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Evidenze e benefici dell’analisi

clinica di routine in LC-MS/MS

• Immunosoppressori in sangue intero

• 25-OH vitamina D3/D2 in plasma/siero

• Steroidi in plasma/siero/DBS

Dr. Donzelli Simone

Regional Development Specialist Clinical

Waters

Indice: • Immunosoppressori

Studio del TDM L’importanza del TDM degli immunosoppressori Tecniche a confronto

• Vitamina D3 Perchè la misura della 25-OH Vitamina D3 L’importanza della 25-OH Vitamina D2 Tecniche a confronto Stato dell’arte

• Steroidi Tecniche a confronto Analisi del profilo steroideo (valutazione kit CE-IVD) Applicazioni su siero e DBS del CAH (Congenital Adrenal Hyperplasia)

Immunosoppressori e l’importanza del Therapeutic Drug Monitoring

Cos’è il “therapeutic drug monitoring”?

“Il Therapeutic Drug Monitoring (TDM) è un settore della

chimica clinica che si specializza nella misurazione di livelli di

farmaci nel sangue. Il suo principale obiettivo è focalizzato sui

farmaci con un piccolo margine terapeutico: farmaci che

facilmente possono essere sotto o sovradosati.” D. Holt

I clinici useranno la misurazione della concentrazione del

farmaco insieme alle loro osservazioni ed agli altri risultati di

altri tests per modificare il dosaggio del farmaco per ottenere il

risultato migliore possibile per ogni paziente. Questa

individualizzazione della terapia usando tutte le informazioni

possibili è conosciuta come Therapeutic Drug Management.

La maggior parte dei farmaci terapeutici possono anche avere

effetti di tossicità

Concentration

peutic

Therapeutic Toxic

Ibuprofene

peutic

Se l’optimum del range terapeutico è vicino alla tossicità

il dosaggio deve essere controllato accuratamente TDM

Perchè il TDM è necessario?

TDM degli immunosoppressori

Il TDM per i farmaci anti-rigetto è una strategia per la quale il regime

di dosaggio per un paziente è controllato da ripetute misurazioni della

concentrazione del farmaco nel sangue.

Fattori critici che possono aiutare a definire un indice terapeutico:

– Età, sesso, peso del paziente

– Dosaggio del farmaco

– Farmacocinetica

– Co-medicazioni

– Metodiche usate dal laboratorio per misurare i farmaci

Variabilità inter-individuale

A seconda del paziente ci possono quindi essere anche grandi

differenze inter-individuali nella farmacocinetica e

farmacodinamica. Una terapia opportuna dipenderà appunto

dall’individualizzazione del trattamento

Patient 1 Patient 2

Patient 3 Patient 4

Perchè TDM per gli immunosuppressori?

L’ individualizzazione del trattamento dovuta alle ampie differenze inter-paziente in PK/PD richiede un accurato TDM;

In alcuni casi il TDM viene utilizzato anche per assicurarsi che i pazienti stiano prendendo le dosi prescritte del farmaco (compliance del paziente).

Il range terapeutico è piccolo per cui il dosaggio deve essere controllato in modo opportuno;

Tecniche di analisi

Immunoassay (automatizzato / semi-automatizzato)

HPLC con rivelazione a UV / Fluorescenza

LC-MS/MS

LC-MS/MS 29%

Abbott Architet 44%

Altre Piattaforme IA 5%

Siemens Dimension 22%

Piattaforme di analisi del tacrolimous in US 2010

Waters 58%

AB Sciex 30%

Thermo Fisher 8%

Agilent 4%

Crescita della tecnica di LC-MS/MS per il monitoraggio degli immunosuppressori

di risultati r

Emit 2000

HPLC MS

LC-MS/MS

Come mai cresce la LC-MS/MS?

Carenze

Immunoassay

Performance

Immunoassay

Performance

LC-MS/MS

Bassa Specificità

Interferenze dei metaboliti di

Ciclosporina e Tacrolimus sono

bene documentati.

Specificità altissima: massa

e frammenti caratteristici

per ogni farmaco

Bassa Sensibilità

Molti, se non tutti gli IA TDM

hanno problemi con la

sensibilità

Eccellente: < 0,5 ug/L

Alti costi*

Confronto di Performance

tra IA e LC-MS/MS

LC-MS/MS è più specifica degli IA

Interferenze con metaboliti

1Ther Drug Monit 2009;31(2):269-272 2Ther Drug Monit 2009;31(6):743-745 3Ther Drug Monit 2007;27(1):94-97 4Clinica Chimica Acta 2010;411:77-80

Interferenze da anticorpi endogeni1

Interferenze da fattori reumatoidi2

Effetto dell’ematocrito3

Interferenze sconosciute4

Perchè la LC-MS/MS?

Tecnica considerata “Gold standard” per il TDM

degli immunosoppressori

Alta Specificità per ogni farmaco

―Le selezioni della massa e dei frammenti caratteristici per ogni farmaco

elimina ogni cross-reaction con i metaboliti

Accuratezza e precisione superiori

Sensibilità elevata (0,5 ug/L)

Immunosuppressant Immunoassays - Company Assay % Metabolite Cross Reactivity Siemens Dimension Systems SIRO Assay 89% Emit 2000 Sirolimus Assay 61% ADVIA Centaur Systems CsA Assay 16% Dimension Clinical Chemistry System CSA/CSE Assay 6% Emit 2000 Cyclosporine Assay 8% Dimension Clinical Chemistry System Tacrolimus 18% Emit 2000 Tacrolimus Assay 21% Abbott ARCHITECT Sirolimus Assay 37% ARCHITECT Tacrolimus Assay 94% ARCHITECT Cyclosporine Assay 3.3% TDx Cyclosporine Monoclonal‐Whole Blood Assay 96% IMx Sirolimus Assay 77% IMx Tacrolimus/Tacrolimus II Assay 67% Thermo-Fisher Thermo Scientific QMS Everolimus Immunoassay 63% Thermo Scientific Innofluor Certican (Eve) Seradyn 142% CEDIA Cyclosporine Plus (Microgenics) 32.5 % CEDIA Tacrolimus (Microgenics) 38% % Metabolite cross reactivity is the highest % of cross reactivity for a specific metabolite of the parent drug. References Advances in Chromatographic Techniques for Therapeutic Drug Monitoring – Amitava Dasgupta 2010

LC-MS/MS vs. MEIA

Ther Drug Monit Volume 28, Number 4, August 2006

LC-MS/MS vs. MEIA e CEDIA

LC-MS/MS vs. FPIA per everolimus

LC-MS/MS vs. ACMIA per tacrolimous

“The analytical methods FPIA and LC-MS/MS are not in

agreement. . . . using FPIA results in higher everolimus

concentrations compared with LC-MS/MS.”

“FPIA can lead to clinically relevant differences in everolimus

dosage advice and higher intra-patient variability.”

“LC-MS/MS outperforms FPIA for clinical monitoring and

intervention of everolimus therapy in adult renal transplant

recipients…”

LC-MS/MS vs. FPIA per everolimus

Tecnica considerata “Gold standard” per il TDM degli

immunosoppressori

Alta Specificità per ogni farmaco Le selezioni della massa e dei frammenti caratteristici per ogni farmaco

Ciclosporina

Cut-off: cuore: 350 ng/ml

Linearità Massa 2000 ng/ml

ARCHITECT tacrolimus package insert

Innofluor Certican package insert

immunosoppressori

Le selezioni della massa e dei frammenti caratteristici per ogni farmaco

LC-MS/MS accuratezza

Concentrazione del Tacrolimus

misurata con il kit MassTrak in

relazione al valore medio dei report

NEQAS di tutti i laboratori che

utilizzano la tecnica di LC-MS/MS

Linearità:

Y = 0.998X + 0.099; r2 = 0.996

Differenza media 1.1% in un range

di 0.0 – 30.7 ng/mL

Accuratezza

immunosoppressori

Le selezioni della massa e dei frammenti caratteristici per ogni farmaco

Sensibilità elevata

La sensibilità,la specificità e la precisione degli strumenti immunochimici ai livelli bassi delle finestre terapeutiche iniziano a diventare critiche per il monitoraggio.

Con livelli funzionali vicini a 1 ng/ml (pediatrici), LC-MS/MS ha prestazioni decisamente superiori della strumentazione immunochimica

La combinazione di immunosoppressori ha portato ad una diminuzione dei livelli di dosaggio terapeutico:

25-OH Vitamina D3/D2

25 OH - Vitamina D

Che cos’è la Vitamina D?

•Vitamina D è una classe a se’ stante: gli effetti che ottiene nel corpo sono allineati a un ormone che agisce per influenzare i percorsi metabolici, le funzioni cellulari…

•La forma metabolica attiva della Vitamina D, chiamata 1,25-diidrossivitamina D (o calcitriolo) è un ormone secosteroide (pro ormone)

•Non bisogna considerare la Vitamina D come una vera e propria Vitamina (sostanza che, come la Vitamina C, partecipa alle reazioni biologiche, aiutando il corpo a operare ottimamente)

Benefici della Vitamina D

• Metabolismo Osseo: previene osteoporosi, rachitismo, fratture

• Salute cellulare: previene tumori (seno, prostata, pancreas, ovaie, colon)

• Salute organismo: previene problemi cardiaci ed infarti, diabete di tipo 2, perdita dei denti…

• Salute muscolare

• Salute Mentale: previene la depressione (stimola la produzione di serotonina), schizofrenia, Alzheimer,...

25 OH - Vitamina D

Misurazione della Vitamina D

Nel corpo sono presenti circa 30 metaboliti che in maggior parte non svolgono alcuna funzione fisiologica ma costituiscono soltanto prodotti di degradazione Migliore indicatore dello stato della vitamina D: 25-OH-vitamina D3

Come mai la forma attiva 1,25-(OH)2-vitamina D3 non viene considerata come il principale indicatore della carenza di Vitamina D?

25 OH - Vitamina D

•È il metabolita principale (prodotto nel fegato); •Emivita di 8 settimane; •Si presenta in concentrazioni rilevabili in siero/plasma: 20 – 70 µg/L; •È l‘indicatore principale dello stato della presenza di Vitamina D3 nel corpo

• molto instabile (emivita 8 minuti)

• quantità di almeno 1000 volte inferiore alla 25-OH-vitamina D

Il fatto che la sintesi della VitD3 viene attivata anche dai raggi UV solari

porta ad un valore medio di Vitamina D3 diverso tra estate ed inverno

ed a un valore basso in zone poco esposte ai raggi solari

Carnagione scura meno Vit.D3; Carnagione chiara più Vit.D3

In Gran Bretagna più del 50% della popolazione ha livelli di vitamina D

insufficienti

In Medio Oriente alta presenza di sole ma le donne sono

completamente vestite

Range terapeutici Vitamina D:

•Grave Carenza: < 10 ug/L (ng/mL)

•Insufficienza: 10 ug/L < Vit D < 20 ug/L

•Livello Ottimale: 20 ug/L < Vit D < 70 ug /L

25 OH - Vitamina D

Valutazione di: • Roche • Diasorin RIA • Diasorin Liaison • IDS EIA • HPLC UV • LC-MS/MS

•Capacità di analizzare 25OH vitD2 e 25OH vit D3 separatamente •Capacità di misurare Vit D2 e vit D3 totali •Capacità di discriminare l’epimero •LOQ •Precisione •Produttività •Flessibilità nel settaggio metodi

Valutazioni Metodiche Immunoassay:

Diasorin:

Sensibilità: 4 ug/L

Range di linearità: 4 – 150 ug/L

Sensibilità: 2,5 ug/L

Range di linearità: 2,5 – 144 ug/L

Abbott:

Sensibilità: 8,0 ug/L

Range di linearità: 8 – 120 ug/L

Entrambe le metodiche:

• Misurano la Vitamina D TOTALE!

• non riescono a separare l’epimero della Vit. D

Valutazioni Metodiche HPLC:

HPLC-UV: Sensibilità: 3 ug/L Range di linearità: 3 – 250 ug/L HPLC-MS/MS: Sensibilità: 1,0 ug/L Range di linearità: 1,0 - 250 ug/L

Entrambe le metodiche:

• Possono calcolare separatamente la 25-OH vitamina D3 e D2

• La massa riesce a separare l’epimero della Vit. D

25 OH - Vitamina D

PERCHE’ E’ IMPORTANTE QUANTIFICARE LE DUE ISOFORME:

La Vitamina D3 non è presente in natura perché viene prodotta solo nel

corpo mediante la reazione vista precedentemente

La Vitamina D2 è di origine vegetale. Mediante la dieta si può raggiungere

una concentrazione massima nel corpo di circa 2 ug/l.

Ci sono quindi differenze nelle attività biologiche e nella tossicità fra le due

isoforme:

– L’assorbimento intestinale della Vitamina D2 è minore che quello della

vitamina D3

– La clearance della 25OH-VitD2 è più veloce di quella della 25OH-VitD3.

Ciò dovrebbe essere dovuto alla

minore affinità del 25OH-VitD2 al legame D-proteico (DPBV)

Ci sono quindi differenze nel metabolismo di queste due forme di Vitamina:

la Vit D2 non può essere considerata efficace come la Vit D3!

Compares DiaSorin RIA, Nichols CPBA, IDS RIA with LC/UV

Vitamin D2 is a common supplement worldwide for the

treatment of vitamin D deficiency. Consequently, assay

recognition of 25OHD2 is critically important

Treatment with vitamin D2 may not be accurately monitored

with any of the three commercial assays studied

Stato dell’arte della Vitamina D

Comparazione di diversi metodi di rilevazione: -RIA (Diasorin) -Diasorin Liaison (CLIA) -IDS – ISYS (CLIA) -Abbott (CMIA) -Siemens (CLIA) -Roche (ECLIA) -2 LC-MS/MS Diasorin R&D: Waters Acquity TQD

Pathology Queensland: Waters Acquity XE premiere (Tecan)

Analisi di 170 pazienti selezionati a caso

Calcoli fatti: Passing-Bablock Regression Y=a + bX

Intrassay precision CCC= Concordance Correlation Coefficient Bias

Steroidi

Steroidi in Immunoassay

Analisi del profilo steroideo utilizzando kit diagnostici CE-IVD

Obiettivo:

Valutazione del kit per analisi degli steroidi CHS su

strumentazione ACQUITY UPLC/Xevo TQ-S

Il metodo usato utilizza la preparazione del campione del kit diagnostico: Precipitazione proteica del siero + evaporazione del surnatante + ricostituzione Il kit presenta calibratori in matrice a 7 livelli (L1-L7) e 3 controlli di qualità sempre in matrice (QC1-QC3)

Abbiamo utilizzato la colonna Waters ACQUITY UPLC HSS T3 1.8μm 1.0x100mm

Pannelo steroideo

Analiti misurabili nel PE

MSMS Steroidi Kit

– Testosterone

– Cortisolo

– Corticosterone

– DHEA,

Deidroepiandrosterone

– Progesterone

– 4-androsten-3,17-dione

– 11-deossicortisolo

– DHEAS,

Deidroepiandrosterone

solfato

– 17-alfa-idrossiprogesterone

– Aldosterone

Produttività

Grazie a Acquity UPLC la cromatografia è stata migliorata portando il tempo a 12

minuti di corsa da iniezione ad iniezione (aumentando produttività e salvando

circa il 25% di fase mobile). Inoltre è stata migliorata la separazione tra i picchi

del 11-deossicortisolo e del corticosterone.

Corticosterone

11-deoxycortisol

Precisione

Analyte Aldosterone Androstenedione

Level Low Middle High Low Middle High

Mean (ng/mL) 0.46 1.26 3.34 1.58 4.1 10.7

CV(%) 2.9 2.9 2.8 3.8 4.5 3.7

Analyte Corticosterone Cortisol

Mean (ng/mL) 7.14 19.22 51.5 70.95 128.21 232.14

CV(%) 3.2 3 4.4 2.7 3.3 2.3

Analyte 11-deoxycortisol Dehydroepiandrosterone

Mean (ng/mL) 1.49 4.05 10.66 7.74 19.68 52.98

CV(%) 3 4.2 4 5.4 5.7 3.8

Analyte Dehydroepiandrosterone sulfate Progesterone

Mean (ng/mL) 1056.2 1485.7 2015.7 1.64 4.38 11.42

CV(%) 7.2 6.1 6.2 3.7 3.5 2.8

Analyte 17á-hydroxyprogesterone Testosterone

Mean (ng/mL) 1.86 5.34 14.65 2 3.52 5.46

CV(%) 3.2 2.7 2.4 3.3 3.3 2.3

Il migliore valore di precisione (2.3% RSD) è stato ottenuto sul controllo di qualità alto del cortisolo e del testosterone (Q3). Il peggiore sul controllo di qualità basso (Q1) del DHEAS (7.25 RSD).

Precisione

Questi dati ottenuti sono migliori di quanto dichiarato sul technical note della Perkin Elmer.

QC1 QC2 QC3

Steroid %RSD %RSD %RSD

Aldosterone 3.73 2.50 2.39

Androstendione 1.78 1.26 0.84

Corticosterone 2.01 1.15 1.71

Cortisol 2.66 2.33 2.70

11-Deoxycortisol 2.88 4.74 2.49

DHEA 5.09 2.36 3.43

DHEAS 1.03 1.03 2.75

Progesterone 4.57 3.53 3.41

17-alpha hydroxyprogesterone 4.93 3.42 4.30

Testosterone 1.52 2.65 0.98

Linearità Compound name: Aldosterone

Correlation coefficient: r = 0.999677, r^2 = 0.999355

Calibration curve: 0.682043 * x + 0.00654052

Response type: Internal Std ( Ref 11 ), Area * ( IS Conc. / IS Area )

Curve type: Linear, Origin: Exclude, Weighting: 1/x, Axis trans: None

nmol/L0.0 5.0 10.0 15.0 20.0

Compound name: Androstendione

nmol/L0.0 10.0 20.0 30.0 40.0 50.0 60.0

Compound name: Corticosterone

Calibration curve: 0.188787 * x + -0.00745606

nmol/L0 25 50 75 100 125 150 175

Compound name: Cortisol

nmol/L0 100 200 300 400 500 600 700 800

Compound name: 11-Deoxycortisol

nmol/L0.0 10.0 20.0 30.0 40.0 50.0

Compound name: DHEA

nmol/L0 50 100 150 200 250

Compound name: DHEAS neg

nmol/L0 2000 4000 6000

Compound name: Progesterone

nmol/L0.0 20.0 40.0 60.0

Compound name: 17-alpha hydroxyprogesterone

nmol/L0.0 20.0 40.0 60.0

Compound name: Testosterone

nmol/L0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0

Linearità

Sovrapposizione di 8 curve di calibrazione:

Steroid Lowest cal (nmol/L)

Highest Cal (nmol/L)

Aldosterone 0.087 21.50 >0.999

Androstendione 0.290 63.60 >0.999

Corticosterone 0.844 190.00 >0.998

Cortisol 3.960 853.00 >0.999

11-Deoxycortisol 0.190 50.60 >0.998

DHEA 1.290 254.00 >0.994

DHEAS 34.300 7564.00 >0.999

Progesterone 0.364 77.20 >0.997

17-alpha hydroxyprogesterone 0.376 70.70 >0.996

Testosterone 0.113 27.80 >0.999

Robustezza

Nota: Risoluzione Cromatografica mantenuta!

CAH in Serum

CAH in DBS

Grazie

l’attenzione

17-OHP analysis in dried blood spots (DBS)

17-OHP analysis in DBS

System: ACQUITY Xevo TQ MS

Protocol:

– 2 x 3mm punches

– LLE ACN/acetone

– 20µL injection

– HSS C18 2.1x50mm

– 4.5min run time

– Calibration 3-400ng/mL

Linearity

Precision

Intra-assay precision of QCs at three levels for 17-OHP (25, 50,

100ng/mL) (n=5)

QCs obtained from CDC (Atlanta, GA)

Low Mid High

mean(ng/mL) 27.97 52.48 108.88

Std.Dev 0.77 1.79 5.35

%CV 2.76 3.41 4.91

Precision

Inter-assay precision of QCs at three levels for 17-OHP (25, 50,

100ng/mL) over five days

Low Mid High

mean(ng/mL) 27.5 53.8 99.6

Std.Dev 1.3 3.5 6.0

%CV 4.8 6.5 6.0

Ion suppression profile

Sensitivity

LLOQ 3.27ng/mL

min1.50 1.60 1.70 1.80 1.90 2.00 2.10 2.20 2.30 2.40

F1:MRM of 6 channels,ES+

339.3 > 100

Sample_20March09_004 Smooth(Mn,2x2)

3.27 ng/mL

2.167e+005d8-17-OHP

6560.95

331.3 > 109.1

3.27 ng/mL

1.387e+0042.3917-OHP

415.52

1.661.591.43 1.51

2.292.18

2.112.041.941.86

331.3 > 97

3.27 ng/mL

1.393e+00417-OHP

398.02

1.45 1.58

2.482.422.372.192.14

1.871.91 2.042.25

Plasmatic Metanephrines analysis

with Off-line SPE

Sample Preparation

Matrix :Plasma

WATERS Oasis® WCX 1cc Cartridge 30mg 30µm

– 1ml ACN

– 1ml Buffered Water pH 6.8

– 1ml Plasma + 25µl Internal Standard Solution

– Wash with 2X 1 ml Buffered Water pH 6.8 an 1ml ACN

– Elute with 1 ml ACN + 2% FA

Chromatograpghic Conditions

Column: Waters Acquity HILIC 50 x 2.1 mm, 1.7 µm with in-line filter

Waters Acquity UPLC TQD Sytem

Flow Rate: 0.6 ml/min

Injected Volume: 20 μL (full loop)

Column Oven: 30°C

Mobiles Phases:

– A = Water + 0.5% FA + 50mM AmFo

– B = Acetonitrile

Total Run Time: 5 minutes

Gradient:

Temps (min.) %A %B Slope

0.0 5 95 1

2.0 30 70 6

3.0 30 70 6

3.5 5 95 6

Calibration curve (can be performed in Extracted Water)

Metanephrine: 0.125-5nM

Normetanephrine: 0.25-10nM

Metanephrine Normetanephrine

Same Sample Positive Patient TQD

Metanephrine 1.4 µg/L

Normetanephrine 1.4 µg/L

Metanephrine

Normetanephrine

Conclusion

Quantification of Plasmatic Metanephrine and Normetanephrine using off-line SPE with UPLC-Quattro Premier XE or TQD

Sensitivity is similar on Quattro Premier XE and TQD

Run time set to 5 minutes in order to maximize the Analytical Column Life-Time (about 1000 injections so far)

Excellent linearity across the analytical range

LOQ < 0.1nM for Metanephrine and < 0.2nM for Normetanephrine

This method has been validated internally and is used by Angers University Hospital as well as Lille University Hospital

Cross Analysis of 10 samples Groningen University Hospital (On-line SPE) gave CV around 10%

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