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Reações de Aglutinação e Precipitação

Pesquisa e quantificação de antígeno (Ag) e anticorpo (Ac)

• Dosagem de hormônios (T3, T4, TSH, etc.) e drogas

• Diagnóstico e acompanhamento de doenças infecciosas (pesquisa de Ag ou Ac)

• Entre outras aplicações.....

Perfil de anticorpos na rubéola

Hepatite por HBV

Diagnóstico e acompanhamento: pesquisa de Ags

virais e de Ac contra o vírus

Sensibilidade analítica

• É a menor quantidade do elemento em análise que o teste é capaz de detectar

• PSA Ultrassensível Sensibilidade – 0,003 ng/mL

• PSA: antígeno prostático específico: diagnóstico precoce e acompanhamento de alterações prostáticas

Especificidade Analítica

• Capacidade do teste de detectar apenas o analito em questão, sem reações cruzadas

• Fatores que levam a resultado falso-positivo:

–Presença de anticorpos naturais

–Poli infecções

o Anticorpos naturais

o Presentes em indivíduos sadios

o IgM que reage com polissacarídeos e lipídeos

Reação Cruzada

capacidade de um Ac produzido contra um Ag de se ligar a outros Ag estruturalmente semelhantes

• Ex: soro de pacientes com leishmaniose pode apresentar reação com Ag de Trypanosoma cruzi

Reação de Aglutinação

• Feita em: lâmina, tubo ou placa de microtitulação

• Reação com partículas insolúveis

• Fatores interferentes: classe de Ac, tempo, temperatura, presença de macromoléculas (ex.: albumina)

1 – Reação de aglutinação direta

• Pesquisa de Ag que faz parte naturalmente da célula (ou hemácia)

• Exemplos:

• Determinação de Ag de grupo sanguíneo dos sistemas ABO e Rh nas hemácias

Pesquisa de Ag na superfície das hemácias

• Pesquisa de Ag do sistema ABO e Rh

1 – Reação de aglutinação direta

• Pesquisa de Ac contra bactérias em amostras de soro

• Exemplos: Ac contre Leptospira, Brucela

2 – Reação de aglutinação indireta ou passiva

• Ag ou Ac não faz parte da partícula

• Exemplo:

• partículas de látex com Ac ou Ag adsorvido

• hemácias de aves com Ag de microrganismos (hemoaglutinação)

Reação de aglutinação de partículas de látex

• Exemplo: látex para Proteína C reativa (PCR), fator reumatoide ou para Ac anti-estreptolisina O (ASO, AEO)

• Kit de látex-PCR: usa partículas de látex com anticorpo anti PCR

• Kit de látex-ASO: usa partículas de látex com um Ag: estreptolisina O (obtida do Streptococcus)

Aglutinação de látex

Aglutinação passiva usando hemácias (hemo aglutinação)

• Hemácias sensibilizadas com Ag do micróbio

• Classe de Ac detectados (detecta todas as classes de Ac)

• Aplicações: sorologia para Ac anti-Toxoplasma gondii

• Usa hemácias sensibilizadas com Ag de Toxoplasma gondii

Reação de hemoaglutinação

3- Reação de Floculação

• VDRL (Venereal Disease Research Laboratory): • Triagem e controle de tratamento da sífilis

• Antígeno usado: cristais de colesterol, cardiolipina e lecitina

• Pesquisa Ac anti cardiolipina

Placa de Kline

VDRL

Síndrome do anticorpo anti fosfolipídio

• Organismo produz anticorpos que levam à formação de trombos

• Causa importante de abortos repetidos

Reação de Precipitação

•Ag e Ac são inicialmente solúveis

•Detecta precipitados

Pesquisa de crio globulinas (precipitação simples)

- crio globulinas em paciente com hepatite C

*** Crio globulinas: Ac que precipitam em temperaturas baixas

1 - Imunodifusão

• A precipitação ocorre em meio gelificado (gel de ágar ou agarose)

• Classificação: simples e dupla

Imunodifusão radial simples

• Anticorpo específico é incorporado à solução de ágar ou agarose antes da gelificação

• Aplicações: classes e subclasses de Ig, proteínas do complemento, proteína C reativa – PCR

Determinação da concentração de Ag por imunodifusão radial simples

Nos orifícios 1 a 12 acrescentar amostra de pacientes onde

se pesquisa Ag (ou Ac) ou padrão em diferentes concentrações

Como determinar a concentração do analito??

• Fazer curva com pelo menos 3 concentrações conhecidas do padrão para determinação da concentração do analito

Pesquisa de imunoglobulinas

• Diagnóstico de infecção

Diagnóstico de infecções intrauterinas (rubéola):

• pesquisar IgM no feto ou recém nascido

• Diagnóstico de câncer de células do sistema imune: mieloma múltiplo (↑ de IgG em grande parte de casos)

• Diagnóstico de alergia (pesquisa de IgE)

• Diagnóstico de imunodeficiências

IgM para diagnóstico de rubéola congênita (pré-natal)

Imunoglobulinas e idade

- Caracterizada por eczema, púrpura trombocitopênica e susceptibilidade a

infecções, frequentemente ocorre aumento de IgA e IgE

Eczema generalizado e infecção

secundária da pele

Imunodifusão radial dupla

• Antissoro e amostra são adicionados a orifícios

diferentes do gel de ágar (não são incorporados no ágar)

Imunoeletroforese (eletroforese seguida de imunodifusão)

Etapas:

1º Eletroforese de proteínas

• Separação das proteínas do soro do paciente de acordo com a carga em gel de agar ou agarose

Proteínas presentes no plasma sanguíneo

Frações

--------------globulinas----------------

Alterações no nível de algumas proteínas podem não provocar

alteração na eletroforese

Eletroforese de Proteínas

Imunoeletroforese

Imunofixação • Mais sensível e rápida que a imuno eletroforese

• Amostra é aplicada em 6 posições diferentes no gel de agarose e proteínas da amostra são fracionadas

• Soros mono-específicos (anti-IgG, anti-IgA) impregnados em fita de papel são aplicados em cada posição e difundem no gel

• Adicionar solução fixadora de proteínas

Detecção de Ag e Ac em reações de aglutinação e precipitação

• Vários fatores físico químicos e imunológicos interferem na ocorrência e visualização da reação Ag-Ac

• O máximo de precipitação (ou aglutinação) ocorre quando as quantidades de Ag e Ac são equivalentes

Curva de Precipitação

Pós zona Pró zona

• A concentração de Ac foi mantida fixa e adicionou-se concentrações crescente de Ag

Curva de Precipitação

• Se aplica também para os testes de aglutinação

A quantidade de Ac usada na técnica para detecção de um Ag interfere na sensibilidade da técnica?

Fenômeno (efeito) de pró-zona

• Ausência de reação detectável quando a quantidade de anticorpo presente numa amostra de soro é alta em relação à quantidade de antígeno usada no teste, gerando resultados falso-negativos

• Ex: altos títulos de Ac anti cardiolipina em paciente com sífilis

Onde estudar

• Imunoensaios – Fundamentos e Aplicações. VAZ, TAKEI, BUENO, 1ª edição, 2007

• Diagnóstico Laboratorial das Principais Doenças Infecciosas e Autoimunes – FERREIRA & MORAES, 3a edição, 2013

• Imunologia Clínica na Prática Médica – VOLTARELLI, DONADI, CARVALHO, ARRUDA, LOUZADA JR, SARTI, 1ª edição, 2008