dna barcode keragaman genetik, dan konservasi...

DNA BARCODE KERAGAMAN GENETIK,

DAN KONSERVASI FAUNA INDONESIA

Oleh

M. Syamsul Arifin Zein

Peneliti Madya Bidang Genetika Molekuler Laboratorium Genetika

Bidang Zoologi

Pusat Penelitian Biologi

LIPI

All Birds DNA barcoding Initiative (ABBI) of Inaugural

Workshop (USA, 2005)

Second International Barcode of Life

Conference (Taiwan, 2007)

Zein MSA et al. 2007. Initiative DNA Barcoding Research in Indonesia.

Second International Barcode of Life Conference, Taipei, Taiwan.

Sutrisno H. 2007. Molecular Phylogeny of Indo-Australian Glyphodes and its Allied

Genera (Lepidoptera: Crambidae) Inferred from Mitochondrial COI and COII and

Nuclear EF-Iα Gene Sequences. Second International Barcode of Life

Conference.Taipei, Taiwan.

ILUSTRASI DNA BARCODE

Dasar pemikiran, Tujuan, dan Hasil

Apa yang disebut DNA Barcode ???

Barcoding: adalah pendekatan standar untuk

mengidentifikasi tumbuhan dan hewan dengan urutan

minimal sekuen DNA, yang disebut barcode DNA. (Barcoding is a standardized approach to identifying plants and animals by minimal

sequences of DNA, called DNA barcodes)

Barcode DNA:

Sebuah urutan DNA pendek, dari sebuah wilayah

yang seragam pada genom, yang digunakan untuk

mengidentifikasi spesies. (A short DNA sequence, from a uniform locality on the genome, used

for identifying species).

DASAR PEMIKIRAN STANDARISASI

DNA BARCODE

Mempercepat pembangunan perpustakaan

referensi urutan DNA yang konsisten dan

komprehensif

Mempercepat pengembangan teknologi yang

ekonomis untuk identifikasi spesies

TUJUAN

AGAR SIAPAPUN, DIMANAPUN,

KAPANPUN DAPAT

MENGIDENTIFIKASI DENGAN

CEPAT DAN AKURAT SPESIES

DARI SPESIMEN APAPUN

KONDISINYA

DNA BARCODE FAUNA....?????

DNA GENOME INTI

DNA MITOKONDRIA

DNA INTI: Exon dan intron

Exon adalah sekuens DNA yang ditranskripsi menjadi RNA dan ditranslasi menjadi polypeptida (coding region)

Intron adalah sekuens DNA yang tidak diubah menjadi RNA dan protein (Non coding region)

DNA MITOKONDRIA Genom DNA mitokondria berbentuk sirkuler, berisi 13 gen penyandi protein, 22 gen

transfer RNA (tRNA), 2 gen ribosoma (rRNA), dan daerah kontrol (control region/D-

Loop) dengan panjang sekitar 16.775 pasang basa (DESJARDIN dan MORAIS, 1990).

Mengapa barcode DNA Fauna dengan DNA mitokondria ?????

Mitokondria:

Merupakan organel yang memproduksi energi dalam sel tumbuhan dan

hewan, Dua puluh tahun penelitian telah menetapkan utilitas urutan DNA

mitokondria dalam membedakan antara spesies hewan yang berhubungan

erat.

Perbedaan antara spesies lebih besar

Jumlah copy:

Ada 100-10,000 lebih banyak salinan mitokondria dibandingkan DNA inti per sel, membuat pemulihan, terutama dari sampel kecil atau sebagian rusak, lebih mudahdan lebih murah

Relatif sedikit perbedaan dalam spesies

Dalam kebanyakan kasus, kecilnya perbedaan intraspesifik dan besarnya perbedaan interspesifik merupakan sinyal batas genetik yang berbeda antara sebagian besar spesies, memungkinkan identifikasi yang tepat dengan barcode DNA mitokondria

Gen di DNA mitokondria

Semua merupakan daerah coding ( tidak diselingi intron dan extron seperti pada gen inti), sehingga dapat amplifikasi langsung. Sedangkan pada gen inti sering terganggu dengan daerah non coding (intron) yang sering amplifikasi sulit dan tak terduga.

Results so far suggest that a

mitochondrial gene will enable

identification of most animal species.

Mengapa Standarisasi DNA Barcode Fauna

menggunakan COI ? Menggunakan Gen Protein DNA Mitokondria: Mendefinisikan wilayah standar dan membuat perbandingan antara urutan gen penyandi

protein yang mudah, karena gen protein umumnya tidak memiliki insersi dan delesi seperti yang ada di dalam gen ribosom.

Mitokondria Gen penyandi protein pada DNA mitokondria umumnya mengandung perbedaan lebih tinggi dari gen ribosom dan dengan demikian lebih mungkin untuk membedakan antara spesies yang berhubungan erat.

KESEPAKATAN INTERNASIONAL DNA BARCODE

FAUNA

Menggunakan Gen COI DNA Mitokondria:

Gen Cytochrome c oxidase subunit I (COI) merupakan reprensentatif dari semua gen penyandi protein DNA mitokondria

Segmen dekat terminus 5’ dari COI sepanjang sekitar 650 pasang basa merupakan daerah yang digunakan sebagai barcode DNA untuk fauna (Herbert et al. 2003)

COI terbukti memiliki variasi intraspesifik rendah, tetapi interspesifik divergensinya tinggi antara taksa yang berdekatan (closely allied taxa) (Ward et al. 2005; Hajbabaei et al. 2006a).

Primer Universal Standard: (amplifikasi muda dan hasil sekuen baik).

An Internal ID System for All Animals

Typical Animal Cell

Mitochondrion

DNA

mtDNA

D-Loop

ND5

H-strand

ND4

ND4L

ND3 COIII

L-strand

ND6

ND2

ND1

COII

Small ribosomal RNA

ATPase subunit 8

ATPase subunit 6

Cytochrome b

COI COI

The Mitochondrial Genome

DNA BARCODE PADA

MAMALIA

Universal Primer Mamalia: FORWARD:

LepF1-tl: 5”TGT AAA ACG ACG GCC AGT ATT CAA CCA ATC ATA AAG ATATTG G3”

VF1-tl: 5”TGT AAA ACG ACG GCC AGT TCT CAA CCA ACC ACA ARG AYA3”

VF1d-tl: 5”TGT AAA ACG ACG GCC AGT TCT CAA CCA ACC ACA ARG AYA TYG G3”

VFli-tl: 5”TGT AAA ACG ACG GCC AGT TCT CAA CCA ACC AAA GAA TGG3”

REVERSE:

LepR1-tl: 5”cag gaa aca gct atg cta aac ttc tgg atg tcc aaa aaa tca3”

VR1-tl: 5”cag gaa aca gct atg act aga ctt ctg ggt ggc cra ara ayc a3”

VR1d-tl: 5”cag gaa aca gct atg act aga ctt ctg ggt ggc caa aga atc a3”

VRli-tl: 5”cag gaa aca gct atg act aga ctt ctg ggt gcc aaa ac3”

(Ivanova et al. 2006). Mix 1:1:1:3

Primer untuk sekuensing: (Messing 1983)

M13F: 5”tgt aaa acg acg gcc agt3”

M13R:5”cag gaa aca gct atg ac3”

Hasil amplifikasi primer universal

Capillary Sequence Read

Barcode menegaskan

kesatuan dari spesies

Homo sapiens

Perbandingan menunjukkan

bahwa kita berbeda satu sama

lain dengan hanya 1 atau 2

nukleotida dari 648, sementara

kita berbeda dari simpanse

pada 60 lokasi dan gorila di 70

lokasi.

Teknik Molekuler untuk Identifikasi Spesies Ordo Cetartiodactyla

Menggunakan DNA Barcode (Zein MSA&Fitriana YS,2012)

ZooIndonesia:21(02):1-8.

112 spesimen, 4 famili, 10 marga and 15 spesies

Jarak genetik:

intraspesies : 0-0,7% (0,13±0,05%)

interspesies : 2-28%

intragenera : 8,8-27,4 (1,36±0,037%)

intergenera : 8,8-27,4%

intrafamily : 5,8-11,9% (7,8±2,85)

interfamili : 18,6-26,3%

Hasil rekonstruksi pohon filogeni Cetartiodactyla menunjukkan semua

spesies membentuk sebuah cluster kohesif yang jelas berbeda.

BARCODING DNA PADA SURVEI KOMUNITAS KELELAWAR PEMAKAN

SERANGGA DI INDONESIA

(DNA Barcoding in Surveys Microbat Communities in Indonesia)

(Zein and Fitriana)

Evaluasi pada

136 individu

6 Famili

45 spesies

Sekuen divergensi intraspesifik gen CO1 0.000 -

0,260.

Hipposideros papua.MG 3540

Hipposideros papua.MG 3542

Hipposideros papua.MG 3539

Hipposideros papua.MG 3538

Hipposideros papua.MG 3537

Hipposideros muscinus.MG 2967

Hipposideros muscinus.MG 2968

Hipposideros sabanus.MG 2745

Hipposideros cervinus.MG 2844

Hipposideros ater.MG 1687

Hipposideros ater.MG 1685

Hipposideros ater.MG 1686

Hipposideros diadema.MG 1237

Hipposideros diadema.MG 1556

Hipposideros diadema.MG 3545

Hipposideros diadema.MG 3650

Hipposideros larvatus.MG 2839

Hipposideros larvatus.MG 2840

Hipposideros larvatus.MG 2847

Hipposideros larvatus.MG 3299

Hipposideros

Pipistrellus Pipistrellus javanicus.MG 113

Asseliscus tricuspidatus.MG 3551

Asseliscus tricuspidatus.MG 3547

Asseliscus tricuspidatus.MG 3529

Asseliscus tricuspidatus.MG 3530

Asseliscus

Megaderma spasma.MG 2793

Megaderma spasma.MG 2794

Megaderma spasma.MG 106

Megaderma spasma.MG 2897

Megaderma spasma.MG 2902

Megaderma

Miniopterus pusillus.MG 3378

Miniopterus pusillus.MG 3379

Miniopterus schreibersi.MG 3367

Miniopterus australis.MG 1710

Miniopterus

Miniopterus australis.MG 3533

Miniopterus australis.MG 3534

Miniopterus australis.MG 3711

Miniopterus australis.MG 3532

Miniopterus australis.MG 2845

Miniopterus

Miniopterus schreibersi.MG 3536

Miniopterus schreibersi.MG 3699

Miniopterus schreibersi.MG 3700

Miniopterus

Pipistrellus Pipistrellus javanicus.MG 152

Miniopterus Miniopterus schreibersi.MG 90

Miniopterus schreibersi.MG 1018

Miniopterus schreibersi.MG 1709

Miniopterus magnater.MG 3247

Miniopterus medius.MG 2843

Miniopterus medius.MG 2841

Miniopterus medius.MG 2842

Miniopterus

Mosia Mosia nigrescens.MG 3681

Scotophilus kuhlii.MG 761

Scotophilus kuhlii.MG 763

Scotophilus kuhlii.MG 765

Scotophilus kuhlii.MG 796

Scotophilus kuhlii.MG 805

Scotophilus

Mops sarasinorum.MG 1528

Mops sarasinorum.MG 1529

Mops sarasinorum.MG 1513

Mops sarasinorum.MG 1519

Mops sarasinorum.MG 1511

Mops

Hipposideros Hipposideros diadema.MG 543

Chaerephon plicata.MG 2851

Chaerephon plicata.MG 2852

Chaerephon plicata.MG 2850

Chaerephon plicata.MG 2853

Chaerephon

Otomops Otomops formosus.MG 2539

Emballonura alecto.MG 2895

Emballonura alecto.MG 2894

Emballonura alecto.MG 2482

Emballonura alecto.MG 2498

Emballonura alecto.MG 2521

Emballonura alecto.MG 2795

Emballonura alecto.MG 2801

Emballonura

Taphozous Taphozous melanopogon.MG 2368

Phoniscus atrox.MG 3787

Phoniscus atrox.MG 3788Phoniscus

Harpiocephalus Kerivoula hardwickei.MG 3759

Kerivoula intermedia.MG 3798

Kerivoula hardwickei.MG 4127

Kerivoula papillosa.MG 3797

Kerivoula

Pipistrellus Pipistrellus javanicus.MG 2469

Tylonycteris Tylonycteris robustula.MG 1081

Pipistrellus javanicus.MG 3295

Pipistrellus javanicus.MG 3301Pipistrellus

Nyctophilus Nyctophilus sp.MG 2671

Tylonycteris Tylonycteris robustula.MG 1653

Harpiocephalus Harpiocephalus harpia.MG 3767

Myotis muricola.MG 3290

Myotis muricola.MG 2462

Myotis muricola.MG 1712

Myotis muricola.MG 2439

Myotis muricola.MG 472

Myotis muricola.MG 2747

Myotis muricola.MG 2748

Myotis muricola.MG 474

Myotis muricola.MG 464

Myotis muricola.MG 471

Myotis

100

69

100

100

100

75

100

99

76

92

100

100

100

100

66

100

100

66

88

100

100

100

100

100

70

48

100

48

41

81

100

62

86

100

84

79

100

100

92

100

100

100

100

97

78

99

100

100

100

93

73

78

51

100

48

100

58

100

98

96

96

98

100

99

100

100

58

50

64

59

82

70

51

57

44

70

44

51

25

47

19

35

27

18

13

26

15

2

6

0.02

Hasil Koreksi Identifikasi Lapangan dengan

DNA Barcode No. Spesimen Identifikasi lapangan Blast DNA barcode Kofirmasi

MG 3786 Rhinolophus philippinensis Rhinolophus trifoliatus R. trifoliatus

MG 3367 Miniopterus scheibersi Minioterus australis M. australis

MG 3379 Miniopterus pussilus Miniopterus australis M. australis

MG 3378 Miniopterus pussilus Miniopterus australis M. australis

MG 472 Myotis adversus Myotis muricola M. muricola

MG 474 Myotis adversus Myotis muricola M. muricola

MG 464 Myotis adversus Myotis muricola M. muricola

MG 464 Myotis adversus Myotis muricola M. muricola

MG 2747 Myotis ater Myotis muricola M. muricola

MG 2748 Myotis ater Myotis muricola M. muricola

MG 2895 Emballonura monticola Emballonura alecto M. alecto

MG 2894 Emballonura monticola Emballonura alecto M. alecto

___________________________________________________________________________

Barcoding DNA Kelelawar Pemakan Buah

(Chiroptera: Pteropodidae) Berdasarkan Sekuen Gen COI DNA Mitokondria

(Zein MSA & Fitriana YS)

Evaluasi pada: 120 spesimen, 17 genera, 43 species

Hasil menunjukkan intraspesific divergensi sekuen gen CO1 0- 13.4%.

Ada 3 spesies menunjukkan divergensi sekuen yang tinggi : Rousettus celebensis

(13.4%), Chironax melanocephalus (7.9%), dan Thoopterus nigrescens (2.9%),

Yang lain sekuen divergensinya rendah

Spesies pada genus Dobsonia (Dobsonia viridis, Dobsonia moluccensis, Dobsonia

crenulata); Cynopterus (Cynopterus minutus, Cynopterus brachyotis, Cynopterus

titthaecheilus, Cynopterus sphinx), dan genera Rousettus (Rousettus celebensis

Rousettus amplexicaudatus) menunjukkan closely allied taxa/kesalahan identifikasi

spesies.

Harus ada konfirmasi ulang diskripsi spesies yang telah dilakukan

DNA BARCODE PADA BURUNG

Interspesifik Lebih rendah dari 1%

Anas puna and Anas versicolor. Distance: 0.43 - 0.72%

Anas puna 1

Anas puna 2

Anas platalea

Anas versicolor 2

Anas cyanoptera 1

Anas cyanoptera 2

Anas versicolor 1

0.25%

Troglodytes aedon

(up to 4,5%)

Upucerthia dumetaria

(up to 5%)

Intraspesifik lebih besar dari 2%

Myophobus fasciatus

(up to 4,35%)

COI also discriminates between closely

related cryptic species. E.g. Myarchus spp.

M. tyrannulus 1

M. tyrannulus 2

M. tyrannulus 3

M. tyrannulus 4

M. swainsoni 1

M. swainsoni 2

M. tuberculifer 1

M. tuberculifer 2

M. tuberculifer 3

M. tuberculifer

M. swainsoni M. tyrannulus

M. ferox

1%

Criptic species

Urutan sekuen

COI pada

geografis

terpisah,

membenarkan

perlakuan

sebagai spesies

yang berbeda.

Misalnya

Lessonia spp.

Lessonia oreas

Lessonia rufa

L. oreas 1

L. oreas 2

L. oreas 3

L. oreas 4

L. oreas 5

L. oreas 6 L. rufa 1

L. rufa 2

L. rufa 3 L. rufa 4

1%

C. fuscus 1

C. fuscus 2

C. fuscus 3

C. fuscus 4

C. fuscus 5

C. atacamensis 1

C. atacamensis 2

C. atacamensis 3

C. patagonicus 1

C. patagonicus 2

1%

Genus Cinclodes

C. fuscus

1%

L. aegithaloides 3

L. aegithaloides 4

L. aegithaloides 5

L. aegithaloides 1

L. aegithaloides 2

L. fuliginiceps 1

L. fuliginiceps 2

L. fuliginiceps 3

Genus Leptasthenura

L. aegithaloides

L. platensis

L. fuliginiceps

L. aegithaloides

Serpophaga munda Serpophaga subcristata Serpophaga griseiceps

Serpophaga subcristata S. subcristata 1

S. subcristata 2

S. griseiceps 1

S. griseiceps 2

1%

Straneck 1993

The Data Barcode Standard

1.Minimum 500 bp, <1% ambiguous base calls 2.Double stranded sequence 3.Trace files and associated quality scores 4.Primers used to generate sequence 5.Linkages to:

• A morphological voucher specimen • Structured reference to collections • Geospatial reference information • Valid species name • Who performed the identification • Literature citations

How Barcoding is Done

From specimen to sequence to species

Voucher Specimen

DNA extraction CO1 gene DNA sequencing Trace file

Database of Barcode

Records

Collecting

N

D

3

C

O

I

I

I

N

D

2

N

D

1

Membangun perpustakaan referensi barcode :

Spesimen voucher diidentifikasi dengan baik

Sampel Jaringan

Ekstrak DNA

Amplifikasi PCR

Sekuensing DNA

Data submission to GenBank

Pengawetan Jaringan Sampel:

1. Nitrogen cair (paling baik)

2. DMSO

3. Alkohol absolut (pure grade)

Ekstraksi DNA

PCR

Sekuensing

Mamalia

Burung

Insekta

Fauna

Lainnya

Kekuatan

Penawaran alternatif alat identifikasi taksonomi untuk

situasi di mana morfologi tidak meyakinkan.

Fokus pada satu atau sejumlah kecil gen memberikan

efisiensi yang lebih besar

Biaya sekuensing DNA juga menurun karena kemajuan

teknis.

Potensi kapasitas yang tinggi dan dapat memproses

sampel dalam jumlah besar.

Setelah database referensi didirikan, dapat diterapkan

oleh non-spesialis

Beberapa aspek yang paling menarik mengandalkan

teknologi masa depan, misalnya, sequencer genggam

What barcode users would do with the

reference libraries

Inspection stations at every port and international airport for:

Agricultural pest control

Illegal trade in endangered species

Violations of trade quotas

Water quality surveys

Food inspection

Public health monitoring and diagnoses

Beberapa Hasil Penelitian

Menggunakan DNA Barcode

Peta lokasi koleksi material DNA

diberbagai tempat di Indonesia

Terima Kasih