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UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ
FACULDADE DE MEDICINA
DEPARTAMENTO DE MEDICINA CLÍNICA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS MÉDICAS
ANA PAULA FONTENELE MENEZES
EFEITOS DA CURCUMINA E DO RESVERATROL EM RATOS COM
PARKINSONISMO EXPERIMENTAL INDUZIDO POR 6-HIDROXIDOPAMINA:
UM ESTUDO COMPORTAMENTAL E NEUROQUÍMICO
FORTALEZA
2012
1
ANA PAULA FONTENELE MENEZES
EFEITOS DA CURCUMINA E DO RESVERATROL EM RATOS COM
PARKINSONISMOS EXPERIMENTAL INDUZIDO POR 6-HIDROXIDOPAMINA: UM
ESTUDO COMPORTAMENTAL E NEUROQUÍMICO
Dissertação de Mestrado apresentada ao
Programa de Pós-Graduação em Ciências
Médicas, da Faculdade de Medicina da
Universidade Federal do Ceará, como requisito
parcial para obtenção do Título de Mestre em
Ciências Médicas. Área de concentração:
Pesquisa pré-clínica.
Orientadora: Profa. Dra. Geanne Matos de
Andrade.
FORTALEZA
2012
2
Dados Internacionais de Catalogação na Publicação
Universidade Federal do Ceará
Biblioteca de Ciências da Saúde
M51 Menezes, Ana Paula Fontenele
Efeitos da curcumina e do resveratrol em ratos com parkinsonismo experimental
induzido por 6-Hidroxidopamina: um estudo comportamental e neuroquímico /
Ana Paula Fontenele Menezes. – 2012.
126 f. : il. color., enc. ; 30 cm.
Dissertação (mestrado) – Universidade Federal do Ceará, Faculdade de
Medicina, Departamento de Medicina Clínica, Programa de Pós-Graduação em
Ciências Médicas, Fortaleza, 2012.
Área de concentração: Pesquisa pré-clínica.
Orientação: Profa. Dra. Geanne Matos de Andrade.
1. Doença de Parkinson. 2. Curcumina. 3. Estresse Oxidativo. 4. Depressão. I.
Título.
CDD 616.833
3
ANA PAULA FONTENELE MENEZES
EFEITOS DA CURCUMINA E DO RESVERATROL EM RATOS COM
PARKINSONISMOS EXPERIMENTAL INDUZIDO POR 6-HIDROXIDOPAMINA: UM
ESTUDO COMPORTAMENTAL E NEUROQUÍMICO
Dissertação de Mestrado apresentada ao
Programa de Pós-Graduação em Ciências
Médicas, da Faculdade de Medicina da
Universidade Federal do Ceará, como requisito
parcial para obtenção do Título de Mestre em
Ciências Médicas. Área de concentração:
Pesquisa pré-clínica.
Data de aprovação ___/ ___/ _____
BANCA EXAMINADORA
_____________________________________________
Profa. Dra. Geanne Matos de Andrade (Orientadora)
Universidade Federal do Ceará – UFC
_____________________________________________
Profa. Dra. Glauce Socorro de Barros Viana
Universiadade Federal do Ceará - UFC
Faculdade de Medicina de Juazeiro do Norte - FMJ /Universidade Estácio de Sá
_____________________________________________
Prof. Dr. André Ferrer Carvalho
Universidade Federal do Ceará – UFC
4
À Deus, que me deu a vida e a quem
tudo devo, por me proteger nessa jornada e a
Nossa Senhora por iluminar meus passos.
Aos meus pais pelo amor incondicional,
dedicação, compreensão, apoio e paciência.
Ao meu esposo, irmãos e amigos que
sempre acreditaram no meu potencial.
5
AGRADECIMENTOS
Um sonho, uma busca, uma realização... Muito a agradecer...
À Deus em primeiro lugar, por ter me protegido e iluminado durante a execução
desse trabalho assim como tem feito sempre em minha vida.
Aos meus pais, Paulo Pedro e Ana Maria, meus maiores mestres, não pelos
ensinamentos técnicos e científicos, mas sim pelo exemplo de vida, de Fé, de perseverança,
de moral, de ética e humildade. Por não terem medido esforços para que eu e meus irmãos
pudéssemos estudar, pelo constante incentivo, por terem me apoiado em todas as decisões e
por todo amor que me dedicaram.
Ao meu grande amor, meu esposo Paulo Jorge, pelo constante incentivo,
companheirismo e apoio, me ajudando nos experimentos e nos estudos, permanecendo
sempre ao meu lado, mesmo nos momentos mais difíceis. Pela dedicação, ajuda,
compreensão, cumplicidade e paciência em todos os momentos.
À Dra. Geanne Matos de Andrade, minha orientadora, que sempre foi para mim
um exemplo de pesquisadora, agradeço pela orientação valiosa, paciência, confiança, atenção,
dedicação, incentivo, compreensão e amizade, bem como, pelo incrível aprendizado e pela
oportunidade que me foi concedida.
Aos professores dos departamentos de Pós-Graduação em Ciências Médicas e
Farmacologia, em especial à Profª. Dra. Glauce Socorro de Barros Viana, pelos
ensinamentos e pelo apoio na realização dos experimentos.
À amiga Marta Regina Santos do Carmo, pelos ensinamentos iniciais da minha
vida experimental, pela paciência, atenção, apoio e amizade.
À amiga Carolina Melo de Souza, pelo incrível apoio na realização dos
experimentos, pelos estudos, pela atenção, amizade sincera e companheirismo.
Às minhas queridas amigas que sempre estiveram presentes em todos momentos
do Laboratório de Neurociências e Comportamento: Analu, Julliana Catharina e Kelly Rose.
Através de vocês pude entender que amigos são os irmãos que escolhemos. Tudo isso, na
certeza que vocês estão sempre em meu coração.
Aos amigos do Laboratório de Neurociências e Comportamento: Ana Carla,
Diego, Camylla, Daniele, Rose, Patrícia, Marcos, Flávio e Neila. Agradeço pela
6
contribuição na parte experimental, pelos momentos de descontração e pela amizade que
fica.
Aos bolsistas Gerdean, Renan, Egberto, Mirlayne Olga, Júlia, Priscila, Thales e
Diego, meu agradecimento a todos vocês por terem colaborado na minha pesquisa científica,
fazendo do trabalho diário um ambiente agradável e alegre.
A todos os amigos com os quais convivi durante este tempo no Departamento de
Fisiologia e Farmacologia e que estão distribuídos pelos diversos laboratórios. Agradeço pelo
espírito de colaboração e pela amizade.
Aos técnicos dos laboratórios, Rafael, Paulo Ricardo, Matheus, Arnaldo, Vilani,
Lena, Débora e Graziely pela contribuição no trabalho, atenção e amizade.
Aos funcionários do departamento de Medicina Clínica, em especial às
secretárias da Pós-Graduação em Ciências Médicas, Ivone e Rita, pela atenção e
disponibilidade de sempre.
Às professoras Dra. Flávia Almeida Santos e Dra. Veralice Meireles Sales de
Bruin, por terem participado do meu exame de qualificação contribuindo com orientações
importantes concernentes à didática.
Aos meus irmãos. Paulo Jansen e Edgar Jefferson, pela amizade, pela
cumplicidade e por sempre acreditarem no meu potencial.
Aos meus sobrinhos, Pedro Yves e Maria Klara, pelos momentos felizes
compartilhados.
À toda minha famíla por ter suportado os momentos de ausência.
À todos os meus amigos, pela amizade e apoio em todos os momentos.
À minha Fé em Deus e grande otimismo, por ter me iluminado e guiado em
todas as decisões e ter me dado força, coragem e muita determinação em todos os
momentos.
À CAPES, pelo incentivo científico e suporte financeiro.
A todos que, de alguma forma, colaboraram direta ou indiretamente para a
execução deste trabalho. Muito obrigada!
7
“A ciência e a fé se juntam para
dizer que somos um milagre do amor e da
sabedoria de Deus. Não compreendemos
toda a nossa grandeza!
Somos, como disse Santo Irineu,
„a glória de Deus”.
Prof. Felipe Aquino
8
RESUMO
A doença de Parkinson é uma desordem neurodegenerativa caracterizada pela perda de
células dopaminérgicas no trato nigroestriatal, com uma correspondente diminuição no
conteúdo de dopamina (DA) no estriado. Diversos fatores têm sido envolvidos na
degeneração neuronal na DP incluindo, estresse oxidativo, disfunção mitocondrial e
excitotoxicidade. A Curcumina é um polifenol e o Resveratrol é uma fitoalexina que têm sido
descritos como tendo propriedades antioxidantes e antiinflamatórias. O objetivo do presente
estudo foi investigar os efeitos do Resveratrol e da Curcumina sobre as alterações
comportamentais e bioquímicas induzidas pela 6-OHDA, um modelo animal de
parkinsonismo. Ratos machos Wistar (180-240g) receberam injeções de 6-OHDA (18 µg/3µl)
no estriado direito através de uma cirurgia estereotáxica e foram tratados por via intragástrica
com Curcumina (25, 50, 100 e 200 mg/kg) ou Resveratrol (5, 10 e 50 mg/kg) por quinze dias.
Não foram observadas diferenças estatísticas na atividade locomotora (teste do campo aberto)
e na função sensório-motora (teste da vibrissa) entre os grupos. A Curcumina e o Resveratrol
melhoraram a assimetria motora no teste do cilindro e a memória aversiva no teste da esquiva
passiva. Um resultado similar foi observado no teste do nado forçado, onde ambos os
antioxidantes reverteram o comportamento depressivo, assim como preveniram a redução do
conteúdo de dopamina e serotonina. Entretanto, somente o Resveratrol preveniu os déficits
apresentados pelos animais em uma versão com pistas do water maze, o aumento das rotações
contralaterais no teste da apomorfina e a perda de neurônios dopaminérgicos no estriado e
substância negra. Os resultados demonstraram efeitos neuroprotetores do Resveratrol, mas
somente efeitos parciais foram observados após o tratamento com Curcumina. Dessa forma, o
presente estudo fornece suporte para os efeitos benéficos dos antioxidantes como adjuvantes
do tratamento da Doença de Parkinson.
Palavras-chave: Doença de Parkinson. Curcumina. Resveratrol. Estresse Oxidativo.
Monoaminas. Comportamento motor. Depressão. Memória.
9
ABSTRACT
Parkinson's disease (PD) is a progressive neurodegenerative disorder characterized by
dopaminergic cell loss in the nigrostriatal tract, with at corresponding decrease in striatal
dopamine (DA) content. Several factors have been involved in neuronal degeneration
including oxidative stress, mithocondrial dysfunction and excitotoxicity. Curcumin is a
polyphenol and Resveratrol is a phytoalexin that have been reported to have antioxidant and
antiinflammatory properties. In the present study, the effects of Curcumin and Resveratrol on
behavioral and biochemical alterations induced by 6-OHDA, an animal model of
Parkinsonism, were investigated. Male Wistar rats (180-240g) received stereotaxic injections
of 6-OHDA (18 µg/3µl) into the right striatum and were intragastrically treated with
Curcumin (25, 50, 100 and 200 mg/kg) or Resveratrol (5, 10 and 50 mg/kg) for fifteen days.
No differences were observed in locomotor activity (open field test) and in sensoriomotor
function (vibrissae test) between groups. Curcumin and Resveratrol improved 6-OHDA-
induced motor asymmetry in the cylinder test and aversive memory deficits in the passive
avoidance test. A similar result was observed in forced swim test where both antioxidants
reversed the depressive behavior, as well as prevented the reduction of dopamine and
serotonin contents. However, only Resveratrol prevented the 6-OHDA-induced impairment of
the performance in a cued version of water maze, the increase of contralateral rotations, after
the apomorphine challenge and DA neurons loss in both the striatum and SN. These results
demonstrate neuroprotective effects of Resveratrol, but only a partial protection by Curcumin.
Taken together, our study support a potential neural basis for the beneficial effect of
antioxidants as adjuvants treatment for Parkinson‟s disease.
Keywords: Parkinson's disease. Curcumin. Resveratrol. Oxidative stress. Monoamines. Motor
behavior. Depression. Memory.
10
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1 – Mudanças relacionadas a DP na atividade global do circuito motor talamocortical
nos gânglios da base .................................................................................................................20
Figura 2 – Modelos experimentais da Doença de Parkinson .................................................. 28
Figura 3 – Estrutura química da curcumina.............................................................. ................30
Figura 4 – Fórmulas moleculares do resveratrol ...................................................................... 33
Figura 5 – Animal posicionado no aperelho estereotáxico com as suturas ósseas expostas ....38
Figura 6 – Desenho Experimental 1 ......................................................................................... 40
Figura 7 – Desenho Experimental 2 ......................................................................................... 41
Figura 8 – Representação da perda parcial de receptores de neurônios dopaminérgicos
nigroestratais ............................................................................................................................. 42
Figura 9 – Animal no teste rotacional induzido por apomorfina .............................................. 42
Figura 10 – Arena do teste de campo aberto dividido em quatro quadrantes iguais ................ 43
Figura 11 – Teste da vibrissa .................................................................................................... 44
Figura 12 – Animal durante o movimento de rearing no teste do cilindro .............................. 44
Figura 13 – Teste do nado forçado ........................................................................................... 45
Figura 14 – Animal durante o teste Y-maze ............................................................................. 46
Figura 15 – Animal no aparelho esquiva passiva ..................................................................... 47
Figura 16 – Labirinto aquático sinalizado e o animal sobre a plataforma ................................ 48
Figura 17 – Efeito da curcumina no comportamento rotacional induzido por apomorfina de
ratos parkinsonianos..................................................................................................................53
Figura 18 – Efeito do resveratrol no comportamento rotacional induzido por apomorfina de
ratos parkinsonianos .................................................................................................................54
Figura 19 –Efeito da curcumina sobre a atividade locomotora (Teste do Campo aberto) em
ratos parkinsonianos..................................................................................................................55
Figura 20 – Efeito do resveratrol sobre a atividade locomotora (Teste do Campo aberto) em
ratos parkinsonianos..................................................................................................................56
Figura 21 – Efeito da curcumina sobre a atividade sensório motora (Teste da Vibrissa) em
ratos parkinsonianos..................................................................................................................57
Figura 22 – Efeito do resveratrol sobre a atividade sensório motora (Teste da Vibrissa) em
ratos parkinsonianos.................................................................................................................58
Figura 23 – Efeito da curcumina sobre a assimetria dos membros anteriores (Teste do
Cilindro) em ratos parkinsonianos............................................................................................60
11
Figura 24 – Efeito do resveratrol sobre a assimetria dos membros anteriores (Teste do
Cilindro) em ratos parkinsonianos............................................................................................61
Figura 25 – Efeito da curcumina sobre a avaliação de desespero comportamental (Teste do
Nado forçado) em ratos parkinsonianos ...................................................................................62
Figura 26 – Efeito do resveratrol sobre a avaliação de desespero comportamental (Teste do
Nado forçado) em ratos parkinsonianos ...................................................................................63
Figura 27 – Efeito da curcumina sobre a avaliação de memória operacional (Labirinto em Y)
em ratos parkinsonianos ...........................................................................................................64
Figura 28 – Efeito do resveratrol sobre a avaliação de memória operacional (Labirinto em Y)
em ratos parkinsonianos ...........................................................................................................65
Figura 29 – Efeito da curcumina sobre a avaliação de memória aversiva (Teste da Esquiva
Passiva) em ratos parkinsonianos.............................................................................................67
Figura 30 – Efeito do resveratrol sobre a avaliação de memória aversiva (Teste da Esquiva
Passiva) em ratos parkinsonianos.............................................................................................68
Figura 31 – Efeito da curcumina sobre a avaliação de memória espacial (Labirinto aquático
sinalizado) em ratos parkinsonianos.........................................................................................69
Figura 32 – Efeito do resveratrol sobre a avaliação de memória espacial (Labirinto aquático
sinalizado) em ratos parkinsonianos ........................................................................................70
Figura 33 – Efeito da curcumina sobre a imunorreatividade para tirosina hidroxilase (TH) no
estriado direito de ratos parkinsonianos....................................................................................84
Figura 34 – Efeito do resveratrol sobre a imunorreatividade para tirosina hidroxilase (TH) no
estriado direito de ratos parkinsonianos....................................................................................85
Figura 35 – Efeito da curcumina sobre a integridade neuronal no estriado direito de ratos
parkinsonianos..........................................................................................................................87
Figura 36 – Efeito da curcumina sobre a integridade neuronal no mesencéfalo de ratos
parkinsonianos.. .......................................................................................................................88
12
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 – Sítios das lesões estriatais unilaterais com a 6-OHDA ..........................................38
Tabela 2 – Protocolo experimental .........................................................................................39
Tabela 3 – Efeito da curcumina sobre a peroxidação lipídica em tecidos cerebrais de ratos
parkinsonianos .........................................................................................................................71
Tabela 4 – Efeito do resveratrol sobre a peroxidação lipídica em tecidos cerebrais de ratos
parkinsonianos .........................................................................................................................74
Tabela 5 – Efeito da curcumina sobre a dosagem de nitrito/nitrato em tecidos cerebrais de
ratos parkinsonianos .................................................................................................................73
Tabela 6 – Efeito do resveratrol sobre a dosagem de nitrito/nitrato em tecidos cerebrais de
ratos parkinsonianos .................................................................................................................74
Tabela 7 – Efeito da curcumina sobre a determinação da concentração da glutationa reduzida
em tecidos cerebrais de ratos parkinsonianos ..........................................................................75
Tabela 8 – Efeito do resveratrol sobre a determinação da concentração da glutationa reduzida
em tecidos cerebrais de ratos parkinsonianos ..........................................................................76
Tabela 9 – Efeito da curcumina sobre determinação da atividade da superóxido dismutase em
tecidos cerebrais de ratos parkinsonianos ................................................................................77
Tabela 10 – Efeito do resveratrol sobre determinação da atividade da superóxido dismutase
em tecidos cerebrais de ratos parkinsonianos ..........................................................................78
Tabela 11 – Efeito da curcumina na concentração de monoaminas em tecido estriatal direito
(lesionado) de ratos submetidos à lesão estriatal por 6-OHDA ...............................................80
Tabela 12 – Efeito da curcumina na concentração de monoaminas em tecido estriatal esquerdo
de ratos submetidos à lesão estriatal por 6-OHDA ..................................................................80
Tabela 13 – Efeito da curcumina na concentração de monoaminas em tecido mesencefálico de
ratos submetidos à lesão estriatal por 6-OHDA .......................................................................80
Tabela 14 – Efeito do resveratrol na concentração de monoaminas em tecido estriatal direito
(lesionado) de ratos submetidos à lesão estriatal por 6-OHDA ...............................................81
Tabela 15 – Efeito do resveratrol na concentração de monoaminas em tecido estriatal
esquerdo de ratos submetidos à lesão estriatal por 6-OHDA ...................................................81
Tabela 16 – Efeito do resveratrol na concentração de monoaminas em tecido mesencefálico de
ratos submetidos à lesão estriatal por 6-OHDA .......................................................................82
13
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
5-HT - Serotonina
6-OHDA -6-hidroxidopamina
ACM - Área cingulato-motora
ANOVA - Análise de variância
ATP - Adenosina trifosfato
AVC – Acidente vascular cerebral
BDNF - Fator neurotrófico derivado do cérebro
CEPA - Comissão de Ética em Pesquisa Animal
Cetrami - Centro de Tratamento dos Movimentos Involuntários
CM - Núcleo do tálamo centromediano
COBEA - Colégio Brasileiro de Experimentação Animal
COMT - enzima catecol O-metiltransferase
D1 - Receptor de dopamina do tipo 1
D2 - Receptor de dopamina do tipo 2
DA - Dopamina
DAT - Transportador de dopamina
DMSO - Dimetilsulfóxido
DNA - Ácido desoxirribonucléico
DOPAC - Ácido dihidroxifenilacético
DP - Doença de Parkinson
EPM - Erro padrão da média
ERNs – Espécies reativas de nitrogênio
EROs - Espécies reativas do oxigênio
FDA - Food and Drug Administration (USA)
FO - Falso-operado
GABA - Ácido γ-amino butírico
GSH - Glutationa reduzida
GSH-Px – Glutationa peroxidase
H2O2 - Peróxido de hidrogênio
HPLC - Cromatografia líquida de alta performance
i.c.v. - Intracerebroventricular
i.p. - Intraperitoneal
i.v. - Intravenoso
14
IL-1 – Interleucina 1
IL-6 – Interleucina 6
LPS - Lipopolisacarídeo
M1- Córtex motor primário
MAO – Monoamina oxidase
MAS - Área motora suplementar
MDA - Malonodialdeído
min - minuto
MPP+ - 1-metil- 4- fenilpiridina
MPTP - 1-metil- 4- fenil-1,2,3,6 – tetraidropiridina
NA - Noradrenalina
NE - Norepinefrina
NMDA - N-metil-D-aspartato
NF-kappaB - Fator de transcrição NF-KB
NO - Óxido nítrico
NO2 - Nitrito
NO3 - Nitrato
OMS - Organização Mundial de Saúde
•OH - Radical hidroxila
Pf - Núcleo do tálamo parafascicular
PMC - Córtex pré-motor
PPN - Núcleo pedúnculo-pontino
RLs – Radicais livres
rpm – Rotações por minuto
s - segundo
SNC – Sistema nervoso central
SNpc ou SNr – Substância negra pars compacta
SOD – Superóxido dismutase
TBARS - Substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico
TH – Tirosina hidroxilase
TNF-α - Fator de necrose tumoral alfa
v.o. – Via oral
VA - Núcleo do tálamo ventral anterior
VL - Núcleo do tálamo ventrolateral
15
LISTA DE SÍMBOLOS
% - Porcentagem
µ - Micro
® - Marca registrada
α - Alfa
β - Beta
± - Mais ou menos
˂ - Menor do que
16
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ..................................................................................................................... 18
1.1 Doença de Parkinson .......................................................................................................... 18
1.1.1 Epidemiologia .................................................................................................................. 18
1.1.2 Fisiopatologia ................................................................................................................. 19
1.1.3 Patogênese da DP ........................................................................................................... 22
1.1.3.1 Estresse Oxidativo na DP ............................................................................................. 22
1.1.3.2 Inflamação na DP ......................................................................................................... 24
1.1.3.3 Apoptose ....................................................................................................................... 24
1.1.3.4 Metabolismo energético na DP .................................................................................... 25
1.1.4 Modelos de Doença de Parkinson in vivo ...................................................................... 27
1.1.5 Tratamentos para a Doença de Parkinson ...................................................................... 29
1.2 Curcumina .......................................................................................................................... 31
1.3 Resveratrol .......................................................................................................................... 33
1.4 Relevância e justificativa .................................................................................................... 36
2 OBJETIVOS .......................................................................................................................... 37
2.1 Objetivo Geral .................................................................................................................... 37
3 MATERIAIS E MÉTODOS .................................................................................................. 38
3.1 Animais ............................................................................................................................... 38
3.2 Drogas ................................................................................................................................. 38
3.3 Cirurgia Estereotáxica (UNGERSTEDT, 1968) ................................................................ 38
3.4 Protocolos Experimentais ................................................................................................... 40
3.5 Testes Comportamentais .................................................................................................... 41
3.5.1 Avaliação do comportamento rotacional induzido por apomorfina (UNGERSTEDT,
1976) ......................................................................................................................................... 42
3.6 Avaliação do comportamento motor .................................................................................. 44
3.6.1 Teste do Campo Aberto (Open Field) (BROADHURST, 1957) ...................................... 44
3.6.2 Teste da Vibrissa (Vibrissae-elicited forelimb placing) (SCHALLERT et al., 2002) ...... 44
3.6.3 Teste do cilindro (Limb-use asymmetry test) (SCHALLERT et al., 2002) ...................... 45
3.7 Teste do Nado forçado (Forced Swim test) (PORSOLT et al., 1978) ............................... 46
3.8 Testes de Memória.............................................................................................................. 46
3.8.1 Labirinto em Y (Y-maze) (STONE et al., 1991) ............................................................... 46
3.8.2 Esquiva passiva (Passive avoidance test) (DeNOBLE et al., 1986) ............................... 47
3.8.3 Teste do labirinto aquático com plataforma sinalizada (Cued Water Maze) (PACKARD
& McGAUGH, 1992; MIYOSHI et al., 2002) .......................................................................... 48
3.9 Avaliação do Estresse oxidativo ......................................................................................... 49
3.9.1 Determinação da peroxidação lipídica (DRAPER & HADELY,1990) ........................... 49
17
3.9.2 Dosagem de Nitrito (GREEN et al., 1982) ...................................................................... 49
3.9.3 Determinação da concentração de glutationa reduzida (GSH) (SEDLAK & LINDSAY,
1968) ......................................................................................................................................... 50
3.9.4 Determinação da atividade da superóxido dismutase (SOD) (BEAUCHAMP &
FRIDOVICH, 1971) ................................................................................................................. 51
3.10 Dosagem de monoaminas e metabólitos com HPLC (AGUIAR, 2006) .......................... 51
3.12 Análise Estatística ............................................................................................................ 53
4 RESULTADOS ..................................................................................................................... 54
4.1 Efeito da curcumina e do resveratrol no comportamento rotacional induzido por
apomorfina de ratos parkinsonianos ......................................................................................... 54
4.2 Efeito da curcumina e do resveratrol sobre a atividade locomotora (Teste do Campo
aberto) em ratos parkinsonianos ............................................................................................... 56
4.3 Efeito da curcumina e do resveratrol sobre a atividade sensório motora (Teste da Vibrissa)
em ratos parkinsonianos ........................................................................................................... 58
4.4 Efeito da curcumina e do resveratrol sobre a assimetria dos membros anteriores (Teste do
Cilindro) em ratos parkinsonianos ............................................................................................ 60
4.5 Efeito da curcumina e do resveratrol sobre a avaliação de desespero comportamental
(Teste do Nado forçado) em ratos parkinsonianos ................................................................... 63
4.6 Efeito da curcumina e do resveratrol sobre a avaliação de memória operacional (Labirinto
em Y) em ratos parkinsonianos ................................................................................................ 65
4.7 Efeito da curcumina e do resveratrol sobre a avaliação de memória aversiva (Teste
Esquiva Passiva) em ratos parkinsonianos ............................................................................... 67
4.8 Efeito da curcumina e do resveratrol sobre a avaliação de memória espacial (Labirinto
aquático sinalizado) em ratos parkinsonianos .......................................................................... 70
4.9 Efeito da curcumina e do resveratrol sobre a peroxidação lipídica (TBARS) em tecidos
cerebrais de ratos parkinsonianos ............................................................................................. 72
4.10 Efeito da curcumina e do resveratrol sobre a dosagem de nitrito/nitrato (NO2/NO3) em
tecidos cerebrais de ratos parkinsonianos ................................................................................. 74
4.11 Efeito da curcumina e do resveratrol sobre a determinação da concentração da glutationa
redutase (GSH) em tecidos cerebrais de ratos parkinsonianos ................................................. 76
4.12 Efeito da curcumina e do resveratrol sobre a determinação da atividade da superóxido
dismutase (SOD) em tecidos cerebrais de ratos parkinsonianos .............................................. 78
4.13 Efeito da curcumina e do resveratrol sobre a determinação das concentrações de
Dopamina (DA), seu metabólito (DOPAC), Noradrenalina (NE) e Serotonina (5-HT) em
tecidos cerebrais de ratos parkinsonianos ................................................................................. 80
4.14 Efeito da curcumina e do resveratrol sobre a imunorreatividade para a tirosina
hidroxilase (TH) no estriado direito de ratos parkinsonianos................................................... 84
4.15 Efeito da curcumina sobre a integridade neuronal no estriado direito e mesencéfalo de
ratos parkinsonianos ................................................................................................................. 87
5 DISCUSSÃO ......................................................................................................................... 90
REFERÊNCIAS ..................................................................................................................... 105
ANEXO .................................................................................................................................. 129
18
1 INTRODUÇÃO
1.1 Doença de Parkinson
1.1.1 Epidemiologia
A doença de Parkinson (DP) é o distúrbio neurodegenerativo do movimento que
afeta 1% da população na faixa etária de 65 anos, com absoluta prevalência e aumentando
para 4%- 5% na população acima de 85 anos (ERIKSSEN, 2003). Trata-se da segunda
principal doença neurológica degenerativa depois da doença de Alzheimer (DA), mas ainda
não se conhece sua etiologia, nem se dispõem de tratamentos efetivos para evitar a
degeneração dopaminérgica progressiva acometida nesta doença (CHOI et al., 1993). No
Brasil a prevalência estimada da doença em pessoas com idade entre 60 e 69 anos é de
700/100 mil e entre 70 e 79 anos é de 1500/100 mil (AGUIAR et al., 2008). Além disso, 36
mil casos surgem por ano no país. Segundo o Centro de Tratamento dos Movimentos
Involuntários do Hospital 9 de Julho (Cetrami), a situação é alarmante, uma vez que muitas
das pessoas que desenvolverão a doença não terão acesso a informações esclarecedoras
(Julia Segatto, www.radiobras.gov.br/ct/2002/notas_180102). A patologia DP já ultrapassa
200.000 casos (Associação Brasil Parkinson), sendo a maior parte concentrada nas regiões
Sudeste e Sul, responsável por um total estimado de 64 mil casos (BRASIL, 2006).
Segundo a Associação Européia de Doença de Parkinson (European Parkinson
Disease Association), a estimativa é de 6,3 milhões de pessoas no mundo com DP. A idade
do aparecimento é comumente após os 60 anos de idade, mas um entre dez indivíduos é
afetado antes dos 50 anos. De acordo com as estatísticas, 1,2 milhões de pessoas na Europa
tem DP: aproximadamente 260.000 na Alemanha, 200.000 na Itália, 150.000 na Espanha,
120.000 no Reino Unido e 117.000 na França. Estudos recentes acerca da incidência da
doença apontam que ela atinge mais indivíduos brancos que negros que habitam grandes
cidades nos Estados Unidos (WILLIS et al., 2011). Alguns estudos epidemiológicos
demonstrarem ainda uma maior freqüência no sexo masculino (MENESES & TEIVE,
2003). Na Ásia, a doença parece ser menos prevalente que em países do ocidente
(MUANGPAISAN et al., 2009).
19
1.1.2 Fisiopatologia
A DP caracteriza-se clinicamente por tremor de repouso, acinesia, rigidez,
instabilidade e anormalidades posturais (WHITE et al., 2009; MORIGUCHI et al., 2012).
Morfologicamente, caracteriza-se por uma degeneração dos neurônios com a presença de
corpúsculos de Lewy (inclusões de proteína no citoplasma intraneural) na substancia negra
pars compacta (SNpc) e outras estruturas, tais como, no locus cerulus, núcleos da base,
hipotálamo, córtex cerebral, núcleos motores dos nervos craniais e estruturas centrais e
periféricas do sistema nervoso autonômico (SCHULZ & FALKENBURGER, 2004; PAL et
al., 2011). Os sintomas clássicos da doença de Parkinson manifestam-se após uma perda de
70-80% dos neurônios dopaminérgicos da SNpc, levando a uma grave redução nos níveis de
dopamina estriatais (LEVY et al., 2009). O diagnóstico definitivo requer tanto a identificação
desta neurodegeneração, quanto a presença dos corpúsculos de Lewy. Os corpúsculos de
Lewy encontrados nos neurônios dopaminérgicos da substância negra e em outras regiões
cerebrais contêm agregados de muitas proteínas, sendo a α-sinucleína a mais abundante
(WEINTRAUB et al., 2008).
A DP também pode ser de carater genético/hereditário, portanto existem cerca de
oito genes reconhecidos e relacionados à patologia, dos quais os mais importantes são a
parkina e a α-sinucleina. A doença genética pode ser autossômica dominante, quando ocorre
mutação do gene da α-sinucleina; ou autossômica recessiva, com mutação no gene da parkina.
O último subtipo freqüentemente surge em doentes mais jovens, com menos de 35 (trinta e
cinco) anos (NUSSBAUM & ELLIS, 2009).
Os sintomas motores da DP são o foco da farmacoterapia, contudo os sintomas
não motores, como demência, psicose, ansiedade, distúrbios de insônia, disfunção autonômica
e distúrbios do humor, podem ser os aspectos mais incapacitantes, perturbadores e não
compreendidos da doença (MACHT et al., 2005; BAGLIO et al., 2011).
A DP resulta de anormalidades primárias nos núcleos da base, uma estrutura
cerebral que atua em tarefas como a motivação crítica, planejamento motor e funções de
aprendizagem (PRESCOTT, 2009). Pois, sabe-se que os gânglios da base são parte de uma
alça fechada que conectam sequencialmente todas as áreas corticais através do corpo estriado,
globo pálido e tálamo com o córtex frontal. O córtex frontal se projeta para baixo em direção
ao nível espinhal formando circuitos. Os componentes dos gânglios da base incluem além do
20
corpo estriado (caudato e putamên) e os segmentos palidais internos e externos (globo pálido
interno-GPi e externo-GPe), também o núcleo subtalâmico (NST) e a substância negra pars
reticulata (SNr) e SNpc (ROSIN et al.,2007; GALVAN et al., 2008).
As estruturas dos gânglios da base formam circuitos paralelos que são divididos
em alças motoras, associativas e límbicas, dependendo da função da área cortical envolvida
(MIDDLETON & STRICK, 2000). O estriado e NST recebem aferências glutamatérgicas de
áreas específicas do córtex cerebral ou tálamo e transferem a informação para os núcleos de
saída dos gânglios da base, que são o globo pálido interno e SNr. A projeção entre o estriado e
o GPe/SNr está dividida em duas vias separadas: uma via direta e uma via indireta, através da
intercalação do globo pálido externo e do núcleo subtalâmico. A via direta conecta
diretamente o estriado aos núcleos de saída (GPi/SNr), e age facilitando o movimento pela
desinibição do tálamo. A via indireta começa na projeção que vai do estriado ao GPe, segue
então ao NST e só depois termina nos núcleos de saída (GPi/SNr) (GALVAN et al., 2008).
Os neurônios que se projetam para o córtex, NST e tálamo utilizam o
neurotransmissor glutamato, que é conhecido por suas propriedades excitatórias no SNC, o
que resulta em um efeito excitatório na via direta. Desta forma, na via direta há uma
facilitação do movimento. Contrariamente, a projeção de neurônios no estriado e em ambos os
segmentos do globo pálido utiliza GABA, que é considerado um neurotransmissor inibitório
do SNC, resultando em efeitos inibitórios. Portanto, a via indireta inibe o movimento,
inibindo o tálamo (TEPPER et al., 2007).
Além das aferências corticais que chegam ao corpo estriado, existe outra projeção
muito importante que é a via dopaminérgica nigro-estriatal. Essa projeção se inicia nos
neurônios SNc, e termina diretamente nas projeções espinhais dendríticas dos neurônios
médios espinhosos. São esses neurônios que dão origem à via direta e à via indireta. Nessa
posição estratégica, a via nigro-estriatal é capaz de modular o afluxo de informações corticais
que chegam aos neurônios de projeção no estriado. Assim, ela pode modular a atividade das
vias direta e indireta. A dopamina é o neurotransmissor dessa via. Ela atua como
neurotransmisor excitatório aos neurônios que vão formar a via direta, ligando-se a receptores
do tipo D1. Por outro lado, a dopamina é inibitória aos neurônios que vão formar a via
indireta, ligando-se a receptores do tipo D2. Dessa forma, a via nigro-estriatal age facilitando
o movimento, já que ela ativa a via direta e inibe a via indireta (GROENEWEGEN et al.,
2003) (Figura 1).
21
Existem vários estudos acerca do papel da dopamina a nível estriatal, porém
muitos aspectos ainda não foram compreendidos. Na DP, a degeneração de neurônios
dopaminérgicos da SNpc inicia uma cascata de mudanças funcionais afetando todos os
circuitos do gânglios da base. As alterações mais relevantes afetam o núcleo de saída do
circuito, o globo pálido e a SNr, que se tornam hiperativos, levando a uma inibição excessiva
dos sistemas motores tálamo-cortical e mesencefálico. Tal hiperatividade é sustentada pela
entrada glutamatérgica acentuada que o núcleo de saída recebe do NST (CALABRESI et al.,
2000). A reduzida ativação dos receptores dopaminérgicos, causada pela deficiência de
dopamina, resulta na inibição reduzida dos neurônios da via indireta e na diminuição da
excitação dos neurônios da via direta. A redução da inibição da via indireta origina potente
inibição do gpe, desinibição do NST e excitação aumentada dos neurônios do GPi e da SNr.
Já a ativação diminuída da via direta causa redução de sua influência inibitória sobre o GPi e a
SNr. O resultado final é uma ativação excessiva dos neurônios de saída dos gânglios da base,
gerando excessiva inibição dos sistemas motores e ocasionando os prejuízos motores
característicos da DP (SANTENS et al., 2003) (Figura 1).
Figura 1 - Mudanças relacionadas à DP na atividade global do circuito motor talamocortical nos gânglios da
base. Setas negras indicam conexões inibitórias e setas cinza indicam conexões excitatórias. A espessura das
setas corresponde a sua atividade presumida. Abreviações: CM, núcleo do tálamo centromediano; ACM, área
cingulato-motora; Dir, via direta; D1 e D2, subtipos dos receptores de dopamina; GPe, globo pálido externo;
GPi, globo pálido interno; Indir, via indireta; M1, córtex motor primário; Pf, núcleo do tálamo parafascicular;
PMC, córtex pré-motor; PPN, núcleo pedúnculo-pontino; MAS, área motora suplementar; SNc ou SNpc,
substância negra pars compacta; SNr, substância negra pars reticulata; VA, núcleo do tálamo ventral anterior;
VL, núcleo do tálamo ventrolateral.
Fonte: GALVAN et al., 2008.
22
Os sintomas depressivos ocorrem em aproximadamente metade dos pacientes e
são uma causa significante de prejuízos funcionais (McDONALD et al., 2003). Duas teorias
apontam para a etiologia da depressão na DP, uma argumenta que ela é reativa e secundária
ao estresse psicossocial de uma doença crônica e incapacitante (COLE et al., 1996), outra que
ela é secundária a uma degeneração neuroanatômica subjacente, antes que simplesmente uma
reação ao estresse psicossocial (McDONALD et al, 2003). A depressão correlaciona-se com
mudanças na função serotoninérgica e dopaminérgica e com a neurodegeneração de vias
corticais e subcorticais específicas (BLANDINI et al., 2000). Possivelmente, os sintomas
depressivos iniciais no curso da DP relacionam-se a um declínio cognitivo mais rápido
(STARKSTEIN et al., 1990a) e a um risco elevado do desenvolvimento de demência
(HUGHES et al., 2000). Por outro lado, o prejuízo cognitivo associa-se a um risco aumentado
do desenvolvimento de depressão (LIMA et al., 2012) e já foi observado que a combinação
demência e depressão correlaciona-se com uma diminuição do metabólito da dopamina nos
pacientes com DP (POLETTI & BONUCCELLI, 2012).
1.1.3 Patogênese da DP
Vários fatores têm sido implicados na patogênese da morte celular na DP. A
origem da degeneração neuronal é desconhecida e provavelmente envolve diversos eventos
celulares e moleculares, incluindo aumento do estresse oxidativo, acúmulo de proteínas
alteradas, excitotoxicidade, processo inflamatório, mecanismos pró-apoptóticos e disfunção
mitocondrial (NUSSBAUM & ELLIS, 2009).
1.1.3.1 Estresse Oxidativo na DP
Na estrutura dos átomos e das moléculas, os elétrons associam-se normalmente
em pares. Definem-se radicais livres (RLs) espécies altamente reativas que contêm um ou
mais elétrons não pareados. Em sistemas biológicos os RLs gerados a partir de oxigênio e
nitrogênio são classificados como espécies reativas de oxigênio (EROs) e espécies reativas de
nitrogênio (ERNs). EROs e ERNs são produzidas fisiologicamente devido ao metabolismo
celular e desempenham importantes papéis em processos de sinalização celular, apoptose,
expressão gênica e transporte iônico. Os níveis de RLs são controlados por antioxidantes que
podem agir de maneira direta, atuando como limpadores, ou de maneira indireta através do
aumento da expressão de enzimas antioxidantes (VALKO, 2007; LÜ et al., 2010).
23
Recentemente, o estresse oxidativo tem sido discutido como um importante
contribuinte na patologia das doenças neurodegenerativas (CHEN et al., 2009; TANSEY &
GOLDBERG, 2010). Uma das idéias relacionadas à patogênese da doença de Parkinson
baseia-se na formação de EROs e conseqüente início de estresse oxidativo, levando à lesão na
substancia nigra pars compacta (SNpc) (PAL et al., 2011).
As evidências que dão suporte ao envolvimento de estresse oxidativo na
patogênese da DP incluem alterações na quantidade de ferro no cérebro (GRUNBLATT et al.,
2004), que produz a formação de EROs quando está numa forma reativa; deficiência no
funcionamento mitocondrial, particularmente no complexo I da cadeia respiratória, alterações
nos sistemas protetores antioxidantes do cérebro, notadamente na superóxido dismutase
(SOD) e glutationa reduzida (GSH) (PEARCE et al., 1997), além de evidências de dano
oxidativo a lipídeos, proteínas e DNA (KNEKT, 1996).
Modelos experimentais de parkinsonismo com toxinas que inibem a função
mitocondrial foram a primeira indicação da existência de uma disfunção mitocondrial na DP.
Os genes mutantes ligados ao parkinsonismo promovem alteração na estrutura ou na função
de proteínas que estão direta ou indiretamente relacionadas à função mitocondrial (GODEIRO
JUNIOR et al., 2007).
A DP é uma doença neurodegenerativa que se associa com níveis aumentados de
metais no cérebro. Altos níveis de ferro vistos durante autópsias de pacientes associam-se
com degeneração nigral na DP e correlacionam-se com a gravidade das alterações
neuropatológicas (GOTZ et al., 2004). Deve ser lembrado que embora um aumento no ferro
possa sinalizar um papel primário do estresse oxidativo na DP, alternativamente esse aumento
pode ser uma conseqüência do seqüestro pelos eosinófilos dos agregados de proteínas.
O ferro tem sido implicado na promoção da agregação da -sinucleína tanto
diretamente quanto via aumento do estresse oxidativo, sugerindo um papel importante para
este na formação dos corpos de Lewy (KAUR & ANDERSEN, 2004). Os esforços para
explicar os mecanismos que levam à morte seletiva dos neurônios dopaminérgicos, têm sido
focados nas conseqüências da oxidação da dopamina (DA). Assume-se que o estresse
oxidativo desempenha um importante papel na causa da DP. Em cultura de células PC12 a
DA é tóxica via estresse oxidativo, o que leva a apoptose (HATTORIA et al., 2009), e deve
ser entendido que a desaminação metabólica da DA e seu metabólito metilado pela MAO
24
resulta na formação de peróxido de hidrogênio (H2O2). Além disso, a oxidação da DA
acompanha-se da inativação da tirosina hidroxilase (TH), enzima envolvida na síntese desta
(XU et al., 1998) e isso pode explicar a inativação da parkina pela DA (LaVOIE et al., 2005).
Atualmente existem vários estudos que tentam explicar os mecanismos que levam
à morte seletiva dos neurônios dopaminérgicos: o foco relaciona-se com as conseqüências da
oxidação da DA, tornando assim o estresse oxidativo relevante na DP.
1.1.3.2 Inflamação na DP
A degeneração dos neurônios dopaminérgicos na DP associa-se com uma grande
atividade microglial (McGEER et al., 1988), a qual pode ser conseqüência da morte neuronal
ou pode refletir uma participação ativa da microglia no processo neurodegenerativo. Se essa
ativação microglial protege ou exacerba a perda neuronal ainda é assunto de debate (HIRSCH
et al., 2003), embora a maioria das evidências sugerem que ela exerce efeitos tóxicos para os
neurônios.
Vários estudos em humanos e usando modelos experimentais mostram uma
participação ativa da inflamação na DP (HIRSCH & HUNOT, 2009), Blum-Degen e
colaboradores (1995) mostraram um aumento nos níveis de citocinas (IL-1 e IL-6) no estriado
de pacientes com DP. Outros evidenciaram uma ativação microglial no cérebro destes
pacientes (TANSEY & GOLDBERG, 2010).
Estudos usando modelos experimentais mostram que a ativação microglial
induzida por LPS, com aumento na expressão de iNOS, leva a uma degeneração
dopaminérgica (ARIMOTO & BING, 2003). Além disso, outros trabalhos evidenciaram uma
diminuição dos riscos de desenvolvimento da DP em usuários regulares de drogas
antiinflamatórias não-esteroidais (CHEN et al., 2003).
1.1.3.3 Apoptose
A apoptose tem sido implicada em várias doenças neurodegenerativas como um
importante fator que contribui significativamente para a morte neuronal (BREDESEN, 2004).
O mecanismo celular de apoptose é marcado por alterações na permeabilidade da
membrana mitocondrial onde há formação de um canal de alta condutância com perda do
potencial para a fosforilação oxidativa; há extravasamento de citocromo c para o meio
25
intracitoplasmático; ativação de uma série de substâncias serino-proteases como as caspases,
transglutaminases, endonucleases e fosfatidilserina/trombospondina. O processo implica na
fragmentação da cromatina e das organelas com posterior clivagem das mesmas. Os
corpúsculos apoptóticos formados são fagocitados por macrófagos, que reconhecem suas
sinalizações (DAMIANI, 2004).
As caspases são proteases, conhecidas por estarem envolvidas na apoptose. Foram
descobertos mais de 14 tipos de caspases no tecido nervoso dos mamíferos, elas podem agir
como iniciadoras da apoptose, executoras da apoptose ou como mediadores inflamatórios,
dependendo do tipo de caspase. A ativação das caspases pode ser observada em várias
doenças como no trauma (caspase-3), na DP (caspase-3) e na DA (caspase-3 e caspase 9)
(WALDMEIER & TATTON, 2004).
A mitocôndria atua como um regulador central da via intrínseca da apoptose, além
disso, também pode amplificar e mediar a via extrínseca. A mitocôndria tem um papel
“chave” na integração e propagação dos sinais de morte originados intrinsicamente por danos
ao DNA, por estresse oxidativo, extravasamentos de proteínas e outros. A maior parte dos
sinais pró-apoptóticos é derivada da disrruptura mitocondrial originada pela perda do
potencial para fosforilação oxidativa, aumentando subitamente a permeabilidade da
membrana mitocondrial com formação de um edema com grande influxo de água para a
matriz mitocondrial e eventual ruptura da membrana. Proteínas são liberadas para o meio
intracitoplasmático (extra-mitocondrial) incluindo fator indutor da apoptose (AIF),
endonucleases (endoG) e o citocromo c, que ativa o aptossomo e, conseqüentemente, a
cascata de caspases (WALDMEIER & TATTON, 2004).
Vários estudos sugerem que o fator de necrose tumoral (TNF-α) e a ativação dos
receptores TNFR ativam a via extrínseca da indução da apoptose, e possuem um papel
importante na patogênese de algumas doenças neurodegenerativas como a DP e a DA
(WALDMEIER & TATTON, 2004).
1.1.3.4 Metabolismo energético na DP
As mitocôndrias são organelas citoplasmáticas relacionadas ao metabolismo
energético resultante de várias reações bioquímicas que ocorrem dento dela. Essa energia
produzida é que faz com que a vida dos metazoários seja possível. O ATP (trifosfato de
adenosina) mitocondrial é quem gera tal energia. Diferente de outras organelas nos animais, a
26
mitocôndria tem seu próprio genoma (DNA mitocondrial) que codifica componentes do
sistema de fosforilação oxidativa (OXPHOS). A maquinaria mitocondrial é composta de
cinco multisubunidades (complexo I–V). A fosforilação oxidativa é o processo metabólico de
síntese de ATP a partir da energia liberada pelo transporte de elétrons na cadeia respiratória
(MORAES, 1996).
Por causa do seu alto nível de atividade metabólica e estrutura complexa, as
mitocôndrias são vulneráveis a uma variedade de problemas funcionais (FEARNLEY &
LEES,1991, MULLER-HOCKER, 1992), incluindo aqueles decorrentes de mutações no
DNA nuclear e mitocondrial, uma série de fatores exógenos, como drogas, infecções,
encargos metabólicos (como obesidade ou diabetes mellitus tipo II) certos fatores da dieta, e
episódios de hipóxia cerebral. Finsterer e colaboradores (2006) enfatizaram que tecidos ou
órgãos com alta demanda de oxigênio e energia, tais como o cérebro, coração, fígado, pele,
intestino e túbulos renais, são aqueles mais afetados pelas mitocondriopatias.
Danos nas enzimas mitocondriais na cadeia transportadora de elétrons,
membranas mitocondriais ou na própria cadeia (a partir de qualquer fonte) irão interferir na
formação de ATP e mesmo levar a apoptose celular ou reduzir a sua habilidade da célula em
funcionar. Este processo de fosforilação oxidativa promove a formação de numerosos radicais
livres (espécies reativas ao oxigênio-ERO) os quais são extremamente reativos e causam
oxidação de moléculas vizinhas através da extração de um elétron. As mitocôndrias são a
principal fonte celular de ERO, particularmente os radicais superóxido que são gerados no
complexo I da cadeia transportadora de elétrons. As ERO podem atacar DNA e proteína
mitocondrial (SCHEFFER, 2001). A razão de formação de EROs pode exceder a habilidade
de enzimas como a superóxido dismutase (SOD), catalase e outros mecanismos protetores em
convertê-las para formas menos reativas ou inofensivas. O estresse oxidativo descontrolado
pode desencadear consequências que resultariam na morte celular programada (MARTIN,
2006; LANG & LOZANO, 1998).
Evidências sugerem a hipótese que o complexo I mitocondrial tem importante
papel na etiologia da DP. A atividade do complexo I está reduzida em 35–40% em
homogenatos de substância negra de pacientes da DP em estudos postmortem (SCHAPIRA et
al.,1989; SCHAPIRA et al.,1990; SCHAPIRA et al., 1990). Recentemente foi relatada a
ocorrência de uma mutação no DNA mitocondrial na forma idiopática da doença (PARKER
27
JR & PARKS, 2005) e uma redução associada da atividade do complexo I nas mitocôndrias
do córtex frontal (PATHAK & DAVEY, 2008).
A exposição crônica a inibidores do complexo I, como pesticidas, pode contribuir
para o desenvolvimento da forma idiopática da doença, no entanto, é improvável que somente
a exposição à toxina seja responsável pelo defeito seletivo no complexo I na população em
geral. Pacientes com a DP sem qualquer história de exposição a toxinas também exibem
defeitos no complexo I de plaquetas (GU et al., 1998).
1.1.4 Modelos de Doença de Parkinson in vivo
A DP tem sido amplamente estudada através de modelos experimentais que são
capazes de reproduzir a perda de neurônios dopaminérgicos. O emprego desses modelos tem
contribuído para o conhecimento sobre os mecanismos patológicos da doença. Além disso,
tem permitido o surgimento de várias hipóteses para explicar os processos neurodegenerativos
do sistema nervoso central possibilitando a pesquisa por novos agentes terapêuticos que
venham a ser úteis no tratamento dessa patologia.
Deste modo foram desenvolvidos modelos animais utilizando-se neurotoxinas
dopaminérgicas e modelos de linhagens genéticas com deleção genética para a doença.
Assim, foram introduzidos agentes que seletivamente lesam e destroem os sistemas
catecolaminérgicos tais como as toxinas 1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetrahidropiridina (MPTP) e
6-hidroxidopamina (6-OHDA) (DAUER & PRZEDBORSKI, 2003). Além desses, alguns
agentes químicos utilizados na agricultura como a rotenona e o paraquat, quando
administrados sistemicamente podem induzir algumas das características da DP, apesar de
serem menos reproduzíveis (SPIVEY, 2011).
O MPTP é um inibidor do complexo I mitocondrial que foi acidentalmente
descoberto após humanos serem expostos a ele e desenvolverem sintomas parkinsonianos em
poucas semanas. Ele é altamente lipofílico e atravessa facilmente a barreira hematoencefálica.
Para exercer efeitos tóxicos o MPTP deve ser convertido em MPP+ pela enzima MAO-B. O
MPP+ é então transportado para dentro dos neurônios dopaminérgicos pelo sistema
transportador de dopamina, onde inibe o sistema de transporte de elétrons do complexo I,
resultando em falha de energia na célula e na formação de ânions superóxido (EMBORG,
2004). Os animais mais freqüentemente utilizados neste modelo são os camundongos e os
28
macacos. Ratos são relativamente insensíveis à toxina (GIOVANNI et al, 1994). Esta toxina
tem a desvantagem de ser muito liposolúvel e, portanto ser tóxica para o experimentador.
A 6-OHDA é uma das neurotoxinas mais frequentemente utilizadas
experimentalmente em modelos de degeneração da substancia negra, tanto in vitro como in
vivo (SCHOBER, 2004). Ela é incapaz de atravessar a barreira hematoencefálica, sendo
necessária a administração diretamente na estrutura cerebral que se deseja lessionar. A injeção
bilateral de 6-OHDA na SNpc ou em outras regiões cerebrais provoca uma elevada destruição
neuronal, principalmente dos neurônios catecolaminérgicos. Esta droga apresenta similaridade
estrutural com as catecolaminas e tem alta afinidade pelo sistema de transporte das mesmas,
mostrando assim a sua seletividade por neurônios catecolaminérgicos. Ela produz lesões na
SNpc pela indução da produção de peróxido de hidrogênio (H2O2) e EROs, como radical
hidroxil, e também pela inibição do complexo I mitocondrial (BLUM et al., 2001).
A 6-OHDA é usualmente injetada unilateralmente, enquanto o hemisfério intacto
serve como controle interno. Esta injeção unilateral representa o modelo conhecido como
“hemiparkinsoniano” (PERESE et al., 1989), que se caracteriza por um comportamento de
assimetria motora após a administração de drogas dopaminérgicas, devido ao desbalanço
fisiológico de receptores entre o corpo estriado lesionado e o não-lesionado (BETARBET et
al., 2002). Por isso, os animais apresentarão um comportamento rotacional contralateral no
sentido do hemisfério o qual a estimulação do receptor dopaminérgico for predominante. O
comportamento rotacional pode ser quantificado e correlacionado com o grau da lesão, a
maior vantagem desde modelo (BEAL, 2001).
Alguns agentes químicos empregados na agricultura, como o pesticidas rotenona e
o herbicida paraquat, quando administrados sistematicamente podem induzir algumas
características da DP, apesar dos resultados serem menos reproduzíveis. Estes compostos
atravessam facilmente a barreira hematoencefálica, pois são bastante lipossolúveis, nos
neurônios acumulam-se nas mitocôndrias, inibindo o complexo I da cadeia respiratória
mitocôndrial, provocando a morte neuronal (VON BOHLEN UND HALBACH et al., 2004).
As toxinas liposolúveis atravessam as membranas celulares e atingem diretamente
a mitocôndria tanto no complexo I como no III. O MPTP através dos transportadores de
dopamina (DAT) pode ficar acumulado nas vesículas sinápticas ou alcançar o complexo I
mitocondrial. A 6-OHDA atinge a cadeia respiratória mitocondrial, através do DAT,
induzindo um colapso na membrana mitocondrial, no complexo I da cadeia respiratória,
29
ocorre então a liberação de EROs e desacoplação da fosforilação oxidativa, gerando prejuízo
na função mitocondrial (Figura 2) (SHOBER, 2004).
Figura 2 - Modelos experimentais da Doença de Parkinson
Fonte: VON BOHLEN UND HALBACH et al., 2004.
Alguns modelos genéticos usando camundongos transgênicos já estão disponíveis,
entretanto os que usam neurotoxinas específicas conseguem reproduzir algumas
características específicas da doença. São mais simples e mais baratos e por este motivo são
mais utilizados. Agentes que alteram ou destroem o sistema catecolaminérgico, incluindo o
sistema nigroestriatal, como a 6-OHDA e o MPTP, são os mais utilizados.
1.1.5 Tratamentos para a Doença de Parkinson
Até o momento, não existe cura para a DP. As terapias atualmente disponíveis não
conseguem impedir a progressão da doença. No entanto, muitas opções de tratamento
descobertas recentemente são capazes de controlar os sintomas, levando a uma melhora
significante do controle motor tanto em estágio inicial, quanto nos estágios avançados da
doença. Porém, os tratamento disponíveis não alteram a progressão do processo
neurodegenerativo. As drogas utilizadas no tratamento da DP agem aumentando os níveis de
dopamina no cérebro ou imitando os efeitos da DA (SINGH et al., 2006).
30
O tratamento atual para a DP consiste essencialmente na reposição do precursor
da dopamina (levodopa), inibição de sua degradação ou o uso de agonistas dopaminérgicos,
contudo com a progressão da doença, observa-se uma redução da eficácia, bem como
sintomas incapacitantes não responsivos ao tratamento (EMBORG et al., 2004).
A maioria dos pacientes faz uso da levodopa, considerada o padrão ouro no
tratamento da DP. Para minimizar os efeitos indesejáveis, como flutuações na resposta
motora, confusões, alucinações e fadiga, inicialmente são usadas baixas doses e tendo
elevação gradual. Além da levodopa, drogas que são prescritas atualmente no tratamento da
DP incluem agonistas dos receptores de DA, tais como, selegilina (inibidor de MAO-B),
amantadina (anti-viral com influência na síntese da DA), inibidores de catecol-O-metil
transferase (COMT) e anticolinérgicos (NAGATSU & SAWADA, 2009).
Outra opção terapêutica seriam os agentes neuroprotetores, cuja importância está
nas suas propriedades antioxidantes, estes poderiam ser capazes de mudar o curso da doença,
barrando a neurodegeneração dopaminérgica. Muitos agentes potencialmente neuroprotetores
tem sido identificados e requerem testes clínicos (HART et al., 2009; SCHAPIRA et al.,
2006). A vitamina E, o deprenil e a nicotina vêm sendo bastante estudados (AGUIAR et al.,
2006). Agentes anti-inflamatórios, melatonina, coenzima Q10, ácido fólico, selênio, vitaminas
A, C e E são algumas substâncias promissoras e que podem contribuir para o tratamento da
DP (SINGH et al., 2006; KLIVENYI & VECSEI, 2009).
Tendo em vista a regeneração celular na medicina pretende-se descobrir novas
terapias para patologias que permanecem sem tratamento efetivo. Esta evolução é verdadeira
para a maioria das doenças neurodegenerativas. O transplante de novos neurônios no cérebro
foi realizado nas doenças de Parkinson e Huntington. O implante de tecido mesencefálico
embrionário foi testado de forma experimental e clínicas, mostrando uma eficácia limitada.
Nos dias de hoje já parece ser possível gerar neurônios funcionais dopaminérgicos ou estriatal
formados por uma variedade de células tronco, incluindo células tronco embrionárias ou
neurais, bem como células tronco pluripotentes (SCHWARZ & SCHWARZ, 2011).
As intervenções cirúrgicas para DP mostraram-se benéficas para alguns sintomas
refratários. No entanto estas cirurgias apresentam indicações específicas e um papel é limitado
como "último recurso”, devido ao custo elevado. A eficácia a longo prazo é limitada.
Recentes avanços nessa área têm levado a uma maior quantidade de procedimentos cirúrgicos.
31
Estes avanços são agora examinados com um renovado interesse devido ao advento das novas
tecnologias na forma de neurocirurgia estereotáxica, os avanços da neuroimagem e o
desenvolvimento da Estimulação Cerebral Profunda (DBS). Atualmente a DBS é a
intervenção de escolha, melhorando resultados, devido ao fato de que essa técnica é
potencialmente mais segura do que outras opções disponíveis (SCHAPIRA et al., 2006;
SINGH et al., 2007).
1.2 Curcumina
Cúrcuma é um tempero indiano derivado do rizoma da planta Curcuma longa que
tem sido utilizada na medicina Ayurvédica para tratar infecções oculares, feridas, picadas de
cobra, queimadura e acne. A Curcuma longa pertence à família Zingiberaceae e é amplamente
cultivada na Índia e em outras partes do sudeste asiático, é conhecida popularmente como
açafrão. O principal constituinte ativo da cúrcuma e um dos responsáveis por sua cor amarela
vibrante é a curcumina (HATCHER et al., 2008).
A curcumina foi isolada pela primeira vez em 1815 por Vogel e Pelleitier, obtida
na forma cristalina é identificada como 1,7-bis(4-hidroxi-3-metoxifenil)-1,6-heptadieno-3,5-
diona ou diferuloilmetano em 1870 e, finalmente, teve sua estrutura confirmada por Lampe
em 1910 (GOEL et al., 2008). Embora a curcumina seja o diferuloilmetano, a sua formulação
estudada também contém em menor proporção demetoxicurcumina e bisdemetoxicurcumina
(Figura 3).
Figura 3 - Estrutura química da curcumina.
Fonte: HATCHER et al, 2008.
A curcumina ou diferuloilmetano (1,7-bis(4-hidroxi-3-metoxifenil)-1,6-
heptadieno-3,5-diona) apresenta natureza polifenólica (CHEN & HUANG, 1998), seu peso
molecular é de 368,4 g/mol e fórmula molecular C21H20O6. Apresenta solubilidade em etanol,
acetona e dimetilsulfóxido (DMSO), sendo pouco solúvel em água (TONNESEN &
KARLSEN, 1985).
32
Quando administrada oralmente a curcumina pode sofrer reações de
glucuronidação, sulfatação e redução no intestino formando produtos como: curcumina
glicuronido, curcumina sulfato, tetrahidrocurcumina, hexadihidrocurcumina e
hexahidrocurcumino (IRESON et al., 2001). A farmacocinética da curcumina tem sido
estudada desde os anos 70, sua excreção pela urina é insignificante sendo aproximadamente
75% da dose excretada pelas fezes (WAHLSTRÖM & BLENNOW, 1978). Dentre as razões
para a biodisponibilidade reduzida estão a baixa taxa de absorção e seu metabolismo de
primeira passagem (ANAND et al., 2007).
De acordo com autoridades em saúde como o FDA (Food and Drug
Administration) e a Organização Mundial de Saúde (OMS), a curcumina é considerada segura
(GOEL et al., 2008). Diversos estudos pré-clínicos in vitro e in vivo tanto com a
curcumina quanto com a cúrcuma têm sido realizados. Além disso, para avaliar a eficácia
terapêutica da curcumina existem mais de 40 ensaios clínicos finalizados e cerca de 30 em
andamento nas fases I e II, que demonstram suas propriedades terapêuticas. Em muitos
destes estudos além da avaliação da eficácia também foram incluídas observações
clínicas sobre possíveis efeitos adversos, fornecendo assim oportunidade para acessar com
segurança a tolerabilidade da curcumina (GOEL et al., 2008). Os resultados dos ensaios
clínicos indicaram que a curcumina em doses elevadas como 12 g/dia por via oral (v.o.) por 3
(três) meses não provocou muitos efeitos adversos, somente efeitos gastrointestinais como
diarréia e nauseas, sendo bem tolerada (AGGARWAL & SUNG, 2008).
A curcumina tem sido usada há séculos na Ásia para várias desordens
inflamatórias, infecções e doenças digestivas. Tem apresentado efeito terapêutico para
artereosclerose, hiperlipidemia, tromboembolismo, infarto do miocárdio, artrite reumatóide,
AIDS e câncer (ALI et al., 2012).
A curcumina apresenta atividade neuroprotetora em doenças neurodegenerativas
tanto pela redução da atividade inflamatória, como através da diminuição do estresse
oxidativo na doença de Creutzfeld-Jakob e na DP (WANG et al., 2010). Mansouri e
colaboradores (2012) em modelo de parkinsionismo induzido por homocisteína observaram
que a curcumina foi capaz de inibir a morte por apoptose dos neurônios da substância negra.
Em modelos induzidos por MPTP a curcumina protegeu tanto contra a neurodegeneração
dopaminérgica e inibiu ativação astrocitária in vivo como inibiu a morte neuronal suprimindo
o aumento da caspase 3 pela via c-JUNK in vitro (YU et al., 2010).
33
Em modelos de parkinsionismo em cultura de celulas SH-SY5Y a curcumina
protegeu os neurônios dopaminérgicos da toxicidade induzida pela 6-OHDA via diminuição
das espécies reativas de oxigênio, e subsequente atenuação da fosforilação de p53 e redução
da razão Bax/Bcl-2 (JAISIN et al., 2011). Tripanichkul e Jaroensuppaperch (2012)
verificaram que em modelo induzido pela injeção unilateral de 6-OHDA em camundongos a
curcumina promoveu efeito neuroprotetor, que parece ser mediado por suas propriedades
antiinflamatórias ou proteção direta de neurônios nigroestriatais, observou-se dessa maneira
redução da ativação glial induzida por injúria neuronal.
Evidenciou-se que a curcumina tem atividade inibitória em uma grande variedade
de tumores como no adenocarcinoma de mama, câncer de estômago, duodeno e cólon em
camundongos (SAMAHA et al., 1997; JAISIN et al., 2011). Essa atividade é justificada pela
indução de apoptose em células neoplásicas (NAGAI et al., 2005), além da inibição da
atividade da proteína quinase C (LIN , 2004).
Apesar da biodisponibilidade da curcumina ser limitada e sua meia-vida muito
curta já foi demonstrado em estudos clínicos sua presença nas porções mais distais do trato
gastrointestinal (HATCHER et al., 2008) e em estudos pré-clínicos quando administrada por
via oral foi evidenciada sua presença no cérebro, demonstrando sua capacidade de atravessar
a barreira hematoencefálica (BEGUM et al., 2008).
1.3 Resveratrol
O resveratrol (3, 4, 5-trihidroxi-trans-estilbeno) é uma fitoalexina de natureza
polifenólica (FRÉMONT, 2000), seu peso molecular é de 228,24 g/mol e sua fórmula
molecular C14H12O3. Está presente em mais de 70 espécies de plantas. Comumente é
encontrado em grande quantidade na casca de uva, vinho tinto e em baixas quantidades no
amendoim e em várias outras plantas (LU et al., 2008).
O composto foi identificado pela primeira vez em 1940 nas raízes de Verartum
grandiflorum O. Loes (TAKAOKA, 1940), cuja função biológica atribui-se a proteção contra
agentes potencialmente lesivos à estrutura da planta e estresse ambientais. A raiz de
Polygnum cuspidatum, erva usada na medicina popular chinesa e japonesa, também apresenta
níveis elevados de resveratrol (SOLEAS et al., 1997).
34
Quimicamente, trata-se de um composto polifenólico derivado da fenilalanina,
que contém dois aneis aromáticos com hidroxilas reativas em sua estrutura e que pode se
apresentar sob duas formas isoméricas: cis e trans-resveratrol. O processo de isomerização
ocorre pela ação da luz e o isômero trans é o principal responsável pelos efeitos biológicos do
resveratrol em mamíferos (SOLEAS et al., 1997) (Figura 4).
Figura 4 - Fórmulas moleculares do resveratrol
Fonte: SOLEAS et al., 1997.
Atualmente, muitos estudos sobre o resveratrol são direcionados aos vinhos (em
especial, ao vinho tinto) e apontam a presença da molécula nessa bebida, sob suas duas
formas isoméricas (WANG et al., 2006). O efeito do resveratrol já foi testado e apresentou
benefício na prevenção e tratamento de muitas doenças, dentre elas câncer, diabetes,
distúrbios cardiovasculares, doenças neurodegenerativas, autoimunes e metabólicas (BAUR
& SINCLAIR, 2006a).
A diversidade dos efeitos biológicos do resveratrol deriva de sua capacidade de
afetar diversos alvos moleculares. Estes alvos podem ser divididos em duas categorias:
aqueles modulados por interação física direta com o resveratrol e aqueles modulados
indiretamente, através da mudança nos níveis de expressão de diversos genes (HARIKUMAR
& AGGARWAL, 2008).
Tem sido especulado que o consumo de resveratrol na dieta pode funcionar como
antioxidante, induzir a produção de óxido nítrico, induzir a agregação plaquetária e aumentar
os níveis de HDL. Os primeiros achados do uso de extratos de uva na saúde humana datam
35
mais de 1.000 anos atrás. Na Índia, a medicina ayurvédica já prescrevia Vitis vinifera L., o
qual possui como principal componente o resveratrol, como droga cardiotônica (BHAT et al.,
2001). O resveratrol é preferencialmente produzido nas cascas das uvas maduras como
resposta à infecções fúngicas e encontra-se praticamente ausente em plantas não estimuladas.
Esse composto não é o único estilbeno envolvido na resposta às infecções, porém é o
precursor da viniferina, composto utilizado na síntese de diversos outros estilbenos (BHAT et
al., 2001).
O efeito neuroprotetor do resveratrol já foi demonstrado em modelos de lesão
cerebral com o pepitídeo β-amilóide em culturas de células PC12, atribuindo esse resultado à
sua capacidade antioxidante (JANG & SURH, 2003), à inibição de receptores glutamatérgicos
pós-sinápticos, diminuindo a excitotoxicidade glutamatérgica (GAO et al., 2009). Também
apresenta neuroproteção em modelo crônico de esclerose múltipla em camundongos
(FONSECA-KELLY et al., 2012)
O resveratrol está ganhando considerável atenção por suas propriedades
anticâncer, ele por sua atividade antiproliferativa, pode suprimir a invasão de metástases em
carcinoma hepatocelular (YU et al., 2008) e induzir apoptose (ROCCARO et al., 2008).
O resveratrol bloqueia a produção de espécies reativas de oxigênio em células
endoteliais bovinas (LU et al., 2008) e inibe a colinesterase e a agregação do peptídio beta
amilóide (JANG & SURH, 2003), além de proteger contra a cardiotoxicidade induzida por
trióxido de arsênico (ZHAO et al., 2008) e contra a apoptose (ANTONIO & DRUSE, 2008).
Finalmente já está demonstrado que o resveratrol protege contra a toxicidade
induzida por glutamato, através do aumento de sua recaptação sináptica em cultura de
astrócitos (De ALMEIDA et al., 2007). Inibe também os receptores pós-sinápticos de
glutamato (GAO et al., 2009) e protege contra o dano cerebral isquêmico (DELLA-MORTE
et al., 2009). Inibe a ativação microglial e a liberação de citocromo c em ratos isquemiados
(CSISZAR, 2011) e previne contra déficits de memória, aumentando a atividade da
acetilcolinesterase em ratos diabéticos (SCHMATZ et al., 2009). Tais efeitos podem atuar de
forma convergente com sua ação antioxidante, para reduzir o dano cerebral durante vários
tipos de injúrias e fornecem substrato para o seu uso futuro em várias doenças
neurodegenerativas.
36
1.4 Relevância e justificativa
A Doença de Parkinson é uma doença degenarativa progressiva que atinge
aproximadamente 1% da população mundial com idade acima de 65 anos. É descrita como
um distúrbio motor em que os pacientes apresentam tremor, rigidez muscular, bradicinesia,
depressão e distúrbios posturais. Além desses déficits motores pode ocorrer também
disfunção cognitiva e, em alguns casos, demência, provavelmente pelo fato de que o processo
degenerativo não se limitar aos gânglios da base, mas afetando também outras áreas de
cérebro (ZHOU et al., 2008).
Os dados recentes mostrando um aumento alarmante na incidência da DP no
Brasil (36 mil casos surgem por ano no país) estimulam a procura de novas terapias, não
somente que reduzam a perda dopaminérgica, e os conseqüentes distúrbios motores, como
também que vise diminuir as complicações associadas como a demência e a depressão. Que
agravam as complicações associadas à doença. Novas drogas estão sendo testadas, e
compostas com atividade antioxidante podem ser promissores no tratamento adjuvante, na
prevenção e/ou na inibição da progressão da DP. Assim este trabalho visou estudar os efeitos
da curcumina e do resveratrol que apresentam atividade antioxidante comprovadas sob o
ponto de vista comportamental e neuroquímico no modelo de parkinsionismo animal induzido
por 6-OHDA.
37
2 OBJETIVOS
2.1 Objetivo Geral
Este trabalho objetivou estudar o efeito neuroprotetor da curcumina e do
resveratrol, em ratos com lesão estriatal produzida pela 6-hidroxidopamina (6-OHDA), num
modelo experimental de DP. Foram analisados os aspectos comportamentais, os efeitos
motores, sintomas depressivos, a memória, e neuroquímico, analisando o estresse oxidativo, a
liberação de monoaminas e o dano neuronal.
2.2 Objetivos Específicos
- Estudar o efeito neuroprotetor da curcumina e do resveratrol, usando o modelo
de parkinsonismo em ratos, pela injeção intra-estriatal de 6-OHDA, avaliando os efeitos sobre
a atividade motora, o comportamento depressivo e da memória;
- Estudar o efeito neuroprotetor da curcumina e do resveratrol, no modelo citado,
avaliando os efeitos na peroxidação lipídica, liberação de nitrito, glutationa redutase e
superóxido dismutase;
- Estudar o efeito da curcumina e do resveratrol, no modelo citado, avaliando a
depleção de monoaminas (HPLC) e a morte neuronal (imunohistoquímica para tirosina
hidroxilase, violeta de cresil).
38
3 MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 Animais
Foram utilizados ratos Wistar albinos (Rattus novergicus), com peso entre 180-
240 gramas, provenientes do biotério central do Campus do Pici, da Universidade Federal do
Ceará (UFC) e transferidos para o biotério setorial do Departamento de Fisiologia e
Farmacologia, Faculdade de Medicina, UFC. Os animais foram mantidos em gaiolas plásticas
apropriadas, forradas com raspas de madeira, com ciclo de claro/escuro de 12h/12h e
alimentados com ração padrão e água à vontade.
No que se refere aos cuidados com os animais, este estudo seguiu os princípios
éticos da experimentação animal, estabelecidos pelo Colégio Brasileiro de Experimentação
Animal (COBEA). O estudo foi submetido e aprovado pela comissão de Ética em Pesquisa
Animal (CEPA) da Universidade Federal do Ceará (UFC) sob o número de registro 33/2011
(Anexo 1).
3.2 Drogas
As seguintes drogas foram utilizadas: 6-OHDA (Sigma Aldrich, USA),
Curcumina (Sigma Aldrich, USA), Resveratrol (Sigma Aldrich, USA), Quetamina (König,
Argentina), Xilazina (König, Argentina) e Apomorfina (Sigma Aldrich, USA). Os demais
reagentes foram de grau analítico.
3.3 Cirurgia Estereotáxica (UNGERSTEDT, 1968)
Os procedimentos de lesão do corpo estriado foram realizados através de cirurgia
estereotáxica. Os animais do grupo falso-operado foram submetidos aos mesmos
procedimentos cirúrgicos, no entanto, não receberam a neurotoxina 6-OHDA, sendo somente
introduzida à agulha nas mesmas coordenadas estereotáxicas, seguido de infusão de salina
estéril com ácido ascórbico a 0,1% (veículo para 6-OHDA)
Os animais foram anestesiados com xilazina (10mg/kg via intraperitoneal, i.p.) e
quetamina (50mg/kg via intramuscular, i.m.) e posicionados no aparelho estereotáxico
(Stoelting®). Foi realizada uma incisão de aproximadamente 2 cm de comprimento com um
bisturi, no alto do crânio, expondo-se as suturas ósseas cranianas, com o objetivo de localizar
o bregma (Figura 5).
39
Figura 5 - Animal posicionado no aperelho estereotáxico com as suturas ósseas expostas.
Fonte: Arquivo pessoal.
Três coordenadas de acesso ao corpo estriado foram marcadas de acordo com o
atlas de Paxinos e Watson (1984). O modelo experimental de lesão do corpo estriado foi
proposto por Ungerstedt (1968). Foram feitas perfurações nos crânios dos animais com uma
broca de baixa rotação (Dremel), permitindo entrada da seringa Hamilton com a 6-OHDA
diretamente no corpo estriado. As lesões foram feitas unilateralmente, apenas no hemisfério
direito dos animais. Os animais receberam três microinjeções de 6-OHDA na dose de 6 µg/µL
em cada sítio, perfazendo um total de 18 g/3L. Os sítios onde a lesão foi realizada
situavam-se nas coordenadas descritas na Tabela 1. Após as injeções, os animais tiveram sua
pele suturada com fio cirúrgico de algodão (AP 0,4 15x45 cm) e desinfectada com povidine.
Tabela 1 - Sítios das lesões estriatais unilaterais com a 6-OHDA.
Coordenadas estriatais 1a 2
a 3
a
Antero-posterior (A-P) + 0,5 - 0,5 - 0,9
Medio-lateral (M-L) - 2,5 - 3,0 - 3,7
Dorso-ventral (D-V) + 5,0 + 6,0 + 6,5
Fonte: PAXINOS & WATSON, 1984.
Após os testes, os animais foram subdivididos dentro dos grupos e mortos por
decaptação e tiveram as áreas cerebrais (estriado direito, estriado esquerdo e mesencéfalo)
dissecadas para a realização das análises bioquímicas e dosagem de monoaminas. Para a
análise imunohistológica, os animais foram anestesiados com xilazina (10mg/kg i.p.) e
40
quetamina (100mg/kg i.m.) e perfundidos com paraformaldeído a 4%, os cérebros foram
retirados e mantidos em paraformolaldeído tamponado over night, posteriormente preservados
em solução de sacarose a 30%. Para realização das imunohistoquímicas os cérebros foram
congelados e fatiados no criostato (20m), montados em lâminas gelatinizadas e estocados à -
20C.
3.4 Protocolos Experimentais
Os animais foram divididos em 10 (dez) grupos, cada um com 16 (dezesseis)
animais da seguinte forma (Tabela 2):
Tabela 2 - Protocolo experimental.
Grupo Tratamento
1 Salina 3 L, intrastriatal + Veículo v.o. durante 15 dias.
2 6-OHDA (18 g/3 L, intrastriatal) + Veículo, v.o., 15 dias.
3 6-OHDA (18 g/3 L, intrastriatal) + Curcumina 25 mg/kg, v.o., 15 dias.
4 6-OHDA (18 g/3 L, intrastriatal) + Curcumina 50 mg/kg, v.o., 15 dias.
5 6-OHDA (18 g/3 L, intrastriatal) + Curcumina 100 mg/kg, v.o., 15 dias.
6 6-OHDA (18 g/3 L, intrastriatal) + Curcumina 200 mg/kg, v.o., 15 dias.
7 6-OHDA (18 g/3 L, intrastriatal) + Curcumina 400 mg/kg, v.o., 15 dias.
8 Salina 3 L, intrastriatal + Curcumina 200 mg/kg, v.o., 15 dias.
9 6-OHDA (18 g/3 L, intrastriatal) + Resveratrol 5 mg/kg, v.o., 15 dias.
10 6-OHDA (18 g/3 L, intrastriatal) + Resveratrol 10 mg/kg, v.o., 15 dias.
11 6-OHDA (18 g/3 L, intrastriatal) + Resveratrol 50 mg/kg, v.o., 15 dias.
12 Salina 3 L, intrastriatal + Resveratrol 50 mg/kg, v.o., 15 dias.
Os animais foram submetidos à lesão nigroestriatal com injeção estereotáxica de
6-OHDA e tratados com curcumina nas doses 25, 50, 100, 200, 400 mg/kg e com resveratrol
nas doses 5, 10 e 50 mg/kg durante 15 (quinze) dias. Decorridos 15 dias após a cirurgia, todos
os animais foram submetidos a testes comportamentais. Após a realização destes testes, os
animais foram eutanaziados para a realização de testes bioquímicos e imunohistoquímicos.
41
A curcumina e o resveratrol foram dissolvidos em tampão fosfato com 6%
dimetilsulfóxido (DMSO) e administrada por via oral (v.o.), a partir de vinte e quatro horas
após a cirurgia até o 15º (décimo quinto) dia de tratamento.
3.5 Testes Comportamentais
Após 15 (quinze) dias de tratamento, os animais foram divididos em dois
grupos de 8 (oito) animais. Os animais do primeiro grupo foram submetidos aos testes para
avaliar o comportamento rotacional, atividade locomotora e assimetria dos membros
anteriores, comportamento depressivo e memória; os testes realizados foram: apomorfina,
campo aberto, vibrissa, cilindro, nado forçado, labirinto em Y e esquiva passiva
respectivamente. E os animais do segundo grupo foram submetidos aos testes para avaliar o
comportamento rotacional e a memória espacial, os testes realizados foram apomorfina e o
labirinto aquático. Os animais foram submetidos a no máximo dois testes por dia. O último
teste realizado foi o teste rotacional induzido por apomorfina.
Figura 6 - Desenho Experimental 1.Os animais sofreram a lesão estriatal pela 6-OHDA (ou foram falso-
operados) no primeiro dia e começaram a ser tratados no dia seguinte. No 16º dia os animais foram submetidos
ao teste do campo aberto e Y-maze. No 17º dia foram submetidos ao teste da vibrissa e nado forçado. No18º dia
foram submetidos ao teste do cilindro e esquiva passiva. E no 19º dia os animais foram submetidos à segunda
parte do teste da esquiva passiva e ao teste de rotacional induzido por apomorfina, sendo sacrificados e seus
cérebros dissecados ou perfundidos.
42
Figura 7 - Desenho Experimental 2.Os animais sofreram a lesão estriatal pela 6-OHDA (ou foram falso-
operados) no primeiro dia e começaram a ser tratados no dia seguinte. No 16º dia os animais foram submetidos
ao primeiro dia do treino do labirinto aquático. No 17º dia foram submetidos ao segundo dia do treino do
labirinto aquático. No18º dia foram submetidos ao terceiro dia do teste do labirinto aquático. E no 19º dia os
animais foram submetidos quarto dia do teste do labirinto aquático e ao teste de rotacional induzido por
apomorfina, sendo sacrificados e seus cérebros dissecados ou perfundidos.
3.5.1 Avaliação do comportamento rotacional induzido por apomorfina (UNGERSTEDT,
1976)
A gravidade da depleção de dopamina foi avaliada pelo comportamento
rotacional. Este é um teste sensível para lesões estriatais com extensões maiores que 80%.
(DEUMENS et al., 2002) (Figura 8).
43
Figura 8 - Representação da perda parcial de receptores de neurônios dopaminérgicos nigroestratais. O animal
roda para o lado que estiver com menos receptores devido a uma assimetria nos hemisférios cerebrais, decorrente
de uma up regulation dos receptores dopaminérgicos no lado lesionado.
Fonte: adaptado de WIETZIKOSKI, 2006.
Após 18 dias da lesão estriatal, foi injetada uma dose de 0,6 mg/kg de apomorfina
i.p. (dissolvidos em salina) em cada animal, estes foram colocados por 60 minutos em bacias
plásticas (Figura 9). O comportamento rotacional foi observado e determinado através do
monitoramento das rotações induzidas pela apomorfina, tanto no número de rotações na
direção contrária à lesão (lado contralateral), quanto no número de rotações na direção da
lesão (ipsilaterais).
Figura 9 - Animal no teste rotacional induzido por apomorfina
Fonte: Arquivo pessoal.
44
3.6 Avaliação do comportamento motor
3.6.1 Teste do Campo Aberto (Open Field) (BROADHURST, 1957)
Neste teste é possível avaliar a atividade exploratória do animal, foi usado o
modelo do Campo Aberto. O Campo aberto consiste de uma arena quadrada de acrílico preto
(50 x50 cm), iluminada com luz vermelha (Figura 3). O piso da arena é dividido em quatro
quadrados iguais. No teste os animais foram colocados na arena e deixados para explorar o
ambiente por 5 (cinco) minutos, durante este período foi registrado o número de quadrantes
atravessados pelo animal (crossings). Também foi avaliado o número de vezes que o animal
se levantou para explorar o ambiente, mantendo-se suspenso apenas pelas patas traseiras,
caracterizando o comportamento exploratório vertical (rearing) (Figura 10). Após cada
animal ser retirado a arena foi limpa com uma solução de álcool a 20% e secada com toalhas
de papel, para evitar que o cheiro de urina e fezes interferissem no teste, este procedimento foi
feito após cada teste comportamental. O ambiente foi iluminado com luz vermelha.
Figura 10 - Arena do teste de campo aberto dividido em quatro quadrantes iguais.
Fonte: Arquivo pessoal.
3.6.2 Teste da Vibrissa (Vibrissae-elicited forelimb placing) (SCHALLERT et al., 2002)
O teste avalia déficits motores dos membros afetados por lesões unilaterais. Neste
teste, seguramos gentilmente o animal pelo dorso e esfregamos as vibrissas do animal por 10
(dez) vezes de cada lado contra um anteparo, para provocar a resposta de estiramento do
membro anterior na direção do anteparo (Figura 11). Avaliamos a resposta motora a um
estímlo sensório, onde o animal não lesionado estira a pata anterior na horizontal.
45
Figura 11. Teste da vibrissa.
Fonte: Arquivo pessoal.
3.6.3 Teste do cilindro (Limb-use asymmetry test) (SCHALLERT et al., 2002)
Nesse teste foi avaliada a assimetria dos membros anteriores, que é determinada
durante o comportamento de rearing (o animal fica em pé sobre as patas posteriores –
exploração vertical). Colocamos o animal em um cilindro de acrílico (60 cm de altura e 18 cm
de diâmetro) e observamos por 5 (cinco) minutos (Figura 12). Durante o comportamento
exploratório de rearing o contato com a parede do cilindro é contado de acordo com o
membro anterior que tocar o cilindro, contralateral (membro afetado), ipsilateral (membro não
afetado) ou ambos (simultaneamente). A assimetria é calculada pela fórmula:
• Percentual ipsilateral [(ipsilateral/Total)x100];
• Percentual contralateral [(contralateral/Total)x100];
• Percentual de ambas [(ambas/Total)x100];
Figura 12. Animal durante o movimento de rearing no teste do cilindro.
Fonte: Arquivo pessoal.
46
3.7 Teste do Nado forçado (Forced Swim test) (PORSOLT et al., 1978)
Este modelo experimental é utilizado para o estudo da atividade depressiva
através do desespero comportamental. Neste teste, os roedores foram submetidos a um
período de nado forçado, uma situação inescapável de estresse como o objetivo de identificar
se os animais estavam com comportamento depressivo. Eles foram colocados em um cilindro
de acrílico (60 cm de altura e 23 cm de diâmetro), contendo 25 cm de água por 6 (seis)
minutos, com o primeiro minuto de adaptação e registramos o tempo de imobilização nos 5
(cinco) minutos posteriores (Figura 13). O tempo de imobilização (apenas com pequenos
movimentos que os impediam de submergir) foi registrado.
Figura 13. Teste do nado forçado.
Fonte: Arquivo pessoal.
3.8 Testes de Memória
3.8.1 Labirinto em Y (Y-maze) (STONE et al., 1991)
Esse teste avalia a memória operacional (working memory) e o aprendizado. O
labirinto em forma de Y consiste de uma caixa de acrílico (35 cm de altura, 40 cm de
comprimento e 12 cm de largura) com os três braços iguais (Figura 14). Neste teste, o animal
foi colocado em um braço e alternou espontaneamente as entradas nos outros braços durante
8 (oito) minutos. Os animais falsos operados apresentam forte tendência de alternar a entrada
nos diferentes ambientes.
Todas as entradas em cada braço foram sequencialmente anotadas, assim o
número total de entradas em cada baço, bem como a seqüência de entradas, foram registradas.
47
As informações foram analisadas para determinar o número de entrada do braço sem
repetição. Os dados foram expressos como a porcentagem de alternância nos braços sem
repetição.
O sucesso do teste é indicado pela alta taxa de alternância nos grupos controle,
indicando que os animais podem se lembrar em qual braço eles entraram por último. O
resultado é expresso em porcentagem e obtido através de uma fórmula matemática:
Figura 14. Animal durante o teste Y-maze.
Fonte: Arquivo pessoal.
3.8.2 Esquiva passiva (Passive avoidance test) (DeNOBLE et al., 1986)
O teste tem como objetivo, avaliar a memória aversiva. Após 17 (dezessete) dias
da lesão com 6-OHDA e tratamento com as drogas, os animais foram habituados ao aparelho
de esquiva passiva (Ugo Basille® 21025). O aparelho consiste de uma caixa de acrílico (48 x
22 x 22 cm), dividida em dois compartimentos separados por uma porta, um branco
(iluminado) e um preto (escuro), este tem o piso eletrificado (Figura 15).
O animal foi deixado para ambientação no aparelho durante um 1 (um) minuto, e
retirado. Após 30 (trinta) segundos o animal foi colocado novamente no compartimento
iluminado. A tendência de o animal preferir o ambiente escuro faz com que, ao passar para
este compartimento, o mesmo recebesse um choque de 1,0 mA, durante 1s, com o tempo de
latência para entrar sendo registrado, até um máximo de 300 (trezentos) segundos (treino). O
animal foi retirado e após 15 (quinze) minutos, foi colocado novamente no compartimento
claro sendo registrada a latência de entrada (memória recente). A retenção do aprendizado foi
48
testada após 24 (vinte e quatro) horas, quando os animais foram colocados no compartimento
claro e o tempo de latência para a entrada no escuro foi registrado (os animais nesta fase não
levaram choque) (memória tardia).
Figura 15. Animal no aparelho esquiva passiva.
Fonte: Ugo Basille®.
3.8.3 Teste do labirinto aquático com plataforma sinalizada (Cued Water Maze)
(PACKARD & McGAUGH, 1992; MIYOSHI et al., 2002)
O teste do labirinto aquático sinalizado consiste em quatro dias de treinamento,
quatro treinos consecutivos por dia, durante os quais os animais foram colocados na piscina
(180 cm de diâmetro e 60 cm de profundidade) de frente para a parede da piscina, permitindo
que nadem livremente para uma plataforma de escape, transparente, de acrílico (11 cm × 14
cm) submersa 2 (dois) cm na água turva. Presa no topo da plataforma e saliente a água é
colocada uma bola de 7 (sete) cm de diâmetro (Figura 16). Além disso, nesta versão modifica-
se a posição da plataforma em cada treino do dia, variando de acordo com o quadrante. Se o
animal não encontrar a plataforma durante um período de 60 (sessenta) segundos este é
gentilmente guiado para a plataforma e permanece lá por 20 (vinte) segundos e depois
removido da piscina por 30 (trinta) segundos antes de ser colocado na próxima posição inicial
aleatória. O tempo de latência para encontrar o local da plataforma é registrado em todos os
treinos, nos quatro dias.
49
Figura 16. Labirinto aquático sinalizado e o animal sobre a plataforma.
Fonte: Arquivo pessoal.
3.9 Avaliação do Estresse oxidativo
3.9.1 Determinação da peroxidação lipídica (DRAPER & HADELY,1990)
A atividade antioxidante foi medida pela dosagem das substâncias reativas ao
ácido tiobarbitúrico (TBARS). Os tecidos mesencefálicos e estriatais foram homogeneizados
a 10% em tampão fosfato 50 mM (pH 7,4) gelado. Duzentos e cinquenta microlitros (250 µL)
do homogenato foram incubados no banho de água a temperatura de 37ºC por uma hora. Após
a incubação, 400 µL de ácido perclórico (35%) foram adicionados, para interromper a
peroxidação, e centrifugados a 12000 rotações por minuto (rpm) 4ºC por dez minutos. Em
seguida, 600 µL do sobrenadante foram retirados, e adicionados a 400 µL de ácido
tiobarbitúrico 0,6%. A mistura foi levada ao banho de água, por 30 (trinta) minutos, a uma
temperatura variável de 95 - 100ºC. A solução foi então retirada e colocada para esfriar a
temperatura ambiente. Após isso, foi feita a leitura em 532 nm. A curva-padrão foi obtida
mediante a leitura das concentrações de malonaldialdeido (MDA)-padrão.
3.9.2 Dosagem de Nitrito (GREEN et al., 1982)
O reativo de Griess (N-1-naftiletilenodiamina a 0,1% em água bidestilada,
sulfanilamida 1% em ácido fosfórico 5%) revela a presença de nitrito/nitrato (NO2/NO3) em
uma amostra (urina, plasma, homogenato tecidual) por uma reação de diazotização que forma
um cromóforo de cor róseo, com um pico de absorbância em 560 nm.
50
Para realização do ensaio foram usados 100 μL do reagente de Griess e
adicionados 100 μL do sobrenadante (amostras previamente centrifugadas) do homogenato a
10% do corpo estriado e mesencéfalo dos ratos em salina ou 100 μL μos padrões nas várias
concentrações. Para o branco foram usados 100 μL do reagente de Griess adicionados a 100
μL de salina. A leitura da absorbância foi feita em 540 nm. As leituras da absorbância dos
padrões (y) foram plotadas contra a concentração de cada padrão (x), então se determinou a
equação da reta, que foi usada para a determinação da concentração de nitrito em cada
amostra.
3.9.3 Determinação da concentração de glutationa reduzida (GSH) (SEDLAK &
LINDSAY, 1968)
A glutationa, um tripeptídeo (g-L-glutamil-L-cisteinil-glicina), existe no
organismo em suas formas reduzida (GSH) e oxidada (GSSG), atuando direta ou
indiretamente em muitos processos biológicos importantes, incluindo metabolismo e proteção
celular. Em particular, problemas na síntese de glutationa estão associados a algumas doenças,
nas quais os níveis de glutationa e enzimas que atuam no seu metabolismo podem ser
significativos na avaliação do estresse oxidativo. Mudanças na concentração deste tripeptídeo
podem ser um indicador útil em certas desordens fisiológicas como alterações dos estados
antioxidantes.
A determinação da concentração da GSH foi realizada em placa de ELISA
(método SEDLAK & LINDSAY, 1968 modificado). Baseia-se na reação do reagente de
Ellman, o 5,5'-ditiobis (ácido 2-nitrobenzóico) (DTNB) com o tiol livre originando um
dissulfeto misto mais ácido 2-nitro-5-tiobenzóico. O preparo das amostras foi feito da
seguinte forma: 40µL de cada amostra (homogenato do tecido a 10% em tampão fosfato) foi
adicionada a um eppendorf + 50µL de água destilada e 10µL de TCA (ácido tricloro acético)
50%. As amostras foram centrifugadas a 3000 rpm, por 15 (quinze) minutos, à temperatura
de 4ºC. Os sobrenadantes foram separados. Adicionou-se 60µL dos sobrenadantes à placa de
ELISA (mantida resfriada), assim como os brancos. O material permaneceu resfriado durante
todo o ensaio. Imediatamente antes da leitura, a este foi adicionado o tampão fosfato p.H 7,4
+ 0,65mL de DTNB 0,01 M em metanol. Adicionou-se 102µL desta solução em cada poço da
placa. A medida do produto de reação formado foi feita a leitura da absorbância a 412 nm. A
concentração da glutationa reduzida foi expressa em μg de GSH por grama de tecido. A curva
51
padrão foi obtida mediante leitura de várias concentrações de GSH padrão (1,56; 3,12; 6,25;
12,5; 25; 50; 100) e os resultados foram expressos em µg.
3.9.4 Determinação da atividade da superóxido dismutase (SOD) (BEAUCHAMP &
FRIDOVICH, 1971)
A atividade da enzima superóxido dismutase (SOD) foi avaliada medindo-se sua
capacidade de inibir a redução fotoquímica do azul de nitrotetrazolio (NBT). Nesse método a
riboflavina, reduzida fotoquimicamente, gera O2-
, o qual reduz o NBT, produzindo formazam,
que absorve no comprimento de onda de 560 nm. Na presença de SOD, a redução do NBT é
inibida. 80 µL do homogenato (10% em tampão fosfato) foi centrifugado (10 minutos, 3.600
rotações por minuto-rpm, 4°C). O sobrenadante foi retirado e centrifugado novamente (20
minutos, 12.000 rpm, 4°C). Para o ensaio, foi utilizado o sobrenadante. Numa câmara escura,
foram misturados 1 mL do meio de reação (tampão fosfato 50 mM, EDTA 100 nM e L-
metionina 13 mM pH 7,8), 150 μL do NBT 75 μM, 300 μL riboflavina 2 μM e 20 μL da
amostra ou do tampão utilizado para o preparo dos homogenatos. Os tubos contendo a
solução obtida foram expostos a lâmpadas fluorescentes (15 W) por 15 minutos. Ao término
do tempo o material foi lido em espectrofotômetro 560 nm. Os resultados foram expressos em
unidades da enzima, que é a quantidade de SOD necessária para inibir a taxa de redução do
NBT em 50%.
3.10 Dosagem de monoaminas e metabólitos com HPLC (AGUIAR, 2006)
O corpo estriado e o mesencéfalo foram utilizados para preparar homogenatos a
10% respectivamente. Os tecidos cerebrais foram sonicados em ácido pérclórico (HCLO4)
por 30 segundos e centrifugados por 15 minutos em centrífuga refrigerada a 15000 rpm. O
sobrenadante foi separado e filtrado através de uma membrana (Millipore- 0,2μm) e uma
alíquota de 20μl foi retirada e injetada no equipamento de HPLC para a análise eletroquímica.
Para a análise das monoaminas, uma coluna CLC-ODS (M) com comprimento de
25cm, calibre 4,6mm e diâmetro da partícula de 3μm da (Shimadzu, Japão) foi utilizada. A
fase móvel foi composta por tampão ácido cítrico 0,163M, pH 3,0, contendo ácido
octasulfônico sódico, 0,69M (SOS), como reagente formados do par iônico, acetonitrila 4%
v/v. Dopamina (DA), ácido diidroxifenilacético (DOPAC), noradrenalina (NE) e serotonina
(5-HT) foram eletricamente detectados usando um detector amperométrico (Modelo L-ECD-
52
6A da Shimadzu, Japão) pela oxidação em um eletrodo de carbono vítreo fixado em 0,85V
relativo a um eletrodo de referência de Ag-AgCl.
Foram pesados 15,75g de ácido cítrico (Grupo Química, RJ, Brasil) e completado
para um volume de 400 mL com água puríssima (Milli-Q). Esta solução foi ajustada para pH
3,0 com hidróxido de sódio 12,5M (Reagen, RJ, Brasil). A esta solução foi adcicionado o
ácido octasulfônico sódico 75g (Sigma, MO, EUA) e completado o volume para 471,5 ml
com água Milli-Q. Em seguida, procedeu-se a filtração e degaseificação, e, posteriormente,
adicionados 20 mL de acetonitrila (Carlo Erba Reagenti. MI, Itália) e 10 ml de
tetrahidrofurano (Sigma, Mo, EUA) para um volume final de 500 ml.
Os padrões foram preparados em uma concentração final de DA, DOPAC, NE e
5-HT. A partir da área dos picos desses padrões, as concentrações das amostras foram
calculadas e os resultados expressos em ng/g de tecido.
3.11 Análise imunohistopatológica
Os animais foram perfundidos através do coração, pelo ventrículo esquerdo com
salina gelada, seguido de paraformaldeído a 4% em PBS. Os cérebros foram removidos e pós-
fixados com formol tamponado por 24 (vinte e quatro) horas, após esse período foram
armazenados em solução crioprotetora de sacarose a 30%. O tecido foi cortado (20µm) no
criostato e montado em lâminas gelatinizadas.
3.11.1 Imunohistoquímica para Tirosina Hidroxilase
A Tirosina Hidroxilase (TH) é uma enzima envolvida na síntese de dopamina e
um marcador molecular de neurônios dopaminérgicos. Na doença de Parkinson há uma
deficiência de TH, assim como baixos níveis de dopamina. A detecção imunohistoquímica foi
realizada sobre cortes estriatais e mesencefálicos. Para examinar a extensão da desnervação
presente na substância negra, a imunorreatividade a TH foi avaliada comparando o lado
lesionado e não lesionado.
Os cortes foram lavados três vezes com tampão fosfato (PBS, pH 7.4) por 5
(cinco) minutos, o bloqueio da peroxidase endógena foi feito com peróxido de hidrogênio
0,3% (H2O2) durante 10 (dez) minutos durante e depois de lavou mais 2 (duas) vezes por 5
(cinco) minutos em PBS. Foram incubados com o anticorpo primário (1:500, anti-TH;
53
“antibody produced in rabbit”, Milipore, USA) em albumina bovina 5% (BSA) durante a
noite a 4°C. No outro dia as lâminas foram lavadas 3 (três) vezes em PBS por 5 (cinco)
minutos, em seguida os cortes foram incubados com um anticorpo secundário (“biotinylated
goat anti-rabbit” IgG – ABC, Santa Cruz) por 1 (uma) hora, enxaguados novamente 3 (três)
vezes com PBS por 5 (cinco) minutos. Posteriormente os cortes foram cobertos com o
conjugado enzimático avidina/biotina (AB) durante 30 (trinta) minutos, enxaguados
novamente 3 (três) vezes com PBS por 5 (cinco) minutos, em seguida os cortes foram
incubados com um anticorpo secundário (“biotinylated goat anti-rabbit” IgG – ABC, Santa
Cruz), seguindo as especificações do fabricante. Em seguida, as lâminas foram desidratadas
em álcool (50, 70 e 100%), diafanizadas e montadas em meio à base de xilol (Entelan®), e
posteriormente examinadas.
3.11.2 Histoquímica Violeta de Cresil (BITTENCOURT, 2007)
A coloração de Nissl é uma das técnicas mais utilizadas para investigação do
sistema nervoso. Ela permite a evidenciação da substância de Nissl, material granular
constituído por DNA ribossomal, o qual se concentra principalmente no nucléolo,
possibilitando a discriminação desta estrutura celular específica. As lâminas foram
mergulhadas em água destilada durante 1 (um) minuto para posterior incubação na solução de
violeta de cresil 0,5% em ácido acético, por um período de 3 (três) minutos. Em seguida, as
lâminas foram desidratadas em álcool (50, 70 e 100%), diafanizadas e montadas em meio à
base de xilol (Entelan®), e posteriormente examinadas.
3.12 Análise Estatística
A avaliação dos testes comportamentais foi realizada utilizando o teste de
Kruskal-Wallis e, para comparação entre os grupos, foi utilizado o teste de Mann-Whitney.
Para os testes da esquiva passiva e treino do labirinto aquático também foram realizados o
teste ANOVA de medidas repetidas e, para comparações dentro dos grupos, o teste de
Bonferroni. Para avaliação dos demais resultados foi utilizada a análise de variância
(ANOVA), seguido do teste de Tukey. Em todos os testes o critério de significância de p <
0,05. Os resultados foram expressos como média ± erro padrão da média. O programa de
computador usado foi GraphPad Prism® 5.0.
54
4 RESULTADOS
4.1 Efeito da curcumina e do resveratrol no comportamento rotacional induzido por
apomorfina de ratos parkinsonianos
A gravidade da depleção de dopamina foi avaliada através do comportamento
rotacional no teste da apomorfina, onde observamos um aumento rotacional do grupo 6-
OHDA, no sentido contralateral, em relação ao grupo FO (nº de rotação: FO: 2,76 ± 1,07; 6-
OHDA: 249,40 ± 31,17). Não houve diferença significativa entre os grupos tratados com
curcumina nas doses 25, 50, 100 e 200 mg/kg (Figura 17).
Nos grupos tratados com resveratrol houve diferença significativa no número de
rotações contralaterais na dose de 50 mg/kg em relação ao grupo 6-OHDA (nº de rotação: 6-
OHDA + Resv50: 101,60 ± 29,92), significando uma neuroproteção (Figura 18).
Figura 17 – Teste da Apomorfina. Avaliação do comportamento rotacional induzido por apomorfina (0,6 mg/kg)
em ratos parkinsonianos tratados com curcumina 25, 50, 100 e 200 mg/kg v.o. por 15 dias (n = 8 animais/grupo).
Os animais sofreram lesão intraestriatal com 6-OHDA (18µg/3µL), a vs FO Contralateral, p<0,05. Testes de
Kruskall-Wallis e Mann-Whitney. Os valores representam a média EPM.
FO
6-OHDA
6-OHDA+C
urc25
6-OHDA+C
urc50
6-OHDA+C
urc10
0
6-OHDA+C
urc20
0
FO +
Curc
200
0
100
200
300Ipsilateral
Contralaterala
nº
de r
ota
çõ
es /
60 m
in
55
Figura 18 - Teste da Apomorfina. Avaliação do comportamento rotacional induzido por apomorfina (0,6 mg/Kg)
em ratos parkinsonianos tratados com resveratrol 5, 10 e 50 mg/kg v.o. por 15 dias (n = 8 animais/grupo). Os
animais sofreram lesão intraestriatal com 6-OHDA (18µg/3µL), a vs FO Contralateral e b vs 6-OHDA, p<0,05.
Testes de Kruskall-Wallis e Mann-Whitney. Os valores representam a média EPM.
FO
6-OHDA
6-OHDA +
Res
v5
6-OHDA +
Res
v10
6-OHDA +
Res
v50
FO+ R
esv5
0
0
100
200
300Ipsilateral
Contralateral
b
a
nº
de r
ota
çõ
es /
60 m
in
56
4.2 Efeito da curcumina e do resveratrol sobre a atividade locomotora (Teste do Campo
aberto) em ratos parkinsonianos
Os resultados obtidos no teste de campo aberto mostraram não haver diferenças
estatísticas significativas entre o grupo falso operado e o grupo operado na atividade
locomotora (crossing: FO: 19,76 ± 1,46; 6-OHDA: 17,53 ± 1,67) e exploratória (rearing: FO:
13,76 ± 1,30; 6-OHDA: 13,47 ± 2,52). Foi observada uma diminuição no número de crossing
e rearing nos animais parkinsonianos tratados com curcumina, na dose de 200 mg/kg
(crossing : 6-OHDA + Curc200: 9,86 ± 1,83; rearing: 6-OHDA + Curc200: 4,43 ± 2,08)
(Figura 19).
Não foi verificada diferença estatística nos animais tratados com resveratrol, nas
doses de 5, 10 e 50 mg/kg (Figura 20).
Figura 19 - Teste do Campo aberto. Avaliação da atividade locomotora em ratos parkinsonianos tratados com
curcumina 25, 50, 100 e 200 mg/kg v.o. por 15 dias (n = 8 animais/grupo). Os animais sofreram lesão
intraestriatal com 6-OHDA (18µg/3µL), a vs 6-OHDA (crossing) e b vs 6-OHDA (rearing), p<0,05. Testes de
Kruskall-Wallis e Mann-Whitney. Os valores representam a média EPM.
FO
6-OHDA
6-OHDA+C
urc25
6-OHDA+C
urc50
6-OHDA+C
urc10
0
6-OHDA+C
urc20
0
FO +
Curc
200
0
5
10
15
20
25Crossing
Rearing
a
b
nº
de e
ven
tos /
5 m
in
57
Figura 20 - Teste do Campo aberto Avaliação da atividade locomotora em ratos parkinsonianos tratados com
resveratrol 5, 10 e 50 mg/kg v.o. por 15 dias (n = 8 animais/grupo). Os animais sofreram lesão intraestriatal com
6-OHDA (18µg/3µL).
FO
6-OHDA
6-OHDA +
Res
v5
6-OHDA +
Res
v10
6-OHDA +
Res
v50
FO+
Res
v50
0
5
10
15
20
25Crossing
Rearing
nº
de e
ven
tos /
5 m
in
58
4.3 Efeito da curcumina e do resveratrol sobre a atividade sensório motora (Teste da
Vibrissa) em ratos parkinsonianos
Os resultados obtidos no teste da vibrissa mostraram não haver diferenças
estatísticas significativas na atividade sensório motora ipsilateral e contralateral, entre o grupo
falso operado e o grupo parkinsoniano (nº de toques: ipsilataeral: FO: 7,86 ± 0,59; 6-OHDA:
8,83 ±0,50 e contralateral: FO: 8,79 ± 0,32; 6-OHDA: 8,00 ± 0,64). Também não foi
verificada diferença estatística entre os animais tratados com curcumina nas doses 25, 50,
100, 200 mg/kg (Figura 21).
Também não houve diferença na atividade sensório motora entre os animais
tratados com resveratrol nas doses 5, 10 e 50 mg/kg (Figura 22).
Figura 21 – Teste da Vibrissa. Avaliação sesório motora dos animais parkinsonianos tratados com curcumina 25,
50, 100 e 200 mg/kg v.o. por 15 dias (n = 8 animais/grupo). Os animais sofreram lesão intraestriatal com 6-
OHDA (18µg/3µL).
FO
6-OHDA
6-OHDA+C
urc25
6-OHDA+C
urc50
6-OHDA+C
urc10
0
6-OHDA+C
urc20
0
FO +
Curc
200
0
2
4
6
8
10
Contralateral
Ipsilateral
nº
de t
oq
ues
59
Figura 22 - Teste da Vibrissa. Avaliação sesório motora dos animais parkinsonianos tratados com resveratrol 5,
10 e 50 mg/kg v.o. por 15 dias (n = 8 animais/grupo). Os animais sofreram lesão intraestriatal com 6-OHDA
(18µg/3µL).
FO
6-OHDA
6-OHDA +
Res
v5
6-OHDA +
Res
v10
6-OHDA +
Res
v50
FO +
Res
v50
0
2
4
6
8
10
Contralateral
Ipsilateral
nº
de t
oq
ues
60
4.4 Efeito da curcumina e do resveratrol sobre a assimetria dos membros anteriores
(Teste do Cilindro) em ratos parkinsonianos
No teste do cilindro foi observada uma assimetria do grupo parkinsoniano (6-
OHDA) em relação ao grupo falso operado (FO), o que demonstra um comprometimento
motor unilateral no grupo que sofreu a lesão com a 6-OHDA (% ipsilateral: FO: 21,51 ± 4,13;
6-OHDA: 48,04 ± 8,61; % contralateral: FO: 19,90 ± 3,93; 6-OHDA: 12,34 ± 4,90 e % ambas
as patas: FO: 58,89 ± 4,32; 6-OHDA: 39,57 ± 5,23). Observou-se diferença significativa entre
o grupo controle e o grupo parkinsoniano, sendo que este último apresentou maior número de
toques ipsilaterais, e menor número de toques com ambas as patas dianteiras.
A administração de curcumina nas doses de 25 e 50 mg/kg não protegeu do
comprometimento motor fino induzido pela 6-OHDA. Observamos uma aumento
significativo da taxa de toques com ambas as patas, nos animais tratados com a dose de 100
mg/kg (% ambas as patas: 6-OHDA + Curc100: 61,74 ± 6,63) e uma porcentagem (%)
aproximada dos valores do controle (Figura 23).
Não foi verificada nos animais tratados com resveratrol, nas doses 5, 10 e 50
mg/kg e lesionados com 6-OHDA (Figura 24).
61
Figura 23 – Teste do Cilindro. Avaliação da simetria dos membros anteriores em ratos parkinsonianos tratados
com curcumina 25, 50, 100 e 200 mg/kg v.o. por 15 dias (n = 8 animais/grupo). Os animais sofreram lesão
intraestriatal com 6-OHDA (18µg/3µL), a vs FO (ipsilateral), b vs FO (ambas), d vs 6-OHDA (ipsilateral), c vs
6-OHDA (ambas), e vs 6-OHDA (contralateral), p<0,05. Testes de Kruskall-Wallis e Mann-Whitney. Os
valores representam a média EPM.
FO
6-OHDA
6-OHDA+C
urc50
6-OHDA+C
urc10
0
6-OHDA+C
urc20
0
FO +
Curc
200
0
20
40
60
80%Ipsilateral
%Contralateral
%Ambas a
b
c
e
d
c
% n
º d
e t
oq
ues /
5 m
in
e
62
Figura 24 – Teste do Cilindro. Avaliação da simetria dos membros anteriores em ratos parkinsonianos tratados
com resveratrol 5, 10 e 50 mg/kg v.o. por 15 dias (n = 8 animais/grupo). Os animais sofreram lesão intraestriatal
com 6-OHDA (18µg/3µL), a vs FO (ipsilateral), b vs FO (ambas), p<0,05. Testes de Kruskall-Wallis e Mann-
Whitney. Os valores representam a média EPM.
FO
6-OHDA
6-OHDA +
Res
v5
6-OHDA +
Res
v10
6-OHDA +
Res
v50
FO+ R
esv5
0
0
20
40
60
80%Ipsilateral
%Contralateral
%Ambasa
b
% n
º d
e t
oq
ues /
5 m
in
63
4.5 Efeito da curcumina e do resveratrol sobre a avaliação de desespero comportamental
(Teste do Nado forçado) em ratos parkinsonianos
Os animais que sofreram lesão por 6-OHDA apresentaram um aumento
significativo no tempo de imobilização, quando comparados ao grupo falso operado (FO:
45,83 ± 5,10s; 6-OHDA: 86,33 ± 12,01s), significando que os animais parkinsonianos tiveram
um comportamento depressivo.
A administração de curcumina nas doses de 100 e 200 mg/kg protegeu
significativamente os animais (6-OHDA + Curc100: 40,60 ± 6,94s; 6-OHDA + Curc200:
16,86 ± 5,76s) (Figura 25).
O resveratrol também protegeu significativamente os animais nas doses 5, 10 e 50
mg/kg (6-OHDA + Resv5: 49,50 ± 19,12s; 6-OHDA + Resv10: 29,33 ± 3,01s; 6-OHDA +
Resv50: 18,43 ± 6,31s) (Figura 26).
Figura 25 – Teste do Nafo forçado. Avaliação de ansiedade em ratos parkinsonianos tratados com curcumina 25,
50, 100 e 200 mg/kg v.o. por 15 dias (n = 8 animais/grupo). Os animais sofreram lesão intraestriatal com 6-
OHDA (18µg/3µL), a vs FO, b vs 6-OHDA, p<0,05. Testes de Kruskall-Wallis e Mann-Whitney. Os valores
representam a média EPM.
FO
6-OHDA
6-OHDA+C
urc25
6-OHDA+C
urc50
6-OHDA+C
urc 1
00
6-OHDA+C
urc20
0
FO +
Curc
200
0
20
40
60
80
100
120
a
b
b
tem
po
de i
mo
bil
ização
(s)
/ 5 m
in
64
Figura 26 – Teste do Nado forçado. Avaliação de ansiedade em ratos parkinsonianos tratados com resveratrol 5,
10 e 50 mg/kg v.o. por 15 dias (n = 8 animais/grupo). Os animais sofreram lesão intraestriatal com 6-OHDA
(18µg/3µL), a vs FO, b vs 6-OHDA, p<0,05. Testes de Kruskall-Wallis e Mann-Whitney. Os valores
representam a média EPM.
FO
6-OHDA
6-OHDA +
Res
v5
6-OHDA +
Res
v10
6-OHDA +
Res
v50
FO +
Res
v50
0
20
40
60
80
100
120
a
b
bb
tem
po
de i
mo
bil
ização
(s)
/ 5 m
in
65
4.6 Efeito da curcumina e do resveratrol sobre a avaliação de memória operacional
(Labirinto em Y) em ratos parkinsonianos
No teste Y-Maze avaliamos a memória de trabalho ou memória operacional.
Observamos que os animais que sofreram lesão por 6-OHDA não apresentaram diferença
significativa na porcentagem de alternações espontâneas no labirinto em Y em relação ao
grupo falso operado (% FO: 68,81 ± 2,53; % 6-OHDA: 67,22 ± 2,88) significando que o
parkinsonismo não leva a déficit na memória operacional.
Também não foram observadas diferenças significativas entre os grupos tratados
com curcumina, nas doses 25, 50, 100 e 200 mg/kg (Figura 27), nem nos tratados com
resveratrol, nas doses 5, 10 e 50 mg/kg (Figura 28).
Figura 27 – Teste do Labirinto em Y. Avaliação da memória operacional em ratos parkinsonianos tratados com
curcumina 25, 50, 100 e 200 mg/kg v.o. por 15 dias (n = 8 animais/grupo). Os animais sofreram lesão
intraestriatal com 6-OHDA (18µg/3µL).
FO
6-OHDA
6-OHDA+C
urc25
6-OHDA+C
urc50
6-OHDA+C
urc 1
00
6-OHDA+C
urc20
0
FO +
Curc
200
0
20
40
60
80
100
% d
e a
cert
os /
8m
in
66
Figura 28 – Teste do Labirinto em Y. Avaliação da memória operacional em ratos parkinsonianos tratados com
resveratrol 5, 10 e 50 mg/kg v.o. por 15 dias (n = 8 animais/grupo). Os animais sofreram lesão intraestriatal com
6-OHDA (18µg/3µL).
FO
6-OHDA
6-OHDA +
Res
v5
6-OHDA +
Res
v10
6-OHDA +
Res
v50
FO +
Res
v50
0
20
40
60
80
100
% d
e a
cert
os /
8m
in
67
4.7 Efeito da curcumina e do resveratrol sobre a avaliação de memória aversiva (Teste
Esquiva Passiva) em ratos parkinsonianos
A avaliação da memória aversiva foi realizada através do teste da esquiva passiva,
onde observamos um déficit na memória recente e memória tardia no grupo 6-OHDA em
relação ao grupo FO (Memória recente: FO: 299,80 ± 0,00s; 6-OHDA: 100,80 ± 34,92s;
Memória tardia: FO: 219,30 ± 32,65s; 6-OHDA: 120,80 ± 32,80s).
A curcumina na dose de 200 mg/kg foi capaz de proteger os animais
parkinsonianos dos déficits observados na memória recente (6-OHDA + Curc200: 239,20 ±
38,49s) (Figura 29). Quando foi realizada a análise do desempenho dentro do grupo foi
observado que animais FO aprenderam e que os animais parkinsonianos não aprenderam tanto
na memória recente quanto tardia. Os animais tratados com curcumina (100 e 200 mg/kg)
apresentam uma melhora significativa de desempenho na memória recente (ANOVA de
medidas repetidas, Teste de Bonferroni, p<0,05).
O resveratrol na dose de 10 mg/kg foi capaz de proteger os animais
parkinsonianos dos déficits observados na memória tardia (6-OHDA + Resv10: 252,50 ±
47,50s), e na dose de 50 mg/kg foi capaz de proteger dos déficits observados tanto na
memória recente como na memória tardia (Memória recente: 6-OHDA + Resv50: 249,10 ±
34,45s; Memória tardia: 6-OHDA + Resv50: 241, 20 ± 38,88s), quando comparado ao grupo
operado (Figura 30). Os animais tratados com a dose de 5 mg/kg aprenderam, porém o
aprendizado não foi significativamente diferente do grupo parkinsoniano.
68
Figura 29 – Teste da Esquiva passiva. Avaliação da memória aversiva em ratos parkinsonianos tratados com
curcumina 25, 50, 100 e 200 mg/kg v.o. por 15 dias (n = 8 animais/grupo). Os animais sofreram lesão
intraestriatal com 6-OHDA (18µg/3µL), a vs FO (memória recente), b vs FO (memória tardia) e c vs 6-OHDA
(memória recente), p<0,05. Testes de Kruskall-Wallis e Mann-Whitney. Os valores representam a média EPM.
FO
6-OHDA
6-OHDA+C
urc25
6-OHDA+C
urc50
6-OHDA+C
urc10
0
6-OHDA+C
urc20
0
FO +
Curc
200
0
100
200
300Treino
Memória recente
Memória tardia
ab
c
latê
ncia
(s)
69
Figura 30 – Teste da Esquiva passiva. Avaliação da memória aversiva em ratos parkinsonianos tratados com
resveratrol 5, 10 e 50 mg/kg v.o. por 15 dias (n = 8 animais/grupo). Os animais sofreram lesão intraestriatal com
6-OHDA (18µg/3µL), a vs FO (memória recente), b vs FO (memória tardia), c vs 6-OHDA (memória recente) e
d vs 6-OHDA (memória tardia), p<0,05. Testes de Kruskall-Wallis e Mann-Whitney. Os valores representam a
média EPM.
FO
6-OHDA
6-OHDA+R
esv5
6-OHDA+R
esv1
0
6-OHDA+R
esv5
0
FO +
Res
v50
0
100
200
300Treino
Memória recente
Memória tardia
b
cc
a
d
latê
ncia
(s)
70
4.8 Efeito da curcumina e do resveratrol sobre a avaliação de memória espacial
(Labirinto aquático sinalizado) em ratos parkinsonianos
A avaliação da memória espacial foi realizada através do teste do labirinto
aquático sinalizado (Cued Water Maze), onde observamos um déficit na memória espacial no
grupo 6-OHDA em relação ao grupo FO em todos os dias de treino (Dia 1: FO: 22,19 ± 2,03s;
6-OHDA: 37,52 ± 3,10s; Dia 2: FO: 13,88 ± 1,30s; 6-OHDA: 23,40 ± 2,22s; Dia 3: FO: 10,00
± 1,19s; 6-OHDA: 23,95 ± 2,37s; Dia 4: FO: 7,18 ± 0,60s; 6-OHDA: 16,20 ± 1,93s).
A curcumina na dose 400 mg/kg foi capaz de reverter os déficits observados na
memória espacial durante o treino do dia 2 (6-OHDA + Curc200: 16,33 ± 3,11s) (Figura 31).
O grupo tratado com resveratrol na dose de 50 mg/kg foi capaz de reverter os
déficits observados na memória espacial durante os treinos dos dias 3 e 4 (Dia 3: 6-OHDA +
Resv50: 16,14 ± 1,70s; Dia 4: 6-OHDA + Resv50: 10,18 ± 1,21s) (Figura 32).
Figura 31 – Teste do Labirinto aquático. Avaliação da memória espacial em ratos parkinsonianos tratados com
curcumina 400 mg/kg v.o. por 15 dias (n = 8 animais/grupo). Os animais sofreram lesão intraestriatal com 6-
OHDA (18µg/3µL), a vs FO, b vs 6-OHDA, p<0,05. Testes de Kruskall-Wallis e Mann-Whitney. Os valores
representam a média EPM.
Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 40
10
20
30
40
50
6-OHDA
a
a
aa
FO
6-OHDA + Curc400
FO + Curc400
b
latê
ncia
(s)
71
Figura 32 – Teste do Labirinto aquático. Avaliação da memória espacial em ratos parkinsonianos tratados com
com resveratrol 5, 10 e 50 mg/kg v.o. por 15 dias (n = 8 animais/grupo). Os animais sofreram lesão intraestriatal
com 6-OHDA (18µg/3µL), a vs FO, b vs 6-OHDA, p<0,05. Testes de Kruskall-Wallis e Mann-Whitney. Os
valores representam a média EPM.
Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 40
10
20
30
40
50
6-OHDA
a
a
aa
FO
6-OHDA + Resv5
6-OHDA + Resv10
6-OHDA + Resv50
FO + Resv50b
b
latê
ncia
(s)
72
4.9 Efeito da curcumina e do resveratrol sobre a peroxidação lipídica (TBARS) em
tecidos cerebrais de ratos parkinsonianos
As tabelas abaixo mostram as concentrações de MDA nos animais que sofreram
lesão unilateral estriatal por 6-OHDA no estriado direito (lesionado), estriado esquerdo e
mesencéfalo. Nos animais parkinsonianos observamos um aumento dos níveis de MDA em
relação ao grupo FO no estriado direito, estriado esquerdo e mesencéfalo.
O tratamento com a curcumina na dose de 200 mg/kg preveniu esse aumento de
MDA nas áreas cerebrais analisadas (Tabela 3).
O tratamento com o resveratrol na dose de 50 mg/kg preveniu esse aumento de
MDA no estriado direito e no mesencéfalo (Tabela 4).
Tabela 3 - Efeito da curcumina sobre a peroxidação lipídica em tecidos cerebrais de ratos parkinsonianos.
Grupo Estriado Dir. Estriado Esq. Mesencéfalo
FO 11,05 ± 1,27 16,18 ± 1,90 19,47 ± 0,24
6-OHDA 16,79 ± 0,93* 22,76 ± 0,36* 23,04 ± 0,73*
6-OHDA + Curc200 mg/kg 12,48 ± 1,04# 14,67 ± 1,16# 15,66 ± 0,77#
A curcumina foi administrada na dose de 200 mg/kg, v.o. por 15 dias (n = 6 animais/grupo). Os animais
sofreram lesão intraestriatal com 6-OHDA (18µg/3µL), * vs FO, # vs 6-OHDA, p<0,05. Testes ANOVA e teste
de Tukey. Os valores representam a média EPM em µM.
73
Tabela 4 - Efeito do resveratrol sobre a peroxidação lipídica em tecidos cerebrais de ratos parkinsonianos.
Grupo Estriado Dir. Estriado Esq. Mesencéfalo
FO 11,25 ± 0,61 10,81 ± 0,97 19,42 ± 0,30
6-OHDA 15,14 ± 0,94* 12,31 ± 0,44 21,76 ± 0,87*
6-OHDA + Resv10 mg/kg 13,10 ± 1,48 13,64 ± 1,11 17,93 ± 0,44#
6-OHDA + Resv50 mg/kg 12,13 ± 0,49# 12,74 ± 0,69 15,73 ± 1,82#
O resveratrol foi administrado nas doses de 10 e 50 mg/kg, v.o. por 15 dias (n = 6 animais/grupo). Os animais
sofreram lesão intraestriatal com 6-OHDA (18µg/3µL), * vs FO, # vs 6-OHDA, p<0,05. Testes ANOVA e teste
de Tukey. Os valores representam a média EPM em µM.
74
4.10 Efeito da curcumina e do resveratrol sobre a dosagem de nitrito/nitrato (NO2/NO3)
em tecidos cerebrais de ratos parkinsonianos
A partir a dosagem de NO2/NO3 podemos avaliar a presença de NO no tecido,
visto que estes dois são seus metabólitos. As tabelas aabaixo mostram a concentração de
NO2/NO3 dos animais que sofreram lesão unilateral estriatal por 6-OHDA no estriado direito
(lesionado), estriado esquerdo e mesencéfalo. A 6-OHDA promoveu um aumento de
nitrito/nitrato no estriado direito dos animais parkinsonianos.
O tratamento com a curcumina diminuiu, mas não de maneira significativa estes
níveis (Tabela 5).
O tratamento com o resveratrol na dose de 50 mg/kg diminuiu significativamente
os níveis de nitrito/nitrato no estriado direito e no mesencéfalo (Tabela 6).
Tabela 5 - Efeito da curcumina sobre a dosagem de nitrito/nitrato em tecidos cerebrais de ratos parkinsonianos.
Grupo Estriado Dir. Estriado Esq. Mesencéfalo
FO 7,85 ± 0,84 6,88 ± 0,99 7,04 ± 0,97
6-OHDA 10,90 ± 1,32 6,63 ± 0,91 8,11 ± 1,58
6-OHDA + Curc200 mg/kg 9,26 ± 1,15 8,77 ± 0,54 10,98 ± 1,43
A curcumina foi administrada na dose de 200 mg/kg, v.o. por 15 dias (n = 6 animais/grupo). Os animais
sofreram lesão intraestriatal com 6-OHDA (18µg/3µL). Os valores representam a média EPM em µM.
75
Tabela 6 - Efeito do resveratrol sobre a dosagem de nitrito/nitrato em tecidos cerebrais de ratos parkinsonianos.
Grupo Estriado Dir. Estriado Esq. Mesencéfalo
FO 8,05 ± 0,57 8,9 ± 1,31 7,64 ± 0,58
6-OHDA 13,85 ± 2,05* 8,60 ± 1,33 12,18 ± 1,43*
6-OHDA + Resv10 mg/kg 10,49 ± 1,21 9,76 ± 1,39 9,33 ± 1,46
6-OHDA + Resv50 mg/kg 7,96 ± 0,95# 7,75 ± 0,85 7,77 ± 0,73#
O resveratrol foi administrado nas doses de 10 e 50 mg/kg, v.o. por 15 dias (n = 6 animais/grupo). Os animais
sofreram lesão intraestriatal com 6-OHDA (18µg/3µL), * vs FO, # vs 6-OHDA, p<0,05. Testes ANOVA e teste
de Tukey. Os valores representam a média EPM em µM.
76
4.11 Efeito da curcumina e do resveratrol sobre a determinação da concentração da
glutationa redutase (GSH) em tecidos cerebrais de ratos parkinsonianos
As tabelas abaixo mostram as concentrações de GSH dos animais que sofreram
lesão unilateral estriatal por 6-OHDA no estriado direito (lesionado), estriado esquerdo e
mesencéfalo. A 6-OHDA promoveu um aumento nos animais parkinsonianos em relação ao
grupo FO.
O tratamento com a curcumina não foi capaz de prevenir esse aumento nas áreas
cerebrais analizadas (Tabela 7).
O tratamento com o resveratrol na dose de 10 mg/kg foi capaz de prevenir esse
aumento no estriado esquerdo e no mesencéfalo, e a dose de 50 mg/kg previniu esse aumento
no estriado direito (Tabela 8).
Tabela 7 - Efeito da curcumina sobre a determinação da concentração da glutationa reduzida em tecidos
cerebrais de ratos parkinsonianos.
Grupo Estriado Dir. Estriado Esq. Mesencéfalo
FO 0,59 ± 0,32 5,17 ± 2,19 2,66 ± 0,72
6-OHDA 1,79 ± 0,72 6,66 ± 0,44 3,36 ± 0,36
6-OHDA + Curc200 mg/kg 2,36 ± 0,81 2,59 ± 0,43 6,05 ± 1,99
A curcumina foi administrada na dose de 200 mg/kg, v.o. por 15 dias (n = 6 animais/grupo). Os animais
sofreram lesão intraestriatal com 6-OHDA (18µg/3µL). Os valores representam a média EPM em µg.
77
Tabela 8 - Efeito do resveratrol sobre a determinação da concentração da glutationa reduzida em tecidos
cerebrais de ratos parkinsonianos.
Grupo Estriado Dir. Estriado Esq. Mesencéfalo
FO 2,24 ± 0,43 2,38 ± 0,27 5,14 ± 1,88
6-OHDA 3,46 ± 0,69 3,32 ± 0,32 4,81 ± 0,40
6-OHDA + Resv10 mg/kg 3,15 ± 0,36 2,12 ± 0,15# 3,66 ± 0,5#
6-OHDA + Resv50 mg/kg 2,86 ± 0,38# 3,19 ± 0,33 4,55 ± 0,69
O resveratrol foi administrado nas doses de 10 e 50 mg/kg, v.o. por 15 dias (n = 6 animais/grupo). Os animais
sofreram lesão intraestriatal com 6-OHDA (18µg/3µL), # vs 6-OHDA, p<0,05. Testes ANOVA e teste de
Tukey. Os valores representam a média EPM em µg.
78
4.12 Efeito da curcumina e do resveratrol sobre a determinação da atividade da
superóxido dismutase (SOD) em tecidos cerebrais de ratos parkinsonianos
As tabelas abaixo mostram os níveis de SOD dos animais que sofreram lesão
unilateral estriatal por 6-OHDA no estriado direito (lesionado), estriado esquerdo e
mesencéfalo. A 6-OHDA promoveu uma diminuição significativo nos níveis de SOD dos
animais parkinsonianos em relação ao grupo FO no estriado direito.
O tratamento com a curcumina não interferiu neste parâmetro (Tabela 9).
O tratamento com o resveratrol protegeu os animais parkinsonianos na dose de 10
mg/kg no estriado esquerdo e na dose de 50 mg/kg no estriado direito (Tabela 10).
Tabela 9 - Efeito da curcumina sobre determinação da atividade da superóxido dismutase em tecidos cerebrais de
ratos parkinsonianos.
Grupo Estriado Dir. Estriado Esq. Mesencéfalo
FO 658,91 ± 9,96 629,70 ± 66,17 632,22 ± 23,56
6-OHDA 533,20 ± 18,51* 602,64 ± 42,56 686,51 ± 1,36
6-OHDA +Curc200 mg/kg 457,35 ± 12,25# 591,0 ± 69,24 662,5 ± 22,17
A curcumina foi administrada na dose de 200 mg/kg, v.o. por 15 dias (n = 6 animais/grupo). Os animais
sofreram lesão intraestriatal com 6-OHDA (18µg/3µL), * vs FO, # vs 6-OHDA, p<0,05. Testes ANOVA e teste
de Tukey. Os valores representam a média EPM em U/mg de tecido.
79
Tabela 10 - Efeito do resveratrol sobre determinação da atividade da superóxido dismutase em tecidos cerebrais
de ratos parkinsonianos.
Grupo Estriado Dir. Estriado Esq. Mesencéfalo
FO 658,91 ± 9,96 629,70 ± 66,17 632,22 ± 23,56
6-OHDA 533,20 ± 18,51* 602,64 ± 42,56 686,51 ± 13,6
6-OHDA + Resv10 mg/kg 457,35 ± 117,65 734,23 ± 13,3# 587,22 ± 56,13#
6-OHDA + Resv50 mg/kg 702,33 ± 20,5# 697,8 ± 3,24 687,0 ± 6,89
O resveratrol foi administrado nas doses de 10 e 50 mg/kg, v.o. por 15 dias (n = 6 animais/grupo). Os animais
sofreram lesão intraestriatal com 6-OHDA (18µg/3µL), * vs FO, # vs 6-OHDA, p<0,05. Testes ANOVA e teste
de Tukey. Os valores representam a média EPM em U/mg de tecido.
80
4.13 Efeito da curcumina e do resveratrol sobre a determinação das concentrações de
Dopamina (DA), seu metabólito (DOPAC), Noradrenalina (NE) e Serotonina (5-HT) em
tecidos cerebrais de ratos parkinsonianos
A injeção intraestriatal de 6-OHDA produziu diminuição da concentração de
monoaminas no estriado direito, estriado esquerdo e mesencéfalo quando comparados aos
animais controles (FO). Houve uma redução de aproximadamente 99% nos níveis de
dopamina no estriado direito, 89% no estriado esquerdo e 56% no mesencéfalo dos animais
que sofreram lesão estriatal. Os níveis de DOPAC reduziram aproximadamente 56% no
estriado direito e mesencéfalo, e aumentou 51% no estriado esquerdo nos animais que
sofreram lesão estriatal.
Também houve uma redução de aproximadamente 94% nos níveis de
noradrenalina (NE) no estriado direito, 95% no estriado esquerdo e 75% no mesencéfalo dos
animais que sofreram lesão estriatal. E uma redução de aproximadamente 97% nos níveis
serotonina (5-HT) no estriado direito e esquerdo e 73% no mesencéfalo dos animais que
sofreram lesão estriatal.
A curcumina protegeu significativamente contra a depleção dopaminérgica
induzida pela 6-OHDA no estriado direito, no estriado esquerdo e no mesencéfalo. Também
protegeu a depleção do seu metabólito (DOPAC) no estriado direito e no mesencéfalo. Ela
não protegeu da depleção noradrenérgica induzida pela 6-OHDA, mas protegeu da depleção
serotonimérgica no mesencéfalo (Tabelas 11, 12 e 13).
O resveratrol protegeu contra a depleção dopaminérgica induzida pela 6-OHDA
no estriado direito e no estriado esquerdo, mas não protegeu no mesencéfalo, também
protegeu contra a depleção do seu metabólito (DOPAC) no estriado direito. Ele não protegeu
a depleção noradrenérgica induzida pela 6-OHDA no estriado direito, no estriado esquerdo e
no mesencéfalo. Contudo ele protegeu a depleção serotonimérgica no estriado esquerdo e no
mesencéfalo (Tabelas 14, 15 e 16).
81
Tabela 11 - Efeito da curcumina na concentração de monoaminas em tecido estriatal direito (lesionado) de
ratos submetidos à lesão estriatal por 6-OHDA.
Grupo DA DOPAC NE 5-HT
FO 2.234 ± 257 111,3 ± 8,5 12.766 ± 1.165 10.842 ± 1.739
6-OHDA 20,6 ± 13,6* 49,3 ± 14* 727,2 ± 209,1* 299 ± 87,3*
6-OHDA+Curc100mg/kg 286 ± 93,1# 132 ± 28# 64,5 ± 11,7 302,1 ± 53,9
6-OHDA+Curc200mg/kg 8,3 ± 5,3 21,9 ± 12,4 58,1 ± 33# 71 ± 71
A curcumina foi administrada nas doses de 100 e 200 mg/kg, v.o. por 15 dias (n = 6 animais/grupo). Os animais
sofreram lesão intraestriatal com 6-OHDA (18µg/3µL), * vs FO, # vs 6-OHDA, p<0,05. Testes ANOVA e teste
de Tukey. Os valores representam a média EPM em pg/mg de tecido.
Tabela 12 - Efeito da curcumina na concentração de monoaminas em tecido estriatal esquerdo de ratos
submetidos à lesão estriatal por 6-OHDA.
Grupo DA DOPAC NE 5-HT
FO 2.539 ± 121,6 121,4 ± 9,1 11.802 ± 3.166 5.667 ±2.547
6-OHDA 297,2 ± 44,4* 249 ± 41,6* 547 ± 113,5* 225,6 ± 103*
6-HDA+Curc100mg/kg 591,5±40,8# 301 ± 28,4 88,1 ± 13,7# 222,7 ± 78,6
6-HDA+Curc200mg/kg 1.532±295# 375±27,8# 720 ± 156,2 614± 268,6#
A curcumina foi administrada nas doses de 100 e 200 mg/kg, v.o. por 15 dias (n = 6 animais/grupo). Os animais
sofreram lesão intraestriatal com 6-OHDA (18µg/3µL), * vs FO, # vs 6-OHDA, p<0,05. Testes ANOVA e teste
de Tukey. Os valores representam a média EPM em pg/mg de tecido.
Tabela 13 - Efeito da curcumina na concentração de monoaminas em tecido mesencefálico de ratos submetidos
à lesão estriatal por 6-OHDA.
Grupo DA DOPAC NE 5-HT
FO 29,7 ± 40,6 11,9 ± 2,2 1.279 ± 229,3 3.105 ±1.143
6-OHDA 13 ± 2,9* 4,2 ± 2,8 320 ± 59,4* 849,1 ± 198,8*
6-OHDA+Curc100mg/kg 17,7 ± 14,9 22,1 ± 9,0 147,6 ± 63,65 555,3 ± 301,9
6-OHDA+Curc200mg/kg 380 ± 78,7# 60,8± 8,4# 194,9 ± 39,6 10.256±3.067#
A curcumina foi administrada nas doses de 100 e 200 mg/kg, v.o. por 15 dias (n = 6 animais/grupo). Os animais
sofreram lesão intraestriatal com 6-OHDA (18µg/3µL), * vs FO, # vs 6-OHDA, p<0,05. Testes ANOVA e teste
de Tukey. Os valores representam a média EPM em pg/mg de tecido.
82
Tabela 14 - Efeito do resveratrol na concentração de monoaminas em tecido estriatal direito (lesionado) de
ratos submetidos à lesão estriatal por 6-OHDA.
Grupo DA DOPAC NE 5-HT
FO 2.234 ± 257 111,3 ± 8,5 12.766 ± 1.165 10.842 ± 1.739
6-OHDA 20,6 ± 13,6* 49,3 ± 14* 727,2 ± 209,1* 299 ± 87,3*
6-OHDA+ Resv10 mg/kg 45,3 ± 23,21 31,7 ± 13,1 16,8 ± 2,0# 1.051 ± 296,8#
6-OHDA+ Resv50 mg/kg 400 ± 67,8# 229±23,2# 12,3 ± 1,3# 996,8 ± 243,8#
FO + Resv 50 mg/kg 1.198 ± 127 969,4 ± 107 6,1 ± 1,9 442,1 ± 39,78
O resveratrol foi administrado nas doses de 10 e 50 mg/kg, v.o. durante 15 dias (n = 6 animais/grupo). Os
animais sofreram lesão intraestriatal com 6-OHDA (18µg/3µL), * vs FO, # vs 6-OHDA, p<0,05. Testes
ANOVA e teste de Tukey. Os valores representam a média EPM em pg/mg de tecido.
Tabela 15 - Efeito do resveratrol na concentração de monoaminas em tecido estriatal esquerdo de ratos
submetidos à lesão estriatal por 6-OHDA.
Grupo DA DOPAC NE 5-HT
FO 2.539± 121,6 121,4 ± 9,1 11.802 ± 3.166 5.667 ± 2.547
6-OHDA 297,2± 44,4* 249 ± 41,6* 547 ± 113,5* 225,6 ± 102,9*
6-OHDA+Resv10mg/kg 1.077 ± 179# 375 ± 77,8 19,1 ± 4,1# 710,4 ± 244,1
6-OHDA+Resv50mg/kg 1.008 ± 450 191,5± 60,4 58,0 ± 22,2# 560,3 ± 182,6
FO + Resv50 mg/kg 1.160± 209,4 453,8± 49,9 14,3 ± 1,5 432,1 ± 58
O resveratrol foi administrado nas doses de 10 e 50 mg/kg, v.o. durante 15 dias (n = 6 animais/grupo). Os
animais sofreram lesão intraestriatal com 6-OHDA (18µg/3µL), * vs FO, # vs 6-OHDA, p<0,05. Testes
ANOVA e teste de Tukey. Os valores representam a média EPM em pg/mg de tecido.
83
Tabela 16 - Efeito do resveratrol na concentração de monoaminas em tecido mesencefálico de ratos submetidos
à lesão estriatal por 6-OHDA.
Grupo DA DOPAC NE 5-HT
FO 29,7±4,6 11,9±2,2 1.279 ± 229,3 3.105 ± 1.143
6-OHDA 13,0±2,9* 4,2±2,8* 320 ± 59,4* 849,1 ± 198,8*
6-OHDA+ Resv10 mg/kg 17,3 ± 6,7 4,1 ± 2,6 125,6 ± 9,4# 2.693 ± 375,4#
6-OHDA+ Resv50 mg/kg 20,8 ± 4,4 6,6 ± 2,2 91,6 ± 39,8# 2.953 ± 246,3#
FO + Resv 50 mg/kg 34,6 ± 10,1 21,8 ± 7,4 109,8 ± 19,1 833,6 ± 2 90,2
O resveratrol foi administrado nas doses de 10 e 50 mg/kg, v.o. durante 15 dias (n = 6 animais/grupo). Os
animais sofreram lesão intraestriatal com 6-OHDA (18µg/3µL), * vs FO, # vs 6-OHDA, p<0,05. Testes
ANOVA e teste de Tukey. Os valores representam a média EPM em pg/mg de tecido.
84
4.14 Efeito da curcumina e do resveratrol sobre a imunorreatividade para a tirosina
hidroxilase (TH) no estriado direito de ratos parkinsonianos
As figuras 33 e 34 mostram que a 6-OHDA (B) causou uma redução de
neurônios dopaminérgicos no estriado direito, quando comparados ao grupo FO (A).
O tratamento com a curcumina na dose de 200 mg/kg aumentou discretamente a
imunorreatividade para TH (Figura 33 C), prevenindo a degeneração dos neurônios expostos
à toxicidade da 6-OHDA.
O tratamento com o resveratrol na dose de 50 mg/kg aumentou a
imunorreatividade para TH (Figura 34 C), prevenindo a degeneração dos neurônios expostos
à toxicidade da 6-OHDA.
85
Figura 33 - Fotomicrografia representativas de neurônios imunorreativos para tirosina-hidroxilase no estriado
direito (lesionado) de ratos submetidos a lesão estriatal com 6-OHDA (18µg/3µL). Coloração marron
representa células imunorreativas a tirosina-hidroxilase no estriado. A- Falso-operado, B- Parkinsoniano, C-
Parkinsoniano tratado com Curcumina 200 mg/kg. Aumento de 4 vezes (barra 2,0 mm) e 40 vezes (barra
200μm).
86
Figura 34 - Fotomicrografia representativas de neurônios imunorreativos para tirosina-hidroxilase no estriado
direito (lesionado) de ratos submetidos a lesão estriatal com 6-OHDA (18µg/3µL). Coloração marron
representa células imunorreativas a tirosina-hidroxilase no estriado. A- Falso-operado, B- Parkinsoniano, C-
Parkinsoniano tratado com Resveratrol 50 mg/kg. Aumento de 4 vezes (barra 2,0 mm) e 40 vezes (barra
200μm).
87
4.15 Efeito da curcumina sobre a integridade neuronal no estriado direito e mesencéfalo
de ratos parkinsonianos
A avaliação do dano neuronal foi realizada através da técnica histológica Violeta
de Cresil, onde podemos observar a morfologia de neurônios. Os animais parkinsonianos
apresentaram neurônios com citoarquitetura celular anormal, com células vacuolizadas e
picnóticas, sem visualização de nucléolos no estriado direito (Figuras 35B) e no mesencéfalo
(Figura 36B).
A curcumina na dose 200 mg/kg mostrou uma ação citoprotetora no estriado
direito (Figura 35C) e um pouco mais discreta no mesencéfalo (Figura 36C) com células
apresentando citoarquitetura normal, com núcleos e nucléolos bem visualizados, semelhantes
ao FO (Figuras 35A e 36A).
88
Figura 35. Fotomicrografia da região do estriado de ratos submetidos a lesão unilateral pela 6-OHDA
(18µg/3µL).. Coloração violeta de cresil. A- Falso-operado, B- Parkinsoniano, C- Parkinsoniano tratado com
Curcumina 200 mg/kg. Aumento de 10 vezes (barra 500 µm) e 40 vezes (barra 200μm).
89
Figura 36. Fotomicrografia da região do mesencéfalo de ratos submetidos a lesão estriatal pela 6-OHDA
(18µg/3µL). Coloração violeta de cresil. A- Falso-operado, B- Parkinsoniano, C- Parkinsoniano tratado com
Curcumina 200 mg/kg. Aumento de 10 vezes (barra 500 µm) e 40 vezes (barra 200μm).
90
5 DISCUSSÃO
A Doença de Parkinson (DP) é uma desordem neurodegenerativa associada com a
perda de neurônios na SNpc (CHEN et al, 2009). A etiologia da doença ainda não está
completamente conhecida, mas, ao que parece, o estresse oxidativo e a disfunção mitocondrial
têm papel importante (MARTIN et al, 2006; PATHAK et al, 2008). A DP ainda é
considerada incurável apesar de existirem inúmeros tratamentos para melhorar a qualidade de
vida dos pacientes como a L-dopa, um precursor de dopamina, inibidores da MAO-B, que
atuam melhorando flutuações motoras, agonistas dopaminérgicos, que mimetizem o efeito da
dopamina, anticolinérgicos, que são indicados para diminuição de tremores, amantadina, um
antiviral que promove a liberação de dopamina, aliviando os sintomas motores (SALAWU et
al, 2010).
O dano neuronal induzido por 6-OHDA é principalmente devido ao estresse
oxidativo maciço causado pela toxina. Sendo semelhante à dopamina, a 6-OHDA mostra alta
afinidade para o transportador de dopamina, que carrega a toxina para dentro dos neurônios
dopaminérgicos. Uma vez no neurônio, 6-OHDA acumula-se no citosol e sofre rápida auto-
oxidação, levando à alta taxa de formação de radicais livres (principalmente o peróxido de
hidrogênio) (BLANDINI et al, 2008). Como um mecanismo adicional, a 6-OHDA pode
acumular-se na mitocôndria, onde inibe a atividade da cadeia de transporte de elétrons através
do bloqueio do complexo I (BLANDINI et al, 2008). A 6-OHDA possui a desvantagem de
não atravessar a barreira hematoencefálica, sendo necessária a cirurgia extereotáxica para
administração intraestriatal da toxina, o que nem sempre leva a uma perda maciça das células
dopaminérgicas (IANCU et al., 2005). Este modelo não imita todas as características
patológicas e clínicas da DP, como por exemplo, a formação de inclusões citoplasmáticas
(corpúsculos de Lewy), mas, no entanto é o modelo mais útil e seguro para o estudo de
substâncias neuroprotetoras (HIRSCH et al, 2008). Apesar da disponibilidade de novos
modelos, a 6-OHDA permenece sendo a ferramenta experimental mais utilizada para induzir a
lesão nigroestriatal em ratos (BLANDINI et al, 2008).
A curcumina um polifenol presente na C. longa possui atividade antioxidante e
supressora da resposta inflamatória de células da micróglia. Possui também efeito
neuroprotetor em doenças degenerativas tanto pela redução da atividade inflamatória, como
através da inibição da “dobradura incorreta” e agregação de proteínas na Doença de
Creutzfeld-Jakob e na Doença de Parkinson (WANG et al, 2010). Zbarsky e colaboradores
91
(2005) demonstraram um efeito protetor da curcumina em modelo de Parkinson in vivo, com a
6-OHDA, atenuando o déficit de dopamina e a imunorreatividade para tirosina hidroxilase.
Além deste trabalho, foi evidenciada que a curcumina, protege cultura de células PC12, contra
a citotoxicidade induzida pelo MPTP, uma neurotoxina dopaminérgica (CHEN et al., 2009).
A curcumina apresenta também atividade antiinflamatória análoga à da fenil-
butasona (SATOSKAR et al., 1986). Inibe a produção de citocinas inflamatórias produzidas
por monócitos no sangue periférico e por macrófagos alveolares (LIN et al., 1997), além de
inibir as formas induzidas da óxido nítrico sintase (ZHANG et al., 1999), a ciclooxigenase e
lipoxigenase (ABE et al., 1999). Esta droga penetra facilmente no citoplasma das células
acumulando-se em estruturas membranosas como a membrana plasmática, o retículo
endoplasmático e a membrana nuclear (JARUGA et al., 1998). Alguns resultados sugerem
que os efeitos antiinflamatório e antitumoral da curcumina podem ser devidos à inibição do
metabolismo do ácido araquidônico e à atividade antioxidante do composto (SRISVASTAVA
et al., 1995). Assim como outros anti-inflamatórios não-esteroidais, a curcumina mostrou-se
capaz de suprimir a transcrição do fator NF-kappaB, que controla a expressão de genes como
a ciclooxigenase-2 e ciclina D1, levando a inibição da proliferação de células tumorais
(TAKADA et al., 2004).
O resveratrol é uma fitoalexina polifenólica comumente encontrada em grande
quantidade na casca de uva e vinho tinto (FREMONT et al., 2000). Ele tem sido o foco de
muitos estudos que visam investigar os seus atributos biológicos, incluindo sua atividade
antioxidante (OLAS et al., 1999, MARTINEZ & MORENO, 2000). Estudos in vivo mostram
que o resveratrol pode exercer neuroproteção contra isquemia, convulsões, doenças
neurodegenerativas (MARKUS & MORRIS, 2008) e possui efeitos benéficos em modelos
experimentais de DP (CHAO et al., 2008). Além disso, estudos in vitro, também
demonstraram que o resveratrol possui efeitos neuroprotetores contra diferentes neurotoxinas
(JIN et al., 2008) e capacidade de exercer efeito neuroprotetor sobre os neurônios
dopaminérgicos (BLANCHET et al., 2008; LU et al., 2008). O principal mecanismo de
neuroproteção do resveratrol seria a sua capacidade sequestradora de radicais livres
(ZHUANG et al., 2003). O resveratrol quando administrado i.p. conseguiu reduzir convulsões
induzidas por FeCl3, ácido caínico, além de restaurar parcialmente a cognição em ratos
induzido por estreptozotocina (GUPTA et al., 2002). Estes resultados levam a crer que o
resveratrol é capaz de atravessar a barreira hemato-encefálica e que exerce de maneira eficaz
92
efeitos neuroprotetores, mesmo em doses baixas após um AVC ou lesão neurotóxica. (LU et
al., 2008).
Com o objetivo de investigar um novo agente neuroprotetor capaz de prevenir a
neurodegeneração que ocorre na doença, bem como outros sintomas clínicos associados à
doença, investigamos o papel da curcumina e do resveratrol, com ação antioxidante e
antiinflamatória já comprovadas, usando um modelo experimental de DP.
O modelo de “hemiparkinsionismo” da 6-OHDA é um modelo robusto,
reprodutível, que leva a uma assimetria motora evidenciada após a administração de agonistas
dopaminérgicos resultando em um comportamento rotacional contralateral à lesão
(BETARBET et al, 2002). Este é o clássico teste da apomorfina ou rotacional, primeiramente
descrito por Ungerstedt (1976), que proporciona a verificação de grandes lesões
nigroestriatais.
Neste trabalho mostramos que animais lesionados com a 6-OHDA apresentaram
um grande número de rotações contralaterais à lesão. Este resultado está em concordância
com a literatura (RIZELIO et al., 2010; YU et al., 2010) que demonstra que lesões extensas
promovidas pela 6-OHDA acarretam esse tipo de comportamento durante a realização do
teste. O agonista dopaminérgico, apomorfina, induz rotações contralaterais ao lado lesionado,
uma vez que estimula no lado lesionado uma “up regulation” dos receptores D2.
Não foi observada proteção no teste rotacional induzido pela apomorfina nas
doses de curcumina testadas, apesar de um estudo com lesão estriatal unilateral de 6-OHDA
em ratos Sprague-Dawley pré tratados com curcumina da dose de 50 mg/Kg (dissolvida em
10% de cremophor) apresentou atividade protetora (ZBARSKY et al., 2005).
O resveratrol conseguiu diminuir as rotações estando de acordo com algumas
literaturas (ZHANG et al., 2002; RIZELIO et al., 2010). Wang e colaboradores (2011) em
modelo de lesão estriatal unilateral de 6-OHDA em ratos demontraram a mesma proteção com
um dose de 20 mg/kg de resveratrol por 14 (quatorze) dias via oral.
A locomoção no campo aberto reflete a atividade exploratória do animal
(KONTINEN et al., 1999). O presente estudo demonstrou que a 6-OHDA não induziu déficit
na atividade exploratória no teste do campo aberto, corroborando com o estudo de Iancu e
colaboradores (2005) onde demonstram que, os animais lesionados unilateralmente pela 6-
93
OHDA, demonstraram comprometimento na atividade locomotora no teste do rotarod e no
teste do cilindro, mas não no teste do campo aberto. Alguns estudos existentes (RIZELIO et
al., 2010) demonstraram uma diminuição no número total de movimentos de exploração
vertical e também em outros teste para avaliação a atividade locomotora. Estas alterações
motoras são mais evidenciadas em outros modelos de parkinsonismo animal, como nos
modelos do MPTP e rotenona, pois no modelo da 6-OHDA não observamos alterações
visíveis como a bradicinesia (SCHOBER, 2004).
Os sintomas sensoriais são uma queixa freqüente dos pacientes com DP, o que
piora sua qualidade de vida e interfere na capacidade deste paciente participar das atividades
da vida diária, contribuindo para a perturbação do sono ou depressão (YOSHII, 2012).
O comportamento sensório motor foi avaliado através do teste da vibrissa onde
observamos que não houve diferença neste modelo, corroborando com alguns autores
(WOODLEE et al., 2005) que utilizou o nosso mesmo modelo em ratos e compando com
outros modelos neuronais.
Na clínica, os pacientes com alterações do movimento, como a DP, apresentam
um importante comprometimento quando foram avaliados com base na função total
de extremidades, através da avaliação das atividades da vida diária, a coordenação fina de
equilíbrio na mão, e na marcha (RAH et al., 2009).
O presente estudo demostrou que a 6-OHDA foi capaz de produzir danos motores
finos através do teste do cilindro, corroborando com a literatura. Woodlee e colaboradores
(2008) observaram em ratos Sprague-Dawley lesionados unilateramente pela 6-OHDA, um
comprometimento da atividade motora fina através dos testes do cilindro e da instabilidade
postural.
A curcumina foi capaz de previnir esta assimetria, corroborando com outros
estudos onde a curcumina aumenta a atividade motora (BISHNOI et al., 2008). Mansouri e
colaboradores (2012) em modelo de parkinsonismo induzido pela administração de
homocisteína (2 mmol/µL) intracerebroventricular (i.c.v.), usando ratos Wistar, observaram
que a curcumina na dose de 50 mg/kg i.p., uma vez ao dia, por um período de 10 (dez) dias
começando 5 (cinco) dias antes da cirurgia, aumentava a atividade locomotora, a velocidade e
a distância percorrida pelo animal.
94
O resveratrol não mostrou proteção neste teste, e até o momento não foi
encontrada na literatura nenhuma referência com o resveratrol avaliando este tipo de
comportamento.
O modelo de “hemiparkinsonismo” induzido pela 6-OHDA promoveu um
comportamento depressivo nos animais lesionados, este comportamento também é observado
na clínica, onde ocorre um alto índice de depressão entre os pacientes com DP. (CHEN et al,
2011; KASTEN et al, 2012). Esta depressão pede ser funcional, pelo conhecimento do
diagnóstico da DP pelo paciente, ou fisiológica devido à diminuição das catecolaminas,
principalmente dopamina e serotonina. Casas e colaboradores (2011) também observaram o
comportamento depressivo em ratos Sprague-Dawley que sofreram lesão unilateral pela 6-
OHDA, através do teste no nado forçado. Outro estudo com este mesmo modelo demonstrou
que o comportamento depressivo está relacionado com a diminuição dopaminérgica nos
neurônios daqueles animais (JAUNARAJS et al., 2010).
A curcumina e o resveratrol protegeram os animais do comportamento depressivo
corroborando com estudos anteriores. Kulkarni e colaboradores (2009) demostraram que a
curcumina nas doses de 10-80 mg/kg i.p. foi capaz de proteger camundongos do
comportamento depressivo farmacológico tanto no teste do nado forçado como no teste de
suspenção da calda. No modelo de depressão induzido por um inibidor da síntese de
serotonina (p-clorofenilalanina) em camundongos, o trans-resveratrol nas doses de 40 e 80
mg/kg i.p. protegeu do comportamento depressivo nos testes do nado forçado e suspenção da
calda (XU et al., 2010).
Os pacientes com DP têm a memória de trabalho e espacial prejudicada (OWEN,
2004; KASTEN et al, 2012). Segundo Stebbins (1999), a redução da atividade dopaminérgica
no estriado e no lobo frontal pode levar a déficits de memória operacional. Em animais,
existem vários testes usados para avaliar a memória de trabalho ou operacional, o hipocampo
parece também estar envolvido (SHARMA et al., 2010).
A memória operacional ou de trabalho pode ser definida como uma memória de
curta duração para estímulos ou localizações espaciais. Há um armazenamento de uma
informação temporária que será utilizada para o planejamento de uma ação futura
(DUDCHENKO, 2004). A alternação entre os braços de um labirinto em Y (Y-maze) após um
curto prazo tem sido proposta como modelo de memória de trabalho (LALONDE et al, 2002).
95
Nakagawa e colaboradores (2004) mostraram que no modelo da doença de Parkinson usando
a neurotoxina 6-OHDA houve um dano na memória de trabalho, no entanto observou-se, em
nosso teste Y-maze, que os animais que lesionados com 6-OHDA não apresentaram déficits
neste tipo de memória.
Em relação à memória aversiva, o presente estudo constatou que a 6-OHDA
promoveu danos significativos na memória aversiva de curta duração (memória recente) e de
longa duração (memória tardia). Corroborando com estes dados, Fernadez e Espejo (2003)
demonstraram que as lesões com a neurotoxina 6-OHDA i.c.v afetam a memória aversiva e
espacial, principalmente por prejudicarem as funções cognitivas dependente do córtex pré-
frontal e do núcleo accumbens. Outro estudo com modelo de parkinsonismo em camundongos
C57/BL induzido por MPTP i.p. também demonstrou um déficit na memória aversiva
avaliada através do teste da esquiva passiva, devido à diminuição da DA no sistema nervoso
(MORIGUCHI et al., 2012).
A curcumina protegeu a memória aversiva de curta duração, corroborando com o
trabalho de Awasthin e colaboradores (2010) que demonstraram uma proteção na memória
aversiva no modelo de excitotoxicidade induzida por estreptozotosina pela curcumina nas
doses de 20 e 50 mg/kg, mediado pela diminuição do estresse oxidativo. Em modelo de DA
induzida por alumínio v.o. e D-galactose i.p. por 90 (noventa) dias em camundongos, a
curcumina 200 mg/kg v.o. por 45 (quarenta e cinco) dias protegeu dos défcites de memória
aversiva pelo teste da esquiva passiva (PAN et al, 2008) e de disfunção cognitiva induzida por
antiepiléticos (REETA et al., 2010). A curcumina diminui a morte dos neurônios hipocampais
e o estresse oxidativo, diminuindo os níveis de MDA e de ânion superóxido, induzida por
homocisteína, protegendo a memória aversiva (ATAIE et al, 2010).
O resveratrol protegeu tanto a memória aversiva recente quanto a tardia,
corroborando com o estudo de Gacar e colaboradores (2011) que utilizaram um modelo de
perda de memória induzido por escopolamina em ratos, onde o resveratrol nas doses de 25 e
50 mg/kg v.o. Protegeu tanto a memória aversiva como a espacial. Karalis e colaboradores
(2011) demonstraram que o resveratrol foi capaz de proteger a memória aversiva e espacial de
animais submetidos à isquemia por traumatismo. Também em modelo dos ratos Wistar
diabéticos pela administração da estreptosozina i.v. o resveratrol nas doses de 10 e 20 mg/kg
protegeu contra os déficits de memória aversiva no teste da esquiva passiva (SCHMATZ et
al., 2009).
96
No teste do labirinto aquático com plataforma sinalizada (Cued Water Maze)
avaliamos a memória espacial dependente de estriado através do aprendizado nos quatro dias
de testes (MIYOSHI et al., 2002). Os animais parkinsonianos apresentaram um déficit de
memória espacial em todos os dias, corroborando com estudos anteriores (PACKARD &
McGAUGH, 1992). Tadaiesky e colaboradores (2008) também observaram este défcit em
modelo de parkinsonismo em ratos induzido pela injeção unilateral de 6-OHDA, e justificam
pela depleção de dopamina, noradrenalina e serotonina nas áreas cerebrais afetadas destes
animais.
A curcumina não conseguiu reverter o déficit na memória espacial no nosso
modelo de doença neurodegenerativa, Kumar e colaboradores (2009) mostraram que no
modelo de DA, com administração de alumínio, a curcumina nas doses 30 e 60 mg/kg por 6
(seis) semanas protegeu a memória espacial utilizando o labirinto aquático de Moris (Moris
Water Maze).
O resveratrol consegui reverter o dano de memória em animais parkinsonianos no
terceiro e quarto dia de teste, corroborando com o estudo de Karalis e colaboradores (2011)
que demonstraram que o trans-resveratrol 90 mg/kg i.p. foi capaz de proteger a memória
espacial de ratos jovens submetidos a isquemia por traumatismo craniano.
Os compostos estudados neste trabalho apresentaram melhora nos tipos de
memória estudados. A curcumina reduz o dano oxidativo em modelo de demência em
camundongo transgênico para doença de Alzheimer (DA) (GARCIA-ALLOZA et al., 2007;
ONO et al., 2004) e exerce um efeito positivo sobre a neurogênese e concentrações de fatores
neurotróficos no cérebro, ativação da via BDNF/TrkB especialmente na região CA3 do
hipocampo (XU et al 2009), provavelmente estes mecanismos de ação podem explicar seus
efeitos neuroprotetores. A atividade antioxidante da curcumina protege os animais dos danos
cognitivos, melhorando a memória de ratos, em modelo de excitotoxicidade cerebral induzido
pela hemocisteína ela apresentou proteção na memória espacial e na memória aversiva
(AWASTHI et al., 2010).
Em humanos, o consumo de curcumina tem sido associado a uma menor
incidência de doenças de Alzheimer e de Parkinson além de melhora cognitiva (NG et al.,
2006). Em modelos animais os mecanismos responsáveis pela prevenção dos déficits
cognitivos parecem ser mediados por suas propriedades antiapoptóticas (PAN et al. 2008) e
97
sua capacidade de alterar bioquímica e morfologicamente as sinapses (AHMED et al., 2010;
XU et al. 2009).
As EROs e ERNs são produzidas fisiologicamente através do metabolismo celular
e, em concentrações moderadas, desempenham importantes papéis em processos de
sinalização celular, apoptose, expressão gênica e transporte iônico. Essas moléculas são
rigidamente controladas por antioxidantes que podem agir de maneira direta, atuando como
varredoras, ou de maneira indireta através do aumento da expressão de enzimas antioxidantes
(LU et al., 2010). Entretanto, o excesso desses radicais causa o estresse oxidativo, um
processo deletério que pode ser um importante mediador dos danos a estruturas celulares,
como lipídeos, proteínas e DNA (VALKO et al., 2007).
Um dos principais componentes celulares afetados pelo estresse oxidativo é a
membrana celular que sofre um processo de peroxidação. O MDA é um aldeído de cadeia
curta, sendo o principal produto da peroxidação lipídica. No presente trabalho a 6-OHDA
promoveu o aumento das concentrações de MDA no estriado direito, esquerdo e mesencéfalo,
corroborando com dados da literatura (KHAN et al., 2010). Kumar e colaboradores (2009)
mostraram que ratos com lesão estriatal por 6-OHDA apresentaram um aumento de 40% nas
concentrações de MDA, indicando altos níveis de peroxidação lipídica. Esses efeitos foram
associados à redução dos conteúdos de GSH, SOD e GSH-Px (glutationa peroxidase), juntos
esses fatores podem levar à diminuição da geração de radicais livres.
O tratamento com curcumina preveniu o aumento nos níveis de MDA nas áreas
cerebrais avaliadas. Estudos mostram a inibição da peroxidação lipídica pela curcumina em
modelos de isquemia focal (RATHORE et al., 2008). Zhu e colaboradores (2004) mostraram
que neurônios corticais em cultura expostos ao indutor de estresse oxidativo t-BHP
apresentam perda do potencial de membrana mitocondrial, seguido da liberação do citocromo
c para o citosol, ativação da caspase 3 e de apoptose, nesse modelo a curcumina se mostrou
protetora, restaurando o potencial de membrana mitocondrial, inibindo a caspase 3 e a
alteração na expressão de proteínas da famíla Bcl-2, diminuindo assim a morte por apoptose.
Segundo Wang e colaboradores (2005) a curcumina também apresenta efeito
protetor quando administrada por 20 (vinte) dias antes da isquemia/reperfusão. A diminuição
da peroxidação lipídica, do dano no potencial de membrana mitocondrial, da liberação do
98
citocromo c e da ativação da caspase 3, com conseqüente diminuição da morte de neurônios e
células da glia, parecem ser os mecanismo responsáveis.
O tratamento com o resveratrol preveniu o aumento nos níveis de MDA no
estriado direito e no mesencéfalo. Uma das mais conhecidas propriedades do resveratrol é a
de ser antioxidante, atenuando a acumulação de EROs. Dados da literatura mostram que o
resveratrol é capaz de impedir o aumento das EROs e a morte por apoptose causada por um
dano oxidativo (OVESNÁ et al., 2006). Jin e colaboradores (2008) demonstraram este efeito
neuroprotetor do resveratrol em modelo animal de parkinsonismo induzido pela injeção
unilateral de 6-OHDA em ratos Sprague-Dawley onde ocorreu diminuição dos níveis de
COX2, TNFα e NO2 na substância negra dos animais lesionados.
A molécula de óxido nítrico (NO) é extremamente tóxica e danifica proteínas,
lipídeos de membrana e DNA. De maneira indireta podemos quantificar a produção do NO
através da dosagem de seu metabólito nitrito/nitrato. A 6-OHDA aumentou os níveis de
nitrito/nitrato, no estriado direito e mesencéfalo dos animais, corroborando com outros
estudos (GUO et al., 2007). Em trabalho realizado no nosso laboratório in vitro em cultura
primárias de células mesencefálicas de rato foi observado que a 6-OHDA aumentou os níveis
de nitrito e a peroxidação lipídica. (NOBRE Jr. et al., 2003).
No presente trabalho o tratamento com curcumin diminui, mas não
significativamente os níveis de nitrito/nitrato no estriado direito induzido pela 6-OHDA.
Outros autores usando um modelo de isquemia tromboembólico também encontraram uma
diminuição dos níveis de nitrito/nitrato pela curcumina (DOHARE et al., 2008).
O resveratrol na dose de 50 mg/kg diminui significativamente os níveis de
nitrito/nitrato induzido pela 6-OHDA no estriado direito e no mesencéfalo. Estudos
demonstram que o resveratrol pode agir inibindo a formação do radical hidroxil e do ânion
superóxido (LEONARD et al., 2003; SOARES et al., 2003), postulando que seu principal
mecanismo de neuroproteção seria a sua capacidade varredora de radicais livres (ZHUANG et
al., 2003).
Uma das primeiras mudanças bioquímicas observadas no cérebro de pacientes
da DP postmortem é o decréscimo nos níveis da GSH. A GSH é o mais importante
componente das defesas antioxidantes celulares (DICKINSON et al., 2003). Em geral, a
99
SNpc é uma das estruturas onde o GSH se encontra em níveis mais baixos e na DP os níveis
de GSH sofrem um decréscimo ainda maior (BHARATH et al., 2002). Níveis baixos de
GSH levam a um aumento do estresse oxidativo, disfunção mitocondrial e
consequentemente morte celular (JHA et al., 2000).
No nosso estudo, não foi observado um decréscimo nos níveis de GSH induzido
pela 6-OHDA nas áreas cerebrais analisadas, discordando dos dados da literatura que
mostram esta diminuição (CHEN et al., 2009; YU et al., 2010). A 6-OHDA induz um
aumento do estresse oxidativo, especificamente por promover a produção de radicais
superóxido, H2O2, hidroxil e quinonas, através da sua ação inibitória sobre a cadeia
respiratória mitocondrial (EMBORG, 2004).
O tratamento com a curcumina não alterou os níveis de GSH. Jagatha e
colaboradores (2008) demonstraram em estudos in vitro e in vivo, que a curcumina restaura
os níveis de GSH, protegendo contra oxidação protéica e preservando a atividade do
complexo I mitocondrial.
O tratamento com o resveratrol na dose de 10 mg/kg restaurou os níveis de GSH
diminuindo no estriado esquerdo e no mesencéfalo e a dose de 50 mg/kg restaurou os níveis
de GSH no estriado direito. Outros autores em estudo com o modelo de 6-OHDA em ratos
causou uma diminuição do estresse oxidativo pelo resveratrol através da diminuição das
enzimas glutationa peroxidase e reduzida e do aumento das substâncias reativas ao ácido
tiobarbitúrico, da proteína carbonil e atividade da fosfolipase A2 (KHAN et al., 2010).
A enzima superóxido dismutase (SOD) é uma das responsáveis pelo seqüestro de
radicais livres, mais especificamente retirando o anion superóxido com conseqüente formação
de peróxido de hidrogênio (LU et al., 2010). No presente trabalho a 6-OHDA promoveu uma
diminuição significativa da SOD no estriado lesado corroborando com outros estudos
(AHMAD et al., 2010). O tratamento com a curcumina não restaurou os níveis de SOD. Yu e
colaboradores (2010) demonstraram em estudos in vitro em células SH-SY5Y, e in vivo em
camundongos C57BL no modelo do MPTP, que a curcumina restaura os níveis de SOD
protegendo contra o aumento das EROs e o estresse oxidativo. Rathore e colaboradores
(2008) também demonstraram que a administração de curcumina reverteu a depleção de SOD,
aumentou de EROs e causou ativação de caspase-3 induzidos por isquemia focal transitória.
100
O resveratrol restaurou os níveis de SOD na dose de 50 mg/kg no estriado direito,
protegendo contra o aumento das EROs e o estresse oxidativo. Outros autores em estudos in
vivo e in vitro usando cultura de células SH-SY5Y também demonstraram o efeito
neuroprotetor do resveratrol, protegendo do estresse oxidativo, utilizando diferentes
neurotoxinas (CHAO et al., 2008).
Os resultados do nosso estudo demonstraram que a 6-OHDA promoveu um
aumento significativo dos níveis de MDA e NO2 e diminuição da SOD. Outros trabalhos com
a 6-OHDA reportam que a lesão nigroestriatal causa aumento da peroxidação lipídica
(AHMAD et al 2010; GUO et al., 2007; KABUTO et al., 2007), nos níveis de nitrito (SINGH
et al., 2005; GUO et al., 2007; XIONG et al., 2009), além do decréscimo nos níveis da SOD
(AHMAD et al., 2010; YU et al., 2010).
Begum e colaboradores (2008) mostraram em modelo de Doença de Alzehaimer
in vitro e in vivo que a curcumina foi capaz de reduzir a inflamação e a neurodegeneração
diminuindo a interleucina 1β (IL-1β) e o marcador astrocitário GFAP. Assim como outros
anti-inflamatórios não-esteroidais, a curcumina mostrou-se capaz de suprimir a transcrição do
fator NF-kappaB, que controla a expressão de genes como a ciclooxigenase-2 e ciclina D1,
levando a inibição da proliferação de células tumorais (TAKADA et al., 2004). Outro estudo
mostrou que os níveis neuronais de EROs, de peroxinitrito e de NO foram significativamente
inibidas após o tratamento com a curcumina (DOHARE et al., 2008). Além disso, a
curcumina também foi capaz de aumentar a atividade das enzimas envolvidas no estresse
oxidativo como a superóxido dismutase, catalase e glutationa peroxidase de forma dose-
dependente (MOKNI et al., 2007), assim como o conteúdo da glutationa (ATES et al., 2007).
Todos estes achados corroboram com os nossos resultados e apontam para o mecanismo de
neuroproteção da curcumina no modelo de DP com a 6-OHDA.
Em modelo de isquemia cerebral in vitro, o resveratrol mostrou-se capaz de
mimetizar condições pré-isquêmica, aumentando o tempo de sobrevida de células
hipocampais isquemiadas (RAVAL et al., 2004). Também mostrou significativa atenuação da
citotoxicidade induzida por Lipoproteína de Baixa Densidade Oxidada (oxLDL) (CAO &
WANG, 2005) e MPP(+) (GELINAS & MARTINOLI, 2002) em cultura de células PC12, e
neuroproteção (por inibição de NF-kappaB p65) em ratos com isquemia induzida (WANG et
al., 2003). Além de ação antioxidante, o resveratrol possivelmente promove neuroproteção
por inibir os canais de K+ dependente de voltagem (GAO & HU, 2005), aumentar a liberação
101
de óxido nítrico (NO) (KIZILTEPE et al., 2004) e antagonizar as ações excitotóxicas do
ácido kaínico (VIRGILI & CONTESTABILE, 2000).
O presente trabalho mostrou que a injeção unilateral de 6-OHDA no corpo
estriado causou uma diminuição significativa nas concentrações de dopamina (DA), DOPAC,
noradrenalina (NE) e serotonina (5-HT) no estriado direito, estriado esquerdo e mesencéfalo
corroborando com outros estudos (YANG et al., 2009). A 6-OHDA foi injetada no corpo
estriado, ocasionando uma lesão retrógrada, atingindo o mesencéfalo e depletando as
monoaminas. As lesões estriatais pela 6-OHDA induzem neurodegeneração retrógrada dos
neurônios da SNpc, que são progressivas nas primeiras semanas da lesão (BERGER et al.,
1991; BLANDINI et al., 2008). Além da perda massiva de DA, são descritas alterações em
outros neurotransmissores, o que inclui redução dos níveis de 5-HT no corpo estriado e SNpc
e redução do conteúdo de NA na SNpc pela 6-OHDA (READER & DEWAR, 1999).
A curcumina nas doses estudadas conseguiu diminuir significativamente a perda
de DA no estriado direito, esquerdo e mesencéfalo induzida pela 6-OHDA. Em um trabalho
realizado em camundongos Swiss, a curcumina na dose 80 mg/kg (i.p.) e a
tetrahidrocurcumina na dose 60 mg/kg (i.p.) previnem a perda de DA e seu matabólito
(DOPAC) nos animais submetidos à lesão nigroestriatal pelo MPTP (RAJESWARI &
SABESAN 2008), no entanto, não foi capaz de reverter a perda de NE e 5-HT.
O resveratrol nas doses estudadas conseguiu diminuir significativamente a perda
de DA induzida pela 6-OHDA no estriado direito e esquerdo, e do metabólito no estriado
direito. Wang e colaboradores (2011) observaram a mesma neuroproteção encontrada em um
modelo de parkinsonismo animal induzido pela 6-OHDA, neste o resveratrol na dose de 20
mg/kg v.o., por 14 (quatorze) dias, protegeu os neurônios dopaminérgicos da depleção de DA,
diminuindo a atividade das EROs possivelmente por sua capacidade antioxidante.
Corroborando com o que foi dito foi constatado que a administração de uma dieta
ou tratamento à base de resveratrol para camundongos adultos antes de serem lesionados pela
neurotoxina MPTP exerce efeito neuroprotetor sobre os neurônios dopaminérgicos,
aumentando os níveis da DA no estriado e na SNpc (BLANCHET et al., 2008; LU et al.,
2008). O resveratrol também foi capaz de reverter à depleção de 5-HT induzida pela 6-
OHDA, mas não a depleção de NE. Xu e colaboradores (2010) demonstraram em que o trans-
resveratrol nas doses de 40 e 80 mg/kg i.p. restaurou os níveis de 5-HT e NE no córtex frontal
102
e no hipocampo de camundongos submetidos à um modelo de depressão induzido por um
inibidor da síntese de serotonina.
A tirosina hidroxilase (TH) tem provado ser um bom marcador para neurônios
que contêm catecolaminas e tem sido utilizada para proporcionar mapas de sistemas
contendo catecolaminas (CUELLO, 1978). No presente trabalho a lesão pela 6-OHDA
promoveu a diminuição da imunorreatividade para TH no corpo estriado e SN. Estes
resultados estão em concordância com a literatura (CHATURVEDI et al., 2006;
YOKOIAMA et al., 2010) que demonstraram que a 6-OHDA é capaz de diminuir a
expressão de TH em neurônios dopaminérgicos.
A curcumina na dose testada promoveu uma discreta proteção nos neurônios
dopaminérgicos contra a 6-OHDA, o que foi observado pelo aumento da imunorreatividade
para TH no corpo estriado e pela manutenção da citoarquitetura normal, com núcleos e
nucléolos bem visualizados, através da coloração violeta de cresil, no corpo estriado e no
mesencéfalo. Zbarsky e colaboradores (2005) também demonstraram um efeito protetor da
curcumina em modelo de Parkinson in vivo induzido pela 6-OHDA, atenuando o déficit de
dopamina e aumentando a imunorreatividade para tirosina hidroxilase na SNpc. Mansouri e
colaboradores (2012) observaram que a curcumina na dose 50 mg/kg i.p., administrada 5
(cinco) dias antes e após a indução do parkinsonismo em ratos com homocisteína i.c.v.,
protegeu os neurônios dopaminérgicos da SNpc da morte e relacionaram os achados à sua
atividade anti-apoptótica.
O resveratrol na dose testada protegeu os neurônios dopaminérgicos contra a
toxicidade pela 6-OHDA. Srivastava e colaboradores (2012) observaram no modelo de
parkinsonismo experimental, em camundongo Swiss, induzido por paraquat (10 mg/kg) que
sozinho ou em combinação com maneb (30 mg/kg), duas vezes por semana, por 9 semanas,
o resveratrol na dose de 10 mg/kg i.p. diariamente aumentou a imunorreatividade para
tirosina hidroxilase na SNpc. Em outro estudo, Blanchet e colaboradores (2008) observaram
a ação neuroprotetora do pré-tratamento com resveratrol nas doses de 50 e 100 mg/kg por
duas semanas, no modelo de parkinsonismo induzido pelo MPTP i.p em camundongos
C57BL, onde foi visto uma diminuição da depleção de estriatal DA, e manutenção da
imunorreatividade para TH estriatal.
103
O efeito neuroprotetor da curcumina contra os danos motores causados pela 6-
OHDA pode não ter sido evidente por problemas farmacocinéticos, uma vez que, quando
administrada oralmente, a curcumina pode sofrer reações de glucuronidação, sulfatação e
redução no intestino formando produtos como: curcumina glicuronido, curcumina sulfato,
tetrahidrocurcumina, hexadihidrocurcumina e hexahidrocurcumina (IRESON et al., 2001).
Sua farmacocinética vem sendo estudadas desde os anos 70 e sabe-se que apresenta baixa
biodisponibilidade, aproximadamente 75% da curcumina é excretada pelas fezes
(WAHSTROMAND & BLENNOW,1978) e sua meia-vida é muito curta. Atualmente, estão
estudando novas formas para o melhoramento da molécula da curcumina, para tentar
solucionar os problemas da farmacocinética e biodisponibilidade, assim como diminuir os
efeitos colaterais (MYTHRI et al., 2011).
Através do nosso estudo, podemos afirmar que a curcumina demonstrou exerce
uma ação neuroprotetora parcial no modelo experimental de DP com a 6-OHDA, mas
protegeu o comportamento depressivo e contra o défcit na memória aversiva, possivelmente
por diminuição na peroxidação lipídica e produção de nitrito, restaurando assim parcialmente
os conteúdos das monoaminas e dos seus metabólitos.
O resveratrol, mas não a curcumina mostrou exercer uma forte ação
neuroprotetora contra os danos motores no modelo experimental de DP com 6-OHDA. Os
dois compostos demonstram exercer efeito protetor contra sinais/sintomas apresentados na DP
como perda de memória e depressão. Deste modo, os resultados elegem o resveratrol como
forte candidato a uso como terapia adjuvante no tratamento da DP.
104
6 CONCLUSÃO
- O resveratrol, mas não a curcumina protegeu os animais parkinsonianos de
danos motores induzidos pela 6-OHDA.
- No modelo de parkinsonismo utilizado não observamos déficit na atividade
locomotora nem na atividade sensório-motor, porém foi visto um déficit no comportamento
motor fino. A curcumina na dose de 100 mg/kg protegeu o animal desse déficit. Essa proteção
foi comprovada no teste do cilindro. O resveratrol não mostrou esta proteção
- Os animais parkinsonianos apresentaram um comportamento depressivo que foi
revertido pela curcumina e pelo resveratrol.
- A 6-OHDA promoveu déficit na memória aversiva e espacial, mas não na
memória de trabalho. A curcumina e o resveratrol protegeram contra os déficits na memória
aversiva recente e tardia. O resveratrol também protegeu os animais parkinsonianos na
memória espacial.
- Ocorreu um aumento do estresse oxidativo pela 6-OHDA, que foi revertido
parcialmente pela curcumina e amplamente pelo resveratrol.
- A depleção das monoaminas foi induzida pela 6-OHDA. A curcumina e o
resveratrol reverteram os níveis de Dopamina e Serotonina.
- A morte dos neurônios dopaminérgicos pela 6-OHDA foi demonstrada através
da imunorreatividade para Tirosina Hidroxilase e pela coloração Violeta de Cresil. A
curcumina e o resveratrol protegeram a morte dos neurônios no estriado direito e no
mesencéfalo.
A proteção observada pelos compostos pode ser atribuida aos mecanismos
antioxidantes que podem estar relacionados com redução de espécies reativas do oxigênio e
nitrogênio, anti-apopitóticos relacionados à diminuição da morte dos neurônios
dopaminérgicos e à diminuição da depleção das monoaminas. Através desses achados
podemos propor o resveratrol como uma substância promissora a ser explorada como agente
neuroprotetor para doença de Parkinson.
105
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ANEXO
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