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Aus der Universitätsklinik für Zahn-, Mund- und Kieferheilkunde
Abteilung Poliklinik für Zahnerhaltungskunde und Parodontologie
der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg i. Br.
(Ärztlicher Direktor: Prof. Dr. E. Hellwig)
DREIDIMENSIONALE STRUKTUR- UND VITALITÄTSVERTEILUNG
ORALER BAKTERIELLER BIOFILME (DENTALER PLAQUE)
INAUGURAL-DISSERTATION
zur Erlangung des Zahnmedizinischen Doktorgrades
der Medizinischen Fakultät der Albert-Ludwigs-Universität
Freiburg i. Br.
Vorgelegt 2003
von Nicole Hein
geboren in Dillingen/Donau
Dekan Prof. Dr. J. Zentner
1. Gutachter PD Dr. N. Arweiler
2. Gutachter Prof. Dr. Dr. N.-C. Gellrich
Jahr der Promotion 2004
1
INHALTSVERZEICHNIS 1 Einleitung 4
2 Literaturübersicht 6
2.1 Der Biofilm 6
2.1.1 Charakteristika von Biofilmen 6
2.1.2 Rolle der extrazellulären polymeren Substanzen (EPS) 8
2.1.3 Biofilme und Gesundheit 8
2.1.4 Die Entwicklung des dentalen Biofilms 10
2.1.4.1 Pellikelbildung 10
2.1.4.2 Bakterielle Besiedelung 11
2.1.4.3 Reifung der Plaque 11
2.1.5 Derzeitiges Biofilm-Modell 12
2.2 Untersuchung von Biofilmen 13
2.3 Vitalfluoreszenztechnik 14
2.4 Konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie 15
3 Versuchsplanung 18
3.1 Vorversuch 18
3.2 Versuch 1: Abhängigkeit der Biofilmbildung von der Lokalisation 19
3.3 Versuch 2: Abhängigkeit der Biofilmbildung von der Zeit 20
4 Material und Methode 21
4.1 Vorversuch 21
4.1.1 Probeplättchen 21
4.1.2 Bakterienstämme 21
4.1.3 Versuchsablauf 21
4.1.4 Vitalfluoreszenzfärbung 22
4.1.5 Konfokales Laser-Scanning-Mikroskop (CLSM) 22
4.1.6 Ergebnisse des Vorversuchs 23
4.2 Versuch 1 24
INHALTSVERZEICHNIS 2
4.2.1 Probanden 24
4.2.2 Probeplättchen 25
4.2.3 Schienen 25
4.2.3.1 Materialien zur Herstellung der Schienen 25
4.2.3.2 Geräte zur Herstellung der Schienen 26
4.2.3.3 Herstellung der Schienen 26
4.2.3.4 Bestückung der Schienen 27
4.2.3.5 Desinfektion 27
4.2.4 Klinischer Ablauf 28
4.2.4.1 Verfahren/Zeitraum 28
4.2.4.2 Entnahme der Proben 29
4.2.5 Vitalfärbung der Proben 29
4.2.6 Konfokales Laser-Scanning-Mikroskop (CLSM) 29
4.2.7 Auswertung der CLSM-Daten 29
4.2.8 Statistische Analyse 30
4.3 Versuch 2 30
4.3.1 Probanden 30
4.3.2 Probeplättchen 31
4.3.3 Schienen 32
4.3.3.1 Bestückung der Schienen 32
4.3.3.2 Desinfektion 32
4.3.4 Klinischer Ablauf 32
4.3.4.1 Verfahren/Zeitraum 32
4.3.4.2 Entnahme der Proben 33
4.3.5 Vitalfärbung der Proben 33
4.3.6 Konfokales Laser-Scanning-Mikroskop (CLSM) 33
4.3.7 Auswertung der CLSM-Daten 33
4.3.8 Statistische Analyse 34
5 Ergebnisse 35
5.1 Versuch 1 35
5.1.1 Biofilmdicke (BD) 35
5.1.2 Vitalität (VF) 37
INHALTSVERZEICHNIS 3
5.2 Versuch 2 40
5.2.1 Biofilmdicke (BD) 40
5.2.2 Vitalität (VF) 40
6 Diskussion 43
6.1 Methodische Diskussion 43
6.1.1 Trägersysteme zur Plaquegewinnung 43
6.1.2 Glasplättchen als Trägermaterial 46
6.2 Biofilmdicke 47
6.3 Vitalfluoreszenz 50
7 Zusammenfassung 53
8 Literaturverzeichnis 54
9 Anhang 62
9.1 Probandeninformation 62
9.2 Vitalität nach 8 und 24 Stunden (in vitro) 63
9.3 Dicken der Biofilme in µm an den Tagen 1 bis 7 65
9.4 Mittelwerte ± Standardabweichungen der Vitalitäten an den Tagen 1-7 66
9.5 Vitalität der 8 Probanden nach 48 h im OK und UK 67
9.6 Übersicht der Vitalität nach Probanden geordnet (Tage 1 bis 7) 71
9.7 Übersicht der Vitalität aller Probanden nach Tagen geordnet 73
Danksagung 76
Lebenslauf 77
4
1 EINLEITUNG
Die dentale Plaque stellt eine dem Zahnarzt wohlbekannte Struktur dar. Sie wird
aus heutiger Sicht als bakterieller Biofilm charakterisiert.
Unter dem Begriff „Biofilm“ versteht man Strukturen, die aus Mikroorganismen und
deren metabolischen Produkten bestehen, diese sind in der Regel schleimartige,
klebrige Substanzen.
Biofilme entstehen jedoch nicht nur in der Mundhöhle, sondern sind ubiquitär.
Solche Strukturen beschäftigen die Wissenschaft und insbesondere die Medizin
schon seit langem. Die frühesten Beobachtungen von Biofilmen gehen auf Antonie
van Leeuwenhoek (1632-1723) zurück, der 1683 als Erster diesen weichen Belag
beschrieb, von dem damals angenommen wurde, dass er haupsächlich aus
Speiseresten besteht. Er veröffentlichte erstmalig Zeichnungen von Bakterien aus
menschlichen Zahnbelägen.
Biofilme sind nicht nur für 65 % aller vorkommenden Infektionserkrankungen in der
industrialisierten Welt verantwortlich, sondern verursachen Millionenschäden in
Industrie und Technik durch Besiedelung von Tanks und Leitungssystemen aller
Art. Aus hygienischer Sicht sind Biofilme als Infektionsquellen von Bedeutung, da
sie einen geschützten Lebensraum für Krankheitserreger darstellen, die sich dort
ansiedeln und vermehren können. Das Leben im Biofilm kann eine erhöhte
Unempfindlichkeit dieser Pathogene gegenüber Antibiotika, Desinfektionsmitteln
oder Immunabwehr des Wirtes bewirken.
Auch die dentale Plaque stellt einen medizinisch wichtigen Biofilm dar. Sie gilt als
ätiologischer Faktor für Karies, Gingivitis und Parodontitis. Daher besteht großer
Bedarf, Informationen über das natürliche Biofilmwachstum und seine
dreidimensionale Struktur zu erhalten, um das Entstehen und Fortschreiten dieser
Erkrankungen zu verhindern. Hierbei spielen auch die Dicke und die Verteilung
von lebenden und toten Bakterien (Vitalität) in den verschiedenen Biofilmschichten
eine entscheidende Rolle.
Die bakterielle Adhärenz auf oralen Oberflächen wurde bereits in In vitro-Studien
untersucht. Dabei wurde versucht, die Bedingungen in der Mundhöhle zu
imitieren. Die menschliche Mundhöhle ist jedoch wegen ihrer Vielzahl an
verschiedenen Mikroorganismen, Scherkräften und antibakteriellen Eigenschaften
EINLEITUNG 5
des Speichels nicht mit In vitro-Untersuchungsbedingungen zu vergleichen. Es ist
daher für eine genauere Untersuchung des Biofilms notwendig, In situ-Modelle zu
etablieren. Die Erforschung des unbeschädigten Biofilms wird durch das konfokale
Laser-Scanning-Mikroskop (CLSM) bzw. durch Kopplung mit der
Vitalfluoreszenztechnik ermöglicht.
Aufgrund der sehr aufwändigen Methode zur Biofilmgewinnung über intraorale
Schienen existieren bisher nur wenige Daten über Biofilmdicke und -vitalität.
Ziel dieser Studie war es somit, mittels der oben genannten Techniken, die Dicke
und Vitalitätsverteilung von in situ Biofilmen in Abhängigkeit von der Lokalisation
und der Zeit zu untersuchen.
6
2 LITERATURÜBERSICHT
2.1 DER BIOFILM
2.1.1 CHARAKTERISTIKA VON BIOFILMEN
Die klassische Mikrobiologie ging lange Zeit davon aus, dass Bakterien als
Einzellebewesen in einem flüssigen Medium leben, welches sie auch ernährt.
Biofilm-Forschungen haben aber gezeigt, dass unter den meisten natürlichen
Umweltbedingungen der Biofilm die vorherrschende Lebensform der Bakterien ist
(Watnick und Kolter 2000). Die Fähigkeit von Bakterien, strukturierte
Gemeinschaften zu bilden, bietet ihnen den Vorteil, Nährstoffe zu akkumulieren
und wiederzuverwerten, sich gegen äußere Einflüsse zu schützen, sowie leicht
Signale und Gene austauschen zu können. Biofilme lassen sich als erster Schritt
der Evolution zu vielzelligen Organismen verstehen (Flemming und Wingender
2001a).
Allen Biofilmen ist gemeinsam, dass die Mikroorganismen in eine Matrix aus
extrazellulären polymeren Substanzen (EPS) eingebettet sind, die die Haftung an
Oberflächen ermöglicht und sie zusammenhält (Flemming und Wingender 2001a).
Biofilme entstehen prinzipiell an allen Grenzflächen zweier Phasen. Das bedeutet,
dass sie sich nicht nur an der Grenzfläche zwischen Wasser und festen Medien
entwickeln können, sondern auch zwischen Wasser und Luft sowie zwischen
Feststoff und Atmosphäre, wie z.B. an natürlichem Gestein oder an Mauern.
Gewisse Grundvoraussetzungen müssen für die Entstehung von Biofilmen aber
erfüllt sein: Das Vorhandensein von Grenzflächen, ausreichend Wasser, mikrobiell
verwertbare Nährstoffe und die Mikroorganismen selbst. Da diese Bedingungen
praktisch ubiquitär sind, sind Biofilme in der Natur, in technischen Systemen und
im medizinischen Bereich weit verbreitet (Costerton et al. 1987).
Auch die dentale Plaque wird aus heutiger Sicht zu den bakteriellen Biofilmen
gezählt (Caldwell et al. 1997; Netuschil et al. 1998).
Bakterienzellen im Verband des Biofilms verhalten sich völlig anders als dieselbe
Spezies in freibeweglicher (planktonischer) Form. Einige Autoren weisen darauf
hin, dass die Plaque in Form von Biofilmen untersucht werden muss und nicht als
LITERATURÜBERSICHT 7
Einzelbakterien, die in einer Lösung vorliegen („dispersed“ bzw. „planctonic“)
(Sissons et al. 1996; Wilson et al. 1996).
Der Metabolismus solcher Biofilm-Zellen untereinander ist sehr unterschiedlich
und hängt von der Lokalisation jeder einzelnen Zelle in verschiedenen
Zellschichten ab, die den Biofilm bilden (Costerton und Lewandowski 1995).
Zellen, die in den oberen Regionen des Biofilms angesiedelt sind, haben leichter
Zugang zu Nahrung und Sauerstoff und haben weniger Probleme ihre
Abfallprodukte zu beseitigen. Diese Zellen sind stoffwechselaktiv und besitzen
eine normale Größe. Zellen der Biofilmoberfläche scheinen sehr ähnliche
Eigenschaften zu haben wie planktonisch gewachsene Zellen. Im Gegensatz dazu
ist bei Zellen, die in eine Matrix aus extrazellulären Polysacchariden eingebettet
sind, der Stoffwechsel aufgrund eines geringeren Nahrungs- und
Sauerstoffangebots reduziert. Solche Biofilmzellen sind an ihre Umgebung, die
durch eine Ansammlung von metabolischen Abfallprodukten charakterisiert ist,
angepasst. Im Biofilm eingebettete Zellen befinden sich in einer ruhenden Phase
und sind kleiner als die Zellen der Biofilmoberfläche, die Zellteilungsrate ist
verringert (Anwar et al. 1992).
Dieses unterschiedliche Verhalten der Bakterienzelle in Abhängigkeit von der
Lokalisation spielt z.B. bei der Gabe von Antibiotika eine Rolle. Die Empfindlichkeit
einer im Biofilm eingebetteten Bakterienzelle gegenüber antibiotischen
Substanzen ist im Vergleich zu freibeweglichen oder an der Biofilmoberfläche
gelegenen Bakterien deutlich herabgesetzt. Ein sequenzieller Abbau dieser
Substanzen findet im Biofilm leichter statt, weil die Nutzung auch schwer
abbaubarer Substrate durch die Zusammenarbeit verschiedener Spezialisten im
Biofilm möglich ist. Die Antibiotika-Moleküle werden zum einen an die von den
Biofilmzellen gebildeten extrazellulären Polysaccharide gebunden und durch
spezielle Enzyme inaktiviert. Außerdem sind Biofilmzellen, die als langsam
wachsene Zellen gelten, generell weniger empfindlich gegenüber Antibiotika,
vermutlich weil die Membran dieser Zellen weniger durchlässig ist (Anwar et al.
1992). Insgesamt bietet der Biofilm den Mikroorganismen die Möglichkeit, auch
unter schwierigen Umgebungsbedingungen zu überleben.
LITERATURÜBERSICHT 8
2.1.2 ROLLE DER EXTRAZELLULÄREN POLYMEREN SUBSTANZEN (EPS)
Die extrazellulären polymeren Substanzen (EPS) stellen die Schlüsselmoleküle für
die Vereinigung von Mikroorganismen zum Biofilm dar. Eigenschaften der EPS
sind von wesentlicher Bedeutung für die Zusammensetzung, Struktur und
Funktion der Biofilme. Allen Biofilmen ist gemeinsam, dass die EPS sie
zusammenhalten, ihnen Form verleihen und für die physikalischen Eigenschaften
des Biofilms verantwortlich sind (Anwar et al. 1992; Flemming und Wingender
2001a). Sie vermitteln auch die Bindung an Oberflächen (Anwar et al. 1992;
Flemming und Wingender 2001a). Die EPS bilden meistens eine hoch
hydratisierte heterogene Schleim-Matrix, die wie ein schwammähnliches Gel
aufgebaut ist und so die Mikroorganismen in ihrer dreidimensionalen Anordnung
fixiert. Die EPS bestehen überwiegend aus geladenen (meist anionischen) oder
neutralen Polysacchariden und Proteinen, es können jedoch auch Anteile von
Nucleinsäuren, Lipiden und anderen Makromolekülen enthalten sein (Flemming
und Wingender 2001b). Geladene Gruppen der Polymere (z.B. Carboxylgruppen
von Uronsäuren) sowie Substituenten (z.B. Acetylgruppen in Polysacchariden)
beeinflussen ihre physikalisch-chemischen Eigenschaften wie Festigkeit,
Viskosität und Wasserbindungskapatzität. Für polysaccharidhaltige Strukturen wie
Kapseln oder Schleime wurde der Begriff „Glykokalix“ eingeführt (Costerton et al.
1987). Zellteilungen innerhalb dieser Glykokalix-Matrix resultieren in der Bildung
von Mikrokolonien. Durch Ansteigen von Größe und Anzahl der anhaftenden
Mikrokolonien bilden sich etablierte Biofilme aus (Caldwell und Lawrence 1986;
Costerton et al. 1987).
2.1.3 BIOFILME UND GESUNDHEIT
Intakte Biofilme, wie sie auf der Haut, im Darm und in Schleimhäuten vorkommen,
sind von grundlegender Bedeutung für die menschliche Gesundheit. Geraten
diese Biofilme aus dem Gleichgewicht, können schwerwiegende Krankheiten
entstehen. Biofilme können auch als unerwünschte Biofilmbildung (sogenanntes
„Biofouling“) große Schwierigkeiten hervorrufen. Besonders problematisch sind sie
LITERATURÜBERSICHT 9
in medizinischen Geräten und auf Implantaten, wo sie Ursache für
lebensbedrohliche Infektionskrankheiten sein können (Costerton et al. 1987).
Patienten mit der Erbkrankheit der Mukoviszidose können sich mit
schleimbildenden Bakterien der Art Pseudomonas aeruginosa infizieren, die das
geschwächte Epithel in Form von Biofilmen besiedeln. Diese Biofilme können aber
durch die humoralen sowie zellulären Immunabwehrmechanismen nicht entfernt
werden. Auch in Biofilmen von Hausinstallationen können sich typische
Wasserbakterien mit pathogenem Potential (opportunistische Krankheitserreger)
ansiedeln, wie zum Beispiel Legionellen oder Pseudomonas aeruginosa
(Flemming und Wingender 2001a).
Die dentale Plaque gilt als wichtigster ätiologischer Faktor für die Entstehung von
Karies, Gingivitis und Parodontitis (Löe et al. 1965; Theilade et al. 1966; Theilade
1989). Bei fehlender Mundhygiene und häufiger Saccharosezufuhr lassen sich
innerhalb von 23 Tagen erkennbare kariöse Veränderungen erzeugen. Diese
Frühveränderungen sind reversibel (Von der Fehr et al. 1970). Die Beziehung
zwischen Plaque und Gingivitis ist ebenfalls klar. Wenn bei gereinigten
Zahnoberflächen, die von gesunder Gingiva umgeben sind, jegliche Mundhygiene
eingestellt wird, so entwickelt sich innerhalb von drei Tagen eine subklinische
Gingivitis und innerhalb von 10-21 Tagen eine klinisch feststellbare Gingivitis (Löe
et al. 1965; Theilade et al. 1966; Löe et al. 1967; Jensen et al. 1968). Diese
Gingivitis ist reversibel, wenn die Plaque durch Zähneputzen oder durch
Anwendung einer antibakteriellen Spüllösung, wie z.B. Chlorhexidin, wieder
entfernt wird (Löe 1970).
Besonders die Parodontitis beeinflusst als orale Infektion den Verlauf und die
Pathogenität einer Reihe systemischer Erkrankungen. Die mikrobielle Besiedelung
der Mundhöhle gilt als primäre Ursache für Parodontitiden, die einen Nährboden
für die Vermehrung parodontalpathogener Keime darstellt. Ihre Ätiologie und
Pathogenese wird jedoch als multifakoriell angesehen und durch ein komplexes
Zusammenspiel angeborener, erworbener und verhaltensbedingter Faktoren
bestimmt (Dörfer 2002).
LITERATURÜBERSICHT 10
2.1.4 DIE ENTWICKLUNG DES DENTALEN BIOFILMS
2.1.4.1 PELLIKELBILDUNG
An der Phasengrenze zwischen Zahnoberfläche und Mundhöhle kommt es durch
die Adsorption von Proteinen und anderen Makromolekülen aus dem Speichel zur
Ausbildung einer Biopolymerschicht (Norde 1984), welche auch Pellikel oder
pellicula dentis genannt wird (Dawes et al. 1963; Zuhrt 1964).
Die Bildung dieser dünnen Schicht (0,1-1 µm) beruht auf der selektiven Adsorption
spezifischer Speichelproteine, wie sauren prolinreichen Proteinen, Glykoproteinen,
Serumproteinen, Enzymen und Immunglobulinen, welche aufgrund des
Speichelflusses in hoher Menge vorhanden sind (Hannig 1993; Hannig 1997).
Das Adsorptionsverhalten der Proteine wird in erster Linie über elektrostatische
Anziehungskräfte bestimmt, die aufgrund ihrer Eigenladungen an die
Kalziumionen und Phosphatgruppen des Apatits der Zahnhartsubstanzen binden
(Hay 1973; Rölla und Bowen 1978).
Es spielen aber auch andere Bindungsarten wie Wasserstoffbrückenbindungen,
van der Waal´s Kräfte und hydrophobe Wechselwirkungen eine Rolle (Pruitt 1977;
Glantz und Larsson 1981; Gorbunoff und Timasheff 1984).
Die Pellikel schützt als semipermeable Membran vor einem Verlust von Kalzium
und Phosphat, indem der Ionenfluss reduziert wird (Schüle 1961; Zahradnik et al.
1976). Außerdem verringert sie den Einfluss einwirkender Säuren. Sie bietet so
einen Schutz vor Demineralisation und damit auch vor Karies (Meckel 1965;
Weiss und Bibby 1966; Arends et al. 1986). Eine weitere Funktion ist die
Herabsetzung der Friktion antagonistischer Zahngruppen. So bietet die Pellikel
den Zähnen Schutz vor Abrasion und Attrition (Mayhall 1980; Nikiforuk 1985).
Neben diesen positiven Eigenschaften hat die Pellikel jedoch den Nachteil, dass
ihre Bildung eine Veränderung der physikalischen und chemischen Eigenschaften
der Schmelzoberfläche bewirkt, wodurch den Bakterien ein Anheften an die
pellikelbedeckte Oberfläche ermöglicht wird. (Pruitt et al. 1969; Van Pelt et al.
1983). Sie ist damit Ausgangspunkt der Biofilmbildung.
LITERATURÜBERSICHT 11
2.1.4.2 BAKTERIELLE BESIEDELUNG
Für zahlreiche Arten von Mikroorganismen stellt die Mundhöhle ein natürliches
Biotop dar. Die Fähigkeit oraler Mikroorganismen, an der Zahnoberfläche zu
adhärieren, ist von großer Bedeutung für die weitere bakterielle Akkumulation und
Proliferation und damit auch für die Pathogenität des Zahnbelages (Van Houte et
al. 1970; 1971; Gibbons und Van Houte 1975).
Der erste Schritt der bakteriellen Kolonisation besteht in der Anheftung der
Mikroorganismen an die pellikelbedeckte Schmelzoberfläche. Bei diesem Vorgang
ist es erforderlich, dass die Mikroorganismen unter den hydrodynamischen
Bedingungen des oralen Milieus irreversibel adhärieren und anschließend
proliferieren können (Marsh und Bradshaw 1995). Bei den anfänglich auf der
Zahnoberfläche anhaftenden Bakterien handelt es sich um verschiedene
Streptokokkenarten, vor allem S. sanguis und in geringerem Umfang S. mitis und
S. mutans (Van Houte et al. 1970; Rönström et al. 1977; Socranscy et al. 1977;
Theilade et al. 1982; Liljemark et al. 1986). Neben den verschiedenen
Streptokkokenspezies zählen auch grampositive Stäbchenbakterien zu den
„Erstbesiedlern“ (Socranscy et al. 1977; Nyvad und Kilian 1987). Zu den
vorherrschenden stäbchenförmigen Mikroorganismen der Initialplaque zählen die
Aktinomyzeten, wie A. naeslundii und A. viscosus (Rönström et al. 1977;
Socranscy et al. 1977; Theilade et al. 1982; Liljemark et al. 1986; Nyvad und Kilian
1987).
2.1.4.3 REIFUNG DER PLAQUE
Durch weitere Ansiedlung von Bakterien und durch Zellteilung kommt es zur
Bildung von Mikrokolonien. In dieser Phase der mikrobiellen Akkumulation wird die
Bildung der extrazellulären polymeren Substanzen (EPS) ausgelöst (Costerton
und Lewandowski 1995). Die Bakterien reagieren, nachdem sie einen sessilen
Zustand eingenommen haben mit einer Änderung ihrer Genaktivität, was zu
Veränderungen der Stoffwechselaktivität und Zellstruktur führt (Davies et al. 1993;
LITERATURÜBERSICHT 12
Hoyle et al. 1993). Dies stellt ein deutliches Unterscheidungsmerkmal zu
„planktonischen“ Bakterien dar.
Biofilme erreichen aber keine unbegrenzte Dicke, sondern es stellt sich ein
Gleichgewicht zwischen Neubildung und Ablösung im Biofilm ein. Durch
Scherkräfte werden Biofilmmikroben passiv als einzelne Zellen abgelöst
(„Erosion“) oder es kommt zur Ablösung ganzer Biofilmfetzen. Dies bezeichnet
man als so genanntes „Sloughing“ (Flemming und Wingender 2001a). Es gibt
auch Hinweise, dass Bakterien befähigt sind, den Verband des Biofilms als
„Schwärmerzellen“ aktiv zu verlassen und an anderen Stellen neue Biofilme zu
bilden beginnen. Ein Mechanismus, der die Freisetzung solcher Zellen aus dem
Biofilm erlaubt, funktioniert folgendermaßen: Diese Bakterien scheiden Enzyme
aus, welche Strukturpolysaccharide im Bereich der Zelle abbauen und so eine
Loslösung des Bakteriums aus dem Biofilmverband ermöglichen (Allison et al.
1998) .
Im Lauf der Zeit verändert sich die Zusammensetzung der Plaque. Bis ungefähr
zum vierten Tag besteht die Plaque hauptsächlich aus grampositiven Kokken.
Nach und nach gesellen sich grampositive und gramnegative Stäbchen hinzu.
Zuletzt sind die Spirochäten als Besiedler zu nennen. Der Charakter der
Plaqueflora ändert sich von aerob zu anaerob (Löe et al. 1965).
Es ist ebenfalls bekannt, dass mikrobielle Populationen sich in verschiedenen
Zustandsstadien befinden können. Dies bedeutet, die Bakterien können sich in
einer schnellen oder langsamen Wachstumsphase befinden, schlafen oder auch
tot sein (Roszak und Colwell 1987a; Roszak und Colwell 1987b). Dies trifft auch
auf die Plaquebakterien zu (Netuschil et al. 1989; Sissons et al. 1991). Es gibt
jedoch nur wenige Daten, die den Vitalitätszustand unter Berücksichtigung der
dreidimensionalen Struktur intakter oraler Biofilme wiedergeben (Auschill et al.
2001; 2002; Zaura-Arite et al. 2001).
2.1.5 DERZEITIGES BIOFILM-MODELL
Die meisten Biofilme in aquatischen Systemen sind mehr oder weniger heterogen
aufgebaut. Bakterien lagern sich als Mikrokolonien übereinander und werden
LITERATURÜBERSICHT 13
durch die EPS zusammengehalten. Sie bilden dabei pilzähnliche Strukturen, die
von der Aufwuchsoberfläche in die umgebende Wasserphase reichen. Der Biofilm
ist von Poren und Kanälen durchzogen, welche den konvektiven Stofftransport im
Biofilm ermöglichen. So werden auch diejenigen Organismen mit Nährstoffen
versorgt, die in der Tiefe des Biofilms angesiedelt sind (Costerton und
Lewandowski 1995). Die Anzahl der interstitiellen Kanäle nimmt im Lauf der Zeit
wegen veränderter Fließeigenschaften und verminderter Austauschprozesse ab.
Die Gesamtstruktur des Biofilms ist letztendlich von der Fließgeschwindigkeit des
Systems abhängig. Es wird angenommen, dass die oberen Biofilmlagen
miteinander verbunden sind und brückenartige Strukturen bilden (Roberts et al.
1999).
Charakteristisch für Biofilme ist die relativ hohe Zelldichte im Vergleich zur
Umgebung. Biofilme an aquatischen Standorten können bis zu 1012 Zellen pro
Milliliter Biovolumen enthalten. Dies sind Konzentrationen, die um den Faktor 103
bis 104 höher liegen als in einer freien wässrigen Phase bzw. in einer Labor-
Flüssigkultur (Flemming und Wingender 2001a).
2.2 UNTERSUCHUNG VON BIOFILMEN
Die Erforschung des Biofilms wird von Robinson et al. (1997) als extrem schwierig
beschrieben, da die Biofilme sehr dünn sind. Des weiteren ist die Benutzung von
chemischen und radioaktiven Markern in der menschlichen Mundhöhle nicht
akzeptabel. Wird diese empfindliche Plaqueschicht zu Untersuchungszwecken
mechanisch von der Zahnoberfläche entfernt, so führt dies zum Zerreißen des
Biofilms (Sandig et al. 1988), der danach nicht mehr die gleiche Struktur und das
gleiche Verhalten wie der unverletzte Biofilm aufweist.
Für die Forschung ist es daher wichtig, auf in situ gebildete Biofilm-Proben
zurückgreifen zu können. Dies bedeutet, dass diese Biofilme direkt in der
Mundhöhle gebildet und unversehrt der weiteren Untersuchung zugeführt werden
sollten. Nur auf diesem Weg ist eine unverfälschte Aussage über die
Zusammensetzung und das Verhalten der Plaque möglich.
LITERATURÜBERSICHT 14
Um direkt gebildete Biofilm-Proben zu erhalten sind verschiedene Arten von
Trägersystemen beschrieben.
Die Methoden zur Plaquegewinnung in vivo gingen von der Extraktion der Zähne
(Mc Dougall 1963; Christ 1984) über das Aufkleben von MYLAR-Folien (Theilade
1964) oder eines Plast-Spray-Films auf Zähne (Brecx et al. 1981; 1983; 1987;
1994) bis hin zu herausnehmbaren Modellguss- oder Kunststoffschienen, die mit
kleinen Trägerplättchen bestückt waren (Baier und Glantz 1978; Macpherson et al.
1990; Hahn et al. 1992; Leonhardt et al. 1995; Thomson et al. 1996; Auschill et al.
2001; 2002).
Meyerowitz et al. (1991), Liljemark et al. (1993), Robinson et al. (1997) und Wood
et al. (2000) erhielten ihre in vivo gebildeten Plaqueproben mit Hilfe von
festsitzenden Apparaturen ähnlich dem Bracket–System aus der Kieferorthopädie.
Als Trägerplättchen zur Gewinnung eines in situ Biofilms eignen sich neben
Schmelzproben (Macpherson et al 1990; Thomson et al. 1996) ebenso
Glasplättchen. Wie Netuschil et al. (1998) feststellten, besteht kein wesentlicher
Unterschied im Plaquewachstum zwischen Glas und Schmelz. Da Schmelz jedoch
eine Eigenfluoreszenz besitzt (Netuschil et al. 1998), könnte sich dies in
Verbindung mit der Vitalfluoreszenztechnik, die in der vorliegenden Studie
verwendet wird, nachteilig auf die Untersuchung auswirken.
2.3 VITALFLUORESZENZTECHNIK
Die Vitalfluoreszenztechnik bietet die Möglichkeit tote von vitalen Bakterien zu
unterscheiden. Diese in den folgenden Versuchen verwendete Technik beruht auf
einem in der Zahnmedizin erstmals von Netuschil (1983) beschriebenen Prinzip:
Zellen werden mit Fluoresceindiacetat (FDA) angefärbt. FDA, ein sogenanntes
Fluorogen fluoresziert nicht selbst, sondern wird von der Zelle aufgenommen. Im
Stoffwechsel eukaryontischer Zellen wie auch von Bakterien wird es enzymatisch
zu einer grün fluoreszierenden Substanz, dem Fluorescein, abgebaut. Dieses
kann die Zelle jedoch nicht mehr verlassen, so dass es in ihr akkumuliert. Da die
Bildung von Fluorescein an den aktiven Stoffwechsel der Zelle gebunden ist,
werden nur lebende Zellen auf diese Weise grün angefärbt, die toten Zellen
LITERATURÜBERSICHT 15
fluoreszieren nicht. Um diese toten Zellen auch sichtbar erscheinen zu lassen,
erfolgt eine Gegenfärbung mit Ethidiumbromid (EB). Es gelangt nur in Zellen mit
nicht mehr vollständig intakter Zellmembran und bindet sich rot fluoreszierend an
die Nukleinsäuren.
Die Vitalfluoreszenztechnik wurde bereits in zahlreichen Studien verwendet
(Netuschil et al. 1989; Brecx et al. 1990; Rundegren et al. 1992; Arweiler et al.
2001a) und gilt als anerkannte Methode, um tote von lebenden Zellen zu
unterscheiden. In Kombination mit der konfokalen Laser-Scanning-Mikroskopie
bietet die Vitalfluoreszenztechnik die Möglichkeit, intakte orale Biofilme, die auf
Trägermaterialien in der Mundhöhle gewachsen sind, zu untersuchen und
Aussagen über die Vitalitätsverteilung im Biofilm zu treffen (Netuschil et al. 1998;
Auschill et al. 2001, 2002; Zaura-Arite et al. 2001).
2.4 KONFOKALE LASER-SCANNING-MIKROSKOPIE
Die konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie (CLSM) ist eine zerstörungsfreie
pseudo-dreidimensionale Technik der mikroskopischen Tomographie (Watson
1991). Konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie gilt seit längerem als
Standardverfahren in der Zellforschung zur Detektion fluoreszenz-markierter
Areale. Seit kurzem wird dieses Verfahren auch in der Hartgewebsforschung zur
Untersuchung (unsektionierter Zähne ebenso wie von Zahnschliffen) genutzt
(Grötz et al. 1996; Duschner 2001). Diese Technik eignet sich zur Analyse
natürlich feuchter Proben und wird erst seit einigen Jahren verstärkt zur optischen
Untersuchung von Biofilmen eingesetzt (Watson 1991). Da das CLSM keine
Fixation oder sonstige Bearbeitung von Proben voraussieht, bietet es den großen
Vorteil, dass die Biofilmproben intakt und unzerstört bleiben (Lawrence et al. 1991;
Costerton und Lewandowski 1995). Mit der Technik der CLSM ist die Möglichkeit
gegeben, Präparate ohne vorherige Bearbeitung unzerstört darzustellen (Grötz et
al. 1995). Somit kann die Entstehung von physikalisch-chemischen Artefakten
(Gewebefixierung, Probenlagerung) und Präparationsartefakten (Herstellung von
Schnitten und Schliffen) vermieden werden (Grötz et al. 1996).
LITERATURÜBERSICHT 16
Im Gegensatz dazu müssen Zellstrukturen für die Untersuchung unter dem
Elektronenmikroskop (TEM, REM) erst präpariert werden. Das heißt, sie werden
fixiert, bevor man die Zellen entwässert und dann für das Transmissions-
Elektronenmikroskop mit Kunststoffen (Epoxide oder Methacrylate) imprägniert
und ultradünne Schnitte anfertigt. Für das Raster-Elektronenmikroskop müssen
die Proben nach dem fixieren und entwässern nicht in Kunstharz eingebettet
werden, jedoch muss die Präparatoberfläche mit einer dünnen leitenden
Metallschicht belegt werden, um statische Aufladungsphänomene zu vermeiden
(Plattner und Hentschel 1997).
Im Gegensatz zu Standardverfahren der Auflichtmikroskopie beruht die
Bildentstehung bei der CLSM auf einem indirekten Verfahren. Ein fein fokussierter,
fast monochromatischer Laserstrahl rastert über die Probenoberfläche. Die aus
den erleuchteten Bereichen der Probe remittierte Strahlung gelangt über eine
kleine konfokale Blende auf einen Detektor und wird ihrer Intensität nach
gemessen. Die Lochblende, die zur Fokusebene konjugiert (konfokal) angeordnet
ist, sorgt dafür, dass sämtliches Licht, das nicht aus dieser Ebene stammt, auch
nicht vom Detektor erfasst werden kann.
Durch schrittweises Verfahren der Höhenposition des Objekttisches wird eine
tomographische Serie von Einzelbildern parallel zur Oberfläche erhalten (Grötz et
al. 1996). Mit Unterstützung eines Rechners entsteht durch Zusammensetzen
dieser Serienschnitte ein dreidimensionales Bild des Biofilms. Die Probe kann
ebenfalls als Seitschnitt durch den Biofilm (z-Achse) und als Bildergalerie
dargestellt werden.
18
3 VERSUCHSPLANUNG
3.1 VORVERSUCH
Da die Penetrationsfähigkeit der Farbstoffe durch den Biofilm bisher noch nicht
explizit nachgewiesen wurde, sollte in einem Vorversuch die Färbetechnik der
Vitalfluoreszenzfärbung auf in situ Biofilmen etabliert werden. Dazu wurden
Bakterienstämme ausgewählt, die als Erstbesiedler initialer Plaque gelten.
Die Fragestellung war, ob vitale Biofilme auch als vital im CLSM erkannt werden,
das heißt ob der Farbstoff Fluoresceindiacetat (FDA) ausreichend durch den
Biofilm penetriert und insbesondere auch die tieferen Schichten erreicht.
Es wurden in vitro 8 und 24 Stunden alte Biofilme gezüchtet. Es wurde
vorausgesetzt, dass die 8 Stunden alten Biofilme weitestgehend vitale Bakterien
enthielten, da sie ausreichend mit Nährstoffen versorgt waren und sich zu diesem
Zeitpunkt in der exponentiellen Phase bezüglich ihrer Wachstumskurve befanden.
In den 24 Stunden alten Biofilmen haben die Bakterien die exponentielle Phase
bereits verlassen, so dass vermehrt abgestorbene Bakterien im Biofilm zu
erwarten waren.
Die Biofilme wurden zu vorgegebener Zeit mit Vitalfluoreszenzfärbung gefärbt und
direkt danach im CLSM untersucht.
VERSUCHSPLANUNG 19
3.2 VERSUCH 1: ABHÄNGIGKEIT DER BIOFILMBILDUNG VON DER
LOKALISATION
Ziel des ersten Versuchsabschnittes war es, zu ermitteln, in welchen
Kieferabschnitten am meisten Plaque gebildet wird und ob dies unter
standardisierten Bedingungen möglich ist. Es wurden für 8 Probanden
herausnehmbare Kunststoff-Draht-Schienen für Ober- und Unterkiefer angefertigt.
An den Bukkalflächen und auf einem Palatinalband wurden insgesamt 15
Glasplättchen als Trägermaterial befestigt. Die Schienen wurden im Ober- und
Unterkiefer gleichzeitig für 48 Stunden getragen. Während der Zahnreinigung und
den Mahlzeiten wurden die Schienen in physiologischer Kochsalzlösung gelagert.
Die Reinigung der Zähne war in dieser Zeit nur mit Zahnbürste und Wasser
erlaubt. Vor der Auswertung unter dem CLSM wurden die Probekörper einzeln
entnommen und sofort mittels der Vitalfluoreszenztechnik gefärbt. Mit dem CLSM
wurden digitale Bilder der einzelnen Biofilmschichten angefertigt, mit deren Hilfe
die Biofilmdicke und die Vitalität in den Biofilmschichten ermittelt werden konnte.
Fließschema der Methoden und Schritte im Versuch 1:
Einsatz
an verschiedenen
Lokalisationen
bei 8 Probanden
Entnahme
Ermittlung der
Probendicke
Ermittlung der Vitalität
Herstellung von in den Mundraum einsetzbaren
Schienen/Splints zur Plaque-Kollektion
Verbleib im Mundraum
für 48 h
Vitalfärbung der nativen
unzerstörten Plaque (ex
vivo), Untersuchung
unter CLSM
VERSUCHSPLANUNG 20
3.3 VERSUCH 2: ABHÄNGIGKEIT DER BIOFILMBILDUNG VON DER ZEIT
Ziel des zweiten Versuchsabschnittes war es, von 12 Probanden die gesammelte
Plaque nach unterschiedlich langer Tragezeit (1 bis 7 Tage) auf Vitalität und
Biofilmdicke hin zu untersuchen. Für diesen Versuchsabschnitt wurden nur noch
die Oberkieferschienen verwandt. Diese wurden so verändert, dass nun je
Schiene sechs bukkale Probeplättchen befestigt werden konnten. Die
Untersuchung der Biofilmbildung über die 7 Tage erfolgte in zwei Tragezyklen.
Im ersten Tragezyklus wurden die Schienen drei Tage getragen, wobei jeden Tag
jeweils zwei Probeplättchen (rechts und links) entnommen wurden. In einem
zweiten Tragezyklus mussten die Schienen 7 Tage getragen werden. Nach 4, 5,
und 7 Tagen wurden ebenfalls jeweils zwei Plättchen (rechts und links)
entnommen. Die Proben wurden analog Versuch 1 verarbeitet und untersucht.
Fließschema der Methoden und Schritte im 2. Versuch:
Einsatz
an den Bukkalflächen
des OK
bei 12 Probanden
Entnahme nach 1, 2, 3, 4, 5 und 7 Tagen
Ermittlung der
Probendicke
Ermittlung der Vitalität
Herstellung von in den Mundraum einsetzbaren
Schienen/Splints zur Plaque-Kollektion
Verbleib im Mundraum
für 1 bis 7 Tage
Vitalfärbung der nativen
unzerstörten Plaque (ex
vivo), Untersuchung
unter CLSM
21
4 MATERIAL UND METHODE
4.1 VORVERSUCH
4.1.1 PROBEPLÄTTCHEN
Als Probeplättchen wurden Glasscheiben mit einer Dicke von 4 mm und einem
Durchmesser von 10 mm verwendet. Die Oberflächen der Glasscheiben waren
alle auf die gleiche Weise poliert (4000 grid) (Roland Vetter Laborbedarf e. K.,
Ammerbuch, Deutschland).
4.1.2 BAKTERIENSTÄMME
Zur in vitro Biofilmzüchtung wurden folgende Bakterienstämme ausgewählt:
Streptococcus mutans
Streptococcus sanguis
Streptococcus mitis
Actinomyces naeslundii
sowie eine Mischung aller vier Bakterienstämme
4.1.3 VERSUCHSABLAUF
Zehn Rundbodenzentrifugenröhrchen wurden mit je einem Probeplättchen
bestückt und danach mit TSB (Trypticase-Soja-Boullion) gefüllt und 15 Minuten bei
121 °C autoklaviert.
Die Nährlösungen wurden mit je einem Bakterienstamm, bzw. der Mischung aus
allen vier Bakterienstämmen beimpft und bei 37 °C im Wärmeschrank deponiert.
Nach 8 bzw. 24 Stunden wurden die entstandenen Biofilme zur weiteren
Untersuchung entnommen.
MATERIAL UND METHODE 22
4.1.4 VITALFLUORESZENZFÄRBUNG
Zur Darstellung von vitalen und toten Bakterien im Biofilm musste zunächst eine
Färbelösung hergestellt werden. Aus zwei Stammlösungen (FDA:
Fluoresceindiacetat, Sigma Chemie, Taufkirchen: 5 mg/ml Aceton, -20°C und EB:
Ethidiumbromid, Sigma Chemie: 0,5 mg/ ml physiologische NaCl, 4°C) wurden je
5 µl in 1 ml vorgelegte physiologische Kochsalzlösung gegeben und sofort
gemischt. Von dieser Färbelösung wurden ca. 5 µl direkt auf die Plaqueprobe
gegeben und zwei Minuten gewartet, bis die Färbereaktion abgeschlossen war.
Danach wurde der so behandelte Biofilm vorsichtig in physiologischer
Kochsalzlösung abgewaschen und anschließend unter dem konfokalen Laser-
Scanning-Mikroskop untersucht.
4.1.5 KONFOKALES LASER-SCANNING-MIKROSKOP (CLSM)
Unmittelbar nach der Vitalfluoreszenzfärbung wurde die Untersuchung der
Biofilmproben unter dem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop (CLSM) (LSM 410
invert, Zeiss, Deutschland) durchgeführt.
Abbildung 4-1: Konfokales Laser-Scanning-Mikroskop
Die Biofilm-Proben wurden mit der Oberfläche nach unten in spezielle
Glaskammern (Lab-Tek II Chambered Coverglass # 1.5, Nalge Nunc International,
MATERIAL UND METHODE 23
USA) gelegt und während der gesamten Untersuchung unter 100-prozentiger
Feuchtigkeit gehalten. Die Analyse erfolgte unter einem Mikroskop, das mit einem
Argon Laser (excitation 488 nm, emission 510-525 nm) und einem Helium-Neon
Laser (excitation 546 nm, emission 590-610 nm) ausgerüstet war. Konfokale
Laserfluoreszenz-Bilder wurden durch eine Wasserobjektiv-Linse (C-Apochromat
40x/1,2 W, Zeiss, Oberkochen, Deutschland) erzeugt. Hierbei wurde das Objektiv
auf eine plaquebedeckte Stelle gerichtet. Der höchste und der tiefste Punkt der
Biofilmprobe, von dem kein Fluoreszenz-Signal mehr ausging, wurden bestimmt.
Von der äußersten Plaqueschicht bis zu der Glasoberfläche wurden alle 2 µm
optische Schnitte von 1 µm Dicke (Average 1) angefertigt (z-sectioning). Dieser
Abstand wurde gewählt, um Bakterienüberlappungen zu vermeiden.
4.1.6 ERGEBNISSE DES VORVERSUCHS
Bei der 8 Stunden alten Mischung der vier verschiedenen Bakterienstämme zeigte
sich nach Vitalfluoreszenzfärbung sehr viel grüner Farbstoff, was auf viele vitale
Bakterienzellen hinweist (siehe Abbildung 9-2). Dagegen gab es nur wenige rote
(tote) Zellen, die nur in den tieferen Schichten (nahe der Glasunterlage) zu finden
waren.
Nach 24 Stunden waren deutlich mehr rote Zellen im Biofilm erkennbar. Diese
waren wieder vornehmlich auf der Glasunterlage zu finden. Die weiter oben
gelegenen Schichten zeigten vermehrt grüne Bakterienzellen (siehe Abbildung
9-3).
Die Färbemethode hat sich zur Anfärbung von toten und lebenden Bakterien im
Biofilm als geeignet erwiesen und konnte für die beiden Hauptversuche verwandt
werden.
MATERIAL UND METHODE 24
4.2 VERSUCH 1
4.2.1 PROBANDEN
Nach entsprechender Information stellten sich für den ersten Versuch acht
Probanden im Alter von 23 bis 30 Jahren zur Verfügung. Das Durchschnittsalter
betrug 26,5 Jahre. Die Allgemeinanamnese aller Probanden war unauffällig. Als
Ausschlusskriterien galten die Verwendung von antibakteriellen
Mundspüllösungen und Antibiotika im letzten halben Jahr, die sich möglicherweise
störend auf die Plaquebildung ausgewirkt hätten. Die Probanden durften
desweiteren nicht Teilnehmer anderer Studien innerhalb der letzten 30 Tage
gewesen sein.
Um das Kariesrisiko der Probanden zu bestimmen, wurde der „plaque formation
rate index“ (PFRI) nach Axelsson 1990 erhoben und das Vorkommen von
Streptococcus mutans und Laktobazillen mit Hilfe eines Bakterientests (CRT
bacteria, Vivadent, Ellwangen, Deutschland) ermittelt. Zur Bestimmung des
PFRI´s wurde bei jedem Probanden eine professionelle Zahnreinigung
durchgeführt. Danach wurden sie angehalten, jegliche Mundhygiene einzustellen.
Nach 24 Stunden wurde der PFRI (plaque formation rate index) nach Axelsson
(1990) erhoben und die Probanden entsprechend ihrer Plaquebildung eingestuft.
Wie in Tabelle 4-1 dargestellt, erreichten zwei Probanden nach der PFRI-
Einteilung den Wert IV, die restlichen sechs Probanden den Wert V.
Somit standen vier Probanden mit geringer Kariesaktivität und vier Probanden mit
hoher Kariesaktivität zur Verfügung.
MATERIAL UND METHODE 25
Tabelle 4-1: Auflistung der Probanden aus Versuch 1 mit den ermittelten Werten des
Bakterientests und des PFRI und der sich daraus ergebenden Einstufung des Kariesrisikos.
Probanden SM-Wert PFRI Risiko-Einstufung Kariesrisiko
AD 0 IV a niedriges Kariesrisiko
NH 0 IV a „
SS 0 V a „
CD 0 V a „
OG 1 V c hohes Kariesrisiko
RS 1 V c „
NB 1 V c „
SR 3 V d „
4.2.2 PROBEPLÄTTCHEN
Als Probeplättchen wurden Glasscheiben mit einer Dicke von 1,5 mm und einem
Durchmesser von 3 mm verwendet. Die Oberflächen der Glasscheiben waren alle
auf die gleiche Weise poliert (4000 grid) (Roland Vetter Laborbedarf e. K.,
Ammerbuch, Deutschland).
4.2.3 SCHIENEN
4.2.3.1 MATERIALIEN ZUR HERSTELLUNG DER SCHIENEN
• Alginat-Abformmasse (blend-a-print, Elast-Alginat; Dentsply De Tray
GmbH, Konstanz, Deutschland)
• Abformlöffel (Algilock, Hager & Werken, Duisburg, Deutschland)
• Superhartgips (Fujirock®; GC Europe, Leuven, Belgien)
• PMMA-Kaltpolymerist (Orthocryl® tansparent, Pulver und Flüssigkeit;
Dentaurum, Pforzheim, Deutschland)
MATERIAL UND METHODE 26
• Rosa Zahnmodellierwachs (Associated Dental Products LTD, Purton,
Swindon, England)
• Draht 0,8 (Remanium® federhart; Dentaurum, Pforzheim, Deutschland)
• Draht 1,1 (Remanium® federhart; Dentaurum, Pforzheim, Deutschland)
• Drahtbügel 1,5 x 3,0 mm, hart (Renfert, Hilzingen, Deutschland)
• Klebewachs (Supradent-Wachs®, Chemisches Dentallabor Oppermann-
Schwedler, Bonn, Deutschland)
• Fräsen und übliche labortechnische Instrumente
4.2.3.2 GERÄTE ZUR HERSTELLUNG DER SCHIENEN
• Gips-Vakuumanrührgerät (Multivac®; Degussa)
• Gips-Rüttler (Vibrator®; Reco)
• Drucktopf (Polyclav®; Dentaurum)
4.2.3.3 HERSTELLUNG DER SCHIENEN
Von jedem Probanden wurde je ein Alginat-Abdruck von Ober- und Unterkiefer
genommen und mit Superhartgips ausgegossen.
Auf den Superhartgips-Modellen wurde jeweils eine Draht-Kunststoffschiene für
Ober- und Unterkiefer wie folgt hergestellt:
Zuerst wurden die bukkalen Approximalflächen der Seitenzähne (bei normaler
Verzahnung zwischen dem ersten und zweiten Prämolar, zwischen zweitem
Prämolar und erstem Molar und zwischen erstem und zweitem Molar) mit rosa
Zahnmodellierwachs auf einer Fläche von ca. 5 x 5 mm ausgeblockt.
Danach wurde ein 1,1 mm dicker federharter Draht entlang der Palatinal- bzw.
Lingualflächen der Zähne angepasst. Distal des letzten Molaren wurde der Draht
auf die Bukkalseite gebogen und als Retention auslaufend gestaltet. Dieses
Drahtgerüst diente als Verstärkung und durfte sowohl bei Okklusion als auch bei
Artikulation nicht stören. Als Retentionselemente wurden C-Klammern (federharter
MATERIAL UND METHODE 27
Draht mit einer Stärke von 0,8 mm) an die jeweiligen ersten Prämolaren gebogen.
Als nächstes wurde transparentes Kaltpolymerisat (Orthocryl® transparent) auf
das Drahtgerüst aufgebracht und im Drucktopf ausgehärtet. Nach Ausarbeitung
und Politur diente der bukkale Schienenbereich der Aufnahme von je drei Proben
pro Seite. Die palatinale bzw. linguale „Kunststoffverkleidung“ diente der Retention
und dem Tragekomfort.
In die Oberkieferschiene wurde zusätzlich ein Palatinalband (Draht 1,5 x 3 mm,
hart) eingearbeitet. In die zum Gaumen gelegene Seite des Palatinalbandes
wurden drei Vertiefungen (ca. 0,5 mm) eingeschliffen, die zur Aufnahme der
Proben dienten.
Den Probanden wurden die Schienen einprobiert und auf Druckstellen kontrolliert.
4.2.3.4 BESTÜCKUNG DER SCHIENEN
In jede Vertiefung der Schiene wurde jeweils ein sterilisiertes Glas-Probeplättchen
mit Klebewachs (Supradent-Wachs®, Chemisches Dentallabor Oppermann-
Schwedler, Bonn, Deutschland) befestigt. Pro Schienenpaar (OK und UK) somit
insgesamt 15 Probeplättchen: drei Plättchen auf jeder Seite und drei Plättchen
palatinal. Es wurde genauestens darauf geachtet, dass kein Klebewachs die zur
Plaqueanlagerung bestimmte Oberfläche verunreinigte. Die zu untersuchende
Oberfläche war dem bukkalen Approximalraum der Seitenzähne und der
Gaumenschleimhaut zugewandt und im Abstand von ca. 1 mm zur Schleimhaut
frei umspülbar angeordnet (siehe Abbildungen 4-2 und 4-3). Eine Störung der
Biofilmbildung durch Zunge und Wange konnte durch diese Platzierung der
Glasplättchen ausgeschlossen werden.
4.2.3.5 DESINFEKTION
Alle Probenoberflächen wurden nach der Befestigung in den Schienen mit 96 %-
igem Alkohol desinfiziert.
MATERIAL UND METHODE 28
4.2.4 KLINISCHER ABLAUF
4.2.4.1 VERFAHREN/ZEITRAUM
Abbildung 4-2: OK-Schiene in situ
Abbildung 4-3: UK-Schiene in situ
Abbildung 4-4: Seitenansicht der Schienen
Nach einer professionellen
Zahnreinigung wurden bei jedem
Teilnehmer die individuell
angefertigten Kunststoff-Draht-
Schienen in Ober- und Unterkiefer
eingesetzt. Beide Schienen mussten
für 48 Stunden kontinuierlich Tag und
Nacht getragen werden und durften
nur zu den Mahlzeiten und zum
Zähneputzen herausgenommen
werden.
Die Zwischenlagerung erfolgte in
physiologischer Kochsalzlösung. Zur
Mundhygiene waren nur Zahnbürste,
fluoridfreie Zahnseide und Wasser
erlaubt. Die Ober- und
Unterkieferschienen sind in situ in
den Abbildungen 4-2, 4-3 und 4-4
dargestellt.
MATERIAL UND METHODE 29
4.2.4.2 ENTNAHME DER PROBEN
Nach 48stündigem Trageintervall wurden die mit Plaque bedeckten Glasplättchen
vorsichtig aus der Schiene gelöst und bis zur weiteren Aufarbeitung kurzzeitig in
physiologischer Kochsalzlösung (bei Raumtemperatur) zwischengelagert.
4.2.5 VITALFÄRBUNG DER PROBEN
Die Vitalfluoreszenzfärbung der Proben wurde analog zu 4.1.4 durchgeführt.
4.2.6 KONFOKALES LASER-SCANNING-MIKROSKOP (CLSM)
Unmittelbar nach der Vitalfluoreszenzfärbung wurde die Untersuchung der
Biofilmproben unter dem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop (CLSM) wie unter
4.1.5 beschrieben durchgeführt.
Unser Versuchsparameter „Biofilmdicke“ (BD) ergab sich aus der Anzahl der
erhaltenen optischen Schnitte (ein Schnitt entpricht zwei µm Biofilmdicke).
Für die weitere Auswertung wurden alle gefertigten digitalen Bilder im TIF-Format
auf CD gebrannt.
4.2.7 AUSWERTUNG DER CLSM-DATEN
Um den Versuchsparameter „Vitalität der Biofilmbakterien“ (VF) zu erhalten,
wurden die auf CD gespeicherten Bilder und Bildserien zunächst am Computer
von TIF- in TGA-Format konvertiert (Adobe Photoshop 6.0). Die Bilder wurden
anschließend mittels eines automatisierten Bildanalyseprogrammes (FLOURO,
Fa.Medvis, Deutschland) auf die prozentuale Vitalität der Plaque hin untersucht.
Dieses Programm ist in der Lage, rote und grüne Pixel zu erkennen. Insgesamt
wird dann die Vitalität der Bakterien in % angegeben, dies entspricht dem Anteil
grüner Bakterien in der Gesamtprobe.
MATERIAL UND METHODE 30
4.2.8 STATISTISCHE ANALYSE
Die statistische Analyse erfolgte mittels SPSS 11.0. Für jede der 15 Lokalisationen
(OA-OF, UA-UF, PA-PC) wurde die mittlere Biofilmdicke ermittelt. Mittels ANOVA
wurden die Datenreihen auf signifikante Unterschiede zwischen den
Lokalisationen innerhalb des Oberkiefers, des Unterkiefers und des
Palatinalbandes überprüft. Dann wurden die Daten des OK, UK und des
Palatinalbandes (Pal) zusammengefasst. Da diese Mittelwerte OK, UK, Pal
signifikante Unterschiede aufwiesen (p≤0.05 mittels ANOVA) und normalverteilt
waren (überprüft mittels Kolmogorow-Smirnow-Test) wurde der gepaarte t-Test
angewandt.
Bei der Datenauswertung der Vitalität wurden die palatinalen Flächen aufgrund zu
geringer Plaquedicken nicht berücksichtigt.
Zunächst wurde für die Probanden anhand der Vitalität der einzelnen Schnitte eine
mittlere Vitalität pro Lokalisation errechnet. Mittels ANOVA zeigten sich keine
signifikanten Unterschiede zwischen den Lokalisationen (p>0,05). Die
unterschiedlichen Vitalitäts-Verteilungsmuster eines jeden Probanden sind nur
beschreibend dargestellt.
Auf Bonferroni Korrekturen konnte verzichtet werden (Perneger 1998).
4.3 VERSUCH 2
4.3.1 PROBANDEN
Für den zweiten Versuch wurden zwölf Probanden rekrutiert. Es stellten sich
sechs Teilnehmer aus Versuch 1 zur Verfügung, sechs Teilnehmer kamen neu
hinzu. Für diese galten die gleichen Ein- und Ausschlusskriterien wie unter 4.2.1
beschrieben. Die Probanden waren zwischen 21 und 29 Jahren alt, das
Durchschnittsalter betrug diesmal 25 Jahre.
Für die sechs weiteren Teilnehmer wurde ebenfalls das Kariesrisiko mittels des
PFRI und Bakterientests bestimmt. Ein Proband erreichte nach Einteilung des
PFRI den Wert II, einer den Wert III, drei Probanden den Wert IV und sieben den
MATERIAL UND METHODE 31
Wert V. Es standen somit sechs Probanden mit geringer Kariesaktivität und sechs
Probanden mit hoher Kariesaktivität zur Verfügung.
Tabelle 4-2: Auflistung der Probanden aus Versuch 2 mit den ermittelten Werten des Bakterientests und des PFRI und der sich daraus ergebenden Einstufung des Kariesrisikos.
Probanden SM-Wert PFRI Risiko-Einstufung Kariesrisiko
DR 0 II a niedriges Kariesrisiko
AD 0 IV a „
NH 0 IV a „
SS 0 V a „
CD 0 V a „
MM 0 V a „
MK 2 III c hohes Kariesrisiko
LH 1 IV c „
RS 1 V c „
NB 1 V c „
AL 2 V d „
SB 2 V d „
4.3.2 PROBEPLÄTTCHEN
Es wurden dieselben Probeplättchen wie in Versuch 1 verwendet: 1,5 mm dicke
Glasscheiben mit einem Durchmesser von 3 mm und einer polierten Oberfläche
(4000 grid) (Roland Vetter Laborbedarf e. K., Ammerbuch, Deutschland).
MATERIAL UND METHODE 32
4.3.3 SCHIENEN
Aufgrund der Ergebnisse in Versuch 1 sollten die Schienen im zweiten
Versuchsabschnitt nur im Oberkiefer getragen werden. Die palatinal platzierten
Probeplättchen wurden im zweiten Versuchsabschnitt nicht untersucht, so dass
die Palatinalbänder der bereits vorhandenen Oberkieferschienen vorher entfernt
wurden. Für die sechs neuen Probanden wurde auf die gleiche Weise, wie in den
Kapiteln 4.2.3.1 – 4.2.3.3 beschrieben, je eine Oberkieferschiene ohne
Palatinalband hergestellt.
4.3.3.1 BESTÜCKUNG DER SCHIENEN
In den Vertiefungen der Schiene wurde jeweils ein Glas-Probeplättchen mit
Klebewachs (Supradent-Wachs®, Chemisches Dentallabor Oppermann-
Schwedler), wie unter 4.2.3.4 beschrieben, befestigt.
4.3.3.2 DESINFEKTION
Alle Probenoberflächen wurden nach dem Befestigen mit 96%-igem Alkohol
desinfiziert.
4.3.4 KLINISCHER ABLAUF
4.3.4.1 VERFAHREN/ZEITRAUM
Die Schienen wurden den Teilnehmern im Oberkiefer eingesetzt. Diese wurden
über einen Zeitraum von drei Tagen getragen. Die Probanden mussten sich am 1.,
2. und 3. Tag dieses Tragezyklus zur selben Uhrzeit vorstellen, da jedes Mal ein
Probeplättchen auf jeder Seite entnommen und direkt im Anschluss ausgewertet
wurde.
MATERIAL UND METHODE 33
Danach wurden die Teilnehmer veranlasst, die OK-Schiene sieben Tage am Stück
zu tragen. In diesem zweiten Tragezyklus mussten sich die Probanden am 4., 5.
und 7. Tag zu vorgeschriebener Zeit vorstellen, damit wieder je ein Probeplättchen
auf jeder Seite entnommen und der Auswertung zugeführt werden konnte.
Wie in Versuch 1 sollten die Schienen kontinuierlich für Tag und Nacht getragen
werden und durften nur zu den Mahlzeiten und zum Zähneputzen
herausgenommen werden. Die Zwischenlagerung erfolgte in physiologischer
Kochsalzlösung. Zur Mundhygiene waren nur Zahnbürste, Zahnseide und Wasser
erlaubt.
4.3.4.2 ENTNAHME DER PROBEN
Nach 1-, 2-, 3-, 4-, 5- und 7tägigem Trageintervall wurden die Glasplättchen
vorsichtig abgelöst und kurzzeitig in physiologischer Kochsalzlösung (bei
Raumtemperatur) zwischengelagert.
4.3.5 VITALFÄRBUNG DER PROBEN
Die Vitalfärbung der Proben erfolgte wie unter 4.1.4 beschrieben.
4.3.6 KONFOKALES LASER-SCANNING-MIKROSKOP (CLSM)
Nach Vitalfluoreszenzfärbung der Proben erfolgte die Untersuchung im konfokalen
Laser-Scanning-Mikroskop (CLSM) (siehe Kapitel 4.1.5).
4.3.7 AUSWERTUNG DER CLSM-DATEN
Die Auswertung der am CLSM erhaltenen Daten erfolgte wie in Kapitel 4.2.7
beschrieben.
MATERIAL UND METHODE 34
4.3.8 STATISTISCHE ANALYSE
Die statistische Analyse erfolgte mittels SPSS 11.0. Für die Tage 1 bis 3 und 4 bis
7 wurden die mittleren Biofilmdicken aller Probanden ermittelt. Mittels ANOVA
wurden die Datenreihen auf signifikante Unterschiede zwischen den Tagen 1 bis 3
und 4 bis 7 überprüft. Da die Mittelwerte der Tage 1 bis 3 signifikannte
Unterschiede aufwiesen (p≤0.05 mittels ANOVA) und normalverteilt waren
(überprüft mittels Kolmogorow-Smirnow-Test) wurde der gepaarte t-Test
angewandt.
Die mittlere Vitalität je Tag (1 bis 3 und 4 bis 7) wurde für die Probanden anhand
der Vitalitäten der einzelnen Schnitte errechnet. Da sich mittels ANOVA ein
signifikanter Unterschied bei den Tagen 1 bis 3 bzw. 4 bis 7 zeigte (p≤0,05) und
die Datenreihen normal verteilt waren (überprüft mittels Kolmogorow-Smirnow-
Test) wurde ebenfalls der gepaarte t-Test angewandt.
Auf Bonferroni Korrekturen konnte verzichtet werden (Perneger 1998).
35
5 ERGEBNISSE
5.1 VERSUCH 1
5.1.1 BIOFILMDICKE (BD)
Alle 8 Probanden trugen in Versuch 1 die Ober- und Unterkieferschienen
zeitgleich für 48 Stunden.
Es ging kein Probeplättchen verloren, so dass bei allen Proben der 8 Probanden
die Biofilmdicke ausgewertet werden konnte.
Die Biofilme ergaben Dicken zwischen 14 und 150 µm, abhängig von der
Plaquebildung des jeweiligen Probanden und von der Lokalisation der
Probeplättchen. Die unterschiedlichen Lokalisationen und ihre Abkürzungen sind
in Abbildung 5-1 dargestellt. Die Daten der Biofilmdicken werden in Abbildung 5-2
und in Tabelle 5-1 gezeigt.
Aus den Einzeldaten wurden die mittleren Biofilmdicken der Ober- und Unterkiefer
und der Palatinalseiten ermittelt. An den Bukkalflächen des Oberkiefers bildete
sich eine durchschnittliche Dicke von 77,63 ± 29,10 µm, während der Unterkiefer
in der gleichen Zeit eine durchschnittliche Dicke von 71,92 ± 26,34 µm ausbildete.
Der Unterschied zwischen Ober- und Unterkiefer war nicht signifikant.
Auf der Palatinalseite bildete sich mit einer Höhe von nur 52,08 ± 26,23 µm
signifikant weniger Plaque als im Ober- und Unterkiefer (Abbildung 5-2).
Betrachtet man die unterschiedlichen Lokalisationen der Bukkalseiten von Ober-
und Unterkiefer, so zeigten sich bei der Dicke sehr ähnliche Werte (Tabelle 5-1).
Der Vergleich der aufgeführten Biofilmdicken der Bukkalseiten von Ober- und
Unterkiefer mit der einfaktoriellen Varianzanalyse (ANOVA) zeigte keine statistisch
signifikanten Unterschiede. Der Vergleich von rechter und linker Seite zeigte
ebenfalls keine statistisch signifikanten Unterschiede.
ERGEBNISSE 36
Abbildung 5-2: Durchschnittliche Biofilmdicken (BD in µm) nach 48 Stunden im Oberkiefer (OK, Bukkalflächen), Unterkiefer (UK, Bukkalflächen) und an den Palatinalflächen (PAL). n.s.: nicht signifikant; ***: p ≤ 0,001 (mittels gepaartem t-Test)
0
10
20
30
40
50
60
70
80
OK UK Pal
n.s. ***
***BD (in µm)
OD
OE
OF
OA
OB
OC
PA PB PC
UD UA
UE
UF
UB
UC
Oberkiefer Unterkiefer
Abbildung 5-1: OK/UK- Schiene mit Lokalisationsangaben
ERGEBNISSE 37
Tabelle 5-1: Mittelwerte ± Standardabweichungen der Biofilmdicken (µm) an den
unterschiedlichen Lokalisationen von Ober- (OA-OF), Unterkiefer (UA-UF) und den Palatinalflächen (PA-PC)
OA OB OC OD OE OF PA PB PC
75.25
± 21,84
76.00
± 36.82
79.00
± 26.17
78.25
± 26.62
84.75
± 36.92
72.50
± 26.21
56.25
± 29.62
54.00
± 26.53
46.00
± 22.61
77.00
± 19.80
70.75
± 28.69
73.00
± 27.42
62.25
± 23.59
73.00
± 30.27
76.00
± 28.27
UA UB UC UD UE UF
5.1.2 VITALITÄT (VF)
Die Vitalität wurde an den Flächen ausgewertet, die signifikant am meisten Plaque
bildeten, also die Bukkalflächen von Ober- und Unterkiefer.
Bei allen Proben der acht Probanden (je 12) konnte die Vitalität des Biofilms
ermittelt werden. Die Biofilme zeigten eine Dicke von 16 bis 150 µm, was bei der
Untersuchung am CLSM 8 bis 75 Schichten entsprach. Die unterschiedlichen
Lokalisationen wurden als OA, OB, OC etc. für den Oberkiefer und als UA, UB,
UC etc. für den Unterkiefer (siehe Abbildung 5-1) benannt.
Die Vitalitäts-Mittelwerte aller Schichten an den verschiedenen Lokalisationen aller
Probanden sind in Tabelle 5-2 dargestellt.
Tabelle 5-2: Mittelwerte ± Standardabweichungen der Vitalitäten (%) an den
unterschiedlichen Lokalisationen der Bukkalflächen
OA OB OC OD OE OF 66.6 ± 19.9 64.4 ± 22.4 73.9 ± 18.7 66.6 ± 29.1 66.7 ± 24.5 72.9 ± 16.7
64.3 ± 15.0 71.9 ± 18.6 68.7 ± 16.5 73.2 ± 17.6 70.8 ± 21.1 76.8 ± 21.9 UA UB UC UD UE UF
Keine signifikanten Unterschiede zwischen den Gruppen (P>0.05) (ANOVA)
ERGEBNISSE 38
Die Anzahl der Plaqueschichten ebenso wie die Vitalitätswerte in den
verschiedenen Schichten variierten abhängig vom Probanden in größerem
Umfang. Zum Beispiel variierte die Vitalität der ersten Biofilmschicht bei den acht
Probanden von 0 bis 100%.
Bei jedem der Probanden war jedoch ein individuell charakteristisches
Vitalitätsmuster erkennbar, das nicht von der Lokalisation der Probe beeinflusst zu
sein scheint. Als Beispiel hierfür sind die Vitalitätsmuster von Probandin AD und
Proband NB in den Abbildungen 5-3 und 5-4 dargestellt.
Die Vitalitätsmuster aller acht Probanden in Abhängigkeit von den
unterschiedlichen Lokalisationen sind im Anhang aufgeführt.
Abbildung 5-3: Vitalität des Probanden AD nach 48 h im OK und UK
0,00
10,00
20,00
30,00
40,00
50,00
60,00
70,00
80,00
90,00
100,00
1 4 7 10 13 16 19 22 25 28 31 34 37 40 43 46 49 52 55 58 61 64 67 70 73
Anzahl der Schichten
OA OB OC OD OE OF UA UB UC UD
UE UF
ERGEBNISSE 39
Abbildung 5-4: Vitalität des Probanden NB nach 48 h im OK und UK
0,00
10,00
20,00
30,00
40,00
50,00
60,00
70,00
80,00
90,00
100,00
1 4 7 10 13 16 19 22 25 28 31 34 37 40 43 46 49 52 55 58 61 64 67 70 73
Anzahl der Schichten
OA OB OC OD OE OF UA UB UC UD
UE UF
ERGEBNISSE 40
5.2 VERSUCH 2
5.2.1 Biofilmdicke (BD)
Es ging ebenfalls kein Probeplättchen verloren, so dass bei allen zwölf Probanden
die Biofilmdicken ausgewertet werden konnten.
Die Biofilme ergaben Dicken zwischen 26 und 190 µm, in Abhängigkeit von der
Plaquebildung des jeweiligen Probanden und von der Lokalisation der
Probeplättchen. Die Lokalisationen und ihre Abkürzungen sind in Abbildung 5-1
dargestellt. Die Daten der Biofilmdicken der Tage 1 bis 7 werden in Abbildung 5-5
und im Anhang in Tabelle 9-1 gezeigt.
Es bildete sich nach einem Tag eine durchschnittliche Dicke von 46,2 ± 12,8 µm,
nach zwei Tagen eine durchschnittliche Dicke von 93,3 ± 47,1 µm und nach drei
Tagen eine durchschnittliche Dicke von 123,7 ± 38,7 µm aus. Tag 1 und 2
verhielten sich zueinander hoch signifikant (p ≤ 0,01), Tag 1 und 3 höchst
signifikant (p ≤ 0,001). Zwischen Tag 2 und 3 konnte noch ein signifikannter
Unterschied (p ≤ 0,05) festgestellt werden.
Im zweiten Tragezyklus wurden die Tage 4 bis 7 ermittelt. Nach vier Tagen zeigte
sich auf den Probeplättchen eine durchschnittliche Dicke von 109,5 ± 31,1 µm,
nach fünf Tagen eine durchschnittliche Dicke von 134,3 ± 36,8 µm und nach
sieben Tagen eine durchschnittliche Dicke von 133,7 ± 27,8 µm. An den Tage 4
bis 7 zeigten sich keine statistisch signifikanten Unterschiede.
5.2.2 VITALITÄT (VF)
Bei allen Proben der zwölf Probanden (je 12) konnte die Vitalität des Biofilms
ermittelt werden. Die unterschiedlichen Lokalisationen der Oberkieferschiene
wurden mit OA-OF benannt (siehe Abbildung 5-1).
Die Vitalitäts-Mittelwerte der zwölf Probanden, die sich an den Tagen 1 bis 7
ergaben, sind in Abbildung 5-6 und im Anhang in Tabelle 9-2 dargestellt.
Im ersten Tragezyklus wurden die Vitalitäten der Tage 1 bis 3 bestimmt. Dabei
ergab sich nach dem ersten Tag eine durchschnittliche Vitalität von 60,9 ± 17,3 %,
nach dem zweiten Tag eine durchschnittliche Vitalität von 53,6 ± 14,3 % und nach
ERGEBNISSE 41
dem dritten Tag eine durchschnittliche Vitalität von 83,9 ± 4,9 %. Zwischen den
Vitalitäten von Tag 1 und 2 war kein signifikanter Unterschied feststellbar. Die
Vitalitäten der Tage 1 und 3 und der Tage 2 und 3 unterschieden sich höchst
signifikant (p ≤ 0,001) voneinander. Im zweiten Tragezyklus wurden die Vitalitäten
der Tage 4 bis 7 ermittelt. Nach dem vierten Tag wurde eine durchschnittliche
Vitalität von 49,0 ± 15,6 % erreicht, nach dem fünften Tag eine durchschnittliche
Vitalität von 65,9 ± 9,0 % und nach dem siebten Tag eine durchschnittliche
Vitalität von 57,8 ± 9,2 %. Dabei unterschieden sich die Vitalitäten der Tage 4 und
5 hoch signifikant (p ≤ 0,01) und die Vitalitäten der Tage 5 und 7 signifikant (p ≤
0,05) voneinander. Zwischen den Vitalitäten von Tag 4 und Tag 7 war kein
signifikanter Unterschied feststellbar.
Die Anzahl der Plaqueschichten ebenso wie die Vitalitätswerte in den
verschiedenen Schichten variierten abhängig vom Probanden und der Zeit in
größerem Umfang. Eine Übersicht der Vitalitäten der Tage 1 bis 7 nach
Probanden geordnet findet sich im Anhang, ebenso wie eine Übersicht, bei der die
Vitalitäten nach Tagen eingeteilt sind.
Ein individuell charakteristisches Vitalitätsmuster, wie es nach 48 Stunden bei den
einzelnen Probanden erkennbar war, ist über sieben Tage verteilt nicht zu
erkennen. Eine Ausnahme bildete Tag 3, an dem alle zwölf Probanden mit 83,9 %
die durchschnittlich höchste Vitalität, aber auch ein sehr ähnliches Vitalitätsmuster
aufwiesen.
ERGEBNISSE 42
Abbildung 5-5: Mittelwerte der Biofilmdicken (Dicke in µm) nach 1 bis 7 Tagen im Oberkiefer (Bukkalflächen) aller zwölf Probanden. n.s.: nicht signifikant; ***: p ≤ 0,001; **: p ≤ 0,01; *: p ≤ 0,05 (mittels gepaartem t-Test)
Abbildung 5-6: Mittelwerte der Vitalitäten (Prozent) nach 1 bis 7 Tagen im Oberkiefer (Bukkalflächen aller 12 Probanden). n.s.: nicht signifikant; ***: p ≤ 0,001; **: p ≤ 0,01; *: p ≤ 0,05 (mittels gepaartem t-Test)
0
20
40
60
80
100
120
140
Tag 1 Tag 2 Tag 3 Tag 4 Tag 5 Tag 7
BD (µm)
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
Tag 1 Tag 2 Tag 3 Tag 4 Tag 5 Tag 7
Vitalität (%)
**
* *** n.s.
n.s.
n.s. *** ***
** *
43
6 DISKUSSION
6.1 METHODISCHE DISKUSSION
In der Literatur finden sich zahlreiche Studien, die sich mit der Plaquebildung
sowie der Vitalität der Plaquebakterien beschäftigen (Netuschil et al. 1989;
Arweiler et al. 2001a; 2001b). Um jedoch die Prozesse, die im Biofilm ablaufen,
verstehen zu können, ist es notwendig, eine Untersuchungsmethode zu wählen,
die den Biofilm nicht zerstört (McCoy et al. 1981). Zu jeglichen bakteriologischen
Untersuchungen musste in früheren Studien die Plaque vom Zahn mechanisch
entfernt werden (Arweiler et al. 2001a; 2001b), was jedoch die Zerstörung der
dreidimensionalen Struktur des Biofilms bedeutete. Verschiedene Arbeitsgruppen
verwendeten künstliche Modelle, sogenannte Biofilm-Reaktoren (Guggenheim et
al. 2001, Shapiro et al. 2002), um die Struktur des oralen Biofilms nachzuahmen.
Dabei wurden Biofilme untersucht, die unter Laborbedingungen von ausgewählten
Bakterienstämmen (Biofilme nur eines Bakterienstammes oder gemischte
Biofilme) gebildet wurden, aber nicht in der Mundhöhle natürlich gewachsenen
waren. Obgleich diese Methoden bereits die komplexe Struktur der Biofilme
aufgezeigt haben (Caldwell et al. 1992) und so eine Kontrolle und Untersuchung
unter standardisierten Bedingungen für verschiedene Einflussfaktoren, wie z.B.
Mundspüllösungen auf den Biofilm (Shapiro et al. 2002) erlaubten, konnten sie
jedoch die intraorale Situation nicht ausreichend wiedergeben. Ihre Aussagekraft
ist damit eingeschränkt. Um diese Schwierigkeiten zu umgehen, wurde die
Technik des konfokalen Laser-Scanning-Mikroskops (CLSM) mit der Verwendung
von intraoralen Schienensystemen kombiniert (Netuschil et al. 1998; Wood et al.
2000; Auschill et al. 2001; 2002; Zaura-Arite et al. 2001). Deshalb war es Ziel
dieser Studie ein in vivo Modell zu etablieren, bei dem nach ungestörter
Plaquebildung die räumliche Struktur des Biofilms untersucht werden kann.
6.1.1 TRÄGERSYSTEME ZUR PLAQUEGEWINNUNG
Das Design der Trägersysteme, die zur in vivo Biofilmgewinnung verwendet
wurden ist, wie bereits in Kapitel 2.2 beschrieben, sehr vielseitig.
DISKUSSION 44
Das gemeinsame Ziel aller Trägersysteme war es, die Plaque intraoral so zu
sammeln, dass eine Veränderung bzw. Zerstörung des Plaqueaufbaus und der
Plaquevitalität weitestgehend verhindert werden konnte.
Theilade (1964) verwendete dünne Kunststofffolien aus MYLAR, die an den
Schneidezähnen befestigt wurden, um diese nach einer vorgegebenen intraoralen
Verweildauer zu entfernen und die darauf befindliche Plaque auszuwerten. Brecx
et al. (1981, 1983, 1987, 1994) benutzten als Trägermaterial für ihre detaillierten
Untersuchungen der frühen Plaquebildung einen sogenannten Plast-Spray-Film,
der auf die Zähne aufgezogen wurde.
Diese Folien befinden sich jedoch relativ „ungeschützt“ in der Mundhöhle und sind
dort den Bewegungen von Zunge und Wange ausgeliefert, was zu einer Störung
der Biofilmbildung oder sogar zu einem Ablösen der Folien führen kann. Deshalb
wurde nach geeigneteren Systemen gesucht, die ein ungestörtes Wachsen der
Plaque ermöglichen sollen.
Man kann prinzipiell zwischen zwei verschiedenen Arten von Trägersystemen in
der Literatur unterscheiden. Einerseits können die Proben ähnlich wie bei
kieferorthopädischen Brackets direkt auf den Zähnen befestigt sein, andererseits
werden Schienensysteme bevorzugt eingesetzt.
Meyerowitz et al. (1991) klebten Metall-Vorrichtungen ähnlich einem
kieferorthopädischen Bracket mittels Säure-Ätz-Technik an die Bukkalflächen von
oberen Molaren. In die Vorrichtung wurden je eine normale und eine
demineralisierte Schmelzprobe so in Kaltpolymerisat eingelassen, dass nur die
äußerste Schmelzoberfläche dem Mundhöhlenmilieu ausgesetzt war. Um die
Plaqueakkumulation zu verbessern, wurden die Plättchen so positioniert, dass die
äußere Oberfläche ungefähr 1mm tiefer als die umgebende Haltevorrichtung lag.
Es wurde dann der Einfluss einer 0.05 %igen Natriumfluorid-Lösung auf
Demineralisation und Remineralisation der Schmelzproben untersucht.
Liljemark et al. (1993) befestigten Komposit-Kugeln (Visio-fil®, Espe, Deutschland)
ebenfalls mit Hilfe der Säure-Ätz-Technik an den Bukkalseiten der
Oberkieferzähne. Diese Komposit-Kugeln waren vor der Aushärtung mit
Schmelzplättchen versehen worden. Anhand der gebildeten Beläge wurde die
Actinomyceten-Verteilung auf Schmelzflächen bei parodontal gesunden und bei
parodontal erkrankten Probanden untersucht.
DISKUSSION 45
Robinson et al. (1997) und Wood et al. (2000) verwendeten für ihre
Untersuchungen von in vivo-Plaque die gleiche Vorrichtung. Ein 2 mm dicker
Nylonring (Innendurchmesser 2 mm) wurde mit Cyanoacrylat auf einen
Schmelzpartikel geklebt, dieser wurde dann, ähnlich wie ein Bracket, direkt auf die
Bukkalfläche eines oberen Molaren befestigt. Die auf diese Weise gewonnene
Plaque wurde dann im Labor aufgearbeitet und verschiedenen Analysen
zugeführt.
Baier und Glantz (1978) verwandten individuell angefertigte, herausnehmbare
Schienen zur Gewinnung von in vivo Biofilmen. Sie fertigten zur Untersuchung
ihrer Plaqueproben Unterkiefer-Kunststoffschienen an, welche in Regio 35/36 und
45/46 zur Aufnahme der Proben erweitert wurden. Die Schienen wurden für die
Versuchsreihe zwischen 2 Sekunden und 2 Stunden getragen.
Macpherson et al. (1990) untersuchten die Zusammensetzung der Mikroflora der
frühen Plaque auf menschlichen Schmelzflächen und eine daraus resultierende
Schmelzdemineralisation. Sie benutzten hierfür herausnehmbare Unterkiefer-
Schienen, die mit lingualen Kunststoffflächen zur Aufnahme der Schmelzproben
versehen waren.
Leonhardt et al. (1995) verwendeten in ihrer Studie zur initialen Plaquebildung auf
Titan-, Hydroxylapatit- und Amalgamflächen Cobalt-Chrom-Schienen die bis auf
einzelne Ausnahmen im Oberkiefer getragen wurden. Thomson et al. (1996)
benutzten ebenfalls Modellgussschienen, die im Unterkiefer getragen wurden. An
den Bukkalflächen befanden sich Nischen, die zur Aufnahme von
Rinderschmelzblöcken dienten. Mit Hilfe dieser Vorrichtung sollte die Kariogenität
von menschlicher Muttermilch und Kuhmilch untersucht werden. Die Verwendung
von Cobalt-Chrom-Schienensystemen bedeutet jedoch eine sehr aufwändige und
teure Methode in der Herstellung der Trägervorrichtungen.
In der vorliegenden Untersuchung wurde die Konstruktion der intraoralen
Schienen zur Sammlung eines in vivo Biofilms ähnlich gestaltet wie in früheren
Studien der gleichen Arbeitsgruppe (Netuschil et al. 1998; Auschill et al. 2001;
2002). Es wurden jedoch einige Änderungen im Schienendesign durchgeführt, mit
der Absicht, ein besseres und einfacheres Plaquewachstum und eine
standardisierte Biofilmbildung gleichzeitig in Ober- und Unterkiefer zu
gewährleisten. Erstmals wurden die Glasplättchen so befestigt, dass sie zu den
DISKUSSION 46
Zähnen gerichtet waren, um jegliche Störung durch Zunge oder Wange zu
vermeiden. Es war jedoch genug Raum vorhanden, um dem Biofilm eine
ernährende und feuchte Umgebung zu bieten. Diese Anordnung sollte eine
interproximale/approximale Plaque nachahmen, die größtenteils vor abscherenden
Kräften durch das Kauen geschützt war.
6.1.2 GLASPLÄTTCHEN ALS TRÄGERMATERIAL
Da bekannt ist, dass Schmelz eine Eigenfluoreszenz besitzt, welche zusammen
mit den Fluoreszenzfarbstoffen zu einer Störung führen kann (Netuschil et al.
1998), wurde in der vorliegenden Studie Glas als Trägermaterial verwendet. Wie
bereits früher gezeigt wurde, besteht kein wesentlicher Unterschied im
Plaquewachstum zwischen Glas und Schmelz als Trägermaterial (Netuschil et al.
1998). Darüber hinaus gibt es Beweise, dass das Plaquewachstum in hohem
Maße von der Oberflächenrauhigkeit und der freien Oberflächenenergie
beeinflusst ist (Marshall 1992). Dies ist ebenso das Ergebnis einer Studie, bei der
die unterschiedlichen Wachstumsmuster der Plaque an den verschiedenen
Zähnen mit Oberflächenirregularitäten erklärt wurden (Quirynen und van
Steenberghe 1989). Die Autoren schließen daraus, dass das Wachstumsmuster
der Plaque in 85% der Fälle auf der Basis der Oberflächenrauhigkeit vorhersagbar
ist. Diese Schlussfolgerung stimmt mit unseren Ergebnissen überein, da alle
Glasplättchen auf die selbe Weise poliert wurden (4000 grid) und die erhaltenen
Biofilmdicken sehr ähnlich waren. Unterschiede zwischen Zahngruppen und
Kiefern beziehungsweise unterschiedlichen Lokalisationen, wie es in einigen
Studien kontrovers diskutiert wurde (Quirynen und van Steenberghe 1989;
Furuichi et al. 1992; Ramberg et al. 1992), wurden nicht gefunden. In den zitierten
Studien ist die Plaque jedoch auf natürlichen Zähnen gewachsen und nicht auf
standardisierten Glasplättchen wie in der vorliegenden Studie. Dies könnte die
unterschiedlichen Plaquedicken an verschiedenen Zahngruppen und
Lokalisationen erklären.
Wie bereits erwähnt, wurden in unserem Modell an allen Lokalisationen
standardisierte Voraussetzungen, was die Oberfläche und die Reinigung betrifft,
DISKUSSION 47
geboten. Demzufolge ist unser Schienenmodell geeignet, unter standardisierten
Bedingungen in vivo/in situ Biofilmbildung zu ermöglichen.
Zaura-Arite et al. (2001) untersuchten in situ gewachsene Biofilme nach der
Behandlung mit CHX unter dem CLSM. In den Trägerplättchen waren Rinnen
eingebracht, in denen die Plaque gewonnen wurde. Dies bedeutet, dass diese
Biofilme einer „Fissurenplaque“ entsprechen, während in der vorliegenden Studie
die Biofilme auf planen Glasoberflächen aufwuchsen, was einer
„Glattflächenplaque“ entspricht. Die Trägerscheiben wurden ebenfallls in
Kunststoffschienen befestigt, die von Probanden bis zu 48 Stunden getragen
wurden. Um den Einfluss des CHX auf die Plaque festzustellen, sollte der gleiche
Biofilm einmal mit und einmal ohne CHX-Behandlung untersucht werden. Die
Trägerscheiben mit den gewonnenen Biofilmen wurden deswegen vor
Weiterbehandlung und Auswertung in der Mitte auseinander gebrochen. Es ist
jedoch fraglich, ob dieser Biofilm als unzerstört angesehen werden kann. Wir
entschieden uns daher in dieser Studie die Trägerplättchen im Ganzen zu
untersuchen, damit es zu keiner Verletzung des empfindlichen Biofilms kam.
6.2 BIOFILMDICKE
Dentale Plaque stellt eine Barriere für die Diffusion organischer Säuren dar,
jedoch ebenso für neutralisierende Agentien gegenüber der Schmelzoberfläche
(Mandel 1974; Saxton 1975). Bedenkt man die Wichtigkeit der Plaquedicke in
Stoffwechselprozessen, die bei dentalen Erkrankungen eine Rolle spielen, so
haben sich nur wenige Studien der Messung der intraoralen Plaquedicke
gewidmet. Folglich gibt es nur wenige Daten, mit denen unsere Ergebnisse
vergleichbar sind. Es gibt Methoden, bei denen die Plaquedicke
elektronenmikroskopisch (Main et al. 1984) oder mit einem Laser-Scanning-
Mikroskop (Yeganeh et al. 1999) untersucht wurde. In anderen Studien wurde die
Plaquedicke, wie auch in der vorliegenden Untersuchung, mit Hilfe des konfokalen
Laser-Scanning-Mikroskops (CLSM) untersucht (Netuschil et al. 1998; Wood et al.
2000; Auschill et al. 2001; Zaura-Arite et al. 2001).
DISKUSSION 48
Netuschil et al. (1998) fanden nach drei Tagen (72 Stunden) Biofilme mit einer
Dicke zwischen 6-45 µm, die auf Schmelz und Glasplättchen wuchsen, welche in
Kunststoffschienen eingebracht waren. Mit einem ähnlichen Schienendesign
zeigten sich bei Auschill et al. (2001) nach fünf Tagen (120 Stunden) Dicken
zwischen 15-31 µm auf Schmelzproben. Zwei Gründe können diese niedrigen
Werte im Vergleich zu den vorliegenden Ergebnissen erklären: In beiden Studien
wurden die Biofilme getrocknet und eingebettet, bevor sie unter dem CLSM
ausgewertet wurden. Die Dicken entsprechen ungefähr der Hälfte des
entsprechenden feuchten Biofilms. Zudem spiegelt die geringe Höhe die Tatsache
wider, dass die „Glattflächenplaque“, die in diesen Studien gesammelt wurde,
deutlich mehr der Umgebung des Speichels und der Wange ausgesetzt war, als
die Proben in der vorliegenden Untersuchung. Die Proben waren in Richtung der
Wange eingebracht und nicht in Richtung der Zähne und damit vor Wangenabrieb
geschützt, wie in unserer Studie.
Wood et al. (2000) klebte eine in situ-Vorrichtung, bestehend aus einem Nylonring,
der auf einem Schmelzplättchen befestigt wurde, auf die ersten oder zweiten
Molaren von acht Probanden. Nachdem die Vorrichtung für 96 Stunden getragen
wurde, fand man an der Schmelz/Ring-Verbindung Plaquetiefen zwischen 75-220
µm und im Zentrum der Vorrichtung Plaquetiefen zwischen 35-215 µm.
Nach 48 Stunden, also der Hälfte der Zeit, untersuchten Zaura-Arite et al. (2001)
Biofilme, die in Vertiefungen auf Rinderdentin wuchsen. Die erreichte Dicke betrug
durchschnittlich 34,3 µm. Obwohl die Probanden in „heavy“ und „light“
Plaquebildner unterschieden wurden, zeigte die 48 Stunden Kontrolle bei den drei
„heavy“ Plaquebildnern eine durchschnittliche Biofilmdicke von 28, 31 und 43 µm,
bei den drei „light“ Plaquebildnern 28, 32 und 37 µm. Die Beobachtung, dass
Probanden, die als „heavy“ Plaquebildner registriert wurden, in einer
vorgegebenen Zeit nicht unbedingt größere Biofilmdicken bildeten als „light“
Plaquebildner, deckt sich auch mit unseren Ergebnissen. Zum Beispiel bildeten
die Probanden DR (PFRI II) und MK (PFRI III) in Versuch 2 nach 48 Stunden mit
72 µm und 118 µm deutlich größere Plaquedicken, als die Probanden LH (26 µm)
und AD (38 µm) die beide mit einem PFRI von IV eingestuft waren. Es sollte
erwähnt werden, dass alle Autoren die großen Unterschiede in der Plaquedicke
zwischen den verschiedenen Probanden betonen. Dies stimmt mit der
DISKUSSION 49
vorliegenden Untersuchung überein, die relativ hohe Standardabweichungen
aufweist. Betrachtet man jedoch jeden einzelnen Probanden für sich, so ist ein
gleichmäßiges Muster mit ähnlichen Dicken in Ober- und Unterkiefer und deutlich
geringeren Werten an den Palatinalflächen an den verschiedenen Lokalisationen
verfolgbar.
Da diese Studie ähnliche Biofilmdicken an verschiedenen Lokalisationen in der
bukkalen Region von Ober- und Unterkiefer aufweist und palatinal gleichmäßig ein
geringeres Wachstum zeigt, lässt sich daraus folgern, dass das in der
vorliegenden Studie verwendete in vivo Biofilm-Modell ein sehr nützliches und
standardisiertes Hilfsmittel darstellt, um in vivo/in situ verschiedene
Einflussfaktoren auf das orale Biofilmwachstum testen zu können.
Der zweite Versuchsabschnitt zeigte eine stetige Zunahme der Biofilmdicken an
den Tagen 1 bis 3 (46,2 µm bis 123,7 µm). In einem weiteren Versuchsdurchlauf,
in dem die Tage 4 bis 7 untersucht wurden, zeigten sich Plaquedicken von 109,5
µm bis 134,3 µm. Quirynen und van Steenberghe (1989) untersuchten die frühe
Plaquebildung von 6 bis 96 Stunden und stellten fest, dass das Plaquewachstum
einer exponentiellen Kurve mit einer leichten Sättigung gegen 96 Stunden folgte.
In der vorliegenden Studie erreichte Tag 4 mit 109,5 µm eine geringere Dicke als
Tag 3 mit 123,7 µm. Dies kann jedoch damit erklärt werden, dass für die
Untersuchung an den Tagen 4 bis 7 ein neuer Versuchsdurchlauf gestartet wurde,
deshalb wirkten auf die einzelnen Biofilmproben unterschiedliche Einflussfaktoren
ein. An Tag 7 zeigt sich mit 133,7 µm eine etwas geringere Dicke als an Tag 5 mit
134.3 µm. Wie bereits in Kapitel 2.1.4.3 beschrieben, ist die Zunahme der
Biofilmdicke nicht unbegrenzt, sondern es stellt sich ein Gleichgewicht zwischen
Neubildung und Ablösung im Biofilm ein (Flemming und Wingender 2001a). Dies
spiegelt sich auch in unseren Ergebnissen wieder, da die Zunahme der Dicke an
den Tagen 4 bis 7 nicht mehr signifikant war, und Tag 7 sogar einen geringeren
Wert zeigte, als Tag 5.
DISKUSSION 50
6.3 VITALFLUORESZENZ
Es bieten sich verschiedene Möglichkeiten die Vitalität dentaler Plaque zu
bestimmen. Sowohl die Kultivierung von Plaque, als auch Vitalitätsbestimmungen
von Plaqueabstrichen mittels Vitalfluoreszenztechnik erforderten bisher die
mechanische Entfernung der Plaque, was automatisch eine Zerstörung des
empfindlichen dreidimensionalen Aufbaus zwischen Zellen und Biofilmmatrix
bedeutete (Arweiler et al. 2001a; 2001b). Um diese Schwierigkeiten zu umgehen,
wurden in vivo Trägervorrichtungen mit der Methode der konfokalen Laser-
Scanning-Mikroskopie kombiniert (Netuschil et al. 1998; Wood et al. 2000; Auschill
et al. 2001; 2002; Zaura-Arite et al. 2001).
Es wurden bisher wenige Studien publiziert, welche die Plaquebildung in
verschiedenen Bereichen der Bezahnung mit Hilfe von Plaqueindizes oder
planimetrischen Messungen der plaquebedeckten Flächen der Zähne beschreiben
(Quirynen und van Steenberghe 1989). Bis jetzt gibt es noch keine Studie, die die
Vitalität in den verschiedenen Biofilmschichten an unterschiedlichen
Lokalisationen systematisch ermittelte. Deswegen können Vergleiche, die die
Vitalitätsmittelwerte betreffen nur allgemein gehalten werden. Die gefundenen
Vitalitätswerte stimmen aber mit Ergebnissen anderer Untersuchungen überein
(Gordon et al. 1971; Manganiello et al. 1977).
Obwohl sich bei allen Probanden (interindividuell) deutliche Unterschiede in der
Anzahl der Biofilmschichten und der Vitalitätswerte zeigten, konnte nach 48
Stunden eine große Beständigkeit bezüglich des Vitalitätsmusters jedes einzelnen
Probanden (intraindividuell) festgestellt werden. Darüber hinaus zeigten einige
Probanden ganz charakteristische Strukturmuster, wie z.B. Plateaus oder Spitzen
auf, die an allen Lokalisationen aufzufinden waren. Trotz der großen Unterschiede
zwischen den Individuen, kann die Vitalitätsverteilung der Plaque der acht
Probanden aus Versuch 1 grob in drei Muster eingeteilt werden.
Bei einigen Probanden wurde eine hohe Anzahl an toten Bakterien (niedrige
Vitalitätswerte) in den ersten Biofilmschichten nahe der Glasoberfläche gefunden.
In höheren Schichten nahmen die Vitalitätswerte zu, während sie in niedrigen
Werten an der Biofilmoberfläche endeten. Diese Beobachtung, dass lebende
Plaquemikroorganismen auf einer dichten Schicht toter Bakterien angesiedelt sind,
DISKUSSION 51
wurde auch von Netuschil et. al. (1998) beschrieben. Eine Erklärung für diese
Beobachtung könnte sein, dass dünne Bakterienschichten, die sich noch nicht zu
einem komplexen Biofilm zusammengeschlossen haben, sehr empfänglich
gegenüber den antibakteriellen Bestandteilen des Speichels sind.
Andere Probanden zeigten ein prinzipiell ähnliches Muster, bei dem die Vitalität in
den obersten Biofilmschichten aber noch einmal anstieg. Die toten Bakterien
werden dann von neuen, vitalen Bakterien überlagert oder die Existenz einzelner
noch lebender Bakterien führt dazu, dass sich neue Schichten von vitalen
Bakterien durch Proliferation bilden. Sind diese neuen vitalen Biofilmschichten
länger dem „antibakteriellen“ Mundhöhlenmilieu ausgesetzt könnte dies wieder zu
niedrigeren Vitalitätswerten in den obersten Schichten führen. Diese Beobachtung
trifft jedoch nur für einige Probanden zu.
Als dritte Variante bildeten einige Probanden Biofilme, die sehr hohe
Vitalitätswerte in Nachbarschaft zur Aufwuchsoberfläche zeigten und deren
Vitalitätswerte zu den äußeren Lagen hin abnahmen. Es ist anzunehmen, dass
diese Probanden möglicherweise schlechtere antibakterielle Mechanismen
besitzen, eine kariogene Ernährungsweise haben oder die Bakterien des Biofilms
bessere Resistenzen aufweisen.
Das Kariesrisiko scheint jedoch keinen Einfluss auf die Werte zu haben. Diese
Beobachtung stimmt, wie bereits in Kapitel 6.2 beschrieben, mit einer
Untersuchung überein, bei der sich zwischen drei „heavy“- und drei „light“-
Plaquebildnern nach 48 Stunden kein Unterschied im Biofilm zeigte (Zaura-Arite et
al. 2001). Des weiteren wurden in dieser Studie keine allgemeinen Muster für die
Vitalitätsverteilung von verschiedenen Probanden gefunden, was auch mit
unseren Beobachtungen übereinstimmt. In der erwähnten Studie wurden die
Vitalitätswerte jedes Probanden als äußere, mittlere und innere Schichten
ermittlet, für die einzelnen Probanden wurden keine Vitalitätswerte aufgezeigt.
Unsere Daten nach 48 Stunden deuten auf ein konstantes ökologisches
Mundhöhlenmilieu jedes Probanden hin, was durch fördernde oder
einschränkende Einflüsse auf die Vitalität des Biofilms zu einem für jeden
Probanden typischen Identitätsmusters führte.
Es ist zu vermuten, dass diese Merkmale und diese für eine bestimmte Lebenszeit
gleichbleibenden Muster sich in jedem Menschen abhängig von genetischen
DISKUSSION 52
(Speichelzusammensetzung, Biofilmresistenz) und umweltbedingten Faktoren
(Ernährung) entwickeln und wahrscheinlich nur schwer zu beeinflussen sind.
Betrachtet man das Vitalitätsmuster eines jeden Probanden an verschiedenen
Tagen (1 bis 7), so zeigen sich deutliche Unterschiede in der Anzahl der
Biofilmschichten und auch der Vitalitätswerte. Charakteristische Strukturmerkmale
lassen sich über eins bis sieben Tage verteilt nicht eindeutig erkennen. Eine
Erklärung hierfür könnte sein, dass im Vergleich zu den nach 48 Stunden
erhaltenen Vitalitätsmustern die Probekörper unterschiedlich lange und zu
verschiedenen Zeitpunkten entfernt wurden. Daher ergaben sich auch
unterschiedliche Einflussfaktoren auf die einzelnen Biofilmproben.
Auch bei der Einteilung nach Tagen ist kein eindeutiges Vitalitätsmuster
erkennbar. Eine Besonderheit stellte jedoch Tag drei dar. Die Vitalitätswerte aller
Probanden lagen in einem relativ engen Bereich zwischen 76,1 und 90,6 %. Diese
konstanten Werte sind jedoch auf keinen anderen Tag übertragbar. Eine Erklärung
hierfür könnte eine gewisse Etablierung des Biofilms und seiner metabolischen
Prozesse nach drei Tagen sein.
Während man annimmt, dass die Vielfalt der Plaque-Mikroflora vorrangig den
endogen aufgenommenen Nährstoffen des Wirts zuzuschreiben sind, als den
exogenen Ernährungsfaktoren (Roberts et al. 1999), so gibt es keinerlei
Informationen über Einflüsse auf den Vitalitätsgrad von Bakterien. Die
Untersuchung solcher Einflussfaktoren, wie zum Beispiel eine spezielle
Ernährungsweise oder der Gebrauch von antibakteriellen Wirkstoffen zu einem
bestimmten Zeitpunkt wird Gegenstand weiterer Studien sein.
53
7 ZUSAMMENFASSUNG
Ziel der vorliegenden Studie war es, ein reproduzierbares und standardisiertes
Verfahren zur Untersuchung von nativen Biofilmen zu entwickeln und die
Parameter „Vitalität“ und „Dicke“ der dentalen Plaque zu untersuchen. Hierfür
wurden die Methoden der Vitalfluoreszenztechnik und der konfokalen Laser-
Scanning-Mikroskopie (CLSM) kombiniert.
In einem Vorversuch wurde die Färbetechnik, die bei „abgekratzten“ Biofilmen
bereits etabliert war auf in situ Biofilme übertragen. Hierzu wurden 8 und 24
Stunden alte Biofilme in vitro gezüchtet, mit Vitalfluoreszenzfärbung gefärbt und
direkt danach unter dem CLSM untersucht.
Der Hauptversuch gliederte sich in zwei Versuchsabschnitte. Im ersten
Versuchsabschnitt trugen 8 Probanden Kunststoffschienen in Ober- und
Unterkiefer, die jeweils mit 15 Glasplättchen als Aufwuchsfläche für den Biofilm
bestückt waren. Nach 48 Stunden wurden die Probenplättchen entfernt und eine
Vitalfluoreszenzfärbung durchgeführt. Die Vitalitätsverteilung der verschiedenen
Schichten und die Biofilmdicke wurden unter dem CLSM untersucht. Die
durchschnittliche Plaquedicke nach 48 Stunden betrug an den Bukkalflächen des
Oberkiefers 77,63 ± 29.10 µm, an den Bukkalflächen des Unterkiefers 71,92 ±
26,34 µm. Palatinal bildete sich mit 52,08 ± 26,23 µm signifikant weniger Plaque
als an den anderen Lokalisationen. Die Vitalitätswerte in den verschiedenen
Schichten variierten abhängig vom Probanden in größerem Umfang. Die
Untersuchung ergab jedoch, dass bei jedem einzelnen Probanden ein individuell
charakteristisches Vitalitätsmuster erkennbar war, das nicht von der Lokalisation
der Probe beeinflusst zu sein schien.
Im zweiten Versuchsabschnitt wurden die Schienen von 12 Probanden im
Oberkiefer für 1 bis 3 Tage und für 4 bis 7 Tage getragen. Es zeigte sich, dass die
Biofilmdicke in den ersten drei Tagen kontinuierlich zunahm. An den Tagen 4 bis 7
konnte kein signifikannter Unterschied mehr festgestellt werden. Die
Vitalitätswerte der verschiedenen Probanden zeigten deutliche Unterschiede.
Charakteristische Strukturmerkmale ließen sich über eins bis sieben Tage verteilt
nicht eindeutig erkennen. Auch bei der Einteilung nach Tagen war kein
eindeutiges Vitalitätsmuster erkennbar.
54
8 LITERATURVERZEICHNIS
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62
9 ANHANG
9.1 PROBANDENINFORMATION
STUDIE ZUR UNTERSUCHUNG DER BIOFILMBILDUNG IM MUND
Sehr geehrte Testteilnehmerin,
sehr geehrter Testteilnehmer,
Sie haben sich bereit erklärt, an einer Studie zur Untersuchung der Biofilmbildung im Mund
teilzunehmen.
Zur Vorbereitung des Tests wir zunächst Ihre Plaquebildung ermittelt. Dazu dürfen Sie nach
einer professionellen Zahnreinigung für die nächsten 24 Stunden die Zähne nicht putzen.
Nach Ablauf dieser 24 Stunden wird die Prüfärztin Frau Hein Ihren Plaque Index erfassen.
Danach werden Abdrücke von Ihrem Gebiss genommen zur Herstellung einer speziellen
Zahnschiene.
Im Rahmen der weiterer Untersuchungen müssen Sie diese Schienen in der ersten Testphase
für zwei Tage gleichzeitig im Oberkiefer und im Unterkiefer tragen. Über die genaue
Vorgehensweise wird Sie ZÄ Nicole Hein aufklären.
In der zweiten Testphase werden Sie nur eine Schiene für 3 Tage und dann für 7 Tage tragen,
wobei Ihnen regelmäßig ein Testplättchen zur Untersuchung entnommen wird.
Sollten Sie in den Wochen des Versuchsablaufs Antibiotika nehmen müssen, so bitten wir Sie,
uns dies sofort mitzuteilen. Das Zähneputzen ist nur mit einer Zahnbürste und Wasser (nicht
mit Zahnpaste) erlaubt. Dazu und während der Mahlzeiten muss die Schiene entnommen und
in einem Glas mit Kochsalzlösung gelagert werden.
Es steht Ihnen völlig frei, an dieser klinischen Studie teilzunehmen. Auch nach Einwilligung in
die Studie können Sie diese Einwilligung ohne Angabe von Gründen jederzeit zurückziehen.
Falls Sie bereit sind, an dieser Studie teilzunehmen, müssen Sie die Anweisungen von Frau
Hein genau befolgen. Wenn Sie die Behandlung beenden möchten oder unvorhergesehene
Ereignisse auftreten, sollten Sie Frau Hein sofort benachrichtigen.
Für alle weiteren Fragen steht Ihnen Frau Hein zur Verfügung
ZÄ Nicole Hein Dr. N. Arweiler
Abbildung 9-1: Merkblatt zur Probandeninformation
ANHANG 63
9.2 VITALITÄT NACH 8 UND 24 STUNDEN (IN VITRO)
Abbildung 9-2: Biofilm nach 8 Stunden in vitro
ANHANG 65
9.3 DICKEN DER BIOFILME IN µM AN DEN TAGEN 1 BIS 7
Tabelle 9-1: Mittelwerte ± Standardabweichungen der Biofilmdicken (µm) an den Tagen 1-7
Dicke (µm)
Probanden Tag 1 Tag 2 Tag 3 Tag 4 Tag 5 Tag 7
AD 42 38 84 150 66 138
AL 42 48 72 162 110 134
CD 56 72 138 102 162 134
DR 38 72 162 118 176 184
LH 32 26 60 66 84 90
MK 50 118 118 94 142 84
MM 44 190 140 80 108 146
NB 34 96 102 64 128 140
NH 38 68 98 132 114 124
RS 36 158 172 144 178 136
SB 70 108 178 110 168 118
SS 72 126 160 92 176 176
Mittelwerte 46,2 93,3 123,7 109,5 134,3 133,7
Standard-abweichungen ± 12,8 ± 47,1 ± 38,7 ± 31,1 ± 36,8 ± 27,8
vorne mitte hinten vorne mitte hinten
ANHANG 66
9.4 MITTELWERTE ± STANDARDABWEICHUNGEN DER VITALITÄTEN AN
DEN TAGEN 1 BIS 7
Tabelle 9-2: Mittelwerte ± Standardabweichungen der Vitalitäten (%) an den Tagen 1-7
Vitalität (%)
Probanden Tag 1 Tag 2 Tag 3 Tag 4 Tag 5 Tag 7
AD 69,1 31,5 80,8 68,5 69,5 65,4
AL 66,0 54,6 76,1 46,2 45,6 63,8
CD 68,0 36,5 85,1 50,4 67,3 58,7
DR 78,9 49,6 78,0 37,6 69,9 70,8
LH 22,6 36,3 76,4 12,5 64,4 49,5
MK 69,7 70,4 88,1 55,4 73,2 50,0
MM 70,7 73,7 90,6 33,2 69,2 69,8
NB 31,8 51,0 82,7 60,3 53,8 38,3
NH 49,0 58,1 87,3 63,8 76,9 62,0
RS 61,8 78,4 88,1 58,1 70,7 58,4
SB 59,8 54,4 89,7 38,2 55,5 48,4
SS 82,7 49,0 83,3 64,1 74,4 58,7
Mittelwerte 60,9 53,6 83,9 49,0 65,9 57,8
Standard-abweichungen ± 17,3 ± 14,3 ± 4,9 ± 15,6 ± 9,0 ± 9,2
vorne mitte hinten vorne mitte hinten
ANHANG 67
9.5 VITALITÄT DER 8 PROBANDEN NACH 48 H IM OK UND UK
Abbildung 9-4: Vitalität des Probanden AD nach 48 H im OK und UK
Abbildung 9-5: Vitalität des Probanden NH nach 48 H im OK und UK
0,00
10,00
20,00
30,00
40,00
50,00
60,00
70,00
80,00
90,00
100,00
1 4 7 10 13 16 19 22 25 28 31 34 37 40 43 46 49 52 55 58 61 64 67 70 73
Anzahl der Schichten
OA OB OC OD OE OF UA UB UC UD UE UF
0,00
10,00
20,00
30,00
40,00
50,00
60,00
70,00
80,00
90,00
100,00
1 4 7 10 13 16 19 22 25 28 31 34 37 40 43 46 49 52 55 58 61 64 67 70 73
Anzahl der Schichten
VF (%
)
OA OB OC OD OE OF UA UB UC UD UE UF
ANHANG 68
Abbildung 9-6: Vitalität des Probanden SS nach 48 h im OK und UK
Abbildung 9-7: Vitalität des Probanden CD nach 48 h im OK und UK
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
1 4 7 10 13 16 19 22 25 28 31 34 37 40 43 46 49 52 55 58 61 64 67 70 73
Anzahl der Schichten
VF (%
)
OA OB OC OD OE OF UA UB UC UD UE UF
0,00
10,00
20,00
30,00
40,00
50,00
60,00
70,00
80,00
90,00
100,00
1 4 7 10 13 16 19 22 25 28 31 34 37 40 43 46 49 52 55 58 61 64 67 70 73
Anzahl der Schichten
OA OB OC OD OE OF UA UB UC UD UE UF
ANHANG 69
Abbildung: 9-8: Vitalität des Probanden OG nach 48 h im OK und UK
0,00
10,00
20,00
30,00
40,00
50,00
60,00
70,00
80,00
90,00
100,00
1 4 7 10 13 16 19 22 25 28 31 34 37 40 43 46 49 52 55 58 61 64 67 70 73
Anzahl der Schichten
OA OB OC OD OE OF UA UB UC UD UE UF
Abbildung 9-9: Vitalität des Probanden RS nach 48 h im OK und UK
0,00
10,00
20,00
30,00
40,00
50,00
60,00
70,00
80,00
90,00
100,00
1 4 7 10 13 16 19 22 25 28 31 34 37 40 43 46 49 52 55 58 61 64 67 70 73
Anzahl der Schichten
OA OB OC OD OE OF UA UB UC UD UE UF
ANHANG 70
Abbildung 9-10: Vitalität des Probanden SR nach 48 h im OK und UK
Abbildung 9-11: Vitalität des Probanden NB nach 48 h im OK und UK
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
1 4 7 10 13 16 19 22 25 28 31 34 37 40 43 46 49 52 55 58 61 64 67 70 73
Anzahl der Schichten
OA OB OC OD OE OF UA UB UC UD UE UF
0,00
10,00
20,00
30,00
40,00
50,00
60,00
70,00
80,00
90,00
100,00
1 4 7 10 13 16 19 22 25 28 31 34 37 40 43 46 49 52 55 58 61 64 67 70 73
Anzahl der Schichten
OA OB OC OD OE OF UA UB UC UD UE UF
ANHANG 71
9.6 ÜBERSICHT DER VITALITÄT NACH PROBANDEN GEORDNET (TAGE 1
BIS 7)
AD
0,00
10,00
20,00
30,00
40,00
50,00
60,00
70,00
80,00
90,00
100,00
1 4 7 10 13 16 19 22 25 28 31 34 37 40 43 46 49 52 55 58 61 64 67 70 73 76 79 82 85 88 91 94
Schichten
Tag 1 Tag 2 Tag 3 Tag 4 Tag 5 Tag 7
DR
0,00
10,00
20,00
30,00
40,00
50,00
60,00
70,00
80,00
90,00
100,00
1 4 7 10 13 16 19 22 25 28 31 34 37 40 43 46 49 52 55 58 61 64 67 70 73 76 79 82 85 88 91 94
Schichten
Tag 1 Tag 2 Tag 3 Tag 4 Tag 5 Tag 7
CD
0,00
10,00
20,00
30,00
40,00
50,00
60,00
70,00
80,00
90,00
100,00
1 4 7 10 13 16 19 22 25 28 31 34 37 40 43 46 49 52 55 58 61 64 67 70 73 76 79 82 85 88 91 94
Schichten
Tag 1 Tag 2 Tag 3 Tag 4 Tag 5 Tag 7
LH
0,00
10,00
20,00
30,00
40,00
50,00
60,00
70,00
80,00
90,00
100,00
1 4 7 10 13 16 19 22 25 28 31 34 37 40 43 46 49 52 55 58 61 64 67 70 73 76 79 82 85 88 91 94
Schichten
Tag 1 Tag 2 Tag 3 Tag 4 Tag 5 Tag 7
AL
0,00
10,00
20,00
30,00
40,00
50,00
60,00
70,00
80,00
90,00
100,00
1 4 7 10 13 16 19 22 25 28 31 34 37 40 43 46 49 52 55 58 61 64 67 70 73 76 79 82 85 88 91 94
Schichten
Tag 1 Tag 2 Tag 3 Tag 4 Tag 5 Tag 7
MK
0,00
10,00
20,00
30,00
40,00
50,00
60,00
70,00
80,00
90,00
100,00
1 4 7 10 13 16 19 22 25 28 31 34 37 40 43 46 49 52 55 58 61 64 67 70 73 76 79 82 85 88 91 94
Schichten
Tag 1 Tag 2 Tag 3 Tag 4 Tag 5 Tag 7
ANHANG 72
MM
0,00
10,00
20,00
30,00
40,00
50,00
60,00
70,00
80,00
90,00
100,00
1 4 7 10 13 16 19 22 25 28 31 34 37 40 43 46 49 52 55 58 61 64 67 70 73 76 79 82 85 88 91 94
Schichten
Tag 1 Tag 2 Tag 3 Tag 4 Tag 5 Tag 7
RS
0,00
10,00
20,00
30,00
40,00
50,00
60,00
70,00
80,00
90,00
100,00
1 4 7 10 13 16 19 22 25 28 31 34 37 40 43 46 49 52 55 58 61 64 67 70 73 76 79 82 85 88 91 94
Schichten
Tag 1 Tag 2 Tag 3 Tag 4 Tag 5 Tag 7
NB
0,00
10,00
20,00
30,00
40,00
50,00
60,00
70,00
80,00
90,00
100,00
1 4 7 10 13 16 19 22 25 28 31 34 37 40 43 46 49 52 55 58 61 64 67 70 73 76 79 82 85 88 91 94
Schichten
Tag 1 Tag 2 Tag 3 Tag 4 Tag 5 Tag 7
SB
0,00
10,00
20,00
30,00
40,00
50,00
60,00
70,00
80,00
90,00
100,00
1 4 7 10 13 16 19 22 25 28 31 34 37 40 43 46 49 52 55 58 61 64 67 70 73 76 79 82 85 88 91 94
Schichten
Tag 1 Tag 2 Tag 3 Tag 4 Tag 5 Tag 7
NH
0,00
10,00
20,00
30,00
40,00
50,00
60,00
70,00
80,00
90,00
100,00
1 4 7 10 13 16 19 22 25 28 31 34 37 40 43 46 49 52 55 58 61 64 67 70 73 76 79 82 85 88 91 94
Schichten
Tag 1 Tag 2 Tag 3 Tag 4 Tag 5 Tag 7
SS
0,00
10,00
20,00
30,00
40,00
50,00
60,00
70,00
80,00
90,00
100,00
1 4 7 10 13 16 19 22 25 28 31 34 37 40 43 46 49 52 55 58 61 64 67 70 73 76 79 82 85 88 91 94
Schichten
Tag 1 Tag 2 Tag 3 Tag 4 Tag 5 Tag 7
Abbildungen 9-12 bis 9-23: Vitalität nach Probanden geordnet (Tage 1 bis 7)
ANHANG 73
9.7 ÜBERSICHT DER VITALITÄT ALLER PROBANDEN NACH TAGEN
GEORDNET
1. Tag
0,00
10,00
20,00
30,00
40,00
50,00
60,00
70,00
80,00
90,00
100,00
1 4 7 10 13 16 19 22 25 28 31 34 37 40 43 46 49 52 55 58 61 64 67 70 73 76 79 82 85 88 91 94
Anzahl der Schichten
AD AL CD DR LH MK MM NB NH RS SB SS
Abbildung 9-24: Vitalität der 12 Probanden am Tag 1
2. Tag
0,00
10,00
20,00
30,00
40,00
50,00
60,00
70,00
80,00
90,00
100,00
1 4 7 10 13 16 19 22 25 28 31 34 37 40 43 46 49 52 55 58 61 64 67 70 73 76 79 82 85 88 91 94
Anzahl der Schichten
AD AL CD DR LH MK MM NB NH RS SB SS
Abbildung 9-25: Vitalität der 12 Probanden am Tag 2
ANHANG 74
3. Tag
0,00
10,00
20,00
30,00
40,00
50,00
60,00
70,00
80,00
90,00
100,00
1 4 7 10 13 16 19 22 25 28 31 34 37 40 43 46 49 52 55 58 61 64 67 70 73 76 79 82 85 88 91 94
Anzahl der Schichten
AD AL CD DR LH MK MM NB NH RS SB SS
Abbildung 9-26: Vitalität der 12 Probanden am Tag 3
4. Tag
0,00
10,00
20,00
30,00
40,00
50,00
60,00
70,00
80,00
90,00
100,00
1 4 7 10 13 16 19 22 25 28 31 34 37 40 43 46 49 52 55 58 61 64 67 70 73 76 79 82 85 88 91 94
Anzahl der Schichten
AD AL CD DR LH MK MM NB NH RS SB SS
Abbildung 9-27: Vitalität der 12 Probanden am Tag 4
ANHANG 75
5. Tag
0,00
10,00
20,00
30,00
40,00
50,00
60,00
70,00
80,00
90,00
100,00
1 4 7 10 13 16 19 22 25 28 31 34 37 40 43 46 49 52 55 58 61 64 67 70 73 76 79 82 85 88 91 94
Anzahl der Schichten
AD AL CD DR LH MK MM NB NH RS SB SS
Abbildung 9-28: Vitalität der 12 Probanden am Tag 5
7. Tag
0,00
10,00
20,00
30,00
40,00
50,00
60,00
70,00
80,00
90,00
100,00
1 4 7 10 13 16 19 22 25 28 31 34 37 40 43 46 49 52 55 58 61 64 67 70 73 76 79 82 85 88 91 94
Anzahl der Schichten
AD AL CD DR LH MK MM NB NH RS SB SS
Abbildung 9-29: Vitalität der 12 Probanden am Tag 7
76
DANKSAGUNG
Frau Privatdozentin Dr. Nicole Arweiler möchte ich für die Überlassung des
Themas, die hervorragende Betreuung sowie die Unterstützung bei der Erstellung
dieser Arbeit herzlich danken.
Herrn Prof. Dr. Dr. N.-C. Gellrich danke ich für die Übernahme des
Zweitgutachtens.
Frau Marie Follo, Ph. D., möchte ich für die Auswertungen am konfokalen Laser-
Scanning-Mikroskop und die wertvollen Hinweise danken.
Mein Dank gilt auch Herrn Dr. Marc Metzger für seine Hilfe bei der Formatierung.
Dr. Thorsten Auschill danke ich für die Beratung und das Korrekturlesen dieser
Arbeit.
Den Probanden, die sich freundlicherweise zur Verfügung gestellt haben danke
ich herzlich sowie all denen, die auf verschiedenen Wegen zum Gelingen dieser
Arbeit beigetragen haben.
77
LEBENSLAUF
Name: Nicole Hein Geburtsdatum: 17.01.1973
Geburtsort: Dillingen a. d. Donau
Vater: Michael Hein, Zahntechnikermeister
Mutter: Josefine Hein, geb. Bestle, Fachwirtin für
kaufmännische Betriebsführung
SCHULAUSBILDUNG: 1979 – 1983 Grundschule in Sonthofen
1983 – 1992 Gymnasium in Sonthofen
Juli 1992 Abitur
BERUFSAUSBILDUNG: 1992 – 1995 Ausbildung als Zahntechnikerin
bei Dental-Labor Herbert Wetzstein in
Oberstdorf-Schöllang
Oktober 1995 Gesellenprüfung
STUDIUM: Oktober 1995 – Juli 2000 Studium der Zahnmedizin an der Albert-Ludwigs-
Universität Freiburg i. Br.
Oktober 1996 Naturwissenschaftliche Vorprüfung
April 1998 Zahnärztliche Vorprüfung
14. Dezember 2000 Abschluss der Zahnärztlichen Prüfung
10. Januar 2001 Approbation als Zahnärztin
BERUFLICHE TÄTIGKEIT: Seit April 2001 Assistenzzahnärztin in der Abteilung Poliklinik für
Zahnerhaltung und Parodontologie,
Universitätsklinik Freiburg i.Br.
Direktor: Prof. Dr. E. Hellwig
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