ndp sugar biosynthesis and glycorandomizationchemical synthesis community lecture series ndp ‐...

Chemical Synthesis Community Lecture Series

NDP‐sugar biosynthesis and glycorandomization

ByAhmad H. Al‐Mestarihi

Graduate StudentLaboratory for Biosynthetic studies

04/26/2011

Glycoslated Biomolecules and their functions 

Types 

Nucleic acids

Polysaccharides

Proteins

Lipids

Secondary metabolites 

Functions 

Information storage and transfer

Energy storage

Maintenance of cell structure

Molecular recognition

Virulence

Chemical defense

significance of GlycoslatedBimolecules

some human diseases are associated with protein glycosylation patterns.

viral infections often involves recognition of specific cell surface protein glycoforms

bacterial virulence is related to cell‐surface polysaccharides

glycosylated small molecules are clinically useful for the treatment of bacterial and fungal infections, cancer, and other human diseases

Glycoslated secondary metabolites

calicheamicin

rubradirin

everninimicin

kijanimicin

Cororubicinrespinomycin

Current Opinion in Chemical Biology 2008, 12:297–305

Sugar Activation

Angew. Chem. Int. Ed. 2008, 47, 9814 – 9859

F‐6‐p

G‐6‐p

The nucleotide moiety

Enzymatic recognitionGood leaving group for glycoslation

Thymidine diphosphate‐α‐D‐glucose:precursor for sugar modifications

Entry point into TDP‐sugar metabolism

Angew. Chem. Int. Ed. 2008, 47, 9814 – 9859

Naturally occurring TDP‐sugarsGroup I

6‐deoxysugars

4‐amino‐4,6‐dideoxysugar 3‐amino‐3,6‐dideoxysugar

Angew. Chem. Int. Ed. 2008, 47, 9814 – 9859

Naturally occurring TDP‐sugarsGroup II

TDP‐D‐desosamine TDP‐D‐chalcomycin actinospectose

TDP‐4,6‐dideoxysugars

3‐amino‐2,3,6‐trideoxysugars

Angew. Chem. Int. Ed. 2008, 47, 9814 – 9859

Naturally occurring TDP‐sugarsGroup III

TDP‐2,6‐dideoxysugars

TDP‐2,3,6‐trideoxysugars

TDP‐4‐amino‐2,3,6‐trideoxysugars

Angew. Chem. Int. Ed. 2008, 47, 9814 – 9859

Other Naturally occurring nucleotide‐sugars

UDP‐sugars

GDP‐sugars

CDP‐sugars

Angew. Chem. Int. Ed. 2008, 47, 9814 – 9859

General Reaction Types of Sugar Biosynthetic Enzymes

4,6‐dehydratase

Adrian D. Hegeman,‡ Jeffrey W. Gross,‡ and Perry A. Frey Biochemistry, Vol. 40, No. 22, 2001

3,5‐epimerase

Angew. Chem. Int. Ed. 2008, 47, 9814 – 9859

TDP‐4‐keto‐6‐deoxy‐l‐mannose

4‐aminotransferase

Angew. Chem. Int. Ed. 2008, 47, 9814 – 9859

external aldimine intermediate

3‐C‐methyltransferase

Angew. Chem. Int. Ed. 2008, 47, 9814 – 9859

2‐dehydratase

Angew. Chem. Int. Ed. 2008, 47, 9814 – 9859

Unusual modification of NDP‐sugars

Angew. Chem. Int. Ed. 2008, 47, 9814 – 9859

fortimycin, and moenomycin

Unusual modification of NDP‐sugars

Angew. Chem. Int. Ed. 2008, 47, 9814 – 9859

5‐methyl‐carboxypyrrole substituentmethyleurekanate moiety 

In vitro sugar biosynthesis(TDP‐L‐epivancosamine)

TDP‐L‐epivancosamine

Dehydration/deoxygenation Dehydration

transamination

methylationepimerization

4‐ketoreduction

Chen et al. PNAS October 24, 2000 vol. 97 no. 22 11947

Huawei Chen*, Michael G. Thomas, Brian K. Hubbard, Heather C. Losey, Christopher T. Walsh†, and Michael D. Burkart*Department of Biological Chemistry and Molecular Pharmacology, Harvard Medical School, 240 Longwood Avenue, Boston, MA 02115

Production of TDP-L-epivancosamine via azideReduction

Hu Y, Al-Mestarihi A, Grimes CL, et al. J. Am Chem Soc. 2008, 130 (47): 15756-15757.

Extent of reduction > 95%

0.00E+00

1.50E+07

3.00E+07

0 20 40 60 80 100

Cou

nts

Time (min)

Hu Y, Al-Mestarihi A, Grimes CL, et al. J. Am Chem Soc. 2008, 130 (47): 15756-15757.

OHO

OTDP

NO

Nitrososynthase Oxidation Reaction: Time Course

Nitrososynthase Substrates

J. L. Vey, A. Al‐Mestarihi, Y. Hu, M. A. Funk, B. O. Bachmann and T. M. Iverson, Biochemistry, 2010, 49, 9306–9317.

Glycosyltransferase structure

(a) The GT‐A fold is represented by the inverting enzyme SpsA from Bacillus subtilus, (b) the GT‐B fold, by bacteriophage T4 β‐glucosyltransferase

Lairson LL, H. B., Davies GJ, Withers SG. Glycosyltransferases: structures, functions, and mechanisms. Annu Rev Biochem 77, 521‐555 (2008).

Glycosyltransferase

Angew. Chem. Int. Ed. 2008, 47, 9814 – 9859

Glycosyltransferase mechanism

Lairson LL, H. B., Davies GJ, Withers SG. Glycosyltransferases: structures, functions, and mechanisms. Annu Rev Biochem 77, 521‐555 (2008).

Glycosyltransferase

Angew. Chem. Int. Ed. 2008, 47, 9814 – 9859

aryl‐C‐glycosidicbond formation

Glycosyltransferase

Angew. Chem. Int. Ed. 2008, 47, 9814 – 9859

urdamycin

Angew. Chem. Int. Ed. 2008, 47, 9814 – 9859

in vitro and in vivo Glycorandomization

In vitro glycorandamization

Expensive cofactorsProtein purificationOptimazation of rxnconditions 

In vivo glycorandamization

In vivo glycorandamization

Provided by host

Williams, GJ, Yang J, Zhang C, Thorson JS. ACS Chem. Biol. 2011, 6, 95‐100. 

TDP16 (glycosyltransferase) substrates

Williams, GJ, Yang J, Zhang C, Thorson JS. ACS Chem. Biol. 2011, 6, 95‐100. 

OleD active site residues

8 residues were chosen for mutation by saturation mutagenesis creating 8 mutant libraries 

To maximize the efficiency of OleD for glycosylationwithin the cytoplasm of E. coli

Williams, GJ, Yang J, Zhang C, Thorson JS. ACS Chem. Biol. 2011, 6, 95‐100. 

Activity of prototype glycoside producing strains

Williams, GJ, Yang J, Zhang C, Thorson JS. ACS Chem. Biol. 2011, 6, 95‐100. 

Angew. Chem. Int. Ed. 2008, 47, 9814 – 9859

urdamycin

Engineering of nucleotidyltransferase

Angew. Chem. Int. Ed. 2008, 47, 9814 – 9859

E. coli galactokinase (GalK) 

Chemoenzymatic glycorandomization

GalK GalK

21 vancomycin analoguesN3‐289    39 additional vancomycin derivatives

d‐glucose andl‐vancosamine

Angew. Chem. Int. Ed. 2008, 47, 9814 – 9859

CuI‐catalyzed Huisgen[3+2]cycloaddition

Summary

Structural diversity with a handful of enzyme activities

unique arrangements of catalytic residues, coenzymes, and cofactor

Deoxysugars can be further modified by unusual enzymes

Sugar modifying enzymes and glycosyltransferases exhibit a degree of substrate flexibility

Metabolic pathway engineering approaches resulted in new glycoforms

Characterizing and modifying the sugar biosynthetic enzymes will expand glycodiversification leading to generation of new compounds of interesting clinical use