lhkpk'a en inmunoquimica
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UNIVERSIDAD AUTONOMA METROPOLITANA
UNIDAD IZTAPALAPA
CIENCIAS BIOLOGICAS Y DE LA SALUD
LICENCIATURA EN BIOLOGlA EXPERIMENTAL
JUAN DANIEL DIAZ VALENCIA
MATRICULA: 91236112
TELEFONO: 756 O1 83
TRIMESTRE LECTIVO:
PROYECTO: "ANALISIS DE LA EWRESION DE ARN MENSAJERO DE CITOCINAS EN CELULAS HUMANAS DE SANGRE PERIFERICA".
CENTRO MEDICO NACIONAL SIGLO X X I EOSPITAL DE ESPECIALIDADES "DR BERNARDO SEPULVEDA"
UNIDAD DE INVESTIGACION MEDICA EN INMUNOQUIMICA INSTITUTO MEXICANO DEL SEGURO SOCIAL
ASESOR EXTERNO: D UA SOLIS INVESTIGA
UNIDAD DE INVESTIGACION lhkPk'A EN INMUNOQUIMICA
ANDO SERRANO MPO COMPLETO
DEPTO. DE CIENCIAS DE LA SALUD
INICIO: 4 DE ABRIL DE 1997
TERMINACION: 4 DE OCTUBRE DE 1997
HORAS A LA SEMANA: 20
CLAVE:
ANALISIS DE LA EXPRESION DEL ARN MENSAJERO DE CITOCINAS EN
CELULAS HUMANAS DE SANGRE PERIFERICA
INTRODUCCION
La sepsis y el choque séptico son síndromes clínicos que pueden ser
desencadenados por bacterias gram-negativas, bacterias gram-positivas y hongos
(I). La sepsis se caracteriza como una respuesta sistémica a la infección
manifestada por taquicardia, taquipnea, cambios en la temperatura (fiebre o
hipotermia), leucopenia o leucocitosis. Por otro lado, el choque séptico se define
como una sepsis severa acompañada de hipotensión. Sin embargo los pacientes
con sepsis pueden tener uno o varios signos y síntomas de sepsis, pero no hay
ningún parámetro fisiológico o de laboratorio que pueda identificar universalmente
este síndrome (2, 4-6, 19, 52, 53). AI inicio del 2000 se realizó una conferencia
consenso (4) donde son definidos cada uno de los síndromes relacionados a la
sepsis, así como la sepsis misma. Se describe como un Síndrome de Respuesta
lnflamatoria Sistémica (SRIS) causada por Infección, con criterios diagnósticos
tales como: signos clínicos de infección, fiebre o hipotermia, taquipnea,
taquicardia, hipoxemia, oliguria, frecuencia respiratoria mayor de 20/min y con
una cuenta leucocitaria mayor de 12 O00 cels/ml (4). De 10s pacientes con
diagnóstico clínico de sepsis un 40-65% tienen hemocultivo positivo y solamente
a un 65 a 85% se les aísla un microorganismo de la sangre, en dicho caso 50%
de 10s gérmenes son gram-negativos, 40% gram-positivos y 5% son hongos. De
tal manera que no es necesario que se presente bacteremia, pues las toxinas
pueden causar la misma sintomatología descrita anteriormente ( 5, 21, 30, 31).
FISIOPATOLOGIA.
La respuesta inflamatoria del huésped a la infección contribuye en forma
importante al desarrollo del choque séptico. Los productos tóxicos bacterianos
presentes en la circulación activan las defensas sistémicas del huésped,
incluyendo tanto factores del plasma como la cascada del complemento (55) y los
componentes de la coagulación; así como neutrófilos, monocitos, macrófagos o
células endoteliales. Las células activadas producen mediadores potencialmente
tóxicos para el huésped: citocinas tales como el factor de necrosis tumoral (TNF),
inteleucina 1 (IL-I ), cininas, derivados del ácido araquidónico, factor activador de
plaquetas y óxido nítrico ( 20, 32-34, 44). Todos estos mediadores aumentan la
respuesta inflamatoria hasta perpetuarla y la ausencia de un equilibrio entre los
componentes inflamatorios y antiinflamatorios del huésped puede generar
choque, falla orgánica múltiple y muerte (1-4, 40).
En el establecimiento de la sepsis intervienen muchos factores, por lo que es
difícil hallar un mediador o mediadores responsables directos del padecimiento,
por lo tanto sería importante encontrar un mediador central que permitiera el
desarrollo de tratamientos más efectivos. Con respecto a lo anterior, los hallazgos
más recientes nos llevan a pensar que la acción de citocinas tales como IL-lp, IL-
6, IL-8, IL-12, IFNy y en especial el factor de necrosis tumoral a (TNFa) ( 23, 29,
38, 39, 43, 48) juegan un papel central en la fisiopatología de la sepsis y la
generación del síndrome de respuesta inflamatoria sistémica (SRIS) (7).
2
En 1997, Bone ( 8-12) describe una nueva hipótesis en la patogénia del SRIS. En
ella describe 5 estadios:
Estadio I .- Ante una infección, lesión traumática (incluyendo lesiones
quirúrgicas), lesión por quemadura, pancreatitis, se presenta una respuesta local
pro y anti inflamatoria fisiológica, con el fin de limitar la lesión.
Estadio 2.- Si la lesión original es severa, aparece una reacción
proinflamatoria sistémica. Los mediadores proinflamatorios, en especial las
citocinas reclutan neutrófilos, linfocitos T, linfocitos B y macrófagos en el sitio de
la lesión, esta cascada estimula a su vez una respuesta antiinflamatoria sistémica
que rápidamente regula la respuesta proinflamatoria, con pocos o ningún signos y
síntomas.
Estadio 3.- Hay pérdida de la regulación de la respuesta proinflamatoria
sistémica, estableciéndose el SRIS o síndrome de respuesta inflamatoria
sistémica, que está constituido por la disfunción progresiva del endotelio,
generando un aumento de la permeabilidad microvascular con agregación de
plaquetas que bloquean la microcirculación, esto produce una mala distribución
del flujo sanguíneo con posible isquémia, esto a su vez puede causar lesión por
reperfusión. Como consecuencia de lo anterior hay inducción de proteínas de
choque térmico, activación del sistema de coagulación e inhibición de 10s
3
mecanismos fisiológicos de la anticoagulación, profunda vasodilatación,
transudación y mala distribución del flujo sanguíneo que pueden conducir al
choque. Finalmente, puede haber falla orgánica con coagulación vascular
generalizada que puede conducir a la muerte si la homeostasis no se restablece.
Estadio 4.- Muchos pacientes con respuesta proinflamatoria SistémiCa
masiva que no mueren en el estadio previo pueden ser capaces de controlar esta
fase con una respuesta antiinflamatoria, sin embargo, está puede ser tan excesiva
como la proinflamatoria, conduciendo finalmente a una inmunosupresión. Los
pacientes que nunca han tenido una respuesta inflamatoria masiva, también
pueden presentar una respuesta antiinflamatoria excesiva desarrollando
inmunosupresión, algunos autores han denominado a la inmunosupresión
"parálisis inmune" o "ventana de inmunodeficiencia" (42). Bone denomina a esta
fase SRAC o Síndrome de Respuesta Antiinflamatoria Compensatoria. En este
síndrome existe mayor susceptibilidad a infecciones y anérgia (8), aumento en el
número de monocitos con una reducción persistente en los antígenos HLA- DR y
HLA-DQ (14, 23-28, 37, 54), disminución en la capacidad de formación de
especies reactivas del oxígeno y citocinas proinflamatorias. La IL-10 ( 25, 36, 45,
50, 51) y el factor de crecimiento transformante-p (TGF-p) inhiben la proliferación
de linfocitos T- antígeno-específicos, así como también suprimen la expresión en
superficie de moléculas de histocompatibilidad clase II en monocitos.
4
Estadio 5.- El estadio final se denomina "disonancia inmunológica" y puede tomar
varias formas, una de ellas puede oscilar entre períodos de severa inflamación y
severa inmunosupresión, durante esta etapa se puede presentar una infección
secundaria que inducira a otra respuesta proinflamatoria seguida por otra
antiinflamatoria, la presencia de citocinas proinflamatorias y antiinflamatorias a un
mismo tiempo en el huésped de esta manera, continuar perpetuándose este
problema hasta la muerte. Mantener este balance entre reacciones pro- y anti-
inflamatorias es crucial para regular y limitar el alcance de SIRIS y SRAC y
consolidar finalmente la homeóstasis
Un antecedente importante en el cual un tratamiento específico ha dado buenos
resultados, es el caso del tratamiento que se hizo con interferon gamma en
pacientes en los cuales se pudo reconocer la fase precisa en la que se
encuentran pues en forma indirecta y a través de la disminución de la expresión
de moléculas de clase II se reconoció que estaban en SRAC ( 24, 46).
5
OBJETIVO GENERAL
Describir el patrón de citocinas presentes en células humanas de sangre
periférica entre individuos normales y pacientes con sepsis y analizar su relación
con el estadio de la respuesta inflamatoria a la infección en cada paciente.
OBJETIVOS ESPECIFICOS
Establecer criterios de selección de pacientes en choque séptico y personas
normales.
Detección por Reacción en Cadena de la Polimerasa-Transcripción Inversa (RT-
PCR) de los ARNm de citocinas presentes en células humanas de sangre
periférica.
Detección y cuantificación de citocinas en suero de individuos normales y
pacientes en choque séptico, por ensayos enzimáticos inmunoabsorbentes
(ELSA).
Caracterizar el perfil de citocinas presente en cada sujeto de estudio para
determinar patron pro-inflamatorio o anti-inflamatorio.
Análisis de los perfiles de citocinas a nivel de expresión genética y proteína en
suero y su relación con la condición de los pacientes.
6
METODOLOGIA
Criterios para la Inclusión de Pacientesterios de Inclusión
1. Pacientes con los diagnósticos de sepsis, sepsis grave y choque séptico
(16, 22, 35, 49), admitidos en la Unidad de Cuidados Intensivos del HE
CMN SIGLLO XXI, de acuerdo a la siguiente tabla:
Definiciones operacionales de los síndromes relacionados a la sepsis ( 2, 3)
TERMINO CRITERIOS DIAGNOSTICOS DEFlNlClON
INFECCION CULTIVO POSITIVO FENOMENO MICROBIAN0
CARACTERIZADO POR UNA
RESPUESTA INFLAMATORIA
SECUNDARIA A LA INVACION DE
MICROORGANISMOS EN SITIOS
NORMALMENTE ESTERILES
BACTEREMIA HEMOCULTIVO POSITIVO PRESENCIA DE MICROORGANISMOS
EN HEMOCULTIVOS
SINDROME DE 2 o mas de los siguientes: RESPUESTA INFLAMATORIA
RESPUESTAINFLAMATORIA
-FC > 90 LATIDOSlrnin. INFECCION, PANCREATITIS, ISQUEMIA SlSTEMlCA
-TEMPERATURA C 36 C ; > 38 SlSTEMlCA CAUSADA POR:
O TRAUMA MULTIPLE -FR > 20/min
-LEUCOCITOS > 12000, < 4000/1
SEPSIS Cultivo positivo RESPUESTA INFLAMATORIA
SlSTEMlCA CAUSADA POR UNA
INFECCION
SEPSIS GRAVE ACIDOSIS LACTICA, OLIGURIA, SEPSIS ASOCIADA CON DISFUNCION
ORGANICA, ANORMALIDADES DE LA PERFUSION TISULAR O HIPOTENSION
CONFUSION MENTAL E HIPOTENSION
CHOQUE SEPTIC0
RESPUESTA A LA ADMlNlSTRAClON
ESTADO ANTERIOR MAS UNA MALA
VASOPRESORES
DE LlQUlDOS Y AGENTES
SINDROME DE FALLA ORGANICA ESTADO ANTERIOR CON EL
MULTIPLE COMPROMISO DE 2 O MAS ORGANOS
VITALES, COMO RESULTADO DEL
CHOQUE SEPTIC0
7
1. Edad de 16 a 65 años.
2. Inicio del padecimiento (sepsis) máximo de 24 hrs.
3. Inicio de la terapia antimicrobiana menor a 24 hrs.
4. Inicio del padecimiento (sepsis) máximo de 24 hrs.
5. Inicio de la terapia antimicrobiana menor a 24 hrs.
Criterios de NO Inclusión.
1.
2.
3.
4.
5.
6.
Pacientes que no cumplan los criterios anteriores.
Portadores de enfermedades que comprometan la inmunidad
(inmunodeficiencias primarias y adquiridas).
Pacientes portadores de insuficiencia renal crónica.
Pacientes bajo tratamiento con factores estimulantes de colonias o
cualquier otra citocina.
Pacientes bajo tratamiento con inmunomoduladores.
Pacientes bajo tratamiento con glucocorticoides o inmunosupresores
. Criterios de eliminación.
1. Pacientes que tengan una coinfección por gérmenes gram-positivos,
negativos u hongos.
2. Pacientes en los que no se logre aislar el germen causal.
3. Pacientes en los que no se complete el estudio.
8
Toma de Muestras
Se extrajeron 5 ml de sangre periférica por punción directa con vacutainer en
tubos que contienen EDTA como anticoagulante. Para el aislamiento de células
mononucleares se mezclaron volúmenes iguales de sangre con solución salina
estéril 0.9%, adicionar 3 ml de Ficoll- Paque (Pharmacia Biotech) en el fondo de
un tubo de polipropileno de 15 ml y formo un gradiente agregando 1 O ml de la
mezcla sangre-solución salina, se centrifugo a 2000 rpm (revoluciones por
minuto) (Sorvall RT6000D) 20 min. a temperatura ambiente. Se recupero la
interfase con pipeta Pasteur estéril, esta interfase contenia las células
mononucleares. Se lavaron las células mononucleares con 5 ml de solución salina
al 0.9% y centrifugo a 1500 rpm, 10 min. t.a.; se elimino el sobrenadante y
resuspendio el paquete celular en 5 ml. de solución salina, se repitio el lavado y
desecho el sobrenadante. Se resuspendio el paquete celular en 3 ml de solución
salina. Se realizo el conteo celular en cámara de Neubauer (American Optical
Scientific Instrument Division), el número obtenido se incorporo en la siguiente
fórmula:
#Células Totales/4= R*100000= X células/ml
Este nuevo número se multiplico por 3 para obtener el número de células del
volumen total. Se centrifugo a 1500 rpm, 5 min, se desecho el sobrenadante.
Para iniciar el análisis, se aislo el mRNA total, para lo cual se utilizo el método de
aislamiento de ARN en un solo paso desarrollado por Chomczynski y Sacchi ( 18).
9
Aislamiento de ARN
Se centrifugo a 1500 rpm por 5 min, desecho el sobrenadante y agrego TRIZOL
(Gibco-BRL/Life Technologies), 1000 pI por 5x106 células, se disolvio la pastilla
por pipeteo e incubo por 10 min a T.A.; transcurrido el tiempo, se agrego
cloroformo CHCl3 (Merck), 200 pl por 1000 pI de TRIZOL, se agito 30” en vortex,
enseguida, se incubo 3 min. a T.A. y se centrifugo a 14000 rpm por 15 min
(Eppendorf Centrifuge 5415C). A continuación se recupero la fase acuosa
(contiene el ARN) y se agrego Isopropanol (Merck), 500pl por 1OOOpl de TRIZOL,
se agito 30” en vortex, enseguida se incubo 10 min t.a. y centrifugar a 14000 rpm
por 15 min. Transcurrido el tiempo, se desecho el sobrernadante y se agrego
etanol al 70% (Mallinckrodt), 1000 pI por 1000 pl de TRIZOL, se centrifugo 5 min
a 14000 rpm, posteriormente se retiro el sobrenadante y se colocaron los tubos
en un concentrador (HETO VAJ VR-1/120/240) por 20 min para secar el ARN y
se almaceno a -70°C hasta el día que se realizo el RT-PCR.
Cuantificación de ARN
Se resuspendio la muestra de ARN con 35 pI de agua estéril y calento a 60°C por
30 min. Posteriormente se cuantifico el ARN haciendo una dilución 1 :IO0 (5 pI de
ARN más 495pl de agua estéril). Se registro la D.O. de la dilución a 260nm y
280nm (Spectrophotometer Beckman DU640). El ARN restante se mantuvo en
hielo. Para cuantificar el ARN, se introdujo el valor de la D.O. a 260 nm en la
siguiente fórmula:
x 40 x I00 = X pg/ml(l m1/1000pl) = Ypg/pI
10
Para determinar el grado de pureza del ARN, se realizo el cociente
A260IA280 = 1.8-2.0
siendo los valores anteriores indicadores de ARN libre de proteínas
Para realizar la Reverso Transcripción (RT), se requirió de un mínimo de 1 pg de
ARN ( 13, 47). Se calentó el ARN 5 minutos a 70°C antes de agregarlo a la
mezcla de RT.
Transcripción Inversa
Los componentes para la mezcla de RT para cada tubo a utilizar son:
Desoxinucle6tidos Trifosfatados (Boehringer Mannheim)
MgC12 (Boehringer Mannheim)
Buffer RT (Boehringer Mannheim)
lnhibidor de RNAsas (Boehringer Mannheim)
Transcriptasa Reversa AMV (Boehringer Mannheim)
Hexanucleótidos (Boehringer Mannheim)
ARN
Agua estéril
10 mM 2Pl
25 mM 4Pl
5x 4Pl
Dilución 1 :40 1 PI
Dilución 1:lO de la IpM, 25 u/pl 2pl
Stock 1OX concentrado 2Pl
1Pg
llevar hasta 20pl
Se incubaron los tubos con mezcla de RT 60 min. a 42°C y posteriormente 3 min.
a 95°C.
11
Reacción en Cadena de la Polimerasa
Para realizar la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR), se colocaron en
tubos eppendorf de 0.5 ml, los siguientes componentes de la mezcla de reacción
para PCR:
MgC12 25 mM (Boehringer Mannheim)
Buffer PCR 10 x (Boehringer Mannheim)
Taq DNA Pol 1 U/pI (Boehringer Mannheim)
Iniciador 3’ (NBU
ADNc 20 pI
Agua estkril 57pl
12
A continuación las secuencias de los iniciadores específicos para cada citocina
Iniciador
IL-IO (5') (3')
IL-12 (5') (3')
TNF-a( 5') (3')
1FN-y (5') (3')
p-actina(5')
Secuencia (5'+3')
AAGCTGAGAACCAAGACCCAGACATCAA 350 ATAAGGTTTCTCAAGGGGCTGGGTCAG
TACTCCTTGTTGTCCCCTCTG GTGGCCATATGGGAACTGAAG
420
ATGAGCACTGAAAGCATGATC 702 TCACAGGGCAATGATCCCAAAGTAGACC
ATGAAATATACAAGTTATATCTTGGCTTT 493 GATGCTCTTCGACCTCGAAAC
GTGGGGCGCCCCAGGCACCA 548 (3') CTCCTTAATGTCACGCACGATTTC
JOURNAL OF IMMUNOLOGY 1993; 150: 39-47.
13
El ADN complementario se calentó durante 5 minutos a 70°C antes de
incorporarse a la mezcla de PCR. Los tubos se colocaron en el termociclador
(Techne, Progene FPROGOSY) programado para las siguientes condiciones:
DESNATURALIZACION 30” 94°C
ALINEAMIENTO 60” 58°C
EXTENSION 90” 72°C
40 CICLOS
I I Los productos de PCR se cargaron en geles de agarosa (Pronadisa, H0503196) a
2%, preparada con TBE 1X y 3 pl de bromuro de etídio (0.5 pg/mI), montados en
de electroforesis horizontal (CBS, MGU-IOOT) de 8 pozos en buffer TBE 1X y
utilizando marcadores de ADN de 50 pares de bases (pb) (1 pgIpI) (Gibco BRL).
Las imágenes de los geles se visualizaron y almacenaron en el Analizador de
Imágenes con software analizador de imágenes (IS-I O00 Alpha-lnnotech).
2 2 7 5 2 6 14
Detección de Citocinas en Suero de Pacientes y Sujetos Normales
Se determinó por duplicado la concentración de las citocinas pro-inflamatorias en
Suero mediante el método de ensayo inmunoenzimático E L M ( 15, 23, 28,38, 39,
50, 51), basado en la técnica inmunométrica cuantitativa de sandwich, utilizando
equipos comerciales (R&D Systems) para las citocinas TNF-a, IFN-y, IL-12 e IL-
I O . (13, 14).Se prepararon los reactivos de ensayo y estándares de trabajo. Se
colocaron placas de microtitulación con suficientes pozos que permitieron las
cuantificación de todas las muestras problema y estándares que se requirieron.
Se agrego 50pL de estándar o muestra por pozo por duplicado. Se agrego 50pl
del reactivo de anticuerpo biotinilado a todos los pozos utilizados. Se agregaron
50pL del diluyente de muestra apropiado a los pozos que no se utilizaron. Se
cubrio con cinta adhesiva cada placa e incubaron por 2 horas a T.A. (20-25°C).
Se decantaron y lavaron vigorosamente cada placa con buffer de lavado 3 veces,
se retiraron los restos del buffer de lavado secando la placa en posición invertida
con una toalla de papel limpio. Se agregaron 100 pL de conjugado estreptavidina-
HRP prediluido. Se cubrió cada placa e incubo por 30 minutos a T.A. (20-25°C).
Posteriormente se decanto y lavo cada placa 3 veces como ya se menciono. Se
agregaron 1OOpL de solución sustrato TMB por pozo e incubo por 30 minutos a
T.A. La placa permaneció en oscuridad. Se agregaron 1OOpL de la solución de
paro por pozo y se determino la D.O. a 450nm de cada placa a los 30 minutos
utilizando un lector de placas para ELlSA (MRX 11, DINEX Technologies). La
concentración de citocinas en muestras de pacientes se determinó interpolando el
15
promedio de las absorbancias por cada muestra dentro de la curva estándar
generada para cada citocina.
16
ACTIVIDADES REALIZADAS
Las actividades que realice hasta la conclusión del proyecto incluyeron el
monitoreo en la UCI del HE CMN SIGLO XXI de los posibles sujetos que
pudieran ingresar al estudio. Puse en practica las medidas de ética y
bioseguridad requeridas para el manejo de muestras potencialmente infecto-
contagiosas; aprendí el aislamiento y cultivo de células mononucleares de sangre
periférica, así como de la extracción, manejo y cuantificación de ARN total.
Estandarice la técnica de RT-PCR y los parámetros para su realización rutinaria.
Me entrene en la elaboración de géles de agarosa y las prácticas correctas para
el manejo y eliminación del bromuro de etidio; así como en la realización de
electroforesis en gel de agarosa y el análisis de los productos de RT-PCR en un
analizador de imágenes, con el correspondiente manejo del software que permite
la visualización, análisis y almacenamiento de las imágenes de los geles. Por otra
parte aprendí el manejo de equipos comerciales para la detección de citocinas en
suero, as;, como también el manejo adecuado del lector de placas para ELEA y la
interpretación y análisis de los resultados generados por este último equipo.
Finalmente, hice la comparación del estado clínico del paciente con el perfil de
citocinas que presento cada día de estudio y lo comparé con el perfil de citocinas
de sujetos sanos; para la elaboración del reporte final realice una búsqueda
bibliográfica la cuál presente las principales evidencias de la participación de
citocinas en diferentes enfermedades y síndromes inflamatorias y autoínmunes,
en un intento de proponer la posible relación de las citocinas en el desarrollo de
la sepsis, choque séptico y síndrome de respuesta inflamatoria sistémica (SRIS).
17
OBJETIVOS Y METAS ALCANZADOS
Al final de este trabajo se puede observar que se cumplieron los objetivos
planteados y entre las metas alcanzadas estan el aprendizaje y manejo de
técnicas actuales y de gran poder de sensibilidad y precisión, que resultan
indispensables y de gran utilidad para abordar problemas relacionados a la
salud y la biomedicina. Dado el impacto que tiene la incidencia de muertes
asociadas a la sepsis, choque séptico y síndrome de respuesta inflamatoria
sistémica (SIRIS) ( 30, 39, 41, 42, 48), el uso de las técnicas abordadas en este
estudio, hizo posible la posible la detección y caracterización de mediadores
proinflamatorios que como se establecera en los resultados y discusión son
fundamentales en la fisiopatología de la sepsis y SRIS. Realización. Otra de las
metas alcanzadas fue el manejo e integración de información generada en los
experimentos y adquirida por medio de la lectura de artículos relacionados con el
problema abordado.
227526 18
RESULTADOS
El proyecto fue aprobado por el comité ético del hospital y se obtuvo el
consentimiento de los pacientes o su familiar responsable. Ingresaron al estudio
4 pacientes, 4 hombres (75%) y una mujer (25%). Las edades de los pacientes
masculinos fueron: 75 años paciente 1; 72 años paciente 3; 39 años paciente 4.
Femenino 65 años paciente 2. Y 4 controles (individuos sanos).
Promedio de edad de la población: 57.8 años. Extremos de edades: 38-75 años.
Controles sanos: Sujetos de 25 a 60 años de edad sin antecedentes patológicos,
sanos durante el mes previo al estudio. Se tomaron muestras por un período
mínimo de tres días.
Antecedentes Patológicos de los pacientes.
Dentro de los antecedentes patológicos personales, se encontró que al momento
de ingreso a la UCI 20% de la población presentó diabetes; 40% presentó algún
tipo de enfermedad pulmonar; 40% presentó pancreatitis; 40% algún tipo de
enfermedad pulmonar; 20% enfermedad hepática; 40% enfermedad renal y 40%
hipertensión arterial.
19
Concentracidn de citocinas en suero de pacientes 1 y 2.
Paciente 1
2501 n - E 200- % CI) a cn Q c 'ii 100- O ' 50-
150-
.c,
+ IL-1 O (pg/ml) + IL-12 (pglml) -+ IFN-y (pg/ml) + TN F-a (pg/ml)
O 1 I I I I I I I I
O 1 2 3 4 5 6 7 8
Tiempo (días)
Paciente 2
2004
Y Q ,501
\
i
+" IL-10 (pg/ml) + IL-12 ( pg/ml) --t IFN-y (pg/ml) + TNF-a ( pg/ml)
O ! 1
O 1 2 3 4
Tiempo (días)
I I I
20
Concentración de citocinas en suero de pacientes 3 y 4.
Paciente 3
500-
E 400- 0 Q
v) Q r= O
'4
300-
'3 200-
100-
.cI
"t IL-I O (pglml) -M- IL-12 (pglml) -O- IFN-y (pglml) +I+ TN F-a ( pglml)
O 1 O 1 2 3 4 5 6 7 8 9
Tiempo (días)
Paciente 4
2000-1 T" f 1750-
3 1500-
1250- a v) 2 1000- .- $ 750-
G 500- *
- IL-10 (pglml) - IL-12 (pglml) - IFN-y (pglml) -+I+ TNF-a ( pglml)
I I I I I I I 1
O 1 2 3 4 5 6 7 8
Tiempo (días)
21
EXPRESIóN DE GENES DE ClTOClNAS EN CELULAS MONONUCLEARES DE SANGRE PERIFERICA ESTIMULADAS CON LPS 10 ng/mI
I 2 3
600 Db
5
I00 Db
l . P.M. 100pb 2. IFN-y 493 pb 3. TNF-a 702 pb 4. IL-4 255 pb 5. p-actina 548 pb
22
Las células mononucleares de todos los pacientes expresaron p-actina (control
positivo) (548 pb), TNF-a (702 pb), IFN-.)I (493 pb), IL-12 (420 pb) e IL-IO (350
pb), al igual que las células estimuladas con ionomicina (control de activación); la
magnitud de la expresión de cada citocina varió considerablemente entre cada
paciente. Por otro lado, las células mononucleares de los controles sanos solo
expresaron p-actina (548 pb), sin detectar ninguna de las citocinas antes
mencionadas en muestras de individuos sanos).
23
CONCLUSIONES
Entre las células mononucleares de sagre periférica, una población de gran
importancia son los monocitos, estos intervienen en muchos procesos incluyendo
la inmunidad medida por células, presentación de antígenos, fagocitósis,
destrucción de microorganismos, producción de citocinas, etc. La expresión de
moléculas clase II del complejo principal de hístocompatibilidad con el péptido
procesado es necesario para que sea presentado al linfocito T; su expresión está
regulada en parte por IFN-y, TNF-a, IL-12 e IL-IO; de estos monocitos de sangre
periférica aproximadamente el 80% expresan HLA-DR.
Pacientes en SRlS cualquiera que sea la causa, pueden progresar hasta la falla
orgánica múltiple con coagulación intravascular diseminada y muerte; sin
embargo otros pacientes tienen una respuesta contraria al SRlS y responden con
síndrome de respuesta antiinflamatoria compensatoria (SRAC); durante esta fase
las citocinas anti-inflamatorias tipo IL-10 predominan por lo que inhiben
secundariamente la producción de TNF-a, IFN-y, etc. La producción deprimida de
IFNy conlleva a la disminución en la expresión de moléculas de clase II en
monocitos, lo que a su vez aumenta la susceptibilidad a infecciones secundarias
en este tipo de pacientes: La infección secundaria agregada en estas condiciones
puede en un principio contra restar el SRAC y tratar de llevar al paciente a la
homeostasis; sin embargo cuando los pacientes han permanecido con cambios
alternos de SRlS Y SRAC pueden perder todo control llegando a la disonancia
24
inmunológica diseminada o síndrome de respuesta de antagonistas mezclados
(SRAM) la cual esta constituida por una mezcla de SRlS y SRAC.
Aun cuando el número de pacientes que se estudiaron fueron muy pocos. Con los
resultados que se obtuvieron se puede señalar que en 3 de ellos hay una
tendencia a MARS pues no existe una correlación entre los criterios pro-
inflamatorios como el IFNy, IL-12 y TNF-a; y anti-inflamatorios como IL-IO ( 10-
12). Ya que en el paciente 4 se encontró que la única interleucina que esta
aumentada en relación con las otras tres fue el TNF-a. En el paciente 3 se
observo una elevación en los niveles de IL-IO por lo que probablemente en este
curso tenemos un Síndrome de respuesta antiinflamatoria compensatoria (SRAC).
El nivel de expresión de genes de citocinas puede depender del grado de
activación celular en cada paciente aunque en los pacientes 1, 2 y 4 no se pudo
correlacionar con el estado clínico y tipo de evolución del paciente. En cambio en
el paciente 3 como ya se dijo, existe una probable relación entre los niveles muy
elevados en la concentración de IL-IO y la susceptibilidad a reinfección que
presento el paciente y que es característico de un SRAC.
Dado que la presencia de citocinas aisladas no puede explicar completamente la
evolución y pronóstico de los pacientes estudiados, probablemente lo permita
explicar el conjunto de eventos moleculares que ocurren durante la sepsis,
choque séptico, síndrome de respuesta inflamatoria sistémica y síndrome de
respuesta antiinflamatoria compensatoria.
25
Los estudios más recientes indican que no solo la producción de citocinas pro-
inflamatorias es importante, sino también el balance entre los mediadores pro-
inflamatorios y anti-inflamatorios.
26
CRITERIOS DE EVALUACION
Se evaluaron los conocimientos adquiridos y el desempeño en el laboratorio
mediante la presentación de seminarios de avance en los cuales se presentaron
los resultados generados en base a los objetivos planteados, así como también
en la elaboración del reporte final y presentación del trabajo en la reunión anual
de investigación del IMSS.
27
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