monografia edvaldo - quechers e cromatografia líquida para identificar resíduos de antibióticos...
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Universidade de So Paulo
Instituto de Qumica de So Carlos
Otimizao de mtodo QuEChERS para determinao de
sulfonamidas presentes em lodo floculado com posterior anlise
em LC-ESI-TOF.
Edvaldo Vasconcelos Soares Maciel
Orientador: Professor Doutor lvaro Jos dos Santos Neto
So Carlos, dezembro de 2014.
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AUTORIZO A DIVULGAO E REPRODUO DE TODO O CONTEDO
CONTIDO NESTE TRABALHO PARA FINS DIDTICOS OU DE PESQUISA, COM
A DEVIDA CITAO SOBRE A FONTE DO MESMO.
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Todo homem tem o direito de decidir sobre o seu prprio destino
Robert Nesta Marley
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Dedicatria
Ao senhor Maciel e a dona Cida pelo amor e por acreditarem em mim durante todo
este tempo, sem vocs eu jamais chegaria at aqui.
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Agradecimentos
Agradeo ao Professor Doutor lvaro Jos dos Santos Neto, pelo apoio,
pacincia, pelos conselhos, e por ter me dado a oportunidade de desenvolver
este trabalho.
Ao grupo de cromatografia do IQSC, principalmente a Marassa pela ajuda,
pacincia e a amizade.
A Professora Doutora Eny Maria Vieira e ao Professor Doutor Igor Renato
Bertoni Olivares, por serem profissionais que eu me espelho e admiro, e por
terem aceitado fazer parte da minha banca.
A minha namorada Thas, pela pacincia, carinho e acima de tudo por estar
ao meu lado nas horas mais difceis.
A toda a Repblica Irmos Metralha pelos ensinamentos, pelo abrigo e por ter
feito de mim um homem com seus alicerces fincados na amizade e no amor
pelas pessoas e pela famlia.
Aos meus avs de considerao Jos Alceu e Dona Jandira, pelo amor e
carinho por algum que nunca fez parte da famlia.
A minha turma, principalmente ao Rodrigo, Leonardo, Douglas, Augusto,
Fernando pelos dias de estudo, ou pelas prticas de laboratrio sempre feitas
com esforo e alegria.
E por ltimo a Deus, pela energia e pela f que sempre foi o meu jogo de
cintura para as horas difceis.
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Resumo
Este presente trabalho tem como enfoque a otimizao de um mtodo baseado em QuEChERS para preparo de amostra proveniente de lodo de esgoto, com posterior identificao de compostos denominados sulfonamidas utilizados na formulao de antibiticos de uso veterinrio e humano. O mtodo denominado QuEChERS surgiu da necessidade de se criar um procedimento de preparo amostral melhorado considerando a necessidade de realizar diversas anlises de rotina em laboratrios. Sendo assim, podemos dizer que o mesmo apresenta certa simplicidade, resumida em poucas etapas onde rapidamente pode-se obter um clean-up da amostra com a utilizao de poucos recursos como: volume de solvente, e pessoal treinado. Para o tratamento da amostra em questo, foi ento empregado o mtodo com algumas modificaes, que foram avaliadas atravs de planejamento experimental obtido pelo software STATISTICA. O desenvolvimento do projeto foi ento efetuado com a realizao de testes considerando variveis como: fase orgnica utilizada na extrao, proporo e volume de fase aquosa/orgnica, quantidade de sal complexante (NaCL e MgSO4) e utilizao de adsorvente como PSA, C18 e grafite, permitindo assim que o procedimento fosse otimizado visando a melhor condio de utilizao do mtodo QuEChERS considerando a matriz lodo e a classe de analitos das sulfonamidas. As variveis independentes (proporo de ACN e H2O como solvente de extrao, volume de solvente, proporo de NaCl e quantidade de MgSO4) da etapa de extrao foram ento avaliadas de acordo com planejamento experimenta e mostraram-se significativas para o aumento da eficincia de extrao a proporo de gua e acetonitrila utilizadas como solventes de extrao e quantidade de MgSO4. A partir dos resultados obtidos pelo planejamento a melhor condio de extrao foi obtida com 4,0 g de amostra, 8,0 mL de solvente na proporo 80% ANC (0,1% cido frmico) e 20% H2O, 30% de NaCl (m/v) e 40 mg de MgSO4.
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ABSTRACT
The aim of this work is to approach the optimization of a method based on "QuEChERS" for sample preparation from sewage sludge, with subsequent identification of compounds called sulfonamides used in the formulation of veterinary and human drugs. The method known as "QuEChERS" arose from the need to creating sample preparation methods, considering to realize various routine analysis in laboratories.Thus, we can say that it presents certain simplicity, summarized in a few steps where you can quickly get a "clean-up" of the sample with the use of limited resources such as volume of solvent, and trained personnel. For the treatment of the sample in question, the method was used with some modifications, which were evaluated using the obtained experimental design software "Statistica". The development project was made with procediments considering variables, such as: organic phase used in the extraction, proportion and volume of water / organic phase, amount of complexing salt (NaCl and MgSO4) and use of adsorbent as PSA, C18 and graphite , thus enabling the procedure to be optimized aiming better utilization condition of the method "QuEChERS" considering the sludge matrix and analyte class of sulfonamides. The independent variables (ratio of ACN and H2O as solvent extraction, solvent volume ratio of amount of NaCl and MgSO 4) the extraction step were evaluated according to design experiment and were significant for increasing the extraction efficiency, the proportion of water and acetonitrile used as solvent extraction and the amount of MgSO4. By the results obtained from the planning experimental, the best extraction condition was 4.0 g of sample, 8.0 mL of solvent in the proportion 80% ACN (0.1% formic acid) and 20% H2O, 30% NaCl (w / v) and 40 mg of MgSO4.
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SUMRIO
1 INTRODUO.......................................................................1
2 OBJETIVOS..........................................................................14
3 PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAIS................................15
3.1 MATERIAIS...............................................................15
3.2 MTODOS.................................................................17
4 RESULTADOS E DISCUSSES..........................................20
5 CONCLUSO........................................................................31
6 REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS......................................33
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1 INTRODUO
Com o mundo atual globalizado e a tecnologia se desenvolvendo na direo
da incluso e de estar ao alcance de todas as pessoas, os mais variados setores
industriais vem crescendo e tomando propores antes no imaginveis desde a
sua escala de produo at a demanda por matria prima.
No mbito das indstrias qumicas no tem sido diferente, j que na situao
atual inmeros produtos utilizados pelos seres humanos tm sua origem ligada a
processos qumicos, o que causa um alerta nas autoridades governamentais ligadas
a preservao ambiental, pois com a crescente demanda na fabricao de novos
produtos oriundos de atividades laboratoriais surge tambm uma crescente gerao
de resduos que pode vir a contaminar bens naturais como a gua e o solo, assim
como os animais e a prpria humanidade.
Levando em conta este cenrio descrito acima, plausvel que tambm haja
um maior incentivo das autoridades e esforo da comunidade cientifica no
desenvolver de novas tcnicas aplicadas aos processos realizados que visem uma
reduo dos impactos ambientais gerados pelas atividades industriais considerando
toda a sua linha de produo at o uso do produto final.
Neste trabalho o enfoque foi nas indstrias farmacuticas onde os remdios
criados so constitudos de substncias ativas que atualmente esto sendo
classificadas como uma classe emergente de contaminantes afetando organismos
terrestres e principalmente aquticos1,2.
Pesquisas recentes documentam a ocorrncia destes compostos
farmacuticos em guas naturais e em efluentes de tratamento de esgoto urbano,
em nveis de concentrao na escala de g/L e ng/L.3,4,5,6
Abaixo temos um esquema representativo das diversas formas de entradas
das sulfonamidas no meio ambiente.
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Figura 1 Esquema representativo das diversas formas de contaminao das sulfonamidas
ao meio ambiente.
Fonte:.BARAN, W., 2011, p 2.
Dentro da ampla classe de compostos farmacuticos, podemos citar os
antibiticos como sendo aqueles de maior periculosidade quando encontrados no
meio ambiente, visto que em contato com organismos vivos podem acabar gerando
resistncia ao uso desses medicamentos, diminuindo assim a efetividade no
combate a diversos tipos de doenas.
Isso resultado do aumento no uso dessas drogas por atividades ligadas a
criao de rebanhos, aves e peixes assim como fruto do hbito das pessoas de se
automedicarem fazendo uso sem orientao de tais substncias que podem resistir
as reaes das vias metablicas sendo excretadas com at 90% da quantidade
inicialmente ingerida, acarretando em uma seleo de carter gentico onde apenas
as bactrias mais perigosas se reproduzem, causando preocupao e necessidade
de que se tenha legislaes e procedimentos para monitorar, medir e controlar este
tipo de resduo gerado7,8.
Inclusa nessa gama de agentes antibacterianos, est a classe das
sulfonamidas, que so utilizadas desde a dcada de 1930 para tratamento de
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doenas em seres humanos devido ao seu grande espectro de ao que se mostra
eficaz contra bactrias gram positivas e gram negativas, alm de ser considerado
um remdio de baixo custo para a linha de produo e comercializao, fato que
tambm faz com que essa classe de frmacos seja utilizada no uso veterinrio9,10.
Esta classe de antibiticos sintticos deriva-se da substncia conhecida como
sulfonilamida e existem diversos compostos antimicrobianos que contm o grupo
sulfonamida como uma espcie de radical similar formando ento um conjunto de
cerca de 150 SNs diferentes11.
A estrutura molecular com propriedades bacteriostticas a que nos referimos
esta representada na figura 2, sendo composta por um radical (-N4H2) em uma das
extremidades, seguido de um anel benznico unido a um grupo sulfonil ligado a
outro grupo amida que serve como stio para ligao de outros radicais, gerando
ento as diversas sulfonamidas que tem sido reportada ao longo da histria12.
Figura 2 Estrutura geral das sulfonamidas.
Olhando para a parte farmacolgica, observa-se que as sulfonamidas tem
estrutura semelhante a do p-aminobenzico tambm conhecido como PABA,
composto importante para reaes de sntese de cido flico por parte das
bactrias. Sendo assim, as sulfonamidas agem como agentes competidores pelos
stios ativos de uma enzima denominada dipropteroato sintetase, o que impede a
sntese de cido flico por parte das bactrias impedindo assim a sua
proliferao13,14.
Devido a diversidade de sulfonamidas existentes e seus diferentes modos de
ao, elas so largamente utilizadas nos dias atuais tanto para uso humano quanto
veterinrio e como no h tratamento espcifico para tais resduos que so deixados
no meio ambiente, a contaminao inevitvel, causando resistncia por parte das
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bactrias e mutaes da enzima dipropteroato sintetase, o que dificulta a ao das
sulfonamidas no mecanismo de inibio da sntese do cido flico diminuindo sua
eficcia no combate as enfermidades13,15,16,17.
Sendo assim preciso estudo para a criao de novos mtodos que
identifiquem e quantifiquem esses antibiticos em nosso ambiente. O problema
que tais agentes bacterostticos se encontram em quantidades minmas em
matrizes complexas com diversos tipos de interferentes que podem prejudicar uma
determinao final de sua concentrao, logo se faz necessrio o uso de mtodos
que limpem e preparem tais amostras para posterior uso de tcnicas de separao e
quantificao desses contaminantes.
Quando se trata de amostras de origem ambiental de extrema importncia
que os processos de preparo de amostras sejam efetivos e eliminem quaisquer
impurezas presentes, alm de permitir a concentrao dos analitos de interesse para
uma melhor identificao final.
Atualmente com polticas de preservao do meio ambiente, do contexto da
qumica verde e dos interesses financeiros dos setores industriais, so exigidos cada
vez mais mtodos que executem o processo de clean-up amostral de maneira
rpida, usando o mnimo de reagentes e gerando pouco resduo. Tcnicas como a
SPE (Solid Phase Extractation), MEPS (Micro-Extractation by Packed Sorbent),
SPME (Solid Phase Micro-Extractation) e QuEChERS (quick, easy, cheap,
effective, rugged and safe) tem sido usadas, revelando nveis satisfatrios de
desempenho no processo de preparo da amostra, alm de proporcionar taxas de
recuperao dos analitos e de reduo de efeitos de matriz cada vez melhores
frente a mtodos anteriormente utilizados. Vale ressaltar que cada uma dessas
tcnicas tem suas particularidades porm no geral elas se assemelham por serem
processos limpos, econmicos e simples de serem executados, fatos que as tornam
mais viveis do ponto de vista industrial e ambiental18,19,20,21.
Dentre os locais onde se tem encontrado a maior parte dos contaminantes de
origem farmacutica destaca-se o solo, que possu caractersticas porozas
contendo matria inorgnica e orgnica favorecendo assim interaes adsortivas
dessa matriz com os mais diversos tipos de compostos incluindo os frmacos22.
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Outra importante matriz atingida por este tipo de contaminao so as guas
subterrneas e de rios, levando em conta que o solo desencadeia papel fundamental
na preservao de ecossistemas adjacentes por realizar a filtragem de certas
substncias23. O lodo de esgoto, tambm conhecido como bioslido, proveniente de
estaes de tratamento est incluso tanto no solo onde usado como adubo
orgnico quanto nos efluentes de guas residurrias onde gerado.
Considerando ento a fora das interaes de adsoro entre o lodo e os
resduos de interesse, o processo de identificao e quantificao de tais analitos
tem certo grau elevado de difilcudade, pois para extra-los de uma matriz complexa
como essa necessrio um mtodo efetivo que garanta confiabilidade na limpeza
da amostra24,25,26.
Levando em conta esses fatores, o mtodo QuEChERS surge como uma
alternativa aos mtodos anteriormente utilizado, desenvolvido no ano de 2003 que
at os dias atuais vem sendo utilizado e aprimorado revelando altos nveis de
recuperao, baixo consumo de reagentes e geraes de resduos, mostrando-se
adequado para o estudo proposto27.
Inicialmente a metodologia QuEChERS foi desenvolvida com o objetivo de
ser aplicada em amostras de origem alimentar com a finalidade de extrair e isolar
algumas classes de pesticidas e inseticidas como: os organoclorados,
organofosforados e os organonitrogenados. Portanto o mtodo deveria ter uma
ampla faixa de atuao sendo classificado como um mtodo MRMs (Multiclass and
Multiresidue Methods). A necessidade de se desenvolver uma nova metodologia de
sucesso na identificao dessas classes de contaminantes provm da conscincia
ambiental que vinha se criando durante a dcada de 90, j que os pesticidas so
uma classe de resduos com mais de 50 anos de estudos e desenvolvimentos de
diversas metodologias, porm nenhuma capaz de cobrir toda a faixa de
contaminantes polares e apolares nos reportando uma faixa de recuperao e
repetibilidade aceitvel27,28. A flexibilidade uma das principais vantagens do
mtodo escolhido para esse estudo, pois desde a sua criao em 2003, inmeras
pesquisas reportam adaptaes do processo de extrao QuEChERS para torn-lo
mais adequado e reprodutivo para determinado tipo de matriz29,30.
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Fluxograma 1 - Procedimento original criado por (Anastassiades et al, 2003);
Como era de se esperar a metodologia QuEChERS inicial contempla poucos
passos de extrao, sendo considerada simples e de fcil execuo podendo ser
conduzida por pessoas com um treinamento mnimo aceitvel no manuseio
laboratorial.
Porm para este presente trabalho onde procura-se otimizar tal procedimento,
faz-se necessrio entender cada um dos passos, as interaes e efeitos gerados
pelos reagentes usados, sendo assim uma explicao mais terica da metodologia
em geral deve ser feita.
O mtodo original de preparo de amostra QuEChERS pode ser dividido em
algumas etapas como:
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i) Fragmentao e homogenizao: Como a massa da matriz utilizada no
mtodo menor em relao a outras tcnicas tradicionais de extrao,
existe a necessidade de se fragmentar a amostra inicial (geralmente na
ordem de quilogramas) e homogenizar a mesma para se obter uma
maior superfcie de contato na hora de extrair os componentes.
ii) Extrao e partio: Devido natureza das matrizes utilizadas nesse
mtodo serem alimentares ou ambientais, sempre h uma grande
porcentagem de gua nas mesmas, por isso necessrio a adio de
um solvente orgnico como etapa de extrao, para que haja a
separao entre a fase aquosa e a orgnica com posterior migrao
dos analitos de interesse para a fase orgnica. Logo este o papel
exercido pelo solvente utilizado no mtodo, geralmente acetonitrila,
podendo ser tambm acetona ou acetato de etila.
iii) Adio do sal: nesta etapa da extrao so feitas as adies de NaCl e
MgSO4 a fim de induzir a separao das fases aquosa/orgnica e o
ajuste da polaridade atravs do efeito denominado salting-out, o qual
auxilia promovendo a secagem da fase aquosa aumentando o
coeficiente de distribuio de determinado analito na fase orgnica
diminuindo a presena do mesmo na gua, aumentado assim a
eficincia do mtodo de extrao.
iv) Adio de padro interno: adiciona-se uma soluo de padro interno
visando minimizar possveis erros provenientes das etapas de extrao
do mtodo, esta soluo pode ser usada em uma etapa inicial do
procedimento, porm se a matriz apresenta uma concentrao
significativa de gordura (0,3 g/10,0 mL de acetonitrila) que pode criar
uma camada adicional para onde partes dos analitos podem migrar,
recomendvel a adio deste padro somente no final do procedimento
analtico de extrao.
v) Utilizao de composto adsorvente: etapa em que uma alquota da
amostra movida para um tubo extrator vazio onde uma pequena
quantidade de composto adsorvente, geralmente PSA (primary
secondary amine), C18 ou grafite adicionada e homogeneizada com
a soluo para que o material absortivo se distribua por toda a alquota
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retendo compostos interferentes provenientes da matriz, realizando
assim um clean up adicional do extrato a ser analisado.
vi) Anlise da amostra: dependendo da origem do extrato, aps a
execuo do quinto passo a amostra j pode ser inserida em um GC
ou HPLC para separao e posterior quantificao dos analitos,
geralmente por espectrometria de massas.
Aps a escolha da metodologia baseada em QuEChERS como o mtodo de
extrao, uma otimizao para adequar as etapas de processamento e as
quantidades de reagentes utilizados necessria, j que a matriz de anlise
distinta daquelas empregadas inicialmente pelos criadores do mtodo28.
Sendo assim, o uso de ferramentas quimiomtricas para se realizar um
planejamento experimental indicado, esses estudos podem ser feitos tanto pelo
software Statistica quanto por linguagem de progamao usando progamas com o
matlab. O operador pode realizar ensaios em diferentes nveis, variando quantidades
de reagentes e composies, para que atravs de manipulaes estatsticas se
obtenha a melhor condio de resposta do mtodo.
Quando h necessidade de otimizao ou validao de um mtodo analtico,
um nmero elevado de anlises se faz necessrio, porm dficil a disponibilidade
de pessoas suficientes para a realizao de tal tarefa em tempo hbil. Por isso o uso
dos recusos estatsticos para um planejamento de experimentos retorna dados
confiveis em um tempo aceitvel, garantindo que os recursos investidos em
determinado estudo tragam resultados satisfatrios, beneficiando assim
pesquisadores e empresas que necessitam realizar diversas anlises em um curto
espao de tempo31,32.
Neste presente trabalho, fez-se uso de alguns tipos de planejamentos
experimentais para se estudar e avaliar condies de aplicabilidade do mtodo
QuEChERS em amostras de lodo, portanto uma explicao um pouco mais
detalhada das caractersticas destes tipos de planejamentos se faz necessria33,34.
i) Planejamento experimental fatorial completo: este tipo de planejamento
representado por n k, onde o nmero de nveis representado por
n, enquanto que k representa os fatores a serem considerados
durante a anlise. Para este tipo de desenho estatstico temos 7
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graus de liberdade, sendo 3 deles responsveis pelos efeitos
independentes dos fatores, enquanto que os outros 4 esto
relacionados aos efeitos das interaes entre esses fatores, ou seja,
para este tipo de planejamento consegue-se visualizar efeitos
singulares assim como relacionados das variveis presentes no ensaio
em questo.[montgomery]
Figura 3 Esquema representativo para um planejamento experimental nk.
Fonte: MONTGOMERY, D.C., 2004, p 228.
ii) Planejamento experimental fatorial fracionado: Quando se tem um
grande nmero de fatores a serem analisados em determinado
experimento, consequentemente tem-se tambm um aumento na
quantidade de interaes que devero ser consideradas, extendo
assim o tempo necessrio para completar um planejamento. Como
tempo um fator limitante, este tipo de experimento considera apenas
as interaes principais (efeitos exercidos pelos fatores de maneira
independente), deixando de lado os efeitos de interao entre as
variveis, possibilitando assim a realizao de apenas uma frao do
planejamento experimental, esse modelo representado por nk-p, onde
n e k tem mesma definio que para experimentos fatoriais
completos, enquanto que p simboliza o nmero de efeitos interativos
entre as variveis a ser desprezado.[montgomery]
iii) Planejamento experimental composto central: Quando se opta por
realizar planejamentos experimentais, principalmente de segunda
ordem, desvios da lineariedade relacionados aos efeitos exercidos
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10
pelos fatores podem aparecer, por isso opta-se por realizar (alm do
planejamento inicial) um estudo de composto central, que seria a
escolha por um ponto central, pontos axiais (estrela) e a utilizao dos
nveis provenientes do planejamento fatorial completo realizado
anteriomente feito (ex: -1, +1), permitindo assim uma estimativa do erro
interno associado ao planejamento, e a gerao de superfcies de
resposta que nos permitem a identificao das melhores condies de
utilizao do mtodo a ser otimizado. [montgomery, artigo favoritos]
Figura 4 Esquema representativo para um planejamento de composto central.
Fonte:
Depois de realizado todo o processo de estudo da matriz, da classe dos
analitos, do preparo da amostra e do tratamento estatstico, possvel realizar a
quantificao e identificao dos compostos atravs de tcnicas cromatogrficas.
No ramo da cromatografia os processos de separaes so regidos por
interaes entre uma fase mvel (onde est contido o analito) e uma fase
estacionria, nesta etapa de separao e identificao dos analitos, diferentes
variveis podem influenciar em uma melhor separao cromatogrfica.
Atualmente existem vrias tcnicas cromatogrficas diferenciadas entre si
pelo mecanismo utilizado na separao dos analitos, assim como na natureza da
fase mvel e estacionria a serem utilizadas35.
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Figura 5 Principais tcnicas de cromatografia.
As tcnicas cromatogrficas tambm podem ser classificadas entre as que
utilizam uma coluna como residncia da fase estacionria e atuam sob alta
presso e as planares para anlises mais simples e objetivas.
No caso de metodologias para preparo de amostra, geralmente so utilizadas
as tcnicas de cromatografia mais complexas, que utilizam a coluna de separao,
portanto iremos se ater a explicar somente sobre esses tcnicas cromatogrficas.
Tcnicas em coluna
i) Cromatografia Lquida Clssica: Criada no incio do sculo 20, baseada
em uma fase mvel lquida que passava atravs de colunas de vidro de
dimetros internos de 1,0 -> 5,0 cm e comprimentos entre 50,0 ->
500,0 cm, a fases estacionrias utilizadas eram partculas com
dimetros de at 200,0 mm por onde a soluo contendo o analito flua
at a sada da coluna, onde eram coletadas fraes dessa amostra em
tubos de ensaio, e cada frao teoricamente representava um grau de
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separao entre os compostos presentes. O fato da coluna ser
relativamente grande e no se usar sistemas pressurizados, acabava
resultando anlises demoradas, logo esse tipo de tcnica serviu mais
como base para o desenvolvimento da cromatografia lquida de alta
eficincia (HPLC)35,36.
ii) Cromatografia Lquida de Alta Eficincia: Utilizada na separao de
compostos com alta massa molar e compostos inicos, essa tcnica
utiliza colunas com comprimento de at 250,0 mm e dimetro de 4,6
mm contendo partculas de at 10 m compactadas. A fase mvel
impulsionada por uma bomba peristltica elevando o fluxo e
aumentando a presso do sistema, resultando em altas velocidades de
anlise em tempos menores, permitindo a realizao de diversas
anlises com boa reprodutibilidade e confiabilidade35,36.
iii) Cromatografia com fludo supercrtico: nesta tcnica um composto em
seu estado super crtico (CO2, por exemplo) utilizado como a fase
mvel do sistema de separao. Esse tipo de cromatografia indicada
para aqueles compostos que dificilmente poderiam ser analisados por
GC ou HPLC, devido a sua baixa volatilizao, probabilidade de
degradao em altas temperaturas ou ausncias de grupos funcionais
ativos para interaes com os detectores presentes em HPLC35,36.
iv) Cromatografia Gasosa: indicada para amostras termicamente
estveis e volteis. Nesse tipo de cromatografia a fase mvel
empregada um gs inerte que s atua no carregamento dos analitos
coluna a dentro. As separaes so realizadas por diferena na
temperatura de ebulio dos compostos em questo e as suas
solubilidades com a fase estacionria, geralmente so usadas
partculas slidas compactadas na coluna que adsorvem os analitos,
ou partculas lquidas envolvidas por um filme slido compactado na
coluna. Atualmente o uso de colunas capilares resistentes a
temperaturas na faixa de 450 oC, para aplicabilidade em compostos de
massas moleculares cada vez maiores, tem sido utilizadas juntamente
com novos mtodos de injeo como o cold on-column e PTV
contribuindo assim para o desenvolvimento da cromatografia gasosa
de alta resoluo35,36.
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13
Com a criao e desenvolvimento de diversas tcnicas cromatogrficas como
as descritas acima, foi possvel obter um controle maior sobre as variveis que
influenciam na corrida cromatografica, assim como atingir menores tempos e
maiores resolues na separao das mais variadas classes de compostos
qumicos.
No casso desse trabalho a cromatografia lquida de alta eficincia (HPLC) foi
escolhida para realizar o processo de separao e a espectrometria de massas para
a identificao e quantificao das sulfonamidas.[referncia sobre HPLC]
Sendo assim, aliando um mtodo de separao efetivo juntamente com as
informaes obtidas do planejamento experimental (sobre melhores condies de
extrao para o preparo de amostra), espera-se resultados satisfatrios sobre a taxa
de recuperao de frmacos nos mais diversos tipos de matriz, justificando de
maneira positiva o intuito deste trabalho.
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2 OBJETIVOS
Este trabalho tem como objetivo a otimizao de um mtodo para preparo de
amostra baseado em QuEChERS visando a extrao confivel das sulfonamidas
presentes em lodo floculado, com posterior separao e identificao atravs de
cromatografia lquida de alta eficincia (HPLC) acoplada a um detector de tempo de
vo (TOF)
A escolha deste bioslido como matriz de estudo foi devido ao mesmo
apresentar altas probabilidades de adsoro residual dos mais diversos tipos de
frmacos, incluindo as sulfonamidas11.
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3 PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAIS
3.1 MATERIAIS
Durante a fase de desenvolvimento do mtodo, foram usados reagentes
como: acetonitrila (Tedia, grau HPLC) na fase mvel do sistema cromatogrfico,
para preparo de amostras e das soluo estoque das sulfonamidas, cido frmico
98% (Tedia), hidrxido de amnio 30% (Synth), os sais NaCl e MgSO4 e gua
purificada atravs de um sistema milli-Q (Millipore)
Para a obteno da soluo estoque, oito compostos classificados como
sulfonamidas foram utilizados, sendo elas: Sulfacetamida, Sulfadiazina,
Sulfametoxazol, Sulfatiazol, Sulfamerazina, Sulfametizol, Sulfametzaina e
Sulfacloropiridazina.
Sendo os padres para a realizao dos testes fornecidos pela Sigma
Aldrich.
Tabela 1 Estrutura das sulfonamidas, massa molecular e pka.
Nome Massa
Molar
pKa Estrutura
Sulfacetamida 214,24 5,43
Sulfadiazina 250,28 6,81
Sulfametoxazol 253,28 5,81
Sulfatiazol 255,32 7,24
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Sulfamerazina 264,30 7,35
Sulfametizol 270,33 5,51
Sulfametazina 278,33 7,89
Sulfacloropiridazina 284,72 5,90
A soluo estoque (SE) foi preparada em acetonitrila na concentrao de 400
mg . L-1 e armazenada em refrigerao durante todo o processo de desenvolvimento
do mtodo. Outras solues denominadas de trabalho (ST) eventualmente em
concentraes diferentes da soluo estoque foram preparas a partir de uma
soluo intermediria (SI), que visando a no degradao da soluo estoque era
feita a partir da mesma.
O preparo da amostra a ser testada no processo de extrao (QuEChERS )
utilizou lodo floculado cedido pelo laboratrio de processos biolgicos (LPB), o qual
foi mantido na geladeira do laboratrio de cromatografia da USP (CROMA).
Antes de pesar as alquotas de lodo a serem utilizadas nos testes, o excesso
de gua contido foi retirado atravs de filtrao a vcuo com um funil de Bchner.
Em seguida pores de 4,0 g do lodo seco foram pesadas e transferidas para
tubos falcon de 50,0 mL onde a contaminao com as sulfonamidas foi feita usando
as solues de trabalho (ST) nas concentraes desejadas.
Por ltimo os tubos foram deixados abertos dentro da capela do laboratrio
por 60 minutos afim de que toda a acetonitrila presente nas solues de trabalho
utilizadas fosse volatilizada, aps estes passos as amostras foram mantidas sob
refrigerao por 48h antes do incio do processo de extrao.
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17
As condies utilizadas na etapa de separao e deteco dos analitos foi o
uso de um sistema HPLC da srie 20A Prominence, Shimadzu operando em fase
reversa, equipado com uma coluna Agilent C18 ( 2,1 mm x 100mm x 2,7 m),
temperatura do forno a 40o C, volume de injeo de 5,0 L, fase mvel de
acetonitrila e gua, ambas acidificadas a 0,1% com cido frmico.
Para a deteco e quantificao das sulfonamidas em questo fez-se uso de
um espectrmetro de massas hbrido, modelo micrOTOF-Q II (Bruker) operando no
modo full SCAN, com ionizao por eletrospray (ESI) no modo positivo sob voltagem
no capilar de 3,5 kV, a temperatura na fonte estava em 200o C, o fluxo do gs
secante manteve-se em 8,0 L . min-1 e utilizou-se uma presso de 4,0 bar para o
nebulizador.
3.2 MTODO
Primeiramente variveis como massa de lodo utilizada e composio da fase
extratora foram testadas de maneira independente, nos reportando que a quantidade
e composio escolhida inicialmente eram as melhores, porque assemelhavam-se
bastante com aquelas usadas no mtodo de extrao original. Sendo assim fixou-se
em 4,0 g a quantidade de lodo utilizada por amostra, e o uso de acetonitrila/gua na
composio da fase extratora.
Depois de escolhida uma metodologia baseada em QuEChERS para o
processo de extrao, a otimizao das etapas de anlise foi realizada atravs de
planejamento experimental gerado pelo software STATISTICA.
Com a realizao de um planejamento quimiomtrico fatorial, fica possvel
evidenciar e quantificar a importncia das variveis que afetam no decorrer do
processo de extrao, assim como avaliar o efeito independente ou relacionado
delas, dentro do desempenho final do mtodo analtico.
Como o planejamento experimental deve abranger todas as variveis com
potencial para afetar o mtodo de extrao, inicialmente foram escolhidas as
variveis originais presentes no mtodo QuEChERS desenvolvido para anlise
de pesticida em matrizes alimentcias.
-
18
Sendo assim um planejamento fatorial fracionrio 24-1 foi realizado, visando
obter informaes sobre a maneira como as variveis clssicas influenciavam de
modo independente o mtodo utilizado para a anlise de sulfonamidas em lodo
granular.
Foram realizados no total oito experimentos avaliando dois nveis (-1, +1),
com a quantidade a ser otimizada de cada varivel clssica empregada na
mtodologia a ser otimizada.
Tabela 2 Fatores avaliados e nveis apresentados no planejamento experimental 2(4-1)
Variveis
Nveis Avaliados
-1 +1
Volume da soluo
extratora
2 3
ACN/H2O 2:1 4:1
NaCl (%) 10 30
MgSO4 (mg) 40 80
Os experimentos foram realizados seguindo etapas adaptadas de um modelo
prximo ao original empregado em QuEChERS
-
19
Fluxograma 2 Etapas do preparo de amostra baseado no mtodo QuEChERS utilizadas no trabalho.
Secagem de Lodo
(filtrao a vcuo);
Pesagem do lodo em
tubo falcon (50 mL);
Adio de soluo
contaminante;
Amosstra em repouso
por 48h;
Adio de NaCl (s) +
vortex;
Centrfuga 3400 rpm;
Tranferncia fase
orgnica para tudo
falcon (15 mL);
Adio de MgSO4
anidro + vortex;
Centrifuga 3400 rpm;
Anlise em LC-ESI-
TOF;
Secagem em fluxo de
N2 + resuspeno em
H2O
tranfere 2 mL para
ephendorf;
-
20
4 RESULTADOS E DISCUSSES
Aps a realizao dos testes propostos no planejamento experimental 24-1 e
anlise dos cromatogramas obtidos para cada sulfonamida presente na amostra, os
picos foram integrados e as reas referentes a cada composto transcritas para o
software STATISTICA 7.0.
Tabela 3 Planejamento experimental 2(4-1) com os respectivos fatores, nveis e sulfonamidas presentes.
Com isso, foi possvel a obteno de grficos de Pareto que informam a
contribuio independente de cada varivel no mtodo QuEChERS empregado na
extrao.
-
21
Figura 6 Projees de pareto para as variveis do planejamento 2(4-1)
.
-
22
Observando os grficos de Pareto fica evidente que a varivel que menos
afeta no desempenho do mtodo em questo a porcentagem de NaCl, portanto
visando um planejamento experimental mais completo, a varivel foi retirada.
-
23
Depois de observado os resultados iniciais, foi ento proposto um novo
planejamento experimental completo, ou seja, um planejamento 23 que nos permite
analisar as variveis de maneira independente e relacionada.
Para isso utilizou-se da mesma ferramenta estatstica, ressaltando que novos
experimentos no foram realizados, ou seja, apenas foi retirada a varivel % NaCl
e os dados foram avaliados de acordo com um planejamenteo fatorial completo 23.
Tabela 4 Planejamento experimental 2(3) com os respectivos fatores, nveis e sulfonamidas presentes.
Depois de gerado a tabela com o planejamento completo, as mesmas
ferramentas e o mesmo mtodo de anlise critica dos dados foi adotado.
Grficos de Pareto, mostrando a contribuio relacionada e independente das
variveis para cada sulfonamida presente na amostra, foram gerados e avaliados
com a perspectiva de que uma nova otimizao poderia ser realizada frente aos
resultados observados.
Figura 7 Projees de pareto para as variveis do planejamento 2(3)
.
-
24
-
25
Ao observar as projees de Pareto para o planejamento experimental
completo 23, feito com o intuito de verificar a contribuio relacionada entre as
variveis presentes na extrao, assim como de forma independente, podemos
constatar um aumento no efeito combinado das variveis no mtodo em geral, o que
nos trs primeiramente a certeza de que retirar a varivel % NaCl foi uma boa
escolha.
Pensando em melhorar ainda mais o mtodo de preparo de amostra, foram
realizados experimentos visando a obteno de superfcies de resposta de segunda
ordem para cada condio usada, o que se tratava de um planejamento
experimental de composto central.
Este tipo de planejamento experimental um dos mais comuns de segunda
ordem, e nos retorna uma estiva sobre o erro interno do experimento e informaes
sobre os termos axiais ao central, que iro determinar os valores quadrticos
responsveis por um ajuste mais preciso no rendimento experimental. Basicamente
este tipo de planejamento realizado escolhendo-se um ponto central, e aplicando
testes experimentais e estatsticos na regio em torno do ponto central.[referncia
da internet, salva nos favoritos]
Nesse caso uma avaliao sobre as variveis que seriam englobadas no novo
planejamento foi necessria, considerando ento toda a etapa de preparo de
amostra e os passos utilizados pelo mtodo. Chegamos concluso que a varivel
Volume de Solvente no poderia ser alterada, pois como seu efeito na projeo de
Pareto teve sinal negativo, apenas uma diminuio do volume utilizado traria efeitos
positivos no resultado final, e isso seria impossvel, pois o volume utilizado j era o
mnimo levando em conta que uma extrao de 2,0 mL de fase orgnica se faz
necessria durante os procedimentos, e ao diminuir mais esse valor de volume de
soluo extratora, esses 2,0 mL no poderiam ser retirados, comprometendo assim
o mtodo como um todo.
Logo no planejamento composto central, apenas as variveis Composio de
Solvente e a massa de MgSO4, foram consideradas.
Portanto, foi escolhido um planejamento 22 onde os nveis avaliados ao redor
do ponto central tiveram um = 2, ou seja, os pontos estrela avaliados neste
planejamento tiveram uma abrangncia maior que a regio delimitada pelo
-
26
experimento (-1, 0, +1), nos permitindo assim avaliaes mais precisas sobre o
rendimento experimental atravs de projees de superfcie quadrticas. Sendo
assim o experimento foi feito em 4 nveis adjacentes ao centro, sendo eles: (-2, -1,
+1,+2), enquanto que o ponto central foi fixado em (0, 0).
Tabela 5 Planejamento de composto central 2(2) com os respectivos fatores, nveis e sulfonamidas presentes
Vale ressaltar que para este planejamento (diferente do planejamento 23 onde
retiramos a varivel NaCl e fizemos apenas ajustes estatsticos), a realizao de
novos experimentos foi necessria e estes foram conduzidos com a mesma
metodologia de preparo de amostra aplicada para os outros planejamentos, porm
agora apenas as variveis quantidade de MgSO4 e proporco ACN/H2O foram
variadas nos pontos estrela, enquanto que para o ponto central as mesmas
quantidades j otimizadas nos experimentos no planejamento 23 se mantiveram, o
ponto central foi realizado em quadruplicata, visando uma melhor anlise sobre os
erros internos provenientes do mtodo.
Tabela 6 - Fatores avaliados e nveis apresentados no planejamento de
composto central 22
Variveis independentes
Nveis Codificados
-1,41 -1,0 0 1,0 1,41 ACN/gua 2,59:1 3:1 4:1 5:1 5,41:1
MgSO4 (g) 25,9 30 40 50 54,1
-
27
Como se trata de uma anlise quimiomtrica atravs de um planejamento de
2a ordem, as condies otimizadas de aplicabilidade do mtodo foram avaliadas a
partir de grficos de superfcie para cada sulfonamida presente na amostra,
ajustados a partir dos termos quadrticos obtidos do planejamento, representando o
recuperao e repetibilidade do mtodo para cada ponto, seja ele adjacente (estrela)
ou o central.
Figura 8 - Superfcies de resposta dos pontos testados no planejamento experimental de composto central.
-
28
Os grficos de superfcie oriundos do experimento composto central, nos
reportaram as condies utilizadas no ponto central como sendo a melhor
encontrada para a utilizao do mtodo, pois para as oito sulfonamidas o ponto
central aquele que tem maior intensidade de resposta na superfcie de segunda
ordem, ou seja, este planejamento experimental foi efetivo e nos provou que a
melhor condio encontrada nos testes provenientes do planejamento 24-1 era
realmente a ideal a ser aplicada para o mtodo.
Estudos recentes mencionam a utilizao de ferramentas estatsticas na hora
de uma otimizao experimental, permitindo assim realizar tais procedimentos em
menor tempo com menos consumo de reagentes, assim como mencionam a
-
29
efetividade ao se aplicar a metodologia QuEChERS na extrao de analitos de
origem farmacutica em amostras de lodo37,38,39.
Como a matriz escolhida para este trabalho no tem origem alimentcia como
aquelas aplicveis ao mtodo original, uma bateria de experimentos visando avaliar
a contribuio na adio de um composto adsortivo, etapa inicialmente aplicada por
(Anastassiades et al, 2003) foi realizada.
Os testes foram realizados nas condies otimizadas pelo planejamento de
composto central, as quantidades utilizadas foram: 4,0 g de lodo, 8,0 mL de soluo
extratora (1,6 mL H2O e 6,4 mL de ACN), 30 % de NaCl e 40 mg de MgSO4.
Figura 9 Intensidade de rea dos picos das sulfonamidas pelo mtodo de extrao utilizado (testes
utilizando fase adsorvente e a amostra controle).
Ao observar o grfico, conclumos, assim como (Bourdat-Deschamps et al,
2014) o uso de uma fase adsorvente no mtodo de preparo de amostra era
dispensvel, pois somente sulfametizol e sulfametoxazol responderam melhor
quando usados grafite e PSA respectivamente, enquanto que as seis demais
sulfonamidas presentes na amostra tiveram melhor resposta quando no realizada
esta etapa no mtodo, o que claro vantagoso pois com menos etapas e uso de
menos reagentes se tem uma melhor rapizes e rentabilidade do mtodo
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
S/N
Controle
PSA
GRA
C18
-
30
respectivamente. Sendo assim optou-se por excluir essa etapa do mtodo de
preparo amostral40.
-
31
5 CONCLUSO
A otimizao de uma metodologia para preparo de amostra baseada em
QuEChERS e realizada atravs de planejamentos experimentais revelou
resultados finais satisftorios.
O intuito desde o incio era adequar os procedimentos e quantidades de
reagentes utilizados a fim de se ter a melhor relao custo/benefcio possvel, ou
seja, um rendimento e uma aplicabilidade boa para o mtodo sem esquecer de todo
o contexto da qumica verde e a gerao de resduos imposta pelo uso de tal
metodologia.
Os experimentos realizados a partir da tabela de nveis gerados pelo
planejamento experimental fatorial fracionrio 2(4-1), permitiu observar a contribuio
independente de cada varivel clssica empregada no mtodo, levando a uma
deciso de retirar a varivel % NaCl j que a mesma revelava ser a varivel de
menos efeito sobre a etapa extratora, com isso um novo planejamento, agora
classificado como fatorial completo foi usado.
No planejamento fatorial completo 23, apenas as variveis: composio da
fase extratora, volume de solvente e quantidade de MgSO4 (mg) foram
consideradas, revelando( atravs das projees de pareto) a contribuio independe
e relacionada de tais fatores. Como a varivel volume de solvente teve sinal
negativo nos grficos, apenas uma diminuio da mesma acarretaria em melhora na
metodologia, porm no era vivel essa diminuio j que o volume utilizado era o
menor possvel para a etapa de extrao.
Visando o melhor ajuste possvel e a melhor otimizao para o mtodo
QuEChERS, aplicvel as oito sulfonamidas presentes no lodo granular, um
planejamento experimental contendo um ponto central foi gerado e somente os
fatores: quantidade de MgSO4 (mg) e composio da fase extratora foram variados
nos nveis adjacentes ao central.
O planejamento em questo nos reportou grficos de superfcie indicando que
as condies utilizadas no ponto central eram aquelas que apresentavam as
melhores taxas de recuperao de analito (observada atravs das reas dos picos),
ou seja, uma otimizao satisfatria do mtodo.
-
32
Logo este planejamento de composto central serviu para minimizar erros
internos em nosso experimento e confirmar a condio ideal de utilizao do mtodo
QuEChERS (encontrada no planejamento experimental fracionrio 24-1) como
aplicvel a amostras de lodo granular a fim de realizar o clean up da amostra para
posterior separao e deteco dos agentes antimicrobianos da classe das
sulfonamidas.
Por ltimo, importante comentar que o estudo em questo serviu para
mostrar a importncia na utilizao de ferramentas estatsticas na hora de realizar
uma otimizio experimental, assim como para acrescentar conhecimentos
analticos sobre procedimentos de preparo de amostra e cromatografia, tornando
esse trabalho uma importante forma de adquirir experincia laboratorial e fixar
conhecimentos trabalhados durante o curso.
-
33
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