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LGN 5799 - SEMINÁRIOS EM GENÉTICA E MELHORAMENTO DE PLANTAS
LGN 5799 LGN 5799 -- SEMINÁRIOS EM GENÉTICA SEMINÁRIOS EM GENÉTICA E MELHORAMENTO DE PLANTASE MELHORAMENTO DE PLANTAS
Programa de Pós-Graduação em Genética e Melhoramento de Plantas
Programa de PósPrograma de Pós--Graduação em Graduação em
Genética e Melhoramento de PlantasGenética e Melhoramento de Plantas
Departamento de GenéticaAvenida Pádua Dias, 11 - Caixa Postal 83, CEP: 13400-970 - Piracicaba - São Paulo - Brasil
Telefone: (0xx19) 3429-4250 / 4125 / 4126 - Fax: (0xx19) 3433-6706 - http://www.genetica.esalq.usp.br/semina.php
Aline Silva Romão
Orientador: Dr. Welington Luiz de Araújo
Aline Silva RomãoAline Silva Romão
Orientador: Dr. Welington Luiz de AraújoOrientador: Dr. Welington Luiz de Araújo
FUNGOS PATOGÊNICOS: MECANISMOS MOLECULARES DE INFECÇÃO E ESTABELECIMENTO NA PLANTA
FUNGOS PATOGÊNICOS: MECANISMOS FUNGOS PATOGÊNICOS: MECANISMOS MOLECULARES DE INFECÇÃO E MOLECULARES DE INFECÇÃO E ESTABELECIMENTO NA PLANTAESTABELECIMENTO NA PLANTA
Doenças Fúngicas em Plantas
Carvão
Ustilago maydis
Carvão
Ustilago maydis
Ferrugem
Puccinia sorghi
Ferrugem
Puccinia sorghi
Mofo Branco
Sclerotina sclerotiorum
Mofo Branco
Sclerotina sclerotiorum
Antracnose
Colletotrichum lindemuthianum
Antracnose
Colletotrichum lindemuthianum
“Rice blast”
Magnaporthe grisea
“Rice blast”
Magnaporthe grisea
Ferrugem Asiática
Phakopsora pachyrhizi
Ferrugem Asiática
Phakopsora pachyrhizi
AmbienteSusceptibilidade do hospedeiro
Patogenicidade
Doença
Componentes da Interação Fungo-Planta
Fungo-Planta
Interações Genéticas
Interações Abióticas
Luz, água, nutrientes, fogo, CO2
Interações Bióticas
Competidores, micróbios, herbívoros, patógenos, inimigos naturais
modificado de Müller & Krauss, 2005
van Baarlen et al., 2006
Mecanismos de Ataque – FUNGO
FUNGOFUNGO PLANTAPLANTA
Reguladores de crescimento
Enzimascutinasespectinases celulaseshemicelulaseslignolíticas
ToxinasToxinasvictorina (Cochliobolus victoriae)tentoxina (Alternaria spp.)toxina HC (Cochliobolus carbonum)toxina AM (A. alternata f. sp. mali)
giberelinaácido indol acético (AIA)citocininas
DetoxificaçãofitoalexinasfitoanticipinasROS
Mecanismos de Defesa – PLANTA
FUNGOFUNGO PLANTAPLANTA
Pós-infeccional
barreiras histológicas
deposição de calose e lignina
hipersensibilidade (HR)
quitinases, glicanases, proteases
fitoalexinas
ROS
detoxificação
mudanças no metabolismo
Pré-infeccionalcutícula e parede celular substâncias inibitóriasausência de nutrientes requeridos pelo fungopHpressão osmótica e efeitos de permeabilidade
Sexton & Howllet, 2006
Adesão
• Contato hidrofóbico
• Matriz extracelular
- adesinas
- lectinas
- enzimas
• Interações iônicas
Enzimas (esterases, cutinases) presentes na mucilagem que cobre
esporos de Colletotrichum sp., Blumeria graminis, Uromyces viciae-
fabae e Erysiphe graminis alteram a superfície da planta produzindo
superfície com diferentes propriedades adesivas.
Breno Leite et al., 2001
Sexton & Howllet, 2006
Germinação• Reconhecimento da superfície do hospedeiro
- hidrofobicidade
- dureza superfície
- componentes químicos
- propriedades topográficas
• Componentes sinalizadores (MAPk, proteínas G, histidina kinases) regulam germinação
Respostas tigmotrópicas direcionam tubos germinativos em superfícies foliares,
permitindo que patógenos reconheçam aberturas estomatais.
Macroconídios de Nectria haematococca (patógeno de ervilha) germinam em
resposta à adição de flavonóides.
Foster et al., 2003
Sexton & Howllet, 2006
PenetraçãoPassiva
- aberturas naturais
- ferimentos
Ex. ferrugens
Sheng et al., 2003Silva et al. 2006 Silva et al. 2006
Penetração
Ativa
- estrutura especializada (apressório)
- processo químico (degradação enzimática)
APRESSÓRIO
Estrutura especializada na penetração mecânica em tecidos
vegetais
Foster et al., 2003 Latijnhouwers et al., 2003
Sexton & Howllet, 2006
Ferreira & Monteiro, 2006
Apressório
↑↑ melaninamelanina na parede na parede
COMO?
↑↑ pressão de pressão de turgorturgor
PENETRAÇÃOPENETRAÇÃO
altas concentrações altas concentrações de glicerolde glicerol
↓↓ porosidade porosidade
Uromyces viciae-fabae
Magnaporthe grisea
Colletotrichum lindemuthiarum
Mendgen & Deising, 1993
Em M. grisea foi encontrada pressão de turgor de 8,0 MPa (pressão comum em pneus carro ~0,2 MPa)
(Howard et al., 1991).
Sexton & Howllet, 2006
Apressório
Sexton & Howllet, 2006
Melanina
• Pigmento escuro de alto peso molecular
• Formada a partir da polimerização oxidativa de compostos fenólicos
e indólicos
GENES
• PKS1, SCD1, THR1 – identificados em M. grisea e Colletotrichum
lagenarium
• Envolvidos na melanização do apressório
• C. lagenarium – genes sob regulação transcricional e pós-trascricional
Hidrofobinas
• Pequenas proteínas secretadas por fungos que se ligam à interfaces
hidrofóbicas/hidrofílicas
• Envolvidas na adesão dos fungos na superfície das plantas
� Gene hidrofobina – MPG1; MHP1
� Genes regulatórios de MPG1 – NPR1, NPR2, NPR3
� Gene proteína de membrana – PTH11
� Gene acropetal – ACR1
� Genes MAPk – PMK1; MPS1
GENES - M. grisea
Apressório
Sexton & Howllet, 2006
Sexton & Howllet, 2006
Degradação Enzimática
ENZIMAS ENZIMAS cutinasescutinases, pectinases, , pectinases, celulasescelulases, , xilanasesxilanases, ,
proteinases, proteinases, glicanasesglicanases, , ligninasesligninases..
•• PenetraçãoPenetração –– degradação de cutícula e parede celulardegradação de cutícula e parede celular
•• AdesãoAdesão
•• Diferenciação de hifas dentro do hospedeiroDiferenciação de hifas dentro do hospedeiro
•• Degradação de hifas velhas ou do inimigoDegradação de hifas velhas ou do inimigo
PRINCIPAIS FUNÇÕES
Cutícula CutinasesCutinases GenesF. solani f.sp. pisi – CUTA, CUT1, CUT2, CUT3
A. Brassicicola – CUTAB1
Degradação Enzimática
Sexton & Howllet, 2006
A presença de AMP cíclico e a fosforilação de fatores de transcrição parecem ter grande importância na regulação da expressão dos genes de cutinases(Kolattukudy et al., 1995).
A. brassicicola
- cutinases com expressão constitutiva
- cutinases induzidas por monômeros de cutina
* Mudança: crescimento parasítico para saprofítico *
McCann et al., 1990
membrana plasmática
parede primária
lamela média
pectina na lamela média
pectina
celulose
hemicelulose
Degradação Enzimática
Parede Celular Parede Celular Enzimas degradadoras da parede celular (CWDE)
Degradação Enzimática - CWDE
PectinasesPectinases
Sexton & Howllet, 2006
� Alternaria citri – Acpg1
� Botrytis cinerea – Bcpg1
� Colletotrichum gloeosporioides – pelB
� Colletotrichum lindemuthianum – CLPG1, CLPG2
� Nectria haematococca – pelA, pelD
• Importante papel na patogenicidade e virulência de vários fungos:
• Têm sido descritas como as primeiras enzimas extracelulares
produzidas pelos fungos durante o processo de infecção
Fusarium solani f. sp. pisi - mutantes duplos para os genes pelA ou pelD
têm a patogênese severamente comprometida no nível de penetração.
Famílias gênicas
endopoligalacturonases, pectina liases, pectinesterases
Degradação Enzimática - CWDE
PectinasesPectinases
Sexton & Howllet, 2006
• A ação de endopoligalacturonases (EPGs) dá origem a formação de oligogalacturonídeos (OGAs)
• OGAs são rapidamente convertidos em fragmentos menores e biologicamente inativos pelas EPGs
O tratamento de folhas de videira com OGAs aumenta a proteção
contra Botrytis cinerea e induz respostas de defesa na planta:
• rápida geração de H2O2
• expressão diferencial de 9 genes relacionados com defesa
• estímulo da atividade de quitinases e β-1,3-glicanases
Aziz et al., 2004
Degradação Enzimática - CWDE
CelulasesCelulases
Sexton & Howllet, 2006
celobioidrolases, endoglicanases, β-glicosidases
Trichoderma reesei - swolenina (SWOI) => capaz de quebrar as fibras de
celulose sem atividade hidrolítica.
• Têm sido isoladas de fungos patogênicos:
� Macrophomina phaseolina – egl1, egl2
� Fusarium oxysporum – Kfam1, Bfam1, Cfam1, Cfam2, Ffam1
� Cochliobolus carbonum – CEL1
Foi proposto que M. phaseolina utiliza uma forma de endo-β-1,4-glicanase
para patogenicidade e a outra para saprofitismo (Wang & Jones, 1995).
Degradação Enzimática - CWDE
LigninasesLigninases
Sexton & Howllet, 2006
lignina peroxidase, manganês peroxidase e lacases
•• Madeira atacadaMadeira atacada – torna-se encharcada, esponjosa, quebradiça e descolorida
• Têm grande importância em fungos que atacam madeira
• Maioria dos patógenos de madeira são Basidiomicetos
�“brown rot”- fungos degradam celulose e hemicelulose
� “white rot”- fungos degradam celulose e lignina
Fusarium solani f. sp. glycines (patógeno de soja) – produção de
ligninases tem papel importante no processo de infecção e colonização
do tecido hospedeiro
Sexton & Howllet, 2006
Colonização
Lidando com o Hospedeiro
• Reconhecimento – elicitores/supressores, genes Avr;
• Resposta ao ambiente hospedeiro – neutralizar mecanismos
de defesa da planta;
• Nutrição – transformar constituintes do citoplasma em
substâncias que possam ser absorvidas;
• Ataque – produção de toxinas e hormônios vegetais.
Reconhecimento do Hospedeiro
Sexton & Howllet, 2006
ElicitoresElicitores ligam-se a receptores específicos do hospedeiro e
desencadeiam resposta de defesa
• Gerais – compostos da parede celular fúngica (exógeno),
oligogalacturonatos (endógeno);
• Específicos – determinam espectro de hospedeiro do patógeno.
• Produzem necrose e desencadeiam SAR em tabaco e outras solanáceas e
também em cultivares de Raphanus sativus e Brassica campestris;
• Parecem ser elicitores genêro-específicos em solanáceas e cultivar-específicos
em brássicas;
• P. parasitica em tomate – família gênica (par A1).
Phytophthora spp. – elicitinas
Reconhecimento do Hospedeiro
SupressoresSupressores reprimem a resposta de defesa do hospedeiro
Sexton & Howllet, 2006
• Mecanismos de ação – hipóteses
� interferência na ligação do elicitor com receptor do hospedeiro;
� interferência na transdução de sinais;
� interferência na ativação gênica;
� interferência nos fatores de defesa da planta.
Mycosphaerella pinodes (patógeno de ervilha) – suprescinas A e B
• Suprescina B – inibe H+ATPase da membrana plasmática.
Reconhecimento do Hospedeiro
Genes de Genes de AvirulênciaAvirulência
Sexton & Howllet, 2006
• Modelo de relação gene-a-gene
�Flor (1956): demonstrou a complementariedade dos sistemas
gênicos do hospedeiro e do patógeno (linho-Melampsora lini)
FUNGOFUNGO
DOENÇA RESISTÊNCIA
• Determinam especificidade de hospedeiro: em nível de cultivar
em nível de espécie
Quando a planta possui gene de resistência R que corresponde ao
gene Avr do patógeno
Incompatibilidade Incompatibilidade
Modelo interação Rhynchosporium secalis (NIP1) – cevada (Rrs1)
Interação compatívelInteração compatível
Interação incompatívelInteração incompatível
Knogge, 1996
Melampsora lini
Peronospora parasitica Blumeria graminisCladosporium fulvum
Phytophthora sojae
M. grisea
Skamniot & Ridout, 2005
� Cladosporium fulvum – Avr2, Avr4, Avr4E, Avr49
� Rhynchosporium secalis – NIP1
� Fusarium oxysporum – SIX1
� Magnaporthe grisea – Avr-Pita, Avr-CO39, PWL1, PWL2, PWL4, ACE1, AvrPil5
� Phytophthora infestans – inf1, Avr3a, Avr3b, Avr10, Avr11
� Phytophthora sojae – Avr1b-1
� Hyaloperonospora parasitica – ATR13, ATR1NdWsB
� Melampsora lini – AvrL567, AvrM, AvrP123, AvrP4
� Blumeria graminis f. sp. hordei – Avr-a10, Avr-k1
� Família gênica PWL (M. grisea) – confere avirulência espécie-específica:
PWL1 – arroz
PWL2 – milheto
PWL4 – “weeping lovegrass”
Genes Avr
Sexton & Howllet, 2006
Sexton & Howllet, 2006
Genes Avr
• Análises moleculares mostraram que alelos Avr não-funcionais
originaram-se a partir de deleções ou mutações na ORF ou no
promotor do gene Avr;
• Deleções no gene Avr permitem que o fungo escape do
reconhecimento por plantas resistentes.
O que leva os patógenos a manter os genes Avr no curso da evolução?
Genes Avr
Sexton & Howllet, 2006
• Produtos AVR são substâncias necessárias ao patógeno:
� função “housekeeping”
� fatores de virulência
� enzimas degradadoras de substratos do hospedeiro
� toxinas
� supressores
• Ação como ELICITORES – ocorre devido à evolução de
mecanismos no hospedeiro que conseguem detectar e assim
responder à ação do patógeno.
• Quitina é o maior componente estrutural da parede celular dos fungos
• Avr4
� Fator de avirulência que induz resposta de hipersensibilidade em plantas Cf-4
� Lectina contendo domínio de ligação à quitina (CBM14)
� Interação Avr4 com quitina é específica pois ele não interage com outrospolissacarídeos da parede celular
Avr4 se liga à quitina da paredecelular dos fungos (C. fulvum, Trichoderma viride e Fusariumsolani f. sp. phaseoli) e protegecontra a ação das quitinases
liberadas pela planta
Função dos Produtos dos Genes Avr
� Avr2 (Cladosporium fulvum) – inibe a ação de proteases presentes no
apoplasto do hospedeiro;
� NIP1 (Rhynchosporium secalis) – toxina;
� Avr3a (Phytophthora infestans) – inibe resposta necrótica em Nicotiana;
� Avr-a10 e Avr-k1 (Blumeria graminis) – penetração do haustório;
� Avr-Pita (Magnaporthe grisea) – é uma metaloprotease (?);
Sexton & Howllet, 2006
Resposta ao Ambiente Hospedeiro
núcleo
H2O2
H2O2
H2O2
O2-
O2-
O2-
RESPOSTA FitoanticipinasFitoanticipinasFitoalexinasFitoalexinasROSROS
núcleo
Célula vegetalCélula vegetal
FungoFungo
Sexton & Howllet, 2006
Resposta ao Ambiente Hospedeiro
FITOANTICIPINAS
FITOALEXINAS
Resposta do Fungo:Resposta do Fungo:
A) Degradação enzimática
B) Exclusão
C) Alteração do alvo da toxina
Vanetten et al., 2001
Sexton & Howllet, 2006
Resposta ao Ambiente Hospedeiro
DETOXIFICAÇÃO - FITOANTICIPINAS
Avenacina A-1
Gaeumannomyces graminis var. avenae produz avenacinase
• Saponinas
• αααα-tomatina
• Glisosídeos cianogênicos
• Glicosinolatos
• Cianeto
Septoria lycopercisi produz tomatinase
Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici degrada α-tomatina em tomatidina e lycotetraose (inibem HR)
Avenacina A-1 – em Gaeumannomyces graminis var. avenae a interrupção do
gene responsável pela produção de avenacinase impediu o ataque dos mutantes
em plantas de aveia, entretanto, não interferiu no ataque à plantas de trigo, um
hospedeiro que não produz avenacina A-1 .
Sexton & Howllet, 2006
Resposta ao Ambiente Hospedeiro
DETOXIFICAÇÃO - FITOALEXINAS
• Pisatina (ervilha) - Nectria haematoccoca produz pisatina demetilase
� Gene PDA1
� Cluster PEP1, PEP2, PEP5
• Maakiaina (grão-de-bico) - Nectria haematoccoca -> MAK1
• Brassinina (crucíferas) - Sclerotinia sclerotiorum -> glucosil transferase induzível
• Sakuranetina (arroz) – Magnaporthe grisea -> ABC1 (cassete de ligação a ATP
do transportador ABC) é essencial para o efluxo da fitoalexina
Sexton & Howllet, 2006
Resposta ao Ambiente Hospedeiro
ESPÉCIES REATIVAS DE OXIGÊNIO - ROS
Aguirre et al., 2005
Função de defesa na Planta
• sinalização
• atividade antimicrobiana
• biossíntese de metabólitosantimicrobianos
Causam danos no DNA, proteínas, lipídios e outros componentes celulares
• Enzimas- superóxido dismutase (SOD)- peroxidases- glutationa peroxidases- peroxiredoxinas- catalases
• Compostos não enzimáticos - glutationa- tioredoxinas- melanina- manitol- prolina- ácido oxálico
Aguirre et al., 2005
Sexton & Howllet, 2006
Resposta ao Ambiente Hospedeiro
DETOXIFICAÇÃO - ROS
Sexton & Howllet, 2006
Nutrição
HAUSTÓRIO
Estrutura especializada na obtenção de nutrientes das células do hospedeiro sem provocar a morte celular
Colletotrichum lindemuthianum
Mendgen & Hahn, 2002
Remanescentes de apressórioCOMO?
Células mãe do haustório
Hifas intercelulares
Hifa intracelular
Haustório
Sexton & Howllet, 2006
NutriçãoGENES - HAUSTÓRIO
Latijnhouwers et al., 2003
Latijnhouwers et al., 2003
• Blumeria graminis f. sp. hordei
� Genes para início da formação haustório – BIG1, BIG2, BIG3
• Uromyces fabae
� Gene biossíntese de tiamina – THI1, THI2 (~5% mRNA haustório)
� Gene de transportador de hexose – HXT1 (na membrana
plasmática haustorial)
� Transportador de aminoácidos – AAT1, AAT2, AAT3, PIG2
Papel central no metabolismo primário e importação de nutrientes
Importação de nutrientes (hipótese) – H+ATPases geram um gradiente de prótons na membrana plasmática haustorial, gerando energia para obtenção de nutrientes
Azinheira, 2005
Sexton & Howllet, 2006
Mecanismos de Ataque HORMÔNIOS
Fitopatógenos são capazes de produzir as principais classes de hormônios vegetais
• Giberelina
• Auxina
• Citocinina
• Giberelina
• Auxina
• Citocinina
Promovem divisão celular
Giberelina (GA3)
Gibberella fujikuroi
mais estudado
• Síntese é controlada por um cluster gênico
Crinipellis perniciosa – Vassoura-de-bruxa em cacaueiros
CITOCININA
• Fungo promove aumento nas quantidades de citocinina
• Alteração do balanço citocinina/auxina
• Indução de brotações laterais e formação de ramos
CITOCININA
• Fungo promove aumento nas quantidades de citocinina
• Alteração do balanço citocinina/auxina
• Indução de brotações laterais e formação de ramos
ETILENO
• Também relacionado à indução de sintomas
ETILENO
• Também relacionado à indução de sintomas
Sexton & Howllet, 2006
HORMÔNIOS
Sexton & Howllet, 2006
Mecanismos de Ataque
TOXINAS
• Metabólitos secundários de baixo peso molecular
• Interrompem processos bioquímicos => provocam morte celularprovocam morte celular
NãoNão--específicasespecíficas => causam danos em células de plantas hospedeiras
e não-hospedeiras
EspecíficasEspecíficas (HSTs) => determinam espectro de hospedeiro e
patogenicidade do fungo
• Genes são específicos
• Locos complexos
Sexton & Howllet, 2006
TOXINAS NÃO ESPECÍFICAS
• Possuem efeitos fitotóxicos relativamente suaves
• Afetam um grande espectro de espécies de plantas
• Não são essenciais para estabelecimento da doença
Fusicoccina (Fusicoccum amygdali) - afeta via de sinalização levando à
estimulação da H+ATPase através da regulação proteína kinase/atividade fosfatase.
Alternaria spp.
� Brefeldina A – provoca desmonte do complexo de Golgi e age como inibidor da secreção
� Curvularina – inibidor da divisão celular
� Ácido tenuazônico – inibe síntese de proteínas
� Zinniol – afeta permeabilidade da membrana
� Tentoxina – inibidor da fotofosforilação através da ligação específica à ATP sintase do cloroplasto
Sexton & Howllet, 2006
TOXINAS HOSPEDEIRO-ESPECÍFICAS (HST)
� PLANTAS – resistência/susceptibilidade => controlados por 1 gene
� FUNGOS – produção => controlada por vários genes
• Possuem efeitos fitotóxicos severos
• Afetam um pequeno número de espécies de plantas
• São indispensáveis para estabelecimento da doença
Gêneros mais produtores - Cochliobolus e Alternaria
Cochliobolus
� C. carbonum (raça 1) – toxina HC (tetrapeptídeo cíclico)
� C. Heterostrophus (raça T) – toxina T
� C. victoriae - victorina
Sexton & Howllet, 2006
TOXINAS HOSPEDEIRO ESPECÍFICAS (HST)
Markham & Hille, 2001
Alternaria
A. alternata f. sp. kikuchiana – toxina AK
A. alternata f. sp. mali – toxina AM
A. alternata f. sp. fragariae – toxina AF
A. alternata f.sp. citri tangerine – toxina ACT
Sexton & Howllet, 2006
Reprodução
• Hospedeiro: pH, disponibilidade de nutrientes
• Ambiente: luz, umidade
• Fungo: fatores genéticos
indução de vias regulatórias
Enzimas hidrolíticas – necessárias para disponibilização de nutrientes a
partir do tecido da planta
Hidrofobinas – necessárias para dispersão e sobrevivência
� Cladosporium fulvum – 5 genes de hidrofobina são superexpressos
durante a esporulação
� HCf-1: papel na dispersão dos conídios via água
Muitos ascomicetos sofrem meiose nos últimos estágios da doença, produzindo estruturas de resistência
Esporulação depende:
• Plantas geneticamente modificadas;
• Desenvolvimento de novas estratégias de controle;
• Desenvolvimento de marcadores moleculares para
monitoramento preciso da progressão da doença.
Considerações Finais
COMPREENSÃO DA INTERAÇÃO PATÓGENO-PLANTA
OBRIGADA PELA ATENÇÃO!OBRIGADA PELA ATENÇÃO!
Banco de dados Pathogen Host Interactions: http://www.phi-base.org
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