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Purificazione e de novo sequencing di Pol1 e Pol2 due nuovi peptidi

antibatterici isolati dalla saliva di larve di Polistes dominulus

Interazione ospite-patogeno

Gli insetti riconoscono dei pattern molecolari associati ai patogeni (Pathogen associated molecular pattern PAMPs) utilizzando delle molecole chiamate recettori di riconoscimento per Pattern patogeni (pattern recognitionreceptors PRRs)

Gli insetti non hanno un sistema di difesa antigene-anticorpo, caratteristico del sistema immunitario dei vertebrati

Drosophila melanogaster è stato scelto come modello per lo studio della risposta umorale innata verso batteri e funghi

ANTIMICROBIAL PEPTIDES (AMPs)

• Antifungini (Candida, Cryptococcus, Aspergillus)

• Antiparassitari (Malaria, Leishmania, Trypanosoma)

• Antibatterici• Gram positivi• Gram negativi

• Antivirali

Piccole proteine cariche positivamente

Prodotti da fat body e epitelio dotto gastrico

Divisi in tre classi principali negli insetti:

2) Peptidi stabilizzati da Cisteina

3) Peptidi ricchi in Prolina e/o Glicina

1) Peptidi lineari, privi di residui di Cisteina, con struttura ad α-elica

ANTIMICROBIAL PEPTIDES

1) Peptidi lineari, privi di residui di Cisteina,

con struttura ad α-elica

Cecropina A di Hyalophora(farfalla)

29-42 residui

Random coil in soluzione, α-

elica a contatto con membrana

Gram-

2) Peptidi stabilizzati da Cisteina

Defensina di Phormia (mosca)

34-46 residui

2-6 Kda

Loop N-terminale, α-elica e due

fogliettiβ antiparalleli, stabilizzati

da 3 ponti di-solfuro

Gram+, Gram-, Fungi

3) Peptidi ricchi in Prolina e/o Glicina

Proline rich:

es.ApidecinaRandom coilGram+, Gram-

Glycine rich:

es. Diptericina e GloverinaGram-

Organism of origin Name Primary structureDrosophila melanogaster Drosocin GKPRPYSPRPTSHPRPIRV

Metchnikowin HRHQGPIFDTRPSPFNPNQPRPGPIYApis mellifera Apidaecin IA GNNRPVYIPQPRPPHPRIBombus pascuorum Abaecin FVPYNPPRPGQSKPFPSFPGHGPFNPKIQWPYPLPNPGHMyrmecia gulosa Formaecin 1 GRPNPVNNKPTPHPRLBombyx mori Lebocin 3 DLRFLYPRGKLPVPTLPPFNPKPIYIDMGNRYTrichoplusia ni Lebocin SLPSLRLPGRNFPIPPTTPPFVPKPRRFPIYVPyrrhocoris apterus Pyrrhocoricin VDKGSYLPRPTPPRPIYNRNPalomena prasina Metalnikowin I VDKPDYRPRPRPPNM 19-30 AA, 25% Pro

Attività antibatterica di saliva di P.dominulus

Microorganism Antimicrobial Antimicrobial Volume of saliva No. tests No. positivestandard1 volume (µl) (µl) performed

tests of saliva 2

B. subtilis Penicillin G [1.15] 1 5 11 11

[5.09 ± 0.93]E. coli Tetracycline [0.6] 1 5 8 8

[7.88 ±4.02] C. parapsilosis Nystatin [1.35] 25 (in disk) 5 10 0C. albicans Nystatin [1.15] 25 (in disk) 5 10 0C. krusei Nystatin [1.1] 25 (in disk) 5 10 0

Purificazione componenti antibatteriche della saliva di Polistes dominulus

Precipitazione frazionata (etanolo 40%)

Purificazione mediante RP-HPLC

Saggi di attività antimicrobica (su B. subtilis)

Analisi MALDI-TOF

Proteine totali (µg)

Attivitàantibatterica

(ng di penicillina)

Peptide A 94,5 7,2

Peptide B 105 12,5

A B

Analisi MALDI-TOF

Peptide A Peptide B

Sequenza peptide A

Degradazione di Edman

Spettrometria ESI-Trap

Spettrometria MALDI-TOF

ESI-Trap sul frammento interno

1 5 10 15 20

R G N I P I I P V V P N V P R L V D P K S

Proline-rich peptide

Caratterizzazione peptide A

Spettro in dicroismo circolare (CD)

Produzione per sintesi chimica del peptide A

Saggi di attività antibatterica negativi (attivi solo ad alte concentrazioni)

Non altamente strutturato (picco negativo a 200 nm)

Predizione struttura secondaria

Riattivazione peptide A sintetico

- Riattivazione su colonna a scambio cationico

- Riattivazione su resina con ancorato PPI

- Riattivazione su piastra (isomerizzazione a contatto con il bersaglio)

- Trattamento con Peptidil Prolil Isomerasi (PPI)

Riattivazione su colonna a scambio cationico

Attività su B.subtilis

Conclusioni I

Prodotto sinteticamente non si è dimostrato attivo e neanche riattivabile in buona resa a seguito di vari trattamenti

Appartiene alla sottofamiglia dei peptidi ricchi in Prolina

UniProt KnowlwdgebaseAccession number Pol2 P86457

PEPTIDE A

Isolamento gene ed espressione eterologa

Caratterizzazione peptide B

Carbamidometilazione

Degradazione di Edman

AA Picco B

Asx 0,23 (1,4)

Thr 0,27 (1,6)

Ser 0,43 (2,5)

Glx 0,47 (2,8)

Gly 0,6 (3,5)

Ala 0,18 (1,0)

Val 0,25 (1,5) Met 0

Ile 0,19 (1,1)

Leu 0,17 (1,0)

Tyr 0

Phe 0

Lys 0,16 (1,0)

His 0

Arg 0,42 (2,5)

Analisi di AA

4042 – 3700 ≈ 342 Da / 57 = 6 Cys

X Cys ?

Caratterizzazione peptide B

Trattamento con Arginina-C-proteasi

1 5 10 15 20 25 30 35

L S C Q A L G P I G C A A N C K R L G F R G G W C T T G N T C R C F RL S C Q L G G I I G C S S S C A Y Q G R R …

Culicoides sonorensis

Polistes dominulus

2000 2100 2200 2300 24000

10000

20000

30000

40000

50000

60000

70000

80000 Peptide 10 Arg-C2173.28

rela

tive

abun

danc

e

m/z

Analisi MALDI-TOF

850 900 950 1000 10500

10000

20000

30000

40000

50000

60000

70000Peptide 5 Arg-C

867.20

1038.32

882.21

rela

tive

abun

danc

e

m/z

850 900 950 1000 1050

0

10000

20000

30000

40000

50000Peptide 7 Arg-C

1035.60

879.44

rela

tive

abun

danc

e

m/z

Regione N-terminale

?

?

1 5 10 15 20

L S C Q L G G I I G C S S S C A Y Q G R R …

0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 10000

2500

5000

7500

10000

12500

15000S

928.4

S

841.4

CCAMA

754.4

594.3

YQGHO-R

523.3360.3232.3

175.3Inte

nsity

[a.u

.]

m/z

1000 1250 1500 1750 2000 22500

2500

5000

7500

10000

12500

15000I/L

2174.2

S

2060.7

CCAM

1973.7

Q

1813.8

I/L

1685.7

GG

1572.7

1515.6

I/L

1458.5

I/L

1345.5

G

1232.5

CCAM

1175.5

S

1015.5

Inte

nsity

[a.u

.]

m/z

L S C Q L G G I I G C S S S C A Y Q G R. . …

Peptide 10

Confermata la sequenza…

Peptide 5

Degradazione di Edman

L S C Q A L G P I G C A A N C K R L G F R G G W C T T G N T C R C F R

L S C Q L G G I I G C S S S C A Y Q G R R . . . . . . . S G C Y C N R

Peptide 5

Culicoides sonorensis

Polistes dominulus

Purtroppo i risultati degli esperimenti MS/MSnon hanno fornito utili informazioni…

600 800 10000

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

8000

LIFT Picco 7 m/z 500-1000 serie y

608.31 707.37

764.44

879.48CAM-C V G D

rela

tive

abun

danc

e

m/z

0 100 200 300 400 5000

1000

2000

LIFT Picco 7 m/z 0-500serie y

??

??

335.22 448.28

I/L CAM-C

rela

tive

abun

danc

e

m/z

Peptide 7

L S C Q A L G P I G C A A N C K R L G F R G G W C T T G N T C R C F R

L S C Q L G G I I G C S S S C A Y Q G R R D G V C I . . S G C Y C N R

Peptide 5

Culicoides sonorensis

Polistes dominulus Peptide 7L

Conclusioni IIPEPTIDE B

La presenza di 6 Cys e l’allineamento con altre proteine simili portano a concludere che sia appartenente alla famiglia delle DEFENSINE

Sono stati ottenuti dati parziali sulla sequenza

(UniProt KnowlwdgebaseAccession number Pol2 P86458)

Come per il PEPTIDE A isolamento del gene…

Dipartimento di Scienze Biochimiche

Luigia PazzagliEleonora PagniGianni Cappugi

Centro Interdipartimentale Spettrometria di Massa

Guido MastrobuoniGloriano MonetiStefano Turillazzi