cold spring harbor symposia on quantititive biology vol 83, 1993 from the chromosomal loops and the...

Cold Spring Harbor Symposia on Quantititive BiologyVol 83, 1993

From the Chromosomal Loops and the Scaffold to the Classic Bands of Metaphase

ChromosomesY. Saitoh AND U.K. Laemmli

Apresentação: D. Safe AND J.L. Carvalho

Loops Cromossômicos

. Dificuldades de estudo

. Estrutura dos cromossomos nativos:

Loops Cromossômicos

Conceito sólido

Primeiras bruxarias. Microscopia eletrônica de cromossomos

metafásicos que tiveram suas histonas removidas através de tratamento com tampões

. Secções dos cromossomos

. Técnicas de espalhamento

. Imunofluorescência (anticorpos anti Topo II)

Loops Cromossômicos

Scaffold

Halo (loops)

Cromossomos desdobrados

• Scaffold = bases dos loops em cromossomos desdobrados (região heterocromática)

• Características do scaffold

Loops Cromossômicos

Topoisomerase II e SARs

• Proteína SC1 (localização, ligação às SARs e função)

• SARs = Scaffold-associated regions (função e características)

- A tracts- Alterações na estrutura do cromossomo

Bandas Cromossômicas

Bandas Q

• Modelo clássico: discos empilhados, densidade gênica, tempo de replicação, seqüências repetitivas, conformação da cromatina.

• Tipos: C, Q/G e R

Bandas Cromossômicas

• Hipóteses para o bandeamento

- Acessibilidade do corante

- Riqueza

- Superestrutura (?)

Bandas Cromossômicas

• Bandas Q/G

- Mais heterocromática

- “Rica” em AT

- 20% dos genes

Bandas Cromossômicas

• Bandas R

- Replica primeiro

- “Rica” em GC

- Digerida por tripsina

- Genes housekeeping

Bandas Cromossômicas

• Dois tipos de loops: Q/G e R

• Fila AT

• Estrutura do cromossomo compacto

Modelo Loop/Scaffold de cromossomos nativos

Modelo Loop/Scaffold de cromossomos nativos

Empacotamento dos loops cromossômicos: possibilidades e

ferramentas.

• Polaridades bioquímica e morfológica

Detecção da Base e Corpo dos Loops

• Soro específico• Fluorocromos AT-específicos

Daunomicina e a detecção das bases dos loops

• DNA muito rico em AT (>65%)

• Fluorometria:

- Excesso de poli (dA.dT), (dA).(dT) ou (dI).(dC): sinal residual de 45-55%

- Excesso de poli (dC.dG), (dC).(dG): sinal residual de 1-2%

- Excesso de SAR (74% AT): sinal residual de 10-15%

YOYO e a detecção do corpo dos loops

• Cora tanto a base quanto o corpo

• MG interage com fragmentos de DNA ricos em AT

Bandas Q e R são complementares e formadas por enovelamento

diferencial da fila AT

• Densidade de DNA e acessibilidade do corante.

• Complementaridade entre as bandas Q e R

• Aparência “puff-like” das bandas R

• Uso de corantes consecutivamente no mesmo cromossomo

Bandas Q e R são complementares e formadas por enovelamento

diferencial da fila AT

Bandas Q e R são complementares e formadas por enovelamento

diferencial da fila AT

Complementaridade de Sub-bandas

• Bandas Q com estrutura preservada não são coradas igualmente por daunomicina

Complementaridade de Sub-bandas

Complementaridade de Sub-bandas

Evidências Relacionam a Fila AT ao Scaffold

• Fila AT como sinal óptico gerado pelo complexo scaffold/SARs

• Daunomicina e SARs

• Topoisomerase II, HMG-I(Y) e a fila AT

Evidências Relacionam a Fila AT ao Scaffold

Topo II

Dauno

Sub-bandas Giemsa e o Scaffold

• Cromossomos alongados pré-matafásicos

• Relaçao 1x1 entre sub-bandas giemsa e AT-coils