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Aus dem
Lehrstuhl für Diagostische Radiologie
der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg
Direktor: Prof. Dr. med Michael Uder
Cytotoxizität gadoliniumhaltiger Kontrastmittel auf renale
Tubuluszellen in vitro:
Vergleich eines nichtionischen iodhaltigen
Röntgenkontrastmittels mit gadoliniumhaltigen
Kontrastmitteln
bei gleichen molaren Konzentrationen und Konzentrationen
gleicher Röntgendichte
Inauguraldissertation
zur Erlangung der Doktorwürde
der Medizinischen Fakultät
der Friedrich-Alexander-Universität
Erlangen-Nürnberg
vorgelegt von
Sonja Reichert geb. Kohlbacher
aus
Saarbrücken
Inhaltsverzeichnis
Zusammenfassung ______________________________________________ 6
Abstract_______________________________________________________ 8 1. Einleitung__________________________________________________ 10
1.1 Kontrastmittel-induzierte Nephropathie ___________________________ 10 1.2 Einteilung und Anwendung der Kontrastmittel_____________________ 11 1.3 Fragestellung _________________________________________________ 20
2. Materialien und Methoden ____________________________________ 21 2.1 Materialien ___________________________________________________ 21 2.2 Methodik _____________________________________________________ 26
3. Ergebnisse _________________________________________________ 34 3.1 Visueller Vergleich der Röntgendichte iodhaltiger und gadoliniumhaltiger Kontrastmittel ___________________________________________________ 34 3.2 Vergleich der Cytotoxizität bei gleicher Röntgendichte ______________ 35 3.3 Vergleich gadoliniumhaltiger und iodhaltiger Kontrastmittel bei äquimolaren Konzentrationen ______________________________________ 37 3.4 Trypanblau-Test_______________________________________________ 44 3.5 ELISA zur Detektion von Apoptose und Nekrose____________________ 46
4. Diskussion _________________________________________________ 50 4.1 Klinische Relevanz der Kontrastmittel-induzierten Nephropathie ______ 50 4.2 Pathogenese der Kontrastmittel-induzierten Nephropathie ___________ 52 4.3 Prophylaxe der Kontrastmittel-induzierten Nephropathie ____________ 53 4.4 Verwendung von Gadoliniumchelaten_____________________________ 54 4.5 Vergleich der Kontrastmittel in vivo ______________________________ 56 4.6 Vergleich der Kontrastmittel in vitro _____________________________ 59 4.7 Kontrastmittelkonzentrationen und Inkubationszeiten ______________ 70 4.8 Zellkultur als in vitro-Modell ____________________________________ 73 4.9 Limitationen der Untersuchungen________________________________ 74 4.10 Resümee und Schlussfolgerung__________________________________ 75
Literaturverzeichnis ____________________________________________ 77
Abkürzungsverzeichnis ________________________________________ 105 Vorveröffentlichungen_________________________________________ 106
Danksagung _________________________________________________ 107
Zusammenfassung
6
Zusammenfassung Hintergrund und Ziele
Die in der Radiologie für diagnostische und interventionelle Röntgenverfahren
eingesetzten iodhaltigen Kontrastmittel können zu schwerwiegenden
Beeinträchtigungen der Nierenfunktion, der kontrastmittelinduzierten
Nephropathie führen, die oft mit hohen Mortalitätsraten einhergeht. Dagegen
gelten die gadoliniumhaltigen MRT-Kontrastmittel als sehr gut
nierenverträglich. Daher wird zurzeit diskutiert, inwiefern der Einsatz
gadoliniumhaltiger Kontrastmittel für CT und Angiographie eine Alternative
zur Verwendung von herkömmlichen iodhaltigen Kontrastmitteln darstellen
könnte.
Methoden
Um die cytotoxischen Effekte eines iodhaltigen Kontrastmittels mit
verschiedenen gadoliniumhaltigen Kontrastmitteln vergleichen zu können,
führten wir Experimente an Kulturen renaler Tubuluszellen (LLC-PK1) durch.
Dazu wurden LLC-PK1-Zellen mit dem Iod-Kontrastmittel Iomeprol und den
Gadolinium-Kontrastmitteln Gadopentetatdimeglumin, Gadobenatdimeglumin,
Gadoteratmeglumin und Gadodiamid bei gleichen molaren Konzentrationen
und Konzentrationen, die sich in ihrer Röntgendichte entsprechen für 24
Stunden inkubiert. Um die Rolle der Osmolalität bewerten zu können, wurden
die Zellen außerdem mit Mannitol-Lösungen entsprechender Osmolalität
inkubiert. Die Cytotoxizität wurde durch einen MTT-Konversionstest, einen
Trypanblau-Exklusionstest und einen ELISA zur Detektion von Apoptose und
Nekrose bewertet.
Ergebnisse und Beobachtungen
Bei äquimolaren Konzentrationen zeigten Gadopentetat und Gadobenat eine
signifikant höhere Inhibition der MTT-Konversion als Gadoterat, Gadodiamid
und Iomeprol (p < 0,001). Wie durch den Trypanblau-Test gezeigt werden
konnte, waren nach Inkubation mit Gadopentetat signifikant mehr Zellen
Zusammenfassung
7
abgestorben als nach Inkubation mit Iomeprol (p < 0,001). Gadopentetat und
Gadobenat induzierten signifikant mehr Apoptose und Nekrose als die übrigen
Kontrastmittel (p < 0,001). Bei Konzentrationen gleicher Röntgendichte war
die Inhibition der MTT-Reduktion nach Inkubation mit Iomeprol bei allen
Konzentrationen signifikant geringer als bei allen getesteten Gadolinium-
Kontrastmitteln (p < 0,001). Somit führten alle getesteten gadoliniumhaltigen
Kontrastmittel bei Konzentrationen gleicher Röntgendichte zu stärkeren
cytotoxischen Effekten als das iodhaltige Kontrastmittel. Die ionischen
hochosmolalen Gadoliniumchelate führten zu stärkeren Zellschädigungen als
die nichtionischen Gadolinium-Kontrastmittel mit niedriger Osmolalität.
Praktische Schlussfolgerungen
Unsere Exprimente lassen darauf schließen, dass die gadoliniumhaltigen
Kontrastmittel bei Konzentrationen, die sich in ihrer Röntgendichte
entsprechen, in vitro ein höheres nephrotoxisches Potential aufweisen, als die
auf Iod basierenden Kontrastmittel. Möglicherweise ist es bei Angiographien
sinnvoller, statt der Gadoliniumchelate zur Nephroprotektion verdünnte
Lösungen der herkömmlichen Iod-Kontrastmittel zu verwenden, die die gleiche
oder sogar bessere Bildqualität bieten. Bevor die Verwendung von
Gadoliniumpräparaten für Röntgenuntersuchungen empfohlen werden kann,
sollten daher größere klinische Studien durchgeführt werden, die die
Nephrotoxizität der Iod-Kontrastmittel und Gadolinium-Kontrastmittel in
Konzentrationen vergleichen, die die gleiche Röntgendichte aufweisen und
damit auch zu vergleichbarer Bildqualität führen.
Abstract
8
Abstract Cytotoxicity of gadolinium-based MRI contrast agents on renal tubular
cells in vitro: comparison of a nonionic iodinated radiographic contrast
medium and gadolinium-based MRI contrast agents at equi-attenuating
and equimolar concentrations.
Goals of this study
The iodine based contrast media used in diagnostic and interventional radioloy
can lead to severe impairment of renal function known as contrast media-
induced nephropathy, which often involves high mortality rates. In contrast,
gadolinium-based MRI contrast agents are known to have very good renal
tolerance. Therefore, the use of gadolinium-based contrast media for CT and
angiography as a possible alternative to the use of conventional iodinated
contrast agents is under discussion.
Materials and methods
To compare the cytotoxic effects of an iodine-based contrast media with
several gadolinium-based agents we conducted some experiments using
cultured renal tubule cells (LLC-PK1). Cells were incubated with the iodinated
contrast agent iomeprol, the gadolinium chelates gadoptentetate dimeglumine,
gadobenate dimeglumine, gadoterate meglumine, or gadodiamide at equimolar
and equi-attenuating doses for 24 hours. To assess the role of osmolality cells
were also incubated with corresponding mannitol solutions. Cytotoxicity was
assesed using the MTT test, a trypan blue exclusion test, and an ELISA to
detect apoptosis and necrosis.
Results
At equimolar concentrations gadopentetate and gadobenate showed a
significantly higher inhibition of MTT conversion than gadoterate, gadidiamide
and iomeprol (p < 0,001). As we could demonstrate using the trypan blue test,
Abstract
9
after incubation with gadopentetate significantly more cells were dead than
after incubation with iomeprol (p < 0,001). Gadopentetate and gadobenate
induced significantly more apoptosis and necrosis than the other contrast media
(p < 0,001).
At equi-attenuating concentrations inhibition of MTT reduction after
incubation with iomeprol was significantly lower than after incubation with all
gadolinium-based contrast agents tested (p < 0,001).
In summary, all gadolinium-based contrast media led to stronger cytotoxic
effects than the iodinated contrast agent. Ionic gadolinium chelates of high
osmolality involved stronger cell damage than nonionic gadolinium contrast
agents with low osmolality.
Conclusion:
Our experiments suggest, that gadolinium-based contrast agents at equi-
attenuating concentrations possess a higher nephrotoxic potential than
iodinated contrast agents in vitro. For reasons of nephroprotection maybe it is
more reasonable to use dilute solutions of conventional iodinated contrast
agents in angiography which provide equal or even better image quality instead
of using gadolinium chelates. Before the use of gadolinium-based contrast
agents for X-ray radiography can be recommended, there should be more
clinical studies to compare nephrotoxicity of iodinated and gadolinium-based
contrast agents in equi-attenuating concentrations which provide equal image
quality.
Einleitung
10
1. Einleitung
1.1 Kontrastmittel-induzierte Nephropathie
Die interventionelle und diagnostische Radiologie umfasst einige
Untersuchungen und Eingriffe, die unter Einsatz von iodhaltigen
Kontrastmitteln durchgeführt werden, wie beispielsweise die Digitale
Subtraktionsangiographie (DSA), Urographie und computertomographische
Untersuchungen. Obwohl die Verabreichung dieser Kontrastmittel in der
Mehrzahl der Fälle gut vertragen wird, steigt mit zunehmender Anwendung
von Verfahren unter Kontrastmittelgabe im klinischen Alltag (KATZBERG,
2006) und zunehmendem Alter und Morbidität der Patienten (TOMS, 2001)
auch die zu erwartende Anzahl von Komplikationen dieser Verfahren. Eine der
wichtigsten Komplikationen nach intravaskulärer Anwendung von
Kontrastmitteln ist die Kontrastmittel-induzierte Nephropathie (KIN), die die
dritthäufigste Ursache für im Krankenhaus erworbenes akutes Nierenversagen
darstellt (BERG, 2000; NASH, 2002; BAKER, 2003; BRIGUORI, 2003).
Diese ist definiert als eine Verschlechterung der Nierenfunktion in Folge der
Kontrastmittelgabe, mit Erhöhung des Kreatinin-Wertes im Serum um mehr als
25 % oder 44 µmol/l (0,5 mg/dl) innerhalb von drei Tagen, wenn eine andere
Ätiologie ausgeschlossen werden kann (MORCOS, 1998; ASPELIN, 2003). In
der Mehrzahl der Fälle zeigt sich ein benigner Verlauf mit Wiederherstellung
der Nierenfunktion innerhalb von 10 bis 14 Tagen (BAKER, 2003). In einigen
Fällen, vor allem bei Patienten mit Risikofaktoren, kommt es jedoch zur
transienten oder sogar zur dauerhaften Dialysepflichtigkeit (McCULLOUGH,
1997; GRUBERG, 2000; RIHAL, 2002). Dabei ist die KIN mit einer hohen
Mortalität und einer geringen Langzeitüberlebensrate verknüpft, vor allem
wenn die Nephropathie die Dialysepflichtigkeit des Patienten nach sich zieht
(LEVY, 1996; McCULLOUGH, 1997; GRUBERG, 2000; FREEMAN, 2002;
RIHAL, 2002; MARENZI, 2004; DANGAS, 2005).
Einleitung
11
Die Inzidenz eines akuten Nierenversagens nach Kontrastmittelgabe wird in
der Allgemeinbevölkerung mit weniger als 2 % angegeben (ASPELIN, 2003;
BERG, 2000; NIKOLSKY, 2003), jedoch steigt sie bei Zugehörigkeit zu einer
der Risikogruppen deutlich an (MANSKE, 1990; RUDNICK, 1995;
McCULLOUGH, 1997; NIKOLSKY, 2003). Zu den Risikofaktoren zählen
hierbei vor allem eine vorbestehende renale Insuffizienz und zusätzlicher
Diabetes mellitus sowie hohes Alter, hohe Dosen des verwendeten
Kontrastmittels, Dehydratation, Herzinsuffizienz und vorhergehende KIN
(RUDNICK, 1995; MORCOS, 1999).
Für Patienten mit vorbestehender Nierenfunktionseinschränkung finden sich in
der Literatur Angaben der Inzidenz zwischen 12 und 27 % (MORCOS, 1998).
Eine Studie bei Patienten mit diabetischer Nephropathie zeigt sogar eine
Inzidenz von 50 % (MANSKE, 1990).
Die Pathomechanismen, welche zur Ausprägung der KIN führen, sind
momentan noch nicht zur Genüge aufgeklärt. Hämodynamische
Veränderungen des renalen Blutflusses, insbesondere medulläre Ischämie und
Hypoxie, eventuell unter Beteiligung vasoaktiver Substanzen wie Adenosin
und Endotheloin, direkte cytotoxische Effekte möglicherweise mit Beteiligung
freier Radikale, Apoptose- und Nekroseauslösung und ein Anstieg des
intratubulären hydrostatischen Druckes, ausgelöst durch die osmotische
Diurese aufgrund der KM-Gabe oder der hohen Viskosität der Kontrastmittel,
werden dafür verantwortlich gemacht (MORCOS, 1998; HEYMAN, 1998;
UEDA, 1998; HIZOH, 1998; RUDNICK, 2003; HAUESSLER, 2004; IDEE,
2004; PERSSON, 2005; SEELIGER, 2007).
1.2 Einteilung und Anwendung der Kontrastmittel
Der Einsatz von Kontrastmitteln (KM) in der Radiologie dient der Verstärkung
von Kontrasten und damit zur Verbesserung der Qualität von bildgebenden
Verfahren. Die auftreffenden Röntgenstrahlen werden durch die Kontrastmittel
abgeschwächt und es resultiert ein stärkerer Kontrast zum KM-freien Gewebe,
welches die Röntgenstrahlung passieren lässt. Der Absorption der
auftreffenden Röntgenstrahlung dienen bei den Röntgen-Kontrastmitteln die
Einleitung
12
enthaltenen Iodatome, die mit ihrer hohen Ordnungszahl die Röntgenstrahlung
stärker abschwächen als die Atome im Weichteil- und Fettgewebe, deren
durchschnittliche Ordnungszahlen deutlich geringer sind. Die Grundstruktur
aller iodhaltigen Kontrastmittel ist der triiodierte Benzolring, der in den
Positionen 2, 4 und 6 mit Iod substituiert ist.
Die im klinischen Alltag gebräuchlichen iodhaltigen Röntgen-Kontrastmittel
können in vier Gruppen eingeteilt werden. Man unterscheidet ionisch
monomere, ionisch dimere, nichtionisch monomere und nichtionisch dimere
iodhaltige Kontrastmittel (ALMEN, 1990). Die Begriffe monomer und dimer
leiten sich dabei von der Anzahl der Benzolringe pro Kontrastmittelmolekül
ab. Ionische Kontrastmittel weisen eine hohe Wasserlöslichkeit aufgrund ihrer
ionischen Struktur auf. Im Gegensatz dazu muss bei nichtionischen KM eine
adäquate Wasserlöslichkeit durch Einführen einer genügend hohen Zahl von
Hydroxylgruppen geschaffen werden (ALMEN, 1990). Abb. 1-4 zeigen die
Grundstrukturen der verschiedenen Gruppen der Röntgen-Kontrastmittel, Abb.
5 zeigt die Struktur des in dieser Studie verwendeten nichtionischen Monomers
Iomeprol.
M+
I
R
ICOO-
RI
Abb. 1: Grundstruktur ionisch monomerer Iod-Kontrastmittel
Einleitung
13
M+
R
I
R I
R
IR
I
I R
I
COO-
Abb .2: Grundstruktur ionisch dimerer Iod-Kontrastmittel
I I
RI
R
NHO R
Abb. 3: Grundstruktur nichtionisch monomerer Iod-Kontrastmittel
ONH
R
I
I
R
IRR
IO
NHR
I R
I
Abb. 4: Grundstruktur nichtionisch dimerer Iod-Kontrastmittel
Einleitung
14
I
I I
NCH3
OOH
O NHOH
OH
O
OHOH
Abb. 5: Strukturformel Iomeprol (Imeron)
Die ionischen Kontrastmittel liegen als Salze vor, die in wässriger Lösung in
das iodhaltige Anion und das zugehörige Kation, je nach Kontrastmittel
beispielsweise Na+ oder Methylglucosamin (Meglumin), dissoziieren. Dadurch
liegt die Osmolalität der Lösung deutlich über der von nichtionischen KM.
Man teilt KM daher auch anhand ihrer Osmolalität ein in hochosmolale
(ionisch monomere) KM mit einer Osmolalität von zwischen 1500 und 1790
mosm/kg H2O in einer Lösung von 300 mg I/ml bei 37 ºC (Ioxitalamat),
niedrigosmolale (ionisch dimere oder nichtionisch monomere) KM mit etwa
520-720 mosm/kg H2O (Ioxaglat, Iomeprol) und isoosmolale (nichtionisch
dimere) KM mit circa 290-320 mosm/kg H2O (Iotrolan, Iodixanol). Tabelle 1
zeigt die Einteilung der iodhaltigen Kontrastmittel und die jeweiligen
Osmolalitäten.
Einleitung
15
KM-Klasse
Kontrastmittel
Osmolalität (mosm/kg H2O, 37ºC) bei 300mg
I/ml Ionische Monomere
Amidotrizoat, Ioxitalamat
1500-1790
Ionische Dimere
Ioxaglat
560
Nichtionische Monomere
Iomeprol, Iohexol, Iopamidol, Ioversol, Iopromid
521-720
Nichtionische Dimere
Iotrolan, Iodixanol
290-320
Tabelle 1: Klasseneinteilung iodhaltiger Kontrastmittel mit Angabe von Kontrastmitteln der jeweiligen Klasse und der Osmolalität.
In den letzten Jahren ist gezeigt worden, dass computertomographische
Untersuchungen und Angiographien auch mit einer weiteren Gruppe von
Kontrastmitteln, den Gadoliniumchelaten, möglich sind (PENA, 1999;
SPINOSA, 2000; LE BLANCHE, 2001; GUPTA, 2002; RIEGER, 2002;
SPINOSA, 2002; KALINOWSKI, 2003; KIM, 2003; BAE, 2004; STRUNK,
2004; REMY-JARDIN, 2005). Dabei handelt es sich um eine Gruppe von KM,
die ursprünglich zur Kontrastgebung in der Magnetresonanztomographie
entwickelt wurden. Sie enthalten anstelle von Iodatomen das Lanthanoid
Gadolinium. Der Aufbau dieser KM beruht auf einem anderen Prinzip als der
der iodhaltigen: die Gadolinium-Atome sind nicht kovalent gebunden, sondern
sind Teil eines Chelat-Komplexes. Daher folgt auch deren Einteilung anderen
Kriterien. Man unterscheidet je nach Struktur des Chelat-Komplexes zwischen
linearen und zyklischen KM und wie bei den Iod-Kontrastmitteln zwischen
ionischen und nichtionischen KM (REIMER, 2004). Daraus folgen ebenfalls
unterschiedliche Osmolalitäten und die Einteilung in hoch- und
niedrigosmolale KM. Die Abbildungen 6-9 zeigen die Strukturformeln der in
dieser Arbeit verwendeten Gadolinium-Kontrastmittel. Tabelle 2 zeigt eine
Aufstellung aller in dieser Arbeit verwendeten KM unter Angabe der
Wirkstoffbezeichnung, des Handelsnamens, der Molekülstruktur und der
Osmolalität.
Einleitung
16
N
N
N
O-
Gd3+
O-
O
O
O-
O
O-O
O-
O
CH3
CH2CCCCCH2OH
NH2+
H OHOH HH OHH OH
2-
2
Abb. 6: Strukturformel Gadopentetatdimeglumin (Magnevist)
O
N
N
N
O-
Gd3+
O-
O
O
O-
O
O-O
O-
O
CH3
CH2CCCCCH2OH
NH2+
H OHOH HH OHH OH
2
2-
Abb. 7: Strukturformel Gadobenatdimeglumin (Multihance)
Einleitung
17
N N
N N
Gd 3+
O--O
O O
-O O-
OO
CH3
CH2CCCCCH2OH
NH2+
H OHOH HH OHH OH
-
+
Abb. 8: Strukturformel Gadoteratmeglumin (Dotarem)
Gd 3+
N
-O
NN
O
O-O
O
NHH3C
O
NHCH3
O-
O
Abb. 9: Strukturformel Gadodiamid (Omniscan)
Einleitung
18
Bezeichnung
Handelsname
Molekulare Struktur
Iod-konzentration
[mg I/ml]
KM-konzentration
[mM]
Osmolalität [mosm/kg
H2O]
Iomeprol-300
Imeron 300 Nichtionisch,
monomer
300
788
521
Iomeprol-190
-- Nichtionisch,
monomer
190
500
301
Iomeprol-150
Imeron 150 Nichtionisch,
monomer
150
394
350
Gadopentetat-dimeglumin (Gd-DTPA)
Magnevist
Linear, ionisch
--
500
1960
Gadobenat-dimeglumin
(GdBOPTA)2- Multihance Linear,
ionisch
--
500
1970
Gadoterat-meglumin
(Gd-DOTA) Dotarem Zyklisch,
ionisch
--
500
1350
Gadodiamid (Gd-DTPA-
BMA) Omniscan Linear,
nichtionisch
--
500
780
Tabelle 2: Aufstellung der verwendeten Kontrastmittel unter Angabe von Bezeichnung, Handelsname, Molekülstruktur, Iodkonzentration, Molarität und Osmolalität.
Die Gadolinium-Kontrastmittel gelten als sicher in Bezug auf nephrotoxische
Nebenwirkungen in den bei Kernspin-Untersuchungen verwendeten
Konzentrationen von bis zu 0,3 mmol/kg Körpergewicht (NIENDORF, 1991;
TOMBACH, 2001; THOMSEN, 2004). Eine Zulassung dieser Präparate für
die Anwendung in der Computertomographie und Angiographie liegt
allerdings nicht vor. Gadoliniumhaltige KM erreichen bei intravasaler
Anwendung in den oben genannten Dosen auch nicht den gleichen Röntgen-
Kontrast, der mit üblichen Dosierungen iodhaltiger Kontrastmittel erzielt
werden kann. Folglich sind auch Bildqualität und diagnostische
Aussagefähigkeit bei Verwendung von Gadolinium-KM denen bei
Einleitung
19
Verwendung von Iod-KM unterlegen (STRUNK, 2004). Es ist zudem berichtet
worden, dass bei Einsatz von Gd-KM in höherer Dosierung ebenfalls eine
nephrotoxische Wirkung auftreten kann (ROSIOREANU, 2004; THOMSEN,
2004). In den letzten Jahren zeigt sich darüber hinaus eine neuartige Entität, die
mit der Applikation von Gadolinium-Kontrastmitteln in Zusammenhang
gebracht wird: die nephrogene systemische Fibrose. Es handelt sich hierbei um
eine Erkrankung, die sich hauptsächlich an der Haut in Form von Fibrosierung
der Haut an den Extremitäten manifestiert, die jedoch auch auf Muskulatur und
andere Organe übergreifen und tödlich enden kann (BRIDGES, 2009;
GOULLE, 2009; TEN DAM 2009). Da es zudem tierexperimentelle Hinweise
darauf gibt, dass die allgemeine Toxizität der Gadolinium-KM bei
Konzentrationen, die die gleiche Röntgenabsorption ergeben wie iodhaltige
KM, 6- bis 25-mal höher ist als die iodierter KM, bleibt die Verwendung von
Gd-KM für computertomographische Untersuchungen und Angiographie
weiterhin umstritten (WEINMANN, 1990; MORCOS, 1999; NYMAN, 2002).
Messungen der Röntgendichte iodhaltiger und gadoliniumhaltiger
Kontrastmittel in vitro zeigen, dass die 0,5 molaren Gadoliniumchelate bei den
für die digitale Subtraktionsangiographie üblichen 70-80 kV in etwa die
gleiche Abschwächung von Röntgenstrahlung zeigen wie Iod-KM mit 60-80
mg I/ml. Bei einer 80 kg schweren Person würde man bei einer Dosierung von
0,3 mmol/kg KG maximal etwa 50 ml Gadolinium-KM geben dürfen. Dies
würde in etwa dem Volumen von 50 ml eines auf 60-80 mg I/ml verdünnten
Iod-KM oder 10-13 ml des unverdünnten Iod-KM entsprechen (NYMAN,
2002).
Da für viele Anwendungen der interventionellen Radiologie wesentlich größere
Volumina benötigt werden, würde hier nur der off-label use, also die
Anwendung außerhalb der Zulassung, von sehr großen Mengen der
Gadolinium-KM in Frage kommen. In der Tat wurde bereits über den Einsatz
auch sehr großer Volumina von bis zu 440 ml von Gadolinium-Kontrastmitteln
für Röntgenuntersuchungen berichtet (GEMMETE, 2001; THOMSEN, 2002;
STRUNK, 2004).
Insgesamt bleibt die Verwendung der Gd-Kontrastmittel weiterhin ein strittiges
Thema: Während einige Autoren darin Vorteile für Patienten mit
Einleitung
20
Risikofaktoren für die Entwicklung einer KIN sehen (WAGNER, 2001;
GUPTA, 2002; RIEGER, 2002; SPINOSA, 2002; FURUICHI, 2004; REMY-
JARDIN, 2005; KALINOWSKI, 2007), gibt es gleichsam auch Autoren, die
aufgrund von tierexperimentellen Studien, klinischen Untersuchungen und
Fallberichten die Meinung vertreten, dass Gadolinium-KM nicht für die
Anwendung außerhalb von Kernspin-Untersuchungen geeignet sind
(GEMERY, 1998; ELMSTAHL, 2004; ERLEY, 2004).
1.3 Fragestellung
Ziel dieser Studie war es zu untersuchen, ob die Gadolinium-Kontrastmittel
weniger toxisch auf renale Tubuluszellen wirken als iodhaltige Kontrastmittel.
Dazu wurden die Kontrastmittel bei gleichen molaren Konzentrationen und bei
Konzentrationen, die sich in ihrer Röntgendichte entsprechen, verglichen. Die
Untersuchung der Kontrastmittel bei gleicher molarer Konzentration zielte
dabei darauf ab, die Cytotoxizität der Kontrastmittelmoleküle vergleichen zu
können. Die Untersuchungen der Kontrastmittel bei Konzentrationen, die in
der Bildgebung gleiche Röntgendichte ergeben würden, sollte vor allem zur
Klärung der klinischen Fragestellung beitragen, ob der Gebrauch der
Gadolinium-Kontrastmittel eine sinnvolle Alternative zur Verwendung
iodhaltiger Kontrastmittel bei Patienten mit Kontraindikationen gegen
iodhaltige KM darstellen könnte.
Zudem sollte untersucht werden, ob der cytotoxische Effekt von
Kontrastmitteln allein durch die Osmolalität der Kontrastmittel zu erklären ist
und in wieweit die Auslösung von Nekrose und Apoptose für die
Nierenzellschädigung durch die verschiedenen Kontrastmittel von Bedeutung
ist.
Material und Methoden
21
2. Materialien und Methoden
2.1 Materialien
2.1.1 Chemikalien MTT-Testreagenz Sigma,Taufkirchen, Deutschland Medium 199 EARLE (1x) Biochrom, Berlin, + 2,2 g NaHCO3 mit Phenolrot Deutschland Trypsin/EDTA-Lösung Biochrom, Berlin, 0,05 % / 0,02 % in PBS Deutschland L-Glutamin (200 mM) Biochrom, Berlin,
Deutschland
Penicillin/Streptomycin Biochrom Berlin, (1000 U/ 10000 µg/ml) Deutschland Fetal bovine serum (FBS) GIBCO Invitrogen
Karlsruhe, Deutschland
Trypanblau MERCK, Darmstadt, Deutschland Fluka Chemika, Buchs, Deutschland Hepes Roth, Karlsruhe, Deutschland D-Mannitol Serva, Heidelberg, Deutschland Natriumdodecylsulfat (SDS) Serva, Heidelberg, Deutschland Essigsäure Roth, Karlsruhe,
Deutschland Dimethylformamid (DMF) AppliChem, Darmstadt, Deutschland
Material und Methoden
22
2.1.2 Medien, Puffer und Lösungen Kulturmedium 500 ml Medium 199 Biochrom, Berlin, Deutschland + 5 ml L-Glutamin Biochrom, Berlin, Deutschland + 5 ml Penicillin/Streptomycin Biochrom, Berlin, Deutschland + 50 ml FBS Invitrogen,
Karlsruhe, Deutschland
Testmedium 500 ml Medium 199 Biochrom, Berlin,
Deutschland + 5 ml Penicillin/Streptomycin Biochrom, Berlin,
Deutschland
Lyse-Puffer für MTT-Test 20,0 % SDS (Natriumdodecylsulfat) Serva, Heidelberg,
Deutschland 33,3 % DMF (Dimethylformamid) AppliChem, Darmstadt, Deutschland 2 % Essigsäure Roth, Karlsruhe, Deutschland pH eingestellt auf 4,7 PBS (phosphate buffer saline) Na2HPO4 8,3 mmol/l NaH2PO4 0,16 mmol/l Linaris, NaCl 185 mmol/l Bettingen am Main, Deutschland
Material und Methoden
23
Mannitol-Lösungen: Mannit-520 47,7 g D-Mannitol Serva, Heidelberg, Deutschland 1,192 g Hepes Roth, Karlsruhe,
Deutschland 500 ml Aqua dest. pH eingestellt auf 7,4 Mannit-1860 84,72 g D-Mannitol Serva, Heidelberg,
Deutschland 0,593 g Hepes Roth, Karlsruhe, Deutschland 250 ml Aqua dest. pH eingestellt auf 7,4 Mannit-780 35,5 g D-Mannitol Serva, Heidelberg, Deutschland 0,593 g Hepes Roth, Karlsruhe, Deutschland 250 ml Aqua dest. pH eingestellt auf 7,4 Trypanblau-Lösung 0,5 g Trypanblau MERCK,
Darmstadt, Deutschland
0,9 g NaCl Fluka Chemika, Buchs, Deutschland 100 ml Aqua dest. MTT-Lösung (7,5 mg/ml) 750 mg MTT-Reagenz [3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazoliumbromid] 100 ml PBS
Material und Methoden
24
2.1.4 Kontrastmittel Iomeprol-300 Imeron 300
ALTANA Pharma, Konstanz, Deutschland
Iomeprol-150 Imeron 150
ALTANA Pharma, Konstanz, Deutschland
Gadopentetatdimeglumin Magnevist Schering AG
Berlin, Deutschland Gadobenatdimeglumin Multihance ALTANA Pharma
Konstanz, Deutschland
Gadoteratmeglumin Dotarem Guerbet Roissy, Frankreich Gadodiamid Omniscan
GE Healthcare Braunschweig, Deutschland
2.1.5 Test-Set Cell Death Detection ELISAPLUS Roche Applied
Science
Mannheim, Deutschland
Material und Methoden
25
2.1.6 Zellkulturzubehör Kulturflaschen 75 cm2 CELLSTAR, mit Filterkappe Frickenhausen, Deutschland 96-Well-Mikrotiterplatten CELLSTAR, steril Frickenhausen, Deutschland 6-Well-Platten CELLSTAR,
Frickenhausen, Deutschland
2.1.7 Geräte ELISA-Reader Dynatech MR 5000, Dynatech.
Alexandria, CA, USA
2.1.8 Zellen LLC-PK1-Zellen American Type
Culture Collection ATCC, Rockville
MD, USA
Material und Methoden
26
2.2 Methodik
2.2.1 Zellkultur Für die Versuche wurden LLC-PK1–Zellen verwendet, die schon
verschiedentlich als in vitro-Modell zur Untersuchung der Nephrotoxizität
verschiedener Substanzen (FALAHATPISHEH, 2001; DOMINGUEZ, 2002)
Verwendung gefunden haben. Die Verwendung dieser Zelllinie gilt als
etabliertes Verfahren zur Aufklärung von Pathomechanismen renaler
Schädigungen unter Ausschluss störender äußerer Faktoren (wie beispielsweise
hämodynamische Veränderungen) (IDEE, 1996).
Die LLC-PK1-Zelllinie wurde erstmals 1958 aus den Nieren eines Hampshire-
Schweines kultiviert und ist durch die Ausbildung dreidimensionaler so
genannter Dome-Strukturen, d.h. flüssigkeitsgefüllte kuppelartig aufgewölbte
Areale innerhalb der Zellschicht, die bei Erreichen der Konfluenz zu
beobachten sind, charakterisiert (HULL, 1976). Die Zellen zeigen typische
Eigenschaften proximaler Tubuluszellen (MULLIN, 1980) und sind im
Gegensatz zu anderen renalen Zelllinien weitestgehend homogen (IDEE,
1996).
Die Zellen wurden in Kulturflaschen mit Filter in modifiziertem Medium 199
kultiviert. Dem Medium wurden 2 mM L-Glutamin, 10 % fetales Kälberserum
(FBS), 100 U/ml Penicillin und 100 µg/ml Streptomycin zugesetzt. Die
Temperatur wurde bei hoher Luftfeuchtigkeit und einem Anteil von 5 % CO2
konstant auf 37 ºC gehalten. Alle 72 Stunden wurde das Medium erneuert, um
optimales Wachstum der Zellen zu gewährleisten. Nach sieben Tagen war die
Konfluenz des Zellrasens erreicht und die Zellen wurden nach Absaugen des
Mediums gesplittet. Dazu wurden die Zellen zweimal mit 37 ºC warmer PBS-
Pufferlösung gewaschen, um eventuelle Interaktionen von
Mediumbestandteilen mit dem Trypsin auszuschließen. Um den Zellrasen
aufzulösen wurden die Zellen für 2-5 Minuten mit Trypsin/EDTA-Lösung
inkubiert bis die Zellen begannen sich abzukugeln. Anschließend wurde die
Lösung abgesaugt und die Zellen nochmals für 20-30 Minuten in den
Material und Methoden
27
Brutschrank gestellt. Nach dieser Zeit konnten die nun komplett abgerundeten
Zellen durch Klopfen von der Wand gelöst und in Medium überführt werden.
Ein Teil der Zellen wurde für die Versuchsdurchführung verwendet, der andere
wurde weiter kultiviert. Dieser Vorgang konnte bis zu einer Passagenzahl von
13-15 wiederholt werden.
2.2.2 Visueller Vergleich der Röntgendichte von Gadolinium-Kontrastmitteln und dem iodhaltigen Kontrastmittel Iomeprol Um die Kontrastmittelkonzentrationen bestimmen zu können, die sich in ihrer
Röntgendichte entsprechen, wurden verschiedenen Verdünnungen des Iod-KM
Iomeprol mit 50, 75, 150, 190 und 300 mg I/ml und die Gadolinium-
Kontrastmittel Gadopentetatdimeglumin, Gadobenatdimeglumin,
Gadoteratmeglumin und Gadodiamid mit 0,5 mol/l in Spritzen gefüllt und
diese anschließend bei etwa 70 kV durchleuchtet. Um die Wirkungen des
menschlichen Körpers zu imitieren wurden die Spritzen dabei von einer 20 cm
hohen Wasserschicht bedeckt. Anschließend wurden die Bilder beurteilt und
die Kontrastmittelkonzentrationen bestimmt, die in etwa zur gleichen
Röntgendichte geführt hatten.
2.2.3 Testlösungen
Zum Vergleich der Effekte von iodhaltigen Kontrastmitteln gegenüber
gadoliniumhaltigen Kontrastmitteln wurden Verdünnungen der Kontrastmittel
Iomeprol-300 (Imeron 300), Iomeprol-150 (Imeron 150),
Gadopentetatdimeglumin (Magnevist), Gadobenatdimeglumin (Multihance),
Gadoteratmeglumin (Dotarem) und Gadodiamid (Omniscan) verwendet. Zur
Kontrolle des Osmolalitätseffektes wurden zusätzlich entsprechend
konzentrierte Mannitol-Lösungen verwendet. Eine Mannitol-Lösung von 780
mosm/kg H2O entspricht der Osmolalität von Omniscan und eine Lösung von
520 mosm/kg H2O diente der Kontrolle des osmolalen Effektes von Iomeprol-
300. Zur Kontrolle des Osmolalitätseffektes von Magnevist wurde eine Lösung
von 1860 mosm/kg H2O verwendet, obwohl die Osmolalität dieses
Kontrastmittels bei 1960 mosm/kg H2O liegt. Eine entsprechend hoch
Material und Methoden
28
konzentrierte Mannitol-Lösung konnte allerdings wegen der Übersättigung der
Lösung nicht verwendet werden.
Zur Herstellung der Verdünnungen, die sich in der Röntgendichte entsprechen
sollten, wurde von folgendem Sachverhalt ausgegangen: Eine Lösung eines
Iod-KM mit 75 mg I/ml würde bei den in der Angiographie üblichen 70 – 80
kV etwa die gleiche Röntgendichte aufweisen wie die 0,5 M Gadolinium-KM
(NYMAN 2002). Es wurden daher die auf Iod basierenden KM bei einer
Konzentration von 75 mg I/ml im Medium mit 0,5 M Gadoliniumverbindungen
im Medium in verschiedenen Verdünnungen verglichen. Das entspricht
Verdünnungen von Iomeprol-300 von 1:8, 1:16 und 1:32 und Verdünnungen
von Iomeprol-150 von 1:4, 1:8 und 1:16 vs. Verdünnungen von Gd-KM von
1:2, 1:4 und 1:8. Die zugehörigen Mannitol-Lösungen wurden entsprechend
verdünnt.
Da eine Lösung des iodhaltigen Kontrastmittel Iomeprol mit 300 mg I/ml einer
788 mM Lösung entspricht, wurde Iomeprol-300 mit destilliertem Wasser im
Verhältnis 1:1,58 verdünnt, so dass man eine Lösung von 500 mM (Iomeprol-
190) erhielt. So war es möglich das iodhaltige Kontrastmittel mit den
Gadolinium-Kontrastmitteln bei gleicher molarer Konzentration zu
vergleichen.
Die Lösung von Iomeprol-190 sowie die Gadolinium- und Mannitol-Lösungen
wurden jeweils im Verhältnis von 1:2, 1:4, 1:8 und 1:16 mit serumfreiem
Medium verdünnt. Dies entsprach KM-Konzentrationen von 250, 125, 62,5
und 31,25 mM.
Material und Methoden
29
2.2.4 MTT-Test
Der MTT-Test stellt ein etabliertes Verfahren zur Testung der Cytotoxizität
verschiedenster Substanzen in der Zellkultur dar und wurde bereits für
verschiedenste Untersuchungen eingesetzt (TOUTAIN, 1992; ANDERSEN,
1998; KREISBERG, 1988; WANG, 1998; AHLENSTIEL, 2003;
THAMILSELVAN, 2002; BALACHANDRAN, 2005; HANIGAN, 2005;
NAKANISHI, 2005; TOLSON, 2005).
Der MTT-Test misst die Aktivität der zellulären Dehydrogenasen lebender
Zellen unabhängig davon, ob sie momentan DNA synthetisieren oder nicht und
gilt als Test für die Lebensfähigkeit der Zelle. MTT ist eine heterozyklische
organische Verbindung, die zur Gruppe der Tetrazoliumsalze gehört. Das
schwach gelbe MTT wird über noch nicht komplett aufgeklärte Mechanismen
in die Zelle aufgenommen, wo sein Tetrazoliumring durch die Dehydrogenasen
aktiver Mitochondrien oder durch andere zelluläre Dehydrogenasen
aufgebrochen wird und wodurch das alkohollösliche dunkelblaue Formazan
entsteht. Anschließend werden die Zellen mittels des Detergens SDS lysiert
und das Formazan freigesetzt. Die Intensität der entstandenen Formazan-
Lösung kann dann photometrisch bestimmt werden (MOSMANN 1983, LIU
1997).
In unseren Experimenten verwendeten wir die Methode nach MOSMANN, der
diesen Cytotoxizitäts-Test 1983 erstmals etabliert hat, in modifizierter Form:
Die trypsinierten Zellen wurden in Medium 199 mit FBS aufgenommen und
anschließend in sterile 96-Well-Mikrotiterplatten mit flachem Boden in einer
Dichte von 30.000-40.000/well ausgesät. Dazu wurden in jede Vertiefung 100
µl der Zellsuspension gegeben. Die Zellen wurden anschließend für 24 Stunden
inkubiert, so dass die Zellen adherieren und durch Teilung einen konfluenten
Zellrasen mit Domes bilden konnten.
Nach der Inkubation wurde das Medium abgesaugt und in jede Vertiefung 200
µl der jeweiligen Kontrastmittellösung bzw. Medium ohne Wachstumsfaktoren
Material und Methoden
30
(Kontrolle) gegeben. Die Zellen wurden mit den Testsubstanzen wiederum für
24 Stunden inkubiert.
Nach Ablauf der Inkubationszeit wurde das MTT-Testreagenz hinzu gegeben
und die Zellen damit 2 Stunden inkubiert, um die Aufnahme des gelben MTT
und die Umwandlung in das blaue Reaktionsprodukt zu ermöglichen. Danach
wurde der Überstand abgegossen und die Zellen mit der SDS/DMF-Essigsäure
lysiert und somit das entstandene Formazan freigesetzt. Die Mikrotiterplatten
wurden anschließend für einige Minuten in den Brutschrank gestellt und
daraufhin für 10-15 Minuten geschüttelt, bis die Zellen vollständig aufgelöst
waren und eine klare Lösung entstand. Die Konzentration des Farbstoffes
wurde mittels eines ELISA-Readers (Dynatech MR 5000) bei einer
Wellenlänge von 570 nm bezüglich einer Referenzlänge von 630 nm
gemessen.
2.2.5 Zeitkinetik der Zellschädigung
Zur Beurteilung der Zeitabhängigkeit der Zellschädigung durch Gadolinium-
Kontrastmittel verwendeten wir exemplarisch Gadopentetatdimeglumin
(Magnevist). Die Zellen wurden mit Konzentrationen von 62,5 und 250 mM
des Kontrastmittels über 2, 8, 24 und 48 Stunden inkubiert. Nach Ablauf der
Inkubationszeit wurde der MTT-Test wie oben beschrieben durchgeführt.
2.2.6 Trypanblau-Test Der Trypanblau-Test beruht auf der Tatsache, dass bei lebenden Zellen der
verwendete Farbstoff nicht ins Zellinnere gelangen kann und sie daher
ungefärbt bleiben, während der Farbstoff bei avitalen Zellen eindringen kann,
so dass tote Zellen sich mit dem betreffenden Farbstoff anfärben.
Für diesen Test wurden die Zellen in 6-Well-Platten in einer Dichte von
100.000 Zellen/ml bzw. 200.000 Zellen/Well ausgesät, die sicherstellen sollte,
dass nach 24 Stunden Inkubation ein subkonfluenter Zellrasen entstand. Eine
Konfluenz sollte nicht erreicht werden, da in diesem Zustand bereits mit dem
Absterben von Zellen zu rechnen ist.
Material und Methoden
31
Die Zellen wurden ausgesät und 24 Stunden in Kulturmedium inkubiert.
Anschließend wurden die Zellen für 24 Stunden mit Medium ohne FBS bzw.
Verdünnungen von Imeron-190 und Magnevist (jeweils 1:2 und 1:4) behandelt.
Der Überstand wurde nach Ablauf der Inkubationszeit abgenommen und
zentrifugiert. Das Pellet wurde in je 900 µl PBS aufgenommen. Der Zellrasen
des dazugehörigen Wells wurde zweimal mit PBS gewaschen und
anschließend für eine Minute mit Trypsin überschichtet. Anschließend wurde
das Trypsin abgesaugt und sobald alle Zellen abgelöst waren, wurden sie zu
den Zellen des Überstandes gegeben. Danach wurden 100 µl der 0,5 %igen
Trypanblau-Lösung hinzugegeben, so dass insgesamt eine 0,05 %ige Farbstoff-
lösung resultierte, die auch in früheren Studien schon Verwendung gefunden
hat (SCHICK, 1999).
Anschließend wurden 10 µl der Lösung nach gründlicher Durchmischung in
eine Zählkammer eingefüllt und die gefärbten und ungefärbten Zellen sofort
unter dem Mikroskop ausgezählt. Aus den erhaltenen Zellzahlen wurde dann
der prozentuale Anteil der abgetöteten blauen Zellen an der Gesamtzellzahl
errechnet.
2.2.7 ELISA-Test zur Detektion von Nekrose und Apoptose
Nach dem Nachweis der Zellschädigung von Tubuluszellen durch iodhaltige
und gadoliniumhaltige Kontrastmittel in den vorhergehenden Versuchen sollte
als nächstes die Frage geklärt werden, inwiefern die Schädigung in der
Auslösung von Nekrose und Apoptose eine Erklärung findet.
Dazu wurde ein enzymgekoppelter Immuntest (ELISA, enzyme-linked
immuno sorbent assay) durchgeführt, dem ein so genanntes Sandwich-Prinzip
zugrunde liegt. Der Test ist in der Lage histongebundene DNA-Fragmente
durch Bindung von Antikörpern und eine anschließenden Farbreaktion
nachzuweisen.
An eine mit Streptavidin beschichtete Platte binden dabei spezielle Antikörper,
die auch spezifisch sind für den Histonanteil der Nucleosomen. Somit kommt
es zum „Einfangen“ der Nucleosomen an der Platte. An den DNA-Teil der
Nucleosomen bindet ein weiterer Antikörper, der außerdem ABTS [2,2 -́
Azino-bis(3-ethylbenzothiazolin-6-Sulfonsäure), Diammoniumsalz] binden
Material und Methoden
32
kann. Wird ABTS gebunden, so kommt es zu einer enzymatischen
Farbreaktion deren Reaktionsprodukt man photometrisch bestimmen kann.
Mit dem Test kann man die zwei bekannten Arten des Zelltodes differenzieren,
indem einerseits der Zellkulturüberstand mit DNA-Fragmenten bereits
nekrotischer Zellen mit permeabler Membran analysiert werden kann
(Nachweis von Nekrose) und indem ein Lysat der Zellen untersucht wird,
deren Membran primär noch intakt ist (Apoptose).
Zunächst wurden die Zellen in einer Dichte von etwa 30.000-40.000/Well in
eine 96-Well-Mikrotiterplatte mit Kulturmedium eingesät und für etwa 24
Stunden proliferieren lassen. Dann wurden die Zellen mit Testmedium und den
verschiedenen Kontrastmittel- und Mannitol-Verdünnungen, wie sie auch im
MTT-Test verwendet wurden, überschichtet. Beispielhaft wurde hier eine
Verdünnung von 1:4 gewählt.
Nach dem Ablauf der Inkubationszeit von 24 Stunden wurden die Platten bei
1300 Umdrehungen/Minute für 7 Minuten zentrifugiert. Anschließend wurde
der Zellkulturüberstand abgenommen und bis zur Weiterverarbeitung bei 4 ºC
gelagert.
Die zurückgebliebenen Zellen wurden daraufhin mit 200 µl Lysepuffer für 30
min bei Raumtemperatur inkubiert. Nach dieser Zeit wurden die Platten
nochmals zentrifugiert und das Lysat vorsichtig abgenommen.
Nun wurden jeweils 20 µl einer Positivkontrolle, bestehend aus DNA-Histon
Komplexen, des Zellkulturüberstandes, des Zelllysates und des
Inkubationspuffers (als Background-Kontrolle) in die Vertiefungen einer mit
Streptavidin beschichteten Platte überführt. Dazu wurden je 80 µl eines
Immunreagenz gegeben. Dieses bestand aus Anti-Histon-Biotin, einem
monoklonalen Maus-Antikörper, der einerseits an das Streptavidin und
andererseits an den Histonanteil der Nucleosomen binden kann, aus Anti-
DNA-POD (anti-DNA-Maus-Antikörper konjugiert mit Peroxidase) als
weiteren Antikörper für die Bindung der DNA-Komponente und die
Farbreaktion mit ABTS als Substrat für die Peroxidase sowie aus einem
Inkubationspuffer. Die Mikrotiterplatten wurden dann bei Raumtemperatur 2
Stunden unter Schütteln inkubiert. Somit wurde eine gründliche
Material und Methoden
33
Durchmischung der Komponenten gewährleistet und die Bindung der
Antikörper sichergestellt.
Der Überstand wurde nach 2 Stunden verworfen und die Platte anschließend 3-
4mal mit 300 µl Inkubationspuffer/Well gewaschen, um überschüssige, d.h.
nicht gebundene Antikörper zu entfernen und damit eine unspezifische
Enzymreaktion auszuschließen. Nach dem Trockenklopfen der Platte wurden
100 µl ABTS-Lösung/Well zugegeben und damit eine enzymatische
Farbreaktion ausgelöst. Nach etwa 3-5 Minuten wurde die Extinktion bei einer
Wellenlänge von 405 nm gegen eine Referenzwellenlänge von 492 nm
gemessen.
Von den erhaltenen Werten wurde der Background-Wert jeweils subtrahiert
und ein Anreicherungsfaktor durch Division der gemittelten Extinktion der
geschädigten Zellen durch die Extinktion der Kontrollzellen, berechnet.
2.2.8 Statistische Analyse
Die Ergebnisse der Versuche werden als Mittelwert Standardfehler des
Mittelwertes (S.E.M.) angegeben. Die Anzahl toter Zellen im Trypanblau-Test
werden als Prozentsatz der Gesamtzellzahl angegeben. Die Daten des MTT-
Tests werden als Prozentsatz der ungeschädigten Kontrollzellen angegeben.
Die Daten des ELISA-Tests wurden als prozentuale Differenzen zur Kontrolle
angegeben. Um die Effekte der verschiedenen Kontrastmittel untereinander
und mit den Effekten der Mannitol-Lösungen und den unbehandelten
Kontrollzellen zu vergleichen, wurden die Daten einer Varianzanalyse mittels
Einweg-ANOVA und eines nachfolgenden Tukey-post-hoc-Tests analysiert.
Zusätzlich wurde ein Zweiwege-ANOVA-Test durchgeführt, um die
Signifikanz der Interaktionen zu bewerten. Ein p-Wert < 0,05 wurde als
signifikant angesehen. Mit Ausnahme des Zweiwege-ANOVA-Tests wurde für
alle statistischen Analysen wurde das Programm Prism 3.03 (2002 Graph Pad
Software, San Diego, CA) verwendet. Für den Zweiwege-ANOVA-Test wurde
das Programm SPSS 11.5.1 für Windows verwendet (2002, SPSS Inc.,
Chicago).
Ergebnisse
34
3. Ergebnisse
3.1 Visueller Vergleich der Röntgendichte iodhaltiger und gadoliniumhaltiger Kontrastmittel Um die verschiedenen Kontrastmittel bei Konzentrationen gleicher
Röntgendichte untersuchen zu können, wurden zunächst Vorversuche
durchgeführt, um die Röntgendichte der Kontrastmittel visuell zu vergleichen.
Das iodhaltige Kontrastmittel führte in der Konzentration von 75 mg I/ml in
etwa zu einer ähnlich starken Abschwächung der Röntgenstrahlung wie die
unverdünnten 0,5 molaren Gadolinium-Kontrastmittel.
Abb. 10: Vergleich der Röntgendichte von Gadolinium-Kontrastmitteln und Iomeprol. Die Spritzen sind mit Iomeprol der Konzentrationen 50, 75, 150, 190 und 300 mg I/ml (erste Reihe) und den 0,5molaren Gadolinium-Kontrastmitteln Gadodiamid (1), Gadoteratmeglumin (2), Gadobenatdimeglumin (3) und Gadopentetatdimeglumin (4) (zweite Reihe) gefüllt. Bei Durchleuchtung mit 70 kV und unter Verwendung von 20 cm Wasser zur Imitation des menschlichen Körpers zeigen die Gadoliniumchelate eine ähnliche Röntgendichte wie eine Iomeprol-Lösung mit 75 mg I/ml.
Ergebnisse
35
3.2 Vergleich der Cytotoxizität bei gleicher Röntgendichte Getestet wurden Kontrastmittelkonzentrationen, die jeweils der Röntgendichte
eines Iod-Kontrastmittels bei 9,375 mg I/ml, 18,75 mg I/ml und 37,5 mg I/ml
entsprechen. Bei einer Konzentration von 9,375 mg I/ml induzierten Iomeprol-
300 und Iomeprol-150 (Im 300 vs. Im 150 p > 0,05) eine signifikant geringere
Schädigung als die gadoliniumhaltigen Kontrastmittel Gadopentetat,
Gadobenat, Gadoterat und Gadodiamid (jeweils p < 0,001 vs. Iomeprol). Dabei
war kein signifikanter Unterschied zwischen den beiden hochosmolalen Gd-
KM festzustellen (p > 0,05), ebenso zwischen Gadoteratmeglumin und
Gadodiamid (p > 0,05). Bei einer Konzentration, die 18,75 mg I/ml entspricht,
wirkte ebenfalls Iomeprol am wenigsten hemmend auf die Konversion des
MTT. Es zeigten sich die gleichen signifikanten Unterschiede zwischen den
Kontrastmitteln wie in der niedrigeren Konzentration: Alle Gadolinium-KM
unterschieden sich in ihrem cytotoxischen Effekt signifikant von Iomeprol
(jeweils p < 0,001 vs. Iomeprol). Bei der höchsten getesteten Konzentration
von 37,5 mg I/ml induzierten die beiden hochosmolalen Gadolinium-
Kontrastmittel Magnevist und Multihance die stärkste Konversionshemmung,
wobei sie sich untereinander in ihrem Effekt nicht signifikant unterschieden (p
> 0,05). Davon abzugrenzen ist die etwas geringere Schädigung durch
Gadoteratmeglumin (Dotarem) und die deutlich geringeren Schädigungen
durch Gadodiamid und Iomeprol (jeweils p < 0,001 vs. Gadoterat und
Gadobenat). Wie auch aus Abb. 11 ersichtlich, unterschieden sich bei dieser
Konzentration aber im Gegensatz zu den vorigen die Gd-KM Gadoterat und
Gadodiamid deutlich voneinander (p < 0,001), so dass die Schädigung des
nichtionischen KM Gadodiamid sich in ihrem Verlauf etwa parallel der
Schädigung durch Iomeprol zeigte, während der Effekt von
Gadoteratmeglumin in hohen Konzentrationen im Bereich der Schädigung
durch die hochosmolalen Gadolinium-Kontrastmittel lag. Tabelle 3 zeigt die
Ergebnisse des MTT-Test als Mittelwerte S.E.M.
Ergebnisse
36
0 10 20 30 400
50
100
Iomeprol-300Iomeprol-150
GadopentetatGadobenatGadoteratGadodiamid
Konzentration [mM Gd]0 67 133 200 267
Konzentration [mg I/ml]
MTT
[% d
er K
ontr
olle
]
Abb. 11: Vergleich der cytotoxischen Effekte auf LLC-PK1–Zellen nach 24-stündiger Inkubation mit Iomeprol, Gadopentetatdimeglumin, Gadobenatdimeglumin, Gadoterat und Gadodiamid anhand der Messung der MTT-Konversion bei Konzentrationen, die gleicher Röntgendichte entsprechen. Iomeprol-300 und Iomeprol-150 induzieren bei allen Konzentrationen eine geringere Schädigung als die Gadolinium-Kontrastmittel (p < 0,001). Die Daten sind angegeben als Prozentsatz der ungeschädigten Kontrollzellen und zeigen jeweils den Mittelwert und die Standardabweichung des Mittelwertes (S.E.M.). n ~ 140 für Iomeprol-300, n ~ 150 für Iomeprol-150, n ~ 300 für die Gadoliniumchelate.
Ergebnisse
37
37,5 mg I/ml 18,75 mg I/ml 9,375 mg I/ml
Iomeprol- 300 66 1,4 74 1,5 82 1,5
Iomeprol- 150 64 1,5 74 1,4 81 1,3
Mannit-520 84 1,1 90 0,8 95 0,8
62,5 mmol/l 31,25 mmol/l 15,625 mmol/l
Mannit-1860 3 0,2 51 1 81 0,9
Gadopentetat 2 0,1 48 1 63 0,8
Gadobenat 1,3 0,2 50 0,9 64 0,7
Gadoterat 9 0,4 60 0,9 71 0,8
Gadodiamid 47 1,2 56 0,9 70 0,8
Mannit-780 56 0,7 75 0,9 86 0,7
Tabelle 3: Ergebnisse des MTT-Konversionstests bei gleicher Röntgendichte in Konzentrationen, die 37,5 mg I/ ml, 18,75 mg I/ml bzw. 9,375 mg I/ml entsprechen, für die Gadoliniumchelate entsprechend 62,5 mmol/l, 31,25 mmol/l bzw. 15,625 mmo/l. Die Werte sind als % der Kontrolle S.E.M. angegeben. n=140 für Iomeprol- 300, n= 150 für Iomeprol-150, n~300 für die Gadoliniumchelate.
3.3 Vergleich gadoliniumhaltiger und iodhaltiger Kontrastmittel bei äquimolaren Konzentrationen
3.3.1 MTT-Test zur Beurteilung der Cytotoxizität der Kontrastmittel
Alle gadoliniumhaltigen Kontrastmittel zeigten bei unseren Experimenten eine
dosisabhängige Inhibition der MTT-Konversion, ebenso wie das auf Iod
basierende Kontrastmittel Iomeprol (Abb. 11).
Bei einer Konzentration von 31,25 mM induzierten alle getesteten
Kontrastmittel eine signifikante Inhibition der MTT-Konversion in Vergleich
zur Kontrolle, wobei allerdings zwischen den einzelnen Kontrastmitteln keine
signifikanten Unterschiede festzustellen waren (p > 0,05).
Ergebnisse
38
Bei der zweifachen Konzentration der Kontrastmittel (62,5 mM) verursachten
die hochosmolalen Gadolinium-KM Gadopentetat- und Gadobenatdimeglumin
eine signifikant höhere Konversionshemmung als die niederosmolalen
Gadolinium-KM Gadoteratmeglumin und Gadodiamid und als das iodhaltige
KM Iomeprol (jeweils p < 0,001). Bei dieser Konzentration konnte jeweils kein
signifikanter Unterschied festgestellt werden zwischen den beiden
hochosmolalen Gd-KM Gadopentetatdimeglumin und Gadobenatdimeglumin
sowie zwischen dem iodhaltigen KM Iomeprol und den Gadolinium-KM
Gadoteratmeglumin und Gadodiamid (p > 0,05).
Auch bei der Konzentration von 125 mM konnte ein stärkerer Effekt von
Gadopentetatdimeglumin und Gadobenatdimeglumin im Vergleich zu
Gadoteratmeglumin, Gadodiamid und Iomeprol nachgewiesen werden (p <
0,001). Auch hier konnte jeweils kein signifikanter Unterschied zwischen
Gadopentetat und Gadobenat gefunden werden (p > 0,05). Bei 250 mM konnte
aber im Gegensatz zu den geringeren Konzentrationen erstmals eine
Signifikanz zwischen Iomeprol und den gadoliniumhaltigen KM Gadoterat (p
< 0,001) und Gadodiamid (p < 0,01) und eine Signifikanz zwischen Gadoterat
und Gadodiamid nachgewiesen werden (p < 0,001). Im Gegensatz dazu zeigte
sich bei den Konzentrationen von 31,25 bis 125 mM kein signifikanter
Unterschied zwischen Gadodiamid und Iomeprol (p > 0,05). Bei einer
Konzentration von 250 mM jedoch war der Effekt von Gadodiamid etwas
geringer als der von Iomeprol (p < 0,05).
Bis zu einer Konzentration von 125 mM waren die Effekte von
Gadoteratmeglumin und Iomeprol nicht signifikant unterschiedlich. Bei einer
Konzentration von 250 mM hingegen erreichte die Toxizität von
Gadoteratmeglumin fast das Niveau der hochosmolalen Gadolinium-
kontrastmittel Gadopentetatdimeglumin und Gadobenatdimeglumin und
übertraf somit weit die toxischen Effekte der nichtionischen KM Gadodiamid
und Iomeprol (p < 0,001).
Zwischen Konzentration und Art des Kontrastmittels konnte im two-way-
ANOVA (p < 0,0001) eine signifikante Interaktion festgestellt werden. Diese
Interaktion ist auch deutlich aus Abb. 11 zu erkennen, da hier ein nicht
Ergebnisse
39
paralleler Verlauf der Dosis-Wirkungs-Kurven der beiden Kontrastmittel-
gruppen zu sehen ist. Während die Dosis-Wirkungs-Kurven der nichtionischen
niedrigosmolalen KM Iomeprol und Gadodiamid einen asymptotischen Verlauf
zeigen, erkennt man im Verlauf der Kurven für Magnevist
(Gadopentetatdimeglumin), Multihance (Gadobenatdimeglumin) und Dotarem
(Gadoteratmeglumin) eine starke Zunahme der Konversionshemmung ab einer
Konzentration von 125 mM.
0 50 100 150 200 2500
50
100
Iomeprol-190
GadopentetateGadobenateGadoterate
Gadodiamide
Kontrastmittelkonzentration [mM]
MTT
[% d
er K
ontr
olle
]
Abb. 12: Vergleich der cytotoxischen Effekte auf LLC-PK1–Zellen nach 24-stündiger Inkubation mit äquimolaren Konzentrationen von Iomeprol-190, Gadopentetat, Gadobenat, Gadoterat und Gadodiamid anhand der Messung der MTT-Konversion. Statistisch signifikante Unterschiede zeigten: Gadopentetat und Gadobenat ab einer Konzentration von 31,25 mM gegenüber allen anderen Substanzen (p < 0,001), Gadodiamid gegenüber Iomeprol-190 bei 250 mM (p < 0,05) und Gadoterat gegenüber Iomeprol und Gadodiamid bei 250 mM (p < 0,001). Die Daten werden angegeben in Mittelwert und Standardabweichung des Mittelwertes (S.E.M.) als Prozentsatz der ungeschädigten Kontrollzellen. n 126 für Iomeprol und n 277 für die Gadoliniumchelate.
Ergebnisse
40
250 mmol/l
125 mmol/l
62,5 mmol/l
31,25 mmol/l
Iomeprol 190 43 1,7 57 1,4 69 1,3 78 2
Mannit 330 71 1,6 79 1 87 1,3 95 0,5
Gadopentetat 2 0,1 48 1 63 0,8 76 1,7
Mannit 1860 3 0,2 51 1 81 0,9 84 0,9
Gadobenat 1,3 0,2 50 0,9 64 0,7 78 1,5
Gadoterat 8,5 0,4 60 0,8 71 0,8 78 1,5
Gadodiamid 47 1,2 56 0,9 70 0,8 78 + 1,5
Mannit 780 56 0,7 75 0,9 86 0,7 91 0,7
Tabelle 4: Vergleich der cytotoxischen Effekte der aufgeführten Kontrastmittel und Mannitollösungen nach 24stündiger Inkubationsdauer anhand des MTT-Tests. Die Werte sind angegeben als Prozentsatz der unbehandelten Kontrollzellen. Angegeben sind jeweils Mittelwert und Standardabweichung des Mittelwertes (S.E.M.). n 120.
3.3.2 Zeitkinetik der Zellschädigung Die Zeitabhängigkeit der Zellschädigung wurde exemplarisch anhand von
Gadopentetatdimeglumin (Magnevist) getestet. Innerhalb der ersten zwei
Stunden nach Inkubationsbeginnn konnte bereits der größte Anteil der
Schädigung als Beeinträchtigung der MTT-Konversion registriert werden (p <
0,001). Nach weiteren sechs Stunden war in der Konzentration von 62,5 mM
eine geringfügig stärkere Zellschädigung nachweisbar (p > 0,05), während aber
bei einer Konzentration von 250 mM eine weitere deutliche Zunahme der
Konversionshemmung gezeigt werden konnte (p < 0,001). Nach 24 Stunden
war bei beiden Kontrastmittel-Konzentrationen kaum noch eine Veränderung
des Effektes festzustellen. Bei einer Inkubationsdauer von 48 Stunden konnte
kein signifikanter Unterschied in der Zellschädigung bei beiden
Konzentrationen gegenüber der Schädigung nach 24 Stunden festgestellt
werden (p > 0,05). Somit scheint der größte Teil der Schädigung bereits in den
ersten Stunden der Exposition einzutreten und das Maximum nach 24 Stunden
erreicht zu sein.
Ergebnisse
41
0 10 20 30 40 500
50
100
150
62.5 mM250 mM
Inkubationszeit [h]
MTT
[% d
er K
ontr
olle
]
Abb. 13: Konzentrations- und Zeitabhängigkeit der cytotoxischen Effekte von Gadopentetatdimeglumin auf LLC-PK1–Zellen verglichen anhand der MTT-Konversionshemmung. Die Zellen wurden für 2, 8, 24 und 48 Stunden mit 62,5 und 250 mM Gadopentetat inkubiert. Die Daten sind angegeben als Prozentsatz der ungeschädigten Kontrollzellen. Gezeigt werden Mittelwert und Standardabweichung des Mittelwertes (S.E.M.). n 60. 2 Stunden 8 Stunden 24 Stunden 48 Stunden
250 mmol/l 28 1,2 3,8 0,3 1,8 0,3 1,2 0,2
62,5 mmol/l 71 1,5 68 1,2 59 1,8 57 1,8
Tabelle 5: Zeitabhängigkeit der Zellschädigung nach Inkubation der Zellen mit Gadopentetatdimeglumin in Konzentrationen von 250 und 62,5 mmol/l und anschließendem MTT-Test. Die Werte sind angegeben als Prozentsatz der ungeschädigten Kontrollzellen. Angegeben sind jeweils Mittelwert und Standardabweichung des Mittelwertes (S.E.M.). n 60.
Ergebnisse
42
3.3.3 Vergleich der Kontrastmittelcytotoxizität mit Osmolalitätseffekten Bei allen zum Vergleich getesteten Mannitol-Lösungen zeigte sich wie bei den
getesteten Kontrastmitteln eine dosisabhängige Toxizität, die jedoch in fast
allen Fällen signifikant geringer war als die Toxizität des damit verglichenen
Kontrastmittels (p < 0,001, siehe Abbildungen 4, 5, 6 sowie Tabelle 4). Im
Gegensatz dazu zeigten Gadopentetatdimeglumin und Gadobenatdimeglumin
nur bei Konzentrationen von 31,25 und 62,5 mM einen stärkeren Effekt als die
entsprechenden Mannitol-Lösungen (p < 0,001 bei beiden Konzentrationen).
Bei den Konzentrationen von 125 und 250 mM hingegen war keine
signifikante Abweichung zwischen der toxischen Wirkung der ionischen Gd-
KM und der Mannitol-Lösung zu erkennen (p > 0,05 bei beiden
Konzentrationen).
0 100 200 3000
50
100
150
Mannitol-330Iomeprol-190
Konzentration [mM]
MTT
[% d
er K
ontr
olle
]
Abb. 14: Vergleich der cytotoxischen Effekte auf LLC-PK1–Zellen nach 24-stündiger Inkubation mit Iomeprol-190 und der korrespondierenden Mannitol-Lösung anhand des MTT-Konversionstests. Statistische Signifikanz zeigten: Iomeprol-190 und Mannit-330 bei allen getesteten Konzentrationen (p < 0,001, n 126). Die Daten sind angegeben als Prozentsatz der ungeschädigten Kontrollzellen und zeigen den Mittelwert und die Standardabweichung des Mittelwertes (S.E.M.).
Ergebnisse
43
0 100 200 3000
50
100
150
GadodiamidMannitol-780
Konzentration [mM]
MTT
[% d
er K
ontr
olle
]
Abb. 15: Vergleich der cytotoxischen Effekte auf LLC-PK1–Zellen nach 24-stündiger Inkubation mit Gadodiamid und der korrespondierenden Mannitol-Lösung anhand des MTT-Konversionstests. Statistische Signifikanz zeigten: Gadodiamid und Mannit-780 bei allen getesteten Konzentrationen (p < 0,001). Die Daten sind angegeben als Prozentsatz der ungeschädigten Kontrollzellen und zeigen den Mittelwert und die Standardabweichung des Mittelwertes (S.E.M.).
Ergebnisse
44
0 100 200 3000
50
100
150
Gadopentetat
Mannitol-1860Gadobenat
Konzentration [mM]
MTT
[% d
er K
ontr
olle
]
Abb. 16: Vergleich der cytotoxischen Effekte auf LLC-PK1–Zellen nach 24-stündiger Inkubation mit Gadopentetatdimeglumin, Gadobenatdimeglumin und der korrespondierenden Mannit-Lösung (Mannit-1860) anhand des MTT-Konversionstests. Statistisch signifikante Unterschiede ergaben sich bei Konzentrationen von 31,25 und 62,5 mM (p < 0,001, n 277 für die Gadoliniumchelate und n 245 für Mannit-1860). Die Daten sind angegeben als Prozentsatz der ungeschädigten Kontrollzellen und zeigen den Mittelwert und die Standardabweichung des Mittelwertes (S.E.M.).
3.4 Trypanblau-Test
Mittels des Trypanblau-Tests konnte nachgewiesen werden, dass die
Inkubation der LLC-PK1–Zellen mit Gadopentetatdimeglumin zum Tod der
Zellen führt. Bei einer Konzentration des KM von 125 mM und 24stündiger
Inkubation kam es bei 57 6 % der Zellen zum Zelltod, bei einer
Konzentration von 250 mM kam es zum Absterben aller Zellen (p < 0,001 vs.
Kontrolle).
Im Gegensatz dazu führte die Inkubation der Zellen mit dem iodhaltigen
Kontrastmittel Iomeprol zu einer geringen Anzahl toter Zellen bei einer
Konzentration von 125 mM (p < 0,001 vs. Gadopentetat, p > 0,05 vs.
Kontrolle). Bei höherer Konzentrierung kam es unter Iomeprol zu einem
moderaten Anstieg der Anzahl toter Zellen an der Gesamtzellzahl (p < 0,001
vs. Kontrolle). Die Auslösung des Zelltodes war aber auch in dieser hohen
Ergebnisse
45
Konzentration noch deutlich geringer als die durch das Gadoliniumchelat
induzierte (p < 0,001).
Kontrollzellen Iomeprol-190 Gadopentetat
250 mmol/l 12 0,7 26 4* 100 0*
125 mmol/l 12 0,7 19 4 57 6*
Tabelle 6: Vergleich der Kontrastmittel Iomeprol-190 und Gadopentetatdimeglumin bezüglich der Auslösung des Zelltodes anhand des Trypanblau-Exklusionstests in den Konzentrationen von 250 und 125 mmol/l. Die Werte sind angegeben als Prozentsatz toter Zellen an der Gesamtzellzahl und zeigen jeweils den Mittelwert und die Standardabweichung des Mittelwertes (S.E.M.). n = 9. * bedeutet Sinifikanz zu den unbehandelten Kontrollzellen.
Kontro
lle12
5 mM Io
meprol
-190
125 m
M Gad
open
tetat
250 m
M Iomep
rol-19
0
250 m
M Gad
open
tetat
0
50
100
*
*
*
+
+
Tote
Zel
len
[% d
erG
esam
tzel
lzah
l]
Abb. 17: Vergleich der Anzahl toter Zellen nach 24-stündiger Inkubation mit Iomeprol-190 und Gadopentetat bei Konzentrationen von 125 und 250 mM. Statistisch signifikante Unterschiede zeigten Gadopentetat zur Kontrolle (Inkubation mit serumfreiem Medium) bei beiden Konzentrationen (p < 0,001), Iomeprol-190 zur Kontrolle bei 250 mM (p < 0,001), und Gadopentetat zu Iomeprol bei beiden Konzentrationen (p < 0,001). Die Daten sind wiedergegeben als Prozentsatz toter Zellen an der Gesamtzellzahl und zeigen die Mittelwerte und die Standardabweichung der Mittelwerte, n = 9. * bedeutet
Ergebnisse
46
signifikante Unterschiede zur Kontrolle, + bedeutet signifikante Unterschiede zwischen den Kontrastmitteln.
3.5 ELISA zur Detektion von Apoptose und Nekrose
Wie mittels eines ELISA für die Detektion von histongebundenen DNA-
Fragmenten im Zellkulturüberstand (Nekrose) und der cytoplasmatischen
Fraktion des Zelllysates (Apoptose) festgestellt wurde, führt bei einer KM-
Konzentration von 125 mM die Inkubation mit Gadopentetatdimeglumin und
Gadobenatdimeglumin zu einem stark signifikanten Anstieg von Nekrose und
Apoptose (Nekrose und Apoptose jeweils p < 0,001 vs. Kontrolle für
Gadopentetat und Gadobenat). Dabei konnte zwischen diesen beiden KM kein
Unterschied in der Auslösung von Apoptose und Nekrose gefunden werden (p
> 0,05).
Gadoterat, Gadodiamid und Iomeprol-190 führten nicht zu einem signifikanten
Anstieg der Nekrose gegenüber den unbehandelten Kontrollzellen (jeweils p >
0,05 vs. Kontrolle).
Gadodiamid und Iomeprol verursachten ebenfalls keinen signifikanten Anstieg
der Apoptose gegenüber der Kontrolle (jeweils p > 0,05 vs. Kontrolle). Im
Gegensatz dazu verursachte Gadoterat einen leichten signifikanten Anstieg der
Apoptose verglichen mit der Apoptose bei unbehandelten Zellen (p < 0,01 vs.
Kontrolle). Zwischen den drei Kontrastmitteln Gadoterat, Gadodiamid und
Iomeprol-190 konnte weder für die Induktion der Nekrose noch für die
Induktion der Apoptose ein signifikanter Unterschied festgestellt werden.
Insgesamt riefen die beiden hochosmolalen Gadolinium-KM bei äquimolaren
Konzentrationen signifikant mehr Nekrose und Apoptose hervor als die beiden
Gd-Kontrastmittel Gadoterat und Gadodiamid sowie das iodhaltige
Kontrastmittel (jeweils p < 0,001 für Nekrose und Apoptose).
Ergebnisse
47
Gadop
entet
atGad
oben
at
Gadote
ratGad
odiam
idIom
eprol
-190
0
50
100
150+
ns
ns
* *
Nek
rose
[% D
iffer
enz
zur
Kont
rolle
]
Abb. 18: Vergleich der cytotoxischen Effekte auf LLC-PK-Zellen nach 24-stündiger Inkubation mit Iomeprol-190 und Gadolinium-KM bei 125 mM anhand eines ELISA für die Detektion von Nekrose. Gadopentetat und Gadobenat induzierten einen signifikanten Anstieg von Nekrose (p < 0,01 vs. Kontrolle). Gadopentetat und Gadobenat induzierten signifikant mehr Nekrose als die beiden anderen Gadoliniumchelate und das iodhaltige Kontrastmittel (p < 0,001). Die Daten sind angegeben als Differenz der Prozentwerte zur Kontrolle und zeigen die Mittelwerte und die Standardabweichungen der Mittelwerte. n = 22. * bedeutet Signifikanz zur Kontrolle, + bedeutet Signifikanz zwischen den Kontrastmitteln, ns bedeutet nicht signifikant.
Ergebnisse
48
Nekrose Apoptose
Gadopentetat +124 9* +34 1*
Gadobenat +95 12* +35 3*
Gadoterat +17 7 +13 3*
Gadodiamid -6 7 +4 3
Iomeprol-190 +3 9 +5 2
Tabelle 7: Vergleich von Nekrose und Apoptose nach 24stündiger Inkubation mit Iomeprol-190 und verschiedenen Gadoliniumchelaten durch einen ELISA. Die Daten sind angegeben als Differenz der Prozentwerte zu den unbehandelten Kontrollzellen. Aufgeführt sind die Mittelwerte und die Standardabweichungen der Mittelwerte (S.E.M.) n = 22; * bedeutet Signifikanz zur Kontrolle.
Ergebnisse
49
Gadop
entet
atGad
oben
at
Gadote
ratGad
odiam
idIom
eprol
-190
0
10
20
30
40 ns
ns
+
* *
*
Apop
tose
[% D
iffer
enz
zu
r Kon
trolle
]
Abb. 19: Vergleich der cytotoxischen Effekte auf LLC-PK-Zellen nach 24-stündiger Inkubation mit Iomeprol-190 und Gadolinium-KM bei 125 mM anhand eines ELISA für die Detektion von Apoptose. Gadopentetat und Gadobenat induzierten einen signifikanten Anstieg von Apoptose (p < 0,01 vs. Kontrolle). Gadoterat führte nur zu einem geringen Anstieg der Apoptose (p < 0,01 vs. Kontrolle). Gadopentetat und Gadobenat induzierten signifikant mehr Apoptose als die beiden anderen Gadoliniumchelate und das iodhaltige Kontrastmittel. (p < 0,001 ). Die Daten sind angegeben als Differenz der Prozentwerte zur Kontrolle und zeigen die Mittelwerte und die Standardabweichungen der Mittelwerte. n = 22. * bedeutet Signifikanz zur Kontrolle, + bedeutet Signifikanz zwischen den Kontrastmitteln, ns bedeutet nicht signifikant.
Diskussion
50
4. Diskussion
4.1 Klinische Relevanz der Kontrastmittel-induzierten Nephropathie
Die Zahl der jährlich durchgeführten diagnostischen Untersuchungen und
interventionellen Verfahren unter intravasaler Applikation von Kontrastmitteln
nimmt immer weiter zu (TOMS, 2001). Insgesamt werden inzwischen weltweit
jährlich mehr als 60 Millionen Kontrastmittel-Dosen verwendet (BERG, 2000),
allein in den USA werden jährlich bis zu einer Million Kontrastmittel-
Untersuchungen durchgeführt (McCULLOUGH, 2003). Ebenso steigen Alter
und damit auch Komorbidität der behandelten Patienten (TOMS, 2001). Dies
hat zur Folge, dass auch die Inzidenz der Nebenwirkungen durch die
applizierten Kontrastmittel zunimmt. Neben Übelkeit und Erbrechen,
allergischen Reaktionen und hyperthyreotischen Krisen (VAN DER MOLEN,
2004) kann es auch zur Kontrastmittel-induzierten Nephropathie kommen, die
eine der wichtigsten Komplikationen der intravasalen Kontrastmittelgabe
darstellt. Dabei kommt es innerhalb von 72 Stunden nach
Kontrastmittelapplikation zu einem Anstieg des Serum-Kreatininwertes um
mehr als 25 % oder mehr als 0,5 mg/dl (MORCOS, 1998), wobei eine andere
Ätiologie ausgeschlossen worden sein muss. Insgesamt liegt die KIN an dritter
Stelle der Ursachen für im Krankenhaus erworbenes akutes Nierenversagen
(BERG, 2000; NASH, 2002; BAKER, 2003; BRIGUORI, 2003).
Bei Patienten ohne Risikofaktoren tritt dieses Ereignis mit einer sehr geringen
Inzidenz zwischen 1,2 und 1,6 % in der Gesamtbevölkerung auf (NIKOLSKY,
2003). Hat ein Patient allerdings einen oder mehrere Risikofaktoren für die
KIN, so steigt sein Risiko deutlich an (WAYBILL, 2001). Als
prädisponierende Faktoren, die zur Entstehung einer KIN beitragen können,
zählen dabei besonders die Einschränkung der Nierenfunktion und die
Kombination aus Niereninsuffizienz und Diabetes mellitus, aber auch die
Einnahme von nichtsteroidalen Antiphlogistika oder Aminoglykosiden, hohes
Alter, Volumenmangel und kardiovaskuläre Vorerkrankungen (MORCOS
Diskussion
51
1998, McCULLOUGH 2003). So fand RIHAL 2002 eine Gesamtinzidenz der
KIN im Patientenkollektiv von 3,3 % wohingegen die Inzidenz bei Patienten
mit erhöhtem Serumkreatinin (> 2,0 mg/dl) einem Risiko von 22,4 %
ausgesetzt waren eine KIN zu entwickeln. Patienten mit erhöhtem
Kreatininwert und zusätzlichem Diabetes mellitus hatten sogar ein Risiko von
30,6 % eine KIN zu entwickeln (RIHAL, 2002). McCULLOUGH berichtet in
ähnlicher Weise von einer Inzidenz der KIN bei Patienten mit schwerer renaler
Funktionsstörung im Herzkatheterlabor von 13 % bei Nichtdiabetikern und 20
% bei Patienten mit zusätzlichem Diabetes mellitus (McCULLOUGH, 2003).
Eine Studie von 1990 zeigte sogar eine Inzidenz der KIN von 50 % bei
Patienten mit diabetischer Nephropathie, die einer koronaren Angiographie
unterzogen wurden (MANSKE, 1990).
In den meisten Studien zum Thema der Inzidenz der KIN wird die Dialyserate
aufgrund der KIN zwischen 0,4 und 2 % angegeben (LEVY, 1996;
McCULLOUGH, 1997; GRUBERG, 2000). Wenn die Dialysepflichtigkeit
eintritt, so sind schlechte Überlebensraten der Patienten die Folge. So spricht
McCULLOUGH von einer Krankenhaus-Mortalitätsrate von 36 % bei
Auftreten einer dialysepflichtigen KIN und einer Zweijahres-Mortalitätsrate
von 80 % (McCULLOUGH, 2003). Auch andere Studien zeigen ähnlich hohe
Mortalitätsraten. So fand GRUBERG eine kumulative Einjahresüberlebensrate
von dialysepflichtigen Patienten, die bei 45,2 % lag. Für Patienten mit
Kontrastmittel-Nephropathie, die nicht dialysiert werden mussten, zeigte sich
hier ebenfalls eine schlechte Überlebensrate von 35,4 % (GRUBERG, 2000).
Ähnliche Ergebnisse finden sich auch in anderen Veröffentlichungen (LEVY,
1996; RIHAL, 2002). Bei Intensivpatienten ermittelte man bereits
Mortalitätsraten von bis zu 76 % (DOUMA, 1997). Die höhere Mortalitätsrate
ist aber zum Großteil nicht auf ein Nierenversagen zurückzuführen, sondern
die Patienten, die eine KIN entwickeln, haben ein höheres Risiko an nicht
renalen Komplikationen wie z.B. Myokardinfarkt, Schlaganfall, Koma,
Lungenembolie oder gastrointestinalen Blutungen zu versterben. Die
schlechten Langzeitüberlebensraten hängen dabei nicht von der Höhe des
Anstiegs des Serum-Kreatinin-Wertes ab, sondern es zeigen sich bereits hohe
Mortalitätsraten bei verhältnismäßig geringem Anstieg des Kreatinin-Wertes
Diskussion
52
von etwa 0,5 mg/dl (McCOULLOUGH, 2003). Doch auch wenn es nicht zu
lebensbedrohlichen Zuständen kommt, so ist die Rate der Komplikationen
während des Krankenhausaufenthaltes erhöht und die Dauer des Aufenthaltes
verlängert, was die KIN zu einem klinisch durchaus relevanten Kranheitsbild
macht (DANGAS, 2005).
4.2 Pathogenese der Kontrastmittel-induzierten Nephropathie
Aufgrund der klinischen Relevanz der KIN wird bereits seit Jahren an der
Erforschung der Pathomechanismen der Erkrankung gearbeitet, allerdings sind
diese noch immer nur unzureichend geklärt. Als eine Hauptursache der KIN
wird die Hypoxie der renalen Medulla angeschuldigt, die durch mehrere
Faktoren ausgelöst werden könnte: Die Kontrastmittel führen eventuell zur
Ausschüttung vasoaktiver Substanzen wie zum Beispiel Endothelin und
Vasopressin und reduzieren dadurch den renalen Blutfluss. Gleichzeitig könnte
eine Erhöhung der Blutviskosität (SOLOMON, 2005; SEELIGER, 2007) und
dadurch eine verschlechterte Sauerstoffversorgung des Gewebes eine Rolle
spielen. Des Weiteren wird ein höherer Sauerstoffverbrauch im distalen
Tubulus und ein erhöhter hydrostatischer Druck in den Tubuli durch
osmotische Diurese und hohe Viskosität der KM als möglicher
Pathomechanismus diskutiert (McCULLOUGH, 2003; IDEE, 2004). Jedoch
lassen neuere Ergebnisse einer kontrollierten Patientenstudie an über 300
Patienten zur fehlenden prophylaktischen Wirkung des Vasodilatators
Fenoldopam und andere klinische Untersuchungen mit verschiedenen
vasodilatatorischen Substanzen darauf schließen, dass die hämodynamischen
Veränderungen nicht die wesentliche Rolle in der Entstehung der KIN beim
Menschen spielen (HALL, 1992; CHERTOW, 1996; KUMIK, 1998;
ABIZAID, 1999; WANG, 2000; STONE, 2003; KATZBERG, 2005).
Neben der medullären Hypoxie wird als wichtiger Pathomechanismus die
direkte Tubuluszellschädigung verstanden (MORCOS, 1999; RUDNICK,
2003). Bereits frühe Studien haben cytotoxische Effekte der Kontrastmittel
zeigen können (TALNER, 1968; HUMES, 1987). HUMES berichtete
beispielsweise, dass Kontrastmittel an isolierten proximalen Tubuluszellen von
Diskussion
53
Kaninchen einen subletalen Schaden verursachten, der sich durch
Erniedrigung der mitochondrialen Respiration, Kaliumaustritt aus den Zellen
und einen veränderten Calciumstoffwechsel der Zellen bemerkbar machte
(HUMES, 1987).
4.3 Prophylaxe der Kontrastmittel-induzierten Nephropathie
Aufgrund der klinischen Relevanz der durch Kontrastmittel induzierten
Nephropathie und der schlechten Langzeitprognose wurden immer neue
Ansätze zur Prävention dieser Erkrankung entwickelt. Ein Ansatz der zu
vielversprechenden Ergebnissen führte, war die Verwendung von
nichtionischen niedrig- oder isoosmolalen Kontrastmitteln (COX, 2004;
MORCOS, 2005). Die Überlegenheit von Kontrastmitteln niedriger
Osmolalität gegenüber KM mit hoher Osmolalität ist inzwischen anerkannt, da
sie durch mehrere Studien wiederholt belegt wurde (MORCOS, 1999;
RUDNICK, 1995; MOORE, 1992). Ob die Verwendung isoosmolaler
Kontrastmittel einen zusätzlichen Nutzen bringt, wird in der Literatur
kontrovers diskutiert. So zeigte ASPELIN die Überlegenheit isoosmolaler KM
(ASPELIN, 2003), während andere Studien keinen Vorteil bei der Verwendung
isoosmolaler Kontrastmittel aufzeigen konnten (KOLEHMAINEN, 2003). Des
Weiteren wurde die Verabreichung von Mannitol-Lösungen, Furosemid,
Natriumbicarbonat, ANP (atriales natriuretisches Peptid), Endothelin-
Antagonisten, Adenosin-Rezeptorantagonisten, Prostaglandin E-1, Calcium-
Kanal-Blockern, Fenoldopam, Dopamin in geringen Dosen, und
Antioxidantien wie N-Acetylcystein auf deren prophylaktische Wirkung hin
untersucht (LEPOR, 2003; MORCOS, 2004; MERTEN, 2004; PANNU, 2004;
SHAH, 2004). Vor allem zur Verwendung von N-Acetylcystein (ACC) wurden
in den letzten Jahren zahlreiche Studien durchgeführt (BAKER, 2003;
MAEDER, 2004; SHAH, 2004; LEPOR, 2003; MORCOS, 2003; MINER,
2004; MORCOS, 2005; NALLAMOTHU, 2004). Eine große Metaanalyse
kommt dabei zu dem Schluss, dass ACC die Inzidenz des Kreatininanstiegs
nach Kontrastmittelgabe senken kann, dass dies aber nur von grenzwertiger
Signifikanz ist und in verschieden Subgruppen nicht zu beobachten war
Diskussion
54
(PANNU, 2004). Hinzu kommt, dass ACC möglicherweise nur eine
pseudoprotektive Wirkung besitzt, da ACC in der Lage ist den
Serumkreatininspiegel zu senken ohne die glomeruläre Filtrationsrate zu
beeinflussen (HOFFMANN, 2004).
Weitere Ansätze waren die prophylaktische Hämodialyse, Hämofiltration und
die Verwendung niedrigerer Kontrastmittel-Dosen (HUBER, 2002;
MARENZI, 2004; MORCOS, 2005). Die prophylaktische Hämodialyse zeigte
dabei keinen Vorteil für die Patienten in Hinsicht auf das Risiko eine KIN zu
entwickeln (MORCOS, 2005). Die prophylaktische Hämofiltration dagegen
zeigte in einer klinischen Studie einen positiven Einfluss auf die Prognose von
Patienten mit schwerwiegendem chronischem Nierenversagen (MARENZI,
2004). Der Nutzen dieses Verfahrens muss aber noch in weiteren Studien
bestätigt werden.
Die einzige Strategie zur Prävention der Kontrastmittelinduzierten
Nephropathie, deren Nutzen auf hohem Evidenzniveau derzeit gesichert ist, ist
die Hydrierung der Patienten vor der Kontrastmittelgabe (MÖCKEL, 2002).
4.4 Verwendung von Gadoliniumchelaten
Ein weiterer Vorschlag, der gemacht wurde, um die KIN zu vermeiden, ist die
Verwendung einer anderen Substanzgruppe, nämlich der Gadolinium-KM statt
der gebräuchlichen auf Iod basierenden Kontrastmittel (STRUNK, 2004;
MORCOS, 2005). Diese Gruppe von Kontrastmitteln findet nämlich schon
lange Zeit bei Untersuchungen im Magnetresonanztomographen Verwendung
und gilt dort als sicher in Bezug auf renale Komplikationen (NIENDORF,
1991; KIRCHIN, 2003; THOMSEN 2004).
Gadolinium-Kontrastmittel sind ursprünglich Kontrastmittel, die für die
Magnetresonanztomographie (MRT) entwickelt wurden. Ihre Kontrastwirkung
im MRT beruht auf der paramagnetischen Wirkung des Gadoliniumions. Die
Kontrastmittel führen zu einer katalytischen Verkürzung der Relaxationszeit
von Protonen und verstärken dadurch den Kontrast zum umgebenden Gewebe
(RAYMOND, 2005). Dieser Effekt ist auf die ungepaarten Elektronen
Diskussion
55
zurückzuführen, von denen Gd(III) jeweils sieben besitzt. Die ungepaarten
Elektronen weisen einen parallelen Spin auf, der sich zu einem
Nettoelektronenspin addiert (Paramagnetismus). Das magnetische Moment der
Elektronen führt zu einem starken magnetischen Wechselfeld und stimuliert
die Relaxation der benachbarten Protonen (REIMER, 2004; RAYMOND,
2005). Die Kontrastgebung bei konventionellen Röntgenverfahren hingegen
beruht auf vollkommen anderen Mechanismen. Dort wird die auftreffende
Röntgenstrahlung von den Kontrastmittelmolekülen absorbiert, was in der
Kontrastverstärkung gegenüber dem umliegenden KM-freien Gewebe
resultiert.
Es gibt mehrere Studien, die belegen, dass auch Gadolinium-KM grundsätzlich
für Untersuchungen im Computertomographen und für angiographische
Untersuchungen geeignet sind (KAUFMAN, 1999; LE BLANCHE, 2001;
GUPTA, 2002; KALINOWSKI, 2003; BAE, 2004). So testete BAE
beispielsweise Gadolinium-KM bei einer Dosis von 0,3 mmol/kg KG bei
Schweinen auf die Verwendbarkeit für computertomographische Angiographie
und kam zu dem Ergebnis, dass diese klinisch durchaus für entsprechende
Untersuchungen genutzt werden können (BAE, 2004). Auch KALINOWSKI
kommt in einer Studie an zehn Schweinen unter Verwendung von 1-molarem
Gadobutrol zu dem Schluss, dass das Gadoliniumchelat für
computertomographische Untersuchungen geeignet erscheint. Allerdings
verwendet er in seiner Studie eine deutlich höhere Konzentration von 2
mmol/kg KG (KALINOWSKI, 2003). Gadoteratmeglumin wurde bei
Kaninchen eingesetzt um renale Arterienstenosen zu beurteilen. Auch in dieser
Studie wurden Gadolinium-KM als Alternative zu iodhaltigen KM gesehen,
ebenso wie bei der Computertomographie eines Hundes unter Verwendung von
Gadopentetatdimeglumin (LE BLANCHE, 2001, GUPTA, 2002). Allerdings
wurde bei keiner dieser Studien die Wirkung auf die Nierenfunktion beurteilt,
sondern lediglich die Kontrasteigenschaften der Gadoliniumchelate.
Unterstützt werden diese tierexperimentellen Studien von Fallberichten und
Studien über die Verwendung von Gadoliniumchelaten außerhalb der
Kernspin-Tomographie an Patienten mit Kontraindikationen gegen Iod-
Kontrastmittel, die die Machbarkeit von CT und Angiographie mit
Diskussion
56
Gadolinium-KM zeigen (HATRICK, 1997; SPINOSA, 1998; HAMMER,
1999; KAUFMAN, 1999; PENA, 1999; ALBRECHT, 2000; ERLY, 2000;
NUSSBAUM, 2000; TOWNSEND, 2000; AMAR, 2001; WAGNER, 2001;
BUDOFF, 2002; DINKEL, 2002; GUPTA, 2002; RIEGER, 2002). RIEGER
berichtet beispielsweise von der Durchführung diagnostischer und inter-
ventioneller Angiographien an 29 Patienten mit Nierenfunktionseinschränkung
und beobachtete dabei eine adäquate diagnostische Darstellung der relevanten
Strukturen (RIEGER, 2002). PENA führte an einem Patienten eine
computertomographische Untersuchung unter Verwendung von
Gadopentetatdimeglumin durch, die eine koronale zweidimensionale
Rekonstruktion der Aorta ermöglichte (PENA, 1999).
4.5 Vergleich der Kontrastmittel in vivo Es gibt jedoch auch Berichte über nephrotoxische Eigenschaften der
Gadoliniumpräparate in Mensch und Tier.
Eine tierexperimentelle Studie an Ratten mit einer Cisplatin-induzierten
Nephropathie zeigte 24 Stunden nach Injektion hoher Dosen von Diatrizoat,
Iohexol, Gadopentetat oder Gadodiamid eine Dysfunktion der Nieren bei allen
vier Kontrastmitteln, wobei Gadodiamid die geringsten Funktionsstörungen
auslöste und Diatrizoat die ausgeprägtesten (THOMSEN, 1995). ELMSTAHL
untersuchte 2004 die Wirkung der Kontrastmittel Gadopentetat, Gadodiamid
und Iohexol in äquimolaren Konzentrationen und Konzentrationen mit sich
entsprechenden Röntgendichten an Schweinen mit renaler Ischämie. Dabei
zeigte sich, dass die Gadolinium-Kontrastmittel sowohl in den äquimolaren als
auch in den Konzentrationen gleicher Röntgendichte stärkere nephrotoxische
Effekte zeigten als das nichtionisch monomere Kontrastmittel Iohexol
(ELMSTAHL, 2004). Auch in einer 2008 veröffentlichten tierexperimentellen
Studie an Schweinen mit renaler Ischämie zeigten die verwendeten iodhaltigen
Kontrastmittel Iodixanol und Iopromid einen deutlichen Vorteil bezüglich
Röntgendichte und Nephrotoxizität in der Arteriographie gegenüber dem
Gadolinium-Kontrastmitteln Gadobutrol und Gadodiamid bei einem injizierten
Volumen von 3 ml/kg KG (ELMSTAHL, 2008).
Diskussion
57
Klinische Fallberichte und Studien widersprechen sich in der Aussage, ob
Gadolinium-Kontrastmittel bei Röntgen-Untersuchungen in Patienten mit
Kontraindikationen gegen Iod-Kontrastmittel einen Vorteil bieten. Eine Studie
von RIEGER impliziert, dass Gadopentetatdimeglumin eine sichere Alternative
für Angiographie und interventionelle Verfahren bei Patienten mit schwerer
vorbestehender Nierenschädigung ist. In dieser Untersuchung wurden 32
diagnostische und interventionelle angiographische Verfahren an Patienten mit
schwerer renaler Insuffizienz, von denen 59 % an zusätzlichem Diabetes
mellitus litten, durchgeführt. Dabei wurde Gadopentetatdimeglumin in einer
Konzentration von durchschnittlich 0,34 mmol/kg KG allein oder in
Kombination mit CO2 verwendet und führte in allen Fällen zu einer
ausreichenden Röntgendichte. Dabei erlitt einer der 29 Patienten ein akutes
Nierenversagen nach der Kontrastmittelanwendung, wobei jedoch andere
Ursachen nicht sicher ausgeschlossen werden konnten. Gadopentetat-
dimeglumin wird daher von Rieger als weniger nephrotoxisch beurteilt als
iodhaltige Kontrastmittel (RIEGER, 2002).
In einer ähnlichen Studie wurden die Verwendung eines nichtionischen Iod-
Kontrastmittels in Kombination mit CO2, CO2 als alleiniges Kontrastmittel und
Gadodiamid in einer Konzentration von bis zu 0,3 mmol/kg KG für die
Angiographie der unteren Extremität auf ihre Nephrotoxizität hin untersucht.
Dabei wurden insgesamt 42 Angiographien an insgesamt 40 Patienten mit
chronischer renaler Insuffizienz, von denen 63 % an Diabetes mellitus erkrankt
waren, beobachtet. 15 Prozeduren wurden mit dem Iod-KM durchgeführt, 7
mit Kohlenstoffdioxid und 20 mit Gadodiamid. Es zeigte sich ein signifikanter
Unterschied in der Inzidenz der KIN zwischen der Gruppe, die das iodhaltige
KM erhielt (40 %) und der Gruppe, die das Gadolinium-KM erhielt (5 %). Die
Kontrastmittel wurden jedoch in verschiedenen Dosierungen verwendet, was
die Beurteilbarkeit des nephrotoxischen Potentials deutlich einschränkt.
Errechnet man für beide Gruppen die durchschnittlich verabreichte Dosis, so
kommt man zu dem Ergebnis, dass das nichtionische Iod-KM deutlich höher
dosiert wurde als das Gadolinium-KM: Die Patienten erhielten durchschnittlich
0,43 mmol des nichtionischen KM/kg KG, aber nur 0,29 mmol/kg KG
Gadodiamid (SPINOSA, 2000). Allerdings gibt es auch klinische Studien und
Diskussion
58
Fallberichte, die zeigen, dass auch die auf Gadolinium basierenden KM zu
akutem Nierenversagen führen können (SCHENKER, 2001; SAM, 2003;
ERLEY, 2004). Dafür spricht eine Studie an 260 Patienten, von denen sich 218
einer Magnetresonanz-Angiographie und 42 einer digitalen
Subtraktionsangiographie mit Gadopentetatdimeglumin als einzigem
Kontrastmittel in einer Dosierung von 0,25 – 0,42 mmol/kg KG unterzogen.
Bei 195 der Patienten bestand vor der Prozedur bereits eine chronische
Niereninsuffizienz (Kreatinin-Clearance < 80 ml/min/1,73 m2). In dieser
Patientengruppe kam es bei sieben Patienten zu einem akuten Nierenversagen
nach der Angiographie. Dies entspricht einer Inzidenz von 3,5 %. Das akute
Nierenversagen nach KM-Gabe trat dabei bei Kontrastmittel-Konzentrationen
zwischen 0,27 und 0,42 mmol/kg KG auf. Bei drei Patienten wurde aufgrund
des akuten Nierenversagens vorübergehende Hämodialyse notwendig, einer der
Patienten musste sich einer Langzeitdialyse unterziehen (SAM, 2003).
Eine neuere randomisierte klinische Studie zeigte, dass die Gabe des
Gadolinium-Kontrastmittels Gadobutrol bei Patienten mit stark eingeschränkter
Nierenfunktion (Serumkreatinin 3,2 1,3 mg/dl, GFR 31 16 ml/min/1,73 m2)
ebenso wie das Iod-KM Iohexol in einer GFR-Reduktion resultiert. Insgesamt
wurden 21 Patienten in zwei Gruppen randomisiert und erhielten während einer
digitalen Subtraktionsangiographie entweder Gadobutrol oder Iohexol. In der
Gadobutrol-Gruppe wurde eine signifikante GFR-Reduktion von 10,6 13,8
ml/min/1,73 m2 beobachtet, in der Iohexol-Gruppe betrug die signifikante
GFR-Reduktion nur 8,7 8,8 ml/min/1,73 m2. Dieser Unterschied in der GFR-
Reduktion durch die beiden Kontrastmittel war allerdings ebenso wie die
Inzidenz des akuten Nierenversagens in den beiden Gruppen (50 % bei
Gadobutrol und 45 % bei Iohexol) nicht statistisch signifikant, da nach der
Untersuchung von 21 Patienten die Studie vorzeitig abgebrochen wurde,
nachdem eine Untersuchung von NYMAN mögliche toxische Effekte von
Gadobutrol gezeigt hatte (NYMAN 2002) und nahezu alle bis dahin
untersuchten Patienten mit einer GFR-Reduktion auf die Applikation von
Gadobutrol reagierten (ERLEY, 2004).
Diskussion
59
4.6 Vergleich der Kontrastmittel in vitro
4.6.1 MTT-Test
Der MTT-Test ist ein etabliertes Testverfahren, das bei vielen Fragestellungen
zur Beurteilung von Lebensfähigkeit, Aktivierungszustand und Proliferation
von Zellen und vor allem der Cytotoxizität verschiedenster Substanzen
Anwendung findet (KREISBERG, 1988; AHLENSTIEHL, 2003; ZHANG,
2003; NAKANISHI, 2005). Auch für die Quantifizierung der Effekte von
Kontrastmitteln wurde der MTT-Test bereits mehrfach angewendet. So zeigen
einige Studien die Reduktion der MTT-Konversion durch iodhaltige
Kontrastmittel an Tubulus-Zellkulturen (DASCALU, 1994; HARDIEK, 2001;
ZAGER, 2003; HEINRICH, 2005).
Auch in unseren Experimenten konnte die Cytotoxizität der verschiedenen
Kontrastmittel gut anhand der Reduktion der MTT-Konversion nachvollzogen
werden. Sämtliche Kontrastmittel zeigten eine Konversionsinhibition, die mit
der Dosis der jeweiligen Kontrastmittel zunahm. Diese Dosisabhängigkeit
zeigte sich auch in anderen Studien zur Kontrastmittelwirkung an Zellkulturen:
HARDIEK zeigte bei Untersuchungen anhand des MTT-Tests eine deutliche
Dosisabhängkeit der MTT-Konversionshemmung durch Iopamidol, Iomeprol,
Iodixanol, Ioxaglat und Diatrizoat in Konzentrationen von 25, 50, 75 und 100
mg I/ml (HARDIEK, 2001). Eine Dosisabhängigkeit der Konversions-
hemmung konnte auch für die Kontrastmittel Ioxitalamat, Ioversol, Iodixanol
und Iotrolan bei Konzentrationen von 18,75 bis 150 mg I/ml beobachtet
werden (HEINRICH, 2005) sowie in einer weiteren Studie für Iomeprol und
Iodixanol in Konzentrationen von 4,77 und 75 mg I/mL (HEINRICH, 2007).
In unserer Arbeit wurde eine Evaluierung der Zeitkinetik der Zellschädigung
durch die Kontrastmittel Iomeprol und Gadopentetatdimeglumin ebenfalls
anhand des MTT-Tests durchgeführt. Hier zeigte sich der Großteil der
Schädigung bereits zwei Stunden nach Inkubation mit den Kontrastmitteln,
nach acht Stunden war keine weitere signifikante Zunahme der Zellschädigung
mehr nachweisbar. Auch HARDIEK evaluierte die Zeitabhängigkeit der
Zellschädigung durch Iopamidol mit Hilfe des MTT-Tests, konnte dabei aber
Diskussion
60
keine eindeutige Zeitabhängigkeit der Schädigung nachweisen. In den
Konzentrationen von 25, 50, 75 und 100 mg I/ml war nach vier Stunden
Inkubation eine maximale Zellschädigung erreicht, die im weiteren Verlauf
gleich blieb oder sich leicht reduzierte (HARDIEK, 2001). Auch in einer in
vitro Studie an humanen Nieren-Adenocarcinom-Zellen wurde mittels des
MTT-Tests eine deutliche Zellschädigung bereits nach vier Stunden
Inkubationszeit nachgewiesen. Dieser Effekt wurde in allen getesteten
Iodkonzentrationen (8, 20, 60 mg I/ml) beobachtet und war für die getesteten
ionischen Kontrastmittel (Diatrizoat, Amidotrizoat, Ioxaglat) signifikant stärker
als für die nichtionischen KM (Iopamidol, Iotrolan, Iopromid). Nach 24
Stunden zeigte sich auch hier keine eindeutige Zunahme der Schädigung, so
dass auch hier keine klare Zeitabhängigkeit gezeigt werden konnte
(DASCALU, 1994). In einer in vitro Studie mittels MTT-Test an LLC-PK1-
Zellen von HEINRICH konnte allerdings eine Zeitabhängigkeit der
Konversionshemmung durch Iomeprol und Iodixanol festgestellt werden. Auch
hier zeigte sich, dass sich ein Großteil der Zellschädigung bereits früh
innerhalb von 8 Stunden auftrat und eine weitere Inkubation nur zu geringer
oder keiner weiteren Zunahme der Konversionshemmung mehr führte
(HEINRICH, 2007).
Zum cytotoxischen Potential gadoliniumhaltiger Kontrastmittel liegen derzeit
noch keine Studien unter Zuhilfenahme des MTT-Tests vor, jedoch verwendet
YANO einen Test, der ebenfalls auf der Reduktion eines Tetrazoliumsalzes zu
einem Formazan beruht und allgemein als Alternative zum MTT-Test
angesehen wird. In dieser Studie wurden die Effekte von Gadopentetat und
Gadoteridol nach 30minütiger KM-Inkubation und anschließender 24stündiger
Inkubation in serumfreiem Medium mittels des WST-8-Tests beurteilt. Es
zeigte sich bei beiden Kontrastmitteln eine signifikante Hemmung der WST-8-
Reduktion (YANO, 2003).
Es gibt nun aber mehrere Möglichkeiten, die beobachtete
Konversionshemmung zu deuten. Der Mechanismus der MTT-Aufnahme in
die Zelle ist nicht komplett geklärt. Die Aufnahme des Tetrazoliums in die
Zelle erfolgt wahrscheinlich durch Endozytose, wobei allerdings auch ein
Diskussion
61
proteinvermittelter Transport ins Zellinnere nicht komplett ausgeschlossen
werden kann (LIU, 1997). In der Zelle wird das gelbe Tetrazolium durch
mitochondriale oder andere zelluläre Dehydrogenasen zu dem blauen
Formazan reduziert.
Die Konversion von MTT in das blaue Formazan kann daher für die Messung
verschiedenster Endpunkte verwendet werden. Zunächst könnte die
verminderte MTT-Konversion durch das Absterben von Zellen erklärt werden.
Dagegen sprechen im Falle von niedrigosmolalen, nichtionischen KM aber in
vitro Studien, die zeigen, dass die Reduzierung des Tetrazoliums zu Formazan
durch nichtionsche KM nicht auf den Zelltod zurückgeführt werden kann
(HARDIEK, 2001). Auch unsere Testergebnisse zum Zelltod durch
nichtionische Kontrastmittel sprechen dagegen, dass der Hauptgrund für die
geringere MTT-Konversion in den behandelten Zellkulturen im Absterben der
Zellen liegt. Zum zweiten könnte eine Reduktion der Proliferationsrate der
behandelten Zellen gegenüber den unbehandelten Kontrollzellen für die
Ergebnisse des MTT-Tests zumindest teilweise verantwortlich sein. Dafür
sprechen die Untersuchungsergebnisse von HARDIEK, die eine geringe
dosisabhängige Proliferationshemmung durch Iopamidol zeigen konnten.
Allerdings konnte die verminderte MTT-Reduktion nicht vollständig durch
diese Proliferationshemmung erklärt werden (HARDIEK, 2001). Weiterhin
könnte eine Beeinflussung mitochondrialer und anderer zellulärer
Dehydrogenasen die verminderte Entstehung des Formazans in den mit
Kontrastmittel behandelten Zellen verursachen (HARDIEK, 2001). In der
Literatur finden sich Hinweise auf die Beeinflussung der Mitochondrien durch
Kontrastmittel: Anhand von in vitro Experimenten an LLC-PK1-Zellen konnte
eine verminderte MTT-Reduktion gezeigt werden, die auf die Beeinflussung
mitochondrialer Dehydrogenasen zurück zu führen sein könnte und zusätzlich
eine Erhöhung der Adenosin-Konzentration als Ausdruck einer Imbalance
zwischen ATP-Produktion und ATP-Utilisation (HARDIEK, 2001). Auch
ZAGER beschreibt die Beeinflussung der Mitochondrien durch Kontrastmittel.
Er fand nach Untersuchungen anhand von Kulturen proximaler Tubuluszellen
nach Schädigung durch das iodhaltige Kontrastmittel Ioversol, dass
Kontrastmittel zur Destabilisierung der Plasmamembran und möglicherweise
Diskussion
62
auch der mitochondrialen Membranen führen können, so dass es in der Folge
zum Verlust wichtiger Plasmamembranproteine wie der Na+/K+-ATPase und
auch mitochondrialer Proteine wie Cytochrom c kommen kann. Der Übertritt
von Cytochrom c, das normalerweise an der inneren Mitochondrienmembran
lokalisiert ist, ins Cytoplasma kann über die Aktivierung von Caspasen
schließlich zum Tod der Zelle führen (ZAGER, 2003; ZAGER, 2004).
Des Weiteren könnten theoretisch die Kontrastmittel auch die Aufnahme des
MTT in die Zellen durch Endozytose oder proteinvermittelten Transport
hemmen und dadurch zu einer verminderten Reduktion des MTT führen. Ein
derartiger Effekt von Kontrastmitteln wurde bisher allerdings noch nicht
beschrieben.
4.6.2 Trypanblau-Test zum Nachweis des Zelltodes
Um bewerten zu können, ob die im MTT-Test beobachtete
Konversionshemmung nach Behandlung der Zellen mit verschiedenen
Kontrastmitteln auf den Untergang von Zellen zurückzuführen ist, führten wir
einen Trypanblau-Exklusions-Test beispielhaft mit einem iodhaltigen
(Iomeprol-190) und einem gadoliniumhaltigen Kontrastmittel (Magnevist,
Gadopentetatdimeglumin) durch.
In unseren Experimenten unter Verwendung des Trypanblau-Exklusions-Tests
konnte eine signifikante Reduktion der Anzahl lebender Zellen durch das
hochosmolale Kontrastmittel Gadopentetatdimeglumin in Konzentrationen von
125 mM und 250 mM festgestellt werden, wohingegen nach Inkubation mit
dem monomeren Iod-Kontrastmittel Iomeprol nur eine geringe Anzahl toter
Zellen nachgewiesen werden konnte und dieser Effekt auch nur in der hohen
Konzentration von 250 mM zu sehen war.
Diese Ergebnisse decken sich gut mit den Resultaten des MTT-Tests und auch
mit bisherigen Untersuchungen anderer Autoren, die den Trypanblau-Test
angewendet haben, um Kontrastmittel-Cytotoxizität untersuchen (HALLER,
1997; WANG, 1998; SCHICK, 1999; ANDERSEN, 1994; HARDIEK, 2001).
Diskussion
63
Dabei zeigt sich meist, dass die nichtionisch monomeren und somit
niedrigosmolalen Iod-KM weniger oft oder gar nicht zum Absterben der Zellen
führten als die ionischen und somit hochosmolalen Kontrastmittel (WANG,
1998). WANG beurteilte anhand der Trypanblau-Färbung die cytotoxischen
Effekte der Kontrastmittel Diatrizoat, Ioxaglat, Iopromid und Iotrolan auf die
Zellen menschlicher Gefäßmuskulatur. Nach 60-minütiger Inkubation der
Zellen mit den Kontrastmittellösungen fand sich keine Beeinträchtigung der
Lebensfähigkeit der Zellen durch die nichtionisch monomeren Kontrastmittel
Iopromid und Iotrolan, bei den ionischen KM Diatrizoat und Ioxaglat wurde
eine signifikante Reduktion lebender Zellen festgestellt (WANG, 1998). Auch
HARDIEK fand keinerlei Hinweise auf eine Beeinträchtigung der
Lebensfähigkeit von LLC-PK1-Zellen nach Inkubation mit dem nichtionischen
Kontrastmittel Iopamidol (HARDIEK, 2001).
HALLER verwendete den Trypanblau-Test zur Beurteilung der Toxizität der
Kontrastmittel nach Inkubation der LLC-PK1-Zellen mit Ioxaglat und
Iopamidol und anschließender Trypsinierung der Zellen. Dabei stellte sich eine
Reduktion der Zahl lebender Zellen heraus, die bei dem hochosmolalen
Kontrastmittel Diatrizoat deutlich ausgeprägter war, als bei dem nichtionisch
monomeren Kontrastmittel Iopamidol (HALLER, 1997). Auch in den
Versuchen von SCHICK an MDCK-Zellen führte das ionische monomere KM
Diatrizoat zu einem signifikanten Anstieg toter Zellen im Trypanblau-Test,
während die verwendeten nichtionischen KM Iohexol und Iodixanol, aber auch
das dimere ionische KM Ioxaglat nicht zu einer reduzierten Lebensfähigkeit
der Zellen führten (SCHICK, 1999). ANDERSEN verwendete zur
Untersuchung der zellulären Schädigungsmechanismen durch Kontrastmittel
den Trypanblau-Test sowohl bei LLC-PK1- als auch MDCK-Zellen. Dabei
zeigte das hochosmolale Kontrastmittel Metrizoat bei beiden Zelltypen eine
signifikante Erhöhung der Zellmortalität (73% tote Zellen bei den LLC-PK1-
Zellen, 56 % bei den MDCK-Zellen), wohingegen die Kontrastmittel niederer
Osmolalität Ioxaglat und Iohexol nur geringe Auswirkungen auf die
Lebensfähigkeit der Zellen hatten (ANDERSEN, 1994).
Zur Auslösung des Zelltodes durch Gadolinium-KM existieren derzeit keine
anderen Studien unter Verwendung der Trypanblau-Methode.
Diskussion
64
4.6.3 Rolle von Apoptose und Nekrose Ein wichtiger Mechanismus bei der Entstehung der KIN soll die direkte
cytotoxische Schädigung der Nierenzellen sein, wozu auch die Auslösung des
Zelltodes gehört (HIZOH, 1998; MORCOS, 1998; PEER, 2003; RUDNICK,
2003). Wie durch die Verwendung des Trypanblau-Tests deutlich wurde,
kommt es bei Inkubation renaler Tubuluszellen mit hochosmolalen
Kontrastmitteln zum Absterben von Zellen. Der Zelltod kann nun aber durch
zwei unterschiedliche Mechanismen erfolgen: durch Apoptose oder Nekrose.
Die Nekrose ist assoziiert mit raschem metabolischem Kollaps der Zelle, der
zur Zellschwellung inklusive Schwellung der cytoplasmatischen Organellen,
Verlust der Plasmamembranintegrität und letztendlich zur Zellruptur führt
(BONFOCO, 1995). Dadurch kommt es zum Austritt von cytoplasmatischen
Bestandteilen, die zu inflammatorischen Reaktionen im umliegenden Gewebe
führen können. (LIEBERTHAL, 1996; ALENZI, 2003).
Im Gegensatz dazu handelt es sich bei der Apoptose um einen
energieverbrauchenden, gengesteuerten Zellprozess, der zum „Suizid“ der
Zelle führt. Dabei unterscheiden sich die beiden Prozesse durch die
morphologischen Charakteristika und die biochemischen Vorgänge
grundlegend voneinander. Die Apoptose ist charakterisiert durch
Zellschrumpfung, nukleare Kondensation und DNA-Fragmentation in
nucleosomale Einheiten durch Spaltung der Linker-DNA zwischen den
Nucleosomen, die zur Bildung von mono- und oligonucleosomalen DNA-
Fragmenten führt. Diese werden als Hauptmerkmal der Apoptose bezeichnet
(ARENDS, 1990; SCHWARTZMAN, 1993; ALENZI, 2003). Anschließend
kommt es zur Karyolyse, dann zur Auflösung der Zelle in mehrere Apoptose-
Körperchen. Darunter versteht man Plamamembranvesikel mit kondensiertem
Chromatin und morphologisch intakten Organellen, wobei es im Gegensatz zur
Nekrose nicht zum Austritt cytoplasmatischen Materials kommt
(LIEBERTHAL, 1996; NAGATA, 2000; ALENZI, 2003).
Diskussion
65
Die Beteiligung beider Vorgänge an der Entstehung der KIN ist seit einiger
Zeit ein kontrovers diskutiertes Thema, zu welchem entgegengesetzte
Studienergebnisse vorliegen. Daher war ein weiterer Schritt unserer
Untersuchungen die Klärung der Frage, ob Nekrose und Apoptose durch die in
unserer Studie verwendeten Iod- und Gadolinium-Kontrastmittel ausgelöst
werden können.
Um die beiden Arten des Zelltodes, die durch die KM ausgelöst werden
könnten - Apoptose und Nekrose - unterscheiden zu können, führten wir einen
ELISA durch, der histongebundenen DNA-Komplexe aus der
cytoplasmatischen Fraktion der Zellen nach apoptotischem Zelluntergang und
DNA-Fragmente nach Austritt aus nekrotischen Zellen nachweisen konnte. Die
hochosmolalen Gadoliniumchelate Magnevist (Gadoliniumpentetatdi-
meglumin) und Multihance (Gadobenatdimeglumin) induzierten dabei
verglichen mit der Kontrolle aus unbehandelten Zellen in serumfreiem Medium
signifikant mehr Apoptose und auch Nekrose, wohingegen Gadoterat nur
wenig Apoptose auszulösen vermochte und die übrigen Kontrastmittel
Gadodiamid und Iomeprol weder zu Apoptose noch zu Nekrose führten.
Auch in früheren Studien wurde der Frage nachgegangen, inwiefern die auf Iod
basierenden Kontrastmittel zur Apoptoseauslösung führen. HIZOH wies
anhand von MDCK-Zellen, die für 2-8 Stunden mit dem ionischen monomeren
Kontrastmittel Diatrizoat in Konzentrationen von 10, 20 und 30 % inkubiert
worden waren, eine DNA-Fragmentation als Zeichen einer Apoptose nach
(HIZOH, 1998; HIZOH, 2002). Die Aussage, dass ionische Iod-Kontrastmittel
apoptotischen Zelltod auslösen können, wird von Untersuchungen von PEER
unterstützt, bei denen renale Mesangiumzellen, Tubuluszellen, Epithelzellen,
endotheliale Zellen und hepatische Zellen verwendet wurden. Dabei wurden
die verschiedene Zelltypen mit Ioxaglat (ionisch dimer), Ioxitalamat (ionisch
monomer), Iopromid und Iomeprol (beide nichtionisch monomer) für 24
Stunden in Konzentrationen von 0,1 %, 1 % und 10 % inkubiert. Die ionischen
Kontrastmittel führten dabei bei allen Konzentrationen zur Auslösung von
Apoptose, ebenso wie das nichtionische KM Iopromid. Iomeprol führte bei
Konzentrationen 1 % zum apoptotischen Zelltod (PEER, 2003).
Diskussion
66
Die Auslösung von Apoptose durch nichtionische Kontrastmittel wird in der
Literatur unterschiedlich beurteilt. Während in der Studie von PEER Iomeprol
und Iopromid zu Apoptose führen, konnte HARDIEK keinen Anhalt für den
programmierten Zelltod nach 24stündiger Inkubation von LLC-PK1-Zellen mit
dem nichtionischen KM Iopamidol finden (HARDIEK, 2001). YANO zeigte in
mehreren Studien, dass das nichtionische iodhaltige Kontrastmittel Ioversol
nach vorübergehender 30minütiger KM-Exposition und anschließender
24stündiger Inkubation in serumfreiem Medium zur Auslösung des
programmierten Zelltodes führt (YANO, 2003; YANO, 2004). Auch
ROMANO konnte 2008 zeigen, dass sowohl Iodixanol (IOCM) als auch
Iobitridol LOCM) in Kulturen von Humanen embryonalen Nierenzellen
(HEK293), LLC-PK1-Zellen und in Hundenierenzellkulturen (MDCK) eine
dosisabhängige Apoptose auslösen können (ROMANO, 2008)
Die unterschiedlichen Ergebnisse der genannten Untersuchungen lassen sich
wohl auf die Verwendung unterschiedlicher Kontrastmittel, Konzentrationen,
Inkubationszeiten und verschiedene Nachweismethoden für Apoptose
zurückführen.
Zur Rolle der Apoptose bei Gadolinium-Kontrastmitteln liegen derzeit noch
keine Studien vor.
4.6.4 Rolle der Osmolalität
Ein wichtiges Kriterium für die Entstehung der Kontrastmittel-induzierten
Nephropathie ist anscheinend die Osmolalität der Kontrastmittel. So zeigten
verschiedene klinische Untersuchungen einen deutlichen Unterschied in der
Toxizität der Kontrastmittel abhängig von der jeweiligen Osmolalität. In einer
großen Metaanalyse zeigte BARRETT eine deutlich höhere Inzidenz der KIN
bei Patienten mit Risikofaktoren, wenn diese ein Iod-KM mit hoher
Osmolalität (Iothalamat, Diatrizoat) erhielten, als wenn sie ein KM mit
niedriger Osmolalität erhielten (Iohexol, Iopamidol). Die niedrigosmolalen KM
induzierten bei 1,9 % der Patienten mit renaler Insuffizienz eine KIN, bei
Patienten mit Niereninsuffizienz und zusätzlichem Diabetes mellitus in 3,8 %.
Bei Verwendung der hochosmomolalen Kontrastmittel zeigte sich bei den
Diskussion
67
Patienten mit Nierenfunktionseinschränkung eine Inzidenz der KIN von 12,5 %
und bei Patienten, die zusätzlich dazu noch an Diabetes mellitus litten, eine
Inzidenz von 25 % (BARRETT, 1993). Eine weitere Studie, die ebenfalls die
Kontrastmittel Iohexol und Diatrizoat verglich, zeigt sehr ähnliche Ergebnisse:
Iohexol führte bei Patienten mit Niereninsuffizienz allein zu einer Inzidenz der
KIN von 4,1 %, bei Patienten mit zusätzlichem Diabetes mellitus von 7,4 %.
Diatrizoat zeigte bei Patienten mit renaler Insuffizienz eine Inzidenz der
Kontrastmittel-Nephropathie von 11,8 %, während Patienten mit beiden
Risikofaktoren einem Risiko von 27 % ausgesetzt waren eine Einschränkung
der Nierenfunktion nach Kontrastmittelgabe zu erleiden (RUDNICK, 1995).
Klinische Studien zur Verwendung von Kontrastmitteln mit noch geringerer
Osmolalität, den so genannten isoosmolalen Kontrastmitteln (Iotrolan,
Iodixanol), zeigen gegensätzliche Ergebnisse. Während einige Autoren einen
Vorteil in der Verwendung isoosmolaler KM sehen (CHALMERS, 1999;
ASPELIN, 2003), sprechen andere Untersuchungen nicht klar für die
Überlegenheit dieser KM-Gruppe (DERAY, 1996; SHARMA, 2005).
Neben klinischen Studien sprechen auch tierexperimentelle Studien für ein
besseres Risikoprofil niedrigosmolaler Kontrastmittel. ELMSTAHL
beobachtete bei seinen Untersuchungen an Schweinen mit vorgeschädigten
Nieren, dass die nephrotoxischen Effekte der gadolinium- und iodhaltigen
Kontrastmittel sich proportional zu ihren Osmolalitäten verhielten. Es wurde
geschlussfolgert, dass die Nierenschädigung im Tiermodell eine Folge der
Hyperosmolalität sein könnte (ELMSTAHL, 2002).
Damit korrelieren auch Ergebnisse von in vitro Studien, die die Toxizität von
hoch- und niedrigosmolalen Kontrastmitteln anhand von Zellkulturen
vergleichen. So zeigte sich bei einem Vergleich des hochosmolalen KM
Ioxitalamat mit dem niedrigosmolalen Iomeprol-300 eine deutlich stärkere
MTT-Konversionshemmung bei dem hochosmolalen KM. Bei einem Vergleich
der Kontrastmitteleffekte mit entsprechenden Mannitol-Lösungen als
Osmolalitätskontrolle wurde aber deutlich, dass zusätzlich zur Osmolalität
noch eine Chemotoxizität der Kontrastmittelmoleküle vorliegt (HEINRICH,
2005). DASCALU verglich die Auswirkungen der Inkubation mit ionischen
und nichtionischen Iod-Kontrastmitteln auf humane endotheliale und renale
Diskussion
68
Zellen und zeigte, dass die ionischen Kontrastmittel zu einer stärkeren
Hemmung der MTT-Konversion führten als die nichtionischen Kontrastmittel
(DASCALU, 1994). Auch in unseren Untersuchungen konnten wir eine
Abhängigkeit der Toxizität von der Osmolalität der Testlösungen feststellen.
So zeigten die hochosmolalen Gadolinium-KM (Magnevist: 1960 mosm/kg;
Multihance: 1970 mosm/kg) eine signifikant höhere Konversionshemmung als
das niedrigosmolale Iod-KM Iomeprol (521 mosm/kg) und die Gadolinium-
KM Gadodiamid und Gadoterat. Auch unsere Ergebnisse weisen darauf hin,
dass die Cytotoxizität nicht allein Folge der Osmolalität ist, sondern zusätzlich
andere Faktoren an der Schädigung beteiligt sein müssen. Dafür sprechen die
Ergebnisse beim Vergleich der Kontrastmitteleffekte mit Mannitol-Lösungen
gleicher Osmolalität, bei denen eine höhere Toxizität der Kontrastmittel
gegenüber den Mannitol-Lösungen nachgewiesen werden konnte.
Gadopentetat und Gadobenat zeigten in den geringeren Konzentrationen
jeweils stärkere Schädigungen der Zellen als die korrespondierenden Mannitol-
Lösungen. In der Konzentration von 250 mM allerdings war dieser Effekt nicht
mehr nachweisbar. Es scheint also bei den hochosmolalen Kontrastmitteln in
hohen Konzentrationen die Osmolalität der vorherrschende Schädigungs-
mechanismus zu sein, während in geringen Dosen auch andere Mechanismen
bei der Zellschädigung eine Rolle spielen.
Auch HARDIEK zeigte, dass zwar ein Teil der Zellschädigung durch die
Osmolalität erklärt werden konnte, aber zusätzlich noch ein chemotoxischer
Effekt der Kontrastmittelmoleküle vorliegen muss (HARDIEK, 2001). Damit
decken sich auch bisherige in vitro Studien zur Rolle der Osmolalität, die
ebenfalls eine wesentliche Bedeutung in der Entstehung der KIN der
Osmolalität zuordnen, gleichzeitig aber einen zusätzlichen chemotoxischen
Effekt beschreiben (WANG, 1998; ZHANG, 2000).
4.6.5 Rolle der Toxizität des Gadoliniums Ein möglicher Grund für die toxischen Effekte der Gadoliniumchelate in
unseren Experimenten könnte die Freisetzung freier Gd3+-Ionen während der
Inkubationszeit sein. Freies Gadolinium stellt eine hochtoxische Substanz dar,
Diskussion
69
weil Gadoliniumionen in freier Form beispielsweise calciumantagonistisch
wirken, sich in Leber und Milz anreichern und zu Interaktionen mit
Blutgerinnung und Hämatopoese führen (REIMER, 2004). Gadolinium muss
daher durch starke organische Chelatoren gebunden werden. Diese können
linear oder zyklisch aufgebaut sein, zusätzlich unterscheidet man ionische und
nichtionische Kontrastmittelmoleküle (RAYMOND, 2005; REIMER, 2004).
Die Gadoliniumchelate zeigen im Vergleich mit freien Gadoliniumionen eine
deutlich geringere Toxizität, so zeigte Gadodiamid in Experimenten in vitro an
menschlichen neutrophilen Granulozyten keine Schädigung, während freies
Gadolinium zu reduzierter Überlebensfähigkeit der Zellen führte (BEHRA-
MIELLET, 1996).
Gadoliniumionen können aber in vivo durch Transmetallisation im Austausch
gegen Kupfer(II)-, Zink(II)- oder Calcium(II)-Ionen aus den Chelatkomplexen
herausgelöst werden (CACHERIS, 1990), so dass Gadoliniumionen freigesetzt
werden. Es gibt klinische Hinweise darauf, dass es bei Anwendung von
Gadodiamid zum Austausch des Gd3+-Ions gegen andere Ionen im Körper
kommen kann (KIRCHIN, 2003). Andererseits wurden bis zu sieben Tage nach
Anwendung von Gadodiamid kein Metabolismus und keine Transmetallisation
bei Patienten mit schwerwiegender Niereninsuffizienz nachgewiesen
(NORMANN, 2000). Für andere Gadoliniumchelate liegen diesbezüglich keine
Hinweise vor, da deren höhere Thermostabilität einen Ionenaustausch zu
verhindern scheinen (KIRCHIN, 2003).
Gegen die Freisetzung freier Gadoliniumionen als Mechanismus der
Zellschädigung in unseren Experimenten sprechen zwei Gründe: Gadodiamid,
das einzige Kontrastmittel für das die Transmetallisation beschrieben wurde,
zeigte in unseren Experimenten die geringste Toxizität verglichen mit den
weiteren getesteten Gadoliniumchelaten. Dagegen spricht ebenfalls der
zeitliche Verlauf der MTT-Konversionshemmung, da der größte Teil des
Effektes bereits nach zwei Stunden erreicht war.
Diskussion
70
4.7 Kontrastmittelkonzentrationen und Inkubationszeiten
Wichtig für die Beurteilung, inwiefern Gadolinium-KM tatsächlich eine
Alternative für Patienten mit Kontraindikationen gegen iodhaltige KM
darstellen, ist die notwendige Dosierung der jeweiligen KM für den
entsprechende Anwendungszweck und die Wirkungen der Kontrastmittel bei
diesen Konzentrationen.
In der Angiographie werden üblicherweise iodhaltige Kontrastmittel mit einer
Konzentration von 300 bis 370 mg I/ml eingesetzt. Für koronare Interventionen
werden von diesen Lösungen Volumina von etwa 240 bis 380 ml verwendet
(McCULLOUGH, 1997; MARENZI, 2004; DANGAS, 2005). Geht man
beispielsweise von einem Volumen von 250 ml eines KM mit 300 mg I/ml aus
und davon, dass dieses Volumen des Kontrastmittels sich im extrazellulären
Volumen ausbreitet, das etwa 20 % des Körpergewichtes ausmacht, so erwartet
man eine Serumkonzentration von etwa 5,4 mg I/ml bei einem 70 kg schweren
Patienten. Dies entspricht bei dem 788 mM Kontrastmittel Iomeprol 197 mmol
oder einer Dosierung von 2,8 mmol/kg KG. Die klinisch verwendeten Dosen
an Iod-Kontrastmittel erreichen nach Injektion eine Serumkonzentration von
maximal 10 bis 20 mg I/ml (HARDIEK, 2001; HALLER, 2004).
In den Nieren erreichen die Kontrastmittel allerdings durch die
physiologischen Konzentrierungsvorgänge deutlich höhere Konzentrationen,
die um das 50 bis 100fache über den Serumkonzentrationen liegen können
(BAKER, 2003; BRIGUORI, 2003). In einer tierexperimentellen Studie
wurden bei Kaninchen Urinkonzentrationen von 100 mg I/ml gemessen
(SPARATO, 1982). UEDA zeigte 1998 durch Mikropunktionstechnik, dass die
Iodkonzentration am proximalen Tubulus der Ratte 15 Minuten nach Injektion
verschiedener iodhaltiger Kontrastmittel zwischen 13,4 und 69,3 mg I/ml lag
(UEDA, 1998).
In unseren Experimenten verwendeten wir für den Vergleich der Kontrastmittel
bei gleicher Röntgendichte Konzentrationen zwischen 9,375 und 37,5 mg I/ml,
die also Konzentrationen der Kontrastmittel entsprechen, wie sie unter
physiologischen Bedingungen in der Niere auftreten können und die
Diskussion
71
gleichzeitig im Rahmen der Konzentrationen liegen, wie sie auch in
vorangegangenen Zellkulturstudien bereits verwendet wurden (ANDERSEN,
1994; HALLER, 1997; HIZOH, 1998; SCHICK, 1999; HARDIEK, 2001;
HIZOH, 2002; YANO, 2003). In einigen Studien wurden sogar
Konzentrationen von 100-150 mg I/ml untersucht (HIZOH, 1998; HARDIEK,
2001; YANO, 2003).
In einer 1997 veröffentlichten Studie von HALLER finden sich Kontrastmittel-
Konzentrationen von 37 mg I/ml und 74 mg I/ml, ähnlich wie sie auch in
unseren Experimenten zum Einsatz kamen (HALLER, 1997). HIZOH
verwendete in seinen Studien zur cytotoxischen Wirkungen iodhaltiger
Kontrastmittel beispielsweise Diatrizoat in Konzentrationen von 37 mg I/ml bis
111 mg I/ml (HIZOH, 1998; HIZOH, 2002). YANO testete die Wirkung des
Kontrastmittels Ioversol auf LLC-PK1-Zellen bei Konzentrationen von 25, 50,
100 und 150 mg I/ml (YANO, 2003). HARDIEK verwendete ebenfalls bei
LLC-PK1-Zellkulturen hohe Konzentrationen von 100 mg I/ml des
Kontrastmittels Iopamidol (HARDIEK, 2001).
Die oben erwähnten Kontrastmittel-Konzentrationen der Iod-Kontrastmittel
wie sie bei unseren Untersuchungen Verwendung fanden, entsprechen
Konzentrationen der Gadoliniumchelate von 62,5 bis 250 mmol/l, wenn die
Kontrastmittel sich in ihren Absorptionsvermögen für Röntgenstrahlen
entsprechen sollen. Diese hohen Konzentrationen von Gadoliniumchelaten
werden in der Niere natürlich nur dann erreicht, wenn sehr viel höhere Dosen
verabreicht werden, als diejenigen die für die Anwendung im Kernspin-
Tomographen üblich sind (0,3 mmol/kg KG). Die Röntgendichte einer 0,5
molaren Lösung eines Gadolinium-KM entspricht etwa der Röntgendichte von
60-80 mg I/ml, wie wir auch in unseren Versuchen bestätigen konnten. So
würden 50 ml eines Gadolinium-KM etwa 10-13 ml eines Iod-KM mit 300 mg
I/ml entsprechen (NYMAN, 2002). Die Mengen an Gadolinium-
Kontrastmittel, die notwendig sind, um aussagekräftige Angiogramme
außerhalb des MRT zu erreichen, liegen im Allgemeinen über den Dosierungen
von 0,3-0,4 mmol/ kg KG (ERLEY, 2004) und müssen insbesondere für
interventionelle Verfahren deutlich höher sein. Daher wurde die Verwendung
Diskussion
72
sehr viel größerer Mengen an Gadolinium-KM zwischen 80 und 440 ml als
Off-label-use bereits beschrieben (GEMMETE, 2001; THOMSEN, 2002;
ROSIOREANU, 2004; STRUNK, 2004). Dies entspricht einer Dosierung von
40-220 mmol oder 0,57-3,14 mmol/kg KG, also dem Vielfachen der üblichen
MRT-Dosis. Bei einem 70 kg schweren Patienten würden diese Dosierungen
zu einer Plasmakonzentration von etwa 3-16 mmol/l führen. Nimmt man
gleiche Konzentrierungsvorgänge wie oben an, so werden in der Niere
Konzentrationen der Gadoliniumchelate erreicht, wie sie in unserer Studie
Anwendung fanden.
Die Elimination von Kontrastmitteln bei Gesunden geschieht fast
ausschließlich durch glomeruläre Filtration (ROSATI, 1994). Da die
Elimination von Kontrastmitteln bei Patienten mit renaler Insuffizienz deutlich
eingeschränkt ist, verlängern sich die Halbwertzeiten der Kontrastmittel
erheblich und daher sind die Nierenepithelien über längere Zeit diesen
toxischen Substanzen ausgesetzt. Dies äußert sich auch in über mehrere Tage
bestehenden Nephrogrammen, wie sie LOVE beschrieben hat (LOVE, 1994).
So beträgt die Halbwertzeit des Gadoliniumchelates Gd-DTPA in Patienten mit
normaler Nierenfunktion etwa 1,5 Stunden, wohingegen die Halbwertzeit bei
Patienten mit chronischem Nierenversagen bis zu 30 Stunden erreichen kann
(PENA, 1999). Die Halbwertzeit von Gadodiamid beträgt bei Patienten mit
stark eingeschränkter Nierenfunktion bis zu 34 Stunden (JOFFE, 1998). Es
fanden sich in einer Studie Halbwertzeiten für das Gadoliniumchelat
Gadobutrol von 20,4 Stunden bei Patienten mit einer Kreatininclearance von
30 ml/min oder weniger, die nicht dialysepflichtig waren, verglichen mit einer
Halbwertzeit von 1,5 Stunden bei gesunden Patienten (TOMBACH, 2000).
Die Eliminationshalbwertzeit für Iopamidol wird in der Literatur bei Patienten
mit starker Einschränkung der Nierenfunktion mit bis zu 70 Stunden
angegeben (DONELLY, 1993). Auch bei anderen iodhaltigen KM liegen sehr
lange Halbwertzeiten vor. NOSSEN beschrieb eine Halbwertzeit von Iodixanol
von 23,0 Stunden und 27,2 Stunden für Iohexol bei Patienten mit schwerer
Nierenfunktionsschädigung (NOSSEN, 1995).
In unseren Experimenten war der größte Teil der MTT-Konversionshemmung
innerhalb der ersten beiden Stunden nachweisbar und nach 24-stündiger
Diskussion
73
Inkubation mit den Kontrastmitteln war ein nahezu maximaler Effekt zu
erkennen. Diese Inkubationszeit liegt noch unterhalb der
Eliminationshalbwertszeiten der Kontrastmittel wie sie in der Literatur für
Patienten mit renaler Insuffizienz beschrieben werden. Eine Inkubationszeit der
Zellen mit KM von 24 Stunden wurde auch in anderen Studien an renalen
Tubuluszellen verwendet (ANDERSEN, 1995; HARDIEK, 2001; PEER,
2003). Und auch noch längere Inkubationszeiten von bis zu drei Tagen sind
beschrieben (ZAGER, 2003).
Unser Versuchsaufbau richtete sich also sowohl was die Konzentrationen als
auch die Inkubationszeiten angeht, so weit wie möglich nach den
Gegebenheiten wie sie in klinischen Situationen bei Patienten mit
Niereninsuffizienz erwartet werden können.
4.8 Zellkultur als in vitro-Modell Die Zuhilfenahme von Zellkulturmodellen für die Aufklärung der Einflüsse
verschiedener Substanzen auf bestimmte Gewebe ist ein etabliertes Verfahren,
das für die unterschiedlichsten Fragestellungen zum Einsatz gekommen ist
(TOUTAIN, 1992; ANDERSEN, 1998; KREISBERG, 1988; WANG, 1998;
AHLENSTIEL, 2003; THAMILSELVAN, 2002; BALACHANDRAN, 2005;
HANIGAN, 2005; NAKANISHI, 2005; TOLSON, 2005).
Mehrere Autoren haben bereits Zellkulturen für ihre Untersuchungen zur
Kontrastmittelwirkung verwendet, um die Pathomechanismen der KIN weiter
aufzuklären und um mögliche prophylaktische Ansätze zu erproben
(ANDERSEN, 1994; HALLER, 1997; HIZOH, 1998; WANG, 1998;
HARDIEK, 2001; DOMINGUEZ, 2002; HIZOH, 2002; PEER, 2003; YANO,
2003; YANO, 2004). Einige in-vitro-Untersuchungen zur Kontrast-
mittelwirkung iodhaltiger Kontrastmittel, aber auch zur Wirkung von
Gadolinium-KM wurden ebenfalls anhand der von uns verwendeten LLC-PK1-
Zellen durchgeführt (HALLER, 1997; HARDIEK, 2001; YANO, 2003;
YANO, 2004; YANO, 2005; ROMANO, 2008)
Der wesentliche Vorteil der Zellkultur ist, dass die Wirkung der getesteten
Substanzen auf die Zellen unter Ausschluss äußerer Störfaktoren (wie z.B.
Diskussion
74
hämodynamische Veränderungen) evaluiert werden kann. Daher ist diese
Methode im besonderen Maße zur Aufklärung der tubulotoxischen Effekte der
KM geeignet (HALLER, 2004).
Die beiden am häufigsten verwendeten renalen Tubuluszelltypen sind MDCK-
Zellen, die aus Hundenieren gewonnen wurden und LLC-PK1-Zellen,
gewonnen aus den proximalen Tubuli des Schweins. Sie entsprechen in ihren
wesentlichen Eigenschaften nativen Nierenepithelzellen (RABITO, 1986;
GRAUNSTHALER, 1985).
Jedoch wurde eine starke Heterogenität der MDCK-Zellen beschrieben und
diese Zelllinie entspricht in ihren Eigenschaften nicht in dem Maße humanen
renalen Tubuluszellen wie LLC-PK1-Zellen, was die Aussagekraft von
Experimenten mit diesen Zellen einschränkt (GRAUNSTHALER, 1985; IDEE,
1996; TOUTAIN, 1995; HALLER, 2004). Für LLC-PK1-Zellen hingegen
liegen keine Berichte vor, die die Validität von Modellen mit diesen Zellen
einschränken könnten. Bisherige Studien mit LLC-PK1-Zellen zeigten, dass die
Schädigung der Zellen durch hochosmolale Kontrastmittel stärker ausgeprägt
ist, als die Schädigung durch niedrigosmolale Kontrastmittel (HARDIEK,
2001; HEINRICH, 2005). Diese Ergebnisse decken sich mit den vielfach
bestätigten Ergebnissen klinischer Untersuchungen (BARRETT, 1993;
RUDNICK, 1995). Diese Korrelation wird als Bestätigung der Validität eines
in-vitro- Modells für die KIN angesehen (IDEE, 1996).
4.9 Limitationen der Untersuchungen
Die verwendete Zellkulturmethode erlaubte uns eine objektive Beurteilung der
Kontrastmittelwirkung auf proximale Tubuluszellen unter standardisierten
Bedingungen. Diese Methode hat einerseits den Vorteil, dass Störfaktoren wie
z.B. hämodynamische Veränderungen weitgehend ausgeschlossen werden
können (HALLER, 2004), andererseits aber den Nachteil, dass sie der
multifaktoriellen Genese der Kontrastmittel-induzierten Nephropathie nicht
gerecht wird, sondern nur die direkte Cytotoxizität als möglichen
Teilmechanismus der KIN darstellen kann. Die KIN wird ja unter anderem
auch auf Beeinflussung der renalen Durchblutungssituation zurückgeführt, die
Diskussion
75
in diesem Modell natürlich nicht berücksichtigt wird (McCULLOUGH, 2003;
IDEE, 2004).
Zudem bleiben die Mechanismen, durch die Kontrastmittel die Zellen
schädigen weiterhin unklar. Die Osmolalität spielt zwar eine wichtige Rolle in
der Zellschädigung durch die Kontrastmittel, jedoch muss zusätzlich noch ein
chemotoxischer Effekt der Kontrastmittelmoleküle vorliegen. Dieser konnte
jedoch noch nicht endgültig aufgeklärt werden.
Eine weitere Limitation unserer Studie besteht darin, dass die verwendeten
Konzentrationen der Gadolinium-Chelate in einem hohen Bereich liegen, der
nur beim Off-label-use von Gadolinium-Kontrastmitteln in hohen
Konzentrationen wie beispielsweise der interventionellen Angiographie
erreicht wird.
4.10 Resümee und Schlussfolgerung
Der Einsatz von Gadoliniumchelaten als Alternative zu iodhaltigen
Kontrastmitteln bei Röntgenuntersuchungen zur Vermeidung der
kontrastmittelinduzierten Nephropathie wird derzeit kontrovers diskutiert.
Es liegen zwar mehrere Studien vor, die den Einsatz gadoliniumhaltiger
Kontrastmittel bei Röntgenuntersuchungen propagieren, jedoch berück-
sichtigen diese oftmals nicht die höhere Dosis bei Iod-Kontrastmitteln und die
schlechteren Kontrasteigenschaften bei Gadolinium-Kontrastmitteln und
beurteilen die toxischen Wirkungen der Kontrastmittel daher unter ungleichen
Bedingungen.
In dieser Studie versuchten wir daher die iodhaltigen und gadoliniumhaltigen
Kontrastmittel unter gleichen Bedingungen zu untersuchen, indem wir gleiche
molare Konzentrationen ebenso einsetzten wie Konzentrationen, die unter
Bestrahlung mit Röntgenstrahlen in der gleichen Röntgendichte resultieren
würden und somit die gleiche Bildqualität liefern würden.
Unsere Exprimente lassen darauf schließen, dass die gadoliniumhaltigen
Kontrastmittel bei Konzentrationen, die sich in ihrer Röntgendichte
entsprechen, in vitro ein höheres nephrotoxisches Potential aufweisen, als die
auf Iod basierenden Kontrastmittel. Möglicherweise ist es bei Angiographien
sinnvoller, statt der Gadoliniumchelate zur Nephroprotektion verdünnte
Diskussion
76
Lösungen der herkömmlichen Iod-Kontrastmittel zu verwenden, die die gleiche
oder sogar bessere Bildqualität bieten. Zudem sollte die Verwendung
gadoliniumhaltiger Kontrastmittel nicht unkritisch gesehen werden, da es auch
durch diese Kontrastmittelgruppe bereits zu schwerwiegenden Komplikationen
gekommen ist, die insbesondere auch die Risikogruppe von
niereninsuffizienten Patienten betraf. Seit 2001 wurden insgesamt über 200
Fälle der potentiell letalen nephrogenen systemischen Fibrose in
Zusammenhang mit der Applikation von Gadolinium-Kontrastmitteln
beschrieben (GOULLE 2009, TEN DAM 2009).
Bevor die Verwendung von Gadoliniumpräparaten für Röntgenuntersuchungen
empfohlen werden kann, sollten daher größere klinische Studien durchgeführt
werden, die die Nephrotoxizität der Iod-Kontrastmittel und Gadolinium-
Kontrastmittel in Konzentrationen vergleichen, die die gleiche Röntgendichte
aufweisen und damit auch zu vergleichbarer Bildqualität führen und es sollten
die Inzidenz und Pathogenese der nephrogenen systemischen Fibrose nach
Gadoliniumapplikation weiter untersucht werden.
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Abkürzungsverzeichnis
105
Abkürzungsverzeichnis ABTS [2,2´-Azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)diammonium salt] ACC Acetylcystein CT Computertomographie DMF Diethylformamid DNA Desoxyribonucleic acid, Desoxyribonucleinsäure DSA Digitale Subtraktionsangiographie EDTA Ethylendiamintetraessigsäure ELISA Enzyme-linked immuno sorbent assay FBS Fetal bovine serum, fetales Kälberserum Gd Gadolinium KG Körpergewicht KIN Kontrastmittel-induzierte Nephropathie KM Kontrastmittel MRT Magnetresonanztomographie MTT 3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-
tetrazoliumbromid PBS Phosphate buffer saline POD Peroxidase SDS Natriumdodecylsulfat S.E.M. Standardabweichung des Mittelwertes
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1. HeinrichMC, Kuhlmann MK, Kohlbacher S, Scheer M, Grgic A,
Heckmann M, Uder M (2006) Cytotoxicity of Iodinated and Gadolinium-based Contrast Agents in Renal Tubular Cells at Angiographic Concentrations: In Vitro Study Radiology 242: 425-434
2. Heinrich MC, Kohlbacher S, Kuhlmann MK, Scheer M, Grgic A,
Heckmann M, Uder M (2006) A comparison of the cytotoxic effects of an iodinated contrast-medium with gadolinium-based MRI contrast agents on renal tubular cells in vitro at doses used for angiography European Radiology 16: 372
3. Heinrich M, Kohlbacher S, Kuhlmann MK, Scheer M, Grgic A,
Heckmann M, Uder M (2006) Vergleich zytotoxischer Effekte von gadoliniumhaltigen MRT-Kontrastmitteln mit einem iodhaltigen Röntgenkontrastmittel an renalen Tubuluszellen in vitro Röfo 178: 338
Lebenslauf
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Danksagung Herrn Professor Dr. Michael Uder möchte ich herzlich für die Überlasssung
des interessanten Dissertationsthemas danken.
Bei meinem Betreuer Dr. Marc C. Heinrich möchte ich mich ganz besonders
für Anregungen, konstruktive Kritik und Hilfestellungen bei der Erstellung
dieser Arbeit sowie die vielen Stunden, die er sich für meine Betreuung Zeit
genommen hat, bedanken.
Ich bin ebenfalls zu tiefstem Dank verpflichtet gegenüber Frau Martina
Wagner, Dr. Christof Ulrich und dem gesamten Team des nephrologischen
Labors, die mir die Durchführung der Laborarbeiten erst ermöglicht haben und
mir jederzeit mit Rat und Tat zur Seite standen. Dr. Martin Kuhlmann möchte
ich dafür danken, dass er meine Arbeit im nephrologischen Labor ermöglicht
hat.
Besonderer Dank gilt meinem Ehemann David, der mich mit viel Verständnis
und Geduld durch Höhen und Tiefen von Studium und Dissertation begleitet
hat.
Schließlich danke ich meinen Eltern, die mich während des Studiums und der
Erstellung dieser Arbeit jederzeit unterstützt haben.
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