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Métodos de estudo em microscopia de

luz e eletrônica

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Microscopia• O microscópio é um

instrumento que permite observar objetos não visíveis a olho nu.

• Isto se consegue através de um sistema óptico composto por lentes de cristal que aumentam a imagem do objeto.

Microscopia de LuzEvolução do microscópio de luz

• Galileu Galilei inventou o Telescópio no século XVI – duas lentes num tubo

• Zacarias Jansen (holandês) inventou o primeiro microscópio composto, em 1660 Século XVII

• O primeiro microscópio era formado por três tubos encaixados

Microscopia de LuzEvolução do microscópio de luz

Leeuwenhoek, final de 1600

Microscopia de LuzEvolução do microscópio de luz

Robert Hooke

Microscopia de LuzEvolução do microscópio de luz

Microscopia de Luz

Microscopia de Luz

Microscopia de Luz

Microscópio óptico, Microscópio composto ou Microscópio de Campo claro

• É um instrumento usado pelo estudante de citologia, histologia e outras disciplinas que estudam microrganismos ou objetos com

medidas micrométricas e serve para serve para aumentar a imagemaumentar a imagem.

• Basicamente, é constituído por uma

parte mecânica e uma parte óptica.

Parte Mecânica

Base ou pé

Coluna ou braço

Tubo

Revólver

Platina

Parafuso Macrométrico

Parafuso Micrométrico

• Parte Mecânica– Base ou pé suporte– Coluna ou braço apoio paras as estruturas– Tubo peça de ligação entre a ocular e o revólver– Revólver peça giratória que contém as lentes

objetivas– Platina suporta a preparação– Parafuso Macrométrico, de passo largo, é para

movimento de grande amplitude– Parafuso Micrométrico, de pequeno passo, é

destinado a focar o material

Parte Óptica

Condensador

Lentes objetivas

Lentes oculares

Parte Óptica

– Condensador, concentra os raios luminosos objeto

• possui um diafragma de diâmetro modificável, proporciona uma maior ou menor intensidade luminosa

– Lentes objetivas, próximas do objeto, projetam a imagem ampliada do objeto em direção a ocular

– Lente ocular, funciona como uma lupa, amplia a imagem fornecida pela objetiva

Parte Óptica

• CONDENSADOR – geralmente negligenciado - não interfere no aumento da imagem, mas ele influencia em sua nitidez e riqueza de detalhes

• Age no LIMITE DA RESOLUÇÃO do sistema óptico, embora esta propriedade dependa principalmente das lentes objetivas

LIMITE DE RESOLUÇÃOLIMITE DE RESOLUÇÃO

• LR de um microscópio é a capacidade de:

– Separar detalhes

– Produzir imagens separadas de partículas muito próximas

– É a menor distância que deve existir entre dois pontos para que eles apareçam separado

Limite de Resolução

LR = K . AN

– K é uma constante 0,612 é o comprimento de onda luz branca (verde-

amarelo) = 0,55 m– AN é a abertura numérica da lente objetiva

LR = 0,612 . 0,55 AN

– O limite e resolução é diretamente proporcional ao comprimento de onda e inversamente proporcional a abertura numérica.

• ABERTURA NUMÉRICA (AN), vem gravado na lente objetiva e sua determinação cabe ao fabricante da lente.

• Indica a resolução de uma lente objetiva• Capacidade de captar a luz• Fornecer detalhes da amostra

AN = n. sen

– n = menor índice da refração = semi-ângulo de abertura

• As objetivas trazem outras informações

– 160 ou 170, indica em milímetro o comprimento do tubo do microscópio, onde devem ser usadas as objetivas para que dêem melhores resultados.

– 0,17, distância de trabalho, que significa o tamanho da lamínula, para a qual as aberrações são corrigidas.

Códigos de cores das lentes objetivas

Aumento Cores

4X ou 5X Vermelho

10X Amarelo

40 ou 50X Azul claro

100X

Imersão – óleo

Branco

Imagem real ampliada e invertida

• Outros tipos de microscópios

–Microscópios Ópticos – MO • Microscópio de Contraste de Fase

• Microscópio de Campo Escuro

• Microscópio de Fluorescência

• Microscópio de Polarização

–Microscópio Eletrônico – ME

Microscópio de contraste de fase – células vivas

• Usa as propriedades da refração da luz– Refração é a passagem da

luz de um meio para outro.

• Microscópio de contraste de fase transforma diferentes fases luminosas em diferentes intensidade luminosa

Microscopia de luz convencional Microscopia de contraste de fase

Microscópio de campo escuro

• Condensador é substituído por um condensador de fundo escuro

• A preparação é iluminada por raios oblíquos

• A célula fica com aparência brilhante e o fundo escuro

CONDENSADOR

LUZ

Objetiva

Microscopia de campo escuro - células de sangue.

Microscópio de Polarização

• Quando um raio de luz atravessa certas substâncias do nosso corpo acontece uma dupla refração

• Substâncias como dentes, ossos, fibras de colágeno e outras possuem um estado cristalino, arranjo molecular interno

• Prisma utiliza as propriedades de um único raio eliminando o outro

2 raios de luz = Raios polarizados

Microscópio de luz polarizada: Fibras de colágeno exibem birrefringência (brilhantes ou amarelas).

Microscópio de luz polarizada: da dentina (dente).

Microscópio de Fluorescência

Utiliza luz fluorescente – permite detectar proteínas ou estruturas marcadas com compostos fluorescentes

Similar ao MO, exceto pela

luz empregada Luz ultra-violeta e pelos 2 conjuntos de filtros que desviam os raios do olho do observador.

Cultivo de astrócitos. Imunofluorescência verde contra GFAP (proteína de filamentos intermediários) e azul (união com DNA)

Alberts et al. Biología Molecular de la célula. (1996) p. 856.

Microscopia Eletrônica

Microscopia Eletrônica• Inventado em 1932,

na Alemanha, Ernest Ruska e Max Knoll

• Utiliza elétronselétrons, comprimento de onda muito pequeno, limite de resolução 1.000X1.000X menor que microscópio de luz

Microscopia eletrônica, músculo estriado cardíaco.

Medidas

Unidade de medida Símbolo Valor

Micrômetro mm 0,001 mm

Nanômetro nmnm 0,000001 mm (10-6 mm) ou 10-3 m

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