qo423-1ppt.ppt · 2020. 12. 17. · unidade de massa atômica (u)unidade de massa atômica (u) u =...
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QO423
Espectrometria de MassasEspectrometria de Massas
O que é a massa de um átomo ?O que é a massa de um átomo ?
M 5M = 5
11H (1p, 1e) = 1.0079H (1p, 1e) = 1.007922H (1p, 1n, 1e) = 2.0141H (1p, 1n, 1e) = 2.014144He (2p 2n 2e) = 4 0026He (2p 2n 2e) = 4 002644He (2p, 2n, 2e) = 4.0026He (2p, 2n, 2e) = 4.0026
4He/ 2H = 1.98 !!
Como é um átomo ?Como é um átomo ?
Como o núcleo ã l d ?!!não explode ?!!
Modelo de Bohr
Forças FundamentaisForças Fundamentais
E 2E = m . c2
Qual é a massa de um átomo ?Qual é a massa de um átomo ?
Massa
=
Soma das massas das partículasSoma das massas das partículas
–
Energia liberada na formação do átomo (núcleo)
Defeito de massaDefeito de massa
• Nenhum átomo (c/ excessão do 12C) tem massa inteira
• Diferença é chamada de Defeito de Massa
Defeito de Massa
Energia de Ligação do Núcleo e Defeito de MassaDefeito de Massa
0,02
0,00
Mas
sa
-0,02
efei
to d
e M
-0,04De
H He Li Be B C N O F Ne Na Mg Al Si P S Cl
-0,06
Elemento
Unidade de massa atômica (u)Unidade de massa atômica (u)
u = 1.6605 x 10-27 kg ( 1/12 12C)
Proton: 1.6726×10-27 kg (1.0073 u)
Nêutron:1.6749 x 10-27 kg (1.0086 u)
Elétron: 9.1093 × 10-31 kg (0.0005u)
Tipos de massas atômicasTipos de massas atômicas• Nominal:• Nominal:
– Massa aredondada em 1 u:H = 1, C = 12, Cl = 35
• Média:• Média:– Massa média dos isótopos:H = 1.0079, C = 12.0107, Cl = 35,4532
M i ó i• Monoisotópica:– Massa do isótopo mais abundante:pH = 1.0078, C = 12.0000, Cl = 34.9688
Massas Moleculares ExatasMassas Moleculares Exatas
• Consiste na soma das massas atômicas
É única para cada fórmula
N2 = 28.0061N2 28.0061C2H4 = 28.0313CO = 27 9949CO = 27.9949B2H6 = 28.0656
Isótopos NaturaisIsótopos Naturais
• Substâncias Orgânicas: • 1H (99 98%) 2H (0 01%)H (99.98%), H (0.01%)• 12C (98.93%), 13C (1.07%)• 14N (99.63%), 15N (0.37%)• 16O (99 80%) 18O (0 20%)• O (99.80%), O (0.20%)• 32S (94.93%), 34S (4.29%)• 35Cl (75.78%), 37Cl (24.22%)• 79Br (50 69%) 81Br (49 31%)• 79Br (50.69%), 81Br (49.31%)
MS e Padrão IsotópicoMS e Padrão Isotópico
• MS mede isótopos individuais e não massas médias
• Substâncias apresentam várias massas dependendo da composição isotópicadependendo da composição isotópica
• Composição isotópica varia de acordo com a composição química
Padrão Isotópicop100 9.88e1216.0313
%
CH4
mass14 15 16 17 18 19 20
0
100 9.35e1278.0470
%
C6H6
%
mass0
79.0470
76 77 78 79 80 81 82
[M+1] = 6%[ ]
Benzo[a]Pireno: C HBenzo[a]Pireno: C20H12
[M 1] 22 5%[M+1] = 22.5%[M+2] = 2.3%
100 7.84e12368.1372
C H N OC20H20N2O5
%
369.1372
mass367 368 369 370 371 372 373 374 375
0370.1450
[M+1] = 23 4%[M+1] = 23.4%[M+2] = 3.6%
100 7.49e1249.9923
%
51 992351.9923
mass45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57
0
CH3Cl
100 5.68e1283.9534
85.9534
CH2Cl2
%
87.9455
mass79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93
0
[M+1] = 1%[M+2] = 64%[M+3] = 0%[M+4] = 10%
100 5.13e12204.0473
%
206.0473
%
C10H14Cl2
mass203 204 205 206 207 208 209 210 211
0
205.0473 208.0394207.0473
203 204 205 206 207 208 209 210 211
[M+1] = 11%[M+2] = 64%[M+3] = 7%[M+3] = 7%[M+4] = 10%[M+5] = 1%
100( ) ( ); ( , )
4.52e12228.0150 230.0150
%%
C10H13BrO
mass226 227 228 229 230 231 232 233 234 235 236 237
0
229.0150 231.0150
10 13
226 227 228 229 230 231 232 233 234 235 236 237
Padrão IsotópicoPadrão Isotópico
5730 3655 3660 2465 2095 1295
1000 2000 3000 4000 5000 6000
Regra do NitrogênioRegra do Nitrogênio
• Uma molécula orgânica neutra só terá massa impar se ela tiver número ímpar de p pnitrogênio
C H O: 44– C2H4O: 44– CH3CONH2: 59– C6H4(NH2)2: 108– C10H22O: 15810 22
Tabela de IsótoposElemento Isótopo Massa (u) Abundância
(%) 1H 1 00782 100H H 1.00782 100H2H 2.01410 0.02
12C 12.00000 100C13C 13.00335 1.07 14N 14.00307 100 N 1515N 15.00010 0.3716O 15.99491 100 O 18O 17 99916 0 20O 17.99916 0.2032S 31.97207 100 S 34S 33.96786 4.52S 33 96 86 535Cl 34.96885 100 Cl 37Cl 36.96590 31.96 7979Br 78.91833 100Br81Br 80.91628 97.27
Instrumentação
IntroduçãoIntroduçãode
amostras
Fonte de Ionização
Analizadorde m/z Detector
Vácuo
EICIAPCI
BQTof
Direto GCHPLC
Multiplicador e-
MCPAPCIAPPIESI
TofITLIT
HPLCCE
ESIMALDIFAB
ICROrbitrap …
DESIDART …
J J. Thomson recebeu o Prêmio Nobel de Física em
J J. Thomson recebeu o Prêmio Nobel de Física emPrêmio Nobel de Física em
1906Prêmio Nobel de Física em
1906
J. J. ThomsonJ. J. Thomson
Descoberta do elétron e medida da sua razão massa/carga (m/z) !!
Descoberta do elétron e medida da sua razão massa/carga (m/z) !!
Ionização por Elétrons (EI)Ionização por Elétrons (EI)
EIEI
Moléculas neutras, na fase gasosa (dessorçãotérmica) a uma pressão típica de 10-5 torr sãotérmica), a uma pressão típica de 10 torr, sãobombardeadas por elétrons, com energia típica de 70eV. Ocorre principalmente a retirada ou captura deum elétron formando íons M+. ou M-.. Íons positivossão predominantes. M-. se tornam importantes para
lé l lt EAmoléculas com alta EA.
M + e- (70 eV) M+. (~ 5-10 eV) + 2e- (~60-)65 eV)
Fonte de EIFonte de EI
EI: CaracterísticasEI: CaracterísticasProcesso unimolecular. Os íons formados são rapidamente extraídosda fonte de ionização pelo eletrodo de repulsão ("repeller“).
Íons moleculares são formados com excesso de energia interna e sef t t t l i l tfragmentam total ou parcialmente.
EI é bastante popular: produz tanto o íon molecular (massa) comotambém fragmentos (estrutura); espectros reprodutíveis; bibliotecas detambém fragmentos (estrutura); espectros reprodutíveis; bibliotecas deespectros de EI a 70 eV; estável; fácil de operar; alta sensibilidade.
Aplica-se a moléculas de média e baixa polaridade e baixo pesomolecular (~500u), voláteis e termo-estáveis: moléculas orgânicasrelativamente pequenas.
Q d í l l é b d (d id di iQuando o íon molecular não é observado (devido a dissociaçãoexcessiva), existe um processo dissociativo exotérmico e portanto M+.
é uma espécie instável.
EI ocorre em ~10-16 s. Uma em cada 103-105 moléculas que entramna fonte de EI é ionizada.
Energia das MoléculasEnergia das Moléculas
ExemplosExemplos
Acetofenonam = 120
ExemplosExemplos
Progesteronem = 314
ExemplosExemplos
C7H16 m = 100
Energia dos ElétronsEnergia dos Elétrons
Energia x FragmentaçãoEnergia x Fragmentação
Dissociação de Íons RadicalaresDissociação de Íons RadicalaresM + e- M+. + 2e-M + e M + 2e
F+. + mol0 F+ + Rad.
F+ + mol0F+ + mol0 F+ + Rad
F+ l0
F+. + mol0 F+ + Rad.
F+ + mol0F+ + mol0F+ + Rad.F+. + mol0
Regra do Elétron Par
Í
Regra do Elétron Par
• Íons positivos radicalares (camada aberta) podem:p– Perder radical e formar fragmentos positivos
(camada fechada)(camada fechada)– Perder molécula neutra e ficar
positivo/radicalar (camada aberta)positivo/radicalar (camada aberta)• Íons positivos (camada fechada) podem:
– Perder moléculas neutras e ficar positivo (camada fechada)( )
DefiniçõesDefinições
Í• Íon Molecular: íon correspondente à
molécula ionizada: M+.molécula ionizada: M+
• Pico base: íon mais intenso no espectrop
Fragmentações em EIFragmentações em EI
Í• Localizar Íon Molecular• Observar característica do espectroObservar característica do espectro• Analisar as fragmentações
Íon MolecularÍon Molecular
Í• Íon de mais alta massa (descontado 13C)• Se tem alta exatidão calcular DBISe tem alta exatidão, calcular DBI• Verificar fragmentações lógicas
ExemploExemplo
152
195
ExemploExemplo
180
166
Exemplosp
Progesteronem = 314
ExemplosExemplos
C7H16 m = 100
Mecanismos de FragmentaçãoMecanismos de Fragmentação
• 4 clivagens principais:– Dissociação sigmaç g– Clivagem alfa
Clivagem indutiva– Clivagem indutiva– Fragmentação remota
• Rearranjos– MclaffertyMclafferty
Fragmentação de HidrocabonetosFragmentação de Hidrocabonetos
• Dissociação Sigma seguida de perda de alcenos
• Íons moleculares pouco intensosR ifi ã di i f t ã• Ramificação dirige a fragmentação
• Íons característicos: 15, 29, 43, 57, 71o s ca acte st cos 5, 9, 3, 5 ,
Exemplosp
ExemplosExemplos
ExemplosExemplos
AlcenosAlcenos
• Dissociação Sigma• Formação de íon alílicoFormação de íon alílico• Forma série C2H2n-1 (2 u menor que
Al )Alcano)
ExemplosExemplos
ÁlcooisÁlcoois
Exemplos
AromáticosAromáticos
• Formam gerlamente, m/z 77, 78 e/ou 79• m/z 91 / 92 para alquil-aromáticosm/z 91 / 92 para alquil aromáticos• Íons característicos de m/z 39, 51 e 65• Íons moleculares mais intensos que HC
AromáticosAromáticos
AromáticosAromáticos
ÁlcooisÁlcoois
ÁlcooisÁlcoois
Álcoois
154
156
EIEI
• Gera M+. e fragmentos• Pode não gerar íon molécularPode não gerar íon molécular
Ionização Química (CI)Ionização Química (CI)Munson and Field 1966Munson and Field - 1966
EI• EI:– Simples– Produz extensa fragmentação– Muitas vezes tem M+.Muitas vezes tem M– Quando não tem M+.
Controle da Exotermicidade da R ã E t ã d F t ãReação: Extensão de Fragmentação
CH44
Exemplos
Iso-C4H10
NH3
Exemplos
Exemplos
GC/MS
GC/MSGC/MS
Mass Analyzer
GC/MSGC/MS
Estrutura dos dadosEstrutura dos dados
GC/MS
GC/MSGC/MS
Mass Analyzer
GC/MSGC/MS
Estrutura dos dadosEstrutura dos dados
Modos de aquisiçãoModos de aquisição
• Varredura– Análises qualitativasq– Análises quantitativas (menor sensibilidade)
SIM (S l t d I M it i )• SIM (Selected Ion Monitoring)– Análises quantitativas (maior sensibilidade)
Eletrosprayp yJohn Fenn – 1989
Prêmio Nobel em Química 2002 !
Yamashita, M.; Fenn, J.B., J. Phys. Chem. 88 (1984) 4451.
Whitehouse, C.M.; Dreyer, R.N.; Yamashita, M.; Fenn, J.B., Anal. Chem. 57 (1985) 675.
Fenn, J.B.; Mann, M.; Meng, C.K.; Wong, S.F.; Whitehouse, C.M., Science 246 (1989) 64.
"Electrospray Ionization for Mass Spectrometry of Large Biomolecules,“
ESI: Princípio GeralESI: Princípio Geral
ESI: Princípio GeralESI: Princípio Geral( Uma solução da amostra em pH ácido ou básico (ou
“neutra” de um sal) é submetida a um spray eletrolítico sob pressão atmosférica Um fino sprayeletrolítico sob pressão atmosférica. Um fino spray(aerosol) se forma (cone de taylor) na presença de um alto campo elétrico de +4000V (ou – 4000V). O u a to ca po e ét co de 000V (ou 000V). Ocontra-íon é oxidado (ou reduzido) e formam-se gôtas com excesso de carga positiva (ou negativa). O solvente evapora, e o volume das gôtas é reduzido, e as gôtas se subdividem. Eventualmente,devido a alta repulsão entre os íons de mesma cargadevido a alta repulsão entre os íons de mesma carga, ou se formam gôtas contendo apenas um íon (modelo CRM) ou íons evaporam (são “ejetados”)( ) p ( j )das gôtas para a fase gasosa (modelo IEM de evaporação de íons).
Mecanismo de DessorçãoMecanismo de Dessorção
Sonda de ESISonda de ESI
ESI e NanoESIESI e NanoESI
ESI: Moléculas OrgânicasESI: Moléculas Orgânicas
ESI: Moléculas OrgânicasESI: Moléculas Orgânicas
Complexos OrganometálicosComplexos Organometálicos
O
ORuOO
O
N100 913.0
912.0
911.0
910.0
O
Ru
RuO
OOO
OO
O
N N
%909.0
908.0
907.0
914.0
915.0
916.0
ON
903 904 905 906 907 908 909 910 911 912 913 914 915 916 917 918 919 920 921 922 923m/z0
906.0
905.0
904.0
918.0917.0
919.1
100 913.0
%
620 640 660 680 700 720 740 760 780 800 820 840 860 880 900 920 940m/z0
PolímerosPolímeros
C9H19 O(CH2CH2O)n H
ESI Glu Fibrinopeptídeo (1568 9)ESI Glu-Fibrinopeptídeo (1568.9)100
( )234785.46
100204785.46
785 97
%
%
785.97
786 47
m/z785 786 787 788
0
786.47
786.95
m/z0 m/z50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 900
0
(1568 9 + 2 ) / 2 = 785 46(1568.9 + 2 ) / 2 = 785.46(1569.9 + 2 ) / 2 = 785.96
Íons Multicarregados:Padrão Isotópico
+1 = 1/1 = 1.00
+2 = 1/2 = 0.50+2 1/2 0.50
3 1/3 0 33+3 = 1/3 = 0.33
+4 = 1/4 = 0.25
Íons MulticarregadosÍons MulticarregadosB-Gal 10 fm/uL
100
hilo08 83 (2.432) 1: TOF MS Survey ES+ 302671.41
B-Gal 10 fm/uL
100
hilo08 83 (2.432) 1: TOF MS Survey ES+ 228567.38100
567.38
567.63
671.90
100
567.12567.63
%
668.70567.85
617.44
575.82604.17576.81587.29
626.92
653.41627.90
672.42
672.91
%
567.85
568.11568 39
m/z560 570 580 590 600 610 620 630 640 650 660 670 680
0
587.29 627.90
m/z567 568
0
568.39
B-Gal 10 fm/uL
100
hilo08 83 (2.432) 1: TOF MS Survey ES+ 103668.70668.37
B-Gal 10 fm/uL
100
hilo08 83 (2.432) 1: TOF MS Survey ES+ 302671.41100 668.37
669.04
100
671.90
%
668.18667 36
669.37
669.68
670 10 670 38
%
672.42
672.91673 40
m/z668 669 670
0
667.36 670.10 670.38m/z
671 672 673 6740
673.40
ESI de ProteínasESI de ProteínasMioglobina: (16881 Da) : (16881 + 20) / 20 = 845.1Mioglobina: (16881 Da) : ( )
(16881 + 21) / 21 = 804.9(16881 + 22) / 22 = 768.3teste
100
Mioglobina 891 (16.772) Cm (889:907) TOF MS ES+ 1.48e3804.9
% (M + x) / x = m/z1
m/z804 805 806
0
( )(M + x +1) / (x +1) = m/z2
1001.48e3804.9768.3735.0
704.4
845.1889.5
938 9
%
676.3
650 3
938.9
994.11056.1
1126.5
m/z650 700 750 800 850 900 950 1000 1050 1100 1150 1200
0
650.31206.9
ESI: ComplexosESI: Complexos
Urease da Helicobacter pylori
1.05 MDa !
ESI de Vírus Intacto
LC MSLC-MS
• ESI: Introdução de amostra em solução• Possibilidade de acoplamento c/ HPLCPossibilidade de acoplamento c/ HPLC
LC MS Urina: MetabólitosLC-MS Urina: Metabólitos
Total: ~1500 peptídeos!
MALDIMALDIIonização e Dessorção a LASER
Auxiliada por Matriz
Koichi Tanaka
Franz HillenkampMichael KarasMichael Karas
MALDI: PrincípioMALDI: Princípio
ION FORMATION IN MALDI MASS SPECTROMETRY Renato Zenobi andION FORMATION IN MALDI MASS SPECTROMETRY Renato Zenobi and Richard Knochenmuss, Mass Spectrometry Reviews, 1998, 17, 337–366
MALDI: Princípio
Nuvem de plasma (Plume)Nuvem de plasma (Plume)
MALDIMALDI
MALDI: Íons MonocarregadosMALDI: Íons Monocarregados
100( ) ( ) ( ) ( )
3.60e312417.97
% 17016.75
12630.54
24042.51
m/z0
17224.64
10000 12000 14000 16000 18000 20000 22000 24000 26000 28000m/z0
MALDI: SensibilidadeMALDI: Sensibilidade
42 Zeptomols42 Zeptomols (25000 Moléculas)de substância P !!!
J Am Soc Mass Spectrom 2001, 12, 1055–1063
MatrizesMatrizes
FulerenosFulerenos
PolímerosPolímeros
PEG 10KDa
ProteínasProteínas
?
MALDI: CaracterísticasMALDI: Características
• Forma íons monocarregados• SensívelSensível• Rápido para amostras individuais• Mais Tolerante a contaminantes• Problemas com massa baixa• Problemas com massa baixa
MS: Métodos de IonizaçãoMS: Métodos de Ionização
MALDI
ssa
Mas
EI ESIPolaridade
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