haplotiposppasociados con resistencia a sulfadoxina
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Haplotipos asociados con resistencia a Sulfadoxina Pirimetamina en Haplotipos asociados con resistencia a Sulfadoxina-Pirimetamina en p pPl di f l i d t d d l lid d Plasmodium falciparum procedente de dos localidades: Plasmodium falciparum procedente de dos localidades:
Tierralta Córdoba y Tumaco Nariño Tierralta, Córdoba y Tumaco, Nariño Tierralta, Córdoba y Tumaco, Nariño Diana Carolina Hernández1, Sandra Milena Barrera1, Zulma Milena Cucunubá2,Diana Carolina Hernández , Sandra Milena Barrera , Zulma Milena Cucunubá ,
R bé S i Ni h ll 2 Á l P i i G 1Rubén Santiago Nicholls2, Ángela Patricia Guerra1g , g1Laboratorio de Bioquímica y Biología Celular Instituto Nacional de Salud Bogotá D C 2Laboratorio de Parasitología Instituto Nacional de Salud Bogotá D C1Laboratorio de Bioquímica y Biología Celular, Instituto Nacional de Salud, Bogotá D.C. 2Laboratorio de Parasitología, Instituto Nacional de Salud, Bogotá D.C.
INTRODUCCIONINTRODUCCIONEl parásito Plasmodium falciparum es capaz de evadir la acción de la sulfadoxina-pirimetamina (SP) debido a la acumulación progresiva de mutaciones en los genesEl parásito Plasmodium falciparum es capaz de evadir la acción de la sulfadoxina pirimetamina (SP) debido a la acumulación progresiva de mutaciones en los genesdhfr y dhps situación que aumenta el nivel de resistencia del parásito a estos medicamentos y conlleva a la aparición de fallas al tratamiento En Colombia SP dejódhfr y dhps, situación que aumenta el nivel de resistencia del parásito a estos medicamentos y conlleva a la aparición de fallas al tratamiento. En Colombia, SP dejód ili l i d l l i li d P f l i d d fi l d l 2006 i b id i li dide utilizarse para el tratamiento de la malaria no complicada por P. falciparum desde finales del 2006; sin embargo, consideramos pertinente realizar un estudiop p p p ; g , pmolecular para detectar los haplotipos circulantes asociados con resistencia a SP, en dos regiones endémicas para malaria con intensidades de transmisión distintas.molecular para detectar los haplotipos circulantes asociados con resistencia a SP, en dos regiones endémicas para malaria con intensidades de transmisión distintas.Lo anterior con el fin de conocer el efecto de la presión ejercida con SP durante casi dos décadas sobre el genoma de los parásitos que circulan en dichas regiones yLo anterior con el fin de conocer el efecto de la presión ejercida con SP durante casi dos décadas sobre el genoma de los parásitos que circulan en dichas regiones yestablecer una línea de base con los haplotipos encontrados.p p
MATERIALES Y METODOS RESULTADOS MATERIALES Y METODOS RESULTADOS PREVALENCIA DE HAPLOTIPOS SEXTUPLES EN LOS GENESPREVALENCIA DE HAPLOTIPOS SEXTUPLES EN LOS GENES dhfr ydhfr y dhpsdhpsMuestrasMuestras PREVALENCIA DE HAPLOTIPOS SEXTUPLES EN LOS GENES PREVALENCIA DE HAPLOTIPOS SEXTUPLES EN LOS GENES dhfr y dhfr y dhpsdhps
LOCALIDADES ESTUDIADASLOCALIDADES ESTUDIADASMuestras Muestras
AnalizadasAnalizadas IPAIPA IFAIFA IVAIVA n=194 n=194 LOCALIDADES ESTUDIADASLOCALIDADES ESTUDIADAS AnalizadasAnalizadas IPA IPA IFAIFA IVAIVA44,8%50%)
H l iTierraTierra Alta,CordobaAlta,Cordoba (E.de eficacia in vivo)(E.de eficacia in vivo) 206(59)206(59) 28.428.4 5.45.4 23.023.0 44,8%
45%% Haplotipos Tierra Tierra Alta,CordobaAlta,Cordoba (E.de eficacia in vivo)(E.de eficacia in vivo) 206(59)206(59) 28.428.4 5.45.4 23.023.0Tumaco NariñoTumaco Nariño 135135 31 331 3 25 625 6 5 75 7 40%
A ( SilvestreTumaco,NariñoTumaco,Nariño 135135 31.331.3 25.625.6 5.75.7
35%IATotalTotal 34134124 7%
30%
NCI Haplotipo 24,7%
25%EN
p pTriple mutante
20%
ALE
Triple mutante
341 15%VA Haplotipo341 t
7,2%4 6%
10%EV
Haplotipo Doble mutantemuestras
,2,1% 0 5%
4,6%0 5%
3,1% 1,5% 1 0%4,1%
0 5% 1 0% 0 5% 1 0% 1,5% 0 5% 0 5%5%PR
Doble mutante 2,1% 0,5% 0,5% 1,5% 1,0% 0,5% 1,0% 0,5% 1,0% 1,5% 0,5% 0,5%
0%5%P Haplotipo 0% p p
CuádrupleCuádruplemutanteExtracción ADN mutante
(Chelex y Saponina )(Chelex y Saponina )
HAPLOTIPOS EN LOS GENES HAPLOTIPOS EN LOS GENES dhfr y dhpsdhfr y dhpsf y pf y p
PCRPCRCOMPARACION DE HAPLOTIPOS EN LOS GENESCOMPARACION DE HAPLOTIPOS EN LOS GENES dhfr y dhps EN TIERRALTA Ydhfr y dhps EN TIERRALTA YCOMPARACION DE HAPLOTIPOS EN LOS GENES COMPARACION DE HAPLOTIPOS EN LOS GENES dhfr y dhps EN TIERRALTA Y dhfr y dhps EN TIERRALTA Y
TUMACO TUMACO Gen dhfr Gen dhps
70,0%70,0%
Gen dhfr Gen dhps 62,6%62,6%
al ) 60,0%60,0%
al
b ) rsa
pb
PREVALENCIA TIERRALTA PREVALENCIA TIERRALTA
M3b 5´TGATGGAACAAGTCTGCGACGTT ´3ersa
pb ve 0 p
N1: 5´‐GATTCTTTTTCAGATGGAGG‐´350,0%50,0%
(%)
(%)
M3b: 5´TGATGGAACAAGTCTGCGACGTT‐´3 ive
50
Uni 75
N1: 5 GATTCTTTTTCAGATGGAGG 3 N2: 5´ TTCCTCATGTAATTCATCTGA ´3 40 0%40 0%IA
(IA ( PREVALENCIA TUMACO PREVALENCIA TUMACO
M9: 5´CTGGAAAAAATACATCACATTCATATG‐´3 Un (65 U ( N2: 5 TTCCTCATGTAATTCATCTGA‐ 3 40,0%40,0%
NCI
NCI
U
27 5%27 5%30 0%30 0%ALE
ALE
27,5%27,5%25,0%25,0%
30,0%30,0%
EVA
EVA
M1 5´ TTTATGATGGAACAAGTCTGC ´3
) ) 19,6%19,6%20,0%20,0%PR
EPR
E
M1: 5´‐TTTATGATGGAACAAGTCTGC‐´3 ed pb ed pb R2: 5´-AACCTAAACGTGCTGTTCAA‐´3 16,1%16,1%14,3%14,3%
20,0%20,0%
M7: 5´‐ CTAGTATATACATCGCTAACA ‐´3 est
94 p
este
1 p
R: 5´‐AATTGTGTGATTTGTCCACAA‐´3 8,9%8,9%10,7%10,7%
10,0%10,0%
Ne
(59 Ne
71 3,1%3,1%0 8%0 8% 0 8%0 8%
2,3%2,3% 1 5%1 5% 0 8%0 8% 1 5%1 5% 0,8%0,8%0 8%0 8%
1,8%1,8% 3,6%3,6%5,4%5,4%
( ( 0,0%0,0% 0,8%0,8% 0,0%0,0% 0,8%0,8% 0,0%0,0%,, 1,5%1,5%
0,0%0,0% 0,8%0,8% 1,5%1,5%0,0%0,0% 0,0%0,0% 0,0%0,0% 0,8%0,8%0,0%0,0% 0,0%0,0% 0,0%0,0% 0,0%0,0% 0,0%0,0% 0,0%0,0% 0,0%0,0% 0,0%0,0% 0,0%0,0%
0,0%0,0%
RFLP Dot blotRFLP Dot blotRFLP Dot blotRFLP Dot blot
l ( )• Alu I : S108 (W) HAPLOTIPOS EN LOS GENES HAPLOTIPOS EN LOS GENES dhfr y dhps dhfr y dhps
C dó(322 pb, 272 pb) •Ava IICodónCodón
p p• Bsr I : N108 (M) Codón
Ava II Codón Codón HAPLOTIPO PREVALENCIA TIERRALTA PREVALENCIA TUMACO VALOR p108Bsr I : N108 (M)(327 pb 267 pb)
Codón 437 A437 (W) : 711 pb59 581
HAPLOTIPO PREVALENCIA TIERRALTA PREVALENCIA TUMACO VALOR pS/N/C/A/K/A 0 0% 2 0% 0 0000
08 (327 pb, 267 pb)• Scrf I : T108 (M)
437 A437 (W) : 711 pbG437 (M) 630 81 b
581 S/N/C/A/K/A 0,0% 25,0% p= 0,0000• Scrf I : T108 (M)(323 b 271 b)
G437 (M) : 630 y 81pbCodón , , p ,
N/I/C/G/K/A 62 6% 8 9% p= 0 0000(323 pb, 271 pb)164
N/I/C/G/K/A 62,6% 8,9% p= 0,0000N/N/C/A/K/A 0 0% 16 1% 0 0000164 N/N/C/A/K/A 0,0% 16,1% p= 0,0000
• Tsp 509 I: SN/NI/C/A/K/A 0,0% 10,7% p= 0,0008C dó
Tsp 509 I: Codón •Fok I SN/NI/C/A/K/A 0,0% 10,7% p 0,0008
N/NI/C/A/K/A 0 0% 14 3% p= 0 0001Codón N51 (W) 149 y 120pb
Codón 540
N/NI/C/A/K/A 0,0% 14,3% p= 0,0001/ / / / /51 N51 (W) : 149 y 120pb
I51 (M) 213 120 b540 K540 (W) : 711 pb S/NI/C/A/K/A 0,0% 5,4% p= 0,041851
I51 (M) : 213 y 120 pb( ) p
E540 (M) : 399 y 312 pb/ / / / / , , p ,
E540 (M) : 399 y 312 pbHaplotipos presentes en los genesHaplotipos presentes en los genes dhfr y dhpsdhfr y dhps en muestras procedentes de un estudio de eficaciaen muestras procedentes de un estudio de eficacia in vivo a AQin vivo a AQ SPSPHaplotipos presentes en los genes Haplotipos presentes en los genes dhfr y dhpsdhfr y dhps en muestras procedentes de un estudio de eficacia en muestras procedentes de un estudio de eficacia in vivo a AQin vivo a AQ‐‐SPSP
1 3D7 T4 MA B M 1 2 Hb3 Dd2 M 1 IEC Dd2AHAPLOTIPO PREVALENCIA
1 M 2 3 3D7 Dd2 1 3D7 T4 MA. B. M 1 2 Hb3 Dd2A. B.
N/I/C/G/K/A 67 2%N/I/C/G/K/A 67,2%N/I/C/A/K/A 31 0%N/I/C/A/K/A 31,0%
N/I/CRCR/G/K/A 1 7%N/I/CRCR/G/K/A 1,7%
00 b
594 pb 350 pb 630 pb
500 pb
b322 pb
350 pb
213 pb 500 pb 500 pb
CONCLUSIONES300 pb
b
p
272 pb 120 pb 399 pb CONCLUSIONES
200 pb 312pb
• Se encontraron diferencias significativas en cuanto a la prevalencia de haplotipos entreSe encontraron diferencias significativas en cuanto a la prevalencia de haplotipos entreTierralta y Tumaco Teniendo en cuenta que las dos localidades han sido sometidas alTierralta y Tumaco. Teniendo en cuenta que las dos localidades han sido sometidas al
ó ó óR t i ió E i áti d l dh
mismo tiempo de presión con SP, se puede pensar que la aparición y la fijación deRestricción Enzimática del gen dhfr Restricción Enzimática del gen dhps
p p , p p q p y jmutaciones no solo está relacionada con la presión con SP sino con otros factores como la
A. Restricción enzimática con Alu I A. Restricción enzimática con Ava II mutaciones no solo está relacionada con la presión con SP sino con otros factores como labi ió áfi l i t id d d l t i ióes ó e á a o u
M:Marcador de peso molecular 100pb #:Muestras M:Marcador de peso molecular 100pb, #: ubicación geográfica o la intensidad de la transmisión.M:Marcador de peso molecular 100pb, #: Muestras,3D7: Cepa 3D7 (S108) Dd2: Cepa Dd2 (108N)
p p ,Muestras HB3:Cepa HB3 (A437) Dd2: Cepa Dd2 (437G)3D7: Cepa 3D7 (S108), Dd2: Cepa Dd2 (108N)
B R t i ió i áti T 509 I
Muestras, HB3:Cepa HB3 (A437), Dd2: Cepa Dd2 (437G)B Restricción enzimática con Fok I •Se obtuvo una línea de base de los haplotipos que circulan en las localidades estudiadasB. Restricción enzimática con Tsp509 I B. Restricción enzimática con Fok IM M d d l l 100 b # M t IEC
•Se obtuvo una línea de base de los haplotipos que circulan en las localidades estudiadas.E t lt d i á t bl i t di f t l fi dM:Marcador de peso molecular 50pb, #: Muestras, 3D7: M:Marcador de peso molecular 100pb, #: Muestras, IEC:
( ) ( )Este resultado servirá para establecer comparaciones con estudios futuros con el fin de
Cepa 3D7 (N51), T4: Cepa T4 (51I) Cepa IEC (E540), Dd2: Cepa Dd2 (K540) p p
realizar vigilancia molecular que eventualmente permita evaluar estrategias de control de lap ( ), p ( ) realizar vigilancia molecular que eventualmente permita evaluar estrategias de control de lamalaria y reconsiderar la reintroducción de SP en Colombiamalaria y reconsiderar la reintroducción de SP en Colombia.
CONSTRUCCION DE HAPLOTIPOSCONSTRUCCION DE HAPLOTIPOSCONSTRUCCION DE HAPLOTIPOSCONSTRUCCION DE HAPLOTIPOS• Aunque la asociación entre los haplotipos mutantes y la falla clínica es muy difícil de
CONSTRUCCION DE HAPLOTIPOSCONSTRUCCION DE HAPLOTIPOSTeniendo en cuenta el alelo (o alelos) presente en cada uno de los codones estudiados (tanto
• Aunque la asociación entre los haplotipos mutantes y la falla clínica es muy difícil det bl l áli i d h l ti l dhf dh l lTeniendo en cuenta el alelo (o alelos) presente en cada uno de los codones estudiados (tanto
l dhf dh ) d t i ó l h l ti d d t P l t ióestablecer, el análisis de haplotipos en los genes dhfr y dhps cumple un papel muy
para el gen dhfr como dhps) se determinó el haplotipo de cada muestra. Para la construcción importante en estudios epidemiológicos y de vigilancia, ya que proporciona una visiónde éstos se tuvo en cuenta el siguiente orden:
importante en estudios epidemiológicos y de vigilancia, ya que proporciona una visióngeneral del comportamiento del parásito cuando ha sido sometido a diferentes condicionesde éstos se tuvo en cuenta el siguiente orden: general del comportamiento del parásito cuando ha sido sometido a diferentes condiciones
l l ó l l d ó d h l dcomo por ejemplo a la presión con SP. Por lo tanto, la detección de haplotipos se puedeGen dhfr Gen dhps p j p p , p p pconsiderar como un primer paso para orientar las decisiones en cuanto a políticas públicas
Gen dhfr Gen dhps
HAPLOTIPOHAPLOTIPO :: 108108//5151//5959//437437//540540//581581considerar como un primer paso para orientar las decisiones en cuanto a políticas públicasde control de la malariaHAPLOTIPOHAPLOTIPO :: 108108//5151//5959//437437//540540//581581 de control de la malaria.
Se encontraron 18 haplotipos, se determinó la frecuencia de cada uno en la muestra total y AGRADECIMIENTOSSe encontraron 18 haplotipos, se determinó la frecuencia de cada uno en la muestra total ypor localidad Los nombres de los aminoácidos están expresados mediante el código de una AGRADECIMIENTOSpor localidad. Los nombres de los aminoácidos están expresados mediante el código de unal t í S S i N A i T T i I I l i A Al i G Gli iletra así: S: Serina, N: Asparagina, T: Treonina, I: Isoleucina, A: Alanina, G: Glicina, Este trabajo fue realizado en el Instituto Nacional de Salud y cofinanciado por el Organismo , p g , , , , ,K: Lisina E: Ácido Glutámico
j y p gInternacional de Energía Atómica (OIEA)K: Lisina, E: Ácido Glutámico
(W): Silvestre (M): MutanteInternacional de Energía Atómica (OIEA)
(W): Silvestre, (M): Mutante.
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