klonlama markerları

KLONLAMADA KULLANILAN MARKERLAREzgi Salmanlı, DVM, PhD cand.

Klonlamanın aşamaları

RE ile DNA fragmentasyonu DNA fragmentlerinin vektöre ligasyonu Transformasyon Rekombinantların seleksiyonu ve

görüntülenmesi

Ligasyondan sonra tüm vektörler insert içermeyebilir

Uygun kombinasyondaki insert’i içeren hücrelerin seleksiyon ve görüntülenmesi ;

Antibiyotik direnci Lethal gen Color selection markers (genetic

screening) Blue-white screening Green Fluorescent Protein (GFP)

Blue-White Screening GOI’i vektör içindeki dogru ligasyonunu

görüntülemeye izin verir En yaygın metod LacZ, b-galactosidase kodlar.MCS içine inserte edilmişDNA LacZ’i inaktive eder.

X-gal , modifiye galaktoz

X-gal, B-galaktosidaz, 5-bromo-4-chloroindoxyl, oksidasyon MAVİ KOLONİ

X-gal metabolize edemeyen hücreler , BEYAZ KOLONİ

Green Fluorescent Protein Aequorea victoria Bakteride eksprese olduğunda UV

altında yeşil koloni

Letal gen ccdA-ccdB ccdB geni,lethal,sitotoksik 101 aa’lik proteini

kodlar,MCS ccdA, negatif regulasyon Böyle bir plasmidin bakteriye transformasyonu

bakterinin üremesini bloke eder İnsersiyon varsa ccdB geni inaktive olur Background minimum Sadece insersiye olmus hücreler ürer

pKIL pZERO

Antibiyotik direnci Hemen tüm vektörlerde var Bazi E.coli’ler kendiliğinden ab dirençli

Ampisillin(ampR)B-lactamase,Bla geni

Kanamisin(KmR)Streptomisin(SmR)**Cloramphenicol(cmR)

Replica Plating