manual de prÁcticas del curso diagnÓstico molecular
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MANUAL DE PRÁCTICAS DEL CURSO DIAGNÓSTICO MOLECULAR
_______________________________________________________________________________ Alvarado-Gómez, O.G. 2009 2
CONTENIDO
Pág.
Presentación .......................................................................................................... ….3
Requerimientos de un laboratorio de Diagnóstico Molecular ......................................4
Práctica 1. Extracción de ácido desoxiribonucleico.....................................................6
Práctica 2. Electroforesis en geles de agarosa .........................................................10
Práctica 3. PCR Universal para Eucariotes y Plantas ...............................................12
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REQUERIMIENTOS DE UN LABORATORIO
DE DIAGNÓSTICO MOLECULAR
1. Materiales
bata
cajas criogénicas para tubos de 1.5 ml
cristalería (probetas, vasos de precipitado y matraces)
gradillas
guantes de latex
papel absorbente
papel dextrasa
parafilm
puntillas de 10, 200 y 1000 µl
hielera
hielo (de preferencia frapé),
marcador para vidrio
morteros y pistilos
pipetas de 10 ml
tubos de 200, 500 y 1500 µl
2. Equipo
autoclave
cámara fotográfica instantánea blanco y negro/cámara digital y filtro naranja
cámara de electroforesis horizontal
campana de flujo laminar ó una estación de trabajo para PCR (no indispensable)
centrifuga ó microcentrifuga (de preferencia refrigerada)
congelador de –20ºC
espectrofotómetro (no indispensable)
flurómetro (no indispensable)
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fuente de poder
horno de microondas ó una plancha con calor
máquina para fabricar hielo frapé//trituradora de hielo (no indispensable)
micropipetas (P2, P20, P200, P1000)
refrigerador 4ºC
termociclador
transiluminador con luz ultravioleta
ultracongelador (-70°C)
vortex
3. Reactivos
ácido bórico
alcohol isopropílico
agarosa
agua mili-Q
azul de bromofenol
bromuro de etidio
cloroformo ó bromocloropropano
desoxinucleósidos trifosfatados (individuales ó una mezcla)
EDTA
enzima M-MLV
etanol
kit para extracción de ADN (DNAzol por ejemplo)
kit para extracción de ARN (RNAzol por ejemplo)
marcador de peso molecular
MgCl2
primers o iniciadores universales y específicos
Taq ADN polimerasa u otra polimerasa
trisma base
xilencianol
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PRÁCTICA 1. EXTRACCIÓN DE ÁCIDO
DESOXIRIBONUCLEICO (ADN)
INTRODUCCIÓN
El aislamiento de ADN de las muestras a analizar, es generalmente el primer paso en
cualquier manipulación de ácidos nucleicos in vitro. El ADN no existe en forma natural
como una molécula libre, sino que se encuentra asociada con proteínas, ARN, y están
rodeadas de membranas celulares (nucleares y citoplásmicas) y en ocasiones de
pared celular, por lo anterior, el aislamiento de ácidos nucleicos en ocasiones puede
dificultarse. En general, la mayoría de los procedimientos consisten de tres pasos
principales: 1) el rompimiento de las paredes y membranas celulares con el fin de
liberar los complejos ADN-proteína (cromatina); 2) la solubilización y disociación de
estos complejos por medio de surfactantes o agentes desnaturalizantes y 3) la
separación del ADN de otras macromoléculas.
Los métodos de extracción de ADN disponibles son muchos y muy variados,
aquí presentamos sólo uno de ellos el cual está basado en un kit comercial y se
caracteriza por ser rápido, sencillo y versátil.
OBJETIVO GENERAL
Realizar un diagnóstico sobre la ubicación taxonómica, en los niveles superiores
(eucariotes y reino vegetal), de algunas muestras biológicas diversas aplicando
técnicas basadas en la amplificación enzimática de ADN.
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OBJETIVO ESPECÍFICO
Aplicar un protocolo de extracción de ADN utilizando un kit comercial en muestras
genéticamente distantes y diversas como plantas, animales y microorganismos.
MATERIALES
Se requieren organismos vegetales (plantas ó vitroplantas), animales (superiores,
insectos) y microbianos (hongos y bacterias).
Equipo y material de laboratorio:
Microcentrifuga
Micropipetas de 20, 200 y 1000 µl
Tubos de centrifuga de 200 µl y 1.5 ml
Puntillas de 200 y 1000 µl
Guantes de latex
Pistilos
Reactivos y soluciones:
Plant DNAzol (Molecular Research Center)
Cloroformo
Etanol absoluto y solución al 80% (v/v)
Solución amortiguadora TE (Tris 100 mM, EDTA 1 mM)
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MÉTODOS
Extracción de ADN por el método del Plant DNAzol (MRC).
Después de haber realizado la colecta del material biológico a utilizar, colóquese un
par de guantes de latex durante todo el proceso de extracción y realice los siguientes
pasos:
1. Pesar 0.1 g de tejido y colocarlo en un tubo de centrifuga nuevo y estéril de 1.5 ml.
Triture el tejido con un pistilo estéril y agregue 0.6 ml del reactivo Plant ADNzol ES y
mezcle la solución en vortex y posteriormente deje reposar durante 5 min a
temperatura ambiente.
2. Agregue 0.6 ml de cloroformo, mezcle vigorosamente y deje reposar por otros 5
min a temperatura ambiente. Centrifugue a 12,000 x g durante 10 min y transfiera el
sobrenadante o fase acuosa, en un tubo de centrifuga nuevo de 1.5 ml.
3. Precipite el ADN mezclando la fase acuosa con 0.75 volúmenes de alcohol etílico
absoluto mezclando las muestras por inversión de los tubos 8 veces y almacénelos a
temperatura ambiente durante 5 min. Precipite el ADN centrifugando a 5,000 x g por 4
min.
4. Prepare una solución de lavado con DNAzol-etanol mezclando un volumen de
DNAzol con 0.75 volúmenes de etanol absoluto. Después de decantar, mezcle 0.6 ml
de la solución anterior con el ADN precipitado. Almacene las muestras durante 5 min
y centrifugue a 5,000 x g por 4 min.
5. Remueva la solución de lavado y lave la pastilla de ADN mezclando vigorosamente
con 0.5 ml de etanol al 80% seguido por una centrifugación de 5,000 x g durante 4
min.
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6. Remueva el etanol por decantación y coloque los tubos invertidos en posición
vertical en una sanita estéril por 1-2 min para secar la pastilla de ADN. Disuelva la
pastilla de ADN en 25 µl de buffer TE (pH 8.0) y almacene a -20°C hasta su
utilización.
Determinación de la cantidad y calidad de ADN.
Se pueden utilizar dos métodos para determinar la concentración y calidad de ADN:
por espectrofotometría y por comparación con un indicador de concentración
conocida, en un gel de agarosa. En el primer caso se coloca 1 ml de amortiguador TE
1X en una celda para UV, se calibra a cero el espectrofotómetro y se añade 1 µl de
muestra y se mezcla bien por inversión. Se toman las lecturas de absorbancias a 260
y 280 nm y se calcula la concentración de ADN con la siguiente fórmula:
Concentración ADN (ng/µl)=(factor de dilución)(50)(lectura 260 nm)
Volumen total de la celda
Factor de dilución=
Volumen de la muestra
La calidad del ADN se determina dividiendo la lectura obtenida (absorbancia) a 260
nm entre la lectura a 280 nm. Un ADN de buena calidad deberá tener un valor entre
1.8 y 2.0.
El otro método, basado en una comparación entre el ADN obtenido y un ADN de
concentración conocida, requiere la preparación de un gel de agarosa al 1% y la
separación del ADN por electroforesis (ver práctica 2).
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(A) (B)
Figura 1. ADN y marcador cuantitativo de concentración. A) ADN obtenido a partir de
ápices y tubérculos de papa. La flecha señala la posición del ADN en el gel
de agarosa al 1%. B) Escala cuantitativa para la estimación de ADN
usando la escalera de masas (Gibco, BRL).
BIBLIOGRAFÍA
Molecular Research Center. 2001. DNAzol®ES. Manufacturer Protocol.
Sambrook, J., Fritsch, E.F., and Maniatis, T. 1989. Molecular Cloning: A
Laboratory Manual. 2nd Ed. Cold Spring harbor Laboratory Press.
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PRÁCTICA 2. ELECTROFORESIS EN GELES
DE AGAROSA
INTRODUCCIÓN
Gracias a la capacidad de las moléculas de adquirir carga, es posible separarlas
cuando se les somete a la influencia de un campo eléctrico. Esta capacidad se
debe a la presencia de grupos con carga positiva o negativa. Cuando las
moléculas con carga en solución negativa como el ADN se someten a una
diferencia de potencial, emigran hacia el ánodo (+). La velocidad de migración
depende de muchos factores como son: el tamaño y carga neta de la molécula,
pureza de la agarosa, voltaje aplicado y buffer de corrimiento. La agarosa es un
polímero que se extrae de un alga marina.
OBJETIVO GENERAL
Realizar un diagnóstico sobre la ubicación taxonómica, en los niveles superiores
(eucariotes y reino vegetal), de algunas muestras biológicas diversas aplicando
técnicas basadas en la amplificación enzimática de ADN.
OBJETIVO ESPECÍFICO
Observar la calidad y cantidad de ADN obtenido en la práctica de extracción, así
como la visualización de los productos de amplificación por PCR de las muestras
analizadas.
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MATERIALES
Reactivos y Equipo
agarosa
agua destilada
buffer TBE
buffer de carga (0.25% de azul de bromofenol, 0.25% de xilencianol y 30% de
glicerol en agua)
bromuro de etidio
cámara de electroforesis
fuente de poder
transiluminador de luz UV
micropipetas
marcador de peso molecular
MÉTODOS
Procedimiento
Diluir una cantidad adecuada de solución TBE 5X a 0.5X la cual se usará en la
preparación del gel y en el corrimiento.
1. Ensamblado del aparato. Coloque el recipiente plástico adentro de la
estructura, y el molde formador del gel en el centro del recipiente. Selle el
molde colocando un trozo de cinta adhesiva (masking tape) en ambos
extremos, y coloque el peine en la posición deseada.
2. Preparación del gel. Prepare un gel de agarosa al 1% (ó a la
concentración requerida) agregando 0.4 g de agarosa a 40 ml de buffer
TBE 0.5 X (o las proporciones equivalentes). Disuelva la agarosa en el
buffer calentando en el horno de microondas mezclando ocasionalmente
hasta hervir. Enfríe la solución hasta 50°C y agregue 2 µl de una solución
de bromuro de etidio (10 mg/ml). Vierta la solución de agarosa en el molde
formador y deje enfriar hasta su solidificación.
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3. Electroforesis. Remueva la cinta selladora del molde y retire el peine.
Vierta de 100 a 150 ml de buffer TBE 0.5X hasta cubrir 1 ó 2 mm por
encima del gel. Cargue las muestras en el fondo de los hoyos dejados por
los dientes del peine mezclando 5 µl de muestra con 1 µl de colorante azul
naranja. Cierre la cubierta y conéctela a la fuente de poder. Encienda la
fuente de poder hasta 64 volts dejando 5 minutos para luego subir a 100 V
por 30 minutos adicionales. Apague la fuente de poder y desconecte los
cables.
4. Observación del gel en luz UV y fotografía. Visualice el gel en el
transiluminador de luz UV. Evite la exposición directa de los ojos y la piel
utilizando la protección adecuada. Para documentar los resultados
anteriormente se utilizaba una cámara fotográfica instantánea con película
667 utilizando un filtro naranja, pero actualmente puede realizarse con
cualquier cámara digital ó un fotodocumentador de geles.
BIBLIOGRAFÍA
Sambrook, J., Fritsch, E.F., and Maniatis, T. 1989. Molecular Cloning: A
Laboratory Manual. 2nd Ed. Cold Spring harbor Laboratory Press.
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PRÁCTICA 3. PCR UNIVERSAL PARA EUCARIOTES
Y PLANTAS
INTRODUCCIÓN
Los organismos de las diferentes ramas evolutivas provienen de ancestros
comunes de los que han ido divergiendo para progresivamente formar los grupos
que actualmente conocemos como reino, división, clase, orden, familia, género,
especie, variedad, etc. Entre los organismos existen secuencias de ADN
homólogas las cuales han sido conservadas durante el proceso evolutivo y
denotan orígenes comunes. Esta homología ha sido la base para los estudios
taxonómicos, filogenéticos y evolutivos, así como para el diseño de primers
capaces de unirse a secuencias de ADN de organismos aparentemente distantes.
Los genes de los ARN ribosomales eucariotes 18S, 5.8S y 28S son fácilmente
aislados ya que son moderadamente repetitivos y son un atractivo blanco para los
ensayos de PCR. Las secuencias de estos genes ribosomales se encuentran
altamente conservadas y están separadas por dos espacios transcritos internos ó
ITS las cuales son regiones variables entre organismos. Las secuencias más
conservadas se utilizan para la clasificación de niveles taxonómicos superiores (de
género a división), mientras que las secuencias ITS se utilizan a nivel de especie ó
inferior.
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técnicas basadas en la amplificación enzimática de ADN.
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OBJETIVO ESPECÍFICO
Amplificación in vitro de ADN de muestras vegetales, animales y microbianas
utilizando primers universales y genéricos.
MATERIALES
Consumibles, reactivos y equipo
Tubos de centrifuga de 0.5 y 0.2 ml
Puntillas para micropipeta
Micropipetas
ADN molde
Buffer de PCR
MgCl2
Desoxinucleótidos trifosfatados (dNTP’s)
Oligonucleótidos sintéticos (primers)
Taq ADN polimerasa
Agua grado Mili-Q (18 mohms, libre de nucleasas)
Termociclador
Se realizarán un número variable de reacciones de PCR utilizando el ADN
obtenido por los estudiantes en la práctica anterior, además de un testigo negativo
(sin ADN) siguiendo el procedimiento descrito a continuación. En los siguientes
pasos observe las siguientes recomendaciones: para evitar contaminar las
soluciones, asegúrese cambiar la puntilla de la micropipeta cada vez,
asegurándose de no rozar la puntilla con ningún objeto, evitar movimientos
bruscos que produzcan corrientes de aire. Evite platicar, estornudar ó cualquier
acción que produzca aerosoles. Las soluciones que van a trabajar son muy
delicadas, así que no olvide mantenerlas siempre en hielo.
En un tubo de centrifuga de 0.5 ml se preparará un coctel (mezcla) con los
siguientes reactivos en solución:
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Reactivo/solución Cantidad unitaria
(µl)
Volumen
total (µl)
Concentración
final
Buffer de PCR 5X 5 1X
MgCl2 25 mM 2 2.5 mM
dNTP’s (2.5 mM) 2 0.2 mM
Primer antisentido (10 µM) 2 20 pmoles
Primer sentido (10 µM) 2 20 pmoles
Go Taq DNA polimerasa (5u/µl) 0.2 1 unidad
Agua grado Mili-Q 9.8 25 �L
Mezclar el coctel y distribuir 23 µl de la mezcla en tubos de 0.2 µl. Agregar 2 µl de
ADN. Mezclar y dar un “golpe” de centrifuga en caso de ser necesario. Colocar las
muestras en el termociclador con los programas ITS y Plantas.
Los primers que se utilizarán y sus secuencias son las siguientes:
a) 16S-anti/16S-sen
b) ITS-1/ITS-2 (Nazar y cols., 1991)
Nombre del primer Secuencia Blanco C015-04 (ITS-1) 5’-caa ggt ttc cgt agg tg-3’ Eucariotes C021-01 (ITS-2) 5’-cgc tta ttg ata tgc tt-3’ Eucariotes 16S sentido 5’-tga gaa tgg ata aga ggc tc-3’ DNA cloroplasto 16S antisentido 5’-tgt tgt tcc cct ccc aag gg-3’ DNA cloroplasto
El programa térmico ITS consiste en lo siguiente:
94ºC 1 minuto
94-48-74 durante 30”-50”-80” 34 ciclos
74ºC 4 minutos
El programa térmico Plantas consiste en lo siguiente:
92ºC 1 minuto
92-60-74 durante 60”-20”-30” 35 ciclos
74ºC 4 minutos
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Al término de la reacción (2 horas 3 min/1 hora 35 min), se carga un gel de
agarosa al 1% previamente teñido con 0.5 µg µl-1 de bromuro de etidio, con 10 µl
del producto amplificado (incluyendo el testigo negativo) y un marcador de peso
molecular (ladder 100). El fragmento esperado es de 330 pb para Plantas y 690
para ITS. Se observa el resultado en un transiluminador de luz UV y se toma una
fotografía.
BIBLIOGRAFÍA
Nazar, R.N., X. Hu, J. Schmide, D. Gelham, and J. Robb. 1991. Potential use of
PCR amplified ribosomal intergenic sequences in detection and differentiation
of Verticilum wilt pathogens. Physiol. and Mol. Plant Pathol. 39:1-11.
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