diagnóstico de laboratorio del covid-19...procesamiento de hasta 32 muestras. tiempo de...

Diagnóstico de Laboratorio del COVID-19

Dr. Roger Soto Palma

Microbiólogo Inmunohematólogo

Jefatura de Laboratorio Clínico

Hospital CIMA San José

Virus SARS Cov-2

• Virus de 70 a 90 nm de diámetro.

• Familia Coronaviridae

• Receptor en la célula: ACE-2 (altaafinidad).

• ARN banda sencilla

• Virus cubierto (membranacellular).

• Otros coronavirus que infectan a los humanos: SARS Cov 1, MERS, HCoV-229E, HCoV NL63, HCoV-HKU1, y HCoV-OC43.

Replicación del virus SARS Cov-2

Swatantra Kumar, et.al. 2020. Morphology, Genome Organization, Replication and Pathogenesis of Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2 (SARS Cov-2)

Genoma del virus SARS Cov-2

Swatantra Kumar, et.al. 2020. Morphology, Genome Organization, Replication and Pathogenesis of Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2 (SARS Cov-2)

Genoma organizado en 32 kb, con 11 ORF, que codifican para 9680 aminoácidosQue forman las proteínas virales.

Genoma del virus SARS Cov-2

microbenotes.com

Diagnóstico de Covid-19• Reacción en Cadena de la

Polimerasa con Retro Transcripción (PCR-RT)

• Detección de antígenos,

• Serología (anticuerpos IgM e IgG)

• Cultivo (líneas celulares Vero)

• Microscopia electrónica

Curso de la infección por SARS Cov-2

Sethuraman, N. et al. 2020. Interpreting Disgnostic Test for SARS-Cov 2. JAMA, 323(22):2249-2251.

Sethuraman, N. et al. 2020. Interpreting Disgnostic Test for SARS-Cov 2. JAMA, 323(22):2249-2251• Pacientes hospitalizados con cuadro de Covid-

19 severo presentan una carga viral más alta que los pacientes asintomáticos.

• PCR positivo no necesariamente indica la presenciade virus viables. Cantidad de virus viables empieza a declinar a partir del octavo día de síntomas.

• Los anticuerpos son detectables a partir de la segunda o tercera semana de inicio de la infección.

• Pruebas de ELISA que detectan anticuerpos contra la nucleocápside viral y la proteína de unión al receptor (Espícula) combinados, muestran la másalta sensibilidad y especificidad.

• Sin embargo, para las pruebas serológicas siempreexiste la posibilidad de reacciones cruzadas con anticuerpos dirigidos a otros coronavirus.

Valor predictivo positivo de acuerdo con cada tipo de prueba

Zhao, J. Et al. Antibody responses to SARS-Cov 2 in Patients of Novel CoronavirusDisease 2019. The Lancet, marzo 2020.

Diagnóstico Agudo de COVID-19• Metodología de PCR Tiempo Real: más alta sensibilidad y

especificidad.

• Detección de secuencias específicas del ARN del virus SARS Cov-2.

• Muestra: Hisopado nasofaríngeo, hisopado orofaríngeo, aspirado nasofaríngeo (saliva ?)

• Estándar para diagnóstico de casos agudos.

• Hasta la fecha, es la única metodología autorizada para suuso en el país.

HisopadoNasofaríngeo:

Torundas de DacrónMedio de TransporteViral

Estabilidad de 48 a 72horas, de 2 a 6°C

¿Qué es la metodología de PCR?

• Técnica molecular para la amplificación de fragmentos de ADN y ARN

• Fases del Análisis: Extracción del material genético, reacción en cadena de la polimerasa (PCR), detección de secuencias blanco.

• Etapas del PCR:

Desnaturalización, Alineamiento,amplificación

Extracción de Material Genético

• Ruptura de las células.

• Precipitación del ADN y ARN

• Concentración en un vial de muestra.

• Obtención del Extracto

Preparación del PCR:

Se agregan los Primers, la Polimerasa y el “Master Mix”

Primers identifican los genes específicos del virus

Etapas del PCR

TERMOCICLADOR ROTORGENE

La SONDA que esuna secuenciamarcada con un Fluorocromo es liberada durante amplificación

Señal luminosa va aumentando conformeaparecen más copias delGen de interés

Causas de Falsos Negativos en análisis de PCR, entre ellos, para el SARS-Cov 2

• Recolección de la muestra en una etapa muy temprana de la infección.

• Técnica de recolección inapropiada.

• Transporte y almacenamiento inapropiado de la muestra.

• Reactivos degradados.

• Muestra no validada para el análisis.

• Presencia de inhibidores de la Polimerasa en al muestra.

Causasde Falsos Positivosen análisis de PCR, entre ellos, para el SARS-Cov 2

• Contaminación de la Muestra

• Contaminación del equipo o el sitio de montaje

• Falta de especificidad del kit de PCR (Primer o Sonda): reacción cruzada con otroscoronavirus.

1) Plataforma QiaGen

Sistema abierto: reactivos de varias casas comerciales se adaptan y validan con estos

equipos.

Extracción de hasta 12 muestras al mismo tiempo.

Procesamiento de hasta 32 muestras.

Tiempo de procesamiento aproximado: 4 horas

Preparación de muestras, montaje e interpretación de los resultados necesita de personal

capacitado.

Se usa actualmente en nuestro Laboratorio para determinación de tuberculosis, enfermedades de transmisión sexual, dengue, zika, chikungunya y papiloma

Plataforma QiaGen: Kits disponibles en Laboratorio CIMA para COVID-19

KIT PCR-RT Marca País de Fabricación

Fecha deAutorización (para su uso en LabCIMA)

Genes queDetecta

GeneFinder COVID-19 Plus

Elitech(OSANGHealthcare)

Corea del Sur 31 de Marzo del 2020

RdRpEN

SARS-Cov-2 Real Time PCR

VIASURE(CerTest Biotec)

España 6 de abril ORF1abN

Vitassay qPCRSARS-Cov-2

Vitassay (Vitassay Healthcare S.L.U.)

España 7 de abril ORF1abN

2) Plataforma Film Array

• Sistema cerrado: solo para kits Film Array

• 5 kits en uso actualmente: Panel Respiratorio, panel Gastrointestinal, panel de Pneumonía, panel de Meningitis, panel de Identificación de Hemocultivos.

• Procesamiento dura 1 hora 10 minutos

• Un kit por muestra, solo es posible correr 1 muestra a la vez por equipo

• El Laboratorio cuenta con 2 analizadores

Plataforma FilmArray para COVID-19

• Casa Biomeriux desarrolló el kit SARS-Cov 2 R-Gene Test.

• Resultado en 45 minutos* (*tiempo de respuesta depende del número de muestras pendientes de analizar)

• Disponible a partir del 12 de mayo, permiso otorgado para su uso desde el 8 de abril

• Se podrían montar un máximo 2 muestras a la vez

Panel FilmArray COVID-19

• Fabricante: Biofire Defense LC

• País de fabricación: Estados Unidos (Biofire)

• Tecnología PCR RT

• Genes que detecta: ORF1ab (dos regiones), ORF8

AnalizadorTORSH Film Array

TécnicasSerológicas

AntibodyPerformance

Measure

Estimate of

Performance

95% Confidence

Interval

IgG Sensitivity (PPA) 100% (88/88) (95.8%; 100%)

IgG Specificity (NPA)99.6%

(1066/1070)(99.0%; 99.9%)

IgGPPV at

prevalence = 5%92.9% (83.4%; 98.1%)

IgGNPV at

prevalence = 5%100% (99.8%; 100%)

Abbott Architect SARS-CoV-2 IgG

Fuente: https://www.fda.gov/medical-devices/emergency-situations-medical-devices/eua-authorized-serology-test-performance

AntibodyPerformance

Measure

Estimate of

Performance

95% Confidence

Interval

Combined Sensitivity (PPA) 93.8% (120/128) (88.2%; 96.8%)

Combined Specificity (NPA) 96.0% (240/250) (92.8%; 97.8%)

CombinedPPV at

prevalence = 5%55.2% (39.2%; 69.8%)

CombinedNPV at

prevalence = 5%99.7% (99.3%; 99.8%)

Cellex qSARS-CoV-2 IgG/IgM Rapid TestDe

Fuente: https://www.fda.gov/medical-devices/emergency-situations-medical-devices/eua-authorized-serology-test-performance

AntibodyPerformance

Measure

Estimate of

Performance

95% Confidence

Interval

IgM Sensitivity 100% (30/30) (88.7%; 100%)

IgM Specificity 100% (80/80) (95.4%; 100%)

IgG Sensitivity 96.7% (29/30) (83.3%; 99.4%)

IgG Specificity 97.5% (78/80) (91.3%; 99.3%)

Combined Sensitivity 100% (30/30) (88.7%; 100%)

Combined Specificity 97.5% (78/80) (91.3%; 99.3%)

CombinedPPV at

prevalence = 5%67.8% (35.0%; 88.4%)

CombinedNPV at

prevalence = 5%100% (99.4%; 100%)

Healgen COVID-19 IgG/IgM Rapid Test Cassette

Próximas Pruebas disponibles para SARS-Cov 2• Panel Respiratorio Film Array 2.1: Panel con 17

virus y bacterias que causan infecciones respiratorias más el SARS Cov-2.

• Anticuerpos IgG contra SARS-Cov 2: inmunoensayo automatizado por metodología de quimioluminiscencia, para analizador Architecti1000 SR.

GRACIAS