primary active transport and its regulation

Первинно активний

транспорт, його регуляція та

клінічні аспекти

К.б.н. Древицька Т.І.

План лекції

Характеристика активного транспорту

Типи АТФаз

Р-тип АТФаз

- Na+/K+-АТФаза (структура, функції, регуляція,

клінічне значення)

- Ca2+-АТФаза (структура, функції, регуляція, клінічне

значення)

V – тип, H+-АТФаза (структура, функції, регуляція,

клінічне значення)

F – тип, АТФ-синтаза (структура, функції, регуляція,

клінічне значення)

ABC – транспортери (структура, функції, регуляція,

клінічне значення)

Транспорт невеликих молекул крізь

мембрану

Транспорт великих молекул крізь мембрану

Ендоцитоз

- жидкофазний піноцитоз ( )

- рецептор-опосередкований (адсорбційний) піноцитоз

(холестерин, вітеллогелін)

Екзоцитоз

ATФ – зв'язаний касетний транспортер (транспорт фосфоліпідів,

невеликих ліпофільних лікарських сполук, холестеролу, тощо)

- експорт

- імпорт

Характеристики активного транспорту

- речовини майже завжди транспортуються проти градієнту

концентрації

- потрібен транспортний білок

- необхіден гідроліз АТФ

- обмежений по швидкості

- насичений процес

Що таке активний транспорт?

Активний транспорт – це транспорт проти

градієнту концентрації водорозчинних речовин за

допомогою вбудованих у мембрани спеціалізованих

білкових структур (транспортерів) за рахунок

використання енергії розщеплення АТФ. Якщо

транспортер (одна з його субодиниць) має АТФ-азну

активність (зданен гідролізувати АТФ до АДФ та

фосфатного залишку із виділенням енергії) – такий

транспорт називають первинно активним.

Що може транспортуватися шляхом

первинно активного транспорту?

- іони Na+, K+, Ca2+, Mg2+, H+

Як? – окремо або спряжено: наприклад Na+ спряжено з К+;

Н+ спряжено з К+.

Для чого? – щоб відновити/або підтримати іону

асиметрію по різні боки плазматичної мембран

Приклади фізіологічних функцій, у реалізації

яких використовується іонна асиметрія:

- у збудливих клітинах для відновлення мембранного потенціалу для

після проведення збудження;

- у незбудливих для транспорту поживних речовин в середину клітини

(амінокислот, глюкози);

- для секреції речовин шляхом екзоцитозу;

- для скорочення м'язових клітин;

- у нирках для реабсорбції;

- у мозку для синаптичної передачі

4 класи іонних насосів

На сьогодні виділяють чотири суперсімейства АТФаз в залежності від

особливостей їх молекулярної організації та функції

P – тип (Na+/K+-АТФаза, Ca2+-АТФаза, H+,K+-АТФаза, Mg2+-

АТФаза)

V – тип (АТФази у ендосомах, мікровезикулах та

комплексі Гольджи)

F – тип (мітохондріальна АТФ-синтаза)

ABC – транспортери (фліппази - MDR, CFTR)

ATP using primary active transport types

Загальна модель перенесення речовин крізь

мембрану за допомогою переносника

Р-клас Іонні насоси цього класу локалізовані у

- плазматичних мембранах

- мембранах ендоплазматичного

ретикулюму

Транспортують Na+, K+, Ca2+, Mg2+, H+ тощо

P – клас, Na+/K+-АТФаза,

Типовий представник - Na+/K+-АТФаза, складається з двох α-субодиниць

(функціональних, або транспортних) та двох β-субодиниць (структурних).

Цитоплазматична частина α-субодиниці зв'язується з молекулою АТФ та 3-ма

молекулами Na+, які потім обмінюються на 2 молекули позаклітинного K+ Насос є

електрогенним, оскільки в результаті 1 циклу сумарний заряд всередині клітини стає -1.

Jens C. Skou отримав Нобелівську премію у

1997 році за дослідження Na+/K+-АТФази

Структура Na+/K+-АТФази

Мінімальна конфігурація доменів,

необхідних для P-типу АТФ-ази привід

(A), нуклеотид-зв'язуючий домен (N) та

домен для фосфорилювання (P) та

трансмембранну корову частину (М1-

М6)

γ – субодиниця (FXYD) – регуляторна,

не завжди присутня, але 1 підтип

знайдений в м'язах і серці, – 2-й у

нирках тощо.

Цикл Na+/K+-

АТФази

Регуляція експресії іонних насосів на прикладі

Na+/K+-АТФази

- регуляція транскрипції генів

- регуляція трансляції мРНК

- формування ассоціації α та

β субодиниць

- розподілення молекул

субодиниць по

плазматичній мембрані

- взаємодія з білками

цитоскелету

- ендо- та екзоцитоз молекул

субодиниць

- деградація

Додатково помпа регулюється

рядом ейкозанойдів,

арахідоновою кислотою та

протеїн-кіназами.

Регуляція Na+/K+-АТФази

Внутрішньоклітинна концентрація Na+

Фосфорилювання через активацію PKA (пригнічення функції) та

PKC рецептор-опосередкованим шляхом

Адренергічні, холінергічні та дофамінергічні впливи

Простагландін Е (у нейронах – пригнічує через PKA, але

збільшує кількість помп)

Ендогенні кардіотонічні стеройди – пригнічують активність

помпи

Регуляція активності Na+/K+-АТФази

Клінічні аспекти порушення будь-якої

помпи можна знайти в цій базі даних

Порушення функції будь-якого іонного насоса

може бути пов'язане з:

- мутаціями генів, що кодують субодиниці

АТФаз

- варіаціями генів, що кодують субодиниці

АТФаз

- порушенням регуляторних механізмів

Клінічні аспекти порушень функціонування

Na+/K+-АТФази

Мутації певних локусів генів, що кодують функціональну α-субодиницю описана

при таких патологіях як:

- паркінсонізм з раннім дебютом (ген ATP1A3 ),

- сімейна геміплегічна мігрень (ген ATP1A2),

- гіпертензія,

- діабет,

- єпілепсія,

- розлади настрою,

- нирковий полікістоз,

- никрова недостатність ( субодиниця β)

База даних про алельні поліморфізми

GeneCard

Певні алельні поліморфізми асоційовані із

порушеннями таких процесів як:

- скоротлива функція серця,

- адренергічний сигнальний шлях

у кардіоміоцитах,

- секреція інсуліну,

- синтез тиреоїдних гормонів,

- сигнальний шлях тиреоїдних

гормонів у клітинах-мішенях

Ca2+-АТФаза плазматичні (Plasma membrane calcium ATPase

– PMCA, викачують Ca2+ з цитoплазми

клітини в позаклітинній простір)

саркоплазматичні (Sarco/endoplasmic reticulum

Ca2+-ATPase – SERCA, закачують Ca2+ з

цитоплазми у цистерни саркоплазматичного

ретикулюму, є у мязевих клітинах)

При гідролізі одного моля АТФ Са-АТФаза

переносить крізь мембрану 2 молі Ca2+ , з

області більш низьких (10–7 М) в область більш

високих (10–3 М).

Характеристика процесу

- підтримка низької концентрації Са2+ у цитоплазмі

- жорстко регулюється, так як це може впливати на багато інших молекул в

цитоплазмі

- збільшення концентрації вільного кальцію - це тригер клітинної сигналізації

PMCA

Вихідна конформація – один іон Са2+, а потім інший

зв'язується з висоафінними ділянками зі сторони цитозолю

(константа зв'язування 10-7)

Mg2+-АТФ зв'язується з іншою ділянкою

Гідроліз АТФ, вільний фосфат фосфорилює

карбоксильну групу аспарагінової кислоти

Зміна конформації білка – перенесення Са2+ на іншій бік мембрани,

відщеплення АДФ, підвищення константи зв'язування для Сa2+ до 10-3, і

його від'єднання

Повернення до вихідної конформаційної будови, цикл повторюється

SERCA, цикл роботи

Регуляція, SERCA

Hypothetical model showing SERCA pump regulation by PLB and SLN. The dephosphorylated phospholamban (PLB) binds to

SERCA pump and regulates its activity (top, middle panel). This interaction is disrupted by either phosphorylation of PLB (top, left

panel) or in the presence of high calcium concentration (top, right panel). Sarcolipin (SLN) interacts with SERCA in its

unphosphorylated form (bottom, middle). This interaction is mainly affected by phosphorylation (bottom, left panel) and is less

affected by Ca2+ concentration (bottom, right panel).

Регуляція SERCA та PMCA

Внутрішньоклітинна концентрація Са2+

Кальмодулін

Протеїнкінази (А, С)

Протеази (кальпаін), фосфоліпіди (phosphotidylserine, phosphatidylinositol), G-

білки

Рівень транскрипції генів, що кодують субодиниці насосів

Порушення кальцієвого обміну в клітині

та перевантаження Са2+

PMCA

патологія

Representation of the plasma membrane Ca2+‐ATPase

signalling complex in the heart. Plasma membrane

Ca2+‐ATPase (PMCA) is located in invaginations of the

plasma membrane (caveolae) and is tethered to the

dystrophin complex through syntrophin; downstream

effectors are regulated by the pump, notably neuronal

nitric oxide synthase (nNOS), nitric oxide (NO) and the

Ras pathway. Rassf1, Ras‐associated factor 1.

PMCA

патологія

Putative mechanism underlying plasma membrane

calcium ATPase 2 (PMCA2)-mediated neuronal

damage in the spinal cord during experimental

autoimmune encephalomyelitis or after spinal cord

injury. Excess glutamate in the affected spinal cord

binds neuronal ?-amino-3-hydroxyl-5-methyl-4-

isoxazole-propionate (AMPA)/kainate receptors and

initiates calcium influx. Inflammatory signals, released

by activated glia or invading cells down regulate

PMCA2 transcript levels attenuating calcium

extrusion. The increased intracellular calcium levels

activate proteases such as calpain and apoptotic

mechanisms. Calpain-mediated degradation of

PMCA2 further reduces PMCA2 levels. Decreased

PMCA2 causes a decline in collapsin response

mediator protein 1 (CRMP1) levels by mechanisms

that are not yet identified. Changes in CRMP1 levels

result in neuronal pathology leading to cell death.

Мутації Са2+-АТФаз, клінічні аспекти

- Захворювання Дарье (Darier disease) – мутація гену

ATP2A2(субодиниця SERCA2), характеризується втратою контактів

між клітинами шкіри та порушеннями епідермального кальцієвого

гомеостазу.

- Сімейна доброякісна пухирчатка (Hailey–Hailey disease - мутація

гена ATP2C1

- Гіпертензія

- Ішемічна хвороба серця

Алельні поліморфізми Са2+-АТФаз, клінічні

аспекти

Асоційовані із такими захворюваннями як:

- Ішемічна хвороба серця

- Гіпертрофія серця

- Псевдоміотонія

- Міотонічна дистрофія І типу

- Катаракта

- Міопатія Броді

- М'язова дистрофія

- Гіпертензія

F-клас та V-клас

Структурно подібні між собою, але зовсім не схожі на представників P-

класу

Всі відомі представники F та V- помп транспортують лише протони

V-клас помп підтримує низький pH за рахунок використання АТФ

F-клас помп це АТФ-синтаза

F-клас, H+-АТФаза

Знаходяться у ендосомальних та лізосомальних

мембранах, плазматичних мембранах

остеокластів, у деяких клітинах ниркових

канальців

• Містить 2 основних домена: Vo (мембран-звязаний) та V1 (каталітичний)

• Активність регулюється дисоціацією Vo та V1

Структура H+-АТФаз

Функціонування H+-АТФаз

The molecular details reveal up to 14 protein subunits arranged in (i) a cytoplasmic

V1 complex, which mediates the hydrolysis of ATP, and (ii) a membrane-embedded

V0 complex, which translocates H+ across the membrane. Clever experiments

have revealed the V-type H+ ATPase as a molecular motor akin to F-type

ATPases. The hydrolysis of ATP turns a rotor consisting largely of one copy of

subunits D and F of the V1 complex and a ring of six or more copies of subunit c of

the V0 complex. The rotation of the ring is thought to deliver H+ from the

cytoplasmic to the endosomal or extracellular side of the membrane, probably via

channels formed by subunit a. The reversible dissociation of V1 and V0 complexes

is one mechanism of physiological regulation that appears to be widely conserved

from yeast to animal cells. Other mechanisms, such as subunit-subunit interactions

or interactions of the V-type H+ ATPase with other proteins that serve physiological

regulation, remain to be explored. Some diseases can now be attributed to genetic

alterations of specific subunits of the V-type H+ ATPase.

Деякі важливі функції V-АТФаз

• Ремоделювання кісток

• Рецептор-опосередкований екзоцитоз: метаболізм холестерола

• Імунна система: макрофаги

• H+-залежний транспорт нейротрансміттерів

Регуляція H+-АТФаз Основна регуляція на рівні зборки та активації

помп, гени субодиниць експресуються

конститутивно

Регуляція щільності розташування у

мембранах

Регуляція асоціації /дисоціації V1 та V0

областей, наприклад, при глюкозній депривації

Регулювання секреторної активності (баланс

бісульфита)

Альдостерон та секретин активує

Ангіотензин ІІ пригнічує

Гранулоцит-стимулюючий фактор активує

Мутації H+-АТФаз, клінічні аспекти

- Остеопетрозис - osteoclastic bone resorption – 23 мутації а3 субодиниці

- Дистальній клубочковий ацидоз Distal – 12 мутацій B1 субодиниці (Stover, 2002)

та 24 мутації a4 субодиниці

- Остеопороз

- Високоінвазивний рак молочних залоз

- Синдром де Тоні - Дебре - Фанконі (первинний ізольований синдром Фанконі,

глюкозо-фосфат-аміновий діабет) - вроджене захворювання, успадковується

по аутосомно-рецесивним типом . Комплекс біохімічних і клінічних проявів

ураження проксимальних ниркових канальців з порушенням канальцевої

реабсорбції фосфату, глюкози, амінокислот бікарбонату.

Алельні поліморфізми H+-АТФаз, клінічні

аспекти

- ревматоїдні артрити

- артрит

- остеопороз

- пухлини мозку

- колоректальний рак

F-клас, АТФ-синтаза Подібна до V-класу, але синтезує АТФ

Відноситься до АТФаз тому, що одна субодиниця F1

домена має АТФазну активність

Вбудована у внутрішню мембрану мітохондрій

За розкриття структури та функції було присуджено

Нобелівську премію

Функція – спряження окислення і фосфорилювання,

градієнт протонів, створений в процесі окислення

використовується для запуску ротору та синтезу АТФ.

The enzyme could be ideally divided into 4 principal

subdomains: the catalytic headpiece (𝛼3𝛽3), hosting the

three catalytic sites for ATP synthesis (one in each 𝛽-

subunit), the H+ channel (𝑎 𝑐8 − 1 5) and two stalks, the

central rotor (𝛾 𝛿 휀) and the peripheral stator (𝑏 𝑑(F6)OSCP),

that link the first two subdomains together. The remaining

minor subunits 𝑒, 𝑓, 𝑔, and A6L are associated with the

proton channel; in particular, subunits 𝑒 and 𝑔 are involved in

the dimerization of the complex.

Функціонування АТФ-синтази, спряження

окислення та фосфорилюання

Регуляція АТФ-синтази- Δ Ψ𝑚- транскрипційні фактор

- контроль трансляції

- модуляція електрон-транспортного

ланцюга або циклу трикарбонових

кислот

- AДФ інгібування

- регуляторні протеїни, такі як IF1,

factor B, CaBI, S100A1.

Мутації АТФ-синтази, клінічне значення

- цілий ряд невропатії (наприклад, хвороба Лебера,

нейродегенерації)

- атаксія

- retinitis pigmentosa

- прогресуюча дистонія,

- макроцефалія

- дискінезія

- епілепсія

Алельні поліморфізми АТФ-синтази, клінічні

аспекти

- шизофренія

- рак мозку

- Паркінсонізм

- ділятаційна кардіоміопатія

- нейробластома

- ендокардіт

ABC (ATP binding cassette) superfamily

У людини відомо більше 50 типів ABC

транспортерів, які об'єднані у 7 класів

Можуть транспортувати речовини як в

середину клітини, так і назовні

Специфічні до одного субстрату, або до

класу субстратів

Іони, цукри, амінокислоти, фосфоліпіди,

пептіди, полісахариди, токсини, лікі

Структурно складаються з 4 доменів

2 трансмембранні домена

2 цитозольні домена

Функція ABC транспортерів

1) Субстрат зв'язується з високоафінним сайтом на трансмембранному домені

2) Це дозволяє зв'язатися 2-м молекулам АТФ на сайті АТФази в NBD

3) 2 NBD димеризуються при зв'язуванні з АТФ

4) Димеризація сприяє виходу субстрату з порожнини трансмембранного домену

на інший бік мембрани

5) Гідроліз АТФ повертає транспортер до вихідної конформації

Регуляція ABC транспортерів

на рівні транскрипції генів

пост-трансляційна регуляція (в тому числі фолдінг)

регуляція збірки транспортера

регуляція активності шляхом форфорилювання та дефосфорилювання

(теж відноситься до пост-трансляційної регуляції) – є найбільш важливим шляхом, оскільки саме

порушення регуляції кіназ призводять до розвитку multidrug resistance (MDR) при онкопатологіях.

Розвиток ряду захворювань є наслідком мутацій у сайтах фосфорилювання.

Мутації ABC транспортерів,клінічні аспекти

Алельні поліморфіз ми генів, що кодують

субодиниці ABC транспортерів

Ген MDR1 (Asn21Asp, Phe103Leu, Ser400Asn, Ala892Ser, Ala998Thr)

порушення транспортування лікарських препаратів (наприклад, дігоксіну та

фексофенадіну)

Адренолейкодистрофія, імунодефіцит, прогресуючий родинний холестаз,

синдром Дубіна-Джонсона, гіперінсулінемія, хвороба Старгардта, вікова

мязева дистрофія

Порушення міграції дендритних клітин, транспорту холестеролу,

Мultiple drug resistance

Порушення захисту плоду під час вагітності від впливу ксенобіотиків.

Порушення функції будь-якого іонного насоса

може бути пов'язане з:

- мутаціями генів, що кодують субодиниці

АТФаз

- варіаціями генів, що кодують субодиниці

АТФаз

- порушенням регуляторних механізмів

Висновки

Клінічні аспекти процесів активного транспорту можуть бути пов'язані із

- мутаціями генів, що кодують субодиниці АТФаз;

- варіаціями генів, що кодують субодиниці АТФаз;

- порушенням регуляторних механізмів.

Наслідками порушень процесів транспорту є ряд таких тяжких захворювань, як

онкологічні хвороби, серцево-судинна та нервова патологія, ниркова та печінкова

недостатність тощо.

Література

http://books.google.com.ua/books?id=rf5nyjCzvrAC&lpg=PA235&ots=fuZs5hZCpL

&dq=membrane%20pump%20at%20disease&hl=uk&pg=PA228#v=onepage&q=m

embrane%20pump%20at%20disease&f=false

http://www.jbc.org/content/287/3/2191.full.pdf+html

Handbook of ATPases: Biochemistry, Cell Biology, Pathophysiology. Masamitsu

Futai,Yoh Wada,Jack H. Kaplan

http://books.google.com.ua/books?id=nEb-t65dFssC&pg=PR17&lpg=PR17&dq=V-

type+ATPases+disease&source=bl&ots=R8eXnbmnQg&sig=V8FhY4neMfRexbbA

eq5c3R4KSAk&hl=ru&sa=X&ei=clH4U_XLIKHnyQOrnoC4BQ#v=onepage&q=V-

type%20ATPases%20disease&f=false