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: FO'RSCHUNGSZENTRUM JOLICH GmbH
Institut für Nuklearchemie
Polymergestützte Synthese von unsymmetrischen n.c.a. e3,75SelSelenoethern
(KFAJ==
zur Markierung von Aminosäuren
Jörn Schmaljohann
'"
Berichte des Forschungszentrums Jüli(:h ; 3108 ISSN 0944-2952 Institut für Nuklearchemie Jül-3108 D 38.(Diss. Universität Köln)
Zu beziehen durch: Forschungszentrum Jülich GmbH· Zentralbibliothek D-52425 Jülich . Bundesrepublik Deutschland Telefon: 02461/61-61 02 . Telefax: 02461/61-61 03 . Telex: 833556-70 kfa d
I
L
Polymergestützte Synthese von unsymmetrischen n.c.a. [73,75SelSelenoethern zur Markierung von Aminosäuren
Jörn Schmaljohann
Abstract The synthesis of n.c.a. selenium-73/75 labelIed methionine and of a selenoalkylation agent have been performed according to a reaction including a primary, polymer supported alkylation step. The selenium-75 was produced through the 75As(p,n)-process and separated as [15Se l selenium dioxide by thermochromatography. The [75Se lSe 0 2 - s ublimate was dissolved in hydrochloric acid and reduced with sulfur dioxide to obtain elemental n.c.a. selenium-75, which was extracted into benzene. Reaction of the elemental n.c.a. selenium-75 with polymeric bound triphenylphosphine led to the formation of the corresponding [75Se l triphenylphosphinselenide in a nearly quantitative yield. In the primary, heterogenous alkylation step the [75Selmethylselenotriphenylphosphonium salt (TPPSeMeOTf) was formed via methyltriflate as alkylation reagent. The phosphonium salt was hydrolised under alkaline condi tions yielding [75 Sel methylselenide anion (MeSe -) in a radiochemical yield of up to 70%. The asymmetrical [75Selselenoethers were synthesized in homogenous phase through the reaction of the [75Se lMeSe- with propylhalides in radiochemical yields up of to 55%. In the case of n.c.a. [75Selselenomethionine, which was produced for the first time, the secondary alkylation step led to the formation of protected [75Se l selenomethionine by using N-BOC-2-amino-4-bromo-butyric acid ethylester as precursor and [75Se lMeSe- (generated from the polymeric bound [75Se l TPPSeMeOTf) as [75Se l selenation re agent . After acid hydrolysis the selenomethionine was obtained in radiochemical yields of 30%, in a radiochemical purity of about 95%, and with a specific activity >185 GBq/mmol. A selenium-75 labelIed prosthetic group was synthesized in radiochemical yields of 48% by the reaction of l-chloro-3-iodopropane with the [75Selselenation reagent [75Se lMeSe-. This reagent was prepared from the polymeric bound [75Se lTPPSeMeOTf using TBAH. For labelling amino functions via [75Selselenoalkylation the [75Selselenated propyl chloride has to be transfered into the iodide with sodium iodide, which was performed in radiochemical yields of 90%. After the reaction of [75Se l-l-iodo-3- (methylseleno)propane with butylamine or with
~-, O-protected lysine in DMF at [75Se l methylselenopropylated products were radiochemical yields of 95% and 90%, respectively.
80°C obtained
the in
Inhaltsverzeichnis
1. Einleitung
1.1. Bedeutung kurzlebiger Positronenstrahler in
Medizin und Pharmakologie
1.2. Nukleare Eigenschaften und Produktion von Selen-
73 und Selen-75
1.3. Chemische und kinetische Aspekte bei Reaktionen
mit trägerfreien (n.c.a.) Radionukliden
1.4. Methoden zur Radioselenierung organischer
Moleküle
1. 5.
2.
3.
3.1.
Zum Einbau von Selenomethionin in Proteine
Problemstellung
Experimenteller Teil
Bezugsnachweis und Qualität der verwendeten
Chemikalien
3.2. Geräte zur Charakterisierung der dargestellten
Verbindungen
3.3. Darstellung inaktiver Ausgangs- und Referenz
substanzen
3.4. Radiosynthesen
3.4.1. Produktion von n.c.a. Selen-75
3.4.1.1. Arsentrioxid als Targetmaterial
3.4.1.2. Kupferarsenlegierung als Targetmaterial
3.4.2. Darstellung von elementarem n.c.a. Selen-75
3.4.3. Durchführung der n.c.a. [75Se jSelenierungs-
1
1
6
10
13
19
21
23
23
25
26
36
36
36
37
39
reaktionen 40
3.4.3.1. [75Se jSelenierung des polymergebundenen Tri-
phenylphosphins 40
3.4.3.2. Darstellung von n.c.a. [75Se jSelenomethionin 41
3.4.3.3. Darstellung von [75Se jMethylselenopropyl-
derivaten 44
3.5.
3.5.1.
3.5.2.
3.6.
3.7.
4.
4.1.
4.2.
4.2.1.
4.2.2.
Analytische Verfahren
Radiohochdruckfüssigkeitschromatographie
Radiodünnschichtchromatographie
Bestimmung der spezifischen Aktivität von
[75Se ]Selenomethionin
Bestimmung der radiochemischen Reinheit
Ergebnisse und Diskussion
Targetaufarbeitung
Synthese von n.c.a. [75Se ]Selenoethern
synthesestrategie zur Darstellung von
[75Se ]Selenoethern
Konzept der polymergestützten synthese von
[75Se ]Selenoethern
4.2.2.1. Darstellung des polymergebundenen n.c.a.
[75Se ] Triphenylphosphinselenids
4.2.2.2. Reaktion zum [75Se ]Alkylselenotriphenyl-
phosphoniumsalz (Primäralkylierung)
4.2.2.3. Baseninduzierte Spaltung des [75Se ]Methyl-
46
46
49
50
52
53
53
59
59
61
63
66
selenotriphenylphosphoniumsalzes 72
4.2.2.4. Abhängigkeit der [75Se ]Selenoetherbildung vom
Alkylierungsagens 74
4.3. synthese von n.c.a. [75Se ]Selenomethionin 77
4.3.1. 2-Aminobutyrolacton als Markierungsvorläufer 78
4.3.1.1. Abhängigkeit der radiochemischen Ausbeute an
[75Se ]Selenomethionin von der Base 79
4.3.1.2. Abhängigkeit der radiochemischen [75Se ]Seleno-
methioninausbeute vom Lösungsmittel 82
4.3.1.3. Abhängigkeit der radiochemischen Ausbeute des
[75Se ]Selenomethionins von der Eduktkonzentra-
4.3.2.
tion, Reaktionszeit und Reaktionstemperatur
O-Tosylhomoserinmethylester als Markierungs
vorläufer
84
86
4.3.2.~. Abhängigkeit der Ausbeute des [75Se ]Seleno
methioninmethylesters von der Tetrabutyl-
ammoniumhydroxidkonzentration und vom Solvens 88
4.3.2.2. Abhängigkeit der [75Se ]Selenomethioninester-
bildung von der Eduktkonzentration und Reak-
tionszeit 90
4.3.2.3. Hydrolyse des [75Se ]Selenomethioninmethylesters 93
4.3.3. Synthese des [75Se ]Selenomethionins ausgehend
von N-BOC-2-Amino-4-brombuttersäureethylester 95
4.3.3.~. Abhängigkeit der Ausbeute an [75Se ]-N-BOC
Selenomethioninethylester von der Tetra-
butylammoniumhydroxidkonzentration
4.3.3.2. Abhängigkeit der radiochemischen Ausbeute an
[75Se ]-N-BOC-Selenomethioninethylester von der
Eduktkonzentration
4.3.3.3. Abhängigkeit der radiochemischen Ausbeute an
[75Se ]-N-BOC-Selenomethioninethylester von der
Reaktionszeit
4.3.3.4. Abspaltung der Schutzgruppen des [75Se ]-N-BOC
Selenomethioninethylesters unter Bildung von
96
98
~oo
[75Se ]Selenomethionin ~O~
4.4. [75Se ]SelenoalkYlierungsagenzien ~05
4.4.~. Synthese von [75Se ]Methylselenopropylderivaten ~05
4.4.2. optimierung der Synthese des [75Se]-~-(Methyl-
seleno)-3-chlorpropans ~09
4.4.3. synthese des [75se]-~-(Methylseleno)-3-iod-
propans ~~3
4.4.4. [75Se ]Selenoalkylierung von Aminoverbindungen ~~5
4.4.4.~. [75Se ]Selenoalkylierung von ~-Butylamin ~~5
4.4.4.2. [75Se ]Selenoalkylierung von Lysin ~~9
5. Zusammenfassung 124
Anhang: Abkürzungsverzeichnis ~28
6. Literatur 130
1. Einleitung
1.1. Bedeutung kurzlebiger positronenstrahler in Medizin und
Pharmakologie
Durch die Entwicklung leistungsfähiger, computergesteuerter
Tomographen gewinnen bildgebende Verfahren der Nuklearmedizin
(Computer-Tomographie (CT), Kernspin-Tomographie (MRI),
Single-Photon-Emission-Tomographie (SPET), Positronen-Emis
sions-Tomographie (PET» zunehmend an Bedeutung. Während
durch CT und MRI die Morphologie des Gewebes dargestellt
wird, können durch SPET und PET biochemische Prozesse in vivo
er faßt werden. Bei der PET ist im Vergleich zu der SPET eine
Quantifizierung der Radioaktivitätsverteilung möglich. Durch
die Markierung von Biomolekülen und Pharmaka mit kurzlebigen
Positronenstrahlern kann deren verteilung im Organismus
nicht-invasiv mittels PET bildlich dargestellt und die
Kinetik der Radiopharmaka im jeweiligen zielorgan gemessen
werden [1-3].
Dem Zerfall von Positronenstrahlern liegt ein Neutronen
unterschuß des Radionuklids gegenüber dem stabilen Isotop zu
grunde. Durch Umwandlung eines Protons in ein Neutron und
gleichzeitiger Emission eines Positrons und eines Neutrinos
können sich diese Atomkerne stabilisieren. Das Positron ver
liert seine hohe kinetische Energie entlang seines Bremsweges
durch Ionisation und Anregung der umgebenden Materie. Der
Bremsweg beträgt wenige Millimeter in Wasser bzw. Gewebe.
Nach seiner Thermalisierung rekombiniert das Positron mit
einem Elektron. Aus der Rekombination resultieren zwei
y-Quanten von je 511 keV (entsprechend der Ruhemasse eines
Elektrons), die vorwiegend unter einem Winkel von 180· emit
tiert werden. y-Strahlen dieser Energie können Gewebe leicht
durchdringen und extern detektiert werden. Grundlage der PET
ist die Messung dieser Annihilationsstrahlung. Dies geschieht
durch ringförmig angeordnete NaI(TI)- bzw. BGO-Kristall
detektoren außerhalb des Körpers. Da pro Zerfall eines
1
Positronenstrahlers zwei y-Quanten winkelkorreliert emittiert
werden, kann durch die Koinzidenzschaltung gegenüberliegender
Detektoren die räumliche verteilung der applizierten Akti
vität in vivo quantitativerfaßt werden [4]. Zusätzlich kön
nen durch zeitabhängige Messungen auch schnelle in vivo Kine
tiken des Pharmakons bestimmt werden. Das räumliche Auf
lösungsvermögen, welches u. a. von der Positronenenergie des
strahlers abhängig ist, beträgt bei modernen PET-Kameras
3-5mm. Durch die PET können nano- bis picomolare Mengen des
Tracers pro cm3 detektiert werden. Damit ist die Empfindlich
keit im Vergleich zur NMR-spektroskopie um den Faktor 103-106
größer [3].
Für die medizinische Anwendung ist der Tägergehalt des
Tracers von entscheidender Bedeutung. Dies muß schon bei der
Produktion des Radionuklids beachtet werden. Die Auswahl
einer geeigneten Kernreaktion und Teilchenenergie ermöglicht
bei bekannter Anregungsfunktion die meist trägerfreie (no
carrier-added, n.c.a.) Darstellung der Positronenstrahler.
Die daraus resultierende hohe spezifische Aktivität bedingt
ein Arbeiten mit kleinsten Massen (ng-I'g). Bei der Appli
kation solch kleiner Stoffmengen sind meist keine pharmako
dynamischen Effekte zu erwarten, so daß auch zentralwirksame
oder toxische Substanzen für die PET verwendet werden können.
Ein weiterer Vorteil ist, daß durch einen praktisch träger
freien Radiotracer eine Beeinflussung des Stoffwechsels nicht
zu erwarten ist [1,5]. Aufgrund der relativ kurzen Halbwerts
zeiten der verwendeten Positronenstrahler ist die Strahlen
belastung des Patienten meist geringer als bei einer normalen
Röntgenaufnahme [3]. Dadurch sind auch wiederholungsmessungen
innerhalb kurzer zeitinterwalle prinzipiell möglich. somit
kann die PET auch in der Therapiekontrolle eingesetzt werden.
Die kurzen Halbwertszeiten machen den Einsatz hoher Anfangs
aktivitäten (im GBq-Bereich) notwendig. Aufgrund der inten
siven 511keV Annihilationsstrahlung ist deshalb eine aus
reichende Abschirmung während der Synthese erforderlich, so
daß die Synthesen automatisiert und ferngesteuert in
2
Bleizellen durchgeführt werden müssen. Für eine effiziente
Synthese und Qualitätskontrolle mit solchen kurzlebigen
Radionukliden stehen maximal nur etwa drei Halbwertszeiten
zur Verfügung [6].
Ausgangspunkt für die
biochemische Modelle,
gruppen beinhalten [1]:
Entwicklung von PET-Radiopharmaka sind
die im wesentlichen folgende Stoff-
- Stoffwechselsubstrate oder deren Analoga
- Enzym-Inhibitoren
- Rezeptorbindende Liganden
- Antikörper-Antigen-Systeme
Körpereigene Substanzen und Pharmaka sind im wesentlichen aus
C-, H-, N-, 0-, P- und S-Atomen aufgebaut. Für die Markierung
von Radiopharmaka mit Positronenstrahlern eignen sich somit
die Isotope 11C, 13N, 150 und 30p besonders, da sich mit Aus
nahme von vernachlässigbaren Isotopieeffekten die bioche
mischen Eigenschaften der Substanzen nicht ändern. Der Ein
satz wird aber durch die sehr kurzen Halbwertszeiten (s. Ta
belle 1.1-1) stark eingeschränkt. Im Fall des 150 sind dies
einfach synthetisierbare Moleküle wie [ 150]02' [150]H20,
[150]C02, [ 150]CO, [ 150]Butanol [7,8]. Auch für 13N resul
tieren aus der kurzen Halbwertszeit nur wenige Umsetzungsmög
lichkeiten der Targetprodukte [13N]N2' [13N]N02 -, [13N]N03 -,
[13N]NH3. Eine Möglichkeit ist die Umsetzung von [13N]NH3 zu
Aminosäuren [9,10]. Aufgrund der längeren Halbwertszeit des
11C sind hier auch Mehrstufensynthesen möglich. Die Bestrah
lungsprodukte ([11C]C02' [11C]CH4' [llC]HCN) können durch
einfache und schnelle Reaktionen zu primären und sekundären
Markierungsvorläufern ([ 11C] CH3I, [llC] COCI2' [llC] Ca rb on
säuren, [llC]Methyltriflat) umgesetzt werden, so daß sich ein
breites Spektrum von 11c-Markierungmöglichkeiten ergibt [zur
Übersicht siehe 1,12].
3
Tab.1.1-1: Physikalische Eigenschaften der wichtigsten Pos i
tronenstrahler für PET [1]
Nuklid t% Zerfallsart Eß+ max Baupt-y-Linie
emin] (%) [keV] (re!.%) [keV] (%)
llc 20,3 ß+ (99,8) 960 (100) 511 (199,6)
EC (0,2) 13N 9,96 ß+ (100) 1190 (100) 511 (200) 150 2,03 ß+ (99,9) 1723 (100) 511 (200)
EC (0,1) 18F 109,7 ß+ (96,9) 635 (100) 511 (193,8)
EC (3,1) 30p 2,5 ß+ (100) 3245 (100) 511 (200)
75Br 96 ß+ (75,5) 1740 (82) 286 (91,6)
EC (24,5) 511 (151) 73Se 426 ß+ (65) 1320 (91,3) 511 (130)
EC (35) 361 (97)
Zeitaufwendige Synthesen oder die Messung langsamer Pharmako
kinetiken erfordern längere Halbwertszeiten des Positronen
strahlers . Zu diesem Zweck werden für die Markierung soge
nannte Analogtracer wie 18F, 75Br und 73Se eingesetzt [1].
Der Grundgedanke der Fremdmarkierung ist die ähnliche Sterik,
z.B. eines H- und F-Atoms bzw. einer Methylgruppe und Br. Die
Änderung der chemischen Eigenschaften der markierten Verbin
dung aufgrund der unterschiedlichen Ladungsverteilung bedingt
aber eine erneute Prüfung der physiologischen und pharmako
logischen Wirksamkeit des Radiopharmakons. Dennoch hat sich
das 18F zu einem der wichtigsten Markierungsisotope ent
wickelt. Dieses beruht auf der sehr stabilen Kohlenstoff
Fluor Bindung und den physikalischen vorteilen des Isotops.
Hier sind die niedrige Positronenenergie des ß+ und die deut
lich längere Halbwertszeit gegenüber l1C hervorzuheben (siehe
Tab. 1.1-1), so daß die höchste Auflösung erzielt werden kann
und zeitaufwendigere Synthesen oder PET-Messungen möglich
sind.
4
Positronen emittierende Schwefel isotope haben zu kurze Halb
wertszeiten für PET-Anwendungen «3s). Da Selen und Schwefel
sowohl in ihrer räumlichen Ausdehnung als auch chemisch sehr
ähnlich sind, kann das 73Se hier als Analogtracer für ein
S-Atom eingesetzt werden. Durch die stärkere POlarisierung
der C-Se-Bindung wird jedoch im markierten Molekül eine
Änderung der Ladungsverteilung hervorgerufen. Der Unterschied
ist aber nur geringfügig, so daß das physiologische Verhalten
eines Pharmakons sich durch die Fremdmarkierung häufig nicht
wesentlich ändert. Das Selen-73 kann darüber hinaus zur syn
these isosterer Verbindungen, z . B. im Austausch gegen eine
CH2-Gruppe, eingesetzt werden.
5
1.2. Nukleare Eigenschaften und Produktion von Se1en-73 und
Se1en-75
Für nuklearmedizinische Anwendungen sind das Selen-73 und Se
len-75 die beiden relevanten Selenisotope. Tabelle 1.2-1
zeigt ihre wichtigsten nuklearen Eigenschaften. Selen-75 zer
fällt zu 100% durch Elektroneneinfang (EC), so daß ein Ein
satz in der PET nicht möglich ist. Eine Forderung an ein
ideales Radionuklid für SPET ist eine dominierende y-Linie in
dem Energiebereich von 100-300keV, so daß Selen-75 aufgrund
der 265keV Haupt-y-linie mit 58% Häufigkeit dort eingesetzt
werden kann. Weil der Patient aber wegen der langen physika
lischen Halbwertszeit bei einer langsamen Ausscheidungs
kinetik einer hohen Strahlendosis ausgesetzt würde, wird Se
len-75 als Markierungsnuklid für Radiopharmaka heute nicht
mehr verwendet. Aufgrund der langen Halbwertszeit und der
niederenergetischen y-Strahlung hat das Selen-75 jedoch Be
deutung für die Syntheseentwicklung und in vitro-Studien als
Substitut für Selen-73 Verbindungen erlangt, da es trägerfrei
(n.c.a.) am Zyklotron erzeugt werden kann [13].
Tab.1.2-1: Nukleare Eigenschaften von Selen-73 und Selen-75
Nukleare Eigenschaft Se1en-73 Selen-75
Halbwertszeit 7,lh 120d
Zerfallsart ß+ (65) EC (100)
(% Häufigkeit) EC (35)
Haupt-y-linie 511 (130) 265 (58)
[keV] (% HäUfigkeit) 361 (97)
Tochternuklid Arsen-73 Arsen-75
Zerfallsart des EC (tJ, = 80d) stabil
Tochternuklids
6
Selen-73 zerfällt mit einer Halbwertszeit von 7, 1h zu 65%
durch einen ß+-Zerfall und zu 35% durch Ee und ist somit, an
ders als Selen-75, für PET geeignet. Die vorteile gegenüber
den anderen wichtigen PET-Nukliden sind in der langen Halb
wertszeit begründet. Durch die Markierung geeigneter MOleküle
könnten Stoffwechsel funktionen mit langsamen Kinetiken (z.B.
Immunreaktionen, proteinsynthese) untersucht werden. Des
weiteren besteht durch die lange Halbwertszeit die Möglich
keit, das Radiopharmakon zur medizinische Anwendung an Kli
niken zu verschicken, die nicht über ein Zyklotron verfügen
(Satellitensystem). Nachteilig bei dem Einsatz von Selen-73-
markierten PET-Pharmaka ist jedoch die begleitende y-Strah
lung, die durch den Ee-Zerfall des instabilen Tochternuklids
Arsen-73 (100% Ee) und Selen-73 (35% Ee) entsteht. Diese zu
sätzliche Strahlenbelastung des Patienten ist nicht unbe
trächtlich [13].
Die wichtigsten Kernreaktionen zur Bildung von Selen-73 und
Selen-75 sind in Tabelle 1.2-2 dargestellt. Die höchsten Aus
beuten an Selen-75 werden durch die n,y-Reaktion im Kern
reaktor erzielt. Da durch das Ausgangsmaterial (Target) inak
tives Selen-74 in großen Mengen zugegen ist, ist sie jedoch
nicht zur Produktion von n.c.a. Selen-75 geeignet. Durch die
beiden Zyklotron-Kernreaktionen läßt sich das Selen-75 n.c.a.
herstellen. Das natürliche Arsen als Targetmaterial ist
monoisotopes Arsen-75, so daß die Kosten niedrig sind [13].
7
Tab. 1. 2 -2: Kernreaktionen für die Bildung von Selen-73 und
Selen-75 [13-15]
Kernreaktion Teilchenenergiebereich max. Ausbeute
Selen-75 MeV bei max. 0- [MBq(mCi)/~Ah]
74Se (n,'Y) crt-~h = 51000 mb GBq (ei)-Bereich
75As (d,2n) 20 ~ 12 1,67 (0,045)
75AS (p,n) 15 ~ 5 2,22 (0,06)
Selen-73
75As (p,3n) 40 ~ 30 1406 (38)
75As (d,4n) 45 ~ 30 651 (17,1)
natGe (3He,xn) 36 ~ 13 37 (1,0)
72Ge (3He,2n) 55 (1,5)
natGe (4He,xn) 28 ~ 13 26 (0,7)
70Ge (4He,n) 126 (3,4)
Die höchsten Ausbeuten für die Produktion von Selen-73 erhält
man über die (p,3n)- bzw. (d,4n)-Reaktionen am Arsen-75. Vor
aussetzung für diese Kernreaktionen ist aber ein Zyklotron,
welches Protonen bzw. Deuteronen im Energiebereich von 30 bis
40MeV erzeugen kann. Die Anregungsfunktionen der 75As(p,xn)
Reaktionen (siehe Abbildung 1.2-3) zeigt deutlich, daß bei
höheren Protonenenergien der wirkungsquerschnitt für die
(p, 4n) -Reaktion stark ansteigt. Deshalb nimmt die radionu
klidische Verunreinigung an Selen-72 besonders oberhalb von
40MeV zu. Im Bereich von 30 bis 40MeV wird vorwiegend Se
len-73 über die (p,3n)-Reaktion gebildet. Unterhalb von 30MeV
fällt der wirkungsquerschnitt für den (p, 3n) -Prozeß schnell
ab. Unterhalb 25MeV protonenenergie erfolgt fast nur noch die
Bildung des Selen-75
Protonenenergie von
Selen-73 und durch
durch die (p,n)-Kernreaktion. Durch eine
40MeV ist also eine Produktion von
Protonen von 20MeV die Produktion von
8
Selen-75 in hoher Radionuklidreinheit und guten Ausbeuten
gewährleistet. Bei Verwendung eines Kompaktzyklotrons mit
24MeV Protonen (z. B. das JÜlicher CV 28) kann nur n. c. a.
Selen-75 in einer guten Ausbeute erzeugt werden. Selen-73 ist
nur durch die Kernreaktion von Germanium mit 4He-Teilchen
zugänglich. Zur Selen-73 Produktion mit zufriedenstellender
Ausbeute muß hier jedoch teures, angereichertes Germanium-70
(20,5% des natürlichen Germaniums) verwendet werden [13,15).
Deshalb ist die Selen-73 Produktion mit einem größeren
Zyklotron (40MeV Protonen) vorzuziehen.
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o 10 20 30 40 so Incidenl proton energy (MeV)
Abb.1.2-3: Anregungsfunktionen für 75As(p,xn)-Kernreaktionen
[13 )
9
1.3. Chemische und kinetische Aspekte bei Reaktionen mit trä
qerfreien (n.c.a.l Radionukliden
Die spezifische Aktivität eines Radiopharmakons ist ein ent
scheidender Parameter für die Anwendung in der Nuklarmedizin.
In diesem Zusammenhang wird zwischen trägerfreien, no carrier
added (n.c.a.) und geträgerten radioaktiven Produkten unter
schieden. Trägerfreie Synthesen sind prinzipiell nur mit
künstlichen Elementen wie Technetium und Astat realisierbar.
Radioisotope natürlich vorkommender Elemente werden immer
während der Produktion und der synthese durch isotopen Träger
verdünnt. Erfolgt dies ungewollt durch Verunreinigungen der
verwendeten Chemikalien bzw. Reaktionsgefäße oder durch Kon
takt mit der Atmosphäre, spricht man von einem no carrier
added (n.c.a.) Produkt. Bei einer geträgerten Synthese er
folgt die gezielte Zugabe des stabilen Isotops. Als nicht
isotopen Träger bezeichnet man beispielsweise die Verdünnung
von Selen-75 mit Schwefel.
Die spezifische Aktivität As ist die Aktivität A bezogen auf
die Masse m [35]:
= Alm [ Bq I g ]
A ist die Zerfallsrate des radioaktiven Nuklids. Sie hängt
von dessen Stoffmenge und Halbwertszeit Tla ab:
A = -dN/dt = ~ . N = ln2 N/Tla
~ = Zerfallskonstante [S-1] , N = Anzahl der radioaktiven
Atome
Daraus folgt eine Abnahme der spezifischen Aktivität bei län
geren Halbwertszeiten des Radionuklids.
Für den Einsatz hochtoxischer oder zentralwirksamer Substan
zen in der Radiopharmazie ist der Trägergehalt ein wichtiges
Kriterium. Da beispielsweise in der Hirnrinde die Rezeptor
dichte nur im Bereich von prnol/g Hirnprotein liegt, ist bei
10
der Markierung Rezeptor-bindender Liganden
Produkt gefordert, da anderenfalls die
ein trägerarmes
Rezeptorplätze
vorwiegend durch inaktive Moleküle besetzt werden und ein
Nachweis auf grund der Radioaktivität nicht mehr möglich ist.
Bei Radionukliden mit relativ kleinen Halbwertszeiten liegen
die stoffmengen im nanomol-Bereich. Aufgrund der kleinen
Stoffmengen ist ein sehr sorgfältiges Arbeiten erforderlich,
um die Verunreinigung mit isotopen Träger möglichst gering zu
halten. Insbesondere beim Arbeiten mit 11C müssen wegen der
Häufigkeit des 12C besondere Vorsichtsmaßnahmen (z.B. Aus
schluß von C02) getroffen werden. Trotzdem sind Isotopen
verdünnungen um den Faktor 10-10000 praktisch unvermeidlich
[1] •
Die Notwendigkeit, hohe spezifische Aktivitäten zu erreichen,
kann aber bei der Synthese erhebliche Probleme bereiten, da
sich normale präparative Umsetzungen nur bedingt auf den Sub
nanogrammbereich übertragen lassen. So können Adsorptions
effekte an der Wand des Reaktionsgefäßes oder an Nieder
schlägen und Staubpartikeln eine große Bedeutung haben. Bei
spielsweise liegt die Austauschkapazität einer Glasoberfläche
mit ca. 10-10 mol cm-2 in der Größenordnung der Radionuklid
stoffmenge. Außerdem sind bei n.c.a. Synthesen Nebenreak
tionen mit dem Lösungsmittel oder mit Verunreinigungen der
verwendeten Chemikalien oder Solventien zu beachten. Da die
Verunreinigungen in Suprapur-Chemikalien oft noch zu hoch
sind, gilt der Reinigung der Reagenzien besondere Aufmerk
samkeit.
Die kinetischen Beschreibungen makroskopischer präparativer
Synthesen sind meistens auf die Reaktionen mit n.c.a. Radio
nukliden nicht direkt übertragbar. stöchiometrische Bedin
gungen sind für die Reaktion zwischen dem radioaktivem Rea
genz A und dem Edukt B praktisch nicht zu erreichen, vielmehr
ist der Überschuß an B so groß, daß dessen Konzentration im
Verlauf der Reaktion als konstant angesehen werden kann. Die
Konzentration des Eduktes [B] kann demzufolge in die Gleich
gewichtskonstante mit einbezogen werden.
11
Für die zeitliche Abhängigkeit der Konzentration des
Produktes [P] gilt:
[P] = [AO] . (l-e-k ' ·t) mit k' = k . [B]
k = Geschwindigkeitskonstante ; t = Reaktionszeit
Es handelt sich demnach um eine Reaktionskinetik pseudo er
ster Ordnung. Wird die Reaktionszeit konstant gehalten und
die Eduktkonzentration [B] variiert, so kann die Reaktions
zeit in die Gleichgewichtskonstante einbezogen werden und es
ergibt sich für die Beschreibung der Reaktionskinetik:
[P] = [AO] . (l-e-k " [B]) mit k' = k . t
Für den Reaktionsverlauf ist, ebenso wie bei der zeitab
hängigkeit, eine Kinetik pseudo erster Ordnung zu beobachten.
Mit zunehmender Eduktkonzentration [B] erfolgt also ein expo
nentieller Anstieg der Produktkonzentration [P]. Die Steigung
dieser Funktion ist abhängig von der tatsächlichen Geschwin
digkeitskonstanten k und der Reaktionszeit t.
Die chemischen und kinetischen Unterschiede zu makro
skopischen Synthesen, sowie die kurzen Halbwertszeiten der
Radionuklide erfordern die Beachtung folgender Punkte bei der
Synthese von Radiopharmaka:
• Der Zeitbedarf für Synthese, Reinigung und Qualitäts
kontrolle sollte nicht größer als etwa drei Halbwerts
zeiten sein, so daß schnelle Synthesen und Analysen
methoden (GC, HPLC) Anwendung finden.
• Um Nebenreaktionen und Adsorptionsverluste zu umgehen,
müssen hochreine Chemikalien und Sol ventien sowie geeig
nete Werkstoffe verwendet werden.
• Die Markierungsreaktion sollte möglichst erst im letzten
Reaktionsschritt erfolgen.
12
1.4. Methoden zur Radiose1enierunq organischer Moleküle
Selen und seine Homologen Schwefel und Tellur unterscheiden
sich in ihren chemischen Eigenschaften nur geringfügig. Für
die Funktionsdiagnostik in der Nuklearmedizin sind die Halb
wertszeiten der positronenemittierenden Schwefelisotope je
doch zu kurz. Zur Markierung schwefelhaltiger Biomoleküle
oder Pharmaka bieten sich deshalb die Radioisotope des Selens
als Analogtracer an. Das physiologische Verhalten der Verbin
dungen wird aufgrund der chemischen Ähnlichkeit normalerweise
kaum beeinflußti die stabilität der Selenverbindungen ist al
lerdings etwas geringer. Eine Möglichkeit der Markierung mit
Selen ist die Synthese isosterer Verbindungen, wobei das Se
lenisotop als Substitut für eine CH2-Gruppe eingesetzt wird.
Durch die geänderte Polarität kann jedoch die Biochemie des
Radiopharmakons wesentlich beeinflußt werden. Aufgrund der
stabilsten Oxidationsstufe (-2) in organischen Molekülen ei
gnet sich die Stoffklasse der Selenoether und seiner Derivate
(z.B. Selenoniumverbindungen) besonders zur Selenmarkierung.
Die Bildung der ebenfalls stabilen Diselenide ist aus
statistischen Gründen bei einer n. c. a.
wahrscheinlich.
Synthese nicht
Obwohl Selen-73 und Selen-75 schon seit längerer Zeit n.c.a.
produz iert werden können (siehe Abschnitt 1.2.), waren syn
thesen radiopharmazeutisch relevanter Verbindungen bisher nur
unter Zusatz von inaktivem Selen möglich. Bei Verwendung von
Reaktorselen ist der isotope Träger in Form von Selen-74 be
reits durch das Ausgangmaterial zugegen, ansonsten erfolgt
die Zugabe von natürlichem Selen vor oder nach der Isolierung
des Selen-75 (oder Selen-73) aus dem Target. Ausgangsver
bindungen für Markierungen sind hauptsächlich [75se] Selenit
und elementares Selen-75 bzw. Selen-73, welche durch chemi
sche oder biochemische Methoden zu Radioselenopharmaka umge
setzt werden können.
13
In der präparativen Chemie werden Selenoether meistens durch
Reduktion von elementarem Selen und anschließender Umsetzung
mit einem Alkylierungsagens synthetisiert. Als Reduktions
mittel wird vorwiegend Natrium oder Natriumborhydrid verwen
det [16]. Da prinzipiell kein Unterschied zwischen einer
Radiosynthese mit Trägerzusatz und einer inaktiven Synthese
besteht, ist die Reduktion mit Natrium oder Natriumborhydrid
auch bei der Darstellung von symmetrischen [75Se ]Selenoethern
weit verbreitet, so beispielsweise bei der Reduktion von
seleniger Säure und anschließender umsetzung mit RX zur syn
these von [75Se ]Diaminoalkylselenoether (s.Abb. 1.4-1). MOSE
und PIPSE besitzen einen pKa-Wert in der Größenordnung des
pH-Wertes des Blutes. Dadurch können durch lokale pH-Diffe
renzen Anreicherungen nach der Passage der Blut-Hirn-Schranke
erreicht werden [18,19]. Disubstituierte Selenoharnstoffe
(s.Abb.1.4-1) werden durch Umsetzung von Carbodiimiden mit
[75Se ]Natriumhydrogenselenid erhalten [17]. Sie können als
Vorläufer zur Darstellung von [75Se ]Selenoethern oder
[75Se ]Selenoestern eingesetzt werden.
75 Se
R 11 R' '-N~N/
Selenoharnstoffe
1
75 seR2 1
MOSE
PIPSE
Abb.1.4-1: Beispiele für Markierungen mit Selen-75 unter
Trägerzusatz
14
Die Synthese unsymmetrischer Selenoether erfolgt in vielen
Fällen durch Reduktion eines symmetrischen Diselenids und der
anschließenden Alkylierung des Alkylselenidanions [161. Da
das Diselenid als Zwischenstufe entsteht, kann dieser Reak
tionsweg nicht auf eine n.c.a. Synthese übertragen werden.
Ein Beispiel für die Synthese eines unsymmetrischen [75Se 1Se
lenoethers über ein Diselenid ist das [75Se 1 Selenopergolid
(s. Abb.1.4-2) [201. Das Schwefelanalogon ist ein starker
Dopaminagonist, so daß mit dem Selen-75-markierten Analog
tracer Untersuchungen an Dopaminrezeptoren durchgeführt wer
den könnten. Selen-75 markierte Steroide, z.B. [75Se 1-24-
(Isopropylseleno)chol-5-en-3-ol [211 und [75Se 1-6-[(Methyl
seleno)methy11-19-norcholest-5(10)-en-3-ol [221 (s.Abb. 1.4-2
und 1.4-3), sind aufrund der langen Halbwertszeit für die
Diagnostik von Erkrankungen der Nebennierenrinde geeignet, da
die Szintigramme im Verlauf mehrerer Tage wiederholt werden
müssen [231. Sie werden jedoch wegen der relativ hohen
Strahlendosis kaum noch eingesetzt.
7 10e
N~
HN
Selenopergolid
HO
24-(Isopropylselenolchol-5-en-3-o1
Abb.1.4-2: Beispiele für die Selen-75 Markierung unsymmetri
scher Selenoether durch Reduktion eines Diselenids
15
Ebenso zu den Steroiden gehört das Gallensäurederivat
[75Se 1Tauro-23-seleno-25-homocholsäure (s.Abb. 1.4-3) [241,
welches zum Studium der Gallensäureresorption und des entero
hepatischen Kreislaufes eingesetzt wurde [251.
HO 75 /'
Se
HO OH
/'.. ,NH 75 - '-/ ~ Se 11
o SO H 3
Tauro-23-seleno-25-homocholsäure
6-[(Methylseleno)-methyl]-19-norcholest-5(10)-en-3-o1
Abb.1-4-3: Selen-75 markierte Steroide
Zur Darstellung der Selenoniumverbindungen (als potentielle
Blutflußtracer) [75Se 1Dimethylselenoniumcysteiniodid und
[75Se 1Trimethylselenoniumiodid wird geträgertes [75Se 1Seleno
cystin mit Natriumborhydrid und Methyliodid umgesetzt [261.
Von den selenanalogen Aminosäuren hatte früher nur das
[75Se 1Selenomethionin eine gewisse nuklear.medizinische Bedeu
tung erlangt. Es diente zur szintigraphischen Darstellung des
Pankreas, obwohl die lange Halbwertszeit des Selen-75 eine
hohe Strahlenbelastung für den Patienten bedeutete [271.
[75Se 1Selenomethionin und [75Se1Selenocystin lassen sich über
ein biochemisches Verfahren synthetisieren. Dazu werden Hefe
kulturen mit Selen-75 in For.m von geträgertem [75Se 1Selenit
versetzt. Dadurch wird das Selen in die Proteine der Zellen
eingebaut. [75Se1Selenomethionin kann durch Hydrolyse der
Proteine und anschließende Reinigung in einer radiochemischen
Ausbeute von 20-40% erhalten werden. Die spezifische
16
AktivitMt beträgt 370GBq/mmol, bei einer Synthesedauer von 30
Stunden [28]. Die Übertragung dieser biochemischen Methode
auf das PET-Nuklid Selen-73 ist nicht sinnvoll, da bei einer
Halbwertszeit von 7,1h schon über 95% der Radioaktivität nach
der synthese zerfallen wären. Eine schnellere chemische Syn
these von [75Se ] Selenomethionin beschrieb 1987 Plenevaux et
al. [29]. Hierbei wird elementares, getrMgertes Selen-75
zuerst mit Methyllithium und dann mit 2-Amino-4-brombutter
säure (ABB) umgesetzt:
75 Se
MeLi 75 ,
----. H C-SeLl. 3
ABB •
Auf diese Weise dargestelltes [15Se ] Selenomethionin erhMlt
man in einer radiochemischen Ausbeute von 75-80% und einer
spezifischen Aktivität von 370GBqjmmol.
Durch Verwendung von Selen-73 ist auf dem gleichen Reaktions
weg trägerhaltiges [73Se ]Selenomethionin synthetisiert worden
[30]. Dieses Aminosäureanalogon könnte als Radiopharmakon für
PET eingesetzt werden und eine Alternative zum kurzlebigen
[11C]Methionin darstellen.
Eine seltener angewandte Methode zur Darstellung von Se
lenoethern ist die Reaktion über Trialkylphosphine [31]:
2 R-X Ph-Se-Se-Ph • 2 Ph-Se ----. 2 Ph-Se·R
2. NaOH
Ausgehend vom 1 mol Diphenylselen.id werden durch Umsetzung
mit Tributylphosphin und Natronlauge 2 mol Phenylselenid
anionen gebildet. Bei der Reaktion mit einfachen Alkylhalo
geniden entstehen die Alkylphenylselenoether in einer Aus
beute von 76-96%.
17
Durch eine ähnliche Reaktionsführung kann der [1SSe] Benzy1-
methylselenoether n.c.a. dargestellt werden [32]. Dazu wurden
die für inaktives Selen bekannten Reaktionen von SeO mit
Triphenylphosphin zum Triphenylphosphinselenid [33] und die
Alkylierung mit Methyltriflat zum Methylselenotripheny1-
phosphoniumtriflat [34] auf die n.c.a. Synthese mit polymer
gebundenem Triphenylphosphin übertragen. Durch die Einwirkung
von Basen und die Reaktion mit Benzylbromid entsteht derun
symmetrische Selenoether [7SSe ]Benzylmethylselenoether n.c.a.
in einer radiochemischen Ausbeute von bis zu 69%.
18
1.5. Zum Einbau von Se1enomethionin in Proteine
In den Zellen des Körpers findet ständig ein Aufbau von Pro
teinen statt, um die benötigten Funktions-, Struktur- und ex
portablen Proteine (z.B. Sekrete) bereitzustellen. Die ein
zelnen Grundbausteine der Proteine, die Aminosäuren, werden
hierzu zuerst aus dem Blutplasma in die Zellen transportiert,
wo dann in den Ribosomen die Proteinsynthese erfolgt. Dazu
wird der genetische Code im Zellkern von der DNA auf die
m-RNA übertragen. In den Ribosomen lesen die t-RNAs die Ami
nosäuresequenz von der m-RNA ab und verknüpfen die Amino
säuren in der festgelegten Reihenfolge zu einem spezifischen
Protein. Die Anzahl und Struktur der synthetisierten Proteine
ist in den einzelnen Organen (-teilen), bedingt durch deren
jeweilige Funktion, sehr unterschiedlich [36,37].
Die nicht-essentielle Aminosäure Selenomethionin wird eben
falls in Proteine eingebaut [38]. Hierbei erfolgt die nicht
spezifische Inkorporation in das Protein anstelle von Methio
nin. In welchem Maße Selenomethioniri Methionin ersetzen kann,
ist von deren molaren Verhältnis abhängig. Andererseits wurde
auch der Einbau in spezifische Selenoproteine oder Seleno
proteinuntereinheiten (13 verschiedene Selenoproteine sind
bisher bekannt) beobachtet [39].
Soll die Proteinbiosynthese über den Aminosäureumsatz
beschrieben werden, ist neben dem Transport der Aminosäuren
aus dem Blutplasma in die Zelle ebenfalls zu beachten, daß
Aminosäuren auch an anderen Stoffwechsel vorgängen beteiligt
sind. Werden diese vernachlässigt, was im Einzelfall zu prü
fen ist, kann ein Drei-Kompartimentmodell für den Amino
säurestoffwechsel aufgestellt werden. Die drei Kompartimente
erfassen die freie Aminosäure im Blutplasma, die freie Amino
säure in den Zellen und die in Proteine inkorporierte Amino
säure [am Beispiel des Methionin s. 40].
Die Proteinsynthese kann
stoffwechsels mittels SPET
durch Erfassung des Aminosäure
oder PET untersucht werden, wenn
19
entsprechende markierte natürliche Aminosäuren oder ihre Ana
loga zur Verfügung stehen. Das Pankreas ist ein Organ mit
einer hohen proteinsyntheserate, die aus der Sekretion von
Polypeptiden (z.B. Insulin) resultiert. Deshalb wurde früher
das über eine biochemische synthese dargestellte [75Se ]
Selenomethionin für die Pankreas-Szintigraphie eingesetzt
[27]. Diese wird aber nur noch selten bei speziellen Fra
gestellungen durchgeführt, da die Strahlenexposition des
Patienten (aufgrund der langen Halbwertszeit von 120 Tagen)
relativ hoch ist und sich für die pankreasdiagnostik die
Sonographie und Computer-Tomographie als geeigneter erwiesen
haben. Der abweichende Stoffwechsel von Tumorgewebe bewirkt
ebenfalls eine gesteigerte Proteinsynthese und damit einen
hohen Aminosäureumsatz. Dieser läßt sich ebenfalls durch SPET
oder PET erfassen. Insbesondere bei Hirntumoren ist eine gute
Korrelation zum Malignitätsgrad zu erkennen. Eine Abgrenzung
zwischen einern Resttumor und nekrotischem Gewebe ist bei be
strahlten Hirntumoren oft nur mittels PET möglich [23]. Für
diese Untersuchungen erfolgte die Entwicklung kurzlebiger
meist positronenemittierender Aminosäuren, wie z.B. [18F]-2-
Fluortyrosin [41], [llC]Methionin [42,43], [llC] Tryptophan
[44], [llC]Valin [45], [18F]-p-Flourphenylalanin [46], [llC]
Leucin [47]. Als Aminosäureanaloga wurde das [73Se ]Seleno
methionin unter Zusatz von isotopem Träger synthetisiert
[30]. Da die Kinetik der Proteinsynthese relativ langsam ist,
könnte im Vergleich zum [llC]Methionin die Markierung mit
einem langlebigen Positronenstrahler vorteile für zeitauf
wendige PET-Untersuchungen bringen. Zuerst müssen aber die
Auswirkungen des Trägergehaltes auf die biochemischen Gleich
gewichte geprüft werden.
20
2. Problemstellung
Von den positronenemittierenden Selennukliden ist nur Se
len-73 (t"2=7, 1h) als Markierungsisotop für die Positronen
Emissions-Tomographie (PET) geeignet. Es kann sowohl als Ana
logtracer für Schwefel eingesetzt werden als auch unter Bil
dung isosterer Verbindungen eine CH2-Gruppe eines Pharmakons
substituieren. Selen-75-markierte Radiopharmaka wurden früher
in der planaren Szintigraphie und der Single-Photon-Emission
Tomographie (SPET) eingesetzt, so z.B. [75Se jSelenomethionin
für die Pankreasdiagnostik. Aufgrund der hohen Strahlen
exposition durch die lange Halbwertszeit, wird Selen-75
jedoch heute fast nur noch für die Entwicklung von Selen-73-
synthesen eingesetzt. Da beide Radionuklide praktisch trä
gerfrei (n.c.a.) am Zyklotron produziert werden können, ist
die Übertragung einer Selen-75- auf eine Selen-73-synthese
möglich. Für die Untersuchungen sollte deshalb Selen-75
(t"2=120d), das über die Kernreaktion 75As(p,n)75se zugänglich
ist, eingesetzt werden.
ziel der Arbeit ist die Synthese von unsymmetrischen n.c.a.
[73,75Se jSelenoethern, die in der nuklearmedizinischen Funk
tionsdiagnostik Anwendung finden könnten. Grundlage war ein
synthesekonzept der [75Se jSelenierung unter Zuhilfenahme von
polymergebundenem Triphenylphosphin. Dieses Verfahren bietet
den vorteil gegenüber anderen Selenierungsreaktionen, daß die
Markierungsprodukte praktisch träger frei hergestellt und so
toxische Effekte vermieden werden können.
Für die Markierungsreaktion mit dem Triphenylphosphin sollte
das Selen-75 aus dem Targetmaterial trägerfrei isoliert und
in elementarer Form in ein inertes Solvens überführt werden.
Speziell für die synthese von n.c.a. [75Se jMethylselenoethern
sollten die Reaktionsbedingungen für die Darstellung der
Zwischenstufen [75SejTriphenylphosphinselenid, [75Se jMethyl
selenotriphenylphosphoniumtriflat und [75Sej Methylselenid un
tersucht und optimiert werden.
21
Für pharmakokinetische in vivo Untersuchungen des Einbaus von
[73Se jSelenomethionin in Proteine mittels PET sollte die Mar
kierung dieser Aminosäure mit n.c.a. Selen-75 durchgeführt,
optimiert und das Produkt nach chromatographischer Reinigung
in eine applizierbare Form überführt werden.
Zielgerichtet auf die spätere Markierung pharmakologisch
relevanter Proteine und Antikörper war auch die Synthese
einer Selen-75 markierten prosthetischen Gruppe von Inter
esse. Zur [75Se jSelenoalkylierung von Aminofunktionen sollte
die [75Se jMethylselenopropylgruppe verwendet werden. Für die
Markierung mit Selen-75 sollte zunächst ein geeigneter Vor
läufer gesucht werden, der die Darstellung der [75Se jMethyl
selenopropylgruppe in hohen radiochemischen Ausbeuten ermög
licht. Im Anschluß daran sollten optimale Bedingungen für die
Umsetzung zu einem Amin-reaktivem [75Se jSelenoalkylierungs
agens erarbeitet werden. Für die einzelnen Reaktionsschritte
sollten jeweils schnelle chromatographische Trennmethoden
entwickelt werden, um das Produkt in einer hohen radio
chemischen Reinheit zu isolieren. Im Hinblick auf die
[75Se j Selenoalk;ylierung von Polypeptiden sollte schließlich
die Umsetzung mit geeigneten Modellverbindungen untersucht
werden.
22
3. Experimenteller Teil
3.1. Bezuqsnachweis und Qualität der verwendeten Chemikalien
In Tabelle 3.1-1 sind die verwendeten Chemikalien aufgeführt.
Wasserfreie Lösungsmittel wurden ohne weitere Reinigung und
Trocknung zur Synthese eingesetzt. Die anderen Chemikalien
und Lösungsmittel wurden nach Standardmethoden gereinigt und
getrocknet (siehe z.B. [48]).
Tab.3.1-1: Verzeichnis der für die synthesen verwendeten
Chemikalien
Chemikalie
Aceton
Acetonitril
2-Aminobutyrolacton
Arsentrioxid
Benzol
Benzylbromid
Brompropanol
Na-tert.-Butoxycarbonyl
Lysinmethylester
1-Butylamin
1-Chlor-3-iodpropan
1,3-Dibrompropan
Dichlorethan
Diethylether
Dimethylformamid
Dimethylsulfoxid
Essigsäure
Ethanol
Ethylacetat
4-Heptanon
Hexamethylphosphorsäure
triamid
Bromwasserstoff
Hersteller Qualität/Gehalt
Riedel-de-Haen p.a.
Merck f. d. DNA-Synthese
Riedel-de-Haen Chromasolv
Aldrich
Merck
Merck
Aldrich
Fluka
Bachem
99%
p.a.
f.d. Spektroskopie
97%
purum
99%
Merck p.a.
Fluka purum
Aldrich 99%
Merck reinst
Merck reinst
Fluka wasserfrei,purriss
Fluka wasserfrei,purriss
Merck >98,5
Riedel-de-Haen p.a.
Merck p.a.
Fluka purum
Aldrich 99%
Merck
23
Chlorwasserstoff
4-Hydroxypiperidin
Kaliumhydroxid
18-Krone-6
Kryptof iX®2 .2.2.
Methanol
Methylethylketon
Methyllithium
Methyliodid
Natriumcarbonat
Natriumhydrogencarbonat
Natriumhydroxid
Natriumiodid
1,3-Propandiol-di
O-p-toluolsulfonat
Pyridin
Pyrokohlensäure-di-tert.
butylester
Salzsäure
Schwefeldioxid
Selen (schwarz)
L-Selenomethionin
Silbertoluolsulfonat
Tetrabutylammonium
hydroxid
Merck
Fluka
Merck
Fluka
Merck
Riedel-de-Haen
Aldrich
Fluka
Aldrich
Fluka
Merck
Merck
Merck
Aldrich
Merck
Fluka
Riedel-de-Haen
Merck
Merck
Serva
Fluka
Aldrich
Tetrahydrofuran Fluka
Tetramethylammonium- Aldrich
hydroxid
Toluol Merck
Toluolsulfonsäurechlorid Aldrich
Trifluormethansulfon- Fluka
säuremethylester
Triphenylphosphin polymer Fluka
gebunden
Triphenylphosphinselenid Merck
Wasserstoffperoxid Merck
24
>98%
p.a.
>97%
>99%
absolut, p.a.
99+%
1,6M in Ether
99%
wasserfrei, >99,5%
p.a.
p.a.97%
99%
98%
absolut, p.a.
>97%
33% p.a.
>99,98%
>99%
purum
purum
40 Gew.%in H20
wasserfrei,purriss
99%
p.a.
98%
purum
200-400 mesh
98%
30%, reinst
3.2. Geräte zur Charakterisierung der dargestellten Verbin
dungen
Die Charakterisierung der synthetisierten Ausgangs- und Refe
renzsubstanzen erfolgte durch 1H-NMR-spektroskopie, IR-spek
troskopie, teilweise auch durch Schmelzpunktanalyse, Elemen
taranalyse und Massenspektrometrie. Folgende Geräte wurden
dabei verwendet:
1H-NMR-spektroskopie: Bruker WP 80 (Signale gemessen gegen
TMS als interner Standard, die chemische Verschiebung 0 wurde
in ppm angegeben)
IR-Spektroskopie: Shimadzu IR-440 (gemessen als KBr-Press
linge)
Schmelzpunktbestimmung: MettIer FP 61
Die Elementaranalysen wurden in der Zentralabteilung für
Chemische Analyse der KFA Jülich durchgeführt.
Die massenspektroskopischen Messungen wurden im Institut 4
für Erdöl und Organische Geochemie der KFA Jülich durch
geführt.
Die verwendeten chromatographischen Geräten sind in Abschnitt
3.5, Analytische Verfahren, näher beschrieben.
Schmelzpunkte und Siedepunkte sind nicht korrigiert worden.
Kontrolle des Reaktionsverlaufes und der Reinheit der Pro-
dukte erfolgte
(Kieselgel Si-60
teilweise über Dünnschichtchromatographie
auf Aluminium der Firma Merck) .
25
3.3. Darstellung inaktiver Ausgangs- und Referenzsubstanzen
Um die chromatographisch getrennten n.c.a. Selen-75-Frak
tionen eindeutig zu identifizieren, müssen die chromato
graphischen Daten der inaktiven Selenverbindungen bekannt
sein. Da die untersuchten Selenverbindungen
ziell nicht erhältlich waren, mußten
teilweise kommer
sie -teilweise
erstmalig- synthetisiert werden, ebenso die nicht kommerziell
erhältlichen Ausgangsverbindungen.
O-Tosyl-2-amino-4-hydroxybuttersäure (O-Tosylhomoserin) [491
7,2g (40mmol) 2-Aminobutyrolacton Hydrobromid und 11,2g
(40mmol) Silbertosylat werden fein gemörsert, in 150ml DMF
gelöst und 3h unter Argon sonofiziert. Dabei steigt die Tem
peratur auf 50-60°C an. Danach werden die Silbersalze abfil
triert und das Lösungsmittel abdestilliert. Der Rückstand
wird in heißem Ethanol gelöst, nochmals filtriert und zum
Auskristallisieren des Produktes über Nacht in der Kälte ste
hen gelassen. Nach Entfernen des Lösungsmittels erhält man
6,67g (24mmol, 61% Ausbeute) O-Tosylhomoserin.
Fp.: 210°C
1H-NMR-Spektrum (CD30D): 7,2-7.8ppm (Ar,4H); 4,35ppm (t,2H);
4,30ppm (t,lH); 2,65ppm (m,2H);
2,30ppm (s,3H)
IR-Spektrum (als KBr-Pressling): V (N-H) 3425cm-1 ,
Elementaranalyse:
Vas,s(C-H) 3045cm- 1+2975cm- 1+2815cm- 1 ,
V (C=O,COOH) 1730cm- l
C: 45,3% (47,5%,theor.)
H: 5,0% (5,4%)
N: 5,1% (5,3%)
S: 12,4% (12,2%)
26
O-Tosyl-2-amino-4-hydroxybuttersäuremethylester (O-Tosylhomo
serinmethylester) [in Anlehnung an SOl
2,Og (7,Ommol) O-Tosylhomoserin werden in 100ml absolutem
Methanol gelöst. Nach Einleiten von gasförmigem Chlorwasser
stoff unter Eisbadkühlung bis zur Sättigung wird die Lösung
über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Danach wird das
Lösungsmittel bei 40·C abdestilliert und der Rückstand über
NaOH getrocknet. Die Reinigung des Produktes erfolgt durch
Säulenchromatographie (Kieselgel-Si60, Eluens: THF 90/
Methanol 10 v/v) .
Ausbeute: 750mg (2,5mmol) 36%
Fp.: 123,5·C
lH-NMR-Spektrum (CD30D): 72-7,8ppm (Ar,4H); 4,20ppm (t,1H);
3,81ppm (s,3H); 3,75ppm (t,3H);
2,35ppm (s,3H), 2,15ppm (m,2H)
IR-Spektrum (als KBr-Pressling): v(N-H) 3390cm- 1 , vas,s(C-H)
3040cm-1 +2950cm- 1 , v(C=O) l741cm- 1
Elementaranalyse: C: 46,5% (46,0%,theor.)
H: 5,6% (5,6%)
N: 5,1% (5,6%)
S: 9,1% (10,3%)
N-BOC-2-AminO-4-brom-buttersäureethylester
2-Amino-4-brom-buttersäureethylester [in Anlehnung an 51J
2,9g (19mmol) fein gemörsertes 2-Aminobutyrolacton Hydro
bromid werden in 200ml absolutem Ethanol suspendiert. Durch
zweistündiges Einleiten von gasförmigem HBr unter Eiskühlung
entsteht eine klare Lösung, die noch 3h bei Raumtemperatur
gerührt wird. Danach destilliert man das Lösungsmittel bei
27
max. 40°C ab, löst den Rückstand in wenig Ethanol und fil
triert das nicht umgesetzte 2-Aminobutyrolacton ab. Nach Ent
fernen des Lösungsmittels beträgt die Ausbeute des zähflüs
sigen Produktes 4,7g (~6mmol, 84%). Es wird ohne weitere Rei
nigung für die weitere Umsetzung eingesetzt.
~H-NMR-Spektrum (CD30D): 4,35ppm (q,2H); 4,25ppm (t,~H);
3,65ppm (t,2H); 2,55ppm (m,2H);
~,35ppm (t,3H)
N-BOC-2-Amino-4-brombuttersäureethylester [in Anlehnung an
52]
4,7g (~6mmol) 2-Amino-4-brom-buttersäureethylester werden in
Ethanol gelöst und mit ~3,4g Natriumhydrogencarbonat ver
setzt. Nach Zugabe von 4,8ml (2~ol) Pyrokohlensäure-di
tert. -butylester wird 2h sonofiziert. Das Natriumhydrogen
carbonat filtriert man ab, destilliert das Lösungsmittel ab
und nimmt den Rückstand in Chloroform auf. Nach einer wei
teren Filtration wird die Chloroformlösung mehrmals mit wäß
riger KHS04-Lösung ausgeschüttelt und über Na2S04 getrocknet.
3,5g kristallines Produkt (~~ol, 7~% Rohausbeute) erhält
man nach Abdestillieren des Lösungsmittels. Die weitere Rei
nigung erfolgt durch präparative HPLC (LiChrosorb RP-~8-7,
250x25mm, Eluens: Acetonitril 50/ Wasser 50 0,1% Essigsäure
v/v) .
Die Synthese des L-N-BOC-2-Amino-4-brombuttersäureethylesters
erfolgte auf die gleiche Weise mit L-2-Aminobutyrolacton als
Ausgangssubstanz.
Fp.: 69,5°C
~H-NMR-Spektrum (CDCI3): 5,2ppm (d,~H); 4,40ppm (t,1H);
4,25ppm (q,2H); 3,45ppm (t,2H);
2,30ppm (m,2H); 1,45ppm (a,9H);
~,30ppm (t,3H)
28
IR-Spektrum (als KBr-Pressling): v(N-H) 3365cm- l , Vas,s(C-H)
2975cm- l , V (C=O,Ester) 1747cm- l ,
V (C=O,Amid) 1681cm- 1
Elementaranalyse: C: 42,7% (42,6%,theor.)
H: 6,2% (6,5%)
N: 4,4% (4,5%)
Br: 25,3% (25,8%)
N-BOC-2-Amino-4-iodbuttersäureethylester [in Anlehnung an 531
Eine Lösung aus 310mg (l,Ommol) N-BOC-2-Amino-4-brombutter
säureethylester und l80mg (1,2mmol) Natriumiodid werden in
Aceton gelöst und mehrere Stunden unter Rückfluß gekocht. Das
Produkt wird nach Entfernen des Acetons in Ether aufgenommen,
die Salze abfiltriert und die etherische Lösung mit wäßriger
Na2S203-Lösung ausgeschüttelt. Nach Trocknung der organischen
Phase mit Na2S04 und Entfernen des Lösungsmittels entstehen
325mg kristalliner N-BOC-2-Amino-4-iodbuttersäureethylester
(0,9mmol, 90% Ausbeute), der ohne weitere Reinigung für die
Radiosynthese eingesetzt wurde.
lH-NMR-Spektrum (CDC13): 5,2ppm (d,lH); 4,30ppm (t,lH);
4,20ppm (q,2H); 3,20ppm (t,2H);
2,30ppm (m,2H); 1,45ppm (s,9H);
1,30ppm (t,3H)
Selenomethioninmethylester [in Anlehnung an 501
30mg (0,15mmol) Selenomethionin in 10ml absolutem Methanol
werden mit gasförmigem Chlorwasserstoff gesättigt und über
Nacht gerührt. Nach Abdestillieren des Methanols erhält man
den Selenomethioninmethyles ter, der aus Methanol umkris tal
lisiert wird.
29
Ausbeute: 25mg (0, 12mmol) 78%
lH-NMR-Spektrum (CD30D): 4,20ppm (t,lH); 3,85ppm (s,3H),
2,70ppm (t,2H), 2,30ppm (m,2H),
2,00ppm (s,3H)
1-(Methylseleno)-3-propanol [54J
1,04g (13, 2mmol) Selen wird als Suspension in wasserfreiem
THF unter Argon langsam mit 10ml 1,6 M Methyllithiumlösung
versetzt. Nach 10 min Rühren wird das überschüssige Methyl
lithium mit Ethanol alkoholysiert und 1,15ml (12,7mmol)
l-Brom- 3 -propanol zugegeben. Nach 3h Rühren destilliert man
das Lösungsmittel ab, nimmt den Rückstand in Chloroform auf
und filtriert die Lösung. Nach Entfernen des Lösungsmittel
erhält man 1,82g (11,9mmol, Ausbeute: 93%) Produkt als zähes
Öl, das ohne weitere Reinigung für die weitere Umsetzung ein
gesetzt wird.
Sdp. 100°C (10Torr)
lH-NMR-Spektrum (CDC13): 3,75ppm (t,2H); 2,65ppm (t,2H),
2,05ppm (m,2H), 2,00ppm (s,3H)
O-Tosyl-l-(methylselenol-3-propanol [54J
1,17g (7,6mmol) 1-(Methylseleno)-3-propanol werden in Pyridin
gelöst und unter Eisbadkühlung 1,50g (7,9mmol) Toluolsulfon
säurechlorid zugegeben. Nach 4h wird die Lösung auf Eiswasser
gegossen und filtriert. Der Rückstand wird mit Eiswasser
gewaschen und dann in Ether gelöst. Nachdem über Na2S04
getrocknet und das Lösungsmittel abdestilliert worden ist,
erhält man 0,90g (2,96mmol, Ausbeute: 39%) Produkt.
30
1H-NMR-Spektrum (CDCI3): 7,2-7,8ppm (Ar,4H); 4,10ppm (t,2H);
2,55ppm (t,2H); 2,45ppm (s,3H);
2,00ppm (m,2H); 1,90ppm (s,3H)
IR-Spektrum (als KBr-Pressling): vas,s(C-H) 3030cm-1 +2920cm- 1 ,
v(Ar-S03-R) 1356cm- 1 +1174cm- 1
Elementaranalyse: C: 44,5% (43,0%,theor.)
H: 5,4% (5,2%)
S: 10,3% (10,4%)
Se: 24,7%(25,7%)
Massenspektrum (EI): M+-1=307, M+-91, M+-155, M+-171, M+-185,
M+-199, M+-213
1-(Methylseleno)-3-chlorpropan [821
310mg (3, 9mmol) Selen werden als Suspension in wasserfreiem
THF unter Argon mit 2,6ml 1,6M Methyllithiumlösung versetzt.
Nach 10 min Rühren wird das überschüssige Methyllithium mit
Ethanol zerstört, 630JtI (5,9mmol) 1-Chlor-3-iodpropan zuge
geben und über Nacht gerührt. Nachdem man das Lösungsmi ttel
abdestilliert und den Rückstand in Chloroform aufgenommen
hat, wird nochmals filtriert und das Lösungsmittel entfernt.
Das ölige Produkt setzt man mit 260mg (2,6mmol) 4-Hydroxy
piperidin in 5ml Acetonitril 15 Minuten bei 80°C um. Nach
Abkühlung auf Raumtemperatur wird die Lösung mit 100JtI Essig
säure und 10ml Ether versetzt und der ausgefallene Feststoff
über ein Si-60-Bett abfiltriert.
nische Phase chromatographiert
Hexan 60/Essigester 1 v/v).
Zur Reinigung wird die orga
(Kieselgel Si-60, Eluens:
Das Methyl-(3-chlorpropyl)-
selenid erhält man als öliges Produkt in einer Ausbeute von
28% (183mg, 1,1mmol).
31
Sdp.: 110·C (1,5Torr)
lH-NMR-Spektrum (CDC13): 3,65ppm (t,2H); 2,70ppm (t,2H);
2,15ppm (m,2H); 2,00ppm (s,3H)
IR-Spektrum (als KBr-Pressling): Vas,s(C-H) 2915cm- 1+2850cm- 1 ,
v(C-Cl) 799cm- 1 +654cm- 1
Elementaranalyse: C: 28,2% (28,0%,theor.)
H: 4,2% (4,1%)
Cl: 20,5% (20,7%)
Se: 45,6% (46,0%)
1-(Methylseleno)-3-brompropan
400mg (5,lmmol) Selen wird als Suspension in wasserfreiem THF
unter Argon mit 3,3ml 1,6 M Methyllithiumlösung versetzt.
Nach 10 min Rühren wird das überschüssige Methyllithium mit
Ethanol zerstört und langsam in eine etherische Lösung aus
520~1 (5,lmmol) 1,3-Dibrompropan getropft. Das Lösungsmittel
wird abdestilliert, der Rückstand in Chloroform aufgenoDlIllen,
filtriert und die organische Phase eingeengt. Nach der Reini
gung durch eine Säulenchromatographie (Kieselgel Si-60,
Eluens: Hexan 20/Essigester 1 v/v) erhält man 0,28g (1,3DlIl1ol,
Ausbeute: 25%) öliges Produkt.
lH-NMR-Spektrum (CDC13): 3,40ppm (t,2H); 2,65ppm (t,2H);
2,10ppm (m,2H); 2,00ppm (s,3H)
1-(Methylseleno)-3-iodpropan
232mg (0,7 6DlIl1ol) O-Tosyl-l-(methylseleno)-3-propanol und
226mg (1,50mmol) Natriumiodid werden 2h in Aceton im Rückfluß
gekocht. Die Lösung wird eingeengt und der Niederschlag bei
Raumtemperatur abfiltriert. Nach Entfernen des Lösungsmittels
32
wird der Rückstand in Ether aufgenommen und mit Natrium
thiosulfatlösung und Wasser ausgeschüttelt. Die etherische
Phase wird über Na2S04 getrocknet. Nach Entfernen des
Lösungsmittels erhält man das 1-(Methylseleno)-3-iodpropan.
Ausbeute: 165mg (0, 63mmol) 83%
1H-NMR-Spektrum (CDC13): 3,30ppm (t,2H); 2,55ppm (t,2H);
2,10ppm (m,2H); 2,00ppm (s,3H)
Elementaranalyse: C: 18,0% (18,3%,theor.)
H: 3,3% (3,1%)
I: 47,7% (48,2%)
Se: 29,1% (30,0%)
1-CMethylseleno)propyl-butylamin
287mg (0, 93mmol) O-Tosyl-1-(methylseleno)-3-propanol werden
in 3ml wasserfreiem DMF gelöst. Nach Zugabe von 84~1
(0, 85mmol) 1-Butylamin wird 15 min auf 80·C erhitzt. 15ml
Ether werden zugegeben und mit verdünnter Essigsäure (5%ig)
extrahiert. Die wäßrige Phase wird mit Natriumcarbonat alka
lisiert und das Produkt mit Ether extrahiert. Die Extraktion
mit verdünnter Essigsäure und die Alkalisierung durch Natri
umcarbonat mit anschließender Überführung in die Etherphase
wird zweimal wiederholt. Danach erfolgt die mehrmalige
Extraktion der etherischen Phase mit Natriumcarbonatlösung
und Wasser und die Trocknung über Na2S04. Nach Entfernen des
Ethers erhält man 90mg (O,42mmol, Ausbeute: 49%) öliges Pro
dukt.
1H-NMR-Spektrum (CDC13): 2,70ppm (t,2H); 2,55ppm (m,1+2H);
1,95ppm (m,2H); 2,00ppm (s,3H);
1,40ppm (m,2+2+2H); 0,95ppm (m,3H)
33
Elementaranalyse: C: 45,9% (46,2%,theor.)
H: 8,8% (9,2%)
N: 6,3% (6,7%)
Se: 35,9% (37,9%)
~-Acetyl-NB-(3-(methylseleno)-propyl)-lysinmethylester
19lmg (0,80mmol) gemörserter ~-Acetyllysinmethylester werden
in 15ml wasserfreiem Acetonitril gelöst, mit 0,8g wasser
freiem Natriumcarbonat versetzt und über Nacht bei Raumtem
peratur gerührt. Die Lösung wird eingeengt und dann fil
triert. Das Lösungsmittel wird entfernt und der Rückstand in
2ml wasserfreiem DMF aufgenommen. Nach Zugabe von 257mg
(0, 85mmol) O-Tosyl-l-(methylseleno)-3-propanol wird 20 min
bei 80·C gerührt. Danach wird die Lösung mit Ether versetzt
und mit verdünnter Essigsäure (5%ig) extrahiert. Die verein
igte wäßrige Phase wird mit Natriumcarbonat alkalisiert und
das Produkt mi t Chloroform extrahiert. Die Extraktion mi t
verdünnter Essigsäure und die Alkalisierung durch Natrium
carbonat, mit anschließender Überführung in die Chloroform
phase, wird zweimal wiederholt. Danach wird das Chloroform
mehrmals mit Natriumcarbonatlösung und Wasser ausgeschüttelt
und anschließend über Na2S04 getrocknet. Nach Entfernen des
Chloroforms erhält man l35mg (0,40mmol, Ausbeute: 50%) reines
Produkt als zähflüssiges Öl.
lH-NMR-Spektrum (CDC13): 6,35ppm (d,lH); 4,65ppm (t,lH);
3,75ppm (s,3H); 2,60ppm (m,2+2+1H);
2,05ppm (s,3H); 2,00ppm (s,3H),
1,85ppm (m,2+2H), 1,45ppm (m,2+2+2H)
34
IR-Spektrum (als KBr-Pressling): v(N-H) 3280cm-1 , vas,s(C-H)
2920cm-1+2850cm-1 , v(C=O,Ester)
1738cm-1 , v(C=O,Amid) 1651cm-1
Elementaranalyse: C: 45,8% (46,3%,theor.)
H: 7,5% (7,8%)
N: 7,9% (8,3%)
Se: 22,5% (23,4%)
Massenspektrum (EI): M+-1=307, M+-15, M+-95, M+-99, M+-113,
M+-172, M+-201
35
3.4. Radiosynthesen
3.4.1. Produktion von n.c.&. Selen-75
Zur Produktion von n. c. a. Selen-75 wurde die Kernreaktion
75As (p, n) 75Se genutzt. Die Bestrahlungen erfolgten an einem
Niederstromtarget mit Arsentrioxid und einem Hochstromtarget
mit einer Kupfer-Arsen-Legierung als Targetmaterial.
3.4.1.1. Arsentrioxid als Targetmaterial
Bei der Bestrahlung von Arsentrioxid im Niederstromtarget ist
der Strahlstrom der 20MeV Protonen auf 7J1.A begrenzt, da bei
höheren Strahlströmen eine optimale Wärmeabführung durch das
Kühlwasser nicht mehr gewährleistet ist. Die Bestrahlung und
AUfarbei tung des Targets erfolgten in Anlehnung an [13,30].
Dazu wurde 19 Arsentrioxid als Pille in einem Aluminium
targethalter (s. Abb. 3.4-1) fixiert und mit einer 10J1.m
dicken Aluminiumfolie wasserundurchlässig verklebt.
Das Target wurde fünf Stunden am Kompaktzyklotron CV 28 der
KFA Jülich im externen Strahlrohr mit 20MeV Protonen und 6J1.A
Strahlstrom bestrahlt. Damit beträgt die theoretisch produ
zierbare Aktivität 64MBq (1,7mCi) [13]. In der Praxis konnten
Ausbeuten von 18,5MBq (O,5J1.Ci) erzielt werden.
Nach der Bestrahlung erfolgte die mechanische Abtrennung der
Arsentrioxidpille von dem Aluminiumtargethalter. Das be
strahlte Arsentrioxid wurde in 5ml 33%iger Salzsäure und un
gefähr 600J1.l 30%iger Wasserstoffperoxidlösung, das portions
weise zugegeben wurde, gelöst. Nach Zerstörung des überschüs
sigen Wasserstoffperoxids bei 85°C wurde die Salzsäurekonzen
tration auf 9 molar eingestellt und das [75Se ] Selenit durch
Schwefeldioxid reduziert (s. 3.4.2.).
36
~ max. 7 pA , 20 MeV p+
1 Havar foil 25/lm 2 Distanee holder foil 100pm
3 Cooling water ehannels
4 AI eover foil 10J1ffi
1". 3
.................................. .......... ~.
Target head ,top view (schematic)
Abb.3.4-1: Schema des Niederstromtargets (As203) mit Target
kopf zur Produktion von Selen-75
3.4.1.2. Kupferarsenlegierung als Targetmaterial [551
Für das Hochstromtarget muß als weniger flüchtige Arsenver
bindung eine CU3As-Legierung verwendet werden, die schon für
die Produktion von Brom-75 und Brom-77 benutzt wurde [56].
Eine 750~m dicke CU3As-Schicht (Durchmesser 13rnrn, As-Gehalt:
28%) wurde auf einen Targethalter gelötet und mit 20~A 20MeV
Protonen bestrahl t. Dabei entstanden nach 4h 35, 5MBq
(0,96mCi) Selen-75 (>60% des theoretischen Wertes). Nachdem
die kurzlebigen Fremdaktivitäten über Nacht abgeklungen
waren, wurde das Target von dem Targethalter abgelötet und in
die Thermochromatographieapparatur (s. Abb 3.4-2) überführt.
Bei einern 02-Strom von 85ml/min sublimierte bei 660°C zuerst
das natürliche Arsen mit dem Arsen-74 (tlz=17, 8d) als Arsen
trioxid aus dem Target (A). Dieses schied sich an der kalten
37
Wand des Glasrohres ab (Zone a). Die Zone a wurde zur Reini
gung vom Arsen in die Mitte des Ofens geschoben (B) und das
[74AS]AS203 bei 750'C durch Sublimation in Zone b weiter
transportiert. Nachdem das Glasrohr in die ursprüngliche
position zurückgeschoben worden war (C), erfolgte der zweite
Schritt der Thermochromatographie. Durch eine schrittweise
Erhöhung der Temperatur von 900'C auf IIOO'C (7min: 900'C,
15min: IOOO'C, IOmin IIOO'C) kondensierte das n.c.a. Selen-75
in Zone ades Glasrohres (0). Durch 2ml 6N Salzsäure konnten
>98% des sublimierten Selen-75 als [75Se ]Selenit gelöst und
reduziert werden (s. 3.4.2).
Length (cm) ovon 0 5 10 15 20 25 30 W///I/P?i//?/);zw/kffi
(A) -0, zone lal
e'As) AS201
( B)
2 'e
v/7(/z?<z,:'l}/ .. 'cY//2dT/ZZTffi I
(u3As target
:;: 0 ~ f;1.0~ A ~ ~ O+-----r-----r----"r---~~~~~~~~,~_r---
a 0 5 10 15 20 25
oven ,
FrQction num ber
tJ / / // / //227/ // / /????/J7 / / / / / (,j
zone (bI
30
(Cl -0, i zone (cl purified
(0 ) zone (0)
Radioselenium
Abb 3.4-2: Apparatur zur thermochromatographischen Abtrennung
von Selen-75 aus einem CU3As-Target [55]
38
Die Aktivitätsbilanz zeigte, daß sich 85% der Selen-75-
Aktivität in der salz sauren Lösung befanden, 5% im Target und
die restlichen 10% mit dem AS203 in der Zone b verblieben.
Die radiochemische Reinheit des [75Se jSelenits betrug >95%.
Die radionuklidische Reinheit des Selen-75 mit >99% wurde
y-spektrometrisch ermittelt.
3.4.2. Darstellung von elementarem n.c.a. Selen-75
Zur Reduktion der salzsauren [75Se jSelenitlösung wurde Schwe
feldioxid 10 min bei Raumtemperatur eingeleitet. Die Reaktion
zum elementarem Selen-75 und das Austreiben des überschüs
sigen Schwefeldioxid erfolgte innerhalb von 20 min bei 85°C.
Zur Untersuchung der Adsorptionsverluste an der Gefäßwand
wurden folgende Gefäßmaterialien für die Reduktion einge
setzt: Teflon, Polyethylen, Polypropylen, Glas, Quarzglas und
Sigradur (Ergebnisse s. Tab.4.1-2).
Aus der arsenhaItigen Selen-75 Lösung (s. 3.4.1.1.) wurde das
elementare Selen-75 in 5ml Benzol durch einstündiges Schüt
teln extrahiert. Mitextrahierte ionische Selen-75-Verbin
dungen konnten durch Zusatz von 3ml Wasser wieder in die wäß
rige Phase überführt werden (zur Ausbeutebestimmung durch
Dünnschichtchromatographie s. 3.5.2.).
Die salzsaure Lösung des elementaren Selen-75, die vorher
durch eine thermochromatographische Reinigung von Arsen
befreit worden war (s. 3.4.1.2.), wurde hierzu in einen spe
ziellen Perforator überführt (s. Abb. 3.4-3). Durch Benzol,
das auf grund der Glassinterplatte in fein dispergierter Form
in die salzsaure Lösung gelangte, erfolgte die Extraktion des
elementaren Selen-75 in die organische Phase. Nach 40 Minuten
wurde die wäßrige Phase aus dem System entfernt und das Ben
zol durch Destillation auf 2-5ml eingeengt. Die konzentrierte
benzolische Lösung des elementaren Selen-75 wurde in ein
Vorrats gefäß überführt und dann bis zum weiteren Gebrauch
39
eingefroren.
erfolgte durch
Die Bestimmung der radiochemischen Ausbeute
Radiodünnschichtchromatographie (s. 3.5.2.).
Benzene removal
Waste removal
Solullon tram thermochroma tography
Fr 11
Magnetlc stirrer
Exhaust
Dimroth cooler
Droppng
, ......... -'ube 0= 4mm
i
Aadioselenium removal
Benzene ~~~I-rlnsing
2S ml benzene
\1/ Ho. ";\TI Abb. 3.4-3: Extraktionsapparatur [55]
100mm
75mm [9 mlJ
3.4.3. Durohführung der n.o.a. r75selselenierungsreaktionen
3.4.3.1. [ 75Se ] Selenierung des polymergebundenen Triphenylphosphins
Als Reaktionsgefäß für die [75Se ]Selenierungsreaktionen
diente ein Glasrohr (Länge 25mm, 1D 1,6mm) mit Glassinter
platte und Luer-Anschlüssen. Das polymergebundene Triphenyl
phosphin läßt man vor der Reaktion mindestens %h in Toluol
quellen. 10mg Polymer (JO~mol Triphenylphosphin auf einer
Polystyrolmatrix) wurden in das Glasrohr eingefüllt. Zur
40
Reaktion mit dem elementaren Selen-75 wurde die benzolische
Lösung (aus 3.4.2.) mit einem Volumenstrom von 2~I/s mit dem
Polymer in Kontakt gebracht. Anschließend wurde das Selen-75,
welches nicht mit dem Polymer reagiert hatte, durch 2ml
Toluol eluiert und das Eluat radiodünnschichtchromato
graphisch untersucht. Die eingesetzte Aktivität betrug in der
Regel 300 bis 800MBq.
Zur primären Alkylierung des [75Se l Triphenylphosphinselenids
wurden alternativ O,25mmol Methyltriflat (5min Reaktions
zeit), Methyliodid (30min) oder Benzylbromid (60min) in 150~1
Toluol auf das Polymer gegeben und anschließend mit 2ml THF
gespült. Für die Optimierungsversuche mittels Methyltriflat
wurde eine Lösung von O,04-0,88mmol in 110~1 Toluol in einem
Zeitbereich von 1 bis 30 Minuten mit dem Polymer umgesetzt.
Für die Synthesen von [75SelSelenomethionin und dem [75Se lSe -
lenoalkylierungsagens wurden 0,25mmol Methyltriflat in 110~1
Toluol bei einer Reaktionszeit von 4 Minuten eingesetzt.
Zur Reaktion
triflats zum
des [75SelMethylselenotriphenylphosphonium
[75Se lMethylselenidanion wurde das Harz mit
O,20mmol folgender alkalischer Lösungen in Kontakt gebracht:
Tetrabutylammoniumhydroxid in THF, Acetonitril, Methanol oder
DMF ; Tetramethylammoniumhydroxid in THF ; 18-Krone-6-Natri
umhydroxid und Kryptofix@2. 2.2. -Kaliumhydroxid in THF oder
DMF ; wäßrige NaOH ; 100~1 Wasser (Konzentrationen der Lösun
gen s. Tab. 4.2-9 in 4.2.2.3.). Die Elution der entstandenen
Produkte erfolgte durch Iml des Lösungsmittels der Base, in
dem meistens das zweite Alkylierungsagens zur Darstellung des
[75SelSelenoethers gelöst war (s.u.).
3.4.3.2. Darstellung von n.c.a. [75SelSelenomethionin
Die Darstellung des [75SelMethylselenotriphenylphosphonium
triflats erfolgte für alle Reaktionswege wie in 3.4.3.1.
beschrieben. Zur Reaktionskontrolle der Umsetzungen wurde zu
41
verschiedenen Zeitpunkten der Produktlösung ein Aliquot ent
nommen und HPLchromatographisch untersucht.
2-Aminobutyrolacton als Edukt
Für die Reaktion zum [ 75Se ]Methylselenidanion wurden 0,2mmol
Base mit einem Volumenstrom von 1ml/min auf das Polymer gege
ben und mit 1ml Methanol, DMF oder HMPA, in dem 0,14mmol 2-
Aminobutyrolacton gelöst waren, gespült (Volumenstrom
1ml/min). Als Basen wurden eingesetzt: 0, 6mol/1 Tetrabutyl
ammoniumhydroxid in wäßrigem THF oder DMF (10%H20), je
0,1mol/1 Lösungen von 18-Krone-6-Natriumhydroxid, 18-Krone-6-
Kaliumhydroxid, Kryptofix®2. 2.2. -Kaliumhydroxid in THF oder
DMF. Die Reaktionszeit betrug 20 min bei einer Reaktions
temperatur von 60·C. Bei dem Einsatz von 18-Krone-6-Kalium
hydroxid als Base wurde die Stoffmenge des 2-Aminobutyro
lactons bis auf 0,05mmol reduziert und die Reaktionstempera
tur auf 20·C gesenkt.
O-Tosylhomoserin als Edukt
Das polymergebundene [ 75se]Methylselenotriphenylphosphonium
triflat (s. 3.4.3.1.) wurde mit 190-250~1 0,27-0,85mol/1
Tetrabutylammoniumhydroxid in wäßrigem THF (10-30%H20) zur
Reaktion gebracht und die Produkte durch eine Lösung von
O-Tosylhomoserin (0,10-0,25mmol) in 1ml Methanol, DMF oder
Wasser von dem Polymer eluiert (Volumenstrom jeweils
1ml/min). Bei Temperaturen zwischen 20 und 70·C wurde die
Reaktion nach 30min beendet.
O-Tosylhomoserinmethylester als Edukt
Zur Darstellung des [ 75s e ]Methylselenidanions wurden 0,5ml
0,10-0,46mol/1 Tetrabutylammoniumhydroxid in wäßrigem THF (4-
18%H20) auf das Polymer aufgegeben und anschließend mit 0,5ml
0,04-0,26mol/1 O-Tosylhomoserinmethylester in Methanol (für
eine Versuchsreihe auch in DMF) eluiert (Volumenstrom
42
1ml/min). Die Reaktion wurde sowohl bei Raumtemperatur als
auch bei 60·C durchgeführt.
Zur Verseifung des [75Se jSelenomethioninmethylesters wurden
0,3ml 6N Salzsäure zugegeben und die Kinetik der Reaktion bei
20, 60 und 100·C untersucht. Zu verschiedenen zeitpunkten
wurden Aliquots entnommen und durch HPLC analysiert. Die Pro
duktlösung wurde weitgehend eingedampft, der Rückstand in 1ml
Methanol aufgenommen und auf eine neutrale A1203-SEP-PAK Kar
tusche gegeben. Die Elution der Nebenprodukte erfolgte durch
3ml Methanol, und die des [75Se jSelenomethionins anschließend
durch 4ml destilliertes Wasser. Aliquots der beiden Frak
tionen wurden HPLchromatographisch analysiert.
N-BOC-2-Amino-4-brombuttersäureethylester als Edukt
Die Freisetzung des [75Se jMethylselenidanions vom Polymer
erfolgte durch 150~1 0,13-1,6mol/l Tetrabutylammoniumhydroxid
in wäßrigem THF (15%H20 bei 0,43mol/l). Anschließend wurde
mit 1001-'1 0,3-1,4mol/l N-BOC-2-Amino-4-brombuttersäure-
ethylester in THF und 1ml THF eluiert (Volumenstrom 1ml/min).
Die Reaktion wurde bei Raumtemperatur durchgeführt.
Die Hydrolyse zum [75Se jSelenomethionin erfolgte nach Zugabe
von 0,2ml 6N Salzsäure bei 60 und 100·C. Der zeitliche Ver
lauf der Reaktion wurde HPLchromatographisch analysiert.
Für die tierexperimentellen Untersuchungen wurde das chirale
Edukt L-N-BOC-2-Amino-4-brombuttersäureethylester eingesetzt
und nach der Synthese die salzsaure L-[75Se jSelenomethionin
lösung mit HPLC-Eluens gepuffert. Das Produkt wurde durch
eine präparative HPLC isoliert.
Zur Abtrennung der aktiven und inaktiven Nebenprodukte wurde
die THF-Lösung des [75Se j-N-BOC-Selenomethioninethylesters
mit 0,2mmol 4-Hydroxypiperidin in 2501-'1 Acetonitril versetzt
und 20 Minuten auf 80·C erhitzt. Nach Abkühlen der Lösung
konnte durch Zugabe von 401-'1 Eisessig und 5001-'1 Diethylether
eine Trübung der Lösung beobachtet werden. Die Lösung wurde
43
auf eine Si-60-SEP-PAK Kartusche gegeben und der [75Se j-N
BOC-Selenomethioninethylester mit 2ml Diethylether eluiert.
Nach der HPLC-Analyse eines Aliquots wurde der Ether durch
einen leichten Argonstrom abgedampft und die Schutzgruppen
durch 6N Salzsäure abgespalten (s.o.).
3.4.3.3. Darstellung von [ 75Se lMethylselenopropylderivaten
Das polymergebundene [75SejMethylselenotriphenylphosphonium
triflat wurde wie in 3.4.3.1 synthetisiert. Die Freisetzung
des [75Se jMethylselenidanions von dem Polymer erfolgte durch
1301L1 0,35mol/l Tetrabutylammoniumhydroxid in wäßrigem THF.
Direkt danach wurden 0, 1mmol 1, 3-Dibrompropan, Propan-
1,3-diol-di-O-p-tosylat oder 1-Chlor-3-iodpropan in lOOlLl THF
aufgegeben und mit 1ml THF eluiert. Die Reaktion wurde nach
10 min bei Raumtemperatur abgebrochen und ein Aliquot der
Lösung durch HPLC analysiert.
synthese von [75s e J-I-(MethyIseIeno)-3-chlorpropan
Für die weiteren Untersuchungen wurde das 1-Chlor-3-iodpropan
(0, 05-0, 14mmol) und TBAH (23 -4 6lLmol) zusammen in 1501L1 THF
gelöst und mit dem [75SejMethylselenotriphenylphosphonium
triflat zur Reaktion gebracht. Die Elution der Produkte vom
Polymer erfolgte durch 1ml Ether. Zur Isolierung des Pro
duktes mittels einer Festphasenfixierung wurde der Ether
durch einen leichten Argonstrom abgedampft und der Rückstand
mit 0,25mmol 4-Hydroxypiperidin in 4001'1 MeCN versetzt.
Innerhalb von 10 bis 15 min bei sO·C reagierte das überschüs
sige 1-Chlor-3-iodpropan zum N- (3-chlorpropyl) -4-hydroxy
piperidiniumiodid und konnte durch die Zugabe von 101L1 Eis
essig und 1ml Ether ausgefällt werden. Die Nebenprodukte wur
den auf einer Si-60-SEP-PAK Kartusche fixiert und das
[75Se j-1-(Methylseleno)-3-chlorpropan durch 0,5ml Ether
eluiert.
44
Synthese von [75sej-~-(Methylseleno)-3-iodpropan
Nach Abdampfen des Ethers der [75Se ]-1-(Methylseleno)-
3-chlorpropanlösung durch einen leichten Argonstrom erfolgte
die Umsetzung mit 0,17mmol Natriumiodid in 100-250~l Aceton,
Methylethylketon oder 4-Heptanon bei 60, 80 bzw. l20·C. Zu
verschiedenen Zeitpunkten wurden Aliquots entnommen und
HPLchromatographisch untersucht. Überschüssiges Natriumiodid
wurde durch 0,5ml Diethylether ausgefällt und über eine
Si-60-SEP-PAK Kartusche filtriert. Das Produkt wurde durch
2ml Diethylether eluiert und das Solvens durch einen Argon
strom entfernt.
synthese von [ 75S e j-3-(Methylseleno)propyl-butylamin
Zum [75Se ]-1-(Methylseleno)-3-iodpropan wurden 0,5ml einer
0,3mol/l l-Butylamin in DMSO, DMF, Acetonitril, Dichlorethan
oder Ether zugegeben. Die Reaktion erfolgte bei Temperaturen
zwischen 20 und 80 D C. Zu verschiedenen zeitpunkten wurden
Aliquots für die HPLc-Analyse entnommen.
synthese von [ 75Se j-Na-Acetyl-NS-(3-(methylseleno)propyl)-
lysinmethylester
Die Darstellung des [75Se ]-Na-Acetyl-NB_(3-(methylseleno)
propyl)-lysinrnethylesters erfolgte durch Zugabe von l30~l
einer 0,19mol/l ~-Acetyl-lysinmethylester in DMF zu dem
[75Se ]-1-(Methylseleno)-3-iodpropan. Die Reaktion wurde bei
50, 80 und 100·C durchgeführt.
45
3.5. Analytische Verfahren
Zur Ermittlung der radiochemischen Ausbeute und Reinheit wer
den verschiedene Verfahren eingesetzt. Kurze Halbwertszeiten
bedingen eine schnelle Trennung und Charakterisierung. Deswe
gen kommen vorwiegend Radiogaschromatographie und Radiohoch
druckflüssigkeitchromatographie sowie Radiodünnschichtchroma
tographie zum Einsatz.
3.5.1. Radiohochdruckfüssigkeitschromatographie
Die Trennung und Identifizierung der Selen-75 Produkte
erfolgte über RadioHPLC. Das system bestand aus einer HPLC
Pumpe (Knauer Typ 6400), einem UV-Photometer (Knauer Typ
3060), einem NaI-Bohrlochkristalldetektor und einem Verstär
kerteil (EG & G ACE Mate™ Amplifier and Bias supply). Die
Probenaufgabe erfolgte über einen Injektionsblock (Rheodyne
Typ7l25) mit einer 200tLl Probenschleife. Hinter der Trenn
säule war ebenfalls ein Injektionsblock (Rheodyne Typ 7125)
zur Aufgabe eines Aliquots zur Bestimmung der Gesamtaktivität
installiert. Die Aufzeichnung, Auswertung und Verarbeitung
der Meßwerte wurde rechnergestützt über das "Radio-Chromato
Graphik-System" (Nina, Version 3.4) der Fa. Nuclear Interface
durchgeführt. Die Messung der Radioakti vi tät erfolgte kon
tinuierlich, und die Detektionswellenlänge des UV-Detektor
betrug 220nm.
Für die Trennungen wurden Säulen mit folgenden stationären
Phasen eingesetzt: LiChrosorb RP-18-7 (250x4), Nucleosil CN
(250x4), LiChrosorb-NH2-7 (250x4), LiChrosorb-NH2-7 (250xl0).
46
Die Trennungen erfolgten durch mobile Phasen aus Methanol
bzw. Acetonitril/Wasser Gemischen, gegebenenfalls in Gegen
wart eines Puffers. Dazu wurde bidestilliertes Wasser einge
setzt und die Eluensgemische mit Helium entgast.
Die chromatographischen Bedingungen und Retentionszeiten der
untersuchten Verbindungen sind in Tabellen 3.5-1 bis 3.5-3
aufgeführt.
Tab.3.S-1: k'-Werte der bei Raumtemperatur mittels HPLC an
LiChrosorb RP-18-7 (250x4mm) getrennten Verbindun
gen (Flow 1ml/min)
Verbindung E1uens k'
Triphenylphosphin MeCN : Wasser
70 . 30 3,90 . Triphenylphosphin- MeCN : Wasser
selenid 70 30 1,86
Selenomethionin 19 SOS, pH 2,5, MeOH:HCl O,lN:
(ZitronensäureO,lN + NaOH O,2N)
37 : 39 : 24 3,00
Selenomethionin- MeOH : PBS-Puffer
methyester 35 : 65 2,67
N-BOC-Selenomethionin- MeCN : Wasser 0,1% HOAc
ethylester 50 : 50 3,98
O-Tosylhomoserin- MeOH : PBS-Puffer
methylester 35 : 65 3,69
N-BOC-2-Amino-4-brom- MeCN : Wasser 0,1% HOAc
buttersäureethylester 50 : 50 3,08
l,3-Dibrompropan MeCN . Wasser 0,1% HOAc . 50 : 50 2,16
l,3-Propandiol-di- MeCN : Wasser 0,1% HOAc
p-toluolsulfonat 60 40 1,53
50 50 4,84
1-Chlor-3-iodpropan MeCN : Wasser 0,1% HOAc
60 : 40 2,10
50 50 4,10
47
l-(Methylseleno)- MeCN : Wasser 0,1% HOAc
3-brompropan 50 : 50 3,49
l-(Methylseleno)- MeCN : Wasser 0,1% HOAc
3-iodpropan 60 : 40 3,29
l-(Methylseleno)- MeCN : Wasser 0,1% HOAc
3 -chlorpropan 60 40 1,86
50 50 3,12
0-Tosyl-1-(Methyl- MeCN . Wasser 0,1% HOAc . seleno)-3-propanol 60 40 2,39
50 50 5,29
l-(Methylseleno)- MeCN : Wasser 0,1% HOAc
3-propanol 60 40 1,24
50 50 2,51
Tab. 3.5-2: k' -Werte der bei Raumtemperatur mittels HPLC an
Lichrosob-NH2-7(250x4mm) getrennten Verbindungen
(Flow 1ml/min)
verbindung E1uens k'
Selenomethionin
77 : 23 3,08
2-Aminobutyrolacton
77 : 23 3,49
Homoserin MeCN
77 :23 2,27
Selenomethionin Q MeCN
80 : 20 5,12
Q Säule: LiChrosorb-NH2-7 (250X10) Flow 5ml/min
48
Tab.3.5-3: k'-Werte der bei Raumtemperatur mittels RPLC an
Nucleosil-CN-5 (250x4mm) getrennten Verbindungen
(Flow 1ml/min)
verbindung
1-Butylamin
(3-(Methylseleno)
propyl)butylamin
l-(Methylseleno)-
3-iodpropan
Eluens
MeCN 0,05M NR40Ac pR 5,8
90 : 10
MeCN : 0,05M NR40Ac pR 5,8
90 : 10
MeCN : 0,05M NR40AC pR 5,8
90 : 10
Na-Acetyl-NS-(3-(methyl- MeCN : 0,05M NR40AC pR 5,8
seleno)propyl) lysin-
methylester
Na-Acetyl-Iysin-
methylester
Gradient Q
MeCN : 0,05M NH40AC pR 5,8
Gradient Q
k'
2,71
2,18
0,07
2,27
2,10
Q Gradient von 100:0 nach 50:50 von omin bis 5min ; ab 5min
isokratisch 50:50 (Flow 1,5ml/min)
3.5.2. Radiodünnschichtchromatographie
Die Radiodünnschichtchromatographie wurde für die Ausbeute
bestimmung des elementaren, n.c.a. Selen-75 eingesetzt. Dazu
erfolgte die Aufgabe von 1~1 der benzolischen Lösung auf eine
Silicagel Si60 beschichtete FOlie, die mit Benzol als Lauf
mittel entwickelt wurde. Das elementare Selen-75 wandert mit
der Laufmittelfront, während ionische Bestandteile am Start
punkt verbleiben. Zur Quantifizierung der Ausbeute wurde die
Folie in der Mitte durchgeschnitten und die Aktivität die
beiden Hälften im y-counter gezählt.
49
3.6. Bestimmung der spezifischen Aktivität von r 75SelSeleno
methionin
Die Angabe der spezifischen Aktivität eines Radiopharmakons
ist notwendig, da z . B. bei der Markierung von Rezeptorli
ganden oder toxischen Substanzen oftmals nur geringste Kon
zentrationen eingesetzt werden können. Die Ermittlung der
spezifischen Aktivität des [75Se ]Selenomethionins erfolgte
mittels HPLC. Zuerst wurden dazu in einer Verdünnungsreihe
unterschiedliche Mengen an inaktivem Selenomethionin inJ1-
ziert und die Stoffmenge gegen das UV-Integral aufgetragen
(s. Abb. 3.4-4).
~
&:Xl
~ 700 .....
~ &:Xl
t: 500 -.... § -.... 400 :S Q)
Ö t:
:m Q) 200 ..... Q)
'" -00
0 0 -00 200 :m 400 500 500 700 &:Xl ~ ~
Integral
Abb.3.4-4: Eichgerade zur Bestimmung der spezifischen Aktivi
tät von [75Se ]Selenomethionin (LiChrosorb-NH2-7-
Säule, Eluens: 0, 05M KH2P04/MeCN 22,5/77,5, Flow:
Iml/min, injiziertes Volumen: 40~l, Wellenlänge
des UV-Detektor 220nrn)
Die untere Nachweisgrenze für Selenomethionin betrug 5nmol.
50
Zur Bestimmung der spezifischen Aktivität wurde die salz saure
[75Se jSelenomethioninlösung eingedampft und mit 1501'1 HPLC
E1uens aufgenommen. Diese Lösung injizierte man auf die HPLC
säule. Die [75Se jSelenomethioninfraktion wurde gesammelt und
in einem geeichten Ge(Li)-Detektor die absolute Aktivität
bestimmt. Die spezifische Aktivität ergibt sich aus der
bestimmten Aktivitätsmenge und der stoffmenge des Seleno
methionins. Für das [75Se jSe1enomethionin zeigte der UV-De
tektor bei n.c.a. synthesen keinen Massenpeak, so daß die
Menge unterhalb der Nachweisgrenze lag. Deshalb kann für die
spezifische Aktivität nur ein Mindestwert angegeben werden:
As > 185GBq/mmol (> 5ci/mmol) (EOS)
für eine injizierte Aktivität von 0,93MBq (25/LCi)
51
3.7. Bestimmung der radiochemischen Reinheit
Die radiochemische Reinheit ist ein wichtiges Qualitätskri
terium bei allen radiochemischen synthesen. Die radio
chemische Reinheit ist definiert als der Anteil des markier
ten Produktes an der Gesamtaktivität der produkthaItigen
Fraktion. Zur Bestimmung der radiochemischen Reinheit wurde
die über ein chromatographisches Verfahren isolierte Fraktion
des Produktes erneut einer Chromatographie unterworfen. Die
zweite Chromatographie erfolgte mit einem HPLC-System, das
andere Trennbedingungen als das ursprüngliche system auf
weist. Durch die Änderung der Chromatographiebedingungen wer
den Produkte, die in der vorhergehenden Chromatographie mög
licherweise die Produktfraktion überlagern, abgetrennt. Im
vorliegenden Fall wurde das [75Se ]Selenomethionin zuerst
durch eine HPLC mit einer NH2-Phase abgetrennt und die radio
chemische Reinheit dann durch eine reversed-phase Chromato
graphie geprüft.
Sie betrug für [75Se ]Selenomethionin und [75Se ]-1-(Methylse
leno) -3-iodpropan >95%, für [75Se ]-1- (Methylseleno) -3-chlor
propan >90%.
52
4. Ergebnisse und Diskussion
4.1. Targetaufarbeitung
Zur Produktion von Selen-75 wurde die Kernreaktion
75As(p,n)75se ausgewählt. Die Entscheidung für die (p,n)
Reaktion erfolgte aufgrund der höheren maximalen theoreti
schen Ausbeute von 2, 8MBq (7 6t1Ci) / tlAh gegenüber 1, 67MBq
(45t1Ci) /tlAh für die (d, 2n) -Reaktion [13]. Die häufig ange
wandte 74Se (n,y)75Se -Kernreaktion ist naturgemäß für die
Produktion von träger freiem Selen-75 nicht geeignet. Ein
weiterer Vorteil, Selen-75 durch eine protoneninduzierte
Kernreaktion aus Arsen-75 zu erzeugen, besteht darin, daß die
Ergebnisse und Bedingungen der Targetaufbereitung [55] zur
Selen-75 Produktion direkt auf die Produktion von Selen-73
über die 75As(p,3n)-Kernreaktion übertragbar sind.
Bei dem Einsatz eines Niederstromtargets wurde als Target
material Arsentrioxid verwendet. Bei der Bestrahlung mit
20MeV Protonen ist auf grund der Wärmeabführung bei diesem
Targetsystem der Strahlstrom auf maximal 6t1A begrenzt, so daß
die maximale theoretische Ausbeute nach 5 Stunden Bestrahlung
63,6MBq (1,72mCi) beträgt. Die tatsächlich produzierte Akti
vität betrug 18,5MBq (0,5mCi), entsprechend 29% des theore
tischen Wertes [13].
Zur Produktion größerer Selen-75 Aktivitätsmengen sind höhere
Strahlströme notwendig. Als arsenhaltiges Hochstromtarget hat
sich eine Kupfer-Arsen-Legierung schon für die Brom-75 und
Brom-77 Produktion bewährt [56]. Dieses Target wurde mit
17MeV Protonen und Strahlströmen von 20tlA 4 Stunden be
strahlt. Dabei wurde 35,5MBq (0,96mCi) Selen-75 produziert,
was mehr als 60% des theoretisch berechneten Wertes ent
spricht. Ein weiterer Vorteil bei diesem Targetmaterial ist
die Möglichkeit der weitgehenden Abtrennung des Arsens durch
eine Thermochromatographie, so daß die weitere chemische
Behandlung des Selen-75 in fast arsenfreier Lösung erfolgen
kann [55].
53
Das angewandte Synthesekonzept einer polymergestützten
[75Se ] selenierungsreaktion erforderte die Isolierung des
Selen-75 aus dem Target und die überführung in eine organi
sche Lösung sowie dessen Umwandlung in die elementare Form.
Hierzu mußte das Selen-75 aus dem Targetmaterial zuerst in
eine salzsaure [75Se ]Selenitlösung überführt werden.
Das Arsentrioxidtarget wurde dazu in HCI/H202 gelöst:
,,75Se "
75% der Selen-75 Aktivität konnten so in Lösung gebracht wer
den.
Das Hochstromtarget, bestehend aus der Kupfer-Arsen-
Legierung, wurde zur Abtrennung des Arsens zuerst einer Zwei
Schritt-Thermochromatographie unterzogen und anschließend die
durch den 02-Strom entstandene [75Se ]Selendioxidzone in Salz
säure gelöst:
CU3As-Target:
Das Sublimat enthielt 85% der produzierten Selen-75 Aktivi
tät, 10% waren in der Arsentrioxidzone und 5% im Target ver
blieben.
Unter diesen Bedingungen liegt das Selen-75 in beiden Fällen
in der Lösung vollständig als [75Se ]Selenit vor ; der analy-
tische Nachweis erfolgte radiopapierchromatographisch
[57,58]. Das Arsen wird durch die Wasserstoffperoxidbehand
lung zum Arsenat oxidiert [59,60].
54
Der nächste Schritt, die Reduktion der salzsauren
[7SSe ]Selenitlösung mit Schwefeldioxid zum elementaren Se
len-7S, erfolgte bei 8S 0 C [61]:
40
35-
30-
"" .-< 25-
v-I \. 0 N ~ 20-QJ
lX1
~ 15-.... 0QJ
CI) 10- .---/ "' ... 5- .--. 0 . ,
2 4 6 8 10 l2 14
c (Hel) [mol/I]
Abb.4.1-1: Abhängigkeit der radiochemischen Ausbeute des ele
mentaren Selen-7S von der Molarität der Salzsäure
während der Reduktion (smin S02 einleiten, 20min
8S o C, Phasenübergang des 7SSe O in Benzol durch 30
min Schütteln)
Die Abhängigkeit der radiochemische Ausbeute des elementaren
Selen-7S von der Salzsäurekonzentration während der Reduktion
wurde ausgehend von der arsenhaItigen Lösung des Nieder
stromtargets bestimmt (s. Abb. 4.1-1). Die maximale radio
chemische Ausbeute von 3S% wird erreicht, wenn die HCI-Lösung
etwa 9 molar ist. Bei höheren Salzsäurekonzentrationen tritt
die Konkurrenzreaktion, die Bildung von Selenchloriden [62],
welche nicht von Schwefeldioxid reduziert werden, zunehmend
SS
in den Vordergrund, so daß die radiochemische Ausbeute an
elementarem Selen-75 bei höheren Salzsäurekonzentrationen
abnimmt. Die Abnahme der radiochemischen Ausbeute bei gerin
geren Salzsäurekonzentrationen könnte zwei Gründe haben: Ent
weder ist das Reduktionspotential des Schwefeldioxids nicht
mehr ausreichend, um das [75Se ]Selenit zu reduzieren, oder
das in der Lösung befindliche Arsen stört die Reduktion des
[75Se ]Selenits in zunehmenden Maße.
Im Falle der fast arsenfreien [75Se ]Selenitlösung, die nach
Thermochromatographie des Targets und Auflösung des Sublimats
mit 6N HCl erhalten wurde, konnte eine radiochemische Ausbeu
te von bis zu 77% erzielt werden. Da bei diesem Ergebnis 6N
Salzsäure verwendet wurde, kann die Abnahme der Reduktions
ausbeute in der arsenhaltigen Lösung sicherlich nicht auf die
verminderte Reduktionskraft des Schwefeldioxides sondern muß
auf die Gegenwart des Arsens zurückgeführt werden. Das n.c.a.
Selen-75 kann bei kleinen Salzsäurekonzentrationen von den
makroskopischen Mengen Arsenat adsorpti v oder in Form eines
Komplexes gebunden werden, so daß es nicht reduziert wird und
demzufolge nicht in die Benzolphase übergeht. Es ist somit
deutlich zu erkennen, daß beim Arbeiten mit praktisch träger
freien Mengen [75Se ] Selenit die weitgehende Entfernung des
Arsens für die Reaktion unabdingbar ist. Bei der langen Halb
wertszeit des Selen-75 (120d) ist der etwas größere zeitauf
wand für die Thermochromatographie (2h gegenüber ~h) vernach
lässigbar , zurnal beim Hochstromtarget aufgrund des höheren
Strahlstroms (durch Bestrahlung des CU3As-Hochstromtargets)
größere Aktivitätsmengen produziert werden können. Auch in
Hinblick auf die Produktion von Selen-73 (7, Ih) wiegt die
höhere Ausbeute den größeren zeitaufwand auf. weitere Vor
teile der thermochromatographischen Aufarbeitung sind die
bessere Reproduzierbarkeit und die geringere Strahlenbe
lastung durch eine einfache Möglichkeit der Automatisierung
der Targetaufbereitung.
56
Zur Untersuchung von Wandverlusten im
[75Se ]Selenitreduktion wurden verschiedene
ausgewählt.
Verlauf der
Gefäßmaterialien
Tab.4.1-2: Aktivitätsbilanz für die Reduktion der salz sauren
[75Se ]Selenitlösung in verschiedenen Gefäßen (6N
Salzsäure, 5min S02 einleiten, 20min auf 85°C
erwärmen)
Gefäß- % RCA % RCA % RCA Anteil 7SSe O
material an der [7SSe l- 7Sse O in der
Gefäßwand Selenit Lösung [%l
Teflon 15±5 8±3 77±5 91
Quarzglas 22±4 8±2 70±4 90
Polyethylen 30±8 9±3 61±8 87
Polypropylen 31±8 9±3 60±8 87
Glas 45±10 5±3 50±10 91
sigradur 50±10 5±3 45±10 90
In Tabelle 4.1-2 sind die Aktivitätsbilanzen für die Reduk
tion arsenfreier, salzsaurer [75Se ]Selenitlösungen in ver
schiedenen Reaktionsgefäßen wiedergegeben. Es ist deutlich zu
erkennen, daß für die Reduktion in Teflon mit nur 15% Wand
verlusten das beste Ergebnis erhalten wurde. Teflon wurde aus
diesem Grund als Material für die Targetaufbereitung einge
setzt, obwohl auch in Quarzglasgefäßen akzeptable Ergebnisse
erhalten wurden. Die Ausbeuten an elementarem Selen-75 der in
Lösung gebliebenen Aktivität wurde dünnschichtchromatogra
phisch untersucht. Sie betrug bei allen untersuchten Gefäß
materialien etwa 90%. Dieses Ergebnis zeigt deutlich, daß die
Reduktion des [75Se ]Selenits zum elementarem Selen-75 mit
einer guten radiochemischen Ausbeute abläuft und unabhängig
57
vom Gefäßmaterial ist. Die Verluste sind deshalb nur durch
Adsorptionseffekte erklärbar.
Für die polymergestützte [75Se ]Selenierung mußte das elemen
tare Selen-75 in ein inertes, organisches Lösungsmittel über
führt werden. In Kohlenstoffdisulfid hat elementares Selen
zwar die größte Löslichkeit [63], es wurde jedoch wegen der
möglichen Verunreinigung durch nichtisotopen Träger nicht in
Erwägung gezogen. Elementares Selen ist in begrenztem Maße
sowohl in Tetrachlorkohlenstoff als auch in Benzol löslich
[64,65]. Aufgrund der nachfolgenden Reaktion wurde Benzol
ausgewählt und die Extraktion in einem eigens dafür konzi
pierten Perforator durchgeführt [55]. Das kontinuierliche
Durchströmen von Benzol in feindispergierter Form durch die
salzsaure Selen-75-Lösung transferierte das elementare Se
len-75 quantitativ innerhalb von 35 Minuten in die benzo
lische Phase.
Die y-spektroskopische Untersuchung der benzolischen Selen-75
Lösung nach drei Tagen ergab, daß mehr als 99% der Aktivität
aus Selen-75 bestand. Die radiochemischen Ausbeuten an ele
mentarem Selen-75 über alle Reaktionsschritte bezogen auf die
produzierte Aktivität im Target betrugen 26±10% beim Arsen
trioxidtarget und 65±5% bei der Kupfer-Arsen-Legierung.
58
4.2. Synthese von n.c.a. [7SSelSelenoethern
4.2.1. Synthesestrategie zur Darstellung von n.c.a. [7SSe lSe -
lenoethern
Ein geeigneter Weg für die Markierung organischer, pharmako
logisch wirksamer Substanzen mit Selenisotopen ist die Syn
these von Selenoethern. Sie werden weder durch verdünnte
Mineralsäuren und konzentrierte Alkalilösungen hydrolysiert
noch durch leichte Oxidations- und Reduktionsmittel chemisch
verändert [66] ; außerdem besitzen sie eine ausreichende in
vivo stabilität [18].
Die erste synthese eines organoselenoethers wurde 1847 von
C.Siemens [67] beschrieben. seitdem sind viele Darstellungs
methoden von unsymmetrischen Selenoethern entwickelt worden,
deren wichtigste in Schema 4.2-1 zusammengefaßt sind.
Betrachtet man die Synthesevarianten unter dem Aspekt einer
Markierung mit Selen-75, so verkleinert sich die Anzahl der
möglichen Reaktionswege erheblich. Da die [75Se ] Selenoether
träger frei (n.c.a.) synthetisiert werden sollten, kommen
Reaktionen mit POlyselenoverbindungen (I-III) nicht in Frage,
weil die Bildung dieser Verbindungen aus statistischen Grün
den unter trägerfreien Bedingungen praktisch unmöglich ist.
Die häufig angewendete Darstellung von Selenoethern durch
Reduktion von elementarem Selen (III-V) sind in früheren
Arbeiten [18,30,68] nur unter Zusatz von Selenträger erfolg
reich gewesen, so daß nach einem anderen Syntheseweg gesucht
wurde. Im Hinblick auf die mögliche Markierung eines breiten
Spektrums von Selenoethern sind die Reaktionswege, die auf
die Darstellung symmetrischer oder aromatischer (VII, VIII)
Selenoether beschränkt sind, außer acht gelassen worden. Bei
vielen Reaktionswegen ist die gezielte Änderung der Oxidati
onsstufe des Selens unter trägerfreien Bedingungen das größte
Problem, da ohne Zusatz von Träger ein Produktgemisch ent
steht.
59
Schema.4.2-1: Potentielle Reaktionswege zur Synthese von
Selenoethern
aus Polyselenoverbindungen
II Al2Se3
I Se2Cl2
111 Se
350°C ANa etc. ROR' 2.RX
RHC=CHR' Se2R2
1"d Na etc.
R-Se-R' I;" R-Se-M R-Se-MgX
3.R'X NaOH
Se Se
VIII 2.RX IV
l,R3P RSeCN
ArSeX
VII V
VI Se
aus Monoselenoverbindungen
60
Aus der Reaktion des Selens mit Trialkylphosphinen zum Tri
alkylphosphinselenid (VI) resultiert ein relativ stabiles
Selenprodukt, bei dem die sukzessive Anlagerung von zwei ver
schiedenen Alkylierungsmitteln möglich ist. Somit sind unsym
metrische Selenoether auf diesem Weg auch trägerfrei dar
stellbar.
4.2.2. Konzept der po1vmergestützten synthese von [ 7SSe l Se
lenoethern
Zur n. c. a. [7 5Se ] Selenierung können [7 5Se ] Triphenylphosphin
selenid und [75Se]Tributylphosphinselenid eingesetzt werden.
Bei der verwendung von [75Se]Tributylphosphinselenid müssen
die Reaktionen in einer Schutzgasatmosphäre durchgeführt wer
den, um die Bildung des Tributylphosphinoxids durch Luft
sauerstoff zu vermeiden. Da [75Se ]Selenierung mit Triphenyl
phosphin auch in Anwesenheit von Wasser und Sauerstoff
erfolgreich waren, wurde diese Reaktion für die Synthese aus
gewählt. Aufgrund der geringeren Reaktivität des [75Se ]Tri
phenylphosphinselenids gegenüber dem [75 Se] Tributylphosphin
selenid sind für die weiteren Umsetzungen reaktivere Rea
genzien notwendig. Die zur Darstellung unsymmetrischer
Selenoether erforderliche Umsetzung mit zwei verschiedenen
Alkylierungsagenzien kann durch die Verwendung des Triphenyl
phosphins in Form eines Polymerharzes (Triphenylphosphin an
Polystyrol gebunden) problemlos in zwei unabhängigen Reak
tionsschritten durchgeführt werden. Hierbei ist das Selen-75
nach der primären Alkylierung des [75Se]Triphenylphosphin
selenids noch kovalent an das Polymer gebunden, so daß über
schüssiges Alkylierungsmittel ohne SChwierigkeit aus dem
System entfernt werden kann. Die anschließende Sekundär
alkylierung des Selen-75 ist dann in einem separaten Reak
tionschritt möglich.
Die Darstellung von n.c.a. [75Se ]Selenoethern aus dem elemen
tarem Selen-75 über eine Heterogenreaktion erfolgte durch
61
eine Vierstufensynthese (Abb. 4.2-2), die in Anlehnung an die
makroskopische Synthese von Phenylselenoethern aus oiphenyl
selenid entwickelt wurde [31,32].
>--<'I
75, (0) ;:;e
Benzol
Heterogenreaktion
+
to-~ fh75 x-P-Se
- I 'R Ph
-OH
Homogenreaktion
R = Alkyl
R' = Alkyl
x = Br, I, OTf
Y = Br, I, OTos
Abb.4.2-2: zur
75 -R-Se
R'Y
Darstellung
RX
Ph
+ ~ 1=0 ~~I
Ph
von n.c.a. Reaktionsschema
[75Se ]Selenoethern
phenylphosphin
über polymergebundenes Tri-
Der erste Schritt ist die Addition des elementaren Selen-75
an das polymergebundene Triphenylphosphin zum [75Se ]Tri
phenylphosphinselenid. Es folgt die primäre Alkylierung (RX)
des Selens unter Bildung des [75Se ]Alkylselenotriphenyl
phosphoniumions. Durch Einwirkung einer Base wird im dritten
62
Schritt der Synthese das entsprechende [75Se ]Alkylselenid
anion freigesetzt und durch anschließende Umsetzung mit einem
weiteren Alkylierungsmittel (R'X) in homogener Phase zum
unsymmetrisch alkylierten [75Se ]Selenoether umgewandelt.
4.2.2.1. Darstellung des polymergebundenen n.c.a. [ 75Se ]Tri
phenylphosphinselenids
Die Reaktion des polymergebundenen Triphenylphosphins mit der
benzolischen Lösung des elementaren Selen-75 (s. 4.1.)
erfolgte bei Raumtemperatur. Da eine quantitative Selen-75
Umsetzung erreicht wird, sind 10mg Polymer für die Reaktion
zum [75Se ] Triphenylphosphinselenid ausreichend. Geringere
Mengen als 10mg sind ungünstiger, da sie zu schlechter repro
duzierbaren Ergebnisse führen.
Die Untersuchung der radiochemischen Ausbeute des
c75se] Triphenylphosphinselenids (TPPSe) in Abhängigkeit von
der Kontaktzeit der benzolischen Lösung des elementaren
Selen-75 mit dem Polymer (s.Abb. 4.2-3) erfolgte durch dünn
schichtchromatographische Analyse der von der Reaktionssäule
eluierten Aktivität. Die Volumenströme der benzolischen
Lösung wurden dann in die jeweilige Kontaktzeit auf dem
Polymer umgerechnet.
Bei einer Kontaktzeit von mehr als 30 Sekunden ist ein fast
quantitativer Umsatz (97±2%) des elementaren Selen-75 zum
[75Se ]TPPSe zu beobachten. Bei kürzeren Kontaktzeiten, also
bei Volumenströmen von > 2,5~l/s, wird weniger Aktivität auf
dem Polymer gebunden. Die dünnschichtchromatographische Ana
lyse des Eluates zeigt, daß es sich um elementares Selen-75
handelt. Bei einer wiederholten Aufgabe der eluierten Lösung
auf das polymergebundene Triphenylphosphin war das Selen-75
unverändert reaktiv, so daß der Grund für die vorherige,
nicht VOllständige Reaktion zum [75Se ]TPPSe ausschließlich in
der zu kurzen Kontaktzeit lag.
63
100
"" ~ QJ
.iJ ::I QJ
.Q
"' ~ 80
J! u "' ..... aJ
.<:1 U 0 .....
60 1:J Cll
0>:;
l-i-I
10 20 30 40 50
Zeit [s) 60 70 80
Abb.4.2-3: Abhängigkeit der radiochemischen Ausbeute (RCA)
des [75Se ]TPPSe von der Kontaktzeit der benzoli
schen Selen-75 Lösung mit dem Polymer (Die RCA ist
bezogen
Polymer
auf elementares n.c.a. Selen-75
30/Lmol Triphenylphosphin in
vorgequollen; RT)
lOmg
Toluol
Um eine chromatographische Analyse des entstandenen Produktes
durchführen zu können, wurde elementares Selen-75 mit nicht
polymergebundenem Triphenylphosphin (TPP) umgesetzt. Die
HPLC-Analyse der Reaktionslösung ergab, daß sich nur ein
Aktivprodukt gebildet hat, welches aufgrund der Vergleichs
messung mit dem inaktivem standard dem [75Se )TPPSe zugeordnet
werden kann. Dieses Ergebnis und die Resultate der nachfol
genden Untersuchungen lassen den Schluß zu, daß die auf dem
Polymer gebundene Aktivität ausschließlich [75Se )TPPSe ist.
Der in benzolischer Lösung noch enthaltene ionische Anteil
des Selen-75, vermutlich [75Se )Selenit (~8%), wird nicht auf
dem polymer fixiert, sondern vollständig eluiert. Durch die
64
Reaktion des elementaren Selen-75 zum [75Se ]TPPSe wird nicht
elementares Selen-75, das eventuell die nachfolgenden Reak
tionschritte stört, automatisch entfernt. Das gebundene
Selen-75 liegt also in einer chemisch eindeutigen Form vor.
Aus der Änderung der radiochemischen Ausbeute an [75Se ]TPPSe
als Funktion der Kontaktzeit kann die relative Geschwindig
keitskonstante k' ermittelt werden. Die zur Berechnung benö
tigte Akti vi tätskonzentration des Produktes zur Zeit t P (t)
kann mit dem Anteil des [75Se ]TPPSe an der Gesamtaktivität AO
gleichgesetzt werden. Dem Wert AO entspricht die eingesetzte
Gesamtmenge an elementarem Selen-75. Eine Auftragung von
In(AO/(AO-P(t))) gegen die Kontaktzeit t sollte bei der
erwarteten Reaktionskinetik pseudo-erster Ordnung
(s. Abschnitt 1. 3) eine Gerade ergeben, deren steigung der
relativen Geschwindigkeitskonstanten k' entspricht. Dazu wUr
den nur die Zeiten bis 30s berücksichtigt, bei denen ein
Anwachsen der radiochemischen Ausbeute zu beobachten ist
(s.Abb 4.2-3). Für die relative Geschwindigkeitskonstante k'
dieser Reaktion pseudo-erster Ordnung ergibt sich ein Wert
von 0,22 s-l (aus Abb. 4.2.-4)
Die relativ schnelle Reaktionskinetik weicht stark von der
makroskopischen Umsetzung des (nicht polymergebundenem) TPP
mi t elementarem Selen bei Raumtemperatur ab [33]. Die Reak
tionszeit beträgt dort 24 stunden, was vermutlich auf die
unterschiedliche Modifikation des elementaren Selens zurück
zuführen ist. Bei der makroskopischen Umsetzung liegt norma
lerweise das Selen in Form oligomerer Einheiten als Ses-Ringe
oder Se-Ketten vor, die bei der Reaktion mit dem TPP erst
gespalten und dann schrittweise abgebaut werden. Da unter
n.c.a. Bedingungen die Wahrscheinlichkeit der Bildung von
Selenoligomeren sehr gering ist, liegt das [75Se ]Selen in
einer reaktiveren Form (wahrscheinlich atomar) vor, die eine
schnelle Addition an das TPP ermöglicht, so daß der im Falle
des natürlichen Selens notwendige energieaufwendige Abbau der
oligomeren Se-Einheiten entfällt.
65
4,0
3,5
3,0
'" ,:p 2,5
"-5' s:: 2,0
.... 1,5
1,0 20 22 24
•
26
Zeit [5)
•
28 30 32
Abb.4.2-4: Auftragung von ln(Ao/(AO-P(t») gegen die Kontakt
zeit t zur Ermittlung der relativen Geschwindig
keitskonstanten k' für die Bildung von [75Se ]Tri
phenylphosphinselenid.
4.2.2.2. Reaktion zum [ 75SelAlkylselenotriphenylphosphonium
salz (primäralkylierung)
Zur Untersuchung der primären Alkylierung des Selens wurde
das [75Se]Triphenylphosphinselenid (TPPSe) mit verschiedenen
Alkylierungsagenzien (Tabelle 4.2-5) in Toluol bei Raumtempe
ratur umgesetzt. Da eine direkte Ausbeutebestimmung des ge
bildeten n.c.a. [75SejAlkylselenotriphenylphosphoniumions auf
dem Polymer nicht möglich war, wurde nach der Reaktion das
Polymer zur Entfernung des überschüssigen Alkylierungsmittels
gewaschen. Das Selen-75 wurde dann durch O,3ml O,6mol/l
Tetrabutylammoniurnhydroxidlösung in Form des [75Se ]Alkyl
selenidanions von dem Polymer gelöst. Es konnte gezeigt
66
werden, daß die vom Polymer als [75Se ]Methylselenidanion
freigesetzte Aktivität, dargestellt durch Reaktion von
[ 75Se]Methylselenotriphenylphosphoniumtriflat mit Tetrabutyl
ammoniumhydroxid, fast vOllständig mit Benzylbromid zum
[75Se ]Benzylmethylselenoether umgesetzt wird [32]. Aus diesem
Grund entspricht die radiochemische Ausbeute des [75Se ]Alkyl
selenotriphenylphosphoniumsalzes der eluierten Aktivitäts
menge.
Tab.4.2-5: Radiochemische Sättigungsausbeute der primären AI
kylierung für verschiedene Alkylierungsmittel (Die
RCA ist bezogen auf das eingesetzte elementare
Selen-75; 10mg Polymer '" 30~mol Triphenylphosphin,
O,25mmol Alkylierungsmittel in Toluol; RT)
% RCA rel. Alky- % Neben- % Neben-
RX [Ph3P75seR]+ X- lierunqs- produkt 1 produkt 2
kraft [69,70]
Benzyl- 47±5 1 40±10 12±5
bromid
Methyl- 50±5 1,6 37±9 13±7
iodid
Methyl- 70±6 2,5*106 1S±7 10±4
triflat
1: Aktivität, die nach der Reaktion des [Ph3P75SeR]+ X- mit
dem Tetrabutylammoniumhydroxid nicht vom Polymer eluiert
werden konnte.
2: Aktivität eines Selen-75 Nebenproduktes, das sich auf grund
einer Nebenreaktion des Alkylierungsmittels mit dem
[75Se]Triphenylphosphinselenid zu einem nicht polymer
gebundenen Selen-75 Nebenprodukt gebildet hat und somit
vor dem Einwirken des Tetrabutylammoniumhydroxides vom
Polymer eluiert werden konnte.
67
wie erwartet, ist die radiochemische Ausbeute des alkylierten
[75Se JTPPse mit Methyltriflat gegenüber den Alkylhalogeniden
viel höher, da die Triflatgruppe aufgrund ihrer sehr guten
Nukleofugie die höchste relative Alkylierungskraft besitzt
[70J. Im Vergleich zu der 96%igen Ausbeute bei der makrosko
pischen Umsetzung von nicht polymer gebundenem TPPSe mit
Methyltriflat [71J bildet sich bei der Reaktion von Methyl
triflat mit polymergebundenem n.c.a. [75Se JTPPSe nur 70%
[75seJMethylselenotriphenylphosphoniumtriflat. Für diese Dis
krepanz können einerseits Reaktionen mit dem Polymer in Frage
kommen, andererseits ist es beim trägerfreien Arbeiten mög
lich, daß durch den großen Überschuß an Methyltriflat Neben
reaktionen an Bedeutung gewinnen, die bei einer äquimolaren
Umsetzung kaum auftreten.
Der Einsatz von Benzylbromid und Methyliodid führt, wie
erwartet, zu den gleichen Ausbeuten, da beide eine ähnliche
Alkylierungskraft besitzen. Der etwas höheren Nukleofugie des
Iods gegenüber Brom wirkt entgegen, daß der Benzylrest den
Übergangszustand etwas besser stabilisieren kann, so daß sich
die beiden Effekte in etwa aufheben.
Die weiteren Arbeiten wurden mit Methyltriflat als primärem
Alkylierungsmittel durchgeführt, da die Verwendung dieses
Methylierungsmittels folgende vorteile bietet:
• höchste radiochemische Ausbeuten in kurzer Reaktionszeit,
• Bildung der Methylselenogruppe als Voraussetzung für die
Selenomethioninsynthese,
• Bildung einer sterisch kleinen Gruppe (der Methylseleno
gruppe) bei der Markierung über die Einführung einer
prosthetischen Gruppe.
Darüber hinaus wird das Alkylselenotriphenylphosphoniumion
durch das schwach nukleophile Trifluormethansulfonation sta
bilisiert [72J. Zur optimierung der radiochemischen Ausbeute
der primären Alkylierung wurden die Kontaktzeit und Methyl
triflatmenge variiert.
68
Die Abhängigkeit der radiochemischen Ausbeute des [75Se ]Me
thylselenotriphenylphosphoniumtriflates (TPPSeMeOTf) von der
Methyltriflatmenge zeigt anfangs erwartungsgemäß etwa eine
Reaktionskinetik pseudo-erster Ordnung (Abb. 4.2.-6). Das
Plateau von etwa 70% wird bei einer Methyltriflatmenge von
etwa 0,20mmol (in 110~1 Toluol) erreicht. Durch eine Erhöhung
der Stoffmenge bis 0,5mmol (in 110~1 Toluol) bleibt die
radiochemische Ausbeute an [75Se ]TPPSeMeOTf zunächst unverän
dert. Da die freien Triphenylphosphingruppen, die nicht sele
niert sind, bevorzugt alkyliert werden [73], reagieren diese
zuerst mit Methyltriflat. Aufgrund dieser Konkurrenzreaktion
zum Methyltriphenylphosphoniumtriflat ist die Stoffmenge des
Methyltriflats direkt von der gewählten Menge an Polymer ab
hängig und sollte ca. das 6-fache der Triphenylphosphinmenge
80
"" 70 Q) ...., ::l 60 Q)
..Q !I)
.§! 50
Q) .c: 40 u !I)
"ffi 30 .c: u 0 20 :a m ~ 10
° 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0
Methyltriflat [rrmoll
Abb.4.2-6: Abhängigkeit der radiochemischen Ausbeute der pri
mären Alkylierung von der Methyltriflatmenge (Die
RCA ist bezogen auf elementares n.c.a. Selen-75;
10mg Polymer""30~mol Triphenylphosphin, Methyltri
flat in 110~1 Toluol; 5min; RT)
69
betragen. Die langsame Abnahme der radiochemischen Ausbeute
bei größeren Methyltriflatmengen ist auf Nebenreaktionen des
Methyltriflates mit dem gebildeten [75Se jTPPSeMeOTf zurück
zuführen.
Die Zeitabhängigkeit der radiochemischen Ausbeute zeigt eben
falls anfangs die erwartete Kinetik pseudo-erster Ordnung
(Abb. 4.2-7). Eine Mindestreaktionszei t von etwa 4 Minuten
ist notwendig, um die maximale radiochemische Ausbeute von
70% des [75Se jTPPSeMeOTf zu erzielen. Im Bereich zwischen 4
und 15 Minuten verändert sich die Ausbeute innerhalb der Feh
lergrenzen nicht. Bei längeren Reaktionszeiten (>15 Minuten)
kommt es durch Nebenreaktionen des überschüssigen Methyl
triflates zur Bildung von Nebenprodukten, so daß die radio
chemische Ausbeute in der gleichen Weise abnimmt wie beim
Einsatz größerer Methyltriflatmengen.
80
oe
'" 70
.jJ ::1
'" 60 .Q
'" ::1 50 ..:
'" .c: u 40
'" ..... 30 I'i
'" .c: u 20 0 ..... "0 1\1 10 ,,;
0 0 5 10 15 20 25 30 35
Zeit [min]
Abh.4.2-7: Abhängigkeit der radiochemischen Ausbeute der pri
mären Alkylierung mit Methyltriflat von der
Reaktionszeit (Die RCA ist bezogen auf elementares
Selen-75j 10mg Polymer~30~mol Triphenylphosphin,
0,25mmol Methyltriflat, 110~1 Toluol; RT)
70
Zur Berechnung der relativen Geschwindigkeitkonstanten k'
wurde wiederum In (Aol (AO-P» gegen die Reaktionszeit bis
4min aufgetragen (AO=Anfangsaktivität an [75Se jTriphenyl
phosphinselenid = 100% i P=radiochemische Ausbeute an
[75SejMethylselenotriphenylphosphoniumtriflat in % zum zeit
punkt t i zur weiteren Erläuterung s. 4.2.2.1.).
Für die Reaktionsgeschwindigkeitskonstante der Bildung des
[75Se jTPPSeMeOTf aus dem [75Se jTPPSe mit Methyltriflat ergibt
sich aus der Steigung der Geraden in Abbildung 4.2-8 ein Wert
von 0,304 s-1.
1,4
1,2
1,0
Il< 0,8 I ~ ..... 0,6 .t: >:l rl 0,4
0,2
0,0
° 1 2 3 4 5
Zeit [minj
Abb.4.2-a: Auftragung von In(AOI (AO-P(t») gegen die Reak
tionszeit t zur Ermittlung der relativen Geschwin
digkeitskonstanten k' für die Bildung von [75Se j
Methylselenotriphenylphosphoniumtriflat
71
".2.2.3. Baseninduzierte spaltung des [75se]Methylselenotri
phenylphosphoniumsalzes
Für die Bildung des deprotonierten [75Se ]Methylselenidanions
([75se]CH3Se-) als nukleophiles Teilchen aus dem poly
mergebundenen [75Se]Methylselenotriphenylphosphoniumtriflat
([75Se ]TPPSeMeOTf) ist die umsetzung mit Hydroxiden notwen
dig. Neben ihren basischen Eigenschaften sind die Hydroxid
ionen aber auch nukleophil, so daß es zu Konkurrenzreaktionen
mit dem zweiten Alkylierungsmittel kommt. Die Freisetzung des
Selens als [75Se ] CH3Se- vom Polymer wurde anhand verschie
dener Basen (s. Tab 4.2-9) untersucht. In früheren Versuchen
[32] wurde ein
polymergebundenem
fast quantitativer Umsatz der (von
[75Se ] TPPSeMeOTf) eluierten Aktivität zum
[75Se ]Benzylmethylselenoethers erzielt. Somit ist die freige
setzte Aktivität indirekt als [75se]CH3se- identifiziert wor
den und kann der radiochemischen Ausbeute an [75se]CH3Se
gleichgesetzt werden.
Die höchste radiochemische
[75Se ]Methylselenidanion wurde
Ausbeute von
durch Einwirken
70% an
von 0,3-
0, 6mol/ I Tetrabutylammoniumhydroxid (TBAH) in THF erreicht.
Mit Tetramethylammoniumhydroxid und Alkalihydroxid-Kryptofix@
2.2.2 bzw. Kronenether-Komplexen war die Ausbeute zwar nie
driger, für weitere Reaktionen jedoch noch akzeptabel. Die
Kronenether- bzw. Kryptand-komplexierten Alkalihydroxide
haben eine schlechtere Löslichkeit in THF als die Tetraalkyl
ammoniumhydroxide, so daß vermutlich durch die geringere
Hydroxidionenkonzentration die radiochemische Ausbeute ab
nimmt. Der Zusammenhang zwischen radiochemischer Ausbeute und
Hydroxidionenkonzentration zeigt sich auch darin, daß bei
Verwendung von Tetramethylammoniumhydroxid- bzw. TBAH-Lösun
gen mit einem Gehalt <0,3mol/1 [75se]CH3se- lediglich mit 58
bzw. 45%iger Ausbeute gebildet wird.
72
Tab.4.2-9: Bildung des [75Se jMethylselenidanions aus
[75Se jTPPSeMeOTf in Abhängigkeit von der Base (Die
RCA ist bezogen auf elementares Selen-75; 10mg
Polymer~30~mol Triphenylphosphin, 0,25mmol Methyl
triflat in 110~l Toluol, 5min, RT, 0,20mmol Base)
Base % RCA % Neben- % Neben-
[7Sse]CH3Se- produkt 1 produkt 2
TBAH 0,3-0,6M in THF 70±6 18±7 10M
TBAH 0,3-0,6M 67±6 22±6 10±4
in MeCN, MeOH
TBAH 0,3-0,6M in DMF 53±10 38±9 9±5
TBAH <0,2M in THF 45±8 44±9 12±5
TMAH 0,25M in THF 58±7 30±7 11±4
KOH/Kryptofix@2.2.2 57±8 30±7 12±5
O,lM in THF
NaOH /18-Krone-6 65±7 25±8 10±4
O,lM in THF
KOH/Kryptofix@2.2.2 47±11 42±12 11±4
O,lM in DMF
NaOH/18-Krone-6 43±12 46±11 9±4
O,lM in DMF
1,5M wäßrige NaOH 47+8 43+7 9+4
Wasser 45±9 45±10 11±4
1: Aktivität, die nach der Reaktion des [Ph3p75SeRj+ X- mit
dem Tetrabutylammoniumhydroxid nicht vom Polymer eluiert
werden konnte.
2: Aktivität eines Selen-75 Nebenproduktes, das sich auf grund
einer Nebenreaktion des Alkylierungsmittels mit dem
[75SejTriphenylphosphinselenid zu einem nicht polymerge
bundenen Selen-75 Nebenprodukt gebildet hat und somit vor
dem Einwirken des Tetrabutylammoniumhydroxides von dem
Polymer eluiert werden konnte.
73
Während sich die radiochemischen Ausbeuten in Acetonitril
oder Methanol im Vergleich zu THF als Lösungsmi ttel kaum
ändern, ist beim Einsatz von DMF eine Abnahme der radioche
mischen Ausbeute um bis zu 20% zu beobachten. Das gleichzei
tig veränderte Quellverhalten des Polymers weist auf eine
unerwünschte Wechselwirkung
mer hin, so daß DMF als
anwendbar ist. Wird für die
zwischen Lösungsmittel und poly
Lösungsmittel nur eingeschränkt
Bildung des [75selCH3se- wäßrige
Natronlauge oder reines Wasser eingesetzt, so ist ein deut
licher Abfall der Ausbeute zu erkennen, der wahrscheinlich
auf das stark wäßrige Milieu zurückzuführen ist. Zusätzlich
ist aufgrund der fehlenden Phasentransfereigenschaften
(gegenüber Tetraalkylammoniumionen oder den Alkalimetallkom
plexen) eine erhöhte Nebenproduktbildung bei der Reaktion des
[75SelCH3se- mit dem zweiten Alkylierungsmittel zu beobach
ten.
Da von den ausgewählten Basen mit TBAH auf grund der hohen
Basizität, der guten Löslichkeit in organischen Solventien
und der Phasentransfereigenschaften die höchsten radio
chemischen Ausbeuten an [75selCH3se- erreicht werden, ist
TBAH die Base der Wahl, wenn nicht im Hinblick auf die nach
folgenden Schritte eine andere Base günstiger erscheint.
Die Menge der Base richtet sich nach dem eingesetzten Edukt
für die zweite Alkylierung. Da in einigen Fällen 40~mol aus
reichend waren, kann dieser Wert als Mindestmenge angesehen
werden. Er muß aber in Abhängigkeit von der Reaktivität des
zweiten Alkylierungsmittels erneut optimiert werden.
4.2.2.4. Abhängigkeit der [ 7SSe ] selenoetherbildung vom Alky
lierungsagens
Der 4. Reaktionsschritt ist die Umsetzung des [75Se lMe
thylselenidanions ([75selCH3Se-) mit einem zweiten Alky
lierungsagens zum unsymmetrischen· [75SelSelenoether. Die
Reaktionen wurden in homogener Lösung bei Raumtemperatur in
74
THF oder Ether als Lösungsmittel durchgeführt. Die Reaktion
des [75SelMethylselenotriphenylphosphoniumtriflats ([75Se l
TPPSeMeOTf) zum [75Se lMethylselenidanion ([75selCH3se-) mit
anschließender Alkylierung erfolgte als Eintopfreaktion durch
130~1 einer O,35mol/l Tetrabutylammoniumhydroxidlösung (in
wäßrigem THF) in Gegenwart von O,10mmol Alkylierungsagens (in
100~1 THF).
Tab.4.2-10: Radiochemische Ausbeute an [75Se lMethylpropyl
selenoether bei der Umsetzung des [75selCH3Se
mit Propylderivaten (Die RCA ist bezogen auf
n.c.a. [75Se lTPPseMeOTfj 130~1 O,35mol/l TBAH in
wäßrigem THF, O,10mmol Edukt in 100~1 THF,
Elution mit 1ml THFj 1minj RT)
Edukt PropX X=Br X=I X=OTos
RCA [tl 78±5 76±3 81±5
Bei der Untersuchung von propylderivaten zeigte sich inner
halb der Fehlergrenze kein Unterschied in der Reaktivität des
Brom- (78%), Iod- (76%) und O-Tosylderivates (81%) (Die RCA
ist bezogen auf n.c.a. [75Se lTPPseMeOTf). Die hohe Reakti
vität des [75selCH3se- wird auch durch die relativ schnelle
Reaktionsgeschwindigkeit deutlich: Das [75SelCH3se- reagiert
innerhalb einer 1 Minute zum Produkt. Diese hohe Reaktivität
erfordert eine Derivatisierung anderer funktioneller Gruppen
des Alkylierungsagens. Zur Vermeidung unerwünschter Neben
reaktionen des sehr reaktiven [75selCH3se- sollte das zweite
Alkylierungsmittel gleichzeitig mit der Base auf das polymer
gebundene [75Se lTPPSeMeOTf gegeben werden, so daß das gebil
dete [75selCH3se- sofort zum gewünschten Produkt weiterrea
gieren kann. Im Falle der zeitversetzten Reagenzzugabe bildet
sich mit einer radiochemischen Ausbeute von bis zu 75% ein
nicht erwünschtes Aktivprodukt. In einem Blindversuch, der
ohne Zugabe eines zweiten Alkylierungsmittels durchgeführt
75
wurde, betrug die Ausbeute dieses polaren Aktivproduktes,
dessen Retentionszeit bei der HPLchromatographischen Unter
suchung identisch mit der des Dimethylselenoethers ist, sogar
88%. Obwohl das System frei von Methyltriflat war, scheint
das [75se]CH3Se- somit einer zweiten Methylierung zu
unterliegen. Da das Methyltriphenylphosphoniumion die einzige
mögliche Methylquelle ist, könnte folgender Mechanismus für
die Methylübertragung verantwortlich sein:
TPPI
Abb.4.2-11: Hypothetischer Reaktionsmechanismus der uner
wünschten Bildung des Dimethylselenoethers
76
4.3. synthese von n.c.a. [75selSeienomethionin
Die beiden bisher wichtigsten Methoden zur Synthese von
[75Se ]Selenomethionin sind ein biochemisches Verfahren [28]
und die Umsetzung von elementarem Selen mit Methyllithium und
2-Amino-4-brombuttersäure [29]. Da die Synthesen jeweils nur
mit Trägerzusatz erfolgreich waren und das biochemische Ver
fahren aufgrund der langen Reaktionszeit nicht für eine
Selen-73 Markierung geeignet ist, wurde die neue polymer
gestützte [75Se ]Selenierung zur Darstellung von n.c.a.
[75Se ]Selenoethern auf die Synthese von n.c.a. [75Se ]Seleno
methionin angewendet.
Elementares n.c.a. Selen-75 wurde auf polymergebundenem
Triphenylphosphin über die Zwischenstufe [75Se ]Triphenyl
phosphinselenid zum [75Se]Methylselenotriphenylphosphonium
triflat umgesetzt und anschließend durch Hydroxidionen als
[75Se ]Methylselenidanion wieder von dem Polymerharz freige
setzt (siehe 4.2.). Für die nachfolgende Reaktion zum [75Se ]
Selenomethionin sind zwei unterschiedliche Synthesestrategien
untersucht worden: Der nukleophile Angriff des [75Se ]Me
thylselenidanions am 2-Aminobutyrolacton, bei dem sich das
[75Se ]Selenomethionin durch Spaltung des Lactonringes bildet,
und die Umsetzungen des anionischen [75Se ]Methylselenids mit
O-Tosylhomoserin, O-Tosylhomoserinmethylester oder N-BOC-2-
Amino-4-brombuttersäureethylester unter Phasentransferbedin
gungen. Die optimierungen wurden mit dem Racemat des
jeweiligen Eduktes durchgeführt. Nur im Falle des N-BOC-
2-Amino-4-brombuttersäureethylesters wurde für die tierex
perimentellen Untersuchungen der chirale Markierungsvorläufer
eingesetzt.
77
4.3.1. 2-Aminobutyrolacton als Markierunqsvorläufer
Die synthese des [ 75s e ]Selenomethionin erfolgte durch Umset
zung des trägerfreien [ 75s e ]Methylselenidanions (CH3Se-" das
durch Hydroxidionen vom polymergebundenen [ 75s e ]Methylseleno
triphenylphosphoniumtriflat freigesetzt wurde, mit 2-Amino
butyrolacton.
75 (0) Se
Benzol
Ph J + I 75 fo-~ P--Se ÖTf - I 'eH
Ph -.!.
OH 75 -----~ H C-Se 3
Methyltriflat ~
Abb.4.3-1: Reaktionsschema zur Darstellung von [75Se ]Seleno
methionin mit 2-Aminobutyrolacton als Markierungs
vorläufer
Für die nukleophile Lactonspaltung kommen zwei positionen in
Frage: das carbinolische Kohlenstoffatom sowie die Keto
funktion. Nach der HSAB-Theorie ist der carboxylische Kohlen
stoff eine harte und der carbinolische Kohlenstoff eine wei
che Säure. Alkylselenidanionen sollten als sehr weiche Basen
78
deshalb hauptsächlich am carbinolischen Kohlenstoffatom an
greifen und somit gleichzeitig die Säure freisetzen und aus
der Alkoholkomponete den Selenoether bilden. Die Nukleophilie
der Alkylselenidanionen als ein entscheidender Parameter kann
aufgrund des kleinen Ionisierungspotentials und der hohen
Polarisierbarkeit für die Reaktion als ausreichend hoch ange
sehen werden. Dies wird durch die mit guten Ausbeuten ablau
fende makroskopische Umsetzung von Natriumphenylselenid mit
Butyrolacton bestätigt [74]. Da hierbei ausschließlich der
Angriff am carbinolischen Kohlenstoffatom beobachtet wird,
kann dies auch für die trägerfreie Reaktion des [75se]CH3Se
mit dem 2-Aminobutyrolacton postuliert werden.
4.3.1.1. Abhängigkeit der radiochemischen Ausbeute an [75Se lSelenomethionin von der Base
Der Einfluß unterschiedlicher Kationen (Anionenaktivatoren)
auf die Nukleophilie des [75Se ]Methylselenidanions ([75Se ]
CH3Se-) wurde in verschiedenen Lösungsmitteln untersucht. Die
Anionenaktivatoren wurden als Hydroxide eingesetzt, die
primär die Freisetzung des [75se]CH3Se- von dem Polymer
bewirken. In homogener Phase erfolgt dann die Reaktion zum
n.c.a. [75Se ]Selenomethionin.
Tabelle 4.3-2 zeigt die radiochemischen Ausbeuten des
[75Se ]Selenomethionins für die unterschiedlichen, in THF ge
lösten Anionenaktivator-Hydroxid-Komplexe, wobei das 2-Amino
butyrolacton jeweils in Methanol gelöst wurde.
Durch Tetrabutylammoniumhydroxid (TBAH) konnten 70% des ele
mentaren Selen-75 als [75se]CH3se- vom Polymer gelöst werden;
die nachfolgende Reaktion mit dem 2-Aminobutyrolacton führte
jedoch lediglich zu einer 2%igen radiochemischen Ausbeute an
[75Se )Selenomethionin.
79
Tab. 4.3-2: Radiochemische Ausbeuten an [75Se ] Selenomethionin
und [15Se ]Methylselenidanion für verschiedene Ba
sen (Die RCA ist bezogen auf elementares Selen-75;
Reaktion zum [75Se ] Methylselenotriphenylphospho
niumtriflat siehe 4.2., 0,2mmol Base unterschied
licher Konzentration in THF, 1ml 0,14mol/1 2-Ami
nobutyrolacton in Methanol; 20min; 60 0 C)
Base % RCA % RCA % Seleno-
(Konzentration) Seleno- CH3se- methionin in
methionin * Lösunq ** TBAH 2±1 70±5 3±1,5
(0,6mol/l)
NaOH/18-Krone-6 11±4 63±7 18±40
(O,lmol/l)
KOH/18-Krone-6 10±4 60±7 17±4
(O,lmol/l)
KOH/Kryptofix@222 9±4 57±8 17±4
*:
**.
(O,lmol/l)
bezogen auf Anfangsaktivität an elementarem Selen-75
bezogen auf gebildetes [75se]CH3Se-, das vom Polymer elu
iert wurde
Zur steigerung der Ausbeute wurden Alkalihydroxide, komple
xiert mit Kronenethern bzw. dem Kryptanden Kryptofix@2.2.2.,
als Hydroxidbasen eingesetzt. Durch die Komplexbildung haben
die Alkalihydroxide in aprotischen, organischen Solventien
eine relativ hohe Löslichkeit. Außerdem wird die Nukleophilie
des Anions [75se]CH3Se- deutlich erhöht. Die radiochemischen
Ausbeuten für die Basen 18-Krone-6/Natriumhydroxid, 18-Krone-
6/Kaliumhydroxid und Kryptofix@2.2.2/Kaliumhydroxid sind
auf grund nur geringer Unterschiede in der Reaktivität der
Kronenether- und Kryptofix-Komplexe innerhalb der Fehler
grenze gleich groß. Im folgenden wird deshalb stellvertretend
80
für diese drei der 18-Krone-6-Ka1iumhydroxid-Komplex be
trachtet.
Im Vergleich zu den mit TBAH erhaltenen radiochemischen Aus
beuten an [75Se ] Selenomethionin konnte durch Verwendung von
18-Krone-6/Kaliumhydroxid der Wert von 2% auf 10% gesteigert
werden. Diese Änderung der radiochemischen Ausbeute ist im
wesentlichen auf zwei Effekte zurückführen: die geringere
Reaktivität der Base gegenüber dem polymergebundenem [75Se ]
Methylselenotriphenylphosphoniumtriflat ([75Se ]TPPSeMeOTf)
und die Aktivierung des CH3Se- durch das Kation. Die Reakti
vität der Base gegenüber dem [75Se ]TPPSeMeOTf wird durch die
radiochemische Ausbeute an [75se]CH3Se-, welche der eluierten
Aktivität entspricht, ausgedrückt (siehe Abschnitt 4.2.). Die
Abnahme der radiochemischen Ausbeute an [15se]CH3Se- von 70
auf 60% beim Wechsel von TBAH zu 18-Krone-6/Kaliumhydroxid
weist auf eine verminderte Reaktivität gegenüber dem
[75Se ]TPPSeMeOTf hin. Ursache ist die niedrigere Hydroxid
ionenkonzentration, die aus der geringeren Löslichkeit des
18-Krone-6-Kaliumhydroxid-Komplexes in THF resultiert. Obwohl
die Reaktivität des 18-Krone-6-Kaliumhydroxid-Komplexes ge
genüber dem Polymer abnimmt, steigt die radiochemische Aus
beute bezogen auf elementares Selen-75 auf den fünf fachen
Wert an. Der Einfluß der unterschiedlichen Kationen auf die
Nukleophilie des [75se]CH3Se- wird durch den Anteil des
[75Se ]Selenomethionins an der Aktivität in der Lösung ausge
drückt, da erst nach der Bildung des [75se]CH3se- in homoge
ner Phase die Reaktion mit 2-Aminobutyrolacton erfolgt. Die
Ausbeute an [75Se ]Selenomethionin in Lösung ist beim 18-Kro
ne-6-Kaliumhydroxid-Komplex sogar sechsmal höher als die für
TBAH. Dieser Wert drückt die höhere Nukleophilie des CH3Se-,
das in Verbindung mit Kalium-18-Krone-6 als unsolvatisiertes
I nacktes I Anion vorliegt, gegenüber dem 2-Aminobutyro
lactonring aus. Mit Tetrabutylammonium als Gegenion ist die
Nukleophilie des [75se]CH3Se- durch die Solvatation vermin
dert und somit die Ausbeute an [75Se ]Selenomethionin wesent
lich geringer.
81
stellt man der träger freien synthese des [75Se ]Seleno
methionins die makroskopische Synthese durch Umsetzung von
Natriumphenylselenid und 18-Krone-6 mit Butyrolacton gegen
über, so führt die Lactonöffnung dort zu einer chemischen
Ausbeute von 85% 4- (Phenylseleno) -buttersäure [74]. Da die
Nukleophilie des CH3Se- gegenüber dem Phenylselenidanion
erhöht ist, sollten die radiochemischen Ausbeuten für die
Umsetzung mit dem n.c.a. CH3se- in der gleichen Größenordnung
liegen. Die Ursache für die geringe Ausbeute bei der n. c. a.
Synthese (17%) ist möglicherweise auf zwei konkurrierende Re
aktionswege des [75se]CH3Se- zurückzuführen, nämlich die Bil
dung des [75Se ]Selenomethionins und die des polaren Selen-75
Nebenproduktes. Unter den gewählten Bedingungen reagiert das
n.c.a. [75se]CH3Se- bevorzugt zum polaren Selen-75 Neben
produkt, da die Bildung des [75Se ]Selenomethionins vermutlich
eine langsamere Kinetik besitzt. Bei der makroskopischen
Umsetzung spielt diese Nebenreaktion eine untergeordnete
Rolle.
4.3.1.2. Abhängigkeit der radiochemischen [ 7SSe ]Selenomethio
ninausbeute vom Lösungsmittel
Die öffnung des Lactonringes ist eine SN2-Reaktion, so daß
zur Stabilisierung des Übergangs zustandes solche Reaktionen
bevorzugt in polaren, aprotischen Solventien hoher Lösungs
mittelpolarität durchgeführt werden. Da bei makroskopischen
Umsetzungen von Natriumphenylselenid mit Butyrolacton in DMF
und HMPA auch in Abwesenheit von Kronenether-Komplexen gute
Ausbeuten erreicht worden sind [75,76], wurden für die n.c.a.
Synthese des [75Se ]Selenomethionin mit 2-Aminobutyrolacton
als Markierungsvorläufer diese beiden Lösungsmittel ausge
wählt. Als Basen wurden TBAH, 18-Krone-6/Natriumhydroxid, 18-
Krone-6/Kaliumhydroxid und Kryptofix®2. 2.2. /Kaliumhydroxid
eingesetzt (Reaktionsbedingungen s.Tab 4.3-2) •
82
Werden die Base und das 2-Aminobutyrolacton in DMF gelöst, so
ist in keinem Fall [7SSelSelenomethionin eindeutig nachzuwei
sen. Dieses kann nicht auf die jeweilige Base zurückgeführt
werden, sondern ist vermutlich auf eine spezifische Wechsel
wirkung des DMF's mit dem Polymer zurückzuführen.
Zur weiteren Untersuchung wurde die Base (wie in 4.3.1.1.) in
THF gelöst und nur das 2-Aminobutyrolacton in DMF. Bei den
Alkalihydroxid-Kronenether- bzw. Krytofix-Komplexen war eine
innerhalb der Fehlergrenze identische radiochemische Ausbeute
von 3% zu beobachten, in Gegenwart von TBAH bildete sich
jedoch kein [7SSe l Selenomethionin. Im Vergleich zu den Aus
beuten in Methanol (als Lösungsmittel des 2-Aminobutyro
lactons) ist aber immer noch ein drastischer Abfall der
radiochemischen Ausbeute festzustellen. Da die Abnahme wie
derum bei allen verwendeten Basen zu beobachten ist, ist
dieses auf das DMF als Lösungsmittel des 2-Aminobutyrolactons
zurückzuführen und nicht auf die unterschiedlichen Kationen.
Durch den Wechsel von einem pro tischen zu einem aprotischen
Lösungsmittel wäre eigentlich ein Anstieg der radiochemischen
Ausbeute zu erwarten. Beobachtet wurde aber eine Abnahme der
Ausbeute an [7SSe l Selenomethionin, entsprechend einer ver
mehrten Nebenproduktbildung. Wird das 2-Aminobutyrolacton in
HMPA, ein sehr potentes Lösungsmittel für SN2-Reaktionen,
gelöst, nimmt die Nebenproduktbildung ebenso wie bei DMF zu.
Aprotische, polare
Nebenproduktbildung
Lösungsmittel beschleunigen also die
stärker als die Reaktion zum [1SSel Se-
lenomethionin und sind somit für die Reaktion ungeeignet. Die
günstigste Kombination der Lösungmittel für die Reaktion ist
somit THF als O,lmol/l 18-Krone-6-Kaliumhydroxidlösung und
Methanol als O,14mol/l 2-Aminobutyrolactonlösung.
83
4.3.1.3. Abhängigkeit der radiochemischen Ausbeute des
[75Se ]Selenomethionins von der Eduktkonzentration,
Reaktionszeit und Reaktionstemperatur
Die nachfolgenden Untersuchungen dienten der optimierung der
Synthese des [75Se )Selenomethionin mit 2-Arninobutyrolacton
als Markierungsvorläufer. Zunächst wurde die Konzentration
des Eduktes 2-Arninobutyrolacton variiert. Es sollte vor allem
versucht werden, die Markierungsvorläufermenge zu verringern,
um eine leichtere Abtrennung des Produktes aus dem Reaktions
gemisch zu ermöglichen. Das Ergebnis ist in Tabelle 4.3-3
dargestellt. Die Synthesen wurden mit 2ml einer O,lmol/l
18-Krone-6-Kaliumhydroxidlösung in THF und lml Methanol als
Lösungsmittel des 2-Arninobutyrolactons durchgeführt. Die Re
aktionstemperatur betrug 60·C und die Reaktionszeit 20 min.
Tab.4.3-3: Abhängigkeit der radiochemischen Ausbeute an
[75Se ]Selenomethionin von der Konzentration des
2-Arninobutyrolactons (Die RCA ist bezogen auf ele
mentares n.c.a. Selen-75 ; 2ml einer O,lmol/l
18-Krone-6-Kaliumhydroxidlösung in THF, lml metha
nolische 2-Arninobutyrolactonlösung; 20min; 60·Cl
2-Aminobutyrolacton [mol/1] 0,05 0,09 0,11 0,14
Radiochemische Ausbeute [%] 6±2 9±4 11±4 10±4
Die Abhängigkeit der radiochemischen Ausbeute von der Konzen
tration des 2-Arninobutyrolactons zeigt, daß die maximale Aus
beute von etwa 11% bei O,llmol/l 2-Arninobutyrolacton erreicht
wird. Die weitere Erhöhung der 2-Arninobutyrolactonkonzen
tration führt zu keiner Zunahme der Ausbeute an [75Se ] Se
lenomethionin. Die Verringerung auf <0,09mol/l bewirkt jedoch
eine Abnahme der radiochemischen Ausbeute, so daß die
84
optimale 2-Aminobutyrolactonkonzentration im Bereich von
O,10-0,12mol/l liegt.
Schließlich wurde die Reaktion hinsichtlich der Reaktionszeit
und Reaktionstemperatur optimiert. Zu diesem Zweck wurde die
Kinetik für die Bildung des [75Se ]Selenomethionins bei Raum
temperatur und 60·C ermittelt. Das Ergebnis ist in Abbildung
4.3-4 zusammengefaßt.
14
"" a 12 ..... a 0 ..... 10 .c .., ~ 8 a Q) rl Q) 6
'" ~ Q)
",'" 4 "'-'
t'J 2 a:
5 10 15 20 25
Zeit emin]
Abb.4.3-4: Abhängigkeit der radiochemischen Ausbeute an
[75Se ]Selenomethionin von zeit und Temperatur (Die
RCA ist bezogen auf elementares n.c.a. Selen-75 ;
2ml einer O,1mol/l 18-Krone-6-Kaliumhydroxid in
THF, 1ml O,12mol/l 2-Aminobutyrolacton in
Methanol)
Es ist zu erkennen, daß erwartungsgemäß eine Reaktionskinetik
pseudo-erster Ordnung vorliegt und bei beiden Reaktions
temperaturen eine maximale radiochemische Ausbeute von 11%
erreicht wird. Die apparente Reaktionskinetik ist für beide
Temperaturen nicht wesentlich verschieden. Das Maximum der
radiochemischen [75Se ]Selenomethioninausbeute ist bei 20·C
85
nach etwa l2min und bei einer Reaktionstemperatur von 60·e
nach 10min erreicht. Die Ausbeute wird somit durch die Tempe
raturerhöhung innerhalb der Fehlergrenze nicht erhöht.
4.3.2. O-Tosylhomoserinmethylester als Markierungsvorläufer
Um eine höhere radiochemische Ausbeute an n.c.a. [75Se ]Se
lenomethionin zu erhalten, sollte die [75Se ]Methylselenierung
von Buttersäurederivaten untersucht werden. Zuerst wurde die
nicht veresterte 2-Amino-4-0-tosylbuttersäure (O-Tosylhomo
serin) als Markierungsvorläufer eingesetzt. Die Darstellung
des polymergebundenen [75Se]Methylselenotriphenylphosphonium
triflats erfolgte unter den in 4.2. optimierten Bedingungen
mit einer Ausbeute von 70%. Die Aktivität wurde dann als
[75Se ]Methylselenidanion durch Tetrabutylammoniumhydroxid vom
Polymer freigesetzt und in verschiedenen Lösungsmitteln (Me
thanol, DMF, Wasser) mit dem Markierungsvorläufer umgesetzt.
Eine Bildung von [75Se ]Selenomethionin war sowohl durch Än
derung der O-Tosylhomoserinkonzentration (0,10-0,25mmol/l),
als auch durch unterschiedliche Tetrabutylammoniumhydroxid
konzentrationen (0,27-0,86M) im untersuchten Temperaturbe
reich (20-70·C) nicht zu beobachten. Die Auswirkung einer Er
höhung der Nukleophilie des [75Se ]Methylselenidanions durch
Anionenaktivatoren (z.B. der l8-Krone-6-Kalium-Komplex) oder
ein Austausch des Tosylrestes durch eine bessere Abgangs
gruppe (z.B. Triflat) wurde nicht untersucht, da auf grund
früherer Arbeiten [32] bekannt war, daß die Reaktivität des
[75Se ]Methylselenidanions für die nukleophile Substitution
des Tosylates ausreichend hoch ist. Die Ursache für die
unterbliebene [75Se ]Methylselenierung ist möglicherweise auf
eine basisch induzierte, intramolekulare Umsetzung des Eduk
tes zum 2-Aminobutyrolacton zurückzuführen. Andererseits ist
auch die Bildung eines Ionenpaares zwischen dem [75Se ]Methyl
selenidanion und der Aminofunktion des Markierungsvorläufers
denkbar, so daß eine SUbstitution des Tosylatrestes
86
verhindert wird. Im Falle der Bildung des 2-Aminobutyro
lactons ist die Reaktivität des [75Se lTetrabutylammonium
methylselenids zu gering (siehe 4.3.1.), um den Lactonring
zum [75SelSelenomethionin zu öffnen.
Zur Vermeidung der intramolekularen Reaktion des Markierungs
vorläufers zum Lacton, wurde der veresterte Vorläufer 2-Ami
no-4-0-tosylbuttersäuremethylester (O-Tosylhomoserinmethyles
ter) für die Synthese eingesetzt. Die Reaktion zum
[75Se l Selenomethionin mit O-Tosylhomoserinmethylester als
Edukt erfolgte nach dem in Abbildung 4.3-5 dargestellten
Reaktionsschema. Das polymergebundene [75Se lMethylselenotri
phenylphosphoniumtriflat ([ 75Se lTPPSeMeOTf) wurde in einer
radiochemischen Ausbeute von 70% aus elementaren Selen-75
erhalten (s. Abschnitt 4.2.).
15 (0) Se f-o-
Ph
'I '\ /
- "Ph Benzol to-r "s,
Ph
jh +
to-' p_15se J-_ I ' OTf Ph eH3
TBAH 75
---~ H3C-Se
Methyltriflat ~
Abb.4.3-5: Reaktionsschema zur Darstellung von [75SelSeleno
methionin mit O-Tosylhomoserinmethylester als Mar
kierungsvorläufer.
87
Im folgenden sind die radiochemischen Ausbeuten an [75Se ]
Selenomethioninmethylester auf das gebildete [75Se ]TPPSeMeOTf
bezogen. Durch Tetrabutylammoniumhydroxid (TBAH) erfolgte die
Elution des [75Se ]Methylselenidanions ([75se]CH3se-), welches
mit dem O-Tosylhomoserinmethylester zum [75Se ]Selenomethio
ninmethylester reagierte. Das [75Se ]Selenomethionin wurde
durch anschließende saure Hydrolyse gebildet.
4.3.2.1. Abhängigkeit der Ausbeute des [ 75Se ]Selenomethionin
methylesters von der Tetrabutylammoniumhydroxidkon
zentration und vom Solvens
Als wichtiger Parameter wurde für die Optimierung der radio
chemischen Ausbeute zuerst die Tetrabutylammoniumhydroxid
konzentration (TBAH) untersucht. Die Hydroxidionen sind für
die Bildung des deprotonierten [75Se ]Methylselenidanions
(CH3Se-) als nukleophiles Teilchen aus dem polymergebundenen
[75Se ]TPPSeMeOTf notwendig. Gleichzeitig sind die Hydroxid
ionen aber auch selber nukleophil, so daß es zu Konkurrenz
reaktionen kommt, die z.B. die Eduktmenge drastisch reduzie
ren können.
Abbildung 4.3-6 zeigt ein Maximum der radiochemischen Ausbeu
te von 50% [75Se ]Selenomethioninmethylester (bezogen auf
[75Se ]TPPSeMeOTf) bei einer Konzentration von O,3lmol/l TBAH.
Im Bereich von O,lO-O,30mol/l TBAH wird durch die zunehmende
Hydroxidionenkonzentration mehr [75Se]CH3se- aus dem [75Se ]
TPPSeMeOTf gebildet, welches anschließend mit dem 0-
Tosylhomoserinmethylester zum [75Se ]Selenomethioninmethyl
ester reagiert. Bei TBAH-Konzentrationen oberhalb 0, 34mol/l
fällt die radiochemische Ausbeute an [75Se ]Selenomethionin
methylester ab. Da aufgrund der ansteigenden Hydroxidionen
konzentration die Hydrolyse des Eduktes zum Homoserin-
methyle ster bzw. Homoserin signifikant
[75se]CH3se- zu einer
zunimmt, führt die
vermehrten Bildung Freisetzung des
eines Selen-75
der ionischer
markierten Nebenproduktes,
Verbindungen entspricht.
88
dessen Polarität
Eine strukturelle
Zuordnung dieses unerwünschten, polaren Aktivproduktes war
jedoch bisher nicht möglich.
'" 60
55 k CI) 50 .... '" 45 CI) <:
• .-1 40 <: 0
35 • .-1 .<:: .... 30 ~ 0 25 <: CI) 20 rl CI)
15 Ul
hl 10
5
0 0,05 0,10 0,15 0,20 0,25 0,30 0,35 0,40
C (TBAH) [mol/I]
Abb.4.3-6: Abhängigkeit der radiochemischen
[75Se]Selenomethioninmethylester von
zentration (Die RCA ist bezogen
[75Se ] TPPSeMeOTf i TBAH in O,5ml
0,45 0,50
Ausbeute an
der TBAH-Kon
auf n. c. a.
wäßrigem THF,
O,5ml O,20moljl O-Tosylhomoserinmethylester in
Methanol; 15 mini RT)
Der [75Se lMethylselenierung liegt ein SN2-Reaktionsmechanis
mus zugrunde. In polaren, aprotischen Sol ventien mit hoher
Lösungsmittelpolarität sollte daher eine Erhöhung der radio
chemischen Ausbeute erwartet werden. Aus diesem Grund wurde
der Markierungsvorläufer in DMF gelöst. Die Freisetzung des
[75Se lCH3se- vom Polymer erfolgte durch O,31mol/1 TBAH in
THF, da in DMF (als Lösungsmittel des TBAH) die Ausbeute des
89
[75Se lMethylselenierungsagens [75selCH3se- abnimmt (s. Ab
schnitt 4.2.). Die erwartete Ausbeuteerhöhung konnte jedoch
bei Verwendung von DMF nicht beobachtet werden, sondern ein
drastischer Abfall auf 4±3% [75SelSelenomethioninmethylester.
Die Erhöhung der Reaktiontemperatur auf 60·C hatte ebenso
keinen Einfluß auf die Ausbeute. Die Reaktion zum sehr
polaren Selen-75 Nebenprodukt entsprach dabei der Abnahme der
Produktbildung. Offensichtlich wird die Konkurrenzreaktion
des [75selCH3se-, d.h. die Bildung des sehr polaren Selen-75
Produktes, durch DMF als Lösungsmittel stärker begünstigt als
die Reaktion zum [75SelSelenomethioninmethylester. DMF ist
als Lösungsmittel für die Reaktion des [75selCH3Se- mit dem
O-Tosylhomoserinmethylester ungeeignet, so daß die Sekundär
alkylierung zum [75SelSelenomethioninmethylester im folgenden
in THF!Methanol durchgeführt wurde.
4.3.2.2. Abhängigkeit der [75selSelenomethioninmethylester
bildung von der Eduktkonzentration und Reaktionszeit
Die Optimierung der radiochemischen Ausbeute des [75Se lSe -
lenomethioninmethylesters hinsichtlich der O-Tosylhomoserin
methylesterkonzentration ist in Abbildung 4.3-7 dargestellt.
Es zeigte sich, daß die Konzentration der methanolischen 0-
Tosylhomoserinmethylesterlösung mindestens 0,l8mol!1 betragen
muß, um den Sättigungsbereich der radiochemische Ausbeute
(bezogen auf n.c.a. [75Se lTPPSeMeOTf) von 50% [75SelSeleno
methioninmethylester zu erreichen. Diese relativ hohe Edukt
konzentration resultiert aus der zur Markierung konkur
rierenden Hydrolyse des Eduktes durch das TBAH. Dadurch kommt
es bei niedrigen Eduktkonzentrationen zur vermehrten Bildung
des sehr polaren Selen-75 markierten Nebenproduktes aus dem
e5Sel CH3Se-.
90
60
dI' 55
... 50 CI)
45 ..., ., CI) 40 s:: ..... 35 s:: 0
30 ..... ..c: ..., CI)
25
E 20 0 s:: CI) 15 .... CI) 10
'" ~ 5
~ 0 0,00 0,05 0,10 0,15 0,20 0,25 0,30
c(O-Tosylhomoserinmethylester) [molli]
Abb.4.3-7: Abhängigkeit der radiochemischen Ausbeute an
[75Se ]Selenomethioninmethylester von der O-Tosyl
homoserinmethylesterkonzentration (Die RCA ist
bezogen auf n.c.a. [75Se ]TPPSeMeOTf i Reaktionsbe
dingungen s. Abb. 4.3-6)
Zur weiteren Optimierung der Reaktion wurden die Parameter
Temperatur und Zeit untersucht. Das Ergebnis ist in Abbildung
4.3-8 zusammengefaßt.
Die sättigungsausbeute der [75 Se] Selenomethioninmethylester
bildung von 50% (bezogen auf n. c. a. [75Se ] TPPSeMeOTf) wird
bei Raumtemperatur nach etwa 10 min erreicht.
Reaktionszeit nimmt die Menge des gebildeten
Bei längerer
[75Se ]Seleno-
methioninmethylesters langsam zugunsten des [75Se ]Seleno
methionin ab. Ursache hierfür ist die basisch katalysierte
Hydrolyse des Selen-75 markierten Methylesters zur freien
Säure. Betrachtet man die Summe aus gebildetem [75Se ]Seleno
methioninmethylester und [75Se ]Selenomethionin als Produkt
der Umsetzung von [75se]CH3Se- mit dem O-Tosylhomoserin
methylester , so ist für die Reaktion erwartungsgemäß eine
Kinetik pseudo-erster Ordnung zu erkennen.
91
60
55 ~
dP 50
<ll 45 .jJ ::s 40 <ll .0 UJ J5 .§l <ll
JO
.g 25 UJ -g <ll
20
.g 15 0
10 B &! 5
0 0
RT
60·C
[75Selselenomethioninmethylester
[75SelSelenomethionin
10 20
Zeit [min]
60·C
RT
JO 40
Abb.4.3-8: Abhängigkeit der radiochemischen Ausbeute an
[75Se ]Selenomethioninmethylester von der Reakti
onszeit (Die RCA ist bezogen auf n.c.a.
[75Se ]TPPSeMeOTf ; Reaktionsbedingungen siehe Abb.
4.3-6)
Bei einer Temperatur von 60°C ist die maximale radiochemische
Ausbeute des [75Se ]Selenomethioninmethylesters im Vergleich
zur Raumtemperatur praktisch unverändert. Die Ausbeute an
[15Se ]Selenomethioninmethylester ist demzufolge zwischen 20
und 60°C praktisch temperaturunabhängig. Die Geschwindigkeit
der Hydrolyse zum [75Se ]Selenomethionin nimmt hingegen bei
60°C etwa um den Faktor 2 zu.
Eine Steigerung der radiochemischen Ausbeute durch eine
nukleofugere Abgangsgruppe, z.B. einer Triflatgruppe, ist
nicht zu erwarten, da sich bei der Markierung von einfachen
Alkylderivaten mit Brom, Iod oder Tosylat als Abgangsgruppe
keine Unterschiede in der Reaktivität gegenüber dem
92
[75se]CH3se- gezeigt haben (siehe 4.2.2.4.). Daß die Nukleo
philie des [75Se]CH3se- in THF/MeOH für diese SN2-Reaktion
ausreichend hoch ist, zeigt sich auch in der trägerhaltigen
Synthese des [75Se ]Selenomethionins von Plenevaux et. ale
[29], der mit dem entsprechenden Bromderivat in THF/EtOH
radiochemische Ausbeuten von 80% erhalten konnte.
4.3.2.3. Hydrolyse des [75selSelenomethioninmethylesters
Der [75Se ]Selenomethioninmethylester wurde sauer hydroly
siert, um eine mögliche Racemisierung im Verlauf einer alka
lischen Verseifung zu vermeiden. In Abbildung 4.3-9 ist die
Verseifung durch 6mol/l Salzsäure für 20, 60 und 100°C
dargestellt.
100
"" <! ..... <! 80 0 .....
.<::
.j.J <1J Ei 60 0 <! <1J
r-i <1J
40 '" <1J
on'" ~~
..: 20
~
0 0 20 40 60 80 100
Zeit [min]
Abb.4.3-9: zeit- und Temperaturabhängigkeit der radiochemi
schen Ausbeute an [75Se ]Selenomethionin durch sau
re Hydrolyse des [75Se ]Selenomethioninmethylesters
(Die RCA ist bezogen auf n.c.a. [75Se ]se
lenomethioninmethylester ; bei t=o Zugabe von
0,3ml 6mol/l Salzsäure)
93
Eine deutliche Steigerung der Hydrolysegeschwindigkeit zum
[75Se ]Selenomethionin ist bei höherer Reaktionstemperatur zu
erkennen. Die Sättigungsausbeute von 85% ist bei Raumtempe
ratur nach 70 Minuten, bei 60·C nach 45 Minuten und bei ~OO·C
nach 25 Minuten erreicht. Dieses entspricht einer radioche
mischen Ausbeute an [75Se ]Selenomethionin von 30% bezogen auf
eingesetztes elementares Selen-75.
Versuch der Reinigung des [ 75Se ]Seleno11let;hionin durch Fest;
phasenfixierung
Zur Vermeidung einer zeitaufwendigen HPLC-Trennung zur Rei
nigung des Produktes wurde versucht, das n.c.a. [75se ]se
lenomethionin durch eine Festphasenfixierung aus dem Reak
tionsgemisch zu isolieren. Dazu wurde die salzsaure Lösung
fast zur Trockne eingedampft, der Rückstand mit Methanol
aufgenommen und die methanolische Lösung auf eine neutrale
AI203-SEP-PAK Kartusche aufgegeben. In Analogie zu der Tren
nung von [35S]HOmocysteinthiolacton und [35S]Methionin [77]
sollten die Nebenprodukte durch weiteres Methanol eluiert
werden und das Produkt auf der Kartusche fixiert bleiben. Die
anschließende Elution des [75Se ]Selenomethionins erfolgte
durch destilliertes Wasser. Die HPLchromatographische Unter
suchung zeigte jedoch, daß sowohl [75Se ]Selenomethionin im
Methanol nachzuweisen war, als auch im wäßrigen Eluat aktive
und inaktive Nebenprodukte enthalten waren. Diese Festphasen
fixierung ist somit für die Abtrennung des [75Se ]Seleno
methionins von den Nebenprodukten nicht geeignet. Es wurde
deshalb eine HPLC-Abtrennung durchgeführt.
94
4.3.3. synthese des [75SelSelenomethionins ausgehend von
N-BOC-2-Amino-4-brombuttersäureethylester
Der N-BOC-2-Amino-4-brombuttersäureethylester ist auf grund
seiner gröBeren Lipophilie im Vergleich zum O-Tosylhomoserin
methylester auch in unpolaren, aprotischen Lösungsmitteln wie
THF oder Ether gut löslich. Da hierdurch die Verwendung pro
tischer Solventien wie Methanol vermieden werden kann, wurde
eine weitere steigerung der radiochemischen Ausbeute an
[75Se jSelenomethionin erwartet. Zusätzlich können hydrophile,
aktive und inaktive Nebenprodukte durch eine Festphasenfixie
rung einfach und schnell abgetrennt werden.
Die Synthese des [75Se jSelenomethionins erfolgte gemäß dem in
Abb. 4.3-10 dargestellten Reaktionsschema. Das polymerge
bundene n.c.a. [75SejMethylselenotriphenylphosphoniumtriflat
'I '\ / 75, (0)
::;e • f-o-
Ph
- "Ph Benzol
fo-' lh 75 J~ - r-s~ OTf Ph eH3
TBAH
•
Abb.4.3-10: Reaktionsschema zur
[75Se jSelenomethionin
Methyltriflat •
Darstellung des n.c.a.
mit N-BOC-2-Amino-4-brom-
buttersäureethylester als Markierungsvorläufer
95
([75Se ] TPPSeMeOTf) wurde in der herkömmlichen Weise (s. Ab
schnitt 4.2.) synthetisiert. Durch Tetrabutylammoniumhydroxid
(TBAH) konnte das [75Se ]Methylselenidanion ([75se]CH3se-) vom
Polymer freigesetzt werden und durch Reaktion mit dem N-BOC-
2-Amino-4-brombuttersäureethylester (BABBE) den [75Se ]-N-BOC
Selenomethioninethylester bilden. Das n.c.a. [75Se ]Seleno
methionin entsteht durch sauer katalysierte Abspaltung der
BOC-Gruppe und nachfolgende Verseifung des Esters.
Die nachfolgenden Untersuchungen dienten zur optimierung der
Synthese des [75Se ] -N-BOC-Selenomethioninethylesters hin
sichtlich der eingesetzten TBAH-, Eduktkonzentration sowie
der Reaktionszeit. Zusätzlich wurde die zeit- und Temperatur
abhängigkeit der Abspaltung der Schutzgruppen untersucht.
4.3.3.1. Abhängigkeit der Ausbeute an [ 75Se l-N-Boc-seleno-
methioninethylester von der Tetrabutylammonium-
hydroxidkonzentration
Das durch TBAH freigesetzte [75se]CH3se- reagierte entweder
zum [75Se ]-N-BOC-Selenomethioninethylester (N-BOC-SeMetEt)
oder zu einem sehr polaren Selen-75 Nebenprodukt nicht be
kannter Struktur, das unter den gewählten Chromatographiebe
dingungen mit dem Totvolumen eluiert wird. Die radio
chemischen Ausbeuten des Produktes sowie des Nebenproduktes
in Abhängigkeit von der TBAH-Konzentration sind in Abbildung
4.3-11 dargestellt. Die [75Se ]-N-BOC-SeMetEt-Bildung erreicht
ihr Maximum von 57% (bezogen auf n.c.a. [75Se ] TPPSeMeOTf) bei
einer TBAH-Konzentration von O,43mol/l. Die deutliche Minde
rung der Ausbeute an [75Se ]-N-BOC-SeMetEt bei TBAH-Konzentra
tionen unterhalb von 0,40mol/l ist auf die geringere Ausbeute
an freigesetztem [75se)CH3Se- zurückzuführen. Die Ursache
hierfür ist die nicht vollständige Reaktion des polymergebun
denen [75Se )TPPSeMeOTf [75se]CH3se- bei TBAH-Mengen <60Jlmol
(gelöst in 150Jll THF) . Von dem nicht umgesetzten
96
70,----------------------------------------------,
'" 60 ~
Q) ..., ~ 50
.g ~ 40
Q)
f1 30
"' .... ~ 20
o .... ~ 10
• es se)-N-BX!-selE!lC1lethionirester o polares selen-75-Produkt
0+--r-,--r-,--r-,--r-~~_.~--r_~_r~--r_4 0,0 0,2 0,4 0,6 O,B 1,0 1,2 1,4 1,6
c (Tetrabutylammoniumhydroxid) [mol/I]
Abb.4.3-11: Abhängigkeit der radiochemischen Ausbeute der
Selen-75 Produkte von der TBAH-Konzentration (Die
RCA ist bezogen auf n.c.a. [75Se]TPPSeMeOTfi TBAH
in 150JLI wäßrigem THF, 100JLl l,30mol/l BABBE in
THF, Elution mit 1ml THF, 15 min, RT)
[75Se ]TPPSeMeOTf konnte durch eine nachfolgende zweite Umset
zung mit TBAH das [75se]CH3se- vom Polymer freigesetzt wer
den. Dieses zeigt, daß das [75Se]TPPSeMeOTf noch chemisch
'intakt' war. Werden TBAH-Konzentrationen >O,47mol/l für die
Synthese eingesetzt, so nimmt die Ausbeute an [75Se ]-N-BOC
SeMetEt im Gegensatz zu der von [75se]CH3Se- ab. Gleichzeitig
wird mit zunehmender Hydroxidionenkonzentration die langsame
Zersetzung des BABBE zum N-BOC-Homoserinethylester beobach
tet, so daß die [75Se ]Methylselenierung auf grund der Edukt
hydrolyse nur noch in geringerem Maße ablaufen kann. Das
[75se]CH3Se- reagiert unter diesen Bedingungen bevorzugt zu
einem polaren Selen-75 Nebenprodukt, so daß die radio
chemische Ausbeute an [75Se ]-N-BOC-SeMetEt bei TBAH-Kon
zentrationen >O,4mol/l langsam wieder abfällt. Im Vergleich
97
zum O-Tosylhomoserinmethylester (siehe 4.3.2.) ist wegen der
höheren Stabilität des Bromderivates eine deutlich langsamere
Hydrolyse des BABBE zu erkennen.
wird der Markierungsvorläufer zeitversetzt zugegeben, so
steigt die Ausbeute des polaren Selen-75 Nebenproduktes zuun
gunsten der [75Se l-N-Boc-seMetEt-Bildung stark an. Die Reak
tion zum polaren Selen-75 markierten Nebenprodukt erfolgt
offensichtlich sofort nach der Bildung des [75selCH3se- aus
dem [75SelMethylselenotriphenylphosphoniumion. Deshalb ist es
notwendig, daß der Markierungsvorläufer direkt bei der
Bildung des [75SelCH3se- anwesend ist, damit die Reaktions
wahrscheinlichkeit zwischen dem [75selCH3Se- und dem Butter
säurederivat und somit die Bildung des [75Se l-N-BoC-SeMetEt
bevorzugt wird.
Die Optimierungsuntersuchungen zeigen, daß die TBAH-Konzen
tration zwischen 0,40 und 0,45mol/l (in 1501'1 THF) betragen
sollte, so daß das [75Se lTPPSeMeOTf vOllständig zum
[75selCH3se- reagiert und darüber hinaus das eingesetzte
Edukt nur in geringem Maße hydrolysiert wird.
4.3.3.2. Abhängigkeit der radiochemischen Ausbeute an [ 758e ]
N-BOC-Se1enomethioninethy1ester von der Eduktkonzen
tration
Der Einfluß der Abgangsgruppe des Markierungsvorläufers wurde
anhand des N-BOC-2-Amino-4-iod-buttersäureethylesters unter
sucht. Da Iod im Vergleich zum Brom eine bessere Abgangs
gruppe für eine SN2-Reaktion ist, wurde eine Zunahme der Aus
beute der [75SelMethylselenierung erwartet. Dies konnte
jedoch nicht beobachtet werden. Die Reaktivität des
c?5selCH3se- ist offenbar so hoch, daß eine Veränderung der
Ausbeute durch Variation der Abgangsgruppen Iod und Brom nur
gering ist. Da jedoch daS Bromderivat eine höhere Hydrolyse
stabilität aufweist, wurde für die weiteren Untersuchungen
auf den Einsatz der Iodverbindung verzichtet.
98
Zur einfacheren Isolierung der trägerfreien Menge des [75Se l
N-BOC-SeMetEt ist die Minimierung der Eduktstoffmenge ohne
Minderung der radiochemischen Ausbeute zweckmäßig. Die Abhän
gigkeit der radiochemischen Ausbeute von der BABBE-Konzen
tration ist in Abbildung 4.3-12 dargestell t. Sie zeigt in
etwa den für eine Reaktion pseudo erster Ordnung erwarteten
Reaktionsverlauf. Um die Sättigungsausbeute von 57% [75Se l-N
BOC-SeMetEt zu erreichen, kann die Eduktkonzentration unter
den gewählten Reaktionsbedingungen auf O,90mol/l begrenzt
werden. Geringere Eduktkonzentrationen führen zu einer Ver
minderung der radiochemischen Ausbeute an [75Se l-N-BOC
SeMetEt. Demgegenüber bleibt die radiochemische Ausbeute bei
höheren Eduktkonzentrationen bis 1,4mol/l unverändert.
70
"" 60 1-1 QJ ....,
'" QJ 50 ~
"a 0 40 "n
.<:1 ...., QJ
Ö ~
30 QJ rl QJ
20 Ul I
U 0 I<l 10 :I:
~ 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4
c (N-Boc-2-Amino-4-brombuttersäureester) [mol/ll
Abb. 4. 3-12: Abhängigkeit der radiochemischen Ausbeute an
[75Se l-N-BOc-Selenomethioninethylester von der
BABBE-Konzentration (Die RCA sind bezogen auf
n.c.a. [75SelTPPSeMeOTfi 150J.Ll O,43mol/l TBAH in
wäßrigem THF, BABBE in 100J.Ll THF, sonstige Reak
tionsbedingungen s. Abb. 4.3-11)
99
4.3.3.3. Abhängigkeit der radiochemischen Ausbeute an [ 75Se ]
N-BOC-Selenomethioninethylester von der Reaktions
zeit
Die nachfolgende Untersuchung diente der Optimierung des
r7 5Se]-N-BOC-SeMetEt hinsichtlich der Reaktionszeit. wie
Abbildung 4.3-13 zeigt, hat die Reaktion des [75se]CH3Se- mit
dem BABBE nach 10 Minuten das Maximum der radiochemische Aus
beute von 57% [75Se ]-N-BOC-SeMetEt erreicht. Eine längere
Reaktionszeit fUhrt zu einer allmählichen Abnahme der [75Se ]
N-BOC-SeMetEt-Konzentration, die durch eine alkalische Ver
seifung des Esters verursacht wird.
70
"" ~ ~ 60 Q) ...., III
~ 50 0'-; 1'1 0
0'-; 40 .J:l ....,
§ 30 Q) ..... Q) 20 Ul I
8 p:J 10 I Z
~ 0 0 10 20 30 40 50 60
Zeit [rnin]
Abb. 4.3-13: Abhängigkeit der radiochemischen Ausbeute an
[75Se ]-N-BOC-selenomethioninethy1ester von der
Reaktionzeit (Die RCA sind bezogen auf n.c.a.
[75Se ]TPPSeMeOTf ; 1501'1 0,43mo1/1 TBAH in wäß
rigem THF, 1001'1 1,30mo1/l BABBE in THF, sonstige
Reaktionsbedingungen s. Abb. 4.3-11)
100
Eine Temperaturerhöhung auf 70·C bewirkt keine meßbare Verän
derung des Maximums der radiochemischen Ausbeute an [75Se l-N
BOC-SeMetEt, die Verseifung des Produktes wird jedoch durch
die Temperaturerhöhung etwa um den Faktor 2 beschleunigt.
4.3.3.4. Abspaltung der Schutzgruppen des [7SSe lN-Boc-seleno
metbioninetbylesters unter Bildung von [7SselSeleno
metbionin
Um das freie [75SelSelenomethionin zu erhalten, muß die BOC
Gruppe abgespalten und der Ester verseift werden. Zur Vermei
dung einer möglichen Racemisierung im Verlauf einer alkali
schen Verseifung wurde der [75Se l-N-Boc-seMetEt sauer
hydrolysiert i gleichzeitig erfolgt die acidolytische Abspal
tung der BOC-Gruppe. Die Zeitabhängigkeit der Schutzgruppen
abspaltung des [75Se l-N-BoC-SeMetEt durch 6mol/l Salzsäure
ist in Abbildung 4.3-14 für 60 und 100·C dargestellt.
100
"" BO <: .... <: 0 .... 60 .<: +J ., 5 <: 40 ., .... ., tIl
..: ~
20
0 0 10 20 30 40 SO 60 70
Zeit [min]
Abb.4.3-14: zeit- und Temperaturabhängigkeit der Schutzgrup
penabspaltung unter Bildung von [75SelSeleno
methionin in Gegenwart von 6mol/l Salzsäure (Die
RCA ist bezogen auf n.c.a. [75Se l-N-BOc-seMetEt)
101
85% des [75Se l -N-BOC-Selenomethioninethylesters konnten bei
60·C nach 50 Minuten und bei 100·C nach 27 Minuten zum
[75SelSelenomethionin umgesetzt werden. Durch die Temperatur
steigerung ist somit eine Zunahme der Hydrolysegeschwindig
keit um fast das Doppelte festzustellen. Bei längerer Reak
tionszeit, insbesondere bei 100·C, wurde eine langsame Zer
setzung des Produktes beobachtet. Wurde die Lösung nach 30
Minuten auf Raumtemperatur abgekühlt, so waren nach 24 Stun
den kaum weitere Zersetzungprodukte (Zunahme <1%) zu
beobachten.
Im Reaktionschema 4.3-15 sind die einzelnen Schritte zur Syn
these des n.c.a. [75SelSelenomethionins hinsichtlich ihres
Zeitaufwandes und ihrer radiochemischen Ausbeute zusammen-
gefaßt. Ausgehend vom
Lösung läßt sich der
elementaren Selen-75 in benzolischer
[75Se l-N-BOC-Selenomethioninethylester
innerhalb von 25 Minuten in einer radiochemischen Ausbeute
von etwa 40% (bezogen auf elementares n.c.a. Selen-75) syn
thetisieren. Daraus ergibt sich nach der Entschützung eine
radiochemische Ausbeute an n. c .a. [75Se l Selenomethionin von
34% bei einer Gesamtreaktionszeit von 60 Minuten. Für die
tierexperimentellen Untersuchungen wurde die Synthese mit dem
chiralen Markierungsvorläufer L-N-BOC-2-Amino-4-brombutter
säureethylester durchgeführt. Das n. c.a. [75Se l Selenomethio
nin hatte· nach der HPLC-Reinigung eine radiochemische Rein
heit von über 95%. Da die Trägermenge an Selenomethionin un
terhalb der Nachweisgrenze lag, kann für die spezifische
Aktivität nur ein Mindestwert von 185GBq/mmol (=5Ci/mmol)
angegeben werden. Die eingesetzte Aktivität betrug 0,93MBq
(25/LCi) .
102
Schema4.3-1S: Fließschema zur Darstellung von n.c.a. [75Se ]
Selenomethionin mit N-BOC-2-AminO-4-brombutter
säureethylester als Markierungsvorläufer
zeit
t=Omin
t=5min
t=12min
t=15min
t=25min
t=60rnin
75Se O in Benzol
I I I polymergebundenes Triphenylphosphin
I .J,
Ph3p75Se
I I I Methyltriflat I .J,
[Ph3P75seCH3]+ -OTf
I I I Tetrabutylamrnoniurnhydroxid I .J,
I I
RCA
100%
97%±2
70%±5
I N-BOC-2-AminO-4-brombuttersäureethylester
I .J,
N-BOC-[75Se ]Selenornethioninethylester
I I I 6N HCl (aq.) I
.J,
[75Se ]Selenomethionin
103
40±5%
34±5%
Reinigung des Produktes über Festphasenfixierung
Zur Umgehung der zeitaufwendigen HPLC wurde untersucht, ob
eine Reinigung mittels SEP-PAK Kartuschen durchführbar ist.
Dazu wurde nach der nukleophilen Substitution der im Über
schuß eingesetzte, lipophile Markierungsvorläufer mit 4-Hy
droxy-Piperidin umgesetzt:
OH
NHBOC
Br~coocH3 1. MeCN, 80·C, 20ffiin,6 Br
NHBOC ___________________ N_H--.. HO~N~COOCH3 2.Essigsaure,Ether
Nach Zugabe von Essigsäure und Ether konnte die entstandene
ionische Verbindung mit anderen hydrophilen Nebenprodukten
und Reagenzien (z.B. TBAH) auf einer Si-60-SEP-PAK Kartusche
fixiert werden. Durch Diethylether wurde der [75Se j-N-BOC-Se-
lenomethioninethylester
Abdampfen des Ethers
methionin umgesetzt.
von der Kartusche eluiert und nach
durch Salzsäure zum [75Se jSeleno-
Die HPLchromatographische Untersuchung der ether ischen Phase
ergab, daß der [75Se j-N-BOC-Selenomethioninethylester zu 95%
von der Kartusche eluiert werden konnte. Zusätzlich wurden in
der Lösung noch 10% polare Selen-75 Produkte nachgewiesen.
Der BABBE wurde zu über 90% durch die Kartusche abgetrennt.
104
4.4. r7SSelselenoalkylierungsagenzien
Im Hinblick auf eine Markierung von Proteinen und Peptiden
mit dem längerlebigen PET-Radioisotop Selen-73 sollte eine
Selen-75 markierte, prosthetische Gruppe synthetisiert wer
den, die eine direkte Ankopplung an ein Protein oder peptid
via Alkylierung einer Aminofunktion ermöglicht. Dazu wurde
auf der Basis eines Selenoethers die Synthese eines n. c. a.
[75Se jSelenoalkylierungsagens entwickelt. Da kurze spacer für
ein unverändertes in vive Verhalten des Proteins von Vorteil
sind, wurde der [75Sej Methylselenopropylrest als prostheti
sehe Gruppe ausgewählt.
4.4.1. synthese von r7SselMethylselenopropylderivaten
Die synthese von [15Se jMethylselenopropylderivaten erfolgte
durch Markierung eines bifunktionellen Propanderivates, so
daß im Eduktmolekül die Abgangsgruppe sowohl für die Markie
rung mit Selen-75 als auch für die Umsetzung mit der Amino
gruppe vorgebildet ist. Zur Ermittlung des geeigneten Eduktes
für die Synthese wurden 1,3-Dibrompropan, 1,3-Propandiol-di
p-toluolsulfonat und 1-Chlor-3-iodpropan als Markierungsvor
läufer eingesetzt.
Das Reaktionsschema zur Synthese der [75Se jSelenoalkylie
rungsagenzien ist in Abbildung 4.4-1 dargestellt. Das n.c.a.
[75Se jMethylselenidanion ([75sejCH3Se-) wurde durch die in
Abschnitt 4.2. beschriebenen Bedingungen in einer radioche
mischen Ausbeute von 70% gewonnen. Analog zur Synthese des
[75Se jSelenomethionins erfolgte die Umsetzung des
[75SejCH3Se- mit dem bifunktionellen Propanderivat in Gegen
wart von Tetrabutylammoniumhydroxid (TBAH) in THF.
105
75, (0) ::;e
Benzol to-r '~e Ph
Methyltriflat ~
TBAH
HC~Se~X 3
X~y
x = Br, OTos, Cl
Y = Br, OTos, I
Abb. 4.4-1: Reaktionsschema zur Darstellung der c?5se JMethyl
selenopropylderivate
Tabelle 4.4-2 zeigt die radiochemische Ausbeute der entstan
denen Selen-75 Produkte für die Markierungsvorläufer l,3-Di
brompropan (BrPropBr), l,3-Propandiol-di-o-p-toluolsulfonat
(TosOPropOTos) und 1-Chlor-3-iodpropan (IPropCl). Betrachtet
man die Selen-75 Produktverteilung ausgehend von BrPropBr, so
ist die radiochemische Ausbeute an [75Se J-1-(Methylseleno)-
3-brompropan 36%, an [75Se J-1-(Methylseleno)-3-prOpanol
(CH375sepropOH) 43% und an unbekanntem, polaren Nebenprodukt
21%. Es wird also vorwiegend der markierte Alkohol
[75seJCH375sepropOH gebildet, der infolge der Hydrolyse des
Alkylbromids durch das Tetrabutylammoniumhydroxid (TBAH) ent
steht. Es konnte nicht eindeutig geklärt werden, ob das Edukt
BrPropBr oder das [75Se J -1- (Methylseleno) -3-brompropan durch
die Hydroxidionen angegriffen wird. Prinzipiell sind beide
Reaktionsalternativen möglich.
106
Tab.4.4-2: Selen-75 produktverteilung bei der Synthese von
[75Se jMethylselenopropylderivaten mit verschieden
en Edukten (Die RCA ist bezogen auf n.c.a.
[ 75SejMethylselenotriphenylphosphoniumtriflat;
130~1 0,35mol/l TBAH in wäßrigem THF, 100~1
1,omol/l Edukt in THF gelöst, Elution mit 1ml THF;
10 mini RT)
RCA RCA RCA
Edukt Produkt [%j Methylseleno- unbekanntes,
CH375se(CH2)3X propanol [%j polares Neben-
produkt [%j
1,3-Dibrom- 36±6 43±6 21±5
propan (X=Br)
1,3-Propandiol- 21±6 47±6 30±6
ditosylat (X=OTos)
1-Chlor- 65±5 12±4 22±5
3-iodpropan (X=CI)
Für das TosOPropOTos als Markierungsvorläufer wurde aufgrund
der hohen Nukleofugie der Tosylatgruppe eine Zunahme der Mar-
kierungsausbeute erwartet.
chemische Ausbeute von
Gemessen wurde jedoch eine radio
lediglich 21% [75Sej-O-Tosyl-l-
(methylseleno)-3-propanol, bei
Ausbeute an [75sejCH375SepropOH
len-75 Nebenproduktes auf 30%.
Tosylgruppe ist offenbar von
gleichzeitiger Zunahme der
auf 47% und des polaren Se
Die höhere Reaktivität der
einer verstärkten Hydrolyse
begleitet. Demzufolge kommt es zu einer Verschiebung der Aus
beute vom Produkt zugunsten des [75SejCH375SepropOH. Die im
Vergleich zu BrPropBr als Edukt geringere Bildung der
[75Se jMethylseienopropylverbindungen (68%= [75Se jCH375Se -
PropOTos + [75SejCH375sepropOH entsprechend 79% bei BrPropBr)
ist durch eine Abnahme der Eduktkonzentration zu erklären,
107
die aus der vollständigen Hydrolyse des TosOPropOTos
resultiert. Dadurch steigt die Ausbeute des polaren Selen-75
Nebenproduktes von 21% (bei BrPropBr als Edukt) auf 30% an.
Durch die Bildung des Hydrolyseproduktes [75se]CH375sepropOH
bei Verwendung
TosOPropOTos war
der Markierungsvorläufer BrPropBr und
die Ausbeute an [75 Se] Selenoalkylierungs-
agens relativ niedrig. Zur steigerung der Ausbeute wurde des
halb 1-Chlor-3-iodpropan (IPropCI) als Edukt eingesetzt.
Einerseits besitzt es durch das Iod eine gute Abgangsgruppe
für die Reaktion mit dem [75se]CH3Se-, andererseits hat das
resultierende Produkt eine ausreichende Stabilität gegenüber
der Hydrolyse durch das TBAH. Desweiteren besteht die Mög
lichkeit, das Edukt nach der Reaktion relativ einfach durch
Festphasenextraktion abzutrennen. Wie aus Tabelle 4.4-2 zu
entnehmen ist, läßt sich das [75Se ]-1-(Methylseleno)-3-chlor
propan (CH375sepropCI) in einer radiochemischen Ausbeute von
65% synthetisieren. Das [75se]CH375sepropOH entsteht nur in
einer Ausbeute von 12%. Da das Chloratom im Produktmolekül
relativ stabil gegenüber der Hydrolyse durch TBAH ist, ist
folgender Reaktionsweg für die Bildung des methylselenierten
Propanols wahrscheinlich: Das IPropCI wird durch das TBAH zum
1-Chlor-3-propanol hydrolysiert, und anschließend erfolgt die
Substitution des Chlors durch das reaktive [75se]CH3se-. Auf
grund der befriedigenden radiochemischen Ausbeute im Falle
von IPropCI wurden die optimierungsversuche auf der Basis
dieses Eduktes durchgeführt.
108
4.4.2. optimierung der synthese des r75sel-l-CMethylseleno)-
3-ohlorpropans
Nachfolgend wird die optimierung der Synthese des [75Se ]-
1-(Methylseleno)-3-chlorpropans (CH375sepropCl) ausgehend von
[75Se ] Methylselenid (CH3Se-) und 1-Chlor-3-iodpropan
(IPropCl) beschrieben.
Abhängigkei~ von der Eduktkonzen~ra~ion und Reaktionszeit
Für die Abtrennung des Produktes sind die eingesetzten Edukt
mengen von entscheidender Bedeutung. Aus diesem Grund wurde
zunächst die Abhängigkeit der radiochemischen Ausbeute von
der IPropCl-Konzentration untersucht. Das Ergebnis der Unter
suchung ist in Abbildung 4.4-3 dargestellt.
70 dP
., 60 ...,
'" ., 50 .Q .,
,'il 40 .,
.<:: 0 ., 30 ..... '" .,
.<:: 20 0
° ..... "0 10
'" 0::
0 0,2
[75 Se ]Methylselenochlorpropan
[15 Se] Methylselenopropanol
°------0----------,0 ----0 0,4 0,6 0,8
c (1-Chlor-3-iod-propan) [mol/l] 1,0
Abb.4.4-3: Abhängigkeit der radiochemischen Ausbeute an
[75se]CH375SepropCl von der Eduktkonzentration
(Die RCA ist bezogen auf n.c.a. [75Se ]Methyl
selenotriphenylphosphoniumtriflat; 150~l wäßriges
THF mit IPropcl und 0,31mol/l TBAH, Elution mit
1ml Ether; 10 mini RT)
109
Es zeigt annähernd den für eine Reaktion pseudo-erster
Ordnung erwarteten Reaktionsverlauf. Die radiochemische Aus
beute erreicht bei einer Eduktkonzentration von 0,60moljl
eine Sättigung von 65%.
Die radiochemische Ausbeute des Nebenproduktes [15Se ]
l-(Methylseleno)-J-propanol (CHJ 75seprOPOH) nimmt mit zuneh
mender IPropCI-Konzentration von 16 auf 7% geringfügig ab. Es
wird vermutet (s. 4.4.1.), daß das [75se]CH375sepropOH haupt
sächlich durch die Reaktion des [75Se]CH3se- mit dem hydroly
sierten Edukt 1-Chlor-3-propanol entsteht. Das Ergebnis
unterstützt diese Vermutung, da mit zunehmender IPropCI-Kon
zentration und gleichbleibender Hydroxidionenkonzentration
die Reaktionswahrscheinlichkeit des [75Se ]CHJse- mit einem
I intakten I IPropCI steigt und somit die Ausbeute an
[75se]CH375SepropOH abnimmt.
Die Untersuchung der Reaktion hinsichtlich der zeit ergab,
daß sich die Selen-75 Produkt zusammensetzung zwischen 30s und
1h nicht ändert. Diese offensichtlich schnelle Umsetzung des
n.c.a. [75Se]CH3Se- verdeutlicht eindrucksvoll dessen hohe
Nukleophilie nach der Bildung aus dem [75Se ]Methylselenotri
phenylphosphoniumtriflat. Aus diesem Grund sollte, um eine
hohe radiochemische Ausbeute zu erhalten, das Edukt während
der Freisetzung des CH3Se- vom Polymer zugegen sein. Aufgrund
der kurzen Reaktionzeit von 30s wurde auf eine weitere Unter
suchung der Kinetik verzichtet.
Optimierung der Tetrabuty~ammoniumhydroxidkonzentration
Als weiterer Parameter interessierte die Abhängigkeit der
radiochemischen Ausbeute an [75se]CH375SePropCI von der TBAH
Konzentration. Zu diesem Zweck wurden 0,15-0, 31molj I TBAH
Lösungen auf das polymergebundene [75Se ]Methylselenotri
phenylphosphoniumtriflat gegeben. Das Ergebnis nach der
anschließenden Reaktion mit dem IPropCI ist in Abbildung
4.4-4 dargestellt.
110
80
"" 70
(!) .j.J 60
'" (!)
~! ! [75SelCH3sepropCl
.0 III 50 ~ (!) 40
.<:: u III
30 .... El
[75 Sel cH,SepropOH
f ~ Y ~
(!) .<:: 20 u 0 .... " 10 !l!
0 0,10 0,15 0,20 0,25 0,30 0,35
c (TBAH) [mol/I]
Abb.4.4-4: Abhängigkeit der radiochemischen Ausbeute an
r75Se]CH375SepropCl von der TBAH-Konzentration
(Die RCA ist bezogen auf n.c.a. [75Se ]Me
thylselenotriphenylphosphoniumtriflatj 150~1 wäß
riges THF mit TBAH und 0,60mol/l IPropCl, Elution
mit 1ml Etherj 10minj RT)
Die Abhängigkeit für die Bildung des [75se]CH375sepropCl
zeigt ein flaches Maximum von 70% bei O,21mol/l TBAH. Bei
TBAH-Konzentrationen über O,25mol/l nimmt die radiochemische
Ausbeute zugunsten des [75se]CH375sepropOH ab, bedingt durch
partielle alkalische Hydrolyse des IPropCl zum 1-Chlor-3-pro
panol. Je höher die TBAH-Konzentration ist, desto größer ist
die gebildete Menge des 1-Chlor-3-propanols und damit auch
der Produktanteil des [75Se ] CH3 75Se propOH. Die Abnahme der
radiochemischen Ausbeute auf 63% [75se]CH375SepropCl bei
O,15mol/l TBAH ist auf
[75se]CH3se- zurückzuführen.
eine niedrigere Ausbeute an
Da alle Triphenylphosphinfunk-
tionen des Polymers mit Hydroxidionen zum Triphenylphosphin
oxid reagieren, ist die Stoffmenge des TBAH zu gering, um das
111
[75SejMethylselenotriphenylphosphoniumtriflat quantitativ in
das [75sejCH3Se- umzusetzen.
Reinigung des Produktes über Festphasenfixierung
Um eine zeitaufwendige HPLchromatographische Reinigung des
[75sejCH375sepropCI zu vermeiden, wurde eine Methode ent
wickelt, die eine Abtrennung des überschüssigen Eduktes durch
Festphasenextraktion ermöglicht. Dazu wurde das IPropCI, des
sen Polarität nur geringfügig von der des [75sejCH375sepropCI
verschieden ist, mit 4-Hydroxypiperidin zum N- (3-Chlorpro
pyl)-4-hydroxypiperidiniumiodid umgesetzt:
I~Cl 2.Essigsäure,Ether
Das [75sejCH375sepropCI reagiert nicht mit dem 4-Hydroxypi
peridin. Die Derivatisierung des Eduktes zu einer ionischen
Verbindung ermöglicht die Fixierung auf einer Si-60-SEP-PAK
Kartusche. Gleichzeitig werden die anderen ionischen und
polaren Nebenprodukte (aktive wie inaktive, z.B. TBAH,
[75sejCH375sepropOH) ebenfalls aus dem Solvens extrahiert.
Die Wechselwirkung des unpolaren [75sejCH375sepropCI mit der
Si-60-Festphase ist so gering, daß durch Elution mit Ether
90% des synthetisierten Produktes freigesetzt werden konnten.
Die Lösung enthielt als radiochemische Verunreinigung nur
noch [75sejCH375sepropOH (0-10%), das bei diesem Reinigungs
verfahren nicht vollständig abgetrennt wird. Darüber hinaus
enthält die Produktlösung noch etwa 0-5% der eingesetzten
Eduktmenge , die jedoch die nachfolgenden Reaktionen nicht
beeinträchtigt.
112
4.4.3. Synthese des r75sel-l-(Methylselenol-3-iodpropans
Das [ 75S e ] CH375sePropCl war für eine Alkylierung von Aminen
nicht ausreichend reaktiv (siehe 4.4.4.1.), so daß das Chlor
atom durch eine bessere Abgangsgruppe substituiert werden
mußte. Zu diesem Zweck wurde in einer Finkelstein-Reaktion
[78] durch einen Chlor-lod-Austausch das [75se]CH375SepropCI
in das [75Se ]-1-(Methylseleno)-3-iodpropan überführt:
Nal
Die Umsetzung mit Natriumiodid wurde in Methylethylketon
(MEK), Aceton und 4-Heptanon durchgeführt, da Natriumiodid in
diesen Ketonen löslich ist, so daß die Reaktion in homogener
Phase abläuft.
Die zeitabhängigkeit der Bildung des [75Se ]-1-(Methylseleno)-
3-iodpropans (CH375sepropl) aus dem [75Se ] CH3 75sePropCI ist
in Abbildung 4.4-5 für verschiedene Ketone als Lösungsmittel
dargestellt. Die Lösungen wurden jeweils mit Natriumiodid
gesättigt und auf die angegebene Temperatur erhitzt. Der Ver
gleich der Reaktionskinetiken von Aceton und MEK zeigt eine
deutliche Zunahme der Reaktionsgeschwindigkeit um einen
Faktor von etwa 2. So haben sich nach 40 Minuten in Aceton
erst 53% des [75se]CH375sePropCI umgesetzt, in MEK ist da
gegen schon zu 88% [75se]CH375sepropI entstanden. Die chemi
schen und physikalischen Eigenschaften, insbesondere die
Polarität von Aceton und MEK, sind, abgesehen von den
siedepunkten, nicht wesentlich verschieden. Die Umsetzung zum
[75se]CH375sepropI in MEK wird somit hauptsächlich durch die
höhere Reaktionstemperatur beschleunigt. Für die Reaktion in
dem noch höher siedenden 4-Heptanon (Kp :143°C) wurde deshalb
113
100,-------------------~--~------------------~
80 ~
"" H 60 g. ... p., llJ
[J) 40 4-Heptanon 120'C "' <-
p:: .... U
~ 20
O~~--~-r--r-~-,--~-r--r-.-~--.-~--r-~ o 20 40 60 80 100 120 140
Zeit [minj
Abb.4.4-5: Abhängigkeit der
[75sejCH375sepropI
Reaktionszeit (Die
[75sejCH375sepropCl;
rad,iochemischen Ausbeute an
vom Lösungsmittel und der
RCA ist bezogen auf n.c.a.
25mg Natriumiodid, 100-200J'1
des jeweiligen Lösungsmittels)
eine weitere Steigerung der Reaktionsgeschwindigkeit erwar
tet. Beobachtet wurde aber ein langsamerer Anstieg der Aus
beute des [75sejCH375SepropI im Vergleich zu MEK und Aceton.
Aufgrund des geringen Umsatzes wurde die Reaktion nach 60
Minuten abgebrochen. Da unpolare Lösungsmittel unvorteilhaft
für nukleophile Substitutionsreaktionen sind, ist die Ursache
für die geringere Reaktionsgeschwindigkeit in 4-Heptanon im
wesentlichen der große Polaritätsunterschied gegenüber MEK
und Aceton. Die höhere Reaktionstemperatur kann den Effekt
der geringeren Polarität nicht ausgleichen, so daß die
Kinetik langsamer ist als in Aceton.
114
somit ist MEK das geeignetste der drei gewählten Lösungsmit
tel, da es eine höhere Reaktionstemperatur als Aceton zuläßt
und aufgrund ähnlicher Polarität die nukleophile Substitution
im gleichen Maße fördert. Für den Chlor-lod-Austausch mit
Natriumiodid wird die maximale radiochemische Ausbeute von
90% an [75sejCH375SePropl in MEK nach 50 Minuten bei SO·C
erreicht.
Zur Reinigung des [75sejCH375sepropl wurde das Natriumiodid
durch Zugabe von Ether ausgefällt und durch nachfolgende Fil
tration über eine Si-60-SEP-PAK Kartusche abgetrennt. Die
Verluste an [75sejCH375sepropl durch die Kartuschentrennung
betrugen 10% bei einer radiochemischen Reinheit von >95%.
Makroskopische Verunreinigungen wurden bei der HPLC-Analyse
nicht beobachtet.
4.4.4. r7SselSelenoalkylierunq von Aminoverbindunqen
4.4.4.1. [7SSelSelenoalkylierung von 1-Butylamin
Grundlegende untersuchungen zur [75Se jSelenoalkylierung wur
den zunächst am Beispiel eines primären Amins durchgeführt,
die als Basis zur [75SejSelenoalkylierung von Aminosäureana
loga dienen. Aufgrund der N&-Aminofunktion des Lysins als
mögliche funktionelle Gruppe zur Alkylierung von Polypeptiden
wurde das I-Butylamin als Modellamin ausgewählt:
H~ 2 H;'Se~NH~
3
Unsetzungen von I-Butylamin und [75Se jCH375sepropCI führten
zu keiner nennenswerten Bildung von [75Sej -3-(Methyl
seleno)propyl-butylamin «5%). Aus diesem Grund wurde durch
115
den Chlor-lod-Austausch aus dem [75se]CH375sepropCl das
reaktivere [75Se ]-1-(Methylseleno)-3-iodpropan (CH375sepropI)
dargestellt. Bei
[75se]CH375SepropI
der Untersuchung der
mit dem l-Butylamin
Reaktion des
interessierten
insbesondere die drei wichtigen Reaktionsparameter Tempera
tur, zeit und Lösungsmittel.
100 .. " . ~ 80 .... '" ... " .Q I 60
~ Po 0
" '" 40 ~
'" ~
~ ~
01 U 20
hl o 20
D
40 60
Zeit [min]
• • ... D
" + x
DMF 80'C DMSO 80'C MeCN 80'C DMF RT MeCN RT
C1CH2CH2Cl 80'C Ether 40'C
80 100
Abb.4.4-6: Abhängigkeit der radiochemischen Ausbeute an
[75Se ]-3-(Methylseleno)propyl-butylamin vom Lö
sungsmittel, der zeit und Temperatur (Die RCA ist
bezogen auf eingesetztes n.c.a.[75se]CH375sepropli
O,5ml O,30mol/l l-Butylamin)
Abbildung 4.4-6
mischen Ausbeute
(CH375sepropNHBu)
zeigt die Zeitabhängigkeit der radioche
an [ 75Se ]-3-(Methylseleno)propyl-butylamin
für die Reaktion des [75se]CH375sepropI mit
l-Butylamin. Die umsetzungen erfolgten bei SO·C in aproti
schen Lösungsmitteln stark unterschiedlicher Polarität. Wegen
des niedrigen Siedepunktes des Ethers wurde diese Reaktion
bei 40·C durchgeführt. Desweiteren wurden für DMF und
116
Acetonitril als Lösungrnittel zusätzlich die Kinetiken bei
Raumtemperatur gemessen. Der [75Se ]Selenoalkylierung liegt in
aprotischen Lösungsmitteln ein SN2-Reaktionsmechanismus zu
grunde. In Lösungsmitteln hoher Polarität wurden daher beson
ders hohe radiochemische Ausbeuten an [75se]-CH375sePropNHBu
erwartet. So konnte in den sehr polaren Lösungsmitteln DMSO
und DMF bei 80°C die Sättigungsausbeute von 95% bereits nach
5 Minuten erreicht werden, während in den unpolaren Lösungs
mitteln Dichlorethan und Ether nach einer Stunde weniger als
30% CH375sepropNHBU entstanden.
Für die Ermittlung der Geschwindigkeitskonstanten wurde
ln (AO/(AO-P» (siehe Abschnitt 4.2.2.1.) gegen die Reak
tionszeit aufgetragen. Für eine Reaktion pseudo-erster Ord
nung ergibt sich eine Gerade, aus deren Steigung die relative
Geschwindigkeitskonstante k' ermittelt werden kann. Abbildung
4.4-7 zeigt diese Auftragung für die Reaktion des
4
x Ether 40°C + C1CH,CH,Cl 80'C
• r::MF soGe 3 0 I:MF RT
• IMSO BOlOe ... MeCN soGe 0 " MeCN RT
• Lys lOOGe
'" • " Lys soGe
~ 2 m Lys 50 Ge
... ...... 0 e 0
a 1 .-f
0
0 20 40 60 80 100
Zeit emin]
Abb.4.4-7: Ermittlung der Geschwindigkeitkonstanten für die
Reaktion von [75se]CH375sepropI mit I-Butylamin
(in verschiedenen Solventien) und Na-Acetyl-lysin
methylester (in DMF bei verschiedenen Tempera
turen)
117
[75se]CH375sePropI mit dem 1-Butylamin in den verschiedenen
Sol ventien. Die berechneten k' -Werte sind in Tabelle 4.4-8
aUfgeführt. Zusätzlich sind in Abbildung 4.4-7 die Werte für
die Reaktion zwischen dem [75se]CH375sepropI und NCI.-Acetyl
lysinmethylester (s. Abschnitt 4.4.4.2.) und die zugehörigen
Regressionsgeraden eingezeichnet.
Ein Vergleich zwischen den radiochemischen Ausbeuten an
r?5se]CH375SePrOpNHBU nach 20 Minuten, der Dielektrizitäts
konstante und dem Dipolmoment ist in Tabelle 4.4-8 für die
verschiedenen Solventien dargestellt. Zusätzlich ist die
relative Geschwindigkeitskonstante k' aufgeführt. Die Dielek
trizitätskonstante und das Dipolmoment sind ein Maß für die
Polarität des Lösungsmittels.
Tab.4.4-8: Dielektrizitätskonstante
Dipolmoment :
6 [79,80]
J.t [81]
rel. Geschwindigkeitskonst. k' (s. Abb.4.4-7)
RCA nach 20 Minuten Reaktionszeit
Lösungsmittel 6 J.t [D] RCA [%] k' [min-1 ]
Ether 40·C 4 8±5 0,00095
Dichlorethan 80·C 6 19±6 0,00212
Acetonitril 80·C 37 3,92 73±6 0,03486
DMF 80·C 37 3,86 95±4 0,76233
DMSO 80·C 47 3,90 95±5 0,64867
Acetonitril RT 37 3,92 31±6 0,0156
DMF RT 37 3,86 53±6 0,0285
Es ist deutlich zu erkennen, daß Solventien hoher Polarität
die [75Se ]Selenoalkylierung begünstigen. Bei dem Vergleich
von DMF und Acetonitril als Lösungsmittel wäre aber bei etwa
gleicher Polarität eine ähnliche radiochemische Ausbeute zu
erwarten gewesen. Die Ausbeuten sind aber sowohl bei 80·C als
118
auch bei Raumtemperatur in DMF mehr als 20% höher als in
Acetonitril. Dies wird auch durch die wesentlich höhere
Geschwindigkeitskonstante ausgedrückt. Der Unterschied ist
auf eine spezifische Wechselwirkung zwischen Edukten und
Lösungsmittel zurückzuführen, welche unabhängig von der Pola
rität des Lösungsmittels ist.
Für die Bildung des eSSe] CH3 7SSe PropNHBu in DMF und Aceto
nitril ist ein ausgeprägter Einfluß der Temperatur auf die
Reaktionsgeschwindigkeit festzustellen, so wird die Reaktion
durch Erhöhung der Temperatur von 20·C auf SO·C um den Faktor
27 (DMF) bzw. 2,3 (Acetonitril) beschleunigt. Werden die
Geschwindigkeitskonstanten für DMF und Acetonitril bei Raum
temperatur mit denen für Dichlorethan (SO·C) und Ether (40·C)
verglichen, so zeigt sich deutlich, daß die Polarität des
Lösungsmittels einen größeren Einfluß auf die eSSe]Seleno
alkylierung hat als die Temperatur.
4.4.4.2. [75selSelenoalkylierung von Lysin
Die s-Aminofunktion der Aminosäure Lysin ist eine mögliche
nukleophile Gruppe in Peptiden und Proteinen, die durch
[7SSe ]Selenoalkylierung markiert werden kann. Um ausschließ
lich die Reaktion der s-ständigen Aminofunktion zu unter
suchen, wurde das Na-geschützte Lysin Na-Acetyl-lysinmethyl
ester für die Synthese eingesetzt:
75 /Se~I Hp
________________ --.~ RN
Hc:::se~ 3
119
o
Die Untersuchungen wurden in DMF als Lösungsmittel durchge
führt, da es bei der [7 S Se j Selenoalkylierung von Butylamin
die besten Ergebnisse erbrachte.
100
90
"" 80 ~ .....
70 ~ ....:I I 60 ~ 8' 50
'"' p., 40 (1J UJ
"' <- JO
5' ~ 20
~ 10
0 0 10 20 JO 40 50 60 70 80 90 100
Zeit [min]
Abb.4.4-9: zeit- und Temperaturabhängigkeit der radiochemi
schen Ausbeute von [7SSe j-Na-Acetyl-NE_(3-(methyl
seleno)propyl)-lysinmethylester (Die RCA ist be
zogen auf eingesetztes n.c.a. [7SsejCH37SsepropIi,
2S~mol Na-Acetyl-lysinmethylester in 130~l DMF)
Die Zeitabhängigkeit der radiochemischen Ausbeute an
[7SSe j-Na-Acetyl-NE_(3-(methylseleno)propyl)-lysinmethylester
(NE_CH3 7Sseprop-Na-Ac-LyS-OCH3) bei SO, 80 und 100·C ist in
Abbildung 4.4-9 dargestellt. Die Kurven zeigen deutlich die
erwartete Kinetik pseudo erster Ordnung. Nach 10min bei 100·C
reagierten bereits 8S% des eingesetzten [75sejCH375sepropI
zum Produkt. Insbesondere im Temperaturbereich zwischen 50
und 80·C ist eine deutliche steigerung der Reaktions
geschwindigkeit zu beobachten. So wird der [75Se j-NE
CH37Sseprop-Na-AC-LyS-OCH3 bei einer Temperaturerhöhung von
120
50 auf SO·C etwa um den Faktor 3,5 schneller gebildet,
während die Kinetik bei lOO·C etwa doppelt so schnell ist als
bei SO·C. Im Vergleich zur Reaktion von [75selCH375sepropI
mit l-Butylamin wird die maximale radiochemische Ausbeute bei
SO·C etwa 35 Minuten später erreicht. Zur Verdeutlichung sind
in Tabelle 4.4-l0 die relativen Geschwindigkeitskonstanten
für die umsetzung von [75selCH375sepropI mit dem N<1-Acetyl
lysinmethylester angegeben. Sie sind aus den Steigungen der
Geraden in Abbildung 4.4-7 ermittelt worden. Zusätzlich wurde
der Wert für die Synthese des [75selCH375sepropNHBu in DMF
bei SO·C eingetragen. Die k'-Werte zeigen eindrucksvoll die
Steigerung der Reaktionsgeschwindigkeit durch die Tempe
raturerhöhung. Wird der Wert bei So·c mit dem bei der Umset
zung mit l-Butylamin verglichen, so ist ein groBer Unter
schied in der Umsatzrate festzustellen. Dennoch handelt es
sieh um eine relativ schnelle Reaktion, da bei lOO·C bereits
nach l5 Minuten eine radiochemische Ausbeute an [75Se1 - NB
CH375seProp-N<1-Ac-Lys-OCH3 von 90% erhalten wurde.
Tab.4.4-10: Relative Geschwindigkeitskonstanten k'
tion zwischen [75Se l CH3 75sePropI und
der Reak
N<1-Acetyl-
lysinmethylester bzw. l-Butylamin für verschie
dene Reaktionstemperaturen in DMF
Temperatur [OC] k' [min-1 ]
50 O,Olll
SO 0,0629
lOO 0,2l17
SO (l-Butylamin) 0,76233
Im Reaktionsschema 4.4-11 sind die einzelnen Reaktions
schritte für die [75se JSelenoalkylierung von Aminen mit der
[75se J-1-Methylselenopropylgruppe als prosthetische Gruppe
zusammengefaBt. Es sind die jeweiligen radiochemischen Aus
beuten und der Zeitbedarf dargestellt.
121
Schema 4.4-11: Reaktionsschema zur Synthese des [75Se ]Seleno
alkylierungsagens und dessen Umsetzung mit
Zeit
Omin
Smin
12min
16min
3Smin
8Smin
1-Butylamin und Na-Acetyl-lysinmethylester RCA
~- Ph 3P 1 75 se (O)
{-Ph 3P=75 se
1 Methyltriflat
OTf
~ + 75
-Ph P-Se -eH 3 3
j TBAH
I~Cl
H C~Se~Cl 3
Derivatisierung des Eduktes
SEP-PAK-Kartuschentrennung
Abdampfen des Ethers
NaI/MEK/80°C
75 ~ H C-Se I
3
SEP-PAK-Kartuschentrennung
Abdampfen des Ethers
97±2%
70±S%
48±S%
42±6%
38±7%
33±7%
lOOmin 1-----L-----.1 l-Butylamin/DMF/80°C N-Ac-Lys-OMe/DMF/100oC
lOSmin
l1Smin
75 ~ H C/Se~NH~
3
HN 75 I
H C-Se~ 3
122
32±7%
HAc
O'CH I 3
° 30±7%
Das [75se]CH375sepropI konnte innerhalb von 85 Minuten in
einer radiochemischen Ausbeute von 38% (bezogen auf das ein
gesetzte elementare Selen-75) synthetisiert werden. Die
anschließende Umsetzung mit 1-Butylamin erfolgte mit einer
Ausbeute von 95%, so daß die radiochemische Ausbeute über
alle schritte 32% innerhalb von 105 Minuten beträgt. Für die
Markierung von WOC-Acetyl-lysinmethylester am seitenketten
stickstoff sind zusätzlich 10 Minuten notwendig, um eine
radiochemische Ausbeute von 30% bezogen auf das eingesetzte
elementare Selen-75 zu erreichen.
Durch die Synthese des [15se]CH375sepropI steht somit eine
Selen-75 markierte, prosthetische Gruppe zur Verfügung, die
via Alkylierung an eine Aminofunktion gekoppelt werden kann.
Die Umsetzungen mit 1-Butylamin und Na.-Acetyl-lysinmethyl
ester erfolgten mit hohen radiochemischen Ausbeuten, so daß
auch radiopharmazeutisch relevante Aminosäuren, polypeptide
oder Antikörper markiert werden können, wenn sie freie Amino
funktionen außerhalb der pharmakophoren Gruppe besitzen. Des
weiteren besteht die Möglichkeit, durch Ankopplung des
[75se]CH375SePropI an anderen nukleophilen Gruppen, z.B. SH
oder OH-Funktionen, potentielle Radiopharmaka zu markieren.
123
5. Zusammenfassung
Der Positronenstrahler Selen-73 ist aufgrund seiner relativ
langen Halbwertszeit von 7,lh ein geeignetes Radionuklid zur
Markierung von PET-Radiopharmaka, die sich durch eine relativ
langsame in vivo Kinetik auszeichnen wie z.B. Antikörper oder
deren Fragmente. Zur EntwiCklung von Markierungssynthesen
wurde trägerfrei (n.c.a.) prOduziertes Selen-75 (EC, T~=120d)
als Modellradionuklid eingesetzt. Die Darstellung von Selen-
75-markierten, unsymmetrischen Selenoethern erfolgte über
eine zweistufige Synthese beginnend mit einer Heterogenreak
tion an polymergebundenem Triphenylphosphin und nachfolgender
Sekundäralkylierung in homogener Phase. Als potentielle Ra
diotracer wurden Synthesen zur Darstellung von n. c.a.
[73,75Se jSelenomethionin, [73,75Se jMethylselenopropylderivaten
und Selen-73/75 markiertem Lysin entwickelt.
Die trägerfreie Produktion des Selen-75 erfolgte über die
75As(p,n)75Se Kernreaktion mit 20MeV Protonen am Jülicher
CV 28 Zyklotron. Bei Verwendung eines Niederstromtargets
diente Arsentrioxid als Targetmaterial. Nach der Bestrahlung
wurde das Selen-75 in HCl/H202 gelöst und das [75Se jSelenit
durch Schwefeldioxid zu elementarem Selen-75 reduziert. Das
n.c.a. Selen-75 wurde durch Benzol extrahiert. Zur Produktion
größerer Aktivitätsmengen wurde ein HOChstromtarget mit einer
Kupfer-Arsen-Legierung (Cu3As) als Targetmaterial eingesetzt.
Das Selen-75 konnte durch Thermochromatographie fast quanti
tativ vom Arsen abgetrennt werden. Durch Reduktion der salz
sauren [75Se jSelenitlösung mit Schwefeldioxid und Extraktion
des elementaren, n.c.a. Selen-75 mit Benzol wurde eine radio
chemische Ausbeute von 65% erreicht.
Für die Selenierungsreaktion wurde im ersten heterogenen
Reaktionschritt das in Benzol gelöste elementare n.c.a.
Selen-75 mit dem polymergebundenem Triphenylphosphin zum
[75SejTriphenylphosphinselenid umgesetzt. Die Addition zum
[75SejPhosphinselenid erfolgte mit einer radiochemischen
124
Ausbeute von > 97% bei einer Verweilzeit von ~30s. Die Alky
lierung zum [75SejAlkylselenotriphenylphosphoniumsalz wurde
mit verschiedenen Alkylierungsagenzien (Benzylbromid, Methyl
iodid und Methyltriflat) untersucht. Die höchste radioche
mische Ausbeute konnte mit Methyltriflat in Toluol erhalten
werden. Hierbei bildet sich das [75Se jMethylselenotriphenyl
phosphoniumtriflat bereits bei Raumtemperatur innerhalb von 4
Minuten zu 70%. Zur Freisetzung von [75Se jMethylselenid unter
Phasentransferbedingungen in THF-Lösung konnten mit Tetra
butylammoniumhydroxid als Base radiochemische Ausbeuten von
70% erreicht werden. Die Darstellung unsymmetrischer Seleno
ether wurde durch Umsetzung des [75Se jMethylselenidanions mit
Brom-, Iod- oder O-Tosylpropan in THF untersucht. Innerhalb
von einer Minute bildete sich [75Se jMethylselenopropan mit
einer für alle drei Edukte identischen radiochemischen Aus
beute von 55±G%.
Im Hinblick auf die radiopharmazeutische Verwendung von
n.c.a. [73Se jSelenomethionin für die PET-Diagnostik konnte
die selenanaloge Aminosäure auf der Basis des Synthesekonzep
tes zur Herstellung unsymmetrischer [75Se j Selenoether erst
mals trägerfrei mit Selen-75 markiert werden. Hierzu wurden
zwei Synthesewege optimiert. Im ersten Fall wurde das über
polymergebundenes [75SejMethylselenotriphenylphosphoniumtri
flat dargestellte [75Se jMethylselenid mit 2-Aminobutyrolacton
als Edukt unter nukleophiler Lactonspaltung zum [75Se jSeleno
methionin umgesetzt. Unter optimierten Bedingungen konnte in
Gegenwart von Natiumhydroxid-1.8-Krone-G bei GO·C in THF/Me
thanol nach 1.0 min eine radiochemische Ausbeute von 1.1.% (be
zogen auf eingesetztes elementares Selen-75) erhalten werden.
Im zweiten Falle wurde die Synthese durch eine nukleophile
Austauschreaktion mit O-Tosylhomoserinmethylester als Edukt
durchgeführt. Die Umsetzung des polymergebundenen [75Se jMe
thylselenotriphenylphosphoniumtriflats mit dem Edukt in THF/
Methanol bei 20·C führte nach 1.0 min zu einer radiochemischen
Ausbeute von 35% [75SejSelenomethioninmethylester (bezogen
auf eingesetztes elementares Selen-75). Nach saurer Hydrolyse
1.25
konnte das n.c.a. [75selSelenomethionin in einer
radiochemischen Ausbeute von 30% erhalten werden. Alternativ
zum O-Tosylhomoserin wurde der nukleophile
N-BOC-2-Amino-4-brombuttersäureethylester
Austausch auch an
untersucht. Nach
Freisetzung des [75Se lMethylselenidanions durch Tetrabutyl
ammoniumhydroxid konnte in THF innerhalb von 10 Minuten eine
radiochemische Ausbeute von 40% [75Se l-N-BOC-Selenomethionin
ethylester (bezogen auf eingesetztes elementares Selen-75)
erreicht werden. Nach säurekatalysierter Schutzgruppenabspal
tung betrug die radiochemische Ausbeute des n.c.a. [75Se lSe -
lenomethionins 34%. Die Reinigung des Produktes erfolgte ent
weder durch eine Festphasenfixierung der Nebenprodukte im An
schluß an die [75Se l Methylselenierung oder durch HPLC nach
dem Abspalten der Schutzgruppen. Die radiochemische Reinheit
des [75SelSelenomethionin war >95% bei einer spezifischen
Aktivität von >185GBq/mmol.
Zur Markierung von Proteinen durch Selenoalkylierung einer
Aminofunktion mittels einer prosthetischen Gruppe wurde eine
Synthese von [75Se lMethylselenopropylderivaten entwickelt.
Durch [75Se lMethylselenierung bifunktioneller Alkane wie 1,3-
Dibrompropan, 1-Chlor-3-iodpropan, 1,3-Propandiol-di-tosylat
konnten verschiedene n.c.a. [75Se lMethylselenopropylderivate
hergestellt werden. Die höchste Ausbeute wurde durch Umset
zung von 1-Chlor-3-iodpropan mit [75Se lMethylselenid in Ge
genwart von Tetrabutylammoniumhydroxid in THF erhalten. Das
[75Se l-1-(Methylseleno)-3-chlorpropan bildete sich bei Raum
temperatur innerhalb von 30 Sekunden in einer radiochemischen
Ausbeute von 48% (bezogen auf eingesetztes elementares Selen-
75). Nach der Isolierung des Produktes durch eine Festphasen
fixierung betrug die radiochemische Reinheit >90%. Zur Me
thylselenopropylierung von Aminen ist die Nukleofugie des
[75Se l-1-(Methylseleno)-3-chlorpropans zu niedrig, so daß
durch einen Chlor für Iod Austausch das reaktivere
[75Se l-1-(Methylseleno)-3-iodpropan synthetisiert werden muß
te. Eine radiochemische Ausbeute von 90% (bezogen auf ein
gesetztes [75Se l-l-(Methylseleno)-3-chlorpropan) konnte bei
126
80°C nach 50 min in Methylethylketon erreicht werden. Die
radiochemische Reinheit war >95%.
Zur Untersuchung der [75SelSelenoalkylierung freier Amino
funktionen in Peptiden oder Proteinen wurden 1-Butylamin und
Lysin als Modellsubstanzen für die Umsetzung mit dem [75Se l
Methylselenopropylderivat ausgewählt. Ausgehend vom [75Se l-1-
(Methylseleno)-3-iodpropan reagierte 1-Butylamin in DMF oder
DMSO innerhalb von 5 min bei 80°C mit einer radio chemischen
Ausbeute von 95% zum n.c.a. [75Se l-3- (Methylseleno)propyl
butylamin (bezogen auf eingesetztes [75Se l -1- (Methylseleno)-
3-iodpropan) .
Zur selektiven Markierung der Aminoseitenkette des Lysins
wurde der N«-Acetyllysinmethylester eingesetzt. In DMF führte
die Umsetzung mit [75Se l-1-(Methylseleno)-3-iodpropan bei
100°C nach 15 min zu einer radio chemischen Ausbeute von 90%
[75Se l-N«-Acetyl-NE-(3-(methylseleno)propyl)lysinmethylester.
Hiermit steht eine effiziente Methode für die Markierung von
Aminosäureanaloga zur Verfügung, die auf die Markierung von
Peptiden bzw. Proteinen über tagen werden kann. Damit wird das
Spektrum der bisher eingesetzten 18F-Alkylierung und 18F-ACy
lierung von Biomolekülen um einen längerlebigen Tracer
erweitert.
Zur Identifizierung der trägerfrei markierten Produkte wurde
folgende Substanzen erstmals mit inaktivem Selen syntheti
siert und spektroskopisch analysiert: 1-(Methylseleno)-3-
brompropan, 1-(Methylseleno)-3-iodpropan, 3-(Methylseleno)
propyl-butylamin, N«-Acetyl-NE_(3-(methylseleno)propyl)lysin
methylester.
127
Anhang
Abkürzungsverzeichnis
BABBE
BOC
BrPropBr
CH3Se
CH375SePropCl
CH375SePropI
CH375SepropNHBu
CH375SepropOH
DK
DMF
DMSO
EC
EI
EtOH
Fp.
HMPA
lH-NMR
HPLC
HSAB
IPropCl
IR
l8-Krone-6
Kryptofix 2.2.2
MeCN
MEK
Methyltriflat
N-BOC-SeMetEt
NE_CH375seprop-
Wl-Ac-Lys- OCH3
n.c.a.
N-BOC-2-Amino-4-brombuttersäureethyl
ester
tert.Butylcarbonyl
l,3-Dibrompropan
Methylselenidanion
[75Se l-l-(Methylseleno)-3-chlorpropan
[75Se l-l-(Methylseleno)-3-iodpropan
[75Se l-3-(Methylseleno)propyl
butylamin
[75Se l-l-(Methylseleno)-3-propanol
Dielektizitätskonstante
N,N,-Dimethylformamid
Dimethylsulfoxid
Electron capture (Elektroneneinfang)
Elektronenstoßionisation
Ethanol
Schmelzpunkt
Hexamethylphosporsäuretriamid
Protonenresonanz-Spektroskopie
High Pressure Liquid Chromatographie
Hard and soft acids and bases
l-Chlor-3-iodpropan
Infrarot-Spektroskopie
1,4,7,lO,13,16-Hexaoxocyclooctadecan
4,7,13,16,21,24-Hexaoxo-l,lO-diaza
bicyclo[8.8.81hexacosan
Acetonitril
Methylethylketon
Trifluormethansulfonsäuremethy1ester
N-BOC-Selenomethioninethylester
[75Se l-Wl-Acetyl-NE-(3-(methylseleno)
propyl)-lysinmethylester
no carrier added (ohne Trägerzusatz)
128
PET
RCA
RP
RT
TBAH
THF
TMAH
TosOPropOTos
TPP
TPPSe
TPPSeMeOTf
E
jJ.
cr
Positronen Emissions Tomographie
radiochemische Ausbeute
Reversed Phase
Raumtemperatur
Tetrabutylammoniumhydroxid
Tetrahydrofuran
Tetramethylammoniumhydroxid
1,3-Propandiol-di-O-p-toluolsulfonat
Triphenylphosphin
Triphenylphosphinselenid
Methylselenotriphenylphosphonium
triflat
Dielektizitätskonstante
Dipolmoment
wirkungsquerschnitt
129
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135
Danksagung:
Herrn Prof. Dr. G. Stöcklin danke ich für die interessante
Themenstellung und die begleitenden Diskussionen.
Mein besonderer Dank gilt Herrn Dr. K. Hamacher für die Be
treuung, die wertvollen Ratschläge und zahlreichen Diskus
sionen.
Ebenfalls schulde ich den Herren Dr. M. Holschbach und
Diplom. ehem. H.-J. Wester für weitere Anregungen Dank.
Desweiteren danke ich Herrn W. Wutz und Herrn D. Unterlugauer
für die Durchführung der tierexperimentellen Untersuchungen
und spektroskopischen Messungen. Nicht zuletzt gilt mein Dank
auch allen Mi tarbei tern und Komili tonen des Instituts für
Nuklearchemie, die mir immer hilfreich mit Rat und Tat zur
Seite gestanden haben.
, FORSCHUNGSZENTRUM JÜLlCH GmbH ==============~F~====
Jül-31GS September 1995 ISSN 0944-2952
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