recherche de marqueurs prÉcoces de la gestation …
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ÉCOLE NATIONALE VÉTÉRINAIRE D’ALFORT
Année 2012
RECHERCHE DE MARQUEURS PRÉCOCES DE LA
GESTATION DANS LES CELLULES IMMUNITAIRES
CIRCULANTES CHEZ LES RUMINANTS
THÈSE
Pour le
DOCTORAT VÉTÉRINAIRE
Présentée et soutenue publiquement devant
LA FACULTÉ DE MÉDECINE DE CRÉTEIL
Le 20 Décembre 2012
par
Laura Hélène SILVA
Née le 26 août 1987 à Brou-sur-Chantereine (Seine-et-Marne)
JURY
Président : Pr
Professeur à la Faculté de Médecine de CRÉTEIL
Membres
Directeur : Mme Fabienne Constant
Maître de conférences à l’ENVA
Assesseur : Mme Bénédicte GRIMARD-BALLIF
Professeur à l’ENVA
REMERCIEMENTS
Au président du jury, Professeur à la faculté de médecine de Créteil,
Qui nous fait l’honneur de présider notre jury,
Hommage respectueux.
A Madame Fabienne Constant,
Maître de conférences à l’Ecole Nationale Vétérinaire d’Alfort,
Qui a accepté d’encadrer ce travail de thèse,
Sincères remerciements.
A Madame Bénédicte Grimard-Ballif,
Professeur à L’Ecole Nationale Vétérinaire d’Alfort,
Qui nous a fait l’honneur d’accepter de participer à notre jury de thèse,
Sincères remerciements.
Aux enseignants de l’Ecole Nationale Vétérinaire d’Alfort, ainsi qu’à mes maîtres de stage,
Qui m’ont permis d’apprendre ce métier passionnant,
Sincères remerciements.
A mes parents, qui ont toujours cru en moi, ont su me soutenir dans mon projet, et m’ont
permis de mener à terme mes longues études sans autre souci que d’apprendre et me former.
Merci pour l’amour inconditionnel et la confiance que vous avez placés en moi.
A mes sœurs, Johanna et Carole, ainsi que mes cousines, Florence et Audrey, avec lesquelles
j’ai passé tant de bons moments et auxquelles je pourrai toujours tout dire. Merci pour les fous
rires et les confidences.
A mes grands-parents, qui ont si bien fait le relais avec mes parents, pour les bons petits plats
et les bonbons du mercredi, notamment a papy, que je n’oublie pas, pour m’avoir donné le
goût du piano. Merci d’avoir cru en moi.
A toute ma famille qui, bien que coupée en deux, m’a apporté beaucoup d’amour et de
moments inoubliables.
A mon homme David, qui m’a soutenue dans l’apprentissage difficile de la pratique de mon
métier et m’a permis de passer des études à la vie active dans la sérénité. Ton amour m’aide à
avoir confiance en moi et à franchir tous les obstacles. Merci pour le bonheur que tu
m’apportes chaque jour par tes petites attentions et ton effort constant pour me rendre
heureuse.
A mon groupe de clinique : Sandrine, Jérèm, Stan, Gaëlle, Ben, Charlotte, Marie-Aude, Chloé
et Matthias. Pour tous les souvenirs que l’on partage, que ce soit les soirées, les premiers pas
au CHUVA, les longs topos à l’heure du déjeuner, les fous rires au RU… Il y en a tellement
que je ne saurais les citer tous. Vous m’avez fait passer 5 années extraordinaires chacun à
votre façon et ce sont des choses qu’on n’oublie pas.
A ma GGO, avec laquelle je partage mes souvenirs de prépa, mais aussi une amitié qui n’a
pas été ébranlée par le passage à l’École. Je me souviens encore du jour où tu m’as félicitée
pour le concours et de ta réaction lorsque j’ai appris que j’intégrais l’ENVA. Rien que pour
cela, mais aussi bien d’autres choses, merci.
A mes amis du lycée, avec lesquels j’ai encore partagé de mémorables soirées bien après le
baccalauréat.
A mes poulottes, Cassandra et Héloïse, qui ont fait de moi une Ancienne. J’espère avoir
participé à vous transmettre les valeurs alforiennes. Je vous souhaite aussi de vous épanouir
dans ce beau métier.
A mes compagnons à quatre pattes, Enzo, Clio, Chérubin, Tango, Pampa, Muguette, Poupette,
Casi, Lady, Benji, Oswald, Alphonse, Nougat et Glupie, qui m’ont accompagnée tout au long
de ma vie et m’ont donné la passion des animaux qui a fait que j’ai voulu devenir vétérinaire.
1
TABLE DES MATIERES
LISTE DES FIGURES ............................................................................................................... 3
LISTE DES TABLEAUX .......................................................................................................... 5
LISTE DES ABRÉVIATIONS .................................................................................................. 6
INTRODUCTION ...................................................................................................................... 9
PREMIERE PARTIE : Étude bibliographique ........................................................................ 11
I. Mécanismes impliqués dans la mise en place et le maintien de la gestation chez les
ruminants .................................................................................................................................. 11
A. Les cycles de la vache et de la brebis ........................................................................... 11
1. Le cycle de la vache ................................................................................................. 11
2. Le cycle de la brebis ................................................................................................. 11
B. Mise en place de la gestation chez les ruminants ......................................................... 12
1. De la fécondation à l’implantation ........................................................................... 12
2. Implantation et formation du placenta ..................................................................... 13
C. Place de la communication fœto-maternelle dans la mise en place de la gestation ..... 14
1. Rôles de l’IFNτ en début de gestation ...................................................................... 14
2. Rôles du système immunitaire dans le maintien de la gestation .............................. 14
II. Méthodes usuelles de diagnostic précoce de la gestation chez les ruminants .................. 16
A. Mise en évidence de l’EPF (early pregnancy factor) ................................................... 16
B. Dosage de la progestérone dans le plasma ou dans le lait ............................................ 16
1. Principe du diagnostic .............................................................................................. 16
2. Résultats obtenus chez la brebis ............................................................................... 16
3. Résultats obtenus chez la vache ............................................................................... 17
4. Intérêts et limites de la méthode ............................................................................... 17
5. Cas particulier de la progestérone fécale chez la vache ........................................... 18
C. Dosage des protéines spécifiques de la gestation ......................................................... 18
D. L’échographie transrectale et trans-abdominale .......................................................... 19
E. La palpation transrectale .............................................................................................. 20
III. Gènes stimulés par l’interféron chez les ruminants ......................................................... 21
A. Stimulation de l'expression des ISG par l’IFNτ ........................................................... 21
1. L’IFNτ possède une action paracrine ....................................................................... 21
2
2. L’action de l’IFNτ fait intervenir la voie de signalisation JAK-STAT
(Stewart et al., 2001 ; Binelli et al., 2001) ....................................................................... 21
3. Principaux ISG étudiés chez les ruminants pendant la gestation ............................. 22
B. Expression des ISG dans l'endomètre .......................................................................... 24
C. Expression des ISG dans les lymphocytes mononucléés circulants (LMC) ................ 24
1. Comparaison de l’expression des ISG dans les LMC entre les femelles gestantes
et les femelles non gestantes ............................................................................................ 24
2. Utilisation de la différence d’expression des ISG dans les LMC pour
diagnostiquer la gestation ................................................................................................. 25
IV. Présentation de deux gènes non stimulés par l’IFNτ : FOS et PBEF-1 ........................... 27
A. Le gène FOS (FBJ murine osteosarcoma viral oncogene homolog) ............................ 27
B. Le gène PBEF-1 (pre-B-cell colony enhancing factor 1)............................................. 28
DEUXIEME PARTIE : Étude expérimentale .......................................................................... 31
I. Matériels et méthodes ....................................................................................................... 31
A. Animaux ....................................................................................................................... 31
B. Prélèvements ................................................................................................................ 31
C. Isolement des leucocytes mononucléés circulants (LMC) ........................................... 32
D. Dosage de progestérone ............................................................................................... 32
E. Extraction des ARN ..................................................................................................... 32
F. Rétrotranscription des ARNm ...................................................................................... 32
G. PCR en temps réel ........................................................................................................ 33
H. Analyses statistiques .................................................................................................... 34
II. Résultats ........................................................................................................................... 35
A. Diagnostics de gestation ............................................................................................... 35
B. Dosage de progestérone ............................................................................................... 35
C. Niveau d'expression de gènes candidats par RT-qPCR en temps réel ......................... 35
III. Discussion ........................................................................................................................ 41
CONCLUSION ........................................................................................................................ 47
BIBLIOGRAPHIE ................................................................................................................... 49
3
LISTE DES FIGURES
Figure 1 : Comparaison chronologique des étapes de la mise en place d’une gestation chez
la vache et la brebis. ................................................................ Erreur ! Signet non défini.
Figure 2 : Mécanisme d’activation de la voie JAK-STAT (d’après la thèse de pharmacie de
Valentino, 2009) ...................................................................... Erreur ! Signet non défini.
Figure 3 : Niveaux d’expression relatifs normalisés de CXCL10 mesurés par PCR en temps
réel dans les leucocytes mononucléés circulants (LMC), selon le lot de brebis (CYCL :
brebis cyclées, IA vide : brebis vides inséminées avec du sperme normal, LS : brebis
inséminées avec du sperme inactivé, G15 : brebis gestantes). Moyenne par lot ±
SEM. ** p<0,01. ..................................................................... Erreur ! Signet non défini.
Figure 4 : Distribution des niveaux d’expression relatifs individuels de CXCL10 dans les
leucocytes mononucléés circulants (LMC), selon le lot de brebis (CYCL : brebis
cyclées, IA vide : brebis vides inséminées avec du sperme normal, LS : brebis
inséminées avec du sperme inactivé, G15 : brebis gestantes). Erreur ! Signet non défini.
Figure 5 : Niveaux d’expression relatifs normalisés de PLAC8 mesurés par PCR en temps
réel dans les leucocytes mononucléés circulants (LMC), selon le lot de brebis (CYCL :
brebis cyclées, IA vide : brebis vides inséminées avec du sperme normal, LS : brebis
inséminées avec du sperme inactivé, G15 : brebis gestantes). Moyenne par lot ± SEM.
a,b : des lettres différentes indiquent une différence significative (p<0,05). ......... Erreur !
Signet non défini.
Figure 6 : Distribution des niveaux d’expression relatifs individuels de PLAC8 dans les
leucocytes mononucléés circulants (LMC), selon le lot de brebis (CYCL : brebis
cyclées, IA vide : brebis vides inséminées avec du sperme normal, LS : brebis
inséminées avec du sperme inactivé, G15 : brebis gestantes). ......................................... 38
Figure 7 : Niveaux d’expression relatifs normalisés de STAT-1 mesurés par PCR en temps
réel dans les leucocytes mononucléés circulants (LMC), selon le lot de brebis (CYCL :
brebis cyclées, IA vide : brebis vides inséminées avec du sperme normal, LS : brebis
inséminées avec du sperme inactivé, G15 : brebis gestantes). Moyenne par lot ± SEM.
a,b,c : des lettres différentes indiquent une différence significative (a,c : p < 0,05 ; b,c :
p < 0,01). ................................................................................. Erreur ! Signet non défini.
Figure 8 : Distribution des niveaux d’expression relatifs individuels de STAT-1 dans les
leucocytes mononucléés circulants (LMC), selon le lot de brebis (CYCL : brebis
4
cyclées, IA vide : brebis vides inséminées avec du sperme normal, LS : brebis
inséminées avec du sperme inactivé, G15 : brebis gestantes). Erreur ! Signet non défini.
Figure 9 : Niveaux d’expression relatifs normalisés de FOS mesurés par PCR en temps réel
dans les leucocytes mononucléés circulants (LMC), selon le lot de brebis (CYCL :
brebis cyclées, IA vide : brebis vides inséminées avec du sperme normal, LS : brebis
inséminées avec du sperme inactivé, G15 : brebis gestantes). Moyenne par lot ±
SEM. ........................................................................................ Erreur ! Signet non défini.
Figure 10 : Distribution des niveaux d’expression relatifs individuels de FOS dans les
leucocytes mononucléés circulants (LMC), selon le lot de brebis (CYCL : brebis
cyclées, IA vide : brebis vides inséminées avec du sperme normal, LS : brebis
inséminées avec du sperme inactivé, G15 : brebis gestantes). Erreur ! Signet non défini.
Figure 11 : Niveaux d’expression relatifs normalisés de PBEF-1 mesurés par PCR en temps
réel dans les leucocytes mononucléés circulants (LMC), selon le lot de brebis (CYCL :
brebis cyclées, IA vide : brebis vides inséminées avec du sperme normal, LS : brebis
inséminées avec du sperme inactivé, G15 : brebis gestantes). Moyenne par lot ± SEM.
a,b : des lettres différentes indiquent une différence significative (p<0,01). ......... Erreur !
Signet non défini.
Figure 12 : Distribution des niveaux d’expression relatifs individuels de PBEF-1 dans les
leucocytes mononucléés circulants (LMC), selon le lot de brebis (CYCL : brebis
cyclées, IA vide : brebis vides inséminées avec du sperme normal, LS : brebis
inséminées avec du sperme inactivé, G15 : brebis gestantes). ......................................... 41
5
LISTE DES TABLEAUX
Tableau 1 : Orientation, séquence, température de fusion des amorces pour chaque gène
amplifié en RT-qPCR et taille attendue des amplicons. ................................................... 34
Tableau 2 : Répartition du nombre de brebis gestantes selon le nombre d'embryons
observés. ........................................................................................................................... 35
6
LISTE DES ABRÉVIATIONS
ADNc : Acide désoxyribonucléique complémentaire
AP : Activator protein
ARNm : Acide ribonucléique messager
CD : Cluster of differenciation
CYCL : Lot des brebis cyclées non inséminées
Da : Dalton
eCG : Equine chorionic gonadotropin
ELISA : Enzyme-linked immunosorbent assay
EPF : Early pregnancy factor
FOS : FBJ murine osteosarcoma viral oncogene homolog
G15 : Lot des brebis inséminées et gestantes à 15 jours de gestation
GAS : Gamma-activated sequence
GDE : Gènes différentiellement exprimés
GM-CSF : Granulocyte macrophage colony stimulating factor
GnRH : Gonadotropin releasing hormone
GTP : Guanosine triphosphate
hCG : Human chorionic gonadotropin
IA : Insémination artificielle
IFNτ : Interféron tau
IL : Interleukine
INRA : Institut national de recherche agronomique
IP-10 : Interferon-gamma inducible protein 10 kDa)
IRF : Interferon regulatory factor
ISG : Interferon stimulated gene
ISGF : Interfeon stimulated gene factor
ISRE : Interferon-stimulated response element
J0 : Jour de l’insémination
JAK : Janus kinase
LMC : Leucocytes mononucléés circulants
LS : Lot des brebis inséminées avec du liquide séminal
Mx : Myxovirus
NAD : Nicotinamide adénine
NAMPT : Nicotinamide phosphoribosyltransferase
NK : Natural killer
OAS : Oligoadenylate synthetase
PAG : Pregnancy associated glycoproteins
PBEF : Pre-B-cell colony enhancing factor
PGE2 : Prostaglandine E2
PGF2-α : Prostaglandine F2alpha
PSP-B : Pregnancy specific protein B
RIA : Radio-immuno assay
RT-qPCR : Reverse trancriptase quantitative polymerase chain reaction
STAT : Signal transducer and activator of transcription
TNF : Tumor necrosis factor
7
8
9
INTRODUCTION
De nos jours, les élevages bovins laitiers sont soumis à de fortes contraintes économiques,
notamment lors de fluctuations du prix du lait. D’après Lemercier (2009), une vache coûte à un
éleveur français 1,50 euros par jour improductif. Afin d’assurer un rendement correct, il est
essentiel que chaque vache soit non gravide le moins longtemps possible et donc de maîtriser la
reproduction. Dans ce but, il faut non seulement être capable de détecter efficacement les chaleurs
pour inséminer au bon moment et permettre que la fécondation ait lieu, mais aussi détecter les
vaches non gravides (non fécondées ou après une interruption précoce de la gestation) le plus tôt
possible. Cela contribue à réduire l’intervalle vêlage – insémination fécondante et donc l’intervalle
vêlage – vêlage afin d’atteindre l’objectif d’un veau par vache et par an, ce qui assure la santé
économique des élevages laitiers.
Une bonne maîtrise de la reproduction est d’autant plus cruciale que la fertilité a tendance à
diminuer au sein du cheptel bovin laitier. En effet, les vaches et les taureaux laitiers sont depuis
longtemps sélectionnés selon le critère production laitière. Ainsi, on assiste depuis les années 80 à
une forte augmentation de la production laitière avec des vaches laitières hautes productrices qui
produisent jusqu’à plus de 8 000 kg de lait par lactation. En parallèle, la fertilité des femelles
diminue (1 point par an depuis 10 ans) et elles expriment de moins en moins leurs chaleurs. Il
devient donc compliqué pour les éleveurs de détecter les chaleurs de leurs vaches afin de les
inséminer au bon moment ou de s’apercevoir qu’elles ne sont pas gestantes en détectant les retours
après insémination artificielle (IA). Cette difficulté est amplifiée par la taille de plus en plus
importante des élevages pour une main d’œuvre en recul, ce qui rend l’observation des vaches
moins aisée.
Il existe de nombreuses méthodes de diagnostic de gestation utilisables chez les ruminants,
mais pas suffisamment précoces pour permettre de réinséminer au cycle suivant en cas d’échec. On
perd donc au moins un cycle, soit 21 jours chez une vache lors de diagnostic de non gestation. De
plus, certaines vaches nécessitent plus de deux inséminations artificielles pour être fécondées en
raison de la baisse de fertilité chez ces animaux. Un diagnostic de gestation précoce serait d’autant
plus crucial pour ces animaux qui ont tendance à rester non gravides plus longtemps entre deux
gestations et à diminuer le rendement des exploitations. Dans les élevages ovins, un diagnostic de
gestation précoce permet de séparer les brebis gestantes et non gestantes afin d’adapter au mieux
leur alimentation et leurs conditions d’élevage (Karen et al., 2003).
C’est pourquoi il est important de rechercher une méthode permettant de diagnostiquer la
gestation dans les 21 jours qui suivent l’insémination chez la vache et dans les 17 jours chez la
brebis, de manière fiable, non invasive et utilisable sur le terrain. De nombreux travaux ont déjà été
menés sur ce sujet, notamment pour trouver des gènes exprimés dans les cellules immunitaires du
sang périphérique dont l’expression diffère entre les animaux gestants et non gestants en début de
gestation. Cependant, ils n’ont pas permis de définir un ou plusieurs gènes suffisamment fiable(s)
pour être utilisé(s) en pratique.
Le travail présenté dans ce manuscrit et effectué chez la brebis, modèle ruminant plus
accessible que la vache, avait pour but d’identifier des gènes dont le niveau d’expression diffère
entre les animaux gestants et non gestants dès 15 jours après l’insémination. Ces gènes ont été
analysés à partir des leucocytes mononucléés circulants (LMC) du sang périphérique ; ainsi, la
manipulation en élevage consiste en une prise de sang, ce qui est peu invasif. Dans une première
10
partie bibliographique, nous rappellerons les mécanismes intervenant dans la mise en place et le
maintien de la gestation, nous présenterons les méthodes existantes pour diagnostiquer la gestation
chez les ruminants et enfin, nous ferons le bilan des connaissances acquises chez ces animaux à
propos des gènes stimulés en début de gestation. Puis dans une seconde partie, nous présenterons
l’étude expérimentale réalisée sur des brebis. Ce travail servira de base à d’autres travaux menés
cette fois sur des échantillons provenant de vaches laitières.
11
PREMIERE PARTIE : Étude bibliographique
I. Mécanismes impliqués dans la mise en place et le maintien de la gestation
chez les ruminants
A. Les cycles de la vache et de la brebis
La reproduction des femelles de ruminants est soumise à un cycle que l’on peut décomposer
en une phase lutéale et une phase folliculaire. Ce cycle dépend en partie de l’utérus, car c’est
l’endomètre qui produit l’hormone lutéolytique : la prostaglandine F2α (PGF2α). Ce sont les pulses
de PGF2α induits par l’ocytocine qui vont entraîner la régression du corps jaune ovarien et ainsi
mettre fin à la phase lutéale. Ce mécanisme dépend également de l’action en amont des hormones
sexuelles femelles que sont les œstrogènes ainsi que la progestérone et c’est tout cet équilibre qui va
être modifié afin de passer du cycle à la gestation (Spencer et al., 2004).
1. Le cycle de la vache
Le cycle de la vache dure en moyenne 21 jours et il s’agit d’un cycle œstral non saisonnier
chez la vache laitière. Il comporte une phase lutéale qui dure 16 à 17 jours durant laquelle le corps
jaune est fonctionnel et une phase folliculaire qui dure 4 à 5 jours durant laquelle se produit la
maturation finale du follicule dominant aboutissant à l’ovulation. C’est à la fin de cette phase du
cycle que la vache exprime un comportement d’œstrus. Les chaleurs durent en moyenne 14 heures
chez les vaches laitières, un peu moins chez les génisses et il existe de grandes variations entre les
races et les individus. Néanmoins, on peut noter que cette période est courte et impose une
observation assidue des animaux pour inséminer au bon moment, c’est-à-dire dans les heures qui
suivent l’observation du comportement d’œstrus. De plus, l’intensité de ces comportements est
devenue faible voire inexistante chez certaines vaches hautes productrices qui refusent le
chevauchement par une femelle congénère, même lors de leurs chaleurs. C’est pourquoi il est
délicat d’utiliser ce comportement pour détecter un échec de l’insémination ou une mortalité
embryonnaire précoce, auquel cas la vache reviendrait en chaleurs 21 jours après l’insémination et
pourrait être ré-inséminée sur chaleurs observées sans perdre un cycle.
2. Le cycle de la brebis
Le cycle de la brebis est plus court (17 jours) et saisonnier, la saison de reproduction se
situant entre septembre et février ; l’ovin est donc une espèce saisonnière à jours courts. L’œstrus
dure 24 à 36 heures et l’ovulation se produit 18 à 36 heures après le début des chaleurs. La détection
des chaleurs n’est pas réalisée en élevage ovin car les brebis sont en général saillies de façon
naturelle, dans les conditions d’élevage. Si l’insémination artificielle est choisie chez ces animaux,
ils doivent impérativement subir un protocole de synchronisation des cycles.
12
B. Mise en place de la gestation chez les ruminants
1. De la fécondation à l’implantation
La fécondation est permise suite à une saillie ou une insémination artificielle au moment des
chaleurs dans les 2 espèces. Elle a lieu dans l’oviducte. La cellule-œuf formée subit des divisions et
devient un embryon. Ce dernier arrive dans l’utérus vers J5 (Figure 1) encore entouré de la zone
pellucide et reste libre encore plusieurs jours avant de s’implanter, l’implantation étant tardive chez
les ruminants. Durant cette phase au cours de laquelle l’embryon est libre dans l’utérus, il se sépare
de la zone pellucide qui l’entoure : on parle d’éclosion (Figure 1). Puis il subit une importante
élongation, passant ainsi d’une forme sphérique à une forme tubulaire et enfin filamenteuse. Dès
cette période de la gestation au cours de laquelle l’embryon n’a pas encore de contact physique avec
l’endomètre maternel, les différenciations cellulaires se mettent en place. Les premières cellules à
se différencier forment le trophoblaste qui constituera la partie embryonnaire du placenta appelé par
la suite trophectoderme. C'est également pendant cette phase que l’embryon communique avec
l’organisme maternel par l’intermédiaire de substances signalant la gestation dont la plus connue est
l’interféron tau (IFNτ). Ces substances sont produites par les cellules trophoblastiques (Roberts,
2007).
Figure 1 : Comparaison chronologique des étapes de la mise en place d’une gestation chez la
vache et la brebis.
Chez la vache :
Chez la brebis :
Durée du IA entrée de l’embryon éclosion implantation Durée
cycle dans l’utérus gestation
= 21 jours = 280 jours
J0 J5 J10 J22
Durée du saillie entrée de l’embryon éclosion implantation Durée
cycle dans l’utérus gestation
= 17 jours = 145 jours
J0 J5 J9 J16
13
2. Implantation et formation du placenta
Avant l’implantation, la nutrition du conceptus est assurée par les histotrophes, produits par
les glandes endométriales, situées dans l’espace inter-caronculaire et indispensables à la survie et au
développement de l’embryon en début de gestation (Gray et al., 2001). En effet, une étude menée
sur des brebis a montré que l’inactivation de ces glandes provoquait des avortements, un défaut de
développement et des différences dans l’activation de gènes normalement activés dans un utérus
gestant par rapport à un utérus non gestant (Gray et al., 2006).
La morphogénèse et la différenciation fonctionnelle des glandes endométriales nécessite une
action conjuguée des hormones d’origine maternelle et fœtale avec intervention de l’œstradiol-17β,
de la prolactine (Gray et al., 2001), de la progestérone, de l’hormone de croissance, du lactogène
placentaire et de l’IFNτ (Spencer et al., 2004). La progestérone agit sur l’utérus gestant en
autorégulant négativement l’expression de ses récepteurs au niveau de l’épithélium glandulaire et
c’est cette absence de récepteurs à la progestérone qui permet l’apparition de la fonction
différenciée des glandes (Spencer et al., 2004). En revanche, les récepteurs restent présents au
niveau du myomètre et du stroma : la progestérone régule ainsi les réponses des différents types
cellulaires qui constituent l’utérus et coopère avec l’IFNτ pour mettre en place et maintenir la
gestation (Gray et al., 2006).
L’implantation consiste en un contact fœto-maternel intime à la fois physique et
physiologique qui constitue le point de départ de la placentation. Elle intéresse d’une part le
trophectoderme et d’autre part les couches les plus superficielles de la paroi utérine qui
comprennent l’épithélium luminal et l’épithélium glandulaire superficiel (Lee et DeMayo, 2004).
L’épithélium utérin comporte chez les ruminants des zones stromales aglandulaires appelées
caroncules (Gray et al., 2001). Les couches plus profondes de la paroi utérine (épithélium
glandulaire profond, myomètre et stroma) subissent également des modifications lors de la gestation
mais n’interviennent pas dans l’implantation. Cette dernière comprend plusieurs étapes qui doivent
se succéder dans un ordre bien défini afin d’assurer la pérennité de la gestation : après éclosion
(sortie du blastocyste de la zone pellucide), il y a d’abord orientation du conceptus au contact de
l’épithélium luminal et glandulaire superficiel de l’endomètre, puis apposition et adhésion du
trophectoderme avec l’endomètre (Bazer et al., 2008). C'est au terme de l'implantation que se
forment les cotylédons qui sont des groupes de villosités trophoblastiques qui se développent en
face puis au sein des caroncules utérines qui vont croître simultanément. L’association de ces deux
structures (caroncule et cotylédon) constitue des unités placentaires appelées placentomes au niveau
desquels se feront les échanges de gaz et de nutriments durant la gestation (Lee et DeMayo, 2004).
Au début de l'implantation, lorsque les premiers contacts cellulaires se mettent en place
entre le trophoblaste et l'endomètre, apparaissent des cellules binucléées au sein de l'épithélium
trophoblastique qui représentent 15-20 % de cette population cellulaire. Dans les cotylédons, ces
cellules binucléées ont un destin particulier car elles migrent vers l'endomètre et fusionnent avec
une (chez la vache) ou plusieurs (chez la brebis et la chèvre) cellules épithéliales utérines. C'est à
cause de ce phénomène que l'on parle de placenta synépithélio-chorial chez les ruminants. Il sera
évoqué de nouveau à propos du diagnostic de gestation par dosage de protéines spécifiques de la
gestation.
14
C. Place de la communication fœto-maternelle dans la mise en place de la gestation
1. Rôles de l’IFNτ en début de gestation
La communication s’établit entre l’organisme maternel et le conceptus dans les 2 sens avec
des signaux différents qui concourent à la mise en place et au maintien de la gestation. Elle
commence pendant la période pré-implantatoire, d’après des études menées à J18 post-IA sur des
vaches (Klein et al., 2006 ; Bauersachs et al., 2006). Elles ont montré que des changements dans le
transcriptome de l’endomètre bovin étaient induits par l’embryon avant l’implantation, avec
stimulation de l’expression de 87 gènes dont la moitié est stimulée par les interférons de type I, dont
l’IFNτ, produit par l'embryon de ruminants. Ces gènes interviennent dans la modulation du système
immunitaire maternel, dans l’adhésion cellulaire et dans le remodelage de l’endomètre.
L’IFNτ est produit par les cellules mononuclées du trophectoderme embryonnaire à partir de
J10 chez la brebis et J14 chez la vache, et de façon soutenue sur plusieurs jours (Roberts, 2007). Sa
production est maximale au moment de l’implantation, qui commence respectivement à J16
(Spencer et al., 2004) et J19-20 (King et al., 1980). Il devient indétectable à partir de 4 semaines de
gestation chez la brebis (Roberts, 2007). Il a pour rôle de signaler à l’organisme maternel la
présence du conceptus par l’intermédiaire d’un mécanisme paracrine afin d’empêcher la lutéolyse.
Sa liaison aux récepteurs endométriaux aux interférons de type I induit une diminution du
nombre de récepteurs à l’ocytocine et aux œstrogènes dans les épithéliums luminal et glandulaire
superficiel, ce qui diminue la synthèse de PGF2α et donc modifie le ratio PGE2/PGF2α en faveur
de PGE2 (Johnson et al., 2001). Cela empêche la lutéolyse, permet le maintien du corps jaune et
donc de la production de progestérone, hormone fondamentale pour la mise en place et le maintien
de la gestation. Cette hormone agit en stimulant et en maintenant les fonctions utérines qui
permettent le développement embryonnaire précoce, l’implantation, la placentation et la poursuite
de la gestation avec un développement fœtal et placentaire optimal (Spencer et al., 2004). La
progestérone augmente par ailleurs l’expression dans l’utérus de nombreux gènes stimulés par
l’interféron (ISG) (Oliveira et al., 2008). La progestérone et l’IFNτ activent donc des voies de
signalisation complémentaires pour moduler l’expression de nombreux gènes exprimés au niveau
de l’épithélium luminal et glandulaire superficiel et qui participent à la réceptivité utérine et au
développement fœtal (Bazer et al., 2008).
De plus, on observe une augmentation de l’expression des gènes stimulés par l’IFNτ dans
d’autres tissus : c’est le cas dans le corps jaune, mais aussi dans les leucocytes mononucléés
circulants (LMC). Cela indique qu’en plus d’une action paracrine sur l’endomètre, l’IFNτ possède
également un mécanisme d’action endocrine sur l’organisme maternel en début de gestation. Les
rôles endocrines de l'IFNτ ne sont pas très bien connus, mais on peut envisager, les fonctions
classiques d’un interféron étant d’assurer un rôle antiviral, antiprolifératif et immunosuppressif, que
l’IFNτ possède des fonctions biologiques particulières afin de protéger la gestation (Bazer et al.,
2008). Cette action de l’IFNτ sur les LMC offre une opportunité de détecter la gestation de façon
précoce et peu invasive à partir du sang périphérique (Oliveira et al., 2008).
2. Rôles du système immunitaire dans le maintien de la gestation
L'embryon, qui possède des caractéristiques génétiques du père, peut être considéré comme
du "non soi" par l'organisme maternel. Cependant, l’endomètre doit lui fournir un environnement
favorable ; une régulation fine du système immunitaire maternel est donc nécessaire pour le
maintien de la gestation.
15
L'embryon produit plusieurs cytokines, la plus connue étant l'IFNτ, qui inhibe la
prolifération des lymphocytes et stimule l'activité des cellules natural killer (NK), et aurait donc un
rôle important dans la tolérance immunologique de l'embryon par l'organisme maternel (Nagaoka et
al., 2003). Ces effets de l’IFNτ sur l’immunité ont un impact positif sur l’établissement de la
gestation et la placentation (Stevenson et al., 2007). Cela renforce son importance dans la mise en
place d’une gestation puisqu’il a été montré chez l’Homme et la souris que les cellules de
l’immunité entraient en jeu lors de la gestation, d’une part afin de lutter contre les infections trans-
placentaires avec notamment intervention des NK, et d’autre part pour participer à la placentation
normale (Boysen et Storset, 2009).
En parallèle, l'organisme maternel réagit à la présence de l'embryon localement. Dans
l'utérus, on observe une augmentation de la proportion de certaines populations leucocytaires. Ainsi,
on observe chez les femelles gestantes une augmentation des lymphocytes à récepteurs T γδ et CD8
chez la brebis (Oliveira et al., 2008 ; Fox et al., 2010), et des macrophages CD68 et CD14 chez la
vache (Oliveira et al., 2008). La réaction maternelle à la présence de l'embryon est aussi visible
dans la circulation sanguine. On observe une modification de certaines populations leucocytaires
dans le sang : augmentation des lymphocytes CD4+ et CD25+ chez la vache à un mois de gestation
(Oliveira et Hansen, 2008). Ceci est également observé chez la femme et on constate que les
femmes qui subissent des avortements spontanés répétés ont un nombre réduit de ces cellules dans
le sang (Yang et al., 2008). Ces cellules influenceraient donc la réussite de la gestation dans
l’espèce humaine, mais aussi dans l’espèce ovine. En effet, d’après Nagaoka et al. (2003), il est
souvent rapporté que le système immunitaire s'orienterait vers une réponse de type humoral pendant
la gestation chez la brebis. Or, dans cette étude, il a été montré d’une part que l’activité des cellules
NK augmentait en début de gestation et d’autre part qu’il était possible d’induire un avortement in
vivo par l’utilisation d’anticorps anti-CD8+. Les auteurs en ont déduit que la présence de cellules
NK et CD8+ sont nécessaires à l’immunotolérance envers le conceptus et donc au maintien de la
gestation dans l’espèce ovine.
Les rôles des cellules immunitaires dans le maintien de la gestation ne sont pas très bien
connus et sont peu décrits chez les ruminants. Ils l'ont davantage été chez l’Homme et la souris.
Dans une première étude, des cellules lutéales cultivées in vitro ont produit plus de progestérone en
présence de LMC issus de femmes enceintes qu'en présence de LMC issues de femmes non
enceintes. Ce dernier effet était amplifié par l’utilisation d’hCG recombinant qui semble augmenter
la production de cytokines par les LMC (Fujiwara, 2009). Une autre étude menée chez l’Homme
sur des cultures cellulaires in vitro montre que les LMC entraînent des changements fonctionnels
sur les cellules épithéliales endométriales, régulant la réceptivité de ces cellules par l’intermédiaire
de cytokines (Kosaka et al., 2003).
L'administration intra-utérine de LMC avant transfert d'embryon a d'ailleurs permis
d'améliorer le taux de gestation chez des femmes ayant recours à la procréation médicalement
assistée et ayant subi plusieurs échecs d'implantation (Fujiwara, 2009), ainsi que chez des vaches
(Ideta et al., 2010). Dans cette dernière étude, il a été montré que l’administration intra-utérine de
LMC augmentait significativement la transcription du facteur stimulant des macrophages (GM-
CSF) dans les cellules lymphoïdes de la paroi utérine. De plus, les embryons présentaient une
meilleure croissance à J15 dans le groupe auquel on avait administré les LMC. Ils en ont déduit que
les LMC amélioraient l’environnement utérin, optimisant ainsi le développement précoce de
l’embryon, même avant son implantation, et expliquant l'amélioration du taux de gestation. La
reconnaissance de la gestation a donc lieu avant l’implantation et très précocement puisque la
différence de croissance embryonnaire peut être constatée dès J15. Fujiwara (2009) a également
conclu que les LMC participeraient en coopération avec le système endocrine maternel (hCG) à la
16
communication fœto-maternelle et contribueraient à la transmission de l'information de la présence
d'un embryon, induiraient la différenciation de l'endomètre nécessaire à l'implantation,
participeraient à la mise en place du placenta et de l'angiogénèse. Cette réaction immunitaire a une
importance fonctionnelle pour l’établissement et le maintien de la gestation localement.
II. Méthodes usuelles de diagnostic précoce de la gestation chez les ruminants
Il existe aujourd’hui plusieurs méthodes pour diagnostiquer la gestation à différents stades
chez les ruminants. Nous allons nous intéresser ici aux méthodes de diagnostic précoce de la
gestation car notre objectif est de différencier le plus tôt possible les animaux gestants des animaux
non gestants. On peut effectuer une simple prise de sang et utiliser des molécules présentes dans le
sang maternel ou bien visualiser, voire palper le fœtus.
A. Mise en évidence de l’EPF (early pregnancy factor)
Parmi les molécules que l’on peut rechercher dans le sang maternel, celle qui apparaît le plus
précocement est l’EPF (early pregnancy factor). Cette molécule est détectable chez la brebis
gestante dès 24 heures après la fécondation grâce un test d’inhibition des rosettes. Cependant, ce
test est trop compliqué à mettre en place en élevage et surtout, il n’est pas suffisamment fiable en
raison de nombreuses réactions croisées (nombreux faux positifs, Karen et al., 2003). Dans l’espèce
bovine, le même type de test existe et permet d’après Ghaffari et al. (2008) de distinguer les
femelles gravides et non gravides au cours de la première semaine de gestation. Cependant, la
spécificité de cette molécule est faible (autour de 50%) en raison de nombreux faux positifs
(Cordoba et al., 2001 ; Ambrose et al., 2007). Ce test n’est donc plus utilisé chez les ruminants.
B. Dosage de la progestérone dans le plasma ou dans le lait
1. Principe du diagnostic
La progestérone est sécrétée par le corps jaune aussi bien lors de la phase lutéale du cycle
que lors de la gestation au cours de laquelle il persiste de façon prolongée. On peut donc se baser
sur le dosage de cette hormone pour détecter les femelles gravides qui auront une progestéronémie
élevée persistante par rapport à aux femelles non gravides et cyclées chez lesquelles la lyse du corps
jaune avant l’œstrus va entraîner une baisse de la progestéronémie. Cette méthode est utilisable à
partir de J18 chez la brebis (Karen et al., 2003) et selon les études, on peut l’utiliser chez la vache
entre J19-J21 et J23-J24 (Isobe et al., 2005 ; Romano et al., 2006).
2. Résultats obtenus chez la brebis
Cette méthode est sensible (100%) mais pas très spécifique (95,4%) car le niveau de
progestérone dépend de plusieurs facteurs tels que l’irrégularité du cycle, la mortalité embryonnaire,
la présence d’une infection utérine ou de kyste lutéal. C’est pourquoi la fiabilité de la
progestéronémie est variable suivant les différentes études existantes. La progestéronémie est plus
fiable pour diagnostiquer l’absence de gestation avec une valeur prédictive négative de 100% alors
que la valeur prédictive positive n’est que de 81,6%. Il convient tout de même de signaler que dans
l’espèce ovine, le manque de consensus sur la méthode de mesure de la progestéronémie ainsi que
17
sur ses niveaux de référence qui peuvent varier en fonction de la prolificité de la race, rendent son
utilisation plus délicate (Alexander et al., 2008).
On peut également utiliser, chez les brebis laitières, le dosage de la concentration de
progestérone dans le lait, qui est sensiblement la même que celle dans le plasma (environ 3,7 ng/mL
chez les femelles gestantes et < 1 ng/mL chez les non gestantes) entre J18 et J22. Ainsi, Shemesh et
al. (1979) ont mis en évidence que la concentration en progestérone dans le lait permettait de
diagnostiquer, pendant la saison de reproduction, la gestation avec une précision similaire à la
concentration plasmatique de progestérone (82%) et la non gestation avec une précision de 92 à
100% dans le lait alors qu’elle est de 100% dans le sang. Cependant, chez les brebis dessaisonnées,
la précision n’est que de 50% dans le lait pour détecter l’absence de gestation, alors qu’elle est de
92% pour la progestérone plasmatique. Les valeurs restent similaires pour objectiver une gestation
(100% dans le lait et 92% dans le sang). La conduite d’élevage a donc une influence sur les
possibilités de faire ce dosage dans le lait et sur l’interprétation du résultat.
3. Résultats obtenus chez la vache
L’étude menée par Humblot et al. (1988) fait état d’une valeur prédictive positive de la
progestéronémie à J24 de 67,2% et d’une valeur prédictive négative de 98%. Cela confirme que la
progestérone est surtout intéressante pour un diagnostic de non gestation quand son taux est faible
alors qu’un taux de progestérone élevé peut être le témoin d’une phase lutéale prolongée ou d’une
anomalie génitale comme chez la brebis. Les variations de concentration en progestérone peuvent
aussi être dues à la méthode utilisée pour la détection (ELISA, agglutination sur latex, radio-
immunologie, Romagnolo et Nebel, 1993).
Des résultats similaires sont observés lors de dosage de la progestérone dans le lait, chez la
vache laitière, entre J18 et J24. Seida et al. (1990) ont obtenu des valeurs prédictives positives allant
de 56% à J18 à 79% à J24 et des valeurs prédictives négatives allant de 90% à J18 à 93% à J24.
Une autre étude se basant sur un diagnostic à 21 jours a fait état d’une précision moyenne, avec une
valeur prédictive positive de 71% et une valeur prédictive négative de 81% (Wimpy et al., 1986).
Enfin, d’après Pieterse et al. (1990), le dosage de la progestérone dans le lait autour de J25 a donné
de nombreux faux négatifs, ce qui pose problème dans les conditions d’élevage.
4. Intérêts et limites de la méthode
La progestéronémie présente un intérêt biologique dans la mesure où elle reflète directement
le développement placentaire et embryonnaire. En effet, on s’aperçoit en comparant des gestations
qui vont jusqu’au terme avec d’autres qui se soldent par une résorption embryonnaire que les profils
de progestéronémie sont significativement différents avec des valeurs bien plus basses dès J19
lorsque l’embryon ne se développe pas (Alexander et al., 2008). Cependant, la progestérone est
aussi le témoin de nombreux événements autres que la gestation au niveau de l’appareil génital
femelle. Il faut également attendre 21 jours pour avoir un diagnostic fiable puisque le niveau de
progestérone entre J0 et J21 est le même que chez une femelle cyclée. Cette méthode présente donc
un risque de faux positifs et, bien que précoce, ne permet pas d’utiliser le cycle en cours.
Le dosage de la progestérone, que ce soit dans le sang ou dans le lait, ne nécessite qu’un
simple prélèvement en élevage et les tests de détection en laboratoire ont depuis longtemps été mis
au point. Il s’agit donc d’une méthode pratique et assez peu coûteuse mais elle manque de
spécificité. Elle est efficace pour diagnostiquer l’absence de gestation à J21 mais manque de
fiabilité lorsque l’on souhaite confirmer la gestation.
18
5. Cas particulier de la progestérone fécale chez la vache
Une étude fait aussi mention de l’utilisation de la progestérone fécale avec une concentration
moyenne significativement différente entres vaches gestantes et non gestantes entre J19 et J24. La
précision est de 100% pour détecter l'absence de gestation avec un faible taux de progestérone. Les
interactions alimentaires peuvent néanmoins modifier la détection de la progestérone dans les fèces
(Isobe et al., 2005).
C. Dosage des protéines spécifiques de la gestation
Chez les ruminants, dès le début de l'implantation, les cellules trophoblastiques produisent
des glycoprotéines associées à la gestation (pregnancy associated glycoproteins ou PAG) de la
famille des protéinases aspartiques, mais elles semblent ne pas avoir d’activité enzymatique. Jusqu'à
aujourd'hui, 22 gènes ont été identifiés, dont l'expression est plus ou mois précoce et plus ou moins
longue au cours de la gestation. Ces protéines sont stockées dans des granules cytoplasmiques et
sont libérées dans le stroma utérin, lors de la fusion de ces cellules trophoblastiques avec des
cellules épithéliales utérines. Elles parviennent ensuite dans la circulation sanguine maternelle.
Elles peuvent ainsi être mises en évidence chez les femelles gravides à partir d'une prise de sang,
par dosage radio-immunologique (radio-immuno assay ou RIA). La première PAG identifiée et
dont le dosage est utilisé à l'heure actuelle en France comme méthode de diagnostic de gestation des
ruminants est connue dans le milieu de l'élevage sous le nom de PSP-B (pregnancy specific protein
B) (Butler et al., 1982). Mais à l'heure actuelle, différents anticorps reconnaissant différentes
protéines sont utilisés pour le dosage des PAG, dans le monde, expliquant les différences observées
entre les études.
Chez la brebis, d’après Karen et al. (2003), elle serait fiable dès J22 et plus spécifique que la
progestérone (100%) avec une valeur prédictive positive de 100%, mais Ranilla et al. (1994) ont
rapporté une valeur prédictive positive bien inférieure (66,6%) à J21. Ainsi, ils ont mis en évidence
des différences de niveau de PAG suivant la race (étude en parallèle sur des Churra et des Mérinos)
et suivant le sexe du fœtus. Quant à El Amiri et al. (2007), ils ont obtenu une concentration
plasmatique de PAG significativement différente entre les brebis gestantes et non gestantes dès J18.
La PSP-B peut être utilisée à partir de J26 avec une sensibilité de 100% mais une spécificité plus
faible (83%) (Ruder et al., 1988).
Chez la vache, les PAG sont détectables dans le sang maternel vers J33 ou J45 selon les
études (Romano et al., 2006). D’après Gajewski et al. (2008), elles peuvent être recherchées par
dosage radio-immunologique dans le sang, mais aussi dans le lait à partir de J28 avec une sensibilité
et une spécificité très élevées. De plus, les différents tests basés sur la RIA sont bien corrélés entre
eux, donc fiables, et indiquent que la concentration des PAG augmente entre J21 et J30, puis
diminue à partir de J30 (Ayad et al., 2009). Sa précision est maximale entre J30 et J35 et son
efficacité à détecter les femelles non gestantes à J30 est bien supérieure à celle du dosage de la
progestérone à J24 (Humblot et al., 1988).
La limite de ce test dans l’espèce bovine est liée à sa demi-vie particulièrement longue. Ces
protéines persistent 20 +/- 8 jours après l’interruption de la gestation : un niveau bas de PAG chez
une vache gestante pourrait donc être prédictif d’un avortement mais leur présence ne suffit pas à
démontrer que le fœtus est bien viable (Romano et Larson, 2010). Cette demi-vie très longue fait
aussi que les PAG sont présentes dans le sang maternel 70 à 100 jours après le vêlage et donc
éventuellement au début de la gestation suivante. Il est important de prendre en compte ce
paramètre car d’après une autre étude de Romano et al. (2006), le taux de mort embryonnaire et
19
fœtale au cours du 1er
trimestre de gestation chez les bovins varie de 10 à 20%. Ce taux a tendance à
augmenter avec la parité et lors de gestation gémellaire.
Les PAG présentent l’avantage de témoigner de la présence d’un tissu embryonnaire viable
étant donnée leur lieu de production, ce qui constitue une indication plus précise du bon
déroulement de la gestation. Leur détection ne nécessite qu’une prise de sang et elles apportent une
meilleure précision que l’échographie dans les 30 premiers jours de gestation. En revanche, les
techniques de détection passent par la radio-immunologie, ce qui coûte cher au laboratoire, présente
le danger de la radioactivité et demande un délai avant d’obtenir les résultats. Il serait donc
intéressant de développer une méthode de détection de type ELISA, sous forme de kit, pour
s’adapter aux conditions de terrain et au budget des éleveurs (Karen et al., 2003).
En dehors des méthodes de laboratoire, qui nécessitent une prise de sang, on peut également
se baser sur des méthodes d’imagerie pour diagnostiquer la gestation.
D. L’échographie transrectale et trans-abdominale
On peut employer l’échographie par voie transrectale sur brebis debout ou couchée, dans des
conditions de manipulations plus délicates que chez la vache, étant donné le format de l’animal, ou
par voie trans-abdominale. L’échographie transrectale manque de sensibilité avant J24, avec une
précision de 50% entre J17 et 24, qui atteint 85% à J32. La précision est meilleure lorsqu’il s’agit
d’exclure une gestation, puisque la spécificité de l’échographie est de 80% de J21 à J23 et de 98% à
partir de J32 (Garcia et al., 1993). La voie transrectale peut également permettre de réaliser un
examen Doppler afin de détecter le pouls fœtal, mais cette méthode apporte des résultats
satisfaisants à partir de J40 seulement. Par voie trans-abdominale, on peut utiliser l’échographie
mode A (basée sur l’amplitude et la profondeur) avec un dispositif appelé Preg-Alert ou
l’échographie mode B avec un échographe équipé d’une sonde sectorielle de 3,5 MHz ou de 5
MHz. Le Preg-Alert ne peut être utilisé avant J30 d’après le constructeur et il est précis seulement à
partir de J60. En revanche, l’échographie trans-abdominale avec une sonde de 3,5 MHz peut être
utilisée à partir de J40 avec une valeur prédictive positive de 94% (Ganaie et al., 2009). Avec une
sonde de 5 MHz, Yotov (2005) a obtenu une valeur prédictive positive de 87% à J27 et de 98% à
J35, tandis que Gearhart et al. (1988) ont obtenu une valeur prédictive négative de 100% à partir de
J25 et une valeur prédictive positive de 100% à partir de J51. Ces différences s’expliquent par le
changement de manipulateur car la réalisation et l’interprétation d’images échographiques
nécessitent de l’expérience.
Chez la vache, l’échographie ne s’utilise que par voie transrectale, à l’aide d’un échographe
équipé d’une sonde linéaire de 5 MHz ou de 7,5 MHz. Différentes études ont été réalisées autour de
J25 et les auteurs ont observé des valeurs prédictives positives autour de 95% et des valeurs
prédictives négatives autour de 89% (Taverne et al., 1985 ; Hanzen et Delsaux, 1987 ; Pieterse et
al., 1990 ; Nation et al., 2003). Les premiers signes évocateurs de la gestation (accumulation de
liquide dans l’utérus et apparition des membranes embryonnaires sans forcément visualiser
l'embryon) peuvent apparaître entre J21 et J25, mais la sensibilité (44,8%) est beaucoup plus faible
qu’entre J25 et J33 (97,7%), tandis que la spécificité se situe autour de 85%. On peut donc
considérer qu’il s’agit d’une technique réellement fiable à partir de J30 chez la vache. On note
également une différence dans l’efficacité de l’échographie entre les vaches et les génisses. En
réalisant des échographies entre J21 et J27 chez des génisses et entre J24 et J30 chez des vaches, on
obtient une sensibilité et une valeur prédictive positive maximale à J26 chez les génisses et J29 chez
les vaches. Cette différence est due à la position du tractus génital qui est plus basculé dans
l’abdomen une fois que l’animal a été gestant (Romano et al., 2006).
20
Lorsqu’on compare la précision de l’échographie avec le dosage des PAG pour les femelles
qui ont déjà vêlé, il n’y a pas de différence significative de précision entre J26 et J58. En revanche,
l’échographie donne moins de faux positifs si on s’intéresse aux femelles qui n’ont pas vêlé. Cette
différence semble due à la mortalité embryonnaire de 8,6% dans cette étude et à la persistance des
PAG dans le sang maternel après la résorption embryonnaire (Szenci et al., 1998). L’échographie
est une méthode fiable, facilement réalisable sur le terrain, économique et peu invasive mais elle
nécessite de l’expérience de la part du manipulateur pour obtenir les images et les interpréter. Elle
présente en outre l’avantage de permettre d’évaluer la viabilité embryonnaire ou fœtale et de limiter
les erreurs de diagnostic.
E. La palpation transrectale
Cette méthode ne peut pas être utilisée dans l’espèce ovine en raison du format de l’animal.
Elle est en revanche couramment employée chez les bovins. Il s’agit de palper l’utérus à travers la
paroi du rectum afin de déterminer s’il est gravide ou non, par la mise en évidence d'une
augmentation du diamètre des cornes utérines, par la perception de liquide dans l'utérus ou/et la
perception du fœtus, des cotylédons et des enveloppes fœtales. Cette méthode peut être mise en
pratique à partir de J35, voire J33, par un manipulateur qui en a l’expérience. Il est également
possible de mettre en évidence les membranes fœtales en pinçant la paroi utérine entre deux doigts
et en la relâchant progressivement, en faisant glisser ses doigts perpendiculairement à l'axe de la
corne. Lors de gestation, on peut sentir que l'on relâche d'abord les enveloppes fœtales avant la
paroi utérine. Cette méthode controversée n'a pourtant pas eu d'impact négatif sur la viabilité du
fœtus dans une étude réalisée dans les conditions de terrain entre J35 et J41 (Romano et al, 2007)
Warnick et al. (1995) ont observé pour un diagnostic entre J30 et J36, 10% de faux négatifs
et 16% de faux positifs, ces chiffres étant réduits respectivement à 5% et 4% à partir de J37. Il
convient donc de prendre en compte un nombre assez important de faux négatifs en début de
gestation, ce qui est confirmé par l’étude de Romano et al. (2006).
La palpation transrectale est très couramment utilisée, nécessite de l’expérience mais pas de
matériel spécifique. Elle est peu risquée pour le fœtus et peu invasive pour la mère. Cependant, elle
reste un peu plus tardive que l’échographie.
L’échographie, trans-abdominale chez la brebis et transrectale chez la vache, reste le moyen
le plus précis, sûr, rapide, pratique et économique de réaliser un diagnostic de gestation, dans les
conditions de terrain, mais il n’est pas très précoce. Le dosage des molécules dans le sang maternel,
bien que plus précoce, n’est pas utilisé car même s’il ne nécessite qu’une prise de sang, les tests
radio-immunologiques qui permettent leur détection ont un coût rédhibitoire dans les conditions
d’élevage. Au vu des résultats des différentes études, il faut tout de même attendre J30 chez les
ovins et les bovins pour avoir un diagnostic suffisamment fiable avec l’échographie, ce qui est tardif
par rapport à ce que l’on voudrait obtenir dans l’idéal (respectivement avant J17 et avant J21). Nous
sommes donc à la recherche de moyens beaucoup plus précoces de diagnostiquer la gestation chez
les ruminants.
Ces méthodes sont intéressantes pour l'éleveur, afin de lui permettre de gérer la production
laitière (élevage laitier) ou de veaux (élevage allaitant) et d'organiser son travail (surveillance des
vêlages). Cependant, quelle que soit la méthode utilisée, le diagnostic de gestation est trop tardif
pour les femelles non gestantes : on a perdu un cycle et donc 17 jours de production pour la brebis
21
et 21 jours pour la vache. On voit donc l’intérêt de détecter les femelles non gestantes le plus tôt
possible, afin de pouvoir utiliser le cycle en cours.
C’est pourquoi nous cherchons à identifier une autre méthode de diagnostic de gestation.
Cette méthode est basée sur des niveaux d'ARNm différents entre les femelles gestantes et les
femelles non gestantes, de gènes exprimés par les cellules mononuclées circulantes. Ces gènes sont
principalement des gènes stimulés par l’IFNτ.
III. Gènes stimulés par l’interféron chez les ruminants
Les ISG (interferon stimulated genes) sont des gènes dont l’expression est stimulée par
l’IFNτ produit par les cellules du trophoblaste en début de gestation. L’IFNτ est présent en grande
quantité dans la lumière utérine et stimule l'expression de nombreux gènes dans l'endomètre. Il n'a
pas pu être mis en évidence de manière directe dans le sang des femelles gestantes, néanmoins,
l'expression des ces ISG est également modifiée au niveau des cellules immunitaires circulantes lors
de gestation (Oliveira et al., 2008). Cela offre une possibilité de détection de changements
d’expression des gènes dans le sang périphérique par une prise de sang. Étant donné qu’il s’agit de
gènes étroitement liés à la gestation, on peut entrevoir l’opportunité de la détecter par une prise de
sang en se basant sur l’expression des ISG, d’où les études réalisées sur ces gènes chez les
ruminants.
A. Stimulation de l'expression des ISG par l’IFNτ
1. L’IFNτ possède une action paracrine
L’IFNτ est un petit polypeptide de 22 à 26 kDa sécrété par les cellules mononucléées du
trophoblaste qui agit de manière paracrine sur différents tissus (Schmitt et al., 1993), dont
l'endomètre, premier tissu au contact du trophoblaste. Oliveira et al. (2008) se sont intéressés à la
bioactivité de l’IFNτ en différenciant les animaux gestants et non gestants dans l’espèce ovine.
D’après cette étude, l’activité antivirale du sang est 500 à 1000 fois plus élevée dans la veine utérine
que dans l’artère utérine à J15, permettant de penser que l’IFNτ est libéré dans l’organisme
maternel par la veine utérine et permet l’induction des ISG dans les tissus extra-utérins, notamment
le corps jaune, pendant la reconnaissance maternelle. De plus, si l’IFNτ est injecté par voie sous-
cutanée, il perd son effet anti-lutéolytique et stimulateur des ISG au niveau de l’endomètre, mais
pas au niveau du corps jaune (Oliveira et al., 2008). L'action de l’IFNτ sur l'endomètre ne semble
donc emprunter que la voie paracrine, alors qu'il semble pouvoir agir différemment sur le corps
jaune, peut-être par le biais d’autres médiateurs.
2. L’action de l’IFNτ fait intervenir la voie de signalisation JAK-STAT (Stewart
et al., 2001 ; Binelli et al., 2001)
L’IFNτ agit sur ses cellules cibles en se liant à son récepteur aux IFN de type I de
l’épithélium endométrial, ce qui active la voie de transduction JAK-STAT (Janus kinase - signal
transducer and activator of transcription). La voie de signalisation JAK-STAT est initiée lorsqu’un
ligand tel qu’une cytokine vient se lier à son récepteur membranaire et active ce dernier (figure 2).
22
Cela consiste en la phosphorylation permanente d’une tyrosine avec des effets à long terme
et une translocation nucléaire de STAT-1 et 2, alors que cette phosphorylation est transitoire et
donne des effets à court terme pour STAT-3 qui subit également une translocation nucléaire. De
plus, l’IFNτ augmente l’expression de STAT-1 et 2 mais pas de STAT-3. Il y a alors formation
d’homodimères (notamment de STAT-1) et d’hétérodimères STAT-1/STAT-2 qui s’associent avec
une protéine de liaison à l’ADN nommée IRF-9 (interferon regulatory factor) (autres appellations :
ISGF3γ ; p48) pour former un facteur de transcription complexe appelé ISGF3 (interferon
stimulated gene factor 3). ISGF3 se lie à l’ADN d’un gène nommé ISRE (interferon-stimulated
response element) et les homodimères de STAT-1 se lient à l’ADN de l’élément GAS (γ-activated
sequence) afin de réguler la transcription des ISG. In vitro, sur une lignée cellulaire d’épithélium
luminal, l’IFNτ augmente la transcription des promoteurs dirigés par GAS au bout de 3 h de culture,
mais supprime leur activité au bout de 24 h, alors que la transcription des promoteurs sous
l’influence de l’ISRE est activée à 3 h et à 24 h. Il apparaît donc que l’IFNτ peut exercer une
activation différente suivant le gène considéré.
Figure 2 : Mécanisme d’activation de la voie JAK-STAT (d’après la thèse de pharmacie de
Valentino, 2009)
3. Principaux ISG étudiés chez les ruminants pendant la gestation
Dans cette partie, nous développerons succinctement les éléments essentiels concernant les
principaux ISG étudiés chez les ruminants, ainsi que deux ISG étudiés dans la partie expérimentale
de ce travail : CXCL10 et PLAC8. Les principaux ISG étudiés chez les ruminants en relation avec la
gestation sont :
- ISG15, codant pour un homologue fonctionnel de l’ubiquitine qui se conjugue à des protéines
intracellulaires afin d’en réguler d’autres, essentielles à l’établissement et au maintien de la
23
gestation. Il fonctionne comme une ubiquitine intracellulaire et comme une cytokine
extracellulaire (Han et al., 2006). D’après Klein et al. (2006), il fait partie des gènes dont
l’expression est la plus fortement augmentée en début de gestation.
- MX1 et MX2 (myxovirus resistance), dont l’expression est induite dans toutes les cellules qui
possèdent le récepteur aux IFN de type I. Ces gènes codent pour deux protéines de la famille des
GTPases qui possèdent une activité antivirale et constituent des composants clé du statut
antiviral induit par les IFN grâce à leur activité inhibitrice sur la réplication des virus à ARN,
notamment les influenzavirus et bunyavirus (Haller et al., 2007). Leur fonction dans le cadre de
la gestation n’est en revanche pas connue mais une étude menée par Racicot et Ott (2011) a
montré que la protéine Mx interagissait avec la tubuline β dans les cellules glandulaires
épithéliales de l’utérus ovin pendant l’interphase et la mitose. Cela fait supposer que Mx
entrerait en jeu dans les déplacements intracellulaires de vésicules pour lesquels la tubuline a un
rôle central.
- OAS-1 (2’,5’-oligoadenylate synthetase), codant pour une protéine impliquée dans les divisions
cellulaires ainsi que la dégradation sélective des ARN viraux et cellulaires par l’intermédiaire
d’une endoribonucléase. Il empêche ainsi la synthèse de protéines nécessaires à la réplication
virale dans les cellules hôtes et est impliqué, dans l'endomètre, dans la transition du protéome du
cycle au protéome du début de gestation (Mirando et al., 1991 ; Schmitt et al., 1993).
- IP-10 (IFN-γ inducible protein 10 kDa), aussi appelée CXCL10 car il code pour une chémokine
appartenant à la famille des chémokines C-X-C, a également été étudié pour sa présence au
moment de la mise en place de la gestation. Cette chémokine joue un rôle important pour le
recrutement et la redistribution des cellules immunitaires dans l’endomètre ovin. En effet, elle
exerce une activité chimiotactique sur les cellules NK, ainsi que sur les LMC et régule de cette
façon la migration de ces derniers. Étant donné l’importance de la distribution des cellules
immunitaires dans l’utérus pour l’implantation et la placentation, on peut en déduire
l’importance de la molécule codée par CXCL10 dans ces mécanismes. Le recrutement des
cellules immunitaires dans l’utérus sous l’influence de l’IFNτ aurait donc lieu par
l’intermédiaire de CXCL10. En effet, Nagaoka et al. (2003) ont montré qu’in vitro, la
stimulation de la migration des LMC était inhibée à plus de 70% par la présence d’anticorps
anti-CXCL10. Cela confirme que la stimulation de ce gène est un des nombreux éléments qui
concourent à la réussite d’une gestation, probablement par son rôle dans la régulation de
l’immunité.
- PLAC8 est un gène qui a été identifié chez la souris comme un gène très fortement exprimé dans
le placenta (expression restreinte au spongiotrophoblaste, dans cette espèce, Galaviz-Hernandez
et al., 2003). Chez la vache, une étude transcriptomique comparant l'expression des gènes dans
l'endomètre (caroncules vs zones inter-caronculaires) chez des vaches gestantes au moment de
l'implantation (J20) et des vaches non gestantes, a montré que PLAC8 était plus exprimé dans
l'endomètre des vaches gestantes (Mansouri-Attia et al., 2009). Il a été montré que l'expression
de PLAC8 par des fibroblastes et des cellules glandulaires épithéliales in vitro était induite par
l'IFNτ ajouté dans le milieu de culture. PLAC8 est également exprimé par l'embryon au stade
blastocyste. Après transfert d'embryons bovins ayant subi des biopsies, les embryons ayant
abouti à la naissance d'un veau exprimaient davantage PLAC8 que ceux ayant abouti à une
résorption embryonnaire (Ghanem et al., 2011). Le gène PLAC8 est donc surexprimé
localement en début de gestation et semble pouvoir constituer un témoin de la viabilité de
l’embryon.
24
B. Expression des ISG dans l'endomètre
L’expression de nombreux gènes stimulés par l’IFNτ a été étudiée en comparant les animaux
cyclés et gestants. Elle est globalement plus importante chez les animaux gestants que non gestants,
avec cependant des différences temporelles et spatiales.
Ott et al. (1998) ont comparé l’expression de MX dans l’endomètre entre des brebis
gestantes et cyclées. Chez les brebis cyclées, l'expression de MX augmentait entre J1 et J13 puis
diminuait jusqu’à J15. Chez les brebis gestantes, le niveau d’ARNm était plus élevé que chez les
cyclées à J13, était 10 fois supérieur à J15 et restait élevé jusqu’à J19. Dans le myomètre, tandis que
le niveau d’ARNm de MX était inchangé pendant le cycle, il était multiplié par 23 entre J11 et J15
chez les brebis gestantes. La gestation entraîne donc une régulation à la hausse de l’expression de
MX dans l’épithélium luminal et glandulaire, le stroma et le myomètre, avec présence de la protéine
dans toutes ces régions de l’utérus lors de la gestation (Ott et al., 1998). L’étude de Yankey et al.
(2001) a montré que l’IFNτ était bien à l’origine d’une modification de l’expression des gènes au
niveau de l’appareil génital femelle puisqu’une injection de cette hormone dans la lumière utérine a
entraîné une augmentation de l’expression de MX dans le corps jaune.
Toujours chez la brebis, il a été montré que l’expression d’OAS-1 était également
significativement plus élevée chez les brebis gestantes par rapport aux brebis non gestantes, à J16,
dans l’endomètre (Mirando et al., 1991). D’après Nagaoka et al. (2003), la présence de l’ARNm de
CXCL10 était prépondérante au moment de l’attachement du conceptus et au début de la
placentation, avec une localisation dans les monocytes qui se distribuaient au stroma sub-épithélial.
Cette expression endométriale de CXCL10 était plus élevée à J14, J17, J20 et J25 chez des brebis
gestantes par rapport aux non gestantes. En revanche, CXCL10 n'a été localisé que dans les
monocytes et non dans les lymphocytes, ni dans les cellules épithéliales ou stromales.
Dans l’espèce bovine, il a été montré qu'OAS-1 était stimulé par l’IFNτ chez les femelles
gestantes dans toutes les régions de la paroi utérine, avec une expression 30 fois supérieure par
rapport aux femelles non gestantes dans l’épithélium (luminal et glandulaire) et 10 fois supérieure
dans le stroma, à J15 et à J18 (Schmitt et al., 1993). Concernant PLAC8, il a été montré que son
expression était induite par l’IFNτ dans les fibroblastes et les cellules glandulaires épithéliales, ainsi
que dans les zones caronculaires, avec une expression plus forte chez les vaches gestantes que chez
les cyclées (Mansouri-Attia et al., 2009).
Ainsi, de nombreux gènes voient leur expression stimulée au niveau de l’endomètre au
début de la gestation, aussi bien chez la brebis que chez la vache, principalement sous l’influence de
l’IFNτ sécrété par le trophoblaste. Certaines études suggèrent de manière indirecte que l’IFNτ passe
dans le sang et modifie l’expression des ISG dans les LMC. C’est pourquoi il paraît intéressant
d'essayer de développer une méthode de diagnostic de gestation non invasive et précoce basée sur la
quantification de l'expression des ISG dans les LMC.
C. Expression des ISG dans les lymphocytes mononucléés circulants (LMC)
1. Comparaison de l’expression des ISG dans les LMC entre les femelles
gestantes et les femelles non gestantes
Chez les ovins, il a été observé que l’expression de MX dans les cellules immunitaires
circulantes était stimulée de façon rapide et prolongée 24 à 48 h après la synthèse d'IFNτ (à J15),
avec une quantité d’ARNm de MX quatre fois supérieure par rapport à une brebis cyclée (Yankey et
25
al., 2001). Le niveau d'expression était deux fois supérieure à J26 chez les brebis gestantes par
rapport aux cyclées et il était resté élevé jusqu’à J30. Le pic d’expression se situait à J21 et
l’augmentation de l’expression de MX était plus marquée lors de gestation multiple (Yankey et al.,
2001).
Chez la vache, de nombreuses études mentionnent une modification d’expression des ISG au
niveau des LMC. L’expression de MX1 et MX2 a été comparée chez des vaches laitières gestantes et
non gestantes par Gifford et al. (2007). L’expression de MX1 était augmentée dans les LMC
uniquement chez les vaches gestantes à J20, alors que MX2 était déjà surexprimé chez ces animaux
à J16. L’induction de MX2 était donc plus précoce mais aussi plus forte que celle de MX1 chez les
vaches gestantes. Une autre étude portant sur MX2 seulement a montré que son expression dans les
LMC de génisses augmentait plus fortement entre J0 et J18 chez les animaux gestants que chez les
femelles inséminées non gestantes ou encore les femelles non inséminées. Le diagnostic de
gestation a ensuite été réalisé à J21, J30, puis J60 et les auteurs ont remarqué que les femelles qui
ont subi une perte embryonnaire entre deux diagnostics présentaient une augmentation moins forte
de l’expression de MX2 dans leurs LMC (Stevenson et al., 2007).
Han et al. (2006) ont montré que l’expression d’ISG15 augmentait chez les vaches gestantes
après J16 avec un pic à J20, puis diminuait jusqu’à J32 pour revenir au même niveau qu’à J16. En
l’absence de gestation, elle diminuait, et chez les vaches gestantes qui ont subi ultérieurement un
avortement précoce, elle avait tendance à être intermédiaire ou à augmenter plus tardivement. Cela
met en évidence une relation entre la viabilité de l’embryon et l’expression d’ISG15 dans les LMC
maternels. Dans l'étude de Gifford et al. (2007), le niveau d'expression d’ISG15 dans les LMC
n'était pas significativement différent à J16 entre les vaches gestantes et non gestantes, mais il était
plus élevé chez les gestantes à partir de J18.
Ces études ont permis de mettre en évidence des différences d’expression des ISG dans les
LMC maternels entre des femelles gestantes et non gestantes, ce qui constitue un préalable à leur
utilisation pour détecter la gestation ou l’absence de gestation chez les femelles de ruminants.
2. Utilisation de la différence d’expression des ISG dans les LMC pour
diagnostiquer la gestation
En ce qui concerne la détection de la gestation chez la brebis, peu d’études se sont focalisées
sur le prélèvement de sang et la détection d’une différence d’expression dans les LMC. La brebis
étant un modèle animal moins coûteux que la vache, beaucoup d’études ont été réalisées
directement sur le tissu utérin après euthanasie. Cela a permis de mettre en évidence la
surexpression des ISG en début de gestation au niveau de l’utérus et de sélectionner ainsi les gènes
dont il est intéressant d'étudier l’expression dans les LMC. Oliveira et al. (2008) se sont basés sur
deux ISG dont les modifications d’expression sont détaillées plus haut : ISG15 et OAS-1. D’après
cette étude menée en parallèle sur des brebis gestantes et non gestantes, l’expression de ces deux
ISG était significativement supérieure chez les animaux gestants au niveau de l’endomètre, mais
aussi dans le sang recueilli à la jugulaire et dans les grandes cellules lutéales du corps jaune à J15.
Cela met donc bien en évidence une relation entre la gestation et une augmentation de l’expression
d’ISG15 et d’OAS-1 détectable dans le sang périphérique à J15 car cette augmentation n’a pas lieu
chez des animaux non gestants comparables. D’après cette étude, ces ISG sont des outils valables
pour distinguer mortalité embryonnaire et défaut de fécondation, ainsi que pour identifier les
animaux non gestants, mais sont contre-indiqués pour diagnostiquer la gestation car ils ne sont pas
suffisamment fiables.
26
Comme pour la brebis, des études se sont intéressées à l’efficacité des ISG pour détecter la
gestation chez la vache. Han et al. (2006) ont choisi de travailler sur des vaches laitières et de les
désigner comme gestantes ou non selon le niveau d’expression d’ISG15. Les prélèvements sanguins
ont été réalisés à J18 ou tous les jours entre J17 et J25 afin d’extraire les ARNm et de mesurer la
progestéronémie. Par ailleurs, des échographies ont été réalisées à J32 et le diagnostic était resté
confidentiel jusqu’à l’obtention des résultats pour ISG15. Les auteurs ont réalisé des analyses
statistiques qui leur ont permis de conclure que par la quantification du niveau d'expression
d’ISG15, on obtenait :
- une sensibilité de 81%, une spécificité de 75%, une valeur prédictive positive de 62% et
une valeur prédictive négative de 89% avec un prélèvement unique à J18,
- une sensibilité de 100%, une spécificité de 86%, une valeur prédictive positive de 78% et
une valeur prédictive négative de 100% avec les prélèvements en série.
Ils ont comparé ces résultats à ceux obtenus avec la mesure de la progestéronémie pour
laquelle on obtient dans cette étude une sensibilité ainsi qu’une valeur prédictive négative de 100%
dans les deux cas (J18 et prélèvements en série entre J17 et J25). Les prélèvements en série
améliorent la spécificité qui passe de 41% à 64% et la valeur prédictive positive qui passe de 47% à
58%. La détection de la gestation en se basant sur des niveaux élevés d’ISG15 dans les LMC
s’avère donc plus fiable que la progestéronémie à ce stade mais reste imprécise. On remarque que
les valeurs prédictives négatives sont plus élevées que les valeurs prédictives positives. On pourrait
donc utiliser un seuil d'expression d’ISG15 faible pour désigner les animaux non gestants avec une
meilleure efficacité. Cependant, cette méthode nécessite une prise de sang tous les jours pendant
huit jours, ce qui est très lourd au niveau de la contention et du coût, pour être vraiment fiable. Le
prélèvement unique à J18 apporte une solution intermédiaire moins fiable mais aussi moins
compliquée à mettre en place.
Le potentiel de MX2 comme marqueur de la gestation chez la vache à J18 a été étudié par
Stevenson et al. (2007) qui ont montré qu’en plus d’une sensibilité et d’une spécificité faibles
(respectivement 57% et 63%), ainsi que des valeurs prédictives positive et négative également
insuffisantes (respectivement 63% et 57%), cette méthode diagnostique présentait une faible
corrélation avec les autres méthodes utilisées. Il s’agit donc d’une méthode de diagnostic de
gestation non fiable à J18.
Dans une étude plus récente, Green et al. (2010) ont également fixé J18 comme date limite
pour connaître le statut de la vache, ce qui permettrait de construire un protocole de synchronisation
sur trois jours. Il consisterait en une injection de PGF2α pour lyser le corps jaune l’après-midi de
J18 ou le matin de J19, puis une injection de GnRH 2 à 2,5 jours après (J21), suivie de
l’insémination artificielle. On profiterait ainsi du corps jaune mature et du gros follicule dominant
normalement présents à ce moment du cycle en cours qui ne serait ainsi pas perdu, tandis que les
actuels programmes de resynchronisation permettent une ré-insémination entre J28 et J56. Leurs
expériences ont porté sur trois ISG : MX2, ISG15 et OAS-1 et ils ont comparé l’évolution de leur
expression sous forme de ratio par rapport au gène de référence qui était ici la cyclophiline A. Dans
une première expérience, ce ratio augmentait entre J14 et J20 pour MX2 et ISG15 chez les femelles
gestantes uniquement, mais les auteurs n'ont pas pu définir de valeur seuil entre les femelles
gestantes et les non gestantes. Dans une deuxième expérience, la prise de sang était réalisée à J17
ou à J18. Un résultat similaire a été observé pour MX2 et OAS-1 à J17. Mais à J18, l’expression de
ces ISG n’était significativement augmentée que pour les primipares et non pour les multipares.
Même pour les primipares, aucun seuil n'a pu être défini (30% de faux positifs, même chez les
27
primipares). Un effet de la parité a été observé dans cette étude, en faveur d’une meilleure détection
chez les primipares. Dans la troisième expérience, les auteurs ont choisi de mesurer l’expression de
MX2 et OAS-1 deux fois pour chaque femelle : à J18 du cycle précédent l'insémination (échantillon
1) et à J18 après l'insémination (échantillon 2), puis d'utiliser le ratio échantillon 2 sur échantillon 1
pour chacun des gènes. Les ratios étaient significativement plus élevés pour les primipares gestantes
que pour les primipares non gestantes. Aucune différence n'a été observée pour les multipares.
Cependant, même cette méthode a obtenu encore 54% de faux positifs avec OAS-1 et 31% avec
MX2 pour les primipares. En revanche, 100% de vrais positifs et 0% de faux positifs ont été observé
pour OAS-1 chez les génisses. Cette méthode de diagnostic nécessite tout de même deux
échantillons, donc elle n’est pas applicable en pratique. Chez la génisse, la seule mesure à J18
pourrait être un test raisonnable car elle donne 82% de vrais positifs et 0% de faux positifs. Elle ne
nécessite qu’un échantillon mais manque de précision.
On constate donc que malgré l’augmentation significative de l’expression d’un grand
nombre d’ISG précocement au cours de la gestation chez les ruminants, on ne peut pas définir de
valeur seuil à partir de laquelle on serait sûr du statut de l’animal avant J20. Les résultats montrent
un trop grand nombre de faux positifs, même chez les primipares. Par conséquent, les ISG
précédemment étudiés ne constituent pas des marqueurs suffisamment fiables en début de gestation
pour servir de méthode diagnostique.
IV. Présentation de deux gènes non stimulés par l’IFNτ : FOS et PBEF-1
Lors de la gestation, l’expression de nombreux gènes est modifiée devant la complexité du
phénomène biologique se mettant en place. Parmi ces gènes, les ISG ont une grande importance
mais présentent l’inconvénient de ne pas être spécifiques de l’IFNτ, mais de tous les interférons de
type 1. Leur stimulation n’est donc pas spécifique de la gestation, ce qui explique la grande
variabilité entre les individus et le manque de fiabilité des diagnostics de gestation se basant sur la
quantification de l’expression des ISG. D’après les résultats d’une analyse transcriptomique réalisée
dans le laboratoire, nous avons identifiés des gènes différentiellement exprimés entre des brebis
gestantes et non gestantes à J15 et qui ne sont pas décrits comme étant régulés par les interférons.
Parmi ces gènes, certains voient leur expression amplifiée alors que l’expression d’autres gènes
diminue. Ces gènes pourraient donc servir de marqueurs de la gestation. Nous en avons choisi deux
pour validation du différentiel d’expression par qPCR dans la deuxième partie de ce travail : FOS et
PBEF-1. Cette partie présente succinctement ces deux gènes.
A. Le gène FOS (FBJ murine osteosarcoma viral oncogene homolog)
FOS code pour deux protéines homologues : l’homologue B (B-fos) et l’homologue C (C-
fos), qui sont des facteurs de transcription. Elles peuvent se dimériser avec d'autres facteurs de
transcription (le plus souvent de la famille JUN) : cette dimérisation forme le complexe
transcriptionnel AP-1 (activator protein-1). Avec C-jun, C-fos reconnait précisément la séquence de
nucléotides TGACTC. L'activité de C-fos peut être modulée lorsqu'elle est phosphorylée. Comme la
plupart des facteurs AP-1, C-fos est présent dans les cellules en faible quantité mais peut être induit
et activé très rapidement en réponse à des stimuli spécifiques, tels que différentes hormones,
facteurs de croissance, cytokines... (Karin, 1995). FOS intervient dans de nombreuses fonctions et
mécanismes cellulaires, tels que :
28
- la prolifération et la différenciation cellulaire : il a été montré que la croissance et la
multiplication cellulaires dépendaient de la synthèse de polyphosphoinositides induite par C-fos,
à la fois in vitro sur l’élongation neurale et in vivo sur des tumeurs du système nerveux (Alfonso
Pecchio et al., 2011). D’après une étude menée par Diaz Sanchez-Bustamante (2008), b-FOS
jouerait un rôle dans la transdifférenciation de cellules adipeuses en cellules osseuses, ce qui
offrirait alors une application en régénération cellulaire.
- les processus tumoraux : lors de processus cancéreux, FOS devient une des cibles
transcriptionnelles de STAT-1 en l’absence de STAT-3. STAT-1, qui est normalement un gène
oncosuppresseur, induit alors la transcription de nouveaux gènes cibles connus pour diriger les
réponses mitotiques vers la transformation tumorale, dont FOS (Schiavone et al., 2011). FOS
est par exemple un acteur clé dans la pathogénèse du carcinome hépatocellulaire chez l’homme
(Li et al., 2009). Il pourrait ainsi servir de marqueur afin de désigner les cellules cancéreuses
dans lesquelles il est surexprimé.
- le métabolisme lipidique : FOS est aussi un gène qui intervient dans le métabolisme, notamment
lipidique. En effet, il fait partie des gènes dont l'expression est modifiée en réponse à la statine
ou selon le niveau de cholestérol dans le sang périphérique chez l’homme. La statine est une
molécule hypolipidémiante utilisée pour diminuer la cholestérolémie qui a aussi une action sur
la fixation de l’antigène, la réponse immunitaire ou inflammatoire, dont les voies qui font
intervenir les interleukines (Won et al., 2012).
- l’inflammation (Hossaini et al, 2011)…
Enfin, d’après Xie et al. (2011), l’expression de FOS pourrait être un marqueur des émotions
puisqu’elle a été détectée dans certains neurones lors de comportements sexuels et agonistiques
chez le poulet domestique.
FOS a montré son intérêt en tant que marqueur pour de nombreux processus différents :
processus tumoral, inflammation, anomalie métabolique, athérosclérose, tabagisme (Saliques et al.,
2011), activité neuronale (Hossaini et al., 2011). C’est ce rôle de marqueur en lien avec
l’inflammation qui servira dans la deuxième partie de ce travail en relation avec la modification de
l’état inflammatoire lors de la gestation.
B. Le gène PBEF-1 (pre-B-cell colony enhancing factor 1)
La molécule codée par PBEF est une protéine de 52 kDa très conservée au cours de
l’évolution. Elle a d’abord été découverte en tant que facteur de croissance qui renforce la
maturation des précurseurs des cellules B en synergie avec IL-7 et le facteur des cellules souches,
ce qui suggérait une fonction de cytokine (Hui Jia et al., 2004). Elle a par la suite été redécouverte
en tant qu’enzyme catalysant l’étape limitante de la voie de récupération du di-nucléotide
nicotinamide-adénine (NAD), élément vital du métabolisme cellulaire des mammifères, ce qui lui a
valu le nom de NAMPT (nicotinamide phosphoribosyltransferase), ainsi qu’un élargissement de ses
activités biologiques potentielles avec des mécanismes extracellulaires et intracellulaires (Reddy et
al., 2008). En outre, on croyait initialement que ce peptide était produit uniquement par le tissu
adipeux viscéral (adipocytes et macrophages infiltrants) étant donné la corrélation entre la quantité
de tissu adipeux viscéral et le niveau de PBEF circulant, d’où son autre nom de visfatin. Cependant,
sa production semble concerner également d’autres tissus et cellules, tels que le muscle
squelettique, le foie, les cellules immunes, les cardiomyocytes et le cerveau. Ces caractéristiques
font que cette molécule peut être impliquée dans de nombreux processus pathophysiologiques et
notamment dans :
29
- les désordres métaboliques : PBEF joue un rôle significatif dans le métabolisme lipidique en
intervenant dans la différenciation des adipocytes, sans que les mécanismes soient connus. En
effet, d’après Tabassum et al. (2012), PBEF-1 est associé à l’obésité chez l’Homme : suivant les
allèles possédés par les individus, ils sont plus ou moins à risque de développer de l’obésité. De
plus, cette adipocytokine a une fonction mimant celle de l’insuline en se fixant à son récepteur :
il s’agit donc d’un régulateur clé de la résistance à cette hormone. Par ailleurs, elle interviendrait
dans le métabolisme thyroïdien : dans l'étude de Han et al. (2012), les individus
hyperthyroïdiens et hypothyroïdiens avaient une concentration plasmatique de ce peptide
significativement plus élevée par rapport à des témoins euthyroïdiens. Le rôle des hormones
thyroïdiennes étant de réguler le métabolisme corporel en augmentant la lipolyse, ce qui
participe au gain et à la perte de poids, on comprend l’interaction qu’elles peuvent avoir avec la
production de PBEF par les adipocytes.
- les processus tumoraux : de nombreuses études ont observé une surexpression de PBEF-1 lors
de certains cancers (Bi et Che, 2010). PBEF-1 régule différentes voies de signalisation. Les
rôles de ce facteur dans la carcinogenèse ne sont donc pas parfaitement décrits, mais il a été
observé un lien entre le niveau d'expression de PBEF-1 par certaines tumeurs et leur résistance à
la chimiothérapie. Enfin, quelques études ont montré une relation entre l'expression de PBEF-1
et l'évolution clinique des patients lors de leucémie myéloïde aiguë (Eisele et al., 2007), de
différents grades d’astrocytome (Reddy et al., 2008), de cancer de l’estomac (Nakajima et al.,
2009) ou du côlon (Nakajima et al., 2010), suggérant une potentielle valeur pronostique du
dosage sérique de PBEF-1, une concentration élevée allant dans le sens d'une évolution
défavorable.
- les maladies inflammatoires et infectieuses (infection par le VIH, septicémie…) (Hui Jia et al.,
2004 ; Moschen et al., 2007 ; Šenolt et al., 2011) : PBEF-1 peut être sécrété par les lymphocytes
activés, mais aussi par les neutrophiles en réponse à des stimuli inflammatoires tels que le
lipopolysaccharide, les cytokines pro-inflammatoires (TNF-α, IL-1β et IL-6) ainsi que les
immuno-modulateurs non spécifiques, ce qui lui confère un rôle significatif dans l’immunité
innée. Il peut également activer des leucocytes, induire la production des cytokines pro-
inflammatoires (IL-1β, TNF-α et surtout IL-6) et stimuler l’expression des molécules co-
stimulantes de surface CD54, CD40 et CD80. Une surexpression de PBEF a été observée dans
de nombreux processus inflammatoires tels que la maladie inflammatoire des intestins, le
dysfonctionnement endothélial (les cytokines pro-inflammatoires affectant la fonction
vasculaire), l’ostéo-arthrite, l’arthrite rhumatoïde, l’athérosclérose, la chorioamniotite (infection
du tissu placentaire et du liquide amniotique) (Hui Jia et al., 2004 ; Moschen et al., 2007 ;
Gunes et al., 2012 ; Jacques et al., 2012) ainsi que dans l’obésité qui est étroitement liée à
l’inflammation systémique avec une surexpression de TNF-α et IL-6 dans le tissu adipeux des
sujets obèses, ce qui contribue à la résistance de ces personnes à l’insuline (Moschen et al.,
2007). Ces données permettent de faire l’hypothèse que cette adipocytokine peut avoir un rôle
dans un large spectre de maladies infectieuses et inflammatoires.
- la défaillance cardiaque, l’athérosclérose, et les processus neuro-dégénératifs (Dahl et al., 2012).
Le rôle exact de PBEF n’est pas identifié dans ces processus pathologiques mais sa
surexpression significative dans de nombreuses maladies infectieuses et inflammatoires en fait un
bon marqueur, ce qui nous intéresse ici dans le cadre de la gestation qui induit aussi des
modulations inflammatoires et immunitaires dans l’organisme en dehors de la présence d’une
anomalie.
30
Malgré les nombreuses méthodes existantes qui permettent de diagnostiquer la gestation
chez les ruminants, aucune n’est à l’heure actuelle suffisamment précoce pour diagnostiquer la
gestation avant le retour en chaleur. Nous sommes donc à la recherche d’un test diagnostic à la fois
plus précoce, mais aussi pratique à utiliser en élevage et peu coûteux. Le plus simple serait de le
réaliser sur du sang ou du lait, ce qui permet un prélèvement non invasif. C’est en cela qu’intervient
l’intérêt des marqueurs présents sur les LMC.
31
DEUXIEME PARTIE : Étude expérimentale
Ce travail a été réalisé dans le but de déterminer si on pouvait différencier des brebis
gestantes de brebis non gestantes dès le début de la gestation (à J15) en se servant de la différence
d’expression de gènes liés à celle-ci. Dans un premier temps, une analyse transcriptomique a été
réalisée (non présentée ici), permettant d'identifier une centaine de gènes différentiellement
exprimés dans les LMC de brebis gestantes et de brebis non gestantes. Parmi ces gènes, nous avons
choisis de valider le différentiel d’expression par RT-qPCR de cinq de ces gènes sur un effectif de
brebis plus grand. STAT-1, CXCL10 et PLAC8 ont été choisis car ils sont connus pour être stimulés
par l’IFNτ en début de gestation dans l'endomètre, et FOS et PBEF-1 ont été sélectionnés car
justement ils ne sont pas connus pour être influencés par l'IFNτ. Ce sont les résultats de la
quantification des ARN de ces cinq gènes qui sont présentés ici.
I. Matériels et méthodes
A. Animaux
Le travail personnel se base sur une étude réalisée à la station INRA de Jouy-en-Josas, sur
32 brebis de race Préalpes du Sud, toutes multipares (entre 3 et 5 gestations). Les chaleurs de ces
animaux ont été synchronisées à l’aide de la méthode Syncro-part® (CEVA, Libourne, France) :
une éponge de 40 mg de fluorogestone a été placée dans le vagin pendant 14 jours et une injection
de 400 UI d’eCG a été réalisée le jour du retrait du dispositif. Les brebis ont alors été réparties de
façon aléatoire en trois lots : 16 brebis ont été inséminées 48 h après le retrait de l’éponge (J0=jour
de l’insémination) avec du sperme provenant d’un même bélier (lot IA pour Insémination
Artificielle) ; 7 brebis n’ont pas été inséminées (lot CYCL pour Cyclées) ; 9 brebis ont été
inséminées avec le sperme du même bélier traité thermiquement (2 heures à 37 °C) afin d’épuiser
les réserves énergétiques des spermatozoïdes pour les rendre non fécondants (lot LS pour Liquide
Séminal). Ce dernier lot a été réalisé en raison de la réaction inflammatoire de l’endomètre, qui
modifie le profil d’expression de certains gènes, provoquée par le contact avec le liquide séminal
(Scott et al., 2009).
B. Prélèvements
Des prises de sang (5 mL de sang sur tube sec : Venoject®, Terumo, Guyancourt, France)
ont été réalisées à la veine jugulaire à J0, J3, J6, J9 et J12 afin d’effectuer des dosages de
progestérone. Une dernière prise de sang a été pratiquée à J15 pour effectuer l’extraction des
leucocytes mononucléés circulants (LMC) (50 mL de sang sur tube citrate : Buffered Na3-citrate
5 mL, Venoject®, Terumo).
Les brebis ont été abattues à J15, peu de temps après la dernière prise de sang. L’utérus a été
isolé et les deux cornes ont été rincées simultanément à l’aide de 50 mL de tampon PBS (Phosphate
Buffer Saline) afin de récupérer d’éventuels embryons. La gestation a été objectivée par la
visualisation directe d’un ou plusieurs embryons à la loupe binoculaire. Les embryons, ainsi que les
corps jaunes, ont été comptabilisés pour chaque brebis.
32
C. Isolement des leucocytes mononucléés circulants (LMC)
Les LMC ont été isolés immédiatement après la prise de sang, par une méthode utilisant un
gradient de Percoll selon le protocole décrit par Inghels (2012) et congelés à -80 °C dans du Trizol
LS® (Invitrogen, Cergy-Pontoise, France) jusqu’à l’extraction des ARNs. Deux échantillons (un
dans le lot CYCL et l'autre dans le lot IA) ont été perdu, respectivement en raison d’une
concentration trop élevée du Percoll, ce qui a provoqué une lyse des érythrocytes et par absence de
culot de LMC après centrifugation.
D. Dosage de progestérone
Les prélèvements de sang ont été centrifugés à 1500 tours/minute pendant 10 minutes à
température ambiante (20 °C) après avoir décanté durant 30 minutes à 20 °C. Le sérum a alors été
prélevé puis congelé et le taux de progestérone a été déterminé par ELISA (kit Ovucheck® Plasma,
Biovet, St-Hyacinthe, Canada).
E. Extraction des ARN
Les LMC ont été décongelés progressivement puis homogénéisés à l’aide d’une aiguille 18
gauges et d’une seringue de 2 mL avant d’être transférés dans des tubes Eppendorf de 2 mL. Les
ARNs de chaque échantillon ont été extraits au Trizol LS® (Invitrogen) selon le protocole suivant :
- ajout de 200 µL de chloroforme par mL de Trizol,
- après une incubation de 3 minutes à température ambiante, centrifugation à 12000
tours/minute pendant 15 minutes à 4°C,
- prélèvement du surnagent transféré dans un tube de 2 mL,
- ajout d'un volume égal d’éthanol 70%.
Puis tous les échantillons d'ARN ont été purifiés et traités à la DNase I à l’aide du RNeasy
Mini kit® (Qiagen, Courtabœuf, France), selon le protocole indiqué par le fabricant. Enfin, on a
quantifié les ARN obtenus par spectrophotométrie (Nanodrop ND-3300, Labtech, Wilmington,
USA) et on a évalué l’absence de dégradation des ARN par migration sur gel d’agarose à 2 % en
TBE 1X, suivie d’une coloration au bromure d’éthidium (BET ; Invitrogen). On a également évalué
la qualité d’une partie des ARN par l’Agilent 2100 bioanalyzer (Agilent, Santa Clara CA, USA).
Les ARN ont été stockés en solution aqueuse après adjonction d’1 µL d’inhibiteur de
RNases dans chaque tube (Rnasine Plus Promega, Charbonnières-les-Bains, France). Les tubes ont
été étiquetés et conservés à -80 °C jusqu'à la rétrotranscription. Lors de cette étape, un échantillon
(lot CYCL) n’a pas pu être exploité en raison d’une quantité trop faible d’ARN obtenue après
extraction.
F. Rétrotranscription des ARNm
La rétrotranscription des ARN a été réalisée à partir d'un µg d’ARNm préalablement dosé au
Nanodrop ND-3300 (Labtech), en utilisant la Superscript II (Invitrogen) avec de l’oligo (dT)
(Invitrogen), selon les recommandations du fabricant. Brièvement :
- ajout d'un µL de MIX 1 (mélange volume à volume d’oligo dT 12-18, Invitrogen et de
dNTP 10 mM) par µg d’ARN,
33
- incubation à 65 °C pendant 5 minutes,
- ajout de 7 µL de MIX 2 (4 µL de Buffer 5X First Strand, Invitrogen + 2 µL de DDT 0,1
M, Invitrogen + 1 µL d’eau exempte de RNase) par µg d’ARN,
- incubation à 42 °C pendant 2 minutes,
- ajout d'un µL de Superscript II RT (Invitrogen, 200 U/µL) par µg d’ARN,
- incubation à 42 °C pendant 50 minutes, puis à 70 °C pendant 15 minutes.
Deux réactions de rétro-transcription par échantillon ont été réalisées et les deux produits
ont été poolés. Les ADNc obtenus ont été dilués 5 à 500 fois dans de l’eau exempte de DNase. Les
échantillons ont été conservés à -20 °C jusqu’à leur utilisation en qPCR.
G. PCR en temps réel
Cinq gènes ont été choisis parmi les gènes différentiellement exprimés (GDE) identifiés par
une analyse transcriptomique, pour confirmer un niveau différentiel d’expression à partir des 29
échantillons d’ARN issus de l’ensemble des brebis qui ont pu être incluses dans ce protocole : FOS,
PBEF-1, PLAC8, STAT-1 et CXCL10. Trois gènes de ménage couramment utilisés chez l’ovin ont
également été choisis pour normaliser les données : β-actine, GAPDH et RPL19. Pour chaque gène,
un couple d’amorces a été dessiné à l’aide de l’application « Primer Blast » (NCBI,
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast), synthétisé et fourni par Eurogentec (Liège,
Belgique). Les amorces utilisées sont représentées dans le tableau 1.
L’efficacité d’amplification de chaque couple d’amorces a été testée sur une gamme de
référence, obtenue par mélange d’échantillons représentant les différentes conditions
physiologiques présentes au sein du protocole expérimental, et par dilutions successives (dilutions
au ¼) à partir de la solution mère issue de la RT. Les produits de PCR ont été analysés par
migration sur un gel d’agarose à 2 % en TBE 1X, suivie d’une coloration au bromure d’éthidium
(BET ; Invitrogen) et d’une lecture au phospho-imageur FLA-3000 (Fujifilms France, Bois d’Arcy,
France). La taille des fragments a ensuite été mesurée et comparée à la taille attendue des
amplicons, puis les produits de PCR ont été adressés au laboratoire Beckman Coulter Genomics
(Takeley, Royaume-Uni) pour séquençage afin de vérifier que l’amplicon obtenu correspondait bien
au gène d’intérêt.
Les échantillons, ainsi que les points de gamme, ont été déposés (5 µL) en dupliquas sur une
plaque de 96 puits (Applied Biosystems, Carlsbad, USA) avec 10 µL de master mix (SYBRGreen®,
Applied Biosystems + amorces du gène à 0,3 ou 0,15 µM selon le gène étudié). Les réactions de
PCR en temps réel ont été réalisées sur un appareil de type Step One Plus (Applied Biosystems)
selon le programme suivant :
- 10 minutes à 90 °C ;
- 45 cycles de 15 secondes à 95 °C suivis par 1 minute à 60 °C ;
- dissociation des amorces : 15 secondes à 95 °C, 20 secondes à 90 °C, puis 15 secondes à
95 °C.
Le logiciel associé à l’appareil permet de vérifier l’efficacité de l’amplification, la cohérence
des niveaux d’expressions déterminés entre les deux dépôts correspondant au même échantillon,
l’absence d’amplification pour les témoins négatifs (pureté de l’eau) et qu’on amplifie bien un seul
gène.
34
Le niveau d’expression des transcrits dans les échantillons a été déterminé à l’aide de la
courbe standard correspondant à la gamme de référence au sein de laquelle chaque point correspond
à une quantité arbitraire attribuée par convention. Le logiciel qbaseplus
(Biogazelle, Zwijnaarde,
Belgique) a ensuite permis de rapporter les niveaux d’expression pour les échantillons à un facteur
de normalisation déterminé à partir des gènes de ménage GAPDH et RPL19, l’actine ayant été
éliminée par le logiciel en raison d’une trop grande variabilité.
Tableau 1 : Orientation, séquence, température de fusion des amorces pour chaque gène amplifié
en RT-qPCR et taille attendue des amplicons.
Nom du gène
Sens Séquence de l’amorce (5’ vers 3’)
Température de fusion
Taille attendue de l’amplicon
FOS sens
anti-sens TCATCCTAGCGGCTCACCGACC
CTTCAGATTCAGGGGTGGCAGC
55,3
55,3 126 pb
PBEF-1 sens
anti-sens CTTGAGGGCTCTGTCATTCC
TGATTGGATACCAGGACTGAACA 64,0
48,4 121 pb
STAT-1 sens
anti-sens GTGGCGGAGAGTCTGCAGCA
GGTGAGTTGGCATGCAGGGC
66,0
66,0 190 pb
PLAC8 sens
anti-sens AGCGGTCCGGTACCTCAAAA
CAGATGCAACTTGACACGCA
62,0
60,0 121 pb
CXCL10 sens
anti-sens CACTCCTCAACTCTTCAGGC
CCATTCCTTTTCATTGTGGC
62,0
58,0 262 pb
GAPDH sens
anti-sens GCTGACGCTCCCATGTTTGT
TCATAAGTCCCTCCACGATGC 67,4
66,1 243 pb
RPL19 sens
anti-sens CCCCAATGAGACCAATGAAATC
CAGCCCATCTTTGATCAGCTT 66,2
65,3 73 pb
β-actine sens
anti-sens GCTTTACCACCACAGCCGAG
CGACGCAGCAGTCATCT 69,8
61,5 100 pb
H. Analyses statistiques
Toutes les données ont subi une transformation logarithmique et ont été traitées
statistiquement par la procédure One-Way ANOVA suivie d’un post-test Tuckey-Kramer à l’aide du
logiciel Graph Pad Prism (Version 4.0 ; GraphPad Software, La Jolia, USA). Les figures ont
également été dessinées par le logiciel Graph Pad Prism (Version 4.0 ; GraphPad Software) à partir
des données non transformées mais normalisées de manière à ce que la moyenne du lot LS soit
égale à 1.
35
II. Résultats
A. Diagnostics de gestation
La gestation a été objectivée par observation directe des embryons lors du lavage de l’utérus
le jour de l’abattage. Sur les 16 brebis inséminées avec du sperme normal, 8 étaient gestantes (lot
G15) et les 8 autres étaient non gestantes (lot IA vide). Les 9 brebis ayant reçu du sperme inactivé
(lot LS), ainsi que les 7 brebis non inséminées (lot CYCL), étaient effectivement non gestantes.
Le nombre d’embryons a également été comptabilisé pour chaque brebis gestante (tableau
2).
Tableau 2 : Répartition du nombre de brebis gestantes selon le nombre d'embryons observés.
Nombre d'embryons Nombre de brebis
1 2
2 4
3 1
5 1
B. Dosage de progestérone
Le dosage de la progestérone plasmatique a montré que la progestéronémie augmentait entre
J0 et J12, que les brebis soient gestantes ou non. Certains profils de progestéronémie anormaux ont
été observés : deux brebis n’ont pas réellement présenté d’augmentation de la progestéronémie (une
brebis dans le lot IA vide et une dans le lot LS), deux brebis ont présenté un retard à l’augmentation
de la progestéronémie par rapport aux autres (une dans le lot CYCL et une dans le lot LS) et une
brebis du lot CYCL a présenté une chute prématurée de la progestéronémie. Cependant, aucune
différence significative n’a été observée entre les 4 lots, quelque soit le jour du prélèvement.
C. Niveau d'expression de gènes candidats par RT-qPCR en temps réel
Parmi les gènes dont le niveau d’expression différait dans les LMC entre les brebis des lots LS et
G15, selon l’analyse transcriptomique, nous avons retenu cinq gènes. Les trois premiers sont des
gènes stimulés par l'IFNτ et ils étaient surexprimés chez les brebis du lot G15 : CXCL10, PLAC8 et
STAT-1. Les deux autres gènes étudiés ne sont pas connus pour être dépendants de l'IFNτ et ils
étaient sous-exprimés chez les brebis du lot G15 : FOS et PBEF-1. Nous avons mesuré le niveau
d’expression relatif de ces gènes dans les LMC issus de l’ensemble des brebis incluses dans cette
étude (n=29).
CXCL10 était significativement surexprimé dans les LMC des brebis gestantes (lot G15) par
rapport aux brebis non gravides des trois autres lots (lots CYCL, IA vide et LS) (p < 0,001) (figure
36
3). La variabilité des niveaux d'expression relatifs individuels dans chacun des lots est illustrée dans
la figure 4.
Figure 3 : Niveaux d’expression relatifs normalisés de CXCL10 mesurés par PCR en temps réel
dans les leucocytes mononucléés circulants (LMC), selon le lot de brebis (CYCL : brebis cyclées, IA
vide : brebis vides inséminées avec du sperme normal, LS : brebis inséminées avec du sperme
inactivé, G15 : brebis gestantes). Moyenne par lot ± SEM. ** p<0,01.
Figure 4 : Distribution des niveaux d’expression relatifs individuels de CXCL10 dans les
leucocytes mononucléés circulants (LMC), selon le lot de brebis (CYCL : brebis cyclées, IA vide :
brebis vides inséminées avec du sperme normal, LS : brebis inséminées avec du sperme inactivé,
G15 : brebis gestantes).
**
37
PLAC8 était significativement surexprimé dans les LMC des brebis gestantes (lot G15) par
rapport aux brebis non inséminées (lot CYCL) (p < 0,05) et les brebis non gestantes du lot IA vide
(p < 0,01). En revanche, le niveau d'expression moyen de PLAC8 n’était significativement pas
différent entre les brebis du lot LS et celles du lot G15 (figure 5). La variabilité des niveaux
d'expression relatifs individuels dans chacun des lots est illustrée dans la figure 6.
Figure 5 : Niveaux d’expression relatifs normalisés de PLAC8 mesurés par PCR en temps réel
dans les leucocytes mononucléés circulants (LMC), selon le lot de brebis (CYCL : brebis cyclées, IA
vide : brebis vides inséminées avec du sperme normal, LS : brebis inséminées avec du sperme
inactivé, G15 : brebis gestantes). Moyenne par lot ± SEM. a,b : des lettres différentes indiquent une
différence significative (p<0,05).
a
b
a,b
a
38
Figure 6 : Distribution des niveaux d’expression relatifs individuels de PLAC8 dans les leucocytes
mononucléés circulants (LMC), selon le lot de brebis (CYCL : brebis cyclées, IA vide : brebis vides
inséminées avec du sperme normal, LS : brebis inséminées avec du sperme inactivé, G15 : brebis
gestantes).
STAT-1 était significativement surexprimé dans les LMC des brebis gestantes (lot G15) par
rapport aux brebis non inséminées (lot CYCL) (p < 0,05) et les brebis inséminées non gestantes
(lots IA vide et LS) (p < 0,001) (figure 7). La variabilité des niveaux d'expression relatifs
individuels dans chacun des lots est illustrée dans la figure 8.
Figure 7 : Niveaux d’expression relatifs normalisés de STAT-1 mesurés par PCR en temps réel
dans les leucocytes mononucléés circulants (LMC), selon le lot de brebis (CYCL : brebis cyclées, IA
vide : brebis vides inséminées avec du sperme normal, LS : brebis inséminées avec du sperme
inactivé, G15 : brebis gestantes). Moyenne par lot ± SEM. a,b,c : des lettres différentes indiquent
une différence significative (a,c : p < 0,05 ; b,c : p < 0,01).
a
c
a,b a,b
39
Figure 8 : Distribution des niveaux d’expression relatifs individuels de STAT-1 dans les leucocytes
mononucléés circulants (LMC), selon le lot de brebis (CYCL : brebis cyclées, IA vide : brebis vides
inséminées avec du sperme normal, LS : brebis inséminées avec du sperme inactivé, G15 : brebis
gestantes).
Aucune différence significative d'expression n'a été observée pour FOS entre les quatre lots
de brebis (figure 9). La variabilité des niveaux d'expression relatifs individuels dans chacun des lots
est illustrée dans la figure 10.
Figure 9 : Niveaux d’expression relatifs normalisés de FOS mesurés par PCR en temps réel dans
les leucocytes mononucléés circulants (LMC), selon le lot de brebis (CYCL : brebis cyclées, IA
vide : brebis vides inséminées avec du sperme normal, LS : brebis inséminées avec du sperme
inactivé, G15 : brebis gestantes). Moyenne par lot ± SEM.
40
Figure 10 : Distribution des niveaux d’expression relatifs individuels de FOS dans les leucocytes
mononucléés circulants (LMC), selon le lot de brebis (CYCL : brebis cyclées, IA vide : brebis vides
inséminées avec du sperme normal, LS : brebis inséminées avec du sperme inactivé, G15 : brebis
gestantes).
PBEF-1 était significativement surexprimé dans les LMC des brebis gestantes (lot G15) par
rapport aux brebis inséminées non gestantes (lots IA vide et LS) (p < 0,01), mais son niveau moyen
d'expression pour le lot G15 n'était pas différent de celui des brebis non inséminées (lot CYCL)
(figure 11). La variabilité des niveaux d'expression relatifs individuels dans chacun des lots est
illustrée dans la figure 12.
Figure 11 : Niveaux d’expression relatifs normalisés de PBEF-1 mesurés par PCR en temps réel
dans les leucocytes mononucléés circulants (LMC), selon le lot de brebis (CYCL : brebis cyclées, IA
vide : brebis vides inséminées avec du sperme normal, LS : brebis inséminées avec du sperme
inactivé, G15 : brebis gestantes). Moyenne par lot ± SEM. a,b : des lettres différentes indiquent une
différence significative (p<0,01).
a
b
a,b
a
41
Figure 12 : Distribution des niveaux d’expression relatifs individuels de PBEF-1 dans les
leucocytes mononucléés circulants (LMC), selon le lot de brebis (CYCL : brebis cyclées, IA vide :
brebis vides inséminées avec du sperme normal, LS : brebis inséminées avec du sperme inactivé,
G15 : brebis gestantes).
III. Discussion
Chez les ruminants, en début de gestation, de nombreux gènes voient leur expression
modifiée avant même l’implantation, afin d’adapter l’environnement utérin à la gestation. Parmi ces
gènes, nombreux sont ceux qui sont sous l’influence de l’IFNτ qui stimule leur expression.
Certaines analyses transcriptomiques ont mis en évidence que l'expression d’autres gènes étaient
modifiée pendant la gestation, sans lien apparent avec cette cytokine sécrétée par le conceptus
(Mansouri-Attia et al., 2009 ; Forde et Lonergan, 2012). Ces modifications d’expression se
produisent localement (endomètre) mais également dans les leucocytes mononucléés circulants
(LMC), et ce, très rapidement (24-48 h après le début de la production de l’IFNτ). Dans les LMC, il
est possible d’objectiver la modification d’expression de certains gènes en début de gestation par un
prélèvement de sang périphérique (Gifford et al., 2007 ; Oliveira et al., 2008). Il est ainsi fait
l'hypothèse que la mesure du niveau d'expression d'un gène ou de certains gènes dans les LMC
pourrait permettre de diagnostiquer une gestation chez les ruminants (et plus particulièrement dans
l'espèce bovine), plus précocement (si possible avant la fin du cycle œstral en cas d'absence de
gestation) que par les méthodes déjà existantes. Dans l’espèce bovine, cela permettrait de
réinséminer un animal non gestant sans perdre un cycle et ainsi, réduire la durée de la période
improductive en réduisant l’intervalle vêlage – insémination fécondante.
Dans le travail présenté dans ce document, nous avons comparé l'expression dans les LMC
de cinq gènes entre des brebis gestantes et brebis non gestantes, par PCR en temps réel, afin de
déterminer si l'un d'eux pouvait constituer un bon marqueur de la gestation. Ces cinq gènes ont été
choisis à partir des résultats d'une analyse transcriptomique réalisée précédemment à partir des
mêmes échantillons et des données bibliographiques. Nous avons choisi trois gènes stimulés par
l’IFNτ (CXCL10, PLAC8 et STAT-1) et deux gènes qui ne le sont pas (FOS et PBEF-1) mais dont
42
l’expression était différente entre les brebis gestantes et celles du lot LS, dans l'analyse
transcriptomique.
Les niveaux d'expression relatifs dans les LMC obtenus par qPCR ont confirmé les résultats
de l'analyse transcriptomique pour CXCL10, STAT-1 et PBEF-1. En revanche, la différence
d'expression entre les brebis gestantes (lot G15) et les brebis du lot LS observée dans l'analyse
transcriptomique n'a pas été confirmée par qPCR pour PLAC8 et FOS. Les différences de résultats
entre ces deux techniques peuvent s'expliquer par le fait que l'analyse transcriptomique n'a été
réalisée que sur une fraction, pas toujours représentative, des brebis utilisées pour la quantification
par qPCR (4 brebis sur les 8 du lot G15 et 4 brebis sur les 9 du lot LS). Néanmoins, une différence
significative d'expression au 15ème
jour de gestation a été observée dans les LMC pour CXCL10,
STAT-1 et PBEF-1 entre les brebis gestantes (lot G15) et au moins certains lots de brebis non
gestantes.
Parmi ces 3 gènes, seul CXCL10 parait être un marqueur de la gestation intéressant. En effet,
la variabilité inter-individuelle des niveaux d'expression est élevée pour les autres gènes, ce qui ne
permet pas de définir des seuils d'expression discriminant entre les brebis gestantes et les brebis non
gestantes. Le seul gène pour lequel les valeurs d'expression se distinguent entre les lots est CXCL10.
Le niveau d'expression le plus élevé parmi les brebis non gestantes était similaire au niveau
d'expression le plus faible parmi les brebis gestantes. Il conviendrait de compléter les données
obtenues avec un plus grand échantillon, afin de déterminer la fiabilité d'un test diagnostique basé
sur le niveau d'expression de CXCL10. En effet, en pratique, il est surtout intéressant de détecter
précocement et sans erreur les femelles non gestantes pour les remettre à la reproduction le plus
rapidement possible. On cherche donc un test qui donne peu de faux positifs (bonne spécificité) et
avec une bonne valeur prédictive négative.
Pour les autres gènes, malgré des niveaux moyens d'expression parfois statistiquement
différents entre les brebis gestantes et les brebis non gestantes, plusieurs brebis de chaque lot
avaient des niveaux comparables, ne permettant pas de définir des valeurs seuils fiables. Des
résultats aussi variables ont été obtenus dans plusieurs études analysant d'autres ISG : MX (Yankey
et al., 2001 ; thèse S. Inghels, 2012), ISG15 et OAS-1 (Oliveira et al., 2008) et RTP4 (Gifford et al.,
2008). Les niveaux moyens d'expression étaient statistiquement différents entre les brebis gestantes
et les brebis non gestantes, mais il a été établi qu'aucun de ces gènes ne pouvait être utilisé en tant
que marqueur précoce et fiable de la gestation dans les LMC chez la brebis. Les études réalisées
chez la vache sur les mêmes gènes sont arrivées aux mêmes conclusions (Han et al., 2006 ; Gifford
et al., 2007 ; Stevenson et al., 2007 ; Green et al., 2010). Il a toutefois été observé un effet de la
parité, avec une plus forte expression des ISG chez les génisses comparées aux vaches et des
primipares comparées aux multipares (Green et al., 2010).
Plusieurs hypothèses peuvent expliquer la variabilité d'expression des ISG chez les femelles
gestantes. Yankey et al. (2001) ont mis en évidence une expression de MX plus élevée en présence
de deux embryons plutôt qu’un seul. Les embryons étant à l’origine de la production d’IFNτ qui
stimule l’expression des ISG, qu'un lien soit établi entre le nombre d'embryons et l'expression des
ISG n'est pas surprenant. De même, Ott et al. (1998) ont observé un lien entre l’expression de MX et
la progestéronémie. Les brebis ayant plus d'un embryon ont une progestéronémie plus élevée, du
fait de la présence d'un nombre plus élevé de corps jaunes. La corrélation entre la progestéronémie
et l'expression de MX peut être directe ou bien s'expliquer par le nombre d'embryons, sans que l'on
puisse aujourd'hui trancher entre les deux hypothèses. Nous n'avons pas observé de relation entre le
nombre d'embryons ou la progestéronémie et l'expression des différents gènes étudiés. Cela peut
être dû à notre effectif plus restreint que celui des études citées précédemment. La variabilité
43
observée parmi les brebis gestantes pourrait être liée à la vitesse de croissance des embryons ou à
leur viabilité. Nous n'avons pas mesuré la taille des embryons récupérés, mais Satterfield et al.
(2006) ont montré chez des brebis traitées à la progestérone au cours des 12 premiers jours de
gestation, que les embryons étaient plus gros et produisaient davantage d’IFNτ. Il existe donc une
relation entre la taille de l’embryon et sa capacité à produire de l’IFNτ et donc à stimuler les ISG.
On peut supposer, à la lumière de ces résultats, que les embryons peu viables sont plus petits et
donc incapables de produire de l’IFNτ en quantité suffisante pour assurer une mise en place correcte
de la gestation. Cela pourrait expliquer que certaines brebis gestantes avaient des niveaux
d'expression d'ISG faibles.
Les niveaux d'expression élevés des ISG (CXCL10, PLAC8 et STAT-1) chez des brebis non
gestantes peuvent s'expliquer de deux façons : une mortalité embryonnaire très précoce après la
mise en place de la synthèse de l'INFτ (peu probable dans notre étude car elle a été réalisée au début
de la production de l'INFτ et à ce stade, nous aurions probablement retrouvé une trace d'un éventuel
embryon non vivant dans le liquide de rinçage utérin) et une stimulation par un autre interféron de
type I (en cas d'infection virale subclinique par exemple), les ISG n'étant pas spécifiques de l'INFτ.
Les gènes inductibles par l'INFτ semblaient être des candidats pertinents pour une utilisation
comme marqueurs non invasifs de la gestation. Mais le fait qu'ils soient également inductibles par
d’autres interférons de type I conduit à étudier en parallèle des gènes non inductibles par l’IFNτ tels
que FOS et PBEF-1.
Bien que l’application d’un test précoce de détection de la gestation serait surtout
intéressante pour l’espèce bovine, nous avons choisi la brebis comme modèle animal. Ce choix a été
fait en raison de la plus grande facilité d’élevage de cette espèce qui est moins coûteuse et prend
moins de place. De plus, la gestation est plus courte les mécanismes de mise en place de la
gestation, avec l’intervention de l’IFNτ, sont très similaires. L’objectif est d'identifier un ou des
marqueurs de la gestation dans le modèle ovin, avant d'essayer de les transposer à l’espèce bovine.
On peut déplorer un nombre d’animaux assez faible avec 32 animaux en tout répartis en
quatre lots, ce qui fait que les lots comprennent moins de 10 animaux et il devient délicat de faire
des statistiques sur de faibles effectifs. Néanmoins, les brebis utilisées étaient comparables du fait
qu’elles ont été élevées dans les mêmes conditions et que leurs cycles œstraux ont été synchronisés.
Nous avons choisi de réaliser les prélèvements 15 jours après les chaleurs, car ce stade
correspond à la fin du cycle des femelles non gestantes et au début de la production d'INFτ chez les
femelles gestantes. Ainsi, les femelles non gestantes seraient identifiées avant le retour en chaleurs
et pourraient être remises à la reproduction. L'abattage des animaux a permis, entre autres,
d'observer les embryons et donc d'avoir un diagnostic de certitude concomitant du prélèvement de
sang périphérique. En effet, on peut déplorer dans certaines études que le diagnostic de gestation
soit réalisé bien après la prise de sang donnant lieu au profil d’expression des gènes marqueurs. Il
peut donc y avoir entre-temps un avortement et une femelle détectée non gestante tardivement
pouvait être gestante au moment de la prise de sang. Cela est d’autant plus important que 40% des
avortements précoces chez la brebis se produisent entre J15 et J17. Nous nous sommes donc
affranchis dans notre cas d’un biais important.
L’inconvénient du protocole utilisé dans cette étude impliquant l’euthanasie des animaux est
que l’on ne sait pas si la gestation aurait été menée jusqu’au terme et avec combien de fœtus
vivants. En effet, il serait intéressant de savoir si un niveau d'expression des gènes marqueurs
44
différent serait le signe d'un avortement à venir. En effet, il a été montré qu’un embryon destiné à
mourir produisait une moins grande quantité d’IFNτ, ce qui devrait se manifester par une
stimulation moins conséquente des ISG (Han et al., 2006, Satterfield et al., 2006). Il a également été
montré que le niveau d'expression de MX2 augmentait de façon plus importante chez les génisses
pour lesquelles la gestation était maintenue par rapport à celles qui avortaient (Stevenson et al.,
2007).
L'isolement des LMC, l’extraction des ARNm et leur rétrotranscription en ADNc, ainsi que
la PCR en temps réel ont été réalisés en laboratoire à l’aide du matériel adapté et d’une méthode
standardisée. Han et al. (2006) ont tout de même supposé que la PCR en temps réel utilisant le
SYBR-green comme réactif pouvait affecter la précision des résultats. Cependant, comme il s’agit
d’une méthode fréquemment employée dans les études du même type, cela rend notre travail plus
facilement comparable à la littérature. Plusieurs méthodes d’extraction des ARNm ont été
comparées par Hammerle-Fickinger et al. (2010) : des différences importantes au niveau du
rendement et de la qualité des ARNm obtenus, ainsi que de la reproductibilité de la méthode ont été
mises en évidence. En outre, les rendements moyens étaient différents d’un animal à l’autre en
raison de modifications du nombre de leucocytes en fonction du cycle et de l’exposition au stress.
Cela pose le problème de la reproductibilité qui est importante dans ce type d’étude pour laquelle
les différences observées doivent être dues le plus possible au statut gestationnel des animaux et
non à des différences autres entre les individus.
Il convient également de prendre en compte la durée et les conditions de stockage entre la
prise de sang et l'isolement des LMC : Debey et al. (2004) ont montré qu’un stockage de 20 à 24
heures à température ambiante suffisait pour augmenter l’expression des gènes liés au stress et à
l’apoptose, avec en parallèle une diminution de l’expression de ceux liés au cycle cellulaire, au
métabolisme et à la fonction immune. Pour limiter l'impact de ces biais, une étude a été menée en
parallèle sur les mêmes brebis afin de comparer deux procédures de prélèvements du sang et
d'extraction des ARN : celle présentée dans ce manuscrit (avec isolement des LMC) et une utilisant
des tubes contenant un conservateur des ARNm (sans isolement des LMC) (thèse S. Gillier, en
cours de réalisation). L’objectif est d’obtenir des ARNm de la meilleure qualité possible, ce qui
permettra d’avoir les résultats les plus précis possible.
Par ailleurs, la méthode utilisée dans l'étude présentée ici est difficile à transposer en élevage
en raison de la complexité de son protocole et du coût qu’elle implique. En effet, il faut passer par
une extraction de l’ARNm des LMC que l’on a préalablement isolés des autres cellules sanguines,
suivi d’une rétrotranscription en ADNc puis d’amplifier les gènes qui nous intéressent à l’aide des
amorces correspondantes par PCR en temps réel. Tout cela nécessite du savoir-faire, des produits
spécifiques, ainsi qu’un cadre et du matériel adaptés. Ce test deviendrait intéressant s’il pouvait par
la suite être développé sous forme de kit rapide. Cela permettrait en effet de détecter la gestation par
une prise de sang qui est un examen peu invasif et facilement réalisable en routine, ne demandant
pas de compétences particulières contrairement à l’échographie ou la palpation transrectale. A
terme, l’application pratique de notre étude serait la mise au point d’un test de diagnostic précoce de
gestation réalisable en ferme, lorsqu'un ou des marqueurs précoces et spécifiques de la gestation
auront été identifiés.
45
Les ISG étudiés jusqu'à aujourd'hui en tant que marqueurs précoces de la gestation sont liés
à l’immunité et à l’inflammation. De nombreux travaux concernent le rôle de l’immunité dans la
mise en place de la gestation, en raison de la nécessité pour l’organisme maternel de supprimer
certains composants de l’immunité afin de laisser s’implanter un conceptus semi-allogénique. La
progestérone agit dans ce sens puisqu’elle manifeste des propriétés immuno-modulatrices qui
facilitent l’acceptation du conceptus avant l’implantation et prévient les avortements précoces,
avant même la mise en place du placenta. Il apparaît alors important que d’autres mécanismes de
l’immunité innée soient activés afin de protéger la mère contre les agents infectieux. D’après
Gifford et al. (2007), en début de gestation chez l’Homme, l’immunité innée est d’ailleurs activée à
un niveau proche de la septicémie, tandis que chez les ruminants, on observe une activation des
composants de la réponse immunitaire innée dans les leucocytes circulants. On peut donc supposer
l’existence de phénomènes similaires chez ces animaux, avec un rôle des gènes stimulés par l’IFNτ
que l’on peut suspecter, mais qui reste difficile à objectiver (Gifford et al., 2007). Cela expliquerait
l’effet sur le système immunitaire longtemps suspecté de l’IFNτ qui régule la prolifération des
lymphocytes et la production de cytokines in vitro (Nagaoka et al., 2003). Cependant, Ott et al.
(1998) font l’hypothèse d’un rôle beaucoup plus large des ISG, qui ne seraient ainsi pas seulement
des marqueurs, mais qui comprendrait en plus de la modulation du système immunitaire muqueux
endométrial, la stimulation des sécrétions et la stabilisation du myomètre dans le but de soutenir
l’attachement embryonnaire, mais aussi d’aider à la croissance et au développement fœtal et
placentaire. Malheureusement, rien n’a pu être prouvé dans ce domaine depuis.
46
47
CONCLUSION
Nos résultats confirment que la présence d’un conceptus entraîne chez la femelle ruminant
une modification de l’expression de nombreux gènes qui peut être détectée dans les cellules
immunitaires circulantes, et ce de façon précoce. Certains de ces gènes sont stimulés (CXCL10,
STAT-1, PLAC8) tandis que d’autres sont inhibés (PBEF-1, FOS). Ils semblent jouer un rôle
important dans la mise en place de la gestation, notamment en participant à la régulation de
l’immunité par des mécanismes non encore totalement élucidés. Les niveaux d’expression à J15
étaient en moyenne significativement différents entre les brebis gestantes et les brebis non gestantes
pour CXCL10 et STAT-1. Concernant PLAC8 et PBEF-1, la différence n’était pas significative entre
le lot de brebis gestantes à J15 et un des trois autres lots de brebis non gestantes, ce qui les rend
inutilisables pour discerner les animaux gestants des non gestants. Le gène FOS ne présentait pas
non plus d’intérêt car le niveau moyen d’expression du lot des brebis gestantes n’était
significativement différent d'aucun des autres lots. Malgré les différences significatives observées
pour STAT-1 qui pourraient en faire un marqueur de la gestation intéressant, on observe une grande
variabilité des valeurs individuelles entre les différents lots qui nous empêche de définir une valeur
seuil à partir de laquelle l’animal pourrait être déclaré gestant avec une fiabilité suffisante. Par
conséquent, l’expression de ce gène ne peut pas aboutir à un test diagnostique fiable dans les
conditions de cette expérience et donnerait trop de faux positifs. Le gène CXCL10 semble plus
intéressant car il permet de discriminer les quatre lots avec une surexpression très marquée pour les
femelles appartenant au lot des brebis gestantes. Il semblerait par conséquent judicieux de mesurer
son expression chez un plus grand nombre de brebis à la fois gestantes et non gestantes afin d’avoir
suffisamment de données pour calculer la sensibilité, la spécificité ainsi que les valeurs prédictives
positive et négative. Si un test diagnostique de gestation basé sur l’expression de CXCL10 se
révélait suffisamment fiable pour être appliqué sur le terrain dans l’espèce ovine, d’autres études
pourront être développées avec l’objectif de mesurer son intérêt dans l’espèce bovine, qui est une
cible plus intéressante pour un diagnostic aussi précoce. Il reste également à s’affranchir du travail
de laboratoire long et fastidieux qui permet de mesurer l’expression des gènes et dont le coût est
également rédhibitoire dans les conditions d’élevage.
48
49
BIBLIOGRAPHIE
- ALEXANDER B, COPPOLA G, MASTROMONACO GF, St. JOHN E, REYES ER, BETTS DH
et al. (2008). Early pregnancy diagnosis by serum progesterone and ultrasound in sheep carrying
somatic cell nuclear transfer-derived pregnancies. Reprod. Dom. Anim., 43, 207-211
- ALFONSO PECCHIO AR, CARDOZO GIZZI AM, RENNER ML, MOLINA-CALAVITA M,
CAPUTTO BL (2011). C-Fos activates and physically interacts with specific enzymes of the
pathway of synthesis of polyphosphoinositides. Mol. Biol. Cell., 22, 4716-4725
- AMBROSE DJ, RADKE B, PITNEY PA, GOONEWARDENE LA (2007). Evaluation of early
conception factor lateral flow test to determine nonpregnancy in dairy cattle. Can. Vet. J., 48, 831-
835
- AYAD A, SOUSA NM, SULON J, HORNICK JL, IGUER-OUADA M, BECKERS JF (2009).
Correlation of five radioimmunoassay systems for measurement of bovine plasma pregnancy-
associated glycoprotein concentrations at early pregnancy period. Res. Vet. Sci., 86, 377-382
- BAUERSACHS S, ULBRICH SE, GROSS K, SCHMIDT SE, MEYER HH, WENIGERKIND H
et al. (2006). Embryo-induced transcriptome changes in bovine endometrium reveal species-
specific and common molecular markers of uterine receptivity. Reproduction, 132, 319-331
- BAZER FW, BURGHARDT RC, JOHNSON GA, SPENCER TE, WU G (2008). Interferon and
progesterone for establishment and maintenance of pregnancy : interactons among novel cell
signaling pathways. Reprod. Biol., 8(3), 179-211
- BI TQ, CHE XM (2010). Nampt/PBEF/visfatin and cancer. Cancer Biol. Ther., 10, 119-125
- BINELLI M, SUBRAMANIAM P, DIAZ T, JOHNSON GA, HANSEN TR, BADINGA L et al.
(2001). Bovine interferon-τ stimulates the Janus Kinase-signal transducer and activator of
transcription pathway in bovine endometrial epithelial cells. Biol. Reprod., 64, 654-665
- BOYSEN P, STORSET AK (2009). Bovine natural killer cells. Vet. Immunol. Immunopathol.,
130, 163-177
- BUTLER JE, HAMILTON WC, SASSER RG, RUDER CA, HASS GM, WILLIAMS RJ (1982).
Detection and partial characterization of two bovine pregnancy-specific proteins. Biol.Reprod., 26,
925-933
- CORDOBA MC, SARTORI R, FRICKE PM (2001). Assessment of a commercially available
early conception factor (ECF) test for determining pregnancy status of dairy cattle. J. Dairy. Sci.,
84, 1884-1889
- DAHL TB, HOLM S, AUKRUST P, HALVORSEN B (2012). Visfatin/NAMPT: a multifaceted
molecule with diverse roles in physiology and pathophysiology. Annu. Rev. Nutr., 32, 229-243
- DEBEY S, SCHOENBECK U, HELLMICH M, GETHOF BS, PILLAI R, ZANDER T et al.
(2004). Comparison of different isolation techniques prior gene expression profiling of blood
50
derived cells: impact on physiological responses, on overall expression and the role of different cell
types. Pharmacogenomics J., 4, 193-207
- DIAZ SANCHEZ-BUSTAMANTE C, KELM JM, EGERMANN M, DJONOV V,
FUSSENEGGER M (2008). Ectopic expression of delta FBJ murine osteosarcoma viral oncogene
homolog B mediates transdifferentiation of adipose-like spheroids into osteo-like microtissues.
Tissue. Eng. Part. A., 14, 1377-1394
- EISELE L, KLEIN-HITPASS L, CHATZIMANOLIS N, OPALKA B, BOES T, SEEBER S et al.
(2007). Differential expression of drug-resistance-related genes between sensitive and resistant
blasts in acute myeloid leukemia. Acta. Haematol., 117, 8-15
- EL AMIRI B, KAREN A, SULON J, MELO DE SOUSA N, ALVAREZ-OXILEY AV, COGNIÉ
Y et al. (2007). Measurement of ovine pregnancy-associated glycoprotein (PAG) during early
pregnancy in Lacaune sheep. Reprod. Domest. Anim., 42, 257-262
- FORDE N, LONERGAN P (2012). Transcriptomic analysis of the bovine endometrium: What is
required to establish uterine receptivity to implantation in cattle? J. Reprod. Dev., 58 (2), 189-19
- FOX A, MADDOXB JF, DE VEERC MJ, MEEUSENC EN (2010). TCR+ cells of the pregnant
ovine uterus express variable T cell receptors and contain granulysin. Journal of Reproductive
Immunology, 84, 52–56.
- FUJIWARA H (2009). Do circulating blood cells contribute to maternal tissue remodeling and
embryo-maternal cross-talk around the implantation period ? Mol. Hum. Reprod., 15(6), 335-343
- GAJEWSKI Z, MELO DE SOUSA N, BECKERS JF, PAWLINSKI B, OLSZEWSKA M, THUN
R et al. (2008). Concentration of bovine pregnancy associated glycoprotein in plasma and milk: its
application for pregnancy diagnosis in cows. J. Physiol. Pharmacol., 59, 55-64
- GALAVIZ-HERNANDEZ C, STAGG C, DE RIDDER G, TANAKA TS, KO MS,
SCHLESSINGER D et al. (2003). Plac8 and Plac9, novel placental-enriched genes identified
through microarray analysis. Gene, 309, 81-89
- GANAIE BA, KHAN MZ, ISLAM R, MAKHDOOMI DM, QURESHI S, WANI GM (2009).
Evaluation of different techniques for pregnancy diagnosis in sheep. Small Rum. Res., 85, 135-141
- GARCÍA A, NEARY MK, KELLY GR, PIERSON RA (1993). Accuracy of ultrasonography in
early pregnancy diagnosis in the ewe (transrectal). Theriogenology, 39, 847-861
- GEARHART MA, WINGFIELD WE, KNIGHT AP, SMITH JA, DARGATZ DA, BOON JA et
al. (1988). Real-time ultrasonography for determining pregnancy status and viable fetal numbers in
ewes (transabdo). Theriogenology, 30, 323-337
- GHAFFARI LALEH V, GHAFFARI LALEH R, PIRANY N, MOGHADASZADEH AHRABI M
(2008). Measurement of EPF for detection of cow pregnancy using rosette inhibition test.
Theriogenology, 70, 105-107
- GHANEM N, SALILEW WONDIM D, TESFAYE D, GAD AY, PHATSARA C, THOLEN E et
al. (2011). Bovine blastocysts with developmental competence to term share similar expression of
51
developmentally important genes although derived from different culture environments.
Reproduction, 142, 551-564
- GIFFORD CA, RACICOT K, CLARK DS, AUSTIN KJ, HANSEN TR, LUCY MC et al. (2007).
Regulation of interferon-stimulated genes in peripheral blood leukocytes in pregnant and bred,
nonpregnant dairy cows. J. Dairy. Sci., 90, 274-280
- GIFFORD CA, ASSIRI AM, SATTERFIELD MC, SPENCER TE, OTT TL (2008). Receptor
transporter protein 4 (RTP4) in endometrium, ovary, and peripheral blood leucocytes of pregnant
and cyclic ewes. Biol. Reprod. 79, 518-524
- GILLIER S (à paraître). Comparaison de deux méthodes d’extraction d’ARN pour identifier des
marqueurs précoces de gestation chez les ruminants. Thèse Méd. Vét., Alfort
- GRAY CA, BARTOL FF, TARLETON BJ, WILEY AA, JOHNSON GA, BAZER FW et al.
(2001). Developmental biology of uterine glands. Biol. Reprod., 65, 1311-1323
- GRAY CA, ABBEY CA, BEREMAND PD, CHOI Y, FARMER JL, ADELSON DL et al.
(2006). Identification of endometrial genes regulated by early pregnancy, progesterone, and
interferon tau in the ovine uterus. Biol. Reprod., 74, 383-394
- GREEN JC, OKAMURA CS, POOCK SE, LUCY MC (2010). Measurement of interferon-tau
(IFN-tau) stimulated gene expression in blood leucocytes for pregnancy diagnosis within 18-20d
after insemination in dairy cattle. Anim. Reprod. Sci., 121, 24-33
- GUNES F, AKBAL E, CAKIR E, AKYUREK O, ALTUNBAS M, OZBEK M (2012). Visfatin
may be a novel marker for identifying stages of essential hypertension in advanced age patients.
Intern. Med., 51, 553-557
- HALLER O, STAEHELI P, KOCHS G (2007). Interferon-induced Mx proteins in antiviral host
defense. Biochimie, 89, 812-818
- HAMMERLE-FICKINGER A, RIEDMAIER I, BECKER C, MEYER HH, PFAFFL MW,
ULBRICH SE (2010). Validation of extraction methods for total RNA and miRNA from bovine
blood prior to quantitative gene expression analyses. Biotechnol. Lett., 32, 35-44
- HAN H, AUSTIN KJ, REMPEL LA, HANSEN TR (2006). Low blood ISG15 mRNA and
progesterone levels are predictive of non-pregnant dairy cows. J. Endocrinol., 191, 505-512
- HAN J, ZHANG TO, XIAO WH, CHANG CQ, AI H (2012). Up-regulation of visfatin expression
in subjects with hyperthyroidism and hypothyroidism is partially relevant to a nonlinear regulation
mechanism between visfatin and tri-iodothyronine with various concentrations. Chin. Med. J.
(Engl), 125, 874-881
- HANZEN C, DELSAUX B (1987). Use of transrectal B-mode ultrasound imaging in bovine
pregnancy diagnosis. Vet. Rec., 121, 200-202
- HOSSAINI M, SARAÇ C, JONGEN JL, HOLSTEGE JC (2011). Spinal glycinergic and
GABAergic neurons expressing C-FOS after capsaicin stimulation are increased in rats with
contralateral neuropathic pain. Neuroscience, 196, 265-275
52
- HUI JIA S, LI Y, PARODO J, KAPUS A, FAN L, ROTSTEIN OD et al. (2004). Pre–B cell
colony–enhancing factor inhibits neutrophil apoptosis in experimental inflammation and clinical
sepsis. J. Clin. Invest., 113, 1318-1327
- HUMBLOT P, CAMOUS S, MARTAL J, CHARLERY J, JEANGUYOT N, THIBIER M et al.
(1988). Diagnosis of pregnancy by radioimmunoassay of a pregnancy-specific protein in the plasma
of dairy cows. Theriogenology, 30, 257-267
- IDETA A, HAYAMA K, NAKAMURA Y, SAKURAI T, TSUCHIYA K, TANAKA S et al.
(2010). Intrauterine administration of peripheral blood mononuclear cells enhances early
development of the pre-implantation bovine embryo. Mol. Reprod. Dev., 77, 954-962
- INGHELS S (2012). Étude de marqueurs potentiels précoces de la gestation chez la brebis. Thèse
Méd. Vét., Alfort
- ISOBE N, AKITA M, NAKAO T, YAMASHIRO H, KUBOTA H (2005). Pregnancy diagnosis
based on the fecal progesterone concentration in beef and dairy heifers and beef cows. Anim.
Reprod. Sci., 90, 211-218
- JACQUES C, HOLZENBERGER M, MLADENOVIC Z, SALVAT C, PECCHI E,
BERENBAUM F et al. (2012). Pro-inflammatory actions of visfatin/Nampt involve regulation of
insulin signaling pathway and Nampt enzymatic activity. J. Biol. Chem., 287, 15100-15108
- JOHNSON GA, STEWART MD, GRAY CA, CHOI Y, BURGHARDT RC, YU-LEE LY (2001).
Effects of the estrous cycle, pregnancy, and interferon tau on 2',5'-oligoadenylate synthetase
expression in the ovine uterus. Biol. Reprod., 64, 1392-1399
- KAREN A, BECKERS JF, SULON J, MELO DE SOUSA N, SZABADOS K, RECZIGEL J et al.
(2003). Early pregnancy diagnosis in sheep by progesterone and pregnancy-associated glycoprotein
tests. Theriogenology, 59, 1941-1948
- KARIN M (1995). The regulation of AP-1 activity by mitogen-activated protein kinases. J. Biol.
Chem., 270, 16483-16486
- KING GJ, ATKINSON BA, ROBERTSON HA (1980). Development of the bovine placentome
from days 20 to 29 of gestation. J. Reprod. Fertil. 59 (1), 95-100.
- KLEIN C, BAUERSACHS S, ULBRICH SE, EINSPANIER R, MEYER HH, SCHMIDT SE et
al. (2006). Monozygotic twin model reveals novel embryo-induced transcriptome changes of
bovine endometrium in the preattachment period. Biol. Reprod., 74, 253-264
- KOSAKA K, FUJIWARA H, TATSUMI K, YOSHIOKA S, HIGUCHI T, SATO Y et al. (2003).
Human peripheral blood mononuclear cells enhance cell-cell interaction between human
endometrial epithelial cells and BeWo cell spheroïds. Hum. Reprod., 18(1), 19-25
- LEE KY, DE MAYO FJ (2004). Animal models of implantation. Reproduction, 128, 679-695
- LEMERCIER G (2009). Élevage laitier : bilan et perspectives économiques. Journée « Vache
53
Laitière » du 5 Novembre 2009, Association Française des Techniciens de l’Alimentation Animale,
Paris, 48 p
- LI S, FU H, WANG Y, TIE Y, XING R, ZHU J et al. (2009). MicroRNA-101 regulates
expression of the v-fos FBJ murine osteosarcoma viral oncogene homolog (FOS) oncogene in
human hepatocellular carcinoma. Hepatology, 49, 1194-1202
- MANSOURI-ATTIA N, AUBERT J, REINAUD P, GIRAUD-DELVILLE C, TAGHOUTI G,
GALIO L et al. (2009). Gene expression profiles of bovine caruncular and intercaruncular
endometrium at implantation. Physiol. Genomics, 39, 14-27
- MIRANDO MA, SHORT EC Jr, GEISERT RD, VALLET JL, BAZER FW (1991). Stimulation of
2’,5’-oligoadenylate synthetase activity in sheep endometrium during pregnancy, by intrauterine
infusion of ovine trophoblast protein-1, and by intramuscular administration of recombinant bovine
interferon-alpha 1. J. Reprod.Fertil., 93, 599-607
- MOSCHEN AR, KASER A, ENRICH B, MOSHEIMER B, THEURL M, NIEDEREGGER H et
al. (2007). Visfatin, an adipocytokine with proinflammatory and immunomodulating properties. J.
Immunol., 178, 1748-1758
- NAGAOKA K, SAKAI A, NOJIMA H, SUDA Y, YOKOMIZO Y, IMAKAWA K et al. (2003).
A chemokine, interferon (IFN)-gamma-inducible protein 10kDa, is stimulated by IFN-tau and
recruits immune cells in the ovine endometrium. Biol. Reprod., 68, 1413-1421
- NAKAJIMA TE, YAMADA Y, HAMANO T, FURUTA K, GOTODA T, KATAI H et al.
(2009). Adipocytokine levels in gastric cancer patients: resistin and visfatin as biomarkers of gastric
cancer. J. Gastroenterol., 44, 685-90
- NAKAJIMA TE, YAMADA Y, HAMANO T, FURUTA K, MATSUDA T, FUJITA S et al.
(2010). Adipocytokines as new promising markers of colorectal tumors: Adiponectin for colorectal
adenoma and resistin and visfatin for colorectal cancer. Cancer Sci., 101, 1286-91
- NATION DP, MALMO J, DAVIS GM, MACMILLAN KL (2003). Accuracy of bovine
pregnancy detection using transrectal ultrasonography at 28 to 35 days after insemination. Aust. Vet.
J., 81, 63-65
- OLIVEIRA LJ, HANSEN PJ (2008). Deviations in populations of peripheral blood mononuclear
cells and endometrial macrophages in the cow during pregnancy. Reproduction, 136, 481-490.
- OLIVEIRA JF, HENKES LE, ASHLEY RL, PURCELL SH, SMIRNOVA NP,
VEERAMACHANENI DN et al. (2008). Expression of interferon (IFN)-stimulated genes in
extrauterine tissues during early pregnancy in sheep is the consequence of endocrine IFN-tau
release from the uterine vein. Endocrinology, 149, 1252-1259
- OTT TL, YIN J, WILEY AA, KIM HT, GERAMI-NAINI B, SPENCER TE et al. (1998). Effects
of the oestrus cycle and early pregnancy on uterine expression of Mx protein in sheep (Ovis Aries).
Biol. Reprod., 59, 784-794
54
- PIETERSE MC, SZENCI O, WILLEMSE AH, BAJCSY CS, DIELEMAN SJ, TAVERNE MA
(1990). Early pregnancy diagnosis in cattle by means of linear-array real-time ultrasound scanning
of the uterus and a qualitative and quantitative milk progesterone test. Theriogenology, 33, 697-707
- RACICOT K, OTT T (2011). The myxovirus resistance protein, MX1, interacts with tubulin beta
in uterine glandular epithelial cells. Am. J. Reprod. Immunol., 65, 44-53
- RANILLA MJ, SULON J, CARRO MD, MANTECON AR, BECKERS JF (1994). Plasmatic
profiles of pregancy-associated glycoprotein and progesterone levels during gestation in Churra ans
Merino sheep. Theriogenology, 42, 537-545
- REDDY PS, UMESH S, THOTA B, TANDON A, PANDEY P, HEGDE AS et al. (2008).
PBEF1/NAmPRTase/Visfatin : a potential malignant astrocytoma/glioblastoma serum marker with
prognostic value. Cancer Biol. Ther., 7, 663-668
- ROBERTS RM (2007). Interferon-tau, a Type 1 interferon involved in maternal recognition of
pregnancy. Cytokine Growth Factor Rev., 18, 403-408
- ROMAGNOLO D, NEBEL RL (1993). The accuracy of enzyme-linked immunosorbent assay and
latex agglutination progesterone test for the validation of oestrus and early pregnancy diagnosis in
dairy cattle. Theriogenology, 39, 1121-1128
- ROMANO JE, THOMPSON JA, FORREST DW, WESTHUSIN ME, TOMASZWESKI MA,
KRAEMER DC (2006). Early pregnancy diagnosis by transrectal ultrasonography in dairy cattle.
Theriogenology, 66, 1034-1041
- ROMANO JE, THOMPSON JA, KRAEMER DC, WESTHUSIN ME, FORREST DW,
TOMASZWESKI MA (2007). Early pregnancy diagnosis by palpation per rectum : influence of
embryo/fetal viability in dairy cattle. Theriogenology, 67, 486-493
- ROMANO JE, LARSON JE (2010). Accuracy of pregnancy-specific protein B test for early
pregnancy diagnosis in dairy cattle. Theriogenology, 74, 932-939
- RUDER CA, STELLGLUG JN, DAHMEN JJ, SASSER RG (1988). Detection of pregnancy in
sheep by radioimmunoassay of sera for pregnancy-specific protein B. Theriogenology, 29, 905-912
- SALIQUES S, TEYSSIER JR, VERGELY C, LORGIS L, LORIN J, DONZEL A et al. (2011).
Smoking and FOS expression from blood leukocyte transcripts in patients with coronary artery
disease. Atherosclerosis, 219, 931-936
- SATTERFIELD MC, BAZER FW, SPENCER TE (2006). Progesterone regulation of
preimplantation conceptus growth and galectin 15 (LGALS15) in the ovine uterus. Biol. Reprod.,
75, 289-296
- SCHIAVONE D, AVALLE L, DEWILDE S, POLI V (2011). The immediate early genes Fos and
Egr1 become STAT1 transcriptional targets in the absence of STAT3. FEBS Lett., 585, 2455-2460
- SCHMITT RA, GEISERT RD, ZAVY MT, SHORT EC, BLAIR RM (1993). Uterine cellular
changes in 2',5'-oligoadenylate synthetase during the bovine estrous cycle and early pregnancy.
Biol. Reprod., 48, 460-466
55
- SCOTT JL, KETHEESAN N, SUMMERS PM (2009). Spermatozoa and seminal plasma induce a
greater inflammatory response in the ovine uterus at oestrus than dioestrus. Reprod. Fertil. Dev.,
21(7), 817-826
- SEIDA AA, BRETZLAFF KN, ELMORE RG (1990). Pregnancy diagnosis by milk progesterone
on days 18, 22, and 24 postbreeding in dairy cows. Arch. Exp. Veterinarmed., 44, 489-491
- ŠENOLT L, KRYŠTŮFKOVÁ O, HULEJOVÁ H, KUKLOVÁ M, FILKOVÁ M, CEREZO LA
et al. (2011). The level of serum visfatin (PBEF) is associated with total number of B cells in
patients with rheumatoid arthritis and decreases following B cell depletion therapy. Cytokine, 55,
116-121
- SHEMESH M, AYALON N, MAZOR T (1979). Early pregnancy diagnosis in the ewe, based on
milk progesterone levels. J. Reprod. Fert., 56, 301-304
- SPENCER TE, JOHNSON GA, BURGHARDT RC, BAZER FW (2004). Progesterone and
placental hormone actions on the uterus: insights from domestic Animals. Biol. Reprod., 71, 2-10
- SPENCER TE, BURGHARDT RC, JOHNSON GA, BAZER FW (2004). Conceptus signals for
establishment and maintenance of pregnancy. Anim.Reprod.Sci., 82-83, 537-550
- STEVENSON JL, DALTON JC, OTT TL, RACICOT KE, CHEBEL RC (2007). Correlation
between reproductive status and steady-state messenger ribonucleic acid levels of the Myxovirus
resistance gene, MX2, in peripheral blood leukocytes of dairy heifers. J. Anim.Sci., 85, 2163-2172
- STEWART MD, JOHNSON GA, VYHLIDAL CA, BURGHARDT RC, SAFE SH, YU-LEE LY
et al. (2001). Interferon-tau activates multiple signal transducer and activator of transcription
proteins and has complex effects on interferon-responsive gene transcription in ovine endometrial
epithelial cells. Endocrinology, 142, 98-107
- SZENCI O, BECKERS JF, HUMBLOT P, SULON J, SASSER G, TAVERNE MA et al. (1998).
Comparison of ultrasonography, bovine-specific protein B, and bovine pregnancy-associated
glycoprotein 1 tests for pregnancy detection in dairy cows. Theriogenology, 50, 77-88
- TABASSUM R, MAHENDRAN Y, DWIVEDI OP, CHAUNHAN G, GHOSH S, MARWAHA
RK et al. (2012). Common variants of IL6, LEPR, and PBEF1 are associated with obesity in Indian
children. Diabetes, 61, 626-631
- TAVERNE MA, SZENCI O, SZÉTAG J, PIROS A (1985). Pregnancy diagnosis in cows with
linear-array real-time ultrasound scanning: a preliminary note. Vet. Q., 7, 264-270
- VALENTINO L (2009). Rôle de la protéine SOCS-1 dans la progression tumorale chronique.
Thèse Pharm., Châtenay-Malabry, n°1025
- WARNICK LD, MOHAMMED HO, WHITE ME, ERB HN (1995). The relationship of the
interval from breeding to uterine palpation for pregnancy diagnosis with calving outcomes in
holstein cows. Theriogenology, 44, 811-825
56
- WIMPY TH, CHANG CF, ESTERGREEN VL, HILLERS JK (1986). Milk progesterone enzyme
immunoassay: modifications and a field trial for pregnancy detection in dairy cows. J. Dairy. Sci.,
69, 1115-1121
- WON HH, KIM SR, BANG OY, LEE SC, HUH W, KO JW et al. (2012). Differentially expressed
genes in human peripheral blood as potential markers for statin response. J. Mol. Med. (Berl.), 90,
201-211
- XIE J, KUENZEL WJ, SHARP PJ, JURKEVICH A (2011). Appetitive and consummatory sexual
and agonistic behaviour elicits FOS expression in aromatase and vasotocin neurones within the
preoptic area and bed nucleus of the stria terminalis of male domestic chickens. J.
Neuroendocrinol., 23, 232-243
- YANG H, QIU L, CHEN G, YE Z, LU C, LIN Q (2008). Proportional change of CD4C-CD25C
regulatory T cells in decidua and peripheral blood in unexplained recurrent spontaneous abortion
patients. Fertility and Sterility, 89, 656-661
- YANKEY SJ, HICKS BA, CARNAHAN KG, ASSIRI AM, SINOR SJ, KODALI K et al. (2001).
Expression of the antiviral protein Mx in peripheral blood mononuclear cells of pregnant and bred,
non-pregnant ewes. J. Endocrinol., 170, R7-R11
- YOTOV S (2005). Diagnosis of early pregnancy in Satra Zagora dairy sheep breed. Bulg. J. Vet.
Med., 1, 1-45
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