 0,1 ml
dimetil-szulfoxidból (DMSO, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) álló oldatot
óvatosan cseppenként adtunk a PBMC-hez, és azonnal lefagyasztottuk a mintát (-80°C).
A mérések előtt a lefagyasztott sejteket felolvaszottuk, és PBS oldatban két alkalommal
mostuk (23 °C, 200 g, 7 perc). Ezután a frissen szeparált, vagy a fagyasztva tárolt mintát
szétosztottuk annyi részre, ahány mérési panel meghatározása volt a cél, de legalább
1x106 sejtet jutattunk be panelenként a mintákba.
A sejtfelszíni méréshez panelenként a gyártó által előírt protokollnak megfelelő
mennyiségű fluoreszcens molekulával jelölt konjugált antitestet tartalmazó festéket
adtuk hozzá a megfelelő mennyiségű mintához majd inkubáltuk (4 °C, 30 perc). Ezután
a mintákhoz 0,5 ml PBS-t mérve a fölösleges, nem kötődött festéket lemostuk (23°C,
200 g , 7 perc). Következő lépésként 0,5 ml lizáló és fixáló oldat került a mintákhoz
(Lysing Solution, Beckton Dickinson & Co, Plymouth, UK), majd sötétben inkubáltuk
Betegek és módszerek
45. oldal
(23 °C, 20 perc). A mintákat mosás után (23°C, 200 g, 7 perc) 0,5 ml PBS-ben
reszuszpendáltuk a FACS-os méréshez.
7. táblázat Az alkalmazott sejtfelszíni és sejten belüli fluoreszcens festékek. A rövidítéseket és
a részleteket lásd a szövegben.
festék gyártó katalógus
Sejtfelszíni markerek
6b11 BD Pharmingen, Pe Anti-Human invariant NKT cell 552825
CCR4 BD Pharmingen, PE Mouse Anti-Human CCR4 551120
CD11c BD Pharmingen, APC Mouse Anti-Human CD11c 333144
CD123 BD Pharmingen, PE Mouse Anti-Human CD123 340545
CD14 BD Pharmingen, FITC Mouse Anti-Human CD11c 555397
CD161 BD Pharmingen, APC Mouse Anti-Human CD161 550968
CD25 BD Pharmingen, FITC Mouse Anti-Human CD25 555431
CD3 BD Pharmingen, PerCP DD3, Clone 345766
CD4 BD Pharmingen, Pe-Cy7 Mouse Anti-Human CD4, Clone 557852
CD45R0 BD Pharmingen, PEMouse Anti-Human CD45R0 555493
CD45RA BD Pharmingen, FITC Mouse Anti-Human CD45RA 335039
CD62L BD Pharmingen, PerCP Mouse Anti-Human CD62L 555545
CD69 BD Pharmingen, APC Mouse Anti-Human CD69 555533
CD8 BD Pharmingen, APC-Cy7 Mouse Anti-Human CD8, Clone 557834
CXCR3 BD Pharmingen, APC Mouse Anti-Human CD183 (CXCR3) 550967
HLA-DR BD Pharmingen, PerCP Mouse Anti-Human HLA-DR 347402
Lin-1 BD Pharmingen, FITC Mouse Anti-Human Lin-1 340546
TLR-2 eBioscience, PE-Cy7 Anti-mouse/human TLR2 (T2.5) 25-9024-80
TLR-4 eBioscience, Alexa Fluor700 Anti-human TLR4 (HTA125) 56-9917-71
Sejten belüli markerek
FoxP3 eBioscience, PE Anti-human Foxp3 Staining Set (PCH101) 72-5776-40
izotípus eBioscience, PE Anti-human PE IgG Isotype 12-4714-73
A sejten belüli FoxP3 meghatározáshoz először a sejtfelszíni festékeket (CD4,
CD25) adtuk hozzá a mintákhoz és inkubáltuk a protokolloknak megfelelően (4 °C, 30
perc). Ezután 1 ml fixáló és permeabilizáló oldatot (Fixation/Permeabilization Solution,
eBioscience, San Diego, CA, USA) adva a mintához újra inkubáció következett (4 °C,
Betegek és módszerek
46. oldal
30 perc). A mintákat 2 ml fixáló oldatban (Fixation Solution, eBioscience, San Diego,
CA, USA) mostuk (23 °C, 200 g, 7 perc). A PBMC-khez egyrészt a FoxP3 festéket (PE
Anti-human Foxp3 Staining Set, eBioscience, San Diego, CA, USA), másrészt az
izotípus kontrollt adtuk hozzá, majd inkubálásuk következett (23 °C, 30 perc). A festés
végével 2 ml fixáló oldatban került a minta mosásra (23°C, 200 g, 7 perc). Az azonnali
méréshez a 0,5 ml PBS-ben reszuszpendált mintát a gépbe helyezésének pillanatáig
jégen tartottuk.
5.2.2. Immunsejt markerek
A perifériás vérminták vizsgálatához szükséges panelek fluoreszcens festékek
kombinációit tartalmazták. [135-141] Ezeknek a segítségével kis mennyiségű
vérmintából több sejtpopuláció vizsgálata volt lehetséges, az áramlási citométer
szűrőinek igény szerint való kombinálásával. A bevezetésben részletesen tárgyalásra
került az immunsejtek patomechanizmusban betöltött szerepe, itt csak az egyes
populációk azonosításában fontos markerek és ezek élettani jelentőségét részletezzük a
módszertani leírásokon túl.
A CD3 a T sejt receptor komplex (TCR) egyik alkotóeleme. A CD3 membrán
fehérje funkciója a TCR kihorgonyzása a sejtmembránhoz, valamint a jelátvitelben való
részvétel. [142]
A CD4 antitestet kötő sejtek a T helper (Th), a CD8 antitesteket kötő sejtek
többsége citotoxikus T limfocita (Tc). A CD4 és a CD8 fehérjék a T-sejtek sejtfelszíni
fehérjéi, amelyek a fő hisztokompatibilitási komplex (MHC) állandó részéhez
kapcsolódnak és a TCR szignáljaival együtt, a T-sejt aktivációt eredményező jelátviteli
mechanizmusokban vesznek részt. A CD4 az MHC II, a CD8 pedig az MHC I
molekulák adhéziós és jelző koreceptorai. Az érett T-sejtek kb. 65 %-a CD4+, kb. 35 %-
a CD8+ a vérben. Fő funkciójuk az antigénfelismeréskor történő jelátvitel. Ezen kívül
erősítik a T-sejtek kötődését az APC-hez. A CD4+ T-sejtek citokintermelő helper sejtek,
és a sejten kívül mikróbák elleni védekezésben van jelentőségük, míg a CD8+ T-sejtek
az intracelluláris fertőzésekkel szemben hatékonyak. Emberben előfordulhat Tc-ként
működő CD4+ T-sejt is, de ezek a sejtek is MHC II-re korlátozottak. Így tehát a CD4,
ill. CD8 expressziója egy sejten azt határozza meg, hogy melyik MHC-re korlátozott, és
Betegek és módszerek
47. oldal
nem feltétlenül a sejt funkcióját. A Th sejtek fejlődésük folyamán effektor, azaz
aktiválódott helper sejtekké alakulhatnak. Elszenvedett infekció után egy részük
memória T sejtté, más részük regulátoros T sejtté differenciálódik. Az aktiválódott
CD4+ sejtek tovább differenciálódhatnak Th1 vagy Th2 irányba.
A CD8 sejtek a CD3+ sejtek olyan csoportját alkotják, amely direkt citotoxikus
hatással rendelkezik. A fertőző ágensek és a megváltozott működéssel rendelkező sejtek
felismerése révén képesek elpusztítani a fertőzött, valamint a tumor sejtté
transzformálódott szomatikus sejteket. Citotoxikus hatásukat két úton érhetik el.
Citotoxinokat (perforin, granulizin) szabadítanak fel, valamint Fas-ligand termelésével a
célsejtek apoptózisát indukálják. [142] Aktivációjukban a helper T sejtek játszanak
központi szerepet. Az NKT és invariáns NKT (iNKT) sejtek a CD8+ sejtek aktivációját
gátló hatással rendelkeznek. Az aktivált citotoxikus T sejtek egy kisebb hányada az
aktivált helper T sejtekhez hasonlóan képes Tc1 vagy Tc2 irányba differenciálódni.
Ezentúl ismert, hogy a Th sejtekhez hasonlóan a CD8 sejtek is képesek szabályozó
funkciókkal bíró Treg irányba differenciálódni bizonyos hatásokra. A CD8+ Treg
sejteket eddig csak nagyon kis számban azonosították, funkciójuk sem ismert, de
valószínűleg daganatos kórképek kialakulásában lehet jelentőségük.
A CXCR3 receptor, mely CD183-ként is ismert, a kemokin receptorok családjába
tartozik. Fokozott expressziója figyelhető meg a Th1 sejtek felszínén. A receptor
ligandja elősegíti a Th1 sejtek érési folyamatait, ezért a Th1 sejtek identifikálására
alkalmas. A Th1 sejtek fő funkciója a citokinek termelése. Szekretálnak IL-2-t,
interferon-gammát (IFN-γ), IL-12-t valamint limfotoxinokat (TNFβ). A Th1 sejtek
túlnyomó része CD4+ sejtekből, kisebb hányaduk CD8+, vagy NKT, esetleg regulátoros
T-sejtekből alakul ki. Az általuk elválasztott citokinek nem csak a Th1 sejtek effektor
funkcióiban játszanak szerepet, hanem befolyásolják a Th1 sejtek érési folyamatait is. A
szekretált citokinek elősegítik a CD4+ sejtek Th1 irányú fejlődését, míg gátolják a Th2
irányú differenciálódást. A legfontosabb Th1 sejt-kialakulást elősegítő citokin az IL-12.
A Th1 irányú differenciálódás a mikróbák megjelenése következtében aktiválódott
makrofágok, valamint NK sejtek IL-12 termelésének következménye. A Th1 sejtek
effektor funkciója a fagocitózis elősegítése fertőzések esetén. [143]
Betegek és módszerek
48. oldal
A CCR4, mely CD194 néven is ismert, a CXCR3 receptorhoz hasonlóan a
kemokin receptorok közé tartozik és alkalmas a Th2 sejtek kimutatására. A leukociták
által termelt kemokinek feladata a gyulladásos sejtek migrációjának befolyásolása. A
Th2 sejtek funkciója az IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-10 és IL-13, továbbá TNF-α
elválasztás. A Th1 sejtek esetében ismertetett prekurzorokból alakulnak ki a Th2 sejtek.
[142] Az általuk elválasztott citokinek a Th1 irányú differenciálódást gátolják, míg a
Th2 irányút elősegítik. A Th2 sejtek képzését emberben helmintiázis, valamint az
allergiás megbetegedések segítik elő. E betegségek okozta krónikus T sejt stimuláció - a
veleszületett immunrendszer sejtjeinek közreműködése nélkül - az IL-4 termelése útján
a Th2 irányú differenciálódáshoz járul hozzá. A Th2 sejtek fő effektor funkciója az IgE-
valamint az eozinofil-, és masztocita-mediált immunválasz elősegítése.
Mind a CD45RO, mind a CD45RA aktivációs marker. Emberben a legtöbb naív T-
sejt felszínén megtalálható a CD45 egy izoformája, amelynek egy részét egy „A”
jelzésű exon kódolja, ezért ezt CD45RA-nak nevezik. Ezzel szemben, a legtöbb aktivált
és memória T-sejt a CD45 olyan izoformáját tartalmazza, melyből az „A” exon már
kivágódott, ez a CD45RO. [142]
A CD69, CD25, HLA-DR és CD62L szintén aktivációs markerek. A CD69
(activation inducer molecule, AIM) nagyon korai aktivációs marker, a CD25 (IL-2
receptor α lánca, IL-2R, Tac, p55) korai aktivációs marker, a HLA-DR (fő
hisztokompatibilitási komplex, MHC) késői aktivációs marker, CD62L (L-szelektin
ligand) késői aktivációs marker. A CD69 funkciója nem pontosan ismert, de a korai
aktivációs mechanizmusok jelátvitelében fontos antigén; aktivált T- és B-sejtek,
makrofágok, NK-sejtek, vérlemezkék, Langerhans-sejtek felszínén található meg. A
CD25 az aktivált T- és B-sejteken és monocitákon található, fő funkciója az IL-2 kötése.
Az IL-2 a regulátoros T-sejtek kialakulásához és működéséhez szükséges. A CD4+
Treg-eken nagy számban találunk CD25-öt, de más aktivációs markert nem. A HLA-DR
a humán MHC, a 6. kromoszóma rövid karján mintegy 4 megabázis területet foglal el.
Három régióban csoportosulnak a különböző lókuszok, melyek legjellemzőbb génjei a
polimorfizmusokat viselő I. és II. osztályú hisztokompatibilitási molekulákat kódolják.
Az I. osztályú kétláncú és doménszerkezetet mutató fehérjéket a HLA-A, -B, -C, -G, -E
stb. lókuszok determinálják. A II. osztályú, a HLA-DR, -DQ, -DP, -DO lókuszok által
Betegek és módszerek
49. oldal
meghatározott kettős láncú (alfa, béta) molekulák kisebb mértékű polimorfizmusát
külön gének kódolják (HLA-DRA, -DRB, -DQA, -DQB stb.). A CD62L megtalálható
T- és B-sejteken, monocitákon, NK-sejteken. Szerepe van a naív T-sejtek homingjában
a perifériás nyirokcsomókban (homing receptor), CD34-et köt, ami a sejt-sejt közötti
kapcsolatért felelős. Affinitása kicsi, ezért a fehérvérsejtek endotéliumhoz való kezdeti
kötődését, és azon való végiggördülését segíti a véráramlással szemben. [142]
A CD161 receptor a C-típusú lektinek családjába tartozik, homodimer láncokból
áll. A legtöbb NK sejten, invariáns NKT sejteken és citolítikus T-sejteken
expresszálódik. Az iNKT sejtek hasonlóak az NK sejtekhez a CD161 (NK-asszociálta
receptor) expresszióban. Az NK sejtek neve arra utal, hogy előzetes aktiváció nélkül is
képesek ellátni védekező feladataikat, a vírusok, valamint egyéb intracelluláris
kórokozókkal fertőződött sejtek elpusztítását. Minden olyan sejtet eliminálnak, melynek
felszínén nincs jelen az MHC I. A fertőzések és egyes, főként hematopoetikus eredetű
tumoros folyamatok a sejtek felszínén az MHC I kifejeződését gátolják, ezáltal válnak e
sejtek az NK sejtek célpontjaivá. Az NK sejtek effektor funkciója direkt citotoxikus
válaszreakció és a makrofág aktiváció, ez utóbbi IFN-γ termelése útján következik be.
Az NK sejtek elősegítik továbbá a nyugvó CD4+ sejtek aktivációs mechanizmusait. A
CD161 fehérje funkciója az NK sejtek citotoxicitásának és aktivitásának szabályozása.
Amennyiben az NK sejt CD3 pozitivitással rendelkezik, NKT sejtről beszélünk. Az
NKT sejtek APC-k által CD1d kontextusban bemutatott antigént ismerik fel, és gyors
Th1/Th2 citokin választ adnak. Így a DC, NK, B, T sejteket aktiválják, valamint a CD4
T sejtek Th1 vagy Th2 irányú differenciálódását szabályozzák. [143] A 6b11 anti-
invariáns NKT sejt (iNKT) ellenes antitest és így az iNKT sejtek (6b11+, CD3+)
vizsgálatára alkalmas. Az NKT sejtek ugyanis TCR receptoruk alapján invariáns NKT
és nem-invariáns NKT sejtek csoportjára oszthatóak. Az iNKT sejtek TCR-je
születéskor kialakult és nem esik át későbbi átrendeződésen. A CD1d reaktív iNKT
sejtek tovább oszthatóak klasszikus (Vα24Vβ11) és nem klasszikus (más Vα géneket
expresszáló) csoportra. Az iNKT sejtek eddig ismert feladata TCR révén gyors citokin
termelés, főleg IL-4 (Th0-ról Th2-re differenciációt fokozza) és IFN-γ (Th1- irányú
differenciációt okoz, APC-ket aktiválja) expresszió. Az NKT és iNKT sejtek ezeken
kívül gátolhatják a nyugvó CD8+ sejtek aktiválódási folyamatát is.
Betegek és módszerek
50. oldal
8. táblázat Példa panel összeállításokra BD FACS Aria típusú áramlási citométerre saját szűrő
beállításokkal sejtfelszíni és sejten belüli mérésekhez. Az alábbi panel összeállítások
mindegyike tartalmazza a feltüntetetteken kívül az FSC (szűrő nélkül) és SSC (488/10-es BP
szűrővel) paramétereket is. Rövidítések: FSC: forward scatter; SSC: side scatter; BP: band
pass; LP: long pass; NK: természetes ölő sejt; DC: denritikus sejt; Treg: regulátoros T sejt.
A DC sejtek vonal marker (Lineage-1, Lin-1) negativitásuk és HLA-DR
pozitivitásuk alapján azonosíthatóak. Az mDC sejtek CD11c-t (antigén felvétel, T-sejt
aktiváció, IL-12 termelés), míg a pDC sejtek CD123-at (szupresszor hatás, IFNα
termelés) expresszálnak. A Lin-1 koktél CD3, CD14, CD16, CD19, CD20 és CD56
elleni antitestekből áll. A CD14 (Mo2, lipopoliszacharid, LPS receptor): az LPS
indukálta makrofág aktivációban játszik szerepet, az LPS és LPS-kötő fehérjék
komplexét köti, a perifériás monociták markere. A CD16 (FcγRIII A és B) az immun-
komplex mediálta sejtaktivációban játszik szerepet. A CD19 (B4) a B-sejt aktivációban
Első szűrő beállításban mérhető panelek
Festék FITC PE PerCP PECy7 APC APCCy7
gerjesztés (nm)
488 488 490 488 650 633
emisszió (nm) 520 575 675 785 660 760
szűrő BP (LP)
530/30 (502)
576/26 (556)
675/20 (655)
780/60 (735)
660/20 (-)
780/60 (735)
T sejtek 1. CCR4 CD62L CD4 CXCR3 CD8
T sejtek 2. CD45RA CD45RO HLA-DR CD4 CD69 CD8
NK 6B11 CD3 CD11b CD161
Treg CD25 FoxP3 CD4 CD8
Második szűrő beállításban mérhető panelek
Festék FITC PE PerCP PECy7 APC Alexa 700
gerjesztés (nm)
488 488 490 488 650 702
emisszió (nm) 520 575 675 785 660 720
szűrő BP (LP)
530/30 (502)
576/26 (556)
675/20 (655)
780/60 (735)
660/20 (-)
695/40 (655)
DC Lin-1 CD123 HLA-DR TLR-2 CD11c TLR-4
monociták CD14 TLR-2 TLR-4
Betegek és módszerek
51. oldal
játszik szerepet, CD21-el és CD81-el képez komplexet, míg a CD20 (B1) a B-sejt
aktivációban és regulációban játszhat szerepet, kálcium-csatorna. CD56 (Leu-19,
NKH1) a homotípiás adhézióban szerepel, az N-CAM izoformája. A CD11c (CR4α
lánc, p150,95, alfaX integrin lánc), az integrin alfa családba tartozik, nem-kovalensen
kötődve a CD18-hoz a p150,95 integrint alkotja. Mieloid (monocita/makrofág,
granulocita, endotél) sejteken expresszálódik. AlfaX alegysége az integrin CR4-nek
(CD18-al asszociálva), amivel fibrinogént köt, hasonlóan a CD11b-hez. A CD123 (IL-
3Rα) a citokin receptor I-es típus, fibronektin III-as típus családba tartozik, a CD131
jelátviteli lánccal asszociálva. Csontvelő őssejteken, granulocitákon, monocitákon,
megakariocitákon expresszálódik, az IL-3 biológiai hatását közvetíti a CD131-el együtt.
Mind a monociták, mind a DC sejtek felszínén megtalálhatóak a TLR-2 és TLR-4
markerek. Ezek a markerek az APC-k sejtmembránján átérő molekulák, amik a
veleszületett immunitás fő mediátorai és többek között az LPS-t képesek megkötni, és
így járulnak hozzá a mikrobiális antigén prezentációjához és citokinek termeléséhez. A
TLR-2 monocitákon/makrofágokon, mDC és hízósejteken expresszálódik, míg a TLR-4
ezeken kívül még az intesztinális epitéliumon is.
A Treg sejteket FoxP3+ sejtekként azonosítottuk. A FoxP3 intracelluláris marker,
transzkripciós faktorként több gén átírását képes befolyásolni, hibás működése
autoimmun kórképek kialakulását okozza. A regulátoros T sejtek fejlődésében és
működésében a fokozott CD25 expresszió központi szerepet játszik. Amennyiben az IL-
2 receptor valamilyen genetikai defektusa áll fenn, úgy a regulátoros T sejtek működése
súlyosan károsodott. A Treg sejtek a T limfociták olyan szubpopulációját alkotják,
melynek szerepe az immunrendszer válaszának visszafogása, a túlzott aktiválódási
folyamatok korlátozása, azaz szuppresszor hatással rendelkeznek. Elősegítik a saját
antigénekkel szemben kialakuló tolerancia létrejöttét. A regulátoros T-sejtek
közvetlenül gátolhatják a nyugvó CD4+ sejtaktivációt, valamint közvetve, az NK sejtek
működésének gátlása révén, tovább csökkenthetik az aktiválódó Th sejtek számát. A
regulátoros T sejtek, a fentiekhez hasonlóan közvetlenül gátolják a CD8+ sejtaktivációt,
valamint effektor funkcióját is. A CD4 populáción belül a Treg sejtek aránya 1-10%
körül alakul perifériás vérmintában, de kevesebb, mint 1%-ban CD8 Treg sejtek is
azonosíthatóak.
Betegek és módszerek
52. oldal
5.2.3. Áramlási citométeres mérések
Az immunsejtek prevalenciáját áramlási citométerrel (BD FACS Aria, Beckton
Dickinson & Co, Plymouth, UK) mértük a Semmelweis Egyetem I. Sz. Gyermekklinika
kutatólaboratóriumában. A FACS vizsgálatok során fluoreszcens festékkel előre
konjugált antitesteket használunk a sejttípusok meghatározásához. A mérés során a
vizsgálandó sejtet tartalmazó egy sejtsor szélességű folyadékoszlopra lézerfényt irányít
a gép (488 nm-es kék, és 633 nm-es vörös fényt). Amikor a sejt (vagy 0,2-150 μm
méretű részecske) a lézerfény fókuszpontjába ér, a ráeső fény oldalirányba (side scatter)
és előrefelé (forward scatter) szóródik. Az előre szóródó fény a sejt (részecske)
méretéről ad információt, és további módosítás nélkül külön csatornán (forward scatter
characteristics, FSC) detektálható. Az oldalra szóródó fény a sejt granuláltságának,
morfológiai tulajdonságainak detektálására szolgál (side scatter characteristics, SSC). A
gerjesztés során keletkező fényszórási jelek mellett a különböző hullámhosszú,
jelöléstől függő fluoreszcens emissziós jelek keletkeznek. A fluoreszcens jeleket a
készülék optikai szűrők segítségével elkülöníti egymástól. A szűrők funkciója alapján
meg lehet különböztetni long pass (LP) és band pass (BP) szűrőket. A LP szűrők egy
meghatározott hullámhossznál nagyobb (felül áteresztő), vagy kisebb (alul áteresztő)
hullámhosszúságú fényt engednek át, a többi fényt pedig visszatükrözik. A BP szűrők
csak egy meghatározott tartományba eső fényjeleket engednek át (pl. 600-620 nm). A
jeleket erősítés majd analóg-digitális konverzió után számítógép gyűjti és elemzi. [144]
A nem fixált minták mérését a festés után a lehető leghamarabb kell elvégezni
(max. 1 óra a festéstől számítva), és a mintákat a gépbe helyezésének pillanatáig
sötétben és hűtve kell tárolni. Minden panel összeállítás előtt a gép használati
utasításának megfelelően kompenzációs számításokat végeztünk, egyszeresen festett és
negatív kontroll mintákkal. Az erősítések mértékét úgy állítottuk be, hogy az adott
festék esetén a negatív és pozitív populáció a lehető legjobban elkülöníthető legyen a
kapuzás során. A kapott kompenzációs értékek a fluoreszcens festékek spektrumának
átfedését mutatják, és a vizsgálatok során soha nem voltak nagyobbak, mint 10%. Egy
mintát véletlenszerűen többször is visszamértünk, hogy a mintán belüli szórásokat
ellenőrizhessük. Továbbá a gép rendszeresen minőségi kontrollon esett át az
előírásoknak megfelelő reagensekkel. A sejtfelszíni mérések során negatív és szükség
Betegek és módszerek
53. oldal
esetén izotípus kontroll mintákatat használtunk, míg a sejten belüli festések esetén
minden esetben izotípus kontrollt is, az autofluoreszenciából és nem specifikus
festődésből eredő zaj kiszűrésére. Minden panel mérésekor legalább 105 sejt mérése
történt a limfocita kapuban (FSC és SSC, valamint CD3 pozitivitás alapján). A mérési
eredmények ábrázolása dot-plot és hisztogram segítségével történt. A dot-ploton az
egyes sejtekről kapott fényjelek ábrázolhatóak intenzitásuk függvényében, míg a
hisztogram egy paraméter jelintenzitása alapján mutatja a sejtek megoszlását. A
kiértékelések a citométerhez mellékelt szoftver (FACS Diva, Beckton Dickinson & Co,
Plymouth, UK) segítségével történtek.
10. ábra A regulátoros T sejtek (Treg) azonosítása. Az ábra bal részében látható, hogy a
CD4+CD25hi sejtpopuláció kijelölésével régebben hogyan azonosították a Treg sejteket. Ismert
azonban, hogy a CD4+CD25hi sejtcsoport nem csak Treg sejteket tartalmaz. Újabban ezért az
ábra jobb oldalán látható módon a CD4+ sejteken belül a FoxP3+ sejteket tekintik Treg-eknek a
jelenleg leginkább elfogadott protokollnak megfelelően. Ezt a populációt a CD4+ vagy a
CD4+CD25+/hi kapun belül szokták azonosítani attól függően, hogy csak a természetes vagy az
indukált Treg sejteket is beleveszik a számításba.
Az áramlási citométeres vizsgálatokban a PBMC populáción belül az egyes
sejttípusok prevalenciáját lehet meghatározni. Ezek a százalékos értékek egy adott
szülőpopuláción belül mutatják a vizsgált immunsejt előfordulási gyakoriságát.
Amennyiben egy sejttípus prevalenciáját vagy egy sejttípus bizonyos expresszióját
kívánják meghatározni, mindig százalékos (%) értékeket adnak meg, ami a jelölt
populáción belüli arányt jelenti. Az adott sejttípust a dot-plot segítségével két (vagy
Betegek és módszerek
54. oldal
újabban háromdimenziós dot-plotok segítségével három) marker kombinációjával lehet
azonosítani. Ritkán az adott expresszió mértékét hisztogram segítségével statisztikai
középértékkel adják meg, és így jellemzik az expresszió mértékét, mint jelintenzitást.
11. ábra Az áramlási citométeres kiértékelés menete. Az ábra bal felső képén a perifériás
mononukleáris sejteken (PBMC) belül a sejtméret (forward scatter characteristics, FSC) és
granuláltság (side scatter characteristics, SSC) alapján azonosítható a limfociták populációja.
Az ábra jobb felső képén limfocita kapun belül a CD4 és CD8 expresszió alapján dot-ploton a
CD4+CD8- sejtek a T helper (Th), míg a CD8+CD4- populáció pedig a T citotoxikus (Tc) sejtek
lesznek. Az ábra bal alsó részén a CD4 jelölés, míg az ábra jobb alsó részén a CD8 jelölés
hisztogramon való eloszlása látható.
Betegek és módszerek
55. oldal
5.2.4. Citokin chip
A perifériás vérmintából szeparált vérplazmát fagyasztva (-80 °C) tároltuk a
mérések időpontjáig. A mérések a Semmelweis Egyetem Központi Laboratóriumában
fehérje meghatározási módszerrel történtek (Bio-Plex Protein Array system, Bio-Rad,
Hemel Hempstead, UK). A Bio-Plex módszer a chiptechnikán és áramlási citométeres
módszeren egyszerre alapul, és lehetőséget ad egyszerre több (gyakorlatilag 27, de
elméletileg akár 100) analit meghatározására is. Olyan mikrogyöngyöket alkalmaznak
ugyanis, amelyeket két színnel jelölnek, ezzel közel 100 gyöngytípust tudnak létrehozni.
A gyöngyökhöz monoklonális antitesteket kötnek, majd fluoreszcens festéket. A mérés
során a kapillárison áthaladó gyöngyöket két színes lézer világítja meg. A piros fény a
gyöngy, a zöld fény pedig a fluoreszcens jel intenzitását teszi mérhetővé. A jelet analóg-
digitális konverzió után a gép szoftveresen kiértékeli, és egy standard görbéhez
viszonyítva adja meg a citokin szinteket (1,95-32 000 pg/ml tartományban). [145]
5.2.5. Statisztika
A statisztikai kiértékelés során minden esetben legelőször az adatok eloszlását
vizsgáltuk. Amennyiben a Kolmogorov-Smirnov, D’Agostino-Pearson, Shapiro-Wilk
tesztek eredménye szignifikáns volt (p<0,05), akkor a vizsgált populáció nem a Gauss-
féle eloszlást követte. Ebben az esetben nem paraméteres teszteket alkalmaztunk és a
centrális tendencia medián [interkvartilis tartomány: 25-75 percentilis], vagy medián
[tartomány] formában adtuk meg. Amennyiben az esetszám a gyermekgyógyászati
klinikai vizsgálatok sajátosságainak megfelelően alacsony (kevesebb, mint 20 fő) volt,
akkor szintén nem paraméteres teszteket alkalmaztunk. A vizsgálatok előtt power
számítások történtek, hogy a nem paraméteres eljárások használatával megnövekvő
másodfajú hiba lehetőségét kontrollálni lehessen. Nem paraméteres eloszlásnak
megfelelően nem párosított két csoport összehasonlítására a Mann-Whitney teszt, míg
párosított esetben a Wilcoxon teszt szolgált. Három, vagy több csoport
összehasonlítására nem párosított mintáknál a Kruskal-Wallis tesztet, míg párosított
esetben a Friedman tesztet használtuk. Post hoc számításokra a Dunn-féle teszt szolgált.
Nem normál eloszlásra való tekintettel korreláció vizsgálatokhoz a Spearman tesztet
alkalmaztuk. A befolyásoló faktorokra való korrekcióra többszörös regressziók
Betegek és módszerek
56. oldal
segítségével került sor. 2x2-es kontingencia táblákat a Fisher-féle egzakt teszttel,
nagyobb táblákat a χ2 próba segítségével értékeltünk ki. A grafikai ábrázolásra a nem
paraméteres eloszlást is jól reprezentáló Whiskers box-plotot használtuk, ahol a
középvonal a medián, a doboz az interkvartilisek, míg a bajusz a tartományt jelölte.
Mivel a fenotípus vizsgálatok hipotézis felvető vizsgálatok, ezért az ilyenkor szokásos
eljárásnak megfelelően nem történt korrekció a többszörös összehasonlításokra
(Bonferroni-hatás), és így az elsőfajú hiba 5%-nál magasabbnak adódhatott bizonyos
esetekben. [146] A 0,05-nél alacsonyabb p érték tekintendő szignifikánsnak minden
esetben, kivéve, ahol ezt külön jeleztük. A kiértékelésre a Statistica szoftvercsomagot
használtuk (Statistica 8, Statsoft, Tulsa, OK, USA).
Eredmények
57. oldal
6. Eredmények
6.1. Crohn betegség
A vizsgálat során összehasonlítottuk a kezeletlen betegek és a kontroll egyének
immunfenotípusát. CD beteg gyermekben az adaptív immunitás sejtes elemei közül az
aktivált (CD4+CD25+) sejtek prevalenciája magasabb volt. Ezzel együtt a Th1
elkötelezett sejtek (CD4+CXCR3+) aránya csökkent, és így a Th1/Th2 arány Th2
irányba eltolódott a terápiában még nem részesült beteg gyermekekben. Az effektor
vagy memória sejtek (CD4+CD45RO+) prevalenciája megnőtt, így a naív/memória
sejtek arányában eltolódás volt a memória sejtek irányába. A Treg sejtek
(CD4+CD25hiFoxP3+) aránya ugyanakkor nem különbözött a beteg és egészséges
csoport között, de jelentős különbségek voltak a veleszületett immunitás fenotípusában.
Az NK (CD3-CD161+) és az NKT (CD3+6b11+) sejtek prevalenciája alacsonyabb volt a
terápiában még nem részesült CD-s gyermekekben, mint a kontroll egyénekben. Az
APC sejtek aránya szintén különbözött a két csoport között. A DC-k (Lin1-HLA-DR+)
és ezen belül az mDC-k (CD11c+) prevalenciája magasabb volt, míg a pDC-k (CD123+)
prevalenciája alacsonyabb friss beteg gyermekekben, mint az egészségesekben. Ezáltal
az mDC/pDC arányban eltolódás volt az mDC-k irányába. A perifériás monociták
(CD14+) száma magasabb volt CD-s betegekben, mint a kontroll populációban.
Továbbá, mind a DC-k, mind a monociták esetében magasabb volt a TLR-2 és TLR-4
expresszió a frissen diagnosztizált kezeletlen betegekben az egészségekhez képest.
Megjegyzendő, hogy a 14 kezeletlen gyermekből 4 gyermek nem reagált a
hagyományos terápiára, ezekben a gyermekekben az immunfenotípus nem különbözött
a terápiára reagálókétól.
A vizsgálat második fázisában prospektíven az immunfenotípus hagyományos
kezelésre történő változását figyeltük meg. Az első remisszió alkalmával az adaptív
immunitásban a Th1/Th2 arány a Th1 felé tolódott, és normalizálódott az aktivált T
sejtek prevalenciájával együtt. A memória T sejtek aránya az emelkedett szinten maradt,
míg a többi adaptív immunsejté nem változott a kezelés előtti szinthez képest. A
veleszületett immunitás elemei közül az NK és NKT sejteké alacsony, míg a DC-k
prevalenciája magasabb maradt a kontrollokéhoz képest. Ugyanakkor, mind az
mDC/pDC arány, a monocita, és TLR-2 és TLR-4 expresszió normális volt ezekben a
betegekben a kontrollokkal összehasonlítva.
Eredmények
58. oldal
9. táblázat Az adaptív immunitás sejtes elemeinek prevalenciája Crohn beteg gyermekekben.
Az adatok medián [interkvartilis tartomány] formátumban vannak megadva. Rövidítések: IFX:
infliximab; PBMC: perifériás vér mononukleáris sejtek; aktivált (CD25+); naív (CD45RA+);
effektor (CD45RO+); Th1 (T helper 1 elkötelezett, CXCR3+); Th2 (T helper 2 elkötelezett,
CCR4+); Treg (regulátoros T sejt, CD25hiFoxP3+). Statisztika: vs. kontroll: *p<0,05, **p<0,01,
***p<0,01; vs. kezeletlen: +p<0,05, +++p<0,01; vs. relapszus: ×p<0,05, ××p<0,01.
sejt prevalencia a
jelzett populációban
kontroll kezeletlen
(hagyományos terápia előtt)
első remisszió (hagyományos
terápiára)
relapszus (IFX
terápia előtt)
IFX terápia (2. adag
előtt)
IFX terápia (3. adag
előtt)
n (fiú/lány) 15 (6/9) 14 (6/8) 10 (4/6) 12 (5/7)
PBMC-ben CD4+
35,16 [24,81-47,79]
36,52 [18,61- 44,06]
37,42 [22,27- 44,26]
39,12 [24,15-51,18]
39,77 [27,71-50,30]
35,65 [24,31-48,81]
CD4+-ben aktivált
5,92 [2,39-6,51]
10,61 [3,93-
19,04]*
5,03 [3,37-
7,93]+++
7,84 [5,30-11,67]*
7,24 [5,67-12,25]*
9,98 [5,45-
16,19]**
CD4+-ben naív
64,57 [59,86-73,03]
63,36 [41,19- 74,86]
61,31 [39,09- 73,05]
66,31 [60,44-71,79]
64,47 [53,90-77,87]
58,11 [53,51-64,96]
CD4+-ben effektor
21,91 [13,94-33,96]
31,29 [22,80- 55,78]*
33,97 [28,54- 39,44]*
29,47 [26,54-36,19]*
35,23 [27,74-40,36]*
37,62 [35,74-45,24]**,
×× naív / effektor arány
2,73 [1,60-4,97]
1,57 [1,02- 2,54]*
1,43 [1,14- 2,21]*
2,34 [1,66- 2,68]
1,79 [1,47-2,36]
1,52 [1,19-
1,74]*, ×
CD4+-ben Th1
16,19 [9,91-25,26]
6,49 [4,50-
7,67]***
12,89 [5,12-
19,03]+
10,90 [4,03-14,38]*
12,73 [8,12-15,81]
18,87 [12,51-38,11]×
CD4+-ben Th2
4,59 [2,78-5,51]
4,70 [1,98- 6,03]
5,06 [1,42- 8,48]
3,97 [2,27- 7,19]
4,61 [2,55-5,65]
4,46 [2,11- 8,16]
Th1 / Th2 arány
3,98 [3,06-5,12]
1,60 [0,50-
2,11]***
1,95 [0,43- 3,62]**
2,68 [0,85- 5,07]
2,68 [1,42-6,14]
3,25 [1,37-4,80]×
CD4+-ben Treg
1,25 [1,10-2,37]
1,36 [1,09- 2,48]
1,41 [1,07- 3,50]
1,31 [1,16- 2,63]
1,33 [1,07-2,99]
1,96 [1,47-
3,77]**, ×
Eredmények
59. oldal
12. ábra Az adaptív immunitás sejtes elemeinek prevalenciája Crohn beteg gyermekekben
(Whiskers box-plot: középvonal a medián, a doboz az interkvartilisek, a bajusz a tartományt
jelöli). Az (A) aktivált (CD4+CD25+), (B) effektor vagy memória (CD4+CXCR3+), (C) T helper
1 elkötelezett (Th1, CD4+CXCR3+) és (D) regulátoros T (CD4+CD25hiFoxP3+) limfociták
prevalenciája. Statisztika: vs. kontroll: *p<0,05, **p<0,01, ***p<0,01; vs. kezeletlen: +p<0,05,
+++p<0,01; vs. relapszus: ×p<0,05, ××p<0,01.
Eredmények
60. oldal
10. táblázat A veleszületett immunitás sejteinek prevalenciája Crohn beteg gyermekekben. Az
adatok medián [interkvartilis tartomány] formátumban vannak megadva. Rövidítések: IFX:
infliximab; PBMC: perifériás vér mononukleáris sejtek; NKT (természetes ölő T, CD3+6b11+);
NK (természetes ölő, CD3-CD161+); DC (dendritikus sejt, Lin1-HLA-DR+), mDC (mieloid DC,
CD11c+), pDC (plazmocitoid DC, CD123+); monocita (CD14+); TLR-2 (Toll-like receptor 2);
TLR-4 (Toll-like receptor 4). Statisztika: vs. kontroll: *p<0,05, **p<0,01; ***p<0,001; vs.
kezeletlen: +p<0,05, ++p<0,01; vs. első remisszió: #p<0,05; vs. relapszus: ×p<0,05.
sejt prevalencia a
jelzett populációban
kontroll kezeletlen
(hagyományos terápia előtt)
első remisszió (hagyományos
terápiára)
relapszus (IFX
terápia előtt)
IFX terápia (2. adag
előtt)
IFX terápia (3. adag
előtt) n (fiú/lány) 15 (6/9) 14 (6/8) 10 (4/6) 12 (5/7)
PBMC-ben NKT
1,39 [0,81-2,42]
0,70 [0,11- 1,33]*
0,74 [0,37- 1,34]
0,72 [0,45-1,23]
0,73 [0,37-1,20]
0,83 [0,31-2,05]
PBMC-ben NK
3,17 [1,71-4,76]
1,73 [0,72- 3,49]*
1,98 [1,65- 2,97]
1,95 [0,72-4,81]
2,14 [0,66-4,78]
2,45 [1,26-4,85]
PBMC-ben DC
0,61 [0,10-2,15]
1,05 [0,54- 3,32]*
1,16 [0,58- 2,98]*
1,45 [1,09-3,46]*
0,86 [0,30-2,80]
0,82 [0,52-2,31]
DC-ben mDC
46,04 [37,14-52,30]
61,66 [45,37- 72,74]**
45,19 [37,83- 56,68]+
69,01 [40,11-
74,79]*, #
60,01 [48,03-68,50]*
57,39 [37,19-
64,14]*, ×
DC-ben pDC
27,38 [20,65-33,94]
19,26 [15,08- 24,58]*
21,61 [14,76- 32,61]*
18,33 [16,59-26,42]*
19,03 [17,26-32,38]
27,39 [19,68-36,70]×
mDC / pDC arány
1,85 [0,44-1,46]
3,05 [2,32-
6,11]***
2,35 [1,80-
9,10] **, +
3,50 [1,74-
7,79]***
3,04 [2,03-
4,65]***
2,20 [1,66-
5,54]**, ×
DC-ben TLR-2
8,80 [4,14-17,35]
55,08 [37,27-
57,94]***
17,32 [6,32-
32,54]+
38,70 [19,31-
54,59]**, #
25,89 [5,69-60,43]
16,70 [2,29-
42,61]×
DC-ben TLR-4
2,24 [0,90-2,78]
14,36 [6,26-
19,20]**
2,73 [1,35- 7,21]++
10,11 [2,29-
19,55]*, #
5,31 [2,81-13,42]
3,32 [0,10-6,05]×
PBMC-ben monocita
2,01 [1,38-3,82]
8,57 [3,82-
16,72]**
5,96 [2,49-
21,22]*, +
7,30 [2,65-
15,44]*
5,58 [2,78-17,52]*
5,31 [3,54-6,94]*
Monocitában TLR-2
16,44 [10,31-19,69]
29,65 [17,83- 39,77]*
20,92 [7,87-
29,15]+
20,63 [7,05-29,01]
19,89 [13,13-29,32]
18,52 [10,29-28,96]
Monocitában TLR-4
7,17 [0,45-14,73]
14,59 [3,01-
35,23]*
4,43 [1,82- 8,31]+
10,39 [2,10-26,54]
8,26 [2,71-17,56]
6,30 [2,48-18,94]
Eredmények
62. oldal
13. ábra (ld. az előző oldalon) A veleszületett immunitás sejtes elemeinek prevalenciája Crohn
beteg gyermekekben (Whiskers box-plot: középvonal a medián, a doboz az interkvartilisek, a
bajusz a tartományt jelöli). A (A) természetes ölő T sejtek (NKT, CD3+6b11+), (B) természetes
ölő sejtek (NK, CD3-CD161+), (C) dendritikus sejtek (DC, Lin1-HLA-DR+), (D) monociták
(CD14+), (E) Toll-like receptor 2 expresszáló DC és (F) Toll-like receptor 4 expresszáló DC-k
prevalenciája. Statisztika: vs. kontroll: *p<0,05, **p<0,01; ***p<0,001; vs. kezeletlen: +p<0,05,
++p<0,01; vs. első remisszió: #p<0,05; vs. relapszus: ×p<0,05.
Azokban a gyermekekben, akik relapszusban maradtak a hagyományos terápia
ellenére, az immunsejt fenotípus sokban hasonlított a kezeletlen CD-s gyermekekben
mérthez. Így tehát az adaptív immunsejtek közül ezekben a betegekben alacsonyabb
Th1, magasabb aktivált T sejt prevalenciát figyeltünk meg. A veleszületett
immunfenotípus tekintetében a relapszusos betegekben a magasabb monocita
prevalencia valamint TLR-2 és 4 expresszió szintén a kezeletlen betegekéhez volt
hasonló. A relapszusban lévő betegekben az mDC-k, akárcsak a TLR-2 és 4-et
expresszáló DC-k aránya, magasabb volt a remissziókban lévőkhöz képest.
Az IFX kezelés hatását két időpontban határoztuk meg (2 és 6 héttel a terápia
kezdete után). Az adaptív sejtek közül a Th1, aktivált T, és Treg prevalencia emelkedett
6 hét után. A veleszületett immunitás elemei közül a DC, mDC, pDC, monocita és a
TLR-2 és 4-et expresszáló DC-k és monociták prevalenciája normalizálódott a kezelés
hatására. Megjegyzendő, hogy 2 hét kezelés után szignifikáns eltéréseket nem, de a fent
részletezettekhez hasonló tendenciákat figyeltünk meg.
Eredmények
63. oldal
6.2. Cöliákia
A frissen diagnosztizált cöliákiásokban az adaptív immunitás elemei közül
alacsonyabb volt a CD4 limfociták prevalenciája a kontrollokéhoz képest, míg
magasabb a korai (CD69+) és késői (HLA-DR+) aktivációs markert expresszáló CD4
sejteké. Továbbá a Th1 populáció aránya szintén kisebb volt a friss cöliákiásokban.
11. táblázat Az adaptív immunitás elemeinek prevalenciája és arányai cöliákiásokban. Az
adatok medián [interkvartilis tartomány] formátumban vannak megadva. Rövidítések: GFD:
gluténmentes diéta; PBMC: perifériás vér mononukleáris sejtek; Th1 (T helper 1 elkötelezett,
CXCR3+), Th2 (T helper 2 elkötelezett, CCR4+), naív (CD45RA+), effektor (CD45RO+), korai
aktivációs markerek (CD25+ és CD69+), késői aktivációs markerek (CD62L+ és HLA-DR+),
Treg (regulátoros T sejtek, CD25hiFoxP3+). Statisztika: vs. kontroll: *p<0,05, **p<0,01;
***p<0,001; vs. friss cöliákiások: #p<0,05.
sejt prevalencia a szülő populációban
kontroll friss
cöliákiások diétázó cöliákiások
(GFD) n (fiú/lány) 15 (6/9) 10 (4/6)
PBMC-ben CD4+ 32,93
[28,07-35,86] 13,21
[11,85-22,97]* 20,34
[12,15-30,70]*, #
PBMC-ben CD8+ 16,71
[14,34-20,55] 15,80
[9,70-26,11] 13,59
[9,40-20,27]
CD4+ / CD8+ arány 2,05
[1,84-2,36] 0,87
[0,36-1,30]** 1,47
[0,87-1,74]#
CD4+-ben Th1 27,96
[19,41-34,46] 13,71
[2,87-27,48]* 23,06
[3,94-33,00]#
CD4+-ben Th2 9,13
[7,49-13,17] 9,92
[7,22-24,01] 8,27
[4,74-15,58]
Th1 / Th2 arány 3,61
[2,07-4,09] 1,20
[0,30-1,67]*** 1,96
[1,30-2,78]#
CD4+-ben naív 71,60
[67,94-80,23] 71,20
[45,83-81,35] 71,80
[61,83-75,31]
CD4+-ben effektor 19,88
[13,59-31,79] 19,60
[12,66-41,08] 17,82
[12,89-32,65]
naív/effektor arány 3,98
[1,85-5,57] 3,63
[1,25-4,64] 3,81
[2,08-4,42]
CD4+-ben CD25+ 11,71
[9,03-14,68] 11,66
[7,42-14,10] 11,19
[4,56-16,83]
CD4+-ben CD69+ 1,87
[1,76-2,08] 3,14
[2,11-4,59]* 1,80
[0,76-4,80]#
CD4+-ben CD62L+ 24,84
[17,32-30,32] 5,28
[4,15-13,09]** 10,78
[2,40-22,90]*,#
CD4+-ben HLA-DR+ 2,57
[1,88-3,40] 5,05
[3,33-8,58]* 5,67
[2,90-22,17]*
CD4+-ben Treg 2,44
[1,86-3,55] 2,97
[2,38-4,70] 3,52
[2,85-5,58]
Eredmények
65. oldal
14. ábra (ld. az előző oldalon) Az adaptív immunitás sejtjei és korrelációi cöliákiásokban. Az
(A) T helper limfociták (Th, CD4+), (B) Th1 elkötelezett limfociták (CXCR3+), (C) Korai
aktivációs markert expresszáló Th limfociták (CD69+), (D) Késői aktivációs markert
expresszáló Th limfociták (HLA-DR+), (E) CD4+ regulátoros T sejtek (Treg, CD25hiFoxP3+),
(F) Korreláció a T citotoxikus sejtek prevalenciája (Tc, CD8+) és a transzglutamináz szint (TG,
IgA, U/l) között diétázó cöliákiásokban (GFD), (G) Korreláció a korai aktivációs markert
expresszáló limfociták és TG szint között GFD-ben (H) Korreláció a késői aktivációs markert
expresszáló limfociták és TG szint között GFD-ben. Statisztika: vs. kontroll: *p<0,05, **p<0,01;
***p<0,001; vs. friss cöliákiások: #p<0,05.
12. táblázat A veleszületett immunitás elemeinek prevalenciája és arányai cöliákiásokban. Az
adatok medián [interkvartilis tartomány] formátumban vannak megadva. Rövidítések: GFD:
gluténmentes diéta; PBMC: perifériás vér mononukleáris sejtek; NK (természetes ölő sejtek,
CD3-CD161+); NKT (természetes ölő T sejtek, CD3+CD161+), iNKT (invariáns természetes ölő
T sejtek, CD3+6b11+), DC (dendritikus sejtek, Lin1-HLA-DR+), mDC (mieloid dendritikus
sejtek, CD11c+), pDC (plazmocitoid dendritikus sejtek, CD123+); monociták (CD14+); TLR-2
(Toll-like receptor 2); TLR-4 (Toll-like receptor 4). Statisztika: vs. kontroll: *p<0,05, **p<0,01;
***p<0,001; vs. friss cöliákiások: #p<0,05, ##p<0,01.
sejt prevalencia a szülő populációban
kontroll friss
cöliákiások diétázó cöliákiások
(GFD) n (fiú/lány) 15 (6/9) 10 (4/6)
PBMC-ben NK 5,13
[3,62-7,79] 2,50
[0,96-3,96]** 2,49
[1,87-4,36]*
PBMC-ben NKT 2,18
[1,51-3,85] 0,89
[0,22-2,73]* 0,77
[0,38-2,27]*
PBMC-ben iNKT 0,61
[0,40-0,83] 0,40
[0,12-0,62]* 1,12
[0,57-1,37]*,##
PBMC-ben DC 1,49
[1,21-2,45] 4,37
[3,53-12,54]** 5,12
[3,58-7,36]*
PBMC-ben mDC 16,14
[11,25-24,27] 31,27
[17,83-41,61]* 19,00
[13,08-25,09]#
PBMC-ben pDC 11,61
[6,25-16,96] 7,91
[4,97-12,23] 3,95
[2,55-12,38]
mDC / pDC arány 1,72
[1,22-2,01] 3,94
[2,75-6,72]** 3,56
[1,61-5,20]
DC-ben TLR-2+ 3,99
[2,30-11,86] 27,10
[19,15-44,50]*** 24,32
[17,78-41,39]**
DC-ben TLR-4+ 2,90
[1,23-5,75] 9,08
[5,41-12,84]* 7,84
[4,10-9,13]
PBMC-ben monociták 1,69
[1,22-2,84] 2,65
[0,44-3,58] 2,33
[0,56-4,17]
monocitákban TLR-2+ 28,53
[23,93-31,85] 58,98
[50,05-70,16]*** 53,64
[35,41-64,25]*
monocitákban TLR-4+ 5,40
[2,90-19,85] 23,39
[14,54-30,77]* 13,04
[7,91-27,30]
Eredmények
67. oldal
15. ábra (ld. előző oldalon) A veleszületett immunitás sejtjei és korrelációi cöliákiásokban
(Whiskers box-plot: középvonal a medián, a doboz az interkvartilisek, a bajusz a tartományt
jelöli). Az (A) Invariáns természetes ölő sejtek (iNKT, CD3+6b11+), (B) Természetes ölő sejtek
(NK, CD3-CD161+), (C) Dendritikus sejtek (DC, Lin1-HLA-DR+), (D) Mieloid DC-k (mDC,
CD11c+), (E) Toll-like receptor (TLR) 2 expresszáló DC-k, (F) TLR-4 expresszáló DC-k, (G)
Korreláció a plazmocitoid DC-k (pDC, CD123+) és transzglutamináz szint (TG, IgA, U/l) között
diétázó cöliákiásokban (GFD), (H) Korreláció a TLR-2 expresszáló monociták (CD14+) és TG
szint között GFD-ben. Statisztika: vs. kontroll: *p<0,05, **p<0,01; ***p<0,001; vs. friss
cöliákiások: #p<0.05, ##p<0,01.
A frissen diagnosztizált, még nem diétázó cöliákiásokban a veleszületett
immunitás elemei közül az NK, NKT, iNKT prevalenciája alacsonyabb volt, a
kontrollokkal való összehasonlításkor. Másrészről azt tapasztaltuk, hogy DC-k, főleg az
mDC-k aránya magasabb volt a betegek egyénekben. Az APC-k TLR-2 és 4
expressziója szintén emelkedett volt a frissen diagnosztizált cöliákiásokban az
egészségesekhez képest.
A GFD-vel a tünetek megszűnte után az adaptív immunitás eltérései
normalizálódtak. A CD4 limfociták prevalenciája a Th1 elkötelezett sejtekkel együtt
emelkedett a diétázó cöliákiásokban. Mind a korai (CD69+), mind a késői (CD62L+)
aktivációs markert expresszáló limfociták prevalenciája pedig normalizálódott a
diétával.
Érdekes módon, a veleszületett immunitás sejtes elemeinek eltérései a diétázó
cöliákiásokban is megmaradtak, egyedül az APC-k TLR-4 expressziója
normalizálódott. Diétázó (GFD) gyermekekben a transzglutamináz (TG) IgA szintje, és
a CD8+, CD4+CD69+, CD4+HLA-DR+, pDC és TLR-2 expresszáló monociták
prevalenciája között fordított korreláció állt fönn.
Eredmények
68. oldal
6.3. Allergiás kolitisz
Az AC-s betegekben kezdetben alacsonyabb volt a Treg (CD4+FoxP3+)
prevalencia és ezzel összhangban az abszolút sejtszám, mint a kontroll egyénekben. Az
AC-s gyermekekben a naív/effektor (CD4+CD45RA+/CD4+CD45RO+) sejtek aránya
magasabb volt, és az aktivált (CD4+CD25+) sejteké alacsonyabb az egészségesekhez
viszonyítva. Megfigyeltük, hogy kezdetben alacsonyabb volt a beteg gyermekekben a
Th1/Th2 elkötelezett limfociták (CD4+CXCR3+/CD4+CXCR4+), és ezzel összhangban
az IFN-γ/IL-4 citokinek aránya is.
13. táblázat A perifériás vérsejt számok, limfocita populációk és citokinek prevalenciája és
arányai hematokéziás betegekben. Az adatok medián [tartomány] formátumban vannak
megadva. Rövidítések: AC: allergiás kolitisz; PBMC: perifériás vér mononukleáris sejtek.
Statisztika: kezdetben vs. kontroll: *p<0,05; kezdetben vs. tünetmentesen: #p<0,05.
AC beteg gyermekek kontrollok
kezdetben tünetmentesen n (fiú/lány) 10 (7/3) 10 (8/2)
életkor (hónap) 5
[1,5-12] 4,5
[1-6,5] 6
[2-10]
fehérvérsejtszám (G/l) 7,30
[6,10-9,60] 11,60
[8,50-17,00]* 11,05
[7,50-12,40]
limfocitaszám (%) 45,90
[24,90-63,10] 62,50
[24,70-75,50]* 63,60
[46,10-74,10]*
CD4+ / PBMC (%) 31,60
[3,20-58,82] 29,19
[8,52-51,10] 35,16
[2,63-57,90]
CD4+FOXP3+ / CD4+ (%) 5,29
[2,23-7,96] 2,52
[1,56-9,60]* 7,46
[1,67-14,67]#
CD4+FOXP3+ (G/l) 0,26
[0,08-0,38] 0,14
[0,09-0,58]* 0,49
[0,16-0,86]#
CD4+CD25hi / CD4+ (%) 6,04
[2,10-8,33] 2,73
[0,89-4,12]* 7,93
[1,30-10,70]# CD4CXCR3+ / CD4CCR4+ (arány)
2,93 [1,00-5,42]
0,77 [0,42-3,80]*
0,85 [0,56-2,90]
IFN-γ / IL-4 (arány) 10,90
[9,40-20,43] 8,98
[8,24-9,59]* 10,19
[7,91-10,84] CD4+CD45RA+ / CD4+CD45RO+ (arány)
3,54 [1,18-6,17]
13,60 [1,12-29,49]*
10,00 [2,71-27,41]
CD4+CD25+ / CD4+ (%) 10,03
[4,83-21,24] 4,23
[1,89-10,38]* 8,83
[2,60-14,67]
CD4+CD62L+ / CD4+ (%) 7,84
[0,35-9,28] 4,10
[0,93-9,35] 6,84
[0,97-11,44]
Eredmények
69. oldal
16. ábra Az immunfenotípus változása hematokéziás gyermekekben (Whiskers box-plot:
középvonal a medián, a doboz az interkvartilisek, a bajusz a tartományt jelöli). Az (A)
Regulátoros T sejtek (CD4+Foxp3+) sejtek prevalenciája, (B) Th1/Th2 elkötelezett
(CD4CXCR3+/CD4CCR4+), (C) Naív/effektor (CD4+CD45RA+/CD4+CD45RO+) limfociták
aránya. Statisztika: kezdetben vs. kontroll: *p<0,05; kezdetben vs. tünetmentesen: #p<0,05.
A vizsgálat második felében az immunfenotípus változását az AC-s tünetek
megszűntével is meghatároztuk. Tünetmentes csecsemőkbe a Treg sejtek prevalenciája
normális szintre emelkedett. Bár a többi vizsgált sejtcsoport szignifikánsan nem
változott a kezdetben mérttől, de a Th1/Th2 elkötelezett sejtek és citokinek aránya
ekkor már nem különbözött a kontrollokéhoz képest.
Megbeszélés
70. oldal
7. Megbeszélés
7.1. Crohn betegség
Vizsgálatunk során a terápia naív, frissen diagnosztizált CD-s gyermekekben az
adaptív immunitás elemei közül a perifériás CD4+ sejtek prevalenciája nem különbözött
a kontrolloktól, hasonlóan a korábban felnőttekben leírtakhoz. [147,148] Ugyanakkor a
Th1/Th2 arány Th2 irányba tolódott el, hasonlóan mások által frissen diagnosztizált
gyermekek perifériás vérében [27,28,30], és biopsziás mintáiban találtakhoz [29]. A
felnőttkori eltérésekhez hasonlóan az aktivált CD4+ sejtek magasabb arányát, és ezzel
együtt az effektor/naív sejt hányados csökkenését lehetett megfigyelni. [14-18] Azt a
feltételezést, hogy ez az eltérés az alacsonyabb Treg számból adódik, nem lehetett
megerősíteni, mivel a FoxP3+ sejtek prevalenciája nem tért el a normálistól. Ez
ellentétben áll a terápia naív felnőttekben leírtakkal, ahol Treg szám csökkenést
figyeltek meg. [10] A különbség az életkori sajátosságok mellett abból adódhatott, hogy
a vizsgálatban a Treg sejtek nem CD25hi expresszió alapján, hanem a sokkal
specifikusabb FoxP3+ transzkripciós faktor révén lettek azonosítva.
Az eredményeink új adatokkal szolgáltak arról, hogy a veleszületett immunitás
milyen szerepet játszik a terápia naív CD-s gyermekekben leírt Th2 eltolódásban. Míg
néhány előző közlemény leírta, hogy a felnőttkori CD patomechanizmusában az NK és
NKT sejteknek szerepe lehet [19,66,149,150], addig adataink bizonyítják, hogy CD-s
gyermekekben az egészségeshez képest alacsonyabb az NK és NKT prevalencia. Ezzel
együtt az APC-k, így a monociták és DC-k prevalenciájának és az mDC/pDC arányának
a növekedése is megfigyelhető volt. Ezek a sejtek az immunválasz elindítói, és ezzel az
effektor vagy memória sejtek arányának a növekedéséhez járulhatnak hozzá. Ahogy a
legújabb adatok bizonyítják, az mDC és pDC szubpopulációknak sajátos szabályozó
szerepük van, mivel az mDC sejtek a citokin miliőtől függően az immunválaszt nem
csak Th1, hanem Th2 irányba is befolyásolhatják. [151] A pDC-knek ezzel szemben a
Treg sejtek indukciójában tulajdonítanak újabban nagyobb szerepet. [152] Így az
mDC/pDC arány növekedése hozzájárulhat a betegekben az alacsonyabb Th1/Th2
arányhoz. Továbbá az eredményeink alapján a TLR-2 és TLR-4 immunaktivációban
szerepet játszó markereket expresszáló monociták és DC-k prevalenciája is
Megbeszélés
71. oldal
megnövekedett frissen diagnosztizált beteg gyermekekben az egészséges kontrollokhoz
képest. Ez a megfigyelés összhangban van a munkacsoportunk által korábban terápia
naív CD-s gyermekek biopsziás mintáiban leírt magasabb TLR-2 és TLR-4
expresszióval. [32]
Vizsgálatunkban prospektíven került meghatározásra a betegség aktivitásának- és
immunfenotípusának a változása is. A hagyományos terápiára reagáló betegekben az
első remisszió alkalmával az adaptív immunsejt prevalenciák nagy része a PCDAI-vel
együtt normalizálódott. A Th1 prevalencia megnőtt a terápia naívokhoz képest és a
Th1/Th2 aránnyal együtt normalizálódott az első remisszió alkalmával, ezzel mutatván
különbséget a felnőttkori immunfenotípushoz viszonyítva. [6-9]
Remisszióban a veleszületett immunválaszt szabályozó NK és NKT sejtek aránya
megnövekedett, és a terápia naívokban a kontrollokéhoz képest mért eltérés eltűnt.
Ezzel szemben felnőttkori kezelt CD-ben az NK és NKT prevalenciáját korábban
alacsonyabbnak találták. [19,66,149,150] Mindemellett megállapítható, hogy az
mDC/pDC arány, és a TLR-2 és TLR-4-et expresszáló monociták és DC-k prevalenciája
normalizálódott a remisszió során. Gyermekekben ezek alapján a PCDAI csökkenésével
az immuneltérések nagy része normalizálódik. Ez eltérő a felnőttekben számos helyen
leírtakkal, a CD betegek idősebb populációjában ugyanis az aktivált és effektor T sejtek
prevalenciája magasabb marad a kezelés ellenére. [14-17,19,89] A Treg sejtek
feltehetően nem játszanak szerepet ebben a normalizációban, ugyanis prevalenciájuk
változatlan maradt a remisszióban.
Másik prospektív vizsgálatunkba tizenkét relapszusban lévő, a hagyományos
kezelésre nem reagáló CD-s gyermeket vontunk be, és kezeltünk IFX-el. Ezekben a
betegekben a szerzett és a természetes immunitás fenotípusa hasonló volt a kezelésben
nem részesültekéhez (leszámítva a normális NK és NKT arányokat).
Az IFX terápia során ugyanakkor a 6. héten markáns eltérések voltak a
relapszusos állapothoz képest, a Th1 és APC-k prevalenciája normalizálódott. Az
adaptív immunitás elemei közül érdekes módon, az aktivált T sejtek, memória sejtek, és
Treg-ek prevalenciája tovább emelkedett az IFX kezelés hatására. A Th1 elkötelezett
sejtek és citokinek arányának növekedését reumatoid arthritiszes betegekben már leírták
Megbeszélés
72. oldal
IFX kezelés hatására. [37,38] Mások szintén megfigyelték, hogy az IFX növeli az
aktivált és effektor T sejtek prevalenciáját. [36,37] Bár ennek a folyamatnak a pontos
magyarázata még nem ismert, de egy újabb feltételezés szerint az IFX gátolja a Th1 és
aktivált T sejtek vándorlását a gyulladásos területekre, ezáltal azok felszaporodnak a
perifériás vérben. [37,38] Elméletileg ez az immunfenotípus a fertőzések iránti
fogékonyságot növelheti. Ugyanakkor azt tapasztaltuk, hogy betegeink az IFX kezelés
alatt nem mutatták infekciók klinikai- és laboratóriumi jeleit. Érdekes módon, az IFX
kezelés a Treg számot is növelte a vizsgált betegekben. Ez a jelenség, aminek
feltehetően a magyarázata az, hogy a Treg sejtek ellenállóbbak az IFX indukálta
apoptózissal szemben, már ismert volt felnőtt CD betegek perifériás [10] és gyermekek
biopsziás mintáiban [35].
A veleszületett immunitás sejtes elemeinek, így a monocitáknak, mDC-knek,
TLR-2 és TLR-4-et expresszáló DC-knek a prevalenciája és az mDC/pDC sejteknek az
aránya normalizálódott az IFX kezeléssel. Az IFX kezelés természetes immunitásra
gyakorolt hatását korábban már RA-s és CD-s betegekben is felvetették. [39,41,42,153]
Megbeszélés
73. oldal
17. ábra Összefoglaló ábra a Crohn beteg gyermekekben talált perifériás immunfenotípus
változásokról. Kezeletlen CD betegekben az aktivált és effektor T sejtek prevalenciája
magasabb, míg a T helper 1 sejteké alacsonyabb. Hagyományos kezelés hatására mind az
aktivált és az effektor T sejtek aránya csökkent, mind pedig a T helper 1 sejtek aránya
emelkedett a kontroll értékek felé. Infliximab kezelés hatására a Th1 sejtek aránya szintén
emelkedett a normál szintre, de az effektor sejtek aránya is emelkedett tovább. A természetes ölő
és ölő T sejtek prevalenciája alacsonyabb betegekben, mint egészségesekben. A dendritikus
sejtek és monociták prevalenciája emelkedett kezeletlen betegekben, de mind a hagyományos,
mind pedig az infliximab kezelés hatására normalizálódik. Ugyanígy az emelkedett Toll-like
receptor expresszió is csökken a CD betegekben kezelés hatására. (A fehér nyíl a kezeletlen
betegekben talált eltéréseket mutatja az egészségesekhez képest, míg a szürke nyíl a
hagyományos vagy infliximab kezelés hatására bekövetkező hatásokat mutatja a kezeletlen vagy
a relapszusban találtakhoz képest.)
Megbeszélés
74. oldal
Eredményeink értékelése során nem szabad figyelmen kívül hagyni a korlátokat:
(1) Bár a párosított vizsgálatok korrekciót jelentettek az összehasonlítások számára, de a
többszörös összehasonlításokból eredendően megnövekedhetett az elsőfajú hiba aránya,
így a szignifikáns eredmények gyakorisága. (2) Perifériás immunsejt prevalenciákat
mértünk, amelyek nem feltétlenül tükrözik az intesztinális fenotípust. (3) Vizsgálatunk
során kapott immunológiai eltérések befolyásolhatták a betegpopuláció életkori
változásaiból eredő immunfenotípus-változások. Valamint az utánkövetés rövid
időtartama (10 hónap az első remisszióig, és 6 hét az IFX terápiáig) ezt a
hibalehetőséget minimálissá teszi.
A CD számos adaptív (csökkent Th1, emelkedett effektor és aktivált T sejt
prevalencia), és veleszületett (emelkedett DC, monocita és TLR-2, 4 expresszió)
immuneltéréssel járt. Ezeknek az adaptív és veleszületett immunfenotípus eltéréseknek
a nagy része a klinikai tünetek javulásával normalizálódott a hagyományos terápiára
reagálókban az első remisszió alkalmával, míg a hagyományos terápiára nem reagáló
relapszusban lévőkben az IFX kezelés hatására. Ezek a változások felvetik annak a
lehetőségét, hogy a gyermekkori CD-ben az immunfenotípus változások
összefüggésben állnak a betegség aktivitással.
7.2. Cöliákia
Frissen diagnosztizált cöliákiás gyermekekben számos eltérést figyeltünk meg az
adaptív immunitás sejtes elemei között. A CD4+ limfociták prevalenciája alacsonyabb
volt, a felnőttkori friss cöliákiás betegekhez hasonlóan. [53] Továbbá, a Th1/Th2
hányados csökkent a friss betegekben, hasonlóan a korábban leírtakhoz. [154] Ezek a
perifériás immunfenotípus változások eltérőek a biopsziás mintákban megfigyeltekkel,
amikben mások emelkedett limfocita és Th1 sejtszámot írtak le. [54,155] Előbbiek
alapján feltételezhető, hogy a perifériás csökkent sejtszám abból adódik, hogy az érintett
sejtpopuláció felszaporodik a mukozális kompartmentben. [156,157] Míg a
naív/memória sejtek aránya megegyezett a kontrollokéval, szemben a mások által
leírtakkal [56], addig az aktivált sejtek prevalenciája eltérő volt, attól függően, hogy
milyen aktivációs markert expresszáltak. A CD69 korai aktivációs marker expressziója
emelkedett és a késői aktivációs marker CD62L-t expresszáló limfociták aránya
Megbeszélés
75. oldal
alacsonyabb volt, megegyezően a korábban leírtakkal. [158,53,55,58] A CD25+ T
helper sejtek prevalenciája ugyanakkor megegyezett a vizsgált csoportokban,
ellentétben azzal, amit felnőttekben tapasztaltak. [53,55,57] Az aktivált limfociták
eltérései alátámasztják a szisztémás gyulladás jelenlétét cöliákiás kezeletlen betegekben,
és felvetik az adaptív immunitás szerepét. Eredményeink a felnőttekben találtakhoz
hasonlatosak, és azt mutatják, hogy a lokális immunmiliő és a perifériás
immunfenotípus között eltérések lehetnek. [156,157] Megjegyzendő, hogy vizsgálatunk
a FoxP3-at expresszáló Treg-ek perifériás prevalenciájában nem talált eltérést. Az eddig
gyermekekben ismert adatok ellentmondásosak, mivel nemrégiben nem találtak eltérést
a FoxP3+ Treg-ek számában [61], míg mások a CD4+CD25hi Treg-ek számának
csökkenését írták le [159]. Korábbi vizsgálatok alapján felnőttekben a FoxP3+ Treg
szám magasabbnak bizonyult. [160]
A frissen diagnosztizált, még nem diétázó cöliákiás gyermekekben a természetes
immunitás eltéréseit is leírtuk. Az egészségesekhez képest alacsonyabb NK, NKT,
iNKT prevalenciát tapasztaltunk, hasonlóan a mások által megfigyeltekkel. [53,65-67]
Az eddig ismertektől eltérően magasabb perifériás DC, és különösen mDC prevalencia
volt jellemző a betegekre. [68,161] Bár az mDC és Th1 prevalenciák között nem volt
összefüggés, de feltételezik, hogy az mDC-k hozzájárulhatnak a Th1/Th2 arány
megváltozásához. Nemrégiben az mDC-k által Th2 irányban történő differenciálódást is
leírták. [151] Másik fontos újdonság, hogy az APC-k általi TLR-2 és TLR-4 expresszió
fokozódását periférián is igazolni lehetett a cöliákiás betegekben, összhangban a
részben munkacsoportunktól származó korábbi biopsziás eredményekkel. [59,65,69]
Mivel a TLR-ek átmenetileg expresszálódnak aktiváció hatására, a fokozott
expressziójuk az APC-k folyamatos aktivációját bizonyítja, és így az adaptív
immunválasz fokozódásához is vezethetnek az aktivált CD4+ sejtek magasabb
prevalenciája révén.
Vizsgálatunk második részében a GFD hatása prospektíven az immunfenotípus
változását jellemeztük. A klinikai tünetek megszűntével, a TG szint minimálisra
csökkenésekor az adaptív immunsejtek közül a CD4, Th1, és az aktivált limfociták nagy
része, szintén normalizálódott. Érdekes módon, még a GFD diéta után is volt
összefüggés a TG valamint a CD8+, CD4+CD69+, és CD4+HLADR+ prevalenciák
Megbeszélés
76. oldal
között, ami alapján feltételezhető az immunrendszer kóros működése még GFD idején
is. [159,160] Az adaptív immunitás normalizációját már részben leírták, de nem
követéses vizsgálatokban, hanem eltérő egyénekből álló diéta előtti és diétázó
betegcsoportokban. [53,61,160] Eredményeink követéses vizsgálatból származtak, és
így az életkor változása befolyásolhatta az immunitás eltéréseit is. [162-164]
Ugyanakkor a 3 hónapos időtartam minimalizálhatja az ebből eredő hiba lehetőségét.
Érdekes módon a diétával járó adaptív immunváltozások nem jártak együtt a
veleszületett immunitás normalizálódásával. Az NK, NKT prevalencia csökkent, míg a
DC, TLR-2 és TLR-4-et expresszáló APC-k aránya emelkedett maradt. Ezzel együtt az
emelkedett TLR-2 és TLR-4-et expresszáló sejtek száma korrelált a maradék TG
szinttel, felvetve ezzel, hogy a tünetek megszűntével a veleszületett immunitás eltérései
továbbra is fennállhatnak. Ezek alapján a veleszületett immunitás dinamikájában eltérő
módon változik a GFD hatására, normalizációja lassabb lehet, szemben az adaptív
immunitáséval. Ezt a gondolatmenetet támasztja alá, hogy újonnan kórismézett
cöliákiásokban a γδT sejtek száma a diéta hatására nem normalizálódik [59], annak
ellenére, hogy GFD következtében megszűnik a boholyatrófia, normalizálódik a
korábban magas IEL szubpopulációk aránya, valamint a kóros Th1 citokinek
mennyisége. Ezzel összhangban, munkacsoportunk korábbi vizsgálataiban az újonnan
kórismézett cöliákiások mukozális biopsziás mintáiban a TLR-2 és TLR-4 fokozott
expressziója volt kimutatható, de meglepő módon ezek az eltérések a GFD után sem
normalizálódtak. [69] Mivel a γδT sejtek és a TLR-ek fontos szerepet töltenek be a
természetes immunitásban, feltételezhető, hogy cöliákiában a kezdeti noxa tartós
változásokat rögzíthet a veleszületett immunitás egyes elemeiben.
Megbeszélés
77. oldal
18. ábra Összefoglaló ábra a cöliákiás gyermekekben talált perifériás immunfenotípus
változásokról. Kezeletlen cöliákiásokban csökkent a CD4 limfociták prevalenciája, és
gluténmentes diéta hatására emelkedett. Ezzel egyidejúleg csökkent a T helper 1 elkötelezett
limfociták aránya, de emelkedett kezelés hatására. A korai aktivációs markert expresszáló CD4
sejtek prevalenciája magasabb, míg a későit expresszáló sejteké alacsonyabb, de közel
normalizálódik a kezeléssel. A természetes ölő és ölő T sejtek aránya alacsonyabb, és a kezelés
hatására csak az invariáns ölő T sejteké emelkedik. Ugyanígy az emelkedett dendritikus sejt, és
Toll-like receptor expresszió sem változik a kezelés hatására. (A fehér nyíl a kezeletlen
betegekben talált eltéréseket mutatja az egészségesekhez képest, míg a szürke nyíl a
gluténmentes kezelés hatására bekövetkező hatásokat mutatja a kezeletlen betegekhez képest.)
Összefoglalva, a gyermekkori cöliákiában mind az adaptív, mind a veleszületett
immunitás kóros fenotípusa jelen van. Az adaptív immunitás eltérései a GFD hatására
döntően normalizálódnak, de a természetes immunitás zavarai a tünetek megszűntével is
fennállhatnak.
Megbeszélés
78. oldal
7.3. Allergiás kolitisz
A vizsgálatunkban bebizonyítottuk, hogy az AC (1) alacsonyabb Treg
prevalenciával, (2) a naív/memória sejtek arányának megnövekedésével, (3) az aktivált
T sejtek csökkenésével, és (4) a CD4+ limfociták Th2 irányába való eltolódásával jár.
Az AC tüneteinek megszűntével ezek az eltérések normalizálódtak. Ezek alapján
felvetődik annak a lehetősége, hogy a betegség hátterében az immunműködés zavara
állhat.
Az AC patomechanizmusa mind a mai napig nem ismert. [165] Korai vizsgálatok
AC-s gyermekekben a vastagbél epitéliumában a T sejtek megnövekedett számát [166],
és immunglobulin deficienciát [167] írtak le. A HC általában megszűnik az anyatejes
csecsemők esetében, amennyiben az édesanya elhagyja étrendéből a tehéntejet.
Ugyanakkor a legújabb vizsgálatok szerint a HC-s esetek majd 82%-a nem tehéntej
allergia, hanem más ételallergia miatt alakul ki. [72] Bár ezek alapján felmerül az
ételallergia jelentősége HC-s betegekben, egy friss tanulmány szerint az ételallergia
szűrővizsgálatok és a specifikus nutritív IgE mérések érdemben nem javítják a
diagnosztikus lehetőségeket. [72]
A mi vizsgálatunkban egyik gyermeknek sem volt tehéntej-allergiája, míg mind a
jellegzetes makroszkópikus (LNH, aftás lézió), és mikroszkópikus (eozinofília) leletek,
mind pedig az elementáris tápszerre adott pozitív reakció alátámasztotta az AC
diagnózisát. Olyan HC-s betegek kerültek bevonásra, akikben a tünetek egy hónap után
is fennálltak. Ezek alapján ki lehetett zárni az akut fertőzés, fisszúra lehetőségét,
endoszkópiával pedig a HC-val járó egyéb ritka okokat is.
Számos adat utal arra, hogy a Treg-eknek fontos szerepük lehet mind a
gyermekkori, mind pedig a felnőttkori ételallergia kialakulásában. [76] (Karlsson 2004)
Adataink szerint azonban az alacsonyabb Treg (CD4+FoxP3+) prevalencia mellett a
korai és késő aktiváció markereket (CD25+ és CD62L+) expresszáló, valamint az
effektor vagy memória sejtek (CD45RO+) aránya nem magasabb AC-s gyermekekben.
Ez az eltérés ellentmond annak, hogy a Treg sejtek az aktivált limfociták számát és
működését befolyásolnák. Az általunk megfigyelt immunfenotípus-eltérés ugyanakkor
jól beleillik a higiénia hipotézis kereteibe. [168] Valóban, a mikrobiális antigének jól
Megbeszélés
79. oldal
ismert indukálói a Treg differenciálódásnak, valamint a memória sejtek és T limfocita
aktivációnak. AC-s betegekben a Treg prevalenciának a memória és aktivált T sejtek
számával együtt való csökkenése az adaptív immunitás éretlenségét, a szuboptimális
antigén expozíció lehetőségét veti fel. [74] Ez az immunmechanizmus járulhat hozzá az
ugyancsak megfigyelt Th1/Th2 arány csökkenéséhez.
Elmondható, hogy újabb vizsgálatok alapján a gasztrointesztinális flóra és
bizonyos probiotikus baktériumoknak az ételallergiákban kifejtett jótékony hatása
részben a Treg indukció révén valósul meg. [169,170] A Lactobacillus reuteri és
Lactobacillus casei által indukált APC-k a Treg sejtek generációjához vezethetnek
[169], míg a szájon át adott probiotikumok egyértelműen a Treg szám növekedésével
járnak [170].
Az eredményeinek értékelése során figyelembe kell venni az alábbi korlátokat: (1)
A Treg sejteket a FoxP3 expresszió alapján azonosítottuk, ami a ma legelfogadottabb
markere ennek a sejtpopulációnak, és más meghatározási móddal ellentétben jól
reprodukálható. Ismert azonban, hogy létezhetnek FoxP3- Treg sejtek is. [171] (2) A
Treg célsejtek számának változásaiból indirekt módon lehet következtetni a Treg sejtek
megváltozott működésére, de direkt funkcionális vizsgálatokkal ezt meg kell erősíteni.
(3) Perifériás Treg prevalencia lett mérve, ezért a szisztémás immunváltozások kerültek
leírásra, ami bizonyos esetekben nem egyértelműen tükrözi a centrális eloszlást, vagy
akár azzal ellentétesen is alakulhat. [6] (4) Egyszerre volt jelen a Treg prevalencia
növekedése és a Th1/Th2 arány normalizálódása, de nem egyértelmű, hogy ok-okozati
összefüggéseiben melyik folyamat felelős a másikért. (5) A vizsgált betegek alacsony
száma a legfőbb korlátozó tényező, ezért a kapott eredmények további vizsgálatok
szükségességét hangsúlyozzák.
Amennyiben az AC valóban az ételallergia egy korai formájának bizonyul, és a
kialakulásában a higiénia hipotézis érvényesül, akkor a csecsemők antigén expozíciója
(orális vakcinákkal vagy probiotikumokkal) segíthetne a betegség kezelésében.
Megbeszélés
80. oldal
19. ábra Összefoglaló ábra a hematokéziás gyermekekben talált perifériás immunfenotípus
változásokról. A kezeletlen betegekben a regulátoros T sejtek, az aktivált, effektor és T helper 1
limfociták prevalenciája alacsonyabb volt. Tünetmentesen a regulátoros T sejtek prevalenciája
és T helper sejtek aránya normalizálódott. (A fehér nyíl a kezeletlen betegekben talált
eltéréseket mutatja az egészségesekhez képest, míg a szürke nyíl az elementáris tápszerre való
áttérés utáni tünetmentes állapotban bekövetkező változásokat a kezeletlen betegekhez
viszonyítva.)
Következtetések
81. oldal
8. Következtetések
(1) A frissen diagnosztizált Crohn beteg gyermekekben mind az adaptív, mind a
veleszületett immunitásért felelős sejtek prevalenciája jellegzetes eltéréseket mutat. A
Th1/Th2 arány Th2 irányba eltolódik, az effektor T sejtek, és aktivációs markereket
hordozó T limfociták prevalenciája magasabb. Az antigén prezentáló DC és monocita
sejtek, valamint a Toll-like receptor expressziójuk emelkedik a kezeletlen betegekben.
(2) A hagyományos terápiával kezelt Crohn betegekben az észlelt adaptív és
veleszületett immunfenotípus eltérések az első remisszió alkalmával a klinikai tünetek
javulásával normalizálódnak. Ugyanakkor a hagyományos terápiára nem reagáló
relapszusban lévőkben ezek az eltérések részben továbbra is fennállnak, és a
hagyományos terápiára remisszióba kerültekhez képest fokozódik az mDC prevalencia
és TLR expresszió.
(3) A hagyományos terápiára nem reagáló Crohn beteg gyermekekben az adaptív
és veleszületett immunitás elemei normalizálódnak az infliximab kezelés hatására. Az
infliximab kezelés ugyanakkor az adaptív immunitás elemei közül tovább fokozza az
effektor limfociták, T-helper 1 és regulátoros T sejtek prevalenciáját.
(4) A gyermekkori frissen diagnosztizált cöliákiában mind az adaptív, mind a
veleszületett immunitás fenotípusa eltér az egészségesétől. Az összes CD4, illetve Th1
sejtek prevalenciája csökken, míg ezzel egyidőben a korai aktivációs markert
expresszáló T sejtek aránya emelkedik, a késői sejteké pedig csökken. A természetes ölő
sejtek prevalenciája alacsonyabb, míg a DC és monocita sejtek, valamint ezek Toll-like
receptor expressziója magasabb a kezeletlen betegekben.
(5) Az adaptív immunitás eltérései, így a Th1 irányú eltolódás és az aktivált sejtek
aránya gluténmentes diéta hatására cöliákiás gyermekekben döntően normalizálódik, de
a természetes immunitás zavarai, az antigén prezentáló DC és monociták magasabb
prevalenciája a tünetek megszűntével is fennállnak.
Következtetések
82. oldal
(6) Allergiás kolitiszes csecsemőkben az elementáris tápszerre való áttérés előtt
kezdetben alacsonyabb regulátoros T sejt, T helper 1, effektor és aktivált limfocita
prevalencia figyelhető meg.
(7) Allergiás kolitiszes csecsemőkben a hematokézia megszűntével a regulátoros
T sejtek prevalenciája normalizálódik, valamint eltűnik a Th1/Th2 arányban mért
eltolódás is.
Összefoglalás
83. oldal
9. Összefoglalás
9.1. Összefoglaló
Bevezetés: A csecsemő- és gyermekkort érintő gasztrointesztinális kórképek közül
a Crohn betegséget, cöliákiát és allergiás kolitiszt vizsgáltuk. Mindhárom kórkép
immunmediálta megbetegedés, amelyeknek azonban pontos immunmechanizmusa nem
ismert. Mind az adaptív, mind a veleszületett immunitás sejtes elemei érintettek
lehetnek a betegségek kialakulásában, központi szerepben az egyik legfőbb szabályozó
sejtcsoporttal, a regulátoros T sejtekkel.
Célkitűzés: Olyan kis mintaigényű áramlási citométeres módszert kívántunk
kidolgozni, amely alkalmas a regulátoros T sejtek és sejtes környezetük vizsgálatára kis
mennyiségű perifériás vérmintából. Ezzel a módszerrel kívántuk jellemezni a csecsemő-
és gyermekkori gasztrointesztinális megbetegedéseket érintő immunfenotípus
változásokat.
Eredmények: Frissen diagnosztizált Crohn beteg gyermekekben a T helper 1
sejtek aránya csökken, és az aktivált és effektor T sejtek prevalenciája emelkedik.
Hagyományos kezelés hatására mind az aktivált és az effektor T sejtek aránya kisebb,
mind pedig a T helper 1 sejtek aránya nagyobb. Infliximab kezelés hatására a T helper 1
sejtek aránya szintén a normál szintre emelkedik, de az effektor sejtek aránya is tovább
emelkedik. A természetes ölő és ölő T sejtek prevalenciája alacsonyabb a betegekben,
mint az egészségesekben. A dendritikus sejtek és monociták prevalenciája magasabb
kezeletlen betegekben, de mind a hagyományos, mind pedig az infliximab kezelés
hatására ez normalizálódik. Ugyanígy Crohn betegekben, kezelés hatására az
emelkedett Toll-like receptor expresszió is lecsökken.
Kezeletlen cöliákiásokban csökken a CD4 limfociták prevalenciája, míg
gluténmentes diéta hatására emelkedik. Csökken a T helper 1 elkötelezett limfociták
aránya is, de emelkedik kezelés hatására. A korai aktivációs markert expresszáló CD4
sejtek prevalenciája megnő, míg a későit expresszáló sejteké lecsökken, de közel
normalizálódik a kezeléssel. Ugyanakkor a természetes ölő és ölő T sejtek aránya
alacsonyabb, de a kezelés hatására csak az invariáns ölő T sejteké emelkedik. Az
Összefoglalás
84. oldal
emelkedett dendritikus sejt, és Toll-like receptor expresszió sem változik a kezelés
hatására.
Az allergiás kolitiszes csecsemőkben az elementáris tápszerre való áttérés előtt
kezdetben alacsonyabb regulátoros T sejt, T helper 1, effektor és aktivált limfocita
prevalencia figyelhető meg Tünetmentes állapotban a hematokézia megszűntével a
regulátoros T sejtek prevalenciája és T helper sejtek aránya normalizálódik.
Következtetések A frissen diagnosztizált Crohn beteg gyermekekben a
felnőttekétől eltérő immunfenotípus eltérések vannak jelen. Az adaptív és veleszületett
immunitást is érintő eltérések a remisszióba kerültekben a hagyományos kezelés
hatására többnyire normalizálódnak, míg a relapszusban lévőkben csak infliximab
kezelés hatására változnak.
A még diétában nem részesült cöliákiás gyermekekben mind az adaptív, mind a
veleszületett immunitás fokozott aktivációja megfigyelhető. Gluténmentes diéta
hatására az adaptív immunitás sejtes elemei normalizálódnak, míg a veleszületett
immunsejtek eltérései továbbra is fennmaradnak.
Az allergiás kolitisz tüneteként jelentkező hematokézia csecsemőkben elementáris
tápszerre való váltással minden esetben megszűnik. A kezeletlen állapotban jelen lévő
allergiás típusú immunfenotípus az immunrendszer éretlenségére utal.
Összefoglalás
85. oldal
9.2. Summary
Background: Gastrointestinal diseases affecting the childhood such as Crohn’s
disease, celiac disease and allergic colitis were investigated. The pathomechanism of
these immunmediated diseases is not fully known. However, both the innate and
adaptive immunity including regulatory T cells, the main suppressor cell type can be
involved .
Aim: To develop a flow cytometry procedure to investigate the regulatory T cells
along with their cellular network in small children. To characterize immune phenotype
in pediatric gastrointestinal disorders.
Results: In newly diagnosed children with Crohn’s disease the prevalence of T
helper 1, activated and effector T cells increased. With conventional therapy the
prevalence of activated and effector T cells decreased, while that of T helper 1
increased. Infliximab therapy also normalized the T helper 2 shifts, but increased the
prevalence of effector cells. Natural killer and natural killer T cells were lower in
patients than in controls. The prevalence of dendritic cells and monocytes, particularly
of those expressing Toll-like receptor are increased in therapy-naïve patients, but
normalized with the conventional and biological therapy.
Untreated celiac patients had lower than normal CD4 lymphocyte prevalence and
T helper 1 ratio; these values increased with gluten-free diet. The prevalence of T
lymphocytes expressing early activation markers is increased, while that of expressing
late activation markers are decreased. These abnormalities were normalized in patients
on diet. In untreated celiac disease the numbers of natural killer and natural killer T cells
are decreased; on therapy just the prevalence of invariant natural killer T cells is
increased. The prevalence of antigen presenting dendritic cells including those
expressing Toll-like receptors is increased in children with celiac disease.
Allergic colitis presents with lower prevalence of regulatory T cells, and that of
activated, effector and T helper 1 lymphocytes. After the cessation of symptoms the
prevalence of regulatory T cells and T helper shift normalized.
Összefoglalás
86. oldal
Conclusions: The adaptive immune phenotype of children with newly diagnosed
Crohn’s disease is different than in adulthood. The alterations of cell prevalence values
of innate and adaptive immunity are ameliorated with conventional therapy, but in non-
responding patients only infliximab therapy had an impact on immune phenotype.
In untreated celiac patients the activation of innate and adaptive immune cells
were detected. On gluten-free diet, the prevalence of cells responsible for adaptive
immunity is normalized, but that of innate immune cells remained unaltered.
Allergic colitis leading in hematochezia responds to elementary formula. In
untreated patients immune phenotype resembles to that observed in allergic disorders.
Irodalomjegyzék
87. oldal
10. Irodalomjegyzék
1. Fábián P, Magasi P. Orvosi helyesírási szótár. Akadémiai Kiadó 1992.
2. Dubinsky M. Special issues in pediatric inflammatory bowel disease. World J
Gastroenterol. 2008;14:413-20.
3. Nieuwenhuis EE, Escher JC. Early onset IBD: what’s the difference? Dig Liver Dis.
2008;40:12-5.
4. Veres G. és a Magyar Gyermek IBD-regiszter részvevői: A magyarországi
gyermekkori gyulladásos bélbetegségek (IBD) regiszterének első éves (2007)
elemzése. Gyermekgyógyászat. 2008;59:282–287.
5. Shaoul R, Karban A, Reif S, Weiss B, Shamir R, Tamir A, Davidovich O, Halevi J,
Silver EL, Levine A. Disease behavior in children with Crohn's disease: the effect
of disease duration, ethnicity, genotype, and phenotype. Dig Dis Sci. 2009;54:142-
50.
6. Himmel ME, Hardenberg G, Piccirillo CA, Steiner TS, Levings MK. The role of T-
regulatory cells and Toll-like receptors in the pathogenesis of human
inflammatory bowel disease. Immunology. 2008;125:145-53.
7. Zenewicz LA, Antov A, Flavell RA. CD4 T-cell differentiation and inflammatory
bowel disease. Trends Mol Med. 2009;15:199-207.
8. van Lierop PP, Samsom JN, Escher JC, Nieuwenhuis EE. Role of the innate immune
system in the pathogenesis of inflammatory bowel disease. J Pediatr Gastroenterol
Nutr 2009; 48: 142-51.
9. Sartor RB. Mechanisms of disease: pathogenesis of Crohn's disease and ulcerative
colitis. Nat Clin Pract Gastroenterol Hepatol 2006;3:390-407.
10. Chamouard P, Monneaux F, Richert Z, Voegeli AC, Lavaux T, Gaub MP, Baumann
R, Oudet P, Muller S. Diminution of Circulating CD4+CD25 high T cells in naïve
Crohn’s disease. Dig Dis Sci. 2009;54:2084-93.
11. Maul J, Loddenkemper C, Mundt P, Berg E, Giese T, Stallmach A, Zeitz M,
Duchmann R. Peripheral and intestinal regulatory CD4+CD25(high) T cells in
inflammatory bowel disease. Gastroenterology. 2005;128:1868–78.
12. Saruta M, Yu QT, Fleshner PR, Mantel PY, Schmidt-Weber CB, Banham AH,
Papadakis KA. Characterization of FOXP3+CD4+ regulatory T cells in Crohn’s
Irodalomjegyzék
88. oldal
disease. Clin Immunol. 2007;125:281–90.
13. Makita S, Kanai T, Oshima S, Uraushihara K, Totsuka T, Sawada T, Nakamura T,
Koganei K, Fukushima T, Watanabe M. CD4+CD25bright T cells in human
intestinal lamina propria as regulatory cells. J Immunol. 2004;173:3119–30.
14. Roman LI, Manzano L, De La Hera A, Abreu L, Rossi I, Alvarez-Mon M.
Expanded CD4+CD45RO+ phenotype and defective proliferative response in T
lymphocytes from patients with Crohn's disease. Gastroenterology.
1996;110:1008-19.
15. Alkim C, Balci M, Alkim H, Dağli U, Parlak E, Tezel A, Ulker A. The importance
of peripheral immune cells in inflammatory bowel disease. Turk J Gastroenterol.
2007;18:82-8.
16. García de Tena J, Manzano L, Leal JC, San Antonio E, Sualdea V, Alvarez-Mon M.
Active Crohn's disease patients show a distinctive expansion of circulating
memory CD4+CD45RO+CD28null T cells. J Clin Immunol 2004;24:185-96.
17. Rose M, Hildebrandt M, Fliege H, Seibold S, Mönnikes H, Klapp BF. T-cell
immune parameters and depression in patients with Crohn's disease. J Clin
Gastroenterol. 2002;34:40-8.
18. Liu ZX, Hiwatashi N, Noguchi M, Toyota T. Increased expression of costimulatory
molecules on peripheral blood monocytes in patients with Crohn's disease. Scand J
Gastroenterol. 1997;32:1241-6.
19. Senju M, Hulstaert F, Lowder J, Jewell DP. Flow cytometric analysis of peripheral
blood lymphocytes in ulcerative colitis and Crohn's disease. Gut. 1991;32:779-83.
20. Baumgart DC, Metzke D, Schmitz J, Scheffold A, Sturm A, Wiedenmann B,
Dignass AU. Patients with active inflammatory bowel disease lack immature
peripheral blood plasmacytoid and myeloid dendritic cells. Gut. 2005;54:228-36.
21. Baumgart DC, Thomas S, Przesdzing I, Metzke D, Bielecki C, Lehmann SM,
Lehnardt S, Dörffel Y, Sturm A, Scheffold A, Schmitz J, Radbruch A.
Exaggerated inflammatory response of primary human myeloid dendritic cells to
lipopolysaccharide in patients with inflammatory bowel disease. Clin Exp
Immunol. 2009;157:423-36.
22. Hart AL, Al-Hassi HO, Rigby RJ, Bell SJ, Emmanuel AV, Knight SC, Kamm MA,
Stagg AJ. Characteristics of intestinal dendritic cells in inflammatory bowel
Irodalomjegyzék
89. oldal
diseases. Gastroenterology. 2005;129:50-65.
23. Frolova L, Drastich P, Rossmann P, Klimesova K, Tlaskalova-Hogenova H.
Expression of Toll-like receptor 2 (TLR2), TLR4, and CD14 in biopsy samples of
patients with inflammatory bowel diseases: upregulated expression of TLR2 in
terminal ileum of patients with ulcerative colitis. J Histochem Cytochem.
2008;56:267-74.
24. Kamada N, Hisamatsu T, Honda H, Kobayashi T, Chinen H, Kitazume MT,
Takayama T, Okamoto S, Koganei K, Sugita A, Kanai T, Hibi T. Human CD14+
macrophages in intestinal lamina propria exhibit potent antigen-presenting ability.
J Immunol. 2009;183:1724-31.
25. Cantó E, Ricart E, Monfort D, González-Juan D, Balanzó J, Rodríguez-Sánchez JL,
Vidal S. TNF alpha production to TLR2 ligands in active IBD patients. Clin
Immunol. 2006;119:156-65.
26. Grimm MC, Pavli P, Van de Pol E, Doe WF. Evidence for a CD14+ population of
monocytes in inflammatory bowel disease mucosa--implications for pathogenesis.
Clin Exp Immunol. 1995;100:291-7.
27. Mack DR, Beedle S, Warren J, Davis J, Gross T. Peripheral blood intracellular
cytokine analysis in children newly diagnosed with inflammatory bowel disease.
Pediatr Res. 2002;51:328-32.
28. Holland N, Dong J, Garnett E, Shaikh N, Huen K, Harmatz P, Olive A, Winter HS,
Gold BD, Cohen SA, Baldassano RN, Kirschner BS, Heyman MB. Reduced
intracellular T-helper 1 interferon-gamma in blood of newly diagnosed children
with Crohn’s disease and age-related changes in Th1/Th2 cytokine profiles.
Pediatr Res. 2008;63:257-62.
29. Desreumaux P, Brandt E, Gambiez L, Emilie D, Geboes K, Klein O, Ectors N,
Cortot A, Capron M, Colombel JF. Distinct cytokine patterns in early and chronic
ileal lesions of Crohn’s disease. Gastroenterology. 1997;113:118-26.
30. Jo Y, Matsumoto T, Yada S, Fujisawa K, Esaki M, Onai N, Matsushima K, Iida M.
CCR4 is an up-regulated chemokine receptor of peripheral blood memory CD4+ T
cells in Crohn’s disease. Clin Exp Immunol. 2003;132:332-8.
31. Perminow G, Reikvam DH, Lyckander LG, Brandtzaeg P, Vatn MH, Carlsen HS.
Increased number and activation of colonic macrophages in pediatric patients with
Irodalomjegyzék
90. oldal
untreated Crohn’s disease. Inflamm Bowel Dis. 2009;15:1368-78.
32. Szebeni B, Veres G, Dezsõfi A, Rusai K, Vannay A, Mraz M, Majorova E, Arató A.
Increased expression of Toll-like receptor (TLR) 2 and TLR4 in the colonic
mucosa of children with inflammatory bowel disease. Clin Exp Immunol.
2008;151:34-41.
33. Diefenbach KA, Breuer CK. Pediatric inflammatory bowel disease. World J
Gastroenterol. 2006;12:3204-12.
34. Veres G, Baldassano RN, Mamula P. Infliximab therapy in children and adolescents
with inflammatory bowel disease. Drugs 2007;67:1703-23.
35. Ricciardelli I, Lindley KJ, Londei M, Quaratino S. Anti tumour necrosis-alpha
therapy increases the number of FOXP3 regulatory T cells in children affected by
Crohn’s disease. Immunology. 2008;125:178-83.
36. Ferkolj I, Ihan A, Markovic S, Veceric Z, Pohar M. Infliximab reduces the number
of activated mucosal lymphocytes in patients with Crohn’s disease. J
Gastrointestin Liver Dis. 2006;15:231-5.
37. Aeberli D, Seitz M, Jüni P, Villiger PM. Increase of peripheral CXCR3 positive T
lymphocytes upon treatment of RA patients with TNF-alpha inhibitors.
Rheumatology (Oxford). 2005;44:172-5.
38. Maurice MM, van der Graaff WL, Leow A, Breedveld FC, van Lier RA, Verweij
CL. Treatment with monoclonal anti-tumor necrosis factor alpha antibody results
in an accumulation of Th1 CD4+ T cells in the peripheral blood of patients with
rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum. 1999;42:2166-73.
39. Richez C, Schaeverbeke T, Dumoulin C, Dehais J, Moreau JF, Blanco P. Myeloid
dendritic cells correlate with clinical response whereas plasmacytoid dendritic
cells impact autoantibody development in rheumatoid arthritis patients treated
with infliximab. Arthritis Res Ther. 2009;11:R100.
40. Balanescu A, Radu E, Nat R, Regalia T, Bojinca V, Ionescu R, Balanescu S, Savu
C, Predeteanu D. Early and late effect of infliximab on circulating dendritic cells
phenotype in rheumatoid arthritis patients. Int J Clin Pharmacol Res. 2005;25:9-
18.
41. Lügering A, Schmidt M, Lügering N, Pauels HG, Domschke W, Kucharzik T.
Infliximab induces apoptosis in monocytes from patients with chronic active
Irodalomjegyzék
91. oldal
Crohn’s disease by using a caspase-dependent pathway. Gastroenterology.
2001;121:1145-57.
42. Baert FJ, D’Haens GR, Peeters M, Hiele MI, Schaible TF, Shealy D, Geboes K,
Rutgeerts PJ. Tumor necrosis factor alpha antibody (infliximab) therapy
profoundly down-regulates the inflammation in Crohn’s ileocolitis.
Gastroenterology. 1999;116:22-8.
43. De Rycke L, Vandooren B, Kruithof E, De Keyser F, Veys EM, Baeten D. Tumor
necrosis factor alpha blockade treatment down-modulates the increased systemic
and local expression of Toll-like receptor 2 and Toll-like receptor 4 in
spondylarthropathy. Arthritis Rheum. 2005;52:2146-58.
44. Cho JH. The genetics and immunopathogenesis of inflammatory bowel disease. Nat
Rev Immunol. 2008;8:458-66.
45. Schuppan D, Junker Y, Barisani D. Celiac disease: from pathogenesis to novel
therapies. Gastroenterology. 2009;137:1912-33.
46. Korponay-Szabó IR, Kovács JB, Czinner A, Gorácz G, Vámos A, Szabó T. High
prevalence of silent celiac disease in preschool children screened with IgA/IgG
antiendomysium antibodies. J Pediatr Gastroenterol Nutr. 1999;28:26-30.
47. Bardella MT, Fredella C, Saladino V, et al. Gluten intolerance: gender- and age-
related differences in symptoms. Scand J Gastroenterol. 2005;40:15-9.
48. Thomson AB, Keelan M, Thiesen A, Clandinin MT, Ropeleski M, Wild GE. Small
bowel review: diseases of the small intestine. Dig Dis Sci. 2001;46:2555-66.
49. Ciccocioppo R, Di Sabatino A, Corazza GR. The immune recognition of gluten in
celiac disease. Clin Exp Immunol. 2005;140:408-16.
50. Maiuri L, Ciacci C, Ricciardelli I, et al. Association between innate response to
gliadin and activation of pathogenic T cells in celiac disease. Lancet. 2003;362:30-
7.
51. Koning F. Celiac disease: sandwiched between innate and adaptive immune
responses induced by gluten. J Pediatr Gastroenterol Nutr. 2008;46:E8-9.
52. Green PH, Cellier C. Celiac disease. N Engl J Med. 2007;357:1731-43.
53. Di Sabatino A, Bertrandi E, Casadei Maldini M, Pennese F, Proietti F, Corazza GR.
Phenotyping of peripheral blood lymphocytes in adult celiac disease.
Immunology. 1998;95:572-6.
Irodalomjegyzék
92. oldal
54. León F, Sánchez L, Camarero C, Roy G. Cytokine production by intestinal
intraepithelial lymphocyte subsets in celiac disease. Dig Dis Sci. 2005;50:593-
600.
55. O'Keeffe J, Mills K, Jackson J, Feighery C. T cell proliferation, MHC class II
restriction and cytokine products of gliadin-stimulated peripheral blood
mononuclear cells (PBMC). Clin Exp Immunol. 1999;117:269-76.
56. Kerttula TO, Hällström O, Mäki M. Phenotypical characterization of peripheral
blood T cells in patients with celiac disease: elevation of antigen-primed
CD45RO+ T lymphocytes. Immunology. 1995;86:104-9.
57. Penttila IA, Gibson CE, Forrest BD, Cummins AG, LaBrooy JT. Lymphocyte
activation as measured by interleukin-2 receptor expression to gluten fraction 111
in celiac disease. Immunol Cell Biol. 1990;68:155-60.
58. Perticarari S, Prodan M, Fragonas E, Canova S, Presani G. CD69 expression on
alpha-gliadin-specific T cells in celiac disease. Eur J Histochem. 2002;46:13-22.
59. Arató A, Savilahti E, Tainio VM, Verkasalo M, Klemola T. HLA-DR expression,
natural killer cells and IgE containing cells in the jejunal mucosa of celiac
children. Gut. 1987;28:988-94.
60. Halstensen TS, Farstad IN, Scott H, Fausa O, Brandtzaeg P. Intraepithelial TcR
alpha/beta+ lymphocytes express CD45RO more often than the TcR
gamma/delta+ counterparts in celiac disease. Immunology. 1990;71:460-6.
61. Granzotto M, dal Bo S, Quaglia S, Tommasini A, Piscianz E, Valencic E, Ferrara F,
Martelossi S, Ventura A, Not T. Regulatory T-cell function is impaired in celiac
disease. Dig Dis Sci. 2009;54:1513-9.
62. Tiittanen M, Westerholm-Ormio M, Verkasalo M, Savilahti E, Vaarala O.
Infiltration of forkhead box P3-expressing cells in small intestinal mucosa in
celiac disease but not in type 1 diabetes. Clin Exp Immunol. 2008;152:498-507.
63. Vorobjova T, Uibo O, Heilman K. Increased FOXP3 expression in small-bowel
mucosa of children with celiac disease and type I diabetes mellitus. Scand J
Gastroenterol. 2009;44:422-30.
64. MacDonald TT, Vossenkamper A, Di Sabatino A. Antigen presenting cells and T
cell interactions in the gastrointestinal tract. Mol Nutr Food Res. 2009;53:947-51.
65. Bernardo D, van Hoogstraten IM, Verbeek WH, et al. Decreased circulating iNKT
Irodalomjegyzék
93. oldal
cell numbers in refractory celiac disease. Clin Immunol. 2008;126:172-9.
66. Grose RH, Thompson FM, Cummins AG. Deficiency of 6B11+ invariant NK T-
cells in celiac disease. Dig Dis Sci. 2008;53:1846-51.
67. van der Vliet HJ, von Blomberg BM, Nishi N, et al. Circulating V(alpha24+)
Vbeta11+ NKT cell numbers are decreased in a wide variety of diseases that are
characterized by autoreactive tissue damage. Clin Immunol. 2001;100:144-8.
68. Vuckovic S, Withers G, Harris M. Decreased blood dendritic cell counts in type 1
diabetic children. Clin Immunol. 2007;123:281–288.
69. Szebeni B, Veres G, Dezsofi A, et al. Increased mucosal expression of Toll-like
receptor (TLR)2 and TLR4 in celiac disease. J Pediatr Gastroenterol Nutr.
2007;45:187-93.
70. Machida HM, Catto Smith AG, Gall DG, et al. Allergic colitis in infancy: clinical
and pathologic aspects. J Pediatr Gastroenterol Nutr. 1994;19:22-6.
71. Martorell A, Plaza AM, Boné J, Nevot S, García Ara MC, Echeverria L, Alonso E,
Garde J, Vila B, Alvaro M, Tauler E, Hernando V, Fernández M. Cow’s milk
protein allergy. A multi-centre study: clinical and epidemiological aspects.
Allergol Immunopathol (Madr). 2006;34:46-53.
72. Arvola T, Ruuska T, Keränen J. Rectal bleeding in infancy: clinical, allergological,
and microbiological examination. Pediatrics. 2006;117:e760-8.
73. Eigenmann PA. Mechanisms of food allergy. Pediatr Allergy Immunol. 2009;20:5-
11.
74. Prioult G, Nagler-Anderson C. Mucosal immunity and allergic responses: lack of
regulation and/or lack of microbial stimulation? Immunol Rev. 2005;206:204-18.
75. Beyer K, Renz H, Wahn U, et al. Changes in blood leukocyte distribution during
double-blind, placebo-controlled food challenges in children with atopic
dermatitis and suspected food allergy. Int Arch Allergy Immunol. 1998;116:110-5
76. Karlsson MR, Rugtveit J, Brandtzaeg P. Allergen-responsive CD4+CD25+
regulatory T cells in children who have outgrown cow’s milk allergy. J Exp Med.
2004;199:1679-88.
77. Cox HE. Food allergy as seen by an allergist. J Pediatr Gastroenterol Nutr.
2008;47:S45-8.
78. Bischoff SC. Food allergy and eosinophilic gastroenteritis and colitis. Curr Opin
Irodalomjegyzék
94. oldal
Allergy Clin Immunol. 2010;10:238-45.
79. Cools N, Ponsaerts P, Van Tendeloo VFI, et al. Regulatory T Cells and Immune
Disease. Clin Dev Immunol. 2007;2007:89195-89206.
80. Corthay A. How do regulatory T cells work? Scand J Immunol. 2009;70:326-36.
81. Sakaguchi S, Miyara M, Costantino CM, Hafler DA. FOXP3+ regulatory T cells in
the human immune system. Nat Rev Immunol. 2010;10:490-500.
82. Piccirillo CA, Thornton AM. Cornerstone of peripheral tolerance: naturally
occurring CD4+CD25+ regulatory T cells. Trends Immunol. 2004;25:374-380.
83. Fehérvari Z, Sakaguchi S. Development and function of CD25+CD4+ regulatory T
cells. Curr Opin Immunol. 2004;16(2):203-208.
84. Chatenoud L, Bach JF. Adaptive human regulatory T cells: myth or reality? J Clin
Invest. 2006;116:2325-2327.
85. Fontenot JD, Rudensky AY. A well adapted regulatory contrivance: regulatory T
cell development and the forkhead family transcription factor Foxp3. Nat
Immunol. 2005;6(4):331-337.
86. Huehn J, Polansky JK, Hamann A. Epigenetic control of FOXP3 expression: the key
to a stable regulatory T-cell lineage? Nat Rev Immunol. 2009;9:83-9.
87. Banham AH. Cell-surface IL-7 receptor expression facilitates the purification of
FOXP3(+) regulatory T cells. Trends Immunol. 2006;27:541-4
88. Seddiki N, Santner-Nanan B, Martinson J, et al. Expression of interleukin (IL)-2 and
IL-7 receptors discriminates between human regulatory and activated T cells. J
Exp Med. 2006;203:1693-1700.
89. Liu W, Putnam AL, Xu-Yu Z, et al. CD127 expression inversely correlates with
FoxP3 and suppressive function of human CD4+ Treg cells. J Exp Med.
2006;203(7):1701-1711.
90. Hofmeister R, Khaled AR, Benbernou N, Rajnavolgyi E, Muegge K, Durum SK.
Interleukin-7: physiological roles and mechanisms of action. Cytokine Growth
Factor Rev. 1999;10:41-60.
91. Wing K, Sakaguchi S. Regulatory T cells exert checks and balances on self
tolerance and autoimmunity. Nat Immunol. 2010;11:7-13.
92. Vignali DA, Collison LW, Workman CJ. How regulatory T cells work. Nat Rev
Immunol. 2008;8:523-32.
Irodalomjegyzék
95. oldal
93. Takahashi T, Tagami T, Yamazaki S, Uede T, Shimizu J, Sakaguchi N, Mak TW,
Sakaguchi S. Immunologic self-tolerance maintained by CD25+CD4+ regulatory
T cells constitutively expressing cytotoxic T lymphocyte-associated antigen 4. J.
Exp. Med. 2000;192:303–310.
94. Dejean AS, Beisner DR, Ch'en IL, Kerdiles YM, Babour A, Arden KC, Castrillon
DH, DePinho RA, Hedrick SM. Transcription factor Foxo3 controls the
magnitude of T cell immune responses by modulating the function of dendritic
cells. Nat Immunol. 2009; 10:504-13.
95. Campbell DJ, Koch MA. Phenotypical and functional specialization of FOXP3(+)
regulatory T cells. Nat Rev Immunol. 2011;11:119-30.
96. Sakaguchi S. Naturally arising Foxp3-expressing CD25+CD4+ regulatory T cells in
immunological tolerance to self and non-self. Nat Immunol. 2005;6:345-352.
97. Wieckiewicz J, Goto R, Wood JK. T regulatory cells and the control of
alloimmunity: from characterisation to clinical application. Curr Opin Immunol.
2010;22: 662–668.
98. Joffre O, Santolaria T, Calise D, Al Saati T, Hudrisier D, Romagnoli P, van
Meerwijk JP. Prevention of acute and chronic allograft rejection with
CD4+CD25+Foxp3+ regulatory T lymphocytes. Nat Med. 2008;14:88-92.
99. Riley JL, June CH, Blazar BR. Human T regulatory cell therapy: take a billion or so
and call me in the morning. Immunity. 2009;30:656-65.
100. Langier S, Sade K, Kivity S. Regulatory T cells: the suppressor arm of the immune
system. Autoimmun Rev. 2010;10:112-5.
101. Dranoff G. Cytokines in cancer pathogenesis and cancer therapy. Nat Rev Cancer.
2004;4:11-22.
102. Swiecki M, Colonna M. Unraveling the functions of plasmacytoid dendritic cells
during viral infections, autoimmunity, and tolerance. Immunol Rev.
2010;234:142-62.
103. Mahnke K, Bedke T, Enk AH. Regulatory conversation between antigen
presenting cells and regulatory T cells enhance immune suppression. Cell
Immunol. 2007;250:1-13.
104. Ito T, Yang M, Wang YH, Lande R, Gregorio J, Perng OA, Qin XF, Liu YJ, Gilliet
M. Plasmacytoid dendritic cells prime IL-10-producing T regulatory cells by
Irodalomjegyzék
96. oldal
inducible costimulator ligand. J Exp Med. 2007;204:105-15.
105. Houot R, Perrot I, Garcia E, Durand I, Lebecque S. Human CD4+CD25high
regulatory T cells modulate myeloid but not plasmacytoid dendritic cells
activation. J Immunol. 2006;176:5293-8.
106. Walker LS. Regulatory T cells overturned: the effectors fight back. Immunology.
2009;126:466-74.
107. Kulkarni R, Behboudi S, Sharif S. Insights into the role of Toll-like receptors in
modulation of T cell responses. Cell Tissue Res. 2011;343:141-52.
108. Lutz MB, Kurts C. Induction of peripheral CD4+ T-cell tolerance and CD8+ T-cell
cross-tolerance by dendritic cells. Eur J Immunol. 2009;39:2325-30.
109. Matta BM, Castellaneta A, Thomson AW. Tolerogenic plasmacytoid DC. Eur J
Immunol. 2010;40:2667-76.
110. Hubert P, Jacobs N, Caberg JH, Boniver J, Delvenne P. The cross-talk between
dendritic and regulatory T cells: good or evil? J Leukoc Biol. 2007;82:781-94.
111. Cole JE, Georgiou E, Monaco C. The expression and functions of toll-like
receptors in atherosclerosis. Mediators Inflamm. 2010;2010:393946.
112. Venet F, Pachot A, Debard AL, Bohe J, Bienvenu J, Lepape A, Powell WS,
Monneret G. Human CD4+CD25+ regulatory T lymphocytes inhibit
lipopolysaccharide-induced monocyte survival through a Fas/Fas ligand-
dependent mechanism. J Immunol. 2006;177:6540-7.
113. Nowak M, Stein-Streilein J. Invariant NKT cells and tolerance. Int Rev Immunol.
2007;26:95-119.
114. Ralainirina N, Poli A, Michel T, Poos L, Andrès E, Hentges F, Zimmer J. Control
of NK cell functions by CD4+CD25+ regulatory T cells. J Leukoc Biol.
2007;81:144-53.
115. Ghiringhelli F, Ménard C, Martin F, Zitvogel L. The role of regulatory T cells in
the control of natural killer cells: relevance during tumor progression. Immunol
Rev. 2006;214:229-38.
116. Zhang C, Zhang J, Tian Z. The regulatory effect of natural killer cells: do "NK-reg
cells" exist? Cell Mol Immunol. 2006;3:241-54.
117. Kohrt HE, Pillai AB, Lowsky R, Strober S. NKT cells, Treg, and their interactions
in bone marrow transplantation. Eur J Immunol. 2010;40:1862-9.
Irodalomjegyzék
97. oldal
118. La Cava A, Van Kaer L, Fu-Dong-Shi. CD4+CD25+ Tregs and NKT cells:
regulators regulating regulators. Trends Immunol. 2006;27:322-7.
119. Chaplin DD. Overview of the immune response. J Allergy Clin Immunol.
2010;125:S3-23.
120. Kindt T. J., Osborne B. A., Goldsby R. A. Kuby. Immunology 6th Edition 2007.
W. H. Freeman and Company. USA
121. Borish LC, Steinke JW. 2. Cytokines and chemokines. J Allergy Clin Immunol.
2003;111:S460-75.
122. Parkin J, Cohen B. An overview of the immune system. Lancet. 2001;357:1777-
89.
123. Borish LC, Steinke JW. 2. Cytokines and chemokines. J Allergy Clin Immunol.
2003;111:S460-75.
124. Zhang N, Bevan MJ. CD8(+) T cells: foot soldiers of the immune system.
Immunity. 2011;35:161-8.
125. Alam R, Gorska M. 3. Lymphocytes. J Allergy Clin Immunol. 2003;111:S476-85.
126. Shevach EM. Mechanisms of foxp3+ T regulatory cell-mediated suppression.
Immunity. 2009;30:636-45.
127. Sakaguchi S., Sakaguchi N., Asano M., Itoh M., and Toda M. Immunologic self-
tolerance maintained by activated T cells expressing IL-2 receptor a-chains
(CD25). J Immunol. 1995;155,1151-1164.
128. Leguern C. Regulatory T cells for tolerance therapy: revisiting the concept. Crit
Rev Immunol. 2011;31:189-207.
129. IBD Working Group of the European Society for Paediatric Gastroenterology,
Hepatology and Nutrition. Inflammatory bowel disease in children and
adolescents: recommendations for diagnosis—the Porto criteria. J Pediatr
Gastroenterol Nutr. 2005;41:1-7.
130. Hyams JS, Ferry GD, Mandel FS, Gryboski JD, Kibort PM, Kirschner BS,
Griffiths AM, Katz AJ, Grand RJ, Boyle JT, et al. Development and validation of
a pediatric Crohn’s disease activity index. J Pediatr Gastroenterol Nutr. 1991;12:
439-47.
131. Satsangi J, Silverberg MS, Vermeire S, Colombel JF. The Montreal classification
of inflammatory bowel disease: controversies, consensus, and implications. Gut
Irodalomjegyzék
98. oldal
2006; 55: 749-53
132. Mamula P, Markowitz JE, Baldassano RN. Inflammatory bowel disease in early
childhood and adolescence: special considerations. Gastroenterol Clin North Am.
2003;32:967-95.
133. Walker-Smith JA, Guandalini S, Schmitz J. Revised criteria for diagnosis of celiac
disease. Report of Working Group of European Society of Paediatric
Gastroenterology and Nutrition. Arch Dis Child. 1990;65:909-11.
134. Marsh M. Gluten, major histocompability complex and small intestine.
Gastroenterology. 1992;102:330–54.
135. Cseh Á, Bohács A, Müller V, Szalay B, Losonczy Gy, Tulassay T, Vásárhelyi B,
Tamási L. Az asztma megváltoztatja a perifériás dendritikus sejtarányt. Med
Thorac. 2010;63:358-362.
136. Cseh A, Bohács A, Szalay B, Losonczy G, Tulassay T, Vásárhelyi B, Tamási L.
Peripheral dendritic cells in asthma. J Investig Allergol Clin Immunol.
2010;20:533-5.
137. Cseh A, Molnár K, Pintér P, Szalay B, Szebeni B, Treszl A, Arató A, Vásárhelyi
B, Veres G. Regulatory T cells and T helper subsets in breast-fed infants with
hematochezia caused by allergic colitis. J Pediatr Gastroenterol Nutr.
2010;51:675-7.
138. Cseh A, Vasarhelyi B, Molnar K, Szalay B, Svec P, Treszl A, Dezsofi A, Lakatos
PL, Arato A, Tulassay T, Veres G. Immune phenotype in children with therapy-
naïve, remitted and relapsed Crohn’s disease. World J Gastroenterol.
2010;16:6001-9.
139. Cseh Á, Vásárhelyi B, Szalay B, Molnár K, Nagy-Szakál D, Treszl A, Vannay Á,
Arató A, Tulassay T, Veres G. Immune phenotype of children with newly
diagnosed and gluten-free diet-treated celiac disease. Dig Dis Sci. 2011;56:792-8.
140. Bohács A, Cseh A, Stenczer B, Müller V, Gálffy G, Molvarec A, Rigó J Jr,
Losonczy G, Vásárhelyi B, Tamási L. Effector and regulatory lymphocytes in
asthmatic pregnant women. Am J Reprod Immunol. 2010;64:393-401.
141. Mácsai E, Cseh A, Budai G, Mészáros G, Vásárhelyi B, Fischer K, Szabó A,
Treszl A. Effect of 3 months of doxazosin therapy on T-cell subsets in type 2
diabetic patients. J Int Med Res. 2009;37:1982-7.
Irodalomjegyzék
99. oldal
142. Abbas AK, Lichtman AH. Cellular and molecular immunology. Elsevier Science.
Philadelphia, 2003.
143. Farkas KM. Rizikófaktorok vizsgálata gyermekkori migrénformákban. Rektori
dolgozat, 2009.
144. Mészáros G, Toldi G. Sejtélettani folyamatok jellemzése áramlási citometriával.
Rektori dolgozat, 2010.
145. Bekő G. Multiplex szérum-citokinszint vizsgálatok jelentősége különböző
kórképekben. Doktori értekezés, 2009.
146. Brown JD. The use of multiple t tests in language research. TESOL Quarterly.
1990;24,770-773.
147. Selby WS, Jewell DP. T lymphocyte subsets in inflammatory bowel disease:
peripheral blood. Gut. 1983;24:99-105.
148. Yuan SZ, Hanauer SB, Kluskens LF, Kraft SC. Circulating lymphocyte
subpopulations in Crohn’s disease. Gastroenterology. 1983;85:1313-8.
149. van Ierssel GJ, van der Sluys Veer A, Verspaget HW, Griffioen G, van Hogezand
RA, Lamers CB. Contribution of plasma cortisol to corticosteroid-suppressed
peripheral blood natural killer cell activity in Crohn's disease. Immuno-
pharmacology 1995;29:11-17.
150. Kontiainen S, Scheinin T, Halme L. Number of activated T-helper cells and NK
cells in peripheral blood is decreased in severe Crohn's disease. APMIS
1996;104:355-361.
151. Kool M, Lambrecht BN. Dendritic cells in asthma and COPD: opportunities for
drug development. Curr Opin Immunol. 2007;19:701-10.
152. de Heer HJ, Hammad H, Kool M, Lambrecht BN. Dendritic cell subsets and
immune regulation in the lung. Semin Immunol. 2005;17:295-303.
153. De Rycke L, Vandooren B, Kruithof E, De Keyser F, Veys EM, Baeten D. Tumor
necrosis factor alpha blockade treatment down-modulates the increased systemic
and local expression of Toll-like receptor 2 and Toll-like receptor 4 in
spondylarthropathy. Arthritis Rheum. 2005;52:2146-58.
154. Mastrandrea F, Semeraro FP, Coradduzza G, et al. CD34+ hemopoietic precursor
and stem cells traffic in peripheral blood of celiac patients is significantly
increased but not directly related to epithelial damage severity. Eur Ann Allergy
Irodalomjegyzék
100. oldal
Clin Immunol. 2008;40:90-103.
155. Lahat N, Shapiro S, Karban A, Gerstein R, Kinarty A, Lerner A. Cytokine profile
in celiac disease. Scand J Immunol. 1999;49:441-6.
156. Saurer L, Mueller C. T cell-mediated immunoregulation in the gastrointestinal
tract. Allergy. 2009;64:505-19.
157. O'Donoghue DP, Lancaster-Smith M, Laviniere P, Kumar PJ. T cell depletion in
untreated adult celiac disease. Gut. 1976;17:328-31. O'Donoghue DP, Lancaster-
Smith M, Laviniere P, Kumar PJ. T cell depletion in untreated adult celiac disease.
Gut. 1976;17:328-31.
158. Kantele JM, Savilahti E, Westerholm-Ormio M, et al. Decreased numbers of
circulating plasmablasts and differences in IgA1-plasmablast homing to skin in
celiac disease and dermatitis herpetiformis. Clin Exp Immunol. 2009;156:535-41.
159. Agardh D, Lynch K, Brundin C, Ivarsson SA, Lernmark A, Cilio CM. Reduction
of tissue transglutaminase autoantibody levels by gluten-free diet is associated
with changes in subsets of peripheral blood lymphocytes in children with newly
diagnosed celiac disease. Clin Exp Immunol. 2006;144:67-75.
160. Frisullo G, Nociti V, Iorio R, et al. Increased CD4+CD25+Foxp3+ T cells in
peripheral blood of celiac disease patients: correlation with dietary treatment. Hum
Immunol. 2009;70:430-5.
161. Ciccocioppo R, Ricci G, Rovati B, et al. Reduced number and function of
peripheral dendritic cells in celiac disease. Clin Exp Immunol. 2007;149:487-96.
162. Weiskopf D, Weinberger B, Grubeck-Loebenstein B. The aging of the immune
system. Transpl Int. 2009;22:1041-50.
163. Aspinall R. Age-related changes in the function of T cells. Microsc Res Tech.
2003;62:508-13.
164. Verkasalo MA, Arató A, Savilahti E, Tainio VM. Effect of diet and age on jejunal
and circulating lymphocyte subsets in children with celiac disease: persistence of
CD4-8-intraepithelial T cells through treatment. Gut. 1990;31:422-5.
165. Lake AM. Food-induced eosinophilic proctocolitis. J Pediatr Gastroenterol Nutr.
2000;30:S58-60.
166. Ormälä T, Rintala R, Savilahti E. T cells of the colonic mucosa in patients with
infantile colitis. J Pediatr Gastroenterol Nutr. 2001;33:133-8.
Irodalomjegyzék
101. oldal
167. Ojuawo A, St Louis D, Lindley KJ, et al. Non-infective colitis in infancy: evidence
in favour of minor immunodeficiency in its pathogenesis. Arch Dis Child.
1997;76:345-8.
168. Romagnani S. The increased prevalence of allergy and the hygiene hypothesis:
missing immune deviation, reduced immune suppression, or both? Immunology.
2004;112:352-63.
169. Smits HH, Engering A, van der Kleij D, et al. Selective probiotic bacteria induce
IL-10-producing regulatory T cells in vitroin vitro by modulating dendritic cell
function through dendritic cell-specific intercellular adhesion molecule 3-grabbing
nonintegrin. J Allergy Clin Immunol. 2005;115:1260-7.
170. de Roock S, van Elk M, van Dijk ME, et al. Lactic acid bacteria differ in their
ability to induce functional regulatory T cells in humans. Clin Exp Allergy.
2010;40:103-10.
Publikációk
102. oldal
11. Publikációk
11.1. A disszertáció alapjául szolgáló publikációk
Cseh Á, Vásárhelyi B, Szalay B, Molnár K, Nagy-Szakál D, Treszl A, Vannay Á, Arató
A, Tulassay T, Veres G: „Immune phenotype of children with newly diagnosed
and gluten-free diet-treated celiac disease” (Digestive Diseases and Sciences
2011;56:792-8. IF: 2,060)
Cseh A, Molnár K, Pintér P, Szalay B, Szebeni B, Treszl A, Arató A, Vásárhelyi B,
Veres G.: „Regulatory T cells and T helper subsets in breast-fed infants with
hematochezia caused by allergic colitis” (Journal of Pediatric Gastroenterology
and Nutrition 2010;51:675-7. IF: 2,180)
Cseh A, Vasarhelyi B, Molnar K, Szalay B, Svec P, Treszl A, Dezsofi A, Lakatos PL,
Arato A, Tulassay T, Veres G.: „Immune phenotype in children with therapy-
naïve, remitted and relapsed Crohn’s disease” (World Journal of Gastroenterolgy
2010;16:6001-9. IF: 2,240)
Összesített IF: 6,480
Publikációk
103. oldal
11.2. A disszertációhoz kapcsolódó publikációk
Cseh A, Bohács A, Szalay B, Losonczy G, Tulassay T, Vásárhelyi B, Tamási L:
„Peripheral dendritic cells in asthma” (Journal of Investigational Allergology and
Clinical Immunology 2010;20:533-5. IF: 1,489)
Bohács A, Cseh A, Stenczer B, Müller V, Gálffy G, Molvarec A, Rigó J Jr, Losonczy
G, Vásárhelyi B, Tamási L: „Effector and regulatory lymphocytes in asthmatic
pregnant women” (American Journal of Reproductive Immunology 2010;64:393-
401. IF: 2,451)
Mácsai E, Cseh A, Budai G, Mészáros G, Vásárhelyi B, Fischer K, Szabó A, Treszl A.:
„Effect of 3 months of doxazosin therapy on T-cell subsets in type 2 diabetic
patients” (The Journal of International Medical Research 2009;37:1982-7. IF:
0,938)
Cseh Á, Bohács A, Müller V, Szalay B, Losonczy Gy, Tulassay T, Vásárhelyi B,
Tamási L: „Az asztma megváltoztatja a perifériás dendritikus sejtarányt”
(Medicina Thoracalis 2010;LXIII:358-362.)
Összesített IF: 4,878
Publikációk
104. oldal
11.3. Egyéb publikációk
Vásárhelyi B, Cseh A, Kocsis I, Treszl A, Györffy B, Rigó J Jr.: “Three mechanisms in
the pathogenesis of pre-eclampsia suggested by over-represented transcription
factor-binding sites detected with comparative promoter analysis” (Molecular
Human Reproduction 2006;12:31-4. IF: 2,760)
Cseh Á. Oh., Rigó J. Jr. Dr.,Vásárhelyi B. Dr., Páli A. Oh., Győrffy B. Dr.: “Szerepet
játszanak-e a transzkripciós faktorok az endometriózis kialakulásában?” (Magyar
Nőorvosok Lapja 2007;70:183-186.)
Páli A., Arató A., Dezsőfi A., Cseh Á., Treszl A., Veress G., Szőnyi L.: „Wilson-kór
vagy epeút-elzáródás?” (Gyermekgyógyászat 2007;58:350-353.)
Gyorffy A, Baranyai Z, Cseh A, Munkácsy G, Jakab F, Tulassay Z, Gyorffy B.:
„Promoter analysis suggest, the implications of NFkB/C-REL transcription factors
in biliary atresia.” (Hepato-Gastroenterology 2008;55:1189-92. IF: 0,680)
Szebeni B., Sziksz E., Prókai Á., Gál K., Vannay Á., Cseh Á., Veres G., Dezsőfi A.,
Korponay Szabó I., Bodánszky H., Arató A.: “Fokozott szérum és glükokortikoid
regulált kináz-1 expresszió gyermekkori cöliákiában” (Gyermekgyógyászat
2009;60:67-73.)
Cseh A, Szebeni B, Szalay B, Vásárhelyi B.: “Az Akt enzim: új terápiás célpont rákban
és cukorbetegségben?” (Orvosi Hetilap 2009;150:373-8.)
Gyarmati B, Beko G, Szalay B, Cseh A, Vásárhelyi B, Treszl A.: „Maternal cytokine
balance on 3rd postpartum day is not affected by the mode of delivery after
healthy pregnancies” (The Journal of International Medical Research
2010;38:208-13. IF: 1,068)
Szebeni B, Vannay A, Sziksz E, Prókai A, Cseh A, Veres G, Dezsőfi A, Győrffy H,
Szabó IK, Arató A.: „Increased Expression of Serum- and Glucocorticoid-
Publikációk
105. oldal
regulated Kinase-1 in the Duodenal Mucosa of Children With Coeliac Disease” (J
Pediatr Gastroenterol Nutr 2010;50:147-53. IF: 2,180)
Szakál DN, Gyorffy H, Arató A, Cseh A, Molnár K, Papp M, Dezsofi A, Veres G.:
„Mucosal expression of claudins 2, 3 and 4 in proximal and distal part of
duodenum in children with coeliac disease.” (Virchows Archiv 2010;456:245-50.
IF: 2,336)
Gyarmati B, Szabó E, Szalay B, Cseh A, Czuczy N, Toldi G, Vásárhelyi B, Takáts Z.:
„Emelkedett hepcidinszint nőgyógyászati műtéteket követő harmadik napon”
(Orvosi Hetilap 2010;151:1790-4.)
Molnár K, Vannay Á, Szebeni B, Sziksz E, Cseh Á, Bánki NF, Dezsőfi A, Arató A,
Tulassay T, Veres G, Győrffy H, Lakatos PL, Papp M: „Intesztinális alkalikus
foszfatáz vizsgálata krónikus bélgyulladásban (IBD) szenvedő gyermekek
bélnyálkahártyájában” (Gyermekgyógyászat 2011;62:105-109.)
Gál K, Cseh A, Szalay B, Rusai K, Vannay A, Lukácsovits J, Heemann U, Szabó AJ,
Losonczy G, Tamási L, Müller V: „Effect of cigarette smoke and dexamethasone
on Hsp72 system of alveolar epithelial cells” (Cell Stress Chaperones. Epub ahead
of print. DOI: 10.1007/s12192-010-0249z IF: 3,162)
Gyarmati B, Szabó E, Szalay B, Czuczy N, Toldi G, Cseh Á, Vásárhelyi B, Takáts Z:
„Serum maternal hepcidin levels three days after delivery are higher compared to
those measured at parturition” (The Journal of Obstetrics and Gynaecology
Research. Accepted. IF: 0,869)
Összesített IF: 13,055
Köszönetnyilvánítás
106. oldal
12. Köszönetnyilvánítás
Köszönettel tartozom mindenek előtt Dr. Tulassay Tivadarnak Professzor Úrnak,
kutatócsoportunk vezetőjének, aki biztosította számomra a kutatómunka elvégzéséhez
szükséges szellemi műhelyt, és akinek az irányítása alatt működő kutatócsoport
tagjaként elsajátíthatattam a megfelelő kérdésfeltevés, módszerkeresés,
vizsgálattervezés technikáját, az adatok értékelésének és értelmezésének képességét.
Ez a munka nem jöhetett volna létre témavezetőm, Dr. Veres Gábor, valamint Dr.
Vásárhelyi Barna nélkül. Köszönöm, hogy mind szakmailag, mind emberileg mellettem
álltak, köszönöm a sok észrevételt, tanácsot, és a felbecsülhetetlen segítséget a
tudományos kutatói magatartás és gondolkodás elsajátításához.
Köszönettel tartozom Dr. Treszl Andrásnak, Dr. Szebeni Beátának és Dr. Vannay
Ádámnak, akik bevezettek a gyakorlati kutatómunka rejtelmeibe, és így fontos szerepet
vállaltak abban, hogy ez a munka megszülethessen.
Köszönöm továbbá Dr. Arató András Professzor Úrnak, Dr. Reusz György
Professzor Úrnak, és Dr. Szabó Attilának, akik ugyancsak felbecsülhetetlen módon
hozzájárultak ahhoz, hogy lehetőségem legyen eredményeinket mind hazai, mind
nemzetközi szinten is közzétenni.
Köszönöm a labor kutatóinak és PhD hallgató társaimnak, hogy olyan légkör
alakulhatott ki, amelyben mindannyiunknak lehetősége volt nemcsak szakmailag, de
emberileg is sokat fejlődni. Külön köszönettel tartozom Bernát Máriának vizsgálataim
során nyújtott felbecsülhetetlen technikai és emberi segítségéért, valamint az I. Sz.
Gyermekklinika valamennyi munkatársának, hogy segítő, baráti körülmények között
végezhettem doktori munkámat.
Végül, de nem utoljára, hálámat fejezem ki családtagjaimnak, különösképpen
Feleségemnek és Édesanyámnak, akiknek megértő türelmessége és féltő szeretete nélkül
ezeket az eredményeket nem érhettem volna el.
top related