igazságügyi genetika alapjai -...

Igazságügyi genetika alapjai

Molekuláris orvostudomány -

molekuláris bűnjelek genetikai analízise

Pádár Zsolt

„Nyomok” - Death Valley, CA 2007 / 10 / 11

… vannak az ÉLET dolgai …

… és vannak ROSSZ dolgok az életben …… ezek egy részét mi tesszük …… másokat velünk tesznek meg …

… és vannak, amiről azt állítják, mi tettük meg …

… vannak, az életben NAGYON ROSSZ dolgok is …

… amiről azt gondoljuk, csak mással történhet meg …

Igazságügyi genetika

BŰNCSELEKMÉNYEK

Genetika

Transzmissziós genetikaMolekuláris genetikaPopuláció genetikaÖkológiai genetikaKvantitatív genetikaViselkedés genetikaKlinikai genetikaCitogenetikaMitokondriális genetikaGenomika…

forward genetikareverse genetikaevolúciógenetika -molekuláris taxonómiaepigenetikafarmakogenetikaigazságügyi genetikapatogenetikagenetikai informatikagénsebészet -genetic engineeringgenetikai etika…

JogtudományokKriminalisztikaOrvos-tudományokÁllatorvos-tudományok

2008. 11. 1. / 2009. 05. 04.

Az igazságügyi genetika …Genetika és jogtudománya gyermek tulajdonságai nem csupán a szülői tulajdonságok

összegződése „a tudomány csak eljárás, nem maga az igazság”

Alkalmazott tudományfizikai nyomok és anyagmaradványok vizsgálata molekuláris

genetikai technikák objektív alkalmazásával, ezáltal igazolva az adott bűncselekményt illetve az azzal fennálló kapcsolatot

eszköz, melynek segítségével a kriminalisztikai hipotézisek megerősíthetők avagy elvethetőkKölcsönös befolyás az alaptudományokramolekuláris genetikai módszerek alkalmazása, módosításaalaptudományokkal kapcsolatos követelmények módosítása új tudományos adatok szolgáltatása gazdasági, társadalmi fejlődésére, közösségekre és a

mindennapok emberére gyakorolt hatások

Szakkérdések …Humán vonatkozások

bűncselekményekemberölés, rablás, erőszakos közösülés …

vitatott szülőségleszármazás

rendkívüli halálrendkívüli szívhalál (SCD)

arrhythmiás szívhalál szindróma

hirtelen csecsemőhalál (SIDS)tömegszerencsétlenségek

áldozatok azonosítása

Szakkérdések …

Nem humán vonatkozásokállatok

kutyák, macskák, vadvilág…állatkínzás, állat támadások, vadorzás …

entomologiahalál időpontja, helye

növények és gombáklevelek, magvak …pollenek

Mikrobáktalajbaktériumok

Genetikai polimorfizmusok analízise

Recesszív gén hőmérséklet szenzitív expressziójaTYR gén ► tirozináz enzim ► melanin szintézis

Defektív tirozináz ► funkcióvesztés normál testhőmérsékleten

Első lépés - a helyszín …

„CSIUniversity ☺”

Vizsgálati komplexitás - „DNA investigation”

Azonosítás – identifikációEredet meghatározása - honnan származik az eredmény?

Azonosságok megállapítása – közös eredet –individualizáció

sejtmagi és mitokondriális DNSBármilyen biológiai anyagból és anyagmaradványból történhet

Mennyiségi korlátok – vizsgálhatóság, reprodukálhatóság, igazolhatóságMinőségi korlátok – minőségromlás, degradálódás, bomlás, szennyezettség, felülszennyezettségReakció komplexitás – sztochasztikaGenetikai komplexitás - pigmentáció

Követelmények …Az igazságügyi genetikai vizsgálatok nem tudományos kísér-letek, hanem tudományos módszerekkel végzett analízisek…

Érzékenység, megbízhatóság, ismételhetőség, ellenőrizhetőség

Technológia, módszertanTudományos kritériumok, statisztikaEtikai kritériumok

FelelősségMinőségirányítás

… és vannak, amiről azt állítják, mi tettük meg …

A kiindulás …Humán és nonhumán DNS

Sejtmagi DNSAutoszómák

Repetitive markerek (VNTR, STR)Single nucleotide polymorphisms (SNP)

Ivari kromoszómákRepetitive markerek (VNTR, STR)Single nucleotide polymorphisms (SNP)

Mitokondriális DNSCytochrome (b)Kontroll régió (HVI, HVII, CR)SNP

Mérföldkövek …

LandsteinerJeffreys

Mullis

PCR

Short Tandem Repeats (STRs)

AATG AATG AATG

Fluoreszcensfesték

7 repetíció

8 repetíció

A flanking régiók (ahol a PCR primerek kötnek)konstans, a repetitív régió variabilis a mintákban

Homozigota = mindkét allél egyforma hosszúHeterozigota = különböző allélhosszakA primerek pozíciója meghatározza a PCR termék méretét

Elválasztás és detektálás

Minta detektálás

CCD Panel

Szín szerinti

szeparálás

Ar+ LASER (488 nm)

Fluoreszcencia ABI Prism spectrograph

Kapillárisvagy gél

Méret-szeparálás

Detektá-lási régió

Fluoreszcens detektálás

Jelölt DNA fragmens(PCR termék)

A laboratóriumban …

Short Tandem Repeats (STRs)

13 STR lokusz kromoszómális pozíciója

CSF1PO

D5S818

D21S11

TH01

TPOX

D13S317

D7S820

D16S539 D18S51

D8S1179

D3S1358

FGAVWA

AMEL

AMEL

amelogenin

D19

D3

D8

TH01

VWA D21FGA

D16D18 D2

amelogeninD19

D3D8 TH01

VWA D21

FGA

D16D18 D2

Két

elté

rősz

emél

y

Allélméret (bp)

Gombostűfejnyi vérfoltból kb. 5 óra elteltével nyert eredmény

véletlenszerű egyezés esélye: ~1 a 3 milliárdhoz

Személyazonosító vizsgálat-multiplex STR

10 STR és a biológiai nem egyidejű vizsgálata

AmpFlSTR® SGM Plus™ kit

9 autoszómás lokusz

15 autoszómás lókusz …

… mondjuk, egy szúnyogból ?

Ez itt én vagyok !!!

Növekvő jelentőség - Y-kromoszóma …Növekvő jelentőség - Y-kromoszóma …

STR lokuszokDYS19

DYS389I/II

DYS390

DYS391

DYS392

DYS393

DYS385

YCAII

DYS437

DYS438

DYS439

Y

http

://w

ww

.ncb

i.nlm

.nih

.gov

/gen

ome/

guid

e/

Human Genome

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 X Y

17 Y-kromoszómás lokusz - haplotípus

Beszédes boríték …brutálisan meggyilkolt áldozat…ellentmondó vallomás…

egyszerű személyiség…„nem én voltam …”kevés információ, sok kétség …

… boríték a helyszínen …sejtmagi DNS vizsgálat …

Az ujjnyomat…

Az ujjnyomat - eredményekautoszómális lókuszokY-STR lókuszok

származás

Egy-nukleotid polimorfizmusok (SNP’s)

Több millió SNP a genombankb. 500-1000 bázispáronkéntpontmutációk génekben és/vagy regulátor régiókban

Fenotípus kapcsolatokpigmentáció, testalkat, …

Leszármazási vonalak (Y-SNP’s)Diagnosztika

multifaktoriális poligénes betegségek

T T C A A G Templát

Primer

Különböző hosszúságúfarokkal tervezett primerek

SNaPshotTM Multiplex Kit:egy bázis extenzió

C G

Primer extenzióés termináció

TA

T

C

A

GA AT

GC

CG

G

T

C Szín = genotípus

Hossz = lókuszElektroforézis

Automatikus analízis

A mitokondriális genomcirkuláris DNSCambridge Referencia Szekvencia~ ezer kópia sejtenkéntnincs hiszton asszociációmagas mutációs ráta

D-loop esetében ~ 9000 év alatt 1%oxidáló szabadgyök érzékenység

betegségek, öregedésnincs excíziós repair-rendszer

nem javítódik, csak szelektálódikpalacknyak hatás

heteroplazmiarekombináció egy mitokondriumonbelül, nukleáris DNS-re jellemzőrekombinációs variancia nincskizárólag anyai öröklődésű

öröklődése földrajzilag determinálta nem kódoló szakaszok mutációinak rögzülése és maternális öröklődése lehetőséget ad a populációk geológiai eredet szerinti elkülönítésére

A kontroll régió

Kontroll Régió (CR) –D(isplacement)-loop

~1120 bpreplikációs origóhipervariábilis szakaszok

HV1, HV2 és HV3alacsony szelekciós nyomása variációk forrása csak mutáció

Szekvencia-adatbázisokEMPOP

Kontroll Régió (D-loop)

1/16569

cyt b

ND5ND6

ND4

ND4L

ND3

COIIIATP6

ATP8 COII

12S rRNS

16S rRNS

ND1

ND2

COI

OH

OL

HV1 HV216024 16365 73 340

16024 576

„16 569” bp

Igazságügyi szempontok …A mtDNS egyedi azonosításra kevésbé alkalmas, mint a

nuDNSNem az egyént, hanem az anyai leszármazási haplotípustidentifikálja

UgyanakkorA diverzitás mértéke miatt nagy a valószínűsége annak, hogy két véletlenül kiválasztott személy különböző mtDNShaplotípussal rendelkezik

Populációtól függetlenül ez az érték általában 95 % valószínűség fölött vanÚj minták esetén kb. 2/3 része a mintáknak új haplotípust mutatCsak kevés ún. “közönséges” gyakori haplotípus van, melyek gyakorisága több mint 1%Több ezer haplotípus figyelhető meg, emiatt a haplotípusokrelatív gyakorisága alacsony

Terminális (Sanger-féle) szekvenálásdNTP és ddNTPeltérő fragmenshosszjelölt primerekvagyjelölt nukleotidok

dideoxi inhibits !

D-loop szekvencia – anyai leszármazási vonal azonosításának igazságügyi eszköze

A vizsgált minták mtDNS szekvenciáját a referenciaként használt CRS-hoz illesztjük (pl. 16071-16140)

A referencia szekvenciától való eltérések pozíciója és nukleotidja megadja az adott minta mtDNS haplotípusát

Bizonyíték (Q)

16093C 16129A

Összehasonlító(R)

16093C 16129A

A haplotípusok …

Leszármazás

3 AFRIKAI - 9 EURÓPAI - 7 ÁZSIAI FŐ HAPLOCSOPORT

Eseti alkalmazás

2004 – házaspár eltűnésehasználati tárgyak, fésű, fogkefe, sapka, pohár

2006 – NN férfi holttest emberölésgépkocsiból hajszál-töredék

morfológiai hasonlatosság a fésű hajszálaival2007 – koponya, állkapocs2008 – összehasonlító minták♀ gyermek és ♂ testvér

Kié a koponya és a hajszál töredék?

Koponya maradvány

Eredményekfésűcsonthajszálgyermektestvér

Eredmények

kizárás

A cytochrome b gén

14747 → 15886 pozíció(1140 bázispár)

cytochrome b-c1 komplex

kódoló szekvencia: - kisebb mutációs ráta - szinonim mutációk

Genetikai drift - fajok közötti szekvenciális különbségek

Filogenetikai analízisek

A cytochrome b gén mint a fajazonosításigazságügyi eszköze

14747 → 15886 pozíció (1140 bázispár) PCR: 358 bp szakasz

Átlagos eltérés kb. 15-20%

SNP a cytochrome b génben (Canis f.)

A vélemény …Szakértői válasz – kiértékelés

Populáció genetikaReprezentatív populáció

Statisztikai genetikaSzármazásLeszármazás, rokonság

Téves véleményekTechnikai okok

Kontamináció, inkompatibilitásSzemélyi okok

Jártasság

Bayes-féle hipotézis tesztelésVád hipotézise (Hp):

Pl.: A helyszínen talált vérnyom XY-tól származott

Védelem ellenhipotézise (Hd):Pl.: A vérnyom az adott népességből véletlenszerűen

kiválasztott másik, NN személytől származott

Bayes-formula (valószínűségi tesztelés)Pr: valószínűség

E: bizonyíték

I: információ

H: hipotézis

p: ügyész

d: ügyvéd

I)E,Pr(HI)E,Pr(H

I),HPr(EI),HPr(E

I)Pr(HI)Pr(H

d

p

d

p

d

p=×

a priorivalószínűségi

hányados(PrPR)

valószínűségihányados

(genetikai bizonyíték)

a posteriorivalószínűségi

hányados(PoPR)

A valószínűségi hányadosHa a biológiai nyom egy személytől származott, és a laboratóriumi hiba kizárt, Pr(E|Hp,I)=1.

A valószínűségi hányados – legegyszerűbb formájában – a genetikai-profil előfordulási gyakoriságának reciprokával egyezik meg.

I),HPr(G1

I),H,GPr(G1

I),HPr(EI),HPr(E

LRdcdscd

p≈==

Egyezési valószínűség Profilgyakoriság

Pr: valószínűségE: bizonyítékG: genetikai profilI: információH: hipotézisp: ügyészd: ügyvédc: helyszíns: gyanúsított

Köszönöm a figyelmet!

Genetikailag módosított karácsonyfa, Amboy, CA