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UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARANAacute
CARACTERIZACcedilAtildeO DE TcKAP7 UMA PROTEIacuteNA ASSOCIADA AO
CINETOPLASTO DO PROTOZOAacuteRIO Trypanosoma cruzi
CURITIBA
2015
FLAacuteVIA SOUZA MORINI
CARACTERIZACcedilAtildeO DE TcKAP7 UMA PROTEIacuteNA ASSOCIADA AO
CINETOPLASTO DO PROTOZOAacuteRIO Trypanosoma cruzi
Tese apresentada ao Curso de Poacutes Graduaccedilatildeo em Biologia Celular e Molecular Departamento de Biologia Celular Setor de Ciecircncias Bioloacutegicas Universidade Federal do Paranaacute como requisito parcial agrave obtenccedilatildeo do tiacutetulo de Doutora em Biologia Celular e Molecular Orientador Dr Stenio Perdigatildeo Fragoso
CURITIBA
2015
Agrave vocecirc minha pequena
Ah como era a vida antes de vocecirc chegar mesmo
Era muito mais sem graccedila com certeza
Vocecirc chegou e junto com vocecirc um turbilhatildeo de novidades e no meio
disso tudo uma tese para ser defendida Mas com a sua inocecircncia
entendeu minhas ausecircncias me fez tirar forccedilas da onde eu natildeo sabia para
tocar meu trabalho a diante e terminar a tese A Mama ama vocecirc mais que
tudo Anjinha Esse trabalho eacute dedicado agrave vocecirc minha princesa
Obrigada por fazer parte desta etapa da minha vida gatinha
Ao meu Mozatildeo Meu marido Meu melhor amigo Meu companheiro para o
que der e vier E agora papaizote da nossa Anjinha
Obrigada por me apoiar sempre Me dar forccedilas broncas conselhos de tudo
um pouco Obrigada por fazer a nossa bebezotinha entender a ausecircncia da
mama quando vaacuterias noites vocecirc tinha que fazer ela dormir para eu poder ir no
lab ou ficar escrevendo Sem vocecirc eu natildeo conseguiria vitinha Obrigada
por estar aqui Sempre Tannnnnntoooooo
Agrave vocecircs pentelhos
O que seria de mim sem vocecircs
Vocecircs satildeo minha fortaleza meu porto seguro sempre posso contar com vocecircs
pra tudo tudo mesmo Obrigada pelos conselhos pelas broncas por
nunca me deixar desistir mesmo nos momentos mais difiacuteceis vocecircs sempre
tinham uma palavra que me confortava me encorajava e me fazia seguir em
frente Sem a ajuda de vocecircs esse trabalho natildeo ficaria pronto nunca
Amo vocecircs
AGRADECIMENTOS
Agrave Deus em primeiro lugar por me dar sauacutede vitalidade e acircnimo sempre
E por sempre estar comigo
Ao Dr Stenio Perdigatildeo Fragoso pela orientaccedilatildeo confianccedila dedicaccedilatildeo e
amizade Afinal satildeo 12 anos hein chefe Como vocecirc ainda me aguenta Obrigada
por tudo aprendi e continuo aprendendo muito com vocecirc
Agrave Dra Tatiana Arruda Campos Brasil que me ajudou desde o primeiro
momento em que eu entrei no Laboratoacuterio de Proteiacutenas com seu jeito meigo e
atencioso e com sua experiecircncia me mostrou um mundo novo por qual eu me
apaixonei Sempre com muita paciecircncia me explicava tudo tim tim por tim tim e me
ajudou muuuito na escrita da tese Obrigada Tati
Agrave Dra Lia Medeiros que me ajudou muito com as microscopias Fizemos ateacute
o sacrifiacutecio de ir visualizar uma MET na UFSC em Floripa que chato neacute Brigadatildeo
Lia pela paciecircncia e boa vontade
Ao Dr Paulo Carvalho e a Dra Juliane Fischer que me ajudaram em
experimentos e anaacutelises que nem entraram na tese Sempre muito atenciosos
Obrigada
Aos meus queridos amigos do LAB2 Aqueles que jaacute se foram (Andreacute
Aleatoacuterio Lari Mauriacutecio Baacuterbara Odineacuteia Paacute ) e aqueles que estatildeo laacute ateacute hoje
(Didi Gi Vanessa Felipe Aline Claudinha) Obrigada por fazerem o trabalho ficar
mais divertido Aos meus companheiros de doc Mocircnica e Fernando o trio parada
dura passou por muita coisa junto e tem muita histoacuteria pra contar Obrigada gente
adoro vocecircs
Agraves minhas queridas amigas mais ldquoexperientesrdquo que moram no meu coraccedilatildeo
Aldinha e Dani obrigada por todos os momentos que passamos juntas no lab e fora
do lab obrigada pela a ajuda que sempre me deram sem esperar nada em troca
vocecircs sabem que seus conselhos sempre foram muito valiosos pra mim Obrigada
amigas vocecircs satildeo iacutempares
Agrave minha querida irmatildezinha Rocirc que nasceu no mesmo dia soacute que eacute mais
velha hahahahaha Obrigada amiga por tudo por todo esse tempo pelos
experimentos pelas confissotildees pelas gargalhadas Vocecirc eacute uacutenica
Agrave Pri Hira Mari Serpeloni Haruo Daisy Vanessa que sempre me ajudavam
quando eu precisava ou fazer um experimento ou jogar conversa fora
Aos meus amigos doutores atleticanos Michel e Henrique que me ajudaram
em vaacuterios experimentos e anaacutelises Obrigada por estarem sempre dispostos em
ajudar Vocecircs satildeo atleticanos mas satildeo gente boa Obrigada
Ao Giovany pela imensa ajuda com os camundongos sempre disposto em
ajudar e ensinar
Ao Nilson Silvio Tacircnia Sibelli por toda a ajuda pela amizade e pela
paciecircncia e competecircncia Ah e pelas histoacuterias de terror
Agrave Maria Cristina por toda a ajuda natildeo soacute na parte administrativa e pela
amizade
Ao Dr Marco Krieger pela confianccedila e por me proporcionar suporte
financeiro quando entrei no periacuteodo de prorrogaccedilatildeo
A todos os amigos e pesquisadores do Instituto Carlos Chagas dos demais
laboratoacuterios Lab REG Lab Genocircmica Laboratoacuterio de Biologia Celular por terem de
um jeito ou de outro participado do processo Eacute difiacutecil agradecer todo mundo
Valeu galera
ldquoTenho a impressatildeo de ter sido uma crianccedila brincando agrave
beira-mar divertindo-me em descobrir uma pedrinha
mais lisa ou uma concha mais bonita que as outras
enquanto o imenso oceano da verdade continua
misterioso diante de meus olhosrdquo
(Isaac Newton)
RESUMO
O DNA do cinetoplasto (kDNA) dos tripanosomatiacutedeos consiste numa rede de
moleacuteculas circulares catenadas entre si os miniciacuterculos e os maxiciacuterculos Os
miniciacuterculos codificam RNAs guias (gRNAs) e os maxiciacuterculos codificam para
algumas subunidades de enzimas mitocondriais e rRNA em um padratildeo
criptografado (ediccedilatildeo de RNA) Estudos com o tripanosomatiacutedeo Crithidia fasciculata
mostraram que proteiacutenas do tipo histona H1 associadas ao cinetoplasto (KAPs) satildeo
capazes de condensar a rede de kDNA Poreacutem pouco eacute conhecido sobre estas
proteiacutenas de Trypanosoma cruzi um protozoaacuterio parasita que sofre alteraccedilotildees na
estrutura do DNA do cinetoplasto ao longo de seu ciclo de vida Neste trabalho foi
caracterizada uma proteiacutena associada ao cinetoplasto de T cruzi denominada de
TcKAP7 que possui baixo peso molecular e natureza baacutesica condizente com um
papel na neutralizaccedilatildeo de carga e na condensaccedilatildeo do DNA Atraveacutes de ensaios
usando a teacutecnica de espalhamento de raios-X a baixo acircngulo (SAXS) foi possiacutevel
perceber que a proteiacutena TcKAP7 sofre mudanccedilas estruturais na presenccedila do kDNA
sugerindo uma interaccedilatildeo com essa estrutura seja atraveacutes de ligaccedilotildees eletrostaacuteticas
ou atraveacutes de ligaccedilotildees especiacuteficas com moleacuteculas presentes na rede A anaacutelise pela
teacutecnica de imunofluorescecircncia mostrou que proteiacutena TcKAP7 estaacute localizada na
regiatildeo dos poacutelos do cinetoplasto o que sugere que pode estar envolvida na
finalizaccedilatildeo da replicaccedilatildeo dos miniciacuterculos Mutante nulo para TcKAP7 foi gerado por
teacutecnicas de substituiccedilatildeo gecircnica a fim de verificar se na ausecircncia de TcKAP7
ocorriam alteraccedilotildees na estrutura do kDNA Contudo os parasitas mutantes para
TcKAP7 natildeo apresentavam alteraccedilotildees na estrutura e morfologia do cinetoplasto
quando analisados por microscopia eletrocircnica e foram capazes de se diferenciar
sem perder a capacidade infectiva Entretanto ensaios de RNA de interferecircncia
visando analisar a funccedilatildeo do gene TbKAP7 ortoacutelogo em T brucei levou agrave reduccedilatildeo
da proliferaccedilatildeo celular das formas prociacuteclicas desse parasita mostrando que este
gene eacute essencial para o metabolismo desse tripanosomatiacutedeo sugerindo que KAP7
possa ter papeis distintos em T cruzi e T brucei
Palavras-chaves Trypanosoma cruzi cinetoplasto nocaute KAPs
ABSTRACT
The kinetoplast DNA (kDNA) of trypanosomatids consists in a network of circular
molecules catenated each other the minicircles and maxicircles The minicircles
code RNAs guides (gRNAs) and the maxicircles code for some subunits of
mitochondrial enzymes and rRNA in a cryptic pattern (RNA editing) Studies in the
trypanosomatid protozoan Crithidia fasciculata showed that the kDNA is associated
with histone H1-like proteins known as kinetoplast-associated proteins (KAPs) wich
are capable of condensing the kDNA network However little is known about these
proteins of Trypanosoma cruzi a protozoan parasite which undergoes changes in
kinetoplast DNA structure over its life cycle Here we characterize a protein
associated with T cruzi kinetoplast named TcKAP7 TcKAP7 is a low molecular
weight protein with basic nature which is consistent with a role in DNA charge
neutralization and condensation Analysis by small angle X-Ray scattering technique
(SAXS) revealed that the TcKAP7 protein undergoes structural changes in the
presence kDNA suggesting an interaction with this DNA network either through
electrostatic bonds or through specific binding to molecules present on the network
The immunofluoresce analysis showed that TcKAP7 is located in the kinetoplast
poles suggesting that TcKAP7 might be involved in the late stages of the minicircle
replication A null mutant for TcKAP7 was obtained by gene replacement techniques
to study possible alterations in the kDNA structure However no modification in the
structure and morphology of the kinetoplast was observed by electron microscopy In
addition Tckap7 null mutant was able to differentiate without losing its infective
capacity Interference RNA assays was performed to analyze the function of
TbKAP7 the ortholog gene in T brucei The ablation of TbKAP7 expression leaded
to reduction in the procyclic proliferation suggesting that this gene is essential for the
metabolism of the parasite and might play distinct roles in T cruzi and T brucei
Key-words Trypanosoma cruzi kinetoplast gene knockout KAPs
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1 DISTRIBUICcedilAtildeO GEOGRAacuteFICA DA DOENCcedilA
DE CHAGAS19 FIGURA 2 CICLO DE TRANSMISSAtildeO DO
Trypanosoma cruzi20 FIGURA 3 ESQUEMA GERAL DAS PRINCIPAIS ESTRUTURAS
CELULARES DE T cruzi 22 FIGURA 4 REDE DE kDNA27 FIGURA 5 DIFERENTES ARRANJOS DO CINETOPLASTO
DE T cruzi29 FIGURA 6 MUDANCcedilAS NA POSICcedilAtildeO DO KDNA
NOS TRYPANOSOMAS29 FIGURA 7 REPOSICIONAMENTO DO KDNA EM RELACcedilAtildeO
AgraveS OUTRAS ORGANELAS DURANTEO CICLO DE VIDA DE UM FLAGELADO30
FIGURA 8 REPLICACcedilAtildeO DO kDNA32 FIGURA 9 REPRESENTACcedilAtildeO ESQUEMAacuteTICA DO
MICROFLUIDIFICADOR45 FIGURA 10 VETOR PARA EXPRESSAtildeO EM T CRUZI
P3XFLAG 50 FIGURA 11 ESQUEMA DA CONSTRUCcedilAtildeO DOS VETORES
UTILIZADOS PARA O NOCAUTE DO GENE TcKAP755
FIGURA 12 MAPA DO VETOR P2T7-177 UTILIZADO PARA ENSAIOS DE RNAi62
FIGURA 13 COMPARACcedilAtildeO ENTRE AS SEQUumlEcircNCIAS DE AMINOAacuteCIDOS DEDUZIDAS DO GENE KAP7 DE T cruzi Dm28C E DOS HAPLOacuteTIPOS DE CL BRENER65
FIGURA 14 COMPARACcedilAtildeO ENTRE AS SEQUumlEcircNCIAS DE AMINOAacuteCIDOS DEDUZIDAS DO GENE KAP7 EM DIFERENTES TRIPANOSOMATIacuteDEOS66
FIGURA 15 SINTENIA DE TcKAP7 COM OUTROS TRIPANOSOMATIacuteDEOS67
FIGURA 16 CARACTERIZACcedilAtildeO DA REGIAtildeO 5rsquo-UTR DO TRANSCRITO TcKAP769
FIGURA17 ANAacuteLISE DA EXPRESSAtildeO DA PROTEIacuteNA DE FUSAtildeO TCKAP7-FLAG EM FORMAS EPIMASTIGOTAS DE T CRUZI70
FIGURA 18 IMUNOLOCALIZACcedilAtildeO DE TcKAP7 EM EPIMASTIGOTAS DE T CRUZI71
FIGURA 19 ENSAIOS DE PCR UTILIZANDO DNA DE T cruzi kap7kap7 (WT) E T cruzi kap7neokap7higro (NO) COM DIFERENTES PRIMERS73
FIGURA 20 REPRESENTACcedilAtildeO ESQUEMAacuteTICA DOS SIacuteTIOS DA ENZIMA HindIII NO LOCUS DO GENE KAP7 DE T cruzi CL Brener75
FIGURA 21 ANAacuteLISE DA ORGANIZACcedilAtildeO DOS GENES TCKAP7 NEO E HIGRO POR ENSAIO DO TIPO SOUTHERN BLOT75
FIGURA 22 COMPARACcedilAtildeO DA EXPRESSAtildeO DO GENE TcKAP7 POR WESTERN BLOT76
FIGURA 23 COLORACcedilAtildeO PELO MEacuteTODO PANOacuteTICO RAacutePIDO DOS PARASITAS EPIMASTIGOTAS NOCAUTEADOS77
FIGURA 24 COMPARACcedilAtildeO ENTRE A ULTRAESTRUTURA DO CINETOPLASTO DO T cruzi DM28C TIPO SELVAGEM (A) E DO MUTANTE DE T cruzi PARA TcKAP7 (B) POR MICROSCOPIA ELETROcircNICA DE TRANSMISSAtildeO78
FIGURA 25 CURVA DE CRESCIMENTO DO MUTANTE DE T cruzi PARA TcKAP7 (KO) E DO T cruzi Dm28c SELVAGEM (WT) 79
FIGURA 26 METACICLOGEcircNESE IN VITRO DE T cruzi Dm28c TIPO SELVAGEM E T cruzi NOCAUTEADO80
FIGURA 27 RNAi DE TbKAP7 INIBE O CRESCIMENTO DAS FORMAS PROCIacuteCLICAS DE T brucei82
FIGURA 28 PURIFICACcedilAtildeO DE TCKAP7 ATRAVEacuteS DE CROMATOGRAFIA DE AFINIDADE83
FIGURA 29 PURIFICACcedilAtildeO DE TCKAP7 ATRAVEacuteS DE CROMATOGRAFIA DE TROCA IOcircNICA84
FIGURA 30 ANAacuteLISE POR DLS DE TCKAP785 FIGURA 31 ENVELOPE MOLECULAR DE SAXS86 FIGURA 32 ESPECTRO DE DICROIacuteSMO CIRCULAR DE
TcKAP787 FIGURA 33 PREDICcedilAtildeO DE ESTRUTURA SECUNDAacuteRIA DE
TcKAP787 FIGURA 34 CRISTAL DE TcKAP7 DE T CRUZI88 FIGURA 35 ESTRUTURA DE TcKAP790 FIGURA 36 SUPERFIacuteCIE ELETROSTAacuteTICA DE
TcKAP791 FIGURA 37 ALINHAMENTO ESTRUTURAL DE 3TQ6 4NOD
3TTM 4NNU E TCKAP793 FIGURA 38 ESPECTRO DE DICROIacuteSMO CIRCULAR
DE TcKAP794 FIGURA 39 ENVELOPE MOLECULAR DETcKAP795 FIGURA 40 ENVELOPE MOLECULAR DETcKAP7 VISTO EM
DIFERENTES AcircNGULOS96
LISTA DE TABELAS
TABELA 1 RELACcedilAtildeO DOS PRIMERS UTILIZADOS PARA A CLONAGEM DA REGIAtildeO UPSTREAM DE TcKAP7 NO VETOR pNEO153
TABELA 2 RELACcedilAtildeO DOS PRIMERS UTILIZADOS PARA A CLONAGEM DA REGIAtildeO DOWNSTREAM DE TcKAP7 NO VETOR pNEO153
TABELA 3 RELACcedilAtildeO DOS PRIMERS UTILIZADOS PARA A AMPLIFICACcedilAtildeO DO GENE TbKAP763
TABELA 4ndash PERCENTUAL DE IDENTIDADE ENTRE AS PROTEIacuteNAS KAP7 NOS TRIPANOSSOMATIacuteDEOS COM O GENOMA SEQUENCIADO67
TABELA 5 COMBINACcedilOtildeES DE PRIMERS UTILIZADOS NA PCR PARA CONFIRMAR O NOCAUTE DE TcKAP772
SUMAacuteRIO
1 INTRODUCcedilAtildeO18 11 O Trypanosoma cruzi18 12 Ciclo de vida do T cruzi20 13 Aspectos celulares de T cruzi21 14 O genoma de T cruzi24 15 Expressatildeo gecircnica de Tcruzi25 16 O cinetoplasto26 17 A rede de kDNA26 171 Replicaccedilatildeo do kDNA31 18 Proteiacutenas associadas ao cinetoplasto (KAPs)32 2 OBJETIVOS35 21 OBJETIVO GERAL35 211 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS35 3 MATERIAIS E MEacuteTODOS36 31 Reagentes e Soluccedilotildees Utilizados36 311 Reagentes36 312 Tampotildees e Soluccedilotildees36 313 Meios de cultura38 32 Cultivo do Trypanosoma cruzi38 321 Epimastigotas38 322 Tripomastigotas metaciacuteclicos39 33 Curva de crescimento de T cruzi39 34 Obtenccedilatildeo de DNA de T cruzi40 35 Obtenccedilatildeo de kDNA de T cruzi40 36 Obtenccedilatildeo de extrato proteico de T cruzi40 37 Clonagem do gene TcKAP741 38 Obtenccedilatildeo do cDNA de TcKAP7 atraveacutes de ensaio de RT-PCR41 39 Seleccedilatildeo dos clones recombinantes42 391 Teacutecnica de palitagem (toothpick)42 392 Teacutecnica de PCR de colocircnia43 310 Preparaccedilatildeo de plasmiacutedeo em pequena escala (miniprep)43 311 Expressatildeo da proteiacutena TcKAP7 em E coli43 312 Purificaccedilatildeo da proteiacutena recombinante TcKAP744 3121 Processamento da amostra44 3122 Cromatografia de afinidade45 3123 Cromatografia de troca iocircnica46 3124 Cromatografia de gel filtraccedilatildeo46 313 Espalhamento Dinacircmico de Luz ndash DLS46 314 Espectroscopia de dicroiacutesmo circular (CD)46 315 Quantificaccedilatildeo e concentraccedilatildeo47 316 Ensaios de Cristalizaccedilatildeo47 317 Espalhamento de raio-X a baixo acircngulo (SAXS)48 318 Modelagem de TcKAP748 319 Obtenccedilatildeo de antissoro policlonal contra TcKAP749 320 Anaacutelise da expressatildeo do gene TcKAP7 e de seu mutante por ensaio tipo western blot49 321 Superexpressatildeo de TcKAP750
3211 Amplificaccedilatildeo e clonagem do gene TcKAP7 no vetor pNEO3xFlag para superexpressatildeo da proteiacutena50 3212 Transfecccedilatildeo por eletroporaccedilatildeo52 3213 Seleccedilatildeo dos transfectantes52 322 Deleccedilatildeo do gene TcKAP7 por nocaute gecircnico53 3221 Amplificaccedilatildeo e clonagem das regiotildees a montante e a jusante do gene TcKAP753 3222 Amplificaccedilatildeo dos cassetes UPS-NEO-DOWN e UPS-HIGRO-DOWN para transfecccedilatildeo de T cruzi55 3223 Transfecccedilatildeo do T cruzi com o cassete UPS-NEO-DOWN56 3224 Extraccedilatildeo de DNA dos transfectantes57 3225 Anaacutelise por PCR do DNA dos parasitas transfectados com o cassete UPS-NEO-DOWN57 3226 Transfecccedilatildeo do T cruzi com o cassete UPS-HIGRO-DOWN57 3227 Anaacutelise por PCR do DNA dos parasitas transfectados com o cassete UPS-HIGRO-DOWN58 3228 Anaacutelise da organizaccedilatildeo do gene TcKAP7 e da eficiecircncia de seu nocaute atraveacutes de ensaio do tipo Southern blot58 323 Localizaccedilatildeo celular da proteiacutena TcKAP7 atraveacutes de ensaio de imunofluorescecircncia59 324 Anaacutelise da ultraestrutura do cinetoplasto do mutante de T cruzi para TcKAP7 por microscopia eletrocircnica de transmissatildeo60 325 Coloraccedilatildeo dos parasitas transfectados60 326 Infecccedilatildeo de ceacutelulas Vero com o mutante de T cruzi para TcKAP761 327 Anaacutelise da funccedilatildeo do gene TbKAP7 de Trypanosoma brucei atraveacutes de ensaios de RNA de interferecircncia61 3271 Induccedilatildeo do RNA dupla fita64 4 RESULTADOS65 41 Clonagem e caracterizaccedilatildeo do gene TcKAP765 42 Expressatildeo da proteiacutena TcKAP7 em T cruzi69 43 Localizaccedilatildeo celular de TcKAP7 atraveacutes de ensaio de imunofluorescecircncia70 44 Deleccedilatildeo do gene TcKAP7 por nocaute gecircnico71 441 Anaacutelise por PCR do DNA dos parasitas transfectados com os cassetes UPS-NEO-DOWN e UPS-HIGRO-DOWN72 442 Anaacutelise da organizaccedilatildeo dos genes TcKAP7 neo e higro por ensaio do tipo Southern blot74 45 Comparaccedilatildeo da expressatildeo do gene TcKAP7 por western blot76 46 Anaacutelise da morfologia e da ultraestrutura do cinetoplasto do mutante de T cruzi para TcKAP776 47 Multiplicaccedilatildeo diferenciaccedilatildeo e infectividade do mutante de T cruzi para TcKAP779 48 Anaacutelise da funccedilatildeo do gene KAP7 de Trypanosoma brucei atraveacutes de ensaios de RNA de interferecircncia80 49 Caracterizaccedilatildeo estrutural de TcKAP782 491 Produccedilatildeo recombinante de TcKAP782 410 Anaacutelise do estado oligomeacuterico de TcKAP784 411 Anaacutelise do conteuacutedo de estrutura secundaacuteria de TcKAP7 recombinante86 412 Anaacutelise estrutural de TcKAP787
413 Investigaccedilatildeo de possiacuteveis funcionalidades baseadas na estrutura de TcKAP791 4131 Prediccedilatildeo de funccedilatildeo paraTcKAP791 4132 Anaacutelises preliminares da possiacutevel interaccedilatildeo entre TcKAP7 e kDNA93 5 DISCUSSAtildeO97 6 CONCLUSOtildeES102 7 REFEREcircNCIAS103
18
1 INTRODUCcedilAtildeO
11 O Trypanosoma cruzi
Trypanosoma cruzi eacute um protozoaacuterio flagelado unicelular pertencente ao
reino Protista subreino Protozoa filo Sarcomastigophora subfilo Mastigophora
classe Zoomastigophora ordem Kinetoplastida e famiacutelia Trypanosomatidae (LEVINE
et al 1980) A principal caracteriacutestica dessa ordem eacute a presenccedila de uma estrutura
singular o cinetoplasto que abriga em uma massa de DNA extranuclear
concentrado na mitococircndria uacutenica deste protista (SHAPIRO amp ENGLUND 1995) A
famiacutelia Trypanosomatidae inclui os seguintes gecircneros importantes Blastocrithidia
Crithidia Endotrypanum Herpetomonas Leishmania Leptomonas Phytomonas e
Trypanosoma O gecircnero Trypanosoma eacute um dos mais importantes dentro da famiacutelia
Trypanosomatidae por incluir uma seacuterie de espeacutecies causadoras de doenccedilas
humanas importantes como o Trypanosoma cruzi agente da doenccedila de Chagas
Trypanosoma rhodesiense e Trypanosoma gambiense agentes da doenccedila do sono
e de animais o Trypanosoma brucei Trypanosoma equiperdum e Trypanosoma
equinum (DE SOUZA 2015)
Este protozoaacuterio eacute um microrganismo heteroxecircnico com ciclo bioloacutegico
alternado entre hospedeiros vertebrados (mamiacuteferos) e invertebrados (triatomiacuteneos)
Existem diferentes formas de transmissatildeo da doenccedila dentre as quais se destaca a
via vetorial que consiste na transmissatildeo do parasita atraveacutes de excretas do inseto
vetor hematoacutefago pertencente agrave ordem Hemiacuteptera famiacutelia Reduvidae subfamiacutelia
Triatominae (DIAS et al 1956) A principal caracteriacutestica bioloacutegica dos triatomiacuteneos
eacute que satildeo obrigatoriamente hematoacutefagos e necessitam do repasto sanguiacuteneo para
completar o desenvolvimento (DIAS 2000) O parasita pode ainda ser transmitido
aos mamiacuteferos por transfusatildeo sanguiacutenea ou via oral e com menos frequecircncia por
via congecircnita acidentes de laboratoacuterio e transplantes de oacutergatildeos (BELTRAO HDE et
al 2009 STEINDEL et al 2008 TANOWITZ et al 1992) Praticamente todo tipo
de ceacutelula nucleada do hospedeiro mamiacutefero pode ser parasitada considerando o
tropismo das diferentes cepas (LENZI et al 1996) Outra caracteriacutestica deste
parasita eacute apresentar diferentes morfologias durante o ciclo bioloacutegico A classificaccedilatildeo
19
de suas formas baseia-se tambeacutem na posiccedilatildeo do cinetoplasto em relaccedilatildeo ao nuacutecleo
e do local de onde emerge o flagelo (HOARE 1971)
Foi no ano de 1909 no estado de Minas Gerais que Carlos Chagas meacutedico
sanitarista identificou pela primeira vez o protozoaacuterio parasita Trypanosoma cruzi
agente causador da Doenccedila de Chagas A doenccedila de Chagas eacute endecircmica na
Ameacuterica Latina sendo conhecida a existecircncia de vetores da doenccedila desde o sul dos
Estados Unidos agrave Argentina (FIGURA 1)
FIGURA 1 DISTRIBUICcedilAtildeO GEOGRAacuteFICA DA DOENCcedilA DE CHAGAS FONTE Modificado de httpwwwwhointen
Em 2008 o nuacutemero de indiviacuteduos infectados era estimado entre 16 e 18
milhotildees sendo que aproximadamente 90 milhotildees de pessoas estariam sob risco
de contaminaccedilatildeo na Ameacuterica Latina (WHO 2010)
Apesar de existirem drogas (Nifurtimox e Benzonidazol) para o tratamento
da doenccedila sua ineficaacutecia no estaacutegio crocircnico e sua accedilatildeo toacutexica acabam prejudicando
o paciente sem conseguir eliminar o parasita (BRENER et al 2000) Sem vacinas
ou tratamento quimioteraacutepico eficiente a principal estrateacutegia de controle limita-se agrave
prevenccedilatildeo da transmissatildeo por transfusatildeo sanguiacutenea e ao controle populacional dos
vetores triatomiacuteneos Aleacutem da sua importacircncia como patoacutegeno humano este micro-
organismo apresenta caracteriacutesticas peculiares que o tornam um excelente modelo
para o estudo de questotildees bioloacutegicas baacutesicas
Regiotildees endecircmicas
20
12 Ciclo de vida do T cruzi
O T cruzi apresenta um ciclo complexo na natureza sofrendo mudanccedilas
estruturais bioquiacutemicas e morfoloacutegicas de acordo com o ambiente em que se
encontra Formas replicativas epimastigotas e amastigotas dos hospedeiros
invertebrado e mamiacutefero respectivamente alternam-se com as formas infectivas e
natildeo proliferativas tripomastigotas metaciacuteclicas (proveniente do inseto vetor) e
tripomastigota sanguiacutenea (originaacuteria do mamiacutefero infectado) (FIGURA 2) (DE
SOUZA 1984)
FIGURA 2 CICLO DE TRANSMISSAtildeO DO Trypanosoma cruzi FONTE Infograacutefico Veniacutecio Ribeiro ICICTFIOCRUZ
Durante o repasto sanguiacuteneo do inseto vetor formas tripomastigotas
metaciacuteclicas atingem a corrente sanguiacutenea do hospedeiro pela lesatildeo da picada Esta
forma infectiva eacute capaz de invadir todos os tipos de ceacutelulas com exceccedilatildeo das
21
hemaacutecias Apoacutes a entrada do parasita na ceacutelula os tripomastigotas diferenciam-se
em uma forma replicativa denominada amastigota que apoacutes diversas divisotildees sofre
uma diferenciaccedilatildeo para um estaacutegio intermediaacuterio o epimastigota intracelular e
posteriormente para tripomastigota Quando ocorre a lise celular os tripomastigotas
satildeo liberados ao meio extracelular podendo entatildeo invadir ceacutelulas vizinhas atingir
novos tecidos atraveacutes da corrente sanguiacutenea ou ainda infectar um inseto vetor
durante o processo de hematofagia recomeccedilando o ciclo no hospedeiro
invertebrado No inseto as formas tripomastigotas diferenciam-se em epimastigotas
no tubo digestivo e migram para o intestino onde ocorrem as divisotildees binaacuterias Ao
atingirem a porccedilatildeo terminal do tubo digestivo ocorre a diferenciaccedilatildeo em
tripomastigotas metaciacuteclicos que satildeo eliminados juntamente com as fezes e urina do
triatomiacutedeo
A transformaccedilatildeo da forma epimastigota do T cruzi em tripomastigota
metaciacuteclica denominada metaciclogecircnese eacute de grande interesse de estudo pois
neste processo ocorrem diversas alteraccedilotildees morfoloacutegicas metaboacutelicas e de
expressatildeo gecircnica (GOLDENBERG et al 1985) A metaciclogecircnese que ocorre
naturalmente no intestino do inseto vetor pode ser mimetizada in vitro utilizando-se
meio quimicamente definido que simula as condiccedilotildees da urina do inseto vetor
(CONTRERAS et al 1985)
13 Aspectos celulares de T cruzi
O Trypanosoma cruzi apresenta aleacutem das organelas tiacutepicas da maioria das
ceacutelulas eucarioacuteticas como nuacutecleo retiacuteculo endoplasmaacutetico aparato de Golgi e
mitococircndria algumas estruturas peculiares (FIGURA 3) como os microtuacutebulos
subpeliculares a estrutura paraflagelar os reservossomos o cinetoplasto os
glicossomos e os acidocalcisomos exclusivos dos tripanosomatiacutedeos (revisto por
DE SOUZA 1984 1999 2002)
22
FIGURA 3 ESQUEMA GERAL DAS PRINCIPAIS ESTRUTURAS CELULARES DE T cruzi FONTE DOCAMPO et al 1975
A superfiacutecie celular dos tripanossomatiacutedeos eacute composta principalmente
pela membrana plasmaacutetica e pelos microtuacutebulos subpeliculares Pequenos
filamentos conectam fortemente os microtuacutebulos subpeliculares os quais se
apresentam espaccedilados de forma regular entre si e com a membrana plasmaacutetica (DE
23
SOUZA SANTANNA CUNHA-E-SILVA 2009) conferindo rigidez agrave ceacutelula e
resistecircncia ao rompimento mecacircnico
Todos os membros da famiacutelia Trypanosomatidae apresentam um flagelo
que emerge de uma aacuterea de invaginaccedilatildeo da membrana plasmaacutetica conhecida como
bolsa flagelar Devido agrave localizaccedilatildeo especiacutefica de vaacuterios receptores nesta aacuterea
acredita-se que a maior parte do traacutefego vesicular e entrada de nutrientes ocorram
nesta regiatildeo Outra invaginaccedilatildeo menor localizada proacutexima agrave bolsa flagelar o
citoacutestomo tambeacutem estaacute envolvida com a absorccedilatildeo de nutrientes (PORTO-
CARREIRO et al 2000)
O flagelo do T cruzi apresenta uma estrutura baacutesica semelhante a outros
flagelos sendo envolvido por uma membrana flagelar e contendo um axonema
tiacutepico que apresenta um padratildeo de nove pares de microtuacutebulos perifeacutericos e um par
central Associado ao flagelo deste parasita eacute encontrado um complexo arranjo de
filamentos proteacuteicos denominado de estrutura paraflagelar (revisto por GULL 1999)
Na parte posterior da ceacutelula existem organelas usualmente esfeacutericas
denominadas reservossomos Os reservossomos satildeo organelas aacutecidas que
possuem em seu interior proteinases principalmente a cruzipaiacutena (uma
cisteiacutenoproteinase) e proteiacutenas ingeridas que chegam dentro de vesiacuteculas
endociacuteticas oriundas da bolsa flagelar e do citoacutestomo Com base nisso foi proposto
que os reservossomos seriam compartimentos preacute-lisossomais (SOARES et al
1992) Tambeacutem tem sido proposta a participaccedilatildeo dos reservossomos no processo
de metaciclogecircnese como principal fonte de energia para esta atividade (SOARES
1999)
O T cruzi assim como todos os membros da famiacutelia Tripanosomatidae
apresenta uma mitococircndria uacutenica e ramificada que se estende por todo o corpo do
protozoaacuterio Como em todas as ceacutelulas eucarioacuteticas a mitococircndria dos
tripanosomatiacutedeos tambeacutem apresenta DNA mitocondrial tambeacutem conhecido como
kDNA ou DNA do cinetoplasto que se concentra em uma determinada regiatildeo da
mitococircndria localizada logo abaixo do corpuacutesculo basal dando origem a uma
estrutura intramitocondrial chamada de cinetoplasto O cinetoplasto abriga o kDNA
o qual eacute constituiacutedo por moleacuteculas circulares que se encontram interligadas
formando uma extensa rede entre si (SHLOMAI 1994)
Distribuiacutedos pelo citoplasma estatildeo os glicossomos um tipo especializado de
peroxissomo Estes acumulam enzimas da via glicoliacutetica envolvidas na conversatildeo
24
da glicose a 3-fosfoglicerato que em outros organismos localizam-se no citoplasma
(HANNAERT et al 2003)
Outra particularidade dos tripanossomatiacutedeos estaacute na estocagem intracelular
de caacutelcio Este iacuteon importante nos processos de sinalizaccedilatildeo celular eacute estocado em
organelas denominadas acidocalcissomos Os acidocalcissomos provavelmente
estatildeo envolvidos em diversos processos bioloacutegicos tais como o armazenamento de
caacutelcio e polifosfatos adaptaccedilatildeo dos tripanosomatiacutedeos a condiccedilotildees de estresse
ambiental manutenccedilatildeo do pH intracelular e osmorregulaccedilatildeo (revisto por DOCAMPO
et al 2005)
14 O genoma de T cruzi
No ano de 2005 foi concluiacuteda a montagem do genoma do T cruzi (EL-
SAYED et al 2005) A cepa CL Brener foi a escolhida para o sequenciamento por
ser bem caracterizada bioquiacutemica e parasitologicamente (ZINGALES et al 1997) e
por ser considerada representativa para o universo de cepas circulantes de T cruzi
Com base na montagem do sequenciamento o genoma diploacuteide do parasita foi
calculado como sendo de 1064 1107 Mb com cada haploacutetipo contendo cerca de
12000 genes sendo que mais de 50 do genoma constituiu-se de sequecircncias
repetitivas compostas por famiacutelias de proteiacutenas de superfiacutecie retrotransposons e
elementos subtelomeacutericos (EL-SAYED et al 2005)
A comparaccedilatildeo das estruturas genocircmicas e proteiacutenas preditas obtidas a
partir do sequenciamento de Trypanosoma cruzi com as de Leishmania major e
Trypanosoma brucei indica mais similaridade entre T cruzi e T brucei uma grande
conservaccedilatildeo entre os respectivos proteomas (exceto para antiacutegenos de superfiacutecie) e
uma sintenia bastante conservada entre os trecircs tripanosomatiacutedeos apesar da
divergecircncia haacute 200-500 milhotildees de anos atraacutes (BERRIMAN et al 2005 EL SAYED
et al 2005 IVENS et al 2005)
Os tripanosomatiacutedeos possuem aleacutem do genoma nuclear um grande
genoma mitocondrial (kDNA) que tem sido extensivamente estudado sendo uacutenico
em estrutura funccedilatildeo e mecanismo de replicaccedilatildeo O kDNA eacute formado por milhares de
moleacuteculas circulares topologicamente relaxadas e interligadas umas as outras Este
arranjo conteacutem aproximadamente 20 - 30 do DNA total dos tripanosomatiacutedeos e eacute
composto por 2 tipos de moleacuteculas circulares os maxiciacuterculos e os miniciacuterculos Os
25
maxiciacuterculos apresentam um tamanho entre 22-37 kb e conteacutem basicamente os
genes codificadores de proteiacutenas envolvidas na fosforilaccedilatildeo oxidativa e RNA
ribossocircmico Os miniciacuterculos com um tamanho que varia de espeacutecie para espeacutecie
(05 a 25 kb) conteacutem os genes que codificam os RNAs guia envolvidos na
editoraccedilatildeo do RNA (STUART et al 1989 SHAPIRO amp ENGLUND 1995 MADISON-
ANTENUCCI et al 2002 SIMPSON et al 2003 ONN et al 2006 GLUENZ et al
2007)
15 Expressatildeo gecircnica de Tcruzi
T cruzi estaacute sujeito agraves frequentes mudanccedilas de ambientes decorrentes da
passagem por diferentes hospedeiros durante seu ciclo de vida (temperatura pH
quantidade de nutrientes evasatildeo do sistema imune) por esse motivo a expressatildeo
gecircnica deste parasita eacute regulada por diversos fatores A adaptaccedilatildeo raacutepida e eficiente
a estas diferentes condiccedilotildees torna-se uma importante tarefa para o parasita
Como os demais eucariotos o T cruzi apresenta trecircs RNAs polimerases a
RNA polimerase I transcreve os genes para RNAs ribossocircmicos a RNA polimerase
II os genes que codificam proteiacutenas e a RNA polimerase III pequenos RNAs como
o tRNA (RNA de transferecircncia) Nos tripanosomatiacutedeos promotores para as RNA
polimerase I e III jaacute foram identificados poreacutem ainda natildeo foram identificados
promotores para os genes transcritos pela RNA polimerase II com exceccedilatildeo de um
promotor associado ao gene do mini-exon (GILLINGER amp BELLOFATTO 2001
revisto por CAMPBELL et al 2003)
Os genes dos tripanosomatiacutedeos estatildeo organizados em unidades
policistrocircnicas e natildeo apresentam interrupccedilotildees por iacutentrons com exceccedilatildeo do gene da
poli-A polimerase (MAIR et al 2000)
Uma vez que em T cruzi como nos demais eucariotos somente mRNAs
monocistrocircnicos satildeo traduzidos os precursores de mRNA policistrocircnicos devem ser
processados ateacute mRNAs individuais Como caracteriacutestica desta famiacutelia os
transcritos de mRNA satildeo processados por mecanismos de trans-splicing (AGABIAN
1990) e poliadenilaccedilatildeo (LEBOWITZ et al 1993 MATTHEWS et al 1994
VANHAMME amp PAYS 1995)
No processo de trans-splicing as unidades codificadoras satildeo separadas e eacute
adicionada na extremidade 5rsquo uma sequecircncia extremamente conservada espeacutecie-
26
especiacutefica de 39 nucleotiacutedeos denominada sequumlecircncia liacuteder (SL) ou minieacutexon
(McCARTHY-BURKE et al 1989 NILSEN 1992 VANHAMME amp PAYS 1995)
Nesta reaccedilatildeo participam duas moleacuteculas de RNA uma doadora e outra aceptora A
doadora eacute um precursor do mini-exon e em T cruzi possui cerca de 110
nucleotiacutedeos (ZWIERZYNSKI amp BUCK 1991) A aceptora eacute o transcrito derivado da
unidade policistrocircnica ao qual o mini-exon eacute transferido O complexo enzimaacutetico
envolvido nesta reaccedilatildeo eacute semelhante ao descrito para a de cis-splicing (LAIRD
1989)
Os transcritos processados satildeo estabilizados pela estrutura cap 4 do mini-
exon (ULLU amp TSCHUDI 1991) e pela adiccedilatildeo de uma cauda poli-A agrave extremidade
3rsquo sendo que a adiccedilatildeo de ambos os elementos ocorrem em conjunto (LEBOWITZ et
al 1993) Regiotildees ricas em resiacuteduos de pirimidinas aleacutem da sequumlecircncia consenso
(AG) para o trans-splicing regulam a adiccedilatildeo do mini-exon e da cauda poli-A
Deleccedilotildees nestas regiotildees impedem o correto processamento destes transcritos
(MATTHEWS et al 1994)
A ocorrecircncia de transcriccedilatildeo policistrocircnica associada agrave ausecircncia de
promotores para RNA polimerase II e agrave presenccedila de niacuteveis distintos de mRNA
originados de uma mesma unidade policistrocircnica sugerem que a regulaccedilatildeo da
expressatildeo gecircnica nesses protozoaacuterios ocorra a niacutevel poacutes-transcricional baseada
principalmente em mecanismos que controlam a estabilidade e a traduccedilatildeo dos
mRNAs (CLAYTON 2002 BOUCHER et al 2002)
16 O cinetoplasto
O cinetoplasto eacute uma estrutura peculiar presente nos tripanosomatiacutedeos e
encontra-se inserida no interior da mitococircndria uacutenica abrigando fibrilas de DNA
conhecidas como kDNA O nome cinetoplasto (cineto=movimento e plasto=organela)
foi dado pois se acreditava que o mesmo fosse responsaacutevel pelo movimento do
flagelo
17 A rede de kDNA
O DNA do cinetoplasto eacute formado por dois tipos de moleacuteculas circulares os
miniciacuterculos de tamanho entre 05 e 25 kb e os maxiciacuterculos que apresentam
entre 20 e 40 kb Cerca de 10000 miniciacuterculos e 50 maxiciacuterculos se encontram
27
catenados formando uma extensa rede (SHAPIRO amp ENGLUND 1995 DE SOUZA amp
CAVALCANTI 2008) (FIGURA 4)
FIGURA 4 REDE DE kDNA
FONTE ROY CHOWDHURY et al 2010
As primeiras questotildees relacionadas ao arranjo das moleacuteculas na rede do
kDNA dos tripanosomatiacutedeos surgiram na deacutecada de 80 sugerindo que tal
organizaccedilatildeo poderia ter evoluiacutedo como um maneira mais eficaz de armazenar uma
grande quantidade de material em um pequeno espaccedilo (HAJDUK et al 1986)
Os maxiciacuterculos apresentam um tamanho de 22 a 37 kb e assim como o
DNA mitocondrial de outros eucariotos codificam RNAs ribossomais e diversas
proteiacutenas da cadeia respiratoacuteria incluindo subunidades da citocromo oxidase e
NADH desidrogenase (revisto por SHAPIRO amp ENGLUND 1995) Os transcritos dos
maxiciacuterculos satildeo processados poacutes-transcricionalmente para formar mRNAs
funcionais atraveacutes de um processo conhecido como ediccedilatildeo ou editoraccedilatildeo do RNA
A editoraccedilatildeo do RNA consiste na inserccedilatildeo ou retirada de resiacuteduos de uridina em
28
siacutetios especiacuteficos dos RNAs transcritos pelos maxiciacuterculos a fim de criar coacutedons de
iniciaccedilatildeo ou terminaccedilatildeo mudanccedilas na fase de leitura ou quadros abertos de leitura a
partir de sequumlecircncias sem sentido O processo de ediccedilatildeo eacute especificado por
pequenos RNAs guias produzidos pelos miniciacuterculos e maxiciacuterculos e catalisado
por um complexo muiltiproteacuteico o editosomo (revisto por Esteacutevez amp Simpson 1999
Stuart et al 2005) Esse processo constitui uma forma de regular poacutes-
transcricionalmente a expressatildeo de genes mitocondriais nas diferentes formas
evolutivas do parasita
Os miniciacuterculos caracterizam-se por apresentar um tamanho de 05 a 25 kb
e por transcrever os RNAs guia (gRNA) responsaacuteveis pela especificidade da ediccedilatildeo
dos mRNAs codificados pelos maxiciacuterculos por meio de uma sequumlecircncia presente na
porccedilatildeo central desses gRNAs (BENNE 1994 STUART et al 2005) A significacircncia
da variaccedilatildeo em tamanho e organizaccedilatildeo entre as espeacutecies ainda natildeo eacute aparente
contudo a diversidade das sequecircncias dos miniciacuterculos estaacute correlacionada com a
necessidade de mais ou menos ediccedilatildeo de mRNA de cada organismo (STUART
1991) Apesar desta diversidade os miniciacuterculos apresentam pelo menos duas
regiotildees conservadas o dodecacircmero GGGGTTGGTGTA conhecido como sequecircncia
universal dos miniciacuterculos (UMS) e o hexacircmero ACGCCC que correspondem agrave
origem de replicaccedilatildeo da fita L (light) e da fita H (heavy) respectivamente
(BIRKENMEYER amp RAY 1986 BIRKENMEYER et al 1987 RAY 1989 SHLOMAI
1994 HINES amp RAY 2008)
Embora o cinetoplasto de todos os tripanosomatiacutedeos seja formado por
moleacuteculas circulares relaxadas e catenadas diferentes arranjos da rede de kDNA
podem ser observados entre diferentes estaacutegios do ciclo de vida desses
protozoaacuterios como em T cruzi (FIGURA 5) assim como mudanccedilas na posiccedilatildeo do
kDNA satildeo utilizadas para identificar as diferentes formas evolutivas do parasita
(FIGURA 6)
29
FIGURA 5 ndash DIFERENTES ARRANJOS DO CINETOPLASTO DE T cruzi
LEGENDA As fibrilas de kDNA se apresentam bastante compactadas em forma de bastatildeo nas formas amastigotas (A) e epimastigotas (B) enquanto nas formas tripomastigotas a rede de kDNA torna-se menos compacta e a forma em bastatildeo do cinetoplasto daacute lugar a uma forma arredondada (C) FONTE DE SOUZA amp SOUTO-PADRON 1980 e DE SOUZA 1984
Nas formas amastigota (FIGURA 5A) e epimastigota (FIGURA 5B) de T
cruzi as fibrilas de kDNA se apresentam bastante compactadas em forma de
bastatildeo Em tripomastigotas (FIGURA 5C) de T cruzi a rede de kDNA torna-se
menos compacta e a forma em bastatildeo do cinetoplasto daacute lugar a uma forma
arredondada (DE SOUZA 1984) Os vaacuterios graus de compactaccedilatildeo do kDNA em
tripanosomatiacutedeos podem estar relacionados com a accedilatildeo de proteiacutenas que
condensam o DNA como seraacute visto mais adiante
FIGURA 6 MUDANCcedilAS NA POSICcedilAtildeO DO KDNA NOS TRYPANOSOMAS FONTE Modificado de DO CAMPO et al 2005
30
O cinetoplasto de todos os tripanosomatiacutedeos encontra-se localizado
proacuteximo ao corpo basal perpendicularmente ao eixo do flagelo Em alguns
tripanosomatiacutedeos que sofrem diferenciaccedilatildeo ao longo de seu ciclo de vida como o
T cruzi o cinetoplasto muda de posiccedilatildeo dentro da ceacutelula passando da regiatildeo
anterior (nos epimastigotas) para a regiatildeo posterior (nos tripomastigotas) poreacutem
permanecendo proacuteximo e perpendicular ao corpo basal (FIGURA 7) O cinetoplasto
eacute fisicamente conectado ao corpo basal atraveacutes de um grupo de filamentos
citoplasmaacuteticos chamado de complexo de ligaccedilatildeo tripartite (TAC) (OGBADOYI et al
2003) Este complexo eacute responsaacutevel pelo posicionamento espacial do cinetoplasto e
por sua segregaccedilatildeo
FIGURA 7 REPOSICIONAMENTO DO KDNA EM RELACcedilAtildeO AgraveS OUTRAS ORGANELAS DURANTE O CICLO DE VIDA DE UM FLAGELADO LEGENDA A morfologia eacute definida pelas posiccedilotildees do ponto onde emerge o flagelo e a bolsa flagelar (BF) (mostrada em laranja) nuacutecleo (mostrado em azul) e kDNA (mostrado em roxo) FONTE Modificado de FIELD amp CARRINGTON 2009
31
171 Replicaccedilatildeo do kDNA
Nos tripanosomatiacutedeos a replicaccedilatildeo do kDNA eacute restrita a fase S nuclear
(COSGROVE amp SKEEN 1970 WOODWARD amp GULL 1990) diferente do que
acontece na maioria dos eucariotos onde a replicaccedilatildeo do DNA mitocondrial ocorre
ao longo do ciclo celular (LIU et al 2005)
A replicaccedilatildeo dos miniciacuterculos se inicia quando estes satildeo individualmente
decatenados da rede de kDNA pela accedilatildeo de DNA topoisomerases do tipo II pois
estes natildeo se replicam enquanto estatildeo ligados agrave rede e termina quando os
miniciacuterculos retornam para a rede com a ajuda da mesma enzima (SHAPIRO amp
ENGLUND 1995)
Os miniciacuterculos satildeo liberados da rede em direccedilatildeo a zona cinetoflagelar
(KFZ) uma regiatildeo especializada da matriz mitocondrial entre o kDNA e o corpo
basal (FIGURA 8) que abriga proteiacutenas envolvidas com o iniacutecio da replicaccedilatildeo Em
seguida os ciacuterculos migram (ou satildeo transportados) para os poacutelos opostos da rede
de kDNA para completar sua replicaccedilatildeo O iniacutecio da replicaccedilatildeo dos miniciacuterculos na
regiatildeo cinetoflagelar envolve a montagem de um complexo proteacuteico na origem de
replicaccedilatildeo dos ciacuterculos com a participaccedilatildeo da primase polimerase e proteiacutenas que
se ligam agrave sequumlecircncia universal de miniciacuterculos (UMSBP) Estas juntamente com
outras proteiacutenas geram uma forquilha de replicaccedilatildeo que se propaga
unidirecionalmente ao redor do miniciacuterculo formando uma estrutura tipo
intermediaacuteria (LIU et al 2005 GLUENZ et al 2007)
Os miniciacuterculos receacutem-replicados migram da zona KFZ para dois complexos
proteacuteicos situados nos poacutelos diametralmente opostos do cinetoplasto onde os
proacuteximos passos de replicaccedilatildeo iratildeo ocorrer Estes passos incluem remoccedilatildeo dos
primers pela accedilatildeo de endonucleases preenchimento de alguns intervalos entre os
fragmentos de Okazaki pela DNA polimerase e uniatildeo dos cortes (nicks) por uma
DNA ligase Apoacutes estas etapas os novos ciacuterculos sintetizados que ainda possuem
pelo menos uma interrupccedilatildeo em sua sequumlecircncia satildeo reunidos agrave periferia da rede
pela accedilatildeo de topoisomerases II Apoacutes todos miniciacuterculos terem sido replicados os
intervalos satildeo reparados (Revisto por LIU et al 2005 POVELONES 2014)
Pouco se sabe sobre o processo de replicaccedilatildeo dos maxiciacuterculos Assim
como os miniciacuterculos os maxiciacuterculos tambeacutem sofrem replicaccedilatildeo unidirecional que
32
se inicia em uma origem contida na regiatildeo variaacutevel da moleacutecula formando estruturas
tipo- Entretanto ao contraacuterio dos miniciacuterculos eles permanecem ligados agrave rede de
kDNA durante o processo replicativo (revisto por KLINGBEIL et al 2001 Liu et al
2005)
FIGURA 8 REPLICACcedilAtildeO DO kDNA FONTE Modificado de LIU et al 2005
18 Proteiacutenas associadas ao cinetoplasto (KAPs)
Proteiacutenas que se ligam ao DNA tambeacutem foram identificadas na mitococircndria
de uma variedade de organismos eucarioacuteticos variando de levedura ateacute humanos
(MAIER et al 2001) Estas proteiacutenas satildeo codificadas no nuacutecleo da ceacutelula e satildeo poacutes-
traducionalmente importadas para a mitococircndria
Conceitualmente qualquer proteiacutena que se associe ao kDNA quer atuando
na replicaccedilatildeo e transcriccedilatildeo quer atuando na organizaccedilatildeo compactaccedilatildeo e
segregaccedilatildeo da rede pode ser chamada de KAP (KAP do inglecircs Kinetoplast-
33
Associated Protein) Observou-se que algumas dessas KAPs apresentam
caracteriacutesticas de proteiacutenas histonas H1 (H1 histone-like proteins) por serem
proteiacutenas pequenas (17 a 25 kDa) fortemente baacutesicas (pI de 11 a 125) interagindo
com a carga negativa das moleacuteculas de DNA e com grande conteuacutedo dos
aminoaacutecidos lisina e arginina elevado (aprox 30 a 50)
Proteiacutenas associadas com genoma mitochondrial (KAPs) dos
tripanosomatiacutedeos e que compartilham caracteriacutesticas com histonas H1 foram
inicialmente identificadas no cinetoplasto do tripanosomatiacutedeo de inseto Crithidia
fasciculata e denominadas de KAP1 a 5 As H1-KAPs de C fasciculata interagem
com miniciacuterculos (XU et al 1996) e desse modo podem facilitar a associaccedilatildeo
orientaccedilatildeo e organizaccedilatildeo dessas moleacuteculas na rede pela neutralizaccedilatildeo das cargas
negativas das moleacuteculas de DNA contribuindo para a condensaccedilatildeo organizaccedilatildeo e
segregaccedilatildeo da rede de kDNA Ateacute o momento foram caracterizadas quatro H1-KAPs
de C fasciculata (CfKAP1 2 3 and 4) Aleacutem das caracteriacutesticas de histona H1
possuem uma preacute-sequecircncia clivaacutevel de nove aminoaacutecidos em sua porccedilatildeo N-
terminal e que provavelmente estaacute envolvida no transporte da proteiacutena para o
cinetoplasto jaacute que natildeo aparece na proteiacutena madura (XU amp RAY 1993 XU et al
1996 HINES amp RAY 1998) Atraveacutes de ensaios de imunofluorescecircncia foi possiacutevel
confirmar que estas proteiacutenas estatildeo presentes em toda a rede de kDNA Pela
facilidade encontrada nas KAPs purificadas de condensar redes de kDNA in vitro
(XU et al 1996) sugere-se que estas estejam envolvidas na organizaccedilatildeo e
condensaccedilatildeo do kDNA in vivo (LUKES et al 2001)
As teacutecnicas de deleccedilatildeo de genes satildeo uma oacutetima ferramenta para elucidar as
possiacuteveis funccedilotildees que um gene pode apresentar Em C fasciculata foi utilizada a
teacutecnica de nocaute gecircnico para o gene Cfkap1 onde mutantes viaacuteveis foram
obtidos mostrando que a forma e a dimensatildeo do cinetoplasto natildeo foram alterados
ao contraacuterio da organizaccedilatildeo da rede de kDNA que passou a apresentar fibrilas de
DNA espessas e uma camada eleacutetron-densa no centro do disco Quando foi
realizada a reintroduccedilatildeo do gene na forma episomal o fenoacutetipo normal da rede de
kDNA foi restaurado (LUKES et al 2001) Tambeacutem foi realizado o duplo nocaute
dos genes Cfkap2 e Cfkap3 o qual da mesma maneira produziu mutantes viaacuteveis
poreacutem com o crescimento bastante reduzido uma reduccedilatildeo na respiraccedilatildeo e um
aumento nos niacuteveis de mRNAs codificados pelos maxiciacuterculos Apesar de todas
estas alteraccedilotildees o kDNA permaneceu inalterado mostrando que as proteiacutenas
34
CfKAP2 e CfKAP3 desempenham um papel diferente ao da CfKAP1 pois estatildeo
envolvidas com o metabolismo mitocondrial e proliferaccedilatildeo celular ao inveacutes de
estarem envolvidas na organizaccedilatildeo estrutural do kDNA (AVLIYAKULOV et al
2004)
Com base nesses estudos surgiu o interesse de nosso grupo no estudo de
KAPs em T cruzi visando verificar qual o papel dessas proteiacutenas na organizaccedilatildeo da
rede de kDNA e sua importacircncia nos diferentes estaacutegios do ciclo de vida do parasita
Atraveacutes de anaacutelises bioinformaacuteticas foram identificadas 6 diferentes H1-KAPs
codificadas no genoma do T cruzi levando em consideraccedilatildeo a similaridade com
KAPs de C fasciculata (CAVALCANTI et al 2009) Essas H1-KAPs foram
denominadas de KAP3 KAP4a KAP4b KAP4c KAP6 e KAP7 Nosso grupo iniciou
a caracterizaccedilatildeo das proteiacutenas TcKAP4 e TcKAP6 mostrando que elas se localizam
no cinetoplasto mas com padrotildees distintos de distribuiccedilatildeo dependendo da forma do
ciclo de vida do parasita (CAVALCANTI et al 2009) Mais recentemente mostramos
que o nocaute da TcKAP3 natildeo afeta a proliferaccedilatildeo diferenciaccedilatildeo e infectividade do
parasita (DE SOUZA et al 2010)
A complexidade da rede de kDNA sugere portanto que as diferentes KAPs
atuem em conjunto algumas vezes de modo redundante para desempenhar
funccedilotildees na condensaccedilatildeo replicaccedilatildeo segregaccedilatildeo dessa estrutura
35
2 OBJETIVOS
21 OBJETIVO GERAL
O objetivo principal deste trabalho eacute caracterizar a funccedilatildeo da TcKAP7 avaliando seu
papel na biologia do parasita
211 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS
a) Analisar a localizaccedilatildeo subcelular da TcKAP7 atraveacutes de ensaios de
imunofluorescecircncia
b) Produzir TcKAP7 recombinante em larga escala para ensaios de biologia
estrutural
c) Estudar a viabilidade do parasita na ausecircncia do gene TcKAP7 para os parasitas
viaacuteveis analisar morfologia e ultraestrutura do cinetoplasto multiplicaccedilatildeo
diferenciaccedilatildeo e infectividade
36
3 MATERIAIS E MEacuteTODOS
31 Reagentes e Soluccedilotildees Utilizados
311 Reagentes
AmershamBioscience dNTPs Hybond C Hybond N kit ECL de western blotting
filmes de raio-X Hyperfilmreg anticorpo monoclonal anti-Histidina
Bio-Rad Acrilamida Agarose (UltraPure DNA grade) Azul de Bromofenol Bis-
Acrilamida Persulfato de Amocircnia
Cult-lab RPMI 1640
Difco Baacutecto-Aacutegar Bactotriptona Extrato de levedura Infuso de fiacutegado Triptose
Invitrogen Inc EDTA Fenol TRIS Nick Translation kit Taq DNA polymerase
IPTG Agarose X-Gal DNA de λHindIII Marcador de massa molecular Benchmark
Alexa Fluacuteor 458 1 kb Plus DNA Ladder Soro Fetal Bovino T4 DNA ligase
Merck Acetato de Soacutedio Aacutecido Aceacutetico Glacial Cloreto de CaacutelcioCloreto de
Potaacutessio Cloreto de Soacutedio Etanol Absoluto Glicina Glicose Hidroacutexido de soacutedio
Isopropanol HCl Na2HPO4
New England Biolabs Endonucleases de restriccedilatildeo
Qiagen Qiaquick PCR Purification kit
Serva Electrophoresis Alu-Gel S
Sigma Acetato de amocircnia Ampicilina Brometo de Etiacutedeo BSA Kanamicina
Glicerol Hepes Cloreto de Magneacutesio Tetraciclina β-mercaptoetanol DEAE-
celulose Tween 20 adjuvante completo de Freund monoclonal M2 anti-FLAG
312 Tampotildees e Soluccedilotildees
PBS NaCl 137 mM KCl 27 mM Na2HPO4 43 mM e KH2PO4 15 mM
PSG Na2HPO4 (anidro) 4747 mM NaH2PO4 H2O 25 mM NaCl 3676 mM e
glicose 555 mM
Soluccedilatildeo de tripsinazaccedilatildeo tripsina 005 (mv) e EDTA 002 (mv) em PBS pH
80
37
Soluccedilatildeo de bloqueio para imunofluorescecircncia PBS e BSA 1 (albumina seacuterica
bovina)
Soluccedilatildeo de bloqueio para western blot TBST e leite em poacute desnatado 5
Soluccedilatildeo de lise para Toothpick NaOH 50 mM Glicerol 5 SDS 05 EDTA 5
mM e azul de bromofenol 0025
Soluccedilatildeo Ponceau S Ponceau S 05 em aacutecido aceacutetico 1
Soluccedilatildeo de coloraccedilatildeo para geacuteis de proteiacutena Coomassie blue R-250 01 em
metanolaacutecido aceacutetico (4510)
Soluccedilatildeo para descoloraccedilatildeo de geacuteis de proteiacutena Metanol 4 aacutecido aceacutetico 75
Tampatildeo de lise hipotocircnico Tris-HCl 10mM pH 75 NaCl 10mM MgCl2 5 mM β-
mercaptoetanol 5 mM
Tampatildeo A para cromatografia de afinidade Tris-HCl 20 mM pH 75 NaCl 500 mM
Tampatildeo B para cromatografia de afinidade Tampatildeo A contendo imidazol 1M
Tampatildeo B para cromatografia de troca iocircnica Tris-HCl 50 mM pH 80 NaCl 1M
Soluccedilatildeo de depurinaccedilatildeo para Southern blot HCl 025 M
Soluccedilatildeo desnaturante para Southern blot NaOH 05 M e NaCl 15 M
Soluccedilatildeo neutralizante para Southern blot Tris-HCl 05 M pH 75 e NaCl 15 M
Soluccedilatildeo Denhardt (50X) ficoll 05 polivinilpirrolidona 06 e albumina de soro
bovino 02
Soluccedilatildeo de hibridaccedilatildeo para Southern blot DNA de esperma de salmatildeo do tipo III
01 mgml fragmentado por ultra-som e desnaturado SSC 6X soluccedilatildeo de denhardt
6X e SDS 1
SSC 20X NaCl 3 M pH 70 e citrato de soacutedio 03 M
Soluccedilatildeo de baixa estringecircncia SSC 2X e SDS 01
Soluccedilatildeo de meacutedia estringecircncia SSC 1X e SDS 01
Soluccedilatildeo de alta estringecircncia SSC 01X e SDS 01
Tampatildeo de eletroporaccedilatildeo para T cruzi NaCl 140 mM HEPES (aacutecido) 25 mM e
Na2HPO4 074 mM pH 75
Tampatildeo ZPFM de eletroporaccedilatildeo de T brucei NaCl 129 mM KH2PO4 15mM KCl
8mM NaH2PO4 8mM MgCl2 15mM CaCl2 90 mM e CH3COONa 24 mM pH 70
Tampatildeo TELT Tris-HCl 50 mM pH 80 EDTA 625 mM pH 90 LiCl 25 M e Triton
X-100 4
Tampatildeo de amostra para DNA 10X Ficoll 400 25 azul de bromofenol 025 e
xileno cianol FF 025
38
Tampatildeo de amostra para proteiacutena 4X Tris-HCl 40 mM pH 68 SDS 1 β-
mercaptoetanol 25 glicerol 6 e azul de bromofenol 0005
Tampatildeo de eletroforese para SDS-PAGE 1X Tris-base 25 mM glicina 192 mM e
SDS 01
Tampatildeo de lise de bacteacuterias Tris-HCl 20 mM pH 75 NaCl 500 mM PMSF1 mM
Tampatildeo para transferecircncia (western blotting) 1X Tris-base 25 mM glicina 192
mM e metanol 20
Tampatildeo TBE Tris base 89 mM aacutecido boacuterico 89 mM e EDTA 2 mM
TBS Tris-HCl 20 mM pH 80 e NaCl 150 mM
TBST TBS e Tween 20 01
TE Tris-HCl 10 mM pH 80 e EDTA 1 mM
313 Meios de cultura
LB Triptona 1 extrato de levedura 5 e NaCl 1
Meio LIT (liver infusion tryptose) infuso de fiacutegado 05 NaCl 753 mM KCl 54
mM glicose 10 mM bacto-triptose 05 Na2HPO4 564 mM hemina 00025 soro
fetal bovino 10 e extrato de levedura 15 gl
Meio TAU NaCl 190 mM KCl 17 mM MgCl2 2 mM CaCl2 2 mM e tampatildeo fosfato 8
mM pH 60
Meio TAU3AAG meio TAU suplementado com L-prolina 10 mM glutamato soacutedico
50 mM aspartato soacutedico 2 mM e glicose 10 mM
32 Cultivo do Trypanosoma cruzi
Neste trabalho foi utilizado o clone Dm28c de T cruzi (CONTRERAS et al
1985 CONTRERAS et al 1988) nas formas epimastigota e tripomastigota
metaciacuteclico
321 Epimastigotas
Formas epimastigotas de T cruzi foram cultivadas em meio LIT (CAMARGO
1964) a 28 oC com passagens a cada trecircs dias e inoacuteculo de 1 x 106 ceacutelulasml As
formas epimastigotas foram coletadas por centrifugaccedilatildeo no terceiro dia de cultivo
39
(correspondente a fase logariacutetmica de crescimento baseada em curva de
crescimento realizada nas mesmas condiccedilotildees) quando a densidade celular
apresentava-se entre de 1 - 3 x 107 ceacutelulasml
322 Tripomastigotas metaciacuteclicos
As formas metaciacuteclicas foram obtidas atraveacutes do processo de diferenciaccedilatildeo
in vitro (BONALDO et al 1988) Formas epimastigotas em final de fase logariacutetmica
de crescimento (densidade celular entre 5 - 7 x 107 ceacutelulasml) foram coletadas por
centrifugaccedilatildeo a 7000 x g por 5 minutos a 10 oC e ressuspendidas em meio TAU
na concentraccedilatildeo de 5 x 108 ceacutelulasml e mantidas a 28 oC por 2 horas Apoacutes este
periacuteodo correspondente ao estresse nutricional as ceacutelulas foram transferidas para
garrafas de 300 cm2 contendo 200 ml de meio TAU3AAG (concentraccedilatildeo final de 5 x
106 ceacutelulasml) Uma proporccedilatildeo dos parasitas que se aderiram agrave superfiacutecie da
garrafa de cultivo se diferenciou em metaciacuteclicos os quais foram liberados no
sobrenadante (BONALDO et al 1988) Estas formas foram purificadas pela
passagem atraveacutes de uma coluna de afinidade contendo a resina DEAE celulose
equilibrada em PSG (SOUSA 1983) Este procedimento foi realizado com o tipo
selvagem para obtenccedilatildeo de extrato proteacuteico e tambeacutem com o mutante de T cruzi
para TcKAP7 para verificaccedilatildeo da capacidade de diferenciaccedilatildeo e infectividade onde
o nuacutemero de metaciacuteclicos no sobrenadante foi contado apoacutes 24 48 72 e 96 horas
da incubaccedilatildeo em meio TAU3AAG
33 Curva de crescimento de T cruzi
Formas epimastigotas de T cruzi clone Dm28c e do mutante de T cruzi para
TcKAP7 foram cultivadas como descrito no item 321 ateacute atingirem a fase
estacionaacuteria para a comparaccedilatildeo da taxa de crescimento de ambas Foram
inoculadas 1 x 106 epimastigotas por ml de meio LIT em garrafas de 25 cm2 e
incubadas em seguida a 28 degC Diariamente foi realizada a contagem das culturas
em cacircmaras de Neubauer em diluiccedilotildees apropriadas ateacute o deacutecimo dia O graacutefico da
curva de crescimento comparativa entre a cultura selvagem e a nocaute foi feito
utilizando o programa Microsoft Excel
40
34 Obtenccedilatildeo de DNA de T cruzi
A extraccedilatildeo de DNA foi realizada conforme descrito por Medina-Acosta amp
Cross (1993) Epimastigotas (1 x 107 ceacutelulas) foram coletadas por centrifugaccedilatildeo a
7000 x g por 5 min lavadas em PBS e ressuspendidas em 350 microl de tampatildeo TELT
Apoacutes 5 min de incubaccedilatildeo agrave temperatura ambiente foi adicionado agrave amostra 1
volume de fenolclorofoacutermio e o material foi centrifugado a 13000 x g por 5 min A
fase aquosa foi recolhida e o DNA foi precipitado com 2 volumes de etanol absoluto
e coletado por centrifugaccedilatildeo a 13000 x g por 10 min O DNA presente no sedimento
foi lavado com etanol 70 seco e em seguida ressuspendido em tampatildeo TE
contendo RNAse a 20 microgml
35 Obtenccedilatildeo de kDNA de T cruzi
A extraccedilatildeo do kDNA de T cruzi foi realizada de acordo com Morel e
colaboradores (1980) com modificaccedilotildees
Formas epimastigotas (1 x109 ceacutelulas) foram coletadas por centrifugaccedilatildeo a
4000 x g por 10 min lavadas em PBS e ressuspendidas em 20 ml de Tampatildeo de
Lise Hipotocircnico Posteriormente adicionou-se Sacarose 025 M e o material foi
centrifugado 6000 x g por 10 min O pellet foi ressuspendido em 20 ml de Tris-HCl
10 mM pH 75 NaCl 10 Mm EDTA 5 mM SDS 05 A esta soluccedilatildeo foi adicionado
100 ug de proteinase K e a mesma permaneceu a 37 ordmC durante a noite No dia
seguinte as ceacutelulas foram transferidas para uma seringa de 50 ml aonde ocorreu a
quebra mecacircnica do DNA nuclear Este material foi ultracentrifugado a 27000 rpm a
4ordm C durante 1 hora utilizando o rotor SW28 Apoacutes centrifugaccedilatildeo o sobrenadante foi
desprezado e o pellet ressuspendido em 25 ml de TE e novamente ultracentrifugado
nas mesmas condiccedilotildees Apoacutes centrifugaccedilatildeo o pellet foi ressuspendido em 1ml de TE
e foi realizada a purificaccedilatildeo por fenolclorofoacutermio Apoacutes purificaccedilatildeo o material foi
ressuspendido em 300 ul de TE e utilizado para ensaios de SAXS
36 Obtenccedilatildeo de extrato proteico de T cruzi
41
As ceacutelulas foram coletadas por centrifugaccedilatildeo (4000 x g 5 min a 10 degC) e
lavadas duas vezes em PBS pH 75 Apoacutes as lavagens os parasitas foram
ressuspendidos em PBS e tampatildeo de amostra 4x foi adicionado de tal maneira que
a concentraccedilatildeo final fosse de 1 x 106 ceacutelulas equivalentesmicrol Os extratos foram
fervidos por 5 min e armazenados a - 70 degC
37 Clonagem do gene TcKAP7
A sequecircncia do gene TcKAP7 (ID Tc00104705350871950) foi obtida a
partir do banco de dados do genoma do T cruzi disponiacutevel no portal da internet
wwwgenedborg e a sua regiatildeo codificante foi amplificada por PCR com os primers
KAP7F (5rsquo ndash AAAGGATCCATGCTAAGAACTGTTCTGCCACTG 3rsquo) e KAP7R (5rsquo ndash
TCAGCGTCGACTTATGACGGTGGTGCAGGATCAGCAGCTGCAGTATTTT3rsquo) a
partir do DNA genocircmico de T cruzi Dm28c As sequecircncias de reconhecimento das
enzimas de restriccedilatildeo BamHI e SalI (marcadas em negrito) foram adicionadas na
extremidade 5rsquo dos primers KAP7F e KAP7R respectivamente As condiccedilotildees da
reaccedilatildeo de PCR foram as seguintes 100 ng de DNA total T cruzi 10 pmol de cada
primer 200 μM de cada dNTP MgCl2 15 mM tampatildeo Taq DNA polimerase 1x 25
U de Taq DNA polimerase (Invitrogen) A reaccedilatildeo de PCR foi processada no
termociclador modelo 9700 (Applied Biosystems EUA) com a desnaturaccedilatildeo do
material por 4 min a 94 degC seguida de 30 ciclos constando de desnaturaccedilatildeo a 94 degC
por 30 s hibridizaccedilatildeo dos primers a 58 degC por 30 s e extensatildeo a 72 degC por 1 min O
material amplificado foi purificado usando o kit Qiaquick PCR Purification (Qiagen) e
digerido com as enzimas de restriccedilatildeo BamHI e SalI com uso de 20 U de cada
enzima e seus respectivos tampotildees em volume final de 20 μl por 4 h a 37 oC O
material foi novamente purificado e utilizado para ligaccedilatildeo com o vetor pET28a
previamente digerido com as respectivas enzimas Bacteacuterias E coli cepa DH5α
foram transformadas com a ligaccedilatildeo A seleccedilatildeo dos clones contendo plasmiacutedeo com
o inserto desejado foi realizada atraveacutes da teacutecnica de palitagem ou de PCR de
colocircnia
38 Obtenccedilatildeo do cDNA de TcKAP7 atraveacutes de ensaio de RT-PCR
42
Com o intuito de verificar a posiccedilatildeo do mini-exon no transcrito de TcKAP7
realizamos o ensaio de RT-PCR para a obtenccedilatildeo do cDNA de TcKAP7
O protocolo utilizado foi baseado no manual teacutecnico da Promega (ΙmProm-ΙΙ
Reverse Transcription System) assim como os reagentes utilizados para essa
reaccedilatildeo Aproximadamente 10 μg de RNA foram incubados com o oligonucleotiacutedeo
KAP7R por 10 min a 70 degC e imediatamente transferidos para o gelo Agrave mistura foi
adicionada uma soluccedilatildeo de dNTPs (concentraccedilatildeo final de 05 mM para cada dNTP)
MgCl2 (120 μM) RNAse OUT (2 unidades) (Invitrogen) Transcriptase reversa
ImProm-II e respectivo tampatildeo A reaccedilatildeo foi incubada por 2 h a 42 degC As amostras
de cDNA foram purificadas por Microcon YM-30 (Millipore) conforme descriccedilatildeo do
fabricante e armazenadas a -20 degC Posteriormente foi realizada uma reaccedilatildeo de
PCR utilizando as seguintes condiccedilotildees 10 ng do cDNA de TcKAP7 de T cruzi 10
pmol do primer ME (5rsquo-AACGCTATTATTGATACAGTTTCTGTACTATATTG -3rsquo) e 10
pmol do primer KAP7R 200 μM de cada dNTP MgCl2 15 mM tampatildeo Taq DNA
polimerase 1x 25 U de Taq DNA polimerase (Invitrogen) A reaccedilatildeo de PCR foi
processada no termociclador modelo 9700 (Applied Biosystems EUA) com a
desnaturaccedilatildeo do material por 3 min a 94 degC seguida de 35 ciclos constando de
desnaturaccedilatildeo a 94 degC por 30 s hibridizaccedilatildeo dos primers a 55 degC por 30 s e extensatildeo
a 72 degC por 1 min O material amplificado foi purificado usando o kit Qiaquick PCR
Purification (Qiagen) e clonado diretamente no vetor pGEMreg-T Easy (Promega)
Bacteacuterias E coli cepa TOP10Frsquo foram transformadas com a ligaccedilatildeo e os plasmiacutedeos
recombinantes foram selecionados pela teacutecnica da palitagem ou de PCR de colocircnia
(itens 391 e 392) Apoacutes a minipreparaccedilatildeo (item 310) o material foi submetido ao
sequenciamento de DNA usando o serviccedilo de sequenciamento da empresa
Macrogen (Coreacuteia do Sul)
39 Seleccedilatildeo dos clones recombinantes
391 Teacutecnica de palitagem (toothpick)
As colocircnias foram coletadas com o auxiacutelio de palitos de dente (toothpick)
esteacutereis e transferidas para o fundo de tubos de micro-centriacutefuga e para a superfiacutecie
do meio LB solidificado (com o antibioacutetico de seleccedilatildeo do plasmiacutedeo) para a obtenccedilatildeo
de uma reacuteplica das colocircnias que foram analisadas (placa-matildee) A cada um dos
43
tubos foram acrescentados 15 μl do tampatildeo de lise Os tubos foram incubados em
banho-maria a 65 degC por 10 min As amostras entatildeo foram analisadas por
eletroforese em gel de agarose 1 usando o plasmiacutedeo sem inserto como controle
Posteriormente o gel foi corado com brometo de etiacutedeo (05 μgml) por
aproximadamente 20 min lavado com aacutegua e analisado sob luz ultravioleta para em
seguida ser fotografado no sistema de fotodocumentaccedilatildeo L-Pix (Locus
Biotecnologia Brasil)
392 Teacutecnica de PCR de colocircnia
Depois de selecionadas as colocircnias foram transferidas para tubos de PCR
contendo os reagentes da PCR e os primers que hibridizam com regiotildees que
flanqueiam o fragmento de DNA clonado em um volume total de 10 microl As amostras
foram incubadas a 94 degC por 3 min e submetidas a 35 ciclos de PCR com as
seguintes etapas 94 degC por 30 s 55 degC por 30 s e 72 degC por 1 min finalizando com
uma etapa de extensatildeo a 72 degC por 10 min Os produtos amplificados foram
analisados em gel de agarose 1 Posteriormente o gel foi corado com brometo de
etiacutedeo (05 microgml) por aproximadamente 20 min lavado com aacutegua e analisado sob
luz ultravioleta O gel foi fotografado no sistema de foto-documentaccedilatildeo L-Pix (Locus
Biotecnologia Brasil)
310 Preparaccedilatildeo de plasmiacutedeo em pequena escala (miniprep)
Os clones recombinantes foram cultivados em 3 ml de meio LB contendo o
antibioacutetico apropriado durante 18 h As culturas foram entatildeo centrifugadas a 12000
x g por 1min a temperatura ambiente e os plasmiacutedeos recombinantes purificados
com o sistema de minipreparaccedilatildeo de plasmiacutedeo (Miniprep Qiagen Kit) (QIAGEN) de
acordo com as recomendaccedilotildees do fabricante
311 Expressatildeo da proteiacutena TcKAP7 em E coli
Para expressar a proteiacutena recombinante TcKAP7 E coli cepa
BL21(DE3)STAR transformada com o plasmiacutedeo pET28a contendo o gene TcKPA7
(pET28a-TcKAP7) foi cultivada em meio LB contendo 25 μgml do antibioacutetico
44
kanamicina a 37 ordmC sob agitaccedilatildeo (preacute-inoacuteculo) Apoacutes 18 horas de crescimento uma
diluiccedilatildeo (110) foi realizada em novos tubos contendo meio LB-kanamicina e a
cultura foi incubada por 1 h a 37 ordmC sob agitaccedilatildeo constante Apoacutes este periacuteodo 05
mM IPTG (isopropil-1-tio-β-D-galactopiranosideo) foi adicionado agraves culturas A
incubaccedilatildeo prosseguiu por mais 3 h nas mesmas condiccedilotildees Como controle negativo
as ceacutelulas tambeacutem foram cultivadas nas mesmas condiccedilotildees poreacutem sem a adiccedilatildeo de
IPTG (cultura natildeo induzida) Aliacutequotas das culturas induzidas e natildeo induzidas com
IPTG foram processadas para anaacutelise em SDS-PAGE
312 Purificaccedilatildeo da proteiacutena recombinante TcKAP7
3121 Processamento da amostra
As bacteacuterias apoacutes a expressatildeo de TcKAP7 foram sedimentadas por
centrifugaccedilatildeo e ressuspendidas em tampatildeo de lise e lisadas utilizando o
microfluidificador modelo M-110L (Microfluidics EUA) Este meacutetodo divide a amostra
em dois fluxos e os conduz sob alta pressatildeo gerada por uma vaacutelvula pneumaacutetica
para uma cacircmara de interaccedilatildeo tambeacutem chamada de aacuterea de choque Esta cacircmara
eacute formada por um sistema de micro-canais dentro de um bloco de ceracircmica Dentro
da cacircmara ocorre cavitaccedilatildeo sonicaccedilatildeo e impacto dos dois fluxos em que a amostra
foi dividida levando a lise das ceacutelulas bacterianas (FIGURA 9) Este processo
provoca o aumento da temperatura e todo o sistema de tubos que conduz a amostra
necessita ser refrigerado com gelo e aacutegua a 4degC para prevenir a precipitaccedilatildeo de
proteiacutenas soluacuteveis
45
FIGURA 9 - REPRESENTACcedilAtildeO ESQUEMAacuteTICA DO MICROFLUIDIFICADOR LEGENDA A suspensatildeo de bacteacuterias eacute dividida em dois fluxos que se chocam sob alta pressatildeo dentro de micro-canais presentes na cacircmara de interaccedilatildeo da vaacutelvula homogeneizadora Melhores resultados satildeo obtidos aumentando o nuacutemero de ciclos de passagens Seta preenchida direccedilatildeo da amostra Seta pontilhada repetindo o ciclo de passagem FONTE Modificado de MAA amp HSU 1999
Apoacutes a lise o extrato soluacutevel foi obtido apoacutes centrifugaccedilatildeo a 30000 x g por
30 min a 4 degC
3122 Cromatografia de afinidade
Por ser expressa fusionada a uma cauda de seis histidinas a proteiacutena
TcKAP7 pode ser separada dos extratos celulares a partir da utilizaccedilatildeo de resina de
niacutequel da qual posteriormente a proteiacutena seraacute eluiacuteda
A purificaccedilatildeo da proteiacutena TcKPA7 presente no sobrenadante foi realizada
em sistema FPLC (Fast Performance Liquid Chromatography ndash GE Healthcare) com
coluna HiTrap Chelating de 1 mL (GE Healthcare) A coluna foi carregada com
soluccedilatildeo NiSO4 100 mM e equilibrada com tampatildeo A para cromatografia de afinidade
Durante a purificaccedilatildeo foi utilizado um gradiente de 0-100 de tampatildeo B para
cromatografia de afinidade As fraccedilotildees provenientes da cromatografia foram
analisadas atraveacutes de SDS-PAGE
Suspensatildeo de bacteacuterias
Ceacutelulas lisadasBomba de
alta pressatildeo
Micro-canais
Vaacutelvula homogeneizadora
46
3123 Cromatografia de troca iocircnica
Para eliminar contaminantes remanescentes da cromatografia de afinidade
a amostra contendo a proteiacutena de interesse foi submetida a uma segunda etapa
cromatograacutefica cromatografia de troca iocircnica utilizando-se a coluna HiTraptrade SP (GE
Healthcare) no sistema de FPLC (GE Healthcare)
Primeiramente a amostra foi diluiacuteda para reduccedilatildeo da concentraccedilatildeo salina e
a coluna foi lavada com 2 volumes de tampatildeo B para cromatografia de troca iocircnica e
depois com 2 volumes de tampatildeo A utilizado na cromatografia de afinidade O
gradiente de passagem do tampatildeo B foi de 0 a 100 e a proteiacutena TcKAP7 foi
obtida na fraccedilatildeo de material natildeo ligado agrave resina (Flow-through) (FT)
3124 Cromatografia de gel filtraccedilatildeo
Amostras da cromatografia de troca iocircnica que continham a proteiacutena de
interesse foram concentradas atraveacutes de filtraccedilatildeo A soluccedilatildeo foi colocada em filtro
Amicon Ultra MWCO 10000 (Milipore) e centrifugada a 4000 rpm a 4 ordmC O
experimento foi realizado em sistema FPLC (GE Healthcare) com a coluna
Superdex 200 HR 1030 (GE Healthcare) em tampatildeo HEPES 20 mM pH 74 e de
cloreto de soacutedio100 mM
313 Espalhamento Dinacircmico de Luz ndash DLS
O experimento foi realizado em equipamento DynaPro Molecular instrument
a 4 ordmC As amostras foram previamente centrifugadas por 5 minutos a 15000 rpm a
4 ordmC A coleta de dados foi realizada com intervalos de 2 segundos com 100
aquisiccedilotildees Para cada leitura utilizou-se 5 microl de amostra proteica
314 Espectroscopia de dicroiacutesmo circular (CD)
O espectro de CD foi coletado usando espectropolariacutemetro Jasco J-715
(Jasco Corporation Toacutekio Japatildeo) sendo a temperatura mantida a 20 degC atraveacutes de
um Peltie rType Control System PFD425S (JASCO) Todos os dados foram
coletados usando cubeta de quartzo de 1 mm de caminho oacuteptico
47
Mediu-se a elipticidade em graus na regiatildeo do UV distante no intervalo de
comprimento de onda de 260 nm a 200 nm com uma velocidade de 100 nmmin
sendo feitas no total 30 leituras com resposta de 1 segundo em varredura contiacutenua
Os valores obtidos em miligraus foram convertidos para elipticidade molar
por resiacuteduo ([θ]MRW) em miligrauscm2dmol-1 que eacute definida pela equaccedilatildeo (Adler et
al 1973)
Onde θobs eacute a elipsidade observada em graus MRW eacute o peso molecular
meacutedio dos resiacuteduos da proteiacutena d eacute o caminho oacuteptico da cubeta em centiacutemetros e c
eacute a concentraccedilatildeo da proteiacutena em mgmL O MRW eacute calculado dividindo-se o peso
molecular da proteiacutena pelo nuacutemero de resiacuteduos
315 Quantificaccedilatildeo e concentraccedilatildeo
As amostras obtidas a partir da purificaccedilatildeo tiveram a concentraccedilatildeo calculada
utillizando a absorbacircncia mensurada pelo aparelho NanoDrop (Thermo Fisher
Scientific) levando-se em consideraccedilatildeo o coeficiente de extinccedilatildeo e teoacuterico da
proteiacutena obtido a partir do ProtParam (httpusexpasyorgtoolsprotparamhtml) e o
peso molecular da proteiacutena que eacute de cerca de 28 kDa
Obtidas as concentraccedilotildees a amostra foi concentrada pelo meacutetodo de
filtraccedilatildeo utilizando o filtro Amiconreg Ultra Centrifugal Filter (Millipore) com poro de
10000 Da A amostra foi centrifugada ateacute a obtenccedilatildeo de uma concentraccedilatildeo final de
5 mgml para os ensaios de cristalizaccedilatildeo Uma aliacutequota da proteiacutena concentrada foi
utilizada para anaacutelise por SDS-PAGE
316 Ensaios de Cristalizaccedilatildeo
Os ensaios de cristalizaccedilatildeo foram realizados empregando-se a teacutecnica de
difusatildeo de vapor em gota sentada utilizando-se os equipamentos disponiacuteveis no
Laboratoacuterio Robotizado de Cristalizaccedilatildeo de Proteiacutenas LNBio Os ensaios foram
feitos em placas de 96 poccedilos e as gotas preparadas pelo robocirc Honeybee
utilizando-se os kits disponiacuteveis no laboratoacuterio Crystal Screen HT (Hampton
Research) JCSG+ Suite (Molecular Dimensions) PACT Suite (Molecular
cd
MRWobs
10][
48
Dimensions) Precipitant Synergy (Rigaku Reagents) SaltRx HT (Hampton
Research) Wizard IampII (Rigaku Reagents)
317 Espalhamento de raio-X a baixo acircngulo (SAXS)
Atraveacutes da teacutecnica de SAXS informaccedilotildees sobre a massa molecular das
partiacuteculas espalhadoras e do raio de giro (Rg) da proteiacutena de estudo satildeo obtidos a
partir dos dados coletados Por meio de programas computacionais como DAMMIN
(SVERGUN1999) e GASBOR (SVERGUN et al 2001) um modelo de baixa
resoluccedilatildeo da forma da proteiacutena pode ser obtido
Os dados de SAXS foram obtidos na linha de luz D02A ndash SAXS2 no
Laboratoacuterio Nacional de Luz Siacutencrotron (LNLS) Campinas-SP Brasil usando
comprimento de onda de 148 A e um detector bidimensional com arranjo CCD
(MARCCD USA) de 165 mm A distacircncia do detector para a amostra foi de 106804
mm e os dados na faixa de 002 nm-1 para 021 nm-1 foram coletados usando
proteiacutena pura nas concentraccedilotildees de 5 mgml em tampatildeo em 20 mM HEPES pH 74
e 100 mM de cloreto de soacutedioExposiccedilotildees de 300 e 600 s foram realizadas e os
dados do tampatildeo foram coletados antes e depois dos dados da amostra para fazer a
correccedilatildeo do solvente e normalizaccedilatildeo do espalhamento
Ajuste dos dados experimentais e avaliaccedilatildeo da funccedilatildeo p(R) foram realizados
utilizando o programa GNOM (SVERGUN 1992) O envelope a baixa resoluccedilatildeo de
TcKAP7 foi determinado usando modelagem abnitio implementada no programa
DAMMIN O modelo a baixa resoluccedilatildeo e o modelo da estrutura tridimensional foram
superpostas usando o programa SUPCOMB (KOZIN amp SVERGUN 2001)
318 Modelagem de TcKAP7
Um modelo da estrutura tridimensional de TcKAP7 foi construiacutedo Para a
construccedilatildeo do modelo foi utilizado o programa MODELLER (SALI amp BLUNDELL
1993) este programa eacute utilizado para a modelagem por homologia a estruturas
tridimensionais de proteiacutenas O programa automaticamente constroacutei um modelo
baseado na anaacutelise de um alinhamento de sequecircncias entre a proteiacutena para a qual
se deseja construir o modelo e uma proteiacutena relacionada cuja estrutura
tridimensional jaacute foi resolvida A qualidade do modelo pode ser avaliada por
49
exemplo atraveacutes de graacuteficos e tabelas que analisam restriccedilotildees quiacutemicas e fiacutesicas de
cada aacutetomo constituinte do modelo
319 Obtenccedilatildeo de antissoro policlonal contra TcKAP7
A proteiacutena TcKPA7 recombinante purificada foi inoculada em camundongos
da linhagem BALBc por via intraperitonial com 4 aplicaccedilotildees de aproximadamente
20-50 μg de antiacutegeno em intervalos de 15 dias seguida de obtenccedilatildeo do soro apoacutes 1
semana da uacuteltima inoculaccedilatildeo O antiacutegeno foi emulsificado em adjuvante completo de
Freund na primeira inoculaccedilatildeo e com adjuvante a base de hidroacutexido de alumiacutenio
(Alu-Gel Serva) nas inoculaccedilotildees posteriores
320 Anaacutelise da expressatildeo do gene TcKAP7 e de seu mutante por ensaio tipo
western blot
Este procedimento foi executado segundo o meacutetodo de Towbin e
colaboradores (1979) Aliacutequotas de extratos de T cruzi equivalentes a 1 x 107
ceacutelulas foram submetidos agrave SDS-PAGE Apoacutes a separaccedilatildeo eletroforeacutetica as
proteiacutenas foram transferidas para membrana de nitrocelulose (Hybond C Amersham
Biosciences) em tampatildeo de western por 2 h a 60 V ou 20 V por 16 h Apoacutes a
transferecircncia a membrana foi corada com Ponceau S e descorada suavemente com
aacutegua bidestilada para a identificaccedilatildeo das bandas do marcador de massa molecular
A membrana foi entatildeo incubada em soluccedilatildeo de bloqueio por 30 min sob agitaccedilatildeo
suave
Apoacutes o bloqueio a membrana foi incubada com os soros policlonais ou
anticorpos monoclonais em TBST-leite por aproximadamente 1 h a 37degC A
membrana foi lavada 5 vezes com TBST Em seguida a membrana foi incubada
com anticorpo secundaacuterio anti-IgG de camundongo conjugado com a enzima
peroxidase (Pierce ndash Thermo Scientific) por 1h na diluiccedilatildeo de 16000 em TBST-leite
a temperatura ambiente A membrana foi submetida a mais cinco lavagens com
TBST e a reaccedilatildeo era evidenciada utilizando substrato quimioluminescente (West
Pico Pierce ndash ThermoScientific) sobre a membrana a qual era exposta a um filme
para raios-X (Hyperfilm ECL GE)
50
321 Superexpressatildeo de TcKAP7
3211 Amplificaccedilatildeo e clonagem do gene TcKAP7 no vetor pNEO3xFlag para
superexpressatildeo da proteiacutena
O gene TcKAP7 foi clonado no vetor pNEO3xFLAG construiacutedo no nosso
laboratoacuterio a partir do vetor pTcGW-ProtCcarboxi (BATISTA et al 2010) que utiliza
o sistema Gateway de clonagem (Invitrogen) Os vetores foram construiacutedos
utilizando-se como base o pBluescript II (Stratagene San Diego USA) onde foram
inseridas trecircs sequencias que codificam para regiotildees intergecircnicas (IR) de T cruzi A
primeira TcUIR eacute a regiatildeo intergecircnica do locus de ubiquitinacalmodulina de T
cruzi (BATISTA et al 2010) As outras duas regiotildees intergecircnicas ITR1 e ITR2 foram
selecionadas a partir de genes de copia uacutenica no genoma e que possuem um niacutevel
de expressatildeo constitutivo nos estaacutegios epimastigota e tripomastigota metaciclicos
avaliados por dados de proteocircmica e RNAseq (Comunicaccedilatildeo pessoal Michel
Batista) Aleacutem disso esse vetor confere agrave regiatildeo C-terminal da proteiacutena
recombinante resultante da clonagem neste vetor trecircs etiquetas FLAG (sequecircncia
DYKDDDDK) em tandem (FIGURA 10)
FIGURA 10 VETOR PARA EXPRESSAtildeO EM T CRUZI P3XFLAG
LEGENDA PR ndash PROMOTOR RIBOSOMAL TCUIR ITR1 E ITR2 - REGIOtildeES INTERGENICAS ATTR1 E ATTR2 ndash REGIOtildeES PARA RECOMBINACcedilAtildeO CMreg - RESISTEcircNCIA A CLORANFENICOL CCDB ndash GENE PARA SELECcedilAtildeO NEGATIVA DURANTE A CLONAGEM 3XFLAG ndash TREcircS ETIQUETAS DE FLAG (DYKDDDDK) NEOMICINA ndash GENE DE RESISTEcircNCIA A NEOMICINA
O gene TcKAP7 foi amplificado utilizando os primers especiacuteficos
KAP7GtwFor (5rsquo-
GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTGCCCGCGAAGTATTCAGCAGCCC)
e KAP7GtwRev (5rsquo-
GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCGTGGTACATGGCGTACGGGTTG)
PR TcUIR Att R1 Cmreg ccdB Att R2 3x Flag ITR1 Neomicina ITR2
51
os quais possuem os siacutetios attB indicados em negrito As condiccedilotildees desta reaccedilatildeo
de PCR foram as seguintes 100 ng de DNA genocircmico de T cruzi 10 pmol de cada
primer 200 μM de cada dNTP MgSO4 2 mM tampatildeo Taq DNA polimerase High
Fidelity 1x 1U de Platinum Taq DNA polimerase high fidelity (Invitrogen) A reaccedilatildeo
de PCR foi processada no termociclador modelo 9700 (AppliedBiosystems EUA)
com a desnaturaccedilatildeo do material por 5 min a 94 degC seguida de 35 ciclos constando
de desnaturaccedilatildeo a 94 degC por 30 s hibridizaccedilatildeo dos primers a 58 degC por 30 s e
extensatildeo a 72 degC por 15 min
O gene amplificado foi clonado no vetor de entrada pDONRtrade221
(Invitrogen) A reaccedilatildeo foi feita com 150 ng dos produtos de PCR contendo os siacutetios
attB 150 ng do plasmiacutedeo pDONRtrade221 1 μL de BP ClonaseTM enzyme mix e TE
para um volume final de 10 μL e com incubaccedilatildeo a 25 degC por 16 h Foi entatildeo
adicionado 1 microL de proteinase K (2 mgmL) com incubaccedilatildeo por 10 min a 37 degC Os
clones em pDONRtrade221 foram transformados em ceacutelulas caacutelcio-competentes E coli
DH5α conforme protocolo de transformaccedilatildeo de ceacutelulas caacutelcio-competentes Apoacutes
transformaccedilatildeo a cultura foi semeada em placa de LBKan (kanamicina 25 microgmL) e
incubada a 37 degC durante 16 h
Para verificar a presenccedila de clones com os insertos de interesse foi feita a
teacutecnica da palitagem As colocircnias selecionadas foram inoculadas em 5 mL de meio
LBKan e incubadas por 16 h a 37 degC com agitaccedilatildeo (190 rpm) A purificaccedilatildeo dos
plasmiacutedeos foi realizada com o kit QIAprepreg Spin Miniprep (Qiagen) conforme
orientaccedilotildees do fabricante
Apoacutes esta etapa foi necessaacuterio transferir os insertos para o vetor de destino
pNEO3xFlag A troca de insertos entre os vetores de entrada e destino denominada
de reaccedilatildeo LR foi realizada conforme orientaccedilotildees do fabricante (Gateway LR clonase
enzyme mix) e ceacutelulas caacutelcio-competentes foram transformadas com os produtos
das recombinaccedilotildees conforme descrito anteriormente semeadas em placas de
LBAmp e incubadas a 37 degC durante 16 h
A verificaccedilatildeo de clones positivos foi realizada atraveacutes de PCR de colocircnias
As colocircnias selecionadas foram inoculadas em 5 mL de meio LB contendo ampicilina
(100 μgmL) e incubada a 37deg C por 16 h sob agitaccedilatildeo (200 rpm)O plasmiacutedeo
contendo o gene TcKAP7 foi denominado de pNEO_KAP7_3xFLAG
52
3212 Transfecccedilatildeo por eletroporaccedilatildeo
A transfecccedilatildeo das formas epimastigotas de T cruzi foi feita pela teacutecnica de
eletroporaccedilatildeo utilizando o equipamento genepulserreg apparatus (Bio-Rad) e cubetas
esteacutereis de eletroporaccedilatildeo gene pulsermicro pulserreg 02 cm (Bio-Rad) Formas
epimastigotas de T cruzi foram cultivadas em meio LIT ateacute uma densidade celular
de 3 x 107 ceacutelulasml Um volume de cultura correspondendo a 1 x 109 parasitas foi
centrifugado (4000 x g 4 degC) O sobrenadante foi descartado e as ceacutelulas foram
ressuspendidas em tampatildeo de eletroporaccedilatildeo esteacuteril e submetidas a centrifugaccedilatildeo
nas condiccedilotildees acima O sedimento celular foi ressuspendido em 2 ml de tampatildeo de
eletroporaccedilatildeo Em cubetas de eletroporaccedilatildeo previamente resfriadas a 4 degC foram
misturados 400 μL (2 x 108 ceacutelulas) da suspensatildeo dos parasitas e 50 μL (20 microg) do
plasmiacutedeo para superexpressatildeo (pNEO_KAP7_3XFLAG) Em paralelo parasitas
foram submetidos agraves mesmas condiccedilotildees mas na ausecircncia de DNA (controle
negativo da transfecccedilatildeo)
As cubetas foram entatildeo mantidas em gelo por 10 min Em seguida os
parasitas foram transfectados com dois pulsos sequenciais de 500 μF e 450 volts
Apoacutes o esse procedimento as cubetas foram mantidas em gelo por mais 5 min A
suspensatildeo de parasitas transfectados foi entatildeo inoculada em 10 mL de meio LIT
suplementado com 10000 U de penicilina e estreptomicina a 10 μgmL
3213 Seleccedilatildeo dos transfectantes
O gene para a enzima neomicina fosfotransferase foi utilizado como
marcador de seleccedilatildeo dos parasitas carregando o plasmiacutedeo para a superexpressatildeo
pNEO_KAP7_3XFLAG Para tanto o antibioacutetico G418 foi adicionado agraves culturas
apoacutes 24 h da transfecccedilatildeo na concentraccedilatildeo final de 500 μgmL Entre 3 e 4 dias apoacutes
a transfecccedilatildeo foi realizada a primeira passagem (14) A partir desse ponto foram
feitas passagens semanais na proporccedilatildeo de 110 ateacute que natildeo fosse observado
crescimento nas duas uacuteltimas passagens da cultura do controle negativo da
transfecccedilatildeo
A expressatildeo da proteiacutena KAP7-FLAG foi analisada atraveacutes de ensaios de
western blot e imunofluorescecircncia
53
322 Deleccedilatildeo do gene TcKAP7 por nocaute gecircnico
3221 Amplificaccedilatildeo e clonagem das regiotildees a montante e a jusante do gene
TcKAP7
As regiotildees a montante (upstream) e a jusante (downstream) do gene TcKAP7
respectivamente denominadas de UPSKAP7 (521 pb) e DOWNKAP7 (500 pb)
foram amplificadas por PCR usando os primers descritos nas TABELAS 1 E 2 A
regiatildeo denominada DOWNKAP7 conteacutem ainda 139 pb do final da regiatildeo codante de
TcKAP7
QUADRO 1 - RELACcedilAtildeO DOS PRIMERS UTILIZADOS PARA A CLONAGEM DA
REGIAtildeO UPSTREAM DE TcKAP7 NO VETOR pNEO1
UPSKAP7F GGGGTCGACCGTTGCTGGTTTTTCTTTTGGTGT
UPSKAP7R GGGAAGCTTGCTTCAAAACGTCTATGCGGGC
Os siacutetios das enzimas de restriccedilatildeo SalI (GTCGAC) e HindIII (AAGCTT) adicionados aos primers estatildeo em negrito
QUADRO 2 - RELACcedilAtildeO DOS PRIMERS UTILIZADOS PARA A CLONAGEM DA
REGIAtildeO DOWNSTREAM DE TcKAP7 NO VETOR pNEO1
DOWNKAP7F GGGGAATTCGCCTCATATGACGCATCTCCCA
DOWNKAP7R GGGGGATCCTGTTGGCGCTGTCAAGGAAGTAAG
Os siacutetios das enzimas de restriccedilatildeo EcoRI (GAATTC) e BamHI (GGATCC) adicionados aos primers estatildeo em negrito
As reaccedilotildees de PCR foram realizadas nas seguintes condiccedilotildees 100 ng de
DNA total de T cruzi Dm28c 10 pmol dos oligonucleotiacutedeos F e R 200 μM de cada
dNTP MgCl2 15 mM tampatildeo Taq DNA polimerase 1x 25 unidades de Taq DNA
polimerase (Invitrogen EUA) A reaccedilatildeo de PCR foi processada no termociclador
modelo 9700 (Applied Biosystems EUA) nas seguintes condiccedilotildees Desnaturaccedilatildeo do
54
material por 4 min a 94 degC seguida de 35 ciclos de desnaturaccedilatildeo a 92 degC por 30 s
hibridizaccedilatildeo dos oligonucleotiacutedeos a 56 degC por 30 s e extensatildeo a 72 degC por 1 min O
material amplificado foi purificado usando o Qiaquick PCR Purification (Qiagen) O
DNA purificado foi digerido com enzimas de restriccedilatildeo apropriadas para a clonagem
dos fragmentos nos vetores pNEO1 O plasmiacutedeo resultante da clonagem das
regiotildees UPSKAP7 e DOWNKAP7 foi denominado de pNEO1kap7 (Figura 11A)
Uma vez que o genoma do T cruzi eacute diploide construiacutemos um segundo
plasmiacutedeo para o nocaute do segundo alelo do gene TcKAP7 tendo como marca de
seleccedilatildeo o gene que codifica resistecircncia a higromicina B Esse plasmiacutedeo foi
construiacutedo usando como molde o plasmiacutedeo pNEO1kap7 O plasmiacutedeo pNEO1kap7
foi digerido com HindIII para remoccedilatildeo do gene neo e uma pequena porccedilatildeo da regiatildeo
DOWNSTREAM (220 pb) O plasmiacutedeo linearizado foi purificado do gel de agarose
usando o kit Qiaquick PCR Purification (Qiagen) e ligado com o gene higro O gene
higro foi amplificado usando os primers HIGROF
(GGGGGAAGCTTATGAAAAAGCCTGAACTCACCGCGAC) e HIGROR
(GGGAAGCTTCTATTCCTTTGCCCTCGGACGAGTGCTG) ambos contendo na
extremidade 5rsquo o siacutetio para a enzima de restriccedilatildeo HindIII (em negrito) O plasmiacutedeo
resultante da ligaccedilatildeo foi denominado de pHIGRO1kap7 (FIGURA 11B)
55
FIGURA 11 ESQUEMA DA CONSTRUCcedilAtildeO DOS VETORES UTILIZADOS PARA O NOCAUTE DO GENE TcKAP7 LEGENDA Nesta figura eacute observada a inserccedilatildeo das sequecircncias flanqueadoras do gene TcKAP7 juntamente com os respectivos siacutetios para cada enzima de restriccedilatildeo nos vetores de clonagem pNEO1 e pHIGRO1
3222 Amplificaccedilatildeo dos cassetes UPS-NEO-DOWN e UPS-HIGRO-DOWN para
transfecccedilatildeo de T cruzi
Os dois plasmiacutedeos recombinantes foram purificados pelo meacutetodo da lise
alcalina utilizando o kit de minipreparaccedilatildeo de plasmiacutedeos (Qiagen) As minipreps
foram utilizadas para a amplificaccedilatildeo da regiatildeo UPS-NEO-DOWN (cassete NEO) e da
regiatildeo UPS-HIGRO-DOWN (cassete HYG) por PCR usando os primers UPSKAP7F
e DOWNKAP7R As reaccedilotildees de PCR foram realizadas nas seguintes condiccedilotildees 20
ng do plasmiacutedeo pNEO1kap7 ou pHIGRO1kap7 10 pmol dos primers UPSKAP7F e
DOWNKAP7R 200 μM de cada dNTP MgCl2 15 mM tampatildeo Taq DNA polimerase
1x 25 unidades de Taq DNA polimerase (Invitrogen EUA) A reaccedilatildeo de PCR foi
processada no termociclador modelo 9700 (AppliedBiosystems EUA) nas seguintes
condiccedilotildees Desnaturaccedilatildeo do material por 4 min a 94 degC seguida de 35 ciclos de
desnaturaccedilatildeo a 92 degC por 30 s hibridizaccedilatildeo dos oligonucleotiacutedeos a 56 degC por 30 s e
56
extensatildeo a 68 degC por 2 min O material amplificado foi submetido agrave eletroforese em
gel preparativo de agarose 1 O gel foi corado com brometo de etiacutedeo (1 μgml) e a
banda correspondente a cada cassete foi removida do gel com auxiacutelio de uma
lacircmina de bisturi O DNA foi purificado por eletroeluiccedilatildeo dentro de saco de diaacutelise
nas condiccedilotildees de 100 V por 1 hora em tampatildeo TBE Para obter massa de DNA
suficiente para a transfecccedilatildeo (20 μg) foram feitas 10 reaccedilotildees de PCR com 100 μl
cada uma
3223 Transfecccedilatildeo do T cruzi com o cassete UPS-NEO-DOWN
Formas epimastigotas de T cruzi foram cultivadas em meio LIT ateacute 2 x 107
ceacutelulasml Os parasitas (1 x 108 ceacutelulas) foram coletados por centrifugaccedilatildeo a 6000
x g por 10 min a 4 degC O sedimento celular foi lavado com PBS esteacuteril e
ressuspendido em 1 ml de soluccedilatildeo de eletroporaccedilatildeo Volumes correspondentes a
04 ml da suspensatildeo de ceacutelulas foram transferidos para cubetas de eletroporaccedilatildeo
esteacutereis (02 cm de gap) (BioRad) e preacute-resfriadas Em uma delas foram adicionados
de 20 μg do fragmento representando o cassete NEO A outra cubeta contendo
apenas a suspensatildeo de parasitas foi usada como controle Apoacutes 10 minutos no gelo
as amostras contidas nas cubetas foram submetidas a 2 pulsos de 450 volts 500
microF utilizando o eletroporadorGenePulserreg IIApparatus (Bio-Rad) As amostras
foram incubadas novamente por 5 a 10 minutos no gelo em seguida foram
transferidas para garrafas de cultura de 25 cm2 contendo 10 ml de meio LIT
(suplementado com 10000 U de penicilina e estreptomicina a 10 mgml) As culturas
foram entatildeo incubadas a 28 degC Apoacutes 24 horas de incubaccedilatildeo adicionou-se o
antibioacutetico G418 na concentraccedilatildeo de 500 μgml As culturas foram mantidas por
sucessivas passagens (diluiccedilatildeo de 110) em meio LIT suplementado com G418 a
cada 8-10 dias ateacute a ausecircncia de proliferaccedilatildeo celular na cultura controle Os
parasitas nos quais TcKAP7 foi substituiacutedo pelo gene neo foram denominados deT
cruzi(kap7kap7neo) e foram testados para a correta inserccedilatildeo do gene neo no locus
genocircmico de TcKAP7
57
3224 Extraccedilatildeo de DNA dos transfectantes
T cruzi transfectado com o cassete NEO (T cruzi(kap7kap7neo) foi cultivado
em meio LIT suplementado com G418 (500 μgml) ateacute uma densidade de 3 x 107
ceacutelulasml Os parasitas foram coletados por centrifugaccedilatildeo por 1 min a 6000 x g e
lavados com PBS Em seguida os parasitas foram lisados gentilmente em 350 μl de
tampatildeo TELT conforme descrito no item 34
3225 Anaacutelise por PCR do DNA dos parasitas transfectados com o cassete
UPS-NEO-DOWN
As reaccedilotildees de PCR foram realizadas utilizando primers externos EXTF
(CCCGCTACGACTGCCCTCCACGCGGAAGGGAA) e EXTR
(AAGTAAACGGGAGAAGCAACACGATGGGAGGCTC) que natildeo estatildeo presentes na
construccedilatildeo do cassete UPS-NEO-DOWN combinados com os primers NEOF
(GGGGAAGCTTATGATTGAACAAGATGGATTGCACGCAG) e NEOR
(GGGGGAATTCAGAAGAACTCGTCAAGAAGGCGATAGAA)
As condiccedilotildees das reaccedilotildees foram as seguintes 100 ng do DNA total de T
cruzi Dm28c tipo selvagem (T cruzi(kap7kap7) ou tipo selvagem) ou do DNA da
populaccedilatildeo T cruzi(kap7kap7neo) (mutante simples nocaute) 10 pmol dos primers EXTF
+ NEOR e NEOF + EXTR 200 μM de cada dNTP MgCl2 15 mM tampatildeo Taq DNA
polimerase 1x 25 unidades de Taq DNA polimerase (Invitrogen EUA) A reaccedilatildeo de
PCR foi processada no termociclador modelo 9700 (AppliedBiosystems EUA) nas
seguintes condiccedilotildees Desnaturaccedilatildeo do material por 4 min a 94 degC seguida de 35
ciclos de desnaturaccedilatildeo a 92 degC por 30 s hibridizaccedilatildeo dos oligonucleotiacutedeos a 55 degC
por 30 s e extensatildeo a 72 degC por 2 min
3226 Transfecccedilatildeo do T cruzi com o cassete UPS-HIGRO-DOWN
Formas epimastigotas da populaccedilatildeo mutante de T cruzi (kap7kap7neo) foram
cultivadas em meio LIT suplementado com G418 (500 μgml) ateacute a densidade de 2 x
107 ceacutelulasml Os parasitas (1 x 108 ceacutelulas) foram coletados por centrifugaccedilatildeo a
6000 x g por 10 min a 4 degC e submetidos ao processo de eletroporaccedilatildeo como
descrito no item 3202 Para a transfecccedilatildeo foram usados 20 μg do fragmento
58
representando o cassete UPS-HIGRO-DOWN As culturas (transfectada e controle)
foram entatildeo incubadas a 28 degC em LIT suplementado de G418 Apoacutes 24 horas de
incubaccedilatildeo foi adicionado o antibioacutetico higromicina ao meio de cultura na
concentraccedilatildeo de 500 μgml As culturas foram mantidas por sucessivas passagens
(diluiccedilatildeo de 110) em meio LIT suplementado com G418 e higromicina a cada 8-10
dias ateacute a ausecircncia de proliferaccedilatildeo celular na cultura controle Mutantes nos quais
os dois alelos de TcKAP7 foram removidos e substituiacutedos pelos genes NEO e
HIGRO foram denominados com genoacutetipo T cruzi (kap7neokap7higro)
3227 Anaacutelise por PCR do DNA dos parasitas transfectados com o cassete
UPS-HIGRO-DOWN
As reaccedilotildees de PCR foram realizadas utilizando primers externos EXTF e
EXTR (item 3225) combinados com os primers HIGROF e HIGROR (item 3221)
As reaccedilotildees de PCR foram realizadas nas seguintes condiccedilotildees 100 ng do
DNA total de T cruzi(kap7kap7) ou do DNA do T cruzi(kap7neokap7higro) 10 pmol dos
primers EXTF + HIGROR e HIGROF + EXTR 200 μM de cada dNTP MgCl2 15
mM tampatildeo Taq DNA polimerase 1x 25 unidades de Taq DNA polimerase
(Invitrogen EUA) A reaccedilatildeo de PCR foi processada no termociclador modelo 9700
(Applied Biosystems EUA) nas seguintes condiccedilotildees Desnaturaccedilatildeo do material por
4 min a 94 degC seguida de 35 ciclos de desnaturaccedilatildeo a 92 degC por 30 s hibridizaccedilatildeo
dos oligonucleotiacutedeos a 55 degC por 30 s e extensatildeo a 72 degC por 2 min
3228 Anaacutelise da organizaccedilatildeo do gene TcKAP7 e da eficiecircncia de seu nocaute
atraveacutes de ensaio do tipo Southern blot
O DNA genocircmico (5 μg) de T cruzikap7kap7 e T cruzikap7neokap7higro foi
submetido a digestatildeo com a enzima de restriccedilatildeo HindIII de acordo com as
especificaccedilotildees do fornecedor Apoacutes 3 horas o DNA digerido foi submetido agrave
eletroforese em gel de agarose 08 em tampatildeo TBE a 100 V O gel foi corado por
brometo de etiacutedio (05 μgmL) e fotografado sob a luz ultravioleta (310 nm)
Posteriormente o gel foi tratado com soluccedilotildees de depurinaccedilatildeo por 15 minutos de
desnaturaccedilatildeo por 30 minutos (2 vezes) e soluccedilatildeo de neutralizaccedilatildeo por 30 minutos (2
vezes) O DNA foi transferido para uma membrana de nylon (Hybond N
59
AmershamBiosciences) por capilaridade (SAMBROOK et al 1989) utilizando-se de
uma ldquoponterdquo de papel 3 MM embebido em SSC 20X Apoacutes a transferecircncia o DNA foi
fixado agrave membrana por exposiccedilatildeo agrave luz ultravioleta com uma dose de 120 mJcm2
usando o aparelho Spectrolinker (Spectronicscorp USA) A membrana contendo o
DNA de T cruzi foi preacute-hibridizada em soluccedilatildeo de hibridizaccedilatildeo de DNA por 1 hora a
65 ordmC seguido da adiccedilatildeo da sonda marcada radioativamente com α-[P32
]-dCTP (10
μCiμl 3000 Cimmol) (Amersham Biosciences) preparada segundo meacutetodo de nick
translation descrito por Rigbyet al (1977) utilizando-se o meacutetodo de iniciaccedilatildeo por
random primers (Megaprimer DNA labeling kit ndash GE) conforme recomendaccedilotildees do
fabricante
Foram utilizadas 3 sondas satildeo elas fragmento do gene TcKAP7
correspondendo a regiatildeo compreendida entre os nucleotiacutedeos 1 e 560 o gene neo e
o gene higro Apoacutes a marcaccedilatildeo as sondas foram purificadas em colunas de
Sephadex G-50 (ProbeQuant ndash Amersham Biosciences) e adicionadas ao tampatildeo de
hibridizaccedilatildeo na concentraccedilatildeo de 5 x 106
cpmml As membranas foram incubadas
por 16 horas a 65 C e em seguida lavadas nesta temperatura duas vezes por 30
minutos com soluccedilotildees de alta meacutedia e baixa estringecircncia As membranas foram
expostas a filme de raio-X (Hyperfilmreg Amersham Biosciences) na presenccedila de tela
intensificadora (Dupont Cronex Lightining Plus) por tempo que varia entre 1 a 3 dias
a ndash70 C
323 Localizaccedilatildeo celular da proteiacutena TcKAP7 atraveacutes de ensaio de
imunofluorescecircncia
Formas epimastigotas de T cruzi foram coletadas por centrifugaccedilatildeo (4000 times
g 3 a 10 ordmC) lavadas duas vezes em PBS e depositadas sobre lacircminas de vidro
previamente tratadas com poli-L-lisina 001 diluiacuteda em PBS Os parasitas foram
entatildeo fixados com paraformaldeiacutedo 4 em PBS permeabilizados com Triton X-100
01 em PBS por 2 min agrave temperatura ambiente e incubados a 4ordmC durante 16 h
em soluccedilatildeo de bloqueio para imunofluorescecircncia (PBS 1X + BSA 1 ) Apoacutes o
bloqueio os parasitas foram incubados agrave temperatura ambiente por 1 h com o
anticorpo monoclonal anti-FLAG em uma diluiccedilatildeo de 11000 em soluccedilatildeo de bloqueio
para imunofluorescecircncia Depois disso as lacircminas foram submetidas a 5 lavagens
60
de 5 min cada em PBS Em seguida os parasitas foram incubados agrave temperatura
ambiente por 1 hora com o anticorpo secundaacuterio anti-IgG de camundongo conjugado
ao fluoroacuteforo Alexa Fluacuteor 488 (Invitrogen) diluiacutedo 1600 em soluccedilatildeo de bloqueio As
lacircminas foram lavadas 5 vezes com PBS e posteriormente incubadas com o corante
Hoechst 33342 (Invitrogen) a 2 μgμL em PBS por 5 min Apoacutes cinco lavagens com
PBS as lacircminas foram montadas com ProLong Gold Antifade (Invitrogen) sobre uma
lacircmina de microscopia oacutetica O material foi observado nos microscoacutepios Leica SP5 e
DMI6000
324 Anaacutelise da ultraestrutura do cinetoplasto do mutante de T cruzi para
TcKAP7 por microscopia eletrocircnica de transmissatildeo
Os parasitas foram coletados lavados com PBS e fixados em soluccedilatildeo
contendo 25 de glutaraldeiacutedo 4 de paraformaldeiacutedo e tampatildeo cacodilato 01 M
Em seguida os parasitas foram fixados por 1 h em soluccedilatildeo de 1 de tetroacutexido de
Oacutesmio e 08 de ferricianeto de potaacutessio diluiacutedos em tampatildeo cacodilato 01 M As
ceacutelulas foram entatildeo desidratadas em soluccedilatildeo contendo concentraccedilotildees crescentes
de acetona e incluiacutedas em Epon Apoacutes a obtenccedilatildeo de cortes ultrafinos dos parasitas
os mesmos foram contrastados em acetato de uranila e citrato de Chumbo antes de
serem observados e fotografados no microscoacutepio eletrocircnico de transmissatildeo Zeiss
900
325 Coloraccedilatildeo dos parasitas transfectados
A coloraccedilatildeo dos parasitas foi realizada pelo meacutetodo panoacutetico raacutepido
(Laborclin Pinhais Paranaacute Brasil) modificado
Formas epimastigotas do mutante de T cruzi para TcKAP7 foram cultivadas
como descrito no item 321 Os parasitas foram coletados por centrifugaccedilatildeo de 1
min a 4000 x g e ressuspensos em PBS Desta suspensatildeo uma gota foi retirada e
depositada sobre lacircminas previamente limpas Quando secas as lacircminas foram
imersas individualmente na Soluccedilatildeo 1 (Fixador) Soluccedilatildeo 2 (Revelador) e Soluccedilatildeo 3
(Corante) em cada uma por 30 s Apoacutes este processo as lacircminas foram lavadas em
aacutegua corrente secas agrave temperatura ambiente e cobertas com Permount e lamiacutenula
Os parasitas foram visualizados em microscoacutepio Nikon E600
61
326 Infecccedilatildeo de ceacutelulas Vero com o mutante de T cruzi para TcKAP7
Ceacutelulas Vero (ATCCreg Nuacutemero CRL-2783trade) foram cultivadas em garrafas
de 150 cm2 contendo meio RPMI suplementado com 5 de soro fetal bovino
(GIBCO) penicilina 100 UIml streptomicina 10 microgml e glutamina 2 mM a 37 o C
com 5 de CO2 Ao atingirem a confluecircncia (80 a 100) realizou-se a passagem
atraveacutes de tripsinizaccedilatildeo e foi feito um inoacuteculo de 1 x 107 ceacutelulas para cada nova
garrafa de 150 cm2 Apoacutes 24 horas estas ceacutelulas (50 ndash 70 de confluecircncia) foram
infectadas com formas metaciacuteclicas obtidas da diferenciaccedilatildeo do mutante de T cruzi
para TcKAP7 em microplacas de 24 poccedilos contendo lamiacutenulas de vidro com
diacircmetro de 13 mm A cada poccedilo foram adicionadas 2 x 104 ceacutelulas Vero Apoacutes 24
horas de cultivo as ceacutelulas foram infectadas com tripomastigotas metaciacuteclicos
(obtidos do sobrenadante das culturas de T cruzi diferenciados em meio TAU3AAG
sem purificaccedilatildeo na coluna de DEAE celulose) A infecccedilatildeo das ceacutelulas Vero foi
acompanhada diariamente por microscopia de contraste de fase
327 Anaacutelise da funccedilatildeo do gene TbKAP7 de Trypanosoma brucei atraveacutes de
ensaios de RNA de interferecircncia
Com o intuito de complementar os estudos da funccedilatildeo do gene TcKAP7 foi
utilizada a teacutecnica de RNA de interferecircncia O uso dessa metodologia compreende
uma abordagem alternativa agrave anaacutelise da funccedilatildeo gecircnica para genes ortoacutelogos deT
brucei por anaacutelises de RNAi uma vez que a maquinaria de RNAi em T cruzi eacute
inexistente (DA ROCHA et al 2003) Os resultados podem gerar evidecircncias que
estejam relacionadas agrave funcionalidade dos genes em T cruzi Esta abordagem foi
utilizada neste trabalho para auxiliar no estudo da funccedilatildeo do gene TcKAP7 a partir
do ortoacutelogo em T brucei ainda natildeo caracterizadoTbKAP7 Os ensaios de RNAi
foram realizados em T brucei cepa 29-13 (WIRTZ et al 1999) com sistema induzido
por tetraciclina utilizando o vetor p2T7-177 ilustrado na figura 12 Este vetor quando
transfectado no parasita integra-se aos minicromossomos do T brucei regiatildeo de
repeticcedilotildees 177 (FOLDYNOVA-TRANTIRKOVA et al 2005)
62
FIGURA 12 MAPA DO VETOR p2T7-177 UTILIZADO PARA ENSAIOS DE RNAi LEGENDA T7 prom Promotor de T7 RNA Polimerase induzido por tetraciclina T7 term Terminador de transcriccedilatildeo 177 Sequumlecircncia repetitiva de 177 pares de bases para alvo de inserccedilatildeo em minicromossomos BLEO gene de resistecircncia agrave fleomicina GFP Proteiacutena Green FluorescentProtein os siacutetios para as enzimas de restriccedilatildeo estatildeo indicados AmpR gene de resistecircncia agrave ampicilina (FONTE WICKSTEAD et al 2002)
As regiotildees do mRNA para alvos nos ensaios de RNAi foram escolhidas com
o auxiacutelio da ferramenta RNAit da base de dados do Trypanofan - Genocircmica
funcional de Tbrucei (httptrypanofanpathcamacuktrypanofanmain)
(REDMOND et al 2003) Essas regiotildees foram amplificadas por PCR usando como
molde o DNA total de T brucei (100 ngreaccedilatildeo) 10 pmol dos primers listados na
tabela 3 200 mM de cada dNTP 15 mM de MgCl2 tampatildeo Taq DNA polimerase 1x
63
(Invitrogen) e 25 unidades de Taq DNA polimerase (Invitrogen) A reaccedilatildeo foi
aquecida por 4 min a 94 degC e entatildeo submetida a 35 ciclos de desnaturaccedilatildeo a 94 degC
por 30 s anelamento a 55 degC por 30 s e extensatildeo a 72 degC por 1 min Os primers
utilizados apresentam siacutetio para as enzimas de restriccedilatildeo BamHI (F) ou HindIII (R)
Os produtos de PCR foram purificados por extraccedilatildeo com fenol-clorofoacutermio e
digeridos com as referentes enzimas
QUADRO 3 - RELACcedilAtildeO DOS PRIMERS UTILIZADOS PARA A AMPLIFICACcedilAtildeO DO
GENE TbKAP7
KAP7RNAiF
AAAGGATCCCTAACCTAACCTGCAGGGTCTCTCG
KAP7RNAiR
GCGAAGCTTTTGTTCCTTTACAAACGCCC
Os siacutetios das enzimas de restriccedilatildeo BamHI (GGATCC) e HindIII (AAGCTT) adicionados aos primers estatildeo em negrito
As clonagens foram confirmadas por PCR de colocircnia e os plasmiacutedeos foram
purificados pelo kit QIAprep Spin Miniprep (Qiagen) Apoacutes purificaccedilatildeo 10 μg dos
plasmiacutedeos foram linearizados com a enzima NotI conforme descrito pelo fabricante
O DNA foi precipitado e ressuspenso em 50 μl de meio de eletroporaccedilatildeo ZPFM para
transfecccedilatildeo do T brucei
Para cada transfecccedilatildeo foi utilizado um total de 4 x 107parasitas em fase logariacutetmica
de crescimento Os parasitas foram obtidos por centrifugaccedilatildeo (5000 x g por 10 min
a 4 degC) lavados em meio ZPFM e ressuspensos em 500 μl do mesmo meio A
transfecccedilatildeo foi feita em cubetas de eletroporaccedilatildeo (4 mm) usando o eletroporador da
BioRad (GenePulser II Electroporator) As condiccedilotildees utilizadas foram dois pulsos de
1600 V e 25 microF Os parasitas foram entatildeo transferidos para garrafas contendo meio
SDM-79 SFB 10 higromicina 50 μgml e G418 15 μgml A seleccedilatildeo dos parasitas
transfectados foi atraveacutes da adiccedilatildeo de 5μgmL de fleomicina resistecircncia conferida
pelo vetor p2T7-177 apoacutes 24 horas de cultivo O tempo para seleccedilatildeo foi entre duas
e trecircs semanas
64
3271 Induccedilatildeo do RNA dupla fita
A induccedilatildeo da expressatildeo de RNA dupla fita referente agrave porccedilatildeo do gene
TbKAP7 clonado no plasmiacutedeo p2T7-177 deu-se pela adiccedilatildeo de tetraciclina 2 μgml
a uma cultura transfectada de T brucei em fase de crescimento exponencial (~2 x
106 parasitasml) Nos dias que se seguiram 1μgml de tetraciclina foi adicionada
diariamente agraves culturas A observaccedilatildeo dos efeitos na curva de crescimento causada
por RNAi em T brucei foi realizada ao longo de uma semana com a contagem de
ceacutelulas e adiccedilatildeo diaacuteria de tetraciclina 1 μgml
65
4 RESULTADOS
41 Clonagem e caracterizaccedilatildeo do gene TcKAP7
A regiatildeo codificante do gene TcKAP7 (ID Tc00104705350871950) foi
obtida a partir do banco de dados do genoma do T cruzi disponiacutevel no portal da
internet wwwgenedborg e amplificada por PCR com os primers descritos no item
37
No genoma do T cruzi cepa CL Brener (EL-SAYED et al 2005) foram
identificados dois haploacutetipos do gene TcKAP7 que foram denominados neste
trabalho de haploacutetipo A (Tc00104705350871950) e haploacutetipo B
(Tc00104705350979320) Neste trabalho foi utilizado o gene TcKAP7 proveniente
da cepa Dm28c de T cruzi Este gene apresenta uma regiatildeo codante de 747 pb e
codifica uma proteiacutena de 276 kDa assumindo que o primeiro ATG apoacutes a sequecircncia
do mini-eacutexon seja usada na iniciaccedilatildeo da traduccedilatildeo
A figura 13 abaixo mostra o alinhamento de TcKAP7 das cepas CL Brener e
Dm28c
FIGURA 13 - COMPARACcedilAtildeO ENTRE AS SEQUumlEcircNCIAS DE AMINOAacuteCIDOS DEDUZIDAS DO GENE KAP7 DE T cruzi Dm28C E DOS HAPLOacuteTIPOS DE CL BRENER
LEGENDA As posiccedilotildees com aminoaacutecidos idecircnticos em todas as sequumlecircncias estatildeo coloridas em preto
66
Embora o gene TcKAP7 natildeo possua grande identidade com os com genes
ortoacutelogos em Trypanosoma brucei TbKAP7 (714 pb) (Tb106k151470) Leishmania
major LmKAP7 (1044 pb) (LMJF_36_5840) Leishmania infantum LiKAP7 (1044 pb)
(LINJ_36_6090) e Leishmania braziliensis LbKAP7 (1038 pb) (LBRM_35_0010)
cujos genomas tambeacutem foram sequumlenciados (BERRIMAN et al 2005 IVENS et al
2005 PEACOCK et al 2007) as sequecircncias de aminoaacutecidos das respectivas
proteiacutenas deduzidas a partir desses genes ainda compartilham certo grau de
similaridade entre si (FIGURA 14) Na tabela 4 pode-se visualizar o percentual de
identidade entre as proteiacutenas KAP7 dos tripanossomatiacutedeos que possuem o genoma
sequenciado
FIGURA 14 COMPARACcedilAtildeO ENTRE AS SEQUumlEcircNCIAS DE AMINOAacuteCIDOS DEDUZIDAS DO GENE KAP7 EM DIFERENTES TRIPANOSOMATIacuteDEOS LEGENDA Em preto encontram-se os resiacuteduos de aminoaacutecidos idecircnticos em todas as sequumlecircncias e em cinza os resiacuteduos conservados na maioria delas
67
QUADRO 4 - PERCENTUAL DE IDENTIDADE ENTRE AS PROTEIacuteNAS KAP7 NOS
TRIPANOSSOMATIacuteDEOS COM O GENOMA SEQUENCIADO
Os valores foram obtidos pelo alinhamento utilizando a ferramenta Clustal21
Mesmo apresentando pouca identidade e variaccedilatildeo de tamanho alguns
dados do genoma sugerem que esses genes satildeo ortoacutelogos entre si Pode-se
perceber uma sintenia entre seus loci nas vaacuterias espeacutecies de tripanosomatiacutedeos
(Cavalcanti et al 2009) (FIGURA 15)
FIGURA 15- SINTENIA DE TcKAP7 COM OUTROS TRIPANOSOMATIacuteDEOS LEGENDA Os dois contigs de TcKAP7 (TcA e TcB) estatildeo representados nesta figura juntamente com os contigs de outros tripanosomatiacutedeos (Tb= T brucei Lm= L major Li= L infantum e Lb= L brasiliensis) mostrando que KAP7 representado pela cor amarela apresenta uma sintenia entre seus loci em todas as espeacutecies mostradas sendo flanqueado pelo gene KAP4 em T cruzi e T brucei representado em azul Portanto em L majorL infantum eL brasiliensis ao lado direito de KAP7 estaacute o gene de uma proteiacutena hipoteacutetica representado pela cor vermelha e ao lado esquerdo encontra-se o gene da KAP4 representado em azul como mencionado anteriormente FONTE CAVALCANTI et al 2009
68
A expressatildeo de vaacuterios genes mitocondriais de C fasciculata e L major eacute
regulada durante o ciclo celular em parte por uma sequumlecircncia consenso
[(CA)AUAGAA(GA)] presente nas regiotildees 5rsquo e 3rsquo-UTR dos respectivos mRNAs
(BROWN amp RAY 1997 MAHMOOD et al 1999 MAHMOOD amp RAY 1998 PASION
et al 1996 ZICK et al 2005)
Assim resolvemos caracterizar a regiatildeo 5rsquo-UTR do transcrito TcKAP7 na
tentativa de identificar sinais com identidade com aqueles encontrados em C
fasciculata Na figura 16 estaacute representada a regiatildeo 5rsquo-UTR do transcrito TcKAP7
com a sequumlecircncia parcial do mini-exon proveniente do primer usado na teacutecnica de
RT-PCR bem como parte da regiatildeo codificante do gene O mini-exon estaacute situado a
129 bases a jusante do iniacutecio da regiatildeo codificante do transcrito TcKAP7 e define
portanto uma regiatildeo 5rsquo-UTR de 168 bases considerando que o tamanho do mini-
exon eacute de 39 bases A anaacutelise da regiatildeo 5rsquo-UTR mostrou um elemento com
caracteriacutesticas muito semelhantes aquele envolvido na regulaccedilatildeo de genes em C
fasciculata (sequencia (G)ATAGAA(G) mostrada no retacircngulo preto na FIGURA
16B) sugerindo que TcKAP7 seja regulada durante o ciclo celular
69
A
B
FIGURA 16 CARACTERIZACcedilAtildeO DA REGIAtildeO 5rsquo-UTR DO TRANSCRITO TcKAP7 LEGENDA A Esquema geral da localizaccedilatildeo do mini-exon de TcKAP7 e B Localizaccedilatildeo especiacutefica do mini-exon de TcKAP7 O mini-exon de TcKAP7 (sequecircncia parcial em verde) estaacute localizado a 129 pb da regiatildeo codante (representada em parte pela cor azul) A regiatildeo 5rsquoUTR do transcrito Tckap7 estaacute representada na cor rosa A possiacutevel sequencia consenso de regulaccedilatildeo durante o ciclo celular estaacute indicada no retacircngulo preto
42 Expressatildeo da proteiacutena TcKAP7 em T cruzi
Formas epimastigotas foram transfectadas com o plasmiacutedeo pNEO3XFLAG
contendo o gene TcKAP7 (pNEO_KAP7_3xFLAG) A expressatildeo da proteiacutena
TcKAP7-FLAG foi analisada por ensaio de western blot Os resultados mostraram
que a expressatildeo da proteiacutena TcKAP7-FLAG foi satisfatoacuteria correspondendo ao
tamanho esperado (FIGURA 17 ) a qual foi confirmada pela reatividade do anticorpo
monoclonal especiacutefico para as etiquetas FLAG (anti-FLAG)
70
FIGURA 17 ANAacuteLISE DA EXPRESSAtildeO DA PROTEIacuteNA DE FUSAtildeO TCKAP7-FLAG EM FORMAS EPIMASTIGOTAS DE T CRUZI
43 Localizaccedilatildeo celular de TcKAP7 atraveacutes de ensaio de imunofluorescecircncia
Para verificar a localizaccedilatildeo celular de TcKAP7 foi realizado o ensaio de
imunofluorescecircncia Como natildeo foi possiacutevel a obtenccedilatildeo do anticorpo com alto tiacutetulo
contra a proteiacutena recombinante TcKAP7 neste ensaio foi utilizado o anticorpo
monoclonal anti-FLAG que reconhece a etiqueta FLAG a qual estaacute fusionada a
proteiacutena TcKAP7
Nessa figura pode-se observar que a proteiacutena de fusatildeo acumula-se na regiatildeo
dos poacutelos do cinetoplasto das formas epimastigotas do T cruzi (FIGURA 18)
indicando que TcKAP7 uma proteiacutena tipo histona H1 estaacute realmente associada com
o kDNA do parasita
71
FIGURA 18 IMUNOLOCALIZACcedilAtildeO DE TcKAP7 EM EPIMASTIGOTAS DE T CRUZI LEGENDAA contraste interferencial diferencial (DIC) B Hoechst marcando o nuacutecleo e o
cinetoplasto C fluorescecircncia mostrando a localizaccedilatildeo de TcKAP7 mais intensa na regiatildeo dos poacutelos
docinetoplasto dos protozoaacuterios D Aumento de C
44 Deleccedilatildeo do gene TcKAP7 por nocaute gecircnico
As teacutecnicas que permitem a remoccedilatildeo de um gene e sua substituiccedilatildeo por
genes repoacuterteres atraveacutes do processo de recombinaccedilatildeo tecircm sido usadas com
sucesso para verificaccedilatildeo da funccedilatildeo gecircnica em tripanosomatiacutedeos (MACRAE et al
2006) O nocaute gecircnico consiste na inserccedilatildeo de marcadores geneacuteticos de seleccedilatildeo
(gene codificando resistecircncia a neomicina ou higromicina entre outros) flanqueados
por sequumlecircncias pertencentes ao locus cromossocircmico de interesse Atraveacutes do
processo de recombinaccedilatildeo homoacuteloga o marcador pode entatildeo substituir o gene que
se quer estudar Desse modo pode ser possiacutevel analisar a funccedilatildeo de determinado
gene atraveacutes das alteraccedilotildees - decorrentes de sua ausecircncia - na fisiologia do
parasita No presente estudo os genes repoacuterteres que codificam resistecircncia aos
72
antibioacuteticos G418 e higromicina foram flanqueados por sequumlecircncias a montante e a
jusante da regiatildeo codificante do gene TcKAP7 As construccedilotildees foram usadas para
transfectarT cruzi e gerar mutantes para o gene TcKAP7 a fim de se estudar o
efeito que a ausecircncia do gene TcKAP7 causa no metabolismo do parasita
Apoacutes obtenccedilatildeo de uma populaccedilatildeo de T cruzi mutante para o gene TcKAP7
(kap7neokap7higro) resistente a ambos antibioacuteticos G418 e higromicina B o
DNA desta populaccedilatildeo foi extraiacutedo para anaacutelise por PCR e Southern blot a fim de
confirmar a eficiecircncia do nocaute
441 Anaacutelise por PCR do DNA dos parasitas transfectados com os cassetes
UPS-NEO-DOWN e UPS-HIGRO-DOWN
Foram realizadas vaacuterias reaccedilotildees de PCR a fim de confirmar a deleccedilatildeo do
gene TcKAP7 do genoma do T cruzi Dm28c e a substituiccedilatildeo dos seus alelos pelos
genes neo e higro As reaccedilotildees de PCR foram feitas com DNA de T cruzikap7kap7 (tipo
selvagem) e com DNA de T cruzikap7neokap7higro utilizando diversas combinaccedilotildees de
primers (TABELA 5) Na figura 32 observa-se que o gene TcKAP7 (747 pb) foi
amplificado somente na PCR realizada com DNA de T cruzi tipo selvagem (FIGURA
19 A canaleta 1) enquanto que os genes neo (795 pb) e higro (1026 pb) soacute foram
amplificados nas reaccedilotildees que conteacutem DNA da populaccedilatildeo do T cruzi kap7neokap7higro
(FIGURA 19 B canaletas 2 e 3) Os tamanhos esperados para amplificaccedilotildees usando
primers externos agraves construccedilotildees e os primers dos genes de resistecircncia foram
identificados no gel de agarose indicando que os cassetes se integraram
corretamente no locus do gene TcKAP7 (FIGURA 19 B canaletas 4 a 7) Um
esquema da localizaccedilatildeo dos primers utilizados nas reaccedilotildees de PCR pode ser
visualizado na figura 19 C
QUADRO 5 ndash COMBINACcedilOtildeES DE PRIMERS UTILIZADOS NA PCR PARA
CONFIRMAR O NOCAUTE DE TcKAP7
Pares de primers Tamanho esperado
(pb)
1 KAP7F + KAP7R 747
2 NEOF + NEOR 795
73
3 HIGROF + HIGROR 1026
4 EXTF + NEOR 1410
5 EXTF + HIGROR 1634
6 NEOF + EXTR 1358
7 HIGROF + EXTR 1360
74
FIGURA 19 ENSAIOS DE PCR UTILIZANDO DNA DE T cruzi kap7kap7 (WT) E
T cruzi kap7neokap7higro (NO) COM DIFERENTES PRIMERS
LEGENDA 1 KAP7F + KAP7R 2 NEOF + NEOR (795 pb) 3 HIGROF + HIGROR (1026 pb) 4
EXTF + NEOR (1410 pb) 5 EXTF + HIGROR (1634 pb) 6 NEOF + EXTR (1358 pb) e 7
HIGROF + EXTR (1360 pb) No quadro A encontram-se as PCRs realizadas com DNA de T cruzi kap7kap7 (WT) e no quadro B encontram-se as PCRs realizadas com DNA de T cruzi kap7neokap7higro
(NO) No quadro C estaacute um esquema da localizaccedilatildeo dos primers utilizados
442 Anaacutelise da organizaccedilatildeo dos genes TcKAP7 neo e higro por ensaio do
tipo Southern blot
Neste ensaio foi utilizado DNA total extraiacutedo de T cruzikap7kap7 (tipo selvagem)
e T cruzi kap7neokap7higro (duplo nocaute) Foram utilizadas trecircs sondas (1) Um
fragmento do gene TcKAP7 (primeiros 598 pb da CDS) (2) o gene neo e (3) o gene
higro O DNA total das duas amostras foi digerido com a enzima de restriccedilatildeo HindIII
O padratildeo de digestatildeo desta enzima pode ser visualizado na figura 20 De acordo
com o mapa de restriccedilatildeo a inserccedilatildeo do cassete neo no locus KAP7 geraria um
fragmento HindIIIHindIII de 1024 pb enquanto a inserccedilatildeo do cassete higro geraria
um fragmento de 1032 pb cujos tamanhos satildeo diferentes do fragmento
HindIIIHindIII do locus original (1776 pb) As hibridizaccedilotildees mostram bandas
compatiacuteveis com os tamanhos dos fragmentos HindIIIHindIII esperados para cada
situaccedilatildeo acima (FIGURA 21) Podemos observar que a sonda KAP7 somente
reconhece uma banda de tamanho esperado apenas no DNA do parasita selvagem
(canaleta 1 FIGURA 21) enquanto que bandas correspondentes aos genes neo e
higrosomente aparecem no DNA do mutante KAP7 (canaleta 2 FIGURA 21)
75
FIGURA 20 ndash REPRESENTACcedilAtildeO ESQUEMAacuteTICA DOS SIacuteTIOS DA ENZIMA HindIII NO LOCUS DO GENE KAP7 DE T cruzi CL Brener LEGENDA Este esquema representa esquematicamente em escala os genes kap3 neo e higro as regiotildees upstream e downstream e os siacutetios de clivagem da enzima KpnI
FIGURA 21 ANAacuteLISE DA ORGANIZACcedilAtildeO DOS GENES TCKAP7 NEO E HIGRO POR ENSAIO DO TIPO SOUTHERN BLOT LEGENDA A Autoradiograma e B Padrotildees dos fragmentos obtidos da digestatildeo do DNA com a enzima de restriccedilatildeo HindIII Foram utilizadas trecircs sondas TcKAP7 neomicina e higromicina 1) DNA de T cruzikap7kap7 (tipo selvagem) e 2) T cruzi kap7neokap7higro (duplo nocaute)
76
45 Comparaccedilatildeo da expressatildeo do gene TcKAP7 por western blot
O antisoro contra a proteiacutena TcKAP7 obtido apoacutes imunizaccedilatildeo dos
camundongos foi utilizado em ensaio do tipo western blot para avaliar se TcKAP7
ainda estava sendo expresso no T cruzi apoacutes o nocaute gecircnico
O que se observou foi novamente como esperado que a proteiacutena TcKAP7 natildeo eacute
mais expressa no T cruzi kap7neokap7higro (figura 22) Pode-se observar a presenccedila
de TcKAP7 ( aprox 28 kDa) no extrato das formas epimastigotas de T cruzi kap7kap7
(figura 22A) mas natildeo no extrato de epimastigotas de T cruzi
kap7neokap7higro (figura 22B)
FIGURA 22 COMPARACcedilAtildeO DA EXPRESSAtildeO DO GENE TcKAP7 POR WESTERN BLOT LEGENDA Imunoblot de extratos de epimastigotas de T cruzi kap7kap7 (A) e de T cruzi kap7neokap7higro (B) reagidos com anti-TcKAP7
46 Anaacutelise da morfologia e da ultraestrutura do cinetoplasto do mutante de T
cruzi para TcKAP7
Sabendo-se que TcKAP7 estaacute associada ao cinetoplasto e pode estar
envolvida na compactaccedilatildeo do kDNA do T cruzi como foi mostrado para as KAPs de
Crithidia fasciculata (XU amp RAY 1993 XU et al 1996 HINES amp RAY 1998) sua
ausecircncia poderia levar a alteraccedilatildeo na estrutura do DNA mitocondrial dos parasitas
nocauteados Portanto o primeiro passo foi verificar se havia alteraccedilotildees na
77
morforlogia do parasita Formas epimastigotas do mutante de T cruzi foram
analisadas ao microscoacutepio oacuteptico apoacutes coloraccedilatildeo Como pode ser observado na
figura 23 epimastigotas do mutante de T cruzi para TcKAP7 apresentam uma
morfologia fusiforme com o cinetoplasto caracteriacutestico em forma de barra localizado
anteriormente ao nuacutecleo natildeo se evidenciando portanto nenhuma alteraccedilatildeo em
relaccedilatildeo agrave morfologia dos parasitas do tipo selvagem
FIGURA 23 - COLORACcedilAtildeO PELO MEacuteTODO PANOacuteTICO RAacutePIDO DOS PARASITAS EPIMASTIGOTAS NOCAUTEADOS LEGENDA A) Formas epimastigotas B) Forma epimastigota em maior aumento
Formas epimastigotas de parasitas do tipo selvagem e nocauteados foram
entatildeo analisados pela teacutecnica de microscopia eletrocircnica de transmissatildeo para
visualizar com mais detalhe o cinetoplasto e verificar se sua estrutura estava
alterada pela ausecircncia da TcKAP7 (FIGURA 24) A figura 24A mostra um corte
ultrafino de um epimastigota de T cruzi do tipo selvagem que apresenta o
cinetoplasto compacto e em forma de bastatildeo caracteriacutestico de formas
epimastigotas sem nenhuma alteraccedilatildeo aparente O mesmo pode ser visto na figura
24B para o epimastigota de T cruzi nocauteado A disposiccedilatildeo estrutura e aspecto
do cinetoplasto de ambos os parasitas selvagem e nocauteado natildeo apresentaram
nenhuma diferenccedila entre si mostrando que mesmo apoacutes o nocaute da KAP7 a
estrutura do cinetoplasto permanece aparentemente inalterada
78
FIGURA 24 COMPARACcedilAtildeO ENTRE A ULTRAESTRUTURA DO CINETOPLASTO DO T cruzi DM28C TIPO SELVAGEM (A) E DO MUTANTE DE T cruzi PARA TcKAP7 (B) POR MICROSCOPIA ELETROcircNICA DE TRANSMISSAtildeO
79
47 Multiplicaccedilatildeo diferenciaccedilatildeo e infectividade do mutante de T cruzi para
TcKAP7
Os parasitas mutantes foram analisados a fim de verificar se alteraccedilotildees na
estrutura do kDNA pela ausecircncia de KAP7 natildeo estavam levando a alteraccedilotildees na
fisiologia do parasita alterando sua multiplicaccedilatildeo diferenciaccedilatildeo e infectividade
Inicialmente foi analisado o perfil da curva de crescimento das formas
epimastigotas Observou-se que natildeo havia diferenccedila na curva de crescimento dos
parasitas nocauteados em relaccedilatildeo ao parasita selvagem (FIGURA 25)
FIGURA 25 CURVA DE CRESCIMENTO DO MUTANTE DE T cruzi PARA TcKAP7 (KO) E DO T cruzi Dm28c SELVAGEM (WT)
LEGENDA Curva de crescimento do mutante de T cruzi para TcKAP7 () e do T cruzi Dm28c ()
Em seguida os parasitas nocauteados foram analisados quanto a sua capacidade
de diferenciaccedilatildeo em tripomastigotas metaciacuteclicos Foram realizadas contagens
diferenciais em cacircmara de Neubauer a partir do sobrenadante da metaciclogecircnese
a cada 24 h apoacutes a incubaccedilatildeo das ceacutelulas em meio TAU3AAG durante um periacuteodo
de 3 dias (72 h) A partir dessas contagens foram construiacutedos curva com a contagem
do nuacutemero de metaciacuteclicos ao longo dos trecircs dias (FIGURA 26)
Nenhuma alteraccedilatildeo foi observada quando os parasitas nocauteados foram
submetidos ao processo de metaciclogecircnese in vitro Ou seja pode-se afirmar que
80
mesmo apoacutes o nocaute do gene TcKAP7 as formas epimastigotas do parasita
conseguem se diferenciar em formas metaciacuteclicas
FIGURA 26 METACICLOGEcircNESE IN VITRO DE T cruzi Dm28c TIPO SELVAGEM E T cruzi NOCAUTEADO LEGENDA Metaciclogecircnese in vitro de T cruzi Dm28c tipo selvagem () e T cruzi nocauteado ()
Uma vez que os parasitas nocauteados foram capazes de se diferenciar de
epimastigota a tripomastigota metaciacuteclico resolveu-se investigar se estes eram
capazes de infectar ceacutelulas in vitro Foi possiacutevel perceber as formas amastigotas
dentro de ceacutelulas VERO em cultura mostrando que o parasita natildeo perdeu sua
capacidade de infecccedilatildeo (dados natildeo mostrados) Assim pode-se concluir que aleacutem
de sofrer diferenciaccedilatildeo os mutantes de T cruzi para KAP7 tambeacutem mantiveram sua
capacidade de infecccedilatildeo
48 Anaacutelise da funccedilatildeo do gene KAP7 de Trypanosoma brucei atraveacutes de
ensaios de RNA de interferecircncia
Para averiguar a importacircncia da proteiacutena TcKAP7 na biologia do parasita
recorremos a ensaios de RNA de interferecircncia (RNAi) jaacute que existe uma alta
similaridade entre TcKAP7 e seu ortoacutelogo em Trypanosoma brucei
81
A via de RNA de interferecircncia consiste em um mecanismo de silenciamento
gecircnico que para a ceacutelula funciona como sistema de defesa O mecanismo inicia-se
atraveacutes da expressatildeo de um RNA dupla fita (dsRNA) contendo uma sequecircncia
complementar ao gene de interesse Este dsRNA seraacute entatildeo clivado em pequenos
fragmentos de cerca de 22 a 25 nucleotiacutedeos atraveacutes da atividade de uma
ribonuclease do tipo III denominada Dicer Estes pequenos RNAs seratildeo
direcionados e permaneceratildeo unidos a um complexo proteico denominado RISC
(ldquoRNA-InducedSilencingComplexrdquo) Nesse complexo os pequenos RNAs de
interferecircncia (siRNA) ligam-se por complementaridade ao RNA mensageiro do gene
a ser inativado guiando-os para degradaccedilatildeo pelas nucleases presentes no
complexo impedindo a siacutentese da respectiva proteiacutena (ULLU et al 2002) O vetor
utilizado para promover o silenciamento do gene TbKAP7 foi o p2T7-177 Este
plasmiacutedeo integra-se aos minicromossomos do T brucei regiatildeo de repeticcedilotildees 177
(FOLDYNOVA-TRANTIRKOVA et al 2005) Este vetor apresenta dois promotores
de polimerase em oposiccedilatildeo induziacuteveis por tetraciclina flanqueando a sequumlecircncia de
interesse Desta forma satildeo geradas duas moleacuteculas de mRNA que pareadas
formam a moleacutecula de RNA fita dupla capaz de induzir a maquinaria de degradaccedilatildeo
A induccedilatildeo da inibiccedilatildeo de TbKAP7 atraveacutes de RNAi levou a uma diminuiccedilatildeo da
multiplicaccedilatildeo celular do parasita a partir do quarto dia do experimento (FIGURA 27)
Os resultados obtidos neste ensaio mostraram que a participaccedilatildeo da TbKAP7
no metabolismo do T brucei eacute essencial jaacute que o silenciamento do gene TbKAP7
levou agrave reduccedilatildeo da proliferaccedilatildeo celular do parasita
82
FIGURA 27 RNAi DE TbKAP7 INIBE O CRESCIMENTO DAS FORMAS PROCIacuteCLICAS DE T
brucei
LEGENDA Curva de crescimento de linhagem celular de RNAi de TbKAP7 em T brucei induzido por
tetraciclina As ceacutelulas foram diluiacutedas a uma densidade celular inicial de 1 X 106 ml na presenccedila e
ausecircncia de tetraciclina As densidades celulares foram determinadas pela contagem de ceacutelulas a
intervalos de 24 horas durante oito dias apoacutes iniacutecio de adiccedilatildeo de tetraciclina A linha com quadrados
mostra a curva de crescimento celular na presenccedila de tetraciclina (+TET) A linha com losangos
mostra a curva de crescimento celular na ausecircncia de tetraciclina (- TET)
49 Caracterizaccedilatildeo estrutural de TcKAP7
491 Produccedilatildeo recombinante de TcKAP7
O cultivo de E coli BL-21(DE3) STAR contendo o plasmiacutedeo pET28a-
TcKAP7 foi feito em meio LB a 37 oC com a induccedilatildeo da expressatildeo realizada a uma
densidade oacutetica de DO600 de 08 com a adiccedilatildeo de 05 mM de ITPG durante a noite a
37 oC
As ceacutelulas foram recuperadas por centrifugaccedilatildeo ressuspensas sonicadas e
centrifugadas para a purificaccedilatildeo de TcKAP7 atraveacutes da cromatografia de afinidade
em resina de Ni-NTA (Figura 28A) Foi possiacutevel obter grande quantidade de
83
amostra com grau de pureza alto como visualizado atraveacutes de anaacutelise por SDS-
PAGE (Figura 28B)
FIGURA28 PURIFICACcedilAtildeO DE TCKAP7 ATRAVEacuteS DE CROMATOGRAFIA DE AFINIDADE LEGENDA A) Cromatograma de afinidade B) SDS-PAGE da cromatografia de afinidade Os nuacutemeros agrave esquerda da figura representam os tamanhos das bandas do marcador de massa molecular (Benchmark) (Invitrogen) e P banda correspondente agrave TcKAP7 purificada Caixa em vermelho indica o pico que corresponde agrave fraccedilatildeo no SDS-PAGE
Devido agrave presenccedila de bandas com possiacuteveis contaminantes as fraccedilotildees que
continham a proteiacutena de interesse foram submetidas agrave purificaccedilatildeo por cromatografia
de troca iocircnica onde a purificaccedilatildeo eacute realizada baseada na afinidade por cargas
entre as proteiacutenas e a resina
Para esta purificaccedilatildeo utilizou-se a coluna SP Hitrap (GE Healthcare Life
Sciences) que eacute uma coluna de carga negativa Essa resina foi escolhida pois o pH
do tampatildeo em que se encontrava TcKAP7 era menor que o pI da proteiacutena Nessas
condiccedilotildees a carga superficial de TcKAP7 eacute positiva Para favorecer a interaccedilatildeo
TcKAP7 e resina foi feita uma diluiccedilatildeo de TcKAP7 para retirada de NaCl A eluiccedilatildeo
da proteiacutena foi realizada com um gradiente segmentado de tampatildeo B para
84
cromatografia de troca iocircnica TcKAP7 foi eluiacuteda com 68 do tampatildeo B (FIGURA
29)
FIGURA 29 PURIFICACcedilAtildeO DE TCKAP7 ATRAVEacuteS DE CROMATOGRAFIA DE TROCA IOcircNICA
LEGENDA A) Cromatografia de troca iocircnica B) SDS-PAGE da cromatografia de troca iocircnica Os nuacutemeros agrave esquerda da figura representam os tamanhos das bandas do marcador de massa molecular (Benchmark) (Invitrogen) e P banda correspondente agrave TcKAP7 purificada Caixa em vermelho indica o pico que corresponde agrave fraccedilatildeo no SDS-PAGE Curva em azul representa absorbacircncia em 280 nm Linha em verde indica concentraccedilatildeo de tampatildeo B para eluiccedilatildeo da amostra
410 Anaacutelise do estado oligomeacuterico de TcKAP7
A amostra purificada por troca iocircnica foi submetida agrave cromatografia de
exclusatildeo molecular tambeacutem chamada de gel filtraccedilatildeo que consiste na separaccedilatildeo
de biomoleacuteculas de acordo com seu tamanho e forma A coluna neste processo
conteacutem um poliacutemero com ligaccedilotildees cruzadas com poros de tamanho definido As
moleacuteculas maiores iratildeo migrar mais rapidamente que as menores pois natildeo satildeo
85
capazes de penetrar no interior dos poros da resina eluindo diretamente da coluna
As moleacuteculas menores por entrarem pelos poros da resina e levarem mais tempo
percorrendo os poros satildeo eluiacutedas mais tarde em relaccedilatildeo as que satildeo maiores
Ao comparar o volume de eluiccedilatildeo de TcKAP7 com o volume de eluiccedilatildeo de
proteiacutenas com massa molecular conhecidos (dados natildeo mostrados) foi possiacutevel
verificar que TcKAP7 parece ser um monocircmero em soluccedilatildeo Para confirmar esses
dados a mesma amostra foi submetida ao experimento de espalhamento dinacircmico
de luz (DLS)
O DLS eacute uma teacutecnica que se estima a distribuiccedilatildeo de tamanho das
populaccedilotildees de partiacuteculas que estatildeo presentes na amostra permitindo a detecccedilatildeo de
agregados proteicos ou de diferentes estados de oligomerizaccedilatildeo na amostra
indicando heterogeneidade Eacute importante ressaltar que para maiores chances de
sucesso em ensaios de cristalizaccedilatildeo a amostra deve encontrar-se monodispersa
Os dados de DLS mostram que 911 da massa de TcKAP7 analisada
apresenta um raio hidrodinacircmico (Rh) de 39 nm que representa uma massa
aparente de 29 kDa (FIGURA 30) Isto eacute condizente com um monocircmero cuja massa
teoacuterica seria de aproximadamente 28 kDa (incluindo a cauda de 6 histidinas) de
acordo com a prediccedilatildeo feita pelo servidor Expasy Protparam
(httpwebexpasyorgprotparam)A polidispersividade da amostra foi baixa
indicando que a mesma estava homogecircnea
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0 1 2 3 4 5 6 7
M
assa
Rh (nm)
fr80
fr82
fr84
fr85
86
FIGURA 30 ANAacuteLISE POR DLS DE TCKAP7 LEGENDA Anaacutelise por DLS de TcKAP7 contendo as fraccedilotildees obtidas na cromatografia de afinidade As fraccedilotildees 80 84 e 85 apresentam um raio hidrodinacircmico (Rh) de 39 nm
Aleacutem disso tambeacutem foram obtidas informaccedilotildees sobre o envelope de TcKAP7
a partir dos dados coletados atraveacutes da teacutecnica de SAXS mostrando que o raio de
giro (Rg) do envelope de TcKAP7 estaacute de acordo com o estimado por DLS (FIGURA
31)
FIGURA 31 ENVELOPE MOLECULAR DE SAXS
411 Anaacutelise do conteuacutedo de estrutura secundaacuteria de TcKAP7 recombinante
Atraveacutes da anaacutelise do espectro de dicroiacutesmo circular pode-se verificar o
conteuacutedo de estrutura secundaacuteria da proteiacutena e inferir enovelamento da proteiacutena
recombinante Os dados obtidos para a TcKAP7 revelaram a presenccedila de estruturas
α caracterizadas pelos miacutenimos pronunciados em 208 nm e 222 nm e de estruturas
coiled na amostra de TcKAP7 caracterizada pelos miacutenimos pronunciados em 205
nm (FIGURA 32) Este resultado estaacute de acordo a prediccedilatildeo de estrutura secundaacuteria
87
realizada pelo servidor PSIPRED (httpbioinfcsuclacukpsipred (FIGURA 33)
Esses resultados sugerem que a proteiacutena recombinante possui correto
enovelamento
FIGURA 32 ESPECTRO DE DICROIacuteSMO CIRCULAR DE TcKAP7
FIGURA 33 PREDICcedilAtildeO DE ESTRUTURA SECUNDAacuteRIA DE TcKAP7
412 Anaacutelise estrutural de TcKAP7
A fim de obter-se a estrutura tridimensional de TcKAP7 por cristalografia de
raios-X foram realizados ensaios de cristalizaccedilatildeoFoi possiacutevel observar a formaccedilatildeo
de um cristal em apenas uma condiccedilatildeo Imidazol 01 M Polietilenoglicol (PEG) 8000
10 wv e Acetato de caacutelcio 02 M
A visualizaccedilatildeo atraveacutes de luz ultra-violeta atraveacutes do equipamento Rock
Imager Fomulatrix permitiu identificaacute-lo como cristal de proteiacutena jaacute que este
diferencia-se de cristal de sal pela fluorescecircncia quando excitado em comprimento
de onda de 280 nm
-20
-18
-16
-14
-12
-10
-8
-6
-4
-2
0
2
200 210 220 230 240 250 260
Ɵ M
RV
x 1
03
(de
g cm
2d
mo
l-1)
Comprimento de onda (nm)
88
O perfil do cristal pode ser visualizado na figura 34 Esse cristal encontra-se
pequeno e mal-formado Aleacutem disso os meacutetodos para a determinaccedilatildeo estrutural de
uma estrutura ineacutedita (sem homologia com estruturas conhecidas) necessitam de
mais de um cristal Dessa forma foram realizados refinamentos dessas condiccedilotildees
iniciais visando aumentar q quantidade de cristais aumentar seu tamanho e
melhorar sua organizaccedilatildeo A concentraccedilatildeo de PEG (5 A 10) e do pH (6 a 9) com
intervalos de 1 unidade foram alterada Entretanto mesmo assim natildeo foi possiacutevel a
obtenccedilatildeo de cristais adequados para a difraccedilatildeo de raios X e novos refinamentos
seratildeo necessaacuterios
FIGURA 34 CRISTAL DE TcKAP7 DE T CRUZI LEGENDA AObtenccedilatildeo do cristal de TcKAP7 na condiccedilatildeo de Imidazol 01 M Polietilenoglicol (PEG) 8000 10 wv e Acetato de caacutelcio 02 M e B Cristal de TcKAP7 visto sob luz ultravioleta
Uma vez que natildeo foi possiacutevel durante o desenvolvimento desse projeto a
obtenccedilatildeo da estrutura cristalograacutefica de TcKAP7 procedeu-se com a construccedilatildeo de
seu modelo molecular
A modelagem molecular eacute uma ferramenta que permite a obtenccedilatildeo de
modelos da estrutura tridimensional de uma determinada proteiacutena com base em
homologia sequencial ou estrutural com proteiacutenas cujas estruturas tridimensional
foram experimentalmente resolvidas
Para a construccedilatildeo do modelo foi utilizado o programa MODELLER (SALI amp
BLUNDELL 1993) este programa eacute utilizado para a modelagem por homologia a
estruturas tridimensionais de proteiacutenas O programa automaticamente constroacutei um
modelo baseado na anaacutelise de um alinhamento de sequecircncias entre a proteiacutena para
a qual se deseja construir o modelo e uma proteiacutena relacionada cuja estrutura
tridimensional jaacute foi resolvida Nesse caso foram utilizadas estruturas de duas
A B
89
proteiacutenas como molde para a construccedilatildeo da estrutura de TcKAP7 A estrutura da
proteiacutena HMGB1(coacutedigo de acesso no banco de dados de proteiacutenas 2GZK)
(wwwpdborg) para a porccedilatildeo amino-terminal e a estrutura do fator A de transcriccedilatildeo
mitocondrial (coacutedigo de acesso 3TQ6) para a porccedilatildeo carboxi-terminal da proteiacutena
(FIGURA 35A) Duas proteiacutenas foram selecionadas para a construccedilatildeo do modelo de
TcKAP7 visto que a similaridade de sequencia entre TcKAP7 e proteiacutenas com
estruturas resolvidas eacute bastante baixo A similaridade sequencial de TcKAP7 e
proteiacutena HMGB1 eacute de 224 e entre TcKAP7 e o fator A de transcriccedilatildeo mitocondrial
eacute de 264 No entanto ambas proteiacutenas possuem alta similaridade em relaccedilatildeo agrave
estrutura secundaacuteria (mais de 90) Para aumentar a confiabilidade do modelo
utilizamos uma proteiacutena para construir a sequencia N-terminal de TcKAP7
(aminoaacutecidos 1-184) e outra para o C-terminal (aminoaacutecidos 185-248)
A qualidade do modelo pode ser avaliada por exemplo atraveacutes de graacuteficos e
tabelas que analisam restriccedilotildees quiacutemicas e fiacutesicas de cada aacutetomo constituinte do
modelo Neste trabalho foi utilizado o graacutefico de Ramachandran (FIGURA 35B) nele
pode-se visualizar todas as combinaccedilotildees possiacuteveis de acircngulos dieacutedricos Ψ (psi)
versus os Φ (phi) nos aminoaacutecidos de um polipeptiacutedeo e que contribuem para a
conformaccedilatildeo das estruturas das proteiacutenas (RAMACHANDRAN et al 1963) Dos 230
resiacuteduos apenas 5 estatildeo em regiotildees natildeo permitidas do graacutefico Esse eacute um
excelente valor pois eacute similar ao valor meacutedio encontrado para estruturas
experimentalmente determinadas com resoluccedilatildeo de no miacutenimo 20 Aring
(httpwwwebiacukthornton-srvdatabasesprofunc)
Tambeacutem eacute possiacutevel visualizar a topologia de TcKAP7 (FIGURA 35 C) que
mostra as regiotildees de α-heacutelices e regiotildees de coiled presentes na proteiacutena
corroborando com os dados obtidos na espectroscopia de dicroiacutesmo circular
90
FIGURA 35 ESTRUTURA DE TcKAP7 LEGENDA AModelo tridimensional de KAP7 B Graacutefico de Ramachandran e C Topologia de TcKAP7
A anaacutelise da superfiacutecie eletrostaacutetica de TcKAP7 mostra que existem regiotildees
ricas em aminoaacutecidos com cargas positivas que podem conferir afinidades agrave outras
proteiacutenas com carga carga superficial negativa ou mesmo aacutecidos nucleicos (FIGURA
36)
91
FIGURA 36 SUPERFIacuteCIE ELETROSTAacuteTICA DE TcKAP7 LEGENDA Visualizaccedilatildeo de diferentes regiotildees de TcKAP7 Vermelho potencial negativo Azul potencial positiva Branco Neutro
413 Investigaccedilatildeo de possiacuteveis funcionalidades baseadas na estrutura de
TcKAP7
4131 Prediccedilatildeo de funccedilatildeo paraTcKAP7
92
A prediccedilatildeo de funccedilatildeo para TcKAP7 foi realizada a partir do enovelamento de
proteiacutenas utilizando o servidor Profunc (httpwwwebiacukthornton-
srvdatabasesprofunc) O objetivo do servidor ProFunc eacute ajudar na identificaccedilatildeo de
uma possiacutevel funccedilatildeo bioquiacutemica de uma proteiacutena a partir da sua estrutura
tridimensional Ele utiliza uma seacuterie de meacutetodos incluindo comparaccedilatildeo de
enovelamento conservaccedilatildeo dos resiacuteduos e modelos 3D funcionais tanto para
identificar provaacuteveis siacutetios ativos da proteiacutena quanto possiacuteveis homoacutelogos no Protein
Data Bank (PDB) Neste procedimento tenta-se ajustar a estrutura da proteiacutena de
interesse aos tipos de enovelamentos de proteiacutenas conhecidas Atualmente mais de
1000 tipos jaacute foram registrados e depositados em bibliotecas de enovelamentos
Sabe-se que o alinhamento estrutural entre proteiacutenas consideradas de uma
mesma famiacutelia mesmo que seja apenas na regiatildeo do siacutetio ativo pode ser um
importante meacutetodo para se inferir a funccedilatildeo da sequecircncia em estudo (LASKOWSKI et
al 2003) A evoluccedilatildeo tende a conservar funccedilotildees que dependem mais diretamente
das estruturas 3D que das similaridades entre as sequecircncias de aminoaacutecidos das
proteiacutenas (SANCHEZ et al 2000)
Neste trabalho as quatro estruturas que possuem maior similaridade
estrutural com TcKAP7 estatildeo depositadas no Protein Data Bank (PDB) com os
coacutedigos 3TQ6 4NOD 3TMM 4NNU Todas as estruturas satildeo referentes agrave proteiacutena
TFAM (fator transcricional A mitocondrial)
As estruturas proteicas foram obtidas no banco de dados puacuteblicos de
proteiacutenas PDB (Protein Data Bank) e submetidas a um alinhamento estrutural com o
modelo de TcKAP7 (FIGURA 35A) no programa WinCoot Esse alinhamento pode
ser visualizado na figura 37 As regiotildees em vermelho representam as regiotildees de
TcKAP7 que apresentam interaccedilatildeo com DNA pois se alinham com as regiotildees de
ligaccedilatildeo agrave DNA das outras proteiacutenas e as regiotildees em azul representam regiotildees sem
homologia com as demais
Esse resultado sugere que TcKAP7 pode interagir com DNA com isso estes
dados podem ser utilizados para nortear mais estudos sobre a interaccedilatildeo das
proteiacutenas KAPrsquos com o DNA do cinetoplasto de T cruzi
93
FIGURA 37 ALINHAMENTO ESTRUTURAL DE 3TQ6 4NOD 3TTM 4NNU E TCKAP7 LEGENDA Em vermelho encontram-se as regiotildees de TcKAP7 que podem interagir com DNA (Resiacuteduos 1-67 e 140-166) e em azul regiotildees sem homologia com as demais
4132 Anaacutelises preliminares da possiacutevel interaccedilatildeo entre TcKAP7 e kDNA
As prediccedilotildees estruturais sugeriram que a proteiacutena TcKAP7 possui motivos
similares agrave proteiacutenas que interagem com DNA No entanto a sequecircncia de
aminoaacutecidos entre as proteiacutenas eacute bastante baixa Como a funccedilatildeo de TcKAP7
permanece obscura foram realizados alguns ensaios para tentar verificar a
possibilidade desta proteiacutena interagir com kDNA Para isto utilizou-se a teacutecnica de
dicroiacutesmo circular para avaliar se a presenccedila de kDNA poderia resultar em
alteraccedilotildees estruturais em TcKAP7 o que seria uma evidecircncia da possiacutevel interaccedilatildeo
entre esta proteiacutena e o aacutecido nucleico
Foram realizadas medidas de dicroiacutesmo circular com amostras de TcKAP7
kDNA e TcKAP7 na presenccedila de kDNA Para a anaacutelise de dados foi realizado o
somatoacuterio das curvas obtidas com as amostras de TcKAP7 e kDNA separadamente
Este somatoacuterio resultou em uma curva teoacuterica que indica o perfil teoacuterico de uma
amostra contendo TcKAP7 e kDNA sem interaccedilotildees presentes Aacute essa curva foi
sobreposta a curva experimental da medida de dicroiacutesmo circular de TcKAP7 na
94
presenccedila de kDNA A figura 38 ilustra essa sobreposiccedilatildeo onde pode-se verificar que
as curvas natildeo se sobrepotildeem portanto alteraccedilotildees estruturais ocorrem em TcKAP7
na presenccedila de kDNA
FIGURA 38 ESPECTRO DE DICROIacuteSMO CIRCULAR DE TcKAP7 LEGENDA Em azul encontra-se o espectro experimental de TcKap7 na presenccedila de DNA em vermelho o espectro teoacuterico de TcKAP7 e DNA
Para investigar mudanccedilas estruturais associadas a interaccedilatildeo com kDNA foi
realizada uma coleta de dados de SAXS na presenccedila de 1ug de kDNA
A comparaccedilatildeo dos modelos de baixa resoluccedilatildeo por SAXS indica uma
diferenccedila conformacional pontual da proteiacutena na presenccedila de kDNA As figuras 28 e
29 mostram os envelopes da proteiacutena TcKAP7na ausecircncia (FIGURAS 39A e 40A) e
presenccedila de kDNA de T cruzi (FIGURA 39B e FIGURA 40B) Percebe-se uma
diferenccedila de densidade eletrocircnica na regiatildeo da heacutelice (Residuos 140 - 166
evidenciados em vermelho) No envelope de TcKAP7 ela eacute bastante flexiacutevel e natildeo eacute
observada densidade eletrocircnica nessa regiatildeo no entanto na presenccedila de kDNA
essa mesma regiatildeo mostra-se mais riacutegida e eacute possiacutevel estimar seu posicionamento
baseado na densidade eletrocircnica Aleacutem disso essa heacutelice eacute predita como interatora
de DNA com base nas anaacutelises estruturais previamente realizadas nesse trabalho
Esses dados sugerem uma mudanccedila conformacional da proteiacutena na presenccedila
do kDNA fazendo com que esta mude seu arranjo estrutural para permanecer ligada
agrave moleacutecula de DNA sugerindo uma interaccedilatildeo entre TcKAP7 e DNA do cinetoplasto
-22
-17
-12
-7
-2
3
200 210 220 230 240 250 260
ϴM
RW
x 1
03
(de
g cm
-2 d
mo
l-1)
Comprimento de onda (nm)
Kap7+DNA
95
de T cruzi Esses dados corroboram com o que foi visto na superfiacutecie eletrostaacutetica
(FIGURA 36) e no alinhamento estrutural (FIGURA 37)
FIGURA 39 ENVELOPE MOLECULAR DETcKAP7 LEGENDA A Monocircmero de TcKAP7 ajustado ao envelope de SAXS B Monocircmero de TcKAP7 + kDNA ajustado ao envelope de SAXSResiduos 140- 166 evidenciados em vermelho
96
FIGURA 40 ENVELOPE MOLECULAR DE TcKAP7 VISTO EM DIFERENTES AcircNGULOS LEGENDA A Monocircmero de TcKAP7 ajustado ao envelope de SAXS B Monocircmero de TcKAP7 + kDNA ajustado ao envelope de SAXS Residuos 140- 166 evidenciados em vermelho
97
5 DISCUSSAtildeO
O Trypanosoma cruzi pertence a um grupo que divergiu muito cedo na
linhagem eucarioacutetica apresentando diversas caracteriacutesticas uacutenicas em relaccedilatildeo a
outros eucariotos Uma dessas caracteriacutesticas eacute a presenccedila de uma mitococircndria
uacutenica ramificada pelo corpo do protozoaacuterio contendo uma regiatildeo especializada o
cinetoplasto onde reside o DNA mitocondrial tambeacutem conhecido como kDNA O
kDNA eacute composto por uma rede de moleacuteculas interligadas entre si os maxiciacuterculos e
os miniciacuterculos (SHAPIRO amp ENGLUND 1995) Mais de 30 proteiacutenas envolvidas na
replicaccedilatildeo e na manutenccedilatildeo do kDNA jaacute foram identificadas e acredita-se que um
nuacutemero aproximado de 100 proteiacutenas muitas delas presentes apenas em
cinetoplastiacutedeos possam estar envolvidas nesses processos (LIU et al 2005) A
maioria dessas proteiacutenas foi identificada em T brucei e C fasciculata e
possivelmente vaacuterias delas principalmente aquelas envolvidas em replicaccedilatildeo
devem estar codificadas no genoma do T cruzi
Apesar de serem conhecidos muitos dos componentes da maquinaria de
replicaccedilatildeo dos miniciacuterculos e maxiciacuterculos natildeo se pode dizer o mesmo para as
proteiacutenas envolvidas na manutenccedilatildeo da estrutura do kDNA Com exceccedilatildeo de 4
proteiacutenas com caracteriacutesticas de histonas H1 (KAP1 a 4) encontradas associadas ao
cinetoplasto de C fasciculata pouco ainda eacute conhecido sobre as proteiacutenas que
participam da organizaccedilatildeo do kDNA em outros tripanosomatiacutedeos
Zavala-Castro e colaboradores (2002) identificaram sete proteiacutenas variando
de 19 a 31 kDa associadas ao kDNA de formas epimastigotas de T cruzi a partir
de kDNA extraiacutedo de ceacutelulas fixadas com formaldeiacutedo Os tamanhos observados satildeo
compatiacuteveis com aqueles das KAPs encontradas por Xu e Ray (1993) usando
experimento similar em C fasciculata entretanto nenhuma das possiacuteveis KAPs
descritas por Zavala-Castro e colaboradores foi caracterizada
Noacutes iniciamos estudos objetivando identificar proteiacutenas envolvidas na
organizaccedilatildeo e segregaccedilatildeo do kDNA de T cruzi a partir dos dados fornecidos pelo
sequenciamento do genoma desse parasita fazendo uma comparaccedilatildeo com as
KAPs de C fasciculata Estudos realizados por Cavalcanti e colaboradores (2009)
usando como modelo as sequecircncias de KAPs de C fasciculata identificaram 35
proteiacutenas relacionadas em diferentes tripanosomatiacutedeos cujos genomas estatildeo
sequenciados (11 em T cruzi 7 em L braziliensis 6 em L major e L infantum e 5
98
em T brucei) Essas sequecircncias puderam ser agrupadas em 7 tipos diferentes de
KAPs (KAP1 a 7) Das 7 KAPs T cruzi possui 5 (TcKAP3 a 7) cuja a sintenia
gecircnica eacute uma das caracteriacutesticas marcantes jaacute que alguns genes divergem em
relaccedilatildeo ao tamanho e portanto no tamanho da proteiacutena codificada As KAPs de T
cruzi e T brucei satildeo maiores do que as de C fasciculata e Leishmania spp Isso
pode sugerir que KAPs possam ter evoluiacutedo para um tamanho que comporte
basicamente suas funccedilotildees de associaccedilatildeo com o kDNA de maneira mais eficiente
Os resultados obtidos por Cavalcanti et al (2009) para TcKAP4 e TcKAP6
mostraram que em epimastigotas e amastigotas estas duas proteiacutenas estatildeo
distribuiacutedas ao longo de toda a rede de kDNA consistente com o que foi observado
em C fasciculata (XU et al 1996 HINES amp RAY 1998) poreacutem CfKAP4 tambeacutem
apresentou um padratildeo de marcaccedilatildeo nos poacutelos opostos do kDNA sugerindo que
essa KAP em particular se associe aos miniciacuterculos receacutem-replicados antes de sua
reintegraccedilatildeo agrave rede de kDNA (XU et al 1996) Contudo em tripomastigotas de T
cruzi estas duas proteiacutenas estatildeo distribuiacutedas na periferia da rede de kDNA
(CAVALCANTI et al 2009) indicando que diferente de C fasciculata elas
apresentam uma dinacircmica de associaccedilatildeo que depende da forma evolutiva do
parasita possivelmente refletindo distintas interaccedilotildees com proteiacutenas da rede de
kDNA em epimastigotas e tripomastigotas No presente trabalho ampliamos o
conhecimento sobre as KAPs de T cruzi estudando o papel da KAP7 na fisiologia
desse parasita
Em C fasciculata a regulaccedilatildeo da expressatildeo de vaacuterios genes que codificam
proteiacutenas mitocondriais ocorre durante o ciclo celular em parte por uma sequumlecircncia
consenso [(CA)AUAGAA(GA)] presente nas regiotildees 5rsquo e 3rsquo-UTR dos respectivos
mRNAs (BROWN amp RAY 1997 MAHMOOD et al 1999 MAHMOOD amp RAY 1998
PASION et al 1996) O mesmo foi observado para L major onde uma sequecircncia
parecida com aquela encontrada em C fasciculata (CATAGA) foi identificada nas
regiotildees 5rsquo e 3rsquo de vaacuterios genes cuja a expressatildeo era maior na fase S do ciclo celular
(ZICK et al 2005) Analisando as regiotildees 5rsquo e 3rsquo do transcrito do gene TOP2 de T
cruzi que codifica a topo II mitocondrial descrito por Fragoso e Goldenberg (1992)
tambeacutem podemos observar a sequecircncia CATAGA repetida duas vezes na regiatildeo
5rsquoUTR e uma vez na regiatildeo 3rsquo-UTR do transcrito desse gene
Como relatamos neste trabalho a sequecircncia da regiatildeo 5rsquo-UTR do transcrito
TcKAP7 natildeo mostrou nenhum elemento com as caracteriacutesticas daquele envolvido na
99
regulaccedilatildeo de genes expressos na fase S do ciclo celular de outros
tripanosomatiacutedeos
Em relaccedilatildeo agrave localizaccedilatildeo de TcKAP7 verificamos atraveacutes de ensaios de
imunofluorescecircncia a distribuiccedilatildeo de TcKAP7 na regiatildeo dos poacutelos da rede de kDNA
das formas epimastigotas de T cruzi poreacutem ainda natildeo analisamos como esta
proteiacutena estaacute distribuiacuteda nas formas tripomastigotas que possuem a rede de kDNA
com formato arredondado e menos compactada
A localizaccedilatildeo de KAP7 na regiatildeo dos poacutelos do cinetoplasto de T cruzi
sugere que ela tenha funccedilotildees na replicaccedilatildeo da rede de kDNA pois nessa regiatildeo
estatildeo concentradas diversas proteiacutenas necessaacuterias para finalizaccedilatildeo do processo de
replicaccedilatildeo de miniciacuterculos
Para a construccedilatildeo do modelo molecular de TcKAP7 foram utilizadas
estruturas de duas proteiacutenas a estrutura da proteiacutena HMGB1 (2GZK) para a porccedilatildeo
amino-terminal e a estrutura da proteiacutena fator A de transcriccedilatildeo mitocondrial (3TQ6)
para a porccedilatildeo carboxi-terminal da proteiacutena ambas apresentam alta similaridade em
relaccedilatildeo agrave estrutura secundaacuteria (mais de 90) e tratam-se de proteiacutenas de um
mesmo grupo HMG (High-mobility group) Em T brucei TbKAP6 uma proteiacutena do
grupo HMG estaacute envolvida na replicaccedilatildeo e manutenccedilatildeo do kDNA (WANG et al
2014) Baseado nesses dados juntamente com os dados da imunofluorescecircncia
indireta pode-se sugerir um papel de TcKAP7 na replicaccedilatildeo da rede de kDNA
Embora ainda natildeo saibamos como KAP7 se associa com o kDNA de T
cruzi eacute possiacutevel que isso ocorra de duas maneiras atraveacutes de ligaccedilotildees
eletrostaacuteticas natildeo-especiacuteficas ou de interaccedilotildees com regiotildees especiacuteficas dos
miniciacuterculos
Atraveacutes de ensaios de SAXS foi possiacutevel perceber que a proteiacutena sofre
alteraccedilotildees conformacionais na presenccedila do kDNA sugerindo sua interaccedilatildeo com
esse aacutecido nucleacuteico Esta interaccedilatildeo pode ser eletrostaacutetica uma vez que a anaacutelise da
superfiacutecie eletrostaacutetica de TcKAP7 mostrou a predominacircncia de regiotildees ricas em
aminoaacutecidos com cargas positivas que podem conferir afinidades agrave outras proteiacutenas
com carga superficial negativa ou mesmo aacutecidos nucleicos mais uma vez sugerindo
a interaccedilatildeo com kDNA
Poreacutem natildeo se pode descartar a possibilidade de que a interaccedilatildeo de TcKAP7
com o kDNA seja atraveacutes de interaccedilotildees com regiotildees especiacuteficas dos miniciacuterculos
Nos tripanosomatiacutedeos a rede de kDNA assume a forma de um disco achatado
100
perpendicular ao flagelo onde os miniciacuterculos estatildeo alinhados em fibrilas orientadas
paralelamente ao eixo do disco (LIU et al 2005) Acredita-se que a ordenaccedilatildeo e
compactaccedilatildeo dos miniciacuterculos estatildeo relacionadas agrave proacutepria estrutura da moleacutecula de
miniciacuterculo Os miniciacuterculos apresentam regiotildees ricas em A+T que podem causar
curvaturas na moleacutecula (MARINI et al 1984 NTAMBI et al 1984) facilitando sua
inserccedilatildeo de forma ordenada no disco de kDNA aleacutem disso possuem regiotildees
conservadas onde estatildeo localizadas as origens de replicaccedilatildeo Essas regiotildees por
sua vez podem ser reconhecidas por proteiacutenas tais como a KAP7 que ajudam a
estabilizar a estrutura Os resultados com C fasciculata mostram que KAP2 3 e 4 se
ligam em regiotildees especiacuteficas dos miniciacuterculos ricas em A+T mas que natildeo satildeo
aquelas que geram a curvatura das moleacuteculas (XU et al 1996) Contudo KAP1 se
liga de maneira inespeciacutefica aos miniciacuterculos (HINES amp RAY 1998) Aleacutem disso
existe a sequecircncia universal de miniciacuterculo (UMS) e as proteiacutenas que se ligam a
essa sequecircncia (UMSBP) as quais podem participar de interaccedilotildees com as KAPrsquos
Em C fasciculata CfKAP3 sozinha consegue condensar a rede de kDNA e inibir a
decatenaccedilatildeo pela enzima topo II Poreacutem a interaccedilatildeo entre CfKAP3 e CfUMSBP
pode descondensar a rede de kDNA e reestabelecer a decatenaccedilatildeo mediada pela
topo II indicando que as proteiacutenas KAPrsquos dos tripanosomatiacutedeos podem apresentar
diferentes funccedilotildees em diferentes espeacutecies (KAPELLER et al 2011)
Para investigar a importacircncia de TcKAP7 no T cruzi e seu envolvimento ou
natildeo com o rearranjo topoloacutegico do kDNA durante o processo de diferenciaccedilatildeo do
parasita realizamos a deleccedilatildeo do gene TcKAP7 Nenhuma alteraccedilatildeo estrutural ou
morfoloacutegica na rede de kDNA foi observada no mutante de T cruzi para TcKAP7 Do
mesmo modo o parasita mutante natildeo apresentou perfil de crescimento alterado e
foi capaz de se diferenciar nas formas tripomastigotas metaciacuteclicas e infectar ceacutelulas
VERO onde se diferenciaram em formas amastigotas O mesmo foi visto quando foi
realizado o nocaute do gene TcKAP3 (DE SOUZA et al 2010)
Uma das hipoacuteteses para explicar esse fato eacute que alguma outra KAP de T
cruzi possa estar assumindo o papel da TcKAP7 talvez a TcKAP4 que se localiza
nos poacutelos do cinetoplasto quando da inserccedilatildeo dos miniciacuterculos na rede apoacutes serem
replicados na regiatildeo cinetoflagelar A redundacircncia no papel das KAPs faz com que a
rede de kDNA seja compactada e segregada corretamente mesmo na ausecircncia de
uma delas (DE SOUZA et al 2010) Sabe-se que o nocaute do gene Cfkap2 ou do
gene Cfkap3 separadamente natildeo mostrou nenhuma alteraccedilatildeo no fenoacutetipo de C
101
fasciculata Poreacutem a deleccedilatildeo de ambos os genes causou diversas alteraccedilotildees
aumento nos niacuteveis de mRNAs mitocondriais reduccedilatildeo na respiraccedilatildeo inibiccedilatildeo da
divisatildeo celular e acuacutemulo de ceacutelulas com morfologias anormais (AVLIYAKULOV et
al 2004)
Com o intuito de complementar os estudos para a caracterizaccedilatildeo do gene
TcKAP7 foram realizados ensaios de RNA de interferecircncia visando analisar a
funccedilatildeo do gene TbKAP7 ortoacutelogo em T brucei jaacute que a maquinaria de RNAi em T
cruzi eacute inexistente (DA ROCHA et al 2003) Com isso foi visto que a participaccedilatildeo da
TbKAP7 no metabolismo do T brucei eacute essencial jaacute que o silenciamento do gene
TbKAP7 levou agrave reduccedilatildeo da proliferaccedilatildeo celular do parasita corroborando com os
dados encontrados para TbKAP6 (WANG et al 2014)
Esperamos que o conhecimento das diversas moleacuteculas envolvidas na
organizaccedilatildeo e replicaccedilatildeo da rede de kDNA assim como o entendimento dos
mecanismos fisioloacutegicos que ocorrem nesta estrutura tatildeo peculiar que eacute o
cinetoplasto dos tripanosomatiacutedeos possam nos ajudar a esclarecer vaacuterios aspectos
relacionados a biologia destes eucariotos primitivos e a evoluccedilatildeo do genoma
mitocondrial ao longo do processo evolutivo
102
6 CONCLUSOtildeES
Com base nos resultados observados neste trabalho foi possiacutevel concluir
1 ndash A proteiacutena TcKAP7 eacute uma proteiacutena associada ao cinetoplasto de T
cruzi e possui caracteriacutesticas que a identificam como KAPs do tipo histona H1
incluindo seu tamanho e sua composiccedilatildeo de aminoaacutecidos e sua superfiacutecie
eletrostaacutetica
2 ndash TcKAP7 estaacute localizada nos poacutelos do cinetoplasto de T cruzi podendo
estar envolvida na replicaccedilatildeo dos miniciacuterculos
3 - TcKAP7 sofre mudanccedilas conformacionais na presenccedila do kDNA de T
cruzi evidenciando sua interaccedilatildeo com o aacutecido nucleico
4 ndash O mutante de T cruzi para TcKAP7 natildeo apresentou alteraccedilatildeo na
estrutura do cinetoplasto e na morfologia do parasita
5 ndash A proliferaccedilatildeo e a diferenciaccedilatildeo do T cruzi natildeo foram alteradas quando
o parasita teve o gene TcKAP7 deletado do genoma
6 ndash O silenciamento do gene TbKAP7 eacute essencial no metabolismo do T
brucei levando agrave reduccedilatildeo da proliferaccedilatildeo celular do parasita
103
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FLAacuteVIA SOUZA MORINI
CARACTERIZACcedilAtildeO DE TcKAP7 UMA PROTEIacuteNA ASSOCIADA AO
CINETOPLASTO DO PROTOZOAacuteRIO Trypanosoma cruzi
Tese apresentada ao Curso de Poacutes Graduaccedilatildeo em Biologia Celular e Molecular Departamento de Biologia Celular Setor de Ciecircncias Bioloacutegicas Universidade Federal do Paranaacute como requisito parcial agrave obtenccedilatildeo do tiacutetulo de Doutora em Biologia Celular e Molecular Orientador Dr Stenio Perdigatildeo Fragoso
CURITIBA
2015
Agrave vocecirc minha pequena
Ah como era a vida antes de vocecirc chegar mesmo
Era muito mais sem graccedila com certeza
Vocecirc chegou e junto com vocecirc um turbilhatildeo de novidades e no meio
disso tudo uma tese para ser defendida Mas com a sua inocecircncia
entendeu minhas ausecircncias me fez tirar forccedilas da onde eu natildeo sabia para
tocar meu trabalho a diante e terminar a tese A Mama ama vocecirc mais que
tudo Anjinha Esse trabalho eacute dedicado agrave vocecirc minha princesa
Obrigada por fazer parte desta etapa da minha vida gatinha
Ao meu Mozatildeo Meu marido Meu melhor amigo Meu companheiro para o
que der e vier E agora papaizote da nossa Anjinha
Obrigada por me apoiar sempre Me dar forccedilas broncas conselhos de tudo
um pouco Obrigada por fazer a nossa bebezotinha entender a ausecircncia da
mama quando vaacuterias noites vocecirc tinha que fazer ela dormir para eu poder ir no
lab ou ficar escrevendo Sem vocecirc eu natildeo conseguiria vitinha Obrigada
por estar aqui Sempre Tannnnnntoooooo
Agrave vocecircs pentelhos
O que seria de mim sem vocecircs
Vocecircs satildeo minha fortaleza meu porto seguro sempre posso contar com vocecircs
pra tudo tudo mesmo Obrigada pelos conselhos pelas broncas por
nunca me deixar desistir mesmo nos momentos mais difiacuteceis vocecircs sempre
tinham uma palavra que me confortava me encorajava e me fazia seguir em
frente Sem a ajuda de vocecircs esse trabalho natildeo ficaria pronto nunca
Amo vocecircs
AGRADECIMENTOS
Agrave Deus em primeiro lugar por me dar sauacutede vitalidade e acircnimo sempre
E por sempre estar comigo
Ao Dr Stenio Perdigatildeo Fragoso pela orientaccedilatildeo confianccedila dedicaccedilatildeo e
amizade Afinal satildeo 12 anos hein chefe Como vocecirc ainda me aguenta Obrigada
por tudo aprendi e continuo aprendendo muito com vocecirc
Agrave Dra Tatiana Arruda Campos Brasil que me ajudou desde o primeiro
momento em que eu entrei no Laboratoacuterio de Proteiacutenas com seu jeito meigo e
atencioso e com sua experiecircncia me mostrou um mundo novo por qual eu me
apaixonei Sempre com muita paciecircncia me explicava tudo tim tim por tim tim e me
ajudou muuuito na escrita da tese Obrigada Tati
Agrave Dra Lia Medeiros que me ajudou muito com as microscopias Fizemos ateacute
o sacrifiacutecio de ir visualizar uma MET na UFSC em Floripa que chato neacute Brigadatildeo
Lia pela paciecircncia e boa vontade
Ao Dr Paulo Carvalho e a Dra Juliane Fischer que me ajudaram em
experimentos e anaacutelises que nem entraram na tese Sempre muito atenciosos
Obrigada
Aos meus queridos amigos do LAB2 Aqueles que jaacute se foram (Andreacute
Aleatoacuterio Lari Mauriacutecio Baacuterbara Odineacuteia Paacute ) e aqueles que estatildeo laacute ateacute hoje
(Didi Gi Vanessa Felipe Aline Claudinha) Obrigada por fazerem o trabalho ficar
mais divertido Aos meus companheiros de doc Mocircnica e Fernando o trio parada
dura passou por muita coisa junto e tem muita histoacuteria pra contar Obrigada gente
adoro vocecircs
Agraves minhas queridas amigas mais ldquoexperientesrdquo que moram no meu coraccedilatildeo
Aldinha e Dani obrigada por todos os momentos que passamos juntas no lab e fora
do lab obrigada pela a ajuda que sempre me deram sem esperar nada em troca
vocecircs sabem que seus conselhos sempre foram muito valiosos pra mim Obrigada
amigas vocecircs satildeo iacutempares
Agrave minha querida irmatildezinha Rocirc que nasceu no mesmo dia soacute que eacute mais
velha hahahahaha Obrigada amiga por tudo por todo esse tempo pelos
experimentos pelas confissotildees pelas gargalhadas Vocecirc eacute uacutenica
Agrave Pri Hira Mari Serpeloni Haruo Daisy Vanessa que sempre me ajudavam
quando eu precisava ou fazer um experimento ou jogar conversa fora
Aos meus amigos doutores atleticanos Michel e Henrique que me ajudaram
em vaacuterios experimentos e anaacutelises Obrigada por estarem sempre dispostos em
ajudar Vocecircs satildeo atleticanos mas satildeo gente boa Obrigada
Ao Giovany pela imensa ajuda com os camundongos sempre disposto em
ajudar e ensinar
Ao Nilson Silvio Tacircnia Sibelli por toda a ajuda pela amizade e pela
paciecircncia e competecircncia Ah e pelas histoacuterias de terror
Agrave Maria Cristina por toda a ajuda natildeo soacute na parte administrativa e pela
amizade
Ao Dr Marco Krieger pela confianccedila e por me proporcionar suporte
financeiro quando entrei no periacuteodo de prorrogaccedilatildeo
A todos os amigos e pesquisadores do Instituto Carlos Chagas dos demais
laboratoacuterios Lab REG Lab Genocircmica Laboratoacuterio de Biologia Celular por terem de
um jeito ou de outro participado do processo Eacute difiacutecil agradecer todo mundo
Valeu galera
ldquoTenho a impressatildeo de ter sido uma crianccedila brincando agrave
beira-mar divertindo-me em descobrir uma pedrinha
mais lisa ou uma concha mais bonita que as outras
enquanto o imenso oceano da verdade continua
misterioso diante de meus olhosrdquo
(Isaac Newton)
RESUMO
O DNA do cinetoplasto (kDNA) dos tripanosomatiacutedeos consiste numa rede de
moleacuteculas circulares catenadas entre si os miniciacuterculos e os maxiciacuterculos Os
miniciacuterculos codificam RNAs guias (gRNAs) e os maxiciacuterculos codificam para
algumas subunidades de enzimas mitocondriais e rRNA em um padratildeo
criptografado (ediccedilatildeo de RNA) Estudos com o tripanosomatiacutedeo Crithidia fasciculata
mostraram que proteiacutenas do tipo histona H1 associadas ao cinetoplasto (KAPs) satildeo
capazes de condensar a rede de kDNA Poreacutem pouco eacute conhecido sobre estas
proteiacutenas de Trypanosoma cruzi um protozoaacuterio parasita que sofre alteraccedilotildees na
estrutura do DNA do cinetoplasto ao longo de seu ciclo de vida Neste trabalho foi
caracterizada uma proteiacutena associada ao cinetoplasto de T cruzi denominada de
TcKAP7 que possui baixo peso molecular e natureza baacutesica condizente com um
papel na neutralizaccedilatildeo de carga e na condensaccedilatildeo do DNA Atraveacutes de ensaios
usando a teacutecnica de espalhamento de raios-X a baixo acircngulo (SAXS) foi possiacutevel
perceber que a proteiacutena TcKAP7 sofre mudanccedilas estruturais na presenccedila do kDNA
sugerindo uma interaccedilatildeo com essa estrutura seja atraveacutes de ligaccedilotildees eletrostaacuteticas
ou atraveacutes de ligaccedilotildees especiacuteficas com moleacuteculas presentes na rede A anaacutelise pela
teacutecnica de imunofluorescecircncia mostrou que proteiacutena TcKAP7 estaacute localizada na
regiatildeo dos poacutelos do cinetoplasto o que sugere que pode estar envolvida na
finalizaccedilatildeo da replicaccedilatildeo dos miniciacuterculos Mutante nulo para TcKAP7 foi gerado por
teacutecnicas de substituiccedilatildeo gecircnica a fim de verificar se na ausecircncia de TcKAP7
ocorriam alteraccedilotildees na estrutura do kDNA Contudo os parasitas mutantes para
TcKAP7 natildeo apresentavam alteraccedilotildees na estrutura e morfologia do cinetoplasto
quando analisados por microscopia eletrocircnica e foram capazes de se diferenciar
sem perder a capacidade infectiva Entretanto ensaios de RNA de interferecircncia
visando analisar a funccedilatildeo do gene TbKAP7 ortoacutelogo em T brucei levou agrave reduccedilatildeo
da proliferaccedilatildeo celular das formas prociacuteclicas desse parasita mostrando que este
gene eacute essencial para o metabolismo desse tripanosomatiacutedeo sugerindo que KAP7
possa ter papeis distintos em T cruzi e T brucei
Palavras-chaves Trypanosoma cruzi cinetoplasto nocaute KAPs
ABSTRACT
The kinetoplast DNA (kDNA) of trypanosomatids consists in a network of circular
molecules catenated each other the minicircles and maxicircles The minicircles
code RNAs guides (gRNAs) and the maxicircles code for some subunits of
mitochondrial enzymes and rRNA in a cryptic pattern (RNA editing) Studies in the
trypanosomatid protozoan Crithidia fasciculata showed that the kDNA is associated
with histone H1-like proteins known as kinetoplast-associated proteins (KAPs) wich
are capable of condensing the kDNA network However little is known about these
proteins of Trypanosoma cruzi a protozoan parasite which undergoes changes in
kinetoplast DNA structure over its life cycle Here we characterize a protein
associated with T cruzi kinetoplast named TcKAP7 TcKAP7 is a low molecular
weight protein with basic nature which is consistent with a role in DNA charge
neutralization and condensation Analysis by small angle X-Ray scattering technique
(SAXS) revealed that the TcKAP7 protein undergoes structural changes in the
presence kDNA suggesting an interaction with this DNA network either through
electrostatic bonds or through specific binding to molecules present on the network
The immunofluoresce analysis showed that TcKAP7 is located in the kinetoplast
poles suggesting that TcKAP7 might be involved in the late stages of the minicircle
replication A null mutant for TcKAP7 was obtained by gene replacement techniques
to study possible alterations in the kDNA structure However no modification in the
structure and morphology of the kinetoplast was observed by electron microscopy In
addition Tckap7 null mutant was able to differentiate without losing its infective
capacity Interference RNA assays was performed to analyze the function of
TbKAP7 the ortholog gene in T brucei The ablation of TbKAP7 expression leaded
to reduction in the procyclic proliferation suggesting that this gene is essential for the
metabolism of the parasite and might play distinct roles in T cruzi and T brucei
Key-words Trypanosoma cruzi kinetoplast gene knockout KAPs
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1 DISTRIBUICcedilAtildeO GEOGRAacuteFICA DA DOENCcedilA
DE CHAGAS19 FIGURA 2 CICLO DE TRANSMISSAtildeO DO
Trypanosoma cruzi20 FIGURA 3 ESQUEMA GERAL DAS PRINCIPAIS ESTRUTURAS
CELULARES DE T cruzi 22 FIGURA 4 REDE DE kDNA27 FIGURA 5 DIFERENTES ARRANJOS DO CINETOPLASTO
DE T cruzi29 FIGURA 6 MUDANCcedilAS NA POSICcedilAtildeO DO KDNA
NOS TRYPANOSOMAS29 FIGURA 7 REPOSICIONAMENTO DO KDNA EM RELACcedilAtildeO
AgraveS OUTRAS ORGANELAS DURANTEO CICLO DE VIDA DE UM FLAGELADO30
FIGURA 8 REPLICACcedilAtildeO DO kDNA32 FIGURA 9 REPRESENTACcedilAtildeO ESQUEMAacuteTICA DO
MICROFLUIDIFICADOR45 FIGURA 10 VETOR PARA EXPRESSAtildeO EM T CRUZI
P3XFLAG 50 FIGURA 11 ESQUEMA DA CONSTRUCcedilAtildeO DOS VETORES
UTILIZADOS PARA O NOCAUTE DO GENE TcKAP755
FIGURA 12 MAPA DO VETOR P2T7-177 UTILIZADO PARA ENSAIOS DE RNAi62
FIGURA 13 COMPARACcedilAtildeO ENTRE AS SEQUumlEcircNCIAS DE AMINOAacuteCIDOS DEDUZIDAS DO GENE KAP7 DE T cruzi Dm28C E DOS HAPLOacuteTIPOS DE CL BRENER65
FIGURA 14 COMPARACcedilAtildeO ENTRE AS SEQUumlEcircNCIAS DE AMINOAacuteCIDOS DEDUZIDAS DO GENE KAP7 EM DIFERENTES TRIPANOSOMATIacuteDEOS66
FIGURA 15 SINTENIA DE TcKAP7 COM OUTROS TRIPANOSOMATIacuteDEOS67
FIGURA 16 CARACTERIZACcedilAtildeO DA REGIAtildeO 5rsquo-UTR DO TRANSCRITO TcKAP769
FIGURA17 ANAacuteLISE DA EXPRESSAtildeO DA PROTEIacuteNA DE FUSAtildeO TCKAP7-FLAG EM FORMAS EPIMASTIGOTAS DE T CRUZI70
FIGURA 18 IMUNOLOCALIZACcedilAtildeO DE TcKAP7 EM EPIMASTIGOTAS DE T CRUZI71
FIGURA 19 ENSAIOS DE PCR UTILIZANDO DNA DE T cruzi kap7kap7 (WT) E T cruzi kap7neokap7higro (NO) COM DIFERENTES PRIMERS73
FIGURA 20 REPRESENTACcedilAtildeO ESQUEMAacuteTICA DOS SIacuteTIOS DA ENZIMA HindIII NO LOCUS DO GENE KAP7 DE T cruzi CL Brener75
FIGURA 21 ANAacuteLISE DA ORGANIZACcedilAtildeO DOS GENES TCKAP7 NEO E HIGRO POR ENSAIO DO TIPO SOUTHERN BLOT75
FIGURA 22 COMPARACcedilAtildeO DA EXPRESSAtildeO DO GENE TcKAP7 POR WESTERN BLOT76
FIGURA 23 COLORACcedilAtildeO PELO MEacuteTODO PANOacuteTICO RAacutePIDO DOS PARASITAS EPIMASTIGOTAS NOCAUTEADOS77
FIGURA 24 COMPARACcedilAtildeO ENTRE A ULTRAESTRUTURA DO CINETOPLASTO DO T cruzi DM28C TIPO SELVAGEM (A) E DO MUTANTE DE T cruzi PARA TcKAP7 (B) POR MICROSCOPIA ELETROcircNICA DE TRANSMISSAtildeO78
FIGURA 25 CURVA DE CRESCIMENTO DO MUTANTE DE T cruzi PARA TcKAP7 (KO) E DO T cruzi Dm28c SELVAGEM (WT) 79
FIGURA 26 METACICLOGEcircNESE IN VITRO DE T cruzi Dm28c TIPO SELVAGEM E T cruzi NOCAUTEADO80
FIGURA 27 RNAi DE TbKAP7 INIBE O CRESCIMENTO DAS FORMAS PROCIacuteCLICAS DE T brucei82
FIGURA 28 PURIFICACcedilAtildeO DE TCKAP7 ATRAVEacuteS DE CROMATOGRAFIA DE AFINIDADE83
FIGURA 29 PURIFICACcedilAtildeO DE TCKAP7 ATRAVEacuteS DE CROMATOGRAFIA DE TROCA IOcircNICA84
FIGURA 30 ANAacuteLISE POR DLS DE TCKAP785 FIGURA 31 ENVELOPE MOLECULAR DE SAXS86 FIGURA 32 ESPECTRO DE DICROIacuteSMO CIRCULAR DE
TcKAP787 FIGURA 33 PREDICcedilAtildeO DE ESTRUTURA SECUNDAacuteRIA DE
TcKAP787 FIGURA 34 CRISTAL DE TcKAP7 DE T CRUZI88 FIGURA 35 ESTRUTURA DE TcKAP790 FIGURA 36 SUPERFIacuteCIE ELETROSTAacuteTICA DE
TcKAP791 FIGURA 37 ALINHAMENTO ESTRUTURAL DE 3TQ6 4NOD
3TTM 4NNU E TCKAP793 FIGURA 38 ESPECTRO DE DICROIacuteSMO CIRCULAR
DE TcKAP794 FIGURA 39 ENVELOPE MOLECULAR DETcKAP795 FIGURA 40 ENVELOPE MOLECULAR DETcKAP7 VISTO EM
DIFERENTES AcircNGULOS96
LISTA DE TABELAS
TABELA 1 RELACcedilAtildeO DOS PRIMERS UTILIZADOS PARA A CLONAGEM DA REGIAtildeO UPSTREAM DE TcKAP7 NO VETOR pNEO153
TABELA 2 RELACcedilAtildeO DOS PRIMERS UTILIZADOS PARA A CLONAGEM DA REGIAtildeO DOWNSTREAM DE TcKAP7 NO VETOR pNEO153
TABELA 3 RELACcedilAtildeO DOS PRIMERS UTILIZADOS PARA A AMPLIFICACcedilAtildeO DO GENE TbKAP763
TABELA 4ndash PERCENTUAL DE IDENTIDADE ENTRE AS PROTEIacuteNAS KAP7 NOS TRIPANOSSOMATIacuteDEOS COM O GENOMA SEQUENCIADO67
TABELA 5 COMBINACcedilOtildeES DE PRIMERS UTILIZADOS NA PCR PARA CONFIRMAR O NOCAUTE DE TcKAP772
SUMAacuteRIO
1 INTRODUCcedilAtildeO18 11 O Trypanosoma cruzi18 12 Ciclo de vida do T cruzi20 13 Aspectos celulares de T cruzi21 14 O genoma de T cruzi24 15 Expressatildeo gecircnica de Tcruzi25 16 O cinetoplasto26 17 A rede de kDNA26 171 Replicaccedilatildeo do kDNA31 18 Proteiacutenas associadas ao cinetoplasto (KAPs)32 2 OBJETIVOS35 21 OBJETIVO GERAL35 211 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS35 3 MATERIAIS E MEacuteTODOS36 31 Reagentes e Soluccedilotildees Utilizados36 311 Reagentes36 312 Tampotildees e Soluccedilotildees36 313 Meios de cultura38 32 Cultivo do Trypanosoma cruzi38 321 Epimastigotas38 322 Tripomastigotas metaciacuteclicos39 33 Curva de crescimento de T cruzi39 34 Obtenccedilatildeo de DNA de T cruzi40 35 Obtenccedilatildeo de kDNA de T cruzi40 36 Obtenccedilatildeo de extrato proteico de T cruzi40 37 Clonagem do gene TcKAP741 38 Obtenccedilatildeo do cDNA de TcKAP7 atraveacutes de ensaio de RT-PCR41 39 Seleccedilatildeo dos clones recombinantes42 391 Teacutecnica de palitagem (toothpick)42 392 Teacutecnica de PCR de colocircnia43 310 Preparaccedilatildeo de plasmiacutedeo em pequena escala (miniprep)43 311 Expressatildeo da proteiacutena TcKAP7 em E coli43 312 Purificaccedilatildeo da proteiacutena recombinante TcKAP744 3121 Processamento da amostra44 3122 Cromatografia de afinidade45 3123 Cromatografia de troca iocircnica46 3124 Cromatografia de gel filtraccedilatildeo46 313 Espalhamento Dinacircmico de Luz ndash DLS46 314 Espectroscopia de dicroiacutesmo circular (CD)46 315 Quantificaccedilatildeo e concentraccedilatildeo47 316 Ensaios de Cristalizaccedilatildeo47 317 Espalhamento de raio-X a baixo acircngulo (SAXS)48 318 Modelagem de TcKAP748 319 Obtenccedilatildeo de antissoro policlonal contra TcKAP749 320 Anaacutelise da expressatildeo do gene TcKAP7 e de seu mutante por ensaio tipo western blot49 321 Superexpressatildeo de TcKAP750
3211 Amplificaccedilatildeo e clonagem do gene TcKAP7 no vetor pNEO3xFlag para superexpressatildeo da proteiacutena50 3212 Transfecccedilatildeo por eletroporaccedilatildeo52 3213 Seleccedilatildeo dos transfectantes52 322 Deleccedilatildeo do gene TcKAP7 por nocaute gecircnico53 3221 Amplificaccedilatildeo e clonagem das regiotildees a montante e a jusante do gene TcKAP753 3222 Amplificaccedilatildeo dos cassetes UPS-NEO-DOWN e UPS-HIGRO-DOWN para transfecccedilatildeo de T cruzi55 3223 Transfecccedilatildeo do T cruzi com o cassete UPS-NEO-DOWN56 3224 Extraccedilatildeo de DNA dos transfectantes57 3225 Anaacutelise por PCR do DNA dos parasitas transfectados com o cassete UPS-NEO-DOWN57 3226 Transfecccedilatildeo do T cruzi com o cassete UPS-HIGRO-DOWN57 3227 Anaacutelise por PCR do DNA dos parasitas transfectados com o cassete UPS-HIGRO-DOWN58 3228 Anaacutelise da organizaccedilatildeo do gene TcKAP7 e da eficiecircncia de seu nocaute atraveacutes de ensaio do tipo Southern blot58 323 Localizaccedilatildeo celular da proteiacutena TcKAP7 atraveacutes de ensaio de imunofluorescecircncia59 324 Anaacutelise da ultraestrutura do cinetoplasto do mutante de T cruzi para TcKAP7 por microscopia eletrocircnica de transmissatildeo60 325 Coloraccedilatildeo dos parasitas transfectados60 326 Infecccedilatildeo de ceacutelulas Vero com o mutante de T cruzi para TcKAP761 327 Anaacutelise da funccedilatildeo do gene TbKAP7 de Trypanosoma brucei atraveacutes de ensaios de RNA de interferecircncia61 3271 Induccedilatildeo do RNA dupla fita64 4 RESULTADOS65 41 Clonagem e caracterizaccedilatildeo do gene TcKAP765 42 Expressatildeo da proteiacutena TcKAP7 em T cruzi69 43 Localizaccedilatildeo celular de TcKAP7 atraveacutes de ensaio de imunofluorescecircncia70 44 Deleccedilatildeo do gene TcKAP7 por nocaute gecircnico71 441 Anaacutelise por PCR do DNA dos parasitas transfectados com os cassetes UPS-NEO-DOWN e UPS-HIGRO-DOWN72 442 Anaacutelise da organizaccedilatildeo dos genes TcKAP7 neo e higro por ensaio do tipo Southern blot74 45 Comparaccedilatildeo da expressatildeo do gene TcKAP7 por western blot76 46 Anaacutelise da morfologia e da ultraestrutura do cinetoplasto do mutante de T cruzi para TcKAP776 47 Multiplicaccedilatildeo diferenciaccedilatildeo e infectividade do mutante de T cruzi para TcKAP779 48 Anaacutelise da funccedilatildeo do gene KAP7 de Trypanosoma brucei atraveacutes de ensaios de RNA de interferecircncia80 49 Caracterizaccedilatildeo estrutural de TcKAP782 491 Produccedilatildeo recombinante de TcKAP782 410 Anaacutelise do estado oligomeacuterico de TcKAP784 411 Anaacutelise do conteuacutedo de estrutura secundaacuteria de TcKAP7 recombinante86 412 Anaacutelise estrutural de TcKAP787
413 Investigaccedilatildeo de possiacuteveis funcionalidades baseadas na estrutura de TcKAP791 4131 Prediccedilatildeo de funccedilatildeo paraTcKAP791 4132 Anaacutelises preliminares da possiacutevel interaccedilatildeo entre TcKAP7 e kDNA93 5 DISCUSSAtildeO97 6 CONCLUSOtildeES102 7 REFEREcircNCIAS103
18
1 INTRODUCcedilAtildeO
11 O Trypanosoma cruzi
Trypanosoma cruzi eacute um protozoaacuterio flagelado unicelular pertencente ao
reino Protista subreino Protozoa filo Sarcomastigophora subfilo Mastigophora
classe Zoomastigophora ordem Kinetoplastida e famiacutelia Trypanosomatidae (LEVINE
et al 1980) A principal caracteriacutestica dessa ordem eacute a presenccedila de uma estrutura
singular o cinetoplasto que abriga em uma massa de DNA extranuclear
concentrado na mitococircndria uacutenica deste protista (SHAPIRO amp ENGLUND 1995) A
famiacutelia Trypanosomatidae inclui os seguintes gecircneros importantes Blastocrithidia
Crithidia Endotrypanum Herpetomonas Leishmania Leptomonas Phytomonas e
Trypanosoma O gecircnero Trypanosoma eacute um dos mais importantes dentro da famiacutelia
Trypanosomatidae por incluir uma seacuterie de espeacutecies causadoras de doenccedilas
humanas importantes como o Trypanosoma cruzi agente da doenccedila de Chagas
Trypanosoma rhodesiense e Trypanosoma gambiense agentes da doenccedila do sono
e de animais o Trypanosoma brucei Trypanosoma equiperdum e Trypanosoma
equinum (DE SOUZA 2015)
Este protozoaacuterio eacute um microrganismo heteroxecircnico com ciclo bioloacutegico
alternado entre hospedeiros vertebrados (mamiacuteferos) e invertebrados (triatomiacuteneos)
Existem diferentes formas de transmissatildeo da doenccedila dentre as quais se destaca a
via vetorial que consiste na transmissatildeo do parasita atraveacutes de excretas do inseto
vetor hematoacutefago pertencente agrave ordem Hemiacuteptera famiacutelia Reduvidae subfamiacutelia
Triatominae (DIAS et al 1956) A principal caracteriacutestica bioloacutegica dos triatomiacuteneos
eacute que satildeo obrigatoriamente hematoacutefagos e necessitam do repasto sanguiacuteneo para
completar o desenvolvimento (DIAS 2000) O parasita pode ainda ser transmitido
aos mamiacuteferos por transfusatildeo sanguiacutenea ou via oral e com menos frequecircncia por
via congecircnita acidentes de laboratoacuterio e transplantes de oacutergatildeos (BELTRAO HDE et
al 2009 STEINDEL et al 2008 TANOWITZ et al 1992) Praticamente todo tipo
de ceacutelula nucleada do hospedeiro mamiacutefero pode ser parasitada considerando o
tropismo das diferentes cepas (LENZI et al 1996) Outra caracteriacutestica deste
parasita eacute apresentar diferentes morfologias durante o ciclo bioloacutegico A classificaccedilatildeo
19
de suas formas baseia-se tambeacutem na posiccedilatildeo do cinetoplasto em relaccedilatildeo ao nuacutecleo
e do local de onde emerge o flagelo (HOARE 1971)
Foi no ano de 1909 no estado de Minas Gerais que Carlos Chagas meacutedico
sanitarista identificou pela primeira vez o protozoaacuterio parasita Trypanosoma cruzi
agente causador da Doenccedila de Chagas A doenccedila de Chagas eacute endecircmica na
Ameacuterica Latina sendo conhecida a existecircncia de vetores da doenccedila desde o sul dos
Estados Unidos agrave Argentina (FIGURA 1)
FIGURA 1 DISTRIBUICcedilAtildeO GEOGRAacuteFICA DA DOENCcedilA DE CHAGAS FONTE Modificado de httpwwwwhointen
Em 2008 o nuacutemero de indiviacuteduos infectados era estimado entre 16 e 18
milhotildees sendo que aproximadamente 90 milhotildees de pessoas estariam sob risco
de contaminaccedilatildeo na Ameacuterica Latina (WHO 2010)
Apesar de existirem drogas (Nifurtimox e Benzonidazol) para o tratamento
da doenccedila sua ineficaacutecia no estaacutegio crocircnico e sua accedilatildeo toacutexica acabam prejudicando
o paciente sem conseguir eliminar o parasita (BRENER et al 2000) Sem vacinas
ou tratamento quimioteraacutepico eficiente a principal estrateacutegia de controle limita-se agrave
prevenccedilatildeo da transmissatildeo por transfusatildeo sanguiacutenea e ao controle populacional dos
vetores triatomiacuteneos Aleacutem da sua importacircncia como patoacutegeno humano este micro-
organismo apresenta caracteriacutesticas peculiares que o tornam um excelente modelo
para o estudo de questotildees bioloacutegicas baacutesicas
Regiotildees endecircmicas
20
12 Ciclo de vida do T cruzi
O T cruzi apresenta um ciclo complexo na natureza sofrendo mudanccedilas
estruturais bioquiacutemicas e morfoloacutegicas de acordo com o ambiente em que se
encontra Formas replicativas epimastigotas e amastigotas dos hospedeiros
invertebrado e mamiacutefero respectivamente alternam-se com as formas infectivas e
natildeo proliferativas tripomastigotas metaciacuteclicas (proveniente do inseto vetor) e
tripomastigota sanguiacutenea (originaacuteria do mamiacutefero infectado) (FIGURA 2) (DE
SOUZA 1984)
FIGURA 2 CICLO DE TRANSMISSAtildeO DO Trypanosoma cruzi FONTE Infograacutefico Veniacutecio Ribeiro ICICTFIOCRUZ
Durante o repasto sanguiacuteneo do inseto vetor formas tripomastigotas
metaciacuteclicas atingem a corrente sanguiacutenea do hospedeiro pela lesatildeo da picada Esta
forma infectiva eacute capaz de invadir todos os tipos de ceacutelulas com exceccedilatildeo das
21
hemaacutecias Apoacutes a entrada do parasita na ceacutelula os tripomastigotas diferenciam-se
em uma forma replicativa denominada amastigota que apoacutes diversas divisotildees sofre
uma diferenciaccedilatildeo para um estaacutegio intermediaacuterio o epimastigota intracelular e
posteriormente para tripomastigota Quando ocorre a lise celular os tripomastigotas
satildeo liberados ao meio extracelular podendo entatildeo invadir ceacutelulas vizinhas atingir
novos tecidos atraveacutes da corrente sanguiacutenea ou ainda infectar um inseto vetor
durante o processo de hematofagia recomeccedilando o ciclo no hospedeiro
invertebrado No inseto as formas tripomastigotas diferenciam-se em epimastigotas
no tubo digestivo e migram para o intestino onde ocorrem as divisotildees binaacuterias Ao
atingirem a porccedilatildeo terminal do tubo digestivo ocorre a diferenciaccedilatildeo em
tripomastigotas metaciacuteclicos que satildeo eliminados juntamente com as fezes e urina do
triatomiacutedeo
A transformaccedilatildeo da forma epimastigota do T cruzi em tripomastigota
metaciacuteclica denominada metaciclogecircnese eacute de grande interesse de estudo pois
neste processo ocorrem diversas alteraccedilotildees morfoloacutegicas metaboacutelicas e de
expressatildeo gecircnica (GOLDENBERG et al 1985) A metaciclogecircnese que ocorre
naturalmente no intestino do inseto vetor pode ser mimetizada in vitro utilizando-se
meio quimicamente definido que simula as condiccedilotildees da urina do inseto vetor
(CONTRERAS et al 1985)
13 Aspectos celulares de T cruzi
O Trypanosoma cruzi apresenta aleacutem das organelas tiacutepicas da maioria das
ceacutelulas eucarioacuteticas como nuacutecleo retiacuteculo endoplasmaacutetico aparato de Golgi e
mitococircndria algumas estruturas peculiares (FIGURA 3) como os microtuacutebulos
subpeliculares a estrutura paraflagelar os reservossomos o cinetoplasto os
glicossomos e os acidocalcisomos exclusivos dos tripanosomatiacutedeos (revisto por
DE SOUZA 1984 1999 2002)
22
FIGURA 3 ESQUEMA GERAL DAS PRINCIPAIS ESTRUTURAS CELULARES DE T cruzi FONTE DOCAMPO et al 1975
A superfiacutecie celular dos tripanossomatiacutedeos eacute composta principalmente
pela membrana plasmaacutetica e pelos microtuacutebulos subpeliculares Pequenos
filamentos conectam fortemente os microtuacutebulos subpeliculares os quais se
apresentam espaccedilados de forma regular entre si e com a membrana plasmaacutetica (DE
23
SOUZA SANTANNA CUNHA-E-SILVA 2009) conferindo rigidez agrave ceacutelula e
resistecircncia ao rompimento mecacircnico
Todos os membros da famiacutelia Trypanosomatidae apresentam um flagelo
que emerge de uma aacuterea de invaginaccedilatildeo da membrana plasmaacutetica conhecida como
bolsa flagelar Devido agrave localizaccedilatildeo especiacutefica de vaacuterios receptores nesta aacuterea
acredita-se que a maior parte do traacutefego vesicular e entrada de nutrientes ocorram
nesta regiatildeo Outra invaginaccedilatildeo menor localizada proacutexima agrave bolsa flagelar o
citoacutestomo tambeacutem estaacute envolvida com a absorccedilatildeo de nutrientes (PORTO-
CARREIRO et al 2000)
O flagelo do T cruzi apresenta uma estrutura baacutesica semelhante a outros
flagelos sendo envolvido por uma membrana flagelar e contendo um axonema
tiacutepico que apresenta um padratildeo de nove pares de microtuacutebulos perifeacutericos e um par
central Associado ao flagelo deste parasita eacute encontrado um complexo arranjo de
filamentos proteacuteicos denominado de estrutura paraflagelar (revisto por GULL 1999)
Na parte posterior da ceacutelula existem organelas usualmente esfeacutericas
denominadas reservossomos Os reservossomos satildeo organelas aacutecidas que
possuem em seu interior proteinases principalmente a cruzipaiacutena (uma
cisteiacutenoproteinase) e proteiacutenas ingeridas que chegam dentro de vesiacuteculas
endociacuteticas oriundas da bolsa flagelar e do citoacutestomo Com base nisso foi proposto
que os reservossomos seriam compartimentos preacute-lisossomais (SOARES et al
1992) Tambeacutem tem sido proposta a participaccedilatildeo dos reservossomos no processo
de metaciclogecircnese como principal fonte de energia para esta atividade (SOARES
1999)
O T cruzi assim como todos os membros da famiacutelia Tripanosomatidae
apresenta uma mitococircndria uacutenica e ramificada que se estende por todo o corpo do
protozoaacuterio Como em todas as ceacutelulas eucarioacuteticas a mitococircndria dos
tripanosomatiacutedeos tambeacutem apresenta DNA mitocondrial tambeacutem conhecido como
kDNA ou DNA do cinetoplasto que se concentra em uma determinada regiatildeo da
mitococircndria localizada logo abaixo do corpuacutesculo basal dando origem a uma
estrutura intramitocondrial chamada de cinetoplasto O cinetoplasto abriga o kDNA
o qual eacute constituiacutedo por moleacuteculas circulares que se encontram interligadas
formando uma extensa rede entre si (SHLOMAI 1994)
Distribuiacutedos pelo citoplasma estatildeo os glicossomos um tipo especializado de
peroxissomo Estes acumulam enzimas da via glicoliacutetica envolvidas na conversatildeo
24
da glicose a 3-fosfoglicerato que em outros organismos localizam-se no citoplasma
(HANNAERT et al 2003)
Outra particularidade dos tripanossomatiacutedeos estaacute na estocagem intracelular
de caacutelcio Este iacuteon importante nos processos de sinalizaccedilatildeo celular eacute estocado em
organelas denominadas acidocalcissomos Os acidocalcissomos provavelmente
estatildeo envolvidos em diversos processos bioloacutegicos tais como o armazenamento de
caacutelcio e polifosfatos adaptaccedilatildeo dos tripanosomatiacutedeos a condiccedilotildees de estresse
ambiental manutenccedilatildeo do pH intracelular e osmorregulaccedilatildeo (revisto por DOCAMPO
et al 2005)
14 O genoma de T cruzi
No ano de 2005 foi concluiacuteda a montagem do genoma do T cruzi (EL-
SAYED et al 2005) A cepa CL Brener foi a escolhida para o sequenciamento por
ser bem caracterizada bioquiacutemica e parasitologicamente (ZINGALES et al 1997) e
por ser considerada representativa para o universo de cepas circulantes de T cruzi
Com base na montagem do sequenciamento o genoma diploacuteide do parasita foi
calculado como sendo de 1064 1107 Mb com cada haploacutetipo contendo cerca de
12000 genes sendo que mais de 50 do genoma constituiu-se de sequecircncias
repetitivas compostas por famiacutelias de proteiacutenas de superfiacutecie retrotransposons e
elementos subtelomeacutericos (EL-SAYED et al 2005)
A comparaccedilatildeo das estruturas genocircmicas e proteiacutenas preditas obtidas a
partir do sequenciamento de Trypanosoma cruzi com as de Leishmania major e
Trypanosoma brucei indica mais similaridade entre T cruzi e T brucei uma grande
conservaccedilatildeo entre os respectivos proteomas (exceto para antiacutegenos de superfiacutecie) e
uma sintenia bastante conservada entre os trecircs tripanosomatiacutedeos apesar da
divergecircncia haacute 200-500 milhotildees de anos atraacutes (BERRIMAN et al 2005 EL SAYED
et al 2005 IVENS et al 2005)
Os tripanosomatiacutedeos possuem aleacutem do genoma nuclear um grande
genoma mitocondrial (kDNA) que tem sido extensivamente estudado sendo uacutenico
em estrutura funccedilatildeo e mecanismo de replicaccedilatildeo O kDNA eacute formado por milhares de
moleacuteculas circulares topologicamente relaxadas e interligadas umas as outras Este
arranjo conteacutem aproximadamente 20 - 30 do DNA total dos tripanosomatiacutedeos e eacute
composto por 2 tipos de moleacuteculas circulares os maxiciacuterculos e os miniciacuterculos Os
25
maxiciacuterculos apresentam um tamanho entre 22-37 kb e conteacutem basicamente os
genes codificadores de proteiacutenas envolvidas na fosforilaccedilatildeo oxidativa e RNA
ribossocircmico Os miniciacuterculos com um tamanho que varia de espeacutecie para espeacutecie
(05 a 25 kb) conteacutem os genes que codificam os RNAs guia envolvidos na
editoraccedilatildeo do RNA (STUART et al 1989 SHAPIRO amp ENGLUND 1995 MADISON-
ANTENUCCI et al 2002 SIMPSON et al 2003 ONN et al 2006 GLUENZ et al
2007)
15 Expressatildeo gecircnica de Tcruzi
T cruzi estaacute sujeito agraves frequentes mudanccedilas de ambientes decorrentes da
passagem por diferentes hospedeiros durante seu ciclo de vida (temperatura pH
quantidade de nutrientes evasatildeo do sistema imune) por esse motivo a expressatildeo
gecircnica deste parasita eacute regulada por diversos fatores A adaptaccedilatildeo raacutepida e eficiente
a estas diferentes condiccedilotildees torna-se uma importante tarefa para o parasita
Como os demais eucariotos o T cruzi apresenta trecircs RNAs polimerases a
RNA polimerase I transcreve os genes para RNAs ribossocircmicos a RNA polimerase
II os genes que codificam proteiacutenas e a RNA polimerase III pequenos RNAs como
o tRNA (RNA de transferecircncia) Nos tripanosomatiacutedeos promotores para as RNA
polimerase I e III jaacute foram identificados poreacutem ainda natildeo foram identificados
promotores para os genes transcritos pela RNA polimerase II com exceccedilatildeo de um
promotor associado ao gene do mini-exon (GILLINGER amp BELLOFATTO 2001
revisto por CAMPBELL et al 2003)
Os genes dos tripanosomatiacutedeos estatildeo organizados em unidades
policistrocircnicas e natildeo apresentam interrupccedilotildees por iacutentrons com exceccedilatildeo do gene da
poli-A polimerase (MAIR et al 2000)
Uma vez que em T cruzi como nos demais eucariotos somente mRNAs
monocistrocircnicos satildeo traduzidos os precursores de mRNA policistrocircnicos devem ser
processados ateacute mRNAs individuais Como caracteriacutestica desta famiacutelia os
transcritos de mRNA satildeo processados por mecanismos de trans-splicing (AGABIAN
1990) e poliadenilaccedilatildeo (LEBOWITZ et al 1993 MATTHEWS et al 1994
VANHAMME amp PAYS 1995)
No processo de trans-splicing as unidades codificadoras satildeo separadas e eacute
adicionada na extremidade 5rsquo uma sequecircncia extremamente conservada espeacutecie-
26
especiacutefica de 39 nucleotiacutedeos denominada sequumlecircncia liacuteder (SL) ou minieacutexon
(McCARTHY-BURKE et al 1989 NILSEN 1992 VANHAMME amp PAYS 1995)
Nesta reaccedilatildeo participam duas moleacuteculas de RNA uma doadora e outra aceptora A
doadora eacute um precursor do mini-exon e em T cruzi possui cerca de 110
nucleotiacutedeos (ZWIERZYNSKI amp BUCK 1991) A aceptora eacute o transcrito derivado da
unidade policistrocircnica ao qual o mini-exon eacute transferido O complexo enzimaacutetico
envolvido nesta reaccedilatildeo eacute semelhante ao descrito para a de cis-splicing (LAIRD
1989)
Os transcritos processados satildeo estabilizados pela estrutura cap 4 do mini-
exon (ULLU amp TSCHUDI 1991) e pela adiccedilatildeo de uma cauda poli-A agrave extremidade
3rsquo sendo que a adiccedilatildeo de ambos os elementos ocorrem em conjunto (LEBOWITZ et
al 1993) Regiotildees ricas em resiacuteduos de pirimidinas aleacutem da sequumlecircncia consenso
(AG) para o trans-splicing regulam a adiccedilatildeo do mini-exon e da cauda poli-A
Deleccedilotildees nestas regiotildees impedem o correto processamento destes transcritos
(MATTHEWS et al 1994)
A ocorrecircncia de transcriccedilatildeo policistrocircnica associada agrave ausecircncia de
promotores para RNA polimerase II e agrave presenccedila de niacuteveis distintos de mRNA
originados de uma mesma unidade policistrocircnica sugerem que a regulaccedilatildeo da
expressatildeo gecircnica nesses protozoaacuterios ocorra a niacutevel poacutes-transcricional baseada
principalmente em mecanismos que controlam a estabilidade e a traduccedilatildeo dos
mRNAs (CLAYTON 2002 BOUCHER et al 2002)
16 O cinetoplasto
O cinetoplasto eacute uma estrutura peculiar presente nos tripanosomatiacutedeos e
encontra-se inserida no interior da mitococircndria uacutenica abrigando fibrilas de DNA
conhecidas como kDNA O nome cinetoplasto (cineto=movimento e plasto=organela)
foi dado pois se acreditava que o mesmo fosse responsaacutevel pelo movimento do
flagelo
17 A rede de kDNA
O DNA do cinetoplasto eacute formado por dois tipos de moleacuteculas circulares os
miniciacuterculos de tamanho entre 05 e 25 kb e os maxiciacuterculos que apresentam
entre 20 e 40 kb Cerca de 10000 miniciacuterculos e 50 maxiciacuterculos se encontram
27
catenados formando uma extensa rede (SHAPIRO amp ENGLUND 1995 DE SOUZA amp
CAVALCANTI 2008) (FIGURA 4)
FIGURA 4 REDE DE kDNA
FONTE ROY CHOWDHURY et al 2010
As primeiras questotildees relacionadas ao arranjo das moleacuteculas na rede do
kDNA dos tripanosomatiacutedeos surgiram na deacutecada de 80 sugerindo que tal
organizaccedilatildeo poderia ter evoluiacutedo como um maneira mais eficaz de armazenar uma
grande quantidade de material em um pequeno espaccedilo (HAJDUK et al 1986)
Os maxiciacuterculos apresentam um tamanho de 22 a 37 kb e assim como o
DNA mitocondrial de outros eucariotos codificam RNAs ribossomais e diversas
proteiacutenas da cadeia respiratoacuteria incluindo subunidades da citocromo oxidase e
NADH desidrogenase (revisto por SHAPIRO amp ENGLUND 1995) Os transcritos dos
maxiciacuterculos satildeo processados poacutes-transcricionalmente para formar mRNAs
funcionais atraveacutes de um processo conhecido como ediccedilatildeo ou editoraccedilatildeo do RNA
A editoraccedilatildeo do RNA consiste na inserccedilatildeo ou retirada de resiacuteduos de uridina em
28
siacutetios especiacuteficos dos RNAs transcritos pelos maxiciacuterculos a fim de criar coacutedons de
iniciaccedilatildeo ou terminaccedilatildeo mudanccedilas na fase de leitura ou quadros abertos de leitura a
partir de sequumlecircncias sem sentido O processo de ediccedilatildeo eacute especificado por
pequenos RNAs guias produzidos pelos miniciacuterculos e maxiciacuterculos e catalisado
por um complexo muiltiproteacuteico o editosomo (revisto por Esteacutevez amp Simpson 1999
Stuart et al 2005) Esse processo constitui uma forma de regular poacutes-
transcricionalmente a expressatildeo de genes mitocondriais nas diferentes formas
evolutivas do parasita
Os miniciacuterculos caracterizam-se por apresentar um tamanho de 05 a 25 kb
e por transcrever os RNAs guia (gRNA) responsaacuteveis pela especificidade da ediccedilatildeo
dos mRNAs codificados pelos maxiciacuterculos por meio de uma sequumlecircncia presente na
porccedilatildeo central desses gRNAs (BENNE 1994 STUART et al 2005) A significacircncia
da variaccedilatildeo em tamanho e organizaccedilatildeo entre as espeacutecies ainda natildeo eacute aparente
contudo a diversidade das sequecircncias dos miniciacuterculos estaacute correlacionada com a
necessidade de mais ou menos ediccedilatildeo de mRNA de cada organismo (STUART
1991) Apesar desta diversidade os miniciacuterculos apresentam pelo menos duas
regiotildees conservadas o dodecacircmero GGGGTTGGTGTA conhecido como sequecircncia
universal dos miniciacuterculos (UMS) e o hexacircmero ACGCCC que correspondem agrave
origem de replicaccedilatildeo da fita L (light) e da fita H (heavy) respectivamente
(BIRKENMEYER amp RAY 1986 BIRKENMEYER et al 1987 RAY 1989 SHLOMAI
1994 HINES amp RAY 2008)
Embora o cinetoplasto de todos os tripanosomatiacutedeos seja formado por
moleacuteculas circulares relaxadas e catenadas diferentes arranjos da rede de kDNA
podem ser observados entre diferentes estaacutegios do ciclo de vida desses
protozoaacuterios como em T cruzi (FIGURA 5) assim como mudanccedilas na posiccedilatildeo do
kDNA satildeo utilizadas para identificar as diferentes formas evolutivas do parasita
(FIGURA 6)
29
FIGURA 5 ndash DIFERENTES ARRANJOS DO CINETOPLASTO DE T cruzi
LEGENDA As fibrilas de kDNA se apresentam bastante compactadas em forma de bastatildeo nas formas amastigotas (A) e epimastigotas (B) enquanto nas formas tripomastigotas a rede de kDNA torna-se menos compacta e a forma em bastatildeo do cinetoplasto daacute lugar a uma forma arredondada (C) FONTE DE SOUZA amp SOUTO-PADRON 1980 e DE SOUZA 1984
Nas formas amastigota (FIGURA 5A) e epimastigota (FIGURA 5B) de T
cruzi as fibrilas de kDNA se apresentam bastante compactadas em forma de
bastatildeo Em tripomastigotas (FIGURA 5C) de T cruzi a rede de kDNA torna-se
menos compacta e a forma em bastatildeo do cinetoplasto daacute lugar a uma forma
arredondada (DE SOUZA 1984) Os vaacuterios graus de compactaccedilatildeo do kDNA em
tripanosomatiacutedeos podem estar relacionados com a accedilatildeo de proteiacutenas que
condensam o DNA como seraacute visto mais adiante
FIGURA 6 MUDANCcedilAS NA POSICcedilAtildeO DO KDNA NOS TRYPANOSOMAS FONTE Modificado de DO CAMPO et al 2005
30
O cinetoplasto de todos os tripanosomatiacutedeos encontra-se localizado
proacuteximo ao corpo basal perpendicularmente ao eixo do flagelo Em alguns
tripanosomatiacutedeos que sofrem diferenciaccedilatildeo ao longo de seu ciclo de vida como o
T cruzi o cinetoplasto muda de posiccedilatildeo dentro da ceacutelula passando da regiatildeo
anterior (nos epimastigotas) para a regiatildeo posterior (nos tripomastigotas) poreacutem
permanecendo proacuteximo e perpendicular ao corpo basal (FIGURA 7) O cinetoplasto
eacute fisicamente conectado ao corpo basal atraveacutes de um grupo de filamentos
citoplasmaacuteticos chamado de complexo de ligaccedilatildeo tripartite (TAC) (OGBADOYI et al
2003) Este complexo eacute responsaacutevel pelo posicionamento espacial do cinetoplasto e
por sua segregaccedilatildeo
FIGURA 7 REPOSICIONAMENTO DO KDNA EM RELACcedilAtildeO AgraveS OUTRAS ORGANELAS DURANTE O CICLO DE VIDA DE UM FLAGELADO LEGENDA A morfologia eacute definida pelas posiccedilotildees do ponto onde emerge o flagelo e a bolsa flagelar (BF) (mostrada em laranja) nuacutecleo (mostrado em azul) e kDNA (mostrado em roxo) FONTE Modificado de FIELD amp CARRINGTON 2009
31
171 Replicaccedilatildeo do kDNA
Nos tripanosomatiacutedeos a replicaccedilatildeo do kDNA eacute restrita a fase S nuclear
(COSGROVE amp SKEEN 1970 WOODWARD amp GULL 1990) diferente do que
acontece na maioria dos eucariotos onde a replicaccedilatildeo do DNA mitocondrial ocorre
ao longo do ciclo celular (LIU et al 2005)
A replicaccedilatildeo dos miniciacuterculos se inicia quando estes satildeo individualmente
decatenados da rede de kDNA pela accedilatildeo de DNA topoisomerases do tipo II pois
estes natildeo se replicam enquanto estatildeo ligados agrave rede e termina quando os
miniciacuterculos retornam para a rede com a ajuda da mesma enzima (SHAPIRO amp
ENGLUND 1995)
Os miniciacuterculos satildeo liberados da rede em direccedilatildeo a zona cinetoflagelar
(KFZ) uma regiatildeo especializada da matriz mitocondrial entre o kDNA e o corpo
basal (FIGURA 8) que abriga proteiacutenas envolvidas com o iniacutecio da replicaccedilatildeo Em
seguida os ciacuterculos migram (ou satildeo transportados) para os poacutelos opostos da rede
de kDNA para completar sua replicaccedilatildeo O iniacutecio da replicaccedilatildeo dos miniciacuterculos na
regiatildeo cinetoflagelar envolve a montagem de um complexo proteacuteico na origem de
replicaccedilatildeo dos ciacuterculos com a participaccedilatildeo da primase polimerase e proteiacutenas que
se ligam agrave sequumlecircncia universal de miniciacuterculos (UMSBP) Estas juntamente com
outras proteiacutenas geram uma forquilha de replicaccedilatildeo que se propaga
unidirecionalmente ao redor do miniciacuterculo formando uma estrutura tipo
intermediaacuteria (LIU et al 2005 GLUENZ et al 2007)
Os miniciacuterculos receacutem-replicados migram da zona KFZ para dois complexos
proteacuteicos situados nos poacutelos diametralmente opostos do cinetoplasto onde os
proacuteximos passos de replicaccedilatildeo iratildeo ocorrer Estes passos incluem remoccedilatildeo dos
primers pela accedilatildeo de endonucleases preenchimento de alguns intervalos entre os
fragmentos de Okazaki pela DNA polimerase e uniatildeo dos cortes (nicks) por uma
DNA ligase Apoacutes estas etapas os novos ciacuterculos sintetizados que ainda possuem
pelo menos uma interrupccedilatildeo em sua sequumlecircncia satildeo reunidos agrave periferia da rede
pela accedilatildeo de topoisomerases II Apoacutes todos miniciacuterculos terem sido replicados os
intervalos satildeo reparados (Revisto por LIU et al 2005 POVELONES 2014)
Pouco se sabe sobre o processo de replicaccedilatildeo dos maxiciacuterculos Assim
como os miniciacuterculos os maxiciacuterculos tambeacutem sofrem replicaccedilatildeo unidirecional que
32
se inicia em uma origem contida na regiatildeo variaacutevel da moleacutecula formando estruturas
tipo- Entretanto ao contraacuterio dos miniciacuterculos eles permanecem ligados agrave rede de
kDNA durante o processo replicativo (revisto por KLINGBEIL et al 2001 Liu et al
2005)
FIGURA 8 REPLICACcedilAtildeO DO kDNA FONTE Modificado de LIU et al 2005
18 Proteiacutenas associadas ao cinetoplasto (KAPs)
Proteiacutenas que se ligam ao DNA tambeacutem foram identificadas na mitococircndria
de uma variedade de organismos eucarioacuteticos variando de levedura ateacute humanos
(MAIER et al 2001) Estas proteiacutenas satildeo codificadas no nuacutecleo da ceacutelula e satildeo poacutes-
traducionalmente importadas para a mitococircndria
Conceitualmente qualquer proteiacutena que se associe ao kDNA quer atuando
na replicaccedilatildeo e transcriccedilatildeo quer atuando na organizaccedilatildeo compactaccedilatildeo e
segregaccedilatildeo da rede pode ser chamada de KAP (KAP do inglecircs Kinetoplast-
33
Associated Protein) Observou-se que algumas dessas KAPs apresentam
caracteriacutesticas de proteiacutenas histonas H1 (H1 histone-like proteins) por serem
proteiacutenas pequenas (17 a 25 kDa) fortemente baacutesicas (pI de 11 a 125) interagindo
com a carga negativa das moleacuteculas de DNA e com grande conteuacutedo dos
aminoaacutecidos lisina e arginina elevado (aprox 30 a 50)
Proteiacutenas associadas com genoma mitochondrial (KAPs) dos
tripanosomatiacutedeos e que compartilham caracteriacutesticas com histonas H1 foram
inicialmente identificadas no cinetoplasto do tripanosomatiacutedeo de inseto Crithidia
fasciculata e denominadas de KAP1 a 5 As H1-KAPs de C fasciculata interagem
com miniciacuterculos (XU et al 1996) e desse modo podem facilitar a associaccedilatildeo
orientaccedilatildeo e organizaccedilatildeo dessas moleacuteculas na rede pela neutralizaccedilatildeo das cargas
negativas das moleacuteculas de DNA contribuindo para a condensaccedilatildeo organizaccedilatildeo e
segregaccedilatildeo da rede de kDNA Ateacute o momento foram caracterizadas quatro H1-KAPs
de C fasciculata (CfKAP1 2 3 and 4) Aleacutem das caracteriacutesticas de histona H1
possuem uma preacute-sequecircncia clivaacutevel de nove aminoaacutecidos em sua porccedilatildeo N-
terminal e que provavelmente estaacute envolvida no transporte da proteiacutena para o
cinetoplasto jaacute que natildeo aparece na proteiacutena madura (XU amp RAY 1993 XU et al
1996 HINES amp RAY 1998) Atraveacutes de ensaios de imunofluorescecircncia foi possiacutevel
confirmar que estas proteiacutenas estatildeo presentes em toda a rede de kDNA Pela
facilidade encontrada nas KAPs purificadas de condensar redes de kDNA in vitro
(XU et al 1996) sugere-se que estas estejam envolvidas na organizaccedilatildeo e
condensaccedilatildeo do kDNA in vivo (LUKES et al 2001)
As teacutecnicas de deleccedilatildeo de genes satildeo uma oacutetima ferramenta para elucidar as
possiacuteveis funccedilotildees que um gene pode apresentar Em C fasciculata foi utilizada a
teacutecnica de nocaute gecircnico para o gene Cfkap1 onde mutantes viaacuteveis foram
obtidos mostrando que a forma e a dimensatildeo do cinetoplasto natildeo foram alterados
ao contraacuterio da organizaccedilatildeo da rede de kDNA que passou a apresentar fibrilas de
DNA espessas e uma camada eleacutetron-densa no centro do disco Quando foi
realizada a reintroduccedilatildeo do gene na forma episomal o fenoacutetipo normal da rede de
kDNA foi restaurado (LUKES et al 2001) Tambeacutem foi realizado o duplo nocaute
dos genes Cfkap2 e Cfkap3 o qual da mesma maneira produziu mutantes viaacuteveis
poreacutem com o crescimento bastante reduzido uma reduccedilatildeo na respiraccedilatildeo e um
aumento nos niacuteveis de mRNAs codificados pelos maxiciacuterculos Apesar de todas
estas alteraccedilotildees o kDNA permaneceu inalterado mostrando que as proteiacutenas
34
CfKAP2 e CfKAP3 desempenham um papel diferente ao da CfKAP1 pois estatildeo
envolvidas com o metabolismo mitocondrial e proliferaccedilatildeo celular ao inveacutes de
estarem envolvidas na organizaccedilatildeo estrutural do kDNA (AVLIYAKULOV et al
2004)
Com base nesses estudos surgiu o interesse de nosso grupo no estudo de
KAPs em T cruzi visando verificar qual o papel dessas proteiacutenas na organizaccedilatildeo da
rede de kDNA e sua importacircncia nos diferentes estaacutegios do ciclo de vida do parasita
Atraveacutes de anaacutelises bioinformaacuteticas foram identificadas 6 diferentes H1-KAPs
codificadas no genoma do T cruzi levando em consideraccedilatildeo a similaridade com
KAPs de C fasciculata (CAVALCANTI et al 2009) Essas H1-KAPs foram
denominadas de KAP3 KAP4a KAP4b KAP4c KAP6 e KAP7 Nosso grupo iniciou
a caracterizaccedilatildeo das proteiacutenas TcKAP4 e TcKAP6 mostrando que elas se localizam
no cinetoplasto mas com padrotildees distintos de distribuiccedilatildeo dependendo da forma do
ciclo de vida do parasita (CAVALCANTI et al 2009) Mais recentemente mostramos
que o nocaute da TcKAP3 natildeo afeta a proliferaccedilatildeo diferenciaccedilatildeo e infectividade do
parasita (DE SOUZA et al 2010)
A complexidade da rede de kDNA sugere portanto que as diferentes KAPs
atuem em conjunto algumas vezes de modo redundante para desempenhar
funccedilotildees na condensaccedilatildeo replicaccedilatildeo segregaccedilatildeo dessa estrutura
35
2 OBJETIVOS
21 OBJETIVO GERAL
O objetivo principal deste trabalho eacute caracterizar a funccedilatildeo da TcKAP7 avaliando seu
papel na biologia do parasita
211 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS
a) Analisar a localizaccedilatildeo subcelular da TcKAP7 atraveacutes de ensaios de
imunofluorescecircncia
b) Produzir TcKAP7 recombinante em larga escala para ensaios de biologia
estrutural
c) Estudar a viabilidade do parasita na ausecircncia do gene TcKAP7 para os parasitas
viaacuteveis analisar morfologia e ultraestrutura do cinetoplasto multiplicaccedilatildeo
diferenciaccedilatildeo e infectividade
36
3 MATERIAIS E MEacuteTODOS
31 Reagentes e Soluccedilotildees Utilizados
311 Reagentes
AmershamBioscience dNTPs Hybond C Hybond N kit ECL de western blotting
filmes de raio-X Hyperfilmreg anticorpo monoclonal anti-Histidina
Bio-Rad Acrilamida Agarose (UltraPure DNA grade) Azul de Bromofenol Bis-
Acrilamida Persulfato de Amocircnia
Cult-lab RPMI 1640
Difco Baacutecto-Aacutegar Bactotriptona Extrato de levedura Infuso de fiacutegado Triptose
Invitrogen Inc EDTA Fenol TRIS Nick Translation kit Taq DNA polymerase
IPTG Agarose X-Gal DNA de λHindIII Marcador de massa molecular Benchmark
Alexa Fluacuteor 458 1 kb Plus DNA Ladder Soro Fetal Bovino T4 DNA ligase
Merck Acetato de Soacutedio Aacutecido Aceacutetico Glacial Cloreto de CaacutelcioCloreto de
Potaacutessio Cloreto de Soacutedio Etanol Absoluto Glicina Glicose Hidroacutexido de soacutedio
Isopropanol HCl Na2HPO4
New England Biolabs Endonucleases de restriccedilatildeo
Qiagen Qiaquick PCR Purification kit
Serva Electrophoresis Alu-Gel S
Sigma Acetato de amocircnia Ampicilina Brometo de Etiacutedeo BSA Kanamicina
Glicerol Hepes Cloreto de Magneacutesio Tetraciclina β-mercaptoetanol DEAE-
celulose Tween 20 adjuvante completo de Freund monoclonal M2 anti-FLAG
312 Tampotildees e Soluccedilotildees
PBS NaCl 137 mM KCl 27 mM Na2HPO4 43 mM e KH2PO4 15 mM
PSG Na2HPO4 (anidro) 4747 mM NaH2PO4 H2O 25 mM NaCl 3676 mM e
glicose 555 mM
Soluccedilatildeo de tripsinazaccedilatildeo tripsina 005 (mv) e EDTA 002 (mv) em PBS pH
80
37
Soluccedilatildeo de bloqueio para imunofluorescecircncia PBS e BSA 1 (albumina seacuterica
bovina)
Soluccedilatildeo de bloqueio para western blot TBST e leite em poacute desnatado 5
Soluccedilatildeo de lise para Toothpick NaOH 50 mM Glicerol 5 SDS 05 EDTA 5
mM e azul de bromofenol 0025
Soluccedilatildeo Ponceau S Ponceau S 05 em aacutecido aceacutetico 1
Soluccedilatildeo de coloraccedilatildeo para geacuteis de proteiacutena Coomassie blue R-250 01 em
metanolaacutecido aceacutetico (4510)
Soluccedilatildeo para descoloraccedilatildeo de geacuteis de proteiacutena Metanol 4 aacutecido aceacutetico 75
Tampatildeo de lise hipotocircnico Tris-HCl 10mM pH 75 NaCl 10mM MgCl2 5 mM β-
mercaptoetanol 5 mM
Tampatildeo A para cromatografia de afinidade Tris-HCl 20 mM pH 75 NaCl 500 mM
Tampatildeo B para cromatografia de afinidade Tampatildeo A contendo imidazol 1M
Tampatildeo B para cromatografia de troca iocircnica Tris-HCl 50 mM pH 80 NaCl 1M
Soluccedilatildeo de depurinaccedilatildeo para Southern blot HCl 025 M
Soluccedilatildeo desnaturante para Southern blot NaOH 05 M e NaCl 15 M
Soluccedilatildeo neutralizante para Southern blot Tris-HCl 05 M pH 75 e NaCl 15 M
Soluccedilatildeo Denhardt (50X) ficoll 05 polivinilpirrolidona 06 e albumina de soro
bovino 02
Soluccedilatildeo de hibridaccedilatildeo para Southern blot DNA de esperma de salmatildeo do tipo III
01 mgml fragmentado por ultra-som e desnaturado SSC 6X soluccedilatildeo de denhardt
6X e SDS 1
SSC 20X NaCl 3 M pH 70 e citrato de soacutedio 03 M
Soluccedilatildeo de baixa estringecircncia SSC 2X e SDS 01
Soluccedilatildeo de meacutedia estringecircncia SSC 1X e SDS 01
Soluccedilatildeo de alta estringecircncia SSC 01X e SDS 01
Tampatildeo de eletroporaccedilatildeo para T cruzi NaCl 140 mM HEPES (aacutecido) 25 mM e
Na2HPO4 074 mM pH 75
Tampatildeo ZPFM de eletroporaccedilatildeo de T brucei NaCl 129 mM KH2PO4 15mM KCl
8mM NaH2PO4 8mM MgCl2 15mM CaCl2 90 mM e CH3COONa 24 mM pH 70
Tampatildeo TELT Tris-HCl 50 mM pH 80 EDTA 625 mM pH 90 LiCl 25 M e Triton
X-100 4
Tampatildeo de amostra para DNA 10X Ficoll 400 25 azul de bromofenol 025 e
xileno cianol FF 025
38
Tampatildeo de amostra para proteiacutena 4X Tris-HCl 40 mM pH 68 SDS 1 β-
mercaptoetanol 25 glicerol 6 e azul de bromofenol 0005
Tampatildeo de eletroforese para SDS-PAGE 1X Tris-base 25 mM glicina 192 mM e
SDS 01
Tampatildeo de lise de bacteacuterias Tris-HCl 20 mM pH 75 NaCl 500 mM PMSF1 mM
Tampatildeo para transferecircncia (western blotting) 1X Tris-base 25 mM glicina 192
mM e metanol 20
Tampatildeo TBE Tris base 89 mM aacutecido boacuterico 89 mM e EDTA 2 mM
TBS Tris-HCl 20 mM pH 80 e NaCl 150 mM
TBST TBS e Tween 20 01
TE Tris-HCl 10 mM pH 80 e EDTA 1 mM
313 Meios de cultura
LB Triptona 1 extrato de levedura 5 e NaCl 1
Meio LIT (liver infusion tryptose) infuso de fiacutegado 05 NaCl 753 mM KCl 54
mM glicose 10 mM bacto-triptose 05 Na2HPO4 564 mM hemina 00025 soro
fetal bovino 10 e extrato de levedura 15 gl
Meio TAU NaCl 190 mM KCl 17 mM MgCl2 2 mM CaCl2 2 mM e tampatildeo fosfato 8
mM pH 60
Meio TAU3AAG meio TAU suplementado com L-prolina 10 mM glutamato soacutedico
50 mM aspartato soacutedico 2 mM e glicose 10 mM
32 Cultivo do Trypanosoma cruzi
Neste trabalho foi utilizado o clone Dm28c de T cruzi (CONTRERAS et al
1985 CONTRERAS et al 1988) nas formas epimastigota e tripomastigota
metaciacuteclico
321 Epimastigotas
Formas epimastigotas de T cruzi foram cultivadas em meio LIT (CAMARGO
1964) a 28 oC com passagens a cada trecircs dias e inoacuteculo de 1 x 106 ceacutelulasml As
formas epimastigotas foram coletadas por centrifugaccedilatildeo no terceiro dia de cultivo
39
(correspondente a fase logariacutetmica de crescimento baseada em curva de
crescimento realizada nas mesmas condiccedilotildees) quando a densidade celular
apresentava-se entre de 1 - 3 x 107 ceacutelulasml
322 Tripomastigotas metaciacuteclicos
As formas metaciacuteclicas foram obtidas atraveacutes do processo de diferenciaccedilatildeo
in vitro (BONALDO et al 1988) Formas epimastigotas em final de fase logariacutetmica
de crescimento (densidade celular entre 5 - 7 x 107 ceacutelulasml) foram coletadas por
centrifugaccedilatildeo a 7000 x g por 5 minutos a 10 oC e ressuspendidas em meio TAU
na concentraccedilatildeo de 5 x 108 ceacutelulasml e mantidas a 28 oC por 2 horas Apoacutes este
periacuteodo correspondente ao estresse nutricional as ceacutelulas foram transferidas para
garrafas de 300 cm2 contendo 200 ml de meio TAU3AAG (concentraccedilatildeo final de 5 x
106 ceacutelulasml) Uma proporccedilatildeo dos parasitas que se aderiram agrave superfiacutecie da
garrafa de cultivo se diferenciou em metaciacuteclicos os quais foram liberados no
sobrenadante (BONALDO et al 1988) Estas formas foram purificadas pela
passagem atraveacutes de uma coluna de afinidade contendo a resina DEAE celulose
equilibrada em PSG (SOUSA 1983) Este procedimento foi realizado com o tipo
selvagem para obtenccedilatildeo de extrato proteacuteico e tambeacutem com o mutante de T cruzi
para TcKAP7 para verificaccedilatildeo da capacidade de diferenciaccedilatildeo e infectividade onde
o nuacutemero de metaciacuteclicos no sobrenadante foi contado apoacutes 24 48 72 e 96 horas
da incubaccedilatildeo em meio TAU3AAG
33 Curva de crescimento de T cruzi
Formas epimastigotas de T cruzi clone Dm28c e do mutante de T cruzi para
TcKAP7 foram cultivadas como descrito no item 321 ateacute atingirem a fase
estacionaacuteria para a comparaccedilatildeo da taxa de crescimento de ambas Foram
inoculadas 1 x 106 epimastigotas por ml de meio LIT em garrafas de 25 cm2 e
incubadas em seguida a 28 degC Diariamente foi realizada a contagem das culturas
em cacircmaras de Neubauer em diluiccedilotildees apropriadas ateacute o deacutecimo dia O graacutefico da
curva de crescimento comparativa entre a cultura selvagem e a nocaute foi feito
utilizando o programa Microsoft Excel
40
34 Obtenccedilatildeo de DNA de T cruzi
A extraccedilatildeo de DNA foi realizada conforme descrito por Medina-Acosta amp
Cross (1993) Epimastigotas (1 x 107 ceacutelulas) foram coletadas por centrifugaccedilatildeo a
7000 x g por 5 min lavadas em PBS e ressuspendidas em 350 microl de tampatildeo TELT
Apoacutes 5 min de incubaccedilatildeo agrave temperatura ambiente foi adicionado agrave amostra 1
volume de fenolclorofoacutermio e o material foi centrifugado a 13000 x g por 5 min A
fase aquosa foi recolhida e o DNA foi precipitado com 2 volumes de etanol absoluto
e coletado por centrifugaccedilatildeo a 13000 x g por 10 min O DNA presente no sedimento
foi lavado com etanol 70 seco e em seguida ressuspendido em tampatildeo TE
contendo RNAse a 20 microgml
35 Obtenccedilatildeo de kDNA de T cruzi
A extraccedilatildeo do kDNA de T cruzi foi realizada de acordo com Morel e
colaboradores (1980) com modificaccedilotildees
Formas epimastigotas (1 x109 ceacutelulas) foram coletadas por centrifugaccedilatildeo a
4000 x g por 10 min lavadas em PBS e ressuspendidas em 20 ml de Tampatildeo de
Lise Hipotocircnico Posteriormente adicionou-se Sacarose 025 M e o material foi
centrifugado 6000 x g por 10 min O pellet foi ressuspendido em 20 ml de Tris-HCl
10 mM pH 75 NaCl 10 Mm EDTA 5 mM SDS 05 A esta soluccedilatildeo foi adicionado
100 ug de proteinase K e a mesma permaneceu a 37 ordmC durante a noite No dia
seguinte as ceacutelulas foram transferidas para uma seringa de 50 ml aonde ocorreu a
quebra mecacircnica do DNA nuclear Este material foi ultracentrifugado a 27000 rpm a
4ordm C durante 1 hora utilizando o rotor SW28 Apoacutes centrifugaccedilatildeo o sobrenadante foi
desprezado e o pellet ressuspendido em 25 ml de TE e novamente ultracentrifugado
nas mesmas condiccedilotildees Apoacutes centrifugaccedilatildeo o pellet foi ressuspendido em 1ml de TE
e foi realizada a purificaccedilatildeo por fenolclorofoacutermio Apoacutes purificaccedilatildeo o material foi
ressuspendido em 300 ul de TE e utilizado para ensaios de SAXS
36 Obtenccedilatildeo de extrato proteico de T cruzi
41
As ceacutelulas foram coletadas por centrifugaccedilatildeo (4000 x g 5 min a 10 degC) e
lavadas duas vezes em PBS pH 75 Apoacutes as lavagens os parasitas foram
ressuspendidos em PBS e tampatildeo de amostra 4x foi adicionado de tal maneira que
a concentraccedilatildeo final fosse de 1 x 106 ceacutelulas equivalentesmicrol Os extratos foram
fervidos por 5 min e armazenados a - 70 degC
37 Clonagem do gene TcKAP7
A sequecircncia do gene TcKAP7 (ID Tc00104705350871950) foi obtida a
partir do banco de dados do genoma do T cruzi disponiacutevel no portal da internet
wwwgenedborg e a sua regiatildeo codificante foi amplificada por PCR com os primers
KAP7F (5rsquo ndash AAAGGATCCATGCTAAGAACTGTTCTGCCACTG 3rsquo) e KAP7R (5rsquo ndash
TCAGCGTCGACTTATGACGGTGGTGCAGGATCAGCAGCTGCAGTATTTT3rsquo) a
partir do DNA genocircmico de T cruzi Dm28c As sequecircncias de reconhecimento das
enzimas de restriccedilatildeo BamHI e SalI (marcadas em negrito) foram adicionadas na
extremidade 5rsquo dos primers KAP7F e KAP7R respectivamente As condiccedilotildees da
reaccedilatildeo de PCR foram as seguintes 100 ng de DNA total T cruzi 10 pmol de cada
primer 200 μM de cada dNTP MgCl2 15 mM tampatildeo Taq DNA polimerase 1x 25
U de Taq DNA polimerase (Invitrogen) A reaccedilatildeo de PCR foi processada no
termociclador modelo 9700 (Applied Biosystems EUA) com a desnaturaccedilatildeo do
material por 4 min a 94 degC seguida de 30 ciclos constando de desnaturaccedilatildeo a 94 degC
por 30 s hibridizaccedilatildeo dos primers a 58 degC por 30 s e extensatildeo a 72 degC por 1 min O
material amplificado foi purificado usando o kit Qiaquick PCR Purification (Qiagen) e
digerido com as enzimas de restriccedilatildeo BamHI e SalI com uso de 20 U de cada
enzima e seus respectivos tampotildees em volume final de 20 μl por 4 h a 37 oC O
material foi novamente purificado e utilizado para ligaccedilatildeo com o vetor pET28a
previamente digerido com as respectivas enzimas Bacteacuterias E coli cepa DH5α
foram transformadas com a ligaccedilatildeo A seleccedilatildeo dos clones contendo plasmiacutedeo com
o inserto desejado foi realizada atraveacutes da teacutecnica de palitagem ou de PCR de
colocircnia
38 Obtenccedilatildeo do cDNA de TcKAP7 atraveacutes de ensaio de RT-PCR
42
Com o intuito de verificar a posiccedilatildeo do mini-exon no transcrito de TcKAP7
realizamos o ensaio de RT-PCR para a obtenccedilatildeo do cDNA de TcKAP7
O protocolo utilizado foi baseado no manual teacutecnico da Promega (ΙmProm-ΙΙ
Reverse Transcription System) assim como os reagentes utilizados para essa
reaccedilatildeo Aproximadamente 10 μg de RNA foram incubados com o oligonucleotiacutedeo
KAP7R por 10 min a 70 degC e imediatamente transferidos para o gelo Agrave mistura foi
adicionada uma soluccedilatildeo de dNTPs (concentraccedilatildeo final de 05 mM para cada dNTP)
MgCl2 (120 μM) RNAse OUT (2 unidades) (Invitrogen) Transcriptase reversa
ImProm-II e respectivo tampatildeo A reaccedilatildeo foi incubada por 2 h a 42 degC As amostras
de cDNA foram purificadas por Microcon YM-30 (Millipore) conforme descriccedilatildeo do
fabricante e armazenadas a -20 degC Posteriormente foi realizada uma reaccedilatildeo de
PCR utilizando as seguintes condiccedilotildees 10 ng do cDNA de TcKAP7 de T cruzi 10
pmol do primer ME (5rsquo-AACGCTATTATTGATACAGTTTCTGTACTATATTG -3rsquo) e 10
pmol do primer KAP7R 200 μM de cada dNTP MgCl2 15 mM tampatildeo Taq DNA
polimerase 1x 25 U de Taq DNA polimerase (Invitrogen) A reaccedilatildeo de PCR foi
processada no termociclador modelo 9700 (Applied Biosystems EUA) com a
desnaturaccedilatildeo do material por 3 min a 94 degC seguida de 35 ciclos constando de
desnaturaccedilatildeo a 94 degC por 30 s hibridizaccedilatildeo dos primers a 55 degC por 30 s e extensatildeo
a 72 degC por 1 min O material amplificado foi purificado usando o kit Qiaquick PCR
Purification (Qiagen) e clonado diretamente no vetor pGEMreg-T Easy (Promega)
Bacteacuterias E coli cepa TOP10Frsquo foram transformadas com a ligaccedilatildeo e os plasmiacutedeos
recombinantes foram selecionados pela teacutecnica da palitagem ou de PCR de colocircnia
(itens 391 e 392) Apoacutes a minipreparaccedilatildeo (item 310) o material foi submetido ao
sequenciamento de DNA usando o serviccedilo de sequenciamento da empresa
Macrogen (Coreacuteia do Sul)
39 Seleccedilatildeo dos clones recombinantes
391 Teacutecnica de palitagem (toothpick)
As colocircnias foram coletadas com o auxiacutelio de palitos de dente (toothpick)
esteacutereis e transferidas para o fundo de tubos de micro-centriacutefuga e para a superfiacutecie
do meio LB solidificado (com o antibioacutetico de seleccedilatildeo do plasmiacutedeo) para a obtenccedilatildeo
de uma reacuteplica das colocircnias que foram analisadas (placa-matildee) A cada um dos
43
tubos foram acrescentados 15 μl do tampatildeo de lise Os tubos foram incubados em
banho-maria a 65 degC por 10 min As amostras entatildeo foram analisadas por
eletroforese em gel de agarose 1 usando o plasmiacutedeo sem inserto como controle
Posteriormente o gel foi corado com brometo de etiacutedeo (05 μgml) por
aproximadamente 20 min lavado com aacutegua e analisado sob luz ultravioleta para em
seguida ser fotografado no sistema de fotodocumentaccedilatildeo L-Pix (Locus
Biotecnologia Brasil)
392 Teacutecnica de PCR de colocircnia
Depois de selecionadas as colocircnias foram transferidas para tubos de PCR
contendo os reagentes da PCR e os primers que hibridizam com regiotildees que
flanqueiam o fragmento de DNA clonado em um volume total de 10 microl As amostras
foram incubadas a 94 degC por 3 min e submetidas a 35 ciclos de PCR com as
seguintes etapas 94 degC por 30 s 55 degC por 30 s e 72 degC por 1 min finalizando com
uma etapa de extensatildeo a 72 degC por 10 min Os produtos amplificados foram
analisados em gel de agarose 1 Posteriormente o gel foi corado com brometo de
etiacutedeo (05 microgml) por aproximadamente 20 min lavado com aacutegua e analisado sob
luz ultravioleta O gel foi fotografado no sistema de foto-documentaccedilatildeo L-Pix (Locus
Biotecnologia Brasil)
310 Preparaccedilatildeo de plasmiacutedeo em pequena escala (miniprep)
Os clones recombinantes foram cultivados em 3 ml de meio LB contendo o
antibioacutetico apropriado durante 18 h As culturas foram entatildeo centrifugadas a 12000
x g por 1min a temperatura ambiente e os plasmiacutedeos recombinantes purificados
com o sistema de minipreparaccedilatildeo de plasmiacutedeo (Miniprep Qiagen Kit) (QIAGEN) de
acordo com as recomendaccedilotildees do fabricante
311 Expressatildeo da proteiacutena TcKAP7 em E coli
Para expressar a proteiacutena recombinante TcKAP7 E coli cepa
BL21(DE3)STAR transformada com o plasmiacutedeo pET28a contendo o gene TcKPA7
(pET28a-TcKAP7) foi cultivada em meio LB contendo 25 μgml do antibioacutetico
44
kanamicina a 37 ordmC sob agitaccedilatildeo (preacute-inoacuteculo) Apoacutes 18 horas de crescimento uma
diluiccedilatildeo (110) foi realizada em novos tubos contendo meio LB-kanamicina e a
cultura foi incubada por 1 h a 37 ordmC sob agitaccedilatildeo constante Apoacutes este periacuteodo 05
mM IPTG (isopropil-1-tio-β-D-galactopiranosideo) foi adicionado agraves culturas A
incubaccedilatildeo prosseguiu por mais 3 h nas mesmas condiccedilotildees Como controle negativo
as ceacutelulas tambeacutem foram cultivadas nas mesmas condiccedilotildees poreacutem sem a adiccedilatildeo de
IPTG (cultura natildeo induzida) Aliacutequotas das culturas induzidas e natildeo induzidas com
IPTG foram processadas para anaacutelise em SDS-PAGE
312 Purificaccedilatildeo da proteiacutena recombinante TcKAP7
3121 Processamento da amostra
As bacteacuterias apoacutes a expressatildeo de TcKAP7 foram sedimentadas por
centrifugaccedilatildeo e ressuspendidas em tampatildeo de lise e lisadas utilizando o
microfluidificador modelo M-110L (Microfluidics EUA) Este meacutetodo divide a amostra
em dois fluxos e os conduz sob alta pressatildeo gerada por uma vaacutelvula pneumaacutetica
para uma cacircmara de interaccedilatildeo tambeacutem chamada de aacuterea de choque Esta cacircmara
eacute formada por um sistema de micro-canais dentro de um bloco de ceracircmica Dentro
da cacircmara ocorre cavitaccedilatildeo sonicaccedilatildeo e impacto dos dois fluxos em que a amostra
foi dividida levando a lise das ceacutelulas bacterianas (FIGURA 9) Este processo
provoca o aumento da temperatura e todo o sistema de tubos que conduz a amostra
necessita ser refrigerado com gelo e aacutegua a 4degC para prevenir a precipitaccedilatildeo de
proteiacutenas soluacuteveis
45
FIGURA 9 - REPRESENTACcedilAtildeO ESQUEMAacuteTICA DO MICROFLUIDIFICADOR LEGENDA A suspensatildeo de bacteacuterias eacute dividida em dois fluxos que se chocam sob alta pressatildeo dentro de micro-canais presentes na cacircmara de interaccedilatildeo da vaacutelvula homogeneizadora Melhores resultados satildeo obtidos aumentando o nuacutemero de ciclos de passagens Seta preenchida direccedilatildeo da amostra Seta pontilhada repetindo o ciclo de passagem FONTE Modificado de MAA amp HSU 1999
Apoacutes a lise o extrato soluacutevel foi obtido apoacutes centrifugaccedilatildeo a 30000 x g por
30 min a 4 degC
3122 Cromatografia de afinidade
Por ser expressa fusionada a uma cauda de seis histidinas a proteiacutena
TcKAP7 pode ser separada dos extratos celulares a partir da utilizaccedilatildeo de resina de
niacutequel da qual posteriormente a proteiacutena seraacute eluiacuteda
A purificaccedilatildeo da proteiacutena TcKPA7 presente no sobrenadante foi realizada
em sistema FPLC (Fast Performance Liquid Chromatography ndash GE Healthcare) com
coluna HiTrap Chelating de 1 mL (GE Healthcare) A coluna foi carregada com
soluccedilatildeo NiSO4 100 mM e equilibrada com tampatildeo A para cromatografia de afinidade
Durante a purificaccedilatildeo foi utilizado um gradiente de 0-100 de tampatildeo B para
cromatografia de afinidade As fraccedilotildees provenientes da cromatografia foram
analisadas atraveacutes de SDS-PAGE
Suspensatildeo de bacteacuterias
Ceacutelulas lisadasBomba de
alta pressatildeo
Micro-canais
Vaacutelvula homogeneizadora
46
3123 Cromatografia de troca iocircnica
Para eliminar contaminantes remanescentes da cromatografia de afinidade
a amostra contendo a proteiacutena de interesse foi submetida a uma segunda etapa
cromatograacutefica cromatografia de troca iocircnica utilizando-se a coluna HiTraptrade SP (GE
Healthcare) no sistema de FPLC (GE Healthcare)
Primeiramente a amostra foi diluiacuteda para reduccedilatildeo da concentraccedilatildeo salina e
a coluna foi lavada com 2 volumes de tampatildeo B para cromatografia de troca iocircnica e
depois com 2 volumes de tampatildeo A utilizado na cromatografia de afinidade O
gradiente de passagem do tampatildeo B foi de 0 a 100 e a proteiacutena TcKAP7 foi
obtida na fraccedilatildeo de material natildeo ligado agrave resina (Flow-through) (FT)
3124 Cromatografia de gel filtraccedilatildeo
Amostras da cromatografia de troca iocircnica que continham a proteiacutena de
interesse foram concentradas atraveacutes de filtraccedilatildeo A soluccedilatildeo foi colocada em filtro
Amicon Ultra MWCO 10000 (Milipore) e centrifugada a 4000 rpm a 4 ordmC O
experimento foi realizado em sistema FPLC (GE Healthcare) com a coluna
Superdex 200 HR 1030 (GE Healthcare) em tampatildeo HEPES 20 mM pH 74 e de
cloreto de soacutedio100 mM
313 Espalhamento Dinacircmico de Luz ndash DLS
O experimento foi realizado em equipamento DynaPro Molecular instrument
a 4 ordmC As amostras foram previamente centrifugadas por 5 minutos a 15000 rpm a
4 ordmC A coleta de dados foi realizada com intervalos de 2 segundos com 100
aquisiccedilotildees Para cada leitura utilizou-se 5 microl de amostra proteica
314 Espectroscopia de dicroiacutesmo circular (CD)
O espectro de CD foi coletado usando espectropolariacutemetro Jasco J-715
(Jasco Corporation Toacutekio Japatildeo) sendo a temperatura mantida a 20 degC atraveacutes de
um Peltie rType Control System PFD425S (JASCO) Todos os dados foram
coletados usando cubeta de quartzo de 1 mm de caminho oacuteptico
47
Mediu-se a elipticidade em graus na regiatildeo do UV distante no intervalo de
comprimento de onda de 260 nm a 200 nm com uma velocidade de 100 nmmin
sendo feitas no total 30 leituras com resposta de 1 segundo em varredura contiacutenua
Os valores obtidos em miligraus foram convertidos para elipticidade molar
por resiacuteduo ([θ]MRW) em miligrauscm2dmol-1 que eacute definida pela equaccedilatildeo (Adler et
al 1973)
Onde θobs eacute a elipsidade observada em graus MRW eacute o peso molecular
meacutedio dos resiacuteduos da proteiacutena d eacute o caminho oacuteptico da cubeta em centiacutemetros e c
eacute a concentraccedilatildeo da proteiacutena em mgmL O MRW eacute calculado dividindo-se o peso
molecular da proteiacutena pelo nuacutemero de resiacuteduos
315 Quantificaccedilatildeo e concentraccedilatildeo
As amostras obtidas a partir da purificaccedilatildeo tiveram a concentraccedilatildeo calculada
utillizando a absorbacircncia mensurada pelo aparelho NanoDrop (Thermo Fisher
Scientific) levando-se em consideraccedilatildeo o coeficiente de extinccedilatildeo e teoacuterico da
proteiacutena obtido a partir do ProtParam (httpusexpasyorgtoolsprotparamhtml) e o
peso molecular da proteiacutena que eacute de cerca de 28 kDa
Obtidas as concentraccedilotildees a amostra foi concentrada pelo meacutetodo de
filtraccedilatildeo utilizando o filtro Amiconreg Ultra Centrifugal Filter (Millipore) com poro de
10000 Da A amostra foi centrifugada ateacute a obtenccedilatildeo de uma concentraccedilatildeo final de
5 mgml para os ensaios de cristalizaccedilatildeo Uma aliacutequota da proteiacutena concentrada foi
utilizada para anaacutelise por SDS-PAGE
316 Ensaios de Cristalizaccedilatildeo
Os ensaios de cristalizaccedilatildeo foram realizados empregando-se a teacutecnica de
difusatildeo de vapor em gota sentada utilizando-se os equipamentos disponiacuteveis no
Laboratoacuterio Robotizado de Cristalizaccedilatildeo de Proteiacutenas LNBio Os ensaios foram
feitos em placas de 96 poccedilos e as gotas preparadas pelo robocirc Honeybee
utilizando-se os kits disponiacuteveis no laboratoacuterio Crystal Screen HT (Hampton
Research) JCSG+ Suite (Molecular Dimensions) PACT Suite (Molecular
cd
MRWobs
10][
48
Dimensions) Precipitant Synergy (Rigaku Reagents) SaltRx HT (Hampton
Research) Wizard IampII (Rigaku Reagents)
317 Espalhamento de raio-X a baixo acircngulo (SAXS)
Atraveacutes da teacutecnica de SAXS informaccedilotildees sobre a massa molecular das
partiacuteculas espalhadoras e do raio de giro (Rg) da proteiacutena de estudo satildeo obtidos a
partir dos dados coletados Por meio de programas computacionais como DAMMIN
(SVERGUN1999) e GASBOR (SVERGUN et al 2001) um modelo de baixa
resoluccedilatildeo da forma da proteiacutena pode ser obtido
Os dados de SAXS foram obtidos na linha de luz D02A ndash SAXS2 no
Laboratoacuterio Nacional de Luz Siacutencrotron (LNLS) Campinas-SP Brasil usando
comprimento de onda de 148 A e um detector bidimensional com arranjo CCD
(MARCCD USA) de 165 mm A distacircncia do detector para a amostra foi de 106804
mm e os dados na faixa de 002 nm-1 para 021 nm-1 foram coletados usando
proteiacutena pura nas concentraccedilotildees de 5 mgml em tampatildeo em 20 mM HEPES pH 74
e 100 mM de cloreto de soacutedioExposiccedilotildees de 300 e 600 s foram realizadas e os
dados do tampatildeo foram coletados antes e depois dos dados da amostra para fazer a
correccedilatildeo do solvente e normalizaccedilatildeo do espalhamento
Ajuste dos dados experimentais e avaliaccedilatildeo da funccedilatildeo p(R) foram realizados
utilizando o programa GNOM (SVERGUN 1992) O envelope a baixa resoluccedilatildeo de
TcKAP7 foi determinado usando modelagem abnitio implementada no programa
DAMMIN O modelo a baixa resoluccedilatildeo e o modelo da estrutura tridimensional foram
superpostas usando o programa SUPCOMB (KOZIN amp SVERGUN 2001)
318 Modelagem de TcKAP7
Um modelo da estrutura tridimensional de TcKAP7 foi construiacutedo Para a
construccedilatildeo do modelo foi utilizado o programa MODELLER (SALI amp BLUNDELL
1993) este programa eacute utilizado para a modelagem por homologia a estruturas
tridimensionais de proteiacutenas O programa automaticamente constroacutei um modelo
baseado na anaacutelise de um alinhamento de sequecircncias entre a proteiacutena para a qual
se deseja construir o modelo e uma proteiacutena relacionada cuja estrutura
tridimensional jaacute foi resolvida A qualidade do modelo pode ser avaliada por
49
exemplo atraveacutes de graacuteficos e tabelas que analisam restriccedilotildees quiacutemicas e fiacutesicas de
cada aacutetomo constituinte do modelo
319 Obtenccedilatildeo de antissoro policlonal contra TcKAP7
A proteiacutena TcKPA7 recombinante purificada foi inoculada em camundongos
da linhagem BALBc por via intraperitonial com 4 aplicaccedilotildees de aproximadamente
20-50 μg de antiacutegeno em intervalos de 15 dias seguida de obtenccedilatildeo do soro apoacutes 1
semana da uacuteltima inoculaccedilatildeo O antiacutegeno foi emulsificado em adjuvante completo de
Freund na primeira inoculaccedilatildeo e com adjuvante a base de hidroacutexido de alumiacutenio
(Alu-Gel Serva) nas inoculaccedilotildees posteriores
320 Anaacutelise da expressatildeo do gene TcKAP7 e de seu mutante por ensaio tipo
western blot
Este procedimento foi executado segundo o meacutetodo de Towbin e
colaboradores (1979) Aliacutequotas de extratos de T cruzi equivalentes a 1 x 107
ceacutelulas foram submetidos agrave SDS-PAGE Apoacutes a separaccedilatildeo eletroforeacutetica as
proteiacutenas foram transferidas para membrana de nitrocelulose (Hybond C Amersham
Biosciences) em tampatildeo de western por 2 h a 60 V ou 20 V por 16 h Apoacutes a
transferecircncia a membrana foi corada com Ponceau S e descorada suavemente com
aacutegua bidestilada para a identificaccedilatildeo das bandas do marcador de massa molecular
A membrana foi entatildeo incubada em soluccedilatildeo de bloqueio por 30 min sob agitaccedilatildeo
suave
Apoacutes o bloqueio a membrana foi incubada com os soros policlonais ou
anticorpos monoclonais em TBST-leite por aproximadamente 1 h a 37degC A
membrana foi lavada 5 vezes com TBST Em seguida a membrana foi incubada
com anticorpo secundaacuterio anti-IgG de camundongo conjugado com a enzima
peroxidase (Pierce ndash Thermo Scientific) por 1h na diluiccedilatildeo de 16000 em TBST-leite
a temperatura ambiente A membrana foi submetida a mais cinco lavagens com
TBST e a reaccedilatildeo era evidenciada utilizando substrato quimioluminescente (West
Pico Pierce ndash ThermoScientific) sobre a membrana a qual era exposta a um filme
para raios-X (Hyperfilm ECL GE)
50
321 Superexpressatildeo de TcKAP7
3211 Amplificaccedilatildeo e clonagem do gene TcKAP7 no vetor pNEO3xFlag para
superexpressatildeo da proteiacutena
O gene TcKAP7 foi clonado no vetor pNEO3xFLAG construiacutedo no nosso
laboratoacuterio a partir do vetor pTcGW-ProtCcarboxi (BATISTA et al 2010) que utiliza
o sistema Gateway de clonagem (Invitrogen) Os vetores foram construiacutedos
utilizando-se como base o pBluescript II (Stratagene San Diego USA) onde foram
inseridas trecircs sequencias que codificam para regiotildees intergecircnicas (IR) de T cruzi A
primeira TcUIR eacute a regiatildeo intergecircnica do locus de ubiquitinacalmodulina de T
cruzi (BATISTA et al 2010) As outras duas regiotildees intergecircnicas ITR1 e ITR2 foram
selecionadas a partir de genes de copia uacutenica no genoma e que possuem um niacutevel
de expressatildeo constitutivo nos estaacutegios epimastigota e tripomastigota metaciclicos
avaliados por dados de proteocircmica e RNAseq (Comunicaccedilatildeo pessoal Michel
Batista) Aleacutem disso esse vetor confere agrave regiatildeo C-terminal da proteiacutena
recombinante resultante da clonagem neste vetor trecircs etiquetas FLAG (sequecircncia
DYKDDDDK) em tandem (FIGURA 10)
FIGURA 10 VETOR PARA EXPRESSAtildeO EM T CRUZI P3XFLAG
LEGENDA PR ndash PROMOTOR RIBOSOMAL TCUIR ITR1 E ITR2 - REGIOtildeES INTERGENICAS ATTR1 E ATTR2 ndash REGIOtildeES PARA RECOMBINACcedilAtildeO CMreg - RESISTEcircNCIA A CLORANFENICOL CCDB ndash GENE PARA SELECcedilAtildeO NEGATIVA DURANTE A CLONAGEM 3XFLAG ndash TREcircS ETIQUETAS DE FLAG (DYKDDDDK) NEOMICINA ndash GENE DE RESISTEcircNCIA A NEOMICINA
O gene TcKAP7 foi amplificado utilizando os primers especiacuteficos
KAP7GtwFor (5rsquo-
GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTGCCCGCGAAGTATTCAGCAGCCC)
e KAP7GtwRev (5rsquo-
GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCGTGGTACATGGCGTACGGGTTG)
PR TcUIR Att R1 Cmreg ccdB Att R2 3x Flag ITR1 Neomicina ITR2
51
os quais possuem os siacutetios attB indicados em negrito As condiccedilotildees desta reaccedilatildeo
de PCR foram as seguintes 100 ng de DNA genocircmico de T cruzi 10 pmol de cada
primer 200 μM de cada dNTP MgSO4 2 mM tampatildeo Taq DNA polimerase High
Fidelity 1x 1U de Platinum Taq DNA polimerase high fidelity (Invitrogen) A reaccedilatildeo
de PCR foi processada no termociclador modelo 9700 (AppliedBiosystems EUA)
com a desnaturaccedilatildeo do material por 5 min a 94 degC seguida de 35 ciclos constando
de desnaturaccedilatildeo a 94 degC por 30 s hibridizaccedilatildeo dos primers a 58 degC por 30 s e
extensatildeo a 72 degC por 15 min
O gene amplificado foi clonado no vetor de entrada pDONRtrade221
(Invitrogen) A reaccedilatildeo foi feita com 150 ng dos produtos de PCR contendo os siacutetios
attB 150 ng do plasmiacutedeo pDONRtrade221 1 μL de BP ClonaseTM enzyme mix e TE
para um volume final de 10 μL e com incubaccedilatildeo a 25 degC por 16 h Foi entatildeo
adicionado 1 microL de proteinase K (2 mgmL) com incubaccedilatildeo por 10 min a 37 degC Os
clones em pDONRtrade221 foram transformados em ceacutelulas caacutelcio-competentes E coli
DH5α conforme protocolo de transformaccedilatildeo de ceacutelulas caacutelcio-competentes Apoacutes
transformaccedilatildeo a cultura foi semeada em placa de LBKan (kanamicina 25 microgmL) e
incubada a 37 degC durante 16 h
Para verificar a presenccedila de clones com os insertos de interesse foi feita a
teacutecnica da palitagem As colocircnias selecionadas foram inoculadas em 5 mL de meio
LBKan e incubadas por 16 h a 37 degC com agitaccedilatildeo (190 rpm) A purificaccedilatildeo dos
plasmiacutedeos foi realizada com o kit QIAprepreg Spin Miniprep (Qiagen) conforme
orientaccedilotildees do fabricante
Apoacutes esta etapa foi necessaacuterio transferir os insertos para o vetor de destino
pNEO3xFlag A troca de insertos entre os vetores de entrada e destino denominada
de reaccedilatildeo LR foi realizada conforme orientaccedilotildees do fabricante (Gateway LR clonase
enzyme mix) e ceacutelulas caacutelcio-competentes foram transformadas com os produtos
das recombinaccedilotildees conforme descrito anteriormente semeadas em placas de
LBAmp e incubadas a 37 degC durante 16 h
A verificaccedilatildeo de clones positivos foi realizada atraveacutes de PCR de colocircnias
As colocircnias selecionadas foram inoculadas em 5 mL de meio LB contendo ampicilina
(100 μgmL) e incubada a 37deg C por 16 h sob agitaccedilatildeo (200 rpm)O plasmiacutedeo
contendo o gene TcKAP7 foi denominado de pNEO_KAP7_3xFLAG
52
3212 Transfecccedilatildeo por eletroporaccedilatildeo
A transfecccedilatildeo das formas epimastigotas de T cruzi foi feita pela teacutecnica de
eletroporaccedilatildeo utilizando o equipamento genepulserreg apparatus (Bio-Rad) e cubetas
esteacutereis de eletroporaccedilatildeo gene pulsermicro pulserreg 02 cm (Bio-Rad) Formas
epimastigotas de T cruzi foram cultivadas em meio LIT ateacute uma densidade celular
de 3 x 107 ceacutelulasml Um volume de cultura correspondendo a 1 x 109 parasitas foi
centrifugado (4000 x g 4 degC) O sobrenadante foi descartado e as ceacutelulas foram
ressuspendidas em tampatildeo de eletroporaccedilatildeo esteacuteril e submetidas a centrifugaccedilatildeo
nas condiccedilotildees acima O sedimento celular foi ressuspendido em 2 ml de tampatildeo de
eletroporaccedilatildeo Em cubetas de eletroporaccedilatildeo previamente resfriadas a 4 degC foram
misturados 400 μL (2 x 108 ceacutelulas) da suspensatildeo dos parasitas e 50 μL (20 microg) do
plasmiacutedeo para superexpressatildeo (pNEO_KAP7_3XFLAG) Em paralelo parasitas
foram submetidos agraves mesmas condiccedilotildees mas na ausecircncia de DNA (controle
negativo da transfecccedilatildeo)
As cubetas foram entatildeo mantidas em gelo por 10 min Em seguida os
parasitas foram transfectados com dois pulsos sequenciais de 500 μF e 450 volts
Apoacutes o esse procedimento as cubetas foram mantidas em gelo por mais 5 min A
suspensatildeo de parasitas transfectados foi entatildeo inoculada em 10 mL de meio LIT
suplementado com 10000 U de penicilina e estreptomicina a 10 μgmL
3213 Seleccedilatildeo dos transfectantes
O gene para a enzima neomicina fosfotransferase foi utilizado como
marcador de seleccedilatildeo dos parasitas carregando o plasmiacutedeo para a superexpressatildeo
pNEO_KAP7_3XFLAG Para tanto o antibioacutetico G418 foi adicionado agraves culturas
apoacutes 24 h da transfecccedilatildeo na concentraccedilatildeo final de 500 μgmL Entre 3 e 4 dias apoacutes
a transfecccedilatildeo foi realizada a primeira passagem (14) A partir desse ponto foram
feitas passagens semanais na proporccedilatildeo de 110 ateacute que natildeo fosse observado
crescimento nas duas uacuteltimas passagens da cultura do controle negativo da
transfecccedilatildeo
A expressatildeo da proteiacutena KAP7-FLAG foi analisada atraveacutes de ensaios de
western blot e imunofluorescecircncia
53
322 Deleccedilatildeo do gene TcKAP7 por nocaute gecircnico
3221 Amplificaccedilatildeo e clonagem das regiotildees a montante e a jusante do gene
TcKAP7
As regiotildees a montante (upstream) e a jusante (downstream) do gene TcKAP7
respectivamente denominadas de UPSKAP7 (521 pb) e DOWNKAP7 (500 pb)
foram amplificadas por PCR usando os primers descritos nas TABELAS 1 E 2 A
regiatildeo denominada DOWNKAP7 conteacutem ainda 139 pb do final da regiatildeo codante de
TcKAP7
QUADRO 1 - RELACcedilAtildeO DOS PRIMERS UTILIZADOS PARA A CLONAGEM DA
REGIAtildeO UPSTREAM DE TcKAP7 NO VETOR pNEO1
UPSKAP7F GGGGTCGACCGTTGCTGGTTTTTCTTTTGGTGT
UPSKAP7R GGGAAGCTTGCTTCAAAACGTCTATGCGGGC
Os siacutetios das enzimas de restriccedilatildeo SalI (GTCGAC) e HindIII (AAGCTT) adicionados aos primers estatildeo em negrito
QUADRO 2 - RELACcedilAtildeO DOS PRIMERS UTILIZADOS PARA A CLONAGEM DA
REGIAtildeO DOWNSTREAM DE TcKAP7 NO VETOR pNEO1
DOWNKAP7F GGGGAATTCGCCTCATATGACGCATCTCCCA
DOWNKAP7R GGGGGATCCTGTTGGCGCTGTCAAGGAAGTAAG
Os siacutetios das enzimas de restriccedilatildeo EcoRI (GAATTC) e BamHI (GGATCC) adicionados aos primers estatildeo em negrito
As reaccedilotildees de PCR foram realizadas nas seguintes condiccedilotildees 100 ng de
DNA total de T cruzi Dm28c 10 pmol dos oligonucleotiacutedeos F e R 200 μM de cada
dNTP MgCl2 15 mM tampatildeo Taq DNA polimerase 1x 25 unidades de Taq DNA
polimerase (Invitrogen EUA) A reaccedilatildeo de PCR foi processada no termociclador
modelo 9700 (Applied Biosystems EUA) nas seguintes condiccedilotildees Desnaturaccedilatildeo do
54
material por 4 min a 94 degC seguida de 35 ciclos de desnaturaccedilatildeo a 92 degC por 30 s
hibridizaccedilatildeo dos oligonucleotiacutedeos a 56 degC por 30 s e extensatildeo a 72 degC por 1 min O
material amplificado foi purificado usando o Qiaquick PCR Purification (Qiagen) O
DNA purificado foi digerido com enzimas de restriccedilatildeo apropriadas para a clonagem
dos fragmentos nos vetores pNEO1 O plasmiacutedeo resultante da clonagem das
regiotildees UPSKAP7 e DOWNKAP7 foi denominado de pNEO1kap7 (Figura 11A)
Uma vez que o genoma do T cruzi eacute diploide construiacutemos um segundo
plasmiacutedeo para o nocaute do segundo alelo do gene TcKAP7 tendo como marca de
seleccedilatildeo o gene que codifica resistecircncia a higromicina B Esse plasmiacutedeo foi
construiacutedo usando como molde o plasmiacutedeo pNEO1kap7 O plasmiacutedeo pNEO1kap7
foi digerido com HindIII para remoccedilatildeo do gene neo e uma pequena porccedilatildeo da regiatildeo
DOWNSTREAM (220 pb) O plasmiacutedeo linearizado foi purificado do gel de agarose
usando o kit Qiaquick PCR Purification (Qiagen) e ligado com o gene higro O gene
higro foi amplificado usando os primers HIGROF
(GGGGGAAGCTTATGAAAAAGCCTGAACTCACCGCGAC) e HIGROR
(GGGAAGCTTCTATTCCTTTGCCCTCGGACGAGTGCTG) ambos contendo na
extremidade 5rsquo o siacutetio para a enzima de restriccedilatildeo HindIII (em negrito) O plasmiacutedeo
resultante da ligaccedilatildeo foi denominado de pHIGRO1kap7 (FIGURA 11B)
55
FIGURA 11 ESQUEMA DA CONSTRUCcedilAtildeO DOS VETORES UTILIZADOS PARA O NOCAUTE DO GENE TcKAP7 LEGENDA Nesta figura eacute observada a inserccedilatildeo das sequecircncias flanqueadoras do gene TcKAP7 juntamente com os respectivos siacutetios para cada enzima de restriccedilatildeo nos vetores de clonagem pNEO1 e pHIGRO1
3222 Amplificaccedilatildeo dos cassetes UPS-NEO-DOWN e UPS-HIGRO-DOWN para
transfecccedilatildeo de T cruzi
Os dois plasmiacutedeos recombinantes foram purificados pelo meacutetodo da lise
alcalina utilizando o kit de minipreparaccedilatildeo de plasmiacutedeos (Qiagen) As minipreps
foram utilizadas para a amplificaccedilatildeo da regiatildeo UPS-NEO-DOWN (cassete NEO) e da
regiatildeo UPS-HIGRO-DOWN (cassete HYG) por PCR usando os primers UPSKAP7F
e DOWNKAP7R As reaccedilotildees de PCR foram realizadas nas seguintes condiccedilotildees 20
ng do plasmiacutedeo pNEO1kap7 ou pHIGRO1kap7 10 pmol dos primers UPSKAP7F e
DOWNKAP7R 200 μM de cada dNTP MgCl2 15 mM tampatildeo Taq DNA polimerase
1x 25 unidades de Taq DNA polimerase (Invitrogen EUA) A reaccedilatildeo de PCR foi
processada no termociclador modelo 9700 (AppliedBiosystems EUA) nas seguintes
condiccedilotildees Desnaturaccedilatildeo do material por 4 min a 94 degC seguida de 35 ciclos de
desnaturaccedilatildeo a 92 degC por 30 s hibridizaccedilatildeo dos oligonucleotiacutedeos a 56 degC por 30 s e
56
extensatildeo a 68 degC por 2 min O material amplificado foi submetido agrave eletroforese em
gel preparativo de agarose 1 O gel foi corado com brometo de etiacutedeo (1 μgml) e a
banda correspondente a cada cassete foi removida do gel com auxiacutelio de uma
lacircmina de bisturi O DNA foi purificado por eletroeluiccedilatildeo dentro de saco de diaacutelise
nas condiccedilotildees de 100 V por 1 hora em tampatildeo TBE Para obter massa de DNA
suficiente para a transfecccedilatildeo (20 μg) foram feitas 10 reaccedilotildees de PCR com 100 μl
cada uma
3223 Transfecccedilatildeo do T cruzi com o cassete UPS-NEO-DOWN
Formas epimastigotas de T cruzi foram cultivadas em meio LIT ateacute 2 x 107
ceacutelulasml Os parasitas (1 x 108 ceacutelulas) foram coletados por centrifugaccedilatildeo a 6000
x g por 10 min a 4 degC O sedimento celular foi lavado com PBS esteacuteril e
ressuspendido em 1 ml de soluccedilatildeo de eletroporaccedilatildeo Volumes correspondentes a
04 ml da suspensatildeo de ceacutelulas foram transferidos para cubetas de eletroporaccedilatildeo
esteacutereis (02 cm de gap) (BioRad) e preacute-resfriadas Em uma delas foram adicionados
de 20 μg do fragmento representando o cassete NEO A outra cubeta contendo
apenas a suspensatildeo de parasitas foi usada como controle Apoacutes 10 minutos no gelo
as amostras contidas nas cubetas foram submetidas a 2 pulsos de 450 volts 500
microF utilizando o eletroporadorGenePulserreg IIApparatus (Bio-Rad) As amostras
foram incubadas novamente por 5 a 10 minutos no gelo em seguida foram
transferidas para garrafas de cultura de 25 cm2 contendo 10 ml de meio LIT
(suplementado com 10000 U de penicilina e estreptomicina a 10 mgml) As culturas
foram entatildeo incubadas a 28 degC Apoacutes 24 horas de incubaccedilatildeo adicionou-se o
antibioacutetico G418 na concentraccedilatildeo de 500 μgml As culturas foram mantidas por
sucessivas passagens (diluiccedilatildeo de 110) em meio LIT suplementado com G418 a
cada 8-10 dias ateacute a ausecircncia de proliferaccedilatildeo celular na cultura controle Os
parasitas nos quais TcKAP7 foi substituiacutedo pelo gene neo foram denominados deT
cruzi(kap7kap7neo) e foram testados para a correta inserccedilatildeo do gene neo no locus
genocircmico de TcKAP7
57
3224 Extraccedilatildeo de DNA dos transfectantes
T cruzi transfectado com o cassete NEO (T cruzi(kap7kap7neo) foi cultivado
em meio LIT suplementado com G418 (500 μgml) ateacute uma densidade de 3 x 107
ceacutelulasml Os parasitas foram coletados por centrifugaccedilatildeo por 1 min a 6000 x g e
lavados com PBS Em seguida os parasitas foram lisados gentilmente em 350 μl de
tampatildeo TELT conforme descrito no item 34
3225 Anaacutelise por PCR do DNA dos parasitas transfectados com o cassete
UPS-NEO-DOWN
As reaccedilotildees de PCR foram realizadas utilizando primers externos EXTF
(CCCGCTACGACTGCCCTCCACGCGGAAGGGAA) e EXTR
(AAGTAAACGGGAGAAGCAACACGATGGGAGGCTC) que natildeo estatildeo presentes na
construccedilatildeo do cassete UPS-NEO-DOWN combinados com os primers NEOF
(GGGGAAGCTTATGATTGAACAAGATGGATTGCACGCAG) e NEOR
(GGGGGAATTCAGAAGAACTCGTCAAGAAGGCGATAGAA)
As condiccedilotildees das reaccedilotildees foram as seguintes 100 ng do DNA total de T
cruzi Dm28c tipo selvagem (T cruzi(kap7kap7) ou tipo selvagem) ou do DNA da
populaccedilatildeo T cruzi(kap7kap7neo) (mutante simples nocaute) 10 pmol dos primers EXTF
+ NEOR e NEOF + EXTR 200 μM de cada dNTP MgCl2 15 mM tampatildeo Taq DNA
polimerase 1x 25 unidades de Taq DNA polimerase (Invitrogen EUA) A reaccedilatildeo de
PCR foi processada no termociclador modelo 9700 (AppliedBiosystems EUA) nas
seguintes condiccedilotildees Desnaturaccedilatildeo do material por 4 min a 94 degC seguida de 35
ciclos de desnaturaccedilatildeo a 92 degC por 30 s hibridizaccedilatildeo dos oligonucleotiacutedeos a 55 degC
por 30 s e extensatildeo a 72 degC por 2 min
3226 Transfecccedilatildeo do T cruzi com o cassete UPS-HIGRO-DOWN
Formas epimastigotas da populaccedilatildeo mutante de T cruzi (kap7kap7neo) foram
cultivadas em meio LIT suplementado com G418 (500 μgml) ateacute a densidade de 2 x
107 ceacutelulasml Os parasitas (1 x 108 ceacutelulas) foram coletados por centrifugaccedilatildeo a
6000 x g por 10 min a 4 degC e submetidos ao processo de eletroporaccedilatildeo como
descrito no item 3202 Para a transfecccedilatildeo foram usados 20 μg do fragmento
58
representando o cassete UPS-HIGRO-DOWN As culturas (transfectada e controle)
foram entatildeo incubadas a 28 degC em LIT suplementado de G418 Apoacutes 24 horas de
incubaccedilatildeo foi adicionado o antibioacutetico higromicina ao meio de cultura na
concentraccedilatildeo de 500 μgml As culturas foram mantidas por sucessivas passagens
(diluiccedilatildeo de 110) em meio LIT suplementado com G418 e higromicina a cada 8-10
dias ateacute a ausecircncia de proliferaccedilatildeo celular na cultura controle Mutantes nos quais
os dois alelos de TcKAP7 foram removidos e substituiacutedos pelos genes NEO e
HIGRO foram denominados com genoacutetipo T cruzi (kap7neokap7higro)
3227 Anaacutelise por PCR do DNA dos parasitas transfectados com o cassete
UPS-HIGRO-DOWN
As reaccedilotildees de PCR foram realizadas utilizando primers externos EXTF e
EXTR (item 3225) combinados com os primers HIGROF e HIGROR (item 3221)
As reaccedilotildees de PCR foram realizadas nas seguintes condiccedilotildees 100 ng do
DNA total de T cruzi(kap7kap7) ou do DNA do T cruzi(kap7neokap7higro) 10 pmol dos
primers EXTF + HIGROR e HIGROF + EXTR 200 μM de cada dNTP MgCl2 15
mM tampatildeo Taq DNA polimerase 1x 25 unidades de Taq DNA polimerase
(Invitrogen EUA) A reaccedilatildeo de PCR foi processada no termociclador modelo 9700
(Applied Biosystems EUA) nas seguintes condiccedilotildees Desnaturaccedilatildeo do material por
4 min a 94 degC seguida de 35 ciclos de desnaturaccedilatildeo a 92 degC por 30 s hibridizaccedilatildeo
dos oligonucleotiacutedeos a 55 degC por 30 s e extensatildeo a 72 degC por 2 min
3228 Anaacutelise da organizaccedilatildeo do gene TcKAP7 e da eficiecircncia de seu nocaute
atraveacutes de ensaio do tipo Southern blot
O DNA genocircmico (5 μg) de T cruzikap7kap7 e T cruzikap7neokap7higro foi
submetido a digestatildeo com a enzima de restriccedilatildeo HindIII de acordo com as
especificaccedilotildees do fornecedor Apoacutes 3 horas o DNA digerido foi submetido agrave
eletroforese em gel de agarose 08 em tampatildeo TBE a 100 V O gel foi corado por
brometo de etiacutedio (05 μgmL) e fotografado sob a luz ultravioleta (310 nm)
Posteriormente o gel foi tratado com soluccedilotildees de depurinaccedilatildeo por 15 minutos de
desnaturaccedilatildeo por 30 minutos (2 vezes) e soluccedilatildeo de neutralizaccedilatildeo por 30 minutos (2
vezes) O DNA foi transferido para uma membrana de nylon (Hybond N
59
AmershamBiosciences) por capilaridade (SAMBROOK et al 1989) utilizando-se de
uma ldquoponterdquo de papel 3 MM embebido em SSC 20X Apoacutes a transferecircncia o DNA foi
fixado agrave membrana por exposiccedilatildeo agrave luz ultravioleta com uma dose de 120 mJcm2
usando o aparelho Spectrolinker (Spectronicscorp USA) A membrana contendo o
DNA de T cruzi foi preacute-hibridizada em soluccedilatildeo de hibridizaccedilatildeo de DNA por 1 hora a
65 ordmC seguido da adiccedilatildeo da sonda marcada radioativamente com α-[P32
]-dCTP (10
μCiμl 3000 Cimmol) (Amersham Biosciences) preparada segundo meacutetodo de nick
translation descrito por Rigbyet al (1977) utilizando-se o meacutetodo de iniciaccedilatildeo por
random primers (Megaprimer DNA labeling kit ndash GE) conforme recomendaccedilotildees do
fabricante
Foram utilizadas 3 sondas satildeo elas fragmento do gene TcKAP7
correspondendo a regiatildeo compreendida entre os nucleotiacutedeos 1 e 560 o gene neo e
o gene higro Apoacutes a marcaccedilatildeo as sondas foram purificadas em colunas de
Sephadex G-50 (ProbeQuant ndash Amersham Biosciences) e adicionadas ao tampatildeo de
hibridizaccedilatildeo na concentraccedilatildeo de 5 x 106
cpmml As membranas foram incubadas
por 16 horas a 65 C e em seguida lavadas nesta temperatura duas vezes por 30
minutos com soluccedilotildees de alta meacutedia e baixa estringecircncia As membranas foram
expostas a filme de raio-X (Hyperfilmreg Amersham Biosciences) na presenccedila de tela
intensificadora (Dupont Cronex Lightining Plus) por tempo que varia entre 1 a 3 dias
a ndash70 C
323 Localizaccedilatildeo celular da proteiacutena TcKAP7 atraveacutes de ensaio de
imunofluorescecircncia
Formas epimastigotas de T cruzi foram coletadas por centrifugaccedilatildeo (4000 times
g 3 a 10 ordmC) lavadas duas vezes em PBS e depositadas sobre lacircminas de vidro
previamente tratadas com poli-L-lisina 001 diluiacuteda em PBS Os parasitas foram
entatildeo fixados com paraformaldeiacutedo 4 em PBS permeabilizados com Triton X-100
01 em PBS por 2 min agrave temperatura ambiente e incubados a 4ordmC durante 16 h
em soluccedilatildeo de bloqueio para imunofluorescecircncia (PBS 1X + BSA 1 ) Apoacutes o
bloqueio os parasitas foram incubados agrave temperatura ambiente por 1 h com o
anticorpo monoclonal anti-FLAG em uma diluiccedilatildeo de 11000 em soluccedilatildeo de bloqueio
para imunofluorescecircncia Depois disso as lacircminas foram submetidas a 5 lavagens
60
de 5 min cada em PBS Em seguida os parasitas foram incubados agrave temperatura
ambiente por 1 hora com o anticorpo secundaacuterio anti-IgG de camundongo conjugado
ao fluoroacuteforo Alexa Fluacuteor 488 (Invitrogen) diluiacutedo 1600 em soluccedilatildeo de bloqueio As
lacircminas foram lavadas 5 vezes com PBS e posteriormente incubadas com o corante
Hoechst 33342 (Invitrogen) a 2 μgμL em PBS por 5 min Apoacutes cinco lavagens com
PBS as lacircminas foram montadas com ProLong Gold Antifade (Invitrogen) sobre uma
lacircmina de microscopia oacutetica O material foi observado nos microscoacutepios Leica SP5 e
DMI6000
324 Anaacutelise da ultraestrutura do cinetoplasto do mutante de T cruzi para
TcKAP7 por microscopia eletrocircnica de transmissatildeo
Os parasitas foram coletados lavados com PBS e fixados em soluccedilatildeo
contendo 25 de glutaraldeiacutedo 4 de paraformaldeiacutedo e tampatildeo cacodilato 01 M
Em seguida os parasitas foram fixados por 1 h em soluccedilatildeo de 1 de tetroacutexido de
Oacutesmio e 08 de ferricianeto de potaacutessio diluiacutedos em tampatildeo cacodilato 01 M As
ceacutelulas foram entatildeo desidratadas em soluccedilatildeo contendo concentraccedilotildees crescentes
de acetona e incluiacutedas em Epon Apoacutes a obtenccedilatildeo de cortes ultrafinos dos parasitas
os mesmos foram contrastados em acetato de uranila e citrato de Chumbo antes de
serem observados e fotografados no microscoacutepio eletrocircnico de transmissatildeo Zeiss
900
325 Coloraccedilatildeo dos parasitas transfectados
A coloraccedilatildeo dos parasitas foi realizada pelo meacutetodo panoacutetico raacutepido
(Laborclin Pinhais Paranaacute Brasil) modificado
Formas epimastigotas do mutante de T cruzi para TcKAP7 foram cultivadas
como descrito no item 321 Os parasitas foram coletados por centrifugaccedilatildeo de 1
min a 4000 x g e ressuspensos em PBS Desta suspensatildeo uma gota foi retirada e
depositada sobre lacircminas previamente limpas Quando secas as lacircminas foram
imersas individualmente na Soluccedilatildeo 1 (Fixador) Soluccedilatildeo 2 (Revelador) e Soluccedilatildeo 3
(Corante) em cada uma por 30 s Apoacutes este processo as lacircminas foram lavadas em
aacutegua corrente secas agrave temperatura ambiente e cobertas com Permount e lamiacutenula
Os parasitas foram visualizados em microscoacutepio Nikon E600
61
326 Infecccedilatildeo de ceacutelulas Vero com o mutante de T cruzi para TcKAP7
Ceacutelulas Vero (ATCCreg Nuacutemero CRL-2783trade) foram cultivadas em garrafas
de 150 cm2 contendo meio RPMI suplementado com 5 de soro fetal bovino
(GIBCO) penicilina 100 UIml streptomicina 10 microgml e glutamina 2 mM a 37 o C
com 5 de CO2 Ao atingirem a confluecircncia (80 a 100) realizou-se a passagem
atraveacutes de tripsinizaccedilatildeo e foi feito um inoacuteculo de 1 x 107 ceacutelulas para cada nova
garrafa de 150 cm2 Apoacutes 24 horas estas ceacutelulas (50 ndash 70 de confluecircncia) foram
infectadas com formas metaciacuteclicas obtidas da diferenciaccedilatildeo do mutante de T cruzi
para TcKAP7 em microplacas de 24 poccedilos contendo lamiacutenulas de vidro com
diacircmetro de 13 mm A cada poccedilo foram adicionadas 2 x 104 ceacutelulas Vero Apoacutes 24
horas de cultivo as ceacutelulas foram infectadas com tripomastigotas metaciacuteclicos
(obtidos do sobrenadante das culturas de T cruzi diferenciados em meio TAU3AAG
sem purificaccedilatildeo na coluna de DEAE celulose) A infecccedilatildeo das ceacutelulas Vero foi
acompanhada diariamente por microscopia de contraste de fase
327 Anaacutelise da funccedilatildeo do gene TbKAP7 de Trypanosoma brucei atraveacutes de
ensaios de RNA de interferecircncia
Com o intuito de complementar os estudos da funccedilatildeo do gene TcKAP7 foi
utilizada a teacutecnica de RNA de interferecircncia O uso dessa metodologia compreende
uma abordagem alternativa agrave anaacutelise da funccedilatildeo gecircnica para genes ortoacutelogos deT
brucei por anaacutelises de RNAi uma vez que a maquinaria de RNAi em T cruzi eacute
inexistente (DA ROCHA et al 2003) Os resultados podem gerar evidecircncias que
estejam relacionadas agrave funcionalidade dos genes em T cruzi Esta abordagem foi
utilizada neste trabalho para auxiliar no estudo da funccedilatildeo do gene TcKAP7 a partir
do ortoacutelogo em T brucei ainda natildeo caracterizadoTbKAP7 Os ensaios de RNAi
foram realizados em T brucei cepa 29-13 (WIRTZ et al 1999) com sistema induzido
por tetraciclina utilizando o vetor p2T7-177 ilustrado na figura 12 Este vetor quando
transfectado no parasita integra-se aos minicromossomos do T brucei regiatildeo de
repeticcedilotildees 177 (FOLDYNOVA-TRANTIRKOVA et al 2005)
62
FIGURA 12 MAPA DO VETOR p2T7-177 UTILIZADO PARA ENSAIOS DE RNAi LEGENDA T7 prom Promotor de T7 RNA Polimerase induzido por tetraciclina T7 term Terminador de transcriccedilatildeo 177 Sequumlecircncia repetitiva de 177 pares de bases para alvo de inserccedilatildeo em minicromossomos BLEO gene de resistecircncia agrave fleomicina GFP Proteiacutena Green FluorescentProtein os siacutetios para as enzimas de restriccedilatildeo estatildeo indicados AmpR gene de resistecircncia agrave ampicilina (FONTE WICKSTEAD et al 2002)
As regiotildees do mRNA para alvos nos ensaios de RNAi foram escolhidas com
o auxiacutelio da ferramenta RNAit da base de dados do Trypanofan - Genocircmica
funcional de Tbrucei (httptrypanofanpathcamacuktrypanofanmain)
(REDMOND et al 2003) Essas regiotildees foram amplificadas por PCR usando como
molde o DNA total de T brucei (100 ngreaccedilatildeo) 10 pmol dos primers listados na
tabela 3 200 mM de cada dNTP 15 mM de MgCl2 tampatildeo Taq DNA polimerase 1x
63
(Invitrogen) e 25 unidades de Taq DNA polimerase (Invitrogen) A reaccedilatildeo foi
aquecida por 4 min a 94 degC e entatildeo submetida a 35 ciclos de desnaturaccedilatildeo a 94 degC
por 30 s anelamento a 55 degC por 30 s e extensatildeo a 72 degC por 1 min Os primers
utilizados apresentam siacutetio para as enzimas de restriccedilatildeo BamHI (F) ou HindIII (R)
Os produtos de PCR foram purificados por extraccedilatildeo com fenol-clorofoacutermio e
digeridos com as referentes enzimas
QUADRO 3 - RELACcedilAtildeO DOS PRIMERS UTILIZADOS PARA A AMPLIFICACcedilAtildeO DO
GENE TbKAP7
KAP7RNAiF
AAAGGATCCCTAACCTAACCTGCAGGGTCTCTCG
KAP7RNAiR
GCGAAGCTTTTGTTCCTTTACAAACGCCC
Os siacutetios das enzimas de restriccedilatildeo BamHI (GGATCC) e HindIII (AAGCTT) adicionados aos primers estatildeo em negrito
As clonagens foram confirmadas por PCR de colocircnia e os plasmiacutedeos foram
purificados pelo kit QIAprep Spin Miniprep (Qiagen) Apoacutes purificaccedilatildeo 10 μg dos
plasmiacutedeos foram linearizados com a enzima NotI conforme descrito pelo fabricante
O DNA foi precipitado e ressuspenso em 50 μl de meio de eletroporaccedilatildeo ZPFM para
transfecccedilatildeo do T brucei
Para cada transfecccedilatildeo foi utilizado um total de 4 x 107parasitas em fase logariacutetmica
de crescimento Os parasitas foram obtidos por centrifugaccedilatildeo (5000 x g por 10 min
a 4 degC) lavados em meio ZPFM e ressuspensos em 500 μl do mesmo meio A
transfecccedilatildeo foi feita em cubetas de eletroporaccedilatildeo (4 mm) usando o eletroporador da
BioRad (GenePulser II Electroporator) As condiccedilotildees utilizadas foram dois pulsos de
1600 V e 25 microF Os parasitas foram entatildeo transferidos para garrafas contendo meio
SDM-79 SFB 10 higromicina 50 μgml e G418 15 μgml A seleccedilatildeo dos parasitas
transfectados foi atraveacutes da adiccedilatildeo de 5μgmL de fleomicina resistecircncia conferida
pelo vetor p2T7-177 apoacutes 24 horas de cultivo O tempo para seleccedilatildeo foi entre duas
e trecircs semanas
64
3271 Induccedilatildeo do RNA dupla fita
A induccedilatildeo da expressatildeo de RNA dupla fita referente agrave porccedilatildeo do gene
TbKAP7 clonado no plasmiacutedeo p2T7-177 deu-se pela adiccedilatildeo de tetraciclina 2 μgml
a uma cultura transfectada de T brucei em fase de crescimento exponencial (~2 x
106 parasitasml) Nos dias que se seguiram 1μgml de tetraciclina foi adicionada
diariamente agraves culturas A observaccedilatildeo dos efeitos na curva de crescimento causada
por RNAi em T brucei foi realizada ao longo de uma semana com a contagem de
ceacutelulas e adiccedilatildeo diaacuteria de tetraciclina 1 μgml
65
4 RESULTADOS
41 Clonagem e caracterizaccedilatildeo do gene TcKAP7
A regiatildeo codificante do gene TcKAP7 (ID Tc00104705350871950) foi
obtida a partir do banco de dados do genoma do T cruzi disponiacutevel no portal da
internet wwwgenedborg e amplificada por PCR com os primers descritos no item
37
No genoma do T cruzi cepa CL Brener (EL-SAYED et al 2005) foram
identificados dois haploacutetipos do gene TcKAP7 que foram denominados neste
trabalho de haploacutetipo A (Tc00104705350871950) e haploacutetipo B
(Tc00104705350979320) Neste trabalho foi utilizado o gene TcKAP7 proveniente
da cepa Dm28c de T cruzi Este gene apresenta uma regiatildeo codante de 747 pb e
codifica uma proteiacutena de 276 kDa assumindo que o primeiro ATG apoacutes a sequecircncia
do mini-eacutexon seja usada na iniciaccedilatildeo da traduccedilatildeo
A figura 13 abaixo mostra o alinhamento de TcKAP7 das cepas CL Brener e
Dm28c
FIGURA 13 - COMPARACcedilAtildeO ENTRE AS SEQUumlEcircNCIAS DE AMINOAacuteCIDOS DEDUZIDAS DO GENE KAP7 DE T cruzi Dm28C E DOS HAPLOacuteTIPOS DE CL BRENER
LEGENDA As posiccedilotildees com aminoaacutecidos idecircnticos em todas as sequumlecircncias estatildeo coloridas em preto
66
Embora o gene TcKAP7 natildeo possua grande identidade com os com genes
ortoacutelogos em Trypanosoma brucei TbKAP7 (714 pb) (Tb106k151470) Leishmania
major LmKAP7 (1044 pb) (LMJF_36_5840) Leishmania infantum LiKAP7 (1044 pb)
(LINJ_36_6090) e Leishmania braziliensis LbKAP7 (1038 pb) (LBRM_35_0010)
cujos genomas tambeacutem foram sequumlenciados (BERRIMAN et al 2005 IVENS et al
2005 PEACOCK et al 2007) as sequecircncias de aminoaacutecidos das respectivas
proteiacutenas deduzidas a partir desses genes ainda compartilham certo grau de
similaridade entre si (FIGURA 14) Na tabela 4 pode-se visualizar o percentual de
identidade entre as proteiacutenas KAP7 dos tripanossomatiacutedeos que possuem o genoma
sequenciado
FIGURA 14 COMPARACcedilAtildeO ENTRE AS SEQUumlEcircNCIAS DE AMINOAacuteCIDOS DEDUZIDAS DO GENE KAP7 EM DIFERENTES TRIPANOSOMATIacuteDEOS LEGENDA Em preto encontram-se os resiacuteduos de aminoaacutecidos idecircnticos em todas as sequumlecircncias e em cinza os resiacuteduos conservados na maioria delas
67
QUADRO 4 - PERCENTUAL DE IDENTIDADE ENTRE AS PROTEIacuteNAS KAP7 NOS
TRIPANOSSOMATIacuteDEOS COM O GENOMA SEQUENCIADO
Os valores foram obtidos pelo alinhamento utilizando a ferramenta Clustal21
Mesmo apresentando pouca identidade e variaccedilatildeo de tamanho alguns
dados do genoma sugerem que esses genes satildeo ortoacutelogos entre si Pode-se
perceber uma sintenia entre seus loci nas vaacuterias espeacutecies de tripanosomatiacutedeos
(Cavalcanti et al 2009) (FIGURA 15)
FIGURA 15- SINTENIA DE TcKAP7 COM OUTROS TRIPANOSOMATIacuteDEOS LEGENDA Os dois contigs de TcKAP7 (TcA e TcB) estatildeo representados nesta figura juntamente com os contigs de outros tripanosomatiacutedeos (Tb= T brucei Lm= L major Li= L infantum e Lb= L brasiliensis) mostrando que KAP7 representado pela cor amarela apresenta uma sintenia entre seus loci em todas as espeacutecies mostradas sendo flanqueado pelo gene KAP4 em T cruzi e T brucei representado em azul Portanto em L majorL infantum eL brasiliensis ao lado direito de KAP7 estaacute o gene de uma proteiacutena hipoteacutetica representado pela cor vermelha e ao lado esquerdo encontra-se o gene da KAP4 representado em azul como mencionado anteriormente FONTE CAVALCANTI et al 2009
68
A expressatildeo de vaacuterios genes mitocondriais de C fasciculata e L major eacute
regulada durante o ciclo celular em parte por uma sequumlecircncia consenso
[(CA)AUAGAA(GA)] presente nas regiotildees 5rsquo e 3rsquo-UTR dos respectivos mRNAs
(BROWN amp RAY 1997 MAHMOOD et al 1999 MAHMOOD amp RAY 1998 PASION
et al 1996 ZICK et al 2005)
Assim resolvemos caracterizar a regiatildeo 5rsquo-UTR do transcrito TcKAP7 na
tentativa de identificar sinais com identidade com aqueles encontrados em C
fasciculata Na figura 16 estaacute representada a regiatildeo 5rsquo-UTR do transcrito TcKAP7
com a sequumlecircncia parcial do mini-exon proveniente do primer usado na teacutecnica de
RT-PCR bem como parte da regiatildeo codificante do gene O mini-exon estaacute situado a
129 bases a jusante do iniacutecio da regiatildeo codificante do transcrito TcKAP7 e define
portanto uma regiatildeo 5rsquo-UTR de 168 bases considerando que o tamanho do mini-
exon eacute de 39 bases A anaacutelise da regiatildeo 5rsquo-UTR mostrou um elemento com
caracteriacutesticas muito semelhantes aquele envolvido na regulaccedilatildeo de genes em C
fasciculata (sequencia (G)ATAGAA(G) mostrada no retacircngulo preto na FIGURA
16B) sugerindo que TcKAP7 seja regulada durante o ciclo celular
69
A
B
FIGURA 16 CARACTERIZACcedilAtildeO DA REGIAtildeO 5rsquo-UTR DO TRANSCRITO TcKAP7 LEGENDA A Esquema geral da localizaccedilatildeo do mini-exon de TcKAP7 e B Localizaccedilatildeo especiacutefica do mini-exon de TcKAP7 O mini-exon de TcKAP7 (sequecircncia parcial em verde) estaacute localizado a 129 pb da regiatildeo codante (representada em parte pela cor azul) A regiatildeo 5rsquoUTR do transcrito Tckap7 estaacute representada na cor rosa A possiacutevel sequencia consenso de regulaccedilatildeo durante o ciclo celular estaacute indicada no retacircngulo preto
42 Expressatildeo da proteiacutena TcKAP7 em T cruzi
Formas epimastigotas foram transfectadas com o plasmiacutedeo pNEO3XFLAG
contendo o gene TcKAP7 (pNEO_KAP7_3xFLAG) A expressatildeo da proteiacutena
TcKAP7-FLAG foi analisada por ensaio de western blot Os resultados mostraram
que a expressatildeo da proteiacutena TcKAP7-FLAG foi satisfatoacuteria correspondendo ao
tamanho esperado (FIGURA 17 ) a qual foi confirmada pela reatividade do anticorpo
monoclonal especiacutefico para as etiquetas FLAG (anti-FLAG)
70
FIGURA 17 ANAacuteLISE DA EXPRESSAtildeO DA PROTEIacuteNA DE FUSAtildeO TCKAP7-FLAG EM FORMAS EPIMASTIGOTAS DE T CRUZI
43 Localizaccedilatildeo celular de TcKAP7 atraveacutes de ensaio de imunofluorescecircncia
Para verificar a localizaccedilatildeo celular de TcKAP7 foi realizado o ensaio de
imunofluorescecircncia Como natildeo foi possiacutevel a obtenccedilatildeo do anticorpo com alto tiacutetulo
contra a proteiacutena recombinante TcKAP7 neste ensaio foi utilizado o anticorpo
monoclonal anti-FLAG que reconhece a etiqueta FLAG a qual estaacute fusionada a
proteiacutena TcKAP7
Nessa figura pode-se observar que a proteiacutena de fusatildeo acumula-se na regiatildeo
dos poacutelos do cinetoplasto das formas epimastigotas do T cruzi (FIGURA 18)
indicando que TcKAP7 uma proteiacutena tipo histona H1 estaacute realmente associada com
o kDNA do parasita
71
FIGURA 18 IMUNOLOCALIZACcedilAtildeO DE TcKAP7 EM EPIMASTIGOTAS DE T CRUZI LEGENDAA contraste interferencial diferencial (DIC) B Hoechst marcando o nuacutecleo e o
cinetoplasto C fluorescecircncia mostrando a localizaccedilatildeo de TcKAP7 mais intensa na regiatildeo dos poacutelos
docinetoplasto dos protozoaacuterios D Aumento de C
44 Deleccedilatildeo do gene TcKAP7 por nocaute gecircnico
As teacutecnicas que permitem a remoccedilatildeo de um gene e sua substituiccedilatildeo por
genes repoacuterteres atraveacutes do processo de recombinaccedilatildeo tecircm sido usadas com
sucesso para verificaccedilatildeo da funccedilatildeo gecircnica em tripanosomatiacutedeos (MACRAE et al
2006) O nocaute gecircnico consiste na inserccedilatildeo de marcadores geneacuteticos de seleccedilatildeo
(gene codificando resistecircncia a neomicina ou higromicina entre outros) flanqueados
por sequumlecircncias pertencentes ao locus cromossocircmico de interesse Atraveacutes do
processo de recombinaccedilatildeo homoacuteloga o marcador pode entatildeo substituir o gene que
se quer estudar Desse modo pode ser possiacutevel analisar a funccedilatildeo de determinado
gene atraveacutes das alteraccedilotildees - decorrentes de sua ausecircncia - na fisiologia do
parasita No presente estudo os genes repoacuterteres que codificam resistecircncia aos
72
antibioacuteticos G418 e higromicina foram flanqueados por sequumlecircncias a montante e a
jusante da regiatildeo codificante do gene TcKAP7 As construccedilotildees foram usadas para
transfectarT cruzi e gerar mutantes para o gene TcKAP7 a fim de se estudar o
efeito que a ausecircncia do gene TcKAP7 causa no metabolismo do parasita
Apoacutes obtenccedilatildeo de uma populaccedilatildeo de T cruzi mutante para o gene TcKAP7
(kap7neokap7higro) resistente a ambos antibioacuteticos G418 e higromicina B o
DNA desta populaccedilatildeo foi extraiacutedo para anaacutelise por PCR e Southern blot a fim de
confirmar a eficiecircncia do nocaute
441 Anaacutelise por PCR do DNA dos parasitas transfectados com os cassetes
UPS-NEO-DOWN e UPS-HIGRO-DOWN
Foram realizadas vaacuterias reaccedilotildees de PCR a fim de confirmar a deleccedilatildeo do
gene TcKAP7 do genoma do T cruzi Dm28c e a substituiccedilatildeo dos seus alelos pelos
genes neo e higro As reaccedilotildees de PCR foram feitas com DNA de T cruzikap7kap7 (tipo
selvagem) e com DNA de T cruzikap7neokap7higro utilizando diversas combinaccedilotildees de
primers (TABELA 5) Na figura 32 observa-se que o gene TcKAP7 (747 pb) foi
amplificado somente na PCR realizada com DNA de T cruzi tipo selvagem (FIGURA
19 A canaleta 1) enquanto que os genes neo (795 pb) e higro (1026 pb) soacute foram
amplificados nas reaccedilotildees que conteacutem DNA da populaccedilatildeo do T cruzi kap7neokap7higro
(FIGURA 19 B canaletas 2 e 3) Os tamanhos esperados para amplificaccedilotildees usando
primers externos agraves construccedilotildees e os primers dos genes de resistecircncia foram
identificados no gel de agarose indicando que os cassetes se integraram
corretamente no locus do gene TcKAP7 (FIGURA 19 B canaletas 4 a 7) Um
esquema da localizaccedilatildeo dos primers utilizados nas reaccedilotildees de PCR pode ser
visualizado na figura 19 C
QUADRO 5 ndash COMBINACcedilOtildeES DE PRIMERS UTILIZADOS NA PCR PARA
CONFIRMAR O NOCAUTE DE TcKAP7
Pares de primers Tamanho esperado
(pb)
1 KAP7F + KAP7R 747
2 NEOF + NEOR 795
73
3 HIGROF + HIGROR 1026
4 EXTF + NEOR 1410
5 EXTF + HIGROR 1634
6 NEOF + EXTR 1358
7 HIGROF + EXTR 1360
74
FIGURA 19 ENSAIOS DE PCR UTILIZANDO DNA DE T cruzi kap7kap7 (WT) E
T cruzi kap7neokap7higro (NO) COM DIFERENTES PRIMERS
LEGENDA 1 KAP7F + KAP7R 2 NEOF + NEOR (795 pb) 3 HIGROF + HIGROR (1026 pb) 4
EXTF + NEOR (1410 pb) 5 EXTF + HIGROR (1634 pb) 6 NEOF + EXTR (1358 pb) e 7
HIGROF + EXTR (1360 pb) No quadro A encontram-se as PCRs realizadas com DNA de T cruzi kap7kap7 (WT) e no quadro B encontram-se as PCRs realizadas com DNA de T cruzi kap7neokap7higro
(NO) No quadro C estaacute um esquema da localizaccedilatildeo dos primers utilizados
442 Anaacutelise da organizaccedilatildeo dos genes TcKAP7 neo e higro por ensaio do
tipo Southern blot
Neste ensaio foi utilizado DNA total extraiacutedo de T cruzikap7kap7 (tipo selvagem)
e T cruzi kap7neokap7higro (duplo nocaute) Foram utilizadas trecircs sondas (1) Um
fragmento do gene TcKAP7 (primeiros 598 pb da CDS) (2) o gene neo e (3) o gene
higro O DNA total das duas amostras foi digerido com a enzima de restriccedilatildeo HindIII
O padratildeo de digestatildeo desta enzima pode ser visualizado na figura 20 De acordo
com o mapa de restriccedilatildeo a inserccedilatildeo do cassete neo no locus KAP7 geraria um
fragmento HindIIIHindIII de 1024 pb enquanto a inserccedilatildeo do cassete higro geraria
um fragmento de 1032 pb cujos tamanhos satildeo diferentes do fragmento
HindIIIHindIII do locus original (1776 pb) As hibridizaccedilotildees mostram bandas
compatiacuteveis com os tamanhos dos fragmentos HindIIIHindIII esperados para cada
situaccedilatildeo acima (FIGURA 21) Podemos observar que a sonda KAP7 somente
reconhece uma banda de tamanho esperado apenas no DNA do parasita selvagem
(canaleta 1 FIGURA 21) enquanto que bandas correspondentes aos genes neo e
higrosomente aparecem no DNA do mutante KAP7 (canaleta 2 FIGURA 21)
75
FIGURA 20 ndash REPRESENTACcedilAtildeO ESQUEMAacuteTICA DOS SIacuteTIOS DA ENZIMA HindIII NO LOCUS DO GENE KAP7 DE T cruzi CL Brener LEGENDA Este esquema representa esquematicamente em escala os genes kap3 neo e higro as regiotildees upstream e downstream e os siacutetios de clivagem da enzima KpnI
FIGURA 21 ANAacuteLISE DA ORGANIZACcedilAtildeO DOS GENES TCKAP7 NEO E HIGRO POR ENSAIO DO TIPO SOUTHERN BLOT LEGENDA A Autoradiograma e B Padrotildees dos fragmentos obtidos da digestatildeo do DNA com a enzima de restriccedilatildeo HindIII Foram utilizadas trecircs sondas TcKAP7 neomicina e higromicina 1) DNA de T cruzikap7kap7 (tipo selvagem) e 2) T cruzi kap7neokap7higro (duplo nocaute)
76
45 Comparaccedilatildeo da expressatildeo do gene TcKAP7 por western blot
O antisoro contra a proteiacutena TcKAP7 obtido apoacutes imunizaccedilatildeo dos
camundongos foi utilizado em ensaio do tipo western blot para avaliar se TcKAP7
ainda estava sendo expresso no T cruzi apoacutes o nocaute gecircnico
O que se observou foi novamente como esperado que a proteiacutena TcKAP7 natildeo eacute
mais expressa no T cruzi kap7neokap7higro (figura 22) Pode-se observar a presenccedila
de TcKAP7 ( aprox 28 kDa) no extrato das formas epimastigotas de T cruzi kap7kap7
(figura 22A) mas natildeo no extrato de epimastigotas de T cruzi
kap7neokap7higro (figura 22B)
FIGURA 22 COMPARACcedilAtildeO DA EXPRESSAtildeO DO GENE TcKAP7 POR WESTERN BLOT LEGENDA Imunoblot de extratos de epimastigotas de T cruzi kap7kap7 (A) e de T cruzi kap7neokap7higro (B) reagidos com anti-TcKAP7
46 Anaacutelise da morfologia e da ultraestrutura do cinetoplasto do mutante de T
cruzi para TcKAP7
Sabendo-se que TcKAP7 estaacute associada ao cinetoplasto e pode estar
envolvida na compactaccedilatildeo do kDNA do T cruzi como foi mostrado para as KAPs de
Crithidia fasciculata (XU amp RAY 1993 XU et al 1996 HINES amp RAY 1998) sua
ausecircncia poderia levar a alteraccedilatildeo na estrutura do DNA mitocondrial dos parasitas
nocauteados Portanto o primeiro passo foi verificar se havia alteraccedilotildees na
77
morforlogia do parasita Formas epimastigotas do mutante de T cruzi foram
analisadas ao microscoacutepio oacuteptico apoacutes coloraccedilatildeo Como pode ser observado na
figura 23 epimastigotas do mutante de T cruzi para TcKAP7 apresentam uma
morfologia fusiforme com o cinetoplasto caracteriacutestico em forma de barra localizado
anteriormente ao nuacutecleo natildeo se evidenciando portanto nenhuma alteraccedilatildeo em
relaccedilatildeo agrave morfologia dos parasitas do tipo selvagem
FIGURA 23 - COLORACcedilAtildeO PELO MEacuteTODO PANOacuteTICO RAacutePIDO DOS PARASITAS EPIMASTIGOTAS NOCAUTEADOS LEGENDA A) Formas epimastigotas B) Forma epimastigota em maior aumento
Formas epimastigotas de parasitas do tipo selvagem e nocauteados foram
entatildeo analisados pela teacutecnica de microscopia eletrocircnica de transmissatildeo para
visualizar com mais detalhe o cinetoplasto e verificar se sua estrutura estava
alterada pela ausecircncia da TcKAP7 (FIGURA 24) A figura 24A mostra um corte
ultrafino de um epimastigota de T cruzi do tipo selvagem que apresenta o
cinetoplasto compacto e em forma de bastatildeo caracteriacutestico de formas
epimastigotas sem nenhuma alteraccedilatildeo aparente O mesmo pode ser visto na figura
24B para o epimastigota de T cruzi nocauteado A disposiccedilatildeo estrutura e aspecto
do cinetoplasto de ambos os parasitas selvagem e nocauteado natildeo apresentaram
nenhuma diferenccedila entre si mostrando que mesmo apoacutes o nocaute da KAP7 a
estrutura do cinetoplasto permanece aparentemente inalterada
78
FIGURA 24 COMPARACcedilAtildeO ENTRE A ULTRAESTRUTURA DO CINETOPLASTO DO T cruzi DM28C TIPO SELVAGEM (A) E DO MUTANTE DE T cruzi PARA TcKAP7 (B) POR MICROSCOPIA ELETROcircNICA DE TRANSMISSAtildeO
79
47 Multiplicaccedilatildeo diferenciaccedilatildeo e infectividade do mutante de T cruzi para
TcKAP7
Os parasitas mutantes foram analisados a fim de verificar se alteraccedilotildees na
estrutura do kDNA pela ausecircncia de KAP7 natildeo estavam levando a alteraccedilotildees na
fisiologia do parasita alterando sua multiplicaccedilatildeo diferenciaccedilatildeo e infectividade
Inicialmente foi analisado o perfil da curva de crescimento das formas
epimastigotas Observou-se que natildeo havia diferenccedila na curva de crescimento dos
parasitas nocauteados em relaccedilatildeo ao parasita selvagem (FIGURA 25)
FIGURA 25 CURVA DE CRESCIMENTO DO MUTANTE DE T cruzi PARA TcKAP7 (KO) E DO T cruzi Dm28c SELVAGEM (WT)
LEGENDA Curva de crescimento do mutante de T cruzi para TcKAP7 () e do T cruzi Dm28c ()
Em seguida os parasitas nocauteados foram analisados quanto a sua capacidade
de diferenciaccedilatildeo em tripomastigotas metaciacuteclicos Foram realizadas contagens
diferenciais em cacircmara de Neubauer a partir do sobrenadante da metaciclogecircnese
a cada 24 h apoacutes a incubaccedilatildeo das ceacutelulas em meio TAU3AAG durante um periacuteodo
de 3 dias (72 h) A partir dessas contagens foram construiacutedos curva com a contagem
do nuacutemero de metaciacuteclicos ao longo dos trecircs dias (FIGURA 26)
Nenhuma alteraccedilatildeo foi observada quando os parasitas nocauteados foram
submetidos ao processo de metaciclogecircnese in vitro Ou seja pode-se afirmar que
80
mesmo apoacutes o nocaute do gene TcKAP7 as formas epimastigotas do parasita
conseguem se diferenciar em formas metaciacuteclicas
FIGURA 26 METACICLOGEcircNESE IN VITRO DE T cruzi Dm28c TIPO SELVAGEM E T cruzi NOCAUTEADO LEGENDA Metaciclogecircnese in vitro de T cruzi Dm28c tipo selvagem () e T cruzi nocauteado ()
Uma vez que os parasitas nocauteados foram capazes de se diferenciar de
epimastigota a tripomastigota metaciacuteclico resolveu-se investigar se estes eram
capazes de infectar ceacutelulas in vitro Foi possiacutevel perceber as formas amastigotas
dentro de ceacutelulas VERO em cultura mostrando que o parasita natildeo perdeu sua
capacidade de infecccedilatildeo (dados natildeo mostrados) Assim pode-se concluir que aleacutem
de sofrer diferenciaccedilatildeo os mutantes de T cruzi para KAP7 tambeacutem mantiveram sua
capacidade de infecccedilatildeo
48 Anaacutelise da funccedilatildeo do gene KAP7 de Trypanosoma brucei atraveacutes de
ensaios de RNA de interferecircncia
Para averiguar a importacircncia da proteiacutena TcKAP7 na biologia do parasita
recorremos a ensaios de RNA de interferecircncia (RNAi) jaacute que existe uma alta
similaridade entre TcKAP7 e seu ortoacutelogo em Trypanosoma brucei
81
A via de RNA de interferecircncia consiste em um mecanismo de silenciamento
gecircnico que para a ceacutelula funciona como sistema de defesa O mecanismo inicia-se
atraveacutes da expressatildeo de um RNA dupla fita (dsRNA) contendo uma sequecircncia
complementar ao gene de interesse Este dsRNA seraacute entatildeo clivado em pequenos
fragmentos de cerca de 22 a 25 nucleotiacutedeos atraveacutes da atividade de uma
ribonuclease do tipo III denominada Dicer Estes pequenos RNAs seratildeo
direcionados e permaneceratildeo unidos a um complexo proteico denominado RISC
(ldquoRNA-InducedSilencingComplexrdquo) Nesse complexo os pequenos RNAs de
interferecircncia (siRNA) ligam-se por complementaridade ao RNA mensageiro do gene
a ser inativado guiando-os para degradaccedilatildeo pelas nucleases presentes no
complexo impedindo a siacutentese da respectiva proteiacutena (ULLU et al 2002) O vetor
utilizado para promover o silenciamento do gene TbKAP7 foi o p2T7-177 Este
plasmiacutedeo integra-se aos minicromossomos do T brucei regiatildeo de repeticcedilotildees 177
(FOLDYNOVA-TRANTIRKOVA et al 2005) Este vetor apresenta dois promotores
de polimerase em oposiccedilatildeo induziacuteveis por tetraciclina flanqueando a sequumlecircncia de
interesse Desta forma satildeo geradas duas moleacuteculas de mRNA que pareadas
formam a moleacutecula de RNA fita dupla capaz de induzir a maquinaria de degradaccedilatildeo
A induccedilatildeo da inibiccedilatildeo de TbKAP7 atraveacutes de RNAi levou a uma diminuiccedilatildeo da
multiplicaccedilatildeo celular do parasita a partir do quarto dia do experimento (FIGURA 27)
Os resultados obtidos neste ensaio mostraram que a participaccedilatildeo da TbKAP7
no metabolismo do T brucei eacute essencial jaacute que o silenciamento do gene TbKAP7
levou agrave reduccedilatildeo da proliferaccedilatildeo celular do parasita
82
FIGURA 27 RNAi DE TbKAP7 INIBE O CRESCIMENTO DAS FORMAS PROCIacuteCLICAS DE T
brucei
LEGENDA Curva de crescimento de linhagem celular de RNAi de TbKAP7 em T brucei induzido por
tetraciclina As ceacutelulas foram diluiacutedas a uma densidade celular inicial de 1 X 106 ml na presenccedila e
ausecircncia de tetraciclina As densidades celulares foram determinadas pela contagem de ceacutelulas a
intervalos de 24 horas durante oito dias apoacutes iniacutecio de adiccedilatildeo de tetraciclina A linha com quadrados
mostra a curva de crescimento celular na presenccedila de tetraciclina (+TET) A linha com losangos
mostra a curva de crescimento celular na ausecircncia de tetraciclina (- TET)
49 Caracterizaccedilatildeo estrutural de TcKAP7
491 Produccedilatildeo recombinante de TcKAP7
O cultivo de E coli BL-21(DE3) STAR contendo o plasmiacutedeo pET28a-
TcKAP7 foi feito em meio LB a 37 oC com a induccedilatildeo da expressatildeo realizada a uma
densidade oacutetica de DO600 de 08 com a adiccedilatildeo de 05 mM de ITPG durante a noite a
37 oC
As ceacutelulas foram recuperadas por centrifugaccedilatildeo ressuspensas sonicadas e
centrifugadas para a purificaccedilatildeo de TcKAP7 atraveacutes da cromatografia de afinidade
em resina de Ni-NTA (Figura 28A) Foi possiacutevel obter grande quantidade de
83
amostra com grau de pureza alto como visualizado atraveacutes de anaacutelise por SDS-
PAGE (Figura 28B)
FIGURA28 PURIFICACcedilAtildeO DE TCKAP7 ATRAVEacuteS DE CROMATOGRAFIA DE AFINIDADE LEGENDA A) Cromatograma de afinidade B) SDS-PAGE da cromatografia de afinidade Os nuacutemeros agrave esquerda da figura representam os tamanhos das bandas do marcador de massa molecular (Benchmark) (Invitrogen) e P banda correspondente agrave TcKAP7 purificada Caixa em vermelho indica o pico que corresponde agrave fraccedilatildeo no SDS-PAGE
Devido agrave presenccedila de bandas com possiacuteveis contaminantes as fraccedilotildees que
continham a proteiacutena de interesse foram submetidas agrave purificaccedilatildeo por cromatografia
de troca iocircnica onde a purificaccedilatildeo eacute realizada baseada na afinidade por cargas
entre as proteiacutenas e a resina
Para esta purificaccedilatildeo utilizou-se a coluna SP Hitrap (GE Healthcare Life
Sciences) que eacute uma coluna de carga negativa Essa resina foi escolhida pois o pH
do tampatildeo em que se encontrava TcKAP7 era menor que o pI da proteiacutena Nessas
condiccedilotildees a carga superficial de TcKAP7 eacute positiva Para favorecer a interaccedilatildeo
TcKAP7 e resina foi feita uma diluiccedilatildeo de TcKAP7 para retirada de NaCl A eluiccedilatildeo
da proteiacutena foi realizada com um gradiente segmentado de tampatildeo B para
84
cromatografia de troca iocircnica TcKAP7 foi eluiacuteda com 68 do tampatildeo B (FIGURA
29)
FIGURA 29 PURIFICACcedilAtildeO DE TCKAP7 ATRAVEacuteS DE CROMATOGRAFIA DE TROCA IOcircNICA
LEGENDA A) Cromatografia de troca iocircnica B) SDS-PAGE da cromatografia de troca iocircnica Os nuacutemeros agrave esquerda da figura representam os tamanhos das bandas do marcador de massa molecular (Benchmark) (Invitrogen) e P banda correspondente agrave TcKAP7 purificada Caixa em vermelho indica o pico que corresponde agrave fraccedilatildeo no SDS-PAGE Curva em azul representa absorbacircncia em 280 nm Linha em verde indica concentraccedilatildeo de tampatildeo B para eluiccedilatildeo da amostra
410 Anaacutelise do estado oligomeacuterico de TcKAP7
A amostra purificada por troca iocircnica foi submetida agrave cromatografia de
exclusatildeo molecular tambeacutem chamada de gel filtraccedilatildeo que consiste na separaccedilatildeo
de biomoleacuteculas de acordo com seu tamanho e forma A coluna neste processo
conteacutem um poliacutemero com ligaccedilotildees cruzadas com poros de tamanho definido As
moleacuteculas maiores iratildeo migrar mais rapidamente que as menores pois natildeo satildeo
85
capazes de penetrar no interior dos poros da resina eluindo diretamente da coluna
As moleacuteculas menores por entrarem pelos poros da resina e levarem mais tempo
percorrendo os poros satildeo eluiacutedas mais tarde em relaccedilatildeo as que satildeo maiores
Ao comparar o volume de eluiccedilatildeo de TcKAP7 com o volume de eluiccedilatildeo de
proteiacutenas com massa molecular conhecidos (dados natildeo mostrados) foi possiacutevel
verificar que TcKAP7 parece ser um monocircmero em soluccedilatildeo Para confirmar esses
dados a mesma amostra foi submetida ao experimento de espalhamento dinacircmico
de luz (DLS)
O DLS eacute uma teacutecnica que se estima a distribuiccedilatildeo de tamanho das
populaccedilotildees de partiacuteculas que estatildeo presentes na amostra permitindo a detecccedilatildeo de
agregados proteicos ou de diferentes estados de oligomerizaccedilatildeo na amostra
indicando heterogeneidade Eacute importante ressaltar que para maiores chances de
sucesso em ensaios de cristalizaccedilatildeo a amostra deve encontrar-se monodispersa
Os dados de DLS mostram que 911 da massa de TcKAP7 analisada
apresenta um raio hidrodinacircmico (Rh) de 39 nm que representa uma massa
aparente de 29 kDa (FIGURA 30) Isto eacute condizente com um monocircmero cuja massa
teoacuterica seria de aproximadamente 28 kDa (incluindo a cauda de 6 histidinas) de
acordo com a prediccedilatildeo feita pelo servidor Expasy Protparam
(httpwebexpasyorgprotparam)A polidispersividade da amostra foi baixa
indicando que a mesma estava homogecircnea
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0 1 2 3 4 5 6 7
M
assa
Rh (nm)
fr80
fr82
fr84
fr85
86
FIGURA 30 ANAacuteLISE POR DLS DE TCKAP7 LEGENDA Anaacutelise por DLS de TcKAP7 contendo as fraccedilotildees obtidas na cromatografia de afinidade As fraccedilotildees 80 84 e 85 apresentam um raio hidrodinacircmico (Rh) de 39 nm
Aleacutem disso tambeacutem foram obtidas informaccedilotildees sobre o envelope de TcKAP7
a partir dos dados coletados atraveacutes da teacutecnica de SAXS mostrando que o raio de
giro (Rg) do envelope de TcKAP7 estaacute de acordo com o estimado por DLS (FIGURA
31)
FIGURA 31 ENVELOPE MOLECULAR DE SAXS
411 Anaacutelise do conteuacutedo de estrutura secundaacuteria de TcKAP7 recombinante
Atraveacutes da anaacutelise do espectro de dicroiacutesmo circular pode-se verificar o
conteuacutedo de estrutura secundaacuteria da proteiacutena e inferir enovelamento da proteiacutena
recombinante Os dados obtidos para a TcKAP7 revelaram a presenccedila de estruturas
α caracterizadas pelos miacutenimos pronunciados em 208 nm e 222 nm e de estruturas
coiled na amostra de TcKAP7 caracterizada pelos miacutenimos pronunciados em 205
nm (FIGURA 32) Este resultado estaacute de acordo a prediccedilatildeo de estrutura secundaacuteria
87
realizada pelo servidor PSIPRED (httpbioinfcsuclacukpsipred (FIGURA 33)
Esses resultados sugerem que a proteiacutena recombinante possui correto
enovelamento
FIGURA 32 ESPECTRO DE DICROIacuteSMO CIRCULAR DE TcKAP7
FIGURA 33 PREDICcedilAtildeO DE ESTRUTURA SECUNDAacuteRIA DE TcKAP7
412 Anaacutelise estrutural de TcKAP7
A fim de obter-se a estrutura tridimensional de TcKAP7 por cristalografia de
raios-X foram realizados ensaios de cristalizaccedilatildeoFoi possiacutevel observar a formaccedilatildeo
de um cristal em apenas uma condiccedilatildeo Imidazol 01 M Polietilenoglicol (PEG) 8000
10 wv e Acetato de caacutelcio 02 M
A visualizaccedilatildeo atraveacutes de luz ultra-violeta atraveacutes do equipamento Rock
Imager Fomulatrix permitiu identificaacute-lo como cristal de proteiacutena jaacute que este
diferencia-se de cristal de sal pela fluorescecircncia quando excitado em comprimento
de onda de 280 nm
-20
-18
-16
-14
-12
-10
-8
-6
-4
-2
0
2
200 210 220 230 240 250 260
Ɵ M
RV
x 1
03
(de
g cm
2d
mo
l-1)
Comprimento de onda (nm)
88
O perfil do cristal pode ser visualizado na figura 34 Esse cristal encontra-se
pequeno e mal-formado Aleacutem disso os meacutetodos para a determinaccedilatildeo estrutural de
uma estrutura ineacutedita (sem homologia com estruturas conhecidas) necessitam de
mais de um cristal Dessa forma foram realizados refinamentos dessas condiccedilotildees
iniciais visando aumentar q quantidade de cristais aumentar seu tamanho e
melhorar sua organizaccedilatildeo A concentraccedilatildeo de PEG (5 A 10) e do pH (6 a 9) com
intervalos de 1 unidade foram alterada Entretanto mesmo assim natildeo foi possiacutevel a
obtenccedilatildeo de cristais adequados para a difraccedilatildeo de raios X e novos refinamentos
seratildeo necessaacuterios
FIGURA 34 CRISTAL DE TcKAP7 DE T CRUZI LEGENDA AObtenccedilatildeo do cristal de TcKAP7 na condiccedilatildeo de Imidazol 01 M Polietilenoglicol (PEG) 8000 10 wv e Acetato de caacutelcio 02 M e B Cristal de TcKAP7 visto sob luz ultravioleta
Uma vez que natildeo foi possiacutevel durante o desenvolvimento desse projeto a
obtenccedilatildeo da estrutura cristalograacutefica de TcKAP7 procedeu-se com a construccedilatildeo de
seu modelo molecular
A modelagem molecular eacute uma ferramenta que permite a obtenccedilatildeo de
modelos da estrutura tridimensional de uma determinada proteiacutena com base em
homologia sequencial ou estrutural com proteiacutenas cujas estruturas tridimensional
foram experimentalmente resolvidas
Para a construccedilatildeo do modelo foi utilizado o programa MODELLER (SALI amp
BLUNDELL 1993) este programa eacute utilizado para a modelagem por homologia a
estruturas tridimensionais de proteiacutenas O programa automaticamente constroacutei um
modelo baseado na anaacutelise de um alinhamento de sequecircncias entre a proteiacutena para
a qual se deseja construir o modelo e uma proteiacutena relacionada cuja estrutura
tridimensional jaacute foi resolvida Nesse caso foram utilizadas estruturas de duas
A B
89
proteiacutenas como molde para a construccedilatildeo da estrutura de TcKAP7 A estrutura da
proteiacutena HMGB1(coacutedigo de acesso no banco de dados de proteiacutenas 2GZK)
(wwwpdborg) para a porccedilatildeo amino-terminal e a estrutura do fator A de transcriccedilatildeo
mitocondrial (coacutedigo de acesso 3TQ6) para a porccedilatildeo carboxi-terminal da proteiacutena
(FIGURA 35A) Duas proteiacutenas foram selecionadas para a construccedilatildeo do modelo de
TcKAP7 visto que a similaridade de sequencia entre TcKAP7 e proteiacutenas com
estruturas resolvidas eacute bastante baixo A similaridade sequencial de TcKAP7 e
proteiacutena HMGB1 eacute de 224 e entre TcKAP7 e o fator A de transcriccedilatildeo mitocondrial
eacute de 264 No entanto ambas proteiacutenas possuem alta similaridade em relaccedilatildeo agrave
estrutura secundaacuteria (mais de 90) Para aumentar a confiabilidade do modelo
utilizamos uma proteiacutena para construir a sequencia N-terminal de TcKAP7
(aminoaacutecidos 1-184) e outra para o C-terminal (aminoaacutecidos 185-248)
A qualidade do modelo pode ser avaliada por exemplo atraveacutes de graacuteficos e
tabelas que analisam restriccedilotildees quiacutemicas e fiacutesicas de cada aacutetomo constituinte do
modelo Neste trabalho foi utilizado o graacutefico de Ramachandran (FIGURA 35B) nele
pode-se visualizar todas as combinaccedilotildees possiacuteveis de acircngulos dieacutedricos Ψ (psi)
versus os Φ (phi) nos aminoaacutecidos de um polipeptiacutedeo e que contribuem para a
conformaccedilatildeo das estruturas das proteiacutenas (RAMACHANDRAN et al 1963) Dos 230
resiacuteduos apenas 5 estatildeo em regiotildees natildeo permitidas do graacutefico Esse eacute um
excelente valor pois eacute similar ao valor meacutedio encontrado para estruturas
experimentalmente determinadas com resoluccedilatildeo de no miacutenimo 20 Aring
(httpwwwebiacukthornton-srvdatabasesprofunc)
Tambeacutem eacute possiacutevel visualizar a topologia de TcKAP7 (FIGURA 35 C) que
mostra as regiotildees de α-heacutelices e regiotildees de coiled presentes na proteiacutena
corroborando com os dados obtidos na espectroscopia de dicroiacutesmo circular
90
FIGURA 35 ESTRUTURA DE TcKAP7 LEGENDA AModelo tridimensional de KAP7 B Graacutefico de Ramachandran e C Topologia de TcKAP7
A anaacutelise da superfiacutecie eletrostaacutetica de TcKAP7 mostra que existem regiotildees
ricas em aminoaacutecidos com cargas positivas que podem conferir afinidades agrave outras
proteiacutenas com carga carga superficial negativa ou mesmo aacutecidos nucleicos (FIGURA
36)
91
FIGURA 36 SUPERFIacuteCIE ELETROSTAacuteTICA DE TcKAP7 LEGENDA Visualizaccedilatildeo de diferentes regiotildees de TcKAP7 Vermelho potencial negativo Azul potencial positiva Branco Neutro
413 Investigaccedilatildeo de possiacuteveis funcionalidades baseadas na estrutura de
TcKAP7
4131 Prediccedilatildeo de funccedilatildeo paraTcKAP7
92
A prediccedilatildeo de funccedilatildeo para TcKAP7 foi realizada a partir do enovelamento de
proteiacutenas utilizando o servidor Profunc (httpwwwebiacukthornton-
srvdatabasesprofunc) O objetivo do servidor ProFunc eacute ajudar na identificaccedilatildeo de
uma possiacutevel funccedilatildeo bioquiacutemica de uma proteiacutena a partir da sua estrutura
tridimensional Ele utiliza uma seacuterie de meacutetodos incluindo comparaccedilatildeo de
enovelamento conservaccedilatildeo dos resiacuteduos e modelos 3D funcionais tanto para
identificar provaacuteveis siacutetios ativos da proteiacutena quanto possiacuteveis homoacutelogos no Protein
Data Bank (PDB) Neste procedimento tenta-se ajustar a estrutura da proteiacutena de
interesse aos tipos de enovelamentos de proteiacutenas conhecidas Atualmente mais de
1000 tipos jaacute foram registrados e depositados em bibliotecas de enovelamentos
Sabe-se que o alinhamento estrutural entre proteiacutenas consideradas de uma
mesma famiacutelia mesmo que seja apenas na regiatildeo do siacutetio ativo pode ser um
importante meacutetodo para se inferir a funccedilatildeo da sequecircncia em estudo (LASKOWSKI et
al 2003) A evoluccedilatildeo tende a conservar funccedilotildees que dependem mais diretamente
das estruturas 3D que das similaridades entre as sequecircncias de aminoaacutecidos das
proteiacutenas (SANCHEZ et al 2000)
Neste trabalho as quatro estruturas que possuem maior similaridade
estrutural com TcKAP7 estatildeo depositadas no Protein Data Bank (PDB) com os
coacutedigos 3TQ6 4NOD 3TMM 4NNU Todas as estruturas satildeo referentes agrave proteiacutena
TFAM (fator transcricional A mitocondrial)
As estruturas proteicas foram obtidas no banco de dados puacuteblicos de
proteiacutenas PDB (Protein Data Bank) e submetidas a um alinhamento estrutural com o
modelo de TcKAP7 (FIGURA 35A) no programa WinCoot Esse alinhamento pode
ser visualizado na figura 37 As regiotildees em vermelho representam as regiotildees de
TcKAP7 que apresentam interaccedilatildeo com DNA pois se alinham com as regiotildees de
ligaccedilatildeo agrave DNA das outras proteiacutenas e as regiotildees em azul representam regiotildees sem
homologia com as demais
Esse resultado sugere que TcKAP7 pode interagir com DNA com isso estes
dados podem ser utilizados para nortear mais estudos sobre a interaccedilatildeo das
proteiacutenas KAPrsquos com o DNA do cinetoplasto de T cruzi
93
FIGURA 37 ALINHAMENTO ESTRUTURAL DE 3TQ6 4NOD 3TTM 4NNU E TCKAP7 LEGENDA Em vermelho encontram-se as regiotildees de TcKAP7 que podem interagir com DNA (Resiacuteduos 1-67 e 140-166) e em azul regiotildees sem homologia com as demais
4132 Anaacutelises preliminares da possiacutevel interaccedilatildeo entre TcKAP7 e kDNA
As prediccedilotildees estruturais sugeriram que a proteiacutena TcKAP7 possui motivos
similares agrave proteiacutenas que interagem com DNA No entanto a sequecircncia de
aminoaacutecidos entre as proteiacutenas eacute bastante baixa Como a funccedilatildeo de TcKAP7
permanece obscura foram realizados alguns ensaios para tentar verificar a
possibilidade desta proteiacutena interagir com kDNA Para isto utilizou-se a teacutecnica de
dicroiacutesmo circular para avaliar se a presenccedila de kDNA poderia resultar em
alteraccedilotildees estruturais em TcKAP7 o que seria uma evidecircncia da possiacutevel interaccedilatildeo
entre esta proteiacutena e o aacutecido nucleico
Foram realizadas medidas de dicroiacutesmo circular com amostras de TcKAP7
kDNA e TcKAP7 na presenccedila de kDNA Para a anaacutelise de dados foi realizado o
somatoacuterio das curvas obtidas com as amostras de TcKAP7 e kDNA separadamente
Este somatoacuterio resultou em uma curva teoacuterica que indica o perfil teoacuterico de uma
amostra contendo TcKAP7 e kDNA sem interaccedilotildees presentes Aacute essa curva foi
sobreposta a curva experimental da medida de dicroiacutesmo circular de TcKAP7 na
94
presenccedila de kDNA A figura 38 ilustra essa sobreposiccedilatildeo onde pode-se verificar que
as curvas natildeo se sobrepotildeem portanto alteraccedilotildees estruturais ocorrem em TcKAP7
na presenccedila de kDNA
FIGURA 38 ESPECTRO DE DICROIacuteSMO CIRCULAR DE TcKAP7 LEGENDA Em azul encontra-se o espectro experimental de TcKap7 na presenccedila de DNA em vermelho o espectro teoacuterico de TcKAP7 e DNA
Para investigar mudanccedilas estruturais associadas a interaccedilatildeo com kDNA foi
realizada uma coleta de dados de SAXS na presenccedila de 1ug de kDNA
A comparaccedilatildeo dos modelos de baixa resoluccedilatildeo por SAXS indica uma
diferenccedila conformacional pontual da proteiacutena na presenccedila de kDNA As figuras 28 e
29 mostram os envelopes da proteiacutena TcKAP7na ausecircncia (FIGURAS 39A e 40A) e
presenccedila de kDNA de T cruzi (FIGURA 39B e FIGURA 40B) Percebe-se uma
diferenccedila de densidade eletrocircnica na regiatildeo da heacutelice (Residuos 140 - 166
evidenciados em vermelho) No envelope de TcKAP7 ela eacute bastante flexiacutevel e natildeo eacute
observada densidade eletrocircnica nessa regiatildeo no entanto na presenccedila de kDNA
essa mesma regiatildeo mostra-se mais riacutegida e eacute possiacutevel estimar seu posicionamento
baseado na densidade eletrocircnica Aleacutem disso essa heacutelice eacute predita como interatora
de DNA com base nas anaacutelises estruturais previamente realizadas nesse trabalho
Esses dados sugerem uma mudanccedila conformacional da proteiacutena na presenccedila
do kDNA fazendo com que esta mude seu arranjo estrutural para permanecer ligada
agrave moleacutecula de DNA sugerindo uma interaccedilatildeo entre TcKAP7 e DNA do cinetoplasto
-22
-17
-12
-7
-2
3
200 210 220 230 240 250 260
ϴM
RW
x 1
03
(de
g cm
-2 d
mo
l-1)
Comprimento de onda (nm)
Kap7+DNA
95
de T cruzi Esses dados corroboram com o que foi visto na superfiacutecie eletrostaacutetica
(FIGURA 36) e no alinhamento estrutural (FIGURA 37)
FIGURA 39 ENVELOPE MOLECULAR DETcKAP7 LEGENDA A Monocircmero de TcKAP7 ajustado ao envelope de SAXS B Monocircmero de TcKAP7 + kDNA ajustado ao envelope de SAXSResiduos 140- 166 evidenciados em vermelho
96
FIGURA 40 ENVELOPE MOLECULAR DE TcKAP7 VISTO EM DIFERENTES AcircNGULOS LEGENDA A Monocircmero de TcKAP7 ajustado ao envelope de SAXS B Monocircmero de TcKAP7 + kDNA ajustado ao envelope de SAXS Residuos 140- 166 evidenciados em vermelho
97
5 DISCUSSAtildeO
O Trypanosoma cruzi pertence a um grupo que divergiu muito cedo na
linhagem eucarioacutetica apresentando diversas caracteriacutesticas uacutenicas em relaccedilatildeo a
outros eucariotos Uma dessas caracteriacutesticas eacute a presenccedila de uma mitococircndria
uacutenica ramificada pelo corpo do protozoaacuterio contendo uma regiatildeo especializada o
cinetoplasto onde reside o DNA mitocondrial tambeacutem conhecido como kDNA O
kDNA eacute composto por uma rede de moleacuteculas interligadas entre si os maxiciacuterculos e
os miniciacuterculos (SHAPIRO amp ENGLUND 1995) Mais de 30 proteiacutenas envolvidas na
replicaccedilatildeo e na manutenccedilatildeo do kDNA jaacute foram identificadas e acredita-se que um
nuacutemero aproximado de 100 proteiacutenas muitas delas presentes apenas em
cinetoplastiacutedeos possam estar envolvidas nesses processos (LIU et al 2005) A
maioria dessas proteiacutenas foi identificada em T brucei e C fasciculata e
possivelmente vaacuterias delas principalmente aquelas envolvidas em replicaccedilatildeo
devem estar codificadas no genoma do T cruzi
Apesar de serem conhecidos muitos dos componentes da maquinaria de
replicaccedilatildeo dos miniciacuterculos e maxiciacuterculos natildeo se pode dizer o mesmo para as
proteiacutenas envolvidas na manutenccedilatildeo da estrutura do kDNA Com exceccedilatildeo de 4
proteiacutenas com caracteriacutesticas de histonas H1 (KAP1 a 4) encontradas associadas ao
cinetoplasto de C fasciculata pouco ainda eacute conhecido sobre as proteiacutenas que
participam da organizaccedilatildeo do kDNA em outros tripanosomatiacutedeos
Zavala-Castro e colaboradores (2002) identificaram sete proteiacutenas variando
de 19 a 31 kDa associadas ao kDNA de formas epimastigotas de T cruzi a partir
de kDNA extraiacutedo de ceacutelulas fixadas com formaldeiacutedo Os tamanhos observados satildeo
compatiacuteveis com aqueles das KAPs encontradas por Xu e Ray (1993) usando
experimento similar em C fasciculata entretanto nenhuma das possiacuteveis KAPs
descritas por Zavala-Castro e colaboradores foi caracterizada
Noacutes iniciamos estudos objetivando identificar proteiacutenas envolvidas na
organizaccedilatildeo e segregaccedilatildeo do kDNA de T cruzi a partir dos dados fornecidos pelo
sequenciamento do genoma desse parasita fazendo uma comparaccedilatildeo com as
KAPs de C fasciculata Estudos realizados por Cavalcanti e colaboradores (2009)
usando como modelo as sequecircncias de KAPs de C fasciculata identificaram 35
proteiacutenas relacionadas em diferentes tripanosomatiacutedeos cujos genomas estatildeo
sequenciados (11 em T cruzi 7 em L braziliensis 6 em L major e L infantum e 5
98
em T brucei) Essas sequecircncias puderam ser agrupadas em 7 tipos diferentes de
KAPs (KAP1 a 7) Das 7 KAPs T cruzi possui 5 (TcKAP3 a 7) cuja a sintenia
gecircnica eacute uma das caracteriacutesticas marcantes jaacute que alguns genes divergem em
relaccedilatildeo ao tamanho e portanto no tamanho da proteiacutena codificada As KAPs de T
cruzi e T brucei satildeo maiores do que as de C fasciculata e Leishmania spp Isso
pode sugerir que KAPs possam ter evoluiacutedo para um tamanho que comporte
basicamente suas funccedilotildees de associaccedilatildeo com o kDNA de maneira mais eficiente
Os resultados obtidos por Cavalcanti et al (2009) para TcKAP4 e TcKAP6
mostraram que em epimastigotas e amastigotas estas duas proteiacutenas estatildeo
distribuiacutedas ao longo de toda a rede de kDNA consistente com o que foi observado
em C fasciculata (XU et al 1996 HINES amp RAY 1998) poreacutem CfKAP4 tambeacutem
apresentou um padratildeo de marcaccedilatildeo nos poacutelos opostos do kDNA sugerindo que
essa KAP em particular se associe aos miniciacuterculos receacutem-replicados antes de sua
reintegraccedilatildeo agrave rede de kDNA (XU et al 1996) Contudo em tripomastigotas de T
cruzi estas duas proteiacutenas estatildeo distribuiacutedas na periferia da rede de kDNA
(CAVALCANTI et al 2009) indicando que diferente de C fasciculata elas
apresentam uma dinacircmica de associaccedilatildeo que depende da forma evolutiva do
parasita possivelmente refletindo distintas interaccedilotildees com proteiacutenas da rede de
kDNA em epimastigotas e tripomastigotas No presente trabalho ampliamos o
conhecimento sobre as KAPs de T cruzi estudando o papel da KAP7 na fisiologia
desse parasita
Em C fasciculata a regulaccedilatildeo da expressatildeo de vaacuterios genes que codificam
proteiacutenas mitocondriais ocorre durante o ciclo celular em parte por uma sequumlecircncia
consenso [(CA)AUAGAA(GA)] presente nas regiotildees 5rsquo e 3rsquo-UTR dos respectivos
mRNAs (BROWN amp RAY 1997 MAHMOOD et al 1999 MAHMOOD amp RAY 1998
PASION et al 1996) O mesmo foi observado para L major onde uma sequecircncia
parecida com aquela encontrada em C fasciculata (CATAGA) foi identificada nas
regiotildees 5rsquo e 3rsquo de vaacuterios genes cuja a expressatildeo era maior na fase S do ciclo celular
(ZICK et al 2005) Analisando as regiotildees 5rsquo e 3rsquo do transcrito do gene TOP2 de T
cruzi que codifica a topo II mitocondrial descrito por Fragoso e Goldenberg (1992)
tambeacutem podemos observar a sequecircncia CATAGA repetida duas vezes na regiatildeo
5rsquoUTR e uma vez na regiatildeo 3rsquo-UTR do transcrito desse gene
Como relatamos neste trabalho a sequecircncia da regiatildeo 5rsquo-UTR do transcrito
TcKAP7 natildeo mostrou nenhum elemento com as caracteriacutesticas daquele envolvido na
99
regulaccedilatildeo de genes expressos na fase S do ciclo celular de outros
tripanosomatiacutedeos
Em relaccedilatildeo agrave localizaccedilatildeo de TcKAP7 verificamos atraveacutes de ensaios de
imunofluorescecircncia a distribuiccedilatildeo de TcKAP7 na regiatildeo dos poacutelos da rede de kDNA
das formas epimastigotas de T cruzi poreacutem ainda natildeo analisamos como esta
proteiacutena estaacute distribuiacuteda nas formas tripomastigotas que possuem a rede de kDNA
com formato arredondado e menos compactada
A localizaccedilatildeo de KAP7 na regiatildeo dos poacutelos do cinetoplasto de T cruzi
sugere que ela tenha funccedilotildees na replicaccedilatildeo da rede de kDNA pois nessa regiatildeo
estatildeo concentradas diversas proteiacutenas necessaacuterias para finalizaccedilatildeo do processo de
replicaccedilatildeo de miniciacuterculos
Para a construccedilatildeo do modelo molecular de TcKAP7 foram utilizadas
estruturas de duas proteiacutenas a estrutura da proteiacutena HMGB1 (2GZK) para a porccedilatildeo
amino-terminal e a estrutura da proteiacutena fator A de transcriccedilatildeo mitocondrial (3TQ6)
para a porccedilatildeo carboxi-terminal da proteiacutena ambas apresentam alta similaridade em
relaccedilatildeo agrave estrutura secundaacuteria (mais de 90) e tratam-se de proteiacutenas de um
mesmo grupo HMG (High-mobility group) Em T brucei TbKAP6 uma proteiacutena do
grupo HMG estaacute envolvida na replicaccedilatildeo e manutenccedilatildeo do kDNA (WANG et al
2014) Baseado nesses dados juntamente com os dados da imunofluorescecircncia
indireta pode-se sugerir um papel de TcKAP7 na replicaccedilatildeo da rede de kDNA
Embora ainda natildeo saibamos como KAP7 se associa com o kDNA de T
cruzi eacute possiacutevel que isso ocorra de duas maneiras atraveacutes de ligaccedilotildees
eletrostaacuteticas natildeo-especiacuteficas ou de interaccedilotildees com regiotildees especiacuteficas dos
miniciacuterculos
Atraveacutes de ensaios de SAXS foi possiacutevel perceber que a proteiacutena sofre
alteraccedilotildees conformacionais na presenccedila do kDNA sugerindo sua interaccedilatildeo com
esse aacutecido nucleacuteico Esta interaccedilatildeo pode ser eletrostaacutetica uma vez que a anaacutelise da
superfiacutecie eletrostaacutetica de TcKAP7 mostrou a predominacircncia de regiotildees ricas em
aminoaacutecidos com cargas positivas que podem conferir afinidades agrave outras proteiacutenas
com carga superficial negativa ou mesmo aacutecidos nucleicos mais uma vez sugerindo
a interaccedilatildeo com kDNA
Poreacutem natildeo se pode descartar a possibilidade de que a interaccedilatildeo de TcKAP7
com o kDNA seja atraveacutes de interaccedilotildees com regiotildees especiacuteficas dos miniciacuterculos
Nos tripanosomatiacutedeos a rede de kDNA assume a forma de um disco achatado
100
perpendicular ao flagelo onde os miniciacuterculos estatildeo alinhados em fibrilas orientadas
paralelamente ao eixo do disco (LIU et al 2005) Acredita-se que a ordenaccedilatildeo e
compactaccedilatildeo dos miniciacuterculos estatildeo relacionadas agrave proacutepria estrutura da moleacutecula de
miniciacuterculo Os miniciacuterculos apresentam regiotildees ricas em A+T que podem causar
curvaturas na moleacutecula (MARINI et al 1984 NTAMBI et al 1984) facilitando sua
inserccedilatildeo de forma ordenada no disco de kDNA aleacutem disso possuem regiotildees
conservadas onde estatildeo localizadas as origens de replicaccedilatildeo Essas regiotildees por
sua vez podem ser reconhecidas por proteiacutenas tais como a KAP7 que ajudam a
estabilizar a estrutura Os resultados com C fasciculata mostram que KAP2 3 e 4 se
ligam em regiotildees especiacuteficas dos miniciacuterculos ricas em A+T mas que natildeo satildeo
aquelas que geram a curvatura das moleacuteculas (XU et al 1996) Contudo KAP1 se
liga de maneira inespeciacutefica aos miniciacuterculos (HINES amp RAY 1998) Aleacutem disso
existe a sequecircncia universal de miniciacuterculo (UMS) e as proteiacutenas que se ligam a
essa sequecircncia (UMSBP) as quais podem participar de interaccedilotildees com as KAPrsquos
Em C fasciculata CfKAP3 sozinha consegue condensar a rede de kDNA e inibir a
decatenaccedilatildeo pela enzima topo II Poreacutem a interaccedilatildeo entre CfKAP3 e CfUMSBP
pode descondensar a rede de kDNA e reestabelecer a decatenaccedilatildeo mediada pela
topo II indicando que as proteiacutenas KAPrsquos dos tripanosomatiacutedeos podem apresentar
diferentes funccedilotildees em diferentes espeacutecies (KAPELLER et al 2011)
Para investigar a importacircncia de TcKAP7 no T cruzi e seu envolvimento ou
natildeo com o rearranjo topoloacutegico do kDNA durante o processo de diferenciaccedilatildeo do
parasita realizamos a deleccedilatildeo do gene TcKAP7 Nenhuma alteraccedilatildeo estrutural ou
morfoloacutegica na rede de kDNA foi observada no mutante de T cruzi para TcKAP7 Do
mesmo modo o parasita mutante natildeo apresentou perfil de crescimento alterado e
foi capaz de se diferenciar nas formas tripomastigotas metaciacuteclicas e infectar ceacutelulas
VERO onde se diferenciaram em formas amastigotas O mesmo foi visto quando foi
realizado o nocaute do gene TcKAP3 (DE SOUZA et al 2010)
Uma das hipoacuteteses para explicar esse fato eacute que alguma outra KAP de T
cruzi possa estar assumindo o papel da TcKAP7 talvez a TcKAP4 que se localiza
nos poacutelos do cinetoplasto quando da inserccedilatildeo dos miniciacuterculos na rede apoacutes serem
replicados na regiatildeo cinetoflagelar A redundacircncia no papel das KAPs faz com que a
rede de kDNA seja compactada e segregada corretamente mesmo na ausecircncia de
uma delas (DE SOUZA et al 2010) Sabe-se que o nocaute do gene Cfkap2 ou do
gene Cfkap3 separadamente natildeo mostrou nenhuma alteraccedilatildeo no fenoacutetipo de C
101
fasciculata Poreacutem a deleccedilatildeo de ambos os genes causou diversas alteraccedilotildees
aumento nos niacuteveis de mRNAs mitocondriais reduccedilatildeo na respiraccedilatildeo inibiccedilatildeo da
divisatildeo celular e acuacutemulo de ceacutelulas com morfologias anormais (AVLIYAKULOV et
al 2004)
Com o intuito de complementar os estudos para a caracterizaccedilatildeo do gene
TcKAP7 foram realizados ensaios de RNA de interferecircncia visando analisar a
funccedilatildeo do gene TbKAP7 ortoacutelogo em T brucei jaacute que a maquinaria de RNAi em T
cruzi eacute inexistente (DA ROCHA et al 2003) Com isso foi visto que a participaccedilatildeo da
TbKAP7 no metabolismo do T brucei eacute essencial jaacute que o silenciamento do gene
TbKAP7 levou agrave reduccedilatildeo da proliferaccedilatildeo celular do parasita corroborando com os
dados encontrados para TbKAP6 (WANG et al 2014)
Esperamos que o conhecimento das diversas moleacuteculas envolvidas na
organizaccedilatildeo e replicaccedilatildeo da rede de kDNA assim como o entendimento dos
mecanismos fisioloacutegicos que ocorrem nesta estrutura tatildeo peculiar que eacute o
cinetoplasto dos tripanosomatiacutedeos possam nos ajudar a esclarecer vaacuterios aspectos
relacionados a biologia destes eucariotos primitivos e a evoluccedilatildeo do genoma
mitocondrial ao longo do processo evolutivo
102
6 CONCLUSOtildeES
Com base nos resultados observados neste trabalho foi possiacutevel concluir
1 ndash A proteiacutena TcKAP7 eacute uma proteiacutena associada ao cinetoplasto de T
cruzi e possui caracteriacutesticas que a identificam como KAPs do tipo histona H1
incluindo seu tamanho e sua composiccedilatildeo de aminoaacutecidos e sua superfiacutecie
eletrostaacutetica
2 ndash TcKAP7 estaacute localizada nos poacutelos do cinetoplasto de T cruzi podendo
estar envolvida na replicaccedilatildeo dos miniciacuterculos
3 - TcKAP7 sofre mudanccedilas conformacionais na presenccedila do kDNA de T
cruzi evidenciando sua interaccedilatildeo com o aacutecido nucleico
4 ndash O mutante de T cruzi para TcKAP7 natildeo apresentou alteraccedilatildeo na
estrutura do cinetoplasto e na morfologia do parasita
5 ndash A proliferaccedilatildeo e a diferenciaccedilatildeo do T cruzi natildeo foram alteradas quando
o parasita teve o gene TcKAP7 deletado do genoma
6 ndash O silenciamento do gene TbKAP7 eacute essencial no metabolismo do T
brucei levando agrave reduccedilatildeo da proliferaccedilatildeo celular do parasita
103
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Agrave vocecirc minha pequena
Ah como era a vida antes de vocecirc chegar mesmo
Era muito mais sem graccedila com certeza
Vocecirc chegou e junto com vocecirc um turbilhatildeo de novidades e no meio
disso tudo uma tese para ser defendida Mas com a sua inocecircncia
entendeu minhas ausecircncias me fez tirar forccedilas da onde eu natildeo sabia para
tocar meu trabalho a diante e terminar a tese A Mama ama vocecirc mais que
tudo Anjinha Esse trabalho eacute dedicado agrave vocecirc minha princesa
Obrigada por fazer parte desta etapa da minha vida gatinha
Ao meu Mozatildeo Meu marido Meu melhor amigo Meu companheiro para o
que der e vier E agora papaizote da nossa Anjinha
Obrigada por me apoiar sempre Me dar forccedilas broncas conselhos de tudo
um pouco Obrigada por fazer a nossa bebezotinha entender a ausecircncia da
mama quando vaacuterias noites vocecirc tinha que fazer ela dormir para eu poder ir no
lab ou ficar escrevendo Sem vocecirc eu natildeo conseguiria vitinha Obrigada
por estar aqui Sempre Tannnnnntoooooo
Agrave vocecircs pentelhos
O que seria de mim sem vocecircs
Vocecircs satildeo minha fortaleza meu porto seguro sempre posso contar com vocecircs
pra tudo tudo mesmo Obrigada pelos conselhos pelas broncas por
nunca me deixar desistir mesmo nos momentos mais difiacuteceis vocecircs sempre
tinham uma palavra que me confortava me encorajava e me fazia seguir em
frente Sem a ajuda de vocecircs esse trabalho natildeo ficaria pronto nunca
Amo vocecircs
AGRADECIMENTOS
Agrave Deus em primeiro lugar por me dar sauacutede vitalidade e acircnimo sempre
E por sempre estar comigo
Ao Dr Stenio Perdigatildeo Fragoso pela orientaccedilatildeo confianccedila dedicaccedilatildeo e
amizade Afinal satildeo 12 anos hein chefe Como vocecirc ainda me aguenta Obrigada
por tudo aprendi e continuo aprendendo muito com vocecirc
Agrave Dra Tatiana Arruda Campos Brasil que me ajudou desde o primeiro
momento em que eu entrei no Laboratoacuterio de Proteiacutenas com seu jeito meigo e
atencioso e com sua experiecircncia me mostrou um mundo novo por qual eu me
apaixonei Sempre com muita paciecircncia me explicava tudo tim tim por tim tim e me
ajudou muuuito na escrita da tese Obrigada Tati
Agrave Dra Lia Medeiros que me ajudou muito com as microscopias Fizemos ateacute
o sacrifiacutecio de ir visualizar uma MET na UFSC em Floripa que chato neacute Brigadatildeo
Lia pela paciecircncia e boa vontade
Ao Dr Paulo Carvalho e a Dra Juliane Fischer que me ajudaram em
experimentos e anaacutelises que nem entraram na tese Sempre muito atenciosos
Obrigada
Aos meus queridos amigos do LAB2 Aqueles que jaacute se foram (Andreacute
Aleatoacuterio Lari Mauriacutecio Baacuterbara Odineacuteia Paacute ) e aqueles que estatildeo laacute ateacute hoje
(Didi Gi Vanessa Felipe Aline Claudinha) Obrigada por fazerem o trabalho ficar
mais divertido Aos meus companheiros de doc Mocircnica e Fernando o trio parada
dura passou por muita coisa junto e tem muita histoacuteria pra contar Obrigada gente
adoro vocecircs
Agraves minhas queridas amigas mais ldquoexperientesrdquo que moram no meu coraccedilatildeo
Aldinha e Dani obrigada por todos os momentos que passamos juntas no lab e fora
do lab obrigada pela a ajuda que sempre me deram sem esperar nada em troca
vocecircs sabem que seus conselhos sempre foram muito valiosos pra mim Obrigada
amigas vocecircs satildeo iacutempares
Agrave minha querida irmatildezinha Rocirc que nasceu no mesmo dia soacute que eacute mais
velha hahahahaha Obrigada amiga por tudo por todo esse tempo pelos
experimentos pelas confissotildees pelas gargalhadas Vocecirc eacute uacutenica
Agrave Pri Hira Mari Serpeloni Haruo Daisy Vanessa que sempre me ajudavam
quando eu precisava ou fazer um experimento ou jogar conversa fora
Aos meus amigos doutores atleticanos Michel e Henrique que me ajudaram
em vaacuterios experimentos e anaacutelises Obrigada por estarem sempre dispostos em
ajudar Vocecircs satildeo atleticanos mas satildeo gente boa Obrigada
Ao Giovany pela imensa ajuda com os camundongos sempre disposto em
ajudar e ensinar
Ao Nilson Silvio Tacircnia Sibelli por toda a ajuda pela amizade e pela
paciecircncia e competecircncia Ah e pelas histoacuterias de terror
Agrave Maria Cristina por toda a ajuda natildeo soacute na parte administrativa e pela
amizade
Ao Dr Marco Krieger pela confianccedila e por me proporcionar suporte
financeiro quando entrei no periacuteodo de prorrogaccedilatildeo
A todos os amigos e pesquisadores do Instituto Carlos Chagas dos demais
laboratoacuterios Lab REG Lab Genocircmica Laboratoacuterio de Biologia Celular por terem de
um jeito ou de outro participado do processo Eacute difiacutecil agradecer todo mundo
Valeu galera
ldquoTenho a impressatildeo de ter sido uma crianccedila brincando agrave
beira-mar divertindo-me em descobrir uma pedrinha
mais lisa ou uma concha mais bonita que as outras
enquanto o imenso oceano da verdade continua
misterioso diante de meus olhosrdquo
(Isaac Newton)
RESUMO
O DNA do cinetoplasto (kDNA) dos tripanosomatiacutedeos consiste numa rede de
moleacuteculas circulares catenadas entre si os miniciacuterculos e os maxiciacuterculos Os
miniciacuterculos codificam RNAs guias (gRNAs) e os maxiciacuterculos codificam para
algumas subunidades de enzimas mitocondriais e rRNA em um padratildeo
criptografado (ediccedilatildeo de RNA) Estudos com o tripanosomatiacutedeo Crithidia fasciculata
mostraram que proteiacutenas do tipo histona H1 associadas ao cinetoplasto (KAPs) satildeo
capazes de condensar a rede de kDNA Poreacutem pouco eacute conhecido sobre estas
proteiacutenas de Trypanosoma cruzi um protozoaacuterio parasita que sofre alteraccedilotildees na
estrutura do DNA do cinetoplasto ao longo de seu ciclo de vida Neste trabalho foi
caracterizada uma proteiacutena associada ao cinetoplasto de T cruzi denominada de
TcKAP7 que possui baixo peso molecular e natureza baacutesica condizente com um
papel na neutralizaccedilatildeo de carga e na condensaccedilatildeo do DNA Atraveacutes de ensaios
usando a teacutecnica de espalhamento de raios-X a baixo acircngulo (SAXS) foi possiacutevel
perceber que a proteiacutena TcKAP7 sofre mudanccedilas estruturais na presenccedila do kDNA
sugerindo uma interaccedilatildeo com essa estrutura seja atraveacutes de ligaccedilotildees eletrostaacuteticas
ou atraveacutes de ligaccedilotildees especiacuteficas com moleacuteculas presentes na rede A anaacutelise pela
teacutecnica de imunofluorescecircncia mostrou que proteiacutena TcKAP7 estaacute localizada na
regiatildeo dos poacutelos do cinetoplasto o que sugere que pode estar envolvida na
finalizaccedilatildeo da replicaccedilatildeo dos miniciacuterculos Mutante nulo para TcKAP7 foi gerado por
teacutecnicas de substituiccedilatildeo gecircnica a fim de verificar se na ausecircncia de TcKAP7
ocorriam alteraccedilotildees na estrutura do kDNA Contudo os parasitas mutantes para
TcKAP7 natildeo apresentavam alteraccedilotildees na estrutura e morfologia do cinetoplasto
quando analisados por microscopia eletrocircnica e foram capazes de se diferenciar
sem perder a capacidade infectiva Entretanto ensaios de RNA de interferecircncia
visando analisar a funccedilatildeo do gene TbKAP7 ortoacutelogo em T brucei levou agrave reduccedilatildeo
da proliferaccedilatildeo celular das formas prociacuteclicas desse parasita mostrando que este
gene eacute essencial para o metabolismo desse tripanosomatiacutedeo sugerindo que KAP7
possa ter papeis distintos em T cruzi e T brucei
Palavras-chaves Trypanosoma cruzi cinetoplasto nocaute KAPs
ABSTRACT
The kinetoplast DNA (kDNA) of trypanosomatids consists in a network of circular
molecules catenated each other the minicircles and maxicircles The minicircles
code RNAs guides (gRNAs) and the maxicircles code for some subunits of
mitochondrial enzymes and rRNA in a cryptic pattern (RNA editing) Studies in the
trypanosomatid protozoan Crithidia fasciculata showed that the kDNA is associated
with histone H1-like proteins known as kinetoplast-associated proteins (KAPs) wich
are capable of condensing the kDNA network However little is known about these
proteins of Trypanosoma cruzi a protozoan parasite which undergoes changes in
kinetoplast DNA structure over its life cycle Here we characterize a protein
associated with T cruzi kinetoplast named TcKAP7 TcKAP7 is a low molecular
weight protein with basic nature which is consistent with a role in DNA charge
neutralization and condensation Analysis by small angle X-Ray scattering technique
(SAXS) revealed that the TcKAP7 protein undergoes structural changes in the
presence kDNA suggesting an interaction with this DNA network either through
electrostatic bonds or through specific binding to molecules present on the network
The immunofluoresce analysis showed that TcKAP7 is located in the kinetoplast
poles suggesting that TcKAP7 might be involved in the late stages of the minicircle
replication A null mutant for TcKAP7 was obtained by gene replacement techniques
to study possible alterations in the kDNA structure However no modification in the
structure and morphology of the kinetoplast was observed by electron microscopy In
addition Tckap7 null mutant was able to differentiate without losing its infective
capacity Interference RNA assays was performed to analyze the function of
TbKAP7 the ortholog gene in T brucei The ablation of TbKAP7 expression leaded
to reduction in the procyclic proliferation suggesting that this gene is essential for the
metabolism of the parasite and might play distinct roles in T cruzi and T brucei
Key-words Trypanosoma cruzi kinetoplast gene knockout KAPs
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1 DISTRIBUICcedilAtildeO GEOGRAacuteFICA DA DOENCcedilA
DE CHAGAS19 FIGURA 2 CICLO DE TRANSMISSAtildeO DO
Trypanosoma cruzi20 FIGURA 3 ESQUEMA GERAL DAS PRINCIPAIS ESTRUTURAS
CELULARES DE T cruzi 22 FIGURA 4 REDE DE kDNA27 FIGURA 5 DIFERENTES ARRANJOS DO CINETOPLASTO
DE T cruzi29 FIGURA 6 MUDANCcedilAS NA POSICcedilAtildeO DO KDNA
NOS TRYPANOSOMAS29 FIGURA 7 REPOSICIONAMENTO DO KDNA EM RELACcedilAtildeO
AgraveS OUTRAS ORGANELAS DURANTEO CICLO DE VIDA DE UM FLAGELADO30
FIGURA 8 REPLICACcedilAtildeO DO kDNA32 FIGURA 9 REPRESENTACcedilAtildeO ESQUEMAacuteTICA DO
MICROFLUIDIFICADOR45 FIGURA 10 VETOR PARA EXPRESSAtildeO EM T CRUZI
P3XFLAG 50 FIGURA 11 ESQUEMA DA CONSTRUCcedilAtildeO DOS VETORES
UTILIZADOS PARA O NOCAUTE DO GENE TcKAP755
FIGURA 12 MAPA DO VETOR P2T7-177 UTILIZADO PARA ENSAIOS DE RNAi62
FIGURA 13 COMPARACcedilAtildeO ENTRE AS SEQUumlEcircNCIAS DE AMINOAacuteCIDOS DEDUZIDAS DO GENE KAP7 DE T cruzi Dm28C E DOS HAPLOacuteTIPOS DE CL BRENER65
FIGURA 14 COMPARACcedilAtildeO ENTRE AS SEQUumlEcircNCIAS DE AMINOAacuteCIDOS DEDUZIDAS DO GENE KAP7 EM DIFERENTES TRIPANOSOMATIacuteDEOS66
FIGURA 15 SINTENIA DE TcKAP7 COM OUTROS TRIPANOSOMATIacuteDEOS67
FIGURA 16 CARACTERIZACcedilAtildeO DA REGIAtildeO 5rsquo-UTR DO TRANSCRITO TcKAP769
FIGURA17 ANAacuteLISE DA EXPRESSAtildeO DA PROTEIacuteNA DE FUSAtildeO TCKAP7-FLAG EM FORMAS EPIMASTIGOTAS DE T CRUZI70
FIGURA 18 IMUNOLOCALIZACcedilAtildeO DE TcKAP7 EM EPIMASTIGOTAS DE T CRUZI71
FIGURA 19 ENSAIOS DE PCR UTILIZANDO DNA DE T cruzi kap7kap7 (WT) E T cruzi kap7neokap7higro (NO) COM DIFERENTES PRIMERS73
FIGURA 20 REPRESENTACcedilAtildeO ESQUEMAacuteTICA DOS SIacuteTIOS DA ENZIMA HindIII NO LOCUS DO GENE KAP7 DE T cruzi CL Brener75
FIGURA 21 ANAacuteLISE DA ORGANIZACcedilAtildeO DOS GENES TCKAP7 NEO E HIGRO POR ENSAIO DO TIPO SOUTHERN BLOT75
FIGURA 22 COMPARACcedilAtildeO DA EXPRESSAtildeO DO GENE TcKAP7 POR WESTERN BLOT76
FIGURA 23 COLORACcedilAtildeO PELO MEacuteTODO PANOacuteTICO RAacutePIDO DOS PARASITAS EPIMASTIGOTAS NOCAUTEADOS77
FIGURA 24 COMPARACcedilAtildeO ENTRE A ULTRAESTRUTURA DO CINETOPLASTO DO T cruzi DM28C TIPO SELVAGEM (A) E DO MUTANTE DE T cruzi PARA TcKAP7 (B) POR MICROSCOPIA ELETROcircNICA DE TRANSMISSAtildeO78
FIGURA 25 CURVA DE CRESCIMENTO DO MUTANTE DE T cruzi PARA TcKAP7 (KO) E DO T cruzi Dm28c SELVAGEM (WT) 79
FIGURA 26 METACICLOGEcircNESE IN VITRO DE T cruzi Dm28c TIPO SELVAGEM E T cruzi NOCAUTEADO80
FIGURA 27 RNAi DE TbKAP7 INIBE O CRESCIMENTO DAS FORMAS PROCIacuteCLICAS DE T brucei82
FIGURA 28 PURIFICACcedilAtildeO DE TCKAP7 ATRAVEacuteS DE CROMATOGRAFIA DE AFINIDADE83
FIGURA 29 PURIFICACcedilAtildeO DE TCKAP7 ATRAVEacuteS DE CROMATOGRAFIA DE TROCA IOcircNICA84
FIGURA 30 ANAacuteLISE POR DLS DE TCKAP785 FIGURA 31 ENVELOPE MOLECULAR DE SAXS86 FIGURA 32 ESPECTRO DE DICROIacuteSMO CIRCULAR DE
TcKAP787 FIGURA 33 PREDICcedilAtildeO DE ESTRUTURA SECUNDAacuteRIA DE
TcKAP787 FIGURA 34 CRISTAL DE TcKAP7 DE T CRUZI88 FIGURA 35 ESTRUTURA DE TcKAP790 FIGURA 36 SUPERFIacuteCIE ELETROSTAacuteTICA DE
TcKAP791 FIGURA 37 ALINHAMENTO ESTRUTURAL DE 3TQ6 4NOD
3TTM 4NNU E TCKAP793 FIGURA 38 ESPECTRO DE DICROIacuteSMO CIRCULAR
DE TcKAP794 FIGURA 39 ENVELOPE MOLECULAR DETcKAP795 FIGURA 40 ENVELOPE MOLECULAR DETcKAP7 VISTO EM
DIFERENTES AcircNGULOS96
LISTA DE TABELAS
TABELA 1 RELACcedilAtildeO DOS PRIMERS UTILIZADOS PARA A CLONAGEM DA REGIAtildeO UPSTREAM DE TcKAP7 NO VETOR pNEO153
TABELA 2 RELACcedilAtildeO DOS PRIMERS UTILIZADOS PARA A CLONAGEM DA REGIAtildeO DOWNSTREAM DE TcKAP7 NO VETOR pNEO153
TABELA 3 RELACcedilAtildeO DOS PRIMERS UTILIZADOS PARA A AMPLIFICACcedilAtildeO DO GENE TbKAP763
TABELA 4ndash PERCENTUAL DE IDENTIDADE ENTRE AS PROTEIacuteNAS KAP7 NOS TRIPANOSSOMATIacuteDEOS COM O GENOMA SEQUENCIADO67
TABELA 5 COMBINACcedilOtildeES DE PRIMERS UTILIZADOS NA PCR PARA CONFIRMAR O NOCAUTE DE TcKAP772
SUMAacuteRIO
1 INTRODUCcedilAtildeO18 11 O Trypanosoma cruzi18 12 Ciclo de vida do T cruzi20 13 Aspectos celulares de T cruzi21 14 O genoma de T cruzi24 15 Expressatildeo gecircnica de Tcruzi25 16 O cinetoplasto26 17 A rede de kDNA26 171 Replicaccedilatildeo do kDNA31 18 Proteiacutenas associadas ao cinetoplasto (KAPs)32 2 OBJETIVOS35 21 OBJETIVO GERAL35 211 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS35 3 MATERIAIS E MEacuteTODOS36 31 Reagentes e Soluccedilotildees Utilizados36 311 Reagentes36 312 Tampotildees e Soluccedilotildees36 313 Meios de cultura38 32 Cultivo do Trypanosoma cruzi38 321 Epimastigotas38 322 Tripomastigotas metaciacuteclicos39 33 Curva de crescimento de T cruzi39 34 Obtenccedilatildeo de DNA de T cruzi40 35 Obtenccedilatildeo de kDNA de T cruzi40 36 Obtenccedilatildeo de extrato proteico de T cruzi40 37 Clonagem do gene TcKAP741 38 Obtenccedilatildeo do cDNA de TcKAP7 atraveacutes de ensaio de RT-PCR41 39 Seleccedilatildeo dos clones recombinantes42 391 Teacutecnica de palitagem (toothpick)42 392 Teacutecnica de PCR de colocircnia43 310 Preparaccedilatildeo de plasmiacutedeo em pequena escala (miniprep)43 311 Expressatildeo da proteiacutena TcKAP7 em E coli43 312 Purificaccedilatildeo da proteiacutena recombinante TcKAP744 3121 Processamento da amostra44 3122 Cromatografia de afinidade45 3123 Cromatografia de troca iocircnica46 3124 Cromatografia de gel filtraccedilatildeo46 313 Espalhamento Dinacircmico de Luz ndash DLS46 314 Espectroscopia de dicroiacutesmo circular (CD)46 315 Quantificaccedilatildeo e concentraccedilatildeo47 316 Ensaios de Cristalizaccedilatildeo47 317 Espalhamento de raio-X a baixo acircngulo (SAXS)48 318 Modelagem de TcKAP748 319 Obtenccedilatildeo de antissoro policlonal contra TcKAP749 320 Anaacutelise da expressatildeo do gene TcKAP7 e de seu mutante por ensaio tipo western blot49 321 Superexpressatildeo de TcKAP750
3211 Amplificaccedilatildeo e clonagem do gene TcKAP7 no vetor pNEO3xFlag para superexpressatildeo da proteiacutena50 3212 Transfecccedilatildeo por eletroporaccedilatildeo52 3213 Seleccedilatildeo dos transfectantes52 322 Deleccedilatildeo do gene TcKAP7 por nocaute gecircnico53 3221 Amplificaccedilatildeo e clonagem das regiotildees a montante e a jusante do gene TcKAP753 3222 Amplificaccedilatildeo dos cassetes UPS-NEO-DOWN e UPS-HIGRO-DOWN para transfecccedilatildeo de T cruzi55 3223 Transfecccedilatildeo do T cruzi com o cassete UPS-NEO-DOWN56 3224 Extraccedilatildeo de DNA dos transfectantes57 3225 Anaacutelise por PCR do DNA dos parasitas transfectados com o cassete UPS-NEO-DOWN57 3226 Transfecccedilatildeo do T cruzi com o cassete UPS-HIGRO-DOWN57 3227 Anaacutelise por PCR do DNA dos parasitas transfectados com o cassete UPS-HIGRO-DOWN58 3228 Anaacutelise da organizaccedilatildeo do gene TcKAP7 e da eficiecircncia de seu nocaute atraveacutes de ensaio do tipo Southern blot58 323 Localizaccedilatildeo celular da proteiacutena TcKAP7 atraveacutes de ensaio de imunofluorescecircncia59 324 Anaacutelise da ultraestrutura do cinetoplasto do mutante de T cruzi para TcKAP7 por microscopia eletrocircnica de transmissatildeo60 325 Coloraccedilatildeo dos parasitas transfectados60 326 Infecccedilatildeo de ceacutelulas Vero com o mutante de T cruzi para TcKAP761 327 Anaacutelise da funccedilatildeo do gene TbKAP7 de Trypanosoma brucei atraveacutes de ensaios de RNA de interferecircncia61 3271 Induccedilatildeo do RNA dupla fita64 4 RESULTADOS65 41 Clonagem e caracterizaccedilatildeo do gene TcKAP765 42 Expressatildeo da proteiacutena TcKAP7 em T cruzi69 43 Localizaccedilatildeo celular de TcKAP7 atraveacutes de ensaio de imunofluorescecircncia70 44 Deleccedilatildeo do gene TcKAP7 por nocaute gecircnico71 441 Anaacutelise por PCR do DNA dos parasitas transfectados com os cassetes UPS-NEO-DOWN e UPS-HIGRO-DOWN72 442 Anaacutelise da organizaccedilatildeo dos genes TcKAP7 neo e higro por ensaio do tipo Southern blot74 45 Comparaccedilatildeo da expressatildeo do gene TcKAP7 por western blot76 46 Anaacutelise da morfologia e da ultraestrutura do cinetoplasto do mutante de T cruzi para TcKAP776 47 Multiplicaccedilatildeo diferenciaccedilatildeo e infectividade do mutante de T cruzi para TcKAP779 48 Anaacutelise da funccedilatildeo do gene KAP7 de Trypanosoma brucei atraveacutes de ensaios de RNA de interferecircncia80 49 Caracterizaccedilatildeo estrutural de TcKAP782 491 Produccedilatildeo recombinante de TcKAP782 410 Anaacutelise do estado oligomeacuterico de TcKAP784 411 Anaacutelise do conteuacutedo de estrutura secundaacuteria de TcKAP7 recombinante86 412 Anaacutelise estrutural de TcKAP787
413 Investigaccedilatildeo de possiacuteveis funcionalidades baseadas na estrutura de TcKAP791 4131 Prediccedilatildeo de funccedilatildeo paraTcKAP791 4132 Anaacutelises preliminares da possiacutevel interaccedilatildeo entre TcKAP7 e kDNA93 5 DISCUSSAtildeO97 6 CONCLUSOtildeES102 7 REFEREcircNCIAS103
18
1 INTRODUCcedilAtildeO
11 O Trypanosoma cruzi
Trypanosoma cruzi eacute um protozoaacuterio flagelado unicelular pertencente ao
reino Protista subreino Protozoa filo Sarcomastigophora subfilo Mastigophora
classe Zoomastigophora ordem Kinetoplastida e famiacutelia Trypanosomatidae (LEVINE
et al 1980) A principal caracteriacutestica dessa ordem eacute a presenccedila de uma estrutura
singular o cinetoplasto que abriga em uma massa de DNA extranuclear
concentrado na mitococircndria uacutenica deste protista (SHAPIRO amp ENGLUND 1995) A
famiacutelia Trypanosomatidae inclui os seguintes gecircneros importantes Blastocrithidia
Crithidia Endotrypanum Herpetomonas Leishmania Leptomonas Phytomonas e
Trypanosoma O gecircnero Trypanosoma eacute um dos mais importantes dentro da famiacutelia
Trypanosomatidae por incluir uma seacuterie de espeacutecies causadoras de doenccedilas
humanas importantes como o Trypanosoma cruzi agente da doenccedila de Chagas
Trypanosoma rhodesiense e Trypanosoma gambiense agentes da doenccedila do sono
e de animais o Trypanosoma brucei Trypanosoma equiperdum e Trypanosoma
equinum (DE SOUZA 2015)
Este protozoaacuterio eacute um microrganismo heteroxecircnico com ciclo bioloacutegico
alternado entre hospedeiros vertebrados (mamiacuteferos) e invertebrados (triatomiacuteneos)
Existem diferentes formas de transmissatildeo da doenccedila dentre as quais se destaca a
via vetorial que consiste na transmissatildeo do parasita atraveacutes de excretas do inseto
vetor hematoacutefago pertencente agrave ordem Hemiacuteptera famiacutelia Reduvidae subfamiacutelia
Triatominae (DIAS et al 1956) A principal caracteriacutestica bioloacutegica dos triatomiacuteneos
eacute que satildeo obrigatoriamente hematoacutefagos e necessitam do repasto sanguiacuteneo para
completar o desenvolvimento (DIAS 2000) O parasita pode ainda ser transmitido
aos mamiacuteferos por transfusatildeo sanguiacutenea ou via oral e com menos frequecircncia por
via congecircnita acidentes de laboratoacuterio e transplantes de oacutergatildeos (BELTRAO HDE et
al 2009 STEINDEL et al 2008 TANOWITZ et al 1992) Praticamente todo tipo
de ceacutelula nucleada do hospedeiro mamiacutefero pode ser parasitada considerando o
tropismo das diferentes cepas (LENZI et al 1996) Outra caracteriacutestica deste
parasita eacute apresentar diferentes morfologias durante o ciclo bioloacutegico A classificaccedilatildeo
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de suas formas baseia-se tambeacutem na posiccedilatildeo do cinetoplasto em relaccedilatildeo ao nuacutecleo
e do local de onde emerge o flagelo (HOARE 1971)
Foi no ano de 1909 no estado de Minas Gerais que Carlos Chagas meacutedico
sanitarista identificou pela primeira vez o protozoaacuterio parasita Trypanosoma cruzi
agente causador da Doenccedila de Chagas A doenccedila de Chagas eacute endecircmica na
Ameacuterica Latina sendo conhecida a existecircncia de vetores da doenccedila desde o sul dos
Estados Unidos agrave Argentina (FIGURA 1)
FIGURA 1 DISTRIBUICcedilAtildeO GEOGRAacuteFICA DA DOENCcedilA DE CHAGAS FONTE Modificado de httpwwwwhointen
Em 2008 o nuacutemero de indiviacuteduos infectados era estimado entre 16 e 18
milhotildees sendo que aproximadamente 90 milhotildees de pessoas estariam sob risco
de contaminaccedilatildeo na Ameacuterica Latina (WHO 2010)
Apesar de existirem drogas (Nifurtimox e Benzonidazol) para o tratamento
da doenccedila sua ineficaacutecia no estaacutegio crocircnico e sua accedilatildeo toacutexica acabam prejudicando
o paciente sem conseguir eliminar o parasita (BRENER et al 2000) Sem vacinas
ou tratamento quimioteraacutepico eficiente a principal estrateacutegia de controle limita-se agrave
prevenccedilatildeo da transmissatildeo por transfusatildeo sanguiacutenea e ao controle populacional dos
vetores triatomiacuteneos Aleacutem da sua importacircncia como patoacutegeno humano este micro-
organismo apresenta caracteriacutesticas peculiares que o tornam um excelente modelo
para o estudo de questotildees bioloacutegicas baacutesicas
Regiotildees endecircmicas
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12 Ciclo de vida do T cruzi
O T cruzi apresenta um ciclo complexo na natureza sofrendo mudanccedilas
estruturais bioquiacutemicas e morfoloacutegicas de acordo com o ambiente em que se
encontra Formas replicativas epimastigotas e amastigotas dos hospedeiros
invertebrado e mamiacutefero respectivamente alternam-se com as formas infectivas e
natildeo proliferativas tripomastigotas metaciacuteclicas (proveniente do inseto vetor) e
tripomastigota sanguiacutenea (originaacuteria do mamiacutefero infectado) (FIGURA 2) (DE
SOUZA 1984)
FIGURA 2 CICLO DE TRANSMISSAtildeO DO Trypanosoma cruzi FONTE Infograacutefico Veniacutecio Ribeiro ICICTFIOCRUZ
Durante o repasto sanguiacuteneo do inseto vetor formas tripomastigotas
metaciacuteclicas atingem a corrente sanguiacutenea do hospedeiro pela lesatildeo da picada Esta
forma infectiva eacute capaz de invadir todos os tipos de ceacutelulas com exceccedilatildeo das
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hemaacutecias Apoacutes a entrada do parasita na ceacutelula os tripomastigotas diferenciam-se
em uma forma replicativa denominada amastigota que apoacutes diversas divisotildees sofre
uma diferenciaccedilatildeo para um estaacutegio intermediaacuterio o epimastigota intracelular e
posteriormente para tripomastigota Quando ocorre a lise celular os tripomastigotas
satildeo liberados ao meio extracelular podendo entatildeo invadir ceacutelulas vizinhas atingir
novos tecidos atraveacutes da corrente sanguiacutenea ou ainda infectar um inseto vetor
durante o processo de hematofagia recomeccedilando o ciclo no hospedeiro
invertebrado No inseto as formas tripomastigotas diferenciam-se em epimastigotas
no tubo digestivo e migram para o intestino onde ocorrem as divisotildees binaacuterias Ao
atingirem a porccedilatildeo terminal do tubo digestivo ocorre a diferenciaccedilatildeo em
tripomastigotas metaciacuteclicos que satildeo eliminados juntamente com as fezes e urina do
triatomiacutedeo
A transformaccedilatildeo da forma epimastigota do T cruzi em tripomastigota
metaciacuteclica denominada metaciclogecircnese eacute de grande interesse de estudo pois
neste processo ocorrem diversas alteraccedilotildees morfoloacutegicas metaboacutelicas e de
expressatildeo gecircnica (GOLDENBERG et al 1985) A metaciclogecircnese que ocorre
naturalmente no intestino do inseto vetor pode ser mimetizada in vitro utilizando-se
meio quimicamente definido que simula as condiccedilotildees da urina do inseto vetor
(CONTRERAS et al 1985)
13 Aspectos celulares de T cruzi
O Trypanosoma cruzi apresenta aleacutem das organelas tiacutepicas da maioria das
ceacutelulas eucarioacuteticas como nuacutecleo retiacuteculo endoplasmaacutetico aparato de Golgi e
mitococircndria algumas estruturas peculiares (FIGURA 3) como os microtuacutebulos
subpeliculares a estrutura paraflagelar os reservossomos o cinetoplasto os
glicossomos e os acidocalcisomos exclusivos dos tripanosomatiacutedeos (revisto por
DE SOUZA 1984 1999 2002)
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FIGURA 3 ESQUEMA GERAL DAS PRINCIPAIS ESTRUTURAS CELULARES DE T cruzi FONTE DOCAMPO et al 1975
A superfiacutecie celular dos tripanossomatiacutedeos eacute composta principalmente
pela membrana plasmaacutetica e pelos microtuacutebulos subpeliculares Pequenos
filamentos conectam fortemente os microtuacutebulos subpeliculares os quais se
apresentam espaccedilados de forma regular entre si e com a membrana plasmaacutetica (DE
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SOUZA SANTANNA CUNHA-E-SILVA 2009) conferindo rigidez agrave ceacutelula e
resistecircncia ao rompimento mecacircnico
Todos os membros da famiacutelia Trypanosomatidae apresentam um flagelo
que emerge de uma aacuterea de invaginaccedilatildeo da membrana plasmaacutetica conhecida como
bolsa flagelar Devido agrave localizaccedilatildeo especiacutefica de vaacuterios receptores nesta aacuterea
acredita-se que a maior parte do traacutefego vesicular e entrada de nutrientes ocorram
nesta regiatildeo Outra invaginaccedilatildeo menor localizada proacutexima agrave bolsa flagelar o
citoacutestomo tambeacutem estaacute envolvida com a absorccedilatildeo de nutrientes (PORTO-
CARREIRO et al 2000)
O flagelo do T cruzi apresenta uma estrutura baacutesica semelhante a outros
flagelos sendo envolvido por uma membrana flagelar e contendo um axonema
tiacutepico que apresenta um padratildeo de nove pares de microtuacutebulos perifeacutericos e um par
central Associado ao flagelo deste parasita eacute encontrado um complexo arranjo de
filamentos proteacuteicos denominado de estrutura paraflagelar (revisto por GULL 1999)
Na parte posterior da ceacutelula existem organelas usualmente esfeacutericas
denominadas reservossomos Os reservossomos satildeo organelas aacutecidas que
possuem em seu interior proteinases principalmente a cruzipaiacutena (uma
cisteiacutenoproteinase) e proteiacutenas ingeridas que chegam dentro de vesiacuteculas
endociacuteticas oriundas da bolsa flagelar e do citoacutestomo Com base nisso foi proposto
que os reservossomos seriam compartimentos preacute-lisossomais (SOARES et al
1992) Tambeacutem tem sido proposta a participaccedilatildeo dos reservossomos no processo
de metaciclogecircnese como principal fonte de energia para esta atividade (SOARES
1999)
O T cruzi assim como todos os membros da famiacutelia Tripanosomatidae
apresenta uma mitococircndria uacutenica e ramificada que se estende por todo o corpo do
protozoaacuterio Como em todas as ceacutelulas eucarioacuteticas a mitococircndria dos
tripanosomatiacutedeos tambeacutem apresenta DNA mitocondrial tambeacutem conhecido como
kDNA ou DNA do cinetoplasto que se concentra em uma determinada regiatildeo da
mitococircndria localizada logo abaixo do corpuacutesculo basal dando origem a uma
estrutura intramitocondrial chamada de cinetoplasto O cinetoplasto abriga o kDNA
o qual eacute constituiacutedo por moleacuteculas circulares que se encontram interligadas
formando uma extensa rede entre si (SHLOMAI 1994)
Distribuiacutedos pelo citoplasma estatildeo os glicossomos um tipo especializado de
peroxissomo Estes acumulam enzimas da via glicoliacutetica envolvidas na conversatildeo
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da glicose a 3-fosfoglicerato que em outros organismos localizam-se no citoplasma
(HANNAERT et al 2003)
Outra particularidade dos tripanossomatiacutedeos estaacute na estocagem intracelular
de caacutelcio Este iacuteon importante nos processos de sinalizaccedilatildeo celular eacute estocado em
organelas denominadas acidocalcissomos Os acidocalcissomos provavelmente
estatildeo envolvidos em diversos processos bioloacutegicos tais como o armazenamento de
caacutelcio e polifosfatos adaptaccedilatildeo dos tripanosomatiacutedeos a condiccedilotildees de estresse
ambiental manutenccedilatildeo do pH intracelular e osmorregulaccedilatildeo (revisto por DOCAMPO
et al 2005)
14 O genoma de T cruzi
No ano de 2005 foi concluiacuteda a montagem do genoma do T cruzi (EL-
SAYED et al 2005) A cepa CL Brener foi a escolhida para o sequenciamento por
ser bem caracterizada bioquiacutemica e parasitologicamente (ZINGALES et al 1997) e
por ser considerada representativa para o universo de cepas circulantes de T cruzi
Com base na montagem do sequenciamento o genoma diploacuteide do parasita foi
calculado como sendo de 1064 1107 Mb com cada haploacutetipo contendo cerca de
12000 genes sendo que mais de 50 do genoma constituiu-se de sequecircncias
repetitivas compostas por famiacutelias de proteiacutenas de superfiacutecie retrotransposons e
elementos subtelomeacutericos (EL-SAYED et al 2005)
A comparaccedilatildeo das estruturas genocircmicas e proteiacutenas preditas obtidas a
partir do sequenciamento de Trypanosoma cruzi com as de Leishmania major e
Trypanosoma brucei indica mais similaridade entre T cruzi e T brucei uma grande
conservaccedilatildeo entre os respectivos proteomas (exceto para antiacutegenos de superfiacutecie) e
uma sintenia bastante conservada entre os trecircs tripanosomatiacutedeos apesar da
divergecircncia haacute 200-500 milhotildees de anos atraacutes (BERRIMAN et al 2005 EL SAYED
et al 2005 IVENS et al 2005)
Os tripanosomatiacutedeos possuem aleacutem do genoma nuclear um grande
genoma mitocondrial (kDNA) que tem sido extensivamente estudado sendo uacutenico
em estrutura funccedilatildeo e mecanismo de replicaccedilatildeo O kDNA eacute formado por milhares de
moleacuteculas circulares topologicamente relaxadas e interligadas umas as outras Este
arranjo conteacutem aproximadamente 20 - 30 do DNA total dos tripanosomatiacutedeos e eacute
composto por 2 tipos de moleacuteculas circulares os maxiciacuterculos e os miniciacuterculos Os
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maxiciacuterculos apresentam um tamanho entre 22-37 kb e conteacutem basicamente os
genes codificadores de proteiacutenas envolvidas na fosforilaccedilatildeo oxidativa e RNA
ribossocircmico Os miniciacuterculos com um tamanho que varia de espeacutecie para espeacutecie
(05 a 25 kb) conteacutem os genes que codificam os RNAs guia envolvidos na
editoraccedilatildeo do RNA (STUART et al 1989 SHAPIRO amp ENGLUND 1995 MADISON-
ANTENUCCI et al 2002 SIMPSON et al 2003 ONN et al 2006 GLUENZ et al
2007)
15 Expressatildeo gecircnica de Tcruzi
T cruzi estaacute sujeito agraves frequentes mudanccedilas de ambientes decorrentes da
passagem por diferentes hospedeiros durante seu ciclo de vida (temperatura pH
quantidade de nutrientes evasatildeo do sistema imune) por esse motivo a expressatildeo
gecircnica deste parasita eacute regulada por diversos fatores A adaptaccedilatildeo raacutepida e eficiente
a estas diferentes condiccedilotildees torna-se uma importante tarefa para o parasita
Como os demais eucariotos o T cruzi apresenta trecircs RNAs polimerases a
RNA polimerase I transcreve os genes para RNAs ribossocircmicos a RNA polimerase
II os genes que codificam proteiacutenas e a RNA polimerase III pequenos RNAs como
o tRNA (RNA de transferecircncia) Nos tripanosomatiacutedeos promotores para as RNA
polimerase I e III jaacute foram identificados poreacutem ainda natildeo foram identificados
promotores para os genes transcritos pela RNA polimerase II com exceccedilatildeo de um
promotor associado ao gene do mini-exon (GILLINGER amp BELLOFATTO 2001
revisto por CAMPBELL et al 2003)
Os genes dos tripanosomatiacutedeos estatildeo organizados em unidades
policistrocircnicas e natildeo apresentam interrupccedilotildees por iacutentrons com exceccedilatildeo do gene da
poli-A polimerase (MAIR et al 2000)
Uma vez que em T cruzi como nos demais eucariotos somente mRNAs
monocistrocircnicos satildeo traduzidos os precursores de mRNA policistrocircnicos devem ser
processados ateacute mRNAs individuais Como caracteriacutestica desta famiacutelia os
transcritos de mRNA satildeo processados por mecanismos de trans-splicing (AGABIAN
1990) e poliadenilaccedilatildeo (LEBOWITZ et al 1993 MATTHEWS et al 1994
VANHAMME amp PAYS 1995)
No processo de trans-splicing as unidades codificadoras satildeo separadas e eacute
adicionada na extremidade 5rsquo uma sequecircncia extremamente conservada espeacutecie-
26
especiacutefica de 39 nucleotiacutedeos denominada sequumlecircncia liacuteder (SL) ou minieacutexon
(McCARTHY-BURKE et al 1989 NILSEN 1992 VANHAMME amp PAYS 1995)
Nesta reaccedilatildeo participam duas moleacuteculas de RNA uma doadora e outra aceptora A
doadora eacute um precursor do mini-exon e em T cruzi possui cerca de 110
nucleotiacutedeos (ZWIERZYNSKI amp BUCK 1991) A aceptora eacute o transcrito derivado da
unidade policistrocircnica ao qual o mini-exon eacute transferido O complexo enzimaacutetico
envolvido nesta reaccedilatildeo eacute semelhante ao descrito para a de cis-splicing (LAIRD
1989)
Os transcritos processados satildeo estabilizados pela estrutura cap 4 do mini-
exon (ULLU amp TSCHUDI 1991) e pela adiccedilatildeo de uma cauda poli-A agrave extremidade
3rsquo sendo que a adiccedilatildeo de ambos os elementos ocorrem em conjunto (LEBOWITZ et
al 1993) Regiotildees ricas em resiacuteduos de pirimidinas aleacutem da sequumlecircncia consenso
(AG) para o trans-splicing regulam a adiccedilatildeo do mini-exon e da cauda poli-A
Deleccedilotildees nestas regiotildees impedem o correto processamento destes transcritos
(MATTHEWS et al 1994)
A ocorrecircncia de transcriccedilatildeo policistrocircnica associada agrave ausecircncia de
promotores para RNA polimerase II e agrave presenccedila de niacuteveis distintos de mRNA
originados de uma mesma unidade policistrocircnica sugerem que a regulaccedilatildeo da
expressatildeo gecircnica nesses protozoaacuterios ocorra a niacutevel poacutes-transcricional baseada
principalmente em mecanismos que controlam a estabilidade e a traduccedilatildeo dos
mRNAs (CLAYTON 2002 BOUCHER et al 2002)
16 O cinetoplasto
O cinetoplasto eacute uma estrutura peculiar presente nos tripanosomatiacutedeos e
encontra-se inserida no interior da mitococircndria uacutenica abrigando fibrilas de DNA
conhecidas como kDNA O nome cinetoplasto (cineto=movimento e plasto=organela)
foi dado pois se acreditava que o mesmo fosse responsaacutevel pelo movimento do
flagelo
17 A rede de kDNA
O DNA do cinetoplasto eacute formado por dois tipos de moleacuteculas circulares os
miniciacuterculos de tamanho entre 05 e 25 kb e os maxiciacuterculos que apresentam
entre 20 e 40 kb Cerca de 10000 miniciacuterculos e 50 maxiciacuterculos se encontram
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catenados formando uma extensa rede (SHAPIRO amp ENGLUND 1995 DE SOUZA amp
CAVALCANTI 2008) (FIGURA 4)
FIGURA 4 REDE DE kDNA
FONTE ROY CHOWDHURY et al 2010
As primeiras questotildees relacionadas ao arranjo das moleacuteculas na rede do
kDNA dos tripanosomatiacutedeos surgiram na deacutecada de 80 sugerindo que tal
organizaccedilatildeo poderia ter evoluiacutedo como um maneira mais eficaz de armazenar uma
grande quantidade de material em um pequeno espaccedilo (HAJDUK et al 1986)
Os maxiciacuterculos apresentam um tamanho de 22 a 37 kb e assim como o
DNA mitocondrial de outros eucariotos codificam RNAs ribossomais e diversas
proteiacutenas da cadeia respiratoacuteria incluindo subunidades da citocromo oxidase e
NADH desidrogenase (revisto por SHAPIRO amp ENGLUND 1995) Os transcritos dos
maxiciacuterculos satildeo processados poacutes-transcricionalmente para formar mRNAs
funcionais atraveacutes de um processo conhecido como ediccedilatildeo ou editoraccedilatildeo do RNA
A editoraccedilatildeo do RNA consiste na inserccedilatildeo ou retirada de resiacuteduos de uridina em
28
siacutetios especiacuteficos dos RNAs transcritos pelos maxiciacuterculos a fim de criar coacutedons de
iniciaccedilatildeo ou terminaccedilatildeo mudanccedilas na fase de leitura ou quadros abertos de leitura a
partir de sequumlecircncias sem sentido O processo de ediccedilatildeo eacute especificado por
pequenos RNAs guias produzidos pelos miniciacuterculos e maxiciacuterculos e catalisado
por um complexo muiltiproteacuteico o editosomo (revisto por Esteacutevez amp Simpson 1999
Stuart et al 2005) Esse processo constitui uma forma de regular poacutes-
transcricionalmente a expressatildeo de genes mitocondriais nas diferentes formas
evolutivas do parasita
Os miniciacuterculos caracterizam-se por apresentar um tamanho de 05 a 25 kb
e por transcrever os RNAs guia (gRNA) responsaacuteveis pela especificidade da ediccedilatildeo
dos mRNAs codificados pelos maxiciacuterculos por meio de uma sequumlecircncia presente na
porccedilatildeo central desses gRNAs (BENNE 1994 STUART et al 2005) A significacircncia
da variaccedilatildeo em tamanho e organizaccedilatildeo entre as espeacutecies ainda natildeo eacute aparente
contudo a diversidade das sequecircncias dos miniciacuterculos estaacute correlacionada com a
necessidade de mais ou menos ediccedilatildeo de mRNA de cada organismo (STUART
1991) Apesar desta diversidade os miniciacuterculos apresentam pelo menos duas
regiotildees conservadas o dodecacircmero GGGGTTGGTGTA conhecido como sequecircncia
universal dos miniciacuterculos (UMS) e o hexacircmero ACGCCC que correspondem agrave
origem de replicaccedilatildeo da fita L (light) e da fita H (heavy) respectivamente
(BIRKENMEYER amp RAY 1986 BIRKENMEYER et al 1987 RAY 1989 SHLOMAI
1994 HINES amp RAY 2008)
Embora o cinetoplasto de todos os tripanosomatiacutedeos seja formado por
moleacuteculas circulares relaxadas e catenadas diferentes arranjos da rede de kDNA
podem ser observados entre diferentes estaacutegios do ciclo de vida desses
protozoaacuterios como em T cruzi (FIGURA 5) assim como mudanccedilas na posiccedilatildeo do
kDNA satildeo utilizadas para identificar as diferentes formas evolutivas do parasita
(FIGURA 6)
29
FIGURA 5 ndash DIFERENTES ARRANJOS DO CINETOPLASTO DE T cruzi
LEGENDA As fibrilas de kDNA se apresentam bastante compactadas em forma de bastatildeo nas formas amastigotas (A) e epimastigotas (B) enquanto nas formas tripomastigotas a rede de kDNA torna-se menos compacta e a forma em bastatildeo do cinetoplasto daacute lugar a uma forma arredondada (C) FONTE DE SOUZA amp SOUTO-PADRON 1980 e DE SOUZA 1984
Nas formas amastigota (FIGURA 5A) e epimastigota (FIGURA 5B) de T
cruzi as fibrilas de kDNA se apresentam bastante compactadas em forma de
bastatildeo Em tripomastigotas (FIGURA 5C) de T cruzi a rede de kDNA torna-se
menos compacta e a forma em bastatildeo do cinetoplasto daacute lugar a uma forma
arredondada (DE SOUZA 1984) Os vaacuterios graus de compactaccedilatildeo do kDNA em
tripanosomatiacutedeos podem estar relacionados com a accedilatildeo de proteiacutenas que
condensam o DNA como seraacute visto mais adiante
FIGURA 6 MUDANCcedilAS NA POSICcedilAtildeO DO KDNA NOS TRYPANOSOMAS FONTE Modificado de DO CAMPO et al 2005
30
O cinetoplasto de todos os tripanosomatiacutedeos encontra-se localizado
proacuteximo ao corpo basal perpendicularmente ao eixo do flagelo Em alguns
tripanosomatiacutedeos que sofrem diferenciaccedilatildeo ao longo de seu ciclo de vida como o
T cruzi o cinetoplasto muda de posiccedilatildeo dentro da ceacutelula passando da regiatildeo
anterior (nos epimastigotas) para a regiatildeo posterior (nos tripomastigotas) poreacutem
permanecendo proacuteximo e perpendicular ao corpo basal (FIGURA 7) O cinetoplasto
eacute fisicamente conectado ao corpo basal atraveacutes de um grupo de filamentos
citoplasmaacuteticos chamado de complexo de ligaccedilatildeo tripartite (TAC) (OGBADOYI et al
2003) Este complexo eacute responsaacutevel pelo posicionamento espacial do cinetoplasto e
por sua segregaccedilatildeo
FIGURA 7 REPOSICIONAMENTO DO KDNA EM RELACcedilAtildeO AgraveS OUTRAS ORGANELAS DURANTE O CICLO DE VIDA DE UM FLAGELADO LEGENDA A morfologia eacute definida pelas posiccedilotildees do ponto onde emerge o flagelo e a bolsa flagelar (BF) (mostrada em laranja) nuacutecleo (mostrado em azul) e kDNA (mostrado em roxo) FONTE Modificado de FIELD amp CARRINGTON 2009
31
171 Replicaccedilatildeo do kDNA
Nos tripanosomatiacutedeos a replicaccedilatildeo do kDNA eacute restrita a fase S nuclear
(COSGROVE amp SKEEN 1970 WOODWARD amp GULL 1990) diferente do que
acontece na maioria dos eucariotos onde a replicaccedilatildeo do DNA mitocondrial ocorre
ao longo do ciclo celular (LIU et al 2005)
A replicaccedilatildeo dos miniciacuterculos se inicia quando estes satildeo individualmente
decatenados da rede de kDNA pela accedilatildeo de DNA topoisomerases do tipo II pois
estes natildeo se replicam enquanto estatildeo ligados agrave rede e termina quando os
miniciacuterculos retornam para a rede com a ajuda da mesma enzima (SHAPIRO amp
ENGLUND 1995)
Os miniciacuterculos satildeo liberados da rede em direccedilatildeo a zona cinetoflagelar
(KFZ) uma regiatildeo especializada da matriz mitocondrial entre o kDNA e o corpo
basal (FIGURA 8) que abriga proteiacutenas envolvidas com o iniacutecio da replicaccedilatildeo Em
seguida os ciacuterculos migram (ou satildeo transportados) para os poacutelos opostos da rede
de kDNA para completar sua replicaccedilatildeo O iniacutecio da replicaccedilatildeo dos miniciacuterculos na
regiatildeo cinetoflagelar envolve a montagem de um complexo proteacuteico na origem de
replicaccedilatildeo dos ciacuterculos com a participaccedilatildeo da primase polimerase e proteiacutenas que
se ligam agrave sequumlecircncia universal de miniciacuterculos (UMSBP) Estas juntamente com
outras proteiacutenas geram uma forquilha de replicaccedilatildeo que se propaga
unidirecionalmente ao redor do miniciacuterculo formando uma estrutura tipo
intermediaacuteria (LIU et al 2005 GLUENZ et al 2007)
Os miniciacuterculos receacutem-replicados migram da zona KFZ para dois complexos
proteacuteicos situados nos poacutelos diametralmente opostos do cinetoplasto onde os
proacuteximos passos de replicaccedilatildeo iratildeo ocorrer Estes passos incluem remoccedilatildeo dos
primers pela accedilatildeo de endonucleases preenchimento de alguns intervalos entre os
fragmentos de Okazaki pela DNA polimerase e uniatildeo dos cortes (nicks) por uma
DNA ligase Apoacutes estas etapas os novos ciacuterculos sintetizados que ainda possuem
pelo menos uma interrupccedilatildeo em sua sequumlecircncia satildeo reunidos agrave periferia da rede
pela accedilatildeo de topoisomerases II Apoacutes todos miniciacuterculos terem sido replicados os
intervalos satildeo reparados (Revisto por LIU et al 2005 POVELONES 2014)
Pouco se sabe sobre o processo de replicaccedilatildeo dos maxiciacuterculos Assim
como os miniciacuterculos os maxiciacuterculos tambeacutem sofrem replicaccedilatildeo unidirecional que
32
se inicia em uma origem contida na regiatildeo variaacutevel da moleacutecula formando estruturas
tipo- Entretanto ao contraacuterio dos miniciacuterculos eles permanecem ligados agrave rede de
kDNA durante o processo replicativo (revisto por KLINGBEIL et al 2001 Liu et al
2005)
FIGURA 8 REPLICACcedilAtildeO DO kDNA FONTE Modificado de LIU et al 2005
18 Proteiacutenas associadas ao cinetoplasto (KAPs)
Proteiacutenas que se ligam ao DNA tambeacutem foram identificadas na mitococircndria
de uma variedade de organismos eucarioacuteticos variando de levedura ateacute humanos
(MAIER et al 2001) Estas proteiacutenas satildeo codificadas no nuacutecleo da ceacutelula e satildeo poacutes-
traducionalmente importadas para a mitococircndria
Conceitualmente qualquer proteiacutena que se associe ao kDNA quer atuando
na replicaccedilatildeo e transcriccedilatildeo quer atuando na organizaccedilatildeo compactaccedilatildeo e
segregaccedilatildeo da rede pode ser chamada de KAP (KAP do inglecircs Kinetoplast-
33
Associated Protein) Observou-se que algumas dessas KAPs apresentam
caracteriacutesticas de proteiacutenas histonas H1 (H1 histone-like proteins) por serem
proteiacutenas pequenas (17 a 25 kDa) fortemente baacutesicas (pI de 11 a 125) interagindo
com a carga negativa das moleacuteculas de DNA e com grande conteuacutedo dos
aminoaacutecidos lisina e arginina elevado (aprox 30 a 50)
Proteiacutenas associadas com genoma mitochondrial (KAPs) dos
tripanosomatiacutedeos e que compartilham caracteriacutesticas com histonas H1 foram
inicialmente identificadas no cinetoplasto do tripanosomatiacutedeo de inseto Crithidia
fasciculata e denominadas de KAP1 a 5 As H1-KAPs de C fasciculata interagem
com miniciacuterculos (XU et al 1996) e desse modo podem facilitar a associaccedilatildeo
orientaccedilatildeo e organizaccedilatildeo dessas moleacuteculas na rede pela neutralizaccedilatildeo das cargas
negativas das moleacuteculas de DNA contribuindo para a condensaccedilatildeo organizaccedilatildeo e
segregaccedilatildeo da rede de kDNA Ateacute o momento foram caracterizadas quatro H1-KAPs
de C fasciculata (CfKAP1 2 3 and 4) Aleacutem das caracteriacutesticas de histona H1
possuem uma preacute-sequecircncia clivaacutevel de nove aminoaacutecidos em sua porccedilatildeo N-
terminal e que provavelmente estaacute envolvida no transporte da proteiacutena para o
cinetoplasto jaacute que natildeo aparece na proteiacutena madura (XU amp RAY 1993 XU et al
1996 HINES amp RAY 1998) Atraveacutes de ensaios de imunofluorescecircncia foi possiacutevel
confirmar que estas proteiacutenas estatildeo presentes em toda a rede de kDNA Pela
facilidade encontrada nas KAPs purificadas de condensar redes de kDNA in vitro
(XU et al 1996) sugere-se que estas estejam envolvidas na organizaccedilatildeo e
condensaccedilatildeo do kDNA in vivo (LUKES et al 2001)
As teacutecnicas de deleccedilatildeo de genes satildeo uma oacutetima ferramenta para elucidar as
possiacuteveis funccedilotildees que um gene pode apresentar Em C fasciculata foi utilizada a
teacutecnica de nocaute gecircnico para o gene Cfkap1 onde mutantes viaacuteveis foram
obtidos mostrando que a forma e a dimensatildeo do cinetoplasto natildeo foram alterados
ao contraacuterio da organizaccedilatildeo da rede de kDNA que passou a apresentar fibrilas de
DNA espessas e uma camada eleacutetron-densa no centro do disco Quando foi
realizada a reintroduccedilatildeo do gene na forma episomal o fenoacutetipo normal da rede de
kDNA foi restaurado (LUKES et al 2001) Tambeacutem foi realizado o duplo nocaute
dos genes Cfkap2 e Cfkap3 o qual da mesma maneira produziu mutantes viaacuteveis
poreacutem com o crescimento bastante reduzido uma reduccedilatildeo na respiraccedilatildeo e um
aumento nos niacuteveis de mRNAs codificados pelos maxiciacuterculos Apesar de todas
estas alteraccedilotildees o kDNA permaneceu inalterado mostrando que as proteiacutenas
34
CfKAP2 e CfKAP3 desempenham um papel diferente ao da CfKAP1 pois estatildeo
envolvidas com o metabolismo mitocondrial e proliferaccedilatildeo celular ao inveacutes de
estarem envolvidas na organizaccedilatildeo estrutural do kDNA (AVLIYAKULOV et al
2004)
Com base nesses estudos surgiu o interesse de nosso grupo no estudo de
KAPs em T cruzi visando verificar qual o papel dessas proteiacutenas na organizaccedilatildeo da
rede de kDNA e sua importacircncia nos diferentes estaacutegios do ciclo de vida do parasita
Atraveacutes de anaacutelises bioinformaacuteticas foram identificadas 6 diferentes H1-KAPs
codificadas no genoma do T cruzi levando em consideraccedilatildeo a similaridade com
KAPs de C fasciculata (CAVALCANTI et al 2009) Essas H1-KAPs foram
denominadas de KAP3 KAP4a KAP4b KAP4c KAP6 e KAP7 Nosso grupo iniciou
a caracterizaccedilatildeo das proteiacutenas TcKAP4 e TcKAP6 mostrando que elas se localizam
no cinetoplasto mas com padrotildees distintos de distribuiccedilatildeo dependendo da forma do
ciclo de vida do parasita (CAVALCANTI et al 2009) Mais recentemente mostramos
que o nocaute da TcKAP3 natildeo afeta a proliferaccedilatildeo diferenciaccedilatildeo e infectividade do
parasita (DE SOUZA et al 2010)
A complexidade da rede de kDNA sugere portanto que as diferentes KAPs
atuem em conjunto algumas vezes de modo redundante para desempenhar
funccedilotildees na condensaccedilatildeo replicaccedilatildeo segregaccedilatildeo dessa estrutura
35
2 OBJETIVOS
21 OBJETIVO GERAL
O objetivo principal deste trabalho eacute caracterizar a funccedilatildeo da TcKAP7 avaliando seu
papel na biologia do parasita
211 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS
a) Analisar a localizaccedilatildeo subcelular da TcKAP7 atraveacutes de ensaios de
imunofluorescecircncia
b) Produzir TcKAP7 recombinante em larga escala para ensaios de biologia
estrutural
c) Estudar a viabilidade do parasita na ausecircncia do gene TcKAP7 para os parasitas
viaacuteveis analisar morfologia e ultraestrutura do cinetoplasto multiplicaccedilatildeo
diferenciaccedilatildeo e infectividade
36
3 MATERIAIS E MEacuteTODOS
31 Reagentes e Soluccedilotildees Utilizados
311 Reagentes
AmershamBioscience dNTPs Hybond C Hybond N kit ECL de western blotting
filmes de raio-X Hyperfilmreg anticorpo monoclonal anti-Histidina
Bio-Rad Acrilamida Agarose (UltraPure DNA grade) Azul de Bromofenol Bis-
Acrilamida Persulfato de Amocircnia
Cult-lab RPMI 1640
Difco Baacutecto-Aacutegar Bactotriptona Extrato de levedura Infuso de fiacutegado Triptose
Invitrogen Inc EDTA Fenol TRIS Nick Translation kit Taq DNA polymerase
IPTG Agarose X-Gal DNA de λHindIII Marcador de massa molecular Benchmark
Alexa Fluacuteor 458 1 kb Plus DNA Ladder Soro Fetal Bovino T4 DNA ligase
Merck Acetato de Soacutedio Aacutecido Aceacutetico Glacial Cloreto de CaacutelcioCloreto de
Potaacutessio Cloreto de Soacutedio Etanol Absoluto Glicina Glicose Hidroacutexido de soacutedio
Isopropanol HCl Na2HPO4
New England Biolabs Endonucleases de restriccedilatildeo
Qiagen Qiaquick PCR Purification kit
Serva Electrophoresis Alu-Gel S
Sigma Acetato de amocircnia Ampicilina Brometo de Etiacutedeo BSA Kanamicina
Glicerol Hepes Cloreto de Magneacutesio Tetraciclina β-mercaptoetanol DEAE-
celulose Tween 20 adjuvante completo de Freund monoclonal M2 anti-FLAG
312 Tampotildees e Soluccedilotildees
PBS NaCl 137 mM KCl 27 mM Na2HPO4 43 mM e KH2PO4 15 mM
PSG Na2HPO4 (anidro) 4747 mM NaH2PO4 H2O 25 mM NaCl 3676 mM e
glicose 555 mM
Soluccedilatildeo de tripsinazaccedilatildeo tripsina 005 (mv) e EDTA 002 (mv) em PBS pH
80
37
Soluccedilatildeo de bloqueio para imunofluorescecircncia PBS e BSA 1 (albumina seacuterica
bovina)
Soluccedilatildeo de bloqueio para western blot TBST e leite em poacute desnatado 5
Soluccedilatildeo de lise para Toothpick NaOH 50 mM Glicerol 5 SDS 05 EDTA 5
mM e azul de bromofenol 0025
Soluccedilatildeo Ponceau S Ponceau S 05 em aacutecido aceacutetico 1
Soluccedilatildeo de coloraccedilatildeo para geacuteis de proteiacutena Coomassie blue R-250 01 em
metanolaacutecido aceacutetico (4510)
Soluccedilatildeo para descoloraccedilatildeo de geacuteis de proteiacutena Metanol 4 aacutecido aceacutetico 75
Tampatildeo de lise hipotocircnico Tris-HCl 10mM pH 75 NaCl 10mM MgCl2 5 mM β-
mercaptoetanol 5 mM
Tampatildeo A para cromatografia de afinidade Tris-HCl 20 mM pH 75 NaCl 500 mM
Tampatildeo B para cromatografia de afinidade Tampatildeo A contendo imidazol 1M
Tampatildeo B para cromatografia de troca iocircnica Tris-HCl 50 mM pH 80 NaCl 1M
Soluccedilatildeo de depurinaccedilatildeo para Southern blot HCl 025 M
Soluccedilatildeo desnaturante para Southern blot NaOH 05 M e NaCl 15 M
Soluccedilatildeo neutralizante para Southern blot Tris-HCl 05 M pH 75 e NaCl 15 M
Soluccedilatildeo Denhardt (50X) ficoll 05 polivinilpirrolidona 06 e albumina de soro
bovino 02
Soluccedilatildeo de hibridaccedilatildeo para Southern blot DNA de esperma de salmatildeo do tipo III
01 mgml fragmentado por ultra-som e desnaturado SSC 6X soluccedilatildeo de denhardt
6X e SDS 1
SSC 20X NaCl 3 M pH 70 e citrato de soacutedio 03 M
Soluccedilatildeo de baixa estringecircncia SSC 2X e SDS 01
Soluccedilatildeo de meacutedia estringecircncia SSC 1X e SDS 01
Soluccedilatildeo de alta estringecircncia SSC 01X e SDS 01
Tampatildeo de eletroporaccedilatildeo para T cruzi NaCl 140 mM HEPES (aacutecido) 25 mM e
Na2HPO4 074 mM pH 75
Tampatildeo ZPFM de eletroporaccedilatildeo de T brucei NaCl 129 mM KH2PO4 15mM KCl
8mM NaH2PO4 8mM MgCl2 15mM CaCl2 90 mM e CH3COONa 24 mM pH 70
Tampatildeo TELT Tris-HCl 50 mM pH 80 EDTA 625 mM pH 90 LiCl 25 M e Triton
X-100 4
Tampatildeo de amostra para DNA 10X Ficoll 400 25 azul de bromofenol 025 e
xileno cianol FF 025
38
Tampatildeo de amostra para proteiacutena 4X Tris-HCl 40 mM pH 68 SDS 1 β-
mercaptoetanol 25 glicerol 6 e azul de bromofenol 0005
Tampatildeo de eletroforese para SDS-PAGE 1X Tris-base 25 mM glicina 192 mM e
SDS 01
Tampatildeo de lise de bacteacuterias Tris-HCl 20 mM pH 75 NaCl 500 mM PMSF1 mM
Tampatildeo para transferecircncia (western blotting) 1X Tris-base 25 mM glicina 192
mM e metanol 20
Tampatildeo TBE Tris base 89 mM aacutecido boacuterico 89 mM e EDTA 2 mM
TBS Tris-HCl 20 mM pH 80 e NaCl 150 mM
TBST TBS e Tween 20 01
TE Tris-HCl 10 mM pH 80 e EDTA 1 mM
313 Meios de cultura
LB Triptona 1 extrato de levedura 5 e NaCl 1
Meio LIT (liver infusion tryptose) infuso de fiacutegado 05 NaCl 753 mM KCl 54
mM glicose 10 mM bacto-triptose 05 Na2HPO4 564 mM hemina 00025 soro
fetal bovino 10 e extrato de levedura 15 gl
Meio TAU NaCl 190 mM KCl 17 mM MgCl2 2 mM CaCl2 2 mM e tampatildeo fosfato 8
mM pH 60
Meio TAU3AAG meio TAU suplementado com L-prolina 10 mM glutamato soacutedico
50 mM aspartato soacutedico 2 mM e glicose 10 mM
32 Cultivo do Trypanosoma cruzi
Neste trabalho foi utilizado o clone Dm28c de T cruzi (CONTRERAS et al
1985 CONTRERAS et al 1988) nas formas epimastigota e tripomastigota
metaciacuteclico
321 Epimastigotas
Formas epimastigotas de T cruzi foram cultivadas em meio LIT (CAMARGO
1964) a 28 oC com passagens a cada trecircs dias e inoacuteculo de 1 x 106 ceacutelulasml As
formas epimastigotas foram coletadas por centrifugaccedilatildeo no terceiro dia de cultivo
39
(correspondente a fase logariacutetmica de crescimento baseada em curva de
crescimento realizada nas mesmas condiccedilotildees) quando a densidade celular
apresentava-se entre de 1 - 3 x 107 ceacutelulasml
322 Tripomastigotas metaciacuteclicos
As formas metaciacuteclicas foram obtidas atraveacutes do processo de diferenciaccedilatildeo
in vitro (BONALDO et al 1988) Formas epimastigotas em final de fase logariacutetmica
de crescimento (densidade celular entre 5 - 7 x 107 ceacutelulasml) foram coletadas por
centrifugaccedilatildeo a 7000 x g por 5 minutos a 10 oC e ressuspendidas em meio TAU
na concentraccedilatildeo de 5 x 108 ceacutelulasml e mantidas a 28 oC por 2 horas Apoacutes este
periacuteodo correspondente ao estresse nutricional as ceacutelulas foram transferidas para
garrafas de 300 cm2 contendo 200 ml de meio TAU3AAG (concentraccedilatildeo final de 5 x
106 ceacutelulasml) Uma proporccedilatildeo dos parasitas que se aderiram agrave superfiacutecie da
garrafa de cultivo se diferenciou em metaciacuteclicos os quais foram liberados no
sobrenadante (BONALDO et al 1988) Estas formas foram purificadas pela
passagem atraveacutes de uma coluna de afinidade contendo a resina DEAE celulose
equilibrada em PSG (SOUSA 1983) Este procedimento foi realizado com o tipo
selvagem para obtenccedilatildeo de extrato proteacuteico e tambeacutem com o mutante de T cruzi
para TcKAP7 para verificaccedilatildeo da capacidade de diferenciaccedilatildeo e infectividade onde
o nuacutemero de metaciacuteclicos no sobrenadante foi contado apoacutes 24 48 72 e 96 horas
da incubaccedilatildeo em meio TAU3AAG
33 Curva de crescimento de T cruzi
Formas epimastigotas de T cruzi clone Dm28c e do mutante de T cruzi para
TcKAP7 foram cultivadas como descrito no item 321 ateacute atingirem a fase
estacionaacuteria para a comparaccedilatildeo da taxa de crescimento de ambas Foram
inoculadas 1 x 106 epimastigotas por ml de meio LIT em garrafas de 25 cm2 e
incubadas em seguida a 28 degC Diariamente foi realizada a contagem das culturas
em cacircmaras de Neubauer em diluiccedilotildees apropriadas ateacute o deacutecimo dia O graacutefico da
curva de crescimento comparativa entre a cultura selvagem e a nocaute foi feito
utilizando o programa Microsoft Excel
40
34 Obtenccedilatildeo de DNA de T cruzi
A extraccedilatildeo de DNA foi realizada conforme descrito por Medina-Acosta amp
Cross (1993) Epimastigotas (1 x 107 ceacutelulas) foram coletadas por centrifugaccedilatildeo a
7000 x g por 5 min lavadas em PBS e ressuspendidas em 350 microl de tampatildeo TELT
Apoacutes 5 min de incubaccedilatildeo agrave temperatura ambiente foi adicionado agrave amostra 1
volume de fenolclorofoacutermio e o material foi centrifugado a 13000 x g por 5 min A
fase aquosa foi recolhida e o DNA foi precipitado com 2 volumes de etanol absoluto
e coletado por centrifugaccedilatildeo a 13000 x g por 10 min O DNA presente no sedimento
foi lavado com etanol 70 seco e em seguida ressuspendido em tampatildeo TE
contendo RNAse a 20 microgml
35 Obtenccedilatildeo de kDNA de T cruzi
A extraccedilatildeo do kDNA de T cruzi foi realizada de acordo com Morel e
colaboradores (1980) com modificaccedilotildees
Formas epimastigotas (1 x109 ceacutelulas) foram coletadas por centrifugaccedilatildeo a
4000 x g por 10 min lavadas em PBS e ressuspendidas em 20 ml de Tampatildeo de
Lise Hipotocircnico Posteriormente adicionou-se Sacarose 025 M e o material foi
centrifugado 6000 x g por 10 min O pellet foi ressuspendido em 20 ml de Tris-HCl
10 mM pH 75 NaCl 10 Mm EDTA 5 mM SDS 05 A esta soluccedilatildeo foi adicionado
100 ug de proteinase K e a mesma permaneceu a 37 ordmC durante a noite No dia
seguinte as ceacutelulas foram transferidas para uma seringa de 50 ml aonde ocorreu a
quebra mecacircnica do DNA nuclear Este material foi ultracentrifugado a 27000 rpm a
4ordm C durante 1 hora utilizando o rotor SW28 Apoacutes centrifugaccedilatildeo o sobrenadante foi
desprezado e o pellet ressuspendido em 25 ml de TE e novamente ultracentrifugado
nas mesmas condiccedilotildees Apoacutes centrifugaccedilatildeo o pellet foi ressuspendido em 1ml de TE
e foi realizada a purificaccedilatildeo por fenolclorofoacutermio Apoacutes purificaccedilatildeo o material foi
ressuspendido em 300 ul de TE e utilizado para ensaios de SAXS
36 Obtenccedilatildeo de extrato proteico de T cruzi
41
As ceacutelulas foram coletadas por centrifugaccedilatildeo (4000 x g 5 min a 10 degC) e
lavadas duas vezes em PBS pH 75 Apoacutes as lavagens os parasitas foram
ressuspendidos em PBS e tampatildeo de amostra 4x foi adicionado de tal maneira que
a concentraccedilatildeo final fosse de 1 x 106 ceacutelulas equivalentesmicrol Os extratos foram
fervidos por 5 min e armazenados a - 70 degC
37 Clonagem do gene TcKAP7
A sequecircncia do gene TcKAP7 (ID Tc00104705350871950) foi obtida a
partir do banco de dados do genoma do T cruzi disponiacutevel no portal da internet
wwwgenedborg e a sua regiatildeo codificante foi amplificada por PCR com os primers
KAP7F (5rsquo ndash AAAGGATCCATGCTAAGAACTGTTCTGCCACTG 3rsquo) e KAP7R (5rsquo ndash
TCAGCGTCGACTTATGACGGTGGTGCAGGATCAGCAGCTGCAGTATTTT3rsquo) a
partir do DNA genocircmico de T cruzi Dm28c As sequecircncias de reconhecimento das
enzimas de restriccedilatildeo BamHI e SalI (marcadas em negrito) foram adicionadas na
extremidade 5rsquo dos primers KAP7F e KAP7R respectivamente As condiccedilotildees da
reaccedilatildeo de PCR foram as seguintes 100 ng de DNA total T cruzi 10 pmol de cada
primer 200 μM de cada dNTP MgCl2 15 mM tampatildeo Taq DNA polimerase 1x 25
U de Taq DNA polimerase (Invitrogen) A reaccedilatildeo de PCR foi processada no
termociclador modelo 9700 (Applied Biosystems EUA) com a desnaturaccedilatildeo do
material por 4 min a 94 degC seguida de 30 ciclos constando de desnaturaccedilatildeo a 94 degC
por 30 s hibridizaccedilatildeo dos primers a 58 degC por 30 s e extensatildeo a 72 degC por 1 min O
material amplificado foi purificado usando o kit Qiaquick PCR Purification (Qiagen) e
digerido com as enzimas de restriccedilatildeo BamHI e SalI com uso de 20 U de cada
enzima e seus respectivos tampotildees em volume final de 20 μl por 4 h a 37 oC O
material foi novamente purificado e utilizado para ligaccedilatildeo com o vetor pET28a
previamente digerido com as respectivas enzimas Bacteacuterias E coli cepa DH5α
foram transformadas com a ligaccedilatildeo A seleccedilatildeo dos clones contendo plasmiacutedeo com
o inserto desejado foi realizada atraveacutes da teacutecnica de palitagem ou de PCR de
colocircnia
38 Obtenccedilatildeo do cDNA de TcKAP7 atraveacutes de ensaio de RT-PCR
42
Com o intuito de verificar a posiccedilatildeo do mini-exon no transcrito de TcKAP7
realizamos o ensaio de RT-PCR para a obtenccedilatildeo do cDNA de TcKAP7
O protocolo utilizado foi baseado no manual teacutecnico da Promega (ΙmProm-ΙΙ
Reverse Transcription System) assim como os reagentes utilizados para essa
reaccedilatildeo Aproximadamente 10 μg de RNA foram incubados com o oligonucleotiacutedeo
KAP7R por 10 min a 70 degC e imediatamente transferidos para o gelo Agrave mistura foi
adicionada uma soluccedilatildeo de dNTPs (concentraccedilatildeo final de 05 mM para cada dNTP)
MgCl2 (120 μM) RNAse OUT (2 unidades) (Invitrogen) Transcriptase reversa
ImProm-II e respectivo tampatildeo A reaccedilatildeo foi incubada por 2 h a 42 degC As amostras
de cDNA foram purificadas por Microcon YM-30 (Millipore) conforme descriccedilatildeo do
fabricante e armazenadas a -20 degC Posteriormente foi realizada uma reaccedilatildeo de
PCR utilizando as seguintes condiccedilotildees 10 ng do cDNA de TcKAP7 de T cruzi 10
pmol do primer ME (5rsquo-AACGCTATTATTGATACAGTTTCTGTACTATATTG -3rsquo) e 10
pmol do primer KAP7R 200 μM de cada dNTP MgCl2 15 mM tampatildeo Taq DNA
polimerase 1x 25 U de Taq DNA polimerase (Invitrogen) A reaccedilatildeo de PCR foi
processada no termociclador modelo 9700 (Applied Biosystems EUA) com a
desnaturaccedilatildeo do material por 3 min a 94 degC seguida de 35 ciclos constando de
desnaturaccedilatildeo a 94 degC por 30 s hibridizaccedilatildeo dos primers a 55 degC por 30 s e extensatildeo
a 72 degC por 1 min O material amplificado foi purificado usando o kit Qiaquick PCR
Purification (Qiagen) e clonado diretamente no vetor pGEMreg-T Easy (Promega)
Bacteacuterias E coli cepa TOP10Frsquo foram transformadas com a ligaccedilatildeo e os plasmiacutedeos
recombinantes foram selecionados pela teacutecnica da palitagem ou de PCR de colocircnia
(itens 391 e 392) Apoacutes a minipreparaccedilatildeo (item 310) o material foi submetido ao
sequenciamento de DNA usando o serviccedilo de sequenciamento da empresa
Macrogen (Coreacuteia do Sul)
39 Seleccedilatildeo dos clones recombinantes
391 Teacutecnica de palitagem (toothpick)
As colocircnias foram coletadas com o auxiacutelio de palitos de dente (toothpick)
esteacutereis e transferidas para o fundo de tubos de micro-centriacutefuga e para a superfiacutecie
do meio LB solidificado (com o antibioacutetico de seleccedilatildeo do plasmiacutedeo) para a obtenccedilatildeo
de uma reacuteplica das colocircnias que foram analisadas (placa-matildee) A cada um dos
43
tubos foram acrescentados 15 μl do tampatildeo de lise Os tubos foram incubados em
banho-maria a 65 degC por 10 min As amostras entatildeo foram analisadas por
eletroforese em gel de agarose 1 usando o plasmiacutedeo sem inserto como controle
Posteriormente o gel foi corado com brometo de etiacutedeo (05 μgml) por
aproximadamente 20 min lavado com aacutegua e analisado sob luz ultravioleta para em
seguida ser fotografado no sistema de fotodocumentaccedilatildeo L-Pix (Locus
Biotecnologia Brasil)
392 Teacutecnica de PCR de colocircnia
Depois de selecionadas as colocircnias foram transferidas para tubos de PCR
contendo os reagentes da PCR e os primers que hibridizam com regiotildees que
flanqueiam o fragmento de DNA clonado em um volume total de 10 microl As amostras
foram incubadas a 94 degC por 3 min e submetidas a 35 ciclos de PCR com as
seguintes etapas 94 degC por 30 s 55 degC por 30 s e 72 degC por 1 min finalizando com
uma etapa de extensatildeo a 72 degC por 10 min Os produtos amplificados foram
analisados em gel de agarose 1 Posteriormente o gel foi corado com brometo de
etiacutedeo (05 microgml) por aproximadamente 20 min lavado com aacutegua e analisado sob
luz ultravioleta O gel foi fotografado no sistema de foto-documentaccedilatildeo L-Pix (Locus
Biotecnologia Brasil)
310 Preparaccedilatildeo de plasmiacutedeo em pequena escala (miniprep)
Os clones recombinantes foram cultivados em 3 ml de meio LB contendo o
antibioacutetico apropriado durante 18 h As culturas foram entatildeo centrifugadas a 12000
x g por 1min a temperatura ambiente e os plasmiacutedeos recombinantes purificados
com o sistema de minipreparaccedilatildeo de plasmiacutedeo (Miniprep Qiagen Kit) (QIAGEN) de
acordo com as recomendaccedilotildees do fabricante
311 Expressatildeo da proteiacutena TcKAP7 em E coli
Para expressar a proteiacutena recombinante TcKAP7 E coli cepa
BL21(DE3)STAR transformada com o plasmiacutedeo pET28a contendo o gene TcKPA7
(pET28a-TcKAP7) foi cultivada em meio LB contendo 25 μgml do antibioacutetico
44
kanamicina a 37 ordmC sob agitaccedilatildeo (preacute-inoacuteculo) Apoacutes 18 horas de crescimento uma
diluiccedilatildeo (110) foi realizada em novos tubos contendo meio LB-kanamicina e a
cultura foi incubada por 1 h a 37 ordmC sob agitaccedilatildeo constante Apoacutes este periacuteodo 05
mM IPTG (isopropil-1-tio-β-D-galactopiranosideo) foi adicionado agraves culturas A
incubaccedilatildeo prosseguiu por mais 3 h nas mesmas condiccedilotildees Como controle negativo
as ceacutelulas tambeacutem foram cultivadas nas mesmas condiccedilotildees poreacutem sem a adiccedilatildeo de
IPTG (cultura natildeo induzida) Aliacutequotas das culturas induzidas e natildeo induzidas com
IPTG foram processadas para anaacutelise em SDS-PAGE
312 Purificaccedilatildeo da proteiacutena recombinante TcKAP7
3121 Processamento da amostra
As bacteacuterias apoacutes a expressatildeo de TcKAP7 foram sedimentadas por
centrifugaccedilatildeo e ressuspendidas em tampatildeo de lise e lisadas utilizando o
microfluidificador modelo M-110L (Microfluidics EUA) Este meacutetodo divide a amostra
em dois fluxos e os conduz sob alta pressatildeo gerada por uma vaacutelvula pneumaacutetica
para uma cacircmara de interaccedilatildeo tambeacutem chamada de aacuterea de choque Esta cacircmara
eacute formada por um sistema de micro-canais dentro de um bloco de ceracircmica Dentro
da cacircmara ocorre cavitaccedilatildeo sonicaccedilatildeo e impacto dos dois fluxos em que a amostra
foi dividida levando a lise das ceacutelulas bacterianas (FIGURA 9) Este processo
provoca o aumento da temperatura e todo o sistema de tubos que conduz a amostra
necessita ser refrigerado com gelo e aacutegua a 4degC para prevenir a precipitaccedilatildeo de
proteiacutenas soluacuteveis
45
FIGURA 9 - REPRESENTACcedilAtildeO ESQUEMAacuteTICA DO MICROFLUIDIFICADOR LEGENDA A suspensatildeo de bacteacuterias eacute dividida em dois fluxos que se chocam sob alta pressatildeo dentro de micro-canais presentes na cacircmara de interaccedilatildeo da vaacutelvula homogeneizadora Melhores resultados satildeo obtidos aumentando o nuacutemero de ciclos de passagens Seta preenchida direccedilatildeo da amostra Seta pontilhada repetindo o ciclo de passagem FONTE Modificado de MAA amp HSU 1999
Apoacutes a lise o extrato soluacutevel foi obtido apoacutes centrifugaccedilatildeo a 30000 x g por
30 min a 4 degC
3122 Cromatografia de afinidade
Por ser expressa fusionada a uma cauda de seis histidinas a proteiacutena
TcKAP7 pode ser separada dos extratos celulares a partir da utilizaccedilatildeo de resina de
niacutequel da qual posteriormente a proteiacutena seraacute eluiacuteda
A purificaccedilatildeo da proteiacutena TcKPA7 presente no sobrenadante foi realizada
em sistema FPLC (Fast Performance Liquid Chromatography ndash GE Healthcare) com
coluna HiTrap Chelating de 1 mL (GE Healthcare) A coluna foi carregada com
soluccedilatildeo NiSO4 100 mM e equilibrada com tampatildeo A para cromatografia de afinidade
Durante a purificaccedilatildeo foi utilizado um gradiente de 0-100 de tampatildeo B para
cromatografia de afinidade As fraccedilotildees provenientes da cromatografia foram
analisadas atraveacutes de SDS-PAGE
Suspensatildeo de bacteacuterias
Ceacutelulas lisadasBomba de
alta pressatildeo
Micro-canais
Vaacutelvula homogeneizadora
46
3123 Cromatografia de troca iocircnica
Para eliminar contaminantes remanescentes da cromatografia de afinidade
a amostra contendo a proteiacutena de interesse foi submetida a uma segunda etapa
cromatograacutefica cromatografia de troca iocircnica utilizando-se a coluna HiTraptrade SP (GE
Healthcare) no sistema de FPLC (GE Healthcare)
Primeiramente a amostra foi diluiacuteda para reduccedilatildeo da concentraccedilatildeo salina e
a coluna foi lavada com 2 volumes de tampatildeo B para cromatografia de troca iocircnica e
depois com 2 volumes de tampatildeo A utilizado na cromatografia de afinidade O
gradiente de passagem do tampatildeo B foi de 0 a 100 e a proteiacutena TcKAP7 foi
obtida na fraccedilatildeo de material natildeo ligado agrave resina (Flow-through) (FT)
3124 Cromatografia de gel filtraccedilatildeo
Amostras da cromatografia de troca iocircnica que continham a proteiacutena de
interesse foram concentradas atraveacutes de filtraccedilatildeo A soluccedilatildeo foi colocada em filtro
Amicon Ultra MWCO 10000 (Milipore) e centrifugada a 4000 rpm a 4 ordmC O
experimento foi realizado em sistema FPLC (GE Healthcare) com a coluna
Superdex 200 HR 1030 (GE Healthcare) em tampatildeo HEPES 20 mM pH 74 e de
cloreto de soacutedio100 mM
313 Espalhamento Dinacircmico de Luz ndash DLS
O experimento foi realizado em equipamento DynaPro Molecular instrument
a 4 ordmC As amostras foram previamente centrifugadas por 5 minutos a 15000 rpm a
4 ordmC A coleta de dados foi realizada com intervalos de 2 segundos com 100
aquisiccedilotildees Para cada leitura utilizou-se 5 microl de amostra proteica
314 Espectroscopia de dicroiacutesmo circular (CD)
O espectro de CD foi coletado usando espectropolariacutemetro Jasco J-715
(Jasco Corporation Toacutekio Japatildeo) sendo a temperatura mantida a 20 degC atraveacutes de
um Peltie rType Control System PFD425S (JASCO) Todos os dados foram
coletados usando cubeta de quartzo de 1 mm de caminho oacuteptico
47
Mediu-se a elipticidade em graus na regiatildeo do UV distante no intervalo de
comprimento de onda de 260 nm a 200 nm com uma velocidade de 100 nmmin
sendo feitas no total 30 leituras com resposta de 1 segundo em varredura contiacutenua
Os valores obtidos em miligraus foram convertidos para elipticidade molar
por resiacuteduo ([θ]MRW) em miligrauscm2dmol-1 que eacute definida pela equaccedilatildeo (Adler et
al 1973)
Onde θobs eacute a elipsidade observada em graus MRW eacute o peso molecular
meacutedio dos resiacuteduos da proteiacutena d eacute o caminho oacuteptico da cubeta em centiacutemetros e c
eacute a concentraccedilatildeo da proteiacutena em mgmL O MRW eacute calculado dividindo-se o peso
molecular da proteiacutena pelo nuacutemero de resiacuteduos
315 Quantificaccedilatildeo e concentraccedilatildeo
As amostras obtidas a partir da purificaccedilatildeo tiveram a concentraccedilatildeo calculada
utillizando a absorbacircncia mensurada pelo aparelho NanoDrop (Thermo Fisher
Scientific) levando-se em consideraccedilatildeo o coeficiente de extinccedilatildeo e teoacuterico da
proteiacutena obtido a partir do ProtParam (httpusexpasyorgtoolsprotparamhtml) e o
peso molecular da proteiacutena que eacute de cerca de 28 kDa
Obtidas as concentraccedilotildees a amostra foi concentrada pelo meacutetodo de
filtraccedilatildeo utilizando o filtro Amiconreg Ultra Centrifugal Filter (Millipore) com poro de
10000 Da A amostra foi centrifugada ateacute a obtenccedilatildeo de uma concentraccedilatildeo final de
5 mgml para os ensaios de cristalizaccedilatildeo Uma aliacutequota da proteiacutena concentrada foi
utilizada para anaacutelise por SDS-PAGE
316 Ensaios de Cristalizaccedilatildeo
Os ensaios de cristalizaccedilatildeo foram realizados empregando-se a teacutecnica de
difusatildeo de vapor em gota sentada utilizando-se os equipamentos disponiacuteveis no
Laboratoacuterio Robotizado de Cristalizaccedilatildeo de Proteiacutenas LNBio Os ensaios foram
feitos em placas de 96 poccedilos e as gotas preparadas pelo robocirc Honeybee
utilizando-se os kits disponiacuteveis no laboratoacuterio Crystal Screen HT (Hampton
Research) JCSG+ Suite (Molecular Dimensions) PACT Suite (Molecular
cd
MRWobs
10][
48
Dimensions) Precipitant Synergy (Rigaku Reagents) SaltRx HT (Hampton
Research) Wizard IampII (Rigaku Reagents)
317 Espalhamento de raio-X a baixo acircngulo (SAXS)
Atraveacutes da teacutecnica de SAXS informaccedilotildees sobre a massa molecular das
partiacuteculas espalhadoras e do raio de giro (Rg) da proteiacutena de estudo satildeo obtidos a
partir dos dados coletados Por meio de programas computacionais como DAMMIN
(SVERGUN1999) e GASBOR (SVERGUN et al 2001) um modelo de baixa
resoluccedilatildeo da forma da proteiacutena pode ser obtido
Os dados de SAXS foram obtidos na linha de luz D02A ndash SAXS2 no
Laboratoacuterio Nacional de Luz Siacutencrotron (LNLS) Campinas-SP Brasil usando
comprimento de onda de 148 A e um detector bidimensional com arranjo CCD
(MARCCD USA) de 165 mm A distacircncia do detector para a amostra foi de 106804
mm e os dados na faixa de 002 nm-1 para 021 nm-1 foram coletados usando
proteiacutena pura nas concentraccedilotildees de 5 mgml em tampatildeo em 20 mM HEPES pH 74
e 100 mM de cloreto de soacutedioExposiccedilotildees de 300 e 600 s foram realizadas e os
dados do tampatildeo foram coletados antes e depois dos dados da amostra para fazer a
correccedilatildeo do solvente e normalizaccedilatildeo do espalhamento
Ajuste dos dados experimentais e avaliaccedilatildeo da funccedilatildeo p(R) foram realizados
utilizando o programa GNOM (SVERGUN 1992) O envelope a baixa resoluccedilatildeo de
TcKAP7 foi determinado usando modelagem abnitio implementada no programa
DAMMIN O modelo a baixa resoluccedilatildeo e o modelo da estrutura tridimensional foram
superpostas usando o programa SUPCOMB (KOZIN amp SVERGUN 2001)
318 Modelagem de TcKAP7
Um modelo da estrutura tridimensional de TcKAP7 foi construiacutedo Para a
construccedilatildeo do modelo foi utilizado o programa MODELLER (SALI amp BLUNDELL
1993) este programa eacute utilizado para a modelagem por homologia a estruturas
tridimensionais de proteiacutenas O programa automaticamente constroacutei um modelo
baseado na anaacutelise de um alinhamento de sequecircncias entre a proteiacutena para a qual
se deseja construir o modelo e uma proteiacutena relacionada cuja estrutura
tridimensional jaacute foi resolvida A qualidade do modelo pode ser avaliada por
49
exemplo atraveacutes de graacuteficos e tabelas que analisam restriccedilotildees quiacutemicas e fiacutesicas de
cada aacutetomo constituinte do modelo
319 Obtenccedilatildeo de antissoro policlonal contra TcKAP7
A proteiacutena TcKPA7 recombinante purificada foi inoculada em camundongos
da linhagem BALBc por via intraperitonial com 4 aplicaccedilotildees de aproximadamente
20-50 μg de antiacutegeno em intervalos de 15 dias seguida de obtenccedilatildeo do soro apoacutes 1
semana da uacuteltima inoculaccedilatildeo O antiacutegeno foi emulsificado em adjuvante completo de
Freund na primeira inoculaccedilatildeo e com adjuvante a base de hidroacutexido de alumiacutenio
(Alu-Gel Serva) nas inoculaccedilotildees posteriores
320 Anaacutelise da expressatildeo do gene TcKAP7 e de seu mutante por ensaio tipo
western blot
Este procedimento foi executado segundo o meacutetodo de Towbin e
colaboradores (1979) Aliacutequotas de extratos de T cruzi equivalentes a 1 x 107
ceacutelulas foram submetidos agrave SDS-PAGE Apoacutes a separaccedilatildeo eletroforeacutetica as
proteiacutenas foram transferidas para membrana de nitrocelulose (Hybond C Amersham
Biosciences) em tampatildeo de western por 2 h a 60 V ou 20 V por 16 h Apoacutes a
transferecircncia a membrana foi corada com Ponceau S e descorada suavemente com
aacutegua bidestilada para a identificaccedilatildeo das bandas do marcador de massa molecular
A membrana foi entatildeo incubada em soluccedilatildeo de bloqueio por 30 min sob agitaccedilatildeo
suave
Apoacutes o bloqueio a membrana foi incubada com os soros policlonais ou
anticorpos monoclonais em TBST-leite por aproximadamente 1 h a 37degC A
membrana foi lavada 5 vezes com TBST Em seguida a membrana foi incubada
com anticorpo secundaacuterio anti-IgG de camundongo conjugado com a enzima
peroxidase (Pierce ndash Thermo Scientific) por 1h na diluiccedilatildeo de 16000 em TBST-leite
a temperatura ambiente A membrana foi submetida a mais cinco lavagens com
TBST e a reaccedilatildeo era evidenciada utilizando substrato quimioluminescente (West
Pico Pierce ndash ThermoScientific) sobre a membrana a qual era exposta a um filme
para raios-X (Hyperfilm ECL GE)
50
321 Superexpressatildeo de TcKAP7
3211 Amplificaccedilatildeo e clonagem do gene TcKAP7 no vetor pNEO3xFlag para
superexpressatildeo da proteiacutena
O gene TcKAP7 foi clonado no vetor pNEO3xFLAG construiacutedo no nosso
laboratoacuterio a partir do vetor pTcGW-ProtCcarboxi (BATISTA et al 2010) que utiliza
o sistema Gateway de clonagem (Invitrogen) Os vetores foram construiacutedos
utilizando-se como base o pBluescript II (Stratagene San Diego USA) onde foram
inseridas trecircs sequencias que codificam para regiotildees intergecircnicas (IR) de T cruzi A
primeira TcUIR eacute a regiatildeo intergecircnica do locus de ubiquitinacalmodulina de T
cruzi (BATISTA et al 2010) As outras duas regiotildees intergecircnicas ITR1 e ITR2 foram
selecionadas a partir de genes de copia uacutenica no genoma e que possuem um niacutevel
de expressatildeo constitutivo nos estaacutegios epimastigota e tripomastigota metaciclicos
avaliados por dados de proteocircmica e RNAseq (Comunicaccedilatildeo pessoal Michel
Batista) Aleacutem disso esse vetor confere agrave regiatildeo C-terminal da proteiacutena
recombinante resultante da clonagem neste vetor trecircs etiquetas FLAG (sequecircncia
DYKDDDDK) em tandem (FIGURA 10)
FIGURA 10 VETOR PARA EXPRESSAtildeO EM T CRUZI P3XFLAG
LEGENDA PR ndash PROMOTOR RIBOSOMAL TCUIR ITR1 E ITR2 - REGIOtildeES INTERGENICAS ATTR1 E ATTR2 ndash REGIOtildeES PARA RECOMBINACcedilAtildeO CMreg - RESISTEcircNCIA A CLORANFENICOL CCDB ndash GENE PARA SELECcedilAtildeO NEGATIVA DURANTE A CLONAGEM 3XFLAG ndash TREcircS ETIQUETAS DE FLAG (DYKDDDDK) NEOMICINA ndash GENE DE RESISTEcircNCIA A NEOMICINA
O gene TcKAP7 foi amplificado utilizando os primers especiacuteficos
KAP7GtwFor (5rsquo-
GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTGCCCGCGAAGTATTCAGCAGCCC)
e KAP7GtwRev (5rsquo-
GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCGTGGTACATGGCGTACGGGTTG)
PR TcUIR Att R1 Cmreg ccdB Att R2 3x Flag ITR1 Neomicina ITR2
51
os quais possuem os siacutetios attB indicados em negrito As condiccedilotildees desta reaccedilatildeo
de PCR foram as seguintes 100 ng de DNA genocircmico de T cruzi 10 pmol de cada
primer 200 μM de cada dNTP MgSO4 2 mM tampatildeo Taq DNA polimerase High
Fidelity 1x 1U de Platinum Taq DNA polimerase high fidelity (Invitrogen) A reaccedilatildeo
de PCR foi processada no termociclador modelo 9700 (AppliedBiosystems EUA)
com a desnaturaccedilatildeo do material por 5 min a 94 degC seguida de 35 ciclos constando
de desnaturaccedilatildeo a 94 degC por 30 s hibridizaccedilatildeo dos primers a 58 degC por 30 s e
extensatildeo a 72 degC por 15 min
O gene amplificado foi clonado no vetor de entrada pDONRtrade221
(Invitrogen) A reaccedilatildeo foi feita com 150 ng dos produtos de PCR contendo os siacutetios
attB 150 ng do plasmiacutedeo pDONRtrade221 1 μL de BP ClonaseTM enzyme mix e TE
para um volume final de 10 μL e com incubaccedilatildeo a 25 degC por 16 h Foi entatildeo
adicionado 1 microL de proteinase K (2 mgmL) com incubaccedilatildeo por 10 min a 37 degC Os
clones em pDONRtrade221 foram transformados em ceacutelulas caacutelcio-competentes E coli
DH5α conforme protocolo de transformaccedilatildeo de ceacutelulas caacutelcio-competentes Apoacutes
transformaccedilatildeo a cultura foi semeada em placa de LBKan (kanamicina 25 microgmL) e
incubada a 37 degC durante 16 h
Para verificar a presenccedila de clones com os insertos de interesse foi feita a
teacutecnica da palitagem As colocircnias selecionadas foram inoculadas em 5 mL de meio
LBKan e incubadas por 16 h a 37 degC com agitaccedilatildeo (190 rpm) A purificaccedilatildeo dos
plasmiacutedeos foi realizada com o kit QIAprepreg Spin Miniprep (Qiagen) conforme
orientaccedilotildees do fabricante
Apoacutes esta etapa foi necessaacuterio transferir os insertos para o vetor de destino
pNEO3xFlag A troca de insertos entre os vetores de entrada e destino denominada
de reaccedilatildeo LR foi realizada conforme orientaccedilotildees do fabricante (Gateway LR clonase
enzyme mix) e ceacutelulas caacutelcio-competentes foram transformadas com os produtos
das recombinaccedilotildees conforme descrito anteriormente semeadas em placas de
LBAmp e incubadas a 37 degC durante 16 h
A verificaccedilatildeo de clones positivos foi realizada atraveacutes de PCR de colocircnias
As colocircnias selecionadas foram inoculadas em 5 mL de meio LB contendo ampicilina
(100 μgmL) e incubada a 37deg C por 16 h sob agitaccedilatildeo (200 rpm)O plasmiacutedeo
contendo o gene TcKAP7 foi denominado de pNEO_KAP7_3xFLAG
52
3212 Transfecccedilatildeo por eletroporaccedilatildeo
A transfecccedilatildeo das formas epimastigotas de T cruzi foi feita pela teacutecnica de
eletroporaccedilatildeo utilizando o equipamento genepulserreg apparatus (Bio-Rad) e cubetas
esteacutereis de eletroporaccedilatildeo gene pulsermicro pulserreg 02 cm (Bio-Rad) Formas
epimastigotas de T cruzi foram cultivadas em meio LIT ateacute uma densidade celular
de 3 x 107 ceacutelulasml Um volume de cultura correspondendo a 1 x 109 parasitas foi
centrifugado (4000 x g 4 degC) O sobrenadante foi descartado e as ceacutelulas foram
ressuspendidas em tampatildeo de eletroporaccedilatildeo esteacuteril e submetidas a centrifugaccedilatildeo
nas condiccedilotildees acima O sedimento celular foi ressuspendido em 2 ml de tampatildeo de
eletroporaccedilatildeo Em cubetas de eletroporaccedilatildeo previamente resfriadas a 4 degC foram
misturados 400 μL (2 x 108 ceacutelulas) da suspensatildeo dos parasitas e 50 μL (20 microg) do
plasmiacutedeo para superexpressatildeo (pNEO_KAP7_3XFLAG) Em paralelo parasitas
foram submetidos agraves mesmas condiccedilotildees mas na ausecircncia de DNA (controle
negativo da transfecccedilatildeo)
As cubetas foram entatildeo mantidas em gelo por 10 min Em seguida os
parasitas foram transfectados com dois pulsos sequenciais de 500 μF e 450 volts
Apoacutes o esse procedimento as cubetas foram mantidas em gelo por mais 5 min A
suspensatildeo de parasitas transfectados foi entatildeo inoculada em 10 mL de meio LIT
suplementado com 10000 U de penicilina e estreptomicina a 10 μgmL
3213 Seleccedilatildeo dos transfectantes
O gene para a enzima neomicina fosfotransferase foi utilizado como
marcador de seleccedilatildeo dos parasitas carregando o plasmiacutedeo para a superexpressatildeo
pNEO_KAP7_3XFLAG Para tanto o antibioacutetico G418 foi adicionado agraves culturas
apoacutes 24 h da transfecccedilatildeo na concentraccedilatildeo final de 500 μgmL Entre 3 e 4 dias apoacutes
a transfecccedilatildeo foi realizada a primeira passagem (14) A partir desse ponto foram
feitas passagens semanais na proporccedilatildeo de 110 ateacute que natildeo fosse observado
crescimento nas duas uacuteltimas passagens da cultura do controle negativo da
transfecccedilatildeo
A expressatildeo da proteiacutena KAP7-FLAG foi analisada atraveacutes de ensaios de
western blot e imunofluorescecircncia
53
322 Deleccedilatildeo do gene TcKAP7 por nocaute gecircnico
3221 Amplificaccedilatildeo e clonagem das regiotildees a montante e a jusante do gene
TcKAP7
As regiotildees a montante (upstream) e a jusante (downstream) do gene TcKAP7
respectivamente denominadas de UPSKAP7 (521 pb) e DOWNKAP7 (500 pb)
foram amplificadas por PCR usando os primers descritos nas TABELAS 1 E 2 A
regiatildeo denominada DOWNKAP7 conteacutem ainda 139 pb do final da regiatildeo codante de
TcKAP7
QUADRO 1 - RELACcedilAtildeO DOS PRIMERS UTILIZADOS PARA A CLONAGEM DA
REGIAtildeO UPSTREAM DE TcKAP7 NO VETOR pNEO1
UPSKAP7F GGGGTCGACCGTTGCTGGTTTTTCTTTTGGTGT
UPSKAP7R GGGAAGCTTGCTTCAAAACGTCTATGCGGGC
Os siacutetios das enzimas de restriccedilatildeo SalI (GTCGAC) e HindIII (AAGCTT) adicionados aos primers estatildeo em negrito
QUADRO 2 - RELACcedilAtildeO DOS PRIMERS UTILIZADOS PARA A CLONAGEM DA
REGIAtildeO DOWNSTREAM DE TcKAP7 NO VETOR pNEO1
DOWNKAP7F GGGGAATTCGCCTCATATGACGCATCTCCCA
DOWNKAP7R GGGGGATCCTGTTGGCGCTGTCAAGGAAGTAAG
Os siacutetios das enzimas de restriccedilatildeo EcoRI (GAATTC) e BamHI (GGATCC) adicionados aos primers estatildeo em negrito
As reaccedilotildees de PCR foram realizadas nas seguintes condiccedilotildees 100 ng de
DNA total de T cruzi Dm28c 10 pmol dos oligonucleotiacutedeos F e R 200 μM de cada
dNTP MgCl2 15 mM tampatildeo Taq DNA polimerase 1x 25 unidades de Taq DNA
polimerase (Invitrogen EUA) A reaccedilatildeo de PCR foi processada no termociclador
modelo 9700 (Applied Biosystems EUA) nas seguintes condiccedilotildees Desnaturaccedilatildeo do
54
material por 4 min a 94 degC seguida de 35 ciclos de desnaturaccedilatildeo a 92 degC por 30 s
hibridizaccedilatildeo dos oligonucleotiacutedeos a 56 degC por 30 s e extensatildeo a 72 degC por 1 min O
material amplificado foi purificado usando o Qiaquick PCR Purification (Qiagen) O
DNA purificado foi digerido com enzimas de restriccedilatildeo apropriadas para a clonagem
dos fragmentos nos vetores pNEO1 O plasmiacutedeo resultante da clonagem das
regiotildees UPSKAP7 e DOWNKAP7 foi denominado de pNEO1kap7 (Figura 11A)
Uma vez que o genoma do T cruzi eacute diploide construiacutemos um segundo
plasmiacutedeo para o nocaute do segundo alelo do gene TcKAP7 tendo como marca de
seleccedilatildeo o gene que codifica resistecircncia a higromicina B Esse plasmiacutedeo foi
construiacutedo usando como molde o plasmiacutedeo pNEO1kap7 O plasmiacutedeo pNEO1kap7
foi digerido com HindIII para remoccedilatildeo do gene neo e uma pequena porccedilatildeo da regiatildeo
DOWNSTREAM (220 pb) O plasmiacutedeo linearizado foi purificado do gel de agarose
usando o kit Qiaquick PCR Purification (Qiagen) e ligado com o gene higro O gene
higro foi amplificado usando os primers HIGROF
(GGGGGAAGCTTATGAAAAAGCCTGAACTCACCGCGAC) e HIGROR
(GGGAAGCTTCTATTCCTTTGCCCTCGGACGAGTGCTG) ambos contendo na
extremidade 5rsquo o siacutetio para a enzima de restriccedilatildeo HindIII (em negrito) O plasmiacutedeo
resultante da ligaccedilatildeo foi denominado de pHIGRO1kap7 (FIGURA 11B)
55
FIGURA 11 ESQUEMA DA CONSTRUCcedilAtildeO DOS VETORES UTILIZADOS PARA O NOCAUTE DO GENE TcKAP7 LEGENDA Nesta figura eacute observada a inserccedilatildeo das sequecircncias flanqueadoras do gene TcKAP7 juntamente com os respectivos siacutetios para cada enzima de restriccedilatildeo nos vetores de clonagem pNEO1 e pHIGRO1
3222 Amplificaccedilatildeo dos cassetes UPS-NEO-DOWN e UPS-HIGRO-DOWN para
transfecccedilatildeo de T cruzi
Os dois plasmiacutedeos recombinantes foram purificados pelo meacutetodo da lise
alcalina utilizando o kit de minipreparaccedilatildeo de plasmiacutedeos (Qiagen) As minipreps
foram utilizadas para a amplificaccedilatildeo da regiatildeo UPS-NEO-DOWN (cassete NEO) e da
regiatildeo UPS-HIGRO-DOWN (cassete HYG) por PCR usando os primers UPSKAP7F
e DOWNKAP7R As reaccedilotildees de PCR foram realizadas nas seguintes condiccedilotildees 20
ng do plasmiacutedeo pNEO1kap7 ou pHIGRO1kap7 10 pmol dos primers UPSKAP7F e
DOWNKAP7R 200 μM de cada dNTP MgCl2 15 mM tampatildeo Taq DNA polimerase
1x 25 unidades de Taq DNA polimerase (Invitrogen EUA) A reaccedilatildeo de PCR foi
processada no termociclador modelo 9700 (AppliedBiosystems EUA) nas seguintes
condiccedilotildees Desnaturaccedilatildeo do material por 4 min a 94 degC seguida de 35 ciclos de
desnaturaccedilatildeo a 92 degC por 30 s hibridizaccedilatildeo dos oligonucleotiacutedeos a 56 degC por 30 s e
56
extensatildeo a 68 degC por 2 min O material amplificado foi submetido agrave eletroforese em
gel preparativo de agarose 1 O gel foi corado com brometo de etiacutedeo (1 μgml) e a
banda correspondente a cada cassete foi removida do gel com auxiacutelio de uma
lacircmina de bisturi O DNA foi purificado por eletroeluiccedilatildeo dentro de saco de diaacutelise
nas condiccedilotildees de 100 V por 1 hora em tampatildeo TBE Para obter massa de DNA
suficiente para a transfecccedilatildeo (20 μg) foram feitas 10 reaccedilotildees de PCR com 100 μl
cada uma
3223 Transfecccedilatildeo do T cruzi com o cassete UPS-NEO-DOWN
Formas epimastigotas de T cruzi foram cultivadas em meio LIT ateacute 2 x 107
ceacutelulasml Os parasitas (1 x 108 ceacutelulas) foram coletados por centrifugaccedilatildeo a 6000
x g por 10 min a 4 degC O sedimento celular foi lavado com PBS esteacuteril e
ressuspendido em 1 ml de soluccedilatildeo de eletroporaccedilatildeo Volumes correspondentes a
04 ml da suspensatildeo de ceacutelulas foram transferidos para cubetas de eletroporaccedilatildeo
esteacutereis (02 cm de gap) (BioRad) e preacute-resfriadas Em uma delas foram adicionados
de 20 μg do fragmento representando o cassete NEO A outra cubeta contendo
apenas a suspensatildeo de parasitas foi usada como controle Apoacutes 10 minutos no gelo
as amostras contidas nas cubetas foram submetidas a 2 pulsos de 450 volts 500
microF utilizando o eletroporadorGenePulserreg IIApparatus (Bio-Rad) As amostras
foram incubadas novamente por 5 a 10 minutos no gelo em seguida foram
transferidas para garrafas de cultura de 25 cm2 contendo 10 ml de meio LIT
(suplementado com 10000 U de penicilina e estreptomicina a 10 mgml) As culturas
foram entatildeo incubadas a 28 degC Apoacutes 24 horas de incubaccedilatildeo adicionou-se o
antibioacutetico G418 na concentraccedilatildeo de 500 μgml As culturas foram mantidas por
sucessivas passagens (diluiccedilatildeo de 110) em meio LIT suplementado com G418 a
cada 8-10 dias ateacute a ausecircncia de proliferaccedilatildeo celular na cultura controle Os
parasitas nos quais TcKAP7 foi substituiacutedo pelo gene neo foram denominados deT
cruzi(kap7kap7neo) e foram testados para a correta inserccedilatildeo do gene neo no locus
genocircmico de TcKAP7
57
3224 Extraccedilatildeo de DNA dos transfectantes
T cruzi transfectado com o cassete NEO (T cruzi(kap7kap7neo) foi cultivado
em meio LIT suplementado com G418 (500 μgml) ateacute uma densidade de 3 x 107
ceacutelulasml Os parasitas foram coletados por centrifugaccedilatildeo por 1 min a 6000 x g e
lavados com PBS Em seguida os parasitas foram lisados gentilmente em 350 μl de
tampatildeo TELT conforme descrito no item 34
3225 Anaacutelise por PCR do DNA dos parasitas transfectados com o cassete
UPS-NEO-DOWN
As reaccedilotildees de PCR foram realizadas utilizando primers externos EXTF
(CCCGCTACGACTGCCCTCCACGCGGAAGGGAA) e EXTR
(AAGTAAACGGGAGAAGCAACACGATGGGAGGCTC) que natildeo estatildeo presentes na
construccedilatildeo do cassete UPS-NEO-DOWN combinados com os primers NEOF
(GGGGAAGCTTATGATTGAACAAGATGGATTGCACGCAG) e NEOR
(GGGGGAATTCAGAAGAACTCGTCAAGAAGGCGATAGAA)
As condiccedilotildees das reaccedilotildees foram as seguintes 100 ng do DNA total de T
cruzi Dm28c tipo selvagem (T cruzi(kap7kap7) ou tipo selvagem) ou do DNA da
populaccedilatildeo T cruzi(kap7kap7neo) (mutante simples nocaute) 10 pmol dos primers EXTF
+ NEOR e NEOF + EXTR 200 μM de cada dNTP MgCl2 15 mM tampatildeo Taq DNA
polimerase 1x 25 unidades de Taq DNA polimerase (Invitrogen EUA) A reaccedilatildeo de
PCR foi processada no termociclador modelo 9700 (AppliedBiosystems EUA) nas
seguintes condiccedilotildees Desnaturaccedilatildeo do material por 4 min a 94 degC seguida de 35
ciclos de desnaturaccedilatildeo a 92 degC por 30 s hibridizaccedilatildeo dos oligonucleotiacutedeos a 55 degC
por 30 s e extensatildeo a 72 degC por 2 min
3226 Transfecccedilatildeo do T cruzi com o cassete UPS-HIGRO-DOWN
Formas epimastigotas da populaccedilatildeo mutante de T cruzi (kap7kap7neo) foram
cultivadas em meio LIT suplementado com G418 (500 μgml) ateacute a densidade de 2 x
107 ceacutelulasml Os parasitas (1 x 108 ceacutelulas) foram coletados por centrifugaccedilatildeo a
6000 x g por 10 min a 4 degC e submetidos ao processo de eletroporaccedilatildeo como
descrito no item 3202 Para a transfecccedilatildeo foram usados 20 μg do fragmento
58
representando o cassete UPS-HIGRO-DOWN As culturas (transfectada e controle)
foram entatildeo incubadas a 28 degC em LIT suplementado de G418 Apoacutes 24 horas de
incubaccedilatildeo foi adicionado o antibioacutetico higromicina ao meio de cultura na
concentraccedilatildeo de 500 μgml As culturas foram mantidas por sucessivas passagens
(diluiccedilatildeo de 110) em meio LIT suplementado com G418 e higromicina a cada 8-10
dias ateacute a ausecircncia de proliferaccedilatildeo celular na cultura controle Mutantes nos quais
os dois alelos de TcKAP7 foram removidos e substituiacutedos pelos genes NEO e
HIGRO foram denominados com genoacutetipo T cruzi (kap7neokap7higro)
3227 Anaacutelise por PCR do DNA dos parasitas transfectados com o cassete
UPS-HIGRO-DOWN
As reaccedilotildees de PCR foram realizadas utilizando primers externos EXTF e
EXTR (item 3225) combinados com os primers HIGROF e HIGROR (item 3221)
As reaccedilotildees de PCR foram realizadas nas seguintes condiccedilotildees 100 ng do
DNA total de T cruzi(kap7kap7) ou do DNA do T cruzi(kap7neokap7higro) 10 pmol dos
primers EXTF + HIGROR e HIGROF + EXTR 200 μM de cada dNTP MgCl2 15
mM tampatildeo Taq DNA polimerase 1x 25 unidades de Taq DNA polimerase
(Invitrogen EUA) A reaccedilatildeo de PCR foi processada no termociclador modelo 9700
(Applied Biosystems EUA) nas seguintes condiccedilotildees Desnaturaccedilatildeo do material por
4 min a 94 degC seguida de 35 ciclos de desnaturaccedilatildeo a 92 degC por 30 s hibridizaccedilatildeo
dos oligonucleotiacutedeos a 55 degC por 30 s e extensatildeo a 72 degC por 2 min
3228 Anaacutelise da organizaccedilatildeo do gene TcKAP7 e da eficiecircncia de seu nocaute
atraveacutes de ensaio do tipo Southern blot
O DNA genocircmico (5 μg) de T cruzikap7kap7 e T cruzikap7neokap7higro foi
submetido a digestatildeo com a enzima de restriccedilatildeo HindIII de acordo com as
especificaccedilotildees do fornecedor Apoacutes 3 horas o DNA digerido foi submetido agrave
eletroforese em gel de agarose 08 em tampatildeo TBE a 100 V O gel foi corado por
brometo de etiacutedio (05 μgmL) e fotografado sob a luz ultravioleta (310 nm)
Posteriormente o gel foi tratado com soluccedilotildees de depurinaccedilatildeo por 15 minutos de
desnaturaccedilatildeo por 30 minutos (2 vezes) e soluccedilatildeo de neutralizaccedilatildeo por 30 minutos (2
vezes) O DNA foi transferido para uma membrana de nylon (Hybond N
59
AmershamBiosciences) por capilaridade (SAMBROOK et al 1989) utilizando-se de
uma ldquoponterdquo de papel 3 MM embebido em SSC 20X Apoacutes a transferecircncia o DNA foi
fixado agrave membrana por exposiccedilatildeo agrave luz ultravioleta com uma dose de 120 mJcm2
usando o aparelho Spectrolinker (Spectronicscorp USA) A membrana contendo o
DNA de T cruzi foi preacute-hibridizada em soluccedilatildeo de hibridizaccedilatildeo de DNA por 1 hora a
65 ordmC seguido da adiccedilatildeo da sonda marcada radioativamente com α-[P32
]-dCTP (10
μCiμl 3000 Cimmol) (Amersham Biosciences) preparada segundo meacutetodo de nick
translation descrito por Rigbyet al (1977) utilizando-se o meacutetodo de iniciaccedilatildeo por
random primers (Megaprimer DNA labeling kit ndash GE) conforme recomendaccedilotildees do
fabricante
Foram utilizadas 3 sondas satildeo elas fragmento do gene TcKAP7
correspondendo a regiatildeo compreendida entre os nucleotiacutedeos 1 e 560 o gene neo e
o gene higro Apoacutes a marcaccedilatildeo as sondas foram purificadas em colunas de
Sephadex G-50 (ProbeQuant ndash Amersham Biosciences) e adicionadas ao tampatildeo de
hibridizaccedilatildeo na concentraccedilatildeo de 5 x 106
cpmml As membranas foram incubadas
por 16 horas a 65 C e em seguida lavadas nesta temperatura duas vezes por 30
minutos com soluccedilotildees de alta meacutedia e baixa estringecircncia As membranas foram
expostas a filme de raio-X (Hyperfilmreg Amersham Biosciences) na presenccedila de tela
intensificadora (Dupont Cronex Lightining Plus) por tempo que varia entre 1 a 3 dias
a ndash70 C
323 Localizaccedilatildeo celular da proteiacutena TcKAP7 atraveacutes de ensaio de
imunofluorescecircncia
Formas epimastigotas de T cruzi foram coletadas por centrifugaccedilatildeo (4000 times
g 3 a 10 ordmC) lavadas duas vezes em PBS e depositadas sobre lacircminas de vidro
previamente tratadas com poli-L-lisina 001 diluiacuteda em PBS Os parasitas foram
entatildeo fixados com paraformaldeiacutedo 4 em PBS permeabilizados com Triton X-100
01 em PBS por 2 min agrave temperatura ambiente e incubados a 4ordmC durante 16 h
em soluccedilatildeo de bloqueio para imunofluorescecircncia (PBS 1X + BSA 1 ) Apoacutes o
bloqueio os parasitas foram incubados agrave temperatura ambiente por 1 h com o
anticorpo monoclonal anti-FLAG em uma diluiccedilatildeo de 11000 em soluccedilatildeo de bloqueio
para imunofluorescecircncia Depois disso as lacircminas foram submetidas a 5 lavagens
60
de 5 min cada em PBS Em seguida os parasitas foram incubados agrave temperatura
ambiente por 1 hora com o anticorpo secundaacuterio anti-IgG de camundongo conjugado
ao fluoroacuteforo Alexa Fluacuteor 488 (Invitrogen) diluiacutedo 1600 em soluccedilatildeo de bloqueio As
lacircminas foram lavadas 5 vezes com PBS e posteriormente incubadas com o corante
Hoechst 33342 (Invitrogen) a 2 μgμL em PBS por 5 min Apoacutes cinco lavagens com
PBS as lacircminas foram montadas com ProLong Gold Antifade (Invitrogen) sobre uma
lacircmina de microscopia oacutetica O material foi observado nos microscoacutepios Leica SP5 e
DMI6000
324 Anaacutelise da ultraestrutura do cinetoplasto do mutante de T cruzi para
TcKAP7 por microscopia eletrocircnica de transmissatildeo
Os parasitas foram coletados lavados com PBS e fixados em soluccedilatildeo
contendo 25 de glutaraldeiacutedo 4 de paraformaldeiacutedo e tampatildeo cacodilato 01 M
Em seguida os parasitas foram fixados por 1 h em soluccedilatildeo de 1 de tetroacutexido de
Oacutesmio e 08 de ferricianeto de potaacutessio diluiacutedos em tampatildeo cacodilato 01 M As
ceacutelulas foram entatildeo desidratadas em soluccedilatildeo contendo concentraccedilotildees crescentes
de acetona e incluiacutedas em Epon Apoacutes a obtenccedilatildeo de cortes ultrafinos dos parasitas
os mesmos foram contrastados em acetato de uranila e citrato de Chumbo antes de
serem observados e fotografados no microscoacutepio eletrocircnico de transmissatildeo Zeiss
900
325 Coloraccedilatildeo dos parasitas transfectados
A coloraccedilatildeo dos parasitas foi realizada pelo meacutetodo panoacutetico raacutepido
(Laborclin Pinhais Paranaacute Brasil) modificado
Formas epimastigotas do mutante de T cruzi para TcKAP7 foram cultivadas
como descrito no item 321 Os parasitas foram coletados por centrifugaccedilatildeo de 1
min a 4000 x g e ressuspensos em PBS Desta suspensatildeo uma gota foi retirada e
depositada sobre lacircminas previamente limpas Quando secas as lacircminas foram
imersas individualmente na Soluccedilatildeo 1 (Fixador) Soluccedilatildeo 2 (Revelador) e Soluccedilatildeo 3
(Corante) em cada uma por 30 s Apoacutes este processo as lacircminas foram lavadas em
aacutegua corrente secas agrave temperatura ambiente e cobertas com Permount e lamiacutenula
Os parasitas foram visualizados em microscoacutepio Nikon E600
61
326 Infecccedilatildeo de ceacutelulas Vero com o mutante de T cruzi para TcKAP7
Ceacutelulas Vero (ATCCreg Nuacutemero CRL-2783trade) foram cultivadas em garrafas
de 150 cm2 contendo meio RPMI suplementado com 5 de soro fetal bovino
(GIBCO) penicilina 100 UIml streptomicina 10 microgml e glutamina 2 mM a 37 o C
com 5 de CO2 Ao atingirem a confluecircncia (80 a 100) realizou-se a passagem
atraveacutes de tripsinizaccedilatildeo e foi feito um inoacuteculo de 1 x 107 ceacutelulas para cada nova
garrafa de 150 cm2 Apoacutes 24 horas estas ceacutelulas (50 ndash 70 de confluecircncia) foram
infectadas com formas metaciacuteclicas obtidas da diferenciaccedilatildeo do mutante de T cruzi
para TcKAP7 em microplacas de 24 poccedilos contendo lamiacutenulas de vidro com
diacircmetro de 13 mm A cada poccedilo foram adicionadas 2 x 104 ceacutelulas Vero Apoacutes 24
horas de cultivo as ceacutelulas foram infectadas com tripomastigotas metaciacuteclicos
(obtidos do sobrenadante das culturas de T cruzi diferenciados em meio TAU3AAG
sem purificaccedilatildeo na coluna de DEAE celulose) A infecccedilatildeo das ceacutelulas Vero foi
acompanhada diariamente por microscopia de contraste de fase
327 Anaacutelise da funccedilatildeo do gene TbKAP7 de Trypanosoma brucei atraveacutes de
ensaios de RNA de interferecircncia
Com o intuito de complementar os estudos da funccedilatildeo do gene TcKAP7 foi
utilizada a teacutecnica de RNA de interferecircncia O uso dessa metodologia compreende
uma abordagem alternativa agrave anaacutelise da funccedilatildeo gecircnica para genes ortoacutelogos deT
brucei por anaacutelises de RNAi uma vez que a maquinaria de RNAi em T cruzi eacute
inexistente (DA ROCHA et al 2003) Os resultados podem gerar evidecircncias que
estejam relacionadas agrave funcionalidade dos genes em T cruzi Esta abordagem foi
utilizada neste trabalho para auxiliar no estudo da funccedilatildeo do gene TcKAP7 a partir
do ortoacutelogo em T brucei ainda natildeo caracterizadoTbKAP7 Os ensaios de RNAi
foram realizados em T brucei cepa 29-13 (WIRTZ et al 1999) com sistema induzido
por tetraciclina utilizando o vetor p2T7-177 ilustrado na figura 12 Este vetor quando
transfectado no parasita integra-se aos minicromossomos do T brucei regiatildeo de
repeticcedilotildees 177 (FOLDYNOVA-TRANTIRKOVA et al 2005)
62
FIGURA 12 MAPA DO VETOR p2T7-177 UTILIZADO PARA ENSAIOS DE RNAi LEGENDA T7 prom Promotor de T7 RNA Polimerase induzido por tetraciclina T7 term Terminador de transcriccedilatildeo 177 Sequumlecircncia repetitiva de 177 pares de bases para alvo de inserccedilatildeo em minicromossomos BLEO gene de resistecircncia agrave fleomicina GFP Proteiacutena Green FluorescentProtein os siacutetios para as enzimas de restriccedilatildeo estatildeo indicados AmpR gene de resistecircncia agrave ampicilina (FONTE WICKSTEAD et al 2002)
As regiotildees do mRNA para alvos nos ensaios de RNAi foram escolhidas com
o auxiacutelio da ferramenta RNAit da base de dados do Trypanofan - Genocircmica
funcional de Tbrucei (httptrypanofanpathcamacuktrypanofanmain)
(REDMOND et al 2003) Essas regiotildees foram amplificadas por PCR usando como
molde o DNA total de T brucei (100 ngreaccedilatildeo) 10 pmol dos primers listados na
tabela 3 200 mM de cada dNTP 15 mM de MgCl2 tampatildeo Taq DNA polimerase 1x
63
(Invitrogen) e 25 unidades de Taq DNA polimerase (Invitrogen) A reaccedilatildeo foi
aquecida por 4 min a 94 degC e entatildeo submetida a 35 ciclos de desnaturaccedilatildeo a 94 degC
por 30 s anelamento a 55 degC por 30 s e extensatildeo a 72 degC por 1 min Os primers
utilizados apresentam siacutetio para as enzimas de restriccedilatildeo BamHI (F) ou HindIII (R)
Os produtos de PCR foram purificados por extraccedilatildeo com fenol-clorofoacutermio e
digeridos com as referentes enzimas
QUADRO 3 - RELACcedilAtildeO DOS PRIMERS UTILIZADOS PARA A AMPLIFICACcedilAtildeO DO
GENE TbKAP7
KAP7RNAiF
AAAGGATCCCTAACCTAACCTGCAGGGTCTCTCG
KAP7RNAiR
GCGAAGCTTTTGTTCCTTTACAAACGCCC
Os siacutetios das enzimas de restriccedilatildeo BamHI (GGATCC) e HindIII (AAGCTT) adicionados aos primers estatildeo em negrito
As clonagens foram confirmadas por PCR de colocircnia e os plasmiacutedeos foram
purificados pelo kit QIAprep Spin Miniprep (Qiagen) Apoacutes purificaccedilatildeo 10 μg dos
plasmiacutedeos foram linearizados com a enzima NotI conforme descrito pelo fabricante
O DNA foi precipitado e ressuspenso em 50 μl de meio de eletroporaccedilatildeo ZPFM para
transfecccedilatildeo do T brucei
Para cada transfecccedilatildeo foi utilizado um total de 4 x 107parasitas em fase logariacutetmica
de crescimento Os parasitas foram obtidos por centrifugaccedilatildeo (5000 x g por 10 min
a 4 degC) lavados em meio ZPFM e ressuspensos em 500 μl do mesmo meio A
transfecccedilatildeo foi feita em cubetas de eletroporaccedilatildeo (4 mm) usando o eletroporador da
BioRad (GenePulser II Electroporator) As condiccedilotildees utilizadas foram dois pulsos de
1600 V e 25 microF Os parasitas foram entatildeo transferidos para garrafas contendo meio
SDM-79 SFB 10 higromicina 50 μgml e G418 15 μgml A seleccedilatildeo dos parasitas
transfectados foi atraveacutes da adiccedilatildeo de 5μgmL de fleomicina resistecircncia conferida
pelo vetor p2T7-177 apoacutes 24 horas de cultivo O tempo para seleccedilatildeo foi entre duas
e trecircs semanas
64
3271 Induccedilatildeo do RNA dupla fita
A induccedilatildeo da expressatildeo de RNA dupla fita referente agrave porccedilatildeo do gene
TbKAP7 clonado no plasmiacutedeo p2T7-177 deu-se pela adiccedilatildeo de tetraciclina 2 μgml
a uma cultura transfectada de T brucei em fase de crescimento exponencial (~2 x
106 parasitasml) Nos dias que se seguiram 1μgml de tetraciclina foi adicionada
diariamente agraves culturas A observaccedilatildeo dos efeitos na curva de crescimento causada
por RNAi em T brucei foi realizada ao longo de uma semana com a contagem de
ceacutelulas e adiccedilatildeo diaacuteria de tetraciclina 1 μgml
65
4 RESULTADOS
41 Clonagem e caracterizaccedilatildeo do gene TcKAP7
A regiatildeo codificante do gene TcKAP7 (ID Tc00104705350871950) foi
obtida a partir do banco de dados do genoma do T cruzi disponiacutevel no portal da
internet wwwgenedborg e amplificada por PCR com os primers descritos no item
37
No genoma do T cruzi cepa CL Brener (EL-SAYED et al 2005) foram
identificados dois haploacutetipos do gene TcKAP7 que foram denominados neste
trabalho de haploacutetipo A (Tc00104705350871950) e haploacutetipo B
(Tc00104705350979320) Neste trabalho foi utilizado o gene TcKAP7 proveniente
da cepa Dm28c de T cruzi Este gene apresenta uma regiatildeo codante de 747 pb e
codifica uma proteiacutena de 276 kDa assumindo que o primeiro ATG apoacutes a sequecircncia
do mini-eacutexon seja usada na iniciaccedilatildeo da traduccedilatildeo
A figura 13 abaixo mostra o alinhamento de TcKAP7 das cepas CL Brener e
Dm28c
FIGURA 13 - COMPARACcedilAtildeO ENTRE AS SEQUumlEcircNCIAS DE AMINOAacuteCIDOS DEDUZIDAS DO GENE KAP7 DE T cruzi Dm28C E DOS HAPLOacuteTIPOS DE CL BRENER
LEGENDA As posiccedilotildees com aminoaacutecidos idecircnticos em todas as sequumlecircncias estatildeo coloridas em preto
66
Embora o gene TcKAP7 natildeo possua grande identidade com os com genes
ortoacutelogos em Trypanosoma brucei TbKAP7 (714 pb) (Tb106k151470) Leishmania
major LmKAP7 (1044 pb) (LMJF_36_5840) Leishmania infantum LiKAP7 (1044 pb)
(LINJ_36_6090) e Leishmania braziliensis LbKAP7 (1038 pb) (LBRM_35_0010)
cujos genomas tambeacutem foram sequumlenciados (BERRIMAN et al 2005 IVENS et al
2005 PEACOCK et al 2007) as sequecircncias de aminoaacutecidos das respectivas
proteiacutenas deduzidas a partir desses genes ainda compartilham certo grau de
similaridade entre si (FIGURA 14) Na tabela 4 pode-se visualizar o percentual de
identidade entre as proteiacutenas KAP7 dos tripanossomatiacutedeos que possuem o genoma
sequenciado
FIGURA 14 COMPARACcedilAtildeO ENTRE AS SEQUumlEcircNCIAS DE AMINOAacuteCIDOS DEDUZIDAS DO GENE KAP7 EM DIFERENTES TRIPANOSOMATIacuteDEOS LEGENDA Em preto encontram-se os resiacuteduos de aminoaacutecidos idecircnticos em todas as sequumlecircncias e em cinza os resiacuteduos conservados na maioria delas
67
QUADRO 4 - PERCENTUAL DE IDENTIDADE ENTRE AS PROTEIacuteNAS KAP7 NOS
TRIPANOSSOMATIacuteDEOS COM O GENOMA SEQUENCIADO
Os valores foram obtidos pelo alinhamento utilizando a ferramenta Clustal21
Mesmo apresentando pouca identidade e variaccedilatildeo de tamanho alguns
dados do genoma sugerem que esses genes satildeo ortoacutelogos entre si Pode-se
perceber uma sintenia entre seus loci nas vaacuterias espeacutecies de tripanosomatiacutedeos
(Cavalcanti et al 2009) (FIGURA 15)
FIGURA 15- SINTENIA DE TcKAP7 COM OUTROS TRIPANOSOMATIacuteDEOS LEGENDA Os dois contigs de TcKAP7 (TcA e TcB) estatildeo representados nesta figura juntamente com os contigs de outros tripanosomatiacutedeos (Tb= T brucei Lm= L major Li= L infantum e Lb= L brasiliensis) mostrando que KAP7 representado pela cor amarela apresenta uma sintenia entre seus loci em todas as espeacutecies mostradas sendo flanqueado pelo gene KAP4 em T cruzi e T brucei representado em azul Portanto em L majorL infantum eL brasiliensis ao lado direito de KAP7 estaacute o gene de uma proteiacutena hipoteacutetica representado pela cor vermelha e ao lado esquerdo encontra-se o gene da KAP4 representado em azul como mencionado anteriormente FONTE CAVALCANTI et al 2009
68
A expressatildeo de vaacuterios genes mitocondriais de C fasciculata e L major eacute
regulada durante o ciclo celular em parte por uma sequumlecircncia consenso
[(CA)AUAGAA(GA)] presente nas regiotildees 5rsquo e 3rsquo-UTR dos respectivos mRNAs
(BROWN amp RAY 1997 MAHMOOD et al 1999 MAHMOOD amp RAY 1998 PASION
et al 1996 ZICK et al 2005)
Assim resolvemos caracterizar a regiatildeo 5rsquo-UTR do transcrito TcKAP7 na
tentativa de identificar sinais com identidade com aqueles encontrados em C
fasciculata Na figura 16 estaacute representada a regiatildeo 5rsquo-UTR do transcrito TcKAP7
com a sequumlecircncia parcial do mini-exon proveniente do primer usado na teacutecnica de
RT-PCR bem como parte da regiatildeo codificante do gene O mini-exon estaacute situado a
129 bases a jusante do iniacutecio da regiatildeo codificante do transcrito TcKAP7 e define
portanto uma regiatildeo 5rsquo-UTR de 168 bases considerando que o tamanho do mini-
exon eacute de 39 bases A anaacutelise da regiatildeo 5rsquo-UTR mostrou um elemento com
caracteriacutesticas muito semelhantes aquele envolvido na regulaccedilatildeo de genes em C
fasciculata (sequencia (G)ATAGAA(G) mostrada no retacircngulo preto na FIGURA
16B) sugerindo que TcKAP7 seja regulada durante o ciclo celular
69
A
B
FIGURA 16 CARACTERIZACcedilAtildeO DA REGIAtildeO 5rsquo-UTR DO TRANSCRITO TcKAP7 LEGENDA A Esquema geral da localizaccedilatildeo do mini-exon de TcKAP7 e B Localizaccedilatildeo especiacutefica do mini-exon de TcKAP7 O mini-exon de TcKAP7 (sequecircncia parcial em verde) estaacute localizado a 129 pb da regiatildeo codante (representada em parte pela cor azul) A regiatildeo 5rsquoUTR do transcrito Tckap7 estaacute representada na cor rosa A possiacutevel sequencia consenso de regulaccedilatildeo durante o ciclo celular estaacute indicada no retacircngulo preto
42 Expressatildeo da proteiacutena TcKAP7 em T cruzi
Formas epimastigotas foram transfectadas com o plasmiacutedeo pNEO3XFLAG
contendo o gene TcKAP7 (pNEO_KAP7_3xFLAG) A expressatildeo da proteiacutena
TcKAP7-FLAG foi analisada por ensaio de western blot Os resultados mostraram
que a expressatildeo da proteiacutena TcKAP7-FLAG foi satisfatoacuteria correspondendo ao
tamanho esperado (FIGURA 17 ) a qual foi confirmada pela reatividade do anticorpo
monoclonal especiacutefico para as etiquetas FLAG (anti-FLAG)
70
FIGURA 17 ANAacuteLISE DA EXPRESSAtildeO DA PROTEIacuteNA DE FUSAtildeO TCKAP7-FLAG EM FORMAS EPIMASTIGOTAS DE T CRUZI
43 Localizaccedilatildeo celular de TcKAP7 atraveacutes de ensaio de imunofluorescecircncia
Para verificar a localizaccedilatildeo celular de TcKAP7 foi realizado o ensaio de
imunofluorescecircncia Como natildeo foi possiacutevel a obtenccedilatildeo do anticorpo com alto tiacutetulo
contra a proteiacutena recombinante TcKAP7 neste ensaio foi utilizado o anticorpo
monoclonal anti-FLAG que reconhece a etiqueta FLAG a qual estaacute fusionada a
proteiacutena TcKAP7
Nessa figura pode-se observar que a proteiacutena de fusatildeo acumula-se na regiatildeo
dos poacutelos do cinetoplasto das formas epimastigotas do T cruzi (FIGURA 18)
indicando que TcKAP7 uma proteiacutena tipo histona H1 estaacute realmente associada com
o kDNA do parasita
71
FIGURA 18 IMUNOLOCALIZACcedilAtildeO DE TcKAP7 EM EPIMASTIGOTAS DE T CRUZI LEGENDAA contraste interferencial diferencial (DIC) B Hoechst marcando o nuacutecleo e o
cinetoplasto C fluorescecircncia mostrando a localizaccedilatildeo de TcKAP7 mais intensa na regiatildeo dos poacutelos
docinetoplasto dos protozoaacuterios D Aumento de C
44 Deleccedilatildeo do gene TcKAP7 por nocaute gecircnico
As teacutecnicas que permitem a remoccedilatildeo de um gene e sua substituiccedilatildeo por
genes repoacuterteres atraveacutes do processo de recombinaccedilatildeo tecircm sido usadas com
sucesso para verificaccedilatildeo da funccedilatildeo gecircnica em tripanosomatiacutedeos (MACRAE et al
2006) O nocaute gecircnico consiste na inserccedilatildeo de marcadores geneacuteticos de seleccedilatildeo
(gene codificando resistecircncia a neomicina ou higromicina entre outros) flanqueados
por sequumlecircncias pertencentes ao locus cromossocircmico de interesse Atraveacutes do
processo de recombinaccedilatildeo homoacuteloga o marcador pode entatildeo substituir o gene que
se quer estudar Desse modo pode ser possiacutevel analisar a funccedilatildeo de determinado
gene atraveacutes das alteraccedilotildees - decorrentes de sua ausecircncia - na fisiologia do
parasita No presente estudo os genes repoacuterteres que codificam resistecircncia aos
72
antibioacuteticos G418 e higromicina foram flanqueados por sequumlecircncias a montante e a
jusante da regiatildeo codificante do gene TcKAP7 As construccedilotildees foram usadas para
transfectarT cruzi e gerar mutantes para o gene TcKAP7 a fim de se estudar o
efeito que a ausecircncia do gene TcKAP7 causa no metabolismo do parasita
Apoacutes obtenccedilatildeo de uma populaccedilatildeo de T cruzi mutante para o gene TcKAP7
(kap7neokap7higro) resistente a ambos antibioacuteticos G418 e higromicina B o
DNA desta populaccedilatildeo foi extraiacutedo para anaacutelise por PCR e Southern blot a fim de
confirmar a eficiecircncia do nocaute
441 Anaacutelise por PCR do DNA dos parasitas transfectados com os cassetes
UPS-NEO-DOWN e UPS-HIGRO-DOWN
Foram realizadas vaacuterias reaccedilotildees de PCR a fim de confirmar a deleccedilatildeo do
gene TcKAP7 do genoma do T cruzi Dm28c e a substituiccedilatildeo dos seus alelos pelos
genes neo e higro As reaccedilotildees de PCR foram feitas com DNA de T cruzikap7kap7 (tipo
selvagem) e com DNA de T cruzikap7neokap7higro utilizando diversas combinaccedilotildees de
primers (TABELA 5) Na figura 32 observa-se que o gene TcKAP7 (747 pb) foi
amplificado somente na PCR realizada com DNA de T cruzi tipo selvagem (FIGURA
19 A canaleta 1) enquanto que os genes neo (795 pb) e higro (1026 pb) soacute foram
amplificados nas reaccedilotildees que conteacutem DNA da populaccedilatildeo do T cruzi kap7neokap7higro
(FIGURA 19 B canaletas 2 e 3) Os tamanhos esperados para amplificaccedilotildees usando
primers externos agraves construccedilotildees e os primers dos genes de resistecircncia foram
identificados no gel de agarose indicando que os cassetes se integraram
corretamente no locus do gene TcKAP7 (FIGURA 19 B canaletas 4 a 7) Um
esquema da localizaccedilatildeo dos primers utilizados nas reaccedilotildees de PCR pode ser
visualizado na figura 19 C
QUADRO 5 ndash COMBINACcedilOtildeES DE PRIMERS UTILIZADOS NA PCR PARA
CONFIRMAR O NOCAUTE DE TcKAP7
Pares de primers Tamanho esperado
(pb)
1 KAP7F + KAP7R 747
2 NEOF + NEOR 795
73
3 HIGROF + HIGROR 1026
4 EXTF + NEOR 1410
5 EXTF + HIGROR 1634
6 NEOF + EXTR 1358
7 HIGROF + EXTR 1360
74
FIGURA 19 ENSAIOS DE PCR UTILIZANDO DNA DE T cruzi kap7kap7 (WT) E
T cruzi kap7neokap7higro (NO) COM DIFERENTES PRIMERS
LEGENDA 1 KAP7F + KAP7R 2 NEOF + NEOR (795 pb) 3 HIGROF + HIGROR (1026 pb) 4
EXTF + NEOR (1410 pb) 5 EXTF + HIGROR (1634 pb) 6 NEOF + EXTR (1358 pb) e 7
HIGROF + EXTR (1360 pb) No quadro A encontram-se as PCRs realizadas com DNA de T cruzi kap7kap7 (WT) e no quadro B encontram-se as PCRs realizadas com DNA de T cruzi kap7neokap7higro
(NO) No quadro C estaacute um esquema da localizaccedilatildeo dos primers utilizados
442 Anaacutelise da organizaccedilatildeo dos genes TcKAP7 neo e higro por ensaio do
tipo Southern blot
Neste ensaio foi utilizado DNA total extraiacutedo de T cruzikap7kap7 (tipo selvagem)
e T cruzi kap7neokap7higro (duplo nocaute) Foram utilizadas trecircs sondas (1) Um
fragmento do gene TcKAP7 (primeiros 598 pb da CDS) (2) o gene neo e (3) o gene
higro O DNA total das duas amostras foi digerido com a enzima de restriccedilatildeo HindIII
O padratildeo de digestatildeo desta enzima pode ser visualizado na figura 20 De acordo
com o mapa de restriccedilatildeo a inserccedilatildeo do cassete neo no locus KAP7 geraria um
fragmento HindIIIHindIII de 1024 pb enquanto a inserccedilatildeo do cassete higro geraria
um fragmento de 1032 pb cujos tamanhos satildeo diferentes do fragmento
HindIIIHindIII do locus original (1776 pb) As hibridizaccedilotildees mostram bandas
compatiacuteveis com os tamanhos dos fragmentos HindIIIHindIII esperados para cada
situaccedilatildeo acima (FIGURA 21) Podemos observar que a sonda KAP7 somente
reconhece uma banda de tamanho esperado apenas no DNA do parasita selvagem
(canaleta 1 FIGURA 21) enquanto que bandas correspondentes aos genes neo e
higrosomente aparecem no DNA do mutante KAP7 (canaleta 2 FIGURA 21)
75
FIGURA 20 ndash REPRESENTACcedilAtildeO ESQUEMAacuteTICA DOS SIacuteTIOS DA ENZIMA HindIII NO LOCUS DO GENE KAP7 DE T cruzi CL Brener LEGENDA Este esquema representa esquematicamente em escala os genes kap3 neo e higro as regiotildees upstream e downstream e os siacutetios de clivagem da enzima KpnI
FIGURA 21 ANAacuteLISE DA ORGANIZACcedilAtildeO DOS GENES TCKAP7 NEO E HIGRO POR ENSAIO DO TIPO SOUTHERN BLOT LEGENDA A Autoradiograma e B Padrotildees dos fragmentos obtidos da digestatildeo do DNA com a enzima de restriccedilatildeo HindIII Foram utilizadas trecircs sondas TcKAP7 neomicina e higromicina 1) DNA de T cruzikap7kap7 (tipo selvagem) e 2) T cruzi kap7neokap7higro (duplo nocaute)
76
45 Comparaccedilatildeo da expressatildeo do gene TcKAP7 por western blot
O antisoro contra a proteiacutena TcKAP7 obtido apoacutes imunizaccedilatildeo dos
camundongos foi utilizado em ensaio do tipo western blot para avaliar se TcKAP7
ainda estava sendo expresso no T cruzi apoacutes o nocaute gecircnico
O que se observou foi novamente como esperado que a proteiacutena TcKAP7 natildeo eacute
mais expressa no T cruzi kap7neokap7higro (figura 22) Pode-se observar a presenccedila
de TcKAP7 ( aprox 28 kDa) no extrato das formas epimastigotas de T cruzi kap7kap7
(figura 22A) mas natildeo no extrato de epimastigotas de T cruzi
kap7neokap7higro (figura 22B)
FIGURA 22 COMPARACcedilAtildeO DA EXPRESSAtildeO DO GENE TcKAP7 POR WESTERN BLOT LEGENDA Imunoblot de extratos de epimastigotas de T cruzi kap7kap7 (A) e de T cruzi kap7neokap7higro (B) reagidos com anti-TcKAP7
46 Anaacutelise da morfologia e da ultraestrutura do cinetoplasto do mutante de T
cruzi para TcKAP7
Sabendo-se que TcKAP7 estaacute associada ao cinetoplasto e pode estar
envolvida na compactaccedilatildeo do kDNA do T cruzi como foi mostrado para as KAPs de
Crithidia fasciculata (XU amp RAY 1993 XU et al 1996 HINES amp RAY 1998) sua
ausecircncia poderia levar a alteraccedilatildeo na estrutura do DNA mitocondrial dos parasitas
nocauteados Portanto o primeiro passo foi verificar se havia alteraccedilotildees na
77
morforlogia do parasita Formas epimastigotas do mutante de T cruzi foram
analisadas ao microscoacutepio oacuteptico apoacutes coloraccedilatildeo Como pode ser observado na
figura 23 epimastigotas do mutante de T cruzi para TcKAP7 apresentam uma
morfologia fusiforme com o cinetoplasto caracteriacutestico em forma de barra localizado
anteriormente ao nuacutecleo natildeo se evidenciando portanto nenhuma alteraccedilatildeo em
relaccedilatildeo agrave morfologia dos parasitas do tipo selvagem
FIGURA 23 - COLORACcedilAtildeO PELO MEacuteTODO PANOacuteTICO RAacutePIDO DOS PARASITAS EPIMASTIGOTAS NOCAUTEADOS LEGENDA A) Formas epimastigotas B) Forma epimastigota em maior aumento
Formas epimastigotas de parasitas do tipo selvagem e nocauteados foram
entatildeo analisados pela teacutecnica de microscopia eletrocircnica de transmissatildeo para
visualizar com mais detalhe o cinetoplasto e verificar se sua estrutura estava
alterada pela ausecircncia da TcKAP7 (FIGURA 24) A figura 24A mostra um corte
ultrafino de um epimastigota de T cruzi do tipo selvagem que apresenta o
cinetoplasto compacto e em forma de bastatildeo caracteriacutestico de formas
epimastigotas sem nenhuma alteraccedilatildeo aparente O mesmo pode ser visto na figura
24B para o epimastigota de T cruzi nocauteado A disposiccedilatildeo estrutura e aspecto
do cinetoplasto de ambos os parasitas selvagem e nocauteado natildeo apresentaram
nenhuma diferenccedila entre si mostrando que mesmo apoacutes o nocaute da KAP7 a
estrutura do cinetoplasto permanece aparentemente inalterada
78
FIGURA 24 COMPARACcedilAtildeO ENTRE A ULTRAESTRUTURA DO CINETOPLASTO DO T cruzi DM28C TIPO SELVAGEM (A) E DO MUTANTE DE T cruzi PARA TcKAP7 (B) POR MICROSCOPIA ELETROcircNICA DE TRANSMISSAtildeO
79
47 Multiplicaccedilatildeo diferenciaccedilatildeo e infectividade do mutante de T cruzi para
TcKAP7
Os parasitas mutantes foram analisados a fim de verificar se alteraccedilotildees na
estrutura do kDNA pela ausecircncia de KAP7 natildeo estavam levando a alteraccedilotildees na
fisiologia do parasita alterando sua multiplicaccedilatildeo diferenciaccedilatildeo e infectividade
Inicialmente foi analisado o perfil da curva de crescimento das formas
epimastigotas Observou-se que natildeo havia diferenccedila na curva de crescimento dos
parasitas nocauteados em relaccedilatildeo ao parasita selvagem (FIGURA 25)
FIGURA 25 CURVA DE CRESCIMENTO DO MUTANTE DE T cruzi PARA TcKAP7 (KO) E DO T cruzi Dm28c SELVAGEM (WT)
LEGENDA Curva de crescimento do mutante de T cruzi para TcKAP7 () e do T cruzi Dm28c ()
Em seguida os parasitas nocauteados foram analisados quanto a sua capacidade
de diferenciaccedilatildeo em tripomastigotas metaciacuteclicos Foram realizadas contagens
diferenciais em cacircmara de Neubauer a partir do sobrenadante da metaciclogecircnese
a cada 24 h apoacutes a incubaccedilatildeo das ceacutelulas em meio TAU3AAG durante um periacuteodo
de 3 dias (72 h) A partir dessas contagens foram construiacutedos curva com a contagem
do nuacutemero de metaciacuteclicos ao longo dos trecircs dias (FIGURA 26)
Nenhuma alteraccedilatildeo foi observada quando os parasitas nocauteados foram
submetidos ao processo de metaciclogecircnese in vitro Ou seja pode-se afirmar que
80
mesmo apoacutes o nocaute do gene TcKAP7 as formas epimastigotas do parasita
conseguem se diferenciar em formas metaciacuteclicas
FIGURA 26 METACICLOGEcircNESE IN VITRO DE T cruzi Dm28c TIPO SELVAGEM E T cruzi NOCAUTEADO LEGENDA Metaciclogecircnese in vitro de T cruzi Dm28c tipo selvagem () e T cruzi nocauteado ()
Uma vez que os parasitas nocauteados foram capazes de se diferenciar de
epimastigota a tripomastigota metaciacuteclico resolveu-se investigar se estes eram
capazes de infectar ceacutelulas in vitro Foi possiacutevel perceber as formas amastigotas
dentro de ceacutelulas VERO em cultura mostrando que o parasita natildeo perdeu sua
capacidade de infecccedilatildeo (dados natildeo mostrados) Assim pode-se concluir que aleacutem
de sofrer diferenciaccedilatildeo os mutantes de T cruzi para KAP7 tambeacutem mantiveram sua
capacidade de infecccedilatildeo
48 Anaacutelise da funccedilatildeo do gene KAP7 de Trypanosoma brucei atraveacutes de
ensaios de RNA de interferecircncia
Para averiguar a importacircncia da proteiacutena TcKAP7 na biologia do parasita
recorremos a ensaios de RNA de interferecircncia (RNAi) jaacute que existe uma alta
similaridade entre TcKAP7 e seu ortoacutelogo em Trypanosoma brucei
81
A via de RNA de interferecircncia consiste em um mecanismo de silenciamento
gecircnico que para a ceacutelula funciona como sistema de defesa O mecanismo inicia-se
atraveacutes da expressatildeo de um RNA dupla fita (dsRNA) contendo uma sequecircncia
complementar ao gene de interesse Este dsRNA seraacute entatildeo clivado em pequenos
fragmentos de cerca de 22 a 25 nucleotiacutedeos atraveacutes da atividade de uma
ribonuclease do tipo III denominada Dicer Estes pequenos RNAs seratildeo
direcionados e permaneceratildeo unidos a um complexo proteico denominado RISC
(ldquoRNA-InducedSilencingComplexrdquo) Nesse complexo os pequenos RNAs de
interferecircncia (siRNA) ligam-se por complementaridade ao RNA mensageiro do gene
a ser inativado guiando-os para degradaccedilatildeo pelas nucleases presentes no
complexo impedindo a siacutentese da respectiva proteiacutena (ULLU et al 2002) O vetor
utilizado para promover o silenciamento do gene TbKAP7 foi o p2T7-177 Este
plasmiacutedeo integra-se aos minicromossomos do T brucei regiatildeo de repeticcedilotildees 177
(FOLDYNOVA-TRANTIRKOVA et al 2005) Este vetor apresenta dois promotores
de polimerase em oposiccedilatildeo induziacuteveis por tetraciclina flanqueando a sequumlecircncia de
interesse Desta forma satildeo geradas duas moleacuteculas de mRNA que pareadas
formam a moleacutecula de RNA fita dupla capaz de induzir a maquinaria de degradaccedilatildeo
A induccedilatildeo da inibiccedilatildeo de TbKAP7 atraveacutes de RNAi levou a uma diminuiccedilatildeo da
multiplicaccedilatildeo celular do parasita a partir do quarto dia do experimento (FIGURA 27)
Os resultados obtidos neste ensaio mostraram que a participaccedilatildeo da TbKAP7
no metabolismo do T brucei eacute essencial jaacute que o silenciamento do gene TbKAP7
levou agrave reduccedilatildeo da proliferaccedilatildeo celular do parasita
82
FIGURA 27 RNAi DE TbKAP7 INIBE O CRESCIMENTO DAS FORMAS PROCIacuteCLICAS DE T
brucei
LEGENDA Curva de crescimento de linhagem celular de RNAi de TbKAP7 em T brucei induzido por
tetraciclina As ceacutelulas foram diluiacutedas a uma densidade celular inicial de 1 X 106 ml na presenccedila e
ausecircncia de tetraciclina As densidades celulares foram determinadas pela contagem de ceacutelulas a
intervalos de 24 horas durante oito dias apoacutes iniacutecio de adiccedilatildeo de tetraciclina A linha com quadrados
mostra a curva de crescimento celular na presenccedila de tetraciclina (+TET) A linha com losangos
mostra a curva de crescimento celular na ausecircncia de tetraciclina (- TET)
49 Caracterizaccedilatildeo estrutural de TcKAP7
491 Produccedilatildeo recombinante de TcKAP7
O cultivo de E coli BL-21(DE3) STAR contendo o plasmiacutedeo pET28a-
TcKAP7 foi feito em meio LB a 37 oC com a induccedilatildeo da expressatildeo realizada a uma
densidade oacutetica de DO600 de 08 com a adiccedilatildeo de 05 mM de ITPG durante a noite a
37 oC
As ceacutelulas foram recuperadas por centrifugaccedilatildeo ressuspensas sonicadas e
centrifugadas para a purificaccedilatildeo de TcKAP7 atraveacutes da cromatografia de afinidade
em resina de Ni-NTA (Figura 28A) Foi possiacutevel obter grande quantidade de
83
amostra com grau de pureza alto como visualizado atraveacutes de anaacutelise por SDS-
PAGE (Figura 28B)
FIGURA28 PURIFICACcedilAtildeO DE TCKAP7 ATRAVEacuteS DE CROMATOGRAFIA DE AFINIDADE LEGENDA A) Cromatograma de afinidade B) SDS-PAGE da cromatografia de afinidade Os nuacutemeros agrave esquerda da figura representam os tamanhos das bandas do marcador de massa molecular (Benchmark) (Invitrogen) e P banda correspondente agrave TcKAP7 purificada Caixa em vermelho indica o pico que corresponde agrave fraccedilatildeo no SDS-PAGE
Devido agrave presenccedila de bandas com possiacuteveis contaminantes as fraccedilotildees que
continham a proteiacutena de interesse foram submetidas agrave purificaccedilatildeo por cromatografia
de troca iocircnica onde a purificaccedilatildeo eacute realizada baseada na afinidade por cargas
entre as proteiacutenas e a resina
Para esta purificaccedilatildeo utilizou-se a coluna SP Hitrap (GE Healthcare Life
Sciences) que eacute uma coluna de carga negativa Essa resina foi escolhida pois o pH
do tampatildeo em que se encontrava TcKAP7 era menor que o pI da proteiacutena Nessas
condiccedilotildees a carga superficial de TcKAP7 eacute positiva Para favorecer a interaccedilatildeo
TcKAP7 e resina foi feita uma diluiccedilatildeo de TcKAP7 para retirada de NaCl A eluiccedilatildeo
da proteiacutena foi realizada com um gradiente segmentado de tampatildeo B para
84
cromatografia de troca iocircnica TcKAP7 foi eluiacuteda com 68 do tampatildeo B (FIGURA
29)
FIGURA 29 PURIFICACcedilAtildeO DE TCKAP7 ATRAVEacuteS DE CROMATOGRAFIA DE TROCA IOcircNICA
LEGENDA A) Cromatografia de troca iocircnica B) SDS-PAGE da cromatografia de troca iocircnica Os nuacutemeros agrave esquerda da figura representam os tamanhos das bandas do marcador de massa molecular (Benchmark) (Invitrogen) e P banda correspondente agrave TcKAP7 purificada Caixa em vermelho indica o pico que corresponde agrave fraccedilatildeo no SDS-PAGE Curva em azul representa absorbacircncia em 280 nm Linha em verde indica concentraccedilatildeo de tampatildeo B para eluiccedilatildeo da amostra
410 Anaacutelise do estado oligomeacuterico de TcKAP7
A amostra purificada por troca iocircnica foi submetida agrave cromatografia de
exclusatildeo molecular tambeacutem chamada de gel filtraccedilatildeo que consiste na separaccedilatildeo
de biomoleacuteculas de acordo com seu tamanho e forma A coluna neste processo
conteacutem um poliacutemero com ligaccedilotildees cruzadas com poros de tamanho definido As
moleacuteculas maiores iratildeo migrar mais rapidamente que as menores pois natildeo satildeo
85
capazes de penetrar no interior dos poros da resina eluindo diretamente da coluna
As moleacuteculas menores por entrarem pelos poros da resina e levarem mais tempo
percorrendo os poros satildeo eluiacutedas mais tarde em relaccedilatildeo as que satildeo maiores
Ao comparar o volume de eluiccedilatildeo de TcKAP7 com o volume de eluiccedilatildeo de
proteiacutenas com massa molecular conhecidos (dados natildeo mostrados) foi possiacutevel
verificar que TcKAP7 parece ser um monocircmero em soluccedilatildeo Para confirmar esses
dados a mesma amostra foi submetida ao experimento de espalhamento dinacircmico
de luz (DLS)
O DLS eacute uma teacutecnica que se estima a distribuiccedilatildeo de tamanho das
populaccedilotildees de partiacuteculas que estatildeo presentes na amostra permitindo a detecccedilatildeo de
agregados proteicos ou de diferentes estados de oligomerizaccedilatildeo na amostra
indicando heterogeneidade Eacute importante ressaltar que para maiores chances de
sucesso em ensaios de cristalizaccedilatildeo a amostra deve encontrar-se monodispersa
Os dados de DLS mostram que 911 da massa de TcKAP7 analisada
apresenta um raio hidrodinacircmico (Rh) de 39 nm que representa uma massa
aparente de 29 kDa (FIGURA 30) Isto eacute condizente com um monocircmero cuja massa
teoacuterica seria de aproximadamente 28 kDa (incluindo a cauda de 6 histidinas) de
acordo com a prediccedilatildeo feita pelo servidor Expasy Protparam
(httpwebexpasyorgprotparam)A polidispersividade da amostra foi baixa
indicando que a mesma estava homogecircnea
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0 1 2 3 4 5 6 7
M
assa
Rh (nm)
fr80
fr82
fr84
fr85
86
FIGURA 30 ANAacuteLISE POR DLS DE TCKAP7 LEGENDA Anaacutelise por DLS de TcKAP7 contendo as fraccedilotildees obtidas na cromatografia de afinidade As fraccedilotildees 80 84 e 85 apresentam um raio hidrodinacircmico (Rh) de 39 nm
Aleacutem disso tambeacutem foram obtidas informaccedilotildees sobre o envelope de TcKAP7
a partir dos dados coletados atraveacutes da teacutecnica de SAXS mostrando que o raio de
giro (Rg) do envelope de TcKAP7 estaacute de acordo com o estimado por DLS (FIGURA
31)
FIGURA 31 ENVELOPE MOLECULAR DE SAXS
411 Anaacutelise do conteuacutedo de estrutura secundaacuteria de TcKAP7 recombinante
Atraveacutes da anaacutelise do espectro de dicroiacutesmo circular pode-se verificar o
conteuacutedo de estrutura secundaacuteria da proteiacutena e inferir enovelamento da proteiacutena
recombinante Os dados obtidos para a TcKAP7 revelaram a presenccedila de estruturas
α caracterizadas pelos miacutenimos pronunciados em 208 nm e 222 nm e de estruturas
coiled na amostra de TcKAP7 caracterizada pelos miacutenimos pronunciados em 205
nm (FIGURA 32) Este resultado estaacute de acordo a prediccedilatildeo de estrutura secundaacuteria
87
realizada pelo servidor PSIPRED (httpbioinfcsuclacukpsipred (FIGURA 33)
Esses resultados sugerem que a proteiacutena recombinante possui correto
enovelamento
FIGURA 32 ESPECTRO DE DICROIacuteSMO CIRCULAR DE TcKAP7
FIGURA 33 PREDICcedilAtildeO DE ESTRUTURA SECUNDAacuteRIA DE TcKAP7
412 Anaacutelise estrutural de TcKAP7
A fim de obter-se a estrutura tridimensional de TcKAP7 por cristalografia de
raios-X foram realizados ensaios de cristalizaccedilatildeoFoi possiacutevel observar a formaccedilatildeo
de um cristal em apenas uma condiccedilatildeo Imidazol 01 M Polietilenoglicol (PEG) 8000
10 wv e Acetato de caacutelcio 02 M
A visualizaccedilatildeo atraveacutes de luz ultra-violeta atraveacutes do equipamento Rock
Imager Fomulatrix permitiu identificaacute-lo como cristal de proteiacutena jaacute que este
diferencia-se de cristal de sal pela fluorescecircncia quando excitado em comprimento
de onda de 280 nm
-20
-18
-16
-14
-12
-10
-8
-6
-4
-2
0
2
200 210 220 230 240 250 260
Ɵ M
RV
x 1
03
(de
g cm
2d
mo
l-1)
Comprimento de onda (nm)
88
O perfil do cristal pode ser visualizado na figura 34 Esse cristal encontra-se
pequeno e mal-formado Aleacutem disso os meacutetodos para a determinaccedilatildeo estrutural de
uma estrutura ineacutedita (sem homologia com estruturas conhecidas) necessitam de
mais de um cristal Dessa forma foram realizados refinamentos dessas condiccedilotildees
iniciais visando aumentar q quantidade de cristais aumentar seu tamanho e
melhorar sua organizaccedilatildeo A concentraccedilatildeo de PEG (5 A 10) e do pH (6 a 9) com
intervalos de 1 unidade foram alterada Entretanto mesmo assim natildeo foi possiacutevel a
obtenccedilatildeo de cristais adequados para a difraccedilatildeo de raios X e novos refinamentos
seratildeo necessaacuterios
FIGURA 34 CRISTAL DE TcKAP7 DE T CRUZI LEGENDA AObtenccedilatildeo do cristal de TcKAP7 na condiccedilatildeo de Imidazol 01 M Polietilenoglicol (PEG) 8000 10 wv e Acetato de caacutelcio 02 M e B Cristal de TcKAP7 visto sob luz ultravioleta
Uma vez que natildeo foi possiacutevel durante o desenvolvimento desse projeto a
obtenccedilatildeo da estrutura cristalograacutefica de TcKAP7 procedeu-se com a construccedilatildeo de
seu modelo molecular
A modelagem molecular eacute uma ferramenta que permite a obtenccedilatildeo de
modelos da estrutura tridimensional de uma determinada proteiacutena com base em
homologia sequencial ou estrutural com proteiacutenas cujas estruturas tridimensional
foram experimentalmente resolvidas
Para a construccedilatildeo do modelo foi utilizado o programa MODELLER (SALI amp
BLUNDELL 1993) este programa eacute utilizado para a modelagem por homologia a
estruturas tridimensionais de proteiacutenas O programa automaticamente constroacutei um
modelo baseado na anaacutelise de um alinhamento de sequecircncias entre a proteiacutena para
a qual se deseja construir o modelo e uma proteiacutena relacionada cuja estrutura
tridimensional jaacute foi resolvida Nesse caso foram utilizadas estruturas de duas
A B
89
proteiacutenas como molde para a construccedilatildeo da estrutura de TcKAP7 A estrutura da
proteiacutena HMGB1(coacutedigo de acesso no banco de dados de proteiacutenas 2GZK)
(wwwpdborg) para a porccedilatildeo amino-terminal e a estrutura do fator A de transcriccedilatildeo
mitocondrial (coacutedigo de acesso 3TQ6) para a porccedilatildeo carboxi-terminal da proteiacutena
(FIGURA 35A) Duas proteiacutenas foram selecionadas para a construccedilatildeo do modelo de
TcKAP7 visto que a similaridade de sequencia entre TcKAP7 e proteiacutenas com
estruturas resolvidas eacute bastante baixo A similaridade sequencial de TcKAP7 e
proteiacutena HMGB1 eacute de 224 e entre TcKAP7 e o fator A de transcriccedilatildeo mitocondrial
eacute de 264 No entanto ambas proteiacutenas possuem alta similaridade em relaccedilatildeo agrave
estrutura secundaacuteria (mais de 90) Para aumentar a confiabilidade do modelo
utilizamos uma proteiacutena para construir a sequencia N-terminal de TcKAP7
(aminoaacutecidos 1-184) e outra para o C-terminal (aminoaacutecidos 185-248)
A qualidade do modelo pode ser avaliada por exemplo atraveacutes de graacuteficos e
tabelas que analisam restriccedilotildees quiacutemicas e fiacutesicas de cada aacutetomo constituinte do
modelo Neste trabalho foi utilizado o graacutefico de Ramachandran (FIGURA 35B) nele
pode-se visualizar todas as combinaccedilotildees possiacuteveis de acircngulos dieacutedricos Ψ (psi)
versus os Φ (phi) nos aminoaacutecidos de um polipeptiacutedeo e que contribuem para a
conformaccedilatildeo das estruturas das proteiacutenas (RAMACHANDRAN et al 1963) Dos 230
resiacuteduos apenas 5 estatildeo em regiotildees natildeo permitidas do graacutefico Esse eacute um
excelente valor pois eacute similar ao valor meacutedio encontrado para estruturas
experimentalmente determinadas com resoluccedilatildeo de no miacutenimo 20 Aring
(httpwwwebiacukthornton-srvdatabasesprofunc)
Tambeacutem eacute possiacutevel visualizar a topologia de TcKAP7 (FIGURA 35 C) que
mostra as regiotildees de α-heacutelices e regiotildees de coiled presentes na proteiacutena
corroborando com os dados obtidos na espectroscopia de dicroiacutesmo circular
90
FIGURA 35 ESTRUTURA DE TcKAP7 LEGENDA AModelo tridimensional de KAP7 B Graacutefico de Ramachandran e C Topologia de TcKAP7
A anaacutelise da superfiacutecie eletrostaacutetica de TcKAP7 mostra que existem regiotildees
ricas em aminoaacutecidos com cargas positivas que podem conferir afinidades agrave outras
proteiacutenas com carga carga superficial negativa ou mesmo aacutecidos nucleicos (FIGURA
36)
91
FIGURA 36 SUPERFIacuteCIE ELETROSTAacuteTICA DE TcKAP7 LEGENDA Visualizaccedilatildeo de diferentes regiotildees de TcKAP7 Vermelho potencial negativo Azul potencial positiva Branco Neutro
413 Investigaccedilatildeo de possiacuteveis funcionalidades baseadas na estrutura de
TcKAP7
4131 Prediccedilatildeo de funccedilatildeo paraTcKAP7
92
A prediccedilatildeo de funccedilatildeo para TcKAP7 foi realizada a partir do enovelamento de
proteiacutenas utilizando o servidor Profunc (httpwwwebiacukthornton-
srvdatabasesprofunc) O objetivo do servidor ProFunc eacute ajudar na identificaccedilatildeo de
uma possiacutevel funccedilatildeo bioquiacutemica de uma proteiacutena a partir da sua estrutura
tridimensional Ele utiliza uma seacuterie de meacutetodos incluindo comparaccedilatildeo de
enovelamento conservaccedilatildeo dos resiacuteduos e modelos 3D funcionais tanto para
identificar provaacuteveis siacutetios ativos da proteiacutena quanto possiacuteveis homoacutelogos no Protein
Data Bank (PDB) Neste procedimento tenta-se ajustar a estrutura da proteiacutena de
interesse aos tipos de enovelamentos de proteiacutenas conhecidas Atualmente mais de
1000 tipos jaacute foram registrados e depositados em bibliotecas de enovelamentos
Sabe-se que o alinhamento estrutural entre proteiacutenas consideradas de uma
mesma famiacutelia mesmo que seja apenas na regiatildeo do siacutetio ativo pode ser um
importante meacutetodo para se inferir a funccedilatildeo da sequecircncia em estudo (LASKOWSKI et
al 2003) A evoluccedilatildeo tende a conservar funccedilotildees que dependem mais diretamente
das estruturas 3D que das similaridades entre as sequecircncias de aminoaacutecidos das
proteiacutenas (SANCHEZ et al 2000)
Neste trabalho as quatro estruturas que possuem maior similaridade
estrutural com TcKAP7 estatildeo depositadas no Protein Data Bank (PDB) com os
coacutedigos 3TQ6 4NOD 3TMM 4NNU Todas as estruturas satildeo referentes agrave proteiacutena
TFAM (fator transcricional A mitocondrial)
As estruturas proteicas foram obtidas no banco de dados puacuteblicos de
proteiacutenas PDB (Protein Data Bank) e submetidas a um alinhamento estrutural com o
modelo de TcKAP7 (FIGURA 35A) no programa WinCoot Esse alinhamento pode
ser visualizado na figura 37 As regiotildees em vermelho representam as regiotildees de
TcKAP7 que apresentam interaccedilatildeo com DNA pois se alinham com as regiotildees de
ligaccedilatildeo agrave DNA das outras proteiacutenas e as regiotildees em azul representam regiotildees sem
homologia com as demais
Esse resultado sugere que TcKAP7 pode interagir com DNA com isso estes
dados podem ser utilizados para nortear mais estudos sobre a interaccedilatildeo das
proteiacutenas KAPrsquos com o DNA do cinetoplasto de T cruzi
93
FIGURA 37 ALINHAMENTO ESTRUTURAL DE 3TQ6 4NOD 3TTM 4NNU E TCKAP7 LEGENDA Em vermelho encontram-se as regiotildees de TcKAP7 que podem interagir com DNA (Resiacuteduos 1-67 e 140-166) e em azul regiotildees sem homologia com as demais
4132 Anaacutelises preliminares da possiacutevel interaccedilatildeo entre TcKAP7 e kDNA
As prediccedilotildees estruturais sugeriram que a proteiacutena TcKAP7 possui motivos
similares agrave proteiacutenas que interagem com DNA No entanto a sequecircncia de
aminoaacutecidos entre as proteiacutenas eacute bastante baixa Como a funccedilatildeo de TcKAP7
permanece obscura foram realizados alguns ensaios para tentar verificar a
possibilidade desta proteiacutena interagir com kDNA Para isto utilizou-se a teacutecnica de
dicroiacutesmo circular para avaliar se a presenccedila de kDNA poderia resultar em
alteraccedilotildees estruturais em TcKAP7 o que seria uma evidecircncia da possiacutevel interaccedilatildeo
entre esta proteiacutena e o aacutecido nucleico
Foram realizadas medidas de dicroiacutesmo circular com amostras de TcKAP7
kDNA e TcKAP7 na presenccedila de kDNA Para a anaacutelise de dados foi realizado o
somatoacuterio das curvas obtidas com as amostras de TcKAP7 e kDNA separadamente
Este somatoacuterio resultou em uma curva teoacuterica que indica o perfil teoacuterico de uma
amostra contendo TcKAP7 e kDNA sem interaccedilotildees presentes Aacute essa curva foi
sobreposta a curva experimental da medida de dicroiacutesmo circular de TcKAP7 na
94
presenccedila de kDNA A figura 38 ilustra essa sobreposiccedilatildeo onde pode-se verificar que
as curvas natildeo se sobrepotildeem portanto alteraccedilotildees estruturais ocorrem em TcKAP7
na presenccedila de kDNA
FIGURA 38 ESPECTRO DE DICROIacuteSMO CIRCULAR DE TcKAP7 LEGENDA Em azul encontra-se o espectro experimental de TcKap7 na presenccedila de DNA em vermelho o espectro teoacuterico de TcKAP7 e DNA
Para investigar mudanccedilas estruturais associadas a interaccedilatildeo com kDNA foi
realizada uma coleta de dados de SAXS na presenccedila de 1ug de kDNA
A comparaccedilatildeo dos modelos de baixa resoluccedilatildeo por SAXS indica uma
diferenccedila conformacional pontual da proteiacutena na presenccedila de kDNA As figuras 28 e
29 mostram os envelopes da proteiacutena TcKAP7na ausecircncia (FIGURAS 39A e 40A) e
presenccedila de kDNA de T cruzi (FIGURA 39B e FIGURA 40B) Percebe-se uma
diferenccedila de densidade eletrocircnica na regiatildeo da heacutelice (Residuos 140 - 166
evidenciados em vermelho) No envelope de TcKAP7 ela eacute bastante flexiacutevel e natildeo eacute
observada densidade eletrocircnica nessa regiatildeo no entanto na presenccedila de kDNA
essa mesma regiatildeo mostra-se mais riacutegida e eacute possiacutevel estimar seu posicionamento
baseado na densidade eletrocircnica Aleacutem disso essa heacutelice eacute predita como interatora
de DNA com base nas anaacutelises estruturais previamente realizadas nesse trabalho
Esses dados sugerem uma mudanccedila conformacional da proteiacutena na presenccedila
do kDNA fazendo com que esta mude seu arranjo estrutural para permanecer ligada
agrave moleacutecula de DNA sugerindo uma interaccedilatildeo entre TcKAP7 e DNA do cinetoplasto
-22
-17
-12
-7
-2
3
200 210 220 230 240 250 260
ϴM
RW
x 1
03
(de
g cm
-2 d
mo
l-1)
Comprimento de onda (nm)
Kap7+DNA
95
de T cruzi Esses dados corroboram com o que foi visto na superfiacutecie eletrostaacutetica
(FIGURA 36) e no alinhamento estrutural (FIGURA 37)
FIGURA 39 ENVELOPE MOLECULAR DETcKAP7 LEGENDA A Monocircmero de TcKAP7 ajustado ao envelope de SAXS B Monocircmero de TcKAP7 + kDNA ajustado ao envelope de SAXSResiduos 140- 166 evidenciados em vermelho
96
FIGURA 40 ENVELOPE MOLECULAR DE TcKAP7 VISTO EM DIFERENTES AcircNGULOS LEGENDA A Monocircmero de TcKAP7 ajustado ao envelope de SAXS B Monocircmero de TcKAP7 + kDNA ajustado ao envelope de SAXS Residuos 140- 166 evidenciados em vermelho
97
5 DISCUSSAtildeO
O Trypanosoma cruzi pertence a um grupo que divergiu muito cedo na
linhagem eucarioacutetica apresentando diversas caracteriacutesticas uacutenicas em relaccedilatildeo a
outros eucariotos Uma dessas caracteriacutesticas eacute a presenccedila de uma mitococircndria
uacutenica ramificada pelo corpo do protozoaacuterio contendo uma regiatildeo especializada o
cinetoplasto onde reside o DNA mitocondrial tambeacutem conhecido como kDNA O
kDNA eacute composto por uma rede de moleacuteculas interligadas entre si os maxiciacuterculos e
os miniciacuterculos (SHAPIRO amp ENGLUND 1995) Mais de 30 proteiacutenas envolvidas na
replicaccedilatildeo e na manutenccedilatildeo do kDNA jaacute foram identificadas e acredita-se que um
nuacutemero aproximado de 100 proteiacutenas muitas delas presentes apenas em
cinetoplastiacutedeos possam estar envolvidas nesses processos (LIU et al 2005) A
maioria dessas proteiacutenas foi identificada em T brucei e C fasciculata e
possivelmente vaacuterias delas principalmente aquelas envolvidas em replicaccedilatildeo
devem estar codificadas no genoma do T cruzi
Apesar de serem conhecidos muitos dos componentes da maquinaria de
replicaccedilatildeo dos miniciacuterculos e maxiciacuterculos natildeo se pode dizer o mesmo para as
proteiacutenas envolvidas na manutenccedilatildeo da estrutura do kDNA Com exceccedilatildeo de 4
proteiacutenas com caracteriacutesticas de histonas H1 (KAP1 a 4) encontradas associadas ao
cinetoplasto de C fasciculata pouco ainda eacute conhecido sobre as proteiacutenas que
participam da organizaccedilatildeo do kDNA em outros tripanosomatiacutedeos
Zavala-Castro e colaboradores (2002) identificaram sete proteiacutenas variando
de 19 a 31 kDa associadas ao kDNA de formas epimastigotas de T cruzi a partir
de kDNA extraiacutedo de ceacutelulas fixadas com formaldeiacutedo Os tamanhos observados satildeo
compatiacuteveis com aqueles das KAPs encontradas por Xu e Ray (1993) usando
experimento similar em C fasciculata entretanto nenhuma das possiacuteveis KAPs
descritas por Zavala-Castro e colaboradores foi caracterizada
Noacutes iniciamos estudos objetivando identificar proteiacutenas envolvidas na
organizaccedilatildeo e segregaccedilatildeo do kDNA de T cruzi a partir dos dados fornecidos pelo
sequenciamento do genoma desse parasita fazendo uma comparaccedilatildeo com as
KAPs de C fasciculata Estudos realizados por Cavalcanti e colaboradores (2009)
usando como modelo as sequecircncias de KAPs de C fasciculata identificaram 35
proteiacutenas relacionadas em diferentes tripanosomatiacutedeos cujos genomas estatildeo
sequenciados (11 em T cruzi 7 em L braziliensis 6 em L major e L infantum e 5
98
em T brucei) Essas sequecircncias puderam ser agrupadas em 7 tipos diferentes de
KAPs (KAP1 a 7) Das 7 KAPs T cruzi possui 5 (TcKAP3 a 7) cuja a sintenia
gecircnica eacute uma das caracteriacutesticas marcantes jaacute que alguns genes divergem em
relaccedilatildeo ao tamanho e portanto no tamanho da proteiacutena codificada As KAPs de T
cruzi e T brucei satildeo maiores do que as de C fasciculata e Leishmania spp Isso
pode sugerir que KAPs possam ter evoluiacutedo para um tamanho que comporte
basicamente suas funccedilotildees de associaccedilatildeo com o kDNA de maneira mais eficiente
Os resultados obtidos por Cavalcanti et al (2009) para TcKAP4 e TcKAP6
mostraram que em epimastigotas e amastigotas estas duas proteiacutenas estatildeo
distribuiacutedas ao longo de toda a rede de kDNA consistente com o que foi observado
em C fasciculata (XU et al 1996 HINES amp RAY 1998) poreacutem CfKAP4 tambeacutem
apresentou um padratildeo de marcaccedilatildeo nos poacutelos opostos do kDNA sugerindo que
essa KAP em particular se associe aos miniciacuterculos receacutem-replicados antes de sua
reintegraccedilatildeo agrave rede de kDNA (XU et al 1996) Contudo em tripomastigotas de T
cruzi estas duas proteiacutenas estatildeo distribuiacutedas na periferia da rede de kDNA
(CAVALCANTI et al 2009) indicando que diferente de C fasciculata elas
apresentam uma dinacircmica de associaccedilatildeo que depende da forma evolutiva do
parasita possivelmente refletindo distintas interaccedilotildees com proteiacutenas da rede de
kDNA em epimastigotas e tripomastigotas No presente trabalho ampliamos o
conhecimento sobre as KAPs de T cruzi estudando o papel da KAP7 na fisiologia
desse parasita
Em C fasciculata a regulaccedilatildeo da expressatildeo de vaacuterios genes que codificam
proteiacutenas mitocondriais ocorre durante o ciclo celular em parte por uma sequumlecircncia
consenso [(CA)AUAGAA(GA)] presente nas regiotildees 5rsquo e 3rsquo-UTR dos respectivos
mRNAs (BROWN amp RAY 1997 MAHMOOD et al 1999 MAHMOOD amp RAY 1998
PASION et al 1996) O mesmo foi observado para L major onde uma sequecircncia
parecida com aquela encontrada em C fasciculata (CATAGA) foi identificada nas
regiotildees 5rsquo e 3rsquo de vaacuterios genes cuja a expressatildeo era maior na fase S do ciclo celular
(ZICK et al 2005) Analisando as regiotildees 5rsquo e 3rsquo do transcrito do gene TOP2 de T
cruzi que codifica a topo II mitocondrial descrito por Fragoso e Goldenberg (1992)
tambeacutem podemos observar a sequecircncia CATAGA repetida duas vezes na regiatildeo
5rsquoUTR e uma vez na regiatildeo 3rsquo-UTR do transcrito desse gene
Como relatamos neste trabalho a sequecircncia da regiatildeo 5rsquo-UTR do transcrito
TcKAP7 natildeo mostrou nenhum elemento com as caracteriacutesticas daquele envolvido na
99
regulaccedilatildeo de genes expressos na fase S do ciclo celular de outros
tripanosomatiacutedeos
Em relaccedilatildeo agrave localizaccedilatildeo de TcKAP7 verificamos atraveacutes de ensaios de
imunofluorescecircncia a distribuiccedilatildeo de TcKAP7 na regiatildeo dos poacutelos da rede de kDNA
das formas epimastigotas de T cruzi poreacutem ainda natildeo analisamos como esta
proteiacutena estaacute distribuiacuteda nas formas tripomastigotas que possuem a rede de kDNA
com formato arredondado e menos compactada
A localizaccedilatildeo de KAP7 na regiatildeo dos poacutelos do cinetoplasto de T cruzi
sugere que ela tenha funccedilotildees na replicaccedilatildeo da rede de kDNA pois nessa regiatildeo
estatildeo concentradas diversas proteiacutenas necessaacuterias para finalizaccedilatildeo do processo de
replicaccedilatildeo de miniciacuterculos
Para a construccedilatildeo do modelo molecular de TcKAP7 foram utilizadas
estruturas de duas proteiacutenas a estrutura da proteiacutena HMGB1 (2GZK) para a porccedilatildeo
amino-terminal e a estrutura da proteiacutena fator A de transcriccedilatildeo mitocondrial (3TQ6)
para a porccedilatildeo carboxi-terminal da proteiacutena ambas apresentam alta similaridade em
relaccedilatildeo agrave estrutura secundaacuteria (mais de 90) e tratam-se de proteiacutenas de um
mesmo grupo HMG (High-mobility group) Em T brucei TbKAP6 uma proteiacutena do
grupo HMG estaacute envolvida na replicaccedilatildeo e manutenccedilatildeo do kDNA (WANG et al
2014) Baseado nesses dados juntamente com os dados da imunofluorescecircncia
indireta pode-se sugerir um papel de TcKAP7 na replicaccedilatildeo da rede de kDNA
Embora ainda natildeo saibamos como KAP7 se associa com o kDNA de T
cruzi eacute possiacutevel que isso ocorra de duas maneiras atraveacutes de ligaccedilotildees
eletrostaacuteticas natildeo-especiacuteficas ou de interaccedilotildees com regiotildees especiacuteficas dos
miniciacuterculos
Atraveacutes de ensaios de SAXS foi possiacutevel perceber que a proteiacutena sofre
alteraccedilotildees conformacionais na presenccedila do kDNA sugerindo sua interaccedilatildeo com
esse aacutecido nucleacuteico Esta interaccedilatildeo pode ser eletrostaacutetica uma vez que a anaacutelise da
superfiacutecie eletrostaacutetica de TcKAP7 mostrou a predominacircncia de regiotildees ricas em
aminoaacutecidos com cargas positivas que podem conferir afinidades agrave outras proteiacutenas
com carga superficial negativa ou mesmo aacutecidos nucleicos mais uma vez sugerindo
a interaccedilatildeo com kDNA
Poreacutem natildeo se pode descartar a possibilidade de que a interaccedilatildeo de TcKAP7
com o kDNA seja atraveacutes de interaccedilotildees com regiotildees especiacuteficas dos miniciacuterculos
Nos tripanosomatiacutedeos a rede de kDNA assume a forma de um disco achatado
100
perpendicular ao flagelo onde os miniciacuterculos estatildeo alinhados em fibrilas orientadas
paralelamente ao eixo do disco (LIU et al 2005) Acredita-se que a ordenaccedilatildeo e
compactaccedilatildeo dos miniciacuterculos estatildeo relacionadas agrave proacutepria estrutura da moleacutecula de
miniciacuterculo Os miniciacuterculos apresentam regiotildees ricas em A+T que podem causar
curvaturas na moleacutecula (MARINI et al 1984 NTAMBI et al 1984) facilitando sua
inserccedilatildeo de forma ordenada no disco de kDNA aleacutem disso possuem regiotildees
conservadas onde estatildeo localizadas as origens de replicaccedilatildeo Essas regiotildees por
sua vez podem ser reconhecidas por proteiacutenas tais como a KAP7 que ajudam a
estabilizar a estrutura Os resultados com C fasciculata mostram que KAP2 3 e 4 se
ligam em regiotildees especiacuteficas dos miniciacuterculos ricas em A+T mas que natildeo satildeo
aquelas que geram a curvatura das moleacuteculas (XU et al 1996) Contudo KAP1 se
liga de maneira inespeciacutefica aos miniciacuterculos (HINES amp RAY 1998) Aleacutem disso
existe a sequecircncia universal de miniciacuterculo (UMS) e as proteiacutenas que se ligam a
essa sequecircncia (UMSBP) as quais podem participar de interaccedilotildees com as KAPrsquos
Em C fasciculata CfKAP3 sozinha consegue condensar a rede de kDNA e inibir a
decatenaccedilatildeo pela enzima topo II Poreacutem a interaccedilatildeo entre CfKAP3 e CfUMSBP
pode descondensar a rede de kDNA e reestabelecer a decatenaccedilatildeo mediada pela
topo II indicando que as proteiacutenas KAPrsquos dos tripanosomatiacutedeos podem apresentar
diferentes funccedilotildees em diferentes espeacutecies (KAPELLER et al 2011)
Para investigar a importacircncia de TcKAP7 no T cruzi e seu envolvimento ou
natildeo com o rearranjo topoloacutegico do kDNA durante o processo de diferenciaccedilatildeo do
parasita realizamos a deleccedilatildeo do gene TcKAP7 Nenhuma alteraccedilatildeo estrutural ou
morfoloacutegica na rede de kDNA foi observada no mutante de T cruzi para TcKAP7 Do
mesmo modo o parasita mutante natildeo apresentou perfil de crescimento alterado e
foi capaz de se diferenciar nas formas tripomastigotas metaciacuteclicas e infectar ceacutelulas
VERO onde se diferenciaram em formas amastigotas O mesmo foi visto quando foi
realizado o nocaute do gene TcKAP3 (DE SOUZA et al 2010)
Uma das hipoacuteteses para explicar esse fato eacute que alguma outra KAP de T
cruzi possa estar assumindo o papel da TcKAP7 talvez a TcKAP4 que se localiza
nos poacutelos do cinetoplasto quando da inserccedilatildeo dos miniciacuterculos na rede apoacutes serem
replicados na regiatildeo cinetoflagelar A redundacircncia no papel das KAPs faz com que a
rede de kDNA seja compactada e segregada corretamente mesmo na ausecircncia de
uma delas (DE SOUZA et al 2010) Sabe-se que o nocaute do gene Cfkap2 ou do
gene Cfkap3 separadamente natildeo mostrou nenhuma alteraccedilatildeo no fenoacutetipo de C
101
fasciculata Poreacutem a deleccedilatildeo de ambos os genes causou diversas alteraccedilotildees
aumento nos niacuteveis de mRNAs mitocondriais reduccedilatildeo na respiraccedilatildeo inibiccedilatildeo da
divisatildeo celular e acuacutemulo de ceacutelulas com morfologias anormais (AVLIYAKULOV et
al 2004)
Com o intuito de complementar os estudos para a caracterizaccedilatildeo do gene
TcKAP7 foram realizados ensaios de RNA de interferecircncia visando analisar a
funccedilatildeo do gene TbKAP7 ortoacutelogo em T brucei jaacute que a maquinaria de RNAi em T
cruzi eacute inexistente (DA ROCHA et al 2003) Com isso foi visto que a participaccedilatildeo da
TbKAP7 no metabolismo do T brucei eacute essencial jaacute que o silenciamento do gene
TbKAP7 levou agrave reduccedilatildeo da proliferaccedilatildeo celular do parasita corroborando com os
dados encontrados para TbKAP6 (WANG et al 2014)
Esperamos que o conhecimento das diversas moleacuteculas envolvidas na
organizaccedilatildeo e replicaccedilatildeo da rede de kDNA assim como o entendimento dos
mecanismos fisioloacutegicos que ocorrem nesta estrutura tatildeo peculiar que eacute o
cinetoplasto dos tripanosomatiacutedeos possam nos ajudar a esclarecer vaacuterios aspectos
relacionados a biologia destes eucariotos primitivos e a evoluccedilatildeo do genoma
mitocondrial ao longo do processo evolutivo
102
6 CONCLUSOtildeES
Com base nos resultados observados neste trabalho foi possiacutevel concluir
1 ndash A proteiacutena TcKAP7 eacute uma proteiacutena associada ao cinetoplasto de T
cruzi e possui caracteriacutesticas que a identificam como KAPs do tipo histona H1
incluindo seu tamanho e sua composiccedilatildeo de aminoaacutecidos e sua superfiacutecie
eletrostaacutetica
2 ndash TcKAP7 estaacute localizada nos poacutelos do cinetoplasto de T cruzi podendo
estar envolvida na replicaccedilatildeo dos miniciacuterculos
3 - TcKAP7 sofre mudanccedilas conformacionais na presenccedila do kDNA de T
cruzi evidenciando sua interaccedilatildeo com o aacutecido nucleico
4 ndash O mutante de T cruzi para TcKAP7 natildeo apresentou alteraccedilatildeo na
estrutura do cinetoplasto e na morfologia do parasita
5 ndash A proliferaccedilatildeo e a diferenciaccedilatildeo do T cruzi natildeo foram alteradas quando
o parasita teve o gene TcKAP7 deletado do genoma
6 ndash O silenciamento do gene TbKAP7 eacute essencial no metabolismo do T
brucei levando agrave reduccedilatildeo da proliferaccedilatildeo celular do parasita
103
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Ao meu Mozatildeo Meu marido Meu melhor amigo Meu companheiro para o
que der e vier E agora papaizote da nossa Anjinha
Obrigada por me apoiar sempre Me dar forccedilas broncas conselhos de tudo
um pouco Obrigada por fazer a nossa bebezotinha entender a ausecircncia da
mama quando vaacuterias noites vocecirc tinha que fazer ela dormir para eu poder ir no
lab ou ficar escrevendo Sem vocecirc eu natildeo conseguiria vitinha Obrigada
por estar aqui Sempre Tannnnnntoooooo
Agrave vocecircs pentelhos
O que seria de mim sem vocecircs
Vocecircs satildeo minha fortaleza meu porto seguro sempre posso contar com vocecircs
pra tudo tudo mesmo Obrigada pelos conselhos pelas broncas por
nunca me deixar desistir mesmo nos momentos mais difiacuteceis vocecircs sempre
tinham uma palavra que me confortava me encorajava e me fazia seguir em
frente Sem a ajuda de vocecircs esse trabalho natildeo ficaria pronto nunca
Amo vocecircs
AGRADECIMENTOS
Agrave Deus em primeiro lugar por me dar sauacutede vitalidade e acircnimo sempre
E por sempre estar comigo
Ao Dr Stenio Perdigatildeo Fragoso pela orientaccedilatildeo confianccedila dedicaccedilatildeo e
amizade Afinal satildeo 12 anos hein chefe Como vocecirc ainda me aguenta Obrigada
por tudo aprendi e continuo aprendendo muito com vocecirc
Agrave Dra Tatiana Arruda Campos Brasil que me ajudou desde o primeiro
momento em que eu entrei no Laboratoacuterio de Proteiacutenas com seu jeito meigo e
atencioso e com sua experiecircncia me mostrou um mundo novo por qual eu me
apaixonei Sempre com muita paciecircncia me explicava tudo tim tim por tim tim e me
ajudou muuuito na escrita da tese Obrigada Tati
Agrave Dra Lia Medeiros que me ajudou muito com as microscopias Fizemos ateacute
o sacrifiacutecio de ir visualizar uma MET na UFSC em Floripa que chato neacute Brigadatildeo
Lia pela paciecircncia e boa vontade
Ao Dr Paulo Carvalho e a Dra Juliane Fischer que me ajudaram em
experimentos e anaacutelises que nem entraram na tese Sempre muito atenciosos
Obrigada
Aos meus queridos amigos do LAB2 Aqueles que jaacute se foram (Andreacute
Aleatoacuterio Lari Mauriacutecio Baacuterbara Odineacuteia Paacute ) e aqueles que estatildeo laacute ateacute hoje
(Didi Gi Vanessa Felipe Aline Claudinha) Obrigada por fazerem o trabalho ficar
mais divertido Aos meus companheiros de doc Mocircnica e Fernando o trio parada
dura passou por muita coisa junto e tem muita histoacuteria pra contar Obrigada gente
adoro vocecircs
Agraves minhas queridas amigas mais ldquoexperientesrdquo que moram no meu coraccedilatildeo
Aldinha e Dani obrigada por todos os momentos que passamos juntas no lab e fora
do lab obrigada pela a ajuda que sempre me deram sem esperar nada em troca
vocecircs sabem que seus conselhos sempre foram muito valiosos pra mim Obrigada
amigas vocecircs satildeo iacutempares
Agrave minha querida irmatildezinha Rocirc que nasceu no mesmo dia soacute que eacute mais
velha hahahahaha Obrigada amiga por tudo por todo esse tempo pelos
experimentos pelas confissotildees pelas gargalhadas Vocecirc eacute uacutenica
Agrave Pri Hira Mari Serpeloni Haruo Daisy Vanessa que sempre me ajudavam
quando eu precisava ou fazer um experimento ou jogar conversa fora
Aos meus amigos doutores atleticanos Michel e Henrique que me ajudaram
em vaacuterios experimentos e anaacutelises Obrigada por estarem sempre dispostos em
ajudar Vocecircs satildeo atleticanos mas satildeo gente boa Obrigada
Ao Giovany pela imensa ajuda com os camundongos sempre disposto em
ajudar e ensinar
Ao Nilson Silvio Tacircnia Sibelli por toda a ajuda pela amizade e pela
paciecircncia e competecircncia Ah e pelas histoacuterias de terror
Agrave Maria Cristina por toda a ajuda natildeo soacute na parte administrativa e pela
amizade
Ao Dr Marco Krieger pela confianccedila e por me proporcionar suporte
financeiro quando entrei no periacuteodo de prorrogaccedilatildeo
A todos os amigos e pesquisadores do Instituto Carlos Chagas dos demais
laboratoacuterios Lab REG Lab Genocircmica Laboratoacuterio de Biologia Celular por terem de
um jeito ou de outro participado do processo Eacute difiacutecil agradecer todo mundo
Valeu galera
ldquoTenho a impressatildeo de ter sido uma crianccedila brincando agrave
beira-mar divertindo-me em descobrir uma pedrinha
mais lisa ou uma concha mais bonita que as outras
enquanto o imenso oceano da verdade continua
misterioso diante de meus olhosrdquo
(Isaac Newton)
RESUMO
O DNA do cinetoplasto (kDNA) dos tripanosomatiacutedeos consiste numa rede de
moleacuteculas circulares catenadas entre si os miniciacuterculos e os maxiciacuterculos Os
miniciacuterculos codificam RNAs guias (gRNAs) e os maxiciacuterculos codificam para
algumas subunidades de enzimas mitocondriais e rRNA em um padratildeo
criptografado (ediccedilatildeo de RNA) Estudos com o tripanosomatiacutedeo Crithidia fasciculata
mostraram que proteiacutenas do tipo histona H1 associadas ao cinetoplasto (KAPs) satildeo
capazes de condensar a rede de kDNA Poreacutem pouco eacute conhecido sobre estas
proteiacutenas de Trypanosoma cruzi um protozoaacuterio parasita que sofre alteraccedilotildees na
estrutura do DNA do cinetoplasto ao longo de seu ciclo de vida Neste trabalho foi
caracterizada uma proteiacutena associada ao cinetoplasto de T cruzi denominada de
TcKAP7 que possui baixo peso molecular e natureza baacutesica condizente com um
papel na neutralizaccedilatildeo de carga e na condensaccedilatildeo do DNA Atraveacutes de ensaios
usando a teacutecnica de espalhamento de raios-X a baixo acircngulo (SAXS) foi possiacutevel
perceber que a proteiacutena TcKAP7 sofre mudanccedilas estruturais na presenccedila do kDNA
sugerindo uma interaccedilatildeo com essa estrutura seja atraveacutes de ligaccedilotildees eletrostaacuteticas
ou atraveacutes de ligaccedilotildees especiacuteficas com moleacuteculas presentes na rede A anaacutelise pela
teacutecnica de imunofluorescecircncia mostrou que proteiacutena TcKAP7 estaacute localizada na
regiatildeo dos poacutelos do cinetoplasto o que sugere que pode estar envolvida na
finalizaccedilatildeo da replicaccedilatildeo dos miniciacuterculos Mutante nulo para TcKAP7 foi gerado por
teacutecnicas de substituiccedilatildeo gecircnica a fim de verificar se na ausecircncia de TcKAP7
ocorriam alteraccedilotildees na estrutura do kDNA Contudo os parasitas mutantes para
TcKAP7 natildeo apresentavam alteraccedilotildees na estrutura e morfologia do cinetoplasto
quando analisados por microscopia eletrocircnica e foram capazes de se diferenciar
sem perder a capacidade infectiva Entretanto ensaios de RNA de interferecircncia
visando analisar a funccedilatildeo do gene TbKAP7 ortoacutelogo em T brucei levou agrave reduccedilatildeo
da proliferaccedilatildeo celular das formas prociacuteclicas desse parasita mostrando que este
gene eacute essencial para o metabolismo desse tripanosomatiacutedeo sugerindo que KAP7
possa ter papeis distintos em T cruzi e T brucei
Palavras-chaves Trypanosoma cruzi cinetoplasto nocaute KAPs
ABSTRACT
The kinetoplast DNA (kDNA) of trypanosomatids consists in a network of circular
molecules catenated each other the minicircles and maxicircles The minicircles
code RNAs guides (gRNAs) and the maxicircles code for some subunits of
mitochondrial enzymes and rRNA in a cryptic pattern (RNA editing) Studies in the
trypanosomatid protozoan Crithidia fasciculata showed that the kDNA is associated
with histone H1-like proteins known as kinetoplast-associated proteins (KAPs) wich
are capable of condensing the kDNA network However little is known about these
proteins of Trypanosoma cruzi a protozoan parasite which undergoes changes in
kinetoplast DNA structure over its life cycle Here we characterize a protein
associated with T cruzi kinetoplast named TcKAP7 TcKAP7 is a low molecular
weight protein with basic nature which is consistent with a role in DNA charge
neutralization and condensation Analysis by small angle X-Ray scattering technique
(SAXS) revealed that the TcKAP7 protein undergoes structural changes in the
presence kDNA suggesting an interaction with this DNA network either through
electrostatic bonds or through specific binding to molecules present on the network
The immunofluoresce analysis showed that TcKAP7 is located in the kinetoplast
poles suggesting that TcKAP7 might be involved in the late stages of the minicircle
replication A null mutant for TcKAP7 was obtained by gene replacement techniques
to study possible alterations in the kDNA structure However no modification in the
structure and morphology of the kinetoplast was observed by electron microscopy In
addition Tckap7 null mutant was able to differentiate without losing its infective
capacity Interference RNA assays was performed to analyze the function of
TbKAP7 the ortholog gene in T brucei The ablation of TbKAP7 expression leaded
to reduction in the procyclic proliferation suggesting that this gene is essential for the
metabolism of the parasite and might play distinct roles in T cruzi and T brucei
Key-words Trypanosoma cruzi kinetoplast gene knockout KAPs
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1 DISTRIBUICcedilAtildeO GEOGRAacuteFICA DA DOENCcedilA
DE CHAGAS19 FIGURA 2 CICLO DE TRANSMISSAtildeO DO
Trypanosoma cruzi20 FIGURA 3 ESQUEMA GERAL DAS PRINCIPAIS ESTRUTURAS
CELULARES DE T cruzi 22 FIGURA 4 REDE DE kDNA27 FIGURA 5 DIFERENTES ARRANJOS DO CINETOPLASTO
DE T cruzi29 FIGURA 6 MUDANCcedilAS NA POSICcedilAtildeO DO KDNA
NOS TRYPANOSOMAS29 FIGURA 7 REPOSICIONAMENTO DO KDNA EM RELACcedilAtildeO
AgraveS OUTRAS ORGANELAS DURANTEO CICLO DE VIDA DE UM FLAGELADO30
FIGURA 8 REPLICACcedilAtildeO DO kDNA32 FIGURA 9 REPRESENTACcedilAtildeO ESQUEMAacuteTICA DO
MICROFLUIDIFICADOR45 FIGURA 10 VETOR PARA EXPRESSAtildeO EM T CRUZI
P3XFLAG 50 FIGURA 11 ESQUEMA DA CONSTRUCcedilAtildeO DOS VETORES
UTILIZADOS PARA O NOCAUTE DO GENE TcKAP755
FIGURA 12 MAPA DO VETOR P2T7-177 UTILIZADO PARA ENSAIOS DE RNAi62
FIGURA 13 COMPARACcedilAtildeO ENTRE AS SEQUumlEcircNCIAS DE AMINOAacuteCIDOS DEDUZIDAS DO GENE KAP7 DE T cruzi Dm28C E DOS HAPLOacuteTIPOS DE CL BRENER65
FIGURA 14 COMPARACcedilAtildeO ENTRE AS SEQUumlEcircNCIAS DE AMINOAacuteCIDOS DEDUZIDAS DO GENE KAP7 EM DIFERENTES TRIPANOSOMATIacuteDEOS66
FIGURA 15 SINTENIA DE TcKAP7 COM OUTROS TRIPANOSOMATIacuteDEOS67
FIGURA 16 CARACTERIZACcedilAtildeO DA REGIAtildeO 5rsquo-UTR DO TRANSCRITO TcKAP769
FIGURA17 ANAacuteLISE DA EXPRESSAtildeO DA PROTEIacuteNA DE FUSAtildeO TCKAP7-FLAG EM FORMAS EPIMASTIGOTAS DE T CRUZI70
FIGURA 18 IMUNOLOCALIZACcedilAtildeO DE TcKAP7 EM EPIMASTIGOTAS DE T CRUZI71
FIGURA 19 ENSAIOS DE PCR UTILIZANDO DNA DE T cruzi kap7kap7 (WT) E T cruzi kap7neokap7higro (NO) COM DIFERENTES PRIMERS73
FIGURA 20 REPRESENTACcedilAtildeO ESQUEMAacuteTICA DOS SIacuteTIOS DA ENZIMA HindIII NO LOCUS DO GENE KAP7 DE T cruzi CL Brener75
FIGURA 21 ANAacuteLISE DA ORGANIZACcedilAtildeO DOS GENES TCKAP7 NEO E HIGRO POR ENSAIO DO TIPO SOUTHERN BLOT75
FIGURA 22 COMPARACcedilAtildeO DA EXPRESSAtildeO DO GENE TcKAP7 POR WESTERN BLOT76
FIGURA 23 COLORACcedilAtildeO PELO MEacuteTODO PANOacuteTICO RAacutePIDO DOS PARASITAS EPIMASTIGOTAS NOCAUTEADOS77
FIGURA 24 COMPARACcedilAtildeO ENTRE A ULTRAESTRUTURA DO CINETOPLASTO DO T cruzi DM28C TIPO SELVAGEM (A) E DO MUTANTE DE T cruzi PARA TcKAP7 (B) POR MICROSCOPIA ELETROcircNICA DE TRANSMISSAtildeO78
FIGURA 25 CURVA DE CRESCIMENTO DO MUTANTE DE T cruzi PARA TcKAP7 (KO) E DO T cruzi Dm28c SELVAGEM (WT) 79
FIGURA 26 METACICLOGEcircNESE IN VITRO DE T cruzi Dm28c TIPO SELVAGEM E T cruzi NOCAUTEADO80
FIGURA 27 RNAi DE TbKAP7 INIBE O CRESCIMENTO DAS FORMAS PROCIacuteCLICAS DE T brucei82
FIGURA 28 PURIFICACcedilAtildeO DE TCKAP7 ATRAVEacuteS DE CROMATOGRAFIA DE AFINIDADE83
FIGURA 29 PURIFICACcedilAtildeO DE TCKAP7 ATRAVEacuteS DE CROMATOGRAFIA DE TROCA IOcircNICA84
FIGURA 30 ANAacuteLISE POR DLS DE TCKAP785 FIGURA 31 ENVELOPE MOLECULAR DE SAXS86 FIGURA 32 ESPECTRO DE DICROIacuteSMO CIRCULAR DE
TcKAP787 FIGURA 33 PREDICcedilAtildeO DE ESTRUTURA SECUNDAacuteRIA DE
TcKAP787 FIGURA 34 CRISTAL DE TcKAP7 DE T CRUZI88 FIGURA 35 ESTRUTURA DE TcKAP790 FIGURA 36 SUPERFIacuteCIE ELETROSTAacuteTICA DE
TcKAP791 FIGURA 37 ALINHAMENTO ESTRUTURAL DE 3TQ6 4NOD
3TTM 4NNU E TCKAP793 FIGURA 38 ESPECTRO DE DICROIacuteSMO CIRCULAR
DE TcKAP794 FIGURA 39 ENVELOPE MOLECULAR DETcKAP795 FIGURA 40 ENVELOPE MOLECULAR DETcKAP7 VISTO EM
DIFERENTES AcircNGULOS96
LISTA DE TABELAS
TABELA 1 RELACcedilAtildeO DOS PRIMERS UTILIZADOS PARA A CLONAGEM DA REGIAtildeO UPSTREAM DE TcKAP7 NO VETOR pNEO153
TABELA 2 RELACcedilAtildeO DOS PRIMERS UTILIZADOS PARA A CLONAGEM DA REGIAtildeO DOWNSTREAM DE TcKAP7 NO VETOR pNEO153
TABELA 3 RELACcedilAtildeO DOS PRIMERS UTILIZADOS PARA A AMPLIFICACcedilAtildeO DO GENE TbKAP763
TABELA 4ndash PERCENTUAL DE IDENTIDADE ENTRE AS PROTEIacuteNAS KAP7 NOS TRIPANOSSOMATIacuteDEOS COM O GENOMA SEQUENCIADO67
TABELA 5 COMBINACcedilOtildeES DE PRIMERS UTILIZADOS NA PCR PARA CONFIRMAR O NOCAUTE DE TcKAP772
SUMAacuteRIO
1 INTRODUCcedilAtildeO18 11 O Trypanosoma cruzi18 12 Ciclo de vida do T cruzi20 13 Aspectos celulares de T cruzi21 14 O genoma de T cruzi24 15 Expressatildeo gecircnica de Tcruzi25 16 O cinetoplasto26 17 A rede de kDNA26 171 Replicaccedilatildeo do kDNA31 18 Proteiacutenas associadas ao cinetoplasto (KAPs)32 2 OBJETIVOS35 21 OBJETIVO GERAL35 211 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS35 3 MATERIAIS E MEacuteTODOS36 31 Reagentes e Soluccedilotildees Utilizados36 311 Reagentes36 312 Tampotildees e Soluccedilotildees36 313 Meios de cultura38 32 Cultivo do Trypanosoma cruzi38 321 Epimastigotas38 322 Tripomastigotas metaciacuteclicos39 33 Curva de crescimento de T cruzi39 34 Obtenccedilatildeo de DNA de T cruzi40 35 Obtenccedilatildeo de kDNA de T cruzi40 36 Obtenccedilatildeo de extrato proteico de T cruzi40 37 Clonagem do gene TcKAP741 38 Obtenccedilatildeo do cDNA de TcKAP7 atraveacutes de ensaio de RT-PCR41 39 Seleccedilatildeo dos clones recombinantes42 391 Teacutecnica de palitagem (toothpick)42 392 Teacutecnica de PCR de colocircnia43 310 Preparaccedilatildeo de plasmiacutedeo em pequena escala (miniprep)43 311 Expressatildeo da proteiacutena TcKAP7 em E coli43 312 Purificaccedilatildeo da proteiacutena recombinante TcKAP744 3121 Processamento da amostra44 3122 Cromatografia de afinidade45 3123 Cromatografia de troca iocircnica46 3124 Cromatografia de gel filtraccedilatildeo46 313 Espalhamento Dinacircmico de Luz ndash DLS46 314 Espectroscopia de dicroiacutesmo circular (CD)46 315 Quantificaccedilatildeo e concentraccedilatildeo47 316 Ensaios de Cristalizaccedilatildeo47 317 Espalhamento de raio-X a baixo acircngulo (SAXS)48 318 Modelagem de TcKAP748 319 Obtenccedilatildeo de antissoro policlonal contra TcKAP749 320 Anaacutelise da expressatildeo do gene TcKAP7 e de seu mutante por ensaio tipo western blot49 321 Superexpressatildeo de TcKAP750
3211 Amplificaccedilatildeo e clonagem do gene TcKAP7 no vetor pNEO3xFlag para superexpressatildeo da proteiacutena50 3212 Transfecccedilatildeo por eletroporaccedilatildeo52 3213 Seleccedilatildeo dos transfectantes52 322 Deleccedilatildeo do gene TcKAP7 por nocaute gecircnico53 3221 Amplificaccedilatildeo e clonagem das regiotildees a montante e a jusante do gene TcKAP753 3222 Amplificaccedilatildeo dos cassetes UPS-NEO-DOWN e UPS-HIGRO-DOWN para transfecccedilatildeo de T cruzi55 3223 Transfecccedilatildeo do T cruzi com o cassete UPS-NEO-DOWN56 3224 Extraccedilatildeo de DNA dos transfectantes57 3225 Anaacutelise por PCR do DNA dos parasitas transfectados com o cassete UPS-NEO-DOWN57 3226 Transfecccedilatildeo do T cruzi com o cassete UPS-HIGRO-DOWN57 3227 Anaacutelise por PCR do DNA dos parasitas transfectados com o cassete UPS-HIGRO-DOWN58 3228 Anaacutelise da organizaccedilatildeo do gene TcKAP7 e da eficiecircncia de seu nocaute atraveacutes de ensaio do tipo Southern blot58 323 Localizaccedilatildeo celular da proteiacutena TcKAP7 atraveacutes de ensaio de imunofluorescecircncia59 324 Anaacutelise da ultraestrutura do cinetoplasto do mutante de T cruzi para TcKAP7 por microscopia eletrocircnica de transmissatildeo60 325 Coloraccedilatildeo dos parasitas transfectados60 326 Infecccedilatildeo de ceacutelulas Vero com o mutante de T cruzi para TcKAP761 327 Anaacutelise da funccedilatildeo do gene TbKAP7 de Trypanosoma brucei atraveacutes de ensaios de RNA de interferecircncia61 3271 Induccedilatildeo do RNA dupla fita64 4 RESULTADOS65 41 Clonagem e caracterizaccedilatildeo do gene TcKAP765 42 Expressatildeo da proteiacutena TcKAP7 em T cruzi69 43 Localizaccedilatildeo celular de TcKAP7 atraveacutes de ensaio de imunofluorescecircncia70 44 Deleccedilatildeo do gene TcKAP7 por nocaute gecircnico71 441 Anaacutelise por PCR do DNA dos parasitas transfectados com os cassetes UPS-NEO-DOWN e UPS-HIGRO-DOWN72 442 Anaacutelise da organizaccedilatildeo dos genes TcKAP7 neo e higro por ensaio do tipo Southern blot74 45 Comparaccedilatildeo da expressatildeo do gene TcKAP7 por western blot76 46 Anaacutelise da morfologia e da ultraestrutura do cinetoplasto do mutante de T cruzi para TcKAP776 47 Multiplicaccedilatildeo diferenciaccedilatildeo e infectividade do mutante de T cruzi para TcKAP779 48 Anaacutelise da funccedilatildeo do gene KAP7 de Trypanosoma brucei atraveacutes de ensaios de RNA de interferecircncia80 49 Caracterizaccedilatildeo estrutural de TcKAP782 491 Produccedilatildeo recombinante de TcKAP782 410 Anaacutelise do estado oligomeacuterico de TcKAP784 411 Anaacutelise do conteuacutedo de estrutura secundaacuteria de TcKAP7 recombinante86 412 Anaacutelise estrutural de TcKAP787
413 Investigaccedilatildeo de possiacuteveis funcionalidades baseadas na estrutura de TcKAP791 4131 Prediccedilatildeo de funccedilatildeo paraTcKAP791 4132 Anaacutelises preliminares da possiacutevel interaccedilatildeo entre TcKAP7 e kDNA93 5 DISCUSSAtildeO97 6 CONCLUSOtildeES102 7 REFEREcircNCIAS103
18
1 INTRODUCcedilAtildeO
11 O Trypanosoma cruzi
Trypanosoma cruzi eacute um protozoaacuterio flagelado unicelular pertencente ao
reino Protista subreino Protozoa filo Sarcomastigophora subfilo Mastigophora
classe Zoomastigophora ordem Kinetoplastida e famiacutelia Trypanosomatidae (LEVINE
et al 1980) A principal caracteriacutestica dessa ordem eacute a presenccedila de uma estrutura
singular o cinetoplasto que abriga em uma massa de DNA extranuclear
concentrado na mitococircndria uacutenica deste protista (SHAPIRO amp ENGLUND 1995) A
famiacutelia Trypanosomatidae inclui os seguintes gecircneros importantes Blastocrithidia
Crithidia Endotrypanum Herpetomonas Leishmania Leptomonas Phytomonas e
Trypanosoma O gecircnero Trypanosoma eacute um dos mais importantes dentro da famiacutelia
Trypanosomatidae por incluir uma seacuterie de espeacutecies causadoras de doenccedilas
humanas importantes como o Trypanosoma cruzi agente da doenccedila de Chagas
Trypanosoma rhodesiense e Trypanosoma gambiense agentes da doenccedila do sono
e de animais o Trypanosoma brucei Trypanosoma equiperdum e Trypanosoma
equinum (DE SOUZA 2015)
Este protozoaacuterio eacute um microrganismo heteroxecircnico com ciclo bioloacutegico
alternado entre hospedeiros vertebrados (mamiacuteferos) e invertebrados (triatomiacuteneos)
Existem diferentes formas de transmissatildeo da doenccedila dentre as quais se destaca a
via vetorial que consiste na transmissatildeo do parasita atraveacutes de excretas do inseto
vetor hematoacutefago pertencente agrave ordem Hemiacuteptera famiacutelia Reduvidae subfamiacutelia
Triatominae (DIAS et al 1956) A principal caracteriacutestica bioloacutegica dos triatomiacuteneos
eacute que satildeo obrigatoriamente hematoacutefagos e necessitam do repasto sanguiacuteneo para
completar o desenvolvimento (DIAS 2000) O parasita pode ainda ser transmitido
aos mamiacuteferos por transfusatildeo sanguiacutenea ou via oral e com menos frequecircncia por
via congecircnita acidentes de laboratoacuterio e transplantes de oacutergatildeos (BELTRAO HDE et
al 2009 STEINDEL et al 2008 TANOWITZ et al 1992) Praticamente todo tipo
de ceacutelula nucleada do hospedeiro mamiacutefero pode ser parasitada considerando o
tropismo das diferentes cepas (LENZI et al 1996) Outra caracteriacutestica deste
parasita eacute apresentar diferentes morfologias durante o ciclo bioloacutegico A classificaccedilatildeo
19
de suas formas baseia-se tambeacutem na posiccedilatildeo do cinetoplasto em relaccedilatildeo ao nuacutecleo
e do local de onde emerge o flagelo (HOARE 1971)
Foi no ano de 1909 no estado de Minas Gerais que Carlos Chagas meacutedico
sanitarista identificou pela primeira vez o protozoaacuterio parasita Trypanosoma cruzi
agente causador da Doenccedila de Chagas A doenccedila de Chagas eacute endecircmica na
Ameacuterica Latina sendo conhecida a existecircncia de vetores da doenccedila desde o sul dos
Estados Unidos agrave Argentina (FIGURA 1)
FIGURA 1 DISTRIBUICcedilAtildeO GEOGRAacuteFICA DA DOENCcedilA DE CHAGAS FONTE Modificado de httpwwwwhointen
Em 2008 o nuacutemero de indiviacuteduos infectados era estimado entre 16 e 18
milhotildees sendo que aproximadamente 90 milhotildees de pessoas estariam sob risco
de contaminaccedilatildeo na Ameacuterica Latina (WHO 2010)
Apesar de existirem drogas (Nifurtimox e Benzonidazol) para o tratamento
da doenccedila sua ineficaacutecia no estaacutegio crocircnico e sua accedilatildeo toacutexica acabam prejudicando
o paciente sem conseguir eliminar o parasita (BRENER et al 2000) Sem vacinas
ou tratamento quimioteraacutepico eficiente a principal estrateacutegia de controle limita-se agrave
prevenccedilatildeo da transmissatildeo por transfusatildeo sanguiacutenea e ao controle populacional dos
vetores triatomiacuteneos Aleacutem da sua importacircncia como patoacutegeno humano este micro-
organismo apresenta caracteriacutesticas peculiares que o tornam um excelente modelo
para o estudo de questotildees bioloacutegicas baacutesicas
Regiotildees endecircmicas
20
12 Ciclo de vida do T cruzi
O T cruzi apresenta um ciclo complexo na natureza sofrendo mudanccedilas
estruturais bioquiacutemicas e morfoloacutegicas de acordo com o ambiente em que se
encontra Formas replicativas epimastigotas e amastigotas dos hospedeiros
invertebrado e mamiacutefero respectivamente alternam-se com as formas infectivas e
natildeo proliferativas tripomastigotas metaciacuteclicas (proveniente do inseto vetor) e
tripomastigota sanguiacutenea (originaacuteria do mamiacutefero infectado) (FIGURA 2) (DE
SOUZA 1984)
FIGURA 2 CICLO DE TRANSMISSAtildeO DO Trypanosoma cruzi FONTE Infograacutefico Veniacutecio Ribeiro ICICTFIOCRUZ
Durante o repasto sanguiacuteneo do inseto vetor formas tripomastigotas
metaciacuteclicas atingem a corrente sanguiacutenea do hospedeiro pela lesatildeo da picada Esta
forma infectiva eacute capaz de invadir todos os tipos de ceacutelulas com exceccedilatildeo das
21
hemaacutecias Apoacutes a entrada do parasita na ceacutelula os tripomastigotas diferenciam-se
em uma forma replicativa denominada amastigota que apoacutes diversas divisotildees sofre
uma diferenciaccedilatildeo para um estaacutegio intermediaacuterio o epimastigota intracelular e
posteriormente para tripomastigota Quando ocorre a lise celular os tripomastigotas
satildeo liberados ao meio extracelular podendo entatildeo invadir ceacutelulas vizinhas atingir
novos tecidos atraveacutes da corrente sanguiacutenea ou ainda infectar um inseto vetor
durante o processo de hematofagia recomeccedilando o ciclo no hospedeiro
invertebrado No inseto as formas tripomastigotas diferenciam-se em epimastigotas
no tubo digestivo e migram para o intestino onde ocorrem as divisotildees binaacuterias Ao
atingirem a porccedilatildeo terminal do tubo digestivo ocorre a diferenciaccedilatildeo em
tripomastigotas metaciacuteclicos que satildeo eliminados juntamente com as fezes e urina do
triatomiacutedeo
A transformaccedilatildeo da forma epimastigota do T cruzi em tripomastigota
metaciacuteclica denominada metaciclogecircnese eacute de grande interesse de estudo pois
neste processo ocorrem diversas alteraccedilotildees morfoloacutegicas metaboacutelicas e de
expressatildeo gecircnica (GOLDENBERG et al 1985) A metaciclogecircnese que ocorre
naturalmente no intestino do inseto vetor pode ser mimetizada in vitro utilizando-se
meio quimicamente definido que simula as condiccedilotildees da urina do inseto vetor
(CONTRERAS et al 1985)
13 Aspectos celulares de T cruzi
O Trypanosoma cruzi apresenta aleacutem das organelas tiacutepicas da maioria das
ceacutelulas eucarioacuteticas como nuacutecleo retiacuteculo endoplasmaacutetico aparato de Golgi e
mitococircndria algumas estruturas peculiares (FIGURA 3) como os microtuacutebulos
subpeliculares a estrutura paraflagelar os reservossomos o cinetoplasto os
glicossomos e os acidocalcisomos exclusivos dos tripanosomatiacutedeos (revisto por
DE SOUZA 1984 1999 2002)
22
FIGURA 3 ESQUEMA GERAL DAS PRINCIPAIS ESTRUTURAS CELULARES DE T cruzi FONTE DOCAMPO et al 1975
A superfiacutecie celular dos tripanossomatiacutedeos eacute composta principalmente
pela membrana plasmaacutetica e pelos microtuacutebulos subpeliculares Pequenos
filamentos conectam fortemente os microtuacutebulos subpeliculares os quais se
apresentam espaccedilados de forma regular entre si e com a membrana plasmaacutetica (DE
23
SOUZA SANTANNA CUNHA-E-SILVA 2009) conferindo rigidez agrave ceacutelula e
resistecircncia ao rompimento mecacircnico
Todos os membros da famiacutelia Trypanosomatidae apresentam um flagelo
que emerge de uma aacuterea de invaginaccedilatildeo da membrana plasmaacutetica conhecida como
bolsa flagelar Devido agrave localizaccedilatildeo especiacutefica de vaacuterios receptores nesta aacuterea
acredita-se que a maior parte do traacutefego vesicular e entrada de nutrientes ocorram
nesta regiatildeo Outra invaginaccedilatildeo menor localizada proacutexima agrave bolsa flagelar o
citoacutestomo tambeacutem estaacute envolvida com a absorccedilatildeo de nutrientes (PORTO-
CARREIRO et al 2000)
O flagelo do T cruzi apresenta uma estrutura baacutesica semelhante a outros
flagelos sendo envolvido por uma membrana flagelar e contendo um axonema
tiacutepico que apresenta um padratildeo de nove pares de microtuacutebulos perifeacutericos e um par
central Associado ao flagelo deste parasita eacute encontrado um complexo arranjo de
filamentos proteacuteicos denominado de estrutura paraflagelar (revisto por GULL 1999)
Na parte posterior da ceacutelula existem organelas usualmente esfeacutericas
denominadas reservossomos Os reservossomos satildeo organelas aacutecidas que
possuem em seu interior proteinases principalmente a cruzipaiacutena (uma
cisteiacutenoproteinase) e proteiacutenas ingeridas que chegam dentro de vesiacuteculas
endociacuteticas oriundas da bolsa flagelar e do citoacutestomo Com base nisso foi proposto
que os reservossomos seriam compartimentos preacute-lisossomais (SOARES et al
1992) Tambeacutem tem sido proposta a participaccedilatildeo dos reservossomos no processo
de metaciclogecircnese como principal fonte de energia para esta atividade (SOARES
1999)
O T cruzi assim como todos os membros da famiacutelia Tripanosomatidae
apresenta uma mitococircndria uacutenica e ramificada que se estende por todo o corpo do
protozoaacuterio Como em todas as ceacutelulas eucarioacuteticas a mitococircndria dos
tripanosomatiacutedeos tambeacutem apresenta DNA mitocondrial tambeacutem conhecido como
kDNA ou DNA do cinetoplasto que se concentra em uma determinada regiatildeo da
mitococircndria localizada logo abaixo do corpuacutesculo basal dando origem a uma
estrutura intramitocondrial chamada de cinetoplasto O cinetoplasto abriga o kDNA
o qual eacute constituiacutedo por moleacuteculas circulares que se encontram interligadas
formando uma extensa rede entre si (SHLOMAI 1994)
Distribuiacutedos pelo citoplasma estatildeo os glicossomos um tipo especializado de
peroxissomo Estes acumulam enzimas da via glicoliacutetica envolvidas na conversatildeo
24
da glicose a 3-fosfoglicerato que em outros organismos localizam-se no citoplasma
(HANNAERT et al 2003)
Outra particularidade dos tripanossomatiacutedeos estaacute na estocagem intracelular
de caacutelcio Este iacuteon importante nos processos de sinalizaccedilatildeo celular eacute estocado em
organelas denominadas acidocalcissomos Os acidocalcissomos provavelmente
estatildeo envolvidos em diversos processos bioloacutegicos tais como o armazenamento de
caacutelcio e polifosfatos adaptaccedilatildeo dos tripanosomatiacutedeos a condiccedilotildees de estresse
ambiental manutenccedilatildeo do pH intracelular e osmorregulaccedilatildeo (revisto por DOCAMPO
et al 2005)
14 O genoma de T cruzi
No ano de 2005 foi concluiacuteda a montagem do genoma do T cruzi (EL-
SAYED et al 2005) A cepa CL Brener foi a escolhida para o sequenciamento por
ser bem caracterizada bioquiacutemica e parasitologicamente (ZINGALES et al 1997) e
por ser considerada representativa para o universo de cepas circulantes de T cruzi
Com base na montagem do sequenciamento o genoma diploacuteide do parasita foi
calculado como sendo de 1064 1107 Mb com cada haploacutetipo contendo cerca de
12000 genes sendo que mais de 50 do genoma constituiu-se de sequecircncias
repetitivas compostas por famiacutelias de proteiacutenas de superfiacutecie retrotransposons e
elementos subtelomeacutericos (EL-SAYED et al 2005)
A comparaccedilatildeo das estruturas genocircmicas e proteiacutenas preditas obtidas a
partir do sequenciamento de Trypanosoma cruzi com as de Leishmania major e
Trypanosoma brucei indica mais similaridade entre T cruzi e T brucei uma grande
conservaccedilatildeo entre os respectivos proteomas (exceto para antiacutegenos de superfiacutecie) e
uma sintenia bastante conservada entre os trecircs tripanosomatiacutedeos apesar da
divergecircncia haacute 200-500 milhotildees de anos atraacutes (BERRIMAN et al 2005 EL SAYED
et al 2005 IVENS et al 2005)
Os tripanosomatiacutedeos possuem aleacutem do genoma nuclear um grande
genoma mitocondrial (kDNA) que tem sido extensivamente estudado sendo uacutenico
em estrutura funccedilatildeo e mecanismo de replicaccedilatildeo O kDNA eacute formado por milhares de
moleacuteculas circulares topologicamente relaxadas e interligadas umas as outras Este
arranjo conteacutem aproximadamente 20 - 30 do DNA total dos tripanosomatiacutedeos e eacute
composto por 2 tipos de moleacuteculas circulares os maxiciacuterculos e os miniciacuterculos Os
25
maxiciacuterculos apresentam um tamanho entre 22-37 kb e conteacutem basicamente os
genes codificadores de proteiacutenas envolvidas na fosforilaccedilatildeo oxidativa e RNA
ribossocircmico Os miniciacuterculos com um tamanho que varia de espeacutecie para espeacutecie
(05 a 25 kb) conteacutem os genes que codificam os RNAs guia envolvidos na
editoraccedilatildeo do RNA (STUART et al 1989 SHAPIRO amp ENGLUND 1995 MADISON-
ANTENUCCI et al 2002 SIMPSON et al 2003 ONN et al 2006 GLUENZ et al
2007)
15 Expressatildeo gecircnica de Tcruzi
T cruzi estaacute sujeito agraves frequentes mudanccedilas de ambientes decorrentes da
passagem por diferentes hospedeiros durante seu ciclo de vida (temperatura pH
quantidade de nutrientes evasatildeo do sistema imune) por esse motivo a expressatildeo
gecircnica deste parasita eacute regulada por diversos fatores A adaptaccedilatildeo raacutepida e eficiente
a estas diferentes condiccedilotildees torna-se uma importante tarefa para o parasita
Como os demais eucariotos o T cruzi apresenta trecircs RNAs polimerases a
RNA polimerase I transcreve os genes para RNAs ribossocircmicos a RNA polimerase
II os genes que codificam proteiacutenas e a RNA polimerase III pequenos RNAs como
o tRNA (RNA de transferecircncia) Nos tripanosomatiacutedeos promotores para as RNA
polimerase I e III jaacute foram identificados poreacutem ainda natildeo foram identificados
promotores para os genes transcritos pela RNA polimerase II com exceccedilatildeo de um
promotor associado ao gene do mini-exon (GILLINGER amp BELLOFATTO 2001
revisto por CAMPBELL et al 2003)
Os genes dos tripanosomatiacutedeos estatildeo organizados em unidades
policistrocircnicas e natildeo apresentam interrupccedilotildees por iacutentrons com exceccedilatildeo do gene da
poli-A polimerase (MAIR et al 2000)
Uma vez que em T cruzi como nos demais eucariotos somente mRNAs
monocistrocircnicos satildeo traduzidos os precursores de mRNA policistrocircnicos devem ser
processados ateacute mRNAs individuais Como caracteriacutestica desta famiacutelia os
transcritos de mRNA satildeo processados por mecanismos de trans-splicing (AGABIAN
1990) e poliadenilaccedilatildeo (LEBOWITZ et al 1993 MATTHEWS et al 1994
VANHAMME amp PAYS 1995)
No processo de trans-splicing as unidades codificadoras satildeo separadas e eacute
adicionada na extremidade 5rsquo uma sequecircncia extremamente conservada espeacutecie-
26
especiacutefica de 39 nucleotiacutedeos denominada sequumlecircncia liacuteder (SL) ou minieacutexon
(McCARTHY-BURKE et al 1989 NILSEN 1992 VANHAMME amp PAYS 1995)
Nesta reaccedilatildeo participam duas moleacuteculas de RNA uma doadora e outra aceptora A
doadora eacute um precursor do mini-exon e em T cruzi possui cerca de 110
nucleotiacutedeos (ZWIERZYNSKI amp BUCK 1991) A aceptora eacute o transcrito derivado da
unidade policistrocircnica ao qual o mini-exon eacute transferido O complexo enzimaacutetico
envolvido nesta reaccedilatildeo eacute semelhante ao descrito para a de cis-splicing (LAIRD
1989)
Os transcritos processados satildeo estabilizados pela estrutura cap 4 do mini-
exon (ULLU amp TSCHUDI 1991) e pela adiccedilatildeo de uma cauda poli-A agrave extremidade
3rsquo sendo que a adiccedilatildeo de ambos os elementos ocorrem em conjunto (LEBOWITZ et
al 1993) Regiotildees ricas em resiacuteduos de pirimidinas aleacutem da sequumlecircncia consenso
(AG) para o trans-splicing regulam a adiccedilatildeo do mini-exon e da cauda poli-A
Deleccedilotildees nestas regiotildees impedem o correto processamento destes transcritos
(MATTHEWS et al 1994)
A ocorrecircncia de transcriccedilatildeo policistrocircnica associada agrave ausecircncia de
promotores para RNA polimerase II e agrave presenccedila de niacuteveis distintos de mRNA
originados de uma mesma unidade policistrocircnica sugerem que a regulaccedilatildeo da
expressatildeo gecircnica nesses protozoaacuterios ocorra a niacutevel poacutes-transcricional baseada
principalmente em mecanismos que controlam a estabilidade e a traduccedilatildeo dos
mRNAs (CLAYTON 2002 BOUCHER et al 2002)
16 O cinetoplasto
O cinetoplasto eacute uma estrutura peculiar presente nos tripanosomatiacutedeos e
encontra-se inserida no interior da mitococircndria uacutenica abrigando fibrilas de DNA
conhecidas como kDNA O nome cinetoplasto (cineto=movimento e plasto=organela)
foi dado pois se acreditava que o mesmo fosse responsaacutevel pelo movimento do
flagelo
17 A rede de kDNA
O DNA do cinetoplasto eacute formado por dois tipos de moleacuteculas circulares os
miniciacuterculos de tamanho entre 05 e 25 kb e os maxiciacuterculos que apresentam
entre 20 e 40 kb Cerca de 10000 miniciacuterculos e 50 maxiciacuterculos se encontram
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catenados formando uma extensa rede (SHAPIRO amp ENGLUND 1995 DE SOUZA amp
CAVALCANTI 2008) (FIGURA 4)
FIGURA 4 REDE DE kDNA
FONTE ROY CHOWDHURY et al 2010
As primeiras questotildees relacionadas ao arranjo das moleacuteculas na rede do
kDNA dos tripanosomatiacutedeos surgiram na deacutecada de 80 sugerindo que tal
organizaccedilatildeo poderia ter evoluiacutedo como um maneira mais eficaz de armazenar uma
grande quantidade de material em um pequeno espaccedilo (HAJDUK et al 1986)
Os maxiciacuterculos apresentam um tamanho de 22 a 37 kb e assim como o
DNA mitocondrial de outros eucariotos codificam RNAs ribossomais e diversas
proteiacutenas da cadeia respiratoacuteria incluindo subunidades da citocromo oxidase e
NADH desidrogenase (revisto por SHAPIRO amp ENGLUND 1995) Os transcritos dos
maxiciacuterculos satildeo processados poacutes-transcricionalmente para formar mRNAs
funcionais atraveacutes de um processo conhecido como ediccedilatildeo ou editoraccedilatildeo do RNA
A editoraccedilatildeo do RNA consiste na inserccedilatildeo ou retirada de resiacuteduos de uridina em
28
siacutetios especiacuteficos dos RNAs transcritos pelos maxiciacuterculos a fim de criar coacutedons de
iniciaccedilatildeo ou terminaccedilatildeo mudanccedilas na fase de leitura ou quadros abertos de leitura a
partir de sequumlecircncias sem sentido O processo de ediccedilatildeo eacute especificado por
pequenos RNAs guias produzidos pelos miniciacuterculos e maxiciacuterculos e catalisado
por um complexo muiltiproteacuteico o editosomo (revisto por Esteacutevez amp Simpson 1999
Stuart et al 2005) Esse processo constitui uma forma de regular poacutes-
transcricionalmente a expressatildeo de genes mitocondriais nas diferentes formas
evolutivas do parasita
Os miniciacuterculos caracterizam-se por apresentar um tamanho de 05 a 25 kb
e por transcrever os RNAs guia (gRNA) responsaacuteveis pela especificidade da ediccedilatildeo
dos mRNAs codificados pelos maxiciacuterculos por meio de uma sequumlecircncia presente na
porccedilatildeo central desses gRNAs (BENNE 1994 STUART et al 2005) A significacircncia
da variaccedilatildeo em tamanho e organizaccedilatildeo entre as espeacutecies ainda natildeo eacute aparente
contudo a diversidade das sequecircncias dos miniciacuterculos estaacute correlacionada com a
necessidade de mais ou menos ediccedilatildeo de mRNA de cada organismo (STUART
1991) Apesar desta diversidade os miniciacuterculos apresentam pelo menos duas
regiotildees conservadas o dodecacircmero GGGGTTGGTGTA conhecido como sequecircncia
universal dos miniciacuterculos (UMS) e o hexacircmero ACGCCC que correspondem agrave
origem de replicaccedilatildeo da fita L (light) e da fita H (heavy) respectivamente
(BIRKENMEYER amp RAY 1986 BIRKENMEYER et al 1987 RAY 1989 SHLOMAI
1994 HINES amp RAY 2008)
Embora o cinetoplasto de todos os tripanosomatiacutedeos seja formado por
moleacuteculas circulares relaxadas e catenadas diferentes arranjos da rede de kDNA
podem ser observados entre diferentes estaacutegios do ciclo de vida desses
protozoaacuterios como em T cruzi (FIGURA 5) assim como mudanccedilas na posiccedilatildeo do
kDNA satildeo utilizadas para identificar as diferentes formas evolutivas do parasita
(FIGURA 6)
29
FIGURA 5 ndash DIFERENTES ARRANJOS DO CINETOPLASTO DE T cruzi
LEGENDA As fibrilas de kDNA se apresentam bastante compactadas em forma de bastatildeo nas formas amastigotas (A) e epimastigotas (B) enquanto nas formas tripomastigotas a rede de kDNA torna-se menos compacta e a forma em bastatildeo do cinetoplasto daacute lugar a uma forma arredondada (C) FONTE DE SOUZA amp SOUTO-PADRON 1980 e DE SOUZA 1984
Nas formas amastigota (FIGURA 5A) e epimastigota (FIGURA 5B) de T
cruzi as fibrilas de kDNA se apresentam bastante compactadas em forma de
bastatildeo Em tripomastigotas (FIGURA 5C) de T cruzi a rede de kDNA torna-se
menos compacta e a forma em bastatildeo do cinetoplasto daacute lugar a uma forma
arredondada (DE SOUZA 1984) Os vaacuterios graus de compactaccedilatildeo do kDNA em
tripanosomatiacutedeos podem estar relacionados com a accedilatildeo de proteiacutenas que
condensam o DNA como seraacute visto mais adiante
FIGURA 6 MUDANCcedilAS NA POSICcedilAtildeO DO KDNA NOS TRYPANOSOMAS FONTE Modificado de DO CAMPO et al 2005
30
O cinetoplasto de todos os tripanosomatiacutedeos encontra-se localizado
proacuteximo ao corpo basal perpendicularmente ao eixo do flagelo Em alguns
tripanosomatiacutedeos que sofrem diferenciaccedilatildeo ao longo de seu ciclo de vida como o
T cruzi o cinetoplasto muda de posiccedilatildeo dentro da ceacutelula passando da regiatildeo
anterior (nos epimastigotas) para a regiatildeo posterior (nos tripomastigotas) poreacutem
permanecendo proacuteximo e perpendicular ao corpo basal (FIGURA 7) O cinetoplasto
eacute fisicamente conectado ao corpo basal atraveacutes de um grupo de filamentos
citoplasmaacuteticos chamado de complexo de ligaccedilatildeo tripartite (TAC) (OGBADOYI et al
2003) Este complexo eacute responsaacutevel pelo posicionamento espacial do cinetoplasto e
por sua segregaccedilatildeo
FIGURA 7 REPOSICIONAMENTO DO KDNA EM RELACcedilAtildeO AgraveS OUTRAS ORGANELAS DURANTE O CICLO DE VIDA DE UM FLAGELADO LEGENDA A morfologia eacute definida pelas posiccedilotildees do ponto onde emerge o flagelo e a bolsa flagelar (BF) (mostrada em laranja) nuacutecleo (mostrado em azul) e kDNA (mostrado em roxo) FONTE Modificado de FIELD amp CARRINGTON 2009
31
171 Replicaccedilatildeo do kDNA
Nos tripanosomatiacutedeos a replicaccedilatildeo do kDNA eacute restrita a fase S nuclear
(COSGROVE amp SKEEN 1970 WOODWARD amp GULL 1990) diferente do que
acontece na maioria dos eucariotos onde a replicaccedilatildeo do DNA mitocondrial ocorre
ao longo do ciclo celular (LIU et al 2005)
A replicaccedilatildeo dos miniciacuterculos se inicia quando estes satildeo individualmente
decatenados da rede de kDNA pela accedilatildeo de DNA topoisomerases do tipo II pois
estes natildeo se replicam enquanto estatildeo ligados agrave rede e termina quando os
miniciacuterculos retornam para a rede com a ajuda da mesma enzima (SHAPIRO amp
ENGLUND 1995)
Os miniciacuterculos satildeo liberados da rede em direccedilatildeo a zona cinetoflagelar
(KFZ) uma regiatildeo especializada da matriz mitocondrial entre o kDNA e o corpo
basal (FIGURA 8) que abriga proteiacutenas envolvidas com o iniacutecio da replicaccedilatildeo Em
seguida os ciacuterculos migram (ou satildeo transportados) para os poacutelos opostos da rede
de kDNA para completar sua replicaccedilatildeo O iniacutecio da replicaccedilatildeo dos miniciacuterculos na
regiatildeo cinetoflagelar envolve a montagem de um complexo proteacuteico na origem de
replicaccedilatildeo dos ciacuterculos com a participaccedilatildeo da primase polimerase e proteiacutenas que
se ligam agrave sequumlecircncia universal de miniciacuterculos (UMSBP) Estas juntamente com
outras proteiacutenas geram uma forquilha de replicaccedilatildeo que se propaga
unidirecionalmente ao redor do miniciacuterculo formando uma estrutura tipo
intermediaacuteria (LIU et al 2005 GLUENZ et al 2007)
Os miniciacuterculos receacutem-replicados migram da zona KFZ para dois complexos
proteacuteicos situados nos poacutelos diametralmente opostos do cinetoplasto onde os
proacuteximos passos de replicaccedilatildeo iratildeo ocorrer Estes passos incluem remoccedilatildeo dos
primers pela accedilatildeo de endonucleases preenchimento de alguns intervalos entre os
fragmentos de Okazaki pela DNA polimerase e uniatildeo dos cortes (nicks) por uma
DNA ligase Apoacutes estas etapas os novos ciacuterculos sintetizados que ainda possuem
pelo menos uma interrupccedilatildeo em sua sequumlecircncia satildeo reunidos agrave periferia da rede
pela accedilatildeo de topoisomerases II Apoacutes todos miniciacuterculos terem sido replicados os
intervalos satildeo reparados (Revisto por LIU et al 2005 POVELONES 2014)
Pouco se sabe sobre o processo de replicaccedilatildeo dos maxiciacuterculos Assim
como os miniciacuterculos os maxiciacuterculos tambeacutem sofrem replicaccedilatildeo unidirecional que
32
se inicia em uma origem contida na regiatildeo variaacutevel da moleacutecula formando estruturas
tipo- Entretanto ao contraacuterio dos miniciacuterculos eles permanecem ligados agrave rede de
kDNA durante o processo replicativo (revisto por KLINGBEIL et al 2001 Liu et al
2005)
FIGURA 8 REPLICACcedilAtildeO DO kDNA FONTE Modificado de LIU et al 2005
18 Proteiacutenas associadas ao cinetoplasto (KAPs)
Proteiacutenas que se ligam ao DNA tambeacutem foram identificadas na mitococircndria
de uma variedade de organismos eucarioacuteticos variando de levedura ateacute humanos
(MAIER et al 2001) Estas proteiacutenas satildeo codificadas no nuacutecleo da ceacutelula e satildeo poacutes-
traducionalmente importadas para a mitococircndria
Conceitualmente qualquer proteiacutena que se associe ao kDNA quer atuando
na replicaccedilatildeo e transcriccedilatildeo quer atuando na organizaccedilatildeo compactaccedilatildeo e
segregaccedilatildeo da rede pode ser chamada de KAP (KAP do inglecircs Kinetoplast-
33
Associated Protein) Observou-se que algumas dessas KAPs apresentam
caracteriacutesticas de proteiacutenas histonas H1 (H1 histone-like proteins) por serem
proteiacutenas pequenas (17 a 25 kDa) fortemente baacutesicas (pI de 11 a 125) interagindo
com a carga negativa das moleacuteculas de DNA e com grande conteuacutedo dos
aminoaacutecidos lisina e arginina elevado (aprox 30 a 50)
Proteiacutenas associadas com genoma mitochondrial (KAPs) dos
tripanosomatiacutedeos e que compartilham caracteriacutesticas com histonas H1 foram
inicialmente identificadas no cinetoplasto do tripanosomatiacutedeo de inseto Crithidia
fasciculata e denominadas de KAP1 a 5 As H1-KAPs de C fasciculata interagem
com miniciacuterculos (XU et al 1996) e desse modo podem facilitar a associaccedilatildeo
orientaccedilatildeo e organizaccedilatildeo dessas moleacuteculas na rede pela neutralizaccedilatildeo das cargas
negativas das moleacuteculas de DNA contribuindo para a condensaccedilatildeo organizaccedilatildeo e
segregaccedilatildeo da rede de kDNA Ateacute o momento foram caracterizadas quatro H1-KAPs
de C fasciculata (CfKAP1 2 3 and 4) Aleacutem das caracteriacutesticas de histona H1
possuem uma preacute-sequecircncia clivaacutevel de nove aminoaacutecidos em sua porccedilatildeo N-
terminal e que provavelmente estaacute envolvida no transporte da proteiacutena para o
cinetoplasto jaacute que natildeo aparece na proteiacutena madura (XU amp RAY 1993 XU et al
1996 HINES amp RAY 1998) Atraveacutes de ensaios de imunofluorescecircncia foi possiacutevel
confirmar que estas proteiacutenas estatildeo presentes em toda a rede de kDNA Pela
facilidade encontrada nas KAPs purificadas de condensar redes de kDNA in vitro
(XU et al 1996) sugere-se que estas estejam envolvidas na organizaccedilatildeo e
condensaccedilatildeo do kDNA in vivo (LUKES et al 2001)
As teacutecnicas de deleccedilatildeo de genes satildeo uma oacutetima ferramenta para elucidar as
possiacuteveis funccedilotildees que um gene pode apresentar Em C fasciculata foi utilizada a
teacutecnica de nocaute gecircnico para o gene Cfkap1 onde mutantes viaacuteveis foram
obtidos mostrando que a forma e a dimensatildeo do cinetoplasto natildeo foram alterados
ao contraacuterio da organizaccedilatildeo da rede de kDNA que passou a apresentar fibrilas de
DNA espessas e uma camada eleacutetron-densa no centro do disco Quando foi
realizada a reintroduccedilatildeo do gene na forma episomal o fenoacutetipo normal da rede de
kDNA foi restaurado (LUKES et al 2001) Tambeacutem foi realizado o duplo nocaute
dos genes Cfkap2 e Cfkap3 o qual da mesma maneira produziu mutantes viaacuteveis
poreacutem com o crescimento bastante reduzido uma reduccedilatildeo na respiraccedilatildeo e um
aumento nos niacuteveis de mRNAs codificados pelos maxiciacuterculos Apesar de todas
estas alteraccedilotildees o kDNA permaneceu inalterado mostrando que as proteiacutenas
34
CfKAP2 e CfKAP3 desempenham um papel diferente ao da CfKAP1 pois estatildeo
envolvidas com o metabolismo mitocondrial e proliferaccedilatildeo celular ao inveacutes de
estarem envolvidas na organizaccedilatildeo estrutural do kDNA (AVLIYAKULOV et al
2004)
Com base nesses estudos surgiu o interesse de nosso grupo no estudo de
KAPs em T cruzi visando verificar qual o papel dessas proteiacutenas na organizaccedilatildeo da
rede de kDNA e sua importacircncia nos diferentes estaacutegios do ciclo de vida do parasita
Atraveacutes de anaacutelises bioinformaacuteticas foram identificadas 6 diferentes H1-KAPs
codificadas no genoma do T cruzi levando em consideraccedilatildeo a similaridade com
KAPs de C fasciculata (CAVALCANTI et al 2009) Essas H1-KAPs foram
denominadas de KAP3 KAP4a KAP4b KAP4c KAP6 e KAP7 Nosso grupo iniciou
a caracterizaccedilatildeo das proteiacutenas TcKAP4 e TcKAP6 mostrando que elas se localizam
no cinetoplasto mas com padrotildees distintos de distribuiccedilatildeo dependendo da forma do
ciclo de vida do parasita (CAVALCANTI et al 2009) Mais recentemente mostramos
que o nocaute da TcKAP3 natildeo afeta a proliferaccedilatildeo diferenciaccedilatildeo e infectividade do
parasita (DE SOUZA et al 2010)
A complexidade da rede de kDNA sugere portanto que as diferentes KAPs
atuem em conjunto algumas vezes de modo redundante para desempenhar
funccedilotildees na condensaccedilatildeo replicaccedilatildeo segregaccedilatildeo dessa estrutura
35
2 OBJETIVOS
21 OBJETIVO GERAL
O objetivo principal deste trabalho eacute caracterizar a funccedilatildeo da TcKAP7 avaliando seu
papel na biologia do parasita
211 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS
a) Analisar a localizaccedilatildeo subcelular da TcKAP7 atraveacutes de ensaios de
imunofluorescecircncia
b) Produzir TcKAP7 recombinante em larga escala para ensaios de biologia
estrutural
c) Estudar a viabilidade do parasita na ausecircncia do gene TcKAP7 para os parasitas
viaacuteveis analisar morfologia e ultraestrutura do cinetoplasto multiplicaccedilatildeo
diferenciaccedilatildeo e infectividade
36
3 MATERIAIS E MEacuteTODOS
31 Reagentes e Soluccedilotildees Utilizados
311 Reagentes
AmershamBioscience dNTPs Hybond C Hybond N kit ECL de western blotting
filmes de raio-X Hyperfilmreg anticorpo monoclonal anti-Histidina
Bio-Rad Acrilamida Agarose (UltraPure DNA grade) Azul de Bromofenol Bis-
Acrilamida Persulfato de Amocircnia
Cult-lab RPMI 1640
Difco Baacutecto-Aacutegar Bactotriptona Extrato de levedura Infuso de fiacutegado Triptose
Invitrogen Inc EDTA Fenol TRIS Nick Translation kit Taq DNA polymerase
IPTG Agarose X-Gal DNA de λHindIII Marcador de massa molecular Benchmark
Alexa Fluacuteor 458 1 kb Plus DNA Ladder Soro Fetal Bovino T4 DNA ligase
Merck Acetato de Soacutedio Aacutecido Aceacutetico Glacial Cloreto de CaacutelcioCloreto de
Potaacutessio Cloreto de Soacutedio Etanol Absoluto Glicina Glicose Hidroacutexido de soacutedio
Isopropanol HCl Na2HPO4
New England Biolabs Endonucleases de restriccedilatildeo
Qiagen Qiaquick PCR Purification kit
Serva Electrophoresis Alu-Gel S
Sigma Acetato de amocircnia Ampicilina Brometo de Etiacutedeo BSA Kanamicina
Glicerol Hepes Cloreto de Magneacutesio Tetraciclina β-mercaptoetanol DEAE-
celulose Tween 20 adjuvante completo de Freund monoclonal M2 anti-FLAG
312 Tampotildees e Soluccedilotildees
PBS NaCl 137 mM KCl 27 mM Na2HPO4 43 mM e KH2PO4 15 mM
PSG Na2HPO4 (anidro) 4747 mM NaH2PO4 H2O 25 mM NaCl 3676 mM e
glicose 555 mM
Soluccedilatildeo de tripsinazaccedilatildeo tripsina 005 (mv) e EDTA 002 (mv) em PBS pH
80
37
Soluccedilatildeo de bloqueio para imunofluorescecircncia PBS e BSA 1 (albumina seacuterica
bovina)
Soluccedilatildeo de bloqueio para western blot TBST e leite em poacute desnatado 5
Soluccedilatildeo de lise para Toothpick NaOH 50 mM Glicerol 5 SDS 05 EDTA 5
mM e azul de bromofenol 0025
Soluccedilatildeo Ponceau S Ponceau S 05 em aacutecido aceacutetico 1
Soluccedilatildeo de coloraccedilatildeo para geacuteis de proteiacutena Coomassie blue R-250 01 em
metanolaacutecido aceacutetico (4510)
Soluccedilatildeo para descoloraccedilatildeo de geacuteis de proteiacutena Metanol 4 aacutecido aceacutetico 75
Tampatildeo de lise hipotocircnico Tris-HCl 10mM pH 75 NaCl 10mM MgCl2 5 mM β-
mercaptoetanol 5 mM
Tampatildeo A para cromatografia de afinidade Tris-HCl 20 mM pH 75 NaCl 500 mM
Tampatildeo B para cromatografia de afinidade Tampatildeo A contendo imidazol 1M
Tampatildeo B para cromatografia de troca iocircnica Tris-HCl 50 mM pH 80 NaCl 1M
Soluccedilatildeo de depurinaccedilatildeo para Southern blot HCl 025 M
Soluccedilatildeo desnaturante para Southern blot NaOH 05 M e NaCl 15 M
Soluccedilatildeo neutralizante para Southern blot Tris-HCl 05 M pH 75 e NaCl 15 M
Soluccedilatildeo Denhardt (50X) ficoll 05 polivinilpirrolidona 06 e albumina de soro
bovino 02
Soluccedilatildeo de hibridaccedilatildeo para Southern blot DNA de esperma de salmatildeo do tipo III
01 mgml fragmentado por ultra-som e desnaturado SSC 6X soluccedilatildeo de denhardt
6X e SDS 1
SSC 20X NaCl 3 M pH 70 e citrato de soacutedio 03 M
Soluccedilatildeo de baixa estringecircncia SSC 2X e SDS 01
Soluccedilatildeo de meacutedia estringecircncia SSC 1X e SDS 01
Soluccedilatildeo de alta estringecircncia SSC 01X e SDS 01
Tampatildeo de eletroporaccedilatildeo para T cruzi NaCl 140 mM HEPES (aacutecido) 25 mM e
Na2HPO4 074 mM pH 75
Tampatildeo ZPFM de eletroporaccedilatildeo de T brucei NaCl 129 mM KH2PO4 15mM KCl
8mM NaH2PO4 8mM MgCl2 15mM CaCl2 90 mM e CH3COONa 24 mM pH 70
Tampatildeo TELT Tris-HCl 50 mM pH 80 EDTA 625 mM pH 90 LiCl 25 M e Triton
X-100 4
Tampatildeo de amostra para DNA 10X Ficoll 400 25 azul de bromofenol 025 e
xileno cianol FF 025
38
Tampatildeo de amostra para proteiacutena 4X Tris-HCl 40 mM pH 68 SDS 1 β-
mercaptoetanol 25 glicerol 6 e azul de bromofenol 0005
Tampatildeo de eletroforese para SDS-PAGE 1X Tris-base 25 mM glicina 192 mM e
SDS 01
Tampatildeo de lise de bacteacuterias Tris-HCl 20 mM pH 75 NaCl 500 mM PMSF1 mM
Tampatildeo para transferecircncia (western blotting) 1X Tris-base 25 mM glicina 192
mM e metanol 20
Tampatildeo TBE Tris base 89 mM aacutecido boacuterico 89 mM e EDTA 2 mM
TBS Tris-HCl 20 mM pH 80 e NaCl 150 mM
TBST TBS e Tween 20 01
TE Tris-HCl 10 mM pH 80 e EDTA 1 mM
313 Meios de cultura
LB Triptona 1 extrato de levedura 5 e NaCl 1
Meio LIT (liver infusion tryptose) infuso de fiacutegado 05 NaCl 753 mM KCl 54
mM glicose 10 mM bacto-triptose 05 Na2HPO4 564 mM hemina 00025 soro
fetal bovino 10 e extrato de levedura 15 gl
Meio TAU NaCl 190 mM KCl 17 mM MgCl2 2 mM CaCl2 2 mM e tampatildeo fosfato 8
mM pH 60
Meio TAU3AAG meio TAU suplementado com L-prolina 10 mM glutamato soacutedico
50 mM aspartato soacutedico 2 mM e glicose 10 mM
32 Cultivo do Trypanosoma cruzi
Neste trabalho foi utilizado o clone Dm28c de T cruzi (CONTRERAS et al
1985 CONTRERAS et al 1988) nas formas epimastigota e tripomastigota
metaciacuteclico
321 Epimastigotas
Formas epimastigotas de T cruzi foram cultivadas em meio LIT (CAMARGO
1964) a 28 oC com passagens a cada trecircs dias e inoacuteculo de 1 x 106 ceacutelulasml As
formas epimastigotas foram coletadas por centrifugaccedilatildeo no terceiro dia de cultivo
39
(correspondente a fase logariacutetmica de crescimento baseada em curva de
crescimento realizada nas mesmas condiccedilotildees) quando a densidade celular
apresentava-se entre de 1 - 3 x 107 ceacutelulasml
322 Tripomastigotas metaciacuteclicos
As formas metaciacuteclicas foram obtidas atraveacutes do processo de diferenciaccedilatildeo
in vitro (BONALDO et al 1988) Formas epimastigotas em final de fase logariacutetmica
de crescimento (densidade celular entre 5 - 7 x 107 ceacutelulasml) foram coletadas por
centrifugaccedilatildeo a 7000 x g por 5 minutos a 10 oC e ressuspendidas em meio TAU
na concentraccedilatildeo de 5 x 108 ceacutelulasml e mantidas a 28 oC por 2 horas Apoacutes este
periacuteodo correspondente ao estresse nutricional as ceacutelulas foram transferidas para
garrafas de 300 cm2 contendo 200 ml de meio TAU3AAG (concentraccedilatildeo final de 5 x
106 ceacutelulasml) Uma proporccedilatildeo dos parasitas que se aderiram agrave superfiacutecie da
garrafa de cultivo se diferenciou em metaciacuteclicos os quais foram liberados no
sobrenadante (BONALDO et al 1988) Estas formas foram purificadas pela
passagem atraveacutes de uma coluna de afinidade contendo a resina DEAE celulose
equilibrada em PSG (SOUSA 1983) Este procedimento foi realizado com o tipo
selvagem para obtenccedilatildeo de extrato proteacuteico e tambeacutem com o mutante de T cruzi
para TcKAP7 para verificaccedilatildeo da capacidade de diferenciaccedilatildeo e infectividade onde
o nuacutemero de metaciacuteclicos no sobrenadante foi contado apoacutes 24 48 72 e 96 horas
da incubaccedilatildeo em meio TAU3AAG
33 Curva de crescimento de T cruzi
Formas epimastigotas de T cruzi clone Dm28c e do mutante de T cruzi para
TcKAP7 foram cultivadas como descrito no item 321 ateacute atingirem a fase
estacionaacuteria para a comparaccedilatildeo da taxa de crescimento de ambas Foram
inoculadas 1 x 106 epimastigotas por ml de meio LIT em garrafas de 25 cm2 e
incubadas em seguida a 28 degC Diariamente foi realizada a contagem das culturas
em cacircmaras de Neubauer em diluiccedilotildees apropriadas ateacute o deacutecimo dia O graacutefico da
curva de crescimento comparativa entre a cultura selvagem e a nocaute foi feito
utilizando o programa Microsoft Excel
40
34 Obtenccedilatildeo de DNA de T cruzi
A extraccedilatildeo de DNA foi realizada conforme descrito por Medina-Acosta amp
Cross (1993) Epimastigotas (1 x 107 ceacutelulas) foram coletadas por centrifugaccedilatildeo a
7000 x g por 5 min lavadas em PBS e ressuspendidas em 350 microl de tampatildeo TELT
Apoacutes 5 min de incubaccedilatildeo agrave temperatura ambiente foi adicionado agrave amostra 1
volume de fenolclorofoacutermio e o material foi centrifugado a 13000 x g por 5 min A
fase aquosa foi recolhida e o DNA foi precipitado com 2 volumes de etanol absoluto
e coletado por centrifugaccedilatildeo a 13000 x g por 10 min O DNA presente no sedimento
foi lavado com etanol 70 seco e em seguida ressuspendido em tampatildeo TE
contendo RNAse a 20 microgml
35 Obtenccedilatildeo de kDNA de T cruzi
A extraccedilatildeo do kDNA de T cruzi foi realizada de acordo com Morel e
colaboradores (1980) com modificaccedilotildees
Formas epimastigotas (1 x109 ceacutelulas) foram coletadas por centrifugaccedilatildeo a
4000 x g por 10 min lavadas em PBS e ressuspendidas em 20 ml de Tampatildeo de
Lise Hipotocircnico Posteriormente adicionou-se Sacarose 025 M e o material foi
centrifugado 6000 x g por 10 min O pellet foi ressuspendido em 20 ml de Tris-HCl
10 mM pH 75 NaCl 10 Mm EDTA 5 mM SDS 05 A esta soluccedilatildeo foi adicionado
100 ug de proteinase K e a mesma permaneceu a 37 ordmC durante a noite No dia
seguinte as ceacutelulas foram transferidas para uma seringa de 50 ml aonde ocorreu a
quebra mecacircnica do DNA nuclear Este material foi ultracentrifugado a 27000 rpm a
4ordm C durante 1 hora utilizando o rotor SW28 Apoacutes centrifugaccedilatildeo o sobrenadante foi
desprezado e o pellet ressuspendido em 25 ml de TE e novamente ultracentrifugado
nas mesmas condiccedilotildees Apoacutes centrifugaccedilatildeo o pellet foi ressuspendido em 1ml de TE
e foi realizada a purificaccedilatildeo por fenolclorofoacutermio Apoacutes purificaccedilatildeo o material foi
ressuspendido em 300 ul de TE e utilizado para ensaios de SAXS
36 Obtenccedilatildeo de extrato proteico de T cruzi
41
As ceacutelulas foram coletadas por centrifugaccedilatildeo (4000 x g 5 min a 10 degC) e
lavadas duas vezes em PBS pH 75 Apoacutes as lavagens os parasitas foram
ressuspendidos em PBS e tampatildeo de amostra 4x foi adicionado de tal maneira que
a concentraccedilatildeo final fosse de 1 x 106 ceacutelulas equivalentesmicrol Os extratos foram
fervidos por 5 min e armazenados a - 70 degC
37 Clonagem do gene TcKAP7
A sequecircncia do gene TcKAP7 (ID Tc00104705350871950) foi obtida a
partir do banco de dados do genoma do T cruzi disponiacutevel no portal da internet
wwwgenedborg e a sua regiatildeo codificante foi amplificada por PCR com os primers
KAP7F (5rsquo ndash AAAGGATCCATGCTAAGAACTGTTCTGCCACTG 3rsquo) e KAP7R (5rsquo ndash
TCAGCGTCGACTTATGACGGTGGTGCAGGATCAGCAGCTGCAGTATTTT3rsquo) a
partir do DNA genocircmico de T cruzi Dm28c As sequecircncias de reconhecimento das
enzimas de restriccedilatildeo BamHI e SalI (marcadas em negrito) foram adicionadas na
extremidade 5rsquo dos primers KAP7F e KAP7R respectivamente As condiccedilotildees da
reaccedilatildeo de PCR foram as seguintes 100 ng de DNA total T cruzi 10 pmol de cada
primer 200 μM de cada dNTP MgCl2 15 mM tampatildeo Taq DNA polimerase 1x 25
U de Taq DNA polimerase (Invitrogen) A reaccedilatildeo de PCR foi processada no
termociclador modelo 9700 (Applied Biosystems EUA) com a desnaturaccedilatildeo do
material por 4 min a 94 degC seguida de 30 ciclos constando de desnaturaccedilatildeo a 94 degC
por 30 s hibridizaccedilatildeo dos primers a 58 degC por 30 s e extensatildeo a 72 degC por 1 min O
material amplificado foi purificado usando o kit Qiaquick PCR Purification (Qiagen) e
digerido com as enzimas de restriccedilatildeo BamHI e SalI com uso de 20 U de cada
enzima e seus respectivos tampotildees em volume final de 20 μl por 4 h a 37 oC O
material foi novamente purificado e utilizado para ligaccedilatildeo com o vetor pET28a
previamente digerido com as respectivas enzimas Bacteacuterias E coli cepa DH5α
foram transformadas com a ligaccedilatildeo A seleccedilatildeo dos clones contendo plasmiacutedeo com
o inserto desejado foi realizada atraveacutes da teacutecnica de palitagem ou de PCR de
colocircnia
38 Obtenccedilatildeo do cDNA de TcKAP7 atraveacutes de ensaio de RT-PCR
42
Com o intuito de verificar a posiccedilatildeo do mini-exon no transcrito de TcKAP7
realizamos o ensaio de RT-PCR para a obtenccedilatildeo do cDNA de TcKAP7
O protocolo utilizado foi baseado no manual teacutecnico da Promega (ΙmProm-ΙΙ
Reverse Transcription System) assim como os reagentes utilizados para essa
reaccedilatildeo Aproximadamente 10 μg de RNA foram incubados com o oligonucleotiacutedeo
KAP7R por 10 min a 70 degC e imediatamente transferidos para o gelo Agrave mistura foi
adicionada uma soluccedilatildeo de dNTPs (concentraccedilatildeo final de 05 mM para cada dNTP)
MgCl2 (120 μM) RNAse OUT (2 unidades) (Invitrogen) Transcriptase reversa
ImProm-II e respectivo tampatildeo A reaccedilatildeo foi incubada por 2 h a 42 degC As amostras
de cDNA foram purificadas por Microcon YM-30 (Millipore) conforme descriccedilatildeo do
fabricante e armazenadas a -20 degC Posteriormente foi realizada uma reaccedilatildeo de
PCR utilizando as seguintes condiccedilotildees 10 ng do cDNA de TcKAP7 de T cruzi 10
pmol do primer ME (5rsquo-AACGCTATTATTGATACAGTTTCTGTACTATATTG -3rsquo) e 10
pmol do primer KAP7R 200 μM de cada dNTP MgCl2 15 mM tampatildeo Taq DNA
polimerase 1x 25 U de Taq DNA polimerase (Invitrogen) A reaccedilatildeo de PCR foi
processada no termociclador modelo 9700 (Applied Biosystems EUA) com a
desnaturaccedilatildeo do material por 3 min a 94 degC seguida de 35 ciclos constando de
desnaturaccedilatildeo a 94 degC por 30 s hibridizaccedilatildeo dos primers a 55 degC por 30 s e extensatildeo
a 72 degC por 1 min O material amplificado foi purificado usando o kit Qiaquick PCR
Purification (Qiagen) e clonado diretamente no vetor pGEMreg-T Easy (Promega)
Bacteacuterias E coli cepa TOP10Frsquo foram transformadas com a ligaccedilatildeo e os plasmiacutedeos
recombinantes foram selecionados pela teacutecnica da palitagem ou de PCR de colocircnia
(itens 391 e 392) Apoacutes a minipreparaccedilatildeo (item 310) o material foi submetido ao
sequenciamento de DNA usando o serviccedilo de sequenciamento da empresa
Macrogen (Coreacuteia do Sul)
39 Seleccedilatildeo dos clones recombinantes
391 Teacutecnica de palitagem (toothpick)
As colocircnias foram coletadas com o auxiacutelio de palitos de dente (toothpick)
esteacutereis e transferidas para o fundo de tubos de micro-centriacutefuga e para a superfiacutecie
do meio LB solidificado (com o antibioacutetico de seleccedilatildeo do plasmiacutedeo) para a obtenccedilatildeo
de uma reacuteplica das colocircnias que foram analisadas (placa-matildee) A cada um dos
43
tubos foram acrescentados 15 μl do tampatildeo de lise Os tubos foram incubados em
banho-maria a 65 degC por 10 min As amostras entatildeo foram analisadas por
eletroforese em gel de agarose 1 usando o plasmiacutedeo sem inserto como controle
Posteriormente o gel foi corado com brometo de etiacutedeo (05 μgml) por
aproximadamente 20 min lavado com aacutegua e analisado sob luz ultravioleta para em
seguida ser fotografado no sistema de fotodocumentaccedilatildeo L-Pix (Locus
Biotecnologia Brasil)
392 Teacutecnica de PCR de colocircnia
Depois de selecionadas as colocircnias foram transferidas para tubos de PCR
contendo os reagentes da PCR e os primers que hibridizam com regiotildees que
flanqueiam o fragmento de DNA clonado em um volume total de 10 microl As amostras
foram incubadas a 94 degC por 3 min e submetidas a 35 ciclos de PCR com as
seguintes etapas 94 degC por 30 s 55 degC por 30 s e 72 degC por 1 min finalizando com
uma etapa de extensatildeo a 72 degC por 10 min Os produtos amplificados foram
analisados em gel de agarose 1 Posteriormente o gel foi corado com brometo de
etiacutedeo (05 microgml) por aproximadamente 20 min lavado com aacutegua e analisado sob
luz ultravioleta O gel foi fotografado no sistema de foto-documentaccedilatildeo L-Pix (Locus
Biotecnologia Brasil)
310 Preparaccedilatildeo de plasmiacutedeo em pequena escala (miniprep)
Os clones recombinantes foram cultivados em 3 ml de meio LB contendo o
antibioacutetico apropriado durante 18 h As culturas foram entatildeo centrifugadas a 12000
x g por 1min a temperatura ambiente e os plasmiacutedeos recombinantes purificados
com o sistema de minipreparaccedilatildeo de plasmiacutedeo (Miniprep Qiagen Kit) (QIAGEN) de
acordo com as recomendaccedilotildees do fabricante
311 Expressatildeo da proteiacutena TcKAP7 em E coli
Para expressar a proteiacutena recombinante TcKAP7 E coli cepa
BL21(DE3)STAR transformada com o plasmiacutedeo pET28a contendo o gene TcKPA7
(pET28a-TcKAP7) foi cultivada em meio LB contendo 25 μgml do antibioacutetico
44
kanamicina a 37 ordmC sob agitaccedilatildeo (preacute-inoacuteculo) Apoacutes 18 horas de crescimento uma
diluiccedilatildeo (110) foi realizada em novos tubos contendo meio LB-kanamicina e a
cultura foi incubada por 1 h a 37 ordmC sob agitaccedilatildeo constante Apoacutes este periacuteodo 05
mM IPTG (isopropil-1-tio-β-D-galactopiranosideo) foi adicionado agraves culturas A
incubaccedilatildeo prosseguiu por mais 3 h nas mesmas condiccedilotildees Como controle negativo
as ceacutelulas tambeacutem foram cultivadas nas mesmas condiccedilotildees poreacutem sem a adiccedilatildeo de
IPTG (cultura natildeo induzida) Aliacutequotas das culturas induzidas e natildeo induzidas com
IPTG foram processadas para anaacutelise em SDS-PAGE
312 Purificaccedilatildeo da proteiacutena recombinante TcKAP7
3121 Processamento da amostra
As bacteacuterias apoacutes a expressatildeo de TcKAP7 foram sedimentadas por
centrifugaccedilatildeo e ressuspendidas em tampatildeo de lise e lisadas utilizando o
microfluidificador modelo M-110L (Microfluidics EUA) Este meacutetodo divide a amostra
em dois fluxos e os conduz sob alta pressatildeo gerada por uma vaacutelvula pneumaacutetica
para uma cacircmara de interaccedilatildeo tambeacutem chamada de aacuterea de choque Esta cacircmara
eacute formada por um sistema de micro-canais dentro de um bloco de ceracircmica Dentro
da cacircmara ocorre cavitaccedilatildeo sonicaccedilatildeo e impacto dos dois fluxos em que a amostra
foi dividida levando a lise das ceacutelulas bacterianas (FIGURA 9) Este processo
provoca o aumento da temperatura e todo o sistema de tubos que conduz a amostra
necessita ser refrigerado com gelo e aacutegua a 4degC para prevenir a precipitaccedilatildeo de
proteiacutenas soluacuteveis
45
FIGURA 9 - REPRESENTACcedilAtildeO ESQUEMAacuteTICA DO MICROFLUIDIFICADOR LEGENDA A suspensatildeo de bacteacuterias eacute dividida em dois fluxos que se chocam sob alta pressatildeo dentro de micro-canais presentes na cacircmara de interaccedilatildeo da vaacutelvula homogeneizadora Melhores resultados satildeo obtidos aumentando o nuacutemero de ciclos de passagens Seta preenchida direccedilatildeo da amostra Seta pontilhada repetindo o ciclo de passagem FONTE Modificado de MAA amp HSU 1999
Apoacutes a lise o extrato soluacutevel foi obtido apoacutes centrifugaccedilatildeo a 30000 x g por
30 min a 4 degC
3122 Cromatografia de afinidade
Por ser expressa fusionada a uma cauda de seis histidinas a proteiacutena
TcKAP7 pode ser separada dos extratos celulares a partir da utilizaccedilatildeo de resina de
niacutequel da qual posteriormente a proteiacutena seraacute eluiacuteda
A purificaccedilatildeo da proteiacutena TcKPA7 presente no sobrenadante foi realizada
em sistema FPLC (Fast Performance Liquid Chromatography ndash GE Healthcare) com
coluna HiTrap Chelating de 1 mL (GE Healthcare) A coluna foi carregada com
soluccedilatildeo NiSO4 100 mM e equilibrada com tampatildeo A para cromatografia de afinidade
Durante a purificaccedilatildeo foi utilizado um gradiente de 0-100 de tampatildeo B para
cromatografia de afinidade As fraccedilotildees provenientes da cromatografia foram
analisadas atraveacutes de SDS-PAGE
Suspensatildeo de bacteacuterias
Ceacutelulas lisadasBomba de
alta pressatildeo
Micro-canais
Vaacutelvula homogeneizadora
46
3123 Cromatografia de troca iocircnica
Para eliminar contaminantes remanescentes da cromatografia de afinidade
a amostra contendo a proteiacutena de interesse foi submetida a uma segunda etapa
cromatograacutefica cromatografia de troca iocircnica utilizando-se a coluna HiTraptrade SP (GE
Healthcare) no sistema de FPLC (GE Healthcare)
Primeiramente a amostra foi diluiacuteda para reduccedilatildeo da concentraccedilatildeo salina e
a coluna foi lavada com 2 volumes de tampatildeo B para cromatografia de troca iocircnica e
depois com 2 volumes de tampatildeo A utilizado na cromatografia de afinidade O
gradiente de passagem do tampatildeo B foi de 0 a 100 e a proteiacutena TcKAP7 foi
obtida na fraccedilatildeo de material natildeo ligado agrave resina (Flow-through) (FT)
3124 Cromatografia de gel filtraccedilatildeo
Amostras da cromatografia de troca iocircnica que continham a proteiacutena de
interesse foram concentradas atraveacutes de filtraccedilatildeo A soluccedilatildeo foi colocada em filtro
Amicon Ultra MWCO 10000 (Milipore) e centrifugada a 4000 rpm a 4 ordmC O
experimento foi realizado em sistema FPLC (GE Healthcare) com a coluna
Superdex 200 HR 1030 (GE Healthcare) em tampatildeo HEPES 20 mM pH 74 e de
cloreto de soacutedio100 mM
313 Espalhamento Dinacircmico de Luz ndash DLS
O experimento foi realizado em equipamento DynaPro Molecular instrument
a 4 ordmC As amostras foram previamente centrifugadas por 5 minutos a 15000 rpm a
4 ordmC A coleta de dados foi realizada com intervalos de 2 segundos com 100
aquisiccedilotildees Para cada leitura utilizou-se 5 microl de amostra proteica
314 Espectroscopia de dicroiacutesmo circular (CD)
O espectro de CD foi coletado usando espectropolariacutemetro Jasco J-715
(Jasco Corporation Toacutekio Japatildeo) sendo a temperatura mantida a 20 degC atraveacutes de
um Peltie rType Control System PFD425S (JASCO) Todos os dados foram
coletados usando cubeta de quartzo de 1 mm de caminho oacuteptico
47
Mediu-se a elipticidade em graus na regiatildeo do UV distante no intervalo de
comprimento de onda de 260 nm a 200 nm com uma velocidade de 100 nmmin
sendo feitas no total 30 leituras com resposta de 1 segundo em varredura contiacutenua
Os valores obtidos em miligraus foram convertidos para elipticidade molar
por resiacuteduo ([θ]MRW) em miligrauscm2dmol-1 que eacute definida pela equaccedilatildeo (Adler et
al 1973)
Onde θobs eacute a elipsidade observada em graus MRW eacute o peso molecular
meacutedio dos resiacuteduos da proteiacutena d eacute o caminho oacuteptico da cubeta em centiacutemetros e c
eacute a concentraccedilatildeo da proteiacutena em mgmL O MRW eacute calculado dividindo-se o peso
molecular da proteiacutena pelo nuacutemero de resiacuteduos
315 Quantificaccedilatildeo e concentraccedilatildeo
As amostras obtidas a partir da purificaccedilatildeo tiveram a concentraccedilatildeo calculada
utillizando a absorbacircncia mensurada pelo aparelho NanoDrop (Thermo Fisher
Scientific) levando-se em consideraccedilatildeo o coeficiente de extinccedilatildeo e teoacuterico da
proteiacutena obtido a partir do ProtParam (httpusexpasyorgtoolsprotparamhtml) e o
peso molecular da proteiacutena que eacute de cerca de 28 kDa
Obtidas as concentraccedilotildees a amostra foi concentrada pelo meacutetodo de
filtraccedilatildeo utilizando o filtro Amiconreg Ultra Centrifugal Filter (Millipore) com poro de
10000 Da A amostra foi centrifugada ateacute a obtenccedilatildeo de uma concentraccedilatildeo final de
5 mgml para os ensaios de cristalizaccedilatildeo Uma aliacutequota da proteiacutena concentrada foi
utilizada para anaacutelise por SDS-PAGE
316 Ensaios de Cristalizaccedilatildeo
Os ensaios de cristalizaccedilatildeo foram realizados empregando-se a teacutecnica de
difusatildeo de vapor em gota sentada utilizando-se os equipamentos disponiacuteveis no
Laboratoacuterio Robotizado de Cristalizaccedilatildeo de Proteiacutenas LNBio Os ensaios foram
feitos em placas de 96 poccedilos e as gotas preparadas pelo robocirc Honeybee
utilizando-se os kits disponiacuteveis no laboratoacuterio Crystal Screen HT (Hampton
Research) JCSG+ Suite (Molecular Dimensions) PACT Suite (Molecular
cd
MRWobs
10][
48
Dimensions) Precipitant Synergy (Rigaku Reagents) SaltRx HT (Hampton
Research) Wizard IampII (Rigaku Reagents)
317 Espalhamento de raio-X a baixo acircngulo (SAXS)
Atraveacutes da teacutecnica de SAXS informaccedilotildees sobre a massa molecular das
partiacuteculas espalhadoras e do raio de giro (Rg) da proteiacutena de estudo satildeo obtidos a
partir dos dados coletados Por meio de programas computacionais como DAMMIN
(SVERGUN1999) e GASBOR (SVERGUN et al 2001) um modelo de baixa
resoluccedilatildeo da forma da proteiacutena pode ser obtido
Os dados de SAXS foram obtidos na linha de luz D02A ndash SAXS2 no
Laboratoacuterio Nacional de Luz Siacutencrotron (LNLS) Campinas-SP Brasil usando
comprimento de onda de 148 A e um detector bidimensional com arranjo CCD
(MARCCD USA) de 165 mm A distacircncia do detector para a amostra foi de 106804
mm e os dados na faixa de 002 nm-1 para 021 nm-1 foram coletados usando
proteiacutena pura nas concentraccedilotildees de 5 mgml em tampatildeo em 20 mM HEPES pH 74
e 100 mM de cloreto de soacutedioExposiccedilotildees de 300 e 600 s foram realizadas e os
dados do tampatildeo foram coletados antes e depois dos dados da amostra para fazer a
correccedilatildeo do solvente e normalizaccedilatildeo do espalhamento
Ajuste dos dados experimentais e avaliaccedilatildeo da funccedilatildeo p(R) foram realizados
utilizando o programa GNOM (SVERGUN 1992) O envelope a baixa resoluccedilatildeo de
TcKAP7 foi determinado usando modelagem abnitio implementada no programa
DAMMIN O modelo a baixa resoluccedilatildeo e o modelo da estrutura tridimensional foram
superpostas usando o programa SUPCOMB (KOZIN amp SVERGUN 2001)
318 Modelagem de TcKAP7
Um modelo da estrutura tridimensional de TcKAP7 foi construiacutedo Para a
construccedilatildeo do modelo foi utilizado o programa MODELLER (SALI amp BLUNDELL
1993) este programa eacute utilizado para a modelagem por homologia a estruturas
tridimensionais de proteiacutenas O programa automaticamente constroacutei um modelo
baseado na anaacutelise de um alinhamento de sequecircncias entre a proteiacutena para a qual
se deseja construir o modelo e uma proteiacutena relacionada cuja estrutura
tridimensional jaacute foi resolvida A qualidade do modelo pode ser avaliada por
49
exemplo atraveacutes de graacuteficos e tabelas que analisam restriccedilotildees quiacutemicas e fiacutesicas de
cada aacutetomo constituinte do modelo
319 Obtenccedilatildeo de antissoro policlonal contra TcKAP7
A proteiacutena TcKPA7 recombinante purificada foi inoculada em camundongos
da linhagem BALBc por via intraperitonial com 4 aplicaccedilotildees de aproximadamente
20-50 μg de antiacutegeno em intervalos de 15 dias seguida de obtenccedilatildeo do soro apoacutes 1
semana da uacuteltima inoculaccedilatildeo O antiacutegeno foi emulsificado em adjuvante completo de
Freund na primeira inoculaccedilatildeo e com adjuvante a base de hidroacutexido de alumiacutenio
(Alu-Gel Serva) nas inoculaccedilotildees posteriores
320 Anaacutelise da expressatildeo do gene TcKAP7 e de seu mutante por ensaio tipo
western blot
Este procedimento foi executado segundo o meacutetodo de Towbin e
colaboradores (1979) Aliacutequotas de extratos de T cruzi equivalentes a 1 x 107
ceacutelulas foram submetidos agrave SDS-PAGE Apoacutes a separaccedilatildeo eletroforeacutetica as
proteiacutenas foram transferidas para membrana de nitrocelulose (Hybond C Amersham
Biosciences) em tampatildeo de western por 2 h a 60 V ou 20 V por 16 h Apoacutes a
transferecircncia a membrana foi corada com Ponceau S e descorada suavemente com
aacutegua bidestilada para a identificaccedilatildeo das bandas do marcador de massa molecular
A membrana foi entatildeo incubada em soluccedilatildeo de bloqueio por 30 min sob agitaccedilatildeo
suave
Apoacutes o bloqueio a membrana foi incubada com os soros policlonais ou
anticorpos monoclonais em TBST-leite por aproximadamente 1 h a 37degC A
membrana foi lavada 5 vezes com TBST Em seguida a membrana foi incubada
com anticorpo secundaacuterio anti-IgG de camundongo conjugado com a enzima
peroxidase (Pierce ndash Thermo Scientific) por 1h na diluiccedilatildeo de 16000 em TBST-leite
a temperatura ambiente A membrana foi submetida a mais cinco lavagens com
TBST e a reaccedilatildeo era evidenciada utilizando substrato quimioluminescente (West
Pico Pierce ndash ThermoScientific) sobre a membrana a qual era exposta a um filme
para raios-X (Hyperfilm ECL GE)
50
321 Superexpressatildeo de TcKAP7
3211 Amplificaccedilatildeo e clonagem do gene TcKAP7 no vetor pNEO3xFlag para
superexpressatildeo da proteiacutena
O gene TcKAP7 foi clonado no vetor pNEO3xFLAG construiacutedo no nosso
laboratoacuterio a partir do vetor pTcGW-ProtCcarboxi (BATISTA et al 2010) que utiliza
o sistema Gateway de clonagem (Invitrogen) Os vetores foram construiacutedos
utilizando-se como base o pBluescript II (Stratagene San Diego USA) onde foram
inseridas trecircs sequencias que codificam para regiotildees intergecircnicas (IR) de T cruzi A
primeira TcUIR eacute a regiatildeo intergecircnica do locus de ubiquitinacalmodulina de T
cruzi (BATISTA et al 2010) As outras duas regiotildees intergecircnicas ITR1 e ITR2 foram
selecionadas a partir de genes de copia uacutenica no genoma e que possuem um niacutevel
de expressatildeo constitutivo nos estaacutegios epimastigota e tripomastigota metaciclicos
avaliados por dados de proteocircmica e RNAseq (Comunicaccedilatildeo pessoal Michel
Batista) Aleacutem disso esse vetor confere agrave regiatildeo C-terminal da proteiacutena
recombinante resultante da clonagem neste vetor trecircs etiquetas FLAG (sequecircncia
DYKDDDDK) em tandem (FIGURA 10)
FIGURA 10 VETOR PARA EXPRESSAtildeO EM T CRUZI P3XFLAG
LEGENDA PR ndash PROMOTOR RIBOSOMAL TCUIR ITR1 E ITR2 - REGIOtildeES INTERGENICAS ATTR1 E ATTR2 ndash REGIOtildeES PARA RECOMBINACcedilAtildeO CMreg - RESISTEcircNCIA A CLORANFENICOL CCDB ndash GENE PARA SELECcedilAtildeO NEGATIVA DURANTE A CLONAGEM 3XFLAG ndash TREcircS ETIQUETAS DE FLAG (DYKDDDDK) NEOMICINA ndash GENE DE RESISTEcircNCIA A NEOMICINA
O gene TcKAP7 foi amplificado utilizando os primers especiacuteficos
KAP7GtwFor (5rsquo-
GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTGCCCGCGAAGTATTCAGCAGCCC)
e KAP7GtwRev (5rsquo-
GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCGTGGTACATGGCGTACGGGTTG)
PR TcUIR Att R1 Cmreg ccdB Att R2 3x Flag ITR1 Neomicina ITR2
51
os quais possuem os siacutetios attB indicados em negrito As condiccedilotildees desta reaccedilatildeo
de PCR foram as seguintes 100 ng de DNA genocircmico de T cruzi 10 pmol de cada
primer 200 μM de cada dNTP MgSO4 2 mM tampatildeo Taq DNA polimerase High
Fidelity 1x 1U de Platinum Taq DNA polimerase high fidelity (Invitrogen) A reaccedilatildeo
de PCR foi processada no termociclador modelo 9700 (AppliedBiosystems EUA)
com a desnaturaccedilatildeo do material por 5 min a 94 degC seguida de 35 ciclos constando
de desnaturaccedilatildeo a 94 degC por 30 s hibridizaccedilatildeo dos primers a 58 degC por 30 s e
extensatildeo a 72 degC por 15 min
O gene amplificado foi clonado no vetor de entrada pDONRtrade221
(Invitrogen) A reaccedilatildeo foi feita com 150 ng dos produtos de PCR contendo os siacutetios
attB 150 ng do plasmiacutedeo pDONRtrade221 1 μL de BP ClonaseTM enzyme mix e TE
para um volume final de 10 μL e com incubaccedilatildeo a 25 degC por 16 h Foi entatildeo
adicionado 1 microL de proteinase K (2 mgmL) com incubaccedilatildeo por 10 min a 37 degC Os
clones em pDONRtrade221 foram transformados em ceacutelulas caacutelcio-competentes E coli
DH5α conforme protocolo de transformaccedilatildeo de ceacutelulas caacutelcio-competentes Apoacutes
transformaccedilatildeo a cultura foi semeada em placa de LBKan (kanamicina 25 microgmL) e
incubada a 37 degC durante 16 h
Para verificar a presenccedila de clones com os insertos de interesse foi feita a
teacutecnica da palitagem As colocircnias selecionadas foram inoculadas em 5 mL de meio
LBKan e incubadas por 16 h a 37 degC com agitaccedilatildeo (190 rpm) A purificaccedilatildeo dos
plasmiacutedeos foi realizada com o kit QIAprepreg Spin Miniprep (Qiagen) conforme
orientaccedilotildees do fabricante
Apoacutes esta etapa foi necessaacuterio transferir os insertos para o vetor de destino
pNEO3xFlag A troca de insertos entre os vetores de entrada e destino denominada
de reaccedilatildeo LR foi realizada conforme orientaccedilotildees do fabricante (Gateway LR clonase
enzyme mix) e ceacutelulas caacutelcio-competentes foram transformadas com os produtos
das recombinaccedilotildees conforme descrito anteriormente semeadas em placas de
LBAmp e incubadas a 37 degC durante 16 h
A verificaccedilatildeo de clones positivos foi realizada atraveacutes de PCR de colocircnias
As colocircnias selecionadas foram inoculadas em 5 mL de meio LB contendo ampicilina
(100 μgmL) e incubada a 37deg C por 16 h sob agitaccedilatildeo (200 rpm)O plasmiacutedeo
contendo o gene TcKAP7 foi denominado de pNEO_KAP7_3xFLAG
52
3212 Transfecccedilatildeo por eletroporaccedilatildeo
A transfecccedilatildeo das formas epimastigotas de T cruzi foi feita pela teacutecnica de
eletroporaccedilatildeo utilizando o equipamento genepulserreg apparatus (Bio-Rad) e cubetas
esteacutereis de eletroporaccedilatildeo gene pulsermicro pulserreg 02 cm (Bio-Rad) Formas
epimastigotas de T cruzi foram cultivadas em meio LIT ateacute uma densidade celular
de 3 x 107 ceacutelulasml Um volume de cultura correspondendo a 1 x 109 parasitas foi
centrifugado (4000 x g 4 degC) O sobrenadante foi descartado e as ceacutelulas foram
ressuspendidas em tampatildeo de eletroporaccedilatildeo esteacuteril e submetidas a centrifugaccedilatildeo
nas condiccedilotildees acima O sedimento celular foi ressuspendido em 2 ml de tampatildeo de
eletroporaccedilatildeo Em cubetas de eletroporaccedilatildeo previamente resfriadas a 4 degC foram
misturados 400 μL (2 x 108 ceacutelulas) da suspensatildeo dos parasitas e 50 μL (20 microg) do
plasmiacutedeo para superexpressatildeo (pNEO_KAP7_3XFLAG) Em paralelo parasitas
foram submetidos agraves mesmas condiccedilotildees mas na ausecircncia de DNA (controle
negativo da transfecccedilatildeo)
As cubetas foram entatildeo mantidas em gelo por 10 min Em seguida os
parasitas foram transfectados com dois pulsos sequenciais de 500 μF e 450 volts
Apoacutes o esse procedimento as cubetas foram mantidas em gelo por mais 5 min A
suspensatildeo de parasitas transfectados foi entatildeo inoculada em 10 mL de meio LIT
suplementado com 10000 U de penicilina e estreptomicina a 10 μgmL
3213 Seleccedilatildeo dos transfectantes
O gene para a enzima neomicina fosfotransferase foi utilizado como
marcador de seleccedilatildeo dos parasitas carregando o plasmiacutedeo para a superexpressatildeo
pNEO_KAP7_3XFLAG Para tanto o antibioacutetico G418 foi adicionado agraves culturas
apoacutes 24 h da transfecccedilatildeo na concentraccedilatildeo final de 500 μgmL Entre 3 e 4 dias apoacutes
a transfecccedilatildeo foi realizada a primeira passagem (14) A partir desse ponto foram
feitas passagens semanais na proporccedilatildeo de 110 ateacute que natildeo fosse observado
crescimento nas duas uacuteltimas passagens da cultura do controle negativo da
transfecccedilatildeo
A expressatildeo da proteiacutena KAP7-FLAG foi analisada atraveacutes de ensaios de
western blot e imunofluorescecircncia
53
322 Deleccedilatildeo do gene TcKAP7 por nocaute gecircnico
3221 Amplificaccedilatildeo e clonagem das regiotildees a montante e a jusante do gene
TcKAP7
As regiotildees a montante (upstream) e a jusante (downstream) do gene TcKAP7
respectivamente denominadas de UPSKAP7 (521 pb) e DOWNKAP7 (500 pb)
foram amplificadas por PCR usando os primers descritos nas TABELAS 1 E 2 A
regiatildeo denominada DOWNKAP7 conteacutem ainda 139 pb do final da regiatildeo codante de
TcKAP7
QUADRO 1 - RELACcedilAtildeO DOS PRIMERS UTILIZADOS PARA A CLONAGEM DA
REGIAtildeO UPSTREAM DE TcKAP7 NO VETOR pNEO1
UPSKAP7F GGGGTCGACCGTTGCTGGTTTTTCTTTTGGTGT
UPSKAP7R GGGAAGCTTGCTTCAAAACGTCTATGCGGGC
Os siacutetios das enzimas de restriccedilatildeo SalI (GTCGAC) e HindIII (AAGCTT) adicionados aos primers estatildeo em negrito
QUADRO 2 - RELACcedilAtildeO DOS PRIMERS UTILIZADOS PARA A CLONAGEM DA
REGIAtildeO DOWNSTREAM DE TcKAP7 NO VETOR pNEO1
DOWNKAP7F GGGGAATTCGCCTCATATGACGCATCTCCCA
DOWNKAP7R GGGGGATCCTGTTGGCGCTGTCAAGGAAGTAAG
Os siacutetios das enzimas de restriccedilatildeo EcoRI (GAATTC) e BamHI (GGATCC) adicionados aos primers estatildeo em negrito
As reaccedilotildees de PCR foram realizadas nas seguintes condiccedilotildees 100 ng de
DNA total de T cruzi Dm28c 10 pmol dos oligonucleotiacutedeos F e R 200 μM de cada
dNTP MgCl2 15 mM tampatildeo Taq DNA polimerase 1x 25 unidades de Taq DNA
polimerase (Invitrogen EUA) A reaccedilatildeo de PCR foi processada no termociclador
modelo 9700 (Applied Biosystems EUA) nas seguintes condiccedilotildees Desnaturaccedilatildeo do
54
material por 4 min a 94 degC seguida de 35 ciclos de desnaturaccedilatildeo a 92 degC por 30 s
hibridizaccedilatildeo dos oligonucleotiacutedeos a 56 degC por 30 s e extensatildeo a 72 degC por 1 min O
material amplificado foi purificado usando o Qiaquick PCR Purification (Qiagen) O
DNA purificado foi digerido com enzimas de restriccedilatildeo apropriadas para a clonagem
dos fragmentos nos vetores pNEO1 O plasmiacutedeo resultante da clonagem das
regiotildees UPSKAP7 e DOWNKAP7 foi denominado de pNEO1kap7 (Figura 11A)
Uma vez que o genoma do T cruzi eacute diploide construiacutemos um segundo
plasmiacutedeo para o nocaute do segundo alelo do gene TcKAP7 tendo como marca de
seleccedilatildeo o gene que codifica resistecircncia a higromicina B Esse plasmiacutedeo foi
construiacutedo usando como molde o plasmiacutedeo pNEO1kap7 O plasmiacutedeo pNEO1kap7
foi digerido com HindIII para remoccedilatildeo do gene neo e uma pequena porccedilatildeo da regiatildeo
DOWNSTREAM (220 pb) O plasmiacutedeo linearizado foi purificado do gel de agarose
usando o kit Qiaquick PCR Purification (Qiagen) e ligado com o gene higro O gene
higro foi amplificado usando os primers HIGROF
(GGGGGAAGCTTATGAAAAAGCCTGAACTCACCGCGAC) e HIGROR
(GGGAAGCTTCTATTCCTTTGCCCTCGGACGAGTGCTG) ambos contendo na
extremidade 5rsquo o siacutetio para a enzima de restriccedilatildeo HindIII (em negrito) O plasmiacutedeo
resultante da ligaccedilatildeo foi denominado de pHIGRO1kap7 (FIGURA 11B)
55
FIGURA 11 ESQUEMA DA CONSTRUCcedilAtildeO DOS VETORES UTILIZADOS PARA O NOCAUTE DO GENE TcKAP7 LEGENDA Nesta figura eacute observada a inserccedilatildeo das sequecircncias flanqueadoras do gene TcKAP7 juntamente com os respectivos siacutetios para cada enzima de restriccedilatildeo nos vetores de clonagem pNEO1 e pHIGRO1
3222 Amplificaccedilatildeo dos cassetes UPS-NEO-DOWN e UPS-HIGRO-DOWN para
transfecccedilatildeo de T cruzi
Os dois plasmiacutedeos recombinantes foram purificados pelo meacutetodo da lise
alcalina utilizando o kit de minipreparaccedilatildeo de plasmiacutedeos (Qiagen) As minipreps
foram utilizadas para a amplificaccedilatildeo da regiatildeo UPS-NEO-DOWN (cassete NEO) e da
regiatildeo UPS-HIGRO-DOWN (cassete HYG) por PCR usando os primers UPSKAP7F
e DOWNKAP7R As reaccedilotildees de PCR foram realizadas nas seguintes condiccedilotildees 20
ng do plasmiacutedeo pNEO1kap7 ou pHIGRO1kap7 10 pmol dos primers UPSKAP7F e
DOWNKAP7R 200 μM de cada dNTP MgCl2 15 mM tampatildeo Taq DNA polimerase
1x 25 unidades de Taq DNA polimerase (Invitrogen EUA) A reaccedilatildeo de PCR foi
processada no termociclador modelo 9700 (AppliedBiosystems EUA) nas seguintes
condiccedilotildees Desnaturaccedilatildeo do material por 4 min a 94 degC seguida de 35 ciclos de
desnaturaccedilatildeo a 92 degC por 30 s hibridizaccedilatildeo dos oligonucleotiacutedeos a 56 degC por 30 s e
56
extensatildeo a 68 degC por 2 min O material amplificado foi submetido agrave eletroforese em
gel preparativo de agarose 1 O gel foi corado com brometo de etiacutedeo (1 μgml) e a
banda correspondente a cada cassete foi removida do gel com auxiacutelio de uma
lacircmina de bisturi O DNA foi purificado por eletroeluiccedilatildeo dentro de saco de diaacutelise
nas condiccedilotildees de 100 V por 1 hora em tampatildeo TBE Para obter massa de DNA
suficiente para a transfecccedilatildeo (20 μg) foram feitas 10 reaccedilotildees de PCR com 100 μl
cada uma
3223 Transfecccedilatildeo do T cruzi com o cassete UPS-NEO-DOWN
Formas epimastigotas de T cruzi foram cultivadas em meio LIT ateacute 2 x 107
ceacutelulasml Os parasitas (1 x 108 ceacutelulas) foram coletados por centrifugaccedilatildeo a 6000
x g por 10 min a 4 degC O sedimento celular foi lavado com PBS esteacuteril e
ressuspendido em 1 ml de soluccedilatildeo de eletroporaccedilatildeo Volumes correspondentes a
04 ml da suspensatildeo de ceacutelulas foram transferidos para cubetas de eletroporaccedilatildeo
esteacutereis (02 cm de gap) (BioRad) e preacute-resfriadas Em uma delas foram adicionados
de 20 μg do fragmento representando o cassete NEO A outra cubeta contendo
apenas a suspensatildeo de parasitas foi usada como controle Apoacutes 10 minutos no gelo
as amostras contidas nas cubetas foram submetidas a 2 pulsos de 450 volts 500
microF utilizando o eletroporadorGenePulserreg IIApparatus (Bio-Rad) As amostras
foram incubadas novamente por 5 a 10 minutos no gelo em seguida foram
transferidas para garrafas de cultura de 25 cm2 contendo 10 ml de meio LIT
(suplementado com 10000 U de penicilina e estreptomicina a 10 mgml) As culturas
foram entatildeo incubadas a 28 degC Apoacutes 24 horas de incubaccedilatildeo adicionou-se o
antibioacutetico G418 na concentraccedilatildeo de 500 μgml As culturas foram mantidas por
sucessivas passagens (diluiccedilatildeo de 110) em meio LIT suplementado com G418 a
cada 8-10 dias ateacute a ausecircncia de proliferaccedilatildeo celular na cultura controle Os
parasitas nos quais TcKAP7 foi substituiacutedo pelo gene neo foram denominados deT
cruzi(kap7kap7neo) e foram testados para a correta inserccedilatildeo do gene neo no locus
genocircmico de TcKAP7
57
3224 Extraccedilatildeo de DNA dos transfectantes
T cruzi transfectado com o cassete NEO (T cruzi(kap7kap7neo) foi cultivado
em meio LIT suplementado com G418 (500 μgml) ateacute uma densidade de 3 x 107
ceacutelulasml Os parasitas foram coletados por centrifugaccedilatildeo por 1 min a 6000 x g e
lavados com PBS Em seguida os parasitas foram lisados gentilmente em 350 μl de
tampatildeo TELT conforme descrito no item 34
3225 Anaacutelise por PCR do DNA dos parasitas transfectados com o cassete
UPS-NEO-DOWN
As reaccedilotildees de PCR foram realizadas utilizando primers externos EXTF
(CCCGCTACGACTGCCCTCCACGCGGAAGGGAA) e EXTR
(AAGTAAACGGGAGAAGCAACACGATGGGAGGCTC) que natildeo estatildeo presentes na
construccedilatildeo do cassete UPS-NEO-DOWN combinados com os primers NEOF
(GGGGAAGCTTATGATTGAACAAGATGGATTGCACGCAG) e NEOR
(GGGGGAATTCAGAAGAACTCGTCAAGAAGGCGATAGAA)
As condiccedilotildees das reaccedilotildees foram as seguintes 100 ng do DNA total de T
cruzi Dm28c tipo selvagem (T cruzi(kap7kap7) ou tipo selvagem) ou do DNA da
populaccedilatildeo T cruzi(kap7kap7neo) (mutante simples nocaute) 10 pmol dos primers EXTF
+ NEOR e NEOF + EXTR 200 μM de cada dNTP MgCl2 15 mM tampatildeo Taq DNA
polimerase 1x 25 unidades de Taq DNA polimerase (Invitrogen EUA) A reaccedilatildeo de
PCR foi processada no termociclador modelo 9700 (AppliedBiosystems EUA) nas
seguintes condiccedilotildees Desnaturaccedilatildeo do material por 4 min a 94 degC seguida de 35
ciclos de desnaturaccedilatildeo a 92 degC por 30 s hibridizaccedilatildeo dos oligonucleotiacutedeos a 55 degC
por 30 s e extensatildeo a 72 degC por 2 min
3226 Transfecccedilatildeo do T cruzi com o cassete UPS-HIGRO-DOWN
Formas epimastigotas da populaccedilatildeo mutante de T cruzi (kap7kap7neo) foram
cultivadas em meio LIT suplementado com G418 (500 μgml) ateacute a densidade de 2 x
107 ceacutelulasml Os parasitas (1 x 108 ceacutelulas) foram coletados por centrifugaccedilatildeo a
6000 x g por 10 min a 4 degC e submetidos ao processo de eletroporaccedilatildeo como
descrito no item 3202 Para a transfecccedilatildeo foram usados 20 μg do fragmento
58
representando o cassete UPS-HIGRO-DOWN As culturas (transfectada e controle)
foram entatildeo incubadas a 28 degC em LIT suplementado de G418 Apoacutes 24 horas de
incubaccedilatildeo foi adicionado o antibioacutetico higromicina ao meio de cultura na
concentraccedilatildeo de 500 μgml As culturas foram mantidas por sucessivas passagens
(diluiccedilatildeo de 110) em meio LIT suplementado com G418 e higromicina a cada 8-10
dias ateacute a ausecircncia de proliferaccedilatildeo celular na cultura controle Mutantes nos quais
os dois alelos de TcKAP7 foram removidos e substituiacutedos pelos genes NEO e
HIGRO foram denominados com genoacutetipo T cruzi (kap7neokap7higro)
3227 Anaacutelise por PCR do DNA dos parasitas transfectados com o cassete
UPS-HIGRO-DOWN
As reaccedilotildees de PCR foram realizadas utilizando primers externos EXTF e
EXTR (item 3225) combinados com os primers HIGROF e HIGROR (item 3221)
As reaccedilotildees de PCR foram realizadas nas seguintes condiccedilotildees 100 ng do
DNA total de T cruzi(kap7kap7) ou do DNA do T cruzi(kap7neokap7higro) 10 pmol dos
primers EXTF + HIGROR e HIGROF + EXTR 200 μM de cada dNTP MgCl2 15
mM tampatildeo Taq DNA polimerase 1x 25 unidades de Taq DNA polimerase
(Invitrogen EUA) A reaccedilatildeo de PCR foi processada no termociclador modelo 9700
(Applied Biosystems EUA) nas seguintes condiccedilotildees Desnaturaccedilatildeo do material por
4 min a 94 degC seguida de 35 ciclos de desnaturaccedilatildeo a 92 degC por 30 s hibridizaccedilatildeo
dos oligonucleotiacutedeos a 55 degC por 30 s e extensatildeo a 72 degC por 2 min
3228 Anaacutelise da organizaccedilatildeo do gene TcKAP7 e da eficiecircncia de seu nocaute
atraveacutes de ensaio do tipo Southern blot
O DNA genocircmico (5 μg) de T cruzikap7kap7 e T cruzikap7neokap7higro foi
submetido a digestatildeo com a enzima de restriccedilatildeo HindIII de acordo com as
especificaccedilotildees do fornecedor Apoacutes 3 horas o DNA digerido foi submetido agrave
eletroforese em gel de agarose 08 em tampatildeo TBE a 100 V O gel foi corado por
brometo de etiacutedio (05 μgmL) e fotografado sob a luz ultravioleta (310 nm)
Posteriormente o gel foi tratado com soluccedilotildees de depurinaccedilatildeo por 15 minutos de
desnaturaccedilatildeo por 30 minutos (2 vezes) e soluccedilatildeo de neutralizaccedilatildeo por 30 minutos (2
vezes) O DNA foi transferido para uma membrana de nylon (Hybond N
59
AmershamBiosciences) por capilaridade (SAMBROOK et al 1989) utilizando-se de
uma ldquoponterdquo de papel 3 MM embebido em SSC 20X Apoacutes a transferecircncia o DNA foi
fixado agrave membrana por exposiccedilatildeo agrave luz ultravioleta com uma dose de 120 mJcm2
usando o aparelho Spectrolinker (Spectronicscorp USA) A membrana contendo o
DNA de T cruzi foi preacute-hibridizada em soluccedilatildeo de hibridizaccedilatildeo de DNA por 1 hora a
65 ordmC seguido da adiccedilatildeo da sonda marcada radioativamente com α-[P32
]-dCTP (10
μCiμl 3000 Cimmol) (Amersham Biosciences) preparada segundo meacutetodo de nick
translation descrito por Rigbyet al (1977) utilizando-se o meacutetodo de iniciaccedilatildeo por
random primers (Megaprimer DNA labeling kit ndash GE) conforme recomendaccedilotildees do
fabricante
Foram utilizadas 3 sondas satildeo elas fragmento do gene TcKAP7
correspondendo a regiatildeo compreendida entre os nucleotiacutedeos 1 e 560 o gene neo e
o gene higro Apoacutes a marcaccedilatildeo as sondas foram purificadas em colunas de
Sephadex G-50 (ProbeQuant ndash Amersham Biosciences) e adicionadas ao tampatildeo de
hibridizaccedilatildeo na concentraccedilatildeo de 5 x 106
cpmml As membranas foram incubadas
por 16 horas a 65 C e em seguida lavadas nesta temperatura duas vezes por 30
minutos com soluccedilotildees de alta meacutedia e baixa estringecircncia As membranas foram
expostas a filme de raio-X (Hyperfilmreg Amersham Biosciences) na presenccedila de tela
intensificadora (Dupont Cronex Lightining Plus) por tempo que varia entre 1 a 3 dias
a ndash70 C
323 Localizaccedilatildeo celular da proteiacutena TcKAP7 atraveacutes de ensaio de
imunofluorescecircncia
Formas epimastigotas de T cruzi foram coletadas por centrifugaccedilatildeo (4000 times
g 3 a 10 ordmC) lavadas duas vezes em PBS e depositadas sobre lacircminas de vidro
previamente tratadas com poli-L-lisina 001 diluiacuteda em PBS Os parasitas foram
entatildeo fixados com paraformaldeiacutedo 4 em PBS permeabilizados com Triton X-100
01 em PBS por 2 min agrave temperatura ambiente e incubados a 4ordmC durante 16 h
em soluccedilatildeo de bloqueio para imunofluorescecircncia (PBS 1X + BSA 1 ) Apoacutes o
bloqueio os parasitas foram incubados agrave temperatura ambiente por 1 h com o
anticorpo monoclonal anti-FLAG em uma diluiccedilatildeo de 11000 em soluccedilatildeo de bloqueio
para imunofluorescecircncia Depois disso as lacircminas foram submetidas a 5 lavagens
60
de 5 min cada em PBS Em seguida os parasitas foram incubados agrave temperatura
ambiente por 1 hora com o anticorpo secundaacuterio anti-IgG de camundongo conjugado
ao fluoroacuteforo Alexa Fluacuteor 488 (Invitrogen) diluiacutedo 1600 em soluccedilatildeo de bloqueio As
lacircminas foram lavadas 5 vezes com PBS e posteriormente incubadas com o corante
Hoechst 33342 (Invitrogen) a 2 μgμL em PBS por 5 min Apoacutes cinco lavagens com
PBS as lacircminas foram montadas com ProLong Gold Antifade (Invitrogen) sobre uma
lacircmina de microscopia oacutetica O material foi observado nos microscoacutepios Leica SP5 e
DMI6000
324 Anaacutelise da ultraestrutura do cinetoplasto do mutante de T cruzi para
TcKAP7 por microscopia eletrocircnica de transmissatildeo
Os parasitas foram coletados lavados com PBS e fixados em soluccedilatildeo
contendo 25 de glutaraldeiacutedo 4 de paraformaldeiacutedo e tampatildeo cacodilato 01 M
Em seguida os parasitas foram fixados por 1 h em soluccedilatildeo de 1 de tetroacutexido de
Oacutesmio e 08 de ferricianeto de potaacutessio diluiacutedos em tampatildeo cacodilato 01 M As
ceacutelulas foram entatildeo desidratadas em soluccedilatildeo contendo concentraccedilotildees crescentes
de acetona e incluiacutedas em Epon Apoacutes a obtenccedilatildeo de cortes ultrafinos dos parasitas
os mesmos foram contrastados em acetato de uranila e citrato de Chumbo antes de
serem observados e fotografados no microscoacutepio eletrocircnico de transmissatildeo Zeiss
900
325 Coloraccedilatildeo dos parasitas transfectados
A coloraccedilatildeo dos parasitas foi realizada pelo meacutetodo panoacutetico raacutepido
(Laborclin Pinhais Paranaacute Brasil) modificado
Formas epimastigotas do mutante de T cruzi para TcKAP7 foram cultivadas
como descrito no item 321 Os parasitas foram coletados por centrifugaccedilatildeo de 1
min a 4000 x g e ressuspensos em PBS Desta suspensatildeo uma gota foi retirada e
depositada sobre lacircminas previamente limpas Quando secas as lacircminas foram
imersas individualmente na Soluccedilatildeo 1 (Fixador) Soluccedilatildeo 2 (Revelador) e Soluccedilatildeo 3
(Corante) em cada uma por 30 s Apoacutes este processo as lacircminas foram lavadas em
aacutegua corrente secas agrave temperatura ambiente e cobertas com Permount e lamiacutenula
Os parasitas foram visualizados em microscoacutepio Nikon E600
61
326 Infecccedilatildeo de ceacutelulas Vero com o mutante de T cruzi para TcKAP7
Ceacutelulas Vero (ATCCreg Nuacutemero CRL-2783trade) foram cultivadas em garrafas
de 150 cm2 contendo meio RPMI suplementado com 5 de soro fetal bovino
(GIBCO) penicilina 100 UIml streptomicina 10 microgml e glutamina 2 mM a 37 o C
com 5 de CO2 Ao atingirem a confluecircncia (80 a 100) realizou-se a passagem
atraveacutes de tripsinizaccedilatildeo e foi feito um inoacuteculo de 1 x 107 ceacutelulas para cada nova
garrafa de 150 cm2 Apoacutes 24 horas estas ceacutelulas (50 ndash 70 de confluecircncia) foram
infectadas com formas metaciacuteclicas obtidas da diferenciaccedilatildeo do mutante de T cruzi
para TcKAP7 em microplacas de 24 poccedilos contendo lamiacutenulas de vidro com
diacircmetro de 13 mm A cada poccedilo foram adicionadas 2 x 104 ceacutelulas Vero Apoacutes 24
horas de cultivo as ceacutelulas foram infectadas com tripomastigotas metaciacuteclicos
(obtidos do sobrenadante das culturas de T cruzi diferenciados em meio TAU3AAG
sem purificaccedilatildeo na coluna de DEAE celulose) A infecccedilatildeo das ceacutelulas Vero foi
acompanhada diariamente por microscopia de contraste de fase
327 Anaacutelise da funccedilatildeo do gene TbKAP7 de Trypanosoma brucei atraveacutes de
ensaios de RNA de interferecircncia
Com o intuito de complementar os estudos da funccedilatildeo do gene TcKAP7 foi
utilizada a teacutecnica de RNA de interferecircncia O uso dessa metodologia compreende
uma abordagem alternativa agrave anaacutelise da funccedilatildeo gecircnica para genes ortoacutelogos deT
brucei por anaacutelises de RNAi uma vez que a maquinaria de RNAi em T cruzi eacute
inexistente (DA ROCHA et al 2003) Os resultados podem gerar evidecircncias que
estejam relacionadas agrave funcionalidade dos genes em T cruzi Esta abordagem foi
utilizada neste trabalho para auxiliar no estudo da funccedilatildeo do gene TcKAP7 a partir
do ortoacutelogo em T brucei ainda natildeo caracterizadoTbKAP7 Os ensaios de RNAi
foram realizados em T brucei cepa 29-13 (WIRTZ et al 1999) com sistema induzido
por tetraciclina utilizando o vetor p2T7-177 ilustrado na figura 12 Este vetor quando
transfectado no parasita integra-se aos minicromossomos do T brucei regiatildeo de
repeticcedilotildees 177 (FOLDYNOVA-TRANTIRKOVA et al 2005)
62
FIGURA 12 MAPA DO VETOR p2T7-177 UTILIZADO PARA ENSAIOS DE RNAi LEGENDA T7 prom Promotor de T7 RNA Polimerase induzido por tetraciclina T7 term Terminador de transcriccedilatildeo 177 Sequumlecircncia repetitiva de 177 pares de bases para alvo de inserccedilatildeo em minicromossomos BLEO gene de resistecircncia agrave fleomicina GFP Proteiacutena Green FluorescentProtein os siacutetios para as enzimas de restriccedilatildeo estatildeo indicados AmpR gene de resistecircncia agrave ampicilina (FONTE WICKSTEAD et al 2002)
As regiotildees do mRNA para alvos nos ensaios de RNAi foram escolhidas com
o auxiacutelio da ferramenta RNAit da base de dados do Trypanofan - Genocircmica
funcional de Tbrucei (httptrypanofanpathcamacuktrypanofanmain)
(REDMOND et al 2003) Essas regiotildees foram amplificadas por PCR usando como
molde o DNA total de T brucei (100 ngreaccedilatildeo) 10 pmol dos primers listados na
tabela 3 200 mM de cada dNTP 15 mM de MgCl2 tampatildeo Taq DNA polimerase 1x
63
(Invitrogen) e 25 unidades de Taq DNA polimerase (Invitrogen) A reaccedilatildeo foi
aquecida por 4 min a 94 degC e entatildeo submetida a 35 ciclos de desnaturaccedilatildeo a 94 degC
por 30 s anelamento a 55 degC por 30 s e extensatildeo a 72 degC por 1 min Os primers
utilizados apresentam siacutetio para as enzimas de restriccedilatildeo BamHI (F) ou HindIII (R)
Os produtos de PCR foram purificados por extraccedilatildeo com fenol-clorofoacutermio e
digeridos com as referentes enzimas
QUADRO 3 - RELACcedilAtildeO DOS PRIMERS UTILIZADOS PARA A AMPLIFICACcedilAtildeO DO
GENE TbKAP7
KAP7RNAiF
AAAGGATCCCTAACCTAACCTGCAGGGTCTCTCG
KAP7RNAiR
GCGAAGCTTTTGTTCCTTTACAAACGCCC
Os siacutetios das enzimas de restriccedilatildeo BamHI (GGATCC) e HindIII (AAGCTT) adicionados aos primers estatildeo em negrito
As clonagens foram confirmadas por PCR de colocircnia e os plasmiacutedeos foram
purificados pelo kit QIAprep Spin Miniprep (Qiagen) Apoacutes purificaccedilatildeo 10 μg dos
plasmiacutedeos foram linearizados com a enzima NotI conforme descrito pelo fabricante
O DNA foi precipitado e ressuspenso em 50 μl de meio de eletroporaccedilatildeo ZPFM para
transfecccedilatildeo do T brucei
Para cada transfecccedilatildeo foi utilizado um total de 4 x 107parasitas em fase logariacutetmica
de crescimento Os parasitas foram obtidos por centrifugaccedilatildeo (5000 x g por 10 min
a 4 degC) lavados em meio ZPFM e ressuspensos em 500 μl do mesmo meio A
transfecccedilatildeo foi feita em cubetas de eletroporaccedilatildeo (4 mm) usando o eletroporador da
BioRad (GenePulser II Electroporator) As condiccedilotildees utilizadas foram dois pulsos de
1600 V e 25 microF Os parasitas foram entatildeo transferidos para garrafas contendo meio
SDM-79 SFB 10 higromicina 50 μgml e G418 15 μgml A seleccedilatildeo dos parasitas
transfectados foi atraveacutes da adiccedilatildeo de 5μgmL de fleomicina resistecircncia conferida
pelo vetor p2T7-177 apoacutes 24 horas de cultivo O tempo para seleccedilatildeo foi entre duas
e trecircs semanas
64
3271 Induccedilatildeo do RNA dupla fita
A induccedilatildeo da expressatildeo de RNA dupla fita referente agrave porccedilatildeo do gene
TbKAP7 clonado no plasmiacutedeo p2T7-177 deu-se pela adiccedilatildeo de tetraciclina 2 μgml
a uma cultura transfectada de T brucei em fase de crescimento exponencial (~2 x
106 parasitasml) Nos dias que se seguiram 1μgml de tetraciclina foi adicionada
diariamente agraves culturas A observaccedilatildeo dos efeitos na curva de crescimento causada
por RNAi em T brucei foi realizada ao longo de uma semana com a contagem de
ceacutelulas e adiccedilatildeo diaacuteria de tetraciclina 1 μgml
65
4 RESULTADOS
41 Clonagem e caracterizaccedilatildeo do gene TcKAP7
A regiatildeo codificante do gene TcKAP7 (ID Tc00104705350871950) foi
obtida a partir do banco de dados do genoma do T cruzi disponiacutevel no portal da
internet wwwgenedborg e amplificada por PCR com os primers descritos no item
37
No genoma do T cruzi cepa CL Brener (EL-SAYED et al 2005) foram
identificados dois haploacutetipos do gene TcKAP7 que foram denominados neste
trabalho de haploacutetipo A (Tc00104705350871950) e haploacutetipo B
(Tc00104705350979320) Neste trabalho foi utilizado o gene TcKAP7 proveniente
da cepa Dm28c de T cruzi Este gene apresenta uma regiatildeo codante de 747 pb e
codifica uma proteiacutena de 276 kDa assumindo que o primeiro ATG apoacutes a sequecircncia
do mini-eacutexon seja usada na iniciaccedilatildeo da traduccedilatildeo
A figura 13 abaixo mostra o alinhamento de TcKAP7 das cepas CL Brener e
Dm28c
FIGURA 13 - COMPARACcedilAtildeO ENTRE AS SEQUumlEcircNCIAS DE AMINOAacuteCIDOS DEDUZIDAS DO GENE KAP7 DE T cruzi Dm28C E DOS HAPLOacuteTIPOS DE CL BRENER
LEGENDA As posiccedilotildees com aminoaacutecidos idecircnticos em todas as sequumlecircncias estatildeo coloridas em preto
66
Embora o gene TcKAP7 natildeo possua grande identidade com os com genes
ortoacutelogos em Trypanosoma brucei TbKAP7 (714 pb) (Tb106k151470) Leishmania
major LmKAP7 (1044 pb) (LMJF_36_5840) Leishmania infantum LiKAP7 (1044 pb)
(LINJ_36_6090) e Leishmania braziliensis LbKAP7 (1038 pb) (LBRM_35_0010)
cujos genomas tambeacutem foram sequumlenciados (BERRIMAN et al 2005 IVENS et al
2005 PEACOCK et al 2007) as sequecircncias de aminoaacutecidos das respectivas
proteiacutenas deduzidas a partir desses genes ainda compartilham certo grau de
similaridade entre si (FIGURA 14) Na tabela 4 pode-se visualizar o percentual de
identidade entre as proteiacutenas KAP7 dos tripanossomatiacutedeos que possuem o genoma
sequenciado
FIGURA 14 COMPARACcedilAtildeO ENTRE AS SEQUumlEcircNCIAS DE AMINOAacuteCIDOS DEDUZIDAS DO GENE KAP7 EM DIFERENTES TRIPANOSOMATIacuteDEOS LEGENDA Em preto encontram-se os resiacuteduos de aminoaacutecidos idecircnticos em todas as sequumlecircncias e em cinza os resiacuteduos conservados na maioria delas
67
QUADRO 4 - PERCENTUAL DE IDENTIDADE ENTRE AS PROTEIacuteNAS KAP7 NOS
TRIPANOSSOMATIacuteDEOS COM O GENOMA SEQUENCIADO
Os valores foram obtidos pelo alinhamento utilizando a ferramenta Clustal21
Mesmo apresentando pouca identidade e variaccedilatildeo de tamanho alguns
dados do genoma sugerem que esses genes satildeo ortoacutelogos entre si Pode-se
perceber uma sintenia entre seus loci nas vaacuterias espeacutecies de tripanosomatiacutedeos
(Cavalcanti et al 2009) (FIGURA 15)
FIGURA 15- SINTENIA DE TcKAP7 COM OUTROS TRIPANOSOMATIacuteDEOS LEGENDA Os dois contigs de TcKAP7 (TcA e TcB) estatildeo representados nesta figura juntamente com os contigs de outros tripanosomatiacutedeos (Tb= T brucei Lm= L major Li= L infantum e Lb= L brasiliensis) mostrando que KAP7 representado pela cor amarela apresenta uma sintenia entre seus loci em todas as espeacutecies mostradas sendo flanqueado pelo gene KAP4 em T cruzi e T brucei representado em azul Portanto em L majorL infantum eL brasiliensis ao lado direito de KAP7 estaacute o gene de uma proteiacutena hipoteacutetica representado pela cor vermelha e ao lado esquerdo encontra-se o gene da KAP4 representado em azul como mencionado anteriormente FONTE CAVALCANTI et al 2009
68
A expressatildeo de vaacuterios genes mitocondriais de C fasciculata e L major eacute
regulada durante o ciclo celular em parte por uma sequumlecircncia consenso
[(CA)AUAGAA(GA)] presente nas regiotildees 5rsquo e 3rsquo-UTR dos respectivos mRNAs
(BROWN amp RAY 1997 MAHMOOD et al 1999 MAHMOOD amp RAY 1998 PASION
et al 1996 ZICK et al 2005)
Assim resolvemos caracterizar a regiatildeo 5rsquo-UTR do transcrito TcKAP7 na
tentativa de identificar sinais com identidade com aqueles encontrados em C
fasciculata Na figura 16 estaacute representada a regiatildeo 5rsquo-UTR do transcrito TcKAP7
com a sequumlecircncia parcial do mini-exon proveniente do primer usado na teacutecnica de
RT-PCR bem como parte da regiatildeo codificante do gene O mini-exon estaacute situado a
129 bases a jusante do iniacutecio da regiatildeo codificante do transcrito TcKAP7 e define
portanto uma regiatildeo 5rsquo-UTR de 168 bases considerando que o tamanho do mini-
exon eacute de 39 bases A anaacutelise da regiatildeo 5rsquo-UTR mostrou um elemento com
caracteriacutesticas muito semelhantes aquele envolvido na regulaccedilatildeo de genes em C
fasciculata (sequencia (G)ATAGAA(G) mostrada no retacircngulo preto na FIGURA
16B) sugerindo que TcKAP7 seja regulada durante o ciclo celular
69
A
B
FIGURA 16 CARACTERIZACcedilAtildeO DA REGIAtildeO 5rsquo-UTR DO TRANSCRITO TcKAP7 LEGENDA A Esquema geral da localizaccedilatildeo do mini-exon de TcKAP7 e B Localizaccedilatildeo especiacutefica do mini-exon de TcKAP7 O mini-exon de TcKAP7 (sequecircncia parcial em verde) estaacute localizado a 129 pb da regiatildeo codante (representada em parte pela cor azul) A regiatildeo 5rsquoUTR do transcrito Tckap7 estaacute representada na cor rosa A possiacutevel sequencia consenso de regulaccedilatildeo durante o ciclo celular estaacute indicada no retacircngulo preto
42 Expressatildeo da proteiacutena TcKAP7 em T cruzi
Formas epimastigotas foram transfectadas com o plasmiacutedeo pNEO3XFLAG
contendo o gene TcKAP7 (pNEO_KAP7_3xFLAG) A expressatildeo da proteiacutena
TcKAP7-FLAG foi analisada por ensaio de western blot Os resultados mostraram
que a expressatildeo da proteiacutena TcKAP7-FLAG foi satisfatoacuteria correspondendo ao
tamanho esperado (FIGURA 17 ) a qual foi confirmada pela reatividade do anticorpo
monoclonal especiacutefico para as etiquetas FLAG (anti-FLAG)
70
FIGURA 17 ANAacuteLISE DA EXPRESSAtildeO DA PROTEIacuteNA DE FUSAtildeO TCKAP7-FLAG EM FORMAS EPIMASTIGOTAS DE T CRUZI
43 Localizaccedilatildeo celular de TcKAP7 atraveacutes de ensaio de imunofluorescecircncia
Para verificar a localizaccedilatildeo celular de TcKAP7 foi realizado o ensaio de
imunofluorescecircncia Como natildeo foi possiacutevel a obtenccedilatildeo do anticorpo com alto tiacutetulo
contra a proteiacutena recombinante TcKAP7 neste ensaio foi utilizado o anticorpo
monoclonal anti-FLAG que reconhece a etiqueta FLAG a qual estaacute fusionada a
proteiacutena TcKAP7
Nessa figura pode-se observar que a proteiacutena de fusatildeo acumula-se na regiatildeo
dos poacutelos do cinetoplasto das formas epimastigotas do T cruzi (FIGURA 18)
indicando que TcKAP7 uma proteiacutena tipo histona H1 estaacute realmente associada com
o kDNA do parasita
71
FIGURA 18 IMUNOLOCALIZACcedilAtildeO DE TcKAP7 EM EPIMASTIGOTAS DE T CRUZI LEGENDAA contraste interferencial diferencial (DIC) B Hoechst marcando o nuacutecleo e o
cinetoplasto C fluorescecircncia mostrando a localizaccedilatildeo de TcKAP7 mais intensa na regiatildeo dos poacutelos
docinetoplasto dos protozoaacuterios D Aumento de C
44 Deleccedilatildeo do gene TcKAP7 por nocaute gecircnico
As teacutecnicas que permitem a remoccedilatildeo de um gene e sua substituiccedilatildeo por
genes repoacuterteres atraveacutes do processo de recombinaccedilatildeo tecircm sido usadas com
sucesso para verificaccedilatildeo da funccedilatildeo gecircnica em tripanosomatiacutedeos (MACRAE et al
2006) O nocaute gecircnico consiste na inserccedilatildeo de marcadores geneacuteticos de seleccedilatildeo
(gene codificando resistecircncia a neomicina ou higromicina entre outros) flanqueados
por sequumlecircncias pertencentes ao locus cromossocircmico de interesse Atraveacutes do
processo de recombinaccedilatildeo homoacuteloga o marcador pode entatildeo substituir o gene que
se quer estudar Desse modo pode ser possiacutevel analisar a funccedilatildeo de determinado
gene atraveacutes das alteraccedilotildees - decorrentes de sua ausecircncia - na fisiologia do
parasita No presente estudo os genes repoacuterteres que codificam resistecircncia aos
72
antibioacuteticos G418 e higromicina foram flanqueados por sequumlecircncias a montante e a
jusante da regiatildeo codificante do gene TcKAP7 As construccedilotildees foram usadas para
transfectarT cruzi e gerar mutantes para o gene TcKAP7 a fim de se estudar o
efeito que a ausecircncia do gene TcKAP7 causa no metabolismo do parasita
Apoacutes obtenccedilatildeo de uma populaccedilatildeo de T cruzi mutante para o gene TcKAP7
(kap7neokap7higro) resistente a ambos antibioacuteticos G418 e higromicina B o
DNA desta populaccedilatildeo foi extraiacutedo para anaacutelise por PCR e Southern blot a fim de
confirmar a eficiecircncia do nocaute
441 Anaacutelise por PCR do DNA dos parasitas transfectados com os cassetes
UPS-NEO-DOWN e UPS-HIGRO-DOWN
Foram realizadas vaacuterias reaccedilotildees de PCR a fim de confirmar a deleccedilatildeo do
gene TcKAP7 do genoma do T cruzi Dm28c e a substituiccedilatildeo dos seus alelos pelos
genes neo e higro As reaccedilotildees de PCR foram feitas com DNA de T cruzikap7kap7 (tipo
selvagem) e com DNA de T cruzikap7neokap7higro utilizando diversas combinaccedilotildees de
primers (TABELA 5) Na figura 32 observa-se que o gene TcKAP7 (747 pb) foi
amplificado somente na PCR realizada com DNA de T cruzi tipo selvagem (FIGURA
19 A canaleta 1) enquanto que os genes neo (795 pb) e higro (1026 pb) soacute foram
amplificados nas reaccedilotildees que conteacutem DNA da populaccedilatildeo do T cruzi kap7neokap7higro
(FIGURA 19 B canaletas 2 e 3) Os tamanhos esperados para amplificaccedilotildees usando
primers externos agraves construccedilotildees e os primers dos genes de resistecircncia foram
identificados no gel de agarose indicando que os cassetes se integraram
corretamente no locus do gene TcKAP7 (FIGURA 19 B canaletas 4 a 7) Um
esquema da localizaccedilatildeo dos primers utilizados nas reaccedilotildees de PCR pode ser
visualizado na figura 19 C
QUADRO 5 ndash COMBINACcedilOtildeES DE PRIMERS UTILIZADOS NA PCR PARA
CONFIRMAR O NOCAUTE DE TcKAP7
Pares de primers Tamanho esperado
(pb)
1 KAP7F + KAP7R 747
2 NEOF + NEOR 795
73
3 HIGROF + HIGROR 1026
4 EXTF + NEOR 1410
5 EXTF + HIGROR 1634
6 NEOF + EXTR 1358
7 HIGROF + EXTR 1360
74
FIGURA 19 ENSAIOS DE PCR UTILIZANDO DNA DE T cruzi kap7kap7 (WT) E
T cruzi kap7neokap7higro (NO) COM DIFERENTES PRIMERS
LEGENDA 1 KAP7F + KAP7R 2 NEOF + NEOR (795 pb) 3 HIGROF + HIGROR (1026 pb) 4
EXTF + NEOR (1410 pb) 5 EXTF + HIGROR (1634 pb) 6 NEOF + EXTR (1358 pb) e 7
HIGROF + EXTR (1360 pb) No quadro A encontram-se as PCRs realizadas com DNA de T cruzi kap7kap7 (WT) e no quadro B encontram-se as PCRs realizadas com DNA de T cruzi kap7neokap7higro
(NO) No quadro C estaacute um esquema da localizaccedilatildeo dos primers utilizados
442 Anaacutelise da organizaccedilatildeo dos genes TcKAP7 neo e higro por ensaio do
tipo Southern blot
Neste ensaio foi utilizado DNA total extraiacutedo de T cruzikap7kap7 (tipo selvagem)
e T cruzi kap7neokap7higro (duplo nocaute) Foram utilizadas trecircs sondas (1) Um
fragmento do gene TcKAP7 (primeiros 598 pb da CDS) (2) o gene neo e (3) o gene
higro O DNA total das duas amostras foi digerido com a enzima de restriccedilatildeo HindIII
O padratildeo de digestatildeo desta enzima pode ser visualizado na figura 20 De acordo
com o mapa de restriccedilatildeo a inserccedilatildeo do cassete neo no locus KAP7 geraria um
fragmento HindIIIHindIII de 1024 pb enquanto a inserccedilatildeo do cassete higro geraria
um fragmento de 1032 pb cujos tamanhos satildeo diferentes do fragmento
HindIIIHindIII do locus original (1776 pb) As hibridizaccedilotildees mostram bandas
compatiacuteveis com os tamanhos dos fragmentos HindIIIHindIII esperados para cada
situaccedilatildeo acima (FIGURA 21) Podemos observar que a sonda KAP7 somente
reconhece uma banda de tamanho esperado apenas no DNA do parasita selvagem
(canaleta 1 FIGURA 21) enquanto que bandas correspondentes aos genes neo e
higrosomente aparecem no DNA do mutante KAP7 (canaleta 2 FIGURA 21)
75
FIGURA 20 ndash REPRESENTACcedilAtildeO ESQUEMAacuteTICA DOS SIacuteTIOS DA ENZIMA HindIII NO LOCUS DO GENE KAP7 DE T cruzi CL Brener LEGENDA Este esquema representa esquematicamente em escala os genes kap3 neo e higro as regiotildees upstream e downstream e os siacutetios de clivagem da enzima KpnI
FIGURA 21 ANAacuteLISE DA ORGANIZACcedilAtildeO DOS GENES TCKAP7 NEO E HIGRO POR ENSAIO DO TIPO SOUTHERN BLOT LEGENDA A Autoradiograma e B Padrotildees dos fragmentos obtidos da digestatildeo do DNA com a enzima de restriccedilatildeo HindIII Foram utilizadas trecircs sondas TcKAP7 neomicina e higromicina 1) DNA de T cruzikap7kap7 (tipo selvagem) e 2) T cruzi kap7neokap7higro (duplo nocaute)
76
45 Comparaccedilatildeo da expressatildeo do gene TcKAP7 por western blot
O antisoro contra a proteiacutena TcKAP7 obtido apoacutes imunizaccedilatildeo dos
camundongos foi utilizado em ensaio do tipo western blot para avaliar se TcKAP7
ainda estava sendo expresso no T cruzi apoacutes o nocaute gecircnico
O que se observou foi novamente como esperado que a proteiacutena TcKAP7 natildeo eacute
mais expressa no T cruzi kap7neokap7higro (figura 22) Pode-se observar a presenccedila
de TcKAP7 ( aprox 28 kDa) no extrato das formas epimastigotas de T cruzi kap7kap7
(figura 22A) mas natildeo no extrato de epimastigotas de T cruzi
kap7neokap7higro (figura 22B)
FIGURA 22 COMPARACcedilAtildeO DA EXPRESSAtildeO DO GENE TcKAP7 POR WESTERN BLOT LEGENDA Imunoblot de extratos de epimastigotas de T cruzi kap7kap7 (A) e de T cruzi kap7neokap7higro (B) reagidos com anti-TcKAP7
46 Anaacutelise da morfologia e da ultraestrutura do cinetoplasto do mutante de T
cruzi para TcKAP7
Sabendo-se que TcKAP7 estaacute associada ao cinetoplasto e pode estar
envolvida na compactaccedilatildeo do kDNA do T cruzi como foi mostrado para as KAPs de
Crithidia fasciculata (XU amp RAY 1993 XU et al 1996 HINES amp RAY 1998) sua
ausecircncia poderia levar a alteraccedilatildeo na estrutura do DNA mitocondrial dos parasitas
nocauteados Portanto o primeiro passo foi verificar se havia alteraccedilotildees na
77
morforlogia do parasita Formas epimastigotas do mutante de T cruzi foram
analisadas ao microscoacutepio oacuteptico apoacutes coloraccedilatildeo Como pode ser observado na
figura 23 epimastigotas do mutante de T cruzi para TcKAP7 apresentam uma
morfologia fusiforme com o cinetoplasto caracteriacutestico em forma de barra localizado
anteriormente ao nuacutecleo natildeo se evidenciando portanto nenhuma alteraccedilatildeo em
relaccedilatildeo agrave morfologia dos parasitas do tipo selvagem
FIGURA 23 - COLORACcedilAtildeO PELO MEacuteTODO PANOacuteTICO RAacutePIDO DOS PARASITAS EPIMASTIGOTAS NOCAUTEADOS LEGENDA A) Formas epimastigotas B) Forma epimastigota em maior aumento
Formas epimastigotas de parasitas do tipo selvagem e nocauteados foram
entatildeo analisados pela teacutecnica de microscopia eletrocircnica de transmissatildeo para
visualizar com mais detalhe o cinetoplasto e verificar se sua estrutura estava
alterada pela ausecircncia da TcKAP7 (FIGURA 24) A figura 24A mostra um corte
ultrafino de um epimastigota de T cruzi do tipo selvagem que apresenta o
cinetoplasto compacto e em forma de bastatildeo caracteriacutestico de formas
epimastigotas sem nenhuma alteraccedilatildeo aparente O mesmo pode ser visto na figura
24B para o epimastigota de T cruzi nocauteado A disposiccedilatildeo estrutura e aspecto
do cinetoplasto de ambos os parasitas selvagem e nocauteado natildeo apresentaram
nenhuma diferenccedila entre si mostrando que mesmo apoacutes o nocaute da KAP7 a
estrutura do cinetoplasto permanece aparentemente inalterada
78
FIGURA 24 COMPARACcedilAtildeO ENTRE A ULTRAESTRUTURA DO CINETOPLASTO DO T cruzi DM28C TIPO SELVAGEM (A) E DO MUTANTE DE T cruzi PARA TcKAP7 (B) POR MICROSCOPIA ELETROcircNICA DE TRANSMISSAtildeO
79
47 Multiplicaccedilatildeo diferenciaccedilatildeo e infectividade do mutante de T cruzi para
TcKAP7
Os parasitas mutantes foram analisados a fim de verificar se alteraccedilotildees na
estrutura do kDNA pela ausecircncia de KAP7 natildeo estavam levando a alteraccedilotildees na
fisiologia do parasita alterando sua multiplicaccedilatildeo diferenciaccedilatildeo e infectividade
Inicialmente foi analisado o perfil da curva de crescimento das formas
epimastigotas Observou-se que natildeo havia diferenccedila na curva de crescimento dos
parasitas nocauteados em relaccedilatildeo ao parasita selvagem (FIGURA 25)
FIGURA 25 CURVA DE CRESCIMENTO DO MUTANTE DE T cruzi PARA TcKAP7 (KO) E DO T cruzi Dm28c SELVAGEM (WT)
LEGENDA Curva de crescimento do mutante de T cruzi para TcKAP7 () e do T cruzi Dm28c ()
Em seguida os parasitas nocauteados foram analisados quanto a sua capacidade
de diferenciaccedilatildeo em tripomastigotas metaciacuteclicos Foram realizadas contagens
diferenciais em cacircmara de Neubauer a partir do sobrenadante da metaciclogecircnese
a cada 24 h apoacutes a incubaccedilatildeo das ceacutelulas em meio TAU3AAG durante um periacuteodo
de 3 dias (72 h) A partir dessas contagens foram construiacutedos curva com a contagem
do nuacutemero de metaciacuteclicos ao longo dos trecircs dias (FIGURA 26)
Nenhuma alteraccedilatildeo foi observada quando os parasitas nocauteados foram
submetidos ao processo de metaciclogecircnese in vitro Ou seja pode-se afirmar que
80
mesmo apoacutes o nocaute do gene TcKAP7 as formas epimastigotas do parasita
conseguem se diferenciar em formas metaciacuteclicas
FIGURA 26 METACICLOGEcircNESE IN VITRO DE T cruzi Dm28c TIPO SELVAGEM E T cruzi NOCAUTEADO LEGENDA Metaciclogecircnese in vitro de T cruzi Dm28c tipo selvagem () e T cruzi nocauteado ()
Uma vez que os parasitas nocauteados foram capazes de se diferenciar de
epimastigota a tripomastigota metaciacuteclico resolveu-se investigar se estes eram
capazes de infectar ceacutelulas in vitro Foi possiacutevel perceber as formas amastigotas
dentro de ceacutelulas VERO em cultura mostrando que o parasita natildeo perdeu sua
capacidade de infecccedilatildeo (dados natildeo mostrados) Assim pode-se concluir que aleacutem
de sofrer diferenciaccedilatildeo os mutantes de T cruzi para KAP7 tambeacutem mantiveram sua
capacidade de infecccedilatildeo
48 Anaacutelise da funccedilatildeo do gene KAP7 de Trypanosoma brucei atraveacutes de
ensaios de RNA de interferecircncia
Para averiguar a importacircncia da proteiacutena TcKAP7 na biologia do parasita
recorremos a ensaios de RNA de interferecircncia (RNAi) jaacute que existe uma alta
similaridade entre TcKAP7 e seu ortoacutelogo em Trypanosoma brucei
81
A via de RNA de interferecircncia consiste em um mecanismo de silenciamento
gecircnico que para a ceacutelula funciona como sistema de defesa O mecanismo inicia-se
atraveacutes da expressatildeo de um RNA dupla fita (dsRNA) contendo uma sequecircncia
complementar ao gene de interesse Este dsRNA seraacute entatildeo clivado em pequenos
fragmentos de cerca de 22 a 25 nucleotiacutedeos atraveacutes da atividade de uma
ribonuclease do tipo III denominada Dicer Estes pequenos RNAs seratildeo
direcionados e permaneceratildeo unidos a um complexo proteico denominado RISC
(ldquoRNA-InducedSilencingComplexrdquo) Nesse complexo os pequenos RNAs de
interferecircncia (siRNA) ligam-se por complementaridade ao RNA mensageiro do gene
a ser inativado guiando-os para degradaccedilatildeo pelas nucleases presentes no
complexo impedindo a siacutentese da respectiva proteiacutena (ULLU et al 2002) O vetor
utilizado para promover o silenciamento do gene TbKAP7 foi o p2T7-177 Este
plasmiacutedeo integra-se aos minicromossomos do T brucei regiatildeo de repeticcedilotildees 177
(FOLDYNOVA-TRANTIRKOVA et al 2005) Este vetor apresenta dois promotores
de polimerase em oposiccedilatildeo induziacuteveis por tetraciclina flanqueando a sequumlecircncia de
interesse Desta forma satildeo geradas duas moleacuteculas de mRNA que pareadas
formam a moleacutecula de RNA fita dupla capaz de induzir a maquinaria de degradaccedilatildeo
A induccedilatildeo da inibiccedilatildeo de TbKAP7 atraveacutes de RNAi levou a uma diminuiccedilatildeo da
multiplicaccedilatildeo celular do parasita a partir do quarto dia do experimento (FIGURA 27)
Os resultados obtidos neste ensaio mostraram que a participaccedilatildeo da TbKAP7
no metabolismo do T brucei eacute essencial jaacute que o silenciamento do gene TbKAP7
levou agrave reduccedilatildeo da proliferaccedilatildeo celular do parasita
82
FIGURA 27 RNAi DE TbKAP7 INIBE O CRESCIMENTO DAS FORMAS PROCIacuteCLICAS DE T
brucei
LEGENDA Curva de crescimento de linhagem celular de RNAi de TbKAP7 em T brucei induzido por
tetraciclina As ceacutelulas foram diluiacutedas a uma densidade celular inicial de 1 X 106 ml na presenccedila e
ausecircncia de tetraciclina As densidades celulares foram determinadas pela contagem de ceacutelulas a
intervalos de 24 horas durante oito dias apoacutes iniacutecio de adiccedilatildeo de tetraciclina A linha com quadrados
mostra a curva de crescimento celular na presenccedila de tetraciclina (+TET) A linha com losangos
mostra a curva de crescimento celular na ausecircncia de tetraciclina (- TET)
49 Caracterizaccedilatildeo estrutural de TcKAP7
491 Produccedilatildeo recombinante de TcKAP7
O cultivo de E coli BL-21(DE3) STAR contendo o plasmiacutedeo pET28a-
TcKAP7 foi feito em meio LB a 37 oC com a induccedilatildeo da expressatildeo realizada a uma
densidade oacutetica de DO600 de 08 com a adiccedilatildeo de 05 mM de ITPG durante a noite a
37 oC
As ceacutelulas foram recuperadas por centrifugaccedilatildeo ressuspensas sonicadas e
centrifugadas para a purificaccedilatildeo de TcKAP7 atraveacutes da cromatografia de afinidade
em resina de Ni-NTA (Figura 28A) Foi possiacutevel obter grande quantidade de
83
amostra com grau de pureza alto como visualizado atraveacutes de anaacutelise por SDS-
PAGE (Figura 28B)
FIGURA28 PURIFICACcedilAtildeO DE TCKAP7 ATRAVEacuteS DE CROMATOGRAFIA DE AFINIDADE LEGENDA A) Cromatograma de afinidade B) SDS-PAGE da cromatografia de afinidade Os nuacutemeros agrave esquerda da figura representam os tamanhos das bandas do marcador de massa molecular (Benchmark) (Invitrogen) e P banda correspondente agrave TcKAP7 purificada Caixa em vermelho indica o pico que corresponde agrave fraccedilatildeo no SDS-PAGE
Devido agrave presenccedila de bandas com possiacuteveis contaminantes as fraccedilotildees que
continham a proteiacutena de interesse foram submetidas agrave purificaccedilatildeo por cromatografia
de troca iocircnica onde a purificaccedilatildeo eacute realizada baseada na afinidade por cargas
entre as proteiacutenas e a resina
Para esta purificaccedilatildeo utilizou-se a coluna SP Hitrap (GE Healthcare Life
Sciences) que eacute uma coluna de carga negativa Essa resina foi escolhida pois o pH
do tampatildeo em que se encontrava TcKAP7 era menor que o pI da proteiacutena Nessas
condiccedilotildees a carga superficial de TcKAP7 eacute positiva Para favorecer a interaccedilatildeo
TcKAP7 e resina foi feita uma diluiccedilatildeo de TcKAP7 para retirada de NaCl A eluiccedilatildeo
da proteiacutena foi realizada com um gradiente segmentado de tampatildeo B para
84
cromatografia de troca iocircnica TcKAP7 foi eluiacuteda com 68 do tampatildeo B (FIGURA
29)
FIGURA 29 PURIFICACcedilAtildeO DE TCKAP7 ATRAVEacuteS DE CROMATOGRAFIA DE TROCA IOcircNICA
LEGENDA A) Cromatografia de troca iocircnica B) SDS-PAGE da cromatografia de troca iocircnica Os nuacutemeros agrave esquerda da figura representam os tamanhos das bandas do marcador de massa molecular (Benchmark) (Invitrogen) e P banda correspondente agrave TcKAP7 purificada Caixa em vermelho indica o pico que corresponde agrave fraccedilatildeo no SDS-PAGE Curva em azul representa absorbacircncia em 280 nm Linha em verde indica concentraccedilatildeo de tampatildeo B para eluiccedilatildeo da amostra
410 Anaacutelise do estado oligomeacuterico de TcKAP7
A amostra purificada por troca iocircnica foi submetida agrave cromatografia de
exclusatildeo molecular tambeacutem chamada de gel filtraccedilatildeo que consiste na separaccedilatildeo
de biomoleacuteculas de acordo com seu tamanho e forma A coluna neste processo
conteacutem um poliacutemero com ligaccedilotildees cruzadas com poros de tamanho definido As
moleacuteculas maiores iratildeo migrar mais rapidamente que as menores pois natildeo satildeo
85
capazes de penetrar no interior dos poros da resina eluindo diretamente da coluna
As moleacuteculas menores por entrarem pelos poros da resina e levarem mais tempo
percorrendo os poros satildeo eluiacutedas mais tarde em relaccedilatildeo as que satildeo maiores
Ao comparar o volume de eluiccedilatildeo de TcKAP7 com o volume de eluiccedilatildeo de
proteiacutenas com massa molecular conhecidos (dados natildeo mostrados) foi possiacutevel
verificar que TcKAP7 parece ser um monocircmero em soluccedilatildeo Para confirmar esses
dados a mesma amostra foi submetida ao experimento de espalhamento dinacircmico
de luz (DLS)
O DLS eacute uma teacutecnica que se estima a distribuiccedilatildeo de tamanho das
populaccedilotildees de partiacuteculas que estatildeo presentes na amostra permitindo a detecccedilatildeo de
agregados proteicos ou de diferentes estados de oligomerizaccedilatildeo na amostra
indicando heterogeneidade Eacute importante ressaltar que para maiores chances de
sucesso em ensaios de cristalizaccedilatildeo a amostra deve encontrar-se monodispersa
Os dados de DLS mostram que 911 da massa de TcKAP7 analisada
apresenta um raio hidrodinacircmico (Rh) de 39 nm que representa uma massa
aparente de 29 kDa (FIGURA 30) Isto eacute condizente com um monocircmero cuja massa
teoacuterica seria de aproximadamente 28 kDa (incluindo a cauda de 6 histidinas) de
acordo com a prediccedilatildeo feita pelo servidor Expasy Protparam
(httpwebexpasyorgprotparam)A polidispersividade da amostra foi baixa
indicando que a mesma estava homogecircnea
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0 1 2 3 4 5 6 7
M
assa
Rh (nm)
fr80
fr82
fr84
fr85
86
FIGURA 30 ANAacuteLISE POR DLS DE TCKAP7 LEGENDA Anaacutelise por DLS de TcKAP7 contendo as fraccedilotildees obtidas na cromatografia de afinidade As fraccedilotildees 80 84 e 85 apresentam um raio hidrodinacircmico (Rh) de 39 nm
Aleacutem disso tambeacutem foram obtidas informaccedilotildees sobre o envelope de TcKAP7
a partir dos dados coletados atraveacutes da teacutecnica de SAXS mostrando que o raio de
giro (Rg) do envelope de TcKAP7 estaacute de acordo com o estimado por DLS (FIGURA
31)
FIGURA 31 ENVELOPE MOLECULAR DE SAXS
411 Anaacutelise do conteuacutedo de estrutura secundaacuteria de TcKAP7 recombinante
Atraveacutes da anaacutelise do espectro de dicroiacutesmo circular pode-se verificar o
conteuacutedo de estrutura secundaacuteria da proteiacutena e inferir enovelamento da proteiacutena
recombinante Os dados obtidos para a TcKAP7 revelaram a presenccedila de estruturas
α caracterizadas pelos miacutenimos pronunciados em 208 nm e 222 nm e de estruturas
coiled na amostra de TcKAP7 caracterizada pelos miacutenimos pronunciados em 205
nm (FIGURA 32) Este resultado estaacute de acordo a prediccedilatildeo de estrutura secundaacuteria
87
realizada pelo servidor PSIPRED (httpbioinfcsuclacukpsipred (FIGURA 33)
Esses resultados sugerem que a proteiacutena recombinante possui correto
enovelamento
FIGURA 32 ESPECTRO DE DICROIacuteSMO CIRCULAR DE TcKAP7
FIGURA 33 PREDICcedilAtildeO DE ESTRUTURA SECUNDAacuteRIA DE TcKAP7
412 Anaacutelise estrutural de TcKAP7
A fim de obter-se a estrutura tridimensional de TcKAP7 por cristalografia de
raios-X foram realizados ensaios de cristalizaccedilatildeoFoi possiacutevel observar a formaccedilatildeo
de um cristal em apenas uma condiccedilatildeo Imidazol 01 M Polietilenoglicol (PEG) 8000
10 wv e Acetato de caacutelcio 02 M
A visualizaccedilatildeo atraveacutes de luz ultra-violeta atraveacutes do equipamento Rock
Imager Fomulatrix permitiu identificaacute-lo como cristal de proteiacutena jaacute que este
diferencia-se de cristal de sal pela fluorescecircncia quando excitado em comprimento
de onda de 280 nm
-20
-18
-16
-14
-12
-10
-8
-6
-4
-2
0
2
200 210 220 230 240 250 260
Ɵ M
RV
x 1
03
(de
g cm
2d
mo
l-1)
Comprimento de onda (nm)
88
O perfil do cristal pode ser visualizado na figura 34 Esse cristal encontra-se
pequeno e mal-formado Aleacutem disso os meacutetodos para a determinaccedilatildeo estrutural de
uma estrutura ineacutedita (sem homologia com estruturas conhecidas) necessitam de
mais de um cristal Dessa forma foram realizados refinamentos dessas condiccedilotildees
iniciais visando aumentar q quantidade de cristais aumentar seu tamanho e
melhorar sua organizaccedilatildeo A concentraccedilatildeo de PEG (5 A 10) e do pH (6 a 9) com
intervalos de 1 unidade foram alterada Entretanto mesmo assim natildeo foi possiacutevel a
obtenccedilatildeo de cristais adequados para a difraccedilatildeo de raios X e novos refinamentos
seratildeo necessaacuterios
FIGURA 34 CRISTAL DE TcKAP7 DE T CRUZI LEGENDA AObtenccedilatildeo do cristal de TcKAP7 na condiccedilatildeo de Imidazol 01 M Polietilenoglicol (PEG) 8000 10 wv e Acetato de caacutelcio 02 M e B Cristal de TcKAP7 visto sob luz ultravioleta
Uma vez que natildeo foi possiacutevel durante o desenvolvimento desse projeto a
obtenccedilatildeo da estrutura cristalograacutefica de TcKAP7 procedeu-se com a construccedilatildeo de
seu modelo molecular
A modelagem molecular eacute uma ferramenta que permite a obtenccedilatildeo de
modelos da estrutura tridimensional de uma determinada proteiacutena com base em
homologia sequencial ou estrutural com proteiacutenas cujas estruturas tridimensional
foram experimentalmente resolvidas
Para a construccedilatildeo do modelo foi utilizado o programa MODELLER (SALI amp
BLUNDELL 1993) este programa eacute utilizado para a modelagem por homologia a
estruturas tridimensionais de proteiacutenas O programa automaticamente constroacutei um
modelo baseado na anaacutelise de um alinhamento de sequecircncias entre a proteiacutena para
a qual se deseja construir o modelo e uma proteiacutena relacionada cuja estrutura
tridimensional jaacute foi resolvida Nesse caso foram utilizadas estruturas de duas
A B
89
proteiacutenas como molde para a construccedilatildeo da estrutura de TcKAP7 A estrutura da
proteiacutena HMGB1(coacutedigo de acesso no banco de dados de proteiacutenas 2GZK)
(wwwpdborg) para a porccedilatildeo amino-terminal e a estrutura do fator A de transcriccedilatildeo
mitocondrial (coacutedigo de acesso 3TQ6) para a porccedilatildeo carboxi-terminal da proteiacutena
(FIGURA 35A) Duas proteiacutenas foram selecionadas para a construccedilatildeo do modelo de
TcKAP7 visto que a similaridade de sequencia entre TcKAP7 e proteiacutenas com
estruturas resolvidas eacute bastante baixo A similaridade sequencial de TcKAP7 e
proteiacutena HMGB1 eacute de 224 e entre TcKAP7 e o fator A de transcriccedilatildeo mitocondrial
eacute de 264 No entanto ambas proteiacutenas possuem alta similaridade em relaccedilatildeo agrave
estrutura secundaacuteria (mais de 90) Para aumentar a confiabilidade do modelo
utilizamos uma proteiacutena para construir a sequencia N-terminal de TcKAP7
(aminoaacutecidos 1-184) e outra para o C-terminal (aminoaacutecidos 185-248)
A qualidade do modelo pode ser avaliada por exemplo atraveacutes de graacuteficos e
tabelas que analisam restriccedilotildees quiacutemicas e fiacutesicas de cada aacutetomo constituinte do
modelo Neste trabalho foi utilizado o graacutefico de Ramachandran (FIGURA 35B) nele
pode-se visualizar todas as combinaccedilotildees possiacuteveis de acircngulos dieacutedricos Ψ (psi)
versus os Φ (phi) nos aminoaacutecidos de um polipeptiacutedeo e que contribuem para a
conformaccedilatildeo das estruturas das proteiacutenas (RAMACHANDRAN et al 1963) Dos 230
resiacuteduos apenas 5 estatildeo em regiotildees natildeo permitidas do graacutefico Esse eacute um
excelente valor pois eacute similar ao valor meacutedio encontrado para estruturas
experimentalmente determinadas com resoluccedilatildeo de no miacutenimo 20 Aring
(httpwwwebiacukthornton-srvdatabasesprofunc)
Tambeacutem eacute possiacutevel visualizar a topologia de TcKAP7 (FIGURA 35 C) que
mostra as regiotildees de α-heacutelices e regiotildees de coiled presentes na proteiacutena
corroborando com os dados obtidos na espectroscopia de dicroiacutesmo circular
90
FIGURA 35 ESTRUTURA DE TcKAP7 LEGENDA AModelo tridimensional de KAP7 B Graacutefico de Ramachandran e C Topologia de TcKAP7
A anaacutelise da superfiacutecie eletrostaacutetica de TcKAP7 mostra que existem regiotildees
ricas em aminoaacutecidos com cargas positivas que podem conferir afinidades agrave outras
proteiacutenas com carga carga superficial negativa ou mesmo aacutecidos nucleicos (FIGURA
36)
91
FIGURA 36 SUPERFIacuteCIE ELETROSTAacuteTICA DE TcKAP7 LEGENDA Visualizaccedilatildeo de diferentes regiotildees de TcKAP7 Vermelho potencial negativo Azul potencial positiva Branco Neutro
413 Investigaccedilatildeo de possiacuteveis funcionalidades baseadas na estrutura de
TcKAP7
4131 Prediccedilatildeo de funccedilatildeo paraTcKAP7
92
A prediccedilatildeo de funccedilatildeo para TcKAP7 foi realizada a partir do enovelamento de
proteiacutenas utilizando o servidor Profunc (httpwwwebiacukthornton-
srvdatabasesprofunc) O objetivo do servidor ProFunc eacute ajudar na identificaccedilatildeo de
uma possiacutevel funccedilatildeo bioquiacutemica de uma proteiacutena a partir da sua estrutura
tridimensional Ele utiliza uma seacuterie de meacutetodos incluindo comparaccedilatildeo de
enovelamento conservaccedilatildeo dos resiacuteduos e modelos 3D funcionais tanto para
identificar provaacuteveis siacutetios ativos da proteiacutena quanto possiacuteveis homoacutelogos no Protein
Data Bank (PDB) Neste procedimento tenta-se ajustar a estrutura da proteiacutena de
interesse aos tipos de enovelamentos de proteiacutenas conhecidas Atualmente mais de
1000 tipos jaacute foram registrados e depositados em bibliotecas de enovelamentos
Sabe-se que o alinhamento estrutural entre proteiacutenas consideradas de uma
mesma famiacutelia mesmo que seja apenas na regiatildeo do siacutetio ativo pode ser um
importante meacutetodo para se inferir a funccedilatildeo da sequecircncia em estudo (LASKOWSKI et
al 2003) A evoluccedilatildeo tende a conservar funccedilotildees que dependem mais diretamente
das estruturas 3D que das similaridades entre as sequecircncias de aminoaacutecidos das
proteiacutenas (SANCHEZ et al 2000)
Neste trabalho as quatro estruturas que possuem maior similaridade
estrutural com TcKAP7 estatildeo depositadas no Protein Data Bank (PDB) com os
coacutedigos 3TQ6 4NOD 3TMM 4NNU Todas as estruturas satildeo referentes agrave proteiacutena
TFAM (fator transcricional A mitocondrial)
As estruturas proteicas foram obtidas no banco de dados puacuteblicos de
proteiacutenas PDB (Protein Data Bank) e submetidas a um alinhamento estrutural com o
modelo de TcKAP7 (FIGURA 35A) no programa WinCoot Esse alinhamento pode
ser visualizado na figura 37 As regiotildees em vermelho representam as regiotildees de
TcKAP7 que apresentam interaccedilatildeo com DNA pois se alinham com as regiotildees de
ligaccedilatildeo agrave DNA das outras proteiacutenas e as regiotildees em azul representam regiotildees sem
homologia com as demais
Esse resultado sugere que TcKAP7 pode interagir com DNA com isso estes
dados podem ser utilizados para nortear mais estudos sobre a interaccedilatildeo das
proteiacutenas KAPrsquos com o DNA do cinetoplasto de T cruzi
93
FIGURA 37 ALINHAMENTO ESTRUTURAL DE 3TQ6 4NOD 3TTM 4NNU E TCKAP7 LEGENDA Em vermelho encontram-se as regiotildees de TcKAP7 que podem interagir com DNA (Resiacuteduos 1-67 e 140-166) e em azul regiotildees sem homologia com as demais
4132 Anaacutelises preliminares da possiacutevel interaccedilatildeo entre TcKAP7 e kDNA
As prediccedilotildees estruturais sugeriram que a proteiacutena TcKAP7 possui motivos
similares agrave proteiacutenas que interagem com DNA No entanto a sequecircncia de
aminoaacutecidos entre as proteiacutenas eacute bastante baixa Como a funccedilatildeo de TcKAP7
permanece obscura foram realizados alguns ensaios para tentar verificar a
possibilidade desta proteiacutena interagir com kDNA Para isto utilizou-se a teacutecnica de
dicroiacutesmo circular para avaliar se a presenccedila de kDNA poderia resultar em
alteraccedilotildees estruturais em TcKAP7 o que seria uma evidecircncia da possiacutevel interaccedilatildeo
entre esta proteiacutena e o aacutecido nucleico
Foram realizadas medidas de dicroiacutesmo circular com amostras de TcKAP7
kDNA e TcKAP7 na presenccedila de kDNA Para a anaacutelise de dados foi realizado o
somatoacuterio das curvas obtidas com as amostras de TcKAP7 e kDNA separadamente
Este somatoacuterio resultou em uma curva teoacuterica que indica o perfil teoacuterico de uma
amostra contendo TcKAP7 e kDNA sem interaccedilotildees presentes Aacute essa curva foi
sobreposta a curva experimental da medida de dicroiacutesmo circular de TcKAP7 na
94
presenccedila de kDNA A figura 38 ilustra essa sobreposiccedilatildeo onde pode-se verificar que
as curvas natildeo se sobrepotildeem portanto alteraccedilotildees estruturais ocorrem em TcKAP7
na presenccedila de kDNA
FIGURA 38 ESPECTRO DE DICROIacuteSMO CIRCULAR DE TcKAP7 LEGENDA Em azul encontra-se o espectro experimental de TcKap7 na presenccedila de DNA em vermelho o espectro teoacuterico de TcKAP7 e DNA
Para investigar mudanccedilas estruturais associadas a interaccedilatildeo com kDNA foi
realizada uma coleta de dados de SAXS na presenccedila de 1ug de kDNA
A comparaccedilatildeo dos modelos de baixa resoluccedilatildeo por SAXS indica uma
diferenccedila conformacional pontual da proteiacutena na presenccedila de kDNA As figuras 28 e
29 mostram os envelopes da proteiacutena TcKAP7na ausecircncia (FIGURAS 39A e 40A) e
presenccedila de kDNA de T cruzi (FIGURA 39B e FIGURA 40B) Percebe-se uma
diferenccedila de densidade eletrocircnica na regiatildeo da heacutelice (Residuos 140 - 166
evidenciados em vermelho) No envelope de TcKAP7 ela eacute bastante flexiacutevel e natildeo eacute
observada densidade eletrocircnica nessa regiatildeo no entanto na presenccedila de kDNA
essa mesma regiatildeo mostra-se mais riacutegida e eacute possiacutevel estimar seu posicionamento
baseado na densidade eletrocircnica Aleacutem disso essa heacutelice eacute predita como interatora
de DNA com base nas anaacutelises estruturais previamente realizadas nesse trabalho
Esses dados sugerem uma mudanccedila conformacional da proteiacutena na presenccedila
do kDNA fazendo com que esta mude seu arranjo estrutural para permanecer ligada
agrave moleacutecula de DNA sugerindo uma interaccedilatildeo entre TcKAP7 e DNA do cinetoplasto
-22
-17
-12
-7
-2
3
200 210 220 230 240 250 260
ϴM
RW
x 1
03
(de
g cm
-2 d
mo
l-1)
Comprimento de onda (nm)
Kap7+DNA
95
de T cruzi Esses dados corroboram com o que foi visto na superfiacutecie eletrostaacutetica
(FIGURA 36) e no alinhamento estrutural (FIGURA 37)
FIGURA 39 ENVELOPE MOLECULAR DETcKAP7 LEGENDA A Monocircmero de TcKAP7 ajustado ao envelope de SAXS B Monocircmero de TcKAP7 + kDNA ajustado ao envelope de SAXSResiduos 140- 166 evidenciados em vermelho
96
FIGURA 40 ENVELOPE MOLECULAR DE TcKAP7 VISTO EM DIFERENTES AcircNGULOS LEGENDA A Monocircmero de TcKAP7 ajustado ao envelope de SAXS B Monocircmero de TcKAP7 + kDNA ajustado ao envelope de SAXS Residuos 140- 166 evidenciados em vermelho
97
5 DISCUSSAtildeO
O Trypanosoma cruzi pertence a um grupo que divergiu muito cedo na
linhagem eucarioacutetica apresentando diversas caracteriacutesticas uacutenicas em relaccedilatildeo a
outros eucariotos Uma dessas caracteriacutesticas eacute a presenccedila de uma mitococircndria
uacutenica ramificada pelo corpo do protozoaacuterio contendo uma regiatildeo especializada o
cinetoplasto onde reside o DNA mitocondrial tambeacutem conhecido como kDNA O
kDNA eacute composto por uma rede de moleacuteculas interligadas entre si os maxiciacuterculos e
os miniciacuterculos (SHAPIRO amp ENGLUND 1995) Mais de 30 proteiacutenas envolvidas na
replicaccedilatildeo e na manutenccedilatildeo do kDNA jaacute foram identificadas e acredita-se que um
nuacutemero aproximado de 100 proteiacutenas muitas delas presentes apenas em
cinetoplastiacutedeos possam estar envolvidas nesses processos (LIU et al 2005) A
maioria dessas proteiacutenas foi identificada em T brucei e C fasciculata e
possivelmente vaacuterias delas principalmente aquelas envolvidas em replicaccedilatildeo
devem estar codificadas no genoma do T cruzi
Apesar de serem conhecidos muitos dos componentes da maquinaria de
replicaccedilatildeo dos miniciacuterculos e maxiciacuterculos natildeo se pode dizer o mesmo para as
proteiacutenas envolvidas na manutenccedilatildeo da estrutura do kDNA Com exceccedilatildeo de 4
proteiacutenas com caracteriacutesticas de histonas H1 (KAP1 a 4) encontradas associadas ao
cinetoplasto de C fasciculata pouco ainda eacute conhecido sobre as proteiacutenas que
participam da organizaccedilatildeo do kDNA em outros tripanosomatiacutedeos
Zavala-Castro e colaboradores (2002) identificaram sete proteiacutenas variando
de 19 a 31 kDa associadas ao kDNA de formas epimastigotas de T cruzi a partir
de kDNA extraiacutedo de ceacutelulas fixadas com formaldeiacutedo Os tamanhos observados satildeo
compatiacuteveis com aqueles das KAPs encontradas por Xu e Ray (1993) usando
experimento similar em C fasciculata entretanto nenhuma das possiacuteveis KAPs
descritas por Zavala-Castro e colaboradores foi caracterizada
Noacutes iniciamos estudos objetivando identificar proteiacutenas envolvidas na
organizaccedilatildeo e segregaccedilatildeo do kDNA de T cruzi a partir dos dados fornecidos pelo
sequenciamento do genoma desse parasita fazendo uma comparaccedilatildeo com as
KAPs de C fasciculata Estudos realizados por Cavalcanti e colaboradores (2009)
usando como modelo as sequecircncias de KAPs de C fasciculata identificaram 35
proteiacutenas relacionadas em diferentes tripanosomatiacutedeos cujos genomas estatildeo
sequenciados (11 em T cruzi 7 em L braziliensis 6 em L major e L infantum e 5
98
em T brucei) Essas sequecircncias puderam ser agrupadas em 7 tipos diferentes de
KAPs (KAP1 a 7) Das 7 KAPs T cruzi possui 5 (TcKAP3 a 7) cuja a sintenia
gecircnica eacute uma das caracteriacutesticas marcantes jaacute que alguns genes divergem em
relaccedilatildeo ao tamanho e portanto no tamanho da proteiacutena codificada As KAPs de T
cruzi e T brucei satildeo maiores do que as de C fasciculata e Leishmania spp Isso
pode sugerir que KAPs possam ter evoluiacutedo para um tamanho que comporte
basicamente suas funccedilotildees de associaccedilatildeo com o kDNA de maneira mais eficiente
Os resultados obtidos por Cavalcanti et al (2009) para TcKAP4 e TcKAP6
mostraram que em epimastigotas e amastigotas estas duas proteiacutenas estatildeo
distribuiacutedas ao longo de toda a rede de kDNA consistente com o que foi observado
em C fasciculata (XU et al 1996 HINES amp RAY 1998) poreacutem CfKAP4 tambeacutem
apresentou um padratildeo de marcaccedilatildeo nos poacutelos opostos do kDNA sugerindo que
essa KAP em particular se associe aos miniciacuterculos receacutem-replicados antes de sua
reintegraccedilatildeo agrave rede de kDNA (XU et al 1996) Contudo em tripomastigotas de T
cruzi estas duas proteiacutenas estatildeo distribuiacutedas na periferia da rede de kDNA
(CAVALCANTI et al 2009) indicando que diferente de C fasciculata elas
apresentam uma dinacircmica de associaccedilatildeo que depende da forma evolutiva do
parasita possivelmente refletindo distintas interaccedilotildees com proteiacutenas da rede de
kDNA em epimastigotas e tripomastigotas No presente trabalho ampliamos o
conhecimento sobre as KAPs de T cruzi estudando o papel da KAP7 na fisiologia
desse parasita
Em C fasciculata a regulaccedilatildeo da expressatildeo de vaacuterios genes que codificam
proteiacutenas mitocondriais ocorre durante o ciclo celular em parte por uma sequumlecircncia
consenso [(CA)AUAGAA(GA)] presente nas regiotildees 5rsquo e 3rsquo-UTR dos respectivos
mRNAs (BROWN amp RAY 1997 MAHMOOD et al 1999 MAHMOOD amp RAY 1998
PASION et al 1996) O mesmo foi observado para L major onde uma sequecircncia
parecida com aquela encontrada em C fasciculata (CATAGA) foi identificada nas
regiotildees 5rsquo e 3rsquo de vaacuterios genes cuja a expressatildeo era maior na fase S do ciclo celular
(ZICK et al 2005) Analisando as regiotildees 5rsquo e 3rsquo do transcrito do gene TOP2 de T
cruzi que codifica a topo II mitocondrial descrito por Fragoso e Goldenberg (1992)
tambeacutem podemos observar a sequecircncia CATAGA repetida duas vezes na regiatildeo
5rsquoUTR e uma vez na regiatildeo 3rsquo-UTR do transcrito desse gene
Como relatamos neste trabalho a sequecircncia da regiatildeo 5rsquo-UTR do transcrito
TcKAP7 natildeo mostrou nenhum elemento com as caracteriacutesticas daquele envolvido na
99
regulaccedilatildeo de genes expressos na fase S do ciclo celular de outros
tripanosomatiacutedeos
Em relaccedilatildeo agrave localizaccedilatildeo de TcKAP7 verificamos atraveacutes de ensaios de
imunofluorescecircncia a distribuiccedilatildeo de TcKAP7 na regiatildeo dos poacutelos da rede de kDNA
das formas epimastigotas de T cruzi poreacutem ainda natildeo analisamos como esta
proteiacutena estaacute distribuiacuteda nas formas tripomastigotas que possuem a rede de kDNA
com formato arredondado e menos compactada
A localizaccedilatildeo de KAP7 na regiatildeo dos poacutelos do cinetoplasto de T cruzi
sugere que ela tenha funccedilotildees na replicaccedilatildeo da rede de kDNA pois nessa regiatildeo
estatildeo concentradas diversas proteiacutenas necessaacuterias para finalizaccedilatildeo do processo de
replicaccedilatildeo de miniciacuterculos
Para a construccedilatildeo do modelo molecular de TcKAP7 foram utilizadas
estruturas de duas proteiacutenas a estrutura da proteiacutena HMGB1 (2GZK) para a porccedilatildeo
amino-terminal e a estrutura da proteiacutena fator A de transcriccedilatildeo mitocondrial (3TQ6)
para a porccedilatildeo carboxi-terminal da proteiacutena ambas apresentam alta similaridade em
relaccedilatildeo agrave estrutura secundaacuteria (mais de 90) e tratam-se de proteiacutenas de um
mesmo grupo HMG (High-mobility group) Em T brucei TbKAP6 uma proteiacutena do
grupo HMG estaacute envolvida na replicaccedilatildeo e manutenccedilatildeo do kDNA (WANG et al
2014) Baseado nesses dados juntamente com os dados da imunofluorescecircncia
indireta pode-se sugerir um papel de TcKAP7 na replicaccedilatildeo da rede de kDNA
Embora ainda natildeo saibamos como KAP7 se associa com o kDNA de T
cruzi eacute possiacutevel que isso ocorra de duas maneiras atraveacutes de ligaccedilotildees
eletrostaacuteticas natildeo-especiacuteficas ou de interaccedilotildees com regiotildees especiacuteficas dos
miniciacuterculos
Atraveacutes de ensaios de SAXS foi possiacutevel perceber que a proteiacutena sofre
alteraccedilotildees conformacionais na presenccedila do kDNA sugerindo sua interaccedilatildeo com
esse aacutecido nucleacuteico Esta interaccedilatildeo pode ser eletrostaacutetica uma vez que a anaacutelise da
superfiacutecie eletrostaacutetica de TcKAP7 mostrou a predominacircncia de regiotildees ricas em
aminoaacutecidos com cargas positivas que podem conferir afinidades agrave outras proteiacutenas
com carga superficial negativa ou mesmo aacutecidos nucleicos mais uma vez sugerindo
a interaccedilatildeo com kDNA
Poreacutem natildeo se pode descartar a possibilidade de que a interaccedilatildeo de TcKAP7
com o kDNA seja atraveacutes de interaccedilotildees com regiotildees especiacuteficas dos miniciacuterculos
Nos tripanosomatiacutedeos a rede de kDNA assume a forma de um disco achatado
100
perpendicular ao flagelo onde os miniciacuterculos estatildeo alinhados em fibrilas orientadas
paralelamente ao eixo do disco (LIU et al 2005) Acredita-se que a ordenaccedilatildeo e
compactaccedilatildeo dos miniciacuterculos estatildeo relacionadas agrave proacutepria estrutura da moleacutecula de
miniciacuterculo Os miniciacuterculos apresentam regiotildees ricas em A+T que podem causar
curvaturas na moleacutecula (MARINI et al 1984 NTAMBI et al 1984) facilitando sua
inserccedilatildeo de forma ordenada no disco de kDNA aleacutem disso possuem regiotildees
conservadas onde estatildeo localizadas as origens de replicaccedilatildeo Essas regiotildees por
sua vez podem ser reconhecidas por proteiacutenas tais como a KAP7 que ajudam a
estabilizar a estrutura Os resultados com C fasciculata mostram que KAP2 3 e 4 se
ligam em regiotildees especiacuteficas dos miniciacuterculos ricas em A+T mas que natildeo satildeo
aquelas que geram a curvatura das moleacuteculas (XU et al 1996) Contudo KAP1 se
liga de maneira inespeciacutefica aos miniciacuterculos (HINES amp RAY 1998) Aleacutem disso
existe a sequecircncia universal de miniciacuterculo (UMS) e as proteiacutenas que se ligam a
essa sequecircncia (UMSBP) as quais podem participar de interaccedilotildees com as KAPrsquos
Em C fasciculata CfKAP3 sozinha consegue condensar a rede de kDNA e inibir a
decatenaccedilatildeo pela enzima topo II Poreacutem a interaccedilatildeo entre CfKAP3 e CfUMSBP
pode descondensar a rede de kDNA e reestabelecer a decatenaccedilatildeo mediada pela
topo II indicando que as proteiacutenas KAPrsquos dos tripanosomatiacutedeos podem apresentar
diferentes funccedilotildees em diferentes espeacutecies (KAPELLER et al 2011)
Para investigar a importacircncia de TcKAP7 no T cruzi e seu envolvimento ou
natildeo com o rearranjo topoloacutegico do kDNA durante o processo de diferenciaccedilatildeo do
parasita realizamos a deleccedilatildeo do gene TcKAP7 Nenhuma alteraccedilatildeo estrutural ou
morfoloacutegica na rede de kDNA foi observada no mutante de T cruzi para TcKAP7 Do
mesmo modo o parasita mutante natildeo apresentou perfil de crescimento alterado e
foi capaz de se diferenciar nas formas tripomastigotas metaciacuteclicas e infectar ceacutelulas
VERO onde se diferenciaram em formas amastigotas O mesmo foi visto quando foi
realizado o nocaute do gene TcKAP3 (DE SOUZA et al 2010)
Uma das hipoacuteteses para explicar esse fato eacute que alguma outra KAP de T
cruzi possa estar assumindo o papel da TcKAP7 talvez a TcKAP4 que se localiza
nos poacutelos do cinetoplasto quando da inserccedilatildeo dos miniciacuterculos na rede apoacutes serem
replicados na regiatildeo cinetoflagelar A redundacircncia no papel das KAPs faz com que a
rede de kDNA seja compactada e segregada corretamente mesmo na ausecircncia de
uma delas (DE SOUZA et al 2010) Sabe-se que o nocaute do gene Cfkap2 ou do
gene Cfkap3 separadamente natildeo mostrou nenhuma alteraccedilatildeo no fenoacutetipo de C
101
fasciculata Poreacutem a deleccedilatildeo de ambos os genes causou diversas alteraccedilotildees
aumento nos niacuteveis de mRNAs mitocondriais reduccedilatildeo na respiraccedilatildeo inibiccedilatildeo da
divisatildeo celular e acuacutemulo de ceacutelulas com morfologias anormais (AVLIYAKULOV et
al 2004)
Com o intuito de complementar os estudos para a caracterizaccedilatildeo do gene
TcKAP7 foram realizados ensaios de RNA de interferecircncia visando analisar a
funccedilatildeo do gene TbKAP7 ortoacutelogo em T brucei jaacute que a maquinaria de RNAi em T
cruzi eacute inexistente (DA ROCHA et al 2003) Com isso foi visto que a participaccedilatildeo da
TbKAP7 no metabolismo do T brucei eacute essencial jaacute que o silenciamento do gene
TbKAP7 levou agrave reduccedilatildeo da proliferaccedilatildeo celular do parasita corroborando com os
dados encontrados para TbKAP6 (WANG et al 2014)
Esperamos que o conhecimento das diversas moleacuteculas envolvidas na
organizaccedilatildeo e replicaccedilatildeo da rede de kDNA assim como o entendimento dos
mecanismos fisioloacutegicos que ocorrem nesta estrutura tatildeo peculiar que eacute o
cinetoplasto dos tripanosomatiacutedeos possam nos ajudar a esclarecer vaacuterios aspectos
relacionados a biologia destes eucariotos primitivos e a evoluccedilatildeo do genoma
mitocondrial ao longo do processo evolutivo
102
6 CONCLUSOtildeES
Com base nos resultados observados neste trabalho foi possiacutevel concluir
1 ndash A proteiacutena TcKAP7 eacute uma proteiacutena associada ao cinetoplasto de T
cruzi e possui caracteriacutesticas que a identificam como KAPs do tipo histona H1
incluindo seu tamanho e sua composiccedilatildeo de aminoaacutecidos e sua superfiacutecie
eletrostaacutetica
2 ndash TcKAP7 estaacute localizada nos poacutelos do cinetoplasto de T cruzi podendo
estar envolvida na replicaccedilatildeo dos miniciacuterculos
3 - TcKAP7 sofre mudanccedilas conformacionais na presenccedila do kDNA de T
cruzi evidenciando sua interaccedilatildeo com o aacutecido nucleico
4 ndash O mutante de T cruzi para TcKAP7 natildeo apresentou alteraccedilatildeo na
estrutura do cinetoplasto e na morfologia do parasita
5 ndash A proliferaccedilatildeo e a diferenciaccedilatildeo do T cruzi natildeo foram alteradas quando
o parasita teve o gene TcKAP7 deletado do genoma
6 ndash O silenciamento do gene TbKAP7 eacute essencial no metabolismo do T
brucei levando agrave reduccedilatildeo da proliferaccedilatildeo celular do parasita
103
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Agrave vocecircs pentelhos
O que seria de mim sem vocecircs
Vocecircs satildeo minha fortaleza meu porto seguro sempre posso contar com vocecircs
pra tudo tudo mesmo Obrigada pelos conselhos pelas broncas por
nunca me deixar desistir mesmo nos momentos mais difiacuteceis vocecircs sempre
tinham uma palavra que me confortava me encorajava e me fazia seguir em
frente Sem a ajuda de vocecircs esse trabalho natildeo ficaria pronto nunca
Amo vocecircs
AGRADECIMENTOS
Agrave Deus em primeiro lugar por me dar sauacutede vitalidade e acircnimo sempre
E por sempre estar comigo
Ao Dr Stenio Perdigatildeo Fragoso pela orientaccedilatildeo confianccedila dedicaccedilatildeo e
amizade Afinal satildeo 12 anos hein chefe Como vocecirc ainda me aguenta Obrigada
por tudo aprendi e continuo aprendendo muito com vocecirc
Agrave Dra Tatiana Arruda Campos Brasil que me ajudou desde o primeiro
momento em que eu entrei no Laboratoacuterio de Proteiacutenas com seu jeito meigo e
atencioso e com sua experiecircncia me mostrou um mundo novo por qual eu me
apaixonei Sempre com muita paciecircncia me explicava tudo tim tim por tim tim e me
ajudou muuuito na escrita da tese Obrigada Tati
Agrave Dra Lia Medeiros que me ajudou muito com as microscopias Fizemos ateacute
o sacrifiacutecio de ir visualizar uma MET na UFSC em Floripa que chato neacute Brigadatildeo
Lia pela paciecircncia e boa vontade
Ao Dr Paulo Carvalho e a Dra Juliane Fischer que me ajudaram em
experimentos e anaacutelises que nem entraram na tese Sempre muito atenciosos
Obrigada
Aos meus queridos amigos do LAB2 Aqueles que jaacute se foram (Andreacute
Aleatoacuterio Lari Mauriacutecio Baacuterbara Odineacuteia Paacute ) e aqueles que estatildeo laacute ateacute hoje
(Didi Gi Vanessa Felipe Aline Claudinha) Obrigada por fazerem o trabalho ficar
mais divertido Aos meus companheiros de doc Mocircnica e Fernando o trio parada
dura passou por muita coisa junto e tem muita histoacuteria pra contar Obrigada gente
adoro vocecircs
Agraves minhas queridas amigas mais ldquoexperientesrdquo que moram no meu coraccedilatildeo
Aldinha e Dani obrigada por todos os momentos que passamos juntas no lab e fora
do lab obrigada pela a ajuda que sempre me deram sem esperar nada em troca
vocecircs sabem que seus conselhos sempre foram muito valiosos pra mim Obrigada
amigas vocecircs satildeo iacutempares
Agrave minha querida irmatildezinha Rocirc que nasceu no mesmo dia soacute que eacute mais
velha hahahahaha Obrigada amiga por tudo por todo esse tempo pelos
experimentos pelas confissotildees pelas gargalhadas Vocecirc eacute uacutenica
Agrave Pri Hira Mari Serpeloni Haruo Daisy Vanessa que sempre me ajudavam
quando eu precisava ou fazer um experimento ou jogar conversa fora
Aos meus amigos doutores atleticanos Michel e Henrique que me ajudaram
em vaacuterios experimentos e anaacutelises Obrigada por estarem sempre dispostos em
ajudar Vocecircs satildeo atleticanos mas satildeo gente boa Obrigada
Ao Giovany pela imensa ajuda com os camundongos sempre disposto em
ajudar e ensinar
Ao Nilson Silvio Tacircnia Sibelli por toda a ajuda pela amizade e pela
paciecircncia e competecircncia Ah e pelas histoacuterias de terror
Agrave Maria Cristina por toda a ajuda natildeo soacute na parte administrativa e pela
amizade
Ao Dr Marco Krieger pela confianccedila e por me proporcionar suporte
financeiro quando entrei no periacuteodo de prorrogaccedilatildeo
A todos os amigos e pesquisadores do Instituto Carlos Chagas dos demais
laboratoacuterios Lab REG Lab Genocircmica Laboratoacuterio de Biologia Celular por terem de
um jeito ou de outro participado do processo Eacute difiacutecil agradecer todo mundo
Valeu galera
ldquoTenho a impressatildeo de ter sido uma crianccedila brincando agrave
beira-mar divertindo-me em descobrir uma pedrinha
mais lisa ou uma concha mais bonita que as outras
enquanto o imenso oceano da verdade continua
misterioso diante de meus olhosrdquo
(Isaac Newton)
RESUMO
O DNA do cinetoplasto (kDNA) dos tripanosomatiacutedeos consiste numa rede de
moleacuteculas circulares catenadas entre si os miniciacuterculos e os maxiciacuterculos Os
miniciacuterculos codificam RNAs guias (gRNAs) e os maxiciacuterculos codificam para
algumas subunidades de enzimas mitocondriais e rRNA em um padratildeo
criptografado (ediccedilatildeo de RNA) Estudos com o tripanosomatiacutedeo Crithidia fasciculata
mostraram que proteiacutenas do tipo histona H1 associadas ao cinetoplasto (KAPs) satildeo
capazes de condensar a rede de kDNA Poreacutem pouco eacute conhecido sobre estas
proteiacutenas de Trypanosoma cruzi um protozoaacuterio parasita que sofre alteraccedilotildees na
estrutura do DNA do cinetoplasto ao longo de seu ciclo de vida Neste trabalho foi
caracterizada uma proteiacutena associada ao cinetoplasto de T cruzi denominada de
TcKAP7 que possui baixo peso molecular e natureza baacutesica condizente com um
papel na neutralizaccedilatildeo de carga e na condensaccedilatildeo do DNA Atraveacutes de ensaios
usando a teacutecnica de espalhamento de raios-X a baixo acircngulo (SAXS) foi possiacutevel
perceber que a proteiacutena TcKAP7 sofre mudanccedilas estruturais na presenccedila do kDNA
sugerindo uma interaccedilatildeo com essa estrutura seja atraveacutes de ligaccedilotildees eletrostaacuteticas
ou atraveacutes de ligaccedilotildees especiacuteficas com moleacuteculas presentes na rede A anaacutelise pela
teacutecnica de imunofluorescecircncia mostrou que proteiacutena TcKAP7 estaacute localizada na
regiatildeo dos poacutelos do cinetoplasto o que sugere que pode estar envolvida na
finalizaccedilatildeo da replicaccedilatildeo dos miniciacuterculos Mutante nulo para TcKAP7 foi gerado por
teacutecnicas de substituiccedilatildeo gecircnica a fim de verificar se na ausecircncia de TcKAP7
ocorriam alteraccedilotildees na estrutura do kDNA Contudo os parasitas mutantes para
TcKAP7 natildeo apresentavam alteraccedilotildees na estrutura e morfologia do cinetoplasto
quando analisados por microscopia eletrocircnica e foram capazes de se diferenciar
sem perder a capacidade infectiva Entretanto ensaios de RNA de interferecircncia
visando analisar a funccedilatildeo do gene TbKAP7 ortoacutelogo em T brucei levou agrave reduccedilatildeo
da proliferaccedilatildeo celular das formas prociacuteclicas desse parasita mostrando que este
gene eacute essencial para o metabolismo desse tripanosomatiacutedeo sugerindo que KAP7
possa ter papeis distintos em T cruzi e T brucei
Palavras-chaves Trypanosoma cruzi cinetoplasto nocaute KAPs
ABSTRACT
The kinetoplast DNA (kDNA) of trypanosomatids consists in a network of circular
molecules catenated each other the minicircles and maxicircles The minicircles
code RNAs guides (gRNAs) and the maxicircles code for some subunits of
mitochondrial enzymes and rRNA in a cryptic pattern (RNA editing) Studies in the
trypanosomatid protozoan Crithidia fasciculata showed that the kDNA is associated
with histone H1-like proteins known as kinetoplast-associated proteins (KAPs) wich
are capable of condensing the kDNA network However little is known about these
proteins of Trypanosoma cruzi a protozoan parasite which undergoes changes in
kinetoplast DNA structure over its life cycle Here we characterize a protein
associated with T cruzi kinetoplast named TcKAP7 TcKAP7 is a low molecular
weight protein with basic nature which is consistent with a role in DNA charge
neutralization and condensation Analysis by small angle X-Ray scattering technique
(SAXS) revealed that the TcKAP7 protein undergoes structural changes in the
presence kDNA suggesting an interaction with this DNA network either through
electrostatic bonds or through specific binding to molecules present on the network
The immunofluoresce analysis showed that TcKAP7 is located in the kinetoplast
poles suggesting that TcKAP7 might be involved in the late stages of the minicircle
replication A null mutant for TcKAP7 was obtained by gene replacement techniques
to study possible alterations in the kDNA structure However no modification in the
structure and morphology of the kinetoplast was observed by electron microscopy In
addition Tckap7 null mutant was able to differentiate without losing its infective
capacity Interference RNA assays was performed to analyze the function of
TbKAP7 the ortholog gene in T brucei The ablation of TbKAP7 expression leaded
to reduction in the procyclic proliferation suggesting that this gene is essential for the
metabolism of the parasite and might play distinct roles in T cruzi and T brucei
Key-words Trypanosoma cruzi kinetoplast gene knockout KAPs
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1 DISTRIBUICcedilAtildeO GEOGRAacuteFICA DA DOENCcedilA
DE CHAGAS19 FIGURA 2 CICLO DE TRANSMISSAtildeO DO
Trypanosoma cruzi20 FIGURA 3 ESQUEMA GERAL DAS PRINCIPAIS ESTRUTURAS
CELULARES DE T cruzi 22 FIGURA 4 REDE DE kDNA27 FIGURA 5 DIFERENTES ARRANJOS DO CINETOPLASTO
DE T cruzi29 FIGURA 6 MUDANCcedilAS NA POSICcedilAtildeO DO KDNA
NOS TRYPANOSOMAS29 FIGURA 7 REPOSICIONAMENTO DO KDNA EM RELACcedilAtildeO
AgraveS OUTRAS ORGANELAS DURANTEO CICLO DE VIDA DE UM FLAGELADO30
FIGURA 8 REPLICACcedilAtildeO DO kDNA32 FIGURA 9 REPRESENTACcedilAtildeO ESQUEMAacuteTICA DO
MICROFLUIDIFICADOR45 FIGURA 10 VETOR PARA EXPRESSAtildeO EM T CRUZI
P3XFLAG 50 FIGURA 11 ESQUEMA DA CONSTRUCcedilAtildeO DOS VETORES
UTILIZADOS PARA O NOCAUTE DO GENE TcKAP755
FIGURA 12 MAPA DO VETOR P2T7-177 UTILIZADO PARA ENSAIOS DE RNAi62
FIGURA 13 COMPARACcedilAtildeO ENTRE AS SEQUumlEcircNCIAS DE AMINOAacuteCIDOS DEDUZIDAS DO GENE KAP7 DE T cruzi Dm28C E DOS HAPLOacuteTIPOS DE CL BRENER65
FIGURA 14 COMPARACcedilAtildeO ENTRE AS SEQUumlEcircNCIAS DE AMINOAacuteCIDOS DEDUZIDAS DO GENE KAP7 EM DIFERENTES TRIPANOSOMATIacuteDEOS66
FIGURA 15 SINTENIA DE TcKAP7 COM OUTROS TRIPANOSOMATIacuteDEOS67
FIGURA 16 CARACTERIZACcedilAtildeO DA REGIAtildeO 5rsquo-UTR DO TRANSCRITO TcKAP769
FIGURA17 ANAacuteLISE DA EXPRESSAtildeO DA PROTEIacuteNA DE FUSAtildeO TCKAP7-FLAG EM FORMAS EPIMASTIGOTAS DE T CRUZI70
FIGURA 18 IMUNOLOCALIZACcedilAtildeO DE TcKAP7 EM EPIMASTIGOTAS DE T CRUZI71
FIGURA 19 ENSAIOS DE PCR UTILIZANDO DNA DE T cruzi kap7kap7 (WT) E T cruzi kap7neokap7higro (NO) COM DIFERENTES PRIMERS73
FIGURA 20 REPRESENTACcedilAtildeO ESQUEMAacuteTICA DOS SIacuteTIOS DA ENZIMA HindIII NO LOCUS DO GENE KAP7 DE T cruzi CL Brener75
FIGURA 21 ANAacuteLISE DA ORGANIZACcedilAtildeO DOS GENES TCKAP7 NEO E HIGRO POR ENSAIO DO TIPO SOUTHERN BLOT75
FIGURA 22 COMPARACcedilAtildeO DA EXPRESSAtildeO DO GENE TcKAP7 POR WESTERN BLOT76
FIGURA 23 COLORACcedilAtildeO PELO MEacuteTODO PANOacuteTICO RAacutePIDO DOS PARASITAS EPIMASTIGOTAS NOCAUTEADOS77
FIGURA 24 COMPARACcedilAtildeO ENTRE A ULTRAESTRUTURA DO CINETOPLASTO DO T cruzi DM28C TIPO SELVAGEM (A) E DO MUTANTE DE T cruzi PARA TcKAP7 (B) POR MICROSCOPIA ELETROcircNICA DE TRANSMISSAtildeO78
FIGURA 25 CURVA DE CRESCIMENTO DO MUTANTE DE T cruzi PARA TcKAP7 (KO) E DO T cruzi Dm28c SELVAGEM (WT) 79
FIGURA 26 METACICLOGEcircNESE IN VITRO DE T cruzi Dm28c TIPO SELVAGEM E T cruzi NOCAUTEADO80
FIGURA 27 RNAi DE TbKAP7 INIBE O CRESCIMENTO DAS FORMAS PROCIacuteCLICAS DE T brucei82
FIGURA 28 PURIFICACcedilAtildeO DE TCKAP7 ATRAVEacuteS DE CROMATOGRAFIA DE AFINIDADE83
FIGURA 29 PURIFICACcedilAtildeO DE TCKAP7 ATRAVEacuteS DE CROMATOGRAFIA DE TROCA IOcircNICA84
FIGURA 30 ANAacuteLISE POR DLS DE TCKAP785 FIGURA 31 ENVELOPE MOLECULAR DE SAXS86 FIGURA 32 ESPECTRO DE DICROIacuteSMO CIRCULAR DE
TcKAP787 FIGURA 33 PREDICcedilAtildeO DE ESTRUTURA SECUNDAacuteRIA DE
TcKAP787 FIGURA 34 CRISTAL DE TcKAP7 DE T CRUZI88 FIGURA 35 ESTRUTURA DE TcKAP790 FIGURA 36 SUPERFIacuteCIE ELETROSTAacuteTICA DE
TcKAP791 FIGURA 37 ALINHAMENTO ESTRUTURAL DE 3TQ6 4NOD
3TTM 4NNU E TCKAP793 FIGURA 38 ESPECTRO DE DICROIacuteSMO CIRCULAR
DE TcKAP794 FIGURA 39 ENVELOPE MOLECULAR DETcKAP795 FIGURA 40 ENVELOPE MOLECULAR DETcKAP7 VISTO EM
DIFERENTES AcircNGULOS96
LISTA DE TABELAS
TABELA 1 RELACcedilAtildeO DOS PRIMERS UTILIZADOS PARA A CLONAGEM DA REGIAtildeO UPSTREAM DE TcKAP7 NO VETOR pNEO153
TABELA 2 RELACcedilAtildeO DOS PRIMERS UTILIZADOS PARA A CLONAGEM DA REGIAtildeO DOWNSTREAM DE TcKAP7 NO VETOR pNEO153
TABELA 3 RELACcedilAtildeO DOS PRIMERS UTILIZADOS PARA A AMPLIFICACcedilAtildeO DO GENE TbKAP763
TABELA 4ndash PERCENTUAL DE IDENTIDADE ENTRE AS PROTEIacuteNAS KAP7 NOS TRIPANOSSOMATIacuteDEOS COM O GENOMA SEQUENCIADO67
TABELA 5 COMBINACcedilOtildeES DE PRIMERS UTILIZADOS NA PCR PARA CONFIRMAR O NOCAUTE DE TcKAP772
SUMAacuteRIO
1 INTRODUCcedilAtildeO18 11 O Trypanosoma cruzi18 12 Ciclo de vida do T cruzi20 13 Aspectos celulares de T cruzi21 14 O genoma de T cruzi24 15 Expressatildeo gecircnica de Tcruzi25 16 O cinetoplasto26 17 A rede de kDNA26 171 Replicaccedilatildeo do kDNA31 18 Proteiacutenas associadas ao cinetoplasto (KAPs)32 2 OBJETIVOS35 21 OBJETIVO GERAL35 211 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS35 3 MATERIAIS E MEacuteTODOS36 31 Reagentes e Soluccedilotildees Utilizados36 311 Reagentes36 312 Tampotildees e Soluccedilotildees36 313 Meios de cultura38 32 Cultivo do Trypanosoma cruzi38 321 Epimastigotas38 322 Tripomastigotas metaciacuteclicos39 33 Curva de crescimento de T cruzi39 34 Obtenccedilatildeo de DNA de T cruzi40 35 Obtenccedilatildeo de kDNA de T cruzi40 36 Obtenccedilatildeo de extrato proteico de T cruzi40 37 Clonagem do gene TcKAP741 38 Obtenccedilatildeo do cDNA de TcKAP7 atraveacutes de ensaio de RT-PCR41 39 Seleccedilatildeo dos clones recombinantes42 391 Teacutecnica de palitagem (toothpick)42 392 Teacutecnica de PCR de colocircnia43 310 Preparaccedilatildeo de plasmiacutedeo em pequena escala (miniprep)43 311 Expressatildeo da proteiacutena TcKAP7 em E coli43 312 Purificaccedilatildeo da proteiacutena recombinante TcKAP744 3121 Processamento da amostra44 3122 Cromatografia de afinidade45 3123 Cromatografia de troca iocircnica46 3124 Cromatografia de gel filtraccedilatildeo46 313 Espalhamento Dinacircmico de Luz ndash DLS46 314 Espectroscopia de dicroiacutesmo circular (CD)46 315 Quantificaccedilatildeo e concentraccedilatildeo47 316 Ensaios de Cristalizaccedilatildeo47 317 Espalhamento de raio-X a baixo acircngulo (SAXS)48 318 Modelagem de TcKAP748 319 Obtenccedilatildeo de antissoro policlonal contra TcKAP749 320 Anaacutelise da expressatildeo do gene TcKAP7 e de seu mutante por ensaio tipo western blot49 321 Superexpressatildeo de TcKAP750
3211 Amplificaccedilatildeo e clonagem do gene TcKAP7 no vetor pNEO3xFlag para superexpressatildeo da proteiacutena50 3212 Transfecccedilatildeo por eletroporaccedilatildeo52 3213 Seleccedilatildeo dos transfectantes52 322 Deleccedilatildeo do gene TcKAP7 por nocaute gecircnico53 3221 Amplificaccedilatildeo e clonagem das regiotildees a montante e a jusante do gene TcKAP753 3222 Amplificaccedilatildeo dos cassetes UPS-NEO-DOWN e UPS-HIGRO-DOWN para transfecccedilatildeo de T cruzi55 3223 Transfecccedilatildeo do T cruzi com o cassete UPS-NEO-DOWN56 3224 Extraccedilatildeo de DNA dos transfectantes57 3225 Anaacutelise por PCR do DNA dos parasitas transfectados com o cassete UPS-NEO-DOWN57 3226 Transfecccedilatildeo do T cruzi com o cassete UPS-HIGRO-DOWN57 3227 Anaacutelise por PCR do DNA dos parasitas transfectados com o cassete UPS-HIGRO-DOWN58 3228 Anaacutelise da organizaccedilatildeo do gene TcKAP7 e da eficiecircncia de seu nocaute atraveacutes de ensaio do tipo Southern blot58 323 Localizaccedilatildeo celular da proteiacutena TcKAP7 atraveacutes de ensaio de imunofluorescecircncia59 324 Anaacutelise da ultraestrutura do cinetoplasto do mutante de T cruzi para TcKAP7 por microscopia eletrocircnica de transmissatildeo60 325 Coloraccedilatildeo dos parasitas transfectados60 326 Infecccedilatildeo de ceacutelulas Vero com o mutante de T cruzi para TcKAP761 327 Anaacutelise da funccedilatildeo do gene TbKAP7 de Trypanosoma brucei atraveacutes de ensaios de RNA de interferecircncia61 3271 Induccedilatildeo do RNA dupla fita64 4 RESULTADOS65 41 Clonagem e caracterizaccedilatildeo do gene TcKAP765 42 Expressatildeo da proteiacutena TcKAP7 em T cruzi69 43 Localizaccedilatildeo celular de TcKAP7 atraveacutes de ensaio de imunofluorescecircncia70 44 Deleccedilatildeo do gene TcKAP7 por nocaute gecircnico71 441 Anaacutelise por PCR do DNA dos parasitas transfectados com os cassetes UPS-NEO-DOWN e UPS-HIGRO-DOWN72 442 Anaacutelise da organizaccedilatildeo dos genes TcKAP7 neo e higro por ensaio do tipo Southern blot74 45 Comparaccedilatildeo da expressatildeo do gene TcKAP7 por western blot76 46 Anaacutelise da morfologia e da ultraestrutura do cinetoplasto do mutante de T cruzi para TcKAP776 47 Multiplicaccedilatildeo diferenciaccedilatildeo e infectividade do mutante de T cruzi para TcKAP779 48 Anaacutelise da funccedilatildeo do gene KAP7 de Trypanosoma brucei atraveacutes de ensaios de RNA de interferecircncia80 49 Caracterizaccedilatildeo estrutural de TcKAP782 491 Produccedilatildeo recombinante de TcKAP782 410 Anaacutelise do estado oligomeacuterico de TcKAP784 411 Anaacutelise do conteuacutedo de estrutura secundaacuteria de TcKAP7 recombinante86 412 Anaacutelise estrutural de TcKAP787
413 Investigaccedilatildeo de possiacuteveis funcionalidades baseadas na estrutura de TcKAP791 4131 Prediccedilatildeo de funccedilatildeo paraTcKAP791 4132 Anaacutelises preliminares da possiacutevel interaccedilatildeo entre TcKAP7 e kDNA93 5 DISCUSSAtildeO97 6 CONCLUSOtildeES102 7 REFEREcircNCIAS103
18
1 INTRODUCcedilAtildeO
11 O Trypanosoma cruzi
Trypanosoma cruzi eacute um protozoaacuterio flagelado unicelular pertencente ao
reino Protista subreino Protozoa filo Sarcomastigophora subfilo Mastigophora
classe Zoomastigophora ordem Kinetoplastida e famiacutelia Trypanosomatidae (LEVINE
et al 1980) A principal caracteriacutestica dessa ordem eacute a presenccedila de uma estrutura
singular o cinetoplasto que abriga em uma massa de DNA extranuclear
concentrado na mitococircndria uacutenica deste protista (SHAPIRO amp ENGLUND 1995) A
famiacutelia Trypanosomatidae inclui os seguintes gecircneros importantes Blastocrithidia
Crithidia Endotrypanum Herpetomonas Leishmania Leptomonas Phytomonas e
Trypanosoma O gecircnero Trypanosoma eacute um dos mais importantes dentro da famiacutelia
Trypanosomatidae por incluir uma seacuterie de espeacutecies causadoras de doenccedilas
humanas importantes como o Trypanosoma cruzi agente da doenccedila de Chagas
Trypanosoma rhodesiense e Trypanosoma gambiense agentes da doenccedila do sono
e de animais o Trypanosoma brucei Trypanosoma equiperdum e Trypanosoma
equinum (DE SOUZA 2015)
Este protozoaacuterio eacute um microrganismo heteroxecircnico com ciclo bioloacutegico
alternado entre hospedeiros vertebrados (mamiacuteferos) e invertebrados (triatomiacuteneos)
Existem diferentes formas de transmissatildeo da doenccedila dentre as quais se destaca a
via vetorial que consiste na transmissatildeo do parasita atraveacutes de excretas do inseto
vetor hematoacutefago pertencente agrave ordem Hemiacuteptera famiacutelia Reduvidae subfamiacutelia
Triatominae (DIAS et al 1956) A principal caracteriacutestica bioloacutegica dos triatomiacuteneos
eacute que satildeo obrigatoriamente hematoacutefagos e necessitam do repasto sanguiacuteneo para
completar o desenvolvimento (DIAS 2000) O parasita pode ainda ser transmitido
aos mamiacuteferos por transfusatildeo sanguiacutenea ou via oral e com menos frequecircncia por
via congecircnita acidentes de laboratoacuterio e transplantes de oacutergatildeos (BELTRAO HDE et
al 2009 STEINDEL et al 2008 TANOWITZ et al 1992) Praticamente todo tipo
de ceacutelula nucleada do hospedeiro mamiacutefero pode ser parasitada considerando o
tropismo das diferentes cepas (LENZI et al 1996) Outra caracteriacutestica deste
parasita eacute apresentar diferentes morfologias durante o ciclo bioloacutegico A classificaccedilatildeo
19
de suas formas baseia-se tambeacutem na posiccedilatildeo do cinetoplasto em relaccedilatildeo ao nuacutecleo
e do local de onde emerge o flagelo (HOARE 1971)
Foi no ano de 1909 no estado de Minas Gerais que Carlos Chagas meacutedico
sanitarista identificou pela primeira vez o protozoaacuterio parasita Trypanosoma cruzi
agente causador da Doenccedila de Chagas A doenccedila de Chagas eacute endecircmica na
Ameacuterica Latina sendo conhecida a existecircncia de vetores da doenccedila desde o sul dos
Estados Unidos agrave Argentina (FIGURA 1)
FIGURA 1 DISTRIBUICcedilAtildeO GEOGRAacuteFICA DA DOENCcedilA DE CHAGAS FONTE Modificado de httpwwwwhointen
Em 2008 o nuacutemero de indiviacuteduos infectados era estimado entre 16 e 18
milhotildees sendo que aproximadamente 90 milhotildees de pessoas estariam sob risco
de contaminaccedilatildeo na Ameacuterica Latina (WHO 2010)
Apesar de existirem drogas (Nifurtimox e Benzonidazol) para o tratamento
da doenccedila sua ineficaacutecia no estaacutegio crocircnico e sua accedilatildeo toacutexica acabam prejudicando
o paciente sem conseguir eliminar o parasita (BRENER et al 2000) Sem vacinas
ou tratamento quimioteraacutepico eficiente a principal estrateacutegia de controle limita-se agrave
prevenccedilatildeo da transmissatildeo por transfusatildeo sanguiacutenea e ao controle populacional dos
vetores triatomiacuteneos Aleacutem da sua importacircncia como patoacutegeno humano este micro-
organismo apresenta caracteriacutesticas peculiares que o tornam um excelente modelo
para o estudo de questotildees bioloacutegicas baacutesicas
Regiotildees endecircmicas
20
12 Ciclo de vida do T cruzi
O T cruzi apresenta um ciclo complexo na natureza sofrendo mudanccedilas
estruturais bioquiacutemicas e morfoloacutegicas de acordo com o ambiente em que se
encontra Formas replicativas epimastigotas e amastigotas dos hospedeiros
invertebrado e mamiacutefero respectivamente alternam-se com as formas infectivas e
natildeo proliferativas tripomastigotas metaciacuteclicas (proveniente do inseto vetor) e
tripomastigota sanguiacutenea (originaacuteria do mamiacutefero infectado) (FIGURA 2) (DE
SOUZA 1984)
FIGURA 2 CICLO DE TRANSMISSAtildeO DO Trypanosoma cruzi FONTE Infograacutefico Veniacutecio Ribeiro ICICTFIOCRUZ
Durante o repasto sanguiacuteneo do inseto vetor formas tripomastigotas
metaciacuteclicas atingem a corrente sanguiacutenea do hospedeiro pela lesatildeo da picada Esta
forma infectiva eacute capaz de invadir todos os tipos de ceacutelulas com exceccedilatildeo das
21
hemaacutecias Apoacutes a entrada do parasita na ceacutelula os tripomastigotas diferenciam-se
em uma forma replicativa denominada amastigota que apoacutes diversas divisotildees sofre
uma diferenciaccedilatildeo para um estaacutegio intermediaacuterio o epimastigota intracelular e
posteriormente para tripomastigota Quando ocorre a lise celular os tripomastigotas
satildeo liberados ao meio extracelular podendo entatildeo invadir ceacutelulas vizinhas atingir
novos tecidos atraveacutes da corrente sanguiacutenea ou ainda infectar um inseto vetor
durante o processo de hematofagia recomeccedilando o ciclo no hospedeiro
invertebrado No inseto as formas tripomastigotas diferenciam-se em epimastigotas
no tubo digestivo e migram para o intestino onde ocorrem as divisotildees binaacuterias Ao
atingirem a porccedilatildeo terminal do tubo digestivo ocorre a diferenciaccedilatildeo em
tripomastigotas metaciacuteclicos que satildeo eliminados juntamente com as fezes e urina do
triatomiacutedeo
A transformaccedilatildeo da forma epimastigota do T cruzi em tripomastigota
metaciacuteclica denominada metaciclogecircnese eacute de grande interesse de estudo pois
neste processo ocorrem diversas alteraccedilotildees morfoloacutegicas metaboacutelicas e de
expressatildeo gecircnica (GOLDENBERG et al 1985) A metaciclogecircnese que ocorre
naturalmente no intestino do inseto vetor pode ser mimetizada in vitro utilizando-se
meio quimicamente definido que simula as condiccedilotildees da urina do inseto vetor
(CONTRERAS et al 1985)
13 Aspectos celulares de T cruzi
O Trypanosoma cruzi apresenta aleacutem das organelas tiacutepicas da maioria das
ceacutelulas eucarioacuteticas como nuacutecleo retiacuteculo endoplasmaacutetico aparato de Golgi e
mitococircndria algumas estruturas peculiares (FIGURA 3) como os microtuacutebulos
subpeliculares a estrutura paraflagelar os reservossomos o cinetoplasto os
glicossomos e os acidocalcisomos exclusivos dos tripanosomatiacutedeos (revisto por
DE SOUZA 1984 1999 2002)
22
FIGURA 3 ESQUEMA GERAL DAS PRINCIPAIS ESTRUTURAS CELULARES DE T cruzi FONTE DOCAMPO et al 1975
A superfiacutecie celular dos tripanossomatiacutedeos eacute composta principalmente
pela membrana plasmaacutetica e pelos microtuacutebulos subpeliculares Pequenos
filamentos conectam fortemente os microtuacutebulos subpeliculares os quais se
apresentam espaccedilados de forma regular entre si e com a membrana plasmaacutetica (DE
23
SOUZA SANTANNA CUNHA-E-SILVA 2009) conferindo rigidez agrave ceacutelula e
resistecircncia ao rompimento mecacircnico
Todos os membros da famiacutelia Trypanosomatidae apresentam um flagelo
que emerge de uma aacuterea de invaginaccedilatildeo da membrana plasmaacutetica conhecida como
bolsa flagelar Devido agrave localizaccedilatildeo especiacutefica de vaacuterios receptores nesta aacuterea
acredita-se que a maior parte do traacutefego vesicular e entrada de nutrientes ocorram
nesta regiatildeo Outra invaginaccedilatildeo menor localizada proacutexima agrave bolsa flagelar o
citoacutestomo tambeacutem estaacute envolvida com a absorccedilatildeo de nutrientes (PORTO-
CARREIRO et al 2000)
O flagelo do T cruzi apresenta uma estrutura baacutesica semelhante a outros
flagelos sendo envolvido por uma membrana flagelar e contendo um axonema
tiacutepico que apresenta um padratildeo de nove pares de microtuacutebulos perifeacutericos e um par
central Associado ao flagelo deste parasita eacute encontrado um complexo arranjo de
filamentos proteacuteicos denominado de estrutura paraflagelar (revisto por GULL 1999)
Na parte posterior da ceacutelula existem organelas usualmente esfeacutericas
denominadas reservossomos Os reservossomos satildeo organelas aacutecidas que
possuem em seu interior proteinases principalmente a cruzipaiacutena (uma
cisteiacutenoproteinase) e proteiacutenas ingeridas que chegam dentro de vesiacuteculas
endociacuteticas oriundas da bolsa flagelar e do citoacutestomo Com base nisso foi proposto
que os reservossomos seriam compartimentos preacute-lisossomais (SOARES et al
1992) Tambeacutem tem sido proposta a participaccedilatildeo dos reservossomos no processo
de metaciclogecircnese como principal fonte de energia para esta atividade (SOARES
1999)
O T cruzi assim como todos os membros da famiacutelia Tripanosomatidae
apresenta uma mitococircndria uacutenica e ramificada que se estende por todo o corpo do
protozoaacuterio Como em todas as ceacutelulas eucarioacuteticas a mitococircndria dos
tripanosomatiacutedeos tambeacutem apresenta DNA mitocondrial tambeacutem conhecido como
kDNA ou DNA do cinetoplasto que se concentra em uma determinada regiatildeo da
mitococircndria localizada logo abaixo do corpuacutesculo basal dando origem a uma
estrutura intramitocondrial chamada de cinetoplasto O cinetoplasto abriga o kDNA
o qual eacute constituiacutedo por moleacuteculas circulares que se encontram interligadas
formando uma extensa rede entre si (SHLOMAI 1994)
Distribuiacutedos pelo citoplasma estatildeo os glicossomos um tipo especializado de
peroxissomo Estes acumulam enzimas da via glicoliacutetica envolvidas na conversatildeo
24
da glicose a 3-fosfoglicerato que em outros organismos localizam-se no citoplasma
(HANNAERT et al 2003)
Outra particularidade dos tripanossomatiacutedeos estaacute na estocagem intracelular
de caacutelcio Este iacuteon importante nos processos de sinalizaccedilatildeo celular eacute estocado em
organelas denominadas acidocalcissomos Os acidocalcissomos provavelmente
estatildeo envolvidos em diversos processos bioloacutegicos tais como o armazenamento de
caacutelcio e polifosfatos adaptaccedilatildeo dos tripanosomatiacutedeos a condiccedilotildees de estresse
ambiental manutenccedilatildeo do pH intracelular e osmorregulaccedilatildeo (revisto por DOCAMPO
et al 2005)
14 O genoma de T cruzi
No ano de 2005 foi concluiacuteda a montagem do genoma do T cruzi (EL-
SAYED et al 2005) A cepa CL Brener foi a escolhida para o sequenciamento por
ser bem caracterizada bioquiacutemica e parasitologicamente (ZINGALES et al 1997) e
por ser considerada representativa para o universo de cepas circulantes de T cruzi
Com base na montagem do sequenciamento o genoma diploacuteide do parasita foi
calculado como sendo de 1064 1107 Mb com cada haploacutetipo contendo cerca de
12000 genes sendo que mais de 50 do genoma constituiu-se de sequecircncias
repetitivas compostas por famiacutelias de proteiacutenas de superfiacutecie retrotransposons e
elementos subtelomeacutericos (EL-SAYED et al 2005)
A comparaccedilatildeo das estruturas genocircmicas e proteiacutenas preditas obtidas a
partir do sequenciamento de Trypanosoma cruzi com as de Leishmania major e
Trypanosoma brucei indica mais similaridade entre T cruzi e T brucei uma grande
conservaccedilatildeo entre os respectivos proteomas (exceto para antiacutegenos de superfiacutecie) e
uma sintenia bastante conservada entre os trecircs tripanosomatiacutedeos apesar da
divergecircncia haacute 200-500 milhotildees de anos atraacutes (BERRIMAN et al 2005 EL SAYED
et al 2005 IVENS et al 2005)
Os tripanosomatiacutedeos possuem aleacutem do genoma nuclear um grande
genoma mitocondrial (kDNA) que tem sido extensivamente estudado sendo uacutenico
em estrutura funccedilatildeo e mecanismo de replicaccedilatildeo O kDNA eacute formado por milhares de
moleacuteculas circulares topologicamente relaxadas e interligadas umas as outras Este
arranjo conteacutem aproximadamente 20 - 30 do DNA total dos tripanosomatiacutedeos e eacute
composto por 2 tipos de moleacuteculas circulares os maxiciacuterculos e os miniciacuterculos Os
25
maxiciacuterculos apresentam um tamanho entre 22-37 kb e conteacutem basicamente os
genes codificadores de proteiacutenas envolvidas na fosforilaccedilatildeo oxidativa e RNA
ribossocircmico Os miniciacuterculos com um tamanho que varia de espeacutecie para espeacutecie
(05 a 25 kb) conteacutem os genes que codificam os RNAs guia envolvidos na
editoraccedilatildeo do RNA (STUART et al 1989 SHAPIRO amp ENGLUND 1995 MADISON-
ANTENUCCI et al 2002 SIMPSON et al 2003 ONN et al 2006 GLUENZ et al
2007)
15 Expressatildeo gecircnica de Tcruzi
T cruzi estaacute sujeito agraves frequentes mudanccedilas de ambientes decorrentes da
passagem por diferentes hospedeiros durante seu ciclo de vida (temperatura pH
quantidade de nutrientes evasatildeo do sistema imune) por esse motivo a expressatildeo
gecircnica deste parasita eacute regulada por diversos fatores A adaptaccedilatildeo raacutepida e eficiente
a estas diferentes condiccedilotildees torna-se uma importante tarefa para o parasita
Como os demais eucariotos o T cruzi apresenta trecircs RNAs polimerases a
RNA polimerase I transcreve os genes para RNAs ribossocircmicos a RNA polimerase
II os genes que codificam proteiacutenas e a RNA polimerase III pequenos RNAs como
o tRNA (RNA de transferecircncia) Nos tripanosomatiacutedeos promotores para as RNA
polimerase I e III jaacute foram identificados poreacutem ainda natildeo foram identificados
promotores para os genes transcritos pela RNA polimerase II com exceccedilatildeo de um
promotor associado ao gene do mini-exon (GILLINGER amp BELLOFATTO 2001
revisto por CAMPBELL et al 2003)
Os genes dos tripanosomatiacutedeos estatildeo organizados em unidades
policistrocircnicas e natildeo apresentam interrupccedilotildees por iacutentrons com exceccedilatildeo do gene da
poli-A polimerase (MAIR et al 2000)
Uma vez que em T cruzi como nos demais eucariotos somente mRNAs
monocistrocircnicos satildeo traduzidos os precursores de mRNA policistrocircnicos devem ser
processados ateacute mRNAs individuais Como caracteriacutestica desta famiacutelia os
transcritos de mRNA satildeo processados por mecanismos de trans-splicing (AGABIAN
1990) e poliadenilaccedilatildeo (LEBOWITZ et al 1993 MATTHEWS et al 1994
VANHAMME amp PAYS 1995)
No processo de trans-splicing as unidades codificadoras satildeo separadas e eacute
adicionada na extremidade 5rsquo uma sequecircncia extremamente conservada espeacutecie-
26
especiacutefica de 39 nucleotiacutedeos denominada sequumlecircncia liacuteder (SL) ou minieacutexon
(McCARTHY-BURKE et al 1989 NILSEN 1992 VANHAMME amp PAYS 1995)
Nesta reaccedilatildeo participam duas moleacuteculas de RNA uma doadora e outra aceptora A
doadora eacute um precursor do mini-exon e em T cruzi possui cerca de 110
nucleotiacutedeos (ZWIERZYNSKI amp BUCK 1991) A aceptora eacute o transcrito derivado da
unidade policistrocircnica ao qual o mini-exon eacute transferido O complexo enzimaacutetico
envolvido nesta reaccedilatildeo eacute semelhante ao descrito para a de cis-splicing (LAIRD
1989)
Os transcritos processados satildeo estabilizados pela estrutura cap 4 do mini-
exon (ULLU amp TSCHUDI 1991) e pela adiccedilatildeo de uma cauda poli-A agrave extremidade
3rsquo sendo que a adiccedilatildeo de ambos os elementos ocorrem em conjunto (LEBOWITZ et
al 1993) Regiotildees ricas em resiacuteduos de pirimidinas aleacutem da sequumlecircncia consenso
(AG) para o trans-splicing regulam a adiccedilatildeo do mini-exon e da cauda poli-A
Deleccedilotildees nestas regiotildees impedem o correto processamento destes transcritos
(MATTHEWS et al 1994)
A ocorrecircncia de transcriccedilatildeo policistrocircnica associada agrave ausecircncia de
promotores para RNA polimerase II e agrave presenccedila de niacuteveis distintos de mRNA
originados de uma mesma unidade policistrocircnica sugerem que a regulaccedilatildeo da
expressatildeo gecircnica nesses protozoaacuterios ocorra a niacutevel poacutes-transcricional baseada
principalmente em mecanismos que controlam a estabilidade e a traduccedilatildeo dos
mRNAs (CLAYTON 2002 BOUCHER et al 2002)
16 O cinetoplasto
O cinetoplasto eacute uma estrutura peculiar presente nos tripanosomatiacutedeos e
encontra-se inserida no interior da mitococircndria uacutenica abrigando fibrilas de DNA
conhecidas como kDNA O nome cinetoplasto (cineto=movimento e plasto=organela)
foi dado pois se acreditava que o mesmo fosse responsaacutevel pelo movimento do
flagelo
17 A rede de kDNA
O DNA do cinetoplasto eacute formado por dois tipos de moleacuteculas circulares os
miniciacuterculos de tamanho entre 05 e 25 kb e os maxiciacuterculos que apresentam
entre 20 e 40 kb Cerca de 10000 miniciacuterculos e 50 maxiciacuterculos se encontram
27
catenados formando uma extensa rede (SHAPIRO amp ENGLUND 1995 DE SOUZA amp
CAVALCANTI 2008) (FIGURA 4)
FIGURA 4 REDE DE kDNA
FONTE ROY CHOWDHURY et al 2010
As primeiras questotildees relacionadas ao arranjo das moleacuteculas na rede do
kDNA dos tripanosomatiacutedeos surgiram na deacutecada de 80 sugerindo que tal
organizaccedilatildeo poderia ter evoluiacutedo como um maneira mais eficaz de armazenar uma
grande quantidade de material em um pequeno espaccedilo (HAJDUK et al 1986)
Os maxiciacuterculos apresentam um tamanho de 22 a 37 kb e assim como o
DNA mitocondrial de outros eucariotos codificam RNAs ribossomais e diversas
proteiacutenas da cadeia respiratoacuteria incluindo subunidades da citocromo oxidase e
NADH desidrogenase (revisto por SHAPIRO amp ENGLUND 1995) Os transcritos dos
maxiciacuterculos satildeo processados poacutes-transcricionalmente para formar mRNAs
funcionais atraveacutes de um processo conhecido como ediccedilatildeo ou editoraccedilatildeo do RNA
A editoraccedilatildeo do RNA consiste na inserccedilatildeo ou retirada de resiacuteduos de uridina em
28
siacutetios especiacuteficos dos RNAs transcritos pelos maxiciacuterculos a fim de criar coacutedons de
iniciaccedilatildeo ou terminaccedilatildeo mudanccedilas na fase de leitura ou quadros abertos de leitura a
partir de sequumlecircncias sem sentido O processo de ediccedilatildeo eacute especificado por
pequenos RNAs guias produzidos pelos miniciacuterculos e maxiciacuterculos e catalisado
por um complexo muiltiproteacuteico o editosomo (revisto por Esteacutevez amp Simpson 1999
Stuart et al 2005) Esse processo constitui uma forma de regular poacutes-
transcricionalmente a expressatildeo de genes mitocondriais nas diferentes formas
evolutivas do parasita
Os miniciacuterculos caracterizam-se por apresentar um tamanho de 05 a 25 kb
e por transcrever os RNAs guia (gRNA) responsaacuteveis pela especificidade da ediccedilatildeo
dos mRNAs codificados pelos maxiciacuterculos por meio de uma sequumlecircncia presente na
porccedilatildeo central desses gRNAs (BENNE 1994 STUART et al 2005) A significacircncia
da variaccedilatildeo em tamanho e organizaccedilatildeo entre as espeacutecies ainda natildeo eacute aparente
contudo a diversidade das sequecircncias dos miniciacuterculos estaacute correlacionada com a
necessidade de mais ou menos ediccedilatildeo de mRNA de cada organismo (STUART
1991) Apesar desta diversidade os miniciacuterculos apresentam pelo menos duas
regiotildees conservadas o dodecacircmero GGGGTTGGTGTA conhecido como sequecircncia
universal dos miniciacuterculos (UMS) e o hexacircmero ACGCCC que correspondem agrave
origem de replicaccedilatildeo da fita L (light) e da fita H (heavy) respectivamente
(BIRKENMEYER amp RAY 1986 BIRKENMEYER et al 1987 RAY 1989 SHLOMAI
1994 HINES amp RAY 2008)
Embora o cinetoplasto de todos os tripanosomatiacutedeos seja formado por
moleacuteculas circulares relaxadas e catenadas diferentes arranjos da rede de kDNA
podem ser observados entre diferentes estaacutegios do ciclo de vida desses
protozoaacuterios como em T cruzi (FIGURA 5) assim como mudanccedilas na posiccedilatildeo do
kDNA satildeo utilizadas para identificar as diferentes formas evolutivas do parasita
(FIGURA 6)
29
FIGURA 5 ndash DIFERENTES ARRANJOS DO CINETOPLASTO DE T cruzi
LEGENDA As fibrilas de kDNA se apresentam bastante compactadas em forma de bastatildeo nas formas amastigotas (A) e epimastigotas (B) enquanto nas formas tripomastigotas a rede de kDNA torna-se menos compacta e a forma em bastatildeo do cinetoplasto daacute lugar a uma forma arredondada (C) FONTE DE SOUZA amp SOUTO-PADRON 1980 e DE SOUZA 1984
Nas formas amastigota (FIGURA 5A) e epimastigota (FIGURA 5B) de T
cruzi as fibrilas de kDNA se apresentam bastante compactadas em forma de
bastatildeo Em tripomastigotas (FIGURA 5C) de T cruzi a rede de kDNA torna-se
menos compacta e a forma em bastatildeo do cinetoplasto daacute lugar a uma forma
arredondada (DE SOUZA 1984) Os vaacuterios graus de compactaccedilatildeo do kDNA em
tripanosomatiacutedeos podem estar relacionados com a accedilatildeo de proteiacutenas que
condensam o DNA como seraacute visto mais adiante
FIGURA 6 MUDANCcedilAS NA POSICcedilAtildeO DO KDNA NOS TRYPANOSOMAS FONTE Modificado de DO CAMPO et al 2005
30
O cinetoplasto de todos os tripanosomatiacutedeos encontra-se localizado
proacuteximo ao corpo basal perpendicularmente ao eixo do flagelo Em alguns
tripanosomatiacutedeos que sofrem diferenciaccedilatildeo ao longo de seu ciclo de vida como o
T cruzi o cinetoplasto muda de posiccedilatildeo dentro da ceacutelula passando da regiatildeo
anterior (nos epimastigotas) para a regiatildeo posterior (nos tripomastigotas) poreacutem
permanecendo proacuteximo e perpendicular ao corpo basal (FIGURA 7) O cinetoplasto
eacute fisicamente conectado ao corpo basal atraveacutes de um grupo de filamentos
citoplasmaacuteticos chamado de complexo de ligaccedilatildeo tripartite (TAC) (OGBADOYI et al
2003) Este complexo eacute responsaacutevel pelo posicionamento espacial do cinetoplasto e
por sua segregaccedilatildeo
FIGURA 7 REPOSICIONAMENTO DO KDNA EM RELACcedilAtildeO AgraveS OUTRAS ORGANELAS DURANTE O CICLO DE VIDA DE UM FLAGELADO LEGENDA A morfologia eacute definida pelas posiccedilotildees do ponto onde emerge o flagelo e a bolsa flagelar (BF) (mostrada em laranja) nuacutecleo (mostrado em azul) e kDNA (mostrado em roxo) FONTE Modificado de FIELD amp CARRINGTON 2009
31
171 Replicaccedilatildeo do kDNA
Nos tripanosomatiacutedeos a replicaccedilatildeo do kDNA eacute restrita a fase S nuclear
(COSGROVE amp SKEEN 1970 WOODWARD amp GULL 1990) diferente do que
acontece na maioria dos eucariotos onde a replicaccedilatildeo do DNA mitocondrial ocorre
ao longo do ciclo celular (LIU et al 2005)
A replicaccedilatildeo dos miniciacuterculos se inicia quando estes satildeo individualmente
decatenados da rede de kDNA pela accedilatildeo de DNA topoisomerases do tipo II pois
estes natildeo se replicam enquanto estatildeo ligados agrave rede e termina quando os
miniciacuterculos retornam para a rede com a ajuda da mesma enzima (SHAPIRO amp
ENGLUND 1995)
Os miniciacuterculos satildeo liberados da rede em direccedilatildeo a zona cinetoflagelar
(KFZ) uma regiatildeo especializada da matriz mitocondrial entre o kDNA e o corpo
basal (FIGURA 8) que abriga proteiacutenas envolvidas com o iniacutecio da replicaccedilatildeo Em
seguida os ciacuterculos migram (ou satildeo transportados) para os poacutelos opostos da rede
de kDNA para completar sua replicaccedilatildeo O iniacutecio da replicaccedilatildeo dos miniciacuterculos na
regiatildeo cinetoflagelar envolve a montagem de um complexo proteacuteico na origem de
replicaccedilatildeo dos ciacuterculos com a participaccedilatildeo da primase polimerase e proteiacutenas que
se ligam agrave sequumlecircncia universal de miniciacuterculos (UMSBP) Estas juntamente com
outras proteiacutenas geram uma forquilha de replicaccedilatildeo que se propaga
unidirecionalmente ao redor do miniciacuterculo formando uma estrutura tipo
intermediaacuteria (LIU et al 2005 GLUENZ et al 2007)
Os miniciacuterculos receacutem-replicados migram da zona KFZ para dois complexos
proteacuteicos situados nos poacutelos diametralmente opostos do cinetoplasto onde os
proacuteximos passos de replicaccedilatildeo iratildeo ocorrer Estes passos incluem remoccedilatildeo dos
primers pela accedilatildeo de endonucleases preenchimento de alguns intervalos entre os
fragmentos de Okazaki pela DNA polimerase e uniatildeo dos cortes (nicks) por uma
DNA ligase Apoacutes estas etapas os novos ciacuterculos sintetizados que ainda possuem
pelo menos uma interrupccedilatildeo em sua sequumlecircncia satildeo reunidos agrave periferia da rede
pela accedilatildeo de topoisomerases II Apoacutes todos miniciacuterculos terem sido replicados os
intervalos satildeo reparados (Revisto por LIU et al 2005 POVELONES 2014)
Pouco se sabe sobre o processo de replicaccedilatildeo dos maxiciacuterculos Assim
como os miniciacuterculos os maxiciacuterculos tambeacutem sofrem replicaccedilatildeo unidirecional que
32
se inicia em uma origem contida na regiatildeo variaacutevel da moleacutecula formando estruturas
tipo- Entretanto ao contraacuterio dos miniciacuterculos eles permanecem ligados agrave rede de
kDNA durante o processo replicativo (revisto por KLINGBEIL et al 2001 Liu et al
2005)
FIGURA 8 REPLICACcedilAtildeO DO kDNA FONTE Modificado de LIU et al 2005
18 Proteiacutenas associadas ao cinetoplasto (KAPs)
Proteiacutenas que se ligam ao DNA tambeacutem foram identificadas na mitococircndria
de uma variedade de organismos eucarioacuteticos variando de levedura ateacute humanos
(MAIER et al 2001) Estas proteiacutenas satildeo codificadas no nuacutecleo da ceacutelula e satildeo poacutes-
traducionalmente importadas para a mitococircndria
Conceitualmente qualquer proteiacutena que se associe ao kDNA quer atuando
na replicaccedilatildeo e transcriccedilatildeo quer atuando na organizaccedilatildeo compactaccedilatildeo e
segregaccedilatildeo da rede pode ser chamada de KAP (KAP do inglecircs Kinetoplast-
33
Associated Protein) Observou-se que algumas dessas KAPs apresentam
caracteriacutesticas de proteiacutenas histonas H1 (H1 histone-like proteins) por serem
proteiacutenas pequenas (17 a 25 kDa) fortemente baacutesicas (pI de 11 a 125) interagindo
com a carga negativa das moleacuteculas de DNA e com grande conteuacutedo dos
aminoaacutecidos lisina e arginina elevado (aprox 30 a 50)
Proteiacutenas associadas com genoma mitochondrial (KAPs) dos
tripanosomatiacutedeos e que compartilham caracteriacutesticas com histonas H1 foram
inicialmente identificadas no cinetoplasto do tripanosomatiacutedeo de inseto Crithidia
fasciculata e denominadas de KAP1 a 5 As H1-KAPs de C fasciculata interagem
com miniciacuterculos (XU et al 1996) e desse modo podem facilitar a associaccedilatildeo
orientaccedilatildeo e organizaccedilatildeo dessas moleacuteculas na rede pela neutralizaccedilatildeo das cargas
negativas das moleacuteculas de DNA contribuindo para a condensaccedilatildeo organizaccedilatildeo e
segregaccedilatildeo da rede de kDNA Ateacute o momento foram caracterizadas quatro H1-KAPs
de C fasciculata (CfKAP1 2 3 and 4) Aleacutem das caracteriacutesticas de histona H1
possuem uma preacute-sequecircncia clivaacutevel de nove aminoaacutecidos em sua porccedilatildeo N-
terminal e que provavelmente estaacute envolvida no transporte da proteiacutena para o
cinetoplasto jaacute que natildeo aparece na proteiacutena madura (XU amp RAY 1993 XU et al
1996 HINES amp RAY 1998) Atraveacutes de ensaios de imunofluorescecircncia foi possiacutevel
confirmar que estas proteiacutenas estatildeo presentes em toda a rede de kDNA Pela
facilidade encontrada nas KAPs purificadas de condensar redes de kDNA in vitro
(XU et al 1996) sugere-se que estas estejam envolvidas na organizaccedilatildeo e
condensaccedilatildeo do kDNA in vivo (LUKES et al 2001)
As teacutecnicas de deleccedilatildeo de genes satildeo uma oacutetima ferramenta para elucidar as
possiacuteveis funccedilotildees que um gene pode apresentar Em C fasciculata foi utilizada a
teacutecnica de nocaute gecircnico para o gene Cfkap1 onde mutantes viaacuteveis foram
obtidos mostrando que a forma e a dimensatildeo do cinetoplasto natildeo foram alterados
ao contraacuterio da organizaccedilatildeo da rede de kDNA que passou a apresentar fibrilas de
DNA espessas e uma camada eleacutetron-densa no centro do disco Quando foi
realizada a reintroduccedilatildeo do gene na forma episomal o fenoacutetipo normal da rede de
kDNA foi restaurado (LUKES et al 2001) Tambeacutem foi realizado o duplo nocaute
dos genes Cfkap2 e Cfkap3 o qual da mesma maneira produziu mutantes viaacuteveis
poreacutem com o crescimento bastante reduzido uma reduccedilatildeo na respiraccedilatildeo e um
aumento nos niacuteveis de mRNAs codificados pelos maxiciacuterculos Apesar de todas
estas alteraccedilotildees o kDNA permaneceu inalterado mostrando que as proteiacutenas
34
CfKAP2 e CfKAP3 desempenham um papel diferente ao da CfKAP1 pois estatildeo
envolvidas com o metabolismo mitocondrial e proliferaccedilatildeo celular ao inveacutes de
estarem envolvidas na organizaccedilatildeo estrutural do kDNA (AVLIYAKULOV et al
2004)
Com base nesses estudos surgiu o interesse de nosso grupo no estudo de
KAPs em T cruzi visando verificar qual o papel dessas proteiacutenas na organizaccedilatildeo da
rede de kDNA e sua importacircncia nos diferentes estaacutegios do ciclo de vida do parasita
Atraveacutes de anaacutelises bioinformaacuteticas foram identificadas 6 diferentes H1-KAPs
codificadas no genoma do T cruzi levando em consideraccedilatildeo a similaridade com
KAPs de C fasciculata (CAVALCANTI et al 2009) Essas H1-KAPs foram
denominadas de KAP3 KAP4a KAP4b KAP4c KAP6 e KAP7 Nosso grupo iniciou
a caracterizaccedilatildeo das proteiacutenas TcKAP4 e TcKAP6 mostrando que elas se localizam
no cinetoplasto mas com padrotildees distintos de distribuiccedilatildeo dependendo da forma do
ciclo de vida do parasita (CAVALCANTI et al 2009) Mais recentemente mostramos
que o nocaute da TcKAP3 natildeo afeta a proliferaccedilatildeo diferenciaccedilatildeo e infectividade do
parasita (DE SOUZA et al 2010)
A complexidade da rede de kDNA sugere portanto que as diferentes KAPs
atuem em conjunto algumas vezes de modo redundante para desempenhar
funccedilotildees na condensaccedilatildeo replicaccedilatildeo segregaccedilatildeo dessa estrutura
35
2 OBJETIVOS
21 OBJETIVO GERAL
O objetivo principal deste trabalho eacute caracterizar a funccedilatildeo da TcKAP7 avaliando seu
papel na biologia do parasita
211 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS
a) Analisar a localizaccedilatildeo subcelular da TcKAP7 atraveacutes de ensaios de
imunofluorescecircncia
b) Produzir TcKAP7 recombinante em larga escala para ensaios de biologia
estrutural
c) Estudar a viabilidade do parasita na ausecircncia do gene TcKAP7 para os parasitas
viaacuteveis analisar morfologia e ultraestrutura do cinetoplasto multiplicaccedilatildeo
diferenciaccedilatildeo e infectividade
36
3 MATERIAIS E MEacuteTODOS
31 Reagentes e Soluccedilotildees Utilizados
311 Reagentes
AmershamBioscience dNTPs Hybond C Hybond N kit ECL de western blotting
filmes de raio-X Hyperfilmreg anticorpo monoclonal anti-Histidina
Bio-Rad Acrilamida Agarose (UltraPure DNA grade) Azul de Bromofenol Bis-
Acrilamida Persulfato de Amocircnia
Cult-lab RPMI 1640
Difco Baacutecto-Aacutegar Bactotriptona Extrato de levedura Infuso de fiacutegado Triptose
Invitrogen Inc EDTA Fenol TRIS Nick Translation kit Taq DNA polymerase
IPTG Agarose X-Gal DNA de λHindIII Marcador de massa molecular Benchmark
Alexa Fluacuteor 458 1 kb Plus DNA Ladder Soro Fetal Bovino T4 DNA ligase
Merck Acetato de Soacutedio Aacutecido Aceacutetico Glacial Cloreto de CaacutelcioCloreto de
Potaacutessio Cloreto de Soacutedio Etanol Absoluto Glicina Glicose Hidroacutexido de soacutedio
Isopropanol HCl Na2HPO4
New England Biolabs Endonucleases de restriccedilatildeo
Qiagen Qiaquick PCR Purification kit
Serva Electrophoresis Alu-Gel S
Sigma Acetato de amocircnia Ampicilina Brometo de Etiacutedeo BSA Kanamicina
Glicerol Hepes Cloreto de Magneacutesio Tetraciclina β-mercaptoetanol DEAE-
celulose Tween 20 adjuvante completo de Freund monoclonal M2 anti-FLAG
312 Tampotildees e Soluccedilotildees
PBS NaCl 137 mM KCl 27 mM Na2HPO4 43 mM e KH2PO4 15 mM
PSG Na2HPO4 (anidro) 4747 mM NaH2PO4 H2O 25 mM NaCl 3676 mM e
glicose 555 mM
Soluccedilatildeo de tripsinazaccedilatildeo tripsina 005 (mv) e EDTA 002 (mv) em PBS pH
80
37
Soluccedilatildeo de bloqueio para imunofluorescecircncia PBS e BSA 1 (albumina seacuterica
bovina)
Soluccedilatildeo de bloqueio para western blot TBST e leite em poacute desnatado 5
Soluccedilatildeo de lise para Toothpick NaOH 50 mM Glicerol 5 SDS 05 EDTA 5
mM e azul de bromofenol 0025
Soluccedilatildeo Ponceau S Ponceau S 05 em aacutecido aceacutetico 1
Soluccedilatildeo de coloraccedilatildeo para geacuteis de proteiacutena Coomassie blue R-250 01 em
metanolaacutecido aceacutetico (4510)
Soluccedilatildeo para descoloraccedilatildeo de geacuteis de proteiacutena Metanol 4 aacutecido aceacutetico 75
Tampatildeo de lise hipotocircnico Tris-HCl 10mM pH 75 NaCl 10mM MgCl2 5 mM β-
mercaptoetanol 5 mM
Tampatildeo A para cromatografia de afinidade Tris-HCl 20 mM pH 75 NaCl 500 mM
Tampatildeo B para cromatografia de afinidade Tampatildeo A contendo imidazol 1M
Tampatildeo B para cromatografia de troca iocircnica Tris-HCl 50 mM pH 80 NaCl 1M
Soluccedilatildeo de depurinaccedilatildeo para Southern blot HCl 025 M
Soluccedilatildeo desnaturante para Southern blot NaOH 05 M e NaCl 15 M
Soluccedilatildeo neutralizante para Southern blot Tris-HCl 05 M pH 75 e NaCl 15 M
Soluccedilatildeo Denhardt (50X) ficoll 05 polivinilpirrolidona 06 e albumina de soro
bovino 02
Soluccedilatildeo de hibridaccedilatildeo para Southern blot DNA de esperma de salmatildeo do tipo III
01 mgml fragmentado por ultra-som e desnaturado SSC 6X soluccedilatildeo de denhardt
6X e SDS 1
SSC 20X NaCl 3 M pH 70 e citrato de soacutedio 03 M
Soluccedilatildeo de baixa estringecircncia SSC 2X e SDS 01
Soluccedilatildeo de meacutedia estringecircncia SSC 1X e SDS 01
Soluccedilatildeo de alta estringecircncia SSC 01X e SDS 01
Tampatildeo de eletroporaccedilatildeo para T cruzi NaCl 140 mM HEPES (aacutecido) 25 mM e
Na2HPO4 074 mM pH 75
Tampatildeo ZPFM de eletroporaccedilatildeo de T brucei NaCl 129 mM KH2PO4 15mM KCl
8mM NaH2PO4 8mM MgCl2 15mM CaCl2 90 mM e CH3COONa 24 mM pH 70
Tampatildeo TELT Tris-HCl 50 mM pH 80 EDTA 625 mM pH 90 LiCl 25 M e Triton
X-100 4
Tampatildeo de amostra para DNA 10X Ficoll 400 25 azul de bromofenol 025 e
xileno cianol FF 025
38
Tampatildeo de amostra para proteiacutena 4X Tris-HCl 40 mM pH 68 SDS 1 β-
mercaptoetanol 25 glicerol 6 e azul de bromofenol 0005
Tampatildeo de eletroforese para SDS-PAGE 1X Tris-base 25 mM glicina 192 mM e
SDS 01
Tampatildeo de lise de bacteacuterias Tris-HCl 20 mM pH 75 NaCl 500 mM PMSF1 mM
Tampatildeo para transferecircncia (western blotting) 1X Tris-base 25 mM glicina 192
mM e metanol 20
Tampatildeo TBE Tris base 89 mM aacutecido boacuterico 89 mM e EDTA 2 mM
TBS Tris-HCl 20 mM pH 80 e NaCl 150 mM
TBST TBS e Tween 20 01
TE Tris-HCl 10 mM pH 80 e EDTA 1 mM
313 Meios de cultura
LB Triptona 1 extrato de levedura 5 e NaCl 1
Meio LIT (liver infusion tryptose) infuso de fiacutegado 05 NaCl 753 mM KCl 54
mM glicose 10 mM bacto-triptose 05 Na2HPO4 564 mM hemina 00025 soro
fetal bovino 10 e extrato de levedura 15 gl
Meio TAU NaCl 190 mM KCl 17 mM MgCl2 2 mM CaCl2 2 mM e tampatildeo fosfato 8
mM pH 60
Meio TAU3AAG meio TAU suplementado com L-prolina 10 mM glutamato soacutedico
50 mM aspartato soacutedico 2 mM e glicose 10 mM
32 Cultivo do Trypanosoma cruzi
Neste trabalho foi utilizado o clone Dm28c de T cruzi (CONTRERAS et al
1985 CONTRERAS et al 1988) nas formas epimastigota e tripomastigota
metaciacuteclico
321 Epimastigotas
Formas epimastigotas de T cruzi foram cultivadas em meio LIT (CAMARGO
1964) a 28 oC com passagens a cada trecircs dias e inoacuteculo de 1 x 106 ceacutelulasml As
formas epimastigotas foram coletadas por centrifugaccedilatildeo no terceiro dia de cultivo
39
(correspondente a fase logariacutetmica de crescimento baseada em curva de
crescimento realizada nas mesmas condiccedilotildees) quando a densidade celular
apresentava-se entre de 1 - 3 x 107 ceacutelulasml
322 Tripomastigotas metaciacuteclicos
As formas metaciacuteclicas foram obtidas atraveacutes do processo de diferenciaccedilatildeo
in vitro (BONALDO et al 1988) Formas epimastigotas em final de fase logariacutetmica
de crescimento (densidade celular entre 5 - 7 x 107 ceacutelulasml) foram coletadas por
centrifugaccedilatildeo a 7000 x g por 5 minutos a 10 oC e ressuspendidas em meio TAU
na concentraccedilatildeo de 5 x 108 ceacutelulasml e mantidas a 28 oC por 2 horas Apoacutes este
periacuteodo correspondente ao estresse nutricional as ceacutelulas foram transferidas para
garrafas de 300 cm2 contendo 200 ml de meio TAU3AAG (concentraccedilatildeo final de 5 x
106 ceacutelulasml) Uma proporccedilatildeo dos parasitas que se aderiram agrave superfiacutecie da
garrafa de cultivo se diferenciou em metaciacuteclicos os quais foram liberados no
sobrenadante (BONALDO et al 1988) Estas formas foram purificadas pela
passagem atraveacutes de uma coluna de afinidade contendo a resina DEAE celulose
equilibrada em PSG (SOUSA 1983) Este procedimento foi realizado com o tipo
selvagem para obtenccedilatildeo de extrato proteacuteico e tambeacutem com o mutante de T cruzi
para TcKAP7 para verificaccedilatildeo da capacidade de diferenciaccedilatildeo e infectividade onde
o nuacutemero de metaciacuteclicos no sobrenadante foi contado apoacutes 24 48 72 e 96 horas
da incubaccedilatildeo em meio TAU3AAG
33 Curva de crescimento de T cruzi
Formas epimastigotas de T cruzi clone Dm28c e do mutante de T cruzi para
TcKAP7 foram cultivadas como descrito no item 321 ateacute atingirem a fase
estacionaacuteria para a comparaccedilatildeo da taxa de crescimento de ambas Foram
inoculadas 1 x 106 epimastigotas por ml de meio LIT em garrafas de 25 cm2 e
incubadas em seguida a 28 degC Diariamente foi realizada a contagem das culturas
em cacircmaras de Neubauer em diluiccedilotildees apropriadas ateacute o deacutecimo dia O graacutefico da
curva de crescimento comparativa entre a cultura selvagem e a nocaute foi feito
utilizando o programa Microsoft Excel
40
34 Obtenccedilatildeo de DNA de T cruzi
A extraccedilatildeo de DNA foi realizada conforme descrito por Medina-Acosta amp
Cross (1993) Epimastigotas (1 x 107 ceacutelulas) foram coletadas por centrifugaccedilatildeo a
7000 x g por 5 min lavadas em PBS e ressuspendidas em 350 microl de tampatildeo TELT
Apoacutes 5 min de incubaccedilatildeo agrave temperatura ambiente foi adicionado agrave amostra 1
volume de fenolclorofoacutermio e o material foi centrifugado a 13000 x g por 5 min A
fase aquosa foi recolhida e o DNA foi precipitado com 2 volumes de etanol absoluto
e coletado por centrifugaccedilatildeo a 13000 x g por 10 min O DNA presente no sedimento
foi lavado com etanol 70 seco e em seguida ressuspendido em tampatildeo TE
contendo RNAse a 20 microgml
35 Obtenccedilatildeo de kDNA de T cruzi
A extraccedilatildeo do kDNA de T cruzi foi realizada de acordo com Morel e
colaboradores (1980) com modificaccedilotildees
Formas epimastigotas (1 x109 ceacutelulas) foram coletadas por centrifugaccedilatildeo a
4000 x g por 10 min lavadas em PBS e ressuspendidas em 20 ml de Tampatildeo de
Lise Hipotocircnico Posteriormente adicionou-se Sacarose 025 M e o material foi
centrifugado 6000 x g por 10 min O pellet foi ressuspendido em 20 ml de Tris-HCl
10 mM pH 75 NaCl 10 Mm EDTA 5 mM SDS 05 A esta soluccedilatildeo foi adicionado
100 ug de proteinase K e a mesma permaneceu a 37 ordmC durante a noite No dia
seguinte as ceacutelulas foram transferidas para uma seringa de 50 ml aonde ocorreu a
quebra mecacircnica do DNA nuclear Este material foi ultracentrifugado a 27000 rpm a
4ordm C durante 1 hora utilizando o rotor SW28 Apoacutes centrifugaccedilatildeo o sobrenadante foi
desprezado e o pellet ressuspendido em 25 ml de TE e novamente ultracentrifugado
nas mesmas condiccedilotildees Apoacutes centrifugaccedilatildeo o pellet foi ressuspendido em 1ml de TE
e foi realizada a purificaccedilatildeo por fenolclorofoacutermio Apoacutes purificaccedilatildeo o material foi
ressuspendido em 300 ul de TE e utilizado para ensaios de SAXS
36 Obtenccedilatildeo de extrato proteico de T cruzi
41
As ceacutelulas foram coletadas por centrifugaccedilatildeo (4000 x g 5 min a 10 degC) e
lavadas duas vezes em PBS pH 75 Apoacutes as lavagens os parasitas foram
ressuspendidos em PBS e tampatildeo de amostra 4x foi adicionado de tal maneira que
a concentraccedilatildeo final fosse de 1 x 106 ceacutelulas equivalentesmicrol Os extratos foram
fervidos por 5 min e armazenados a - 70 degC
37 Clonagem do gene TcKAP7
A sequecircncia do gene TcKAP7 (ID Tc00104705350871950) foi obtida a
partir do banco de dados do genoma do T cruzi disponiacutevel no portal da internet
wwwgenedborg e a sua regiatildeo codificante foi amplificada por PCR com os primers
KAP7F (5rsquo ndash AAAGGATCCATGCTAAGAACTGTTCTGCCACTG 3rsquo) e KAP7R (5rsquo ndash
TCAGCGTCGACTTATGACGGTGGTGCAGGATCAGCAGCTGCAGTATTTT3rsquo) a
partir do DNA genocircmico de T cruzi Dm28c As sequecircncias de reconhecimento das
enzimas de restriccedilatildeo BamHI e SalI (marcadas em negrito) foram adicionadas na
extremidade 5rsquo dos primers KAP7F e KAP7R respectivamente As condiccedilotildees da
reaccedilatildeo de PCR foram as seguintes 100 ng de DNA total T cruzi 10 pmol de cada
primer 200 μM de cada dNTP MgCl2 15 mM tampatildeo Taq DNA polimerase 1x 25
U de Taq DNA polimerase (Invitrogen) A reaccedilatildeo de PCR foi processada no
termociclador modelo 9700 (Applied Biosystems EUA) com a desnaturaccedilatildeo do
material por 4 min a 94 degC seguida de 30 ciclos constando de desnaturaccedilatildeo a 94 degC
por 30 s hibridizaccedilatildeo dos primers a 58 degC por 30 s e extensatildeo a 72 degC por 1 min O
material amplificado foi purificado usando o kit Qiaquick PCR Purification (Qiagen) e
digerido com as enzimas de restriccedilatildeo BamHI e SalI com uso de 20 U de cada
enzima e seus respectivos tampotildees em volume final de 20 μl por 4 h a 37 oC O
material foi novamente purificado e utilizado para ligaccedilatildeo com o vetor pET28a
previamente digerido com as respectivas enzimas Bacteacuterias E coli cepa DH5α
foram transformadas com a ligaccedilatildeo A seleccedilatildeo dos clones contendo plasmiacutedeo com
o inserto desejado foi realizada atraveacutes da teacutecnica de palitagem ou de PCR de
colocircnia
38 Obtenccedilatildeo do cDNA de TcKAP7 atraveacutes de ensaio de RT-PCR
42
Com o intuito de verificar a posiccedilatildeo do mini-exon no transcrito de TcKAP7
realizamos o ensaio de RT-PCR para a obtenccedilatildeo do cDNA de TcKAP7
O protocolo utilizado foi baseado no manual teacutecnico da Promega (ΙmProm-ΙΙ
Reverse Transcription System) assim como os reagentes utilizados para essa
reaccedilatildeo Aproximadamente 10 μg de RNA foram incubados com o oligonucleotiacutedeo
KAP7R por 10 min a 70 degC e imediatamente transferidos para o gelo Agrave mistura foi
adicionada uma soluccedilatildeo de dNTPs (concentraccedilatildeo final de 05 mM para cada dNTP)
MgCl2 (120 μM) RNAse OUT (2 unidades) (Invitrogen) Transcriptase reversa
ImProm-II e respectivo tampatildeo A reaccedilatildeo foi incubada por 2 h a 42 degC As amostras
de cDNA foram purificadas por Microcon YM-30 (Millipore) conforme descriccedilatildeo do
fabricante e armazenadas a -20 degC Posteriormente foi realizada uma reaccedilatildeo de
PCR utilizando as seguintes condiccedilotildees 10 ng do cDNA de TcKAP7 de T cruzi 10
pmol do primer ME (5rsquo-AACGCTATTATTGATACAGTTTCTGTACTATATTG -3rsquo) e 10
pmol do primer KAP7R 200 μM de cada dNTP MgCl2 15 mM tampatildeo Taq DNA
polimerase 1x 25 U de Taq DNA polimerase (Invitrogen) A reaccedilatildeo de PCR foi
processada no termociclador modelo 9700 (Applied Biosystems EUA) com a
desnaturaccedilatildeo do material por 3 min a 94 degC seguida de 35 ciclos constando de
desnaturaccedilatildeo a 94 degC por 30 s hibridizaccedilatildeo dos primers a 55 degC por 30 s e extensatildeo
a 72 degC por 1 min O material amplificado foi purificado usando o kit Qiaquick PCR
Purification (Qiagen) e clonado diretamente no vetor pGEMreg-T Easy (Promega)
Bacteacuterias E coli cepa TOP10Frsquo foram transformadas com a ligaccedilatildeo e os plasmiacutedeos
recombinantes foram selecionados pela teacutecnica da palitagem ou de PCR de colocircnia
(itens 391 e 392) Apoacutes a minipreparaccedilatildeo (item 310) o material foi submetido ao
sequenciamento de DNA usando o serviccedilo de sequenciamento da empresa
Macrogen (Coreacuteia do Sul)
39 Seleccedilatildeo dos clones recombinantes
391 Teacutecnica de palitagem (toothpick)
As colocircnias foram coletadas com o auxiacutelio de palitos de dente (toothpick)
esteacutereis e transferidas para o fundo de tubos de micro-centriacutefuga e para a superfiacutecie
do meio LB solidificado (com o antibioacutetico de seleccedilatildeo do plasmiacutedeo) para a obtenccedilatildeo
de uma reacuteplica das colocircnias que foram analisadas (placa-matildee) A cada um dos
43
tubos foram acrescentados 15 μl do tampatildeo de lise Os tubos foram incubados em
banho-maria a 65 degC por 10 min As amostras entatildeo foram analisadas por
eletroforese em gel de agarose 1 usando o plasmiacutedeo sem inserto como controle
Posteriormente o gel foi corado com brometo de etiacutedeo (05 μgml) por
aproximadamente 20 min lavado com aacutegua e analisado sob luz ultravioleta para em
seguida ser fotografado no sistema de fotodocumentaccedilatildeo L-Pix (Locus
Biotecnologia Brasil)
392 Teacutecnica de PCR de colocircnia
Depois de selecionadas as colocircnias foram transferidas para tubos de PCR
contendo os reagentes da PCR e os primers que hibridizam com regiotildees que
flanqueiam o fragmento de DNA clonado em um volume total de 10 microl As amostras
foram incubadas a 94 degC por 3 min e submetidas a 35 ciclos de PCR com as
seguintes etapas 94 degC por 30 s 55 degC por 30 s e 72 degC por 1 min finalizando com
uma etapa de extensatildeo a 72 degC por 10 min Os produtos amplificados foram
analisados em gel de agarose 1 Posteriormente o gel foi corado com brometo de
etiacutedeo (05 microgml) por aproximadamente 20 min lavado com aacutegua e analisado sob
luz ultravioleta O gel foi fotografado no sistema de foto-documentaccedilatildeo L-Pix (Locus
Biotecnologia Brasil)
310 Preparaccedilatildeo de plasmiacutedeo em pequena escala (miniprep)
Os clones recombinantes foram cultivados em 3 ml de meio LB contendo o
antibioacutetico apropriado durante 18 h As culturas foram entatildeo centrifugadas a 12000
x g por 1min a temperatura ambiente e os plasmiacutedeos recombinantes purificados
com o sistema de minipreparaccedilatildeo de plasmiacutedeo (Miniprep Qiagen Kit) (QIAGEN) de
acordo com as recomendaccedilotildees do fabricante
311 Expressatildeo da proteiacutena TcKAP7 em E coli
Para expressar a proteiacutena recombinante TcKAP7 E coli cepa
BL21(DE3)STAR transformada com o plasmiacutedeo pET28a contendo o gene TcKPA7
(pET28a-TcKAP7) foi cultivada em meio LB contendo 25 μgml do antibioacutetico
44
kanamicina a 37 ordmC sob agitaccedilatildeo (preacute-inoacuteculo) Apoacutes 18 horas de crescimento uma
diluiccedilatildeo (110) foi realizada em novos tubos contendo meio LB-kanamicina e a
cultura foi incubada por 1 h a 37 ordmC sob agitaccedilatildeo constante Apoacutes este periacuteodo 05
mM IPTG (isopropil-1-tio-β-D-galactopiranosideo) foi adicionado agraves culturas A
incubaccedilatildeo prosseguiu por mais 3 h nas mesmas condiccedilotildees Como controle negativo
as ceacutelulas tambeacutem foram cultivadas nas mesmas condiccedilotildees poreacutem sem a adiccedilatildeo de
IPTG (cultura natildeo induzida) Aliacutequotas das culturas induzidas e natildeo induzidas com
IPTG foram processadas para anaacutelise em SDS-PAGE
312 Purificaccedilatildeo da proteiacutena recombinante TcKAP7
3121 Processamento da amostra
As bacteacuterias apoacutes a expressatildeo de TcKAP7 foram sedimentadas por
centrifugaccedilatildeo e ressuspendidas em tampatildeo de lise e lisadas utilizando o
microfluidificador modelo M-110L (Microfluidics EUA) Este meacutetodo divide a amostra
em dois fluxos e os conduz sob alta pressatildeo gerada por uma vaacutelvula pneumaacutetica
para uma cacircmara de interaccedilatildeo tambeacutem chamada de aacuterea de choque Esta cacircmara
eacute formada por um sistema de micro-canais dentro de um bloco de ceracircmica Dentro
da cacircmara ocorre cavitaccedilatildeo sonicaccedilatildeo e impacto dos dois fluxos em que a amostra
foi dividida levando a lise das ceacutelulas bacterianas (FIGURA 9) Este processo
provoca o aumento da temperatura e todo o sistema de tubos que conduz a amostra
necessita ser refrigerado com gelo e aacutegua a 4degC para prevenir a precipitaccedilatildeo de
proteiacutenas soluacuteveis
45
FIGURA 9 - REPRESENTACcedilAtildeO ESQUEMAacuteTICA DO MICROFLUIDIFICADOR LEGENDA A suspensatildeo de bacteacuterias eacute dividida em dois fluxos que se chocam sob alta pressatildeo dentro de micro-canais presentes na cacircmara de interaccedilatildeo da vaacutelvula homogeneizadora Melhores resultados satildeo obtidos aumentando o nuacutemero de ciclos de passagens Seta preenchida direccedilatildeo da amostra Seta pontilhada repetindo o ciclo de passagem FONTE Modificado de MAA amp HSU 1999
Apoacutes a lise o extrato soluacutevel foi obtido apoacutes centrifugaccedilatildeo a 30000 x g por
30 min a 4 degC
3122 Cromatografia de afinidade
Por ser expressa fusionada a uma cauda de seis histidinas a proteiacutena
TcKAP7 pode ser separada dos extratos celulares a partir da utilizaccedilatildeo de resina de
niacutequel da qual posteriormente a proteiacutena seraacute eluiacuteda
A purificaccedilatildeo da proteiacutena TcKPA7 presente no sobrenadante foi realizada
em sistema FPLC (Fast Performance Liquid Chromatography ndash GE Healthcare) com
coluna HiTrap Chelating de 1 mL (GE Healthcare) A coluna foi carregada com
soluccedilatildeo NiSO4 100 mM e equilibrada com tampatildeo A para cromatografia de afinidade
Durante a purificaccedilatildeo foi utilizado um gradiente de 0-100 de tampatildeo B para
cromatografia de afinidade As fraccedilotildees provenientes da cromatografia foram
analisadas atraveacutes de SDS-PAGE
Suspensatildeo de bacteacuterias
Ceacutelulas lisadasBomba de
alta pressatildeo
Micro-canais
Vaacutelvula homogeneizadora
46
3123 Cromatografia de troca iocircnica
Para eliminar contaminantes remanescentes da cromatografia de afinidade
a amostra contendo a proteiacutena de interesse foi submetida a uma segunda etapa
cromatograacutefica cromatografia de troca iocircnica utilizando-se a coluna HiTraptrade SP (GE
Healthcare) no sistema de FPLC (GE Healthcare)
Primeiramente a amostra foi diluiacuteda para reduccedilatildeo da concentraccedilatildeo salina e
a coluna foi lavada com 2 volumes de tampatildeo B para cromatografia de troca iocircnica e
depois com 2 volumes de tampatildeo A utilizado na cromatografia de afinidade O
gradiente de passagem do tampatildeo B foi de 0 a 100 e a proteiacutena TcKAP7 foi
obtida na fraccedilatildeo de material natildeo ligado agrave resina (Flow-through) (FT)
3124 Cromatografia de gel filtraccedilatildeo
Amostras da cromatografia de troca iocircnica que continham a proteiacutena de
interesse foram concentradas atraveacutes de filtraccedilatildeo A soluccedilatildeo foi colocada em filtro
Amicon Ultra MWCO 10000 (Milipore) e centrifugada a 4000 rpm a 4 ordmC O
experimento foi realizado em sistema FPLC (GE Healthcare) com a coluna
Superdex 200 HR 1030 (GE Healthcare) em tampatildeo HEPES 20 mM pH 74 e de
cloreto de soacutedio100 mM
313 Espalhamento Dinacircmico de Luz ndash DLS
O experimento foi realizado em equipamento DynaPro Molecular instrument
a 4 ordmC As amostras foram previamente centrifugadas por 5 minutos a 15000 rpm a
4 ordmC A coleta de dados foi realizada com intervalos de 2 segundos com 100
aquisiccedilotildees Para cada leitura utilizou-se 5 microl de amostra proteica
314 Espectroscopia de dicroiacutesmo circular (CD)
O espectro de CD foi coletado usando espectropolariacutemetro Jasco J-715
(Jasco Corporation Toacutekio Japatildeo) sendo a temperatura mantida a 20 degC atraveacutes de
um Peltie rType Control System PFD425S (JASCO) Todos os dados foram
coletados usando cubeta de quartzo de 1 mm de caminho oacuteptico
47
Mediu-se a elipticidade em graus na regiatildeo do UV distante no intervalo de
comprimento de onda de 260 nm a 200 nm com uma velocidade de 100 nmmin
sendo feitas no total 30 leituras com resposta de 1 segundo em varredura contiacutenua
Os valores obtidos em miligraus foram convertidos para elipticidade molar
por resiacuteduo ([θ]MRW) em miligrauscm2dmol-1 que eacute definida pela equaccedilatildeo (Adler et
al 1973)
Onde θobs eacute a elipsidade observada em graus MRW eacute o peso molecular
meacutedio dos resiacuteduos da proteiacutena d eacute o caminho oacuteptico da cubeta em centiacutemetros e c
eacute a concentraccedilatildeo da proteiacutena em mgmL O MRW eacute calculado dividindo-se o peso
molecular da proteiacutena pelo nuacutemero de resiacuteduos
315 Quantificaccedilatildeo e concentraccedilatildeo
As amostras obtidas a partir da purificaccedilatildeo tiveram a concentraccedilatildeo calculada
utillizando a absorbacircncia mensurada pelo aparelho NanoDrop (Thermo Fisher
Scientific) levando-se em consideraccedilatildeo o coeficiente de extinccedilatildeo e teoacuterico da
proteiacutena obtido a partir do ProtParam (httpusexpasyorgtoolsprotparamhtml) e o
peso molecular da proteiacutena que eacute de cerca de 28 kDa
Obtidas as concentraccedilotildees a amostra foi concentrada pelo meacutetodo de
filtraccedilatildeo utilizando o filtro Amiconreg Ultra Centrifugal Filter (Millipore) com poro de
10000 Da A amostra foi centrifugada ateacute a obtenccedilatildeo de uma concentraccedilatildeo final de
5 mgml para os ensaios de cristalizaccedilatildeo Uma aliacutequota da proteiacutena concentrada foi
utilizada para anaacutelise por SDS-PAGE
316 Ensaios de Cristalizaccedilatildeo
Os ensaios de cristalizaccedilatildeo foram realizados empregando-se a teacutecnica de
difusatildeo de vapor em gota sentada utilizando-se os equipamentos disponiacuteveis no
Laboratoacuterio Robotizado de Cristalizaccedilatildeo de Proteiacutenas LNBio Os ensaios foram
feitos em placas de 96 poccedilos e as gotas preparadas pelo robocirc Honeybee
utilizando-se os kits disponiacuteveis no laboratoacuterio Crystal Screen HT (Hampton
Research) JCSG+ Suite (Molecular Dimensions) PACT Suite (Molecular
cd
MRWobs
10][
48
Dimensions) Precipitant Synergy (Rigaku Reagents) SaltRx HT (Hampton
Research) Wizard IampII (Rigaku Reagents)
317 Espalhamento de raio-X a baixo acircngulo (SAXS)
Atraveacutes da teacutecnica de SAXS informaccedilotildees sobre a massa molecular das
partiacuteculas espalhadoras e do raio de giro (Rg) da proteiacutena de estudo satildeo obtidos a
partir dos dados coletados Por meio de programas computacionais como DAMMIN
(SVERGUN1999) e GASBOR (SVERGUN et al 2001) um modelo de baixa
resoluccedilatildeo da forma da proteiacutena pode ser obtido
Os dados de SAXS foram obtidos na linha de luz D02A ndash SAXS2 no
Laboratoacuterio Nacional de Luz Siacutencrotron (LNLS) Campinas-SP Brasil usando
comprimento de onda de 148 A e um detector bidimensional com arranjo CCD
(MARCCD USA) de 165 mm A distacircncia do detector para a amostra foi de 106804
mm e os dados na faixa de 002 nm-1 para 021 nm-1 foram coletados usando
proteiacutena pura nas concentraccedilotildees de 5 mgml em tampatildeo em 20 mM HEPES pH 74
e 100 mM de cloreto de soacutedioExposiccedilotildees de 300 e 600 s foram realizadas e os
dados do tampatildeo foram coletados antes e depois dos dados da amostra para fazer a
correccedilatildeo do solvente e normalizaccedilatildeo do espalhamento
Ajuste dos dados experimentais e avaliaccedilatildeo da funccedilatildeo p(R) foram realizados
utilizando o programa GNOM (SVERGUN 1992) O envelope a baixa resoluccedilatildeo de
TcKAP7 foi determinado usando modelagem abnitio implementada no programa
DAMMIN O modelo a baixa resoluccedilatildeo e o modelo da estrutura tridimensional foram
superpostas usando o programa SUPCOMB (KOZIN amp SVERGUN 2001)
318 Modelagem de TcKAP7
Um modelo da estrutura tridimensional de TcKAP7 foi construiacutedo Para a
construccedilatildeo do modelo foi utilizado o programa MODELLER (SALI amp BLUNDELL
1993) este programa eacute utilizado para a modelagem por homologia a estruturas
tridimensionais de proteiacutenas O programa automaticamente constroacutei um modelo
baseado na anaacutelise de um alinhamento de sequecircncias entre a proteiacutena para a qual
se deseja construir o modelo e uma proteiacutena relacionada cuja estrutura
tridimensional jaacute foi resolvida A qualidade do modelo pode ser avaliada por
49
exemplo atraveacutes de graacuteficos e tabelas que analisam restriccedilotildees quiacutemicas e fiacutesicas de
cada aacutetomo constituinte do modelo
319 Obtenccedilatildeo de antissoro policlonal contra TcKAP7
A proteiacutena TcKPA7 recombinante purificada foi inoculada em camundongos
da linhagem BALBc por via intraperitonial com 4 aplicaccedilotildees de aproximadamente
20-50 μg de antiacutegeno em intervalos de 15 dias seguida de obtenccedilatildeo do soro apoacutes 1
semana da uacuteltima inoculaccedilatildeo O antiacutegeno foi emulsificado em adjuvante completo de
Freund na primeira inoculaccedilatildeo e com adjuvante a base de hidroacutexido de alumiacutenio
(Alu-Gel Serva) nas inoculaccedilotildees posteriores
320 Anaacutelise da expressatildeo do gene TcKAP7 e de seu mutante por ensaio tipo
western blot
Este procedimento foi executado segundo o meacutetodo de Towbin e
colaboradores (1979) Aliacutequotas de extratos de T cruzi equivalentes a 1 x 107
ceacutelulas foram submetidos agrave SDS-PAGE Apoacutes a separaccedilatildeo eletroforeacutetica as
proteiacutenas foram transferidas para membrana de nitrocelulose (Hybond C Amersham
Biosciences) em tampatildeo de western por 2 h a 60 V ou 20 V por 16 h Apoacutes a
transferecircncia a membrana foi corada com Ponceau S e descorada suavemente com
aacutegua bidestilada para a identificaccedilatildeo das bandas do marcador de massa molecular
A membrana foi entatildeo incubada em soluccedilatildeo de bloqueio por 30 min sob agitaccedilatildeo
suave
Apoacutes o bloqueio a membrana foi incubada com os soros policlonais ou
anticorpos monoclonais em TBST-leite por aproximadamente 1 h a 37degC A
membrana foi lavada 5 vezes com TBST Em seguida a membrana foi incubada
com anticorpo secundaacuterio anti-IgG de camundongo conjugado com a enzima
peroxidase (Pierce ndash Thermo Scientific) por 1h na diluiccedilatildeo de 16000 em TBST-leite
a temperatura ambiente A membrana foi submetida a mais cinco lavagens com
TBST e a reaccedilatildeo era evidenciada utilizando substrato quimioluminescente (West
Pico Pierce ndash ThermoScientific) sobre a membrana a qual era exposta a um filme
para raios-X (Hyperfilm ECL GE)
50
321 Superexpressatildeo de TcKAP7
3211 Amplificaccedilatildeo e clonagem do gene TcKAP7 no vetor pNEO3xFlag para
superexpressatildeo da proteiacutena
O gene TcKAP7 foi clonado no vetor pNEO3xFLAG construiacutedo no nosso
laboratoacuterio a partir do vetor pTcGW-ProtCcarboxi (BATISTA et al 2010) que utiliza
o sistema Gateway de clonagem (Invitrogen) Os vetores foram construiacutedos
utilizando-se como base o pBluescript II (Stratagene San Diego USA) onde foram
inseridas trecircs sequencias que codificam para regiotildees intergecircnicas (IR) de T cruzi A
primeira TcUIR eacute a regiatildeo intergecircnica do locus de ubiquitinacalmodulina de T
cruzi (BATISTA et al 2010) As outras duas regiotildees intergecircnicas ITR1 e ITR2 foram
selecionadas a partir de genes de copia uacutenica no genoma e que possuem um niacutevel
de expressatildeo constitutivo nos estaacutegios epimastigota e tripomastigota metaciclicos
avaliados por dados de proteocircmica e RNAseq (Comunicaccedilatildeo pessoal Michel
Batista) Aleacutem disso esse vetor confere agrave regiatildeo C-terminal da proteiacutena
recombinante resultante da clonagem neste vetor trecircs etiquetas FLAG (sequecircncia
DYKDDDDK) em tandem (FIGURA 10)
FIGURA 10 VETOR PARA EXPRESSAtildeO EM T CRUZI P3XFLAG
LEGENDA PR ndash PROMOTOR RIBOSOMAL TCUIR ITR1 E ITR2 - REGIOtildeES INTERGENICAS ATTR1 E ATTR2 ndash REGIOtildeES PARA RECOMBINACcedilAtildeO CMreg - RESISTEcircNCIA A CLORANFENICOL CCDB ndash GENE PARA SELECcedilAtildeO NEGATIVA DURANTE A CLONAGEM 3XFLAG ndash TREcircS ETIQUETAS DE FLAG (DYKDDDDK) NEOMICINA ndash GENE DE RESISTEcircNCIA A NEOMICINA
O gene TcKAP7 foi amplificado utilizando os primers especiacuteficos
KAP7GtwFor (5rsquo-
GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTGCCCGCGAAGTATTCAGCAGCCC)
e KAP7GtwRev (5rsquo-
GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCGTGGTACATGGCGTACGGGTTG)
PR TcUIR Att R1 Cmreg ccdB Att R2 3x Flag ITR1 Neomicina ITR2
51
os quais possuem os siacutetios attB indicados em negrito As condiccedilotildees desta reaccedilatildeo
de PCR foram as seguintes 100 ng de DNA genocircmico de T cruzi 10 pmol de cada
primer 200 μM de cada dNTP MgSO4 2 mM tampatildeo Taq DNA polimerase High
Fidelity 1x 1U de Platinum Taq DNA polimerase high fidelity (Invitrogen) A reaccedilatildeo
de PCR foi processada no termociclador modelo 9700 (AppliedBiosystems EUA)
com a desnaturaccedilatildeo do material por 5 min a 94 degC seguida de 35 ciclos constando
de desnaturaccedilatildeo a 94 degC por 30 s hibridizaccedilatildeo dos primers a 58 degC por 30 s e
extensatildeo a 72 degC por 15 min
O gene amplificado foi clonado no vetor de entrada pDONRtrade221
(Invitrogen) A reaccedilatildeo foi feita com 150 ng dos produtos de PCR contendo os siacutetios
attB 150 ng do plasmiacutedeo pDONRtrade221 1 μL de BP ClonaseTM enzyme mix e TE
para um volume final de 10 μL e com incubaccedilatildeo a 25 degC por 16 h Foi entatildeo
adicionado 1 microL de proteinase K (2 mgmL) com incubaccedilatildeo por 10 min a 37 degC Os
clones em pDONRtrade221 foram transformados em ceacutelulas caacutelcio-competentes E coli
DH5α conforme protocolo de transformaccedilatildeo de ceacutelulas caacutelcio-competentes Apoacutes
transformaccedilatildeo a cultura foi semeada em placa de LBKan (kanamicina 25 microgmL) e
incubada a 37 degC durante 16 h
Para verificar a presenccedila de clones com os insertos de interesse foi feita a
teacutecnica da palitagem As colocircnias selecionadas foram inoculadas em 5 mL de meio
LBKan e incubadas por 16 h a 37 degC com agitaccedilatildeo (190 rpm) A purificaccedilatildeo dos
plasmiacutedeos foi realizada com o kit QIAprepreg Spin Miniprep (Qiagen) conforme
orientaccedilotildees do fabricante
Apoacutes esta etapa foi necessaacuterio transferir os insertos para o vetor de destino
pNEO3xFlag A troca de insertos entre os vetores de entrada e destino denominada
de reaccedilatildeo LR foi realizada conforme orientaccedilotildees do fabricante (Gateway LR clonase
enzyme mix) e ceacutelulas caacutelcio-competentes foram transformadas com os produtos
das recombinaccedilotildees conforme descrito anteriormente semeadas em placas de
LBAmp e incubadas a 37 degC durante 16 h
A verificaccedilatildeo de clones positivos foi realizada atraveacutes de PCR de colocircnias
As colocircnias selecionadas foram inoculadas em 5 mL de meio LB contendo ampicilina
(100 μgmL) e incubada a 37deg C por 16 h sob agitaccedilatildeo (200 rpm)O plasmiacutedeo
contendo o gene TcKAP7 foi denominado de pNEO_KAP7_3xFLAG
52
3212 Transfecccedilatildeo por eletroporaccedilatildeo
A transfecccedilatildeo das formas epimastigotas de T cruzi foi feita pela teacutecnica de
eletroporaccedilatildeo utilizando o equipamento genepulserreg apparatus (Bio-Rad) e cubetas
esteacutereis de eletroporaccedilatildeo gene pulsermicro pulserreg 02 cm (Bio-Rad) Formas
epimastigotas de T cruzi foram cultivadas em meio LIT ateacute uma densidade celular
de 3 x 107 ceacutelulasml Um volume de cultura correspondendo a 1 x 109 parasitas foi
centrifugado (4000 x g 4 degC) O sobrenadante foi descartado e as ceacutelulas foram
ressuspendidas em tampatildeo de eletroporaccedilatildeo esteacuteril e submetidas a centrifugaccedilatildeo
nas condiccedilotildees acima O sedimento celular foi ressuspendido em 2 ml de tampatildeo de
eletroporaccedilatildeo Em cubetas de eletroporaccedilatildeo previamente resfriadas a 4 degC foram
misturados 400 μL (2 x 108 ceacutelulas) da suspensatildeo dos parasitas e 50 μL (20 microg) do
plasmiacutedeo para superexpressatildeo (pNEO_KAP7_3XFLAG) Em paralelo parasitas
foram submetidos agraves mesmas condiccedilotildees mas na ausecircncia de DNA (controle
negativo da transfecccedilatildeo)
As cubetas foram entatildeo mantidas em gelo por 10 min Em seguida os
parasitas foram transfectados com dois pulsos sequenciais de 500 μF e 450 volts
Apoacutes o esse procedimento as cubetas foram mantidas em gelo por mais 5 min A
suspensatildeo de parasitas transfectados foi entatildeo inoculada em 10 mL de meio LIT
suplementado com 10000 U de penicilina e estreptomicina a 10 μgmL
3213 Seleccedilatildeo dos transfectantes
O gene para a enzima neomicina fosfotransferase foi utilizado como
marcador de seleccedilatildeo dos parasitas carregando o plasmiacutedeo para a superexpressatildeo
pNEO_KAP7_3XFLAG Para tanto o antibioacutetico G418 foi adicionado agraves culturas
apoacutes 24 h da transfecccedilatildeo na concentraccedilatildeo final de 500 μgmL Entre 3 e 4 dias apoacutes
a transfecccedilatildeo foi realizada a primeira passagem (14) A partir desse ponto foram
feitas passagens semanais na proporccedilatildeo de 110 ateacute que natildeo fosse observado
crescimento nas duas uacuteltimas passagens da cultura do controle negativo da
transfecccedilatildeo
A expressatildeo da proteiacutena KAP7-FLAG foi analisada atraveacutes de ensaios de
western blot e imunofluorescecircncia
53
322 Deleccedilatildeo do gene TcKAP7 por nocaute gecircnico
3221 Amplificaccedilatildeo e clonagem das regiotildees a montante e a jusante do gene
TcKAP7
As regiotildees a montante (upstream) e a jusante (downstream) do gene TcKAP7
respectivamente denominadas de UPSKAP7 (521 pb) e DOWNKAP7 (500 pb)
foram amplificadas por PCR usando os primers descritos nas TABELAS 1 E 2 A
regiatildeo denominada DOWNKAP7 conteacutem ainda 139 pb do final da regiatildeo codante de
TcKAP7
QUADRO 1 - RELACcedilAtildeO DOS PRIMERS UTILIZADOS PARA A CLONAGEM DA
REGIAtildeO UPSTREAM DE TcKAP7 NO VETOR pNEO1
UPSKAP7F GGGGTCGACCGTTGCTGGTTTTTCTTTTGGTGT
UPSKAP7R GGGAAGCTTGCTTCAAAACGTCTATGCGGGC
Os siacutetios das enzimas de restriccedilatildeo SalI (GTCGAC) e HindIII (AAGCTT) adicionados aos primers estatildeo em negrito
QUADRO 2 - RELACcedilAtildeO DOS PRIMERS UTILIZADOS PARA A CLONAGEM DA
REGIAtildeO DOWNSTREAM DE TcKAP7 NO VETOR pNEO1
DOWNKAP7F GGGGAATTCGCCTCATATGACGCATCTCCCA
DOWNKAP7R GGGGGATCCTGTTGGCGCTGTCAAGGAAGTAAG
Os siacutetios das enzimas de restriccedilatildeo EcoRI (GAATTC) e BamHI (GGATCC) adicionados aos primers estatildeo em negrito
As reaccedilotildees de PCR foram realizadas nas seguintes condiccedilotildees 100 ng de
DNA total de T cruzi Dm28c 10 pmol dos oligonucleotiacutedeos F e R 200 μM de cada
dNTP MgCl2 15 mM tampatildeo Taq DNA polimerase 1x 25 unidades de Taq DNA
polimerase (Invitrogen EUA) A reaccedilatildeo de PCR foi processada no termociclador
modelo 9700 (Applied Biosystems EUA) nas seguintes condiccedilotildees Desnaturaccedilatildeo do
54
material por 4 min a 94 degC seguida de 35 ciclos de desnaturaccedilatildeo a 92 degC por 30 s
hibridizaccedilatildeo dos oligonucleotiacutedeos a 56 degC por 30 s e extensatildeo a 72 degC por 1 min O
material amplificado foi purificado usando o Qiaquick PCR Purification (Qiagen) O
DNA purificado foi digerido com enzimas de restriccedilatildeo apropriadas para a clonagem
dos fragmentos nos vetores pNEO1 O plasmiacutedeo resultante da clonagem das
regiotildees UPSKAP7 e DOWNKAP7 foi denominado de pNEO1kap7 (Figura 11A)
Uma vez que o genoma do T cruzi eacute diploide construiacutemos um segundo
plasmiacutedeo para o nocaute do segundo alelo do gene TcKAP7 tendo como marca de
seleccedilatildeo o gene que codifica resistecircncia a higromicina B Esse plasmiacutedeo foi
construiacutedo usando como molde o plasmiacutedeo pNEO1kap7 O plasmiacutedeo pNEO1kap7
foi digerido com HindIII para remoccedilatildeo do gene neo e uma pequena porccedilatildeo da regiatildeo
DOWNSTREAM (220 pb) O plasmiacutedeo linearizado foi purificado do gel de agarose
usando o kit Qiaquick PCR Purification (Qiagen) e ligado com o gene higro O gene
higro foi amplificado usando os primers HIGROF
(GGGGGAAGCTTATGAAAAAGCCTGAACTCACCGCGAC) e HIGROR
(GGGAAGCTTCTATTCCTTTGCCCTCGGACGAGTGCTG) ambos contendo na
extremidade 5rsquo o siacutetio para a enzima de restriccedilatildeo HindIII (em negrito) O plasmiacutedeo
resultante da ligaccedilatildeo foi denominado de pHIGRO1kap7 (FIGURA 11B)
55
FIGURA 11 ESQUEMA DA CONSTRUCcedilAtildeO DOS VETORES UTILIZADOS PARA O NOCAUTE DO GENE TcKAP7 LEGENDA Nesta figura eacute observada a inserccedilatildeo das sequecircncias flanqueadoras do gene TcKAP7 juntamente com os respectivos siacutetios para cada enzima de restriccedilatildeo nos vetores de clonagem pNEO1 e pHIGRO1
3222 Amplificaccedilatildeo dos cassetes UPS-NEO-DOWN e UPS-HIGRO-DOWN para
transfecccedilatildeo de T cruzi
Os dois plasmiacutedeos recombinantes foram purificados pelo meacutetodo da lise
alcalina utilizando o kit de minipreparaccedilatildeo de plasmiacutedeos (Qiagen) As minipreps
foram utilizadas para a amplificaccedilatildeo da regiatildeo UPS-NEO-DOWN (cassete NEO) e da
regiatildeo UPS-HIGRO-DOWN (cassete HYG) por PCR usando os primers UPSKAP7F
e DOWNKAP7R As reaccedilotildees de PCR foram realizadas nas seguintes condiccedilotildees 20
ng do plasmiacutedeo pNEO1kap7 ou pHIGRO1kap7 10 pmol dos primers UPSKAP7F e
DOWNKAP7R 200 μM de cada dNTP MgCl2 15 mM tampatildeo Taq DNA polimerase
1x 25 unidades de Taq DNA polimerase (Invitrogen EUA) A reaccedilatildeo de PCR foi
processada no termociclador modelo 9700 (AppliedBiosystems EUA) nas seguintes
condiccedilotildees Desnaturaccedilatildeo do material por 4 min a 94 degC seguida de 35 ciclos de
desnaturaccedilatildeo a 92 degC por 30 s hibridizaccedilatildeo dos oligonucleotiacutedeos a 56 degC por 30 s e
56
extensatildeo a 68 degC por 2 min O material amplificado foi submetido agrave eletroforese em
gel preparativo de agarose 1 O gel foi corado com brometo de etiacutedeo (1 μgml) e a
banda correspondente a cada cassete foi removida do gel com auxiacutelio de uma
lacircmina de bisturi O DNA foi purificado por eletroeluiccedilatildeo dentro de saco de diaacutelise
nas condiccedilotildees de 100 V por 1 hora em tampatildeo TBE Para obter massa de DNA
suficiente para a transfecccedilatildeo (20 μg) foram feitas 10 reaccedilotildees de PCR com 100 μl
cada uma
3223 Transfecccedilatildeo do T cruzi com o cassete UPS-NEO-DOWN
Formas epimastigotas de T cruzi foram cultivadas em meio LIT ateacute 2 x 107
ceacutelulasml Os parasitas (1 x 108 ceacutelulas) foram coletados por centrifugaccedilatildeo a 6000
x g por 10 min a 4 degC O sedimento celular foi lavado com PBS esteacuteril e
ressuspendido em 1 ml de soluccedilatildeo de eletroporaccedilatildeo Volumes correspondentes a
04 ml da suspensatildeo de ceacutelulas foram transferidos para cubetas de eletroporaccedilatildeo
esteacutereis (02 cm de gap) (BioRad) e preacute-resfriadas Em uma delas foram adicionados
de 20 μg do fragmento representando o cassete NEO A outra cubeta contendo
apenas a suspensatildeo de parasitas foi usada como controle Apoacutes 10 minutos no gelo
as amostras contidas nas cubetas foram submetidas a 2 pulsos de 450 volts 500
microF utilizando o eletroporadorGenePulserreg IIApparatus (Bio-Rad) As amostras
foram incubadas novamente por 5 a 10 minutos no gelo em seguida foram
transferidas para garrafas de cultura de 25 cm2 contendo 10 ml de meio LIT
(suplementado com 10000 U de penicilina e estreptomicina a 10 mgml) As culturas
foram entatildeo incubadas a 28 degC Apoacutes 24 horas de incubaccedilatildeo adicionou-se o
antibioacutetico G418 na concentraccedilatildeo de 500 μgml As culturas foram mantidas por
sucessivas passagens (diluiccedilatildeo de 110) em meio LIT suplementado com G418 a
cada 8-10 dias ateacute a ausecircncia de proliferaccedilatildeo celular na cultura controle Os
parasitas nos quais TcKAP7 foi substituiacutedo pelo gene neo foram denominados deT
cruzi(kap7kap7neo) e foram testados para a correta inserccedilatildeo do gene neo no locus
genocircmico de TcKAP7
57
3224 Extraccedilatildeo de DNA dos transfectantes
T cruzi transfectado com o cassete NEO (T cruzi(kap7kap7neo) foi cultivado
em meio LIT suplementado com G418 (500 μgml) ateacute uma densidade de 3 x 107
ceacutelulasml Os parasitas foram coletados por centrifugaccedilatildeo por 1 min a 6000 x g e
lavados com PBS Em seguida os parasitas foram lisados gentilmente em 350 μl de
tampatildeo TELT conforme descrito no item 34
3225 Anaacutelise por PCR do DNA dos parasitas transfectados com o cassete
UPS-NEO-DOWN
As reaccedilotildees de PCR foram realizadas utilizando primers externos EXTF
(CCCGCTACGACTGCCCTCCACGCGGAAGGGAA) e EXTR
(AAGTAAACGGGAGAAGCAACACGATGGGAGGCTC) que natildeo estatildeo presentes na
construccedilatildeo do cassete UPS-NEO-DOWN combinados com os primers NEOF
(GGGGAAGCTTATGATTGAACAAGATGGATTGCACGCAG) e NEOR
(GGGGGAATTCAGAAGAACTCGTCAAGAAGGCGATAGAA)
As condiccedilotildees das reaccedilotildees foram as seguintes 100 ng do DNA total de T
cruzi Dm28c tipo selvagem (T cruzi(kap7kap7) ou tipo selvagem) ou do DNA da
populaccedilatildeo T cruzi(kap7kap7neo) (mutante simples nocaute) 10 pmol dos primers EXTF
+ NEOR e NEOF + EXTR 200 μM de cada dNTP MgCl2 15 mM tampatildeo Taq DNA
polimerase 1x 25 unidades de Taq DNA polimerase (Invitrogen EUA) A reaccedilatildeo de
PCR foi processada no termociclador modelo 9700 (AppliedBiosystems EUA) nas
seguintes condiccedilotildees Desnaturaccedilatildeo do material por 4 min a 94 degC seguida de 35
ciclos de desnaturaccedilatildeo a 92 degC por 30 s hibridizaccedilatildeo dos oligonucleotiacutedeos a 55 degC
por 30 s e extensatildeo a 72 degC por 2 min
3226 Transfecccedilatildeo do T cruzi com o cassete UPS-HIGRO-DOWN
Formas epimastigotas da populaccedilatildeo mutante de T cruzi (kap7kap7neo) foram
cultivadas em meio LIT suplementado com G418 (500 μgml) ateacute a densidade de 2 x
107 ceacutelulasml Os parasitas (1 x 108 ceacutelulas) foram coletados por centrifugaccedilatildeo a
6000 x g por 10 min a 4 degC e submetidos ao processo de eletroporaccedilatildeo como
descrito no item 3202 Para a transfecccedilatildeo foram usados 20 μg do fragmento
58
representando o cassete UPS-HIGRO-DOWN As culturas (transfectada e controle)
foram entatildeo incubadas a 28 degC em LIT suplementado de G418 Apoacutes 24 horas de
incubaccedilatildeo foi adicionado o antibioacutetico higromicina ao meio de cultura na
concentraccedilatildeo de 500 μgml As culturas foram mantidas por sucessivas passagens
(diluiccedilatildeo de 110) em meio LIT suplementado com G418 e higromicina a cada 8-10
dias ateacute a ausecircncia de proliferaccedilatildeo celular na cultura controle Mutantes nos quais
os dois alelos de TcKAP7 foram removidos e substituiacutedos pelos genes NEO e
HIGRO foram denominados com genoacutetipo T cruzi (kap7neokap7higro)
3227 Anaacutelise por PCR do DNA dos parasitas transfectados com o cassete
UPS-HIGRO-DOWN
As reaccedilotildees de PCR foram realizadas utilizando primers externos EXTF e
EXTR (item 3225) combinados com os primers HIGROF e HIGROR (item 3221)
As reaccedilotildees de PCR foram realizadas nas seguintes condiccedilotildees 100 ng do
DNA total de T cruzi(kap7kap7) ou do DNA do T cruzi(kap7neokap7higro) 10 pmol dos
primers EXTF + HIGROR e HIGROF + EXTR 200 μM de cada dNTP MgCl2 15
mM tampatildeo Taq DNA polimerase 1x 25 unidades de Taq DNA polimerase
(Invitrogen EUA) A reaccedilatildeo de PCR foi processada no termociclador modelo 9700
(Applied Biosystems EUA) nas seguintes condiccedilotildees Desnaturaccedilatildeo do material por
4 min a 94 degC seguida de 35 ciclos de desnaturaccedilatildeo a 92 degC por 30 s hibridizaccedilatildeo
dos oligonucleotiacutedeos a 55 degC por 30 s e extensatildeo a 72 degC por 2 min
3228 Anaacutelise da organizaccedilatildeo do gene TcKAP7 e da eficiecircncia de seu nocaute
atraveacutes de ensaio do tipo Southern blot
O DNA genocircmico (5 μg) de T cruzikap7kap7 e T cruzikap7neokap7higro foi
submetido a digestatildeo com a enzima de restriccedilatildeo HindIII de acordo com as
especificaccedilotildees do fornecedor Apoacutes 3 horas o DNA digerido foi submetido agrave
eletroforese em gel de agarose 08 em tampatildeo TBE a 100 V O gel foi corado por
brometo de etiacutedio (05 μgmL) e fotografado sob a luz ultravioleta (310 nm)
Posteriormente o gel foi tratado com soluccedilotildees de depurinaccedilatildeo por 15 minutos de
desnaturaccedilatildeo por 30 minutos (2 vezes) e soluccedilatildeo de neutralizaccedilatildeo por 30 minutos (2
vezes) O DNA foi transferido para uma membrana de nylon (Hybond N
59
AmershamBiosciences) por capilaridade (SAMBROOK et al 1989) utilizando-se de
uma ldquoponterdquo de papel 3 MM embebido em SSC 20X Apoacutes a transferecircncia o DNA foi
fixado agrave membrana por exposiccedilatildeo agrave luz ultravioleta com uma dose de 120 mJcm2
usando o aparelho Spectrolinker (Spectronicscorp USA) A membrana contendo o
DNA de T cruzi foi preacute-hibridizada em soluccedilatildeo de hibridizaccedilatildeo de DNA por 1 hora a
65 ordmC seguido da adiccedilatildeo da sonda marcada radioativamente com α-[P32
]-dCTP (10
μCiμl 3000 Cimmol) (Amersham Biosciences) preparada segundo meacutetodo de nick
translation descrito por Rigbyet al (1977) utilizando-se o meacutetodo de iniciaccedilatildeo por
random primers (Megaprimer DNA labeling kit ndash GE) conforme recomendaccedilotildees do
fabricante
Foram utilizadas 3 sondas satildeo elas fragmento do gene TcKAP7
correspondendo a regiatildeo compreendida entre os nucleotiacutedeos 1 e 560 o gene neo e
o gene higro Apoacutes a marcaccedilatildeo as sondas foram purificadas em colunas de
Sephadex G-50 (ProbeQuant ndash Amersham Biosciences) e adicionadas ao tampatildeo de
hibridizaccedilatildeo na concentraccedilatildeo de 5 x 106
cpmml As membranas foram incubadas
por 16 horas a 65 C e em seguida lavadas nesta temperatura duas vezes por 30
minutos com soluccedilotildees de alta meacutedia e baixa estringecircncia As membranas foram
expostas a filme de raio-X (Hyperfilmreg Amersham Biosciences) na presenccedila de tela
intensificadora (Dupont Cronex Lightining Plus) por tempo que varia entre 1 a 3 dias
a ndash70 C
323 Localizaccedilatildeo celular da proteiacutena TcKAP7 atraveacutes de ensaio de
imunofluorescecircncia
Formas epimastigotas de T cruzi foram coletadas por centrifugaccedilatildeo (4000 times
g 3 a 10 ordmC) lavadas duas vezes em PBS e depositadas sobre lacircminas de vidro
previamente tratadas com poli-L-lisina 001 diluiacuteda em PBS Os parasitas foram
entatildeo fixados com paraformaldeiacutedo 4 em PBS permeabilizados com Triton X-100
01 em PBS por 2 min agrave temperatura ambiente e incubados a 4ordmC durante 16 h
em soluccedilatildeo de bloqueio para imunofluorescecircncia (PBS 1X + BSA 1 ) Apoacutes o
bloqueio os parasitas foram incubados agrave temperatura ambiente por 1 h com o
anticorpo monoclonal anti-FLAG em uma diluiccedilatildeo de 11000 em soluccedilatildeo de bloqueio
para imunofluorescecircncia Depois disso as lacircminas foram submetidas a 5 lavagens
60
de 5 min cada em PBS Em seguida os parasitas foram incubados agrave temperatura
ambiente por 1 hora com o anticorpo secundaacuterio anti-IgG de camundongo conjugado
ao fluoroacuteforo Alexa Fluacuteor 488 (Invitrogen) diluiacutedo 1600 em soluccedilatildeo de bloqueio As
lacircminas foram lavadas 5 vezes com PBS e posteriormente incubadas com o corante
Hoechst 33342 (Invitrogen) a 2 μgμL em PBS por 5 min Apoacutes cinco lavagens com
PBS as lacircminas foram montadas com ProLong Gold Antifade (Invitrogen) sobre uma
lacircmina de microscopia oacutetica O material foi observado nos microscoacutepios Leica SP5 e
DMI6000
324 Anaacutelise da ultraestrutura do cinetoplasto do mutante de T cruzi para
TcKAP7 por microscopia eletrocircnica de transmissatildeo
Os parasitas foram coletados lavados com PBS e fixados em soluccedilatildeo
contendo 25 de glutaraldeiacutedo 4 de paraformaldeiacutedo e tampatildeo cacodilato 01 M
Em seguida os parasitas foram fixados por 1 h em soluccedilatildeo de 1 de tetroacutexido de
Oacutesmio e 08 de ferricianeto de potaacutessio diluiacutedos em tampatildeo cacodilato 01 M As
ceacutelulas foram entatildeo desidratadas em soluccedilatildeo contendo concentraccedilotildees crescentes
de acetona e incluiacutedas em Epon Apoacutes a obtenccedilatildeo de cortes ultrafinos dos parasitas
os mesmos foram contrastados em acetato de uranila e citrato de Chumbo antes de
serem observados e fotografados no microscoacutepio eletrocircnico de transmissatildeo Zeiss
900
325 Coloraccedilatildeo dos parasitas transfectados
A coloraccedilatildeo dos parasitas foi realizada pelo meacutetodo panoacutetico raacutepido
(Laborclin Pinhais Paranaacute Brasil) modificado
Formas epimastigotas do mutante de T cruzi para TcKAP7 foram cultivadas
como descrito no item 321 Os parasitas foram coletados por centrifugaccedilatildeo de 1
min a 4000 x g e ressuspensos em PBS Desta suspensatildeo uma gota foi retirada e
depositada sobre lacircminas previamente limpas Quando secas as lacircminas foram
imersas individualmente na Soluccedilatildeo 1 (Fixador) Soluccedilatildeo 2 (Revelador) e Soluccedilatildeo 3
(Corante) em cada uma por 30 s Apoacutes este processo as lacircminas foram lavadas em
aacutegua corrente secas agrave temperatura ambiente e cobertas com Permount e lamiacutenula
Os parasitas foram visualizados em microscoacutepio Nikon E600
61
326 Infecccedilatildeo de ceacutelulas Vero com o mutante de T cruzi para TcKAP7
Ceacutelulas Vero (ATCCreg Nuacutemero CRL-2783trade) foram cultivadas em garrafas
de 150 cm2 contendo meio RPMI suplementado com 5 de soro fetal bovino
(GIBCO) penicilina 100 UIml streptomicina 10 microgml e glutamina 2 mM a 37 o C
com 5 de CO2 Ao atingirem a confluecircncia (80 a 100) realizou-se a passagem
atraveacutes de tripsinizaccedilatildeo e foi feito um inoacuteculo de 1 x 107 ceacutelulas para cada nova
garrafa de 150 cm2 Apoacutes 24 horas estas ceacutelulas (50 ndash 70 de confluecircncia) foram
infectadas com formas metaciacuteclicas obtidas da diferenciaccedilatildeo do mutante de T cruzi
para TcKAP7 em microplacas de 24 poccedilos contendo lamiacutenulas de vidro com
diacircmetro de 13 mm A cada poccedilo foram adicionadas 2 x 104 ceacutelulas Vero Apoacutes 24
horas de cultivo as ceacutelulas foram infectadas com tripomastigotas metaciacuteclicos
(obtidos do sobrenadante das culturas de T cruzi diferenciados em meio TAU3AAG
sem purificaccedilatildeo na coluna de DEAE celulose) A infecccedilatildeo das ceacutelulas Vero foi
acompanhada diariamente por microscopia de contraste de fase
327 Anaacutelise da funccedilatildeo do gene TbKAP7 de Trypanosoma brucei atraveacutes de
ensaios de RNA de interferecircncia
Com o intuito de complementar os estudos da funccedilatildeo do gene TcKAP7 foi
utilizada a teacutecnica de RNA de interferecircncia O uso dessa metodologia compreende
uma abordagem alternativa agrave anaacutelise da funccedilatildeo gecircnica para genes ortoacutelogos deT
brucei por anaacutelises de RNAi uma vez que a maquinaria de RNAi em T cruzi eacute
inexistente (DA ROCHA et al 2003) Os resultados podem gerar evidecircncias que
estejam relacionadas agrave funcionalidade dos genes em T cruzi Esta abordagem foi
utilizada neste trabalho para auxiliar no estudo da funccedilatildeo do gene TcKAP7 a partir
do ortoacutelogo em T brucei ainda natildeo caracterizadoTbKAP7 Os ensaios de RNAi
foram realizados em T brucei cepa 29-13 (WIRTZ et al 1999) com sistema induzido
por tetraciclina utilizando o vetor p2T7-177 ilustrado na figura 12 Este vetor quando
transfectado no parasita integra-se aos minicromossomos do T brucei regiatildeo de
repeticcedilotildees 177 (FOLDYNOVA-TRANTIRKOVA et al 2005)
62
FIGURA 12 MAPA DO VETOR p2T7-177 UTILIZADO PARA ENSAIOS DE RNAi LEGENDA T7 prom Promotor de T7 RNA Polimerase induzido por tetraciclina T7 term Terminador de transcriccedilatildeo 177 Sequumlecircncia repetitiva de 177 pares de bases para alvo de inserccedilatildeo em minicromossomos BLEO gene de resistecircncia agrave fleomicina GFP Proteiacutena Green FluorescentProtein os siacutetios para as enzimas de restriccedilatildeo estatildeo indicados AmpR gene de resistecircncia agrave ampicilina (FONTE WICKSTEAD et al 2002)
As regiotildees do mRNA para alvos nos ensaios de RNAi foram escolhidas com
o auxiacutelio da ferramenta RNAit da base de dados do Trypanofan - Genocircmica
funcional de Tbrucei (httptrypanofanpathcamacuktrypanofanmain)
(REDMOND et al 2003) Essas regiotildees foram amplificadas por PCR usando como
molde o DNA total de T brucei (100 ngreaccedilatildeo) 10 pmol dos primers listados na
tabela 3 200 mM de cada dNTP 15 mM de MgCl2 tampatildeo Taq DNA polimerase 1x
63
(Invitrogen) e 25 unidades de Taq DNA polimerase (Invitrogen) A reaccedilatildeo foi
aquecida por 4 min a 94 degC e entatildeo submetida a 35 ciclos de desnaturaccedilatildeo a 94 degC
por 30 s anelamento a 55 degC por 30 s e extensatildeo a 72 degC por 1 min Os primers
utilizados apresentam siacutetio para as enzimas de restriccedilatildeo BamHI (F) ou HindIII (R)
Os produtos de PCR foram purificados por extraccedilatildeo com fenol-clorofoacutermio e
digeridos com as referentes enzimas
QUADRO 3 - RELACcedilAtildeO DOS PRIMERS UTILIZADOS PARA A AMPLIFICACcedilAtildeO DO
GENE TbKAP7
KAP7RNAiF
AAAGGATCCCTAACCTAACCTGCAGGGTCTCTCG
KAP7RNAiR
GCGAAGCTTTTGTTCCTTTACAAACGCCC
Os siacutetios das enzimas de restriccedilatildeo BamHI (GGATCC) e HindIII (AAGCTT) adicionados aos primers estatildeo em negrito
As clonagens foram confirmadas por PCR de colocircnia e os plasmiacutedeos foram
purificados pelo kit QIAprep Spin Miniprep (Qiagen) Apoacutes purificaccedilatildeo 10 μg dos
plasmiacutedeos foram linearizados com a enzima NotI conforme descrito pelo fabricante
O DNA foi precipitado e ressuspenso em 50 μl de meio de eletroporaccedilatildeo ZPFM para
transfecccedilatildeo do T brucei
Para cada transfecccedilatildeo foi utilizado um total de 4 x 107parasitas em fase logariacutetmica
de crescimento Os parasitas foram obtidos por centrifugaccedilatildeo (5000 x g por 10 min
a 4 degC) lavados em meio ZPFM e ressuspensos em 500 μl do mesmo meio A
transfecccedilatildeo foi feita em cubetas de eletroporaccedilatildeo (4 mm) usando o eletroporador da
BioRad (GenePulser II Electroporator) As condiccedilotildees utilizadas foram dois pulsos de
1600 V e 25 microF Os parasitas foram entatildeo transferidos para garrafas contendo meio
SDM-79 SFB 10 higromicina 50 μgml e G418 15 μgml A seleccedilatildeo dos parasitas
transfectados foi atraveacutes da adiccedilatildeo de 5μgmL de fleomicina resistecircncia conferida
pelo vetor p2T7-177 apoacutes 24 horas de cultivo O tempo para seleccedilatildeo foi entre duas
e trecircs semanas
64
3271 Induccedilatildeo do RNA dupla fita
A induccedilatildeo da expressatildeo de RNA dupla fita referente agrave porccedilatildeo do gene
TbKAP7 clonado no plasmiacutedeo p2T7-177 deu-se pela adiccedilatildeo de tetraciclina 2 μgml
a uma cultura transfectada de T brucei em fase de crescimento exponencial (~2 x
106 parasitasml) Nos dias que se seguiram 1μgml de tetraciclina foi adicionada
diariamente agraves culturas A observaccedilatildeo dos efeitos na curva de crescimento causada
por RNAi em T brucei foi realizada ao longo de uma semana com a contagem de
ceacutelulas e adiccedilatildeo diaacuteria de tetraciclina 1 μgml
65
4 RESULTADOS
41 Clonagem e caracterizaccedilatildeo do gene TcKAP7
A regiatildeo codificante do gene TcKAP7 (ID Tc00104705350871950) foi
obtida a partir do banco de dados do genoma do T cruzi disponiacutevel no portal da
internet wwwgenedborg e amplificada por PCR com os primers descritos no item
37
No genoma do T cruzi cepa CL Brener (EL-SAYED et al 2005) foram
identificados dois haploacutetipos do gene TcKAP7 que foram denominados neste
trabalho de haploacutetipo A (Tc00104705350871950) e haploacutetipo B
(Tc00104705350979320) Neste trabalho foi utilizado o gene TcKAP7 proveniente
da cepa Dm28c de T cruzi Este gene apresenta uma regiatildeo codante de 747 pb e
codifica uma proteiacutena de 276 kDa assumindo que o primeiro ATG apoacutes a sequecircncia
do mini-eacutexon seja usada na iniciaccedilatildeo da traduccedilatildeo
A figura 13 abaixo mostra o alinhamento de TcKAP7 das cepas CL Brener e
Dm28c
FIGURA 13 - COMPARACcedilAtildeO ENTRE AS SEQUumlEcircNCIAS DE AMINOAacuteCIDOS DEDUZIDAS DO GENE KAP7 DE T cruzi Dm28C E DOS HAPLOacuteTIPOS DE CL BRENER
LEGENDA As posiccedilotildees com aminoaacutecidos idecircnticos em todas as sequumlecircncias estatildeo coloridas em preto
66
Embora o gene TcKAP7 natildeo possua grande identidade com os com genes
ortoacutelogos em Trypanosoma brucei TbKAP7 (714 pb) (Tb106k151470) Leishmania
major LmKAP7 (1044 pb) (LMJF_36_5840) Leishmania infantum LiKAP7 (1044 pb)
(LINJ_36_6090) e Leishmania braziliensis LbKAP7 (1038 pb) (LBRM_35_0010)
cujos genomas tambeacutem foram sequumlenciados (BERRIMAN et al 2005 IVENS et al
2005 PEACOCK et al 2007) as sequecircncias de aminoaacutecidos das respectivas
proteiacutenas deduzidas a partir desses genes ainda compartilham certo grau de
similaridade entre si (FIGURA 14) Na tabela 4 pode-se visualizar o percentual de
identidade entre as proteiacutenas KAP7 dos tripanossomatiacutedeos que possuem o genoma
sequenciado
FIGURA 14 COMPARACcedilAtildeO ENTRE AS SEQUumlEcircNCIAS DE AMINOAacuteCIDOS DEDUZIDAS DO GENE KAP7 EM DIFERENTES TRIPANOSOMATIacuteDEOS LEGENDA Em preto encontram-se os resiacuteduos de aminoaacutecidos idecircnticos em todas as sequumlecircncias e em cinza os resiacuteduos conservados na maioria delas
67
QUADRO 4 - PERCENTUAL DE IDENTIDADE ENTRE AS PROTEIacuteNAS KAP7 NOS
TRIPANOSSOMATIacuteDEOS COM O GENOMA SEQUENCIADO
Os valores foram obtidos pelo alinhamento utilizando a ferramenta Clustal21
Mesmo apresentando pouca identidade e variaccedilatildeo de tamanho alguns
dados do genoma sugerem que esses genes satildeo ortoacutelogos entre si Pode-se
perceber uma sintenia entre seus loci nas vaacuterias espeacutecies de tripanosomatiacutedeos
(Cavalcanti et al 2009) (FIGURA 15)
FIGURA 15- SINTENIA DE TcKAP7 COM OUTROS TRIPANOSOMATIacuteDEOS LEGENDA Os dois contigs de TcKAP7 (TcA e TcB) estatildeo representados nesta figura juntamente com os contigs de outros tripanosomatiacutedeos (Tb= T brucei Lm= L major Li= L infantum e Lb= L brasiliensis) mostrando que KAP7 representado pela cor amarela apresenta uma sintenia entre seus loci em todas as espeacutecies mostradas sendo flanqueado pelo gene KAP4 em T cruzi e T brucei representado em azul Portanto em L majorL infantum eL brasiliensis ao lado direito de KAP7 estaacute o gene de uma proteiacutena hipoteacutetica representado pela cor vermelha e ao lado esquerdo encontra-se o gene da KAP4 representado em azul como mencionado anteriormente FONTE CAVALCANTI et al 2009
68
A expressatildeo de vaacuterios genes mitocondriais de C fasciculata e L major eacute
regulada durante o ciclo celular em parte por uma sequumlecircncia consenso
[(CA)AUAGAA(GA)] presente nas regiotildees 5rsquo e 3rsquo-UTR dos respectivos mRNAs
(BROWN amp RAY 1997 MAHMOOD et al 1999 MAHMOOD amp RAY 1998 PASION
et al 1996 ZICK et al 2005)
Assim resolvemos caracterizar a regiatildeo 5rsquo-UTR do transcrito TcKAP7 na
tentativa de identificar sinais com identidade com aqueles encontrados em C
fasciculata Na figura 16 estaacute representada a regiatildeo 5rsquo-UTR do transcrito TcKAP7
com a sequumlecircncia parcial do mini-exon proveniente do primer usado na teacutecnica de
RT-PCR bem como parte da regiatildeo codificante do gene O mini-exon estaacute situado a
129 bases a jusante do iniacutecio da regiatildeo codificante do transcrito TcKAP7 e define
portanto uma regiatildeo 5rsquo-UTR de 168 bases considerando que o tamanho do mini-
exon eacute de 39 bases A anaacutelise da regiatildeo 5rsquo-UTR mostrou um elemento com
caracteriacutesticas muito semelhantes aquele envolvido na regulaccedilatildeo de genes em C
fasciculata (sequencia (G)ATAGAA(G) mostrada no retacircngulo preto na FIGURA
16B) sugerindo que TcKAP7 seja regulada durante o ciclo celular
69
A
B
FIGURA 16 CARACTERIZACcedilAtildeO DA REGIAtildeO 5rsquo-UTR DO TRANSCRITO TcKAP7 LEGENDA A Esquema geral da localizaccedilatildeo do mini-exon de TcKAP7 e B Localizaccedilatildeo especiacutefica do mini-exon de TcKAP7 O mini-exon de TcKAP7 (sequecircncia parcial em verde) estaacute localizado a 129 pb da regiatildeo codante (representada em parte pela cor azul) A regiatildeo 5rsquoUTR do transcrito Tckap7 estaacute representada na cor rosa A possiacutevel sequencia consenso de regulaccedilatildeo durante o ciclo celular estaacute indicada no retacircngulo preto
42 Expressatildeo da proteiacutena TcKAP7 em T cruzi
Formas epimastigotas foram transfectadas com o plasmiacutedeo pNEO3XFLAG
contendo o gene TcKAP7 (pNEO_KAP7_3xFLAG) A expressatildeo da proteiacutena
TcKAP7-FLAG foi analisada por ensaio de western blot Os resultados mostraram
que a expressatildeo da proteiacutena TcKAP7-FLAG foi satisfatoacuteria correspondendo ao
tamanho esperado (FIGURA 17 ) a qual foi confirmada pela reatividade do anticorpo
monoclonal especiacutefico para as etiquetas FLAG (anti-FLAG)
70
FIGURA 17 ANAacuteLISE DA EXPRESSAtildeO DA PROTEIacuteNA DE FUSAtildeO TCKAP7-FLAG EM FORMAS EPIMASTIGOTAS DE T CRUZI
43 Localizaccedilatildeo celular de TcKAP7 atraveacutes de ensaio de imunofluorescecircncia
Para verificar a localizaccedilatildeo celular de TcKAP7 foi realizado o ensaio de
imunofluorescecircncia Como natildeo foi possiacutevel a obtenccedilatildeo do anticorpo com alto tiacutetulo
contra a proteiacutena recombinante TcKAP7 neste ensaio foi utilizado o anticorpo
monoclonal anti-FLAG que reconhece a etiqueta FLAG a qual estaacute fusionada a
proteiacutena TcKAP7
Nessa figura pode-se observar que a proteiacutena de fusatildeo acumula-se na regiatildeo
dos poacutelos do cinetoplasto das formas epimastigotas do T cruzi (FIGURA 18)
indicando que TcKAP7 uma proteiacutena tipo histona H1 estaacute realmente associada com
o kDNA do parasita
71
FIGURA 18 IMUNOLOCALIZACcedilAtildeO DE TcKAP7 EM EPIMASTIGOTAS DE T CRUZI LEGENDAA contraste interferencial diferencial (DIC) B Hoechst marcando o nuacutecleo e o
cinetoplasto C fluorescecircncia mostrando a localizaccedilatildeo de TcKAP7 mais intensa na regiatildeo dos poacutelos
docinetoplasto dos protozoaacuterios D Aumento de C
44 Deleccedilatildeo do gene TcKAP7 por nocaute gecircnico
As teacutecnicas que permitem a remoccedilatildeo de um gene e sua substituiccedilatildeo por
genes repoacuterteres atraveacutes do processo de recombinaccedilatildeo tecircm sido usadas com
sucesso para verificaccedilatildeo da funccedilatildeo gecircnica em tripanosomatiacutedeos (MACRAE et al
2006) O nocaute gecircnico consiste na inserccedilatildeo de marcadores geneacuteticos de seleccedilatildeo
(gene codificando resistecircncia a neomicina ou higromicina entre outros) flanqueados
por sequumlecircncias pertencentes ao locus cromossocircmico de interesse Atraveacutes do
processo de recombinaccedilatildeo homoacuteloga o marcador pode entatildeo substituir o gene que
se quer estudar Desse modo pode ser possiacutevel analisar a funccedilatildeo de determinado
gene atraveacutes das alteraccedilotildees - decorrentes de sua ausecircncia - na fisiologia do
parasita No presente estudo os genes repoacuterteres que codificam resistecircncia aos
72
antibioacuteticos G418 e higromicina foram flanqueados por sequumlecircncias a montante e a
jusante da regiatildeo codificante do gene TcKAP7 As construccedilotildees foram usadas para
transfectarT cruzi e gerar mutantes para o gene TcKAP7 a fim de se estudar o
efeito que a ausecircncia do gene TcKAP7 causa no metabolismo do parasita
Apoacutes obtenccedilatildeo de uma populaccedilatildeo de T cruzi mutante para o gene TcKAP7
(kap7neokap7higro) resistente a ambos antibioacuteticos G418 e higromicina B o
DNA desta populaccedilatildeo foi extraiacutedo para anaacutelise por PCR e Southern blot a fim de
confirmar a eficiecircncia do nocaute
441 Anaacutelise por PCR do DNA dos parasitas transfectados com os cassetes
UPS-NEO-DOWN e UPS-HIGRO-DOWN
Foram realizadas vaacuterias reaccedilotildees de PCR a fim de confirmar a deleccedilatildeo do
gene TcKAP7 do genoma do T cruzi Dm28c e a substituiccedilatildeo dos seus alelos pelos
genes neo e higro As reaccedilotildees de PCR foram feitas com DNA de T cruzikap7kap7 (tipo
selvagem) e com DNA de T cruzikap7neokap7higro utilizando diversas combinaccedilotildees de
primers (TABELA 5) Na figura 32 observa-se que o gene TcKAP7 (747 pb) foi
amplificado somente na PCR realizada com DNA de T cruzi tipo selvagem (FIGURA
19 A canaleta 1) enquanto que os genes neo (795 pb) e higro (1026 pb) soacute foram
amplificados nas reaccedilotildees que conteacutem DNA da populaccedilatildeo do T cruzi kap7neokap7higro
(FIGURA 19 B canaletas 2 e 3) Os tamanhos esperados para amplificaccedilotildees usando
primers externos agraves construccedilotildees e os primers dos genes de resistecircncia foram
identificados no gel de agarose indicando que os cassetes se integraram
corretamente no locus do gene TcKAP7 (FIGURA 19 B canaletas 4 a 7) Um
esquema da localizaccedilatildeo dos primers utilizados nas reaccedilotildees de PCR pode ser
visualizado na figura 19 C
QUADRO 5 ndash COMBINACcedilOtildeES DE PRIMERS UTILIZADOS NA PCR PARA
CONFIRMAR O NOCAUTE DE TcKAP7
Pares de primers Tamanho esperado
(pb)
1 KAP7F + KAP7R 747
2 NEOF + NEOR 795
73
3 HIGROF + HIGROR 1026
4 EXTF + NEOR 1410
5 EXTF + HIGROR 1634
6 NEOF + EXTR 1358
7 HIGROF + EXTR 1360
74
FIGURA 19 ENSAIOS DE PCR UTILIZANDO DNA DE T cruzi kap7kap7 (WT) E
T cruzi kap7neokap7higro (NO) COM DIFERENTES PRIMERS
LEGENDA 1 KAP7F + KAP7R 2 NEOF + NEOR (795 pb) 3 HIGROF + HIGROR (1026 pb) 4
EXTF + NEOR (1410 pb) 5 EXTF + HIGROR (1634 pb) 6 NEOF + EXTR (1358 pb) e 7
HIGROF + EXTR (1360 pb) No quadro A encontram-se as PCRs realizadas com DNA de T cruzi kap7kap7 (WT) e no quadro B encontram-se as PCRs realizadas com DNA de T cruzi kap7neokap7higro
(NO) No quadro C estaacute um esquema da localizaccedilatildeo dos primers utilizados
442 Anaacutelise da organizaccedilatildeo dos genes TcKAP7 neo e higro por ensaio do
tipo Southern blot
Neste ensaio foi utilizado DNA total extraiacutedo de T cruzikap7kap7 (tipo selvagem)
e T cruzi kap7neokap7higro (duplo nocaute) Foram utilizadas trecircs sondas (1) Um
fragmento do gene TcKAP7 (primeiros 598 pb da CDS) (2) o gene neo e (3) o gene
higro O DNA total das duas amostras foi digerido com a enzima de restriccedilatildeo HindIII
O padratildeo de digestatildeo desta enzima pode ser visualizado na figura 20 De acordo
com o mapa de restriccedilatildeo a inserccedilatildeo do cassete neo no locus KAP7 geraria um
fragmento HindIIIHindIII de 1024 pb enquanto a inserccedilatildeo do cassete higro geraria
um fragmento de 1032 pb cujos tamanhos satildeo diferentes do fragmento
HindIIIHindIII do locus original (1776 pb) As hibridizaccedilotildees mostram bandas
compatiacuteveis com os tamanhos dos fragmentos HindIIIHindIII esperados para cada
situaccedilatildeo acima (FIGURA 21) Podemos observar que a sonda KAP7 somente
reconhece uma banda de tamanho esperado apenas no DNA do parasita selvagem
(canaleta 1 FIGURA 21) enquanto que bandas correspondentes aos genes neo e
higrosomente aparecem no DNA do mutante KAP7 (canaleta 2 FIGURA 21)
75
FIGURA 20 ndash REPRESENTACcedilAtildeO ESQUEMAacuteTICA DOS SIacuteTIOS DA ENZIMA HindIII NO LOCUS DO GENE KAP7 DE T cruzi CL Brener LEGENDA Este esquema representa esquematicamente em escala os genes kap3 neo e higro as regiotildees upstream e downstream e os siacutetios de clivagem da enzima KpnI
FIGURA 21 ANAacuteLISE DA ORGANIZACcedilAtildeO DOS GENES TCKAP7 NEO E HIGRO POR ENSAIO DO TIPO SOUTHERN BLOT LEGENDA A Autoradiograma e B Padrotildees dos fragmentos obtidos da digestatildeo do DNA com a enzima de restriccedilatildeo HindIII Foram utilizadas trecircs sondas TcKAP7 neomicina e higromicina 1) DNA de T cruzikap7kap7 (tipo selvagem) e 2) T cruzi kap7neokap7higro (duplo nocaute)
76
45 Comparaccedilatildeo da expressatildeo do gene TcKAP7 por western blot
O antisoro contra a proteiacutena TcKAP7 obtido apoacutes imunizaccedilatildeo dos
camundongos foi utilizado em ensaio do tipo western blot para avaliar se TcKAP7
ainda estava sendo expresso no T cruzi apoacutes o nocaute gecircnico
O que se observou foi novamente como esperado que a proteiacutena TcKAP7 natildeo eacute
mais expressa no T cruzi kap7neokap7higro (figura 22) Pode-se observar a presenccedila
de TcKAP7 ( aprox 28 kDa) no extrato das formas epimastigotas de T cruzi kap7kap7
(figura 22A) mas natildeo no extrato de epimastigotas de T cruzi
kap7neokap7higro (figura 22B)
FIGURA 22 COMPARACcedilAtildeO DA EXPRESSAtildeO DO GENE TcKAP7 POR WESTERN BLOT LEGENDA Imunoblot de extratos de epimastigotas de T cruzi kap7kap7 (A) e de T cruzi kap7neokap7higro (B) reagidos com anti-TcKAP7
46 Anaacutelise da morfologia e da ultraestrutura do cinetoplasto do mutante de T
cruzi para TcKAP7
Sabendo-se que TcKAP7 estaacute associada ao cinetoplasto e pode estar
envolvida na compactaccedilatildeo do kDNA do T cruzi como foi mostrado para as KAPs de
Crithidia fasciculata (XU amp RAY 1993 XU et al 1996 HINES amp RAY 1998) sua
ausecircncia poderia levar a alteraccedilatildeo na estrutura do DNA mitocondrial dos parasitas
nocauteados Portanto o primeiro passo foi verificar se havia alteraccedilotildees na
77
morforlogia do parasita Formas epimastigotas do mutante de T cruzi foram
analisadas ao microscoacutepio oacuteptico apoacutes coloraccedilatildeo Como pode ser observado na
figura 23 epimastigotas do mutante de T cruzi para TcKAP7 apresentam uma
morfologia fusiforme com o cinetoplasto caracteriacutestico em forma de barra localizado
anteriormente ao nuacutecleo natildeo se evidenciando portanto nenhuma alteraccedilatildeo em
relaccedilatildeo agrave morfologia dos parasitas do tipo selvagem
FIGURA 23 - COLORACcedilAtildeO PELO MEacuteTODO PANOacuteTICO RAacutePIDO DOS PARASITAS EPIMASTIGOTAS NOCAUTEADOS LEGENDA A) Formas epimastigotas B) Forma epimastigota em maior aumento
Formas epimastigotas de parasitas do tipo selvagem e nocauteados foram
entatildeo analisados pela teacutecnica de microscopia eletrocircnica de transmissatildeo para
visualizar com mais detalhe o cinetoplasto e verificar se sua estrutura estava
alterada pela ausecircncia da TcKAP7 (FIGURA 24) A figura 24A mostra um corte
ultrafino de um epimastigota de T cruzi do tipo selvagem que apresenta o
cinetoplasto compacto e em forma de bastatildeo caracteriacutestico de formas
epimastigotas sem nenhuma alteraccedilatildeo aparente O mesmo pode ser visto na figura
24B para o epimastigota de T cruzi nocauteado A disposiccedilatildeo estrutura e aspecto
do cinetoplasto de ambos os parasitas selvagem e nocauteado natildeo apresentaram
nenhuma diferenccedila entre si mostrando que mesmo apoacutes o nocaute da KAP7 a
estrutura do cinetoplasto permanece aparentemente inalterada
78
FIGURA 24 COMPARACcedilAtildeO ENTRE A ULTRAESTRUTURA DO CINETOPLASTO DO T cruzi DM28C TIPO SELVAGEM (A) E DO MUTANTE DE T cruzi PARA TcKAP7 (B) POR MICROSCOPIA ELETROcircNICA DE TRANSMISSAtildeO
79
47 Multiplicaccedilatildeo diferenciaccedilatildeo e infectividade do mutante de T cruzi para
TcKAP7
Os parasitas mutantes foram analisados a fim de verificar se alteraccedilotildees na
estrutura do kDNA pela ausecircncia de KAP7 natildeo estavam levando a alteraccedilotildees na
fisiologia do parasita alterando sua multiplicaccedilatildeo diferenciaccedilatildeo e infectividade
Inicialmente foi analisado o perfil da curva de crescimento das formas
epimastigotas Observou-se que natildeo havia diferenccedila na curva de crescimento dos
parasitas nocauteados em relaccedilatildeo ao parasita selvagem (FIGURA 25)
FIGURA 25 CURVA DE CRESCIMENTO DO MUTANTE DE T cruzi PARA TcKAP7 (KO) E DO T cruzi Dm28c SELVAGEM (WT)
LEGENDA Curva de crescimento do mutante de T cruzi para TcKAP7 () e do T cruzi Dm28c ()
Em seguida os parasitas nocauteados foram analisados quanto a sua capacidade
de diferenciaccedilatildeo em tripomastigotas metaciacuteclicos Foram realizadas contagens
diferenciais em cacircmara de Neubauer a partir do sobrenadante da metaciclogecircnese
a cada 24 h apoacutes a incubaccedilatildeo das ceacutelulas em meio TAU3AAG durante um periacuteodo
de 3 dias (72 h) A partir dessas contagens foram construiacutedos curva com a contagem
do nuacutemero de metaciacuteclicos ao longo dos trecircs dias (FIGURA 26)
Nenhuma alteraccedilatildeo foi observada quando os parasitas nocauteados foram
submetidos ao processo de metaciclogecircnese in vitro Ou seja pode-se afirmar que
80
mesmo apoacutes o nocaute do gene TcKAP7 as formas epimastigotas do parasita
conseguem se diferenciar em formas metaciacuteclicas
FIGURA 26 METACICLOGEcircNESE IN VITRO DE T cruzi Dm28c TIPO SELVAGEM E T cruzi NOCAUTEADO LEGENDA Metaciclogecircnese in vitro de T cruzi Dm28c tipo selvagem () e T cruzi nocauteado ()
Uma vez que os parasitas nocauteados foram capazes de se diferenciar de
epimastigota a tripomastigota metaciacuteclico resolveu-se investigar se estes eram
capazes de infectar ceacutelulas in vitro Foi possiacutevel perceber as formas amastigotas
dentro de ceacutelulas VERO em cultura mostrando que o parasita natildeo perdeu sua
capacidade de infecccedilatildeo (dados natildeo mostrados) Assim pode-se concluir que aleacutem
de sofrer diferenciaccedilatildeo os mutantes de T cruzi para KAP7 tambeacutem mantiveram sua
capacidade de infecccedilatildeo
48 Anaacutelise da funccedilatildeo do gene KAP7 de Trypanosoma brucei atraveacutes de
ensaios de RNA de interferecircncia
Para averiguar a importacircncia da proteiacutena TcKAP7 na biologia do parasita
recorremos a ensaios de RNA de interferecircncia (RNAi) jaacute que existe uma alta
similaridade entre TcKAP7 e seu ortoacutelogo em Trypanosoma brucei
81
A via de RNA de interferecircncia consiste em um mecanismo de silenciamento
gecircnico que para a ceacutelula funciona como sistema de defesa O mecanismo inicia-se
atraveacutes da expressatildeo de um RNA dupla fita (dsRNA) contendo uma sequecircncia
complementar ao gene de interesse Este dsRNA seraacute entatildeo clivado em pequenos
fragmentos de cerca de 22 a 25 nucleotiacutedeos atraveacutes da atividade de uma
ribonuclease do tipo III denominada Dicer Estes pequenos RNAs seratildeo
direcionados e permaneceratildeo unidos a um complexo proteico denominado RISC
(ldquoRNA-InducedSilencingComplexrdquo) Nesse complexo os pequenos RNAs de
interferecircncia (siRNA) ligam-se por complementaridade ao RNA mensageiro do gene
a ser inativado guiando-os para degradaccedilatildeo pelas nucleases presentes no
complexo impedindo a siacutentese da respectiva proteiacutena (ULLU et al 2002) O vetor
utilizado para promover o silenciamento do gene TbKAP7 foi o p2T7-177 Este
plasmiacutedeo integra-se aos minicromossomos do T brucei regiatildeo de repeticcedilotildees 177
(FOLDYNOVA-TRANTIRKOVA et al 2005) Este vetor apresenta dois promotores
de polimerase em oposiccedilatildeo induziacuteveis por tetraciclina flanqueando a sequumlecircncia de
interesse Desta forma satildeo geradas duas moleacuteculas de mRNA que pareadas
formam a moleacutecula de RNA fita dupla capaz de induzir a maquinaria de degradaccedilatildeo
A induccedilatildeo da inibiccedilatildeo de TbKAP7 atraveacutes de RNAi levou a uma diminuiccedilatildeo da
multiplicaccedilatildeo celular do parasita a partir do quarto dia do experimento (FIGURA 27)
Os resultados obtidos neste ensaio mostraram que a participaccedilatildeo da TbKAP7
no metabolismo do T brucei eacute essencial jaacute que o silenciamento do gene TbKAP7
levou agrave reduccedilatildeo da proliferaccedilatildeo celular do parasita
82
FIGURA 27 RNAi DE TbKAP7 INIBE O CRESCIMENTO DAS FORMAS PROCIacuteCLICAS DE T
brucei
LEGENDA Curva de crescimento de linhagem celular de RNAi de TbKAP7 em T brucei induzido por
tetraciclina As ceacutelulas foram diluiacutedas a uma densidade celular inicial de 1 X 106 ml na presenccedila e
ausecircncia de tetraciclina As densidades celulares foram determinadas pela contagem de ceacutelulas a
intervalos de 24 horas durante oito dias apoacutes iniacutecio de adiccedilatildeo de tetraciclina A linha com quadrados
mostra a curva de crescimento celular na presenccedila de tetraciclina (+TET) A linha com losangos
mostra a curva de crescimento celular na ausecircncia de tetraciclina (- TET)
49 Caracterizaccedilatildeo estrutural de TcKAP7
491 Produccedilatildeo recombinante de TcKAP7
O cultivo de E coli BL-21(DE3) STAR contendo o plasmiacutedeo pET28a-
TcKAP7 foi feito em meio LB a 37 oC com a induccedilatildeo da expressatildeo realizada a uma
densidade oacutetica de DO600 de 08 com a adiccedilatildeo de 05 mM de ITPG durante a noite a
37 oC
As ceacutelulas foram recuperadas por centrifugaccedilatildeo ressuspensas sonicadas e
centrifugadas para a purificaccedilatildeo de TcKAP7 atraveacutes da cromatografia de afinidade
em resina de Ni-NTA (Figura 28A) Foi possiacutevel obter grande quantidade de
83
amostra com grau de pureza alto como visualizado atraveacutes de anaacutelise por SDS-
PAGE (Figura 28B)
FIGURA28 PURIFICACcedilAtildeO DE TCKAP7 ATRAVEacuteS DE CROMATOGRAFIA DE AFINIDADE LEGENDA A) Cromatograma de afinidade B) SDS-PAGE da cromatografia de afinidade Os nuacutemeros agrave esquerda da figura representam os tamanhos das bandas do marcador de massa molecular (Benchmark) (Invitrogen) e P banda correspondente agrave TcKAP7 purificada Caixa em vermelho indica o pico que corresponde agrave fraccedilatildeo no SDS-PAGE
Devido agrave presenccedila de bandas com possiacuteveis contaminantes as fraccedilotildees que
continham a proteiacutena de interesse foram submetidas agrave purificaccedilatildeo por cromatografia
de troca iocircnica onde a purificaccedilatildeo eacute realizada baseada na afinidade por cargas
entre as proteiacutenas e a resina
Para esta purificaccedilatildeo utilizou-se a coluna SP Hitrap (GE Healthcare Life
Sciences) que eacute uma coluna de carga negativa Essa resina foi escolhida pois o pH
do tampatildeo em que se encontrava TcKAP7 era menor que o pI da proteiacutena Nessas
condiccedilotildees a carga superficial de TcKAP7 eacute positiva Para favorecer a interaccedilatildeo
TcKAP7 e resina foi feita uma diluiccedilatildeo de TcKAP7 para retirada de NaCl A eluiccedilatildeo
da proteiacutena foi realizada com um gradiente segmentado de tampatildeo B para
84
cromatografia de troca iocircnica TcKAP7 foi eluiacuteda com 68 do tampatildeo B (FIGURA
29)
FIGURA 29 PURIFICACcedilAtildeO DE TCKAP7 ATRAVEacuteS DE CROMATOGRAFIA DE TROCA IOcircNICA
LEGENDA A) Cromatografia de troca iocircnica B) SDS-PAGE da cromatografia de troca iocircnica Os nuacutemeros agrave esquerda da figura representam os tamanhos das bandas do marcador de massa molecular (Benchmark) (Invitrogen) e P banda correspondente agrave TcKAP7 purificada Caixa em vermelho indica o pico que corresponde agrave fraccedilatildeo no SDS-PAGE Curva em azul representa absorbacircncia em 280 nm Linha em verde indica concentraccedilatildeo de tampatildeo B para eluiccedilatildeo da amostra
410 Anaacutelise do estado oligomeacuterico de TcKAP7
A amostra purificada por troca iocircnica foi submetida agrave cromatografia de
exclusatildeo molecular tambeacutem chamada de gel filtraccedilatildeo que consiste na separaccedilatildeo
de biomoleacuteculas de acordo com seu tamanho e forma A coluna neste processo
conteacutem um poliacutemero com ligaccedilotildees cruzadas com poros de tamanho definido As
moleacuteculas maiores iratildeo migrar mais rapidamente que as menores pois natildeo satildeo
85
capazes de penetrar no interior dos poros da resina eluindo diretamente da coluna
As moleacuteculas menores por entrarem pelos poros da resina e levarem mais tempo
percorrendo os poros satildeo eluiacutedas mais tarde em relaccedilatildeo as que satildeo maiores
Ao comparar o volume de eluiccedilatildeo de TcKAP7 com o volume de eluiccedilatildeo de
proteiacutenas com massa molecular conhecidos (dados natildeo mostrados) foi possiacutevel
verificar que TcKAP7 parece ser um monocircmero em soluccedilatildeo Para confirmar esses
dados a mesma amostra foi submetida ao experimento de espalhamento dinacircmico
de luz (DLS)
O DLS eacute uma teacutecnica que se estima a distribuiccedilatildeo de tamanho das
populaccedilotildees de partiacuteculas que estatildeo presentes na amostra permitindo a detecccedilatildeo de
agregados proteicos ou de diferentes estados de oligomerizaccedilatildeo na amostra
indicando heterogeneidade Eacute importante ressaltar que para maiores chances de
sucesso em ensaios de cristalizaccedilatildeo a amostra deve encontrar-se monodispersa
Os dados de DLS mostram que 911 da massa de TcKAP7 analisada
apresenta um raio hidrodinacircmico (Rh) de 39 nm que representa uma massa
aparente de 29 kDa (FIGURA 30) Isto eacute condizente com um monocircmero cuja massa
teoacuterica seria de aproximadamente 28 kDa (incluindo a cauda de 6 histidinas) de
acordo com a prediccedilatildeo feita pelo servidor Expasy Protparam
(httpwebexpasyorgprotparam)A polidispersividade da amostra foi baixa
indicando que a mesma estava homogecircnea
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0 1 2 3 4 5 6 7
M
assa
Rh (nm)
fr80
fr82
fr84
fr85
86
FIGURA 30 ANAacuteLISE POR DLS DE TCKAP7 LEGENDA Anaacutelise por DLS de TcKAP7 contendo as fraccedilotildees obtidas na cromatografia de afinidade As fraccedilotildees 80 84 e 85 apresentam um raio hidrodinacircmico (Rh) de 39 nm
Aleacutem disso tambeacutem foram obtidas informaccedilotildees sobre o envelope de TcKAP7
a partir dos dados coletados atraveacutes da teacutecnica de SAXS mostrando que o raio de
giro (Rg) do envelope de TcKAP7 estaacute de acordo com o estimado por DLS (FIGURA
31)
FIGURA 31 ENVELOPE MOLECULAR DE SAXS
411 Anaacutelise do conteuacutedo de estrutura secundaacuteria de TcKAP7 recombinante
Atraveacutes da anaacutelise do espectro de dicroiacutesmo circular pode-se verificar o
conteuacutedo de estrutura secundaacuteria da proteiacutena e inferir enovelamento da proteiacutena
recombinante Os dados obtidos para a TcKAP7 revelaram a presenccedila de estruturas
α caracterizadas pelos miacutenimos pronunciados em 208 nm e 222 nm e de estruturas
coiled na amostra de TcKAP7 caracterizada pelos miacutenimos pronunciados em 205
nm (FIGURA 32) Este resultado estaacute de acordo a prediccedilatildeo de estrutura secundaacuteria
87
realizada pelo servidor PSIPRED (httpbioinfcsuclacukpsipred (FIGURA 33)
Esses resultados sugerem que a proteiacutena recombinante possui correto
enovelamento
FIGURA 32 ESPECTRO DE DICROIacuteSMO CIRCULAR DE TcKAP7
FIGURA 33 PREDICcedilAtildeO DE ESTRUTURA SECUNDAacuteRIA DE TcKAP7
412 Anaacutelise estrutural de TcKAP7
A fim de obter-se a estrutura tridimensional de TcKAP7 por cristalografia de
raios-X foram realizados ensaios de cristalizaccedilatildeoFoi possiacutevel observar a formaccedilatildeo
de um cristal em apenas uma condiccedilatildeo Imidazol 01 M Polietilenoglicol (PEG) 8000
10 wv e Acetato de caacutelcio 02 M
A visualizaccedilatildeo atraveacutes de luz ultra-violeta atraveacutes do equipamento Rock
Imager Fomulatrix permitiu identificaacute-lo como cristal de proteiacutena jaacute que este
diferencia-se de cristal de sal pela fluorescecircncia quando excitado em comprimento
de onda de 280 nm
-20
-18
-16
-14
-12
-10
-8
-6
-4
-2
0
2
200 210 220 230 240 250 260
Ɵ M
RV
x 1
03
(de
g cm
2d
mo
l-1)
Comprimento de onda (nm)
88
O perfil do cristal pode ser visualizado na figura 34 Esse cristal encontra-se
pequeno e mal-formado Aleacutem disso os meacutetodos para a determinaccedilatildeo estrutural de
uma estrutura ineacutedita (sem homologia com estruturas conhecidas) necessitam de
mais de um cristal Dessa forma foram realizados refinamentos dessas condiccedilotildees
iniciais visando aumentar q quantidade de cristais aumentar seu tamanho e
melhorar sua organizaccedilatildeo A concentraccedilatildeo de PEG (5 A 10) e do pH (6 a 9) com
intervalos de 1 unidade foram alterada Entretanto mesmo assim natildeo foi possiacutevel a
obtenccedilatildeo de cristais adequados para a difraccedilatildeo de raios X e novos refinamentos
seratildeo necessaacuterios
FIGURA 34 CRISTAL DE TcKAP7 DE T CRUZI LEGENDA AObtenccedilatildeo do cristal de TcKAP7 na condiccedilatildeo de Imidazol 01 M Polietilenoglicol (PEG) 8000 10 wv e Acetato de caacutelcio 02 M e B Cristal de TcKAP7 visto sob luz ultravioleta
Uma vez que natildeo foi possiacutevel durante o desenvolvimento desse projeto a
obtenccedilatildeo da estrutura cristalograacutefica de TcKAP7 procedeu-se com a construccedilatildeo de
seu modelo molecular
A modelagem molecular eacute uma ferramenta que permite a obtenccedilatildeo de
modelos da estrutura tridimensional de uma determinada proteiacutena com base em
homologia sequencial ou estrutural com proteiacutenas cujas estruturas tridimensional
foram experimentalmente resolvidas
Para a construccedilatildeo do modelo foi utilizado o programa MODELLER (SALI amp
BLUNDELL 1993) este programa eacute utilizado para a modelagem por homologia a
estruturas tridimensionais de proteiacutenas O programa automaticamente constroacutei um
modelo baseado na anaacutelise de um alinhamento de sequecircncias entre a proteiacutena para
a qual se deseja construir o modelo e uma proteiacutena relacionada cuja estrutura
tridimensional jaacute foi resolvida Nesse caso foram utilizadas estruturas de duas
A B
89
proteiacutenas como molde para a construccedilatildeo da estrutura de TcKAP7 A estrutura da
proteiacutena HMGB1(coacutedigo de acesso no banco de dados de proteiacutenas 2GZK)
(wwwpdborg) para a porccedilatildeo amino-terminal e a estrutura do fator A de transcriccedilatildeo
mitocondrial (coacutedigo de acesso 3TQ6) para a porccedilatildeo carboxi-terminal da proteiacutena
(FIGURA 35A) Duas proteiacutenas foram selecionadas para a construccedilatildeo do modelo de
TcKAP7 visto que a similaridade de sequencia entre TcKAP7 e proteiacutenas com
estruturas resolvidas eacute bastante baixo A similaridade sequencial de TcKAP7 e
proteiacutena HMGB1 eacute de 224 e entre TcKAP7 e o fator A de transcriccedilatildeo mitocondrial
eacute de 264 No entanto ambas proteiacutenas possuem alta similaridade em relaccedilatildeo agrave
estrutura secundaacuteria (mais de 90) Para aumentar a confiabilidade do modelo
utilizamos uma proteiacutena para construir a sequencia N-terminal de TcKAP7
(aminoaacutecidos 1-184) e outra para o C-terminal (aminoaacutecidos 185-248)
A qualidade do modelo pode ser avaliada por exemplo atraveacutes de graacuteficos e
tabelas que analisam restriccedilotildees quiacutemicas e fiacutesicas de cada aacutetomo constituinte do
modelo Neste trabalho foi utilizado o graacutefico de Ramachandran (FIGURA 35B) nele
pode-se visualizar todas as combinaccedilotildees possiacuteveis de acircngulos dieacutedricos Ψ (psi)
versus os Φ (phi) nos aminoaacutecidos de um polipeptiacutedeo e que contribuem para a
conformaccedilatildeo das estruturas das proteiacutenas (RAMACHANDRAN et al 1963) Dos 230
resiacuteduos apenas 5 estatildeo em regiotildees natildeo permitidas do graacutefico Esse eacute um
excelente valor pois eacute similar ao valor meacutedio encontrado para estruturas
experimentalmente determinadas com resoluccedilatildeo de no miacutenimo 20 Aring
(httpwwwebiacukthornton-srvdatabasesprofunc)
Tambeacutem eacute possiacutevel visualizar a topologia de TcKAP7 (FIGURA 35 C) que
mostra as regiotildees de α-heacutelices e regiotildees de coiled presentes na proteiacutena
corroborando com os dados obtidos na espectroscopia de dicroiacutesmo circular
90
FIGURA 35 ESTRUTURA DE TcKAP7 LEGENDA AModelo tridimensional de KAP7 B Graacutefico de Ramachandran e C Topologia de TcKAP7
A anaacutelise da superfiacutecie eletrostaacutetica de TcKAP7 mostra que existem regiotildees
ricas em aminoaacutecidos com cargas positivas que podem conferir afinidades agrave outras
proteiacutenas com carga carga superficial negativa ou mesmo aacutecidos nucleicos (FIGURA
36)
91
FIGURA 36 SUPERFIacuteCIE ELETROSTAacuteTICA DE TcKAP7 LEGENDA Visualizaccedilatildeo de diferentes regiotildees de TcKAP7 Vermelho potencial negativo Azul potencial positiva Branco Neutro
413 Investigaccedilatildeo de possiacuteveis funcionalidades baseadas na estrutura de
TcKAP7
4131 Prediccedilatildeo de funccedilatildeo paraTcKAP7
92
A prediccedilatildeo de funccedilatildeo para TcKAP7 foi realizada a partir do enovelamento de
proteiacutenas utilizando o servidor Profunc (httpwwwebiacukthornton-
srvdatabasesprofunc) O objetivo do servidor ProFunc eacute ajudar na identificaccedilatildeo de
uma possiacutevel funccedilatildeo bioquiacutemica de uma proteiacutena a partir da sua estrutura
tridimensional Ele utiliza uma seacuterie de meacutetodos incluindo comparaccedilatildeo de
enovelamento conservaccedilatildeo dos resiacuteduos e modelos 3D funcionais tanto para
identificar provaacuteveis siacutetios ativos da proteiacutena quanto possiacuteveis homoacutelogos no Protein
Data Bank (PDB) Neste procedimento tenta-se ajustar a estrutura da proteiacutena de
interesse aos tipos de enovelamentos de proteiacutenas conhecidas Atualmente mais de
1000 tipos jaacute foram registrados e depositados em bibliotecas de enovelamentos
Sabe-se que o alinhamento estrutural entre proteiacutenas consideradas de uma
mesma famiacutelia mesmo que seja apenas na regiatildeo do siacutetio ativo pode ser um
importante meacutetodo para se inferir a funccedilatildeo da sequecircncia em estudo (LASKOWSKI et
al 2003) A evoluccedilatildeo tende a conservar funccedilotildees que dependem mais diretamente
das estruturas 3D que das similaridades entre as sequecircncias de aminoaacutecidos das
proteiacutenas (SANCHEZ et al 2000)
Neste trabalho as quatro estruturas que possuem maior similaridade
estrutural com TcKAP7 estatildeo depositadas no Protein Data Bank (PDB) com os
coacutedigos 3TQ6 4NOD 3TMM 4NNU Todas as estruturas satildeo referentes agrave proteiacutena
TFAM (fator transcricional A mitocondrial)
As estruturas proteicas foram obtidas no banco de dados puacuteblicos de
proteiacutenas PDB (Protein Data Bank) e submetidas a um alinhamento estrutural com o
modelo de TcKAP7 (FIGURA 35A) no programa WinCoot Esse alinhamento pode
ser visualizado na figura 37 As regiotildees em vermelho representam as regiotildees de
TcKAP7 que apresentam interaccedilatildeo com DNA pois se alinham com as regiotildees de
ligaccedilatildeo agrave DNA das outras proteiacutenas e as regiotildees em azul representam regiotildees sem
homologia com as demais
Esse resultado sugere que TcKAP7 pode interagir com DNA com isso estes
dados podem ser utilizados para nortear mais estudos sobre a interaccedilatildeo das
proteiacutenas KAPrsquos com o DNA do cinetoplasto de T cruzi
93
FIGURA 37 ALINHAMENTO ESTRUTURAL DE 3TQ6 4NOD 3TTM 4NNU E TCKAP7 LEGENDA Em vermelho encontram-se as regiotildees de TcKAP7 que podem interagir com DNA (Resiacuteduos 1-67 e 140-166) e em azul regiotildees sem homologia com as demais
4132 Anaacutelises preliminares da possiacutevel interaccedilatildeo entre TcKAP7 e kDNA
As prediccedilotildees estruturais sugeriram que a proteiacutena TcKAP7 possui motivos
similares agrave proteiacutenas que interagem com DNA No entanto a sequecircncia de
aminoaacutecidos entre as proteiacutenas eacute bastante baixa Como a funccedilatildeo de TcKAP7
permanece obscura foram realizados alguns ensaios para tentar verificar a
possibilidade desta proteiacutena interagir com kDNA Para isto utilizou-se a teacutecnica de
dicroiacutesmo circular para avaliar se a presenccedila de kDNA poderia resultar em
alteraccedilotildees estruturais em TcKAP7 o que seria uma evidecircncia da possiacutevel interaccedilatildeo
entre esta proteiacutena e o aacutecido nucleico
Foram realizadas medidas de dicroiacutesmo circular com amostras de TcKAP7
kDNA e TcKAP7 na presenccedila de kDNA Para a anaacutelise de dados foi realizado o
somatoacuterio das curvas obtidas com as amostras de TcKAP7 e kDNA separadamente
Este somatoacuterio resultou em uma curva teoacuterica que indica o perfil teoacuterico de uma
amostra contendo TcKAP7 e kDNA sem interaccedilotildees presentes Aacute essa curva foi
sobreposta a curva experimental da medida de dicroiacutesmo circular de TcKAP7 na
94
presenccedila de kDNA A figura 38 ilustra essa sobreposiccedilatildeo onde pode-se verificar que
as curvas natildeo se sobrepotildeem portanto alteraccedilotildees estruturais ocorrem em TcKAP7
na presenccedila de kDNA
FIGURA 38 ESPECTRO DE DICROIacuteSMO CIRCULAR DE TcKAP7 LEGENDA Em azul encontra-se o espectro experimental de TcKap7 na presenccedila de DNA em vermelho o espectro teoacuterico de TcKAP7 e DNA
Para investigar mudanccedilas estruturais associadas a interaccedilatildeo com kDNA foi
realizada uma coleta de dados de SAXS na presenccedila de 1ug de kDNA
A comparaccedilatildeo dos modelos de baixa resoluccedilatildeo por SAXS indica uma
diferenccedila conformacional pontual da proteiacutena na presenccedila de kDNA As figuras 28 e
29 mostram os envelopes da proteiacutena TcKAP7na ausecircncia (FIGURAS 39A e 40A) e
presenccedila de kDNA de T cruzi (FIGURA 39B e FIGURA 40B) Percebe-se uma
diferenccedila de densidade eletrocircnica na regiatildeo da heacutelice (Residuos 140 - 166
evidenciados em vermelho) No envelope de TcKAP7 ela eacute bastante flexiacutevel e natildeo eacute
observada densidade eletrocircnica nessa regiatildeo no entanto na presenccedila de kDNA
essa mesma regiatildeo mostra-se mais riacutegida e eacute possiacutevel estimar seu posicionamento
baseado na densidade eletrocircnica Aleacutem disso essa heacutelice eacute predita como interatora
de DNA com base nas anaacutelises estruturais previamente realizadas nesse trabalho
Esses dados sugerem uma mudanccedila conformacional da proteiacutena na presenccedila
do kDNA fazendo com que esta mude seu arranjo estrutural para permanecer ligada
agrave moleacutecula de DNA sugerindo uma interaccedilatildeo entre TcKAP7 e DNA do cinetoplasto
-22
-17
-12
-7
-2
3
200 210 220 230 240 250 260
ϴM
RW
x 1
03
(de
g cm
-2 d
mo
l-1)
Comprimento de onda (nm)
Kap7+DNA
95
de T cruzi Esses dados corroboram com o que foi visto na superfiacutecie eletrostaacutetica
(FIGURA 36) e no alinhamento estrutural (FIGURA 37)
FIGURA 39 ENVELOPE MOLECULAR DETcKAP7 LEGENDA A Monocircmero de TcKAP7 ajustado ao envelope de SAXS B Monocircmero de TcKAP7 + kDNA ajustado ao envelope de SAXSResiduos 140- 166 evidenciados em vermelho
96
FIGURA 40 ENVELOPE MOLECULAR DE TcKAP7 VISTO EM DIFERENTES AcircNGULOS LEGENDA A Monocircmero de TcKAP7 ajustado ao envelope de SAXS B Monocircmero de TcKAP7 + kDNA ajustado ao envelope de SAXS Residuos 140- 166 evidenciados em vermelho
97
5 DISCUSSAtildeO
O Trypanosoma cruzi pertence a um grupo que divergiu muito cedo na
linhagem eucarioacutetica apresentando diversas caracteriacutesticas uacutenicas em relaccedilatildeo a
outros eucariotos Uma dessas caracteriacutesticas eacute a presenccedila de uma mitococircndria
uacutenica ramificada pelo corpo do protozoaacuterio contendo uma regiatildeo especializada o
cinetoplasto onde reside o DNA mitocondrial tambeacutem conhecido como kDNA O
kDNA eacute composto por uma rede de moleacuteculas interligadas entre si os maxiciacuterculos e
os miniciacuterculos (SHAPIRO amp ENGLUND 1995) Mais de 30 proteiacutenas envolvidas na
replicaccedilatildeo e na manutenccedilatildeo do kDNA jaacute foram identificadas e acredita-se que um
nuacutemero aproximado de 100 proteiacutenas muitas delas presentes apenas em
cinetoplastiacutedeos possam estar envolvidas nesses processos (LIU et al 2005) A
maioria dessas proteiacutenas foi identificada em T brucei e C fasciculata e
possivelmente vaacuterias delas principalmente aquelas envolvidas em replicaccedilatildeo
devem estar codificadas no genoma do T cruzi
Apesar de serem conhecidos muitos dos componentes da maquinaria de
replicaccedilatildeo dos miniciacuterculos e maxiciacuterculos natildeo se pode dizer o mesmo para as
proteiacutenas envolvidas na manutenccedilatildeo da estrutura do kDNA Com exceccedilatildeo de 4
proteiacutenas com caracteriacutesticas de histonas H1 (KAP1 a 4) encontradas associadas ao
cinetoplasto de C fasciculata pouco ainda eacute conhecido sobre as proteiacutenas que
participam da organizaccedilatildeo do kDNA em outros tripanosomatiacutedeos
Zavala-Castro e colaboradores (2002) identificaram sete proteiacutenas variando
de 19 a 31 kDa associadas ao kDNA de formas epimastigotas de T cruzi a partir
de kDNA extraiacutedo de ceacutelulas fixadas com formaldeiacutedo Os tamanhos observados satildeo
compatiacuteveis com aqueles das KAPs encontradas por Xu e Ray (1993) usando
experimento similar em C fasciculata entretanto nenhuma das possiacuteveis KAPs
descritas por Zavala-Castro e colaboradores foi caracterizada
Noacutes iniciamos estudos objetivando identificar proteiacutenas envolvidas na
organizaccedilatildeo e segregaccedilatildeo do kDNA de T cruzi a partir dos dados fornecidos pelo
sequenciamento do genoma desse parasita fazendo uma comparaccedilatildeo com as
KAPs de C fasciculata Estudos realizados por Cavalcanti e colaboradores (2009)
usando como modelo as sequecircncias de KAPs de C fasciculata identificaram 35
proteiacutenas relacionadas em diferentes tripanosomatiacutedeos cujos genomas estatildeo
sequenciados (11 em T cruzi 7 em L braziliensis 6 em L major e L infantum e 5
98
em T brucei) Essas sequecircncias puderam ser agrupadas em 7 tipos diferentes de
KAPs (KAP1 a 7) Das 7 KAPs T cruzi possui 5 (TcKAP3 a 7) cuja a sintenia
gecircnica eacute uma das caracteriacutesticas marcantes jaacute que alguns genes divergem em
relaccedilatildeo ao tamanho e portanto no tamanho da proteiacutena codificada As KAPs de T
cruzi e T brucei satildeo maiores do que as de C fasciculata e Leishmania spp Isso
pode sugerir que KAPs possam ter evoluiacutedo para um tamanho que comporte
basicamente suas funccedilotildees de associaccedilatildeo com o kDNA de maneira mais eficiente
Os resultados obtidos por Cavalcanti et al (2009) para TcKAP4 e TcKAP6
mostraram que em epimastigotas e amastigotas estas duas proteiacutenas estatildeo
distribuiacutedas ao longo de toda a rede de kDNA consistente com o que foi observado
em C fasciculata (XU et al 1996 HINES amp RAY 1998) poreacutem CfKAP4 tambeacutem
apresentou um padratildeo de marcaccedilatildeo nos poacutelos opostos do kDNA sugerindo que
essa KAP em particular se associe aos miniciacuterculos receacutem-replicados antes de sua
reintegraccedilatildeo agrave rede de kDNA (XU et al 1996) Contudo em tripomastigotas de T
cruzi estas duas proteiacutenas estatildeo distribuiacutedas na periferia da rede de kDNA
(CAVALCANTI et al 2009) indicando que diferente de C fasciculata elas
apresentam uma dinacircmica de associaccedilatildeo que depende da forma evolutiva do
parasita possivelmente refletindo distintas interaccedilotildees com proteiacutenas da rede de
kDNA em epimastigotas e tripomastigotas No presente trabalho ampliamos o
conhecimento sobre as KAPs de T cruzi estudando o papel da KAP7 na fisiologia
desse parasita
Em C fasciculata a regulaccedilatildeo da expressatildeo de vaacuterios genes que codificam
proteiacutenas mitocondriais ocorre durante o ciclo celular em parte por uma sequumlecircncia
consenso [(CA)AUAGAA(GA)] presente nas regiotildees 5rsquo e 3rsquo-UTR dos respectivos
mRNAs (BROWN amp RAY 1997 MAHMOOD et al 1999 MAHMOOD amp RAY 1998
PASION et al 1996) O mesmo foi observado para L major onde uma sequecircncia
parecida com aquela encontrada em C fasciculata (CATAGA) foi identificada nas
regiotildees 5rsquo e 3rsquo de vaacuterios genes cuja a expressatildeo era maior na fase S do ciclo celular
(ZICK et al 2005) Analisando as regiotildees 5rsquo e 3rsquo do transcrito do gene TOP2 de T
cruzi que codifica a topo II mitocondrial descrito por Fragoso e Goldenberg (1992)
tambeacutem podemos observar a sequecircncia CATAGA repetida duas vezes na regiatildeo
5rsquoUTR e uma vez na regiatildeo 3rsquo-UTR do transcrito desse gene
Como relatamos neste trabalho a sequecircncia da regiatildeo 5rsquo-UTR do transcrito
TcKAP7 natildeo mostrou nenhum elemento com as caracteriacutesticas daquele envolvido na
99
regulaccedilatildeo de genes expressos na fase S do ciclo celular de outros
tripanosomatiacutedeos
Em relaccedilatildeo agrave localizaccedilatildeo de TcKAP7 verificamos atraveacutes de ensaios de
imunofluorescecircncia a distribuiccedilatildeo de TcKAP7 na regiatildeo dos poacutelos da rede de kDNA
das formas epimastigotas de T cruzi poreacutem ainda natildeo analisamos como esta
proteiacutena estaacute distribuiacuteda nas formas tripomastigotas que possuem a rede de kDNA
com formato arredondado e menos compactada
A localizaccedilatildeo de KAP7 na regiatildeo dos poacutelos do cinetoplasto de T cruzi
sugere que ela tenha funccedilotildees na replicaccedilatildeo da rede de kDNA pois nessa regiatildeo
estatildeo concentradas diversas proteiacutenas necessaacuterias para finalizaccedilatildeo do processo de
replicaccedilatildeo de miniciacuterculos
Para a construccedilatildeo do modelo molecular de TcKAP7 foram utilizadas
estruturas de duas proteiacutenas a estrutura da proteiacutena HMGB1 (2GZK) para a porccedilatildeo
amino-terminal e a estrutura da proteiacutena fator A de transcriccedilatildeo mitocondrial (3TQ6)
para a porccedilatildeo carboxi-terminal da proteiacutena ambas apresentam alta similaridade em
relaccedilatildeo agrave estrutura secundaacuteria (mais de 90) e tratam-se de proteiacutenas de um
mesmo grupo HMG (High-mobility group) Em T brucei TbKAP6 uma proteiacutena do
grupo HMG estaacute envolvida na replicaccedilatildeo e manutenccedilatildeo do kDNA (WANG et al
2014) Baseado nesses dados juntamente com os dados da imunofluorescecircncia
indireta pode-se sugerir um papel de TcKAP7 na replicaccedilatildeo da rede de kDNA
Embora ainda natildeo saibamos como KAP7 se associa com o kDNA de T
cruzi eacute possiacutevel que isso ocorra de duas maneiras atraveacutes de ligaccedilotildees
eletrostaacuteticas natildeo-especiacuteficas ou de interaccedilotildees com regiotildees especiacuteficas dos
miniciacuterculos
Atraveacutes de ensaios de SAXS foi possiacutevel perceber que a proteiacutena sofre
alteraccedilotildees conformacionais na presenccedila do kDNA sugerindo sua interaccedilatildeo com
esse aacutecido nucleacuteico Esta interaccedilatildeo pode ser eletrostaacutetica uma vez que a anaacutelise da
superfiacutecie eletrostaacutetica de TcKAP7 mostrou a predominacircncia de regiotildees ricas em
aminoaacutecidos com cargas positivas que podem conferir afinidades agrave outras proteiacutenas
com carga superficial negativa ou mesmo aacutecidos nucleicos mais uma vez sugerindo
a interaccedilatildeo com kDNA
Poreacutem natildeo se pode descartar a possibilidade de que a interaccedilatildeo de TcKAP7
com o kDNA seja atraveacutes de interaccedilotildees com regiotildees especiacuteficas dos miniciacuterculos
Nos tripanosomatiacutedeos a rede de kDNA assume a forma de um disco achatado
100
perpendicular ao flagelo onde os miniciacuterculos estatildeo alinhados em fibrilas orientadas
paralelamente ao eixo do disco (LIU et al 2005) Acredita-se que a ordenaccedilatildeo e
compactaccedilatildeo dos miniciacuterculos estatildeo relacionadas agrave proacutepria estrutura da moleacutecula de
miniciacuterculo Os miniciacuterculos apresentam regiotildees ricas em A+T que podem causar
curvaturas na moleacutecula (MARINI et al 1984 NTAMBI et al 1984) facilitando sua
inserccedilatildeo de forma ordenada no disco de kDNA aleacutem disso possuem regiotildees
conservadas onde estatildeo localizadas as origens de replicaccedilatildeo Essas regiotildees por
sua vez podem ser reconhecidas por proteiacutenas tais como a KAP7 que ajudam a
estabilizar a estrutura Os resultados com C fasciculata mostram que KAP2 3 e 4 se
ligam em regiotildees especiacuteficas dos miniciacuterculos ricas em A+T mas que natildeo satildeo
aquelas que geram a curvatura das moleacuteculas (XU et al 1996) Contudo KAP1 se
liga de maneira inespeciacutefica aos miniciacuterculos (HINES amp RAY 1998) Aleacutem disso
existe a sequecircncia universal de miniciacuterculo (UMS) e as proteiacutenas que se ligam a
essa sequecircncia (UMSBP) as quais podem participar de interaccedilotildees com as KAPrsquos
Em C fasciculata CfKAP3 sozinha consegue condensar a rede de kDNA e inibir a
decatenaccedilatildeo pela enzima topo II Poreacutem a interaccedilatildeo entre CfKAP3 e CfUMSBP
pode descondensar a rede de kDNA e reestabelecer a decatenaccedilatildeo mediada pela
topo II indicando que as proteiacutenas KAPrsquos dos tripanosomatiacutedeos podem apresentar
diferentes funccedilotildees em diferentes espeacutecies (KAPELLER et al 2011)
Para investigar a importacircncia de TcKAP7 no T cruzi e seu envolvimento ou
natildeo com o rearranjo topoloacutegico do kDNA durante o processo de diferenciaccedilatildeo do
parasita realizamos a deleccedilatildeo do gene TcKAP7 Nenhuma alteraccedilatildeo estrutural ou
morfoloacutegica na rede de kDNA foi observada no mutante de T cruzi para TcKAP7 Do
mesmo modo o parasita mutante natildeo apresentou perfil de crescimento alterado e
foi capaz de se diferenciar nas formas tripomastigotas metaciacuteclicas e infectar ceacutelulas
VERO onde se diferenciaram em formas amastigotas O mesmo foi visto quando foi
realizado o nocaute do gene TcKAP3 (DE SOUZA et al 2010)
Uma das hipoacuteteses para explicar esse fato eacute que alguma outra KAP de T
cruzi possa estar assumindo o papel da TcKAP7 talvez a TcKAP4 que se localiza
nos poacutelos do cinetoplasto quando da inserccedilatildeo dos miniciacuterculos na rede apoacutes serem
replicados na regiatildeo cinetoflagelar A redundacircncia no papel das KAPs faz com que a
rede de kDNA seja compactada e segregada corretamente mesmo na ausecircncia de
uma delas (DE SOUZA et al 2010) Sabe-se que o nocaute do gene Cfkap2 ou do
gene Cfkap3 separadamente natildeo mostrou nenhuma alteraccedilatildeo no fenoacutetipo de C
101
fasciculata Poreacutem a deleccedilatildeo de ambos os genes causou diversas alteraccedilotildees
aumento nos niacuteveis de mRNAs mitocondriais reduccedilatildeo na respiraccedilatildeo inibiccedilatildeo da
divisatildeo celular e acuacutemulo de ceacutelulas com morfologias anormais (AVLIYAKULOV et
al 2004)
Com o intuito de complementar os estudos para a caracterizaccedilatildeo do gene
TcKAP7 foram realizados ensaios de RNA de interferecircncia visando analisar a
funccedilatildeo do gene TbKAP7 ortoacutelogo em T brucei jaacute que a maquinaria de RNAi em T
cruzi eacute inexistente (DA ROCHA et al 2003) Com isso foi visto que a participaccedilatildeo da
TbKAP7 no metabolismo do T brucei eacute essencial jaacute que o silenciamento do gene
TbKAP7 levou agrave reduccedilatildeo da proliferaccedilatildeo celular do parasita corroborando com os
dados encontrados para TbKAP6 (WANG et al 2014)
Esperamos que o conhecimento das diversas moleacuteculas envolvidas na
organizaccedilatildeo e replicaccedilatildeo da rede de kDNA assim como o entendimento dos
mecanismos fisioloacutegicos que ocorrem nesta estrutura tatildeo peculiar que eacute o
cinetoplasto dos tripanosomatiacutedeos possam nos ajudar a esclarecer vaacuterios aspectos
relacionados a biologia destes eucariotos primitivos e a evoluccedilatildeo do genoma
mitocondrial ao longo do processo evolutivo
102
6 CONCLUSOtildeES
Com base nos resultados observados neste trabalho foi possiacutevel concluir
1 ndash A proteiacutena TcKAP7 eacute uma proteiacutena associada ao cinetoplasto de T
cruzi e possui caracteriacutesticas que a identificam como KAPs do tipo histona H1
incluindo seu tamanho e sua composiccedilatildeo de aminoaacutecidos e sua superfiacutecie
eletrostaacutetica
2 ndash TcKAP7 estaacute localizada nos poacutelos do cinetoplasto de T cruzi podendo
estar envolvida na replicaccedilatildeo dos miniciacuterculos
3 - TcKAP7 sofre mudanccedilas conformacionais na presenccedila do kDNA de T
cruzi evidenciando sua interaccedilatildeo com o aacutecido nucleico
4 ndash O mutante de T cruzi para TcKAP7 natildeo apresentou alteraccedilatildeo na
estrutura do cinetoplasto e na morfologia do parasita
5 ndash A proliferaccedilatildeo e a diferenciaccedilatildeo do T cruzi natildeo foram alteradas quando
o parasita teve o gene TcKAP7 deletado do genoma
6 ndash O silenciamento do gene TbKAP7 eacute essencial no metabolismo do T
brucei levando agrave reduccedilatildeo da proliferaccedilatildeo celular do parasita
103
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AGRADECIMENTOS
Agrave Deus em primeiro lugar por me dar sauacutede vitalidade e acircnimo sempre
E por sempre estar comigo
Ao Dr Stenio Perdigatildeo Fragoso pela orientaccedilatildeo confianccedila dedicaccedilatildeo e
amizade Afinal satildeo 12 anos hein chefe Como vocecirc ainda me aguenta Obrigada
por tudo aprendi e continuo aprendendo muito com vocecirc
Agrave Dra Tatiana Arruda Campos Brasil que me ajudou desde o primeiro
momento em que eu entrei no Laboratoacuterio de Proteiacutenas com seu jeito meigo e
atencioso e com sua experiecircncia me mostrou um mundo novo por qual eu me
apaixonei Sempre com muita paciecircncia me explicava tudo tim tim por tim tim e me
ajudou muuuito na escrita da tese Obrigada Tati
Agrave Dra Lia Medeiros que me ajudou muito com as microscopias Fizemos ateacute
o sacrifiacutecio de ir visualizar uma MET na UFSC em Floripa que chato neacute Brigadatildeo
Lia pela paciecircncia e boa vontade
Ao Dr Paulo Carvalho e a Dra Juliane Fischer que me ajudaram em
experimentos e anaacutelises que nem entraram na tese Sempre muito atenciosos
Obrigada
Aos meus queridos amigos do LAB2 Aqueles que jaacute se foram (Andreacute
Aleatoacuterio Lari Mauriacutecio Baacuterbara Odineacuteia Paacute ) e aqueles que estatildeo laacute ateacute hoje
(Didi Gi Vanessa Felipe Aline Claudinha) Obrigada por fazerem o trabalho ficar
mais divertido Aos meus companheiros de doc Mocircnica e Fernando o trio parada
dura passou por muita coisa junto e tem muita histoacuteria pra contar Obrigada gente
adoro vocecircs
Agraves minhas queridas amigas mais ldquoexperientesrdquo que moram no meu coraccedilatildeo
Aldinha e Dani obrigada por todos os momentos que passamos juntas no lab e fora
do lab obrigada pela a ajuda que sempre me deram sem esperar nada em troca
vocecircs sabem que seus conselhos sempre foram muito valiosos pra mim Obrigada
amigas vocecircs satildeo iacutempares
Agrave minha querida irmatildezinha Rocirc que nasceu no mesmo dia soacute que eacute mais
velha hahahahaha Obrigada amiga por tudo por todo esse tempo pelos
experimentos pelas confissotildees pelas gargalhadas Vocecirc eacute uacutenica
Agrave Pri Hira Mari Serpeloni Haruo Daisy Vanessa que sempre me ajudavam
quando eu precisava ou fazer um experimento ou jogar conversa fora
Aos meus amigos doutores atleticanos Michel e Henrique que me ajudaram
em vaacuterios experimentos e anaacutelises Obrigada por estarem sempre dispostos em
ajudar Vocecircs satildeo atleticanos mas satildeo gente boa Obrigada
Ao Giovany pela imensa ajuda com os camundongos sempre disposto em
ajudar e ensinar
Ao Nilson Silvio Tacircnia Sibelli por toda a ajuda pela amizade e pela
paciecircncia e competecircncia Ah e pelas histoacuterias de terror
Agrave Maria Cristina por toda a ajuda natildeo soacute na parte administrativa e pela
amizade
Ao Dr Marco Krieger pela confianccedila e por me proporcionar suporte
financeiro quando entrei no periacuteodo de prorrogaccedilatildeo
A todos os amigos e pesquisadores do Instituto Carlos Chagas dos demais
laboratoacuterios Lab REG Lab Genocircmica Laboratoacuterio de Biologia Celular por terem de
um jeito ou de outro participado do processo Eacute difiacutecil agradecer todo mundo
Valeu galera
ldquoTenho a impressatildeo de ter sido uma crianccedila brincando agrave
beira-mar divertindo-me em descobrir uma pedrinha
mais lisa ou uma concha mais bonita que as outras
enquanto o imenso oceano da verdade continua
misterioso diante de meus olhosrdquo
(Isaac Newton)
RESUMO
O DNA do cinetoplasto (kDNA) dos tripanosomatiacutedeos consiste numa rede de
moleacuteculas circulares catenadas entre si os miniciacuterculos e os maxiciacuterculos Os
miniciacuterculos codificam RNAs guias (gRNAs) e os maxiciacuterculos codificam para
algumas subunidades de enzimas mitocondriais e rRNA em um padratildeo
criptografado (ediccedilatildeo de RNA) Estudos com o tripanosomatiacutedeo Crithidia fasciculata
mostraram que proteiacutenas do tipo histona H1 associadas ao cinetoplasto (KAPs) satildeo
capazes de condensar a rede de kDNA Poreacutem pouco eacute conhecido sobre estas
proteiacutenas de Trypanosoma cruzi um protozoaacuterio parasita que sofre alteraccedilotildees na
estrutura do DNA do cinetoplasto ao longo de seu ciclo de vida Neste trabalho foi
caracterizada uma proteiacutena associada ao cinetoplasto de T cruzi denominada de
TcKAP7 que possui baixo peso molecular e natureza baacutesica condizente com um
papel na neutralizaccedilatildeo de carga e na condensaccedilatildeo do DNA Atraveacutes de ensaios
usando a teacutecnica de espalhamento de raios-X a baixo acircngulo (SAXS) foi possiacutevel
perceber que a proteiacutena TcKAP7 sofre mudanccedilas estruturais na presenccedila do kDNA
sugerindo uma interaccedilatildeo com essa estrutura seja atraveacutes de ligaccedilotildees eletrostaacuteticas
ou atraveacutes de ligaccedilotildees especiacuteficas com moleacuteculas presentes na rede A anaacutelise pela
teacutecnica de imunofluorescecircncia mostrou que proteiacutena TcKAP7 estaacute localizada na
regiatildeo dos poacutelos do cinetoplasto o que sugere que pode estar envolvida na
finalizaccedilatildeo da replicaccedilatildeo dos miniciacuterculos Mutante nulo para TcKAP7 foi gerado por
teacutecnicas de substituiccedilatildeo gecircnica a fim de verificar se na ausecircncia de TcKAP7
ocorriam alteraccedilotildees na estrutura do kDNA Contudo os parasitas mutantes para
TcKAP7 natildeo apresentavam alteraccedilotildees na estrutura e morfologia do cinetoplasto
quando analisados por microscopia eletrocircnica e foram capazes de se diferenciar
sem perder a capacidade infectiva Entretanto ensaios de RNA de interferecircncia
visando analisar a funccedilatildeo do gene TbKAP7 ortoacutelogo em T brucei levou agrave reduccedilatildeo
da proliferaccedilatildeo celular das formas prociacuteclicas desse parasita mostrando que este
gene eacute essencial para o metabolismo desse tripanosomatiacutedeo sugerindo que KAP7
possa ter papeis distintos em T cruzi e T brucei
Palavras-chaves Trypanosoma cruzi cinetoplasto nocaute KAPs
ABSTRACT
The kinetoplast DNA (kDNA) of trypanosomatids consists in a network of circular
molecules catenated each other the minicircles and maxicircles The minicircles
code RNAs guides (gRNAs) and the maxicircles code for some subunits of
mitochondrial enzymes and rRNA in a cryptic pattern (RNA editing) Studies in the
trypanosomatid protozoan Crithidia fasciculata showed that the kDNA is associated
with histone H1-like proteins known as kinetoplast-associated proteins (KAPs) wich
are capable of condensing the kDNA network However little is known about these
proteins of Trypanosoma cruzi a protozoan parasite which undergoes changes in
kinetoplast DNA structure over its life cycle Here we characterize a protein
associated with T cruzi kinetoplast named TcKAP7 TcKAP7 is a low molecular
weight protein with basic nature which is consistent with a role in DNA charge
neutralization and condensation Analysis by small angle X-Ray scattering technique
(SAXS) revealed that the TcKAP7 protein undergoes structural changes in the
presence kDNA suggesting an interaction with this DNA network either through
electrostatic bonds or through specific binding to molecules present on the network
The immunofluoresce analysis showed that TcKAP7 is located in the kinetoplast
poles suggesting that TcKAP7 might be involved in the late stages of the minicircle
replication A null mutant for TcKAP7 was obtained by gene replacement techniques
to study possible alterations in the kDNA structure However no modification in the
structure and morphology of the kinetoplast was observed by electron microscopy In
addition Tckap7 null mutant was able to differentiate without losing its infective
capacity Interference RNA assays was performed to analyze the function of
TbKAP7 the ortholog gene in T brucei The ablation of TbKAP7 expression leaded
to reduction in the procyclic proliferation suggesting that this gene is essential for the
metabolism of the parasite and might play distinct roles in T cruzi and T brucei
Key-words Trypanosoma cruzi kinetoplast gene knockout KAPs
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1 DISTRIBUICcedilAtildeO GEOGRAacuteFICA DA DOENCcedilA
DE CHAGAS19 FIGURA 2 CICLO DE TRANSMISSAtildeO DO
Trypanosoma cruzi20 FIGURA 3 ESQUEMA GERAL DAS PRINCIPAIS ESTRUTURAS
CELULARES DE T cruzi 22 FIGURA 4 REDE DE kDNA27 FIGURA 5 DIFERENTES ARRANJOS DO CINETOPLASTO
DE T cruzi29 FIGURA 6 MUDANCcedilAS NA POSICcedilAtildeO DO KDNA
NOS TRYPANOSOMAS29 FIGURA 7 REPOSICIONAMENTO DO KDNA EM RELACcedilAtildeO
AgraveS OUTRAS ORGANELAS DURANTEO CICLO DE VIDA DE UM FLAGELADO30
FIGURA 8 REPLICACcedilAtildeO DO kDNA32 FIGURA 9 REPRESENTACcedilAtildeO ESQUEMAacuteTICA DO
MICROFLUIDIFICADOR45 FIGURA 10 VETOR PARA EXPRESSAtildeO EM T CRUZI
P3XFLAG 50 FIGURA 11 ESQUEMA DA CONSTRUCcedilAtildeO DOS VETORES
UTILIZADOS PARA O NOCAUTE DO GENE TcKAP755
FIGURA 12 MAPA DO VETOR P2T7-177 UTILIZADO PARA ENSAIOS DE RNAi62
FIGURA 13 COMPARACcedilAtildeO ENTRE AS SEQUumlEcircNCIAS DE AMINOAacuteCIDOS DEDUZIDAS DO GENE KAP7 DE T cruzi Dm28C E DOS HAPLOacuteTIPOS DE CL BRENER65
FIGURA 14 COMPARACcedilAtildeO ENTRE AS SEQUumlEcircNCIAS DE AMINOAacuteCIDOS DEDUZIDAS DO GENE KAP7 EM DIFERENTES TRIPANOSOMATIacuteDEOS66
FIGURA 15 SINTENIA DE TcKAP7 COM OUTROS TRIPANOSOMATIacuteDEOS67
FIGURA 16 CARACTERIZACcedilAtildeO DA REGIAtildeO 5rsquo-UTR DO TRANSCRITO TcKAP769
FIGURA17 ANAacuteLISE DA EXPRESSAtildeO DA PROTEIacuteNA DE FUSAtildeO TCKAP7-FLAG EM FORMAS EPIMASTIGOTAS DE T CRUZI70
FIGURA 18 IMUNOLOCALIZACcedilAtildeO DE TcKAP7 EM EPIMASTIGOTAS DE T CRUZI71
FIGURA 19 ENSAIOS DE PCR UTILIZANDO DNA DE T cruzi kap7kap7 (WT) E T cruzi kap7neokap7higro (NO) COM DIFERENTES PRIMERS73
FIGURA 20 REPRESENTACcedilAtildeO ESQUEMAacuteTICA DOS SIacuteTIOS DA ENZIMA HindIII NO LOCUS DO GENE KAP7 DE T cruzi CL Brener75
FIGURA 21 ANAacuteLISE DA ORGANIZACcedilAtildeO DOS GENES TCKAP7 NEO E HIGRO POR ENSAIO DO TIPO SOUTHERN BLOT75
FIGURA 22 COMPARACcedilAtildeO DA EXPRESSAtildeO DO GENE TcKAP7 POR WESTERN BLOT76
FIGURA 23 COLORACcedilAtildeO PELO MEacuteTODO PANOacuteTICO RAacutePIDO DOS PARASITAS EPIMASTIGOTAS NOCAUTEADOS77
FIGURA 24 COMPARACcedilAtildeO ENTRE A ULTRAESTRUTURA DO CINETOPLASTO DO T cruzi DM28C TIPO SELVAGEM (A) E DO MUTANTE DE T cruzi PARA TcKAP7 (B) POR MICROSCOPIA ELETROcircNICA DE TRANSMISSAtildeO78
FIGURA 25 CURVA DE CRESCIMENTO DO MUTANTE DE T cruzi PARA TcKAP7 (KO) E DO T cruzi Dm28c SELVAGEM (WT) 79
FIGURA 26 METACICLOGEcircNESE IN VITRO DE T cruzi Dm28c TIPO SELVAGEM E T cruzi NOCAUTEADO80
FIGURA 27 RNAi DE TbKAP7 INIBE O CRESCIMENTO DAS FORMAS PROCIacuteCLICAS DE T brucei82
FIGURA 28 PURIFICACcedilAtildeO DE TCKAP7 ATRAVEacuteS DE CROMATOGRAFIA DE AFINIDADE83
FIGURA 29 PURIFICACcedilAtildeO DE TCKAP7 ATRAVEacuteS DE CROMATOGRAFIA DE TROCA IOcircNICA84
FIGURA 30 ANAacuteLISE POR DLS DE TCKAP785 FIGURA 31 ENVELOPE MOLECULAR DE SAXS86 FIGURA 32 ESPECTRO DE DICROIacuteSMO CIRCULAR DE
TcKAP787 FIGURA 33 PREDICcedilAtildeO DE ESTRUTURA SECUNDAacuteRIA DE
TcKAP787 FIGURA 34 CRISTAL DE TcKAP7 DE T CRUZI88 FIGURA 35 ESTRUTURA DE TcKAP790 FIGURA 36 SUPERFIacuteCIE ELETROSTAacuteTICA DE
TcKAP791 FIGURA 37 ALINHAMENTO ESTRUTURAL DE 3TQ6 4NOD
3TTM 4NNU E TCKAP793 FIGURA 38 ESPECTRO DE DICROIacuteSMO CIRCULAR
DE TcKAP794 FIGURA 39 ENVELOPE MOLECULAR DETcKAP795 FIGURA 40 ENVELOPE MOLECULAR DETcKAP7 VISTO EM
DIFERENTES AcircNGULOS96
LISTA DE TABELAS
TABELA 1 RELACcedilAtildeO DOS PRIMERS UTILIZADOS PARA A CLONAGEM DA REGIAtildeO UPSTREAM DE TcKAP7 NO VETOR pNEO153
TABELA 2 RELACcedilAtildeO DOS PRIMERS UTILIZADOS PARA A CLONAGEM DA REGIAtildeO DOWNSTREAM DE TcKAP7 NO VETOR pNEO153
TABELA 3 RELACcedilAtildeO DOS PRIMERS UTILIZADOS PARA A AMPLIFICACcedilAtildeO DO GENE TbKAP763
TABELA 4ndash PERCENTUAL DE IDENTIDADE ENTRE AS PROTEIacuteNAS KAP7 NOS TRIPANOSSOMATIacuteDEOS COM O GENOMA SEQUENCIADO67
TABELA 5 COMBINACcedilOtildeES DE PRIMERS UTILIZADOS NA PCR PARA CONFIRMAR O NOCAUTE DE TcKAP772
SUMAacuteRIO
1 INTRODUCcedilAtildeO18 11 O Trypanosoma cruzi18 12 Ciclo de vida do T cruzi20 13 Aspectos celulares de T cruzi21 14 O genoma de T cruzi24 15 Expressatildeo gecircnica de Tcruzi25 16 O cinetoplasto26 17 A rede de kDNA26 171 Replicaccedilatildeo do kDNA31 18 Proteiacutenas associadas ao cinetoplasto (KAPs)32 2 OBJETIVOS35 21 OBJETIVO GERAL35 211 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS35 3 MATERIAIS E MEacuteTODOS36 31 Reagentes e Soluccedilotildees Utilizados36 311 Reagentes36 312 Tampotildees e Soluccedilotildees36 313 Meios de cultura38 32 Cultivo do Trypanosoma cruzi38 321 Epimastigotas38 322 Tripomastigotas metaciacuteclicos39 33 Curva de crescimento de T cruzi39 34 Obtenccedilatildeo de DNA de T cruzi40 35 Obtenccedilatildeo de kDNA de T cruzi40 36 Obtenccedilatildeo de extrato proteico de T cruzi40 37 Clonagem do gene TcKAP741 38 Obtenccedilatildeo do cDNA de TcKAP7 atraveacutes de ensaio de RT-PCR41 39 Seleccedilatildeo dos clones recombinantes42 391 Teacutecnica de palitagem (toothpick)42 392 Teacutecnica de PCR de colocircnia43 310 Preparaccedilatildeo de plasmiacutedeo em pequena escala (miniprep)43 311 Expressatildeo da proteiacutena TcKAP7 em E coli43 312 Purificaccedilatildeo da proteiacutena recombinante TcKAP744 3121 Processamento da amostra44 3122 Cromatografia de afinidade45 3123 Cromatografia de troca iocircnica46 3124 Cromatografia de gel filtraccedilatildeo46 313 Espalhamento Dinacircmico de Luz ndash DLS46 314 Espectroscopia de dicroiacutesmo circular (CD)46 315 Quantificaccedilatildeo e concentraccedilatildeo47 316 Ensaios de Cristalizaccedilatildeo47 317 Espalhamento de raio-X a baixo acircngulo (SAXS)48 318 Modelagem de TcKAP748 319 Obtenccedilatildeo de antissoro policlonal contra TcKAP749 320 Anaacutelise da expressatildeo do gene TcKAP7 e de seu mutante por ensaio tipo western blot49 321 Superexpressatildeo de TcKAP750
3211 Amplificaccedilatildeo e clonagem do gene TcKAP7 no vetor pNEO3xFlag para superexpressatildeo da proteiacutena50 3212 Transfecccedilatildeo por eletroporaccedilatildeo52 3213 Seleccedilatildeo dos transfectantes52 322 Deleccedilatildeo do gene TcKAP7 por nocaute gecircnico53 3221 Amplificaccedilatildeo e clonagem das regiotildees a montante e a jusante do gene TcKAP753 3222 Amplificaccedilatildeo dos cassetes UPS-NEO-DOWN e UPS-HIGRO-DOWN para transfecccedilatildeo de T cruzi55 3223 Transfecccedilatildeo do T cruzi com o cassete UPS-NEO-DOWN56 3224 Extraccedilatildeo de DNA dos transfectantes57 3225 Anaacutelise por PCR do DNA dos parasitas transfectados com o cassete UPS-NEO-DOWN57 3226 Transfecccedilatildeo do T cruzi com o cassete UPS-HIGRO-DOWN57 3227 Anaacutelise por PCR do DNA dos parasitas transfectados com o cassete UPS-HIGRO-DOWN58 3228 Anaacutelise da organizaccedilatildeo do gene TcKAP7 e da eficiecircncia de seu nocaute atraveacutes de ensaio do tipo Southern blot58 323 Localizaccedilatildeo celular da proteiacutena TcKAP7 atraveacutes de ensaio de imunofluorescecircncia59 324 Anaacutelise da ultraestrutura do cinetoplasto do mutante de T cruzi para TcKAP7 por microscopia eletrocircnica de transmissatildeo60 325 Coloraccedilatildeo dos parasitas transfectados60 326 Infecccedilatildeo de ceacutelulas Vero com o mutante de T cruzi para TcKAP761 327 Anaacutelise da funccedilatildeo do gene TbKAP7 de Trypanosoma brucei atraveacutes de ensaios de RNA de interferecircncia61 3271 Induccedilatildeo do RNA dupla fita64 4 RESULTADOS65 41 Clonagem e caracterizaccedilatildeo do gene TcKAP765 42 Expressatildeo da proteiacutena TcKAP7 em T cruzi69 43 Localizaccedilatildeo celular de TcKAP7 atraveacutes de ensaio de imunofluorescecircncia70 44 Deleccedilatildeo do gene TcKAP7 por nocaute gecircnico71 441 Anaacutelise por PCR do DNA dos parasitas transfectados com os cassetes UPS-NEO-DOWN e UPS-HIGRO-DOWN72 442 Anaacutelise da organizaccedilatildeo dos genes TcKAP7 neo e higro por ensaio do tipo Southern blot74 45 Comparaccedilatildeo da expressatildeo do gene TcKAP7 por western blot76 46 Anaacutelise da morfologia e da ultraestrutura do cinetoplasto do mutante de T cruzi para TcKAP776 47 Multiplicaccedilatildeo diferenciaccedilatildeo e infectividade do mutante de T cruzi para TcKAP779 48 Anaacutelise da funccedilatildeo do gene KAP7 de Trypanosoma brucei atraveacutes de ensaios de RNA de interferecircncia80 49 Caracterizaccedilatildeo estrutural de TcKAP782 491 Produccedilatildeo recombinante de TcKAP782 410 Anaacutelise do estado oligomeacuterico de TcKAP784 411 Anaacutelise do conteuacutedo de estrutura secundaacuteria de TcKAP7 recombinante86 412 Anaacutelise estrutural de TcKAP787
413 Investigaccedilatildeo de possiacuteveis funcionalidades baseadas na estrutura de TcKAP791 4131 Prediccedilatildeo de funccedilatildeo paraTcKAP791 4132 Anaacutelises preliminares da possiacutevel interaccedilatildeo entre TcKAP7 e kDNA93 5 DISCUSSAtildeO97 6 CONCLUSOtildeES102 7 REFEREcircNCIAS103
18
1 INTRODUCcedilAtildeO
11 O Trypanosoma cruzi
Trypanosoma cruzi eacute um protozoaacuterio flagelado unicelular pertencente ao
reino Protista subreino Protozoa filo Sarcomastigophora subfilo Mastigophora
classe Zoomastigophora ordem Kinetoplastida e famiacutelia Trypanosomatidae (LEVINE
et al 1980) A principal caracteriacutestica dessa ordem eacute a presenccedila de uma estrutura
singular o cinetoplasto que abriga em uma massa de DNA extranuclear
concentrado na mitococircndria uacutenica deste protista (SHAPIRO amp ENGLUND 1995) A
famiacutelia Trypanosomatidae inclui os seguintes gecircneros importantes Blastocrithidia
Crithidia Endotrypanum Herpetomonas Leishmania Leptomonas Phytomonas e
Trypanosoma O gecircnero Trypanosoma eacute um dos mais importantes dentro da famiacutelia
Trypanosomatidae por incluir uma seacuterie de espeacutecies causadoras de doenccedilas
humanas importantes como o Trypanosoma cruzi agente da doenccedila de Chagas
Trypanosoma rhodesiense e Trypanosoma gambiense agentes da doenccedila do sono
e de animais o Trypanosoma brucei Trypanosoma equiperdum e Trypanosoma
equinum (DE SOUZA 2015)
Este protozoaacuterio eacute um microrganismo heteroxecircnico com ciclo bioloacutegico
alternado entre hospedeiros vertebrados (mamiacuteferos) e invertebrados (triatomiacuteneos)
Existem diferentes formas de transmissatildeo da doenccedila dentre as quais se destaca a
via vetorial que consiste na transmissatildeo do parasita atraveacutes de excretas do inseto
vetor hematoacutefago pertencente agrave ordem Hemiacuteptera famiacutelia Reduvidae subfamiacutelia
Triatominae (DIAS et al 1956) A principal caracteriacutestica bioloacutegica dos triatomiacuteneos
eacute que satildeo obrigatoriamente hematoacutefagos e necessitam do repasto sanguiacuteneo para
completar o desenvolvimento (DIAS 2000) O parasita pode ainda ser transmitido
aos mamiacuteferos por transfusatildeo sanguiacutenea ou via oral e com menos frequecircncia por
via congecircnita acidentes de laboratoacuterio e transplantes de oacutergatildeos (BELTRAO HDE et
al 2009 STEINDEL et al 2008 TANOWITZ et al 1992) Praticamente todo tipo
de ceacutelula nucleada do hospedeiro mamiacutefero pode ser parasitada considerando o
tropismo das diferentes cepas (LENZI et al 1996) Outra caracteriacutestica deste
parasita eacute apresentar diferentes morfologias durante o ciclo bioloacutegico A classificaccedilatildeo
19
de suas formas baseia-se tambeacutem na posiccedilatildeo do cinetoplasto em relaccedilatildeo ao nuacutecleo
e do local de onde emerge o flagelo (HOARE 1971)
Foi no ano de 1909 no estado de Minas Gerais que Carlos Chagas meacutedico
sanitarista identificou pela primeira vez o protozoaacuterio parasita Trypanosoma cruzi
agente causador da Doenccedila de Chagas A doenccedila de Chagas eacute endecircmica na
Ameacuterica Latina sendo conhecida a existecircncia de vetores da doenccedila desde o sul dos
Estados Unidos agrave Argentina (FIGURA 1)
FIGURA 1 DISTRIBUICcedilAtildeO GEOGRAacuteFICA DA DOENCcedilA DE CHAGAS FONTE Modificado de httpwwwwhointen
Em 2008 o nuacutemero de indiviacuteduos infectados era estimado entre 16 e 18
milhotildees sendo que aproximadamente 90 milhotildees de pessoas estariam sob risco
de contaminaccedilatildeo na Ameacuterica Latina (WHO 2010)
Apesar de existirem drogas (Nifurtimox e Benzonidazol) para o tratamento
da doenccedila sua ineficaacutecia no estaacutegio crocircnico e sua accedilatildeo toacutexica acabam prejudicando
o paciente sem conseguir eliminar o parasita (BRENER et al 2000) Sem vacinas
ou tratamento quimioteraacutepico eficiente a principal estrateacutegia de controle limita-se agrave
prevenccedilatildeo da transmissatildeo por transfusatildeo sanguiacutenea e ao controle populacional dos
vetores triatomiacuteneos Aleacutem da sua importacircncia como patoacutegeno humano este micro-
organismo apresenta caracteriacutesticas peculiares que o tornam um excelente modelo
para o estudo de questotildees bioloacutegicas baacutesicas
Regiotildees endecircmicas
20
12 Ciclo de vida do T cruzi
O T cruzi apresenta um ciclo complexo na natureza sofrendo mudanccedilas
estruturais bioquiacutemicas e morfoloacutegicas de acordo com o ambiente em que se
encontra Formas replicativas epimastigotas e amastigotas dos hospedeiros
invertebrado e mamiacutefero respectivamente alternam-se com as formas infectivas e
natildeo proliferativas tripomastigotas metaciacuteclicas (proveniente do inseto vetor) e
tripomastigota sanguiacutenea (originaacuteria do mamiacutefero infectado) (FIGURA 2) (DE
SOUZA 1984)
FIGURA 2 CICLO DE TRANSMISSAtildeO DO Trypanosoma cruzi FONTE Infograacutefico Veniacutecio Ribeiro ICICTFIOCRUZ
Durante o repasto sanguiacuteneo do inseto vetor formas tripomastigotas
metaciacuteclicas atingem a corrente sanguiacutenea do hospedeiro pela lesatildeo da picada Esta
forma infectiva eacute capaz de invadir todos os tipos de ceacutelulas com exceccedilatildeo das
21
hemaacutecias Apoacutes a entrada do parasita na ceacutelula os tripomastigotas diferenciam-se
em uma forma replicativa denominada amastigota que apoacutes diversas divisotildees sofre
uma diferenciaccedilatildeo para um estaacutegio intermediaacuterio o epimastigota intracelular e
posteriormente para tripomastigota Quando ocorre a lise celular os tripomastigotas
satildeo liberados ao meio extracelular podendo entatildeo invadir ceacutelulas vizinhas atingir
novos tecidos atraveacutes da corrente sanguiacutenea ou ainda infectar um inseto vetor
durante o processo de hematofagia recomeccedilando o ciclo no hospedeiro
invertebrado No inseto as formas tripomastigotas diferenciam-se em epimastigotas
no tubo digestivo e migram para o intestino onde ocorrem as divisotildees binaacuterias Ao
atingirem a porccedilatildeo terminal do tubo digestivo ocorre a diferenciaccedilatildeo em
tripomastigotas metaciacuteclicos que satildeo eliminados juntamente com as fezes e urina do
triatomiacutedeo
A transformaccedilatildeo da forma epimastigota do T cruzi em tripomastigota
metaciacuteclica denominada metaciclogecircnese eacute de grande interesse de estudo pois
neste processo ocorrem diversas alteraccedilotildees morfoloacutegicas metaboacutelicas e de
expressatildeo gecircnica (GOLDENBERG et al 1985) A metaciclogecircnese que ocorre
naturalmente no intestino do inseto vetor pode ser mimetizada in vitro utilizando-se
meio quimicamente definido que simula as condiccedilotildees da urina do inseto vetor
(CONTRERAS et al 1985)
13 Aspectos celulares de T cruzi
O Trypanosoma cruzi apresenta aleacutem das organelas tiacutepicas da maioria das
ceacutelulas eucarioacuteticas como nuacutecleo retiacuteculo endoplasmaacutetico aparato de Golgi e
mitococircndria algumas estruturas peculiares (FIGURA 3) como os microtuacutebulos
subpeliculares a estrutura paraflagelar os reservossomos o cinetoplasto os
glicossomos e os acidocalcisomos exclusivos dos tripanosomatiacutedeos (revisto por
DE SOUZA 1984 1999 2002)
22
FIGURA 3 ESQUEMA GERAL DAS PRINCIPAIS ESTRUTURAS CELULARES DE T cruzi FONTE DOCAMPO et al 1975
A superfiacutecie celular dos tripanossomatiacutedeos eacute composta principalmente
pela membrana plasmaacutetica e pelos microtuacutebulos subpeliculares Pequenos
filamentos conectam fortemente os microtuacutebulos subpeliculares os quais se
apresentam espaccedilados de forma regular entre si e com a membrana plasmaacutetica (DE
23
SOUZA SANTANNA CUNHA-E-SILVA 2009) conferindo rigidez agrave ceacutelula e
resistecircncia ao rompimento mecacircnico
Todos os membros da famiacutelia Trypanosomatidae apresentam um flagelo
que emerge de uma aacuterea de invaginaccedilatildeo da membrana plasmaacutetica conhecida como
bolsa flagelar Devido agrave localizaccedilatildeo especiacutefica de vaacuterios receptores nesta aacuterea
acredita-se que a maior parte do traacutefego vesicular e entrada de nutrientes ocorram
nesta regiatildeo Outra invaginaccedilatildeo menor localizada proacutexima agrave bolsa flagelar o
citoacutestomo tambeacutem estaacute envolvida com a absorccedilatildeo de nutrientes (PORTO-
CARREIRO et al 2000)
O flagelo do T cruzi apresenta uma estrutura baacutesica semelhante a outros
flagelos sendo envolvido por uma membrana flagelar e contendo um axonema
tiacutepico que apresenta um padratildeo de nove pares de microtuacutebulos perifeacutericos e um par
central Associado ao flagelo deste parasita eacute encontrado um complexo arranjo de
filamentos proteacuteicos denominado de estrutura paraflagelar (revisto por GULL 1999)
Na parte posterior da ceacutelula existem organelas usualmente esfeacutericas
denominadas reservossomos Os reservossomos satildeo organelas aacutecidas que
possuem em seu interior proteinases principalmente a cruzipaiacutena (uma
cisteiacutenoproteinase) e proteiacutenas ingeridas que chegam dentro de vesiacuteculas
endociacuteticas oriundas da bolsa flagelar e do citoacutestomo Com base nisso foi proposto
que os reservossomos seriam compartimentos preacute-lisossomais (SOARES et al
1992) Tambeacutem tem sido proposta a participaccedilatildeo dos reservossomos no processo
de metaciclogecircnese como principal fonte de energia para esta atividade (SOARES
1999)
O T cruzi assim como todos os membros da famiacutelia Tripanosomatidae
apresenta uma mitococircndria uacutenica e ramificada que se estende por todo o corpo do
protozoaacuterio Como em todas as ceacutelulas eucarioacuteticas a mitococircndria dos
tripanosomatiacutedeos tambeacutem apresenta DNA mitocondrial tambeacutem conhecido como
kDNA ou DNA do cinetoplasto que se concentra em uma determinada regiatildeo da
mitococircndria localizada logo abaixo do corpuacutesculo basal dando origem a uma
estrutura intramitocondrial chamada de cinetoplasto O cinetoplasto abriga o kDNA
o qual eacute constituiacutedo por moleacuteculas circulares que se encontram interligadas
formando uma extensa rede entre si (SHLOMAI 1994)
Distribuiacutedos pelo citoplasma estatildeo os glicossomos um tipo especializado de
peroxissomo Estes acumulam enzimas da via glicoliacutetica envolvidas na conversatildeo
24
da glicose a 3-fosfoglicerato que em outros organismos localizam-se no citoplasma
(HANNAERT et al 2003)
Outra particularidade dos tripanossomatiacutedeos estaacute na estocagem intracelular
de caacutelcio Este iacuteon importante nos processos de sinalizaccedilatildeo celular eacute estocado em
organelas denominadas acidocalcissomos Os acidocalcissomos provavelmente
estatildeo envolvidos em diversos processos bioloacutegicos tais como o armazenamento de
caacutelcio e polifosfatos adaptaccedilatildeo dos tripanosomatiacutedeos a condiccedilotildees de estresse
ambiental manutenccedilatildeo do pH intracelular e osmorregulaccedilatildeo (revisto por DOCAMPO
et al 2005)
14 O genoma de T cruzi
No ano de 2005 foi concluiacuteda a montagem do genoma do T cruzi (EL-
SAYED et al 2005) A cepa CL Brener foi a escolhida para o sequenciamento por
ser bem caracterizada bioquiacutemica e parasitologicamente (ZINGALES et al 1997) e
por ser considerada representativa para o universo de cepas circulantes de T cruzi
Com base na montagem do sequenciamento o genoma diploacuteide do parasita foi
calculado como sendo de 1064 1107 Mb com cada haploacutetipo contendo cerca de
12000 genes sendo que mais de 50 do genoma constituiu-se de sequecircncias
repetitivas compostas por famiacutelias de proteiacutenas de superfiacutecie retrotransposons e
elementos subtelomeacutericos (EL-SAYED et al 2005)
A comparaccedilatildeo das estruturas genocircmicas e proteiacutenas preditas obtidas a
partir do sequenciamento de Trypanosoma cruzi com as de Leishmania major e
Trypanosoma brucei indica mais similaridade entre T cruzi e T brucei uma grande
conservaccedilatildeo entre os respectivos proteomas (exceto para antiacutegenos de superfiacutecie) e
uma sintenia bastante conservada entre os trecircs tripanosomatiacutedeos apesar da
divergecircncia haacute 200-500 milhotildees de anos atraacutes (BERRIMAN et al 2005 EL SAYED
et al 2005 IVENS et al 2005)
Os tripanosomatiacutedeos possuem aleacutem do genoma nuclear um grande
genoma mitocondrial (kDNA) que tem sido extensivamente estudado sendo uacutenico
em estrutura funccedilatildeo e mecanismo de replicaccedilatildeo O kDNA eacute formado por milhares de
moleacuteculas circulares topologicamente relaxadas e interligadas umas as outras Este
arranjo conteacutem aproximadamente 20 - 30 do DNA total dos tripanosomatiacutedeos e eacute
composto por 2 tipos de moleacuteculas circulares os maxiciacuterculos e os miniciacuterculos Os
25
maxiciacuterculos apresentam um tamanho entre 22-37 kb e conteacutem basicamente os
genes codificadores de proteiacutenas envolvidas na fosforilaccedilatildeo oxidativa e RNA
ribossocircmico Os miniciacuterculos com um tamanho que varia de espeacutecie para espeacutecie
(05 a 25 kb) conteacutem os genes que codificam os RNAs guia envolvidos na
editoraccedilatildeo do RNA (STUART et al 1989 SHAPIRO amp ENGLUND 1995 MADISON-
ANTENUCCI et al 2002 SIMPSON et al 2003 ONN et al 2006 GLUENZ et al
2007)
15 Expressatildeo gecircnica de Tcruzi
T cruzi estaacute sujeito agraves frequentes mudanccedilas de ambientes decorrentes da
passagem por diferentes hospedeiros durante seu ciclo de vida (temperatura pH
quantidade de nutrientes evasatildeo do sistema imune) por esse motivo a expressatildeo
gecircnica deste parasita eacute regulada por diversos fatores A adaptaccedilatildeo raacutepida e eficiente
a estas diferentes condiccedilotildees torna-se uma importante tarefa para o parasita
Como os demais eucariotos o T cruzi apresenta trecircs RNAs polimerases a
RNA polimerase I transcreve os genes para RNAs ribossocircmicos a RNA polimerase
II os genes que codificam proteiacutenas e a RNA polimerase III pequenos RNAs como
o tRNA (RNA de transferecircncia) Nos tripanosomatiacutedeos promotores para as RNA
polimerase I e III jaacute foram identificados poreacutem ainda natildeo foram identificados
promotores para os genes transcritos pela RNA polimerase II com exceccedilatildeo de um
promotor associado ao gene do mini-exon (GILLINGER amp BELLOFATTO 2001
revisto por CAMPBELL et al 2003)
Os genes dos tripanosomatiacutedeos estatildeo organizados em unidades
policistrocircnicas e natildeo apresentam interrupccedilotildees por iacutentrons com exceccedilatildeo do gene da
poli-A polimerase (MAIR et al 2000)
Uma vez que em T cruzi como nos demais eucariotos somente mRNAs
monocistrocircnicos satildeo traduzidos os precursores de mRNA policistrocircnicos devem ser
processados ateacute mRNAs individuais Como caracteriacutestica desta famiacutelia os
transcritos de mRNA satildeo processados por mecanismos de trans-splicing (AGABIAN
1990) e poliadenilaccedilatildeo (LEBOWITZ et al 1993 MATTHEWS et al 1994
VANHAMME amp PAYS 1995)
No processo de trans-splicing as unidades codificadoras satildeo separadas e eacute
adicionada na extremidade 5rsquo uma sequecircncia extremamente conservada espeacutecie-
26
especiacutefica de 39 nucleotiacutedeos denominada sequumlecircncia liacuteder (SL) ou minieacutexon
(McCARTHY-BURKE et al 1989 NILSEN 1992 VANHAMME amp PAYS 1995)
Nesta reaccedilatildeo participam duas moleacuteculas de RNA uma doadora e outra aceptora A
doadora eacute um precursor do mini-exon e em T cruzi possui cerca de 110
nucleotiacutedeos (ZWIERZYNSKI amp BUCK 1991) A aceptora eacute o transcrito derivado da
unidade policistrocircnica ao qual o mini-exon eacute transferido O complexo enzimaacutetico
envolvido nesta reaccedilatildeo eacute semelhante ao descrito para a de cis-splicing (LAIRD
1989)
Os transcritos processados satildeo estabilizados pela estrutura cap 4 do mini-
exon (ULLU amp TSCHUDI 1991) e pela adiccedilatildeo de uma cauda poli-A agrave extremidade
3rsquo sendo que a adiccedilatildeo de ambos os elementos ocorrem em conjunto (LEBOWITZ et
al 1993) Regiotildees ricas em resiacuteduos de pirimidinas aleacutem da sequumlecircncia consenso
(AG) para o trans-splicing regulam a adiccedilatildeo do mini-exon e da cauda poli-A
Deleccedilotildees nestas regiotildees impedem o correto processamento destes transcritos
(MATTHEWS et al 1994)
A ocorrecircncia de transcriccedilatildeo policistrocircnica associada agrave ausecircncia de
promotores para RNA polimerase II e agrave presenccedila de niacuteveis distintos de mRNA
originados de uma mesma unidade policistrocircnica sugerem que a regulaccedilatildeo da
expressatildeo gecircnica nesses protozoaacuterios ocorra a niacutevel poacutes-transcricional baseada
principalmente em mecanismos que controlam a estabilidade e a traduccedilatildeo dos
mRNAs (CLAYTON 2002 BOUCHER et al 2002)
16 O cinetoplasto
O cinetoplasto eacute uma estrutura peculiar presente nos tripanosomatiacutedeos e
encontra-se inserida no interior da mitococircndria uacutenica abrigando fibrilas de DNA
conhecidas como kDNA O nome cinetoplasto (cineto=movimento e plasto=organela)
foi dado pois se acreditava que o mesmo fosse responsaacutevel pelo movimento do
flagelo
17 A rede de kDNA
O DNA do cinetoplasto eacute formado por dois tipos de moleacuteculas circulares os
miniciacuterculos de tamanho entre 05 e 25 kb e os maxiciacuterculos que apresentam
entre 20 e 40 kb Cerca de 10000 miniciacuterculos e 50 maxiciacuterculos se encontram
27
catenados formando uma extensa rede (SHAPIRO amp ENGLUND 1995 DE SOUZA amp
CAVALCANTI 2008) (FIGURA 4)
FIGURA 4 REDE DE kDNA
FONTE ROY CHOWDHURY et al 2010
As primeiras questotildees relacionadas ao arranjo das moleacuteculas na rede do
kDNA dos tripanosomatiacutedeos surgiram na deacutecada de 80 sugerindo que tal
organizaccedilatildeo poderia ter evoluiacutedo como um maneira mais eficaz de armazenar uma
grande quantidade de material em um pequeno espaccedilo (HAJDUK et al 1986)
Os maxiciacuterculos apresentam um tamanho de 22 a 37 kb e assim como o
DNA mitocondrial de outros eucariotos codificam RNAs ribossomais e diversas
proteiacutenas da cadeia respiratoacuteria incluindo subunidades da citocromo oxidase e
NADH desidrogenase (revisto por SHAPIRO amp ENGLUND 1995) Os transcritos dos
maxiciacuterculos satildeo processados poacutes-transcricionalmente para formar mRNAs
funcionais atraveacutes de um processo conhecido como ediccedilatildeo ou editoraccedilatildeo do RNA
A editoraccedilatildeo do RNA consiste na inserccedilatildeo ou retirada de resiacuteduos de uridina em
28
siacutetios especiacuteficos dos RNAs transcritos pelos maxiciacuterculos a fim de criar coacutedons de
iniciaccedilatildeo ou terminaccedilatildeo mudanccedilas na fase de leitura ou quadros abertos de leitura a
partir de sequumlecircncias sem sentido O processo de ediccedilatildeo eacute especificado por
pequenos RNAs guias produzidos pelos miniciacuterculos e maxiciacuterculos e catalisado
por um complexo muiltiproteacuteico o editosomo (revisto por Esteacutevez amp Simpson 1999
Stuart et al 2005) Esse processo constitui uma forma de regular poacutes-
transcricionalmente a expressatildeo de genes mitocondriais nas diferentes formas
evolutivas do parasita
Os miniciacuterculos caracterizam-se por apresentar um tamanho de 05 a 25 kb
e por transcrever os RNAs guia (gRNA) responsaacuteveis pela especificidade da ediccedilatildeo
dos mRNAs codificados pelos maxiciacuterculos por meio de uma sequumlecircncia presente na
porccedilatildeo central desses gRNAs (BENNE 1994 STUART et al 2005) A significacircncia
da variaccedilatildeo em tamanho e organizaccedilatildeo entre as espeacutecies ainda natildeo eacute aparente
contudo a diversidade das sequecircncias dos miniciacuterculos estaacute correlacionada com a
necessidade de mais ou menos ediccedilatildeo de mRNA de cada organismo (STUART
1991) Apesar desta diversidade os miniciacuterculos apresentam pelo menos duas
regiotildees conservadas o dodecacircmero GGGGTTGGTGTA conhecido como sequecircncia
universal dos miniciacuterculos (UMS) e o hexacircmero ACGCCC que correspondem agrave
origem de replicaccedilatildeo da fita L (light) e da fita H (heavy) respectivamente
(BIRKENMEYER amp RAY 1986 BIRKENMEYER et al 1987 RAY 1989 SHLOMAI
1994 HINES amp RAY 2008)
Embora o cinetoplasto de todos os tripanosomatiacutedeos seja formado por
moleacuteculas circulares relaxadas e catenadas diferentes arranjos da rede de kDNA
podem ser observados entre diferentes estaacutegios do ciclo de vida desses
protozoaacuterios como em T cruzi (FIGURA 5) assim como mudanccedilas na posiccedilatildeo do
kDNA satildeo utilizadas para identificar as diferentes formas evolutivas do parasita
(FIGURA 6)
29
FIGURA 5 ndash DIFERENTES ARRANJOS DO CINETOPLASTO DE T cruzi
LEGENDA As fibrilas de kDNA se apresentam bastante compactadas em forma de bastatildeo nas formas amastigotas (A) e epimastigotas (B) enquanto nas formas tripomastigotas a rede de kDNA torna-se menos compacta e a forma em bastatildeo do cinetoplasto daacute lugar a uma forma arredondada (C) FONTE DE SOUZA amp SOUTO-PADRON 1980 e DE SOUZA 1984
Nas formas amastigota (FIGURA 5A) e epimastigota (FIGURA 5B) de T
cruzi as fibrilas de kDNA se apresentam bastante compactadas em forma de
bastatildeo Em tripomastigotas (FIGURA 5C) de T cruzi a rede de kDNA torna-se
menos compacta e a forma em bastatildeo do cinetoplasto daacute lugar a uma forma
arredondada (DE SOUZA 1984) Os vaacuterios graus de compactaccedilatildeo do kDNA em
tripanosomatiacutedeos podem estar relacionados com a accedilatildeo de proteiacutenas que
condensam o DNA como seraacute visto mais adiante
FIGURA 6 MUDANCcedilAS NA POSICcedilAtildeO DO KDNA NOS TRYPANOSOMAS FONTE Modificado de DO CAMPO et al 2005
30
O cinetoplasto de todos os tripanosomatiacutedeos encontra-se localizado
proacuteximo ao corpo basal perpendicularmente ao eixo do flagelo Em alguns
tripanosomatiacutedeos que sofrem diferenciaccedilatildeo ao longo de seu ciclo de vida como o
T cruzi o cinetoplasto muda de posiccedilatildeo dentro da ceacutelula passando da regiatildeo
anterior (nos epimastigotas) para a regiatildeo posterior (nos tripomastigotas) poreacutem
permanecendo proacuteximo e perpendicular ao corpo basal (FIGURA 7) O cinetoplasto
eacute fisicamente conectado ao corpo basal atraveacutes de um grupo de filamentos
citoplasmaacuteticos chamado de complexo de ligaccedilatildeo tripartite (TAC) (OGBADOYI et al
2003) Este complexo eacute responsaacutevel pelo posicionamento espacial do cinetoplasto e
por sua segregaccedilatildeo
FIGURA 7 REPOSICIONAMENTO DO KDNA EM RELACcedilAtildeO AgraveS OUTRAS ORGANELAS DURANTE O CICLO DE VIDA DE UM FLAGELADO LEGENDA A morfologia eacute definida pelas posiccedilotildees do ponto onde emerge o flagelo e a bolsa flagelar (BF) (mostrada em laranja) nuacutecleo (mostrado em azul) e kDNA (mostrado em roxo) FONTE Modificado de FIELD amp CARRINGTON 2009
31
171 Replicaccedilatildeo do kDNA
Nos tripanosomatiacutedeos a replicaccedilatildeo do kDNA eacute restrita a fase S nuclear
(COSGROVE amp SKEEN 1970 WOODWARD amp GULL 1990) diferente do que
acontece na maioria dos eucariotos onde a replicaccedilatildeo do DNA mitocondrial ocorre
ao longo do ciclo celular (LIU et al 2005)
A replicaccedilatildeo dos miniciacuterculos se inicia quando estes satildeo individualmente
decatenados da rede de kDNA pela accedilatildeo de DNA topoisomerases do tipo II pois
estes natildeo se replicam enquanto estatildeo ligados agrave rede e termina quando os
miniciacuterculos retornam para a rede com a ajuda da mesma enzima (SHAPIRO amp
ENGLUND 1995)
Os miniciacuterculos satildeo liberados da rede em direccedilatildeo a zona cinetoflagelar
(KFZ) uma regiatildeo especializada da matriz mitocondrial entre o kDNA e o corpo
basal (FIGURA 8) que abriga proteiacutenas envolvidas com o iniacutecio da replicaccedilatildeo Em
seguida os ciacuterculos migram (ou satildeo transportados) para os poacutelos opostos da rede
de kDNA para completar sua replicaccedilatildeo O iniacutecio da replicaccedilatildeo dos miniciacuterculos na
regiatildeo cinetoflagelar envolve a montagem de um complexo proteacuteico na origem de
replicaccedilatildeo dos ciacuterculos com a participaccedilatildeo da primase polimerase e proteiacutenas que
se ligam agrave sequumlecircncia universal de miniciacuterculos (UMSBP) Estas juntamente com
outras proteiacutenas geram uma forquilha de replicaccedilatildeo que se propaga
unidirecionalmente ao redor do miniciacuterculo formando uma estrutura tipo
intermediaacuteria (LIU et al 2005 GLUENZ et al 2007)
Os miniciacuterculos receacutem-replicados migram da zona KFZ para dois complexos
proteacuteicos situados nos poacutelos diametralmente opostos do cinetoplasto onde os
proacuteximos passos de replicaccedilatildeo iratildeo ocorrer Estes passos incluem remoccedilatildeo dos
primers pela accedilatildeo de endonucleases preenchimento de alguns intervalos entre os
fragmentos de Okazaki pela DNA polimerase e uniatildeo dos cortes (nicks) por uma
DNA ligase Apoacutes estas etapas os novos ciacuterculos sintetizados que ainda possuem
pelo menos uma interrupccedilatildeo em sua sequumlecircncia satildeo reunidos agrave periferia da rede
pela accedilatildeo de topoisomerases II Apoacutes todos miniciacuterculos terem sido replicados os
intervalos satildeo reparados (Revisto por LIU et al 2005 POVELONES 2014)
Pouco se sabe sobre o processo de replicaccedilatildeo dos maxiciacuterculos Assim
como os miniciacuterculos os maxiciacuterculos tambeacutem sofrem replicaccedilatildeo unidirecional que
32
se inicia em uma origem contida na regiatildeo variaacutevel da moleacutecula formando estruturas
tipo- Entretanto ao contraacuterio dos miniciacuterculos eles permanecem ligados agrave rede de
kDNA durante o processo replicativo (revisto por KLINGBEIL et al 2001 Liu et al
2005)
FIGURA 8 REPLICACcedilAtildeO DO kDNA FONTE Modificado de LIU et al 2005
18 Proteiacutenas associadas ao cinetoplasto (KAPs)
Proteiacutenas que se ligam ao DNA tambeacutem foram identificadas na mitococircndria
de uma variedade de organismos eucarioacuteticos variando de levedura ateacute humanos
(MAIER et al 2001) Estas proteiacutenas satildeo codificadas no nuacutecleo da ceacutelula e satildeo poacutes-
traducionalmente importadas para a mitococircndria
Conceitualmente qualquer proteiacutena que se associe ao kDNA quer atuando
na replicaccedilatildeo e transcriccedilatildeo quer atuando na organizaccedilatildeo compactaccedilatildeo e
segregaccedilatildeo da rede pode ser chamada de KAP (KAP do inglecircs Kinetoplast-
33
Associated Protein) Observou-se que algumas dessas KAPs apresentam
caracteriacutesticas de proteiacutenas histonas H1 (H1 histone-like proteins) por serem
proteiacutenas pequenas (17 a 25 kDa) fortemente baacutesicas (pI de 11 a 125) interagindo
com a carga negativa das moleacuteculas de DNA e com grande conteuacutedo dos
aminoaacutecidos lisina e arginina elevado (aprox 30 a 50)
Proteiacutenas associadas com genoma mitochondrial (KAPs) dos
tripanosomatiacutedeos e que compartilham caracteriacutesticas com histonas H1 foram
inicialmente identificadas no cinetoplasto do tripanosomatiacutedeo de inseto Crithidia
fasciculata e denominadas de KAP1 a 5 As H1-KAPs de C fasciculata interagem
com miniciacuterculos (XU et al 1996) e desse modo podem facilitar a associaccedilatildeo
orientaccedilatildeo e organizaccedilatildeo dessas moleacuteculas na rede pela neutralizaccedilatildeo das cargas
negativas das moleacuteculas de DNA contribuindo para a condensaccedilatildeo organizaccedilatildeo e
segregaccedilatildeo da rede de kDNA Ateacute o momento foram caracterizadas quatro H1-KAPs
de C fasciculata (CfKAP1 2 3 and 4) Aleacutem das caracteriacutesticas de histona H1
possuem uma preacute-sequecircncia clivaacutevel de nove aminoaacutecidos em sua porccedilatildeo N-
terminal e que provavelmente estaacute envolvida no transporte da proteiacutena para o
cinetoplasto jaacute que natildeo aparece na proteiacutena madura (XU amp RAY 1993 XU et al
1996 HINES amp RAY 1998) Atraveacutes de ensaios de imunofluorescecircncia foi possiacutevel
confirmar que estas proteiacutenas estatildeo presentes em toda a rede de kDNA Pela
facilidade encontrada nas KAPs purificadas de condensar redes de kDNA in vitro
(XU et al 1996) sugere-se que estas estejam envolvidas na organizaccedilatildeo e
condensaccedilatildeo do kDNA in vivo (LUKES et al 2001)
As teacutecnicas de deleccedilatildeo de genes satildeo uma oacutetima ferramenta para elucidar as
possiacuteveis funccedilotildees que um gene pode apresentar Em C fasciculata foi utilizada a
teacutecnica de nocaute gecircnico para o gene Cfkap1 onde mutantes viaacuteveis foram
obtidos mostrando que a forma e a dimensatildeo do cinetoplasto natildeo foram alterados
ao contraacuterio da organizaccedilatildeo da rede de kDNA que passou a apresentar fibrilas de
DNA espessas e uma camada eleacutetron-densa no centro do disco Quando foi
realizada a reintroduccedilatildeo do gene na forma episomal o fenoacutetipo normal da rede de
kDNA foi restaurado (LUKES et al 2001) Tambeacutem foi realizado o duplo nocaute
dos genes Cfkap2 e Cfkap3 o qual da mesma maneira produziu mutantes viaacuteveis
poreacutem com o crescimento bastante reduzido uma reduccedilatildeo na respiraccedilatildeo e um
aumento nos niacuteveis de mRNAs codificados pelos maxiciacuterculos Apesar de todas
estas alteraccedilotildees o kDNA permaneceu inalterado mostrando que as proteiacutenas
34
CfKAP2 e CfKAP3 desempenham um papel diferente ao da CfKAP1 pois estatildeo
envolvidas com o metabolismo mitocondrial e proliferaccedilatildeo celular ao inveacutes de
estarem envolvidas na organizaccedilatildeo estrutural do kDNA (AVLIYAKULOV et al
2004)
Com base nesses estudos surgiu o interesse de nosso grupo no estudo de
KAPs em T cruzi visando verificar qual o papel dessas proteiacutenas na organizaccedilatildeo da
rede de kDNA e sua importacircncia nos diferentes estaacutegios do ciclo de vida do parasita
Atraveacutes de anaacutelises bioinformaacuteticas foram identificadas 6 diferentes H1-KAPs
codificadas no genoma do T cruzi levando em consideraccedilatildeo a similaridade com
KAPs de C fasciculata (CAVALCANTI et al 2009) Essas H1-KAPs foram
denominadas de KAP3 KAP4a KAP4b KAP4c KAP6 e KAP7 Nosso grupo iniciou
a caracterizaccedilatildeo das proteiacutenas TcKAP4 e TcKAP6 mostrando que elas se localizam
no cinetoplasto mas com padrotildees distintos de distribuiccedilatildeo dependendo da forma do
ciclo de vida do parasita (CAVALCANTI et al 2009) Mais recentemente mostramos
que o nocaute da TcKAP3 natildeo afeta a proliferaccedilatildeo diferenciaccedilatildeo e infectividade do
parasita (DE SOUZA et al 2010)
A complexidade da rede de kDNA sugere portanto que as diferentes KAPs
atuem em conjunto algumas vezes de modo redundante para desempenhar
funccedilotildees na condensaccedilatildeo replicaccedilatildeo segregaccedilatildeo dessa estrutura
35
2 OBJETIVOS
21 OBJETIVO GERAL
O objetivo principal deste trabalho eacute caracterizar a funccedilatildeo da TcKAP7 avaliando seu
papel na biologia do parasita
211 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS
a) Analisar a localizaccedilatildeo subcelular da TcKAP7 atraveacutes de ensaios de
imunofluorescecircncia
b) Produzir TcKAP7 recombinante em larga escala para ensaios de biologia
estrutural
c) Estudar a viabilidade do parasita na ausecircncia do gene TcKAP7 para os parasitas
viaacuteveis analisar morfologia e ultraestrutura do cinetoplasto multiplicaccedilatildeo
diferenciaccedilatildeo e infectividade
36
3 MATERIAIS E MEacuteTODOS
31 Reagentes e Soluccedilotildees Utilizados
311 Reagentes
AmershamBioscience dNTPs Hybond C Hybond N kit ECL de western blotting
filmes de raio-X Hyperfilmreg anticorpo monoclonal anti-Histidina
Bio-Rad Acrilamida Agarose (UltraPure DNA grade) Azul de Bromofenol Bis-
Acrilamida Persulfato de Amocircnia
Cult-lab RPMI 1640
Difco Baacutecto-Aacutegar Bactotriptona Extrato de levedura Infuso de fiacutegado Triptose
Invitrogen Inc EDTA Fenol TRIS Nick Translation kit Taq DNA polymerase
IPTG Agarose X-Gal DNA de λHindIII Marcador de massa molecular Benchmark
Alexa Fluacuteor 458 1 kb Plus DNA Ladder Soro Fetal Bovino T4 DNA ligase
Merck Acetato de Soacutedio Aacutecido Aceacutetico Glacial Cloreto de CaacutelcioCloreto de
Potaacutessio Cloreto de Soacutedio Etanol Absoluto Glicina Glicose Hidroacutexido de soacutedio
Isopropanol HCl Na2HPO4
New England Biolabs Endonucleases de restriccedilatildeo
Qiagen Qiaquick PCR Purification kit
Serva Electrophoresis Alu-Gel S
Sigma Acetato de amocircnia Ampicilina Brometo de Etiacutedeo BSA Kanamicina
Glicerol Hepes Cloreto de Magneacutesio Tetraciclina β-mercaptoetanol DEAE-
celulose Tween 20 adjuvante completo de Freund monoclonal M2 anti-FLAG
312 Tampotildees e Soluccedilotildees
PBS NaCl 137 mM KCl 27 mM Na2HPO4 43 mM e KH2PO4 15 mM
PSG Na2HPO4 (anidro) 4747 mM NaH2PO4 H2O 25 mM NaCl 3676 mM e
glicose 555 mM
Soluccedilatildeo de tripsinazaccedilatildeo tripsina 005 (mv) e EDTA 002 (mv) em PBS pH
80
37
Soluccedilatildeo de bloqueio para imunofluorescecircncia PBS e BSA 1 (albumina seacuterica
bovina)
Soluccedilatildeo de bloqueio para western blot TBST e leite em poacute desnatado 5
Soluccedilatildeo de lise para Toothpick NaOH 50 mM Glicerol 5 SDS 05 EDTA 5
mM e azul de bromofenol 0025
Soluccedilatildeo Ponceau S Ponceau S 05 em aacutecido aceacutetico 1
Soluccedilatildeo de coloraccedilatildeo para geacuteis de proteiacutena Coomassie blue R-250 01 em
metanolaacutecido aceacutetico (4510)
Soluccedilatildeo para descoloraccedilatildeo de geacuteis de proteiacutena Metanol 4 aacutecido aceacutetico 75
Tampatildeo de lise hipotocircnico Tris-HCl 10mM pH 75 NaCl 10mM MgCl2 5 mM β-
mercaptoetanol 5 mM
Tampatildeo A para cromatografia de afinidade Tris-HCl 20 mM pH 75 NaCl 500 mM
Tampatildeo B para cromatografia de afinidade Tampatildeo A contendo imidazol 1M
Tampatildeo B para cromatografia de troca iocircnica Tris-HCl 50 mM pH 80 NaCl 1M
Soluccedilatildeo de depurinaccedilatildeo para Southern blot HCl 025 M
Soluccedilatildeo desnaturante para Southern blot NaOH 05 M e NaCl 15 M
Soluccedilatildeo neutralizante para Southern blot Tris-HCl 05 M pH 75 e NaCl 15 M
Soluccedilatildeo Denhardt (50X) ficoll 05 polivinilpirrolidona 06 e albumina de soro
bovino 02
Soluccedilatildeo de hibridaccedilatildeo para Southern blot DNA de esperma de salmatildeo do tipo III
01 mgml fragmentado por ultra-som e desnaturado SSC 6X soluccedilatildeo de denhardt
6X e SDS 1
SSC 20X NaCl 3 M pH 70 e citrato de soacutedio 03 M
Soluccedilatildeo de baixa estringecircncia SSC 2X e SDS 01
Soluccedilatildeo de meacutedia estringecircncia SSC 1X e SDS 01
Soluccedilatildeo de alta estringecircncia SSC 01X e SDS 01
Tampatildeo de eletroporaccedilatildeo para T cruzi NaCl 140 mM HEPES (aacutecido) 25 mM e
Na2HPO4 074 mM pH 75
Tampatildeo ZPFM de eletroporaccedilatildeo de T brucei NaCl 129 mM KH2PO4 15mM KCl
8mM NaH2PO4 8mM MgCl2 15mM CaCl2 90 mM e CH3COONa 24 mM pH 70
Tampatildeo TELT Tris-HCl 50 mM pH 80 EDTA 625 mM pH 90 LiCl 25 M e Triton
X-100 4
Tampatildeo de amostra para DNA 10X Ficoll 400 25 azul de bromofenol 025 e
xileno cianol FF 025
38
Tampatildeo de amostra para proteiacutena 4X Tris-HCl 40 mM pH 68 SDS 1 β-
mercaptoetanol 25 glicerol 6 e azul de bromofenol 0005
Tampatildeo de eletroforese para SDS-PAGE 1X Tris-base 25 mM glicina 192 mM e
SDS 01
Tampatildeo de lise de bacteacuterias Tris-HCl 20 mM pH 75 NaCl 500 mM PMSF1 mM
Tampatildeo para transferecircncia (western blotting) 1X Tris-base 25 mM glicina 192
mM e metanol 20
Tampatildeo TBE Tris base 89 mM aacutecido boacuterico 89 mM e EDTA 2 mM
TBS Tris-HCl 20 mM pH 80 e NaCl 150 mM
TBST TBS e Tween 20 01
TE Tris-HCl 10 mM pH 80 e EDTA 1 mM
313 Meios de cultura
LB Triptona 1 extrato de levedura 5 e NaCl 1
Meio LIT (liver infusion tryptose) infuso de fiacutegado 05 NaCl 753 mM KCl 54
mM glicose 10 mM bacto-triptose 05 Na2HPO4 564 mM hemina 00025 soro
fetal bovino 10 e extrato de levedura 15 gl
Meio TAU NaCl 190 mM KCl 17 mM MgCl2 2 mM CaCl2 2 mM e tampatildeo fosfato 8
mM pH 60
Meio TAU3AAG meio TAU suplementado com L-prolina 10 mM glutamato soacutedico
50 mM aspartato soacutedico 2 mM e glicose 10 mM
32 Cultivo do Trypanosoma cruzi
Neste trabalho foi utilizado o clone Dm28c de T cruzi (CONTRERAS et al
1985 CONTRERAS et al 1988) nas formas epimastigota e tripomastigota
metaciacuteclico
321 Epimastigotas
Formas epimastigotas de T cruzi foram cultivadas em meio LIT (CAMARGO
1964) a 28 oC com passagens a cada trecircs dias e inoacuteculo de 1 x 106 ceacutelulasml As
formas epimastigotas foram coletadas por centrifugaccedilatildeo no terceiro dia de cultivo
39
(correspondente a fase logariacutetmica de crescimento baseada em curva de
crescimento realizada nas mesmas condiccedilotildees) quando a densidade celular
apresentava-se entre de 1 - 3 x 107 ceacutelulasml
322 Tripomastigotas metaciacuteclicos
As formas metaciacuteclicas foram obtidas atraveacutes do processo de diferenciaccedilatildeo
in vitro (BONALDO et al 1988) Formas epimastigotas em final de fase logariacutetmica
de crescimento (densidade celular entre 5 - 7 x 107 ceacutelulasml) foram coletadas por
centrifugaccedilatildeo a 7000 x g por 5 minutos a 10 oC e ressuspendidas em meio TAU
na concentraccedilatildeo de 5 x 108 ceacutelulasml e mantidas a 28 oC por 2 horas Apoacutes este
periacuteodo correspondente ao estresse nutricional as ceacutelulas foram transferidas para
garrafas de 300 cm2 contendo 200 ml de meio TAU3AAG (concentraccedilatildeo final de 5 x
106 ceacutelulasml) Uma proporccedilatildeo dos parasitas que se aderiram agrave superfiacutecie da
garrafa de cultivo se diferenciou em metaciacuteclicos os quais foram liberados no
sobrenadante (BONALDO et al 1988) Estas formas foram purificadas pela
passagem atraveacutes de uma coluna de afinidade contendo a resina DEAE celulose
equilibrada em PSG (SOUSA 1983) Este procedimento foi realizado com o tipo
selvagem para obtenccedilatildeo de extrato proteacuteico e tambeacutem com o mutante de T cruzi
para TcKAP7 para verificaccedilatildeo da capacidade de diferenciaccedilatildeo e infectividade onde
o nuacutemero de metaciacuteclicos no sobrenadante foi contado apoacutes 24 48 72 e 96 horas
da incubaccedilatildeo em meio TAU3AAG
33 Curva de crescimento de T cruzi
Formas epimastigotas de T cruzi clone Dm28c e do mutante de T cruzi para
TcKAP7 foram cultivadas como descrito no item 321 ateacute atingirem a fase
estacionaacuteria para a comparaccedilatildeo da taxa de crescimento de ambas Foram
inoculadas 1 x 106 epimastigotas por ml de meio LIT em garrafas de 25 cm2 e
incubadas em seguida a 28 degC Diariamente foi realizada a contagem das culturas
em cacircmaras de Neubauer em diluiccedilotildees apropriadas ateacute o deacutecimo dia O graacutefico da
curva de crescimento comparativa entre a cultura selvagem e a nocaute foi feito
utilizando o programa Microsoft Excel
40
34 Obtenccedilatildeo de DNA de T cruzi
A extraccedilatildeo de DNA foi realizada conforme descrito por Medina-Acosta amp
Cross (1993) Epimastigotas (1 x 107 ceacutelulas) foram coletadas por centrifugaccedilatildeo a
7000 x g por 5 min lavadas em PBS e ressuspendidas em 350 microl de tampatildeo TELT
Apoacutes 5 min de incubaccedilatildeo agrave temperatura ambiente foi adicionado agrave amostra 1
volume de fenolclorofoacutermio e o material foi centrifugado a 13000 x g por 5 min A
fase aquosa foi recolhida e o DNA foi precipitado com 2 volumes de etanol absoluto
e coletado por centrifugaccedilatildeo a 13000 x g por 10 min O DNA presente no sedimento
foi lavado com etanol 70 seco e em seguida ressuspendido em tampatildeo TE
contendo RNAse a 20 microgml
35 Obtenccedilatildeo de kDNA de T cruzi
A extraccedilatildeo do kDNA de T cruzi foi realizada de acordo com Morel e
colaboradores (1980) com modificaccedilotildees
Formas epimastigotas (1 x109 ceacutelulas) foram coletadas por centrifugaccedilatildeo a
4000 x g por 10 min lavadas em PBS e ressuspendidas em 20 ml de Tampatildeo de
Lise Hipotocircnico Posteriormente adicionou-se Sacarose 025 M e o material foi
centrifugado 6000 x g por 10 min O pellet foi ressuspendido em 20 ml de Tris-HCl
10 mM pH 75 NaCl 10 Mm EDTA 5 mM SDS 05 A esta soluccedilatildeo foi adicionado
100 ug de proteinase K e a mesma permaneceu a 37 ordmC durante a noite No dia
seguinte as ceacutelulas foram transferidas para uma seringa de 50 ml aonde ocorreu a
quebra mecacircnica do DNA nuclear Este material foi ultracentrifugado a 27000 rpm a
4ordm C durante 1 hora utilizando o rotor SW28 Apoacutes centrifugaccedilatildeo o sobrenadante foi
desprezado e o pellet ressuspendido em 25 ml de TE e novamente ultracentrifugado
nas mesmas condiccedilotildees Apoacutes centrifugaccedilatildeo o pellet foi ressuspendido em 1ml de TE
e foi realizada a purificaccedilatildeo por fenolclorofoacutermio Apoacutes purificaccedilatildeo o material foi
ressuspendido em 300 ul de TE e utilizado para ensaios de SAXS
36 Obtenccedilatildeo de extrato proteico de T cruzi
41
As ceacutelulas foram coletadas por centrifugaccedilatildeo (4000 x g 5 min a 10 degC) e
lavadas duas vezes em PBS pH 75 Apoacutes as lavagens os parasitas foram
ressuspendidos em PBS e tampatildeo de amostra 4x foi adicionado de tal maneira que
a concentraccedilatildeo final fosse de 1 x 106 ceacutelulas equivalentesmicrol Os extratos foram
fervidos por 5 min e armazenados a - 70 degC
37 Clonagem do gene TcKAP7
A sequecircncia do gene TcKAP7 (ID Tc00104705350871950) foi obtida a
partir do banco de dados do genoma do T cruzi disponiacutevel no portal da internet
wwwgenedborg e a sua regiatildeo codificante foi amplificada por PCR com os primers
KAP7F (5rsquo ndash AAAGGATCCATGCTAAGAACTGTTCTGCCACTG 3rsquo) e KAP7R (5rsquo ndash
TCAGCGTCGACTTATGACGGTGGTGCAGGATCAGCAGCTGCAGTATTTT3rsquo) a
partir do DNA genocircmico de T cruzi Dm28c As sequecircncias de reconhecimento das
enzimas de restriccedilatildeo BamHI e SalI (marcadas em negrito) foram adicionadas na
extremidade 5rsquo dos primers KAP7F e KAP7R respectivamente As condiccedilotildees da
reaccedilatildeo de PCR foram as seguintes 100 ng de DNA total T cruzi 10 pmol de cada
primer 200 μM de cada dNTP MgCl2 15 mM tampatildeo Taq DNA polimerase 1x 25
U de Taq DNA polimerase (Invitrogen) A reaccedilatildeo de PCR foi processada no
termociclador modelo 9700 (Applied Biosystems EUA) com a desnaturaccedilatildeo do
material por 4 min a 94 degC seguida de 30 ciclos constando de desnaturaccedilatildeo a 94 degC
por 30 s hibridizaccedilatildeo dos primers a 58 degC por 30 s e extensatildeo a 72 degC por 1 min O
material amplificado foi purificado usando o kit Qiaquick PCR Purification (Qiagen) e
digerido com as enzimas de restriccedilatildeo BamHI e SalI com uso de 20 U de cada
enzima e seus respectivos tampotildees em volume final de 20 μl por 4 h a 37 oC O
material foi novamente purificado e utilizado para ligaccedilatildeo com o vetor pET28a
previamente digerido com as respectivas enzimas Bacteacuterias E coli cepa DH5α
foram transformadas com a ligaccedilatildeo A seleccedilatildeo dos clones contendo plasmiacutedeo com
o inserto desejado foi realizada atraveacutes da teacutecnica de palitagem ou de PCR de
colocircnia
38 Obtenccedilatildeo do cDNA de TcKAP7 atraveacutes de ensaio de RT-PCR
42
Com o intuito de verificar a posiccedilatildeo do mini-exon no transcrito de TcKAP7
realizamos o ensaio de RT-PCR para a obtenccedilatildeo do cDNA de TcKAP7
O protocolo utilizado foi baseado no manual teacutecnico da Promega (ΙmProm-ΙΙ
Reverse Transcription System) assim como os reagentes utilizados para essa
reaccedilatildeo Aproximadamente 10 μg de RNA foram incubados com o oligonucleotiacutedeo
KAP7R por 10 min a 70 degC e imediatamente transferidos para o gelo Agrave mistura foi
adicionada uma soluccedilatildeo de dNTPs (concentraccedilatildeo final de 05 mM para cada dNTP)
MgCl2 (120 μM) RNAse OUT (2 unidades) (Invitrogen) Transcriptase reversa
ImProm-II e respectivo tampatildeo A reaccedilatildeo foi incubada por 2 h a 42 degC As amostras
de cDNA foram purificadas por Microcon YM-30 (Millipore) conforme descriccedilatildeo do
fabricante e armazenadas a -20 degC Posteriormente foi realizada uma reaccedilatildeo de
PCR utilizando as seguintes condiccedilotildees 10 ng do cDNA de TcKAP7 de T cruzi 10
pmol do primer ME (5rsquo-AACGCTATTATTGATACAGTTTCTGTACTATATTG -3rsquo) e 10
pmol do primer KAP7R 200 μM de cada dNTP MgCl2 15 mM tampatildeo Taq DNA
polimerase 1x 25 U de Taq DNA polimerase (Invitrogen) A reaccedilatildeo de PCR foi
processada no termociclador modelo 9700 (Applied Biosystems EUA) com a
desnaturaccedilatildeo do material por 3 min a 94 degC seguida de 35 ciclos constando de
desnaturaccedilatildeo a 94 degC por 30 s hibridizaccedilatildeo dos primers a 55 degC por 30 s e extensatildeo
a 72 degC por 1 min O material amplificado foi purificado usando o kit Qiaquick PCR
Purification (Qiagen) e clonado diretamente no vetor pGEMreg-T Easy (Promega)
Bacteacuterias E coli cepa TOP10Frsquo foram transformadas com a ligaccedilatildeo e os plasmiacutedeos
recombinantes foram selecionados pela teacutecnica da palitagem ou de PCR de colocircnia
(itens 391 e 392) Apoacutes a minipreparaccedilatildeo (item 310) o material foi submetido ao
sequenciamento de DNA usando o serviccedilo de sequenciamento da empresa
Macrogen (Coreacuteia do Sul)
39 Seleccedilatildeo dos clones recombinantes
391 Teacutecnica de palitagem (toothpick)
As colocircnias foram coletadas com o auxiacutelio de palitos de dente (toothpick)
esteacutereis e transferidas para o fundo de tubos de micro-centriacutefuga e para a superfiacutecie
do meio LB solidificado (com o antibioacutetico de seleccedilatildeo do plasmiacutedeo) para a obtenccedilatildeo
de uma reacuteplica das colocircnias que foram analisadas (placa-matildee) A cada um dos
43
tubos foram acrescentados 15 μl do tampatildeo de lise Os tubos foram incubados em
banho-maria a 65 degC por 10 min As amostras entatildeo foram analisadas por
eletroforese em gel de agarose 1 usando o plasmiacutedeo sem inserto como controle
Posteriormente o gel foi corado com brometo de etiacutedeo (05 μgml) por
aproximadamente 20 min lavado com aacutegua e analisado sob luz ultravioleta para em
seguida ser fotografado no sistema de fotodocumentaccedilatildeo L-Pix (Locus
Biotecnologia Brasil)
392 Teacutecnica de PCR de colocircnia
Depois de selecionadas as colocircnias foram transferidas para tubos de PCR
contendo os reagentes da PCR e os primers que hibridizam com regiotildees que
flanqueiam o fragmento de DNA clonado em um volume total de 10 microl As amostras
foram incubadas a 94 degC por 3 min e submetidas a 35 ciclos de PCR com as
seguintes etapas 94 degC por 30 s 55 degC por 30 s e 72 degC por 1 min finalizando com
uma etapa de extensatildeo a 72 degC por 10 min Os produtos amplificados foram
analisados em gel de agarose 1 Posteriormente o gel foi corado com brometo de
etiacutedeo (05 microgml) por aproximadamente 20 min lavado com aacutegua e analisado sob
luz ultravioleta O gel foi fotografado no sistema de foto-documentaccedilatildeo L-Pix (Locus
Biotecnologia Brasil)
310 Preparaccedilatildeo de plasmiacutedeo em pequena escala (miniprep)
Os clones recombinantes foram cultivados em 3 ml de meio LB contendo o
antibioacutetico apropriado durante 18 h As culturas foram entatildeo centrifugadas a 12000
x g por 1min a temperatura ambiente e os plasmiacutedeos recombinantes purificados
com o sistema de minipreparaccedilatildeo de plasmiacutedeo (Miniprep Qiagen Kit) (QIAGEN) de
acordo com as recomendaccedilotildees do fabricante
311 Expressatildeo da proteiacutena TcKAP7 em E coli
Para expressar a proteiacutena recombinante TcKAP7 E coli cepa
BL21(DE3)STAR transformada com o plasmiacutedeo pET28a contendo o gene TcKPA7
(pET28a-TcKAP7) foi cultivada em meio LB contendo 25 μgml do antibioacutetico
44
kanamicina a 37 ordmC sob agitaccedilatildeo (preacute-inoacuteculo) Apoacutes 18 horas de crescimento uma
diluiccedilatildeo (110) foi realizada em novos tubos contendo meio LB-kanamicina e a
cultura foi incubada por 1 h a 37 ordmC sob agitaccedilatildeo constante Apoacutes este periacuteodo 05
mM IPTG (isopropil-1-tio-β-D-galactopiranosideo) foi adicionado agraves culturas A
incubaccedilatildeo prosseguiu por mais 3 h nas mesmas condiccedilotildees Como controle negativo
as ceacutelulas tambeacutem foram cultivadas nas mesmas condiccedilotildees poreacutem sem a adiccedilatildeo de
IPTG (cultura natildeo induzida) Aliacutequotas das culturas induzidas e natildeo induzidas com
IPTG foram processadas para anaacutelise em SDS-PAGE
312 Purificaccedilatildeo da proteiacutena recombinante TcKAP7
3121 Processamento da amostra
As bacteacuterias apoacutes a expressatildeo de TcKAP7 foram sedimentadas por
centrifugaccedilatildeo e ressuspendidas em tampatildeo de lise e lisadas utilizando o
microfluidificador modelo M-110L (Microfluidics EUA) Este meacutetodo divide a amostra
em dois fluxos e os conduz sob alta pressatildeo gerada por uma vaacutelvula pneumaacutetica
para uma cacircmara de interaccedilatildeo tambeacutem chamada de aacuterea de choque Esta cacircmara
eacute formada por um sistema de micro-canais dentro de um bloco de ceracircmica Dentro
da cacircmara ocorre cavitaccedilatildeo sonicaccedilatildeo e impacto dos dois fluxos em que a amostra
foi dividida levando a lise das ceacutelulas bacterianas (FIGURA 9) Este processo
provoca o aumento da temperatura e todo o sistema de tubos que conduz a amostra
necessita ser refrigerado com gelo e aacutegua a 4degC para prevenir a precipitaccedilatildeo de
proteiacutenas soluacuteveis
45
FIGURA 9 - REPRESENTACcedilAtildeO ESQUEMAacuteTICA DO MICROFLUIDIFICADOR LEGENDA A suspensatildeo de bacteacuterias eacute dividida em dois fluxos que se chocam sob alta pressatildeo dentro de micro-canais presentes na cacircmara de interaccedilatildeo da vaacutelvula homogeneizadora Melhores resultados satildeo obtidos aumentando o nuacutemero de ciclos de passagens Seta preenchida direccedilatildeo da amostra Seta pontilhada repetindo o ciclo de passagem FONTE Modificado de MAA amp HSU 1999
Apoacutes a lise o extrato soluacutevel foi obtido apoacutes centrifugaccedilatildeo a 30000 x g por
30 min a 4 degC
3122 Cromatografia de afinidade
Por ser expressa fusionada a uma cauda de seis histidinas a proteiacutena
TcKAP7 pode ser separada dos extratos celulares a partir da utilizaccedilatildeo de resina de
niacutequel da qual posteriormente a proteiacutena seraacute eluiacuteda
A purificaccedilatildeo da proteiacutena TcKPA7 presente no sobrenadante foi realizada
em sistema FPLC (Fast Performance Liquid Chromatography ndash GE Healthcare) com
coluna HiTrap Chelating de 1 mL (GE Healthcare) A coluna foi carregada com
soluccedilatildeo NiSO4 100 mM e equilibrada com tampatildeo A para cromatografia de afinidade
Durante a purificaccedilatildeo foi utilizado um gradiente de 0-100 de tampatildeo B para
cromatografia de afinidade As fraccedilotildees provenientes da cromatografia foram
analisadas atraveacutes de SDS-PAGE
Suspensatildeo de bacteacuterias
Ceacutelulas lisadasBomba de
alta pressatildeo
Micro-canais
Vaacutelvula homogeneizadora
46
3123 Cromatografia de troca iocircnica
Para eliminar contaminantes remanescentes da cromatografia de afinidade
a amostra contendo a proteiacutena de interesse foi submetida a uma segunda etapa
cromatograacutefica cromatografia de troca iocircnica utilizando-se a coluna HiTraptrade SP (GE
Healthcare) no sistema de FPLC (GE Healthcare)
Primeiramente a amostra foi diluiacuteda para reduccedilatildeo da concentraccedilatildeo salina e
a coluna foi lavada com 2 volumes de tampatildeo B para cromatografia de troca iocircnica e
depois com 2 volumes de tampatildeo A utilizado na cromatografia de afinidade O
gradiente de passagem do tampatildeo B foi de 0 a 100 e a proteiacutena TcKAP7 foi
obtida na fraccedilatildeo de material natildeo ligado agrave resina (Flow-through) (FT)
3124 Cromatografia de gel filtraccedilatildeo
Amostras da cromatografia de troca iocircnica que continham a proteiacutena de
interesse foram concentradas atraveacutes de filtraccedilatildeo A soluccedilatildeo foi colocada em filtro
Amicon Ultra MWCO 10000 (Milipore) e centrifugada a 4000 rpm a 4 ordmC O
experimento foi realizado em sistema FPLC (GE Healthcare) com a coluna
Superdex 200 HR 1030 (GE Healthcare) em tampatildeo HEPES 20 mM pH 74 e de
cloreto de soacutedio100 mM
313 Espalhamento Dinacircmico de Luz ndash DLS
O experimento foi realizado em equipamento DynaPro Molecular instrument
a 4 ordmC As amostras foram previamente centrifugadas por 5 minutos a 15000 rpm a
4 ordmC A coleta de dados foi realizada com intervalos de 2 segundos com 100
aquisiccedilotildees Para cada leitura utilizou-se 5 microl de amostra proteica
314 Espectroscopia de dicroiacutesmo circular (CD)
O espectro de CD foi coletado usando espectropolariacutemetro Jasco J-715
(Jasco Corporation Toacutekio Japatildeo) sendo a temperatura mantida a 20 degC atraveacutes de
um Peltie rType Control System PFD425S (JASCO) Todos os dados foram
coletados usando cubeta de quartzo de 1 mm de caminho oacuteptico
47
Mediu-se a elipticidade em graus na regiatildeo do UV distante no intervalo de
comprimento de onda de 260 nm a 200 nm com uma velocidade de 100 nmmin
sendo feitas no total 30 leituras com resposta de 1 segundo em varredura contiacutenua
Os valores obtidos em miligraus foram convertidos para elipticidade molar
por resiacuteduo ([θ]MRW) em miligrauscm2dmol-1 que eacute definida pela equaccedilatildeo (Adler et
al 1973)
Onde θobs eacute a elipsidade observada em graus MRW eacute o peso molecular
meacutedio dos resiacuteduos da proteiacutena d eacute o caminho oacuteptico da cubeta em centiacutemetros e c
eacute a concentraccedilatildeo da proteiacutena em mgmL O MRW eacute calculado dividindo-se o peso
molecular da proteiacutena pelo nuacutemero de resiacuteduos
315 Quantificaccedilatildeo e concentraccedilatildeo
As amostras obtidas a partir da purificaccedilatildeo tiveram a concentraccedilatildeo calculada
utillizando a absorbacircncia mensurada pelo aparelho NanoDrop (Thermo Fisher
Scientific) levando-se em consideraccedilatildeo o coeficiente de extinccedilatildeo e teoacuterico da
proteiacutena obtido a partir do ProtParam (httpusexpasyorgtoolsprotparamhtml) e o
peso molecular da proteiacutena que eacute de cerca de 28 kDa
Obtidas as concentraccedilotildees a amostra foi concentrada pelo meacutetodo de
filtraccedilatildeo utilizando o filtro Amiconreg Ultra Centrifugal Filter (Millipore) com poro de
10000 Da A amostra foi centrifugada ateacute a obtenccedilatildeo de uma concentraccedilatildeo final de
5 mgml para os ensaios de cristalizaccedilatildeo Uma aliacutequota da proteiacutena concentrada foi
utilizada para anaacutelise por SDS-PAGE
316 Ensaios de Cristalizaccedilatildeo
Os ensaios de cristalizaccedilatildeo foram realizados empregando-se a teacutecnica de
difusatildeo de vapor em gota sentada utilizando-se os equipamentos disponiacuteveis no
Laboratoacuterio Robotizado de Cristalizaccedilatildeo de Proteiacutenas LNBio Os ensaios foram
feitos em placas de 96 poccedilos e as gotas preparadas pelo robocirc Honeybee
utilizando-se os kits disponiacuteveis no laboratoacuterio Crystal Screen HT (Hampton
Research) JCSG+ Suite (Molecular Dimensions) PACT Suite (Molecular
cd
MRWobs
10][
48
Dimensions) Precipitant Synergy (Rigaku Reagents) SaltRx HT (Hampton
Research) Wizard IampII (Rigaku Reagents)
317 Espalhamento de raio-X a baixo acircngulo (SAXS)
Atraveacutes da teacutecnica de SAXS informaccedilotildees sobre a massa molecular das
partiacuteculas espalhadoras e do raio de giro (Rg) da proteiacutena de estudo satildeo obtidos a
partir dos dados coletados Por meio de programas computacionais como DAMMIN
(SVERGUN1999) e GASBOR (SVERGUN et al 2001) um modelo de baixa
resoluccedilatildeo da forma da proteiacutena pode ser obtido
Os dados de SAXS foram obtidos na linha de luz D02A ndash SAXS2 no
Laboratoacuterio Nacional de Luz Siacutencrotron (LNLS) Campinas-SP Brasil usando
comprimento de onda de 148 A e um detector bidimensional com arranjo CCD
(MARCCD USA) de 165 mm A distacircncia do detector para a amostra foi de 106804
mm e os dados na faixa de 002 nm-1 para 021 nm-1 foram coletados usando
proteiacutena pura nas concentraccedilotildees de 5 mgml em tampatildeo em 20 mM HEPES pH 74
e 100 mM de cloreto de soacutedioExposiccedilotildees de 300 e 600 s foram realizadas e os
dados do tampatildeo foram coletados antes e depois dos dados da amostra para fazer a
correccedilatildeo do solvente e normalizaccedilatildeo do espalhamento
Ajuste dos dados experimentais e avaliaccedilatildeo da funccedilatildeo p(R) foram realizados
utilizando o programa GNOM (SVERGUN 1992) O envelope a baixa resoluccedilatildeo de
TcKAP7 foi determinado usando modelagem abnitio implementada no programa
DAMMIN O modelo a baixa resoluccedilatildeo e o modelo da estrutura tridimensional foram
superpostas usando o programa SUPCOMB (KOZIN amp SVERGUN 2001)
318 Modelagem de TcKAP7
Um modelo da estrutura tridimensional de TcKAP7 foi construiacutedo Para a
construccedilatildeo do modelo foi utilizado o programa MODELLER (SALI amp BLUNDELL
1993) este programa eacute utilizado para a modelagem por homologia a estruturas
tridimensionais de proteiacutenas O programa automaticamente constroacutei um modelo
baseado na anaacutelise de um alinhamento de sequecircncias entre a proteiacutena para a qual
se deseja construir o modelo e uma proteiacutena relacionada cuja estrutura
tridimensional jaacute foi resolvida A qualidade do modelo pode ser avaliada por
49
exemplo atraveacutes de graacuteficos e tabelas que analisam restriccedilotildees quiacutemicas e fiacutesicas de
cada aacutetomo constituinte do modelo
319 Obtenccedilatildeo de antissoro policlonal contra TcKAP7
A proteiacutena TcKPA7 recombinante purificada foi inoculada em camundongos
da linhagem BALBc por via intraperitonial com 4 aplicaccedilotildees de aproximadamente
20-50 μg de antiacutegeno em intervalos de 15 dias seguida de obtenccedilatildeo do soro apoacutes 1
semana da uacuteltima inoculaccedilatildeo O antiacutegeno foi emulsificado em adjuvante completo de
Freund na primeira inoculaccedilatildeo e com adjuvante a base de hidroacutexido de alumiacutenio
(Alu-Gel Serva) nas inoculaccedilotildees posteriores
320 Anaacutelise da expressatildeo do gene TcKAP7 e de seu mutante por ensaio tipo
western blot
Este procedimento foi executado segundo o meacutetodo de Towbin e
colaboradores (1979) Aliacutequotas de extratos de T cruzi equivalentes a 1 x 107
ceacutelulas foram submetidos agrave SDS-PAGE Apoacutes a separaccedilatildeo eletroforeacutetica as
proteiacutenas foram transferidas para membrana de nitrocelulose (Hybond C Amersham
Biosciences) em tampatildeo de western por 2 h a 60 V ou 20 V por 16 h Apoacutes a
transferecircncia a membrana foi corada com Ponceau S e descorada suavemente com
aacutegua bidestilada para a identificaccedilatildeo das bandas do marcador de massa molecular
A membrana foi entatildeo incubada em soluccedilatildeo de bloqueio por 30 min sob agitaccedilatildeo
suave
Apoacutes o bloqueio a membrana foi incubada com os soros policlonais ou
anticorpos monoclonais em TBST-leite por aproximadamente 1 h a 37degC A
membrana foi lavada 5 vezes com TBST Em seguida a membrana foi incubada
com anticorpo secundaacuterio anti-IgG de camundongo conjugado com a enzima
peroxidase (Pierce ndash Thermo Scientific) por 1h na diluiccedilatildeo de 16000 em TBST-leite
a temperatura ambiente A membrana foi submetida a mais cinco lavagens com
TBST e a reaccedilatildeo era evidenciada utilizando substrato quimioluminescente (West
Pico Pierce ndash ThermoScientific) sobre a membrana a qual era exposta a um filme
para raios-X (Hyperfilm ECL GE)
50
321 Superexpressatildeo de TcKAP7
3211 Amplificaccedilatildeo e clonagem do gene TcKAP7 no vetor pNEO3xFlag para
superexpressatildeo da proteiacutena
O gene TcKAP7 foi clonado no vetor pNEO3xFLAG construiacutedo no nosso
laboratoacuterio a partir do vetor pTcGW-ProtCcarboxi (BATISTA et al 2010) que utiliza
o sistema Gateway de clonagem (Invitrogen) Os vetores foram construiacutedos
utilizando-se como base o pBluescript II (Stratagene San Diego USA) onde foram
inseridas trecircs sequencias que codificam para regiotildees intergecircnicas (IR) de T cruzi A
primeira TcUIR eacute a regiatildeo intergecircnica do locus de ubiquitinacalmodulina de T
cruzi (BATISTA et al 2010) As outras duas regiotildees intergecircnicas ITR1 e ITR2 foram
selecionadas a partir de genes de copia uacutenica no genoma e que possuem um niacutevel
de expressatildeo constitutivo nos estaacutegios epimastigota e tripomastigota metaciclicos
avaliados por dados de proteocircmica e RNAseq (Comunicaccedilatildeo pessoal Michel
Batista) Aleacutem disso esse vetor confere agrave regiatildeo C-terminal da proteiacutena
recombinante resultante da clonagem neste vetor trecircs etiquetas FLAG (sequecircncia
DYKDDDDK) em tandem (FIGURA 10)
FIGURA 10 VETOR PARA EXPRESSAtildeO EM T CRUZI P3XFLAG
LEGENDA PR ndash PROMOTOR RIBOSOMAL TCUIR ITR1 E ITR2 - REGIOtildeES INTERGENICAS ATTR1 E ATTR2 ndash REGIOtildeES PARA RECOMBINACcedilAtildeO CMreg - RESISTEcircNCIA A CLORANFENICOL CCDB ndash GENE PARA SELECcedilAtildeO NEGATIVA DURANTE A CLONAGEM 3XFLAG ndash TREcircS ETIQUETAS DE FLAG (DYKDDDDK) NEOMICINA ndash GENE DE RESISTEcircNCIA A NEOMICINA
O gene TcKAP7 foi amplificado utilizando os primers especiacuteficos
KAP7GtwFor (5rsquo-
GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTGCCCGCGAAGTATTCAGCAGCCC)
e KAP7GtwRev (5rsquo-
GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCGTGGTACATGGCGTACGGGTTG)
PR TcUIR Att R1 Cmreg ccdB Att R2 3x Flag ITR1 Neomicina ITR2
51
os quais possuem os siacutetios attB indicados em negrito As condiccedilotildees desta reaccedilatildeo
de PCR foram as seguintes 100 ng de DNA genocircmico de T cruzi 10 pmol de cada
primer 200 μM de cada dNTP MgSO4 2 mM tampatildeo Taq DNA polimerase High
Fidelity 1x 1U de Platinum Taq DNA polimerase high fidelity (Invitrogen) A reaccedilatildeo
de PCR foi processada no termociclador modelo 9700 (AppliedBiosystems EUA)
com a desnaturaccedilatildeo do material por 5 min a 94 degC seguida de 35 ciclos constando
de desnaturaccedilatildeo a 94 degC por 30 s hibridizaccedilatildeo dos primers a 58 degC por 30 s e
extensatildeo a 72 degC por 15 min
O gene amplificado foi clonado no vetor de entrada pDONRtrade221
(Invitrogen) A reaccedilatildeo foi feita com 150 ng dos produtos de PCR contendo os siacutetios
attB 150 ng do plasmiacutedeo pDONRtrade221 1 μL de BP ClonaseTM enzyme mix e TE
para um volume final de 10 μL e com incubaccedilatildeo a 25 degC por 16 h Foi entatildeo
adicionado 1 microL de proteinase K (2 mgmL) com incubaccedilatildeo por 10 min a 37 degC Os
clones em pDONRtrade221 foram transformados em ceacutelulas caacutelcio-competentes E coli
DH5α conforme protocolo de transformaccedilatildeo de ceacutelulas caacutelcio-competentes Apoacutes
transformaccedilatildeo a cultura foi semeada em placa de LBKan (kanamicina 25 microgmL) e
incubada a 37 degC durante 16 h
Para verificar a presenccedila de clones com os insertos de interesse foi feita a
teacutecnica da palitagem As colocircnias selecionadas foram inoculadas em 5 mL de meio
LBKan e incubadas por 16 h a 37 degC com agitaccedilatildeo (190 rpm) A purificaccedilatildeo dos
plasmiacutedeos foi realizada com o kit QIAprepreg Spin Miniprep (Qiagen) conforme
orientaccedilotildees do fabricante
Apoacutes esta etapa foi necessaacuterio transferir os insertos para o vetor de destino
pNEO3xFlag A troca de insertos entre os vetores de entrada e destino denominada
de reaccedilatildeo LR foi realizada conforme orientaccedilotildees do fabricante (Gateway LR clonase
enzyme mix) e ceacutelulas caacutelcio-competentes foram transformadas com os produtos
das recombinaccedilotildees conforme descrito anteriormente semeadas em placas de
LBAmp e incubadas a 37 degC durante 16 h
A verificaccedilatildeo de clones positivos foi realizada atraveacutes de PCR de colocircnias
As colocircnias selecionadas foram inoculadas em 5 mL de meio LB contendo ampicilina
(100 μgmL) e incubada a 37deg C por 16 h sob agitaccedilatildeo (200 rpm)O plasmiacutedeo
contendo o gene TcKAP7 foi denominado de pNEO_KAP7_3xFLAG
52
3212 Transfecccedilatildeo por eletroporaccedilatildeo
A transfecccedilatildeo das formas epimastigotas de T cruzi foi feita pela teacutecnica de
eletroporaccedilatildeo utilizando o equipamento genepulserreg apparatus (Bio-Rad) e cubetas
esteacutereis de eletroporaccedilatildeo gene pulsermicro pulserreg 02 cm (Bio-Rad) Formas
epimastigotas de T cruzi foram cultivadas em meio LIT ateacute uma densidade celular
de 3 x 107 ceacutelulasml Um volume de cultura correspondendo a 1 x 109 parasitas foi
centrifugado (4000 x g 4 degC) O sobrenadante foi descartado e as ceacutelulas foram
ressuspendidas em tampatildeo de eletroporaccedilatildeo esteacuteril e submetidas a centrifugaccedilatildeo
nas condiccedilotildees acima O sedimento celular foi ressuspendido em 2 ml de tampatildeo de
eletroporaccedilatildeo Em cubetas de eletroporaccedilatildeo previamente resfriadas a 4 degC foram
misturados 400 μL (2 x 108 ceacutelulas) da suspensatildeo dos parasitas e 50 μL (20 microg) do
plasmiacutedeo para superexpressatildeo (pNEO_KAP7_3XFLAG) Em paralelo parasitas
foram submetidos agraves mesmas condiccedilotildees mas na ausecircncia de DNA (controle
negativo da transfecccedilatildeo)
As cubetas foram entatildeo mantidas em gelo por 10 min Em seguida os
parasitas foram transfectados com dois pulsos sequenciais de 500 μF e 450 volts
Apoacutes o esse procedimento as cubetas foram mantidas em gelo por mais 5 min A
suspensatildeo de parasitas transfectados foi entatildeo inoculada em 10 mL de meio LIT
suplementado com 10000 U de penicilina e estreptomicina a 10 μgmL
3213 Seleccedilatildeo dos transfectantes
O gene para a enzima neomicina fosfotransferase foi utilizado como
marcador de seleccedilatildeo dos parasitas carregando o plasmiacutedeo para a superexpressatildeo
pNEO_KAP7_3XFLAG Para tanto o antibioacutetico G418 foi adicionado agraves culturas
apoacutes 24 h da transfecccedilatildeo na concentraccedilatildeo final de 500 μgmL Entre 3 e 4 dias apoacutes
a transfecccedilatildeo foi realizada a primeira passagem (14) A partir desse ponto foram
feitas passagens semanais na proporccedilatildeo de 110 ateacute que natildeo fosse observado
crescimento nas duas uacuteltimas passagens da cultura do controle negativo da
transfecccedilatildeo
A expressatildeo da proteiacutena KAP7-FLAG foi analisada atraveacutes de ensaios de
western blot e imunofluorescecircncia
53
322 Deleccedilatildeo do gene TcKAP7 por nocaute gecircnico
3221 Amplificaccedilatildeo e clonagem das regiotildees a montante e a jusante do gene
TcKAP7
As regiotildees a montante (upstream) e a jusante (downstream) do gene TcKAP7
respectivamente denominadas de UPSKAP7 (521 pb) e DOWNKAP7 (500 pb)
foram amplificadas por PCR usando os primers descritos nas TABELAS 1 E 2 A
regiatildeo denominada DOWNKAP7 conteacutem ainda 139 pb do final da regiatildeo codante de
TcKAP7
QUADRO 1 - RELACcedilAtildeO DOS PRIMERS UTILIZADOS PARA A CLONAGEM DA
REGIAtildeO UPSTREAM DE TcKAP7 NO VETOR pNEO1
UPSKAP7F GGGGTCGACCGTTGCTGGTTTTTCTTTTGGTGT
UPSKAP7R GGGAAGCTTGCTTCAAAACGTCTATGCGGGC
Os siacutetios das enzimas de restriccedilatildeo SalI (GTCGAC) e HindIII (AAGCTT) adicionados aos primers estatildeo em negrito
QUADRO 2 - RELACcedilAtildeO DOS PRIMERS UTILIZADOS PARA A CLONAGEM DA
REGIAtildeO DOWNSTREAM DE TcKAP7 NO VETOR pNEO1
DOWNKAP7F GGGGAATTCGCCTCATATGACGCATCTCCCA
DOWNKAP7R GGGGGATCCTGTTGGCGCTGTCAAGGAAGTAAG
Os siacutetios das enzimas de restriccedilatildeo EcoRI (GAATTC) e BamHI (GGATCC) adicionados aos primers estatildeo em negrito
As reaccedilotildees de PCR foram realizadas nas seguintes condiccedilotildees 100 ng de
DNA total de T cruzi Dm28c 10 pmol dos oligonucleotiacutedeos F e R 200 μM de cada
dNTP MgCl2 15 mM tampatildeo Taq DNA polimerase 1x 25 unidades de Taq DNA
polimerase (Invitrogen EUA) A reaccedilatildeo de PCR foi processada no termociclador
modelo 9700 (Applied Biosystems EUA) nas seguintes condiccedilotildees Desnaturaccedilatildeo do
54
material por 4 min a 94 degC seguida de 35 ciclos de desnaturaccedilatildeo a 92 degC por 30 s
hibridizaccedilatildeo dos oligonucleotiacutedeos a 56 degC por 30 s e extensatildeo a 72 degC por 1 min O
material amplificado foi purificado usando o Qiaquick PCR Purification (Qiagen) O
DNA purificado foi digerido com enzimas de restriccedilatildeo apropriadas para a clonagem
dos fragmentos nos vetores pNEO1 O plasmiacutedeo resultante da clonagem das
regiotildees UPSKAP7 e DOWNKAP7 foi denominado de pNEO1kap7 (Figura 11A)
Uma vez que o genoma do T cruzi eacute diploide construiacutemos um segundo
plasmiacutedeo para o nocaute do segundo alelo do gene TcKAP7 tendo como marca de
seleccedilatildeo o gene que codifica resistecircncia a higromicina B Esse plasmiacutedeo foi
construiacutedo usando como molde o plasmiacutedeo pNEO1kap7 O plasmiacutedeo pNEO1kap7
foi digerido com HindIII para remoccedilatildeo do gene neo e uma pequena porccedilatildeo da regiatildeo
DOWNSTREAM (220 pb) O plasmiacutedeo linearizado foi purificado do gel de agarose
usando o kit Qiaquick PCR Purification (Qiagen) e ligado com o gene higro O gene
higro foi amplificado usando os primers HIGROF
(GGGGGAAGCTTATGAAAAAGCCTGAACTCACCGCGAC) e HIGROR
(GGGAAGCTTCTATTCCTTTGCCCTCGGACGAGTGCTG) ambos contendo na
extremidade 5rsquo o siacutetio para a enzima de restriccedilatildeo HindIII (em negrito) O plasmiacutedeo
resultante da ligaccedilatildeo foi denominado de pHIGRO1kap7 (FIGURA 11B)
55
FIGURA 11 ESQUEMA DA CONSTRUCcedilAtildeO DOS VETORES UTILIZADOS PARA O NOCAUTE DO GENE TcKAP7 LEGENDA Nesta figura eacute observada a inserccedilatildeo das sequecircncias flanqueadoras do gene TcKAP7 juntamente com os respectivos siacutetios para cada enzima de restriccedilatildeo nos vetores de clonagem pNEO1 e pHIGRO1
3222 Amplificaccedilatildeo dos cassetes UPS-NEO-DOWN e UPS-HIGRO-DOWN para
transfecccedilatildeo de T cruzi
Os dois plasmiacutedeos recombinantes foram purificados pelo meacutetodo da lise
alcalina utilizando o kit de minipreparaccedilatildeo de plasmiacutedeos (Qiagen) As minipreps
foram utilizadas para a amplificaccedilatildeo da regiatildeo UPS-NEO-DOWN (cassete NEO) e da
regiatildeo UPS-HIGRO-DOWN (cassete HYG) por PCR usando os primers UPSKAP7F
e DOWNKAP7R As reaccedilotildees de PCR foram realizadas nas seguintes condiccedilotildees 20
ng do plasmiacutedeo pNEO1kap7 ou pHIGRO1kap7 10 pmol dos primers UPSKAP7F e
DOWNKAP7R 200 μM de cada dNTP MgCl2 15 mM tampatildeo Taq DNA polimerase
1x 25 unidades de Taq DNA polimerase (Invitrogen EUA) A reaccedilatildeo de PCR foi
processada no termociclador modelo 9700 (AppliedBiosystems EUA) nas seguintes
condiccedilotildees Desnaturaccedilatildeo do material por 4 min a 94 degC seguida de 35 ciclos de
desnaturaccedilatildeo a 92 degC por 30 s hibridizaccedilatildeo dos oligonucleotiacutedeos a 56 degC por 30 s e
56
extensatildeo a 68 degC por 2 min O material amplificado foi submetido agrave eletroforese em
gel preparativo de agarose 1 O gel foi corado com brometo de etiacutedeo (1 μgml) e a
banda correspondente a cada cassete foi removida do gel com auxiacutelio de uma
lacircmina de bisturi O DNA foi purificado por eletroeluiccedilatildeo dentro de saco de diaacutelise
nas condiccedilotildees de 100 V por 1 hora em tampatildeo TBE Para obter massa de DNA
suficiente para a transfecccedilatildeo (20 μg) foram feitas 10 reaccedilotildees de PCR com 100 μl
cada uma
3223 Transfecccedilatildeo do T cruzi com o cassete UPS-NEO-DOWN
Formas epimastigotas de T cruzi foram cultivadas em meio LIT ateacute 2 x 107
ceacutelulasml Os parasitas (1 x 108 ceacutelulas) foram coletados por centrifugaccedilatildeo a 6000
x g por 10 min a 4 degC O sedimento celular foi lavado com PBS esteacuteril e
ressuspendido em 1 ml de soluccedilatildeo de eletroporaccedilatildeo Volumes correspondentes a
04 ml da suspensatildeo de ceacutelulas foram transferidos para cubetas de eletroporaccedilatildeo
esteacutereis (02 cm de gap) (BioRad) e preacute-resfriadas Em uma delas foram adicionados
de 20 μg do fragmento representando o cassete NEO A outra cubeta contendo
apenas a suspensatildeo de parasitas foi usada como controle Apoacutes 10 minutos no gelo
as amostras contidas nas cubetas foram submetidas a 2 pulsos de 450 volts 500
microF utilizando o eletroporadorGenePulserreg IIApparatus (Bio-Rad) As amostras
foram incubadas novamente por 5 a 10 minutos no gelo em seguida foram
transferidas para garrafas de cultura de 25 cm2 contendo 10 ml de meio LIT
(suplementado com 10000 U de penicilina e estreptomicina a 10 mgml) As culturas
foram entatildeo incubadas a 28 degC Apoacutes 24 horas de incubaccedilatildeo adicionou-se o
antibioacutetico G418 na concentraccedilatildeo de 500 μgml As culturas foram mantidas por
sucessivas passagens (diluiccedilatildeo de 110) em meio LIT suplementado com G418 a
cada 8-10 dias ateacute a ausecircncia de proliferaccedilatildeo celular na cultura controle Os
parasitas nos quais TcKAP7 foi substituiacutedo pelo gene neo foram denominados deT
cruzi(kap7kap7neo) e foram testados para a correta inserccedilatildeo do gene neo no locus
genocircmico de TcKAP7
57
3224 Extraccedilatildeo de DNA dos transfectantes
T cruzi transfectado com o cassete NEO (T cruzi(kap7kap7neo) foi cultivado
em meio LIT suplementado com G418 (500 μgml) ateacute uma densidade de 3 x 107
ceacutelulasml Os parasitas foram coletados por centrifugaccedilatildeo por 1 min a 6000 x g e
lavados com PBS Em seguida os parasitas foram lisados gentilmente em 350 μl de
tampatildeo TELT conforme descrito no item 34
3225 Anaacutelise por PCR do DNA dos parasitas transfectados com o cassete
UPS-NEO-DOWN
As reaccedilotildees de PCR foram realizadas utilizando primers externos EXTF
(CCCGCTACGACTGCCCTCCACGCGGAAGGGAA) e EXTR
(AAGTAAACGGGAGAAGCAACACGATGGGAGGCTC) que natildeo estatildeo presentes na
construccedilatildeo do cassete UPS-NEO-DOWN combinados com os primers NEOF
(GGGGAAGCTTATGATTGAACAAGATGGATTGCACGCAG) e NEOR
(GGGGGAATTCAGAAGAACTCGTCAAGAAGGCGATAGAA)
As condiccedilotildees das reaccedilotildees foram as seguintes 100 ng do DNA total de T
cruzi Dm28c tipo selvagem (T cruzi(kap7kap7) ou tipo selvagem) ou do DNA da
populaccedilatildeo T cruzi(kap7kap7neo) (mutante simples nocaute) 10 pmol dos primers EXTF
+ NEOR e NEOF + EXTR 200 μM de cada dNTP MgCl2 15 mM tampatildeo Taq DNA
polimerase 1x 25 unidades de Taq DNA polimerase (Invitrogen EUA) A reaccedilatildeo de
PCR foi processada no termociclador modelo 9700 (AppliedBiosystems EUA) nas
seguintes condiccedilotildees Desnaturaccedilatildeo do material por 4 min a 94 degC seguida de 35
ciclos de desnaturaccedilatildeo a 92 degC por 30 s hibridizaccedilatildeo dos oligonucleotiacutedeos a 55 degC
por 30 s e extensatildeo a 72 degC por 2 min
3226 Transfecccedilatildeo do T cruzi com o cassete UPS-HIGRO-DOWN
Formas epimastigotas da populaccedilatildeo mutante de T cruzi (kap7kap7neo) foram
cultivadas em meio LIT suplementado com G418 (500 μgml) ateacute a densidade de 2 x
107 ceacutelulasml Os parasitas (1 x 108 ceacutelulas) foram coletados por centrifugaccedilatildeo a
6000 x g por 10 min a 4 degC e submetidos ao processo de eletroporaccedilatildeo como
descrito no item 3202 Para a transfecccedilatildeo foram usados 20 μg do fragmento
58
representando o cassete UPS-HIGRO-DOWN As culturas (transfectada e controle)
foram entatildeo incubadas a 28 degC em LIT suplementado de G418 Apoacutes 24 horas de
incubaccedilatildeo foi adicionado o antibioacutetico higromicina ao meio de cultura na
concentraccedilatildeo de 500 μgml As culturas foram mantidas por sucessivas passagens
(diluiccedilatildeo de 110) em meio LIT suplementado com G418 e higromicina a cada 8-10
dias ateacute a ausecircncia de proliferaccedilatildeo celular na cultura controle Mutantes nos quais
os dois alelos de TcKAP7 foram removidos e substituiacutedos pelos genes NEO e
HIGRO foram denominados com genoacutetipo T cruzi (kap7neokap7higro)
3227 Anaacutelise por PCR do DNA dos parasitas transfectados com o cassete
UPS-HIGRO-DOWN
As reaccedilotildees de PCR foram realizadas utilizando primers externos EXTF e
EXTR (item 3225) combinados com os primers HIGROF e HIGROR (item 3221)
As reaccedilotildees de PCR foram realizadas nas seguintes condiccedilotildees 100 ng do
DNA total de T cruzi(kap7kap7) ou do DNA do T cruzi(kap7neokap7higro) 10 pmol dos
primers EXTF + HIGROR e HIGROF + EXTR 200 μM de cada dNTP MgCl2 15
mM tampatildeo Taq DNA polimerase 1x 25 unidades de Taq DNA polimerase
(Invitrogen EUA) A reaccedilatildeo de PCR foi processada no termociclador modelo 9700
(Applied Biosystems EUA) nas seguintes condiccedilotildees Desnaturaccedilatildeo do material por
4 min a 94 degC seguida de 35 ciclos de desnaturaccedilatildeo a 92 degC por 30 s hibridizaccedilatildeo
dos oligonucleotiacutedeos a 55 degC por 30 s e extensatildeo a 72 degC por 2 min
3228 Anaacutelise da organizaccedilatildeo do gene TcKAP7 e da eficiecircncia de seu nocaute
atraveacutes de ensaio do tipo Southern blot
O DNA genocircmico (5 μg) de T cruzikap7kap7 e T cruzikap7neokap7higro foi
submetido a digestatildeo com a enzima de restriccedilatildeo HindIII de acordo com as
especificaccedilotildees do fornecedor Apoacutes 3 horas o DNA digerido foi submetido agrave
eletroforese em gel de agarose 08 em tampatildeo TBE a 100 V O gel foi corado por
brometo de etiacutedio (05 μgmL) e fotografado sob a luz ultravioleta (310 nm)
Posteriormente o gel foi tratado com soluccedilotildees de depurinaccedilatildeo por 15 minutos de
desnaturaccedilatildeo por 30 minutos (2 vezes) e soluccedilatildeo de neutralizaccedilatildeo por 30 minutos (2
vezes) O DNA foi transferido para uma membrana de nylon (Hybond N
59
AmershamBiosciences) por capilaridade (SAMBROOK et al 1989) utilizando-se de
uma ldquoponterdquo de papel 3 MM embebido em SSC 20X Apoacutes a transferecircncia o DNA foi
fixado agrave membrana por exposiccedilatildeo agrave luz ultravioleta com uma dose de 120 mJcm2
usando o aparelho Spectrolinker (Spectronicscorp USA) A membrana contendo o
DNA de T cruzi foi preacute-hibridizada em soluccedilatildeo de hibridizaccedilatildeo de DNA por 1 hora a
65 ordmC seguido da adiccedilatildeo da sonda marcada radioativamente com α-[P32
]-dCTP (10
μCiμl 3000 Cimmol) (Amersham Biosciences) preparada segundo meacutetodo de nick
translation descrito por Rigbyet al (1977) utilizando-se o meacutetodo de iniciaccedilatildeo por
random primers (Megaprimer DNA labeling kit ndash GE) conforme recomendaccedilotildees do
fabricante
Foram utilizadas 3 sondas satildeo elas fragmento do gene TcKAP7
correspondendo a regiatildeo compreendida entre os nucleotiacutedeos 1 e 560 o gene neo e
o gene higro Apoacutes a marcaccedilatildeo as sondas foram purificadas em colunas de
Sephadex G-50 (ProbeQuant ndash Amersham Biosciences) e adicionadas ao tampatildeo de
hibridizaccedilatildeo na concentraccedilatildeo de 5 x 106
cpmml As membranas foram incubadas
por 16 horas a 65 C e em seguida lavadas nesta temperatura duas vezes por 30
minutos com soluccedilotildees de alta meacutedia e baixa estringecircncia As membranas foram
expostas a filme de raio-X (Hyperfilmreg Amersham Biosciences) na presenccedila de tela
intensificadora (Dupont Cronex Lightining Plus) por tempo que varia entre 1 a 3 dias
a ndash70 C
323 Localizaccedilatildeo celular da proteiacutena TcKAP7 atraveacutes de ensaio de
imunofluorescecircncia
Formas epimastigotas de T cruzi foram coletadas por centrifugaccedilatildeo (4000 times
g 3 a 10 ordmC) lavadas duas vezes em PBS e depositadas sobre lacircminas de vidro
previamente tratadas com poli-L-lisina 001 diluiacuteda em PBS Os parasitas foram
entatildeo fixados com paraformaldeiacutedo 4 em PBS permeabilizados com Triton X-100
01 em PBS por 2 min agrave temperatura ambiente e incubados a 4ordmC durante 16 h
em soluccedilatildeo de bloqueio para imunofluorescecircncia (PBS 1X + BSA 1 ) Apoacutes o
bloqueio os parasitas foram incubados agrave temperatura ambiente por 1 h com o
anticorpo monoclonal anti-FLAG em uma diluiccedilatildeo de 11000 em soluccedilatildeo de bloqueio
para imunofluorescecircncia Depois disso as lacircminas foram submetidas a 5 lavagens
60
de 5 min cada em PBS Em seguida os parasitas foram incubados agrave temperatura
ambiente por 1 hora com o anticorpo secundaacuterio anti-IgG de camundongo conjugado
ao fluoroacuteforo Alexa Fluacuteor 488 (Invitrogen) diluiacutedo 1600 em soluccedilatildeo de bloqueio As
lacircminas foram lavadas 5 vezes com PBS e posteriormente incubadas com o corante
Hoechst 33342 (Invitrogen) a 2 μgμL em PBS por 5 min Apoacutes cinco lavagens com
PBS as lacircminas foram montadas com ProLong Gold Antifade (Invitrogen) sobre uma
lacircmina de microscopia oacutetica O material foi observado nos microscoacutepios Leica SP5 e
DMI6000
324 Anaacutelise da ultraestrutura do cinetoplasto do mutante de T cruzi para
TcKAP7 por microscopia eletrocircnica de transmissatildeo
Os parasitas foram coletados lavados com PBS e fixados em soluccedilatildeo
contendo 25 de glutaraldeiacutedo 4 de paraformaldeiacutedo e tampatildeo cacodilato 01 M
Em seguida os parasitas foram fixados por 1 h em soluccedilatildeo de 1 de tetroacutexido de
Oacutesmio e 08 de ferricianeto de potaacutessio diluiacutedos em tampatildeo cacodilato 01 M As
ceacutelulas foram entatildeo desidratadas em soluccedilatildeo contendo concentraccedilotildees crescentes
de acetona e incluiacutedas em Epon Apoacutes a obtenccedilatildeo de cortes ultrafinos dos parasitas
os mesmos foram contrastados em acetato de uranila e citrato de Chumbo antes de
serem observados e fotografados no microscoacutepio eletrocircnico de transmissatildeo Zeiss
900
325 Coloraccedilatildeo dos parasitas transfectados
A coloraccedilatildeo dos parasitas foi realizada pelo meacutetodo panoacutetico raacutepido
(Laborclin Pinhais Paranaacute Brasil) modificado
Formas epimastigotas do mutante de T cruzi para TcKAP7 foram cultivadas
como descrito no item 321 Os parasitas foram coletados por centrifugaccedilatildeo de 1
min a 4000 x g e ressuspensos em PBS Desta suspensatildeo uma gota foi retirada e
depositada sobre lacircminas previamente limpas Quando secas as lacircminas foram
imersas individualmente na Soluccedilatildeo 1 (Fixador) Soluccedilatildeo 2 (Revelador) e Soluccedilatildeo 3
(Corante) em cada uma por 30 s Apoacutes este processo as lacircminas foram lavadas em
aacutegua corrente secas agrave temperatura ambiente e cobertas com Permount e lamiacutenula
Os parasitas foram visualizados em microscoacutepio Nikon E600
61
326 Infecccedilatildeo de ceacutelulas Vero com o mutante de T cruzi para TcKAP7
Ceacutelulas Vero (ATCCreg Nuacutemero CRL-2783trade) foram cultivadas em garrafas
de 150 cm2 contendo meio RPMI suplementado com 5 de soro fetal bovino
(GIBCO) penicilina 100 UIml streptomicina 10 microgml e glutamina 2 mM a 37 o C
com 5 de CO2 Ao atingirem a confluecircncia (80 a 100) realizou-se a passagem
atraveacutes de tripsinizaccedilatildeo e foi feito um inoacuteculo de 1 x 107 ceacutelulas para cada nova
garrafa de 150 cm2 Apoacutes 24 horas estas ceacutelulas (50 ndash 70 de confluecircncia) foram
infectadas com formas metaciacuteclicas obtidas da diferenciaccedilatildeo do mutante de T cruzi
para TcKAP7 em microplacas de 24 poccedilos contendo lamiacutenulas de vidro com
diacircmetro de 13 mm A cada poccedilo foram adicionadas 2 x 104 ceacutelulas Vero Apoacutes 24
horas de cultivo as ceacutelulas foram infectadas com tripomastigotas metaciacuteclicos
(obtidos do sobrenadante das culturas de T cruzi diferenciados em meio TAU3AAG
sem purificaccedilatildeo na coluna de DEAE celulose) A infecccedilatildeo das ceacutelulas Vero foi
acompanhada diariamente por microscopia de contraste de fase
327 Anaacutelise da funccedilatildeo do gene TbKAP7 de Trypanosoma brucei atraveacutes de
ensaios de RNA de interferecircncia
Com o intuito de complementar os estudos da funccedilatildeo do gene TcKAP7 foi
utilizada a teacutecnica de RNA de interferecircncia O uso dessa metodologia compreende
uma abordagem alternativa agrave anaacutelise da funccedilatildeo gecircnica para genes ortoacutelogos deT
brucei por anaacutelises de RNAi uma vez que a maquinaria de RNAi em T cruzi eacute
inexistente (DA ROCHA et al 2003) Os resultados podem gerar evidecircncias que
estejam relacionadas agrave funcionalidade dos genes em T cruzi Esta abordagem foi
utilizada neste trabalho para auxiliar no estudo da funccedilatildeo do gene TcKAP7 a partir
do ortoacutelogo em T brucei ainda natildeo caracterizadoTbKAP7 Os ensaios de RNAi
foram realizados em T brucei cepa 29-13 (WIRTZ et al 1999) com sistema induzido
por tetraciclina utilizando o vetor p2T7-177 ilustrado na figura 12 Este vetor quando
transfectado no parasita integra-se aos minicromossomos do T brucei regiatildeo de
repeticcedilotildees 177 (FOLDYNOVA-TRANTIRKOVA et al 2005)
62
FIGURA 12 MAPA DO VETOR p2T7-177 UTILIZADO PARA ENSAIOS DE RNAi LEGENDA T7 prom Promotor de T7 RNA Polimerase induzido por tetraciclina T7 term Terminador de transcriccedilatildeo 177 Sequumlecircncia repetitiva de 177 pares de bases para alvo de inserccedilatildeo em minicromossomos BLEO gene de resistecircncia agrave fleomicina GFP Proteiacutena Green FluorescentProtein os siacutetios para as enzimas de restriccedilatildeo estatildeo indicados AmpR gene de resistecircncia agrave ampicilina (FONTE WICKSTEAD et al 2002)
As regiotildees do mRNA para alvos nos ensaios de RNAi foram escolhidas com
o auxiacutelio da ferramenta RNAit da base de dados do Trypanofan - Genocircmica
funcional de Tbrucei (httptrypanofanpathcamacuktrypanofanmain)
(REDMOND et al 2003) Essas regiotildees foram amplificadas por PCR usando como
molde o DNA total de T brucei (100 ngreaccedilatildeo) 10 pmol dos primers listados na
tabela 3 200 mM de cada dNTP 15 mM de MgCl2 tampatildeo Taq DNA polimerase 1x
63
(Invitrogen) e 25 unidades de Taq DNA polimerase (Invitrogen) A reaccedilatildeo foi
aquecida por 4 min a 94 degC e entatildeo submetida a 35 ciclos de desnaturaccedilatildeo a 94 degC
por 30 s anelamento a 55 degC por 30 s e extensatildeo a 72 degC por 1 min Os primers
utilizados apresentam siacutetio para as enzimas de restriccedilatildeo BamHI (F) ou HindIII (R)
Os produtos de PCR foram purificados por extraccedilatildeo com fenol-clorofoacutermio e
digeridos com as referentes enzimas
QUADRO 3 - RELACcedilAtildeO DOS PRIMERS UTILIZADOS PARA A AMPLIFICACcedilAtildeO DO
GENE TbKAP7
KAP7RNAiF
AAAGGATCCCTAACCTAACCTGCAGGGTCTCTCG
KAP7RNAiR
GCGAAGCTTTTGTTCCTTTACAAACGCCC
Os siacutetios das enzimas de restriccedilatildeo BamHI (GGATCC) e HindIII (AAGCTT) adicionados aos primers estatildeo em negrito
As clonagens foram confirmadas por PCR de colocircnia e os plasmiacutedeos foram
purificados pelo kit QIAprep Spin Miniprep (Qiagen) Apoacutes purificaccedilatildeo 10 μg dos
plasmiacutedeos foram linearizados com a enzima NotI conforme descrito pelo fabricante
O DNA foi precipitado e ressuspenso em 50 μl de meio de eletroporaccedilatildeo ZPFM para
transfecccedilatildeo do T brucei
Para cada transfecccedilatildeo foi utilizado um total de 4 x 107parasitas em fase logariacutetmica
de crescimento Os parasitas foram obtidos por centrifugaccedilatildeo (5000 x g por 10 min
a 4 degC) lavados em meio ZPFM e ressuspensos em 500 μl do mesmo meio A
transfecccedilatildeo foi feita em cubetas de eletroporaccedilatildeo (4 mm) usando o eletroporador da
BioRad (GenePulser II Electroporator) As condiccedilotildees utilizadas foram dois pulsos de
1600 V e 25 microF Os parasitas foram entatildeo transferidos para garrafas contendo meio
SDM-79 SFB 10 higromicina 50 μgml e G418 15 μgml A seleccedilatildeo dos parasitas
transfectados foi atraveacutes da adiccedilatildeo de 5μgmL de fleomicina resistecircncia conferida
pelo vetor p2T7-177 apoacutes 24 horas de cultivo O tempo para seleccedilatildeo foi entre duas
e trecircs semanas
64
3271 Induccedilatildeo do RNA dupla fita
A induccedilatildeo da expressatildeo de RNA dupla fita referente agrave porccedilatildeo do gene
TbKAP7 clonado no plasmiacutedeo p2T7-177 deu-se pela adiccedilatildeo de tetraciclina 2 μgml
a uma cultura transfectada de T brucei em fase de crescimento exponencial (~2 x
106 parasitasml) Nos dias que se seguiram 1μgml de tetraciclina foi adicionada
diariamente agraves culturas A observaccedilatildeo dos efeitos na curva de crescimento causada
por RNAi em T brucei foi realizada ao longo de uma semana com a contagem de
ceacutelulas e adiccedilatildeo diaacuteria de tetraciclina 1 μgml
65
4 RESULTADOS
41 Clonagem e caracterizaccedilatildeo do gene TcKAP7
A regiatildeo codificante do gene TcKAP7 (ID Tc00104705350871950) foi
obtida a partir do banco de dados do genoma do T cruzi disponiacutevel no portal da
internet wwwgenedborg e amplificada por PCR com os primers descritos no item
37
No genoma do T cruzi cepa CL Brener (EL-SAYED et al 2005) foram
identificados dois haploacutetipos do gene TcKAP7 que foram denominados neste
trabalho de haploacutetipo A (Tc00104705350871950) e haploacutetipo B
(Tc00104705350979320) Neste trabalho foi utilizado o gene TcKAP7 proveniente
da cepa Dm28c de T cruzi Este gene apresenta uma regiatildeo codante de 747 pb e
codifica uma proteiacutena de 276 kDa assumindo que o primeiro ATG apoacutes a sequecircncia
do mini-eacutexon seja usada na iniciaccedilatildeo da traduccedilatildeo
A figura 13 abaixo mostra o alinhamento de TcKAP7 das cepas CL Brener e
Dm28c
FIGURA 13 - COMPARACcedilAtildeO ENTRE AS SEQUumlEcircNCIAS DE AMINOAacuteCIDOS DEDUZIDAS DO GENE KAP7 DE T cruzi Dm28C E DOS HAPLOacuteTIPOS DE CL BRENER
LEGENDA As posiccedilotildees com aminoaacutecidos idecircnticos em todas as sequumlecircncias estatildeo coloridas em preto
66
Embora o gene TcKAP7 natildeo possua grande identidade com os com genes
ortoacutelogos em Trypanosoma brucei TbKAP7 (714 pb) (Tb106k151470) Leishmania
major LmKAP7 (1044 pb) (LMJF_36_5840) Leishmania infantum LiKAP7 (1044 pb)
(LINJ_36_6090) e Leishmania braziliensis LbKAP7 (1038 pb) (LBRM_35_0010)
cujos genomas tambeacutem foram sequumlenciados (BERRIMAN et al 2005 IVENS et al
2005 PEACOCK et al 2007) as sequecircncias de aminoaacutecidos das respectivas
proteiacutenas deduzidas a partir desses genes ainda compartilham certo grau de
similaridade entre si (FIGURA 14) Na tabela 4 pode-se visualizar o percentual de
identidade entre as proteiacutenas KAP7 dos tripanossomatiacutedeos que possuem o genoma
sequenciado
FIGURA 14 COMPARACcedilAtildeO ENTRE AS SEQUumlEcircNCIAS DE AMINOAacuteCIDOS DEDUZIDAS DO GENE KAP7 EM DIFERENTES TRIPANOSOMATIacuteDEOS LEGENDA Em preto encontram-se os resiacuteduos de aminoaacutecidos idecircnticos em todas as sequumlecircncias e em cinza os resiacuteduos conservados na maioria delas
67
QUADRO 4 - PERCENTUAL DE IDENTIDADE ENTRE AS PROTEIacuteNAS KAP7 NOS
TRIPANOSSOMATIacuteDEOS COM O GENOMA SEQUENCIADO
Os valores foram obtidos pelo alinhamento utilizando a ferramenta Clustal21
Mesmo apresentando pouca identidade e variaccedilatildeo de tamanho alguns
dados do genoma sugerem que esses genes satildeo ortoacutelogos entre si Pode-se
perceber uma sintenia entre seus loci nas vaacuterias espeacutecies de tripanosomatiacutedeos
(Cavalcanti et al 2009) (FIGURA 15)
FIGURA 15- SINTENIA DE TcKAP7 COM OUTROS TRIPANOSOMATIacuteDEOS LEGENDA Os dois contigs de TcKAP7 (TcA e TcB) estatildeo representados nesta figura juntamente com os contigs de outros tripanosomatiacutedeos (Tb= T brucei Lm= L major Li= L infantum e Lb= L brasiliensis) mostrando que KAP7 representado pela cor amarela apresenta uma sintenia entre seus loci em todas as espeacutecies mostradas sendo flanqueado pelo gene KAP4 em T cruzi e T brucei representado em azul Portanto em L majorL infantum eL brasiliensis ao lado direito de KAP7 estaacute o gene de uma proteiacutena hipoteacutetica representado pela cor vermelha e ao lado esquerdo encontra-se o gene da KAP4 representado em azul como mencionado anteriormente FONTE CAVALCANTI et al 2009
68
A expressatildeo de vaacuterios genes mitocondriais de C fasciculata e L major eacute
regulada durante o ciclo celular em parte por uma sequumlecircncia consenso
[(CA)AUAGAA(GA)] presente nas regiotildees 5rsquo e 3rsquo-UTR dos respectivos mRNAs
(BROWN amp RAY 1997 MAHMOOD et al 1999 MAHMOOD amp RAY 1998 PASION
et al 1996 ZICK et al 2005)
Assim resolvemos caracterizar a regiatildeo 5rsquo-UTR do transcrito TcKAP7 na
tentativa de identificar sinais com identidade com aqueles encontrados em C
fasciculata Na figura 16 estaacute representada a regiatildeo 5rsquo-UTR do transcrito TcKAP7
com a sequumlecircncia parcial do mini-exon proveniente do primer usado na teacutecnica de
RT-PCR bem como parte da regiatildeo codificante do gene O mini-exon estaacute situado a
129 bases a jusante do iniacutecio da regiatildeo codificante do transcrito TcKAP7 e define
portanto uma regiatildeo 5rsquo-UTR de 168 bases considerando que o tamanho do mini-
exon eacute de 39 bases A anaacutelise da regiatildeo 5rsquo-UTR mostrou um elemento com
caracteriacutesticas muito semelhantes aquele envolvido na regulaccedilatildeo de genes em C
fasciculata (sequencia (G)ATAGAA(G) mostrada no retacircngulo preto na FIGURA
16B) sugerindo que TcKAP7 seja regulada durante o ciclo celular
69
A
B
FIGURA 16 CARACTERIZACcedilAtildeO DA REGIAtildeO 5rsquo-UTR DO TRANSCRITO TcKAP7 LEGENDA A Esquema geral da localizaccedilatildeo do mini-exon de TcKAP7 e B Localizaccedilatildeo especiacutefica do mini-exon de TcKAP7 O mini-exon de TcKAP7 (sequecircncia parcial em verde) estaacute localizado a 129 pb da regiatildeo codante (representada em parte pela cor azul) A regiatildeo 5rsquoUTR do transcrito Tckap7 estaacute representada na cor rosa A possiacutevel sequencia consenso de regulaccedilatildeo durante o ciclo celular estaacute indicada no retacircngulo preto
42 Expressatildeo da proteiacutena TcKAP7 em T cruzi
Formas epimastigotas foram transfectadas com o plasmiacutedeo pNEO3XFLAG
contendo o gene TcKAP7 (pNEO_KAP7_3xFLAG) A expressatildeo da proteiacutena
TcKAP7-FLAG foi analisada por ensaio de western blot Os resultados mostraram
que a expressatildeo da proteiacutena TcKAP7-FLAG foi satisfatoacuteria correspondendo ao
tamanho esperado (FIGURA 17 ) a qual foi confirmada pela reatividade do anticorpo
monoclonal especiacutefico para as etiquetas FLAG (anti-FLAG)
70
FIGURA 17 ANAacuteLISE DA EXPRESSAtildeO DA PROTEIacuteNA DE FUSAtildeO TCKAP7-FLAG EM FORMAS EPIMASTIGOTAS DE T CRUZI
43 Localizaccedilatildeo celular de TcKAP7 atraveacutes de ensaio de imunofluorescecircncia
Para verificar a localizaccedilatildeo celular de TcKAP7 foi realizado o ensaio de
imunofluorescecircncia Como natildeo foi possiacutevel a obtenccedilatildeo do anticorpo com alto tiacutetulo
contra a proteiacutena recombinante TcKAP7 neste ensaio foi utilizado o anticorpo
monoclonal anti-FLAG que reconhece a etiqueta FLAG a qual estaacute fusionada a
proteiacutena TcKAP7
Nessa figura pode-se observar que a proteiacutena de fusatildeo acumula-se na regiatildeo
dos poacutelos do cinetoplasto das formas epimastigotas do T cruzi (FIGURA 18)
indicando que TcKAP7 uma proteiacutena tipo histona H1 estaacute realmente associada com
o kDNA do parasita
71
FIGURA 18 IMUNOLOCALIZACcedilAtildeO DE TcKAP7 EM EPIMASTIGOTAS DE T CRUZI LEGENDAA contraste interferencial diferencial (DIC) B Hoechst marcando o nuacutecleo e o
cinetoplasto C fluorescecircncia mostrando a localizaccedilatildeo de TcKAP7 mais intensa na regiatildeo dos poacutelos
docinetoplasto dos protozoaacuterios D Aumento de C
44 Deleccedilatildeo do gene TcKAP7 por nocaute gecircnico
As teacutecnicas que permitem a remoccedilatildeo de um gene e sua substituiccedilatildeo por
genes repoacuterteres atraveacutes do processo de recombinaccedilatildeo tecircm sido usadas com
sucesso para verificaccedilatildeo da funccedilatildeo gecircnica em tripanosomatiacutedeos (MACRAE et al
2006) O nocaute gecircnico consiste na inserccedilatildeo de marcadores geneacuteticos de seleccedilatildeo
(gene codificando resistecircncia a neomicina ou higromicina entre outros) flanqueados
por sequumlecircncias pertencentes ao locus cromossocircmico de interesse Atraveacutes do
processo de recombinaccedilatildeo homoacuteloga o marcador pode entatildeo substituir o gene que
se quer estudar Desse modo pode ser possiacutevel analisar a funccedilatildeo de determinado
gene atraveacutes das alteraccedilotildees - decorrentes de sua ausecircncia - na fisiologia do
parasita No presente estudo os genes repoacuterteres que codificam resistecircncia aos
72
antibioacuteticos G418 e higromicina foram flanqueados por sequumlecircncias a montante e a
jusante da regiatildeo codificante do gene TcKAP7 As construccedilotildees foram usadas para
transfectarT cruzi e gerar mutantes para o gene TcKAP7 a fim de se estudar o
efeito que a ausecircncia do gene TcKAP7 causa no metabolismo do parasita
Apoacutes obtenccedilatildeo de uma populaccedilatildeo de T cruzi mutante para o gene TcKAP7
(kap7neokap7higro) resistente a ambos antibioacuteticos G418 e higromicina B o
DNA desta populaccedilatildeo foi extraiacutedo para anaacutelise por PCR e Southern blot a fim de
confirmar a eficiecircncia do nocaute
441 Anaacutelise por PCR do DNA dos parasitas transfectados com os cassetes
UPS-NEO-DOWN e UPS-HIGRO-DOWN
Foram realizadas vaacuterias reaccedilotildees de PCR a fim de confirmar a deleccedilatildeo do
gene TcKAP7 do genoma do T cruzi Dm28c e a substituiccedilatildeo dos seus alelos pelos
genes neo e higro As reaccedilotildees de PCR foram feitas com DNA de T cruzikap7kap7 (tipo
selvagem) e com DNA de T cruzikap7neokap7higro utilizando diversas combinaccedilotildees de
primers (TABELA 5) Na figura 32 observa-se que o gene TcKAP7 (747 pb) foi
amplificado somente na PCR realizada com DNA de T cruzi tipo selvagem (FIGURA
19 A canaleta 1) enquanto que os genes neo (795 pb) e higro (1026 pb) soacute foram
amplificados nas reaccedilotildees que conteacutem DNA da populaccedilatildeo do T cruzi kap7neokap7higro
(FIGURA 19 B canaletas 2 e 3) Os tamanhos esperados para amplificaccedilotildees usando
primers externos agraves construccedilotildees e os primers dos genes de resistecircncia foram
identificados no gel de agarose indicando que os cassetes se integraram
corretamente no locus do gene TcKAP7 (FIGURA 19 B canaletas 4 a 7) Um
esquema da localizaccedilatildeo dos primers utilizados nas reaccedilotildees de PCR pode ser
visualizado na figura 19 C
QUADRO 5 ndash COMBINACcedilOtildeES DE PRIMERS UTILIZADOS NA PCR PARA
CONFIRMAR O NOCAUTE DE TcKAP7
Pares de primers Tamanho esperado
(pb)
1 KAP7F + KAP7R 747
2 NEOF + NEOR 795
73
3 HIGROF + HIGROR 1026
4 EXTF + NEOR 1410
5 EXTF + HIGROR 1634
6 NEOF + EXTR 1358
7 HIGROF + EXTR 1360
74
FIGURA 19 ENSAIOS DE PCR UTILIZANDO DNA DE T cruzi kap7kap7 (WT) E
T cruzi kap7neokap7higro (NO) COM DIFERENTES PRIMERS
LEGENDA 1 KAP7F + KAP7R 2 NEOF + NEOR (795 pb) 3 HIGROF + HIGROR (1026 pb) 4
EXTF + NEOR (1410 pb) 5 EXTF + HIGROR (1634 pb) 6 NEOF + EXTR (1358 pb) e 7
HIGROF + EXTR (1360 pb) No quadro A encontram-se as PCRs realizadas com DNA de T cruzi kap7kap7 (WT) e no quadro B encontram-se as PCRs realizadas com DNA de T cruzi kap7neokap7higro
(NO) No quadro C estaacute um esquema da localizaccedilatildeo dos primers utilizados
442 Anaacutelise da organizaccedilatildeo dos genes TcKAP7 neo e higro por ensaio do
tipo Southern blot
Neste ensaio foi utilizado DNA total extraiacutedo de T cruzikap7kap7 (tipo selvagem)
e T cruzi kap7neokap7higro (duplo nocaute) Foram utilizadas trecircs sondas (1) Um
fragmento do gene TcKAP7 (primeiros 598 pb da CDS) (2) o gene neo e (3) o gene
higro O DNA total das duas amostras foi digerido com a enzima de restriccedilatildeo HindIII
O padratildeo de digestatildeo desta enzima pode ser visualizado na figura 20 De acordo
com o mapa de restriccedilatildeo a inserccedilatildeo do cassete neo no locus KAP7 geraria um
fragmento HindIIIHindIII de 1024 pb enquanto a inserccedilatildeo do cassete higro geraria
um fragmento de 1032 pb cujos tamanhos satildeo diferentes do fragmento
HindIIIHindIII do locus original (1776 pb) As hibridizaccedilotildees mostram bandas
compatiacuteveis com os tamanhos dos fragmentos HindIIIHindIII esperados para cada
situaccedilatildeo acima (FIGURA 21) Podemos observar que a sonda KAP7 somente
reconhece uma banda de tamanho esperado apenas no DNA do parasita selvagem
(canaleta 1 FIGURA 21) enquanto que bandas correspondentes aos genes neo e
higrosomente aparecem no DNA do mutante KAP7 (canaleta 2 FIGURA 21)
75
FIGURA 20 ndash REPRESENTACcedilAtildeO ESQUEMAacuteTICA DOS SIacuteTIOS DA ENZIMA HindIII NO LOCUS DO GENE KAP7 DE T cruzi CL Brener LEGENDA Este esquema representa esquematicamente em escala os genes kap3 neo e higro as regiotildees upstream e downstream e os siacutetios de clivagem da enzima KpnI
FIGURA 21 ANAacuteLISE DA ORGANIZACcedilAtildeO DOS GENES TCKAP7 NEO E HIGRO POR ENSAIO DO TIPO SOUTHERN BLOT LEGENDA A Autoradiograma e B Padrotildees dos fragmentos obtidos da digestatildeo do DNA com a enzima de restriccedilatildeo HindIII Foram utilizadas trecircs sondas TcKAP7 neomicina e higromicina 1) DNA de T cruzikap7kap7 (tipo selvagem) e 2) T cruzi kap7neokap7higro (duplo nocaute)
76
45 Comparaccedilatildeo da expressatildeo do gene TcKAP7 por western blot
O antisoro contra a proteiacutena TcKAP7 obtido apoacutes imunizaccedilatildeo dos
camundongos foi utilizado em ensaio do tipo western blot para avaliar se TcKAP7
ainda estava sendo expresso no T cruzi apoacutes o nocaute gecircnico
O que se observou foi novamente como esperado que a proteiacutena TcKAP7 natildeo eacute
mais expressa no T cruzi kap7neokap7higro (figura 22) Pode-se observar a presenccedila
de TcKAP7 ( aprox 28 kDa) no extrato das formas epimastigotas de T cruzi kap7kap7
(figura 22A) mas natildeo no extrato de epimastigotas de T cruzi
kap7neokap7higro (figura 22B)
FIGURA 22 COMPARACcedilAtildeO DA EXPRESSAtildeO DO GENE TcKAP7 POR WESTERN BLOT LEGENDA Imunoblot de extratos de epimastigotas de T cruzi kap7kap7 (A) e de T cruzi kap7neokap7higro (B) reagidos com anti-TcKAP7
46 Anaacutelise da morfologia e da ultraestrutura do cinetoplasto do mutante de T
cruzi para TcKAP7
Sabendo-se que TcKAP7 estaacute associada ao cinetoplasto e pode estar
envolvida na compactaccedilatildeo do kDNA do T cruzi como foi mostrado para as KAPs de
Crithidia fasciculata (XU amp RAY 1993 XU et al 1996 HINES amp RAY 1998) sua
ausecircncia poderia levar a alteraccedilatildeo na estrutura do DNA mitocondrial dos parasitas
nocauteados Portanto o primeiro passo foi verificar se havia alteraccedilotildees na
77
morforlogia do parasita Formas epimastigotas do mutante de T cruzi foram
analisadas ao microscoacutepio oacuteptico apoacutes coloraccedilatildeo Como pode ser observado na
figura 23 epimastigotas do mutante de T cruzi para TcKAP7 apresentam uma
morfologia fusiforme com o cinetoplasto caracteriacutestico em forma de barra localizado
anteriormente ao nuacutecleo natildeo se evidenciando portanto nenhuma alteraccedilatildeo em
relaccedilatildeo agrave morfologia dos parasitas do tipo selvagem
FIGURA 23 - COLORACcedilAtildeO PELO MEacuteTODO PANOacuteTICO RAacutePIDO DOS PARASITAS EPIMASTIGOTAS NOCAUTEADOS LEGENDA A) Formas epimastigotas B) Forma epimastigota em maior aumento
Formas epimastigotas de parasitas do tipo selvagem e nocauteados foram
entatildeo analisados pela teacutecnica de microscopia eletrocircnica de transmissatildeo para
visualizar com mais detalhe o cinetoplasto e verificar se sua estrutura estava
alterada pela ausecircncia da TcKAP7 (FIGURA 24) A figura 24A mostra um corte
ultrafino de um epimastigota de T cruzi do tipo selvagem que apresenta o
cinetoplasto compacto e em forma de bastatildeo caracteriacutestico de formas
epimastigotas sem nenhuma alteraccedilatildeo aparente O mesmo pode ser visto na figura
24B para o epimastigota de T cruzi nocauteado A disposiccedilatildeo estrutura e aspecto
do cinetoplasto de ambos os parasitas selvagem e nocauteado natildeo apresentaram
nenhuma diferenccedila entre si mostrando que mesmo apoacutes o nocaute da KAP7 a
estrutura do cinetoplasto permanece aparentemente inalterada
78
FIGURA 24 COMPARACcedilAtildeO ENTRE A ULTRAESTRUTURA DO CINETOPLASTO DO T cruzi DM28C TIPO SELVAGEM (A) E DO MUTANTE DE T cruzi PARA TcKAP7 (B) POR MICROSCOPIA ELETROcircNICA DE TRANSMISSAtildeO
79
47 Multiplicaccedilatildeo diferenciaccedilatildeo e infectividade do mutante de T cruzi para
TcKAP7
Os parasitas mutantes foram analisados a fim de verificar se alteraccedilotildees na
estrutura do kDNA pela ausecircncia de KAP7 natildeo estavam levando a alteraccedilotildees na
fisiologia do parasita alterando sua multiplicaccedilatildeo diferenciaccedilatildeo e infectividade
Inicialmente foi analisado o perfil da curva de crescimento das formas
epimastigotas Observou-se que natildeo havia diferenccedila na curva de crescimento dos
parasitas nocauteados em relaccedilatildeo ao parasita selvagem (FIGURA 25)
FIGURA 25 CURVA DE CRESCIMENTO DO MUTANTE DE T cruzi PARA TcKAP7 (KO) E DO T cruzi Dm28c SELVAGEM (WT)
LEGENDA Curva de crescimento do mutante de T cruzi para TcKAP7 () e do T cruzi Dm28c ()
Em seguida os parasitas nocauteados foram analisados quanto a sua capacidade
de diferenciaccedilatildeo em tripomastigotas metaciacuteclicos Foram realizadas contagens
diferenciais em cacircmara de Neubauer a partir do sobrenadante da metaciclogecircnese
a cada 24 h apoacutes a incubaccedilatildeo das ceacutelulas em meio TAU3AAG durante um periacuteodo
de 3 dias (72 h) A partir dessas contagens foram construiacutedos curva com a contagem
do nuacutemero de metaciacuteclicos ao longo dos trecircs dias (FIGURA 26)
Nenhuma alteraccedilatildeo foi observada quando os parasitas nocauteados foram
submetidos ao processo de metaciclogecircnese in vitro Ou seja pode-se afirmar que
80
mesmo apoacutes o nocaute do gene TcKAP7 as formas epimastigotas do parasita
conseguem se diferenciar em formas metaciacuteclicas
FIGURA 26 METACICLOGEcircNESE IN VITRO DE T cruzi Dm28c TIPO SELVAGEM E T cruzi NOCAUTEADO LEGENDA Metaciclogecircnese in vitro de T cruzi Dm28c tipo selvagem () e T cruzi nocauteado ()
Uma vez que os parasitas nocauteados foram capazes de se diferenciar de
epimastigota a tripomastigota metaciacuteclico resolveu-se investigar se estes eram
capazes de infectar ceacutelulas in vitro Foi possiacutevel perceber as formas amastigotas
dentro de ceacutelulas VERO em cultura mostrando que o parasita natildeo perdeu sua
capacidade de infecccedilatildeo (dados natildeo mostrados) Assim pode-se concluir que aleacutem
de sofrer diferenciaccedilatildeo os mutantes de T cruzi para KAP7 tambeacutem mantiveram sua
capacidade de infecccedilatildeo
48 Anaacutelise da funccedilatildeo do gene KAP7 de Trypanosoma brucei atraveacutes de
ensaios de RNA de interferecircncia
Para averiguar a importacircncia da proteiacutena TcKAP7 na biologia do parasita
recorremos a ensaios de RNA de interferecircncia (RNAi) jaacute que existe uma alta
similaridade entre TcKAP7 e seu ortoacutelogo em Trypanosoma brucei
81
A via de RNA de interferecircncia consiste em um mecanismo de silenciamento
gecircnico que para a ceacutelula funciona como sistema de defesa O mecanismo inicia-se
atraveacutes da expressatildeo de um RNA dupla fita (dsRNA) contendo uma sequecircncia
complementar ao gene de interesse Este dsRNA seraacute entatildeo clivado em pequenos
fragmentos de cerca de 22 a 25 nucleotiacutedeos atraveacutes da atividade de uma
ribonuclease do tipo III denominada Dicer Estes pequenos RNAs seratildeo
direcionados e permaneceratildeo unidos a um complexo proteico denominado RISC
(ldquoRNA-InducedSilencingComplexrdquo) Nesse complexo os pequenos RNAs de
interferecircncia (siRNA) ligam-se por complementaridade ao RNA mensageiro do gene
a ser inativado guiando-os para degradaccedilatildeo pelas nucleases presentes no
complexo impedindo a siacutentese da respectiva proteiacutena (ULLU et al 2002) O vetor
utilizado para promover o silenciamento do gene TbKAP7 foi o p2T7-177 Este
plasmiacutedeo integra-se aos minicromossomos do T brucei regiatildeo de repeticcedilotildees 177
(FOLDYNOVA-TRANTIRKOVA et al 2005) Este vetor apresenta dois promotores
de polimerase em oposiccedilatildeo induziacuteveis por tetraciclina flanqueando a sequumlecircncia de
interesse Desta forma satildeo geradas duas moleacuteculas de mRNA que pareadas
formam a moleacutecula de RNA fita dupla capaz de induzir a maquinaria de degradaccedilatildeo
A induccedilatildeo da inibiccedilatildeo de TbKAP7 atraveacutes de RNAi levou a uma diminuiccedilatildeo da
multiplicaccedilatildeo celular do parasita a partir do quarto dia do experimento (FIGURA 27)
Os resultados obtidos neste ensaio mostraram que a participaccedilatildeo da TbKAP7
no metabolismo do T brucei eacute essencial jaacute que o silenciamento do gene TbKAP7
levou agrave reduccedilatildeo da proliferaccedilatildeo celular do parasita
82
FIGURA 27 RNAi DE TbKAP7 INIBE O CRESCIMENTO DAS FORMAS PROCIacuteCLICAS DE T
brucei
LEGENDA Curva de crescimento de linhagem celular de RNAi de TbKAP7 em T brucei induzido por
tetraciclina As ceacutelulas foram diluiacutedas a uma densidade celular inicial de 1 X 106 ml na presenccedila e
ausecircncia de tetraciclina As densidades celulares foram determinadas pela contagem de ceacutelulas a
intervalos de 24 horas durante oito dias apoacutes iniacutecio de adiccedilatildeo de tetraciclina A linha com quadrados
mostra a curva de crescimento celular na presenccedila de tetraciclina (+TET) A linha com losangos
mostra a curva de crescimento celular na ausecircncia de tetraciclina (- TET)
49 Caracterizaccedilatildeo estrutural de TcKAP7
491 Produccedilatildeo recombinante de TcKAP7
O cultivo de E coli BL-21(DE3) STAR contendo o plasmiacutedeo pET28a-
TcKAP7 foi feito em meio LB a 37 oC com a induccedilatildeo da expressatildeo realizada a uma
densidade oacutetica de DO600 de 08 com a adiccedilatildeo de 05 mM de ITPG durante a noite a
37 oC
As ceacutelulas foram recuperadas por centrifugaccedilatildeo ressuspensas sonicadas e
centrifugadas para a purificaccedilatildeo de TcKAP7 atraveacutes da cromatografia de afinidade
em resina de Ni-NTA (Figura 28A) Foi possiacutevel obter grande quantidade de
83
amostra com grau de pureza alto como visualizado atraveacutes de anaacutelise por SDS-
PAGE (Figura 28B)
FIGURA28 PURIFICACcedilAtildeO DE TCKAP7 ATRAVEacuteS DE CROMATOGRAFIA DE AFINIDADE LEGENDA A) Cromatograma de afinidade B) SDS-PAGE da cromatografia de afinidade Os nuacutemeros agrave esquerda da figura representam os tamanhos das bandas do marcador de massa molecular (Benchmark) (Invitrogen) e P banda correspondente agrave TcKAP7 purificada Caixa em vermelho indica o pico que corresponde agrave fraccedilatildeo no SDS-PAGE
Devido agrave presenccedila de bandas com possiacuteveis contaminantes as fraccedilotildees que
continham a proteiacutena de interesse foram submetidas agrave purificaccedilatildeo por cromatografia
de troca iocircnica onde a purificaccedilatildeo eacute realizada baseada na afinidade por cargas
entre as proteiacutenas e a resina
Para esta purificaccedilatildeo utilizou-se a coluna SP Hitrap (GE Healthcare Life
Sciences) que eacute uma coluna de carga negativa Essa resina foi escolhida pois o pH
do tampatildeo em que se encontrava TcKAP7 era menor que o pI da proteiacutena Nessas
condiccedilotildees a carga superficial de TcKAP7 eacute positiva Para favorecer a interaccedilatildeo
TcKAP7 e resina foi feita uma diluiccedilatildeo de TcKAP7 para retirada de NaCl A eluiccedilatildeo
da proteiacutena foi realizada com um gradiente segmentado de tampatildeo B para
84
cromatografia de troca iocircnica TcKAP7 foi eluiacuteda com 68 do tampatildeo B (FIGURA
29)
FIGURA 29 PURIFICACcedilAtildeO DE TCKAP7 ATRAVEacuteS DE CROMATOGRAFIA DE TROCA IOcircNICA
LEGENDA A) Cromatografia de troca iocircnica B) SDS-PAGE da cromatografia de troca iocircnica Os nuacutemeros agrave esquerda da figura representam os tamanhos das bandas do marcador de massa molecular (Benchmark) (Invitrogen) e P banda correspondente agrave TcKAP7 purificada Caixa em vermelho indica o pico que corresponde agrave fraccedilatildeo no SDS-PAGE Curva em azul representa absorbacircncia em 280 nm Linha em verde indica concentraccedilatildeo de tampatildeo B para eluiccedilatildeo da amostra
410 Anaacutelise do estado oligomeacuterico de TcKAP7
A amostra purificada por troca iocircnica foi submetida agrave cromatografia de
exclusatildeo molecular tambeacutem chamada de gel filtraccedilatildeo que consiste na separaccedilatildeo
de biomoleacuteculas de acordo com seu tamanho e forma A coluna neste processo
conteacutem um poliacutemero com ligaccedilotildees cruzadas com poros de tamanho definido As
moleacuteculas maiores iratildeo migrar mais rapidamente que as menores pois natildeo satildeo
85
capazes de penetrar no interior dos poros da resina eluindo diretamente da coluna
As moleacuteculas menores por entrarem pelos poros da resina e levarem mais tempo
percorrendo os poros satildeo eluiacutedas mais tarde em relaccedilatildeo as que satildeo maiores
Ao comparar o volume de eluiccedilatildeo de TcKAP7 com o volume de eluiccedilatildeo de
proteiacutenas com massa molecular conhecidos (dados natildeo mostrados) foi possiacutevel
verificar que TcKAP7 parece ser um monocircmero em soluccedilatildeo Para confirmar esses
dados a mesma amostra foi submetida ao experimento de espalhamento dinacircmico
de luz (DLS)
O DLS eacute uma teacutecnica que se estima a distribuiccedilatildeo de tamanho das
populaccedilotildees de partiacuteculas que estatildeo presentes na amostra permitindo a detecccedilatildeo de
agregados proteicos ou de diferentes estados de oligomerizaccedilatildeo na amostra
indicando heterogeneidade Eacute importante ressaltar que para maiores chances de
sucesso em ensaios de cristalizaccedilatildeo a amostra deve encontrar-se monodispersa
Os dados de DLS mostram que 911 da massa de TcKAP7 analisada
apresenta um raio hidrodinacircmico (Rh) de 39 nm que representa uma massa
aparente de 29 kDa (FIGURA 30) Isto eacute condizente com um monocircmero cuja massa
teoacuterica seria de aproximadamente 28 kDa (incluindo a cauda de 6 histidinas) de
acordo com a prediccedilatildeo feita pelo servidor Expasy Protparam
(httpwebexpasyorgprotparam)A polidispersividade da amostra foi baixa
indicando que a mesma estava homogecircnea
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0 1 2 3 4 5 6 7
M
assa
Rh (nm)
fr80
fr82
fr84
fr85
86
FIGURA 30 ANAacuteLISE POR DLS DE TCKAP7 LEGENDA Anaacutelise por DLS de TcKAP7 contendo as fraccedilotildees obtidas na cromatografia de afinidade As fraccedilotildees 80 84 e 85 apresentam um raio hidrodinacircmico (Rh) de 39 nm
Aleacutem disso tambeacutem foram obtidas informaccedilotildees sobre o envelope de TcKAP7
a partir dos dados coletados atraveacutes da teacutecnica de SAXS mostrando que o raio de
giro (Rg) do envelope de TcKAP7 estaacute de acordo com o estimado por DLS (FIGURA
31)
FIGURA 31 ENVELOPE MOLECULAR DE SAXS
411 Anaacutelise do conteuacutedo de estrutura secundaacuteria de TcKAP7 recombinante
Atraveacutes da anaacutelise do espectro de dicroiacutesmo circular pode-se verificar o
conteuacutedo de estrutura secundaacuteria da proteiacutena e inferir enovelamento da proteiacutena
recombinante Os dados obtidos para a TcKAP7 revelaram a presenccedila de estruturas
α caracterizadas pelos miacutenimos pronunciados em 208 nm e 222 nm e de estruturas
coiled na amostra de TcKAP7 caracterizada pelos miacutenimos pronunciados em 205
nm (FIGURA 32) Este resultado estaacute de acordo a prediccedilatildeo de estrutura secundaacuteria
87
realizada pelo servidor PSIPRED (httpbioinfcsuclacukpsipred (FIGURA 33)
Esses resultados sugerem que a proteiacutena recombinante possui correto
enovelamento
FIGURA 32 ESPECTRO DE DICROIacuteSMO CIRCULAR DE TcKAP7
FIGURA 33 PREDICcedilAtildeO DE ESTRUTURA SECUNDAacuteRIA DE TcKAP7
412 Anaacutelise estrutural de TcKAP7
A fim de obter-se a estrutura tridimensional de TcKAP7 por cristalografia de
raios-X foram realizados ensaios de cristalizaccedilatildeoFoi possiacutevel observar a formaccedilatildeo
de um cristal em apenas uma condiccedilatildeo Imidazol 01 M Polietilenoglicol (PEG) 8000
10 wv e Acetato de caacutelcio 02 M
A visualizaccedilatildeo atraveacutes de luz ultra-violeta atraveacutes do equipamento Rock
Imager Fomulatrix permitiu identificaacute-lo como cristal de proteiacutena jaacute que este
diferencia-se de cristal de sal pela fluorescecircncia quando excitado em comprimento
de onda de 280 nm
-20
-18
-16
-14
-12
-10
-8
-6
-4
-2
0
2
200 210 220 230 240 250 260
Ɵ M
RV
x 1
03
(de
g cm
2d
mo
l-1)
Comprimento de onda (nm)
88
O perfil do cristal pode ser visualizado na figura 34 Esse cristal encontra-se
pequeno e mal-formado Aleacutem disso os meacutetodos para a determinaccedilatildeo estrutural de
uma estrutura ineacutedita (sem homologia com estruturas conhecidas) necessitam de
mais de um cristal Dessa forma foram realizados refinamentos dessas condiccedilotildees
iniciais visando aumentar q quantidade de cristais aumentar seu tamanho e
melhorar sua organizaccedilatildeo A concentraccedilatildeo de PEG (5 A 10) e do pH (6 a 9) com
intervalos de 1 unidade foram alterada Entretanto mesmo assim natildeo foi possiacutevel a
obtenccedilatildeo de cristais adequados para a difraccedilatildeo de raios X e novos refinamentos
seratildeo necessaacuterios
FIGURA 34 CRISTAL DE TcKAP7 DE T CRUZI LEGENDA AObtenccedilatildeo do cristal de TcKAP7 na condiccedilatildeo de Imidazol 01 M Polietilenoglicol (PEG) 8000 10 wv e Acetato de caacutelcio 02 M e B Cristal de TcKAP7 visto sob luz ultravioleta
Uma vez que natildeo foi possiacutevel durante o desenvolvimento desse projeto a
obtenccedilatildeo da estrutura cristalograacutefica de TcKAP7 procedeu-se com a construccedilatildeo de
seu modelo molecular
A modelagem molecular eacute uma ferramenta que permite a obtenccedilatildeo de
modelos da estrutura tridimensional de uma determinada proteiacutena com base em
homologia sequencial ou estrutural com proteiacutenas cujas estruturas tridimensional
foram experimentalmente resolvidas
Para a construccedilatildeo do modelo foi utilizado o programa MODELLER (SALI amp
BLUNDELL 1993) este programa eacute utilizado para a modelagem por homologia a
estruturas tridimensionais de proteiacutenas O programa automaticamente constroacutei um
modelo baseado na anaacutelise de um alinhamento de sequecircncias entre a proteiacutena para
a qual se deseja construir o modelo e uma proteiacutena relacionada cuja estrutura
tridimensional jaacute foi resolvida Nesse caso foram utilizadas estruturas de duas
A B
89
proteiacutenas como molde para a construccedilatildeo da estrutura de TcKAP7 A estrutura da
proteiacutena HMGB1(coacutedigo de acesso no banco de dados de proteiacutenas 2GZK)
(wwwpdborg) para a porccedilatildeo amino-terminal e a estrutura do fator A de transcriccedilatildeo
mitocondrial (coacutedigo de acesso 3TQ6) para a porccedilatildeo carboxi-terminal da proteiacutena
(FIGURA 35A) Duas proteiacutenas foram selecionadas para a construccedilatildeo do modelo de
TcKAP7 visto que a similaridade de sequencia entre TcKAP7 e proteiacutenas com
estruturas resolvidas eacute bastante baixo A similaridade sequencial de TcKAP7 e
proteiacutena HMGB1 eacute de 224 e entre TcKAP7 e o fator A de transcriccedilatildeo mitocondrial
eacute de 264 No entanto ambas proteiacutenas possuem alta similaridade em relaccedilatildeo agrave
estrutura secundaacuteria (mais de 90) Para aumentar a confiabilidade do modelo
utilizamos uma proteiacutena para construir a sequencia N-terminal de TcKAP7
(aminoaacutecidos 1-184) e outra para o C-terminal (aminoaacutecidos 185-248)
A qualidade do modelo pode ser avaliada por exemplo atraveacutes de graacuteficos e
tabelas que analisam restriccedilotildees quiacutemicas e fiacutesicas de cada aacutetomo constituinte do
modelo Neste trabalho foi utilizado o graacutefico de Ramachandran (FIGURA 35B) nele
pode-se visualizar todas as combinaccedilotildees possiacuteveis de acircngulos dieacutedricos Ψ (psi)
versus os Φ (phi) nos aminoaacutecidos de um polipeptiacutedeo e que contribuem para a
conformaccedilatildeo das estruturas das proteiacutenas (RAMACHANDRAN et al 1963) Dos 230
resiacuteduos apenas 5 estatildeo em regiotildees natildeo permitidas do graacutefico Esse eacute um
excelente valor pois eacute similar ao valor meacutedio encontrado para estruturas
experimentalmente determinadas com resoluccedilatildeo de no miacutenimo 20 Aring
(httpwwwebiacukthornton-srvdatabasesprofunc)
Tambeacutem eacute possiacutevel visualizar a topologia de TcKAP7 (FIGURA 35 C) que
mostra as regiotildees de α-heacutelices e regiotildees de coiled presentes na proteiacutena
corroborando com os dados obtidos na espectroscopia de dicroiacutesmo circular
90
FIGURA 35 ESTRUTURA DE TcKAP7 LEGENDA AModelo tridimensional de KAP7 B Graacutefico de Ramachandran e C Topologia de TcKAP7
A anaacutelise da superfiacutecie eletrostaacutetica de TcKAP7 mostra que existem regiotildees
ricas em aminoaacutecidos com cargas positivas que podem conferir afinidades agrave outras
proteiacutenas com carga carga superficial negativa ou mesmo aacutecidos nucleicos (FIGURA
36)
91
FIGURA 36 SUPERFIacuteCIE ELETROSTAacuteTICA DE TcKAP7 LEGENDA Visualizaccedilatildeo de diferentes regiotildees de TcKAP7 Vermelho potencial negativo Azul potencial positiva Branco Neutro
413 Investigaccedilatildeo de possiacuteveis funcionalidades baseadas na estrutura de
TcKAP7
4131 Prediccedilatildeo de funccedilatildeo paraTcKAP7
92
A prediccedilatildeo de funccedilatildeo para TcKAP7 foi realizada a partir do enovelamento de
proteiacutenas utilizando o servidor Profunc (httpwwwebiacukthornton-
srvdatabasesprofunc) O objetivo do servidor ProFunc eacute ajudar na identificaccedilatildeo de
uma possiacutevel funccedilatildeo bioquiacutemica de uma proteiacutena a partir da sua estrutura
tridimensional Ele utiliza uma seacuterie de meacutetodos incluindo comparaccedilatildeo de
enovelamento conservaccedilatildeo dos resiacuteduos e modelos 3D funcionais tanto para
identificar provaacuteveis siacutetios ativos da proteiacutena quanto possiacuteveis homoacutelogos no Protein
Data Bank (PDB) Neste procedimento tenta-se ajustar a estrutura da proteiacutena de
interesse aos tipos de enovelamentos de proteiacutenas conhecidas Atualmente mais de
1000 tipos jaacute foram registrados e depositados em bibliotecas de enovelamentos
Sabe-se que o alinhamento estrutural entre proteiacutenas consideradas de uma
mesma famiacutelia mesmo que seja apenas na regiatildeo do siacutetio ativo pode ser um
importante meacutetodo para se inferir a funccedilatildeo da sequecircncia em estudo (LASKOWSKI et
al 2003) A evoluccedilatildeo tende a conservar funccedilotildees que dependem mais diretamente
das estruturas 3D que das similaridades entre as sequecircncias de aminoaacutecidos das
proteiacutenas (SANCHEZ et al 2000)
Neste trabalho as quatro estruturas que possuem maior similaridade
estrutural com TcKAP7 estatildeo depositadas no Protein Data Bank (PDB) com os
coacutedigos 3TQ6 4NOD 3TMM 4NNU Todas as estruturas satildeo referentes agrave proteiacutena
TFAM (fator transcricional A mitocondrial)
As estruturas proteicas foram obtidas no banco de dados puacuteblicos de
proteiacutenas PDB (Protein Data Bank) e submetidas a um alinhamento estrutural com o
modelo de TcKAP7 (FIGURA 35A) no programa WinCoot Esse alinhamento pode
ser visualizado na figura 37 As regiotildees em vermelho representam as regiotildees de
TcKAP7 que apresentam interaccedilatildeo com DNA pois se alinham com as regiotildees de
ligaccedilatildeo agrave DNA das outras proteiacutenas e as regiotildees em azul representam regiotildees sem
homologia com as demais
Esse resultado sugere que TcKAP7 pode interagir com DNA com isso estes
dados podem ser utilizados para nortear mais estudos sobre a interaccedilatildeo das
proteiacutenas KAPrsquos com o DNA do cinetoplasto de T cruzi
93
FIGURA 37 ALINHAMENTO ESTRUTURAL DE 3TQ6 4NOD 3TTM 4NNU E TCKAP7 LEGENDA Em vermelho encontram-se as regiotildees de TcKAP7 que podem interagir com DNA (Resiacuteduos 1-67 e 140-166) e em azul regiotildees sem homologia com as demais
4132 Anaacutelises preliminares da possiacutevel interaccedilatildeo entre TcKAP7 e kDNA
As prediccedilotildees estruturais sugeriram que a proteiacutena TcKAP7 possui motivos
similares agrave proteiacutenas que interagem com DNA No entanto a sequecircncia de
aminoaacutecidos entre as proteiacutenas eacute bastante baixa Como a funccedilatildeo de TcKAP7
permanece obscura foram realizados alguns ensaios para tentar verificar a
possibilidade desta proteiacutena interagir com kDNA Para isto utilizou-se a teacutecnica de
dicroiacutesmo circular para avaliar se a presenccedila de kDNA poderia resultar em
alteraccedilotildees estruturais em TcKAP7 o que seria uma evidecircncia da possiacutevel interaccedilatildeo
entre esta proteiacutena e o aacutecido nucleico
Foram realizadas medidas de dicroiacutesmo circular com amostras de TcKAP7
kDNA e TcKAP7 na presenccedila de kDNA Para a anaacutelise de dados foi realizado o
somatoacuterio das curvas obtidas com as amostras de TcKAP7 e kDNA separadamente
Este somatoacuterio resultou em uma curva teoacuterica que indica o perfil teoacuterico de uma
amostra contendo TcKAP7 e kDNA sem interaccedilotildees presentes Aacute essa curva foi
sobreposta a curva experimental da medida de dicroiacutesmo circular de TcKAP7 na
94
presenccedila de kDNA A figura 38 ilustra essa sobreposiccedilatildeo onde pode-se verificar que
as curvas natildeo se sobrepotildeem portanto alteraccedilotildees estruturais ocorrem em TcKAP7
na presenccedila de kDNA
FIGURA 38 ESPECTRO DE DICROIacuteSMO CIRCULAR DE TcKAP7 LEGENDA Em azul encontra-se o espectro experimental de TcKap7 na presenccedila de DNA em vermelho o espectro teoacuterico de TcKAP7 e DNA
Para investigar mudanccedilas estruturais associadas a interaccedilatildeo com kDNA foi
realizada uma coleta de dados de SAXS na presenccedila de 1ug de kDNA
A comparaccedilatildeo dos modelos de baixa resoluccedilatildeo por SAXS indica uma
diferenccedila conformacional pontual da proteiacutena na presenccedila de kDNA As figuras 28 e
29 mostram os envelopes da proteiacutena TcKAP7na ausecircncia (FIGURAS 39A e 40A) e
presenccedila de kDNA de T cruzi (FIGURA 39B e FIGURA 40B) Percebe-se uma
diferenccedila de densidade eletrocircnica na regiatildeo da heacutelice (Residuos 140 - 166
evidenciados em vermelho) No envelope de TcKAP7 ela eacute bastante flexiacutevel e natildeo eacute
observada densidade eletrocircnica nessa regiatildeo no entanto na presenccedila de kDNA
essa mesma regiatildeo mostra-se mais riacutegida e eacute possiacutevel estimar seu posicionamento
baseado na densidade eletrocircnica Aleacutem disso essa heacutelice eacute predita como interatora
de DNA com base nas anaacutelises estruturais previamente realizadas nesse trabalho
Esses dados sugerem uma mudanccedila conformacional da proteiacutena na presenccedila
do kDNA fazendo com que esta mude seu arranjo estrutural para permanecer ligada
agrave moleacutecula de DNA sugerindo uma interaccedilatildeo entre TcKAP7 e DNA do cinetoplasto
-22
-17
-12
-7
-2
3
200 210 220 230 240 250 260
ϴM
RW
x 1
03
(de
g cm
-2 d
mo
l-1)
Comprimento de onda (nm)
Kap7+DNA
95
de T cruzi Esses dados corroboram com o que foi visto na superfiacutecie eletrostaacutetica
(FIGURA 36) e no alinhamento estrutural (FIGURA 37)
FIGURA 39 ENVELOPE MOLECULAR DETcKAP7 LEGENDA A Monocircmero de TcKAP7 ajustado ao envelope de SAXS B Monocircmero de TcKAP7 + kDNA ajustado ao envelope de SAXSResiduos 140- 166 evidenciados em vermelho
96
FIGURA 40 ENVELOPE MOLECULAR DE TcKAP7 VISTO EM DIFERENTES AcircNGULOS LEGENDA A Monocircmero de TcKAP7 ajustado ao envelope de SAXS B Monocircmero de TcKAP7 + kDNA ajustado ao envelope de SAXS Residuos 140- 166 evidenciados em vermelho
97
5 DISCUSSAtildeO
O Trypanosoma cruzi pertence a um grupo que divergiu muito cedo na
linhagem eucarioacutetica apresentando diversas caracteriacutesticas uacutenicas em relaccedilatildeo a
outros eucariotos Uma dessas caracteriacutesticas eacute a presenccedila de uma mitococircndria
uacutenica ramificada pelo corpo do protozoaacuterio contendo uma regiatildeo especializada o
cinetoplasto onde reside o DNA mitocondrial tambeacutem conhecido como kDNA O
kDNA eacute composto por uma rede de moleacuteculas interligadas entre si os maxiciacuterculos e
os miniciacuterculos (SHAPIRO amp ENGLUND 1995) Mais de 30 proteiacutenas envolvidas na
replicaccedilatildeo e na manutenccedilatildeo do kDNA jaacute foram identificadas e acredita-se que um
nuacutemero aproximado de 100 proteiacutenas muitas delas presentes apenas em
cinetoplastiacutedeos possam estar envolvidas nesses processos (LIU et al 2005) A
maioria dessas proteiacutenas foi identificada em T brucei e C fasciculata e
possivelmente vaacuterias delas principalmente aquelas envolvidas em replicaccedilatildeo
devem estar codificadas no genoma do T cruzi
Apesar de serem conhecidos muitos dos componentes da maquinaria de
replicaccedilatildeo dos miniciacuterculos e maxiciacuterculos natildeo se pode dizer o mesmo para as
proteiacutenas envolvidas na manutenccedilatildeo da estrutura do kDNA Com exceccedilatildeo de 4
proteiacutenas com caracteriacutesticas de histonas H1 (KAP1 a 4) encontradas associadas ao
cinetoplasto de C fasciculata pouco ainda eacute conhecido sobre as proteiacutenas que
participam da organizaccedilatildeo do kDNA em outros tripanosomatiacutedeos
Zavala-Castro e colaboradores (2002) identificaram sete proteiacutenas variando
de 19 a 31 kDa associadas ao kDNA de formas epimastigotas de T cruzi a partir
de kDNA extraiacutedo de ceacutelulas fixadas com formaldeiacutedo Os tamanhos observados satildeo
compatiacuteveis com aqueles das KAPs encontradas por Xu e Ray (1993) usando
experimento similar em C fasciculata entretanto nenhuma das possiacuteveis KAPs
descritas por Zavala-Castro e colaboradores foi caracterizada
Noacutes iniciamos estudos objetivando identificar proteiacutenas envolvidas na
organizaccedilatildeo e segregaccedilatildeo do kDNA de T cruzi a partir dos dados fornecidos pelo
sequenciamento do genoma desse parasita fazendo uma comparaccedilatildeo com as
KAPs de C fasciculata Estudos realizados por Cavalcanti e colaboradores (2009)
usando como modelo as sequecircncias de KAPs de C fasciculata identificaram 35
proteiacutenas relacionadas em diferentes tripanosomatiacutedeos cujos genomas estatildeo
sequenciados (11 em T cruzi 7 em L braziliensis 6 em L major e L infantum e 5
98
em T brucei) Essas sequecircncias puderam ser agrupadas em 7 tipos diferentes de
KAPs (KAP1 a 7) Das 7 KAPs T cruzi possui 5 (TcKAP3 a 7) cuja a sintenia
gecircnica eacute uma das caracteriacutesticas marcantes jaacute que alguns genes divergem em
relaccedilatildeo ao tamanho e portanto no tamanho da proteiacutena codificada As KAPs de T
cruzi e T brucei satildeo maiores do que as de C fasciculata e Leishmania spp Isso
pode sugerir que KAPs possam ter evoluiacutedo para um tamanho que comporte
basicamente suas funccedilotildees de associaccedilatildeo com o kDNA de maneira mais eficiente
Os resultados obtidos por Cavalcanti et al (2009) para TcKAP4 e TcKAP6
mostraram que em epimastigotas e amastigotas estas duas proteiacutenas estatildeo
distribuiacutedas ao longo de toda a rede de kDNA consistente com o que foi observado
em C fasciculata (XU et al 1996 HINES amp RAY 1998) poreacutem CfKAP4 tambeacutem
apresentou um padratildeo de marcaccedilatildeo nos poacutelos opostos do kDNA sugerindo que
essa KAP em particular se associe aos miniciacuterculos receacutem-replicados antes de sua
reintegraccedilatildeo agrave rede de kDNA (XU et al 1996) Contudo em tripomastigotas de T
cruzi estas duas proteiacutenas estatildeo distribuiacutedas na periferia da rede de kDNA
(CAVALCANTI et al 2009) indicando que diferente de C fasciculata elas
apresentam uma dinacircmica de associaccedilatildeo que depende da forma evolutiva do
parasita possivelmente refletindo distintas interaccedilotildees com proteiacutenas da rede de
kDNA em epimastigotas e tripomastigotas No presente trabalho ampliamos o
conhecimento sobre as KAPs de T cruzi estudando o papel da KAP7 na fisiologia
desse parasita
Em C fasciculata a regulaccedilatildeo da expressatildeo de vaacuterios genes que codificam
proteiacutenas mitocondriais ocorre durante o ciclo celular em parte por uma sequumlecircncia
consenso [(CA)AUAGAA(GA)] presente nas regiotildees 5rsquo e 3rsquo-UTR dos respectivos
mRNAs (BROWN amp RAY 1997 MAHMOOD et al 1999 MAHMOOD amp RAY 1998
PASION et al 1996) O mesmo foi observado para L major onde uma sequecircncia
parecida com aquela encontrada em C fasciculata (CATAGA) foi identificada nas
regiotildees 5rsquo e 3rsquo de vaacuterios genes cuja a expressatildeo era maior na fase S do ciclo celular
(ZICK et al 2005) Analisando as regiotildees 5rsquo e 3rsquo do transcrito do gene TOP2 de T
cruzi que codifica a topo II mitocondrial descrito por Fragoso e Goldenberg (1992)
tambeacutem podemos observar a sequecircncia CATAGA repetida duas vezes na regiatildeo
5rsquoUTR e uma vez na regiatildeo 3rsquo-UTR do transcrito desse gene
Como relatamos neste trabalho a sequecircncia da regiatildeo 5rsquo-UTR do transcrito
TcKAP7 natildeo mostrou nenhum elemento com as caracteriacutesticas daquele envolvido na
99
regulaccedilatildeo de genes expressos na fase S do ciclo celular de outros
tripanosomatiacutedeos
Em relaccedilatildeo agrave localizaccedilatildeo de TcKAP7 verificamos atraveacutes de ensaios de
imunofluorescecircncia a distribuiccedilatildeo de TcKAP7 na regiatildeo dos poacutelos da rede de kDNA
das formas epimastigotas de T cruzi poreacutem ainda natildeo analisamos como esta
proteiacutena estaacute distribuiacuteda nas formas tripomastigotas que possuem a rede de kDNA
com formato arredondado e menos compactada
A localizaccedilatildeo de KAP7 na regiatildeo dos poacutelos do cinetoplasto de T cruzi
sugere que ela tenha funccedilotildees na replicaccedilatildeo da rede de kDNA pois nessa regiatildeo
estatildeo concentradas diversas proteiacutenas necessaacuterias para finalizaccedilatildeo do processo de
replicaccedilatildeo de miniciacuterculos
Para a construccedilatildeo do modelo molecular de TcKAP7 foram utilizadas
estruturas de duas proteiacutenas a estrutura da proteiacutena HMGB1 (2GZK) para a porccedilatildeo
amino-terminal e a estrutura da proteiacutena fator A de transcriccedilatildeo mitocondrial (3TQ6)
para a porccedilatildeo carboxi-terminal da proteiacutena ambas apresentam alta similaridade em
relaccedilatildeo agrave estrutura secundaacuteria (mais de 90) e tratam-se de proteiacutenas de um
mesmo grupo HMG (High-mobility group) Em T brucei TbKAP6 uma proteiacutena do
grupo HMG estaacute envolvida na replicaccedilatildeo e manutenccedilatildeo do kDNA (WANG et al
2014) Baseado nesses dados juntamente com os dados da imunofluorescecircncia
indireta pode-se sugerir um papel de TcKAP7 na replicaccedilatildeo da rede de kDNA
Embora ainda natildeo saibamos como KAP7 se associa com o kDNA de T
cruzi eacute possiacutevel que isso ocorra de duas maneiras atraveacutes de ligaccedilotildees
eletrostaacuteticas natildeo-especiacuteficas ou de interaccedilotildees com regiotildees especiacuteficas dos
miniciacuterculos
Atraveacutes de ensaios de SAXS foi possiacutevel perceber que a proteiacutena sofre
alteraccedilotildees conformacionais na presenccedila do kDNA sugerindo sua interaccedilatildeo com
esse aacutecido nucleacuteico Esta interaccedilatildeo pode ser eletrostaacutetica uma vez que a anaacutelise da
superfiacutecie eletrostaacutetica de TcKAP7 mostrou a predominacircncia de regiotildees ricas em
aminoaacutecidos com cargas positivas que podem conferir afinidades agrave outras proteiacutenas
com carga superficial negativa ou mesmo aacutecidos nucleicos mais uma vez sugerindo
a interaccedilatildeo com kDNA
Poreacutem natildeo se pode descartar a possibilidade de que a interaccedilatildeo de TcKAP7
com o kDNA seja atraveacutes de interaccedilotildees com regiotildees especiacuteficas dos miniciacuterculos
Nos tripanosomatiacutedeos a rede de kDNA assume a forma de um disco achatado
100
perpendicular ao flagelo onde os miniciacuterculos estatildeo alinhados em fibrilas orientadas
paralelamente ao eixo do disco (LIU et al 2005) Acredita-se que a ordenaccedilatildeo e
compactaccedilatildeo dos miniciacuterculos estatildeo relacionadas agrave proacutepria estrutura da moleacutecula de
miniciacuterculo Os miniciacuterculos apresentam regiotildees ricas em A+T que podem causar
curvaturas na moleacutecula (MARINI et al 1984 NTAMBI et al 1984) facilitando sua
inserccedilatildeo de forma ordenada no disco de kDNA aleacutem disso possuem regiotildees
conservadas onde estatildeo localizadas as origens de replicaccedilatildeo Essas regiotildees por
sua vez podem ser reconhecidas por proteiacutenas tais como a KAP7 que ajudam a
estabilizar a estrutura Os resultados com C fasciculata mostram que KAP2 3 e 4 se
ligam em regiotildees especiacuteficas dos miniciacuterculos ricas em A+T mas que natildeo satildeo
aquelas que geram a curvatura das moleacuteculas (XU et al 1996) Contudo KAP1 se
liga de maneira inespeciacutefica aos miniciacuterculos (HINES amp RAY 1998) Aleacutem disso
existe a sequecircncia universal de miniciacuterculo (UMS) e as proteiacutenas que se ligam a
essa sequecircncia (UMSBP) as quais podem participar de interaccedilotildees com as KAPrsquos
Em C fasciculata CfKAP3 sozinha consegue condensar a rede de kDNA e inibir a
decatenaccedilatildeo pela enzima topo II Poreacutem a interaccedilatildeo entre CfKAP3 e CfUMSBP
pode descondensar a rede de kDNA e reestabelecer a decatenaccedilatildeo mediada pela
topo II indicando que as proteiacutenas KAPrsquos dos tripanosomatiacutedeos podem apresentar
diferentes funccedilotildees em diferentes espeacutecies (KAPELLER et al 2011)
Para investigar a importacircncia de TcKAP7 no T cruzi e seu envolvimento ou
natildeo com o rearranjo topoloacutegico do kDNA durante o processo de diferenciaccedilatildeo do
parasita realizamos a deleccedilatildeo do gene TcKAP7 Nenhuma alteraccedilatildeo estrutural ou
morfoloacutegica na rede de kDNA foi observada no mutante de T cruzi para TcKAP7 Do
mesmo modo o parasita mutante natildeo apresentou perfil de crescimento alterado e
foi capaz de se diferenciar nas formas tripomastigotas metaciacuteclicas e infectar ceacutelulas
VERO onde se diferenciaram em formas amastigotas O mesmo foi visto quando foi
realizado o nocaute do gene TcKAP3 (DE SOUZA et al 2010)
Uma das hipoacuteteses para explicar esse fato eacute que alguma outra KAP de T
cruzi possa estar assumindo o papel da TcKAP7 talvez a TcKAP4 que se localiza
nos poacutelos do cinetoplasto quando da inserccedilatildeo dos miniciacuterculos na rede apoacutes serem
replicados na regiatildeo cinetoflagelar A redundacircncia no papel das KAPs faz com que a
rede de kDNA seja compactada e segregada corretamente mesmo na ausecircncia de
uma delas (DE SOUZA et al 2010) Sabe-se que o nocaute do gene Cfkap2 ou do
gene Cfkap3 separadamente natildeo mostrou nenhuma alteraccedilatildeo no fenoacutetipo de C
101
fasciculata Poreacutem a deleccedilatildeo de ambos os genes causou diversas alteraccedilotildees
aumento nos niacuteveis de mRNAs mitocondriais reduccedilatildeo na respiraccedilatildeo inibiccedilatildeo da
divisatildeo celular e acuacutemulo de ceacutelulas com morfologias anormais (AVLIYAKULOV et
al 2004)
Com o intuito de complementar os estudos para a caracterizaccedilatildeo do gene
TcKAP7 foram realizados ensaios de RNA de interferecircncia visando analisar a
funccedilatildeo do gene TbKAP7 ortoacutelogo em T brucei jaacute que a maquinaria de RNAi em T
cruzi eacute inexistente (DA ROCHA et al 2003) Com isso foi visto que a participaccedilatildeo da
TbKAP7 no metabolismo do T brucei eacute essencial jaacute que o silenciamento do gene
TbKAP7 levou agrave reduccedilatildeo da proliferaccedilatildeo celular do parasita corroborando com os
dados encontrados para TbKAP6 (WANG et al 2014)
Esperamos que o conhecimento das diversas moleacuteculas envolvidas na
organizaccedilatildeo e replicaccedilatildeo da rede de kDNA assim como o entendimento dos
mecanismos fisioloacutegicos que ocorrem nesta estrutura tatildeo peculiar que eacute o
cinetoplasto dos tripanosomatiacutedeos possam nos ajudar a esclarecer vaacuterios aspectos
relacionados a biologia destes eucariotos primitivos e a evoluccedilatildeo do genoma
mitocondrial ao longo do processo evolutivo
102
6 CONCLUSOtildeES
Com base nos resultados observados neste trabalho foi possiacutevel concluir
1 ndash A proteiacutena TcKAP7 eacute uma proteiacutena associada ao cinetoplasto de T
cruzi e possui caracteriacutesticas que a identificam como KAPs do tipo histona H1
incluindo seu tamanho e sua composiccedilatildeo de aminoaacutecidos e sua superfiacutecie
eletrostaacutetica
2 ndash TcKAP7 estaacute localizada nos poacutelos do cinetoplasto de T cruzi podendo
estar envolvida na replicaccedilatildeo dos miniciacuterculos
3 - TcKAP7 sofre mudanccedilas conformacionais na presenccedila do kDNA de T
cruzi evidenciando sua interaccedilatildeo com o aacutecido nucleico
4 ndash O mutante de T cruzi para TcKAP7 natildeo apresentou alteraccedilatildeo na
estrutura do cinetoplasto e na morfologia do parasita
5 ndash A proliferaccedilatildeo e a diferenciaccedilatildeo do T cruzi natildeo foram alteradas quando
o parasita teve o gene TcKAP7 deletado do genoma
6 ndash O silenciamento do gene TbKAP7 eacute essencial no metabolismo do T
brucei levando agrave reduccedilatildeo da proliferaccedilatildeo celular do parasita
103
7 REFEREcircNCIAS AGABIAN N Trans splicing of nuclear pre-mRNAs Cell 61 1157-1160 1990 AVLIYAKULOV N K LUKES J amp RAY D S Mitochondrial histone-like DNA-binding proteins are essential for normal cell growth and mitochondrial function in Crithidia fasciculata Eukaryot Cell 3 518-26 2004 BATISTA M MARCHINI F K CELEDON P A FRAGOSO S P PROBST C M PRETI H OZAKI L S BUCK G A GOLDENBERG S KRIEGER M A A high-throughput cloning system for reverse genetics in Trypanosoma cruzi BMC Microbiol v 10 p 259 2010 BELTRAO HDE B P CERRONI MDE D R FREITAS A Y PINTO C VALENTE VDA S A VALENTE G COSTA EDE e J SOBEL Investigation of two outbreaks of suspected oral transmission of acute Chagas disease in the Amazon region Para State Brazil in 2007 Trop Doct v39 n4 Oct p231-2 2009 BENNE R RNA editing in trypanosomes Eur J Biochem 221(1) 9-23 1994 BERRIMAN M GHEDIN E HERTZ-FOWLER C BLANDIN G RENAULD H BARTHOLOMEU D C LENNARD N J CALER E HAMLIN N E HAAS B BOHME U HANNICK L ASLETT M A SHALLOM J MARCELLO L HOU L WICKSTEAD B ALSMARK U C M ARROWSMITH C ATKIN R J BARRON A J BRINGAUD F BROOKS K CARRINGTON M CHEREVACH I CHILLINGWORTH T J CHURCHER C CLARK L N CORTON C H CRONIN A DAVIES R M DOGGETT J DJIKENG A FELDBLYUM T FIELD M C FRASER A GOODHEAD I HANCE Z HARPER D HARRIS B R HAUSER H HOSTETLER J IVENS A JAGELS K JOHNSON D JOHNSON J JONES K KERHORNOU A X KOO H LARKE N LANDFEAR S LARKIN C LEECH V LINE A LORD A MACLEOD A MOONEY P J MOULE S MARTIN D M A MORGAN G W MUNGALL K NORBERTCZAK H ORMOND D PAI G PEACOCK C S PETERSON J QUAIL M A RABBINOWITSCH E RAJANDREAM M A REITTER C SALZBERG S L SANDERS M SCHOBEL S SHARP S SIMMONDS M SIMPSON A J TALLON L TURNER C M R TAIT A TIVEY A R VAN AKEN S WALKER D WANLESS D WANG S WHITE B WHITE O WHITEHEAD S WOODWARD J WORTMAN J ADAMS M D EMBLEY T M GULL K ULLU E BARRY J D FAIRLAMB A H OPPERDOES F BARRELL B G DONELSON J E HALL N FRASER C M MELVILLE SE EL-SAYED N M The Genome of the African Trypanosome Trypanosoma brucei Science 309 (5733) 416-422 2005
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vocecircs sabem que seus conselhos sempre foram muito valiosos pra mim Obrigada
amigas vocecircs satildeo iacutempares
Agrave minha querida irmatildezinha Rocirc que nasceu no mesmo dia soacute que eacute mais
velha hahahahaha Obrigada amiga por tudo por todo esse tempo pelos
experimentos pelas confissotildees pelas gargalhadas Vocecirc eacute uacutenica
Agrave Pri Hira Mari Serpeloni Haruo Daisy Vanessa que sempre me ajudavam
quando eu precisava ou fazer um experimento ou jogar conversa fora
Aos meus amigos doutores atleticanos Michel e Henrique que me ajudaram
em vaacuterios experimentos e anaacutelises Obrigada por estarem sempre dispostos em
ajudar Vocecircs satildeo atleticanos mas satildeo gente boa Obrigada
Ao Giovany pela imensa ajuda com os camundongos sempre disposto em
ajudar e ensinar
Ao Nilson Silvio Tacircnia Sibelli por toda a ajuda pela amizade e pela
paciecircncia e competecircncia Ah e pelas histoacuterias de terror
Agrave Maria Cristina por toda a ajuda natildeo soacute na parte administrativa e pela
amizade
Ao Dr Marco Krieger pela confianccedila e por me proporcionar suporte
financeiro quando entrei no periacuteodo de prorrogaccedilatildeo
A todos os amigos e pesquisadores do Instituto Carlos Chagas dos demais
laboratoacuterios Lab REG Lab Genocircmica Laboratoacuterio de Biologia Celular por terem de
um jeito ou de outro participado do processo Eacute difiacutecil agradecer todo mundo
Valeu galera
ldquoTenho a impressatildeo de ter sido uma crianccedila brincando agrave
beira-mar divertindo-me em descobrir uma pedrinha
mais lisa ou uma concha mais bonita que as outras
enquanto o imenso oceano da verdade continua
misterioso diante de meus olhosrdquo
(Isaac Newton)
RESUMO
O DNA do cinetoplasto (kDNA) dos tripanosomatiacutedeos consiste numa rede de
moleacuteculas circulares catenadas entre si os miniciacuterculos e os maxiciacuterculos Os
miniciacuterculos codificam RNAs guias (gRNAs) e os maxiciacuterculos codificam para
algumas subunidades de enzimas mitocondriais e rRNA em um padratildeo
criptografado (ediccedilatildeo de RNA) Estudos com o tripanosomatiacutedeo Crithidia fasciculata
mostraram que proteiacutenas do tipo histona H1 associadas ao cinetoplasto (KAPs) satildeo
capazes de condensar a rede de kDNA Poreacutem pouco eacute conhecido sobre estas
proteiacutenas de Trypanosoma cruzi um protozoaacuterio parasita que sofre alteraccedilotildees na
estrutura do DNA do cinetoplasto ao longo de seu ciclo de vida Neste trabalho foi
caracterizada uma proteiacutena associada ao cinetoplasto de T cruzi denominada de
TcKAP7 que possui baixo peso molecular e natureza baacutesica condizente com um
papel na neutralizaccedilatildeo de carga e na condensaccedilatildeo do DNA Atraveacutes de ensaios
usando a teacutecnica de espalhamento de raios-X a baixo acircngulo (SAXS) foi possiacutevel
perceber que a proteiacutena TcKAP7 sofre mudanccedilas estruturais na presenccedila do kDNA
sugerindo uma interaccedilatildeo com essa estrutura seja atraveacutes de ligaccedilotildees eletrostaacuteticas
ou atraveacutes de ligaccedilotildees especiacuteficas com moleacuteculas presentes na rede A anaacutelise pela
teacutecnica de imunofluorescecircncia mostrou que proteiacutena TcKAP7 estaacute localizada na
regiatildeo dos poacutelos do cinetoplasto o que sugere que pode estar envolvida na
finalizaccedilatildeo da replicaccedilatildeo dos miniciacuterculos Mutante nulo para TcKAP7 foi gerado por
teacutecnicas de substituiccedilatildeo gecircnica a fim de verificar se na ausecircncia de TcKAP7
ocorriam alteraccedilotildees na estrutura do kDNA Contudo os parasitas mutantes para
TcKAP7 natildeo apresentavam alteraccedilotildees na estrutura e morfologia do cinetoplasto
quando analisados por microscopia eletrocircnica e foram capazes de se diferenciar
sem perder a capacidade infectiva Entretanto ensaios de RNA de interferecircncia
visando analisar a funccedilatildeo do gene TbKAP7 ortoacutelogo em T brucei levou agrave reduccedilatildeo
da proliferaccedilatildeo celular das formas prociacuteclicas desse parasita mostrando que este
gene eacute essencial para o metabolismo desse tripanosomatiacutedeo sugerindo que KAP7
possa ter papeis distintos em T cruzi e T brucei
Palavras-chaves Trypanosoma cruzi cinetoplasto nocaute KAPs
ABSTRACT
The kinetoplast DNA (kDNA) of trypanosomatids consists in a network of circular
molecules catenated each other the minicircles and maxicircles The minicircles
code RNAs guides (gRNAs) and the maxicircles code for some subunits of
mitochondrial enzymes and rRNA in a cryptic pattern (RNA editing) Studies in the
trypanosomatid protozoan Crithidia fasciculata showed that the kDNA is associated
with histone H1-like proteins known as kinetoplast-associated proteins (KAPs) wich
are capable of condensing the kDNA network However little is known about these
proteins of Trypanosoma cruzi a protozoan parasite which undergoes changes in
kinetoplast DNA structure over its life cycle Here we characterize a protein
associated with T cruzi kinetoplast named TcKAP7 TcKAP7 is a low molecular
weight protein with basic nature which is consistent with a role in DNA charge
neutralization and condensation Analysis by small angle X-Ray scattering technique
(SAXS) revealed that the TcKAP7 protein undergoes structural changes in the
presence kDNA suggesting an interaction with this DNA network either through
electrostatic bonds or through specific binding to molecules present on the network
The immunofluoresce analysis showed that TcKAP7 is located in the kinetoplast
poles suggesting that TcKAP7 might be involved in the late stages of the minicircle
replication A null mutant for TcKAP7 was obtained by gene replacement techniques
to study possible alterations in the kDNA structure However no modification in the
structure and morphology of the kinetoplast was observed by electron microscopy In
addition Tckap7 null mutant was able to differentiate without losing its infective
capacity Interference RNA assays was performed to analyze the function of
TbKAP7 the ortholog gene in T brucei The ablation of TbKAP7 expression leaded
to reduction in the procyclic proliferation suggesting that this gene is essential for the
metabolism of the parasite and might play distinct roles in T cruzi and T brucei
Key-words Trypanosoma cruzi kinetoplast gene knockout KAPs
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1 DISTRIBUICcedilAtildeO GEOGRAacuteFICA DA DOENCcedilA
DE CHAGAS19 FIGURA 2 CICLO DE TRANSMISSAtildeO DO
Trypanosoma cruzi20 FIGURA 3 ESQUEMA GERAL DAS PRINCIPAIS ESTRUTURAS
CELULARES DE T cruzi 22 FIGURA 4 REDE DE kDNA27 FIGURA 5 DIFERENTES ARRANJOS DO CINETOPLASTO
DE T cruzi29 FIGURA 6 MUDANCcedilAS NA POSICcedilAtildeO DO KDNA
NOS TRYPANOSOMAS29 FIGURA 7 REPOSICIONAMENTO DO KDNA EM RELACcedilAtildeO
AgraveS OUTRAS ORGANELAS DURANTEO CICLO DE VIDA DE UM FLAGELADO30
FIGURA 8 REPLICACcedilAtildeO DO kDNA32 FIGURA 9 REPRESENTACcedilAtildeO ESQUEMAacuteTICA DO
MICROFLUIDIFICADOR45 FIGURA 10 VETOR PARA EXPRESSAtildeO EM T CRUZI
P3XFLAG 50 FIGURA 11 ESQUEMA DA CONSTRUCcedilAtildeO DOS VETORES
UTILIZADOS PARA O NOCAUTE DO GENE TcKAP755
FIGURA 12 MAPA DO VETOR P2T7-177 UTILIZADO PARA ENSAIOS DE RNAi62
FIGURA 13 COMPARACcedilAtildeO ENTRE AS SEQUumlEcircNCIAS DE AMINOAacuteCIDOS DEDUZIDAS DO GENE KAP7 DE T cruzi Dm28C E DOS HAPLOacuteTIPOS DE CL BRENER65
FIGURA 14 COMPARACcedilAtildeO ENTRE AS SEQUumlEcircNCIAS DE AMINOAacuteCIDOS DEDUZIDAS DO GENE KAP7 EM DIFERENTES TRIPANOSOMATIacuteDEOS66
FIGURA 15 SINTENIA DE TcKAP7 COM OUTROS TRIPANOSOMATIacuteDEOS67
FIGURA 16 CARACTERIZACcedilAtildeO DA REGIAtildeO 5rsquo-UTR DO TRANSCRITO TcKAP769
FIGURA17 ANAacuteLISE DA EXPRESSAtildeO DA PROTEIacuteNA DE FUSAtildeO TCKAP7-FLAG EM FORMAS EPIMASTIGOTAS DE T CRUZI70
FIGURA 18 IMUNOLOCALIZACcedilAtildeO DE TcKAP7 EM EPIMASTIGOTAS DE T CRUZI71
FIGURA 19 ENSAIOS DE PCR UTILIZANDO DNA DE T cruzi kap7kap7 (WT) E T cruzi kap7neokap7higro (NO) COM DIFERENTES PRIMERS73
FIGURA 20 REPRESENTACcedilAtildeO ESQUEMAacuteTICA DOS SIacuteTIOS DA ENZIMA HindIII NO LOCUS DO GENE KAP7 DE T cruzi CL Brener75
FIGURA 21 ANAacuteLISE DA ORGANIZACcedilAtildeO DOS GENES TCKAP7 NEO E HIGRO POR ENSAIO DO TIPO SOUTHERN BLOT75
FIGURA 22 COMPARACcedilAtildeO DA EXPRESSAtildeO DO GENE TcKAP7 POR WESTERN BLOT76
FIGURA 23 COLORACcedilAtildeO PELO MEacuteTODO PANOacuteTICO RAacutePIDO DOS PARASITAS EPIMASTIGOTAS NOCAUTEADOS77
FIGURA 24 COMPARACcedilAtildeO ENTRE A ULTRAESTRUTURA DO CINETOPLASTO DO T cruzi DM28C TIPO SELVAGEM (A) E DO MUTANTE DE T cruzi PARA TcKAP7 (B) POR MICROSCOPIA ELETROcircNICA DE TRANSMISSAtildeO78
FIGURA 25 CURVA DE CRESCIMENTO DO MUTANTE DE T cruzi PARA TcKAP7 (KO) E DO T cruzi Dm28c SELVAGEM (WT) 79
FIGURA 26 METACICLOGEcircNESE IN VITRO DE T cruzi Dm28c TIPO SELVAGEM E T cruzi NOCAUTEADO80
FIGURA 27 RNAi DE TbKAP7 INIBE O CRESCIMENTO DAS FORMAS PROCIacuteCLICAS DE T brucei82
FIGURA 28 PURIFICACcedilAtildeO DE TCKAP7 ATRAVEacuteS DE CROMATOGRAFIA DE AFINIDADE83
FIGURA 29 PURIFICACcedilAtildeO DE TCKAP7 ATRAVEacuteS DE CROMATOGRAFIA DE TROCA IOcircNICA84
FIGURA 30 ANAacuteLISE POR DLS DE TCKAP785 FIGURA 31 ENVELOPE MOLECULAR DE SAXS86 FIGURA 32 ESPECTRO DE DICROIacuteSMO CIRCULAR DE
TcKAP787 FIGURA 33 PREDICcedilAtildeO DE ESTRUTURA SECUNDAacuteRIA DE
TcKAP787 FIGURA 34 CRISTAL DE TcKAP7 DE T CRUZI88 FIGURA 35 ESTRUTURA DE TcKAP790 FIGURA 36 SUPERFIacuteCIE ELETROSTAacuteTICA DE
TcKAP791 FIGURA 37 ALINHAMENTO ESTRUTURAL DE 3TQ6 4NOD
3TTM 4NNU E TCKAP793 FIGURA 38 ESPECTRO DE DICROIacuteSMO CIRCULAR
DE TcKAP794 FIGURA 39 ENVELOPE MOLECULAR DETcKAP795 FIGURA 40 ENVELOPE MOLECULAR DETcKAP7 VISTO EM
DIFERENTES AcircNGULOS96
LISTA DE TABELAS
TABELA 1 RELACcedilAtildeO DOS PRIMERS UTILIZADOS PARA A CLONAGEM DA REGIAtildeO UPSTREAM DE TcKAP7 NO VETOR pNEO153
TABELA 2 RELACcedilAtildeO DOS PRIMERS UTILIZADOS PARA A CLONAGEM DA REGIAtildeO DOWNSTREAM DE TcKAP7 NO VETOR pNEO153
TABELA 3 RELACcedilAtildeO DOS PRIMERS UTILIZADOS PARA A AMPLIFICACcedilAtildeO DO GENE TbKAP763
TABELA 4ndash PERCENTUAL DE IDENTIDADE ENTRE AS PROTEIacuteNAS KAP7 NOS TRIPANOSSOMATIacuteDEOS COM O GENOMA SEQUENCIADO67
TABELA 5 COMBINACcedilOtildeES DE PRIMERS UTILIZADOS NA PCR PARA CONFIRMAR O NOCAUTE DE TcKAP772
SUMAacuteRIO
1 INTRODUCcedilAtildeO18 11 O Trypanosoma cruzi18 12 Ciclo de vida do T cruzi20 13 Aspectos celulares de T cruzi21 14 O genoma de T cruzi24 15 Expressatildeo gecircnica de Tcruzi25 16 O cinetoplasto26 17 A rede de kDNA26 171 Replicaccedilatildeo do kDNA31 18 Proteiacutenas associadas ao cinetoplasto (KAPs)32 2 OBJETIVOS35 21 OBJETIVO GERAL35 211 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS35 3 MATERIAIS E MEacuteTODOS36 31 Reagentes e Soluccedilotildees Utilizados36 311 Reagentes36 312 Tampotildees e Soluccedilotildees36 313 Meios de cultura38 32 Cultivo do Trypanosoma cruzi38 321 Epimastigotas38 322 Tripomastigotas metaciacuteclicos39 33 Curva de crescimento de T cruzi39 34 Obtenccedilatildeo de DNA de T cruzi40 35 Obtenccedilatildeo de kDNA de T cruzi40 36 Obtenccedilatildeo de extrato proteico de T cruzi40 37 Clonagem do gene TcKAP741 38 Obtenccedilatildeo do cDNA de TcKAP7 atraveacutes de ensaio de RT-PCR41 39 Seleccedilatildeo dos clones recombinantes42 391 Teacutecnica de palitagem (toothpick)42 392 Teacutecnica de PCR de colocircnia43 310 Preparaccedilatildeo de plasmiacutedeo em pequena escala (miniprep)43 311 Expressatildeo da proteiacutena TcKAP7 em E coli43 312 Purificaccedilatildeo da proteiacutena recombinante TcKAP744 3121 Processamento da amostra44 3122 Cromatografia de afinidade45 3123 Cromatografia de troca iocircnica46 3124 Cromatografia de gel filtraccedilatildeo46 313 Espalhamento Dinacircmico de Luz ndash DLS46 314 Espectroscopia de dicroiacutesmo circular (CD)46 315 Quantificaccedilatildeo e concentraccedilatildeo47 316 Ensaios de Cristalizaccedilatildeo47 317 Espalhamento de raio-X a baixo acircngulo (SAXS)48 318 Modelagem de TcKAP748 319 Obtenccedilatildeo de antissoro policlonal contra TcKAP749 320 Anaacutelise da expressatildeo do gene TcKAP7 e de seu mutante por ensaio tipo western blot49 321 Superexpressatildeo de TcKAP750
3211 Amplificaccedilatildeo e clonagem do gene TcKAP7 no vetor pNEO3xFlag para superexpressatildeo da proteiacutena50 3212 Transfecccedilatildeo por eletroporaccedilatildeo52 3213 Seleccedilatildeo dos transfectantes52 322 Deleccedilatildeo do gene TcKAP7 por nocaute gecircnico53 3221 Amplificaccedilatildeo e clonagem das regiotildees a montante e a jusante do gene TcKAP753 3222 Amplificaccedilatildeo dos cassetes UPS-NEO-DOWN e UPS-HIGRO-DOWN para transfecccedilatildeo de T cruzi55 3223 Transfecccedilatildeo do T cruzi com o cassete UPS-NEO-DOWN56 3224 Extraccedilatildeo de DNA dos transfectantes57 3225 Anaacutelise por PCR do DNA dos parasitas transfectados com o cassete UPS-NEO-DOWN57 3226 Transfecccedilatildeo do T cruzi com o cassete UPS-HIGRO-DOWN57 3227 Anaacutelise por PCR do DNA dos parasitas transfectados com o cassete UPS-HIGRO-DOWN58 3228 Anaacutelise da organizaccedilatildeo do gene TcKAP7 e da eficiecircncia de seu nocaute atraveacutes de ensaio do tipo Southern blot58 323 Localizaccedilatildeo celular da proteiacutena TcKAP7 atraveacutes de ensaio de imunofluorescecircncia59 324 Anaacutelise da ultraestrutura do cinetoplasto do mutante de T cruzi para TcKAP7 por microscopia eletrocircnica de transmissatildeo60 325 Coloraccedilatildeo dos parasitas transfectados60 326 Infecccedilatildeo de ceacutelulas Vero com o mutante de T cruzi para TcKAP761 327 Anaacutelise da funccedilatildeo do gene TbKAP7 de Trypanosoma brucei atraveacutes de ensaios de RNA de interferecircncia61 3271 Induccedilatildeo do RNA dupla fita64 4 RESULTADOS65 41 Clonagem e caracterizaccedilatildeo do gene TcKAP765 42 Expressatildeo da proteiacutena TcKAP7 em T cruzi69 43 Localizaccedilatildeo celular de TcKAP7 atraveacutes de ensaio de imunofluorescecircncia70 44 Deleccedilatildeo do gene TcKAP7 por nocaute gecircnico71 441 Anaacutelise por PCR do DNA dos parasitas transfectados com os cassetes UPS-NEO-DOWN e UPS-HIGRO-DOWN72 442 Anaacutelise da organizaccedilatildeo dos genes TcKAP7 neo e higro por ensaio do tipo Southern blot74 45 Comparaccedilatildeo da expressatildeo do gene TcKAP7 por western blot76 46 Anaacutelise da morfologia e da ultraestrutura do cinetoplasto do mutante de T cruzi para TcKAP776 47 Multiplicaccedilatildeo diferenciaccedilatildeo e infectividade do mutante de T cruzi para TcKAP779 48 Anaacutelise da funccedilatildeo do gene KAP7 de Trypanosoma brucei atraveacutes de ensaios de RNA de interferecircncia80 49 Caracterizaccedilatildeo estrutural de TcKAP782 491 Produccedilatildeo recombinante de TcKAP782 410 Anaacutelise do estado oligomeacuterico de TcKAP784 411 Anaacutelise do conteuacutedo de estrutura secundaacuteria de TcKAP7 recombinante86 412 Anaacutelise estrutural de TcKAP787
413 Investigaccedilatildeo de possiacuteveis funcionalidades baseadas na estrutura de TcKAP791 4131 Prediccedilatildeo de funccedilatildeo paraTcKAP791 4132 Anaacutelises preliminares da possiacutevel interaccedilatildeo entre TcKAP7 e kDNA93 5 DISCUSSAtildeO97 6 CONCLUSOtildeES102 7 REFEREcircNCIAS103
18
1 INTRODUCcedilAtildeO
11 O Trypanosoma cruzi
Trypanosoma cruzi eacute um protozoaacuterio flagelado unicelular pertencente ao
reino Protista subreino Protozoa filo Sarcomastigophora subfilo Mastigophora
classe Zoomastigophora ordem Kinetoplastida e famiacutelia Trypanosomatidae (LEVINE
et al 1980) A principal caracteriacutestica dessa ordem eacute a presenccedila de uma estrutura
singular o cinetoplasto que abriga em uma massa de DNA extranuclear
concentrado na mitococircndria uacutenica deste protista (SHAPIRO amp ENGLUND 1995) A
famiacutelia Trypanosomatidae inclui os seguintes gecircneros importantes Blastocrithidia
Crithidia Endotrypanum Herpetomonas Leishmania Leptomonas Phytomonas e
Trypanosoma O gecircnero Trypanosoma eacute um dos mais importantes dentro da famiacutelia
Trypanosomatidae por incluir uma seacuterie de espeacutecies causadoras de doenccedilas
humanas importantes como o Trypanosoma cruzi agente da doenccedila de Chagas
Trypanosoma rhodesiense e Trypanosoma gambiense agentes da doenccedila do sono
e de animais o Trypanosoma brucei Trypanosoma equiperdum e Trypanosoma
equinum (DE SOUZA 2015)
Este protozoaacuterio eacute um microrganismo heteroxecircnico com ciclo bioloacutegico
alternado entre hospedeiros vertebrados (mamiacuteferos) e invertebrados (triatomiacuteneos)
Existem diferentes formas de transmissatildeo da doenccedila dentre as quais se destaca a
via vetorial que consiste na transmissatildeo do parasita atraveacutes de excretas do inseto
vetor hematoacutefago pertencente agrave ordem Hemiacuteptera famiacutelia Reduvidae subfamiacutelia
Triatominae (DIAS et al 1956) A principal caracteriacutestica bioloacutegica dos triatomiacuteneos
eacute que satildeo obrigatoriamente hematoacutefagos e necessitam do repasto sanguiacuteneo para
completar o desenvolvimento (DIAS 2000) O parasita pode ainda ser transmitido
aos mamiacuteferos por transfusatildeo sanguiacutenea ou via oral e com menos frequecircncia por
via congecircnita acidentes de laboratoacuterio e transplantes de oacutergatildeos (BELTRAO HDE et
al 2009 STEINDEL et al 2008 TANOWITZ et al 1992) Praticamente todo tipo
de ceacutelula nucleada do hospedeiro mamiacutefero pode ser parasitada considerando o
tropismo das diferentes cepas (LENZI et al 1996) Outra caracteriacutestica deste
parasita eacute apresentar diferentes morfologias durante o ciclo bioloacutegico A classificaccedilatildeo
19
de suas formas baseia-se tambeacutem na posiccedilatildeo do cinetoplasto em relaccedilatildeo ao nuacutecleo
e do local de onde emerge o flagelo (HOARE 1971)
Foi no ano de 1909 no estado de Minas Gerais que Carlos Chagas meacutedico
sanitarista identificou pela primeira vez o protozoaacuterio parasita Trypanosoma cruzi
agente causador da Doenccedila de Chagas A doenccedila de Chagas eacute endecircmica na
Ameacuterica Latina sendo conhecida a existecircncia de vetores da doenccedila desde o sul dos
Estados Unidos agrave Argentina (FIGURA 1)
FIGURA 1 DISTRIBUICcedilAtildeO GEOGRAacuteFICA DA DOENCcedilA DE CHAGAS FONTE Modificado de httpwwwwhointen
Em 2008 o nuacutemero de indiviacuteduos infectados era estimado entre 16 e 18
milhotildees sendo que aproximadamente 90 milhotildees de pessoas estariam sob risco
de contaminaccedilatildeo na Ameacuterica Latina (WHO 2010)
Apesar de existirem drogas (Nifurtimox e Benzonidazol) para o tratamento
da doenccedila sua ineficaacutecia no estaacutegio crocircnico e sua accedilatildeo toacutexica acabam prejudicando
o paciente sem conseguir eliminar o parasita (BRENER et al 2000) Sem vacinas
ou tratamento quimioteraacutepico eficiente a principal estrateacutegia de controle limita-se agrave
prevenccedilatildeo da transmissatildeo por transfusatildeo sanguiacutenea e ao controle populacional dos
vetores triatomiacuteneos Aleacutem da sua importacircncia como patoacutegeno humano este micro-
organismo apresenta caracteriacutesticas peculiares que o tornam um excelente modelo
para o estudo de questotildees bioloacutegicas baacutesicas
Regiotildees endecircmicas
20
12 Ciclo de vida do T cruzi
O T cruzi apresenta um ciclo complexo na natureza sofrendo mudanccedilas
estruturais bioquiacutemicas e morfoloacutegicas de acordo com o ambiente em que se
encontra Formas replicativas epimastigotas e amastigotas dos hospedeiros
invertebrado e mamiacutefero respectivamente alternam-se com as formas infectivas e
natildeo proliferativas tripomastigotas metaciacuteclicas (proveniente do inseto vetor) e
tripomastigota sanguiacutenea (originaacuteria do mamiacutefero infectado) (FIGURA 2) (DE
SOUZA 1984)
FIGURA 2 CICLO DE TRANSMISSAtildeO DO Trypanosoma cruzi FONTE Infograacutefico Veniacutecio Ribeiro ICICTFIOCRUZ
Durante o repasto sanguiacuteneo do inseto vetor formas tripomastigotas
metaciacuteclicas atingem a corrente sanguiacutenea do hospedeiro pela lesatildeo da picada Esta
forma infectiva eacute capaz de invadir todos os tipos de ceacutelulas com exceccedilatildeo das
21
hemaacutecias Apoacutes a entrada do parasita na ceacutelula os tripomastigotas diferenciam-se
em uma forma replicativa denominada amastigota que apoacutes diversas divisotildees sofre
uma diferenciaccedilatildeo para um estaacutegio intermediaacuterio o epimastigota intracelular e
posteriormente para tripomastigota Quando ocorre a lise celular os tripomastigotas
satildeo liberados ao meio extracelular podendo entatildeo invadir ceacutelulas vizinhas atingir
novos tecidos atraveacutes da corrente sanguiacutenea ou ainda infectar um inseto vetor
durante o processo de hematofagia recomeccedilando o ciclo no hospedeiro
invertebrado No inseto as formas tripomastigotas diferenciam-se em epimastigotas
no tubo digestivo e migram para o intestino onde ocorrem as divisotildees binaacuterias Ao
atingirem a porccedilatildeo terminal do tubo digestivo ocorre a diferenciaccedilatildeo em
tripomastigotas metaciacuteclicos que satildeo eliminados juntamente com as fezes e urina do
triatomiacutedeo
A transformaccedilatildeo da forma epimastigota do T cruzi em tripomastigota
metaciacuteclica denominada metaciclogecircnese eacute de grande interesse de estudo pois
neste processo ocorrem diversas alteraccedilotildees morfoloacutegicas metaboacutelicas e de
expressatildeo gecircnica (GOLDENBERG et al 1985) A metaciclogecircnese que ocorre
naturalmente no intestino do inseto vetor pode ser mimetizada in vitro utilizando-se
meio quimicamente definido que simula as condiccedilotildees da urina do inseto vetor
(CONTRERAS et al 1985)
13 Aspectos celulares de T cruzi
O Trypanosoma cruzi apresenta aleacutem das organelas tiacutepicas da maioria das
ceacutelulas eucarioacuteticas como nuacutecleo retiacuteculo endoplasmaacutetico aparato de Golgi e
mitococircndria algumas estruturas peculiares (FIGURA 3) como os microtuacutebulos
subpeliculares a estrutura paraflagelar os reservossomos o cinetoplasto os
glicossomos e os acidocalcisomos exclusivos dos tripanosomatiacutedeos (revisto por
DE SOUZA 1984 1999 2002)
22
FIGURA 3 ESQUEMA GERAL DAS PRINCIPAIS ESTRUTURAS CELULARES DE T cruzi FONTE DOCAMPO et al 1975
A superfiacutecie celular dos tripanossomatiacutedeos eacute composta principalmente
pela membrana plasmaacutetica e pelos microtuacutebulos subpeliculares Pequenos
filamentos conectam fortemente os microtuacutebulos subpeliculares os quais se
apresentam espaccedilados de forma regular entre si e com a membrana plasmaacutetica (DE
23
SOUZA SANTANNA CUNHA-E-SILVA 2009) conferindo rigidez agrave ceacutelula e
resistecircncia ao rompimento mecacircnico
Todos os membros da famiacutelia Trypanosomatidae apresentam um flagelo
que emerge de uma aacuterea de invaginaccedilatildeo da membrana plasmaacutetica conhecida como
bolsa flagelar Devido agrave localizaccedilatildeo especiacutefica de vaacuterios receptores nesta aacuterea
acredita-se que a maior parte do traacutefego vesicular e entrada de nutrientes ocorram
nesta regiatildeo Outra invaginaccedilatildeo menor localizada proacutexima agrave bolsa flagelar o
citoacutestomo tambeacutem estaacute envolvida com a absorccedilatildeo de nutrientes (PORTO-
CARREIRO et al 2000)
O flagelo do T cruzi apresenta uma estrutura baacutesica semelhante a outros
flagelos sendo envolvido por uma membrana flagelar e contendo um axonema
tiacutepico que apresenta um padratildeo de nove pares de microtuacutebulos perifeacutericos e um par
central Associado ao flagelo deste parasita eacute encontrado um complexo arranjo de
filamentos proteacuteicos denominado de estrutura paraflagelar (revisto por GULL 1999)
Na parte posterior da ceacutelula existem organelas usualmente esfeacutericas
denominadas reservossomos Os reservossomos satildeo organelas aacutecidas que
possuem em seu interior proteinases principalmente a cruzipaiacutena (uma
cisteiacutenoproteinase) e proteiacutenas ingeridas que chegam dentro de vesiacuteculas
endociacuteticas oriundas da bolsa flagelar e do citoacutestomo Com base nisso foi proposto
que os reservossomos seriam compartimentos preacute-lisossomais (SOARES et al
1992) Tambeacutem tem sido proposta a participaccedilatildeo dos reservossomos no processo
de metaciclogecircnese como principal fonte de energia para esta atividade (SOARES
1999)
O T cruzi assim como todos os membros da famiacutelia Tripanosomatidae
apresenta uma mitococircndria uacutenica e ramificada que se estende por todo o corpo do
protozoaacuterio Como em todas as ceacutelulas eucarioacuteticas a mitococircndria dos
tripanosomatiacutedeos tambeacutem apresenta DNA mitocondrial tambeacutem conhecido como
kDNA ou DNA do cinetoplasto que se concentra em uma determinada regiatildeo da
mitococircndria localizada logo abaixo do corpuacutesculo basal dando origem a uma
estrutura intramitocondrial chamada de cinetoplasto O cinetoplasto abriga o kDNA
o qual eacute constituiacutedo por moleacuteculas circulares que se encontram interligadas
formando uma extensa rede entre si (SHLOMAI 1994)
Distribuiacutedos pelo citoplasma estatildeo os glicossomos um tipo especializado de
peroxissomo Estes acumulam enzimas da via glicoliacutetica envolvidas na conversatildeo
24
da glicose a 3-fosfoglicerato que em outros organismos localizam-se no citoplasma
(HANNAERT et al 2003)
Outra particularidade dos tripanossomatiacutedeos estaacute na estocagem intracelular
de caacutelcio Este iacuteon importante nos processos de sinalizaccedilatildeo celular eacute estocado em
organelas denominadas acidocalcissomos Os acidocalcissomos provavelmente
estatildeo envolvidos em diversos processos bioloacutegicos tais como o armazenamento de
caacutelcio e polifosfatos adaptaccedilatildeo dos tripanosomatiacutedeos a condiccedilotildees de estresse
ambiental manutenccedilatildeo do pH intracelular e osmorregulaccedilatildeo (revisto por DOCAMPO
et al 2005)
14 O genoma de T cruzi
No ano de 2005 foi concluiacuteda a montagem do genoma do T cruzi (EL-
SAYED et al 2005) A cepa CL Brener foi a escolhida para o sequenciamento por
ser bem caracterizada bioquiacutemica e parasitologicamente (ZINGALES et al 1997) e
por ser considerada representativa para o universo de cepas circulantes de T cruzi
Com base na montagem do sequenciamento o genoma diploacuteide do parasita foi
calculado como sendo de 1064 1107 Mb com cada haploacutetipo contendo cerca de
12000 genes sendo que mais de 50 do genoma constituiu-se de sequecircncias
repetitivas compostas por famiacutelias de proteiacutenas de superfiacutecie retrotransposons e
elementos subtelomeacutericos (EL-SAYED et al 2005)
A comparaccedilatildeo das estruturas genocircmicas e proteiacutenas preditas obtidas a
partir do sequenciamento de Trypanosoma cruzi com as de Leishmania major e
Trypanosoma brucei indica mais similaridade entre T cruzi e T brucei uma grande
conservaccedilatildeo entre os respectivos proteomas (exceto para antiacutegenos de superfiacutecie) e
uma sintenia bastante conservada entre os trecircs tripanosomatiacutedeos apesar da
divergecircncia haacute 200-500 milhotildees de anos atraacutes (BERRIMAN et al 2005 EL SAYED
et al 2005 IVENS et al 2005)
Os tripanosomatiacutedeos possuem aleacutem do genoma nuclear um grande
genoma mitocondrial (kDNA) que tem sido extensivamente estudado sendo uacutenico
em estrutura funccedilatildeo e mecanismo de replicaccedilatildeo O kDNA eacute formado por milhares de
moleacuteculas circulares topologicamente relaxadas e interligadas umas as outras Este
arranjo conteacutem aproximadamente 20 - 30 do DNA total dos tripanosomatiacutedeos e eacute
composto por 2 tipos de moleacuteculas circulares os maxiciacuterculos e os miniciacuterculos Os
25
maxiciacuterculos apresentam um tamanho entre 22-37 kb e conteacutem basicamente os
genes codificadores de proteiacutenas envolvidas na fosforilaccedilatildeo oxidativa e RNA
ribossocircmico Os miniciacuterculos com um tamanho que varia de espeacutecie para espeacutecie
(05 a 25 kb) conteacutem os genes que codificam os RNAs guia envolvidos na
editoraccedilatildeo do RNA (STUART et al 1989 SHAPIRO amp ENGLUND 1995 MADISON-
ANTENUCCI et al 2002 SIMPSON et al 2003 ONN et al 2006 GLUENZ et al
2007)
15 Expressatildeo gecircnica de Tcruzi
T cruzi estaacute sujeito agraves frequentes mudanccedilas de ambientes decorrentes da
passagem por diferentes hospedeiros durante seu ciclo de vida (temperatura pH
quantidade de nutrientes evasatildeo do sistema imune) por esse motivo a expressatildeo
gecircnica deste parasita eacute regulada por diversos fatores A adaptaccedilatildeo raacutepida e eficiente
a estas diferentes condiccedilotildees torna-se uma importante tarefa para o parasita
Como os demais eucariotos o T cruzi apresenta trecircs RNAs polimerases a
RNA polimerase I transcreve os genes para RNAs ribossocircmicos a RNA polimerase
II os genes que codificam proteiacutenas e a RNA polimerase III pequenos RNAs como
o tRNA (RNA de transferecircncia) Nos tripanosomatiacutedeos promotores para as RNA
polimerase I e III jaacute foram identificados poreacutem ainda natildeo foram identificados
promotores para os genes transcritos pela RNA polimerase II com exceccedilatildeo de um
promotor associado ao gene do mini-exon (GILLINGER amp BELLOFATTO 2001
revisto por CAMPBELL et al 2003)
Os genes dos tripanosomatiacutedeos estatildeo organizados em unidades
policistrocircnicas e natildeo apresentam interrupccedilotildees por iacutentrons com exceccedilatildeo do gene da
poli-A polimerase (MAIR et al 2000)
Uma vez que em T cruzi como nos demais eucariotos somente mRNAs
monocistrocircnicos satildeo traduzidos os precursores de mRNA policistrocircnicos devem ser
processados ateacute mRNAs individuais Como caracteriacutestica desta famiacutelia os
transcritos de mRNA satildeo processados por mecanismos de trans-splicing (AGABIAN
1990) e poliadenilaccedilatildeo (LEBOWITZ et al 1993 MATTHEWS et al 1994
VANHAMME amp PAYS 1995)
No processo de trans-splicing as unidades codificadoras satildeo separadas e eacute
adicionada na extremidade 5rsquo uma sequecircncia extremamente conservada espeacutecie-
26
especiacutefica de 39 nucleotiacutedeos denominada sequumlecircncia liacuteder (SL) ou minieacutexon
(McCARTHY-BURKE et al 1989 NILSEN 1992 VANHAMME amp PAYS 1995)
Nesta reaccedilatildeo participam duas moleacuteculas de RNA uma doadora e outra aceptora A
doadora eacute um precursor do mini-exon e em T cruzi possui cerca de 110
nucleotiacutedeos (ZWIERZYNSKI amp BUCK 1991) A aceptora eacute o transcrito derivado da
unidade policistrocircnica ao qual o mini-exon eacute transferido O complexo enzimaacutetico
envolvido nesta reaccedilatildeo eacute semelhante ao descrito para a de cis-splicing (LAIRD
1989)
Os transcritos processados satildeo estabilizados pela estrutura cap 4 do mini-
exon (ULLU amp TSCHUDI 1991) e pela adiccedilatildeo de uma cauda poli-A agrave extremidade
3rsquo sendo que a adiccedilatildeo de ambos os elementos ocorrem em conjunto (LEBOWITZ et
al 1993) Regiotildees ricas em resiacuteduos de pirimidinas aleacutem da sequumlecircncia consenso
(AG) para o trans-splicing regulam a adiccedilatildeo do mini-exon e da cauda poli-A
Deleccedilotildees nestas regiotildees impedem o correto processamento destes transcritos
(MATTHEWS et al 1994)
A ocorrecircncia de transcriccedilatildeo policistrocircnica associada agrave ausecircncia de
promotores para RNA polimerase II e agrave presenccedila de niacuteveis distintos de mRNA
originados de uma mesma unidade policistrocircnica sugerem que a regulaccedilatildeo da
expressatildeo gecircnica nesses protozoaacuterios ocorra a niacutevel poacutes-transcricional baseada
principalmente em mecanismos que controlam a estabilidade e a traduccedilatildeo dos
mRNAs (CLAYTON 2002 BOUCHER et al 2002)
16 O cinetoplasto
O cinetoplasto eacute uma estrutura peculiar presente nos tripanosomatiacutedeos e
encontra-se inserida no interior da mitococircndria uacutenica abrigando fibrilas de DNA
conhecidas como kDNA O nome cinetoplasto (cineto=movimento e plasto=organela)
foi dado pois se acreditava que o mesmo fosse responsaacutevel pelo movimento do
flagelo
17 A rede de kDNA
O DNA do cinetoplasto eacute formado por dois tipos de moleacuteculas circulares os
miniciacuterculos de tamanho entre 05 e 25 kb e os maxiciacuterculos que apresentam
entre 20 e 40 kb Cerca de 10000 miniciacuterculos e 50 maxiciacuterculos se encontram
27
catenados formando uma extensa rede (SHAPIRO amp ENGLUND 1995 DE SOUZA amp
CAVALCANTI 2008) (FIGURA 4)
FIGURA 4 REDE DE kDNA
FONTE ROY CHOWDHURY et al 2010
As primeiras questotildees relacionadas ao arranjo das moleacuteculas na rede do
kDNA dos tripanosomatiacutedeos surgiram na deacutecada de 80 sugerindo que tal
organizaccedilatildeo poderia ter evoluiacutedo como um maneira mais eficaz de armazenar uma
grande quantidade de material em um pequeno espaccedilo (HAJDUK et al 1986)
Os maxiciacuterculos apresentam um tamanho de 22 a 37 kb e assim como o
DNA mitocondrial de outros eucariotos codificam RNAs ribossomais e diversas
proteiacutenas da cadeia respiratoacuteria incluindo subunidades da citocromo oxidase e
NADH desidrogenase (revisto por SHAPIRO amp ENGLUND 1995) Os transcritos dos
maxiciacuterculos satildeo processados poacutes-transcricionalmente para formar mRNAs
funcionais atraveacutes de um processo conhecido como ediccedilatildeo ou editoraccedilatildeo do RNA
A editoraccedilatildeo do RNA consiste na inserccedilatildeo ou retirada de resiacuteduos de uridina em
28
siacutetios especiacuteficos dos RNAs transcritos pelos maxiciacuterculos a fim de criar coacutedons de
iniciaccedilatildeo ou terminaccedilatildeo mudanccedilas na fase de leitura ou quadros abertos de leitura a
partir de sequumlecircncias sem sentido O processo de ediccedilatildeo eacute especificado por
pequenos RNAs guias produzidos pelos miniciacuterculos e maxiciacuterculos e catalisado
por um complexo muiltiproteacuteico o editosomo (revisto por Esteacutevez amp Simpson 1999
Stuart et al 2005) Esse processo constitui uma forma de regular poacutes-
transcricionalmente a expressatildeo de genes mitocondriais nas diferentes formas
evolutivas do parasita
Os miniciacuterculos caracterizam-se por apresentar um tamanho de 05 a 25 kb
e por transcrever os RNAs guia (gRNA) responsaacuteveis pela especificidade da ediccedilatildeo
dos mRNAs codificados pelos maxiciacuterculos por meio de uma sequumlecircncia presente na
porccedilatildeo central desses gRNAs (BENNE 1994 STUART et al 2005) A significacircncia
da variaccedilatildeo em tamanho e organizaccedilatildeo entre as espeacutecies ainda natildeo eacute aparente
contudo a diversidade das sequecircncias dos miniciacuterculos estaacute correlacionada com a
necessidade de mais ou menos ediccedilatildeo de mRNA de cada organismo (STUART
1991) Apesar desta diversidade os miniciacuterculos apresentam pelo menos duas
regiotildees conservadas o dodecacircmero GGGGTTGGTGTA conhecido como sequecircncia
universal dos miniciacuterculos (UMS) e o hexacircmero ACGCCC que correspondem agrave
origem de replicaccedilatildeo da fita L (light) e da fita H (heavy) respectivamente
(BIRKENMEYER amp RAY 1986 BIRKENMEYER et al 1987 RAY 1989 SHLOMAI
1994 HINES amp RAY 2008)
Embora o cinetoplasto de todos os tripanosomatiacutedeos seja formado por
moleacuteculas circulares relaxadas e catenadas diferentes arranjos da rede de kDNA
podem ser observados entre diferentes estaacutegios do ciclo de vida desses
protozoaacuterios como em T cruzi (FIGURA 5) assim como mudanccedilas na posiccedilatildeo do
kDNA satildeo utilizadas para identificar as diferentes formas evolutivas do parasita
(FIGURA 6)
29
FIGURA 5 ndash DIFERENTES ARRANJOS DO CINETOPLASTO DE T cruzi
LEGENDA As fibrilas de kDNA se apresentam bastante compactadas em forma de bastatildeo nas formas amastigotas (A) e epimastigotas (B) enquanto nas formas tripomastigotas a rede de kDNA torna-se menos compacta e a forma em bastatildeo do cinetoplasto daacute lugar a uma forma arredondada (C) FONTE DE SOUZA amp SOUTO-PADRON 1980 e DE SOUZA 1984
Nas formas amastigota (FIGURA 5A) e epimastigota (FIGURA 5B) de T
cruzi as fibrilas de kDNA se apresentam bastante compactadas em forma de
bastatildeo Em tripomastigotas (FIGURA 5C) de T cruzi a rede de kDNA torna-se
menos compacta e a forma em bastatildeo do cinetoplasto daacute lugar a uma forma
arredondada (DE SOUZA 1984) Os vaacuterios graus de compactaccedilatildeo do kDNA em
tripanosomatiacutedeos podem estar relacionados com a accedilatildeo de proteiacutenas que
condensam o DNA como seraacute visto mais adiante
FIGURA 6 MUDANCcedilAS NA POSICcedilAtildeO DO KDNA NOS TRYPANOSOMAS FONTE Modificado de DO CAMPO et al 2005
30
O cinetoplasto de todos os tripanosomatiacutedeos encontra-se localizado
proacuteximo ao corpo basal perpendicularmente ao eixo do flagelo Em alguns
tripanosomatiacutedeos que sofrem diferenciaccedilatildeo ao longo de seu ciclo de vida como o
T cruzi o cinetoplasto muda de posiccedilatildeo dentro da ceacutelula passando da regiatildeo
anterior (nos epimastigotas) para a regiatildeo posterior (nos tripomastigotas) poreacutem
permanecendo proacuteximo e perpendicular ao corpo basal (FIGURA 7) O cinetoplasto
eacute fisicamente conectado ao corpo basal atraveacutes de um grupo de filamentos
citoplasmaacuteticos chamado de complexo de ligaccedilatildeo tripartite (TAC) (OGBADOYI et al
2003) Este complexo eacute responsaacutevel pelo posicionamento espacial do cinetoplasto e
por sua segregaccedilatildeo
FIGURA 7 REPOSICIONAMENTO DO KDNA EM RELACcedilAtildeO AgraveS OUTRAS ORGANELAS DURANTE O CICLO DE VIDA DE UM FLAGELADO LEGENDA A morfologia eacute definida pelas posiccedilotildees do ponto onde emerge o flagelo e a bolsa flagelar (BF) (mostrada em laranja) nuacutecleo (mostrado em azul) e kDNA (mostrado em roxo) FONTE Modificado de FIELD amp CARRINGTON 2009
31
171 Replicaccedilatildeo do kDNA
Nos tripanosomatiacutedeos a replicaccedilatildeo do kDNA eacute restrita a fase S nuclear
(COSGROVE amp SKEEN 1970 WOODWARD amp GULL 1990) diferente do que
acontece na maioria dos eucariotos onde a replicaccedilatildeo do DNA mitocondrial ocorre
ao longo do ciclo celular (LIU et al 2005)
A replicaccedilatildeo dos miniciacuterculos se inicia quando estes satildeo individualmente
decatenados da rede de kDNA pela accedilatildeo de DNA topoisomerases do tipo II pois
estes natildeo se replicam enquanto estatildeo ligados agrave rede e termina quando os
miniciacuterculos retornam para a rede com a ajuda da mesma enzima (SHAPIRO amp
ENGLUND 1995)
Os miniciacuterculos satildeo liberados da rede em direccedilatildeo a zona cinetoflagelar
(KFZ) uma regiatildeo especializada da matriz mitocondrial entre o kDNA e o corpo
basal (FIGURA 8) que abriga proteiacutenas envolvidas com o iniacutecio da replicaccedilatildeo Em
seguida os ciacuterculos migram (ou satildeo transportados) para os poacutelos opostos da rede
de kDNA para completar sua replicaccedilatildeo O iniacutecio da replicaccedilatildeo dos miniciacuterculos na
regiatildeo cinetoflagelar envolve a montagem de um complexo proteacuteico na origem de
replicaccedilatildeo dos ciacuterculos com a participaccedilatildeo da primase polimerase e proteiacutenas que
se ligam agrave sequumlecircncia universal de miniciacuterculos (UMSBP) Estas juntamente com
outras proteiacutenas geram uma forquilha de replicaccedilatildeo que se propaga
unidirecionalmente ao redor do miniciacuterculo formando uma estrutura tipo
intermediaacuteria (LIU et al 2005 GLUENZ et al 2007)
Os miniciacuterculos receacutem-replicados migram da zona KFZ para dois complexos
proteacuteicos situados nos poacutelos diametralmente opostos do cinetoplasto onde os
proacuteximos passos de replicaccedilatildeo iratildeo ocorrer Estes passos incluem remoccedilatildeo dos
primers pela accedilatildeo de endonucleases preenchimento de alguns intervalos entre os
fragmentos de Okazaki pela DNA polimerase e uniatildeo dos cortes (nicks) por uma
DNA ligase Apoacutes estas etapas os novos ciacuterculos sintetizados que ainda possuem
pelo menos uma interrupccedilatildeo em sua sequumlecircncia satildeo reunidos agrave periferia da rede
pela accedilatildeo de topoisomerases II Apoacutes todos miniciacuterculos terem sido replicados os
intervalos satildeo reparados (Revisto por LIU et al 2005 POVELONES 2014)
Pouco se sabe sobre o processo de replicaccedilatildeo dos maxiciacuterculos Assim
como os miniciacuterculos os maxiciacuterculos tambeacutem sofrem replicaccedilatildeo unidirecional que
32
se inicia em uma origem contida na regiatildeo variaacutevel da moleacutecula formando estruturas
tipo- Entretanto ao contraacuterio dos miniciacuterculos eles permanecem ligados agrave rede de
kDNA durante o processo replicativo (revisto por KLINGBEIL et al 2001 Liu et al
2005)
FIGURA 8 REPLICACcedilAtildeO DO kDNA FONTE Modificado de LIU et al 2005
18 Proteiacutenas associadas ao cinetoplasto (KAPs)
Proteiacutenas que se ligam ao DNA tambeacutem foram identificadas na mitococircndria
de uma variedade de organismos eucarioacuteticos variando de levedura ateacute humanos
(MAIER et al 2001) Estas proteiacutenas satildeo codificadas no nuacutecleo da ceacutelula e satildeo poacutes-
traducionalmente importadas para a mitococircndria
Conceitualmente qualquer proteiacutena que se associe ao kDNA quer atuando
na replicaccedilatildeo e transcriccedilatildeo quer atuando na organizaccedilatildeo compactaccedilatildeo e
segregaccedilatildeo da rede pode ser chamada de KAP (KAP do inglecircs Kinetoplast-
33
Associated Protein) Observou-se que algumas dessas KAPs apresentam
caracteriacutesticas de proteiacutenas histonas H1 (H1 histone-like proteins) por serem
proteiacutenas pequenas (17 a 25 kDa) fortemente baacutesicas (pI de 11 a 125) interagindo
com a carga negativa das moleacuteculas de DNA e com grande conteuacutedo dos
aminoaacutecidos lisina e arginina elevado (aprox 30 a 50)
Proteiacutenas associadas com genoma mitochondrial (KAPs) dos
tripanosomatiacutedeos e que compartilham caracteriacutesticas com histonas H1 foram
inicialmente identificadas no cinetoplasto do tripanosomatiacutedeo de inseto Crithidia
fasciculata e denominadas de KAP1 a 5 As H1-KAPs de C fasciculata interagem
com miniciacuterculos (XU et al 1996) e desse modo podem facilitar a associaccedilatildeo
orientaccedilatildeo e organizaccedilatildeo dessas moleacuteculas na rede pela neutralizaccedilatildeo das cargas
negativas das moleacuteculas de DNA contribuindo para a condensaccedilatildeo organizaccedilatildeo e
segregaccedilatildeo da rede de kDNA Ateacute o momento foram caracterizadas quatro H1-KAPs
de C fasciculata (CfKAP1 2 3 and 4) Aleacutem das caracteriacutesticas de histona H1
possuem uma preacute-sequecircncia clivaacutevel de nove aminoaacutecidos em sua porccedilatildeo N-
terminal e que provavelmente estaacute envolvida no transporte da proteiacutena para o
cinetoplasto jaacute que natildeo aparece na proteiacutena madura (XU amp RAY 1993 XU et al
1996 HINES amp RAY 1998) Atraveacutes de ensaios de imunofluorescecircncia foi possiacutevel
confirmar que estas proteiacutenas estatildeo presentes em toda a rede de kDNA Pela
facilidade encontrada nas KAPs purificadas de condensar redes de kDNA in vitro
(XU et al 1996) sugere-se que estas estejam envolvidas na organizaccedilatildeo e
condensaccedilatildeo do kDNA in vivo (LUKES et al 2001)
As teacutecnicas de deleccedilatildeo de genes satildeo uma oacutetima ferramenta para elucidar as
possiacuteveis funccedilotildees que um gene pode apresentar Em C fasciculata foi utilizada a
teacutecnica de nocaute gecircnico para o gene Cfkap1 onde mutantes viaacuteveis foram
obtidos mostrando que a forma e a dimensatildeo do cinetoplasto natildeo foram alterados
ao contraacuterio da organizaccedilatildeo da rede de kDNA que passou a apresentar fibrilas de
DNA espessas e uma camada eleacutetron-densa no centro do disco Quando foi
realizada a reintroduccedilatildeo do gene na forma episomal o fenoacutetipo normal da rede de
kDNA foi restaurado (LUKES et al 2001) Tambeacutem foi realizado o duplo nocaute
dos genes Cfkap2 e Cfkap3 o qual da mesma maneira produziu mutantes viaacuteveis
poreacutem com o crescimento bastante reduzido uma reduccedilatildeo na respiraccedilatildeo e um
aumento nos niacuteveis de mRNAs codificados pelos maxiciacuterculos Apesar de todas
estas alteraccedilotildees o kDNA permaneceu inalterado mostrando que as proteiacutenas
34
CfKAP2 e CfKAP3 desempenham um papel diferente ao da CfKAP1 pois estatildeo
envolvidas com o metabolismo mitocondrial e proliferaccedilatildeo celular ao inveacutes de
estarem envolvidas na organizaccedilatildeo estrutural do kDNA (AVLIYAKULOV et al
2004)
Com base nesses estudos surgiu o interesse de nosso grupo no estudo de
KAPs em T cruzi visando verificar qual o papel dessas proteiacutenas na organizaccedilatildeo da
rede de kDNA e sua importacircncia nos diferentes estaacutegios do ciclo de vida do parasita
Atraveacutes de anaacutelises bioinformaacuteticas foram identificadas 6 diferentes H1-KAPs
codificadas no genoma do T cruzi levando em consideraccedilatildeo a similaridade com
KAPs de C fasciculata (CAVALCANTI et al 2009) Essas H1-KAPs foram
denominadas de KAP3 KAP4a KAP4b KAP4c KAP6 e KAP7 Nosso grupo iniciou
a caracterizaccedilatildeo das proteiacutenas TcKAP4 e TcKAP6 mostrando que elas se localizam
no cinetoplasto mas com padrotildees distintos de distribuiccedilatildeo dependendo da forma do
ciclo de vida do parasita (CAVALCANTI et al 2009) Mais recentemente mostramos
que o nocaute da TcKAP3 natildeo afeta a proliferaccedilatildeo diferenciaccedilatildeo e infectividade do
parasita (DE SOUZA et al 2010)
A complexidade da rede de kDNA sugere portanto que as diferentes KAPs
atuem em conjunto algumas vezes de modo redundante para desempenhar
funccedilotildees na condensaccedilatildeo replicaccedilatildeo segregaccedilatildeo dessa estrutura
35
2 OBJETIVOS
21 OBJETIVO GERAL
O objetivo principal deste trabalho eacute caracterizar a funccedilatildeo da TcKAP7 avaliando seu
papel na biologia do parasita
211 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS
a) Analisar a localizaccedilatildeo subcelular da TcKAP7 atraveacutes de ensaios de
imunofluorescecircncia
b) Produzir TcKAP7 recombinante em larga escala para ensaios de biologia
estrutural
c) Estudar a viabilidade do parasita na ausecircncia do gene TcKAP7 para os parasitas
viaacuteveis analisar morfologia e ultraestrutura do cinetoplasto multiplicaccedilatildeo
diferenciaccedilatildeo e infectividade
36
3 MATERIAIS E MEacuteTODOS
31 Reagentes e Soluccedilotildees Utilizados
311 Reagentes
AmershamBioscience dNTPs Hybond C Hybond N kit ECL de western blotting
filmes de raio-X Hyperfilmreg anticorpo monoclonal anti-Histidina
Bio-Rad Acrilamida Agarose (UltraPure DNA grade) Azul de Bromofenol Bis-
Acrilamida Persulfato de Amocircnia
Cult-lab RPMI 1640
Difco Baacutecto-Aacutegar Bactotriptona Extrato de levedura Infuso de fiacutegado Triptose
Invitrogen Inc EDTA Fenol TRIS Nick Translation kit Taq DNA polymerase
IPTG Agarose X-Gal DNA de λHindIII Marcador de massa molecular Benchmark
Alexa Fluacuteor 458 1 kb Plus DNA Ladder Soro Fetal Bovino T4 DNA ligase
Merck Acetato de Soacutedio Aacutecido Aceacutetico Glacial Cloreto de CaacutelcioCloreto de
Potaacutessio Cloreto de Soacutedio Etanol Absoluto Glicina Glicose Hidroacutexido de soacutedio
Isopropanol HCl Na2HPO4
New England Biolabs Endonucleases de restriccedilatildeo
Qiagen Qiaquick PCR Purification kit
Serva Electrophoresis Alu-Gel S
Sigma Acetato de amocircnia Ampicilina Brometo de Etiacutedeo BSA Kanamicina
Glicerol Hepes Cloreto de Magneacutesio Tetraciclina β-mercaptoetanol DEAE-
celulose Tween 20 adjuvante completo de Freund monoclonal M2 anti-FLAG
312 Tampotildees e Soluccedilotildees
PBS NaCl 137 mM KCl 27 mM Na2HPO4 43 mM e KH2PO4 15 mM
PSG Na2HPO4 (anidro) 4747 mM NaH2PO4 H2O 25 mM NaCl 3676 mM e
glicose 555 mM
Soluccedilatildeo de tripsinazaccedilatildeo tripsina 005 (mv) e EDTA 002 (mv) em PBS pH
80
37
Soluccedilatildeo de bloqueio para imunofluorescecircncia PBS e BSA 1 (albumina seacuterica
bovina)
Soluccedilatildeo de bloqueio para western blot TBST e leite em poacute desnatado 5
Soluccedilatildeo de lise para Toothpick NaOH 50 mM Glicerol 5 SDS 05 EDTA 5
mM e azul de bromofenol 0025
Soluccedilatildeo Ponceau S Ponceau S 05 em aacutecido aceacutetico 1
Soluccedilatildeo de coloraccedilatildeo para geacuteis de proteiacutena Coomassie blue R-250 01 em
metanolaacutecido aceacutetico (4510)
Soluccedilatildeo para descoloraccedilatildeo de geacuteis de proteiacutena Metanol 4 aacutecido aceacutetico 75
Tampatildeo de lise hipotocircnico Tris-HCl 10mM pH 75 NaCl 10mM MgCl2 5 mM β-
mercaptoetanol 5 mM
Tampatildeo A para cromatografia de afinidade Tris-HCl 20 mM pH 75 NaCl 500 mM
Tampatildeo B para cromatografia de afinidade Tampatildeo A contendo imidazol 1M
Tampatildeo B para cromatografia de troca iocircnica Tris-HCl 50 mM pH 80 NaCl 1M
Soluccedilatildeo de depurinaccedilatildeo para Southern blot HCl 025 M
Soluccedilatildeo desnaturante para Southern blot NaOH 05 M e NaCl 15 M
Soluccedilatildeo neutralizante para Southern blot Tris-HCl 05 M pH 75 e NaCl 15 M
Soluccedilatildeo Denhardt (50X) ficoll 05 polivinilpirrolidona 06 e albumina de soro
bovino 02
Soluccedilatildeo de hibridaccedilatildeo para Southern blot DNA de esperma de salmatildeo do tipo III
01 mgml fragmentado por ultra-som e desnaturado SSC 6X soluccedilatildeo de denhardt
6X e SDS 1
SSC 20X NaCl 3 M pH 70 e citrato de soacutedio 03 M
Soluccedilatildeo de baixa estringecircncia SSC 2X e SDS 01
Soluccedilatildeo de meacutedia estringecircncia SSC 1X e SDS 01
Soluccedilatildeo de alta estringecircncia SSC 01X e SDS 01
Tampatildeo de eletroporaccedilatildeo para T cruzi NaCl 140 mM HEPES (aacutecido) 25 mM e
Na2HPO4 074 mM pH 75
Tampatildeo ZPFM de eletroporaccedilatildeo de T brucei NaCl 129 mM KH2PO4 15mM KCl
8mM NaH2PO4 8mM MgCl2 15mM CaCl2 90 mM e CH3COONa 24 mM pH 70
Tampatildeo TELT Tris-HCl 50 mM pH 80 EDTA 625 mM pH 90 LiCl 25 M e Triton
X-100 4
Tampatildeo de amostra para DNA 10X Ficoll 400 25 azul de bromofenol 025 e
xileno cianol FF 025
38
Tampatildeo de amostra para proteiacutena 4X Tris-HCl 40 mM pH 68 SDS 1 β-
mercaptoetanol 25 glicerol 6 e azul de bromofenol 0005
Tampatildeo de eletroforese para SDS-PAGE 1X Tris-base 25 mM glicina 192 mM e
SDS 01
Tampatildeo de lise de bacteacuterias Tris-HCl 20 mM pH 75 NaCl 500 mM PMSF1 mM
Tampatildeo para transferecircncia (western blotting) 1X Tris-base 25 mM glicina 192
mM e metanol 20
Tampatildeo TBE Tris base 89 mM aacutecido boacuterico 89 mM e EDTA 2 mM
TBS Tris-HCl 20 mM pH 80 e NaCl 150 mM
TBST TBS e Tween 20 01
TE Tris-HCl 10 mM pH 80 e EDTA 1 mM
313 Meios de cultura
LB Triptona 1 extrato de levedura 5 e NaCl 1
Meio LIT (liver infusion tryptose) infuso de fiacutegado 05 NaCl 753 mM KCl 54
mM glicose 10 mM bacto-triptose 05 Na2HPO4 564 mM hemina 00025 soro
fetal bovino 10 e extrato de levedura 15 gl
Meio TAU NaCl 190 mM KCl 17 mM MgCl2 2 mM CaCl2 2 mM e tampatildeo fosfato 8
mM pH 60
Meio TAU3AAG meio TAU suplementado com L-prolina 10 mM glutamato soacutedico
50 mM aspartato soacutedico 2 mM e glicose 10 mM
32 Cultivo do Trypanosoma cruzi
Neste trabalho foi utilizado o clone Dm28c de T cruzi (CONTRERAS et al
1985 CONTRERAS et al 1988) nas formas epimastigota e tripomastigota
metaciacuteclico
321 Epimastigotas
Formas epimastigotas de T cruzi foram cultivadas em meio LIT (CAMARGO
1964) a 28 oC com passagens a cada trecircs dias e inoacuteculo de 1 x 106 ceacutelulasml As
formas epimastigotas foram coletadas por centrifugaccedilatildeo no terceiro dia de cultivo
39
(correspondente a fase logariacutetmica de crescimento baseada em curva de
crescimento realizada nas mesmas condiccedilotildees) quando a densidade celular
apresentava-se entre de 1 - 3 x 107 ceacutelulasml
322 Tripomastigotas metaciacuteclicos
As formas metaciacuteclicas foram obtidas atraveacutes do processo de diferenciaccedilatildeo
in vitro (BONALDO et al 1988) Formas epimastigotas em final de fase logariacutetmica
de crescimento (densidade celular entre 5 - 7 x 107 ceacutelulasml) foram coletadas por
centrifugaccedilatildeo a 7000 x g por 5 minutos a 10 oC e ressuspendidas em meio TAU
na concentraccedilatildeo de 5 x 108 ceacutelulasml e mantidas a 28 oC por 2 horas Apoacutes este
periacuteodo correspondente ao estresse nutricional as ceacutelulas foram transferidas para
garrafas de 300 cm2 contendo 200 ml de meio TAU3AAG (concentraccedilatildeo final de 5 x
106 ceacutelulasml) Uma proporccedilatildeo dos parasitas que se aderiram agrave superfiacutecie da
garrafa de cultivo se diferenciou em metaciacuteclicos os quais foram liberados no
sobrenadante (BONALDO et al 1988) Estas formas foram purificadas pela
passagem atraveacutes de uma coluna de afinidade contendo a resina DEAE celulose
equilibrada em PSG (SOUSA 1983) Este procedimento foi realizado com o tipo
selvagem para obtenccedilatildeo de extrato proteacuteico e tambeacutem com o mutante de T cruzi
para TcKAP7 para verificaccedilatildeo da capacidade de diferenciaccedilatildeo e infectividade onde
o nuacutemero de metaciacuteclicos no sobrenadante foi contado apoacutes 24 48 72 e 96 horas
da incubaccedilatildeo em meio TAU3AAG
33 Curva de crescimento de T cruzi
Formas epimastigotas de T cruzi clone Dm28c e do mutante de T cruzi para
TcKAP7 foram cultivadas como descrito no item 321 ateacute atingirem a fase
estacionaacuteria para a comparaccedilatildeo da taxa de crescimento de ambas Foram
inoculadas 1 x 106 epimastigotas por ml de meio LIT em garrafas de 25 cm2 e
incubadas em seguida a 28 degC Diariamente foi realizada a contagem das culturas
em cacircmaras de Neubauer em diluiccedilotildees apropriadas ateacute o deacutecimo dia O graacutefico da
curva de crescimento comparativa entre a cultura selvagem e a nocaute foi feito
utilizando o programa Microsoft Excel
40
34 Obtenccedilatildeo de DNA de T cruzi
A extraccedilatildeo de DNA foi realizada conforme descrito por Medina-Acosta amp
Cross (1993) Epimastigotas (1 x 107 ceacutelulas) foram coletadas por centrifugaccedilatildeo a
7000 x g por 5 min lavadas em PBS e ressuspendidas em 350 microl de tampatildeo TELT
Apoacutes 5 min de incubaccedilatildeo agrave temperatura ambiente foi adicionado agrave amostra 1
volume de fenolclorofoacutermio e o material foi centrifugado a 13000 x g por 5 min A
fase aquosa foi recolhida e o DNA foi precipitado com 2 volumes de etanol absoluto
e coletado por centrifugaccedilatildeo a 13000 x g por 10 min O DNA presente no sedimento
foi lavado com etanol 70 seco e em seguida ressuspendido em tampatildeo TE
contendo RNAse a 20 microgml
35 Obtenccedilatildeo de kDNA de T cruzi
A extraccedilatildeo do kDNA de T cruzi foi realizada de acordo com Morel e
colaboradores (1980) com modificaccedilotildees
Formas epimastigotas (1 x109 ceacutelulas) foram coletadas por centrifugaccedilatildeo a
4000 x g por 10 min lavadas em PBS e ressuspendidas em 20 ml de Tampatildeo de
Lise Hipotocircnico Posteriormente adicionou-se Sacarose 025 M e o material foi
centrifugado 6000 x g por 10 min O pellet foi ressuspendido em 20 ml de Tris-HCl
10 mM pH 75 NaCl 10 Mm EDTA 5 mM SDS 05 A esta soluccedilatildeo foi adicionado
100 ug de proteinase K e a mesma permaneceu a 37 ordmC durante a noite No dia
seguinte as ceacutelulas foram transferidas para uma seringa de 50 ml aonde ocorreu a
quebra mecacircnica do DNA nuclear Este material foi ultracentrifugado a 27000 rpm a
4ordm C durante 1 hora utilizando o rotor SW28 Apoacutes centrifugaccedilatildeo o sobrenadante foi
desprezado e o pellet ressuspendido em 25 ml de TE e novamente ultracentrifugado
nas mesmas condiccedilotildees Apoacutes centrifugaccedilatildeo o pellet foi ressuspendido em 1ml de TE
e foi realizada a purificaccedilatildeo por fenolclorofoacutermio Apoacutes purificaccedilatildeo o material foi
ressuspendido em 300 ul de TE e utilizado para ensaios de SAXS
36 Obtenccedilatildeo de extrato proteico de T cruzi
41
As ceacutelulas foram coletadas por centrifugaccedilatildeo (4000 x g 5 min a 10 degC) e
lavadas duas vezes em PBS pH 75 Apoacutes as lavagens os parasitas foram
ressuspendidos em PBS e tampatildeo de amostra 4x foi adicionado de tal maneira que
a concentraccedilatildeo final fosse de 1 x 106 ceacutelulas equivalentesmicrol Os extratos foram
fervidos por 5 min e armazenados a - 70 degC
37 Clonagem do gene TcKAP7
A sequecircncia do gene TcKAP7 (ID Tc00104705350871950) foi obtida a
partir do banco de dados do genoma do T cruzi disponiacutevel no portal da internet
wwwgenedborg e a sua regiatildeo codificante foi amplificada por PCR com os primers
KAP7F (5rsquo ndash AAAGGATCCATGCTAAGAACTGTTCTGCCACTG 3rsquo) e KAP7R (5rsquo ndash
TCAGCGTCGACTTATGACGGTGGTGCAGGATCAGCAGCTGCAGTATTTT3rsquo) a
partir do DNA genocircmico de T cruzi Dm28c As sequecircncias de reconhecimento das
enzimas de restriccedilatildeo BamHI e SalI (marcadas em negrito) foram adicionadas na
extremidade 5rsquo dos primers KAP7F e KAP7R respectivamente As condiccedilotildees da
reaccedilatildeo de PCR foram as seguintes 100 ng de DNA total T cruzi 10 pmol de cada
primer 200 μM de cada dNTP MgCl2 15 mM tampatildeo Taq DNA polimerase 1x 25
U de Taq DNA polimerase (Invitrogen) A reaccedilatildeo de PCR foi processada no
termociclador modelo 9700 (Applied Biosystems EUA) com a desnaturaccedilatildeo do
material por 4 min a 94 degC seguida de 30 ciclos constando de desnaturaccedilatildeo a 94 degC
por 30 s hibridizaccedilatildeo dos primers a 58 degC por 30 s e extensatildeo a 72 degC por 1 min O
material amplificado foi purificado usando o kit Qiaquick PCR Purification (Qiagen) e
digerido com as enzimas de restriccedilatildeo BamHI e SalI com uso de 20 U de cada
enzima e seus respectivos tampotildees em volume final de 20 μl por 4 h a 37 oC O
material foi novamente purificado e utilizado para ligaccedilatildeo com o vetor pET28a
previamente digerido com as respectivas enzimas Bacteacuterias E coli cepa DH5α
foram transformadas com a ligaccedilatildeo A seleccedilatildeo dos clones contendo plasmiacutedeo com
o inserto desejado foi realizada atraveacutes da teacutecnica de palitagem ou de PCR de
colocircnia
38 Obtenccedilatildeo do cDNA de TcKAP7 atraveacutes de ensaio de RT-PCR
42
Com o intuito de verificar a posiccedilatildeo do mini-exon no transcrito de TcKAP7
realizamos o ensaio de RT-PCR para a obtenccedilatildeo do cDNA de TcKAP7
O protocolo utilizado foi baseado no manual teacutecnico da Promega (ΙmProm-ΙΙ
Reverse Transcription System) assim como os reagentes utilizados para essa
reaccedilatildeo Aproximadamente 10 μg de RNA foram incubados com o oligonucleotiacutedeo
KAP7R por 10 min a 70 degC e imediatamente transferidos para o gelo Agrave mistura foi
adicionada uma soluccedilatildeo de dNTPs (concentraccedilatildeo final de 05 mM para cada dNTP)
MgCl2 (120 μM) RNAse OUT (2 unidades) (Invitrogen) Transcriptase reversa
ImProm-II e respectivo tampatildeo A reaccedilatildeo foi incubada por 2 h a 42 degC As amostras
de cDNA foram purificadas por Microcon YM-30 (Millipore) conforme descriccedilatildeo do
fabricante e armazenadas a -20 degC Posteriormente foi realizada uma reaccedilatildeo de
PCR utilizando as seguintes condiccedilotildees 10 ng do cDNA de TcKAP7 de T cruzi 10
pmol do primer ME (5rsquo-AACGCTATTATTGATACAGTTTCTGTACTATATTG -3rsquo) e 10
pmol do primer KAP7R 200 μM de cada dNTP MgCl2 15 mM tampatildeo Taq DNA
polimerase 1x 25 U de Taq DNA polimerase (Invitrogen) A reaccedilatildeo de PCR foi
processada no termociclador modelo 9700 (Applied Biosystems EUA) com a
desnaturaccedilatildeo do material por 3 min a 94 degC seguida de 35 ciclos constando de
desnaturaccedilatildeo a 94 degC por 30 s hibridizaccedilatildeo dos primers a 55 degC por 30 s e extensatildeo
a 72 degC por 1 min O material amplificado foi purificado usando o kit Qiaquick PCR
Purification (Qiagen) e clonado diretamente no vetor pGEMreg-T Easy (Promega)
Bacteacuterias E coli cepa TOP10Frsquo foram transformadas com a ligaccedilatildeo e os plasmiacutedeos
recombinantes foram selecionados pela teacutecnica da palitagem ou de PCR de colocircnia
(itens 391 e 392) Apoacutes a minipreparaccedilatildeo (item 310) o material foi submetido ao
sequenciamento de DNA usando o serviccedilo de sequenciamento da empresa
Macrogen (Coreacuteia do Sul)
39 Seleccedilatildeo dos clones recombinantes
391 Teacutecnica de palitagem (toothpick)
As colocircnias foram coletadas com o auxiacutelio de palitos de dente (toothpick)
esteacutereis e transferidas para o fundo de tubos de micro-centriacutefuga e para a superfiacutecie
do meio LB solidificado (com o antibioacutetico de seleccedilatildeo do plasmiacutedeo) para a obtenccedilatildeo
de uma reacuteplica das colocircnias que foram analisadas (placa-matildee) A cada um dos
43
tubos foram acrescentados 15 μl do tampatildeo de lise Os tubos foram incubados em
banho-maria a 65 degC por 10 min As amostras entatildeo foram analisadas por
eletroforese em gel de agarose 1 usando o plasmiacutedeo sem inserto como controle
Posteriormente o gel foi corado com brometo de etiacutedeo (05 μgml) por
aproximadamente 20 min lavado com aacutegua e analisado sob luz ultravioleta para em
seguida ser fotografado no sistema de fotodocumentaccedilatildeo L-Pix (Locus
Biotecnologia Brasil)
392 Teacutecnica de PCR de colocircnia
Depois de selecionadas as colocircnias foram transferidas para tubos de PCR
contendo os reagentes da PCR e os primers que hibridizam com regiotildees que
flanqueiam o fragmento de DNA clonado em um volume total de 10 microl As amostras
foram incubadas a 94 degC por 3 min e submetidas a 35 ciclos de PCR com as
seguintes etapas 94 degC por 30 s 55 degC por 30 s e 72 degC por 1 min finalizando com
uma etapa de extensatildeo a 72 degC por 10 min Os produtos amplificados foram
analisados em gel de agarose 1 Posteriormente o gel foi corado com brometo de
etiacutedeo (05 microgml) por aproximadamente 20 min lavado com aacutegua e analisado sob
luz ultravioleta O gel foi fotografado no sistema de foto-documentaccedilatildeo L-Pix (Locus
Biotecnologia Brasil)
310 Preparaccedilatildeo de plasmiacutedeo em pequena escala (miniprep)
Os clones recombinantes foram cultivados em 3 ml de meio LB contendo o
antibioacutetico apropriado durante 18 h As culturas foram entatildeo centrifugadas a 12000
x g por 1min a temperatura ambiente e os plasmiacutedeos recombinantes purificados
com o sistema de minipreparaccedilatildeo de plasmiacutedeo (Miniprep Qiagen Kit) (QIAGEN) de
acordo com as recomendaccedilotildees do fabricante
311 Expressatildeo da proteiacutena TcKAP7 em E coli
Para expressar a proteiacutena recombinante TcKAP7 E coli cepa
BL21(DE3)STAR transformada com o plasmiacutedeo pET28a contendo o gene TcKPA7
(pET28a-TcKAP7) foi cultivada em meio LB contendo 25 μgml do antibioacutetico
44
kanamicina a 37 ordmC sob agitaccedilatildeo (preacute-inoacuteculo) Apoacutes 18 horas de crescimento uma
diluiccedilatildeo (110) foi realizada em novos tubos contendo meio LB-kanamicina e a
cultura foi incubada por 1 h a 37 ordmC sob agitaccedilatildeo constante Apoacutes este periacuteodo 05
mM IPTG (isopropil-1-tio-β-D-galactopiranosideo) foi adicionado agraves culturas A
incubaccedilatildeo prosseguiu por mais 3 h nas mesmas condiccedilotildees Como controle negativo
as ceacutelulas tambeacutem foram cultivadas nas mesmas condiccedilotildees poreacutem sem a adiccedilatildeo de
IPTG (cultura natildeo induzida) Aliacutequotas das culturas induzidas e natildeo induzidas com
IPTG foram processadas para anaacutelise em SDS-PAGE
312 Purificaccedilatildeo da proteiacutena recombinante TcKAP7
3121 Processamento da amostra
As bacteacuterias apoacutes a expressatildeo de TcKAP7 foram sedimentadas por
centrifugaccedilatildeo e ressuspendidas em tampatildeo de lise e lisadas utilizando o
microfluidificador modelo M-110L (Microfluidics EUA) Este meacutetodo divide a amostra
em dois fluxos e os conduz sob alta pressatildeo gerada por uma vaacutelvula pneumaacutetica
para uma cacircmara de interaccedilatildeo tambeacutem chamada de aacuterea de choque Esta cacircmara
eacute formada por um sistema de micro-canais dentro de um bloco de ceracircmica Dentro
da cacircmara ocorre cavitaccedilatildeo sonicaccedilatildeo e impacto dos dois fluxos em que a amostra
foi dividida levando a lise das ceacutelulas bacterianas (FIGURA 9) Este processo
provoca o aumento da temperatura e todo o sistema de tubos que conduz a amostra
necessita ser refrigerado com gelo e aacutegua a 4degC para prevenir a precipitaccedilatildeo de
proteiacutenas soluacuteveis
45
FIGURA 9 - REPRESENTACcedilAtildeO ESQUEMAacuteTICA DO MICROFLUIDIFICADOR LEGENDA A suspensatildeo de bacteacuterias eacute dividida em dois fluxos que se chocam sob alta pressatildeo dentro de micro-canais presentes na cacircmara de interaccedilatildeo da vaacutelvula homogeneizadora Melhores resultados satildeo obtidos aumentando o nuacutemero de ciclos de passagens Seta preenchida direccedilatildeo da amostra Seta pontilhada repetindo o ciclo de passagem FONTE Modificado de MAA amp HSU 1999
Apoacutes a lise o extrato soluacutevel foi obtido apoacutes centrifugaccedilatildeo a 30000 x g por
30 min a 4 degC
3122 Cromatografia de afinidade
Por ser expressa fusionada a uma cauda de seis histidinas a proteiacutena
TcKAP7 pode ser separada dos extratos celulares a partir da utilizaccedilatildeo de resina de
niacutequel da qual posteriormente a proteiacutena seraacute eluiacuteda
A purificaccedilatildeo da proteiacutena TcKPA7 presente no sobrenadante foi realizada
em sistema FPLC (Fast Performance Liquid Chromatography ndash GE Healthcare) com
coluna HiTrap Chelating de 1 mL (GE Healthcare) A coluna foi carregada com
soluccedilatildeo NiSO4 100 mM e equilibrada com tampatildeo A para cromatografia de afinidade
Durante a purificaccedilatildeo foi utilizado um gradiente de 0-100 de tampatildeo B para
cromatografia de afinidade As fraccedilotildees provenientes da cromatografia foram
analisadas atraveacutes de SDS-PAGE
Suspensatildeo de bacteacuterias
Ceacutelulas lisadasBomba de
alta pressatildeo
Micro-canais
Vaacutelvula homogeneizadora
46
3123 Cromatografia de troca iocircnica
Para eliminar contaminantes remanescentes da cromatografia de afinidade
a amostra contendo a proteiacutena de interesse foi submetida a uma segunda etapa
cromatograacutefica cromatografia de troca iocircnica utilizando-se a coluna HiTraptrade SP (GE
Healthcare) no sistema de FPLC (GE Healthcare)
Primeiramente a amostra foi diluiacuteda para reduccedilatildeo da concentraccedilatildeo salina e
a coluna foi lavada com 2 volumes de tampatildeo B para cromatografia de troca iocircnica e
depois com 2 volumes de tampatildeo A utilizado na cromatografia de afinidade O
gradiente de passagem do tampatildeo B foi de 0 a 100 e a proteiacutena TcKAP7 foi
obtida na fraccedilatildeo de material natildeo ligado agrave resina (Flow-through) (FT)
3124 Cromatografia de gel filtraccedilatildeo
Amostras da cromatografia de troca iocircnica que continham a proteiacutena de
interesse foram concentradas atraveacutes de filtraccedilatildeo A soluccedilatildeo foi colocada em filtro
Amicon Ultra MWCO 10000 (Milipore) e centrifugada a 4000 rpm a 4 ordmC O
experimento foi realizado em sistema FPLC (GE Healthcare) com a coluna
Superdex 200 HR 1030 (GE Healthcare) em tampatildeo HEPES 20 mM pH 74 e de
cloreto de soacutedio100 mM
313 Espalhamento Dinacircmico de Luz ndash DLS
O experimento foi realizado em equipamento DynaPro Molecular instrument
a 4 ordmC As amostras foram previamente centrifugadas por 5 minutos a 15000 rpm a
4 ordmC A coleta de dados foi realizada com intervalos de 2 segundos com 100
aquisiccedilotildees Para cada leitura utilizou-se 5 microl de amostra proteica
314 Espectroscopia de dicroiacutesmo circular (CD)
O espectro de CD foi coletado usando espectropolariacutemetro Jasco J-715
(Jasco Corporation Toacutekio Japatildeo) sendo a temperatura mantida a 20 degC atraveacutes de
um Peltie rType Control System PFD425S (JASCO) Todos os dados foram
coletados usando cubeta de quartzo de 1 mm de caminho oacuteptico
47
Mediu-se a elipticidade em graus na regiatildeo do UV distante no intervalo de
comprimento de onda de 260 nm a 200 nm com uma velocidade de 100 nmmin
sendo feitas no total 30 leituras com resposta de 1 segundo em varredura contiacutenua
Os valores obtidos em miligraus foram convertidos para elipticidade molar
por resiacuteduo ([θ]MRW) em miligrauscm2dmol-1 que eacute definida pela equaccedilatildeo (Adler et
al 1973)
Onde θobs eacute a elipsidade observada em graus MRW eacute o peso molecular
meacutedio dos resiacuteduos da proteiacutena d eacute o caminho oacuteptico da cubeta em centiacutemetros e c
eacute a concentraccedilatildeo da proteiacutena em mgmL O MRW eacute calculado dividindo-se o peso
molecular da proteiacutena pelo nuacutemero de resiacuteduos
315 Quantificaccedilatildeo e concentraccedilatildeo
As amostras obtidas a partir da purificaccedilatildeo tiveram a concentraccedilatildeo calculada
utillizando a absorbacircncia mensurada pelo aparelho NanoDrop (Thermo Fisher
Scientific) levando-se em consideraccedilatildeo o coeficiente de extinccedilatildeo e teoacuterico da
proteiacutena obtido a partir do ProtParam (httpusexpasyorgtoolsprotparamhtml) e o
peso molecular da proteiacutena que eacute de cerca de 28 kDa
Obtidas as concentraccedilotildees a amostra foi concentrada pelo meacutetodo de
filtraccedilatildeo utilizando o filtro Amiconreg Ultra Centrifugal Filter (Millipore) com poro de
10000 Da A amostra foi centrifugada ateacute a obtenccedilatildeo de uma concentraccedilatildeo final de
5 mgml para os ensaios de cristalizaccedilatildeo Uma aliacutequota da proteiacutena concentrada foi
utilizada para anaacutelise por SDS-PAGE
316 Ensaios de Cristalizaccedilatildeo
Os ensaios de cristalizaccedilatildeo foram realizados empregando-se a teacutecnica de
difusatildeo de vapor em gota sentada utilizando-se os equipamentos disponiacuteveis no
Laboratoacuterio Robotizado de Cristalizaccedilatildeo de Proteiacutenas LNBio Os ensaios foram
feitos em placas de 96 poccedilos e as gotas preparadas pelo robocirc Honeybee
utilizando-se os kits disponiacuteveis no laboratoacuterio Crystal Screen HT (Hampton
Research) JCSG+ Suite (Molecular Dimensions) PACT Suite (Molecular
cd
MRWobs
10][
48
Dimensions) Precipitant Synergy (Rigaku Reagents) SaltRx HT (Hampton
Research) Wizard IampII (Rigaku Reagents)
317 Espalhamento de raio-X a baixo acircngulo (SAXS)
Atraveacutes da teacutecnica de SAXS informaccedilotildees sobre a massa molecular das
partiacuteculas espalhadoras e do raio de giro (Rg) da proteiacutena de estudo satildeo obtidos a
partir dos dados coletados Por meio de programas computacionais como DAMMIN
(SVERGUN1999) e GASBOR (SVERGUN et al 2001) um modelo de baixa
resoluccedilatildeo da forma da proteiacutena pode ser obtido
Os dados de SAXS foram obtidos na linha de luz D02A ndash SAXS2 no
Laboratoacuterio Nacional de Luz Siacutencrotron (LNLS) Campinas-SP Brasil usando
comprimento de onda de 148 A e um detector bidimensional com arranjo CCD
(MARCCD USA) de 165 mm A distacircncia do detector para a amostra foi de 106804
mm e os dados na faixa de 002 nm-1 para 021 nm-1 foram coletados usando
proteiacutena pura nas concentraccedilotildees de 5 mgml em tampatildeo em 20 mM HEPES pH 74
e 100 mM de cloreto de soacutedioExposiccedilotildees de 300 e 600 s foram realizadas e os
dados do tampatildeo foram coletados antes e depois dos dados da amostra para fazer a
correccedilatildeo do solvente e normalizaccedilatildeo do espalhamento
Ajuste dos dados experimentais e avaliaccedilatildeo da funccedilatildeo p(R) foram realizados
utilizando o programa GNOM (SVERGUN 1992) O envelope a baixa resoluccedilatildeo de
TcKAP7 foi determinado usando modelagem abnitio implementada no programa
DAMMIN O modelo a baixa resoluccedilatildeo e o modelo da estrutura tridimensional foram
superpostas usando o programa SUPCOMB (KOZIN amp SVERGUN 2001)
318 Modelagem de TcKAP7
Um modelo da estrutura tridimensional de TcKAP7 foi construiacutedo Para a
construccedilatildeo do modelo foi utilizado o programa MODELLER (SALI amp BLUNDELL
1993) este programa eacute utilizado para a modelagem por homologia a estruturas
tridimensionais de proteiacutenas O programa automaticamente constroacutei um modelo
baseado na anaacutelise de um alinhamento de sequecircncias entre a proteiacutena para a qual
se deseja construir o modelo e uma proteiacutena relacionada cuja estrutura
tridimensional jaacute foi resolvida A qualidade do modelo pode ser avaliada por
49
exemplo atraveacutes de graacuteficos e tabelas que analisam restriccedilotildees quiacutemicas e fiacutesicas de
cada aacutetomo constituinte do modelo
319 Obtenccedilatildeo de antissoro policlonal contra TcKAP7
A proteiacutena TcKPA7 recombinante purificada foi inoculada em camundongos
da linhagem BALBc por via intraperitonial com 4 aplicaccedilotildees de aproximadamente
20-50 μg de antiacutegeno em intervalos de 15 dias seguida de obtenccedilatildeo do soro apoacutes 1
semana da uacuteltima inoculaccedilatildeo O antiacutegeno foi emulsificado em adjuvante completo de
Freund na primeira inoculaccedilatildeo e com adjuvante a base de hidroacutexido de alumiacutenio
(Alu-Gel Serva) nas inoculaccedilotildees posteriores
320 Anaacutelise da expressatildeo do gene TcKAP7 e de seu mutante por ensaio tipo
western blot
Este procedimento foi executado segundo o meacutetodo de Towbin e
colaboradores (1979) Aliacutequotas de extratos de T cruzi equivalentes a 1 x 107
ceacutelulas foram submetidos agrave SDS-PAGE Apoacutes a separaccedilatildeo eletroforeacutetica as
proteiacutenas foram transferidas para membrana de nitrocelulose (Hybond C Amersham
Biosciences) em tampatildeo de western por 2 h a 60 V ou 20 V por 16 h Apoacutes a
transferecircncia a membrana foi corada com Ponceau S e descorada suavemente com
aacutegua bidestilada para a identificaccedilatildeo das bandas do marcador de massa molecular
A membrana foi entatildeo incubada em soluccedilatildeo de bloqueio por 30 min sob agitaccedilatildeo
suave
Apoacutes o bloqueio a membrana foi incubada com os soros policlonais ou
anticorpos monoclonais em TBST-leite por aproximadamente 1 h a 37degC A
membrana foi lavada 5 vezes com TBST Em seguida a membrana foi incubada
com anticorpo secundaacuterio anti-IgG de camundongo conjugado com a enzima
peroxidase (Pierce ndash Thermo Scientific) por 1h na diluiccedilatildeo de 16000 em TBST-leite
a temperatura ambiente A membrana foi submetida a mais cinco lavagens com
TBST e a reaccedilatildeo era evidenciada utilizando substrato quimioluminescente (West
Pico Pierce ndash ThermoScientific) sobre a membrana a qual era exposta a um filme
para raios-X (Hyperfilm ECL GE)
50
321 Superexpressatildeo de TcKAP7
3211 Amplificaccedilatildeo e clonagem do gene TcKAP7 no vetor pNEO3xFlag para
superexpressatildeo da proteiacutena
O gene TcKAP7 foi clonado no vetor pNEO3xFLAG construiacutedo no nosso
laboratoacuterio a partir do vetor pTcGW-ProtCcarboxi (BATISTA et al 2010) que utiliza
o sistema Gateway de clonagem (Invitrogen) Os vetores foram construiacutedos
utilizando-se como base o pBluescript II (Stratagene San Diego USA) onde foram
inseridas trecircs sequencias que codificam para regiotildees intergecircnicas (IR) de T cruzi A
primeira TcUIR eacute a regiatildeo intergecircnica do locus de ubiquitinacalmodulina de T
cruzi (BATISTA et al 2010) As outras duas regiotildees intergecircnicas ITR1 e ITR2 foram
selecionadas a partir de genes de copia uacutenica no genoma e que possuem um niacutevel
de expressatildeo constitutivo nos estaacutegios epimastigota e tripomastigota metaciclicos
avaliados por dados de proteocircmica e RNAseq (Comunicaccedilatildeo pessoal Michel
Batista) Aleacutem disso esse vetor confere agrave regiatildeo C-terminal da proteiacutena
recombinante resultante da clonagem neste vetor trecircs etiquetas FLAG (sequecircncia
DYKDDDDK) em tandem (FIGURA 10)
FIGURA 10 VETOR PARA EXPRESSAtildeO EM T CRUZI P3XFLAG
LEGENDA PR ndash PROMOTOR RIBOSOMAL TCUIR ITR1 E ITR2 - REGIOtildeES INTERGENICAS ATTR1 E ATTR2 ndash REGIOtildeES PARA RECOMBINACcedilAtildeO CMreg - RESISTEcircNCIA A CLORANFENICOL CCDB ndash GENE PARA SELECcedilAtildeO NEGATIVA DURANTE A CLONAGEM 3XFLAG ndash TREcircS ETIQUETAS DE FLAG (DYKDDDDK) NEOMICINA ndash GENE DE RESISTEcircNCIA A NEOMICINA
O gene TcKAP7 foi amplificado utilizando os primers especiacuteficos
KAP7GtwFor (5rsquo-
GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTGCCCGCGAAGTATTCAGCAGCCC)
e KAP7GtwRev (5rsquo-
GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCGTGGTACATGGCGTACGGGTTG)
PR TcUIR Att R1 Cmreg ccdB Att R2 3x Flag ITR1 Neomicina ITR2
51
os quais possuem os siacutetios attB indicados em negrito As condiccedilotildees desta reaccedilatildeo
de PCR foram as seguintes 100 ng de DNA genocircmico de T cruzi 10 pmol de cada
primer 200 μM de cada dNTP MgSO4 2 mM tampatildeo Taq DNA polimerase High
Fidelity 1x 1U de Platinum Taq DNA polimerase high fidelity (Invitrogen) A reaccedilatildeo
de PCR foi processada no termociclador modelo 9700 (AppliedBiosystems EUA)
com a desnaturaccedilatildeo do material por 5 min a 94 degC seguida de 35 ciclos constando
de desnaturaccedilatildeo a 94 degC por 30 s hibridizaccedilatildeo dos primers a 58 degC por 30 s e
extensatildeo a 72 degC por 15 min
O gene amplificado foi clonado no vetor de entrada pDONRtrade221
(Invitrogen) A reaccedilatildeo foi feita com 150 ng dos produtos de PCR contendo os siacutetios
attB 150 ng do plasmiacutedeo pDONRtrade221 1 μL de BP ClonaseTM enzyme mix e TE
para um volume final de 10 μL e com incubaccedilatildeo a 25 degC por 16 h Foi entatildeo
adicionado 1 microL de proteinase K (2 mgmL) com incubaccedilatildeo por 10 min a 37 degC Os
clones em pDONRtrade221 foram transformados em ceacutelulas caacutelcio-competentes E coli
DH5α conforme protocolo de transformaccedilatildeo de ceacutelulas caacutelcio-competentes Apoacutes
transformaccedilatildeo a cultura foi semeada em placa de LBKan (kanamicina 25 microgmL) e
incubada a 37 degC durante 16 h
Para verificar a presenccedila de clones com os insertos de interesse foi feita a
teacutecnica da palitagem As colocircnias selecionadas foram inoculadas em 5 mL de meio
LBKan e incubadas por 16 h a 37 degC com agitaccedilatildeo (190 rpm) A purificaccedilatildeo dos
plasmiacutedeos foi realizada com o kit QIAprepreg Spin Miniprep (Qiagen) conforme
orientaccedilotildees do fabricante
Apoacutes esta etapa foi necessaacuterio transferir os insertos para o vetor de destino
pNEO3xFlag A troca de insertos entre os vetores de entrada e destino denominada
de reaccedilatildeo LR foi realizada conforme orientaccedilotildees do fabricante (Gateway LR clonase
enzyme mix) e ceacutelulas caacutelcio-competentes foram transformadas com os produtos
das recombinaccedilotildees conforme descrito anteriormente semeadas em placas de
LBAmp e incubadas a 37 degC durante 16 h
A verificaccedilatildeo de clones positivos foi realizada atraveacutes de PCR de colocircnias
As colocircnias selecionadas foram inoculadas em 5 mL de meio LB contendo ampicilina
(100 μgmL) e incubada a 37deg C por 16 h sob agitaccedilatildeo (200 rpm)O plasmiacutedeo
contendo o gene TcKAP7 foi denominado de pNEO_KAP7_3xFLAG
52
3212 Transfecccedilatildeo por eletroporaccedilatildeo
A transfecccedilatildeo das formas epimastigotas de T cruzi foi feita pela teacutecnica de
eletroporaccedilatildeo utilizando o equipamento genepulserreg apparatus (Bio-Rad) e cubetas
esteacutereis de eletroporaccedilatildeo gene pulsermicro pulserreg 02 cm (Bio-Rad) Formas
epimastigotas de T cruzi foram cultivadas em meio LIT ateacute uma densidade celular
de 3 x 107 ceacutelulasml Um volume de cultura correspondendo a 1 x 109 parasitas foi
centrifugado (4000 x g 4 degC) O sobrenadante foi descartado e as ceacutelulas foram
ressuspendidas em tampatildeo de eletroporaccedilatildeo esteacuteril e submetidas a centrifugaccedilatildeo
nas condiccedilotildees acima O sedimento celular foi ressuspendido em 2 ml de tampatildeo de
eletroporaccedilatildeo Em cubetas de eletroporaccedilatildeo previamente resfriadas a 4 degC foram
misturados 400 μL (2 x 108 ceacutelulas) da suspensatildeo dos parasitas e 50 μL (20 microg) do
plasmiacutedeo para superexpressatildeo (pNEO_KAP7_3XFLAG) Em paralelo parasitas
foram submetidos agraves mesmas condiccedilotildees mas na ausecircncia de DNA (controle
negativo da transfecccedilatildeo)
As cubetas foram entatildeo mantidas em gelo por 10 min Em seguida os
parasitas foram transfectados com dois pulsos sequenciais de 500 μF e 450 volts
Apoacutes o esse procedimento as cubetas foram mantidas em gelo por mais 5 min A
suspensatildeo de parasitas transfectados foi entatildeo inoculada em 10 mL de meio LIT
suplementado com 10000 U de penicilina e estreptomicina a 10 μgmL
3213 Seleccedilatildeo dos transfectantes
O gene para a enzima neomicina fosfotransferase foi utilizado como
marcador de seleccedilatildeo dos parasitas carregando o plasmiacutedeo para a superexpressatildeo
pNEO_KAP7_3XFLAG Para tanto o antibioacutetico G418 foi adicionado agraves culturas
apoacutes 24 h da transfecccedilatildeo na concentraccedilatildeo final de 500 μgmL Entre 3 e 4 dias apoacutes
a transfecccedilatildeo foi realizada a primeira passagem (14) A partir desse ponto foram
feitas passagens semanais na proporccedilatildeo de 110 ateacute que natildeo fosse observado
crescimento nas duas uacuteltimas passagens da cultura do controle negativo da
transfecccedilatildeo
A expressatildeo da proteiacutena KAP7-FLAG foi analisada atraveacutes de ensaios de
western blot e imunofluorescecircncia
53
322 Deleccedilatildeo do gene TcKAP7 por nocaute gecircnico
3221 Amplificaccedilatildeo e clonagem das regiotildees a montante e a jusante do gene
TcKAP7
As regiotildees a montante (upstream) e a jusante (downstream) do gene TcKAP7
respectivamente denominadas de UPSKAP7 (521 pb) e DOWNKAP7 (500 pb)
foram amplificadas por PCR usando os primers descritos nas TABELAS 1 E 2 A
regiatildeo denominada DOWNKAP7 conteacutem ainda 139 pb do final da regiatildeo codante de
TcKAP7
QUADRO 1 - RELACcedilAtildeO DOS PRIMERS UTILIZADOS PARA A CLONAGEM DA
REGIAtildeO UPSTREAM DE TcKAP7 NO VETOR pNEO1
UPSKAP7F GGGGTCGACCGTTGCTGGTTTTTCTTTTGGTGT
UPSKAP7R GGGAAGCTTGCTTCAAAACGTCTATGCGGGC
Os siacutetios das enzimas de restriccedilatildeo SalI (GTCGAC) e HindIII (AAGCTT) adicionados aos primers estatildeo em negrito
QUADRO 2 - RELACcedilAtildeO DOS PRIMERS UTILIZADOS PARA A CLONAGEM DA
REGIAtildeO DOWNSTREAM DE TcKAP7 NO VETOR pNEO1
DOWNKAP7F GGGGAATTCGCCTCATATGACGCATCTCCCA
DOWNKAP7R GGGGGATCCTGTTGGCGCTGTCAAGGAAGTAAG
Os siacutetios das enzimas de restriccedilatildeo EcoRI (GAATTC) e BamHI (GGATCC) adicionados aos primers estatildeo em negrito
As reaccedilotildees de PCR foram realizadas nas seguintes condiccedilotildees 100 ng de
DNA total de T cruzi Dm28c 10 pmol dos oligonucleotiacutedeos F e R 200 μM de cada
dNTP MgCl2 15 mM tampatildeo Taq DNA polimerase 1x 25 unidades de Taq DNA
polimerase (Invitrogen EUA) A reaccedilatildeo de PCR foi processada no termociclador
modelo 9700 (Applied Biosystems EUA) nas seguintes condiccedilotildees Desnaturaccedilatildeo do
54
material por 4 min a 94 degC seguida de 35 ciclos de desnaturaccedilatildeo a 92 degC por 30 s
hibridizaccedilatildeo dos oligonucleotiacutedeos a 56 degC por 30 s e extensatildeo a 72 degC por 1 min O
material amplificado foi purificado usando o Qiaquick PCR Purification (Qiagen) O
DNA purificado foi digerido com enzimas de restriccedilatildeo apropriadas para a clonagem
dos fragmentos nos vetores pNEO1 O plasmiacutedeo resultante da clonagem das
regiotildees UPSKAP7 e DOWNKAP7 foi denominado de pNEO1kap7 (Figura 11A)
Uma vez que o genoma do T cruzi eacute diploide construiacutemos um segundo
plasmiacutedeo para o nocaute do segundo alelo do gene TcKAP7 tendo como marca de
seleccedilatildeo o gene que codifica resistecircncia a higromicina B Esse plasmiacutedeo foi
construiacutedo usando como molde o plasmiacutedeo pNEO1kap7 O plasmiacutedeo pNEO1kap7
foi digerido com HindIII para remoccedilatildeo do gene neo e uma pequena porccedilatildeo da regiatildeo
DOWNSTREAM (220 pb) O plasmiacutedeo linearizado foi purificado do gel de agarose
usando o kit Qiaquick PCR Purification (Qiagen) e ligado com o gene higro O gene
higro foi amplificado usando os primers HIGROF
(GGGGGAAGCTTATGAAAAAGCCTGAACTCACCGCGAC) e HIGROR
(GGGAAGCTTCTATTCCTTTGCCCTCGGACGAGTGCTG) ambos contendo na
extremidade 5rsquo o siacutetio para a enzima de restriccedilatildeo HindIII (em negrito) O plasmiacutedeo
resultante da ligaccedilatildeo foi denominado de pHIGRO1kap7 (FIGURA 11B)
55
FIGURA 11 ESQUEMA DA CONSTRUCcedilAtildeO DOS VETORES UTILIZADOS PARA O NOCAUTE DO GENE TcKAP7 LEGENDA Nesta figura eacute observada a inserccedilatildeo das sequecircncias flanqueadoras do gene TcKAP7 juntamente com os respectivos siacutetios para cada enzima de restriccedilatildeo nos vetores de clonagem pNEO1 e pHIGRO1
3222 Amplificaccedilatildeo dos cassetes UPS-NEO-DOWN e UPS-HIGRO-DOWN para
transfecccedilatildeo de T cruzi
Os dois plasmiacutedeos recombinantes foram purificados pelo meacutetodo da lise
alcalina utilizando o kit de minipreparaccedilatildeo de plasmiacutedeos (Qiagen) As minipreps
foram utilizadas para a amplificaccedilatildeo da regiatildeo UPS-NEO-DOWN (cassete NEO) e da
regiatildeo UPS-HIGRO-DOWN (cassete HYG) por PCR usando os primers UPSKAP7F
e DOWNKAP7R As reaccedilotildees de PCR foram realizadas nas seguintes condiccedilotildees 20
ng do plasmiacutedeo pNEO1kap7 ou pHIGRO1kap7 10 pmol dos primers UPSKAP7F e
DOWNKAP7R 200 μM de cada dNTP MgCl2 15 mM tampatildeo Taq DNA polimerase
1x 25 unidades de Taq DNA polimerase (Invitrogen EUA) A reaccedilatildeo de PCR foi
processada no termociclador modelo 9700 (AppliedBiosystems EUA) nas seguintes
condiccedilotildees Desnaturaccedilatildeo do material por 4 min a 94 degC seguida de 35 ciclos de
desnaturaccedilatildeo a 92 degC por 30 s hibridizaccedilatildeo dos oligonucleotiacutedeos a 56 degC por 30 s e
56
extensatildeo a 68 degC por 2 min O material amplificado foi submetido agrave eletroforese em
gel preparativo de agarose 1 O gel foi corado com brometo de etiacutedeo (1 μgml) e a
banda correspondente a cada cassete foi removida do gel com auxiacutelio de uma
lacircmina de bisturi O DNA foi purificado por eletroeluiccedilatildeo dentro de saco de diaacutelise
nas condiccedilotildees de 100 V por 1 hora em tampatildeo TBE Para obter massa de DNA
suficiente para a transfecccedilatildeo (20 μg) foram feitas 10 reaccedilotildees de PCR com 100 μl
cada uma
3223 Transfecccedilatildeo do T cruzi com o cassete UPS-NEO-DOWN
Formas epimastigotas de T cruzi foram cultivadas em meio LIT ateacute 2 x 107
ceacutelulasml Os parasitas (1 x 108 ceacutelulas) foram coletados por centrifugaccedilatildeo a 6000
x g por 10 min a 4 degC O sedimento celular foi lavado com PBS esteacuteril e
ressuspendido em 1 ml de soluccedilatildeo de eletroporaccedilatildeo Volumes correspondentes a
04 ml da suspensatildeo de ceacutelulas foram transferidos para cubetas de eletroporaccedilatildeo
esteacutereis (02 cm de gap) (BioRad) e preacute-resfriadas Em uma delas foram adicionados
de 20 μg do fragmento representando o cassete NEO A outra cubeta contendo
apenas a suspensatildeo de parasitas foi usada como controle Apoacutes 10 minutos no gelo
as amostras contidas nas cubetas foram submetidas a 2 pulsos de 450 volts 500
microF utilizando o eletroporadorGenePulserreg IIApparatus (Bio-Rad) As amostras
foram incubadas novamente por 5 a 10 minutos no gelo em seguida foram
transferidas para garrafas de cultura de 25 cm2 contendo 10 ml de meio LIT
(suplementado com 10000 U de penicilina e estreptomicina a 10 mgml) As culturas
foram entatildeo incubadas a 28 degC Apoacutes 24 horas de incubaccedilatildeo adicionou-se o
antibioacutetico G418 na concentraccedilatildeo de 500 μgml As culturas foram mantidas por
sucessivas passagens (diluiccedilatildeo de 110) em meio LIT suplementado com G418 a
cada 8-10 dias ateacute a ausecircncia de proliferaccedilatildeo celular na cultura controle Os
parasitas nos quais TcKAP7 foi substituiacutedo pelo gene neo foram denominados deT
cruzi(kap7kap7neo) e foram testados para a correta inserccedilatildeo do gene neo no locus
genocircmico de TcKAP7
57
3224 Extraccedilatildeo de DNA dos transfectantes
T cruzi transfectado com o cassete NEO (T cruzi(kap7kap7neo) foi cultivado
em meio LIT suplementado com G418 (500 μgml) ateacute uma densidade de 3 x 107
ceacutelulasml Os parasitas foram coletados por centrifugaccedilatildeo por 1 min a 6000 x g e
lavados com PBS Em seguida os parasitas foram lisados gentilmente em 350 μl de
tampatildeo TELT conforme descrito no item 34
3225 Anaacutelise por PCR do DNA dos parasitas transfectados com o cassete
UPS-NEO-DOWN
As reaccedilotildees de PCR foram realizadas utilizando primers externos EXTF
(CCCGCTACGACTGCCCTCCACGCGGAAGGGAA) e EXTR
(AAGTAAACGGGAGAAGCAACACGATGGGAGGCTC) que natildeo estatildeo presentes na
construccedilatildeo do cassete UPS-NEO-DOWN combinados com os primers NEOF
(GGGGAAGCTTATGATTGAACAAGATGGATTGCACGCAG) e NEOR
(GGGGGAATTCAGAAGAACTCGTCAAGAAGGCGATAGAA)
As condiccedilotildees das reaccedilotildees foram as seguintes 100 ng do DNA total de T
cruzi Dm28c tipo selvagem (T cruzi(kap7kap7) ou tipo selvagem) ou do DNA da
populaccedilatildeo T cruzi(kap7kap7neo) (mutante simples nocaute) 10 pmol dos primers EXTF
+ NEOR e NEOF + EXTR 200 μM de cada dNTP MgCl2 15 mM tampatildeo Taq DNA
polimerase 1x 25 unidades de Taq DNA polimerase (Invitrogen EUA) A reaccedilatildeo de
PCR foi processada no termociclador modelo 9700 (AppliedBiosystems EUA) nas
seguintes condiccedilotildees Desnaturaccedilatildeo do material por 4 min a 94 degC seguida de 35
ciclos de desnaturaccedilatildeo a 92 degC por 30 s hibridizaccedilatildeo dos oligonucleotiacutedeos a 55 degC
por 30 s e extensatildeo a 72 degC por 2 min
3226 Transfecccedilatildeo do T cruzi com o cassete UPS-HIGRO-DOWN
Formas epimastigotas da populaccedilatildeo mutante de T cruzi (kap7kap7neo) foram
cultivadas em meio LIT suplementado com G418 (500 μgml) ateacute a densidade de 2 x
107 ceacutelulasml Os parasitas (1 x 108 ceacutelulas) foram coletados por centrifugaccedilatildeo a
6000 x g por 10 min a 4 degC e submetidos ao processo de eletroporaccedilatildeo como
descrito no item 3202 Para a transfecccedilatildeo foram usados 20 μg do fragmento
58
representando o cassete UPS-HIGRO-DOWN As culturas (transfectada e controle)
foram entatildeo incubadas a 28 degC em LIT suplementado de G418 Apoacutes 24 horas de
incubaccedilatildeo foi adicionado o antibioacutetico higromicina ao meio de cultura na
concentraccedilatildeo de 500 μgml As culturas foram mantidas por sucessivas passagens
(diluiccedilatildeo de 110) em meio LIT suplementado com G418 e higromicina a cada 8-10
dias ateacute a ausecircncia de proliferaccedilatildeo celular na cultura controle Mutantes nos quais
os dois alelos de TcKAP7 foram removidos e substituiacutedos pelos genes NEO e
HIGRO foram denominados com genoacutetipo T cruzi (kap7neokap7higro)
3227 Anaacutelise por PCR do DNA dos parasitas transfectados com o cassete
UPS-HIGRO-DOWN
As reaccedilotildees de PCR foram realizadas utilizando primers externos EXTF e
EXTR (item 3225) combinados com os primers HIGROF e HIGROR (item 3221)
As reaccedilotildees de PCR foram realizadas nas seguintes condiccedilotildees 100 ng do
DNA total de T cruzi(kap7kap7) ou do DNA do T cruzi(kap7neokap7higro) 10 pmol dos
primers EXTF + HIGROR e HIGROF + EXTR 200 μM de cada dNTP MgCl2 15
mM tampatildeo Taq DNA polimerase 1x 25 unidades de Taq DNA polimerase
(Invitrogen EUA) A reaccedilatildeo de PCR foi processada no termociclador modelo 9700
(Applied Biosystems EUA) nas seguintes condiccedilotildees Desnaturaccedilatildeo do material por
4 min a 94 degC seguida de 35 ciclos de desnaturaccedilatildeo a 92 degC por 30 s hibridizaccedilatildeo
dos oligonucleotiacutedeos a 55 degC por 30 s e extensatildeo a 72 degC por 2 min
3228 Anaacutelise da organizaccedilatildeo do gene TcKAP7 e da eficiecircncia de seu nocaute
atraveacutes de ensaio do tipo Southern blot
O DNA genocircmico (5 μg) de T cruzikap7kap7 e T cruzikap7neokap7higro foi
submetido a digestatildeo com a enzima de restriccedilatildeo HindIII de acordo com as
especificaccedilotildees do fornecedor Apoacutes 3 horas o DNA digerido foi submetido agrave
eletroforese em gel de agarose 08 em tampatildeo TBE a 100 V O gel foi corado por
brometo de etiacutedio (05 μgmL) e fotografado sob a luz ultravioleta (310 nm)
Posteriormente o gel foi tratado com soluccedilotildees de depurinaccedilatildeo por 15 minutos de
desnaturaccedilatildeo por 30 minutos (2 vezes) e soluccedilatildeo de neutralizaccedilatildeo por 30 minutos (2
vezes) O DNA foi transferido para uma membrana de nylon (Hybond N
59
AmershamBiosciences) por capilaridade (SAMBROOK et al 1989) utilizando-se de
uma ldquoponterdquo de papel 3 MM embebido em SSC 20X Apoacutes a transferecircncia o DNA foi
fixado agrave membrana por exposiccedilatildeo agrave luz ultravioleta com uma dose de 120 mJcm2
usando o aparelho Spectrolinker (Spectronicscorp USA) A membrana contendo o
DNA de T cruzi foi preacute-hibridizada em soluccedilatildeo de hibridizaccedilatildeo de DNA por 1 hora a
65 ordmC seguido da adiccedilatildeo da sonda marcada radioativamente com α-[P32
]-dCTP (10
μCiμl 3000 Cimmol) (Amersham Biosciences) preparada segundo meacutetodo de nick
translation descrito por Rigbyet al (1977) utilizando-se o meacutetodo de iniciaccedilatildeo por
random primers (Megaprimer DNA labeling kit ndash GE) conforme recomendaccedilotildees do
fabricante
Foram utilizadas 3 sondas satildeo elas fragmento do gene TcKAP7
correspondendo a regiatildeo compreendida entre os nucleotiacutedeos 1 e 560 o gene neo e
o gene higro Apoacutes a marcaccedilatildeo as sondas foram purificadas em colunas de
Sephadex G-50 (ProbeQuant ndash Amersham Biosciences) e adicionadas ao tampatildeo de
hibridizaccedilatildeo na concentraccedilatildeo de 5 x 106
cpmml As membranas foram incubadas
por 16 horas a 65 C e em seguida lavadas nesta temperatura duas vezes por 30
minutos com soluccedilotildees de alta meacutedia e baixa estringecircncia As membranas foram
expostas a filme de raio-X (Hyperfilmreg Amersham Biosciences) na presenccedila de tela
intensificadora (Dupont Cronex Lightining Plus) por tempo que varia entre 1 a 3 dias
a ndash70 C
323 Localizaccedilatildeo celular da proteiacutena TcKAP7 atraveacutes de ensaio de
imunofluorescecircncia
Formas epimastigotas de T cruzi foram coletadas por centrifugaccedilatildeo (4000 times
g 3 a 10 ordmC) lavadas duas vezes em PBS e depositadas sobre lacircminas de vidro
previamente tratadas com poli-L-lisina 001 diluiacuteda em PBS Os parasitas foram
entatildeo fixados com paraformaldeiacutedo 4 em PBS permeabilizados com Triton X-100
01 em PBS por 2 min agrave temperatura ambiente e incubados a 4ordmC durante 16 h
em soluccedilatildeo de bloqueio para imunofluorescecircncia (PBS 1X + BSA 1 ) Apoacutes o
bloqueio os parasitas foram incubados agrave temperatura ambiente por 1 h com o
anticorpo monoclonal anti-FLAG em uma diluiccedilatildeo de 11000 em soluccedilatildeo de bloqueio
para imunofluorescecircncia Depois disso as lacircminas foram submetidas a 5 lavagens
60
de 5 min cada em PBS Em seguida os parasitas foram incubados agrave temperatura
ambiente por 1 hora com o anticorpo secundaacuterio anti-IgG de camundongo conjugado
ao fluoroacuteforo Alexa Fluacuteor 488 (Invitrogen) diluiacutedo 1600 em soluccedilatildeo de bloqueio As
lacircminas foram lavadas 5 vezes com PBS e posteriormente incubadas com o corante
Hoechst 33342 (Invitrogen) a 2 μgμL em PBS por 5 min Apoacutes cinco lavagens com
PBS as lacircminas foram montadas com ProLong Gold Antifade (Invitrogen) sobre uma
lacircmina de microscopia oacutetica O material foi observado nos microscoacutepios Leica SP5 e
DMI6000
324 Anaacutelise da ultraestrutura do cinetoplasto do mutante de T cruzi para
TcKAP7 por microscopia eletrocircnica de transmissatildeo
Os parasitas foram coletados lavados com PBS e fixados em soluccedilatildeo
contendo 25 de glutaraldeiacutedo 4 de paraformaldeiacutedo e tampatildeo cacodilato 01 M
Em seguida os parasitas foram fixados por 1 h em soluccedilatildeo de 1 de tetroacutexido de
Oacutesmio e 08 de ferricianeto de potaacutessio diluiacutedos em tampatildeo cacodilato 01 M As
ceacutelulas foram entatildeo desidratadas em soluccedilatildeo contendo concentraccedilotildees crescentes
de acetona e incluiacutedas em Epon Apoacutes a obtenccedilatildeo de cortes ultrafinos dos parasitas
os mesmos foram contrastados em acetato de uranila e citrato de Chumbo antes de
serem observados e fotografados no microscoacutepio eletrocircnico de transmissatildeo Zeiss
900
325 Coloraccedilatildeo dos parasitas transfectados
A coloraccedilatildeo dos parasitas foi realizada pelo meacutetodo panoacutetico raacutepido
(Laborclin Pinhais Paranaacute Brasil) modificado
Formas epimastigotas do mutante de T cruzi para TcKAP7 foram cultivadas
como descrito no item 321 Os parasitas foram coletados por centrifugaccedilatildeo de 1
min a 4000 x g e ressuspensos em PBS Desta suspensatildeo uma gota foi retirada e
depositada sobre lacircminas previamente limpas Quando secas as lacircminas foram
imersas individualmente na Soluccedilatildeo 1 (Fixador) Soluccedilatildeo 2 (Revelador) e Soluccedilatildeo 3
(Corante) em cada uma por 30 s Apoacutes este processo as lacircminas foram lavadas em
aacutegua corrente secas agrave temperatura ambiente e cobertas com Permount e lamiacutenula
Os parasitas foram visualizados em microscoacutepio Nikon E600
61
326 Infecccedilatildeo de ceacutelulas Vero com o mutante de T cruzi para TcKAP7
Ceacutelulas Vero (ATCCreg Nuacutemero CRL-2783trade) foram cultivadas em garrafas
de 150 cm2 contendo meio RPMI suplementado com 5 de soro fetal bovino
(GIBCO) penicilina 100 UIml streptomicina 10 microgml e glutamina 2 mM a 37 o C
com 5 de CO2 Ao atingirem a confluecircncia (80 a 100) realizou-se a passagem
atraveacutes de tripsinizaccedilatildeo e foi feito um inoacuteculo de 1 x 107 ceacutelulas para cada nova
garrafa de 150 cm2 Apoacutes 24 horas estas ceacutelulas (50 ndash 70 de confluecircncia) foram
infectadas com formas metaciacuteclicas obtidas da diferenciaccedilatildeo do mutante de T cruzi
para TcKAP7 em microplacas de 24 poccedilos contendo lamiacutenulas de vidro com
diacircmetro de 13 mm A cada poccedilo foram adicionadas 2 x 104 ceacutelulas Vero Apoacutes 24
horas de cultivo as ceacutelulas foram infectadas com tripomastigotas metaciacuteclicos
(obtidos do sobrenadante das culturas de T cruzi diferenciados em meio TAU3AAG
sem purificaccedilatildeo na coluna de DEAE celulose) A infecccedilatildeo das ceacutelulas Vero foi
acompanhada diariamente por microscopia de contraste de fase
327 Anaacutelise da funccedilatildeo do gene TbKAP7 de Trypanosoma brucei atraveacutes de
ensaios de RNA de interferecircncia
Com o intuito de complementar os estudos da funccedilatildeo do gene TcKAP7 foi
utilizada a teacutecnica de RNA de interferecircncia O uso dessa metodologia compreende
uma abordagem alternativa agrave anaacutelise da funccedilatildeo gecircnica para genes ortoacutelogos deT
brucei por anaacutelises de RNAi uma vez que a maquinaria de RNAi em T cruzi eacute
inexistente (DA ROCHA et al 2003) Os resultados podem gerar evidecircncias que
estejam relacionadas agrave funcionalidade dos genes em T cruzi Esta abordagem foi
utilizada neste trabalho para auxiliar no estudo da funccedilatildeo do gene TcKAP7 a partir
do ortoacutelogo em T brucei ainda natildeo caracterizadoTbKAP7 Os ensaios de RNAi
foram realizados em T brucei cepa 29-13 (WIRTZ et al 1999) com sistema induzido
por tetraciclina utilizando o vetor p2T7-177 ilustrado na figura 12 Este vetor quando
transfectado no parasita integra-se aos minicromossomos do T brucei regiatildeo de
repeticcedilotildees 177 (FOLDYNOVA-TRANTIRKOVA et al 2005)
62
FIGURA 12 MAPA DO VETOR p2T7-177 UTILIZADO PARA ENSAIOS DE RNAi LEGENDA T7 prom Promotor de T7 RNA Polimerase induzido por tetraciclina T7 term Terminador de transcriccedilatildeo 177 Sequumlecircncia repetitiva de 177 pares de bases para alvo de inserccedilatildeo em minicromossomos BLEO gene de resistecircncia agrave fleomicina GFP Proteiacutena Green FluorescentProtein os siacutetios para as enzimas de restriccedilatildeo estatildeo indicados AmpR gene de resistecircncia agrave ampicilina (FONTE WICKSTEAD et al 2002)
As regiotildees do mRNA para alvos nos ensaios de RNAi foram escolhidas com
o auxiacutelio da ferramenta RNAit da base de dados do Trypanofan - Genocircmica
funcional de Tbrucei (httptrypanofanpathcamacuktrypanofanmain)
(REDMOND et al 2003) Essas regiotildees foram amplificadas por PCR usando como
molde o DNA total de T brucei (100 ngreaccedilatildeo) 10 pmol dos primers listados na
tabela 3 200 mM de cada dNTP 15 mM de MgCl2 tampatildeo Taq DNA polimerase 1x
63
(Invitrogen) e 25 unidades de Taq DNA polimerase (Invitrogen) A reaccedilatildeo foi
aquecida por 4 min a 94 degC e entatildeo submetida a 35 ciclos de desnaturaccedilatildeo a 94 degC
por 30 s anelamento a 55 degC por 30 s e extensatildeo a 72 degC por 1 min Os primers
utilizados apresentam siacutetio para as enzimas de restriccedilatildeo BamHI (F) ou HindIII (R)
Os produtos de PCR foram purificados por extraccedilatildeo com fenol-clorofoacutermio e
digeridos com as referentes enzimas
QUADRO 3 - RELACcedilAtildeO DOS PRIMERS UTILIZADOS PARA A AMPLIFICACcedilAtildeO DO
GENE TbKAP7
KAP7RNAiF
AAAGGATCCCTAACCTAACCTGCAGGGTCTCTCG
KAP7RNAiR
GCGAAGCTTTTGTTCCTTTACAAACGCCC
Os siacutetios das enzimas de restriccedilatildeo BamHI (GGATCC) e HindIII (AAGCTT) adicionados aos primers estatildeo em negrito
As clonagens foram confirmadas por PCR de colocircnia e os plasmiacutedeos foram
purificados pelo kit QIAprep Spin Miniprep (Qiagen) Apoacutes purificaccedilatildeo 10 μg dos
plasmiacutedeos foram linearizados com a enzima NotI conforme descrito pelo fabricante
O DNA foi precipitado e ressuspenso em 50 μl de meio de eletroporaccedilatildeo ZPFM para
transfecccedilatildeo do T brucei
Para cada transfecccedilatildeo foi utilizado um total de 4 x 107parasitas em fase logariacutetmica
de crescimento Os parasitas foram obtidos por centrifugaccedilatildeo (5000 x g por 10 min
a 4 degC) lavados em meio ZPFM e ressuspensos em 500 μl do mesmo meio A
transfecccedilatildeo foi feita em cubetas de eletroporaccedilatildeo (4 mm) usando o eletroporador da
BioRad (GenePulser II Electroporator) As condiccedilotildees utilizadas foram dois pulsos de
1600 V e 25 microF Os parasitas foram entatildeo transferidos para garrafas contendo meio
SDM-79 SFB 10 higromicina 50 μgml e G418 15 μgml A seleccedilatildeo dos parasitas
transfectados foi atraveacutes da adiccedilatildeo de 5μgmL de fleomicina resistecircncia conferida
pelo vetor p2T7-177 apoacutes 24 horas de cultivo O tempo para seleccedilatildeo foi entre duas
e trecircs semanas
64
3271 Induccedilatildeo do RNA dupla fita
A induccedilatildeo da expressatildeo de RNA dupla fita referente agrave porccedilatildeo do gene
TbKAP7 clonado no plasmiacutedeo p2T7-177 deu-se pela adiccedilatildeo de tetraciclina 2 μgml
a uma cultura transfectada de T brucei em fase de crescimento exponencial (~2 x
106 parasitasml) Nos dias que se seguiram 1μgml de tetraciclina foi adicionada
diariamente agraves culturas A observaccedilatildeo dos efeitos na curva de crescimento causada
por RNAi em T brucei foi realizada ao longo de uma semana com a contagem de
ceacutelulas e adiccedilatildeo diaacuteria de tetraciclina 1 μgml
65
4 RESULTADOS
41 Clonagem e caracterizaccedilatildeo do gene TcKAP7
A regiatildeo codificante do gene TcKAP7 (ID Tc00104705350871950) foi
obtida a partir do banco de dados do genoma do T cruzi disponiacutevel no portal da
internet wwwgenedborg e amplificada por PCR com os primers descritos no item
37
No genoma do T cruzi cepa CL Brener (EL-SAYED et al 2005) foram
identificados dois haploacutetipos do gene TcKAP7 que foram denominados neste
trabalho de haploacutetipo A (Tc00104705350871950) e haploacutetipo B
(Tc00104705350979320) Neste trabalho foi utilizado o gene TcKAP7 proveniente
da cepa Dm28c de T cruzi Este gene apresenta uma regiatildeo codante de 747 pb e
codifica uma proteiacutena de 276 kDa assumindo que o primeiro ATG apoacutes a sequecircncia
do mini-eacutexon seja usada na iniciaccedilatildeo da traduccedilatildeo
A figura 13 abaixo mostra o alinhamento de TcKAP7 das cepas CL Brener e
Dm28c
FIGURA 13 - COMPARACcedilAtildeO ENTRE AS SEQUumlEcircNCIAS DE AMINOAacuteCIDOS DEDUZIDAS DO GENE KAP7 DE T cruzi Dm28C E DOS HAPLOacuteTIPOS DE CL BRENER
LEGENDA As posiccedilotildees com aminoaacutecidos idecircnticos em todas as sequumlecircncias estatildeo coloridas em preto
66
Embora o gene TcKAP7 natildeo possua grande identidade com os com genes
ortoacutelogos em Trypanosoma brucei TbKAP7 (714 pb) (Tb106k151470) Leishmania
major LmKAP7 (1044 pb) (LMJF_36_5840) Leishmania infantum LiKAP7 (1044 pb)
(LINJ_36_6090) e Leishmania braziliensis LbKAP7 (1038 pb) (LBRM_35_0010)
cujos genomas tambeacutem foram sequumlenciados (BERRIMAN et al 2005 IVENS et al
2005 PEACOCK et al 2007) as sequecircncias de aminoaacutecidos das respectivas
proteiacutenas deduzidas a partir desses genes ainda compartilham certo grau de
similaridade entre si (FIGURA 14) Na tabela 4 pode-se visualizar o percentual de
identidade entre as proteiacutenas KAP7 dos tripanossomatiacutedeos que possuem o genoma
sequenciado
FIGURA 14 COMPARACcedilAtildeO ENTRE AS SEQUumlEcircNCIAS DE AMINOAacuteCIDOS DEDUZIDAS DO GENE KAP7 EM DIFERENTES TRIPANOSOMATIacuteDEOS LEGENDA Em preto encontram-se os resiacuteduos de aminoaacutecidos idecircnticos em todas as sequumlecircncias e em cinza os resiacuteduos conservados na maioria delas
67
QUADRO 4 - PERCENTUAL DE IDENTIDADE ENTRE AS PROTEIacuteNAS KAP7 NOS
TRIPANOSSOMATIacuteDEOS COM O GENOMA SEQUENCIADO
Os valores foram obtidos pelo alinhamento utilizando a ferramenta Clustal21
Mesmo apresentando pouca identidade e variaccedilatildeo de tamanho alguns
dados do genoma sugerem que esses genes satildeo ortoacutelogos entre si Pode-se
perceber uma sintenia entre seus loci nas vaacuterias espeacutecies de tripanosomatiacutedeos
(Cavalcanti et al 2009) (FIGURA 15)
FIGURA 15- SINTENIA DE TcKAP7 COM OUTROS TRIPANOSOMATIacuteDEOS LEGENDA Os dois contigs de TcKAP7 (TcA e TcB) estatildeo representados nesta figura juntamente com os contigs de outros tripanosomatiacutedeos (Tb= T brucei Lm= L major Li= L infantum e Lb= L brasiliensis) mostrando que KAP7 representado pela cor amarela apresenta uma sintenia entre seus loci em todas as espeacutecies mostradas sendo flanqueado pelo gene KAP4 em T cruzi e T brucei representado em azul Portanto em L majorL infantum eL brasiliensis ao lado direito de KAP7 estaacute o gene de uma proteiacutena hipoteacutetica representado pela cor vermelha e ao lado esquerdo encontra-se o gene da KAP4 representado em azul como mencionado anteriormente FONTE CAVALCANTI et al 2009
68
A expressatildeo de vaacuterios genes mitocondriais de C fasciculata e L major eacute
regulada durante o ciclo celular em parte por uma sequumlecircncia consenso
[(CA)AUAGAA(GA)] presente nas regiotildees 5rsquo e 3rsquo-UTR dos respectivos mRNAs
(BROWN amp RAY 1997 MAHMOOD et al 1999 MAHMOOD amp RAY 1998 PASION
et al 1996 ZICK et al 2005)
Assim resolvemos caracterizar a regiatildeo 5rsquo-UTR do transcrito TcKAP7 na
tentativa de identificar sinais com identidade com aqueles encontrados em C
fasciculata Na figura 16 estaacute representada a regiatildeo 5rsquo-UTR do transcrito TcKAP7
com a sequumlecircncia parcial do mini-exon proveniente do primer usado na teacutecnica de
RT-PCR bem como parte da regiatildeo codificante do gene O mini-exon estaacute situado a
129 bases a jusante do iniacutecio da regiatildeo codificante do transcrito TcKAP7 e define
portanto uma regiatildeo 5rsquo-UTR de 168 bases considerando que o tamanho do mini-
exon eacute de 39 bases A anaacutelise da regiatildeo 5rsquo-UTR mostrou um elemento com
caracteriacutesticas muito semelhantes aquele envolvido na regulaccedilatildeo de genes em C
fasciculata (sequencia (G)ATAGAA(G) mostrada no retacircngulo preto na FIGURA
16B) sugerindo que TcKAP7 seja regulada durante o ciclo celular
69
A
B
FIGURA 16 CARACTERIZACcedilAtildeO DA REGIAtildeO 5rsquo-UTR DO TRANSCRITO TcKAP7 LEGENDA A Esquema geral da localizaccedilatildeo do mini-exon de TcKAP7 e B Localizaccedilatildeo especiacutefica do mini-exon de TcKAP7 O mini-exon de TcKAP7 (sequecircncia parcial em verde) estaacute localizado a 129 pb da regiatildeo codante (representada em parte pela cor azul) A regiatildeo 5rsquoUTR do transcrito Tckap7 estaacute representada na cor rosa A possiacutevel sequencia consenso de regulaccedilatildeo durante o ciclo celular estaacute indicada no retacircngulo preto
42 Expressatildeo da proteiacutena TcKAP7 em T cruzi
Formas epimastigotas foram transfectadas com o plasmiacutedeo pNEO3XFLAG
contendo o gene TcKAP7 (pNEO_KAP7_3xFLAG) A expressatildeo da proteiacutena
TcKAP7-FLAG foi analisada por ensaio de western blot Os resultados mostraram
que a expressatildeo da proteiacutena TcKAP7-FLAG foi satisfatoacuteria correspondendo ao
tamanho esperado (FIGURA 17 ) a qual foi confirmada pela reatividade do anticorpo
monoclonal especiacutefico para as etiquetas FLAG (anti-FLAG)
70
FIGURA 17 ANAacuteLISE DA EXPRESSAtildeO DA PROTEIacuteNA DE FUSAtildeO TCKAP7-FLAG EM FORMAS EPIMASTIGOTAS DE T CRUZI
43 Localizaccedilatildeo celular de TcKAP7 atraveacutes de ensaio de imunofluorescecircncia
Para verificar a localizaccedilatildeo celular de TcKAP7 foi realizado o ensaio de
imunofluorescecircncia Como natildeo foi possiacutevel a obtenccedilatildeo do anticorpo com alto tiacutetulo
contra a proteiacutena recombinante TcKAP7 neste ensaio foi utilizado o anticorpo
monoclonal anti-FLAG que reconhece a etiqueta FLAG a qual estaacute fusionada a
proteiacutena TcKAP7
Nessa figura pode-se observar que a proteiacutena de fusatildeo acumula-se na regiatildeo
dos poacutelos do cinetoplasto das formas epimastigotas do T cruzi (FIGURA 18)
indicando que TcKAP7 uma proteiacutena tipo histona H1 estaacute realmente associada com
o kDNA do parasita
71
FIGURA 18 IMUNOLOCALIZACcedilAtildeO DE TcKAP7 EM EPIMASTIGOTAS DE T CRUZI LEGENDAA contraste interferencial diferencial (DIC) B Hoechst marcando o nuacutecleo e o
cinetoplasto C fluorescecircncia mostrando a localizaccedilatildeo de TcKAP7 mais intensa na regiatildeo dos poacutelos
docinetoplasto dos protozoaacuterios D Aumento de C
44 Deleccedilatildeo do gene TcKAP7 por nocaute gecircnico
As teacutecnicas que permitem a remoccedilatildeo de um gene e sua substituiccedilatildeo por
genes repoacuterteres atraveacutes do processo de recombinaccedilatildeo tecircm sido usadas com
sucesso para verificaccedilatildeo da funccedilatildeo gecircnica em tripanosomatiacutedeos (MACRAE et al
2006) O nocaute gecircnico consiste na inserccedilatildeo de marcadores geneacuteticos de seleccedilatildeo
(gene codificando resistecircncia a neomicina ou higromicina entre outros) flanqueados
por sequumlecircncias pertencentes ao locus cromossocircmico de interesse Atraveacutes do
processo de recombinaccedilatildeo homoacuteloga o marcador pode entatildeo substituir o gene que
se quer estudar Desse modo pode ser possiacutevel analisar a funccedilatildeo de determinado
gene atraveacutes das alteraccedilotildees - decorrentes de sua ausecircncia - na fisiologia do
parasita No presente estudo os genes repoacuterteres que codificam resistecircncia aos
72
antibioacuteticos G418 e higromicina foram flanqueados por sequumlecircncias a montante e a
jusante da regiatildeo codificante do gene TcKAP7 As construccedilotildees foram usadas para
transfectarT cruzi e gerar mutantes para o gene TcKAP7 a fim de se estudar o
efeito que a ausecircncia do gene TcKAP7 causa no metabolismo do parasita
Apoacutes obtenccedilatildeo de uma populaccedilatildeo de T cruzi mutante para o gene TcKAP7
(kap7neokap7higro) resistente a ambos antibioacuteticos G418 e higromicina B o
DNA desta populaccedilatildeo foi extraiacutedo para anaacutelise por PCR e Southern blot a fim de
confirmar a eficiecircncia do nocaute
441 Anaacutelise por PCR do DNA dos parasitas transfectados com os cassetes
UPS-NEO-DOWN e UPS-HIGRO-DOWN
Foram realizadas vaacuterias reaccedilotildees de PCR a fim de confirmar a deleccedilatildeo do
gene TcKAP7 do genoma do T cruzi Dm28c e a substituiccedilatildeo dos seus alelos pelos
genes neo e higro As reaccedilotildees de PCR foram feitas com DNA de T cruzikap7kap7 (tipo
selvagem) e com DNA de T cruzikap7neokap7higro utilizando diversas combinaccedilotildees de
primers (TABELA 5) Na figura 32 observa-se que o gene TcKAP7 (747 pb) foi
amplificado somente na PCR realizada com DNA de T cruzi tipo selvagem (FIGURA
19 A canaleta 1) enquanto que os genes neo (795 pb) e higro (1026 pb) soacute foram
amplificados nas reaccedilotildees que conteacutem DNA da populaccedilatildeo do T cruzi kap7neokap7higro
(FIGURA 19 B canaletas 2 e 3) Os tamanhos esperados para amplificaccedilotildees usando
primers externos agraves construccedilotildees e os primers dos genes de resistecircncia foram
identificados no gel de agarose indicando que os cassetes se integraram
corretamente no locus do gene TcKAP7 (FIGURA 19 B canaletas 4 a 7) Um
esquema da localizaccedilatildeo dos primers utilizados nas reaccedilotildees de PCR pode ser
visualizado na figura 19 C
QUADRO 5 ndash COMBINACcedilOtildeES DE PRIMERS UTILIZADOS NA PCR PARA
CONFIRMAR O NOCAUTE DE TcKAP7
Pares de primers Tamanho esperado
(pb)
1 KAP7F + KAP7R 747
2 NEOF + NEOR 795
73
3 HIGROF + HIGROR 1026
4 EXTF + NEOR 1410
5 EXTF + HIGROR 1634
6 NEOF + EXTR 1358
7 HIGROF + EXTR 1360
74
FIGURA 19 ENSAIOS DE PCR UTILIZANDO DNA DE T cruzi kap7kap7 (WT) E
T cruzi kap7neokap7higro (NO) COM DIFERENTES PRIMERS
LEGENDA 1 KAP7F + KAP7R 2 NEOF + NEOR (795 pb) 3 HIGROF + HIGROR (1026 pb) 4
EXTF + NEOR (1410 pb) 5 EXTF + HIGROR (1634 pb) 6 NEOF + EXTR (1358 pb) e 7
HIGROF + EXTR (1360 pb) No quadro A encontram-se as PCRs realizadas com DNA de T cruzi kap7kap7 (WT) e no quadro B encontram-se as PCRs realizadas com DNA de T cruzi kap7neokap7higro
(NO) No quadro C estaacute um esquema da localizaccedilatildeo dos primers utilizados
442 Anaacutelise da organizaccedilatildeo dos genes TcKAP7 neo e higro por ensaio do
tipo Southern blot
Neste ensaio foi utilizado DNA total extraiacutedo de T cruzikap7kap7 (tipo selvagem)
e T cruzi kap7neokap7higro (duplo nocaute) Foram utilizadas trecircs sondas (1) Um
fragmento do gene TcKAP7 (primeiros 598 pb da CDS) (2) o gene neo e (3) o gene
higro O DNA total das duas amostras foi digerido com a enzima de restriccedilatildeo HindIII
O padratildeo de digestatildeo desta enzima pode ser visualizado na figura 20 De acordo
com o mapa de restriccedilatildeo a inserccedilatildeo do cassete neo no locus KAP7 geraria um
fragmento HindIIIHindIII de 1024 pb enquanto a inserccedilatildeo do cassete higro geraria
um fragmento de 1032 pb cujos tamanhos satildeo diferentes do fragmento
HindIIIHindIII do locus original (1776 pb) As hibridizaccedilotildees mostram bandas
compatiacuteveis com os tamanhos dos fragmentos HindIIIHindIII esperados para cada
situaccedilatildeo acima (FIGURA 21) Podemos observar que a sonda KAP7 somente
reconhece uma banda de tamanho esperado apenas no DNA do parasita selvagem
(canaleta 1 FIGURA 21) enquanto que bandas correspondentes aos genes neo e
higrosomente aparecem no DNA do mutante KAP7 (canaleta 2 FIGURA 21)
75
FIGURA 20 ndash REPRESENTACcedilAtildeO ESQUEMAacuteTICA DOS SIacuteTIOS DA ENZIMA HindIII NO LOCUS DO GENE KAP7 DE T cruzi CL Brener LEGENDA Este esquema representa esquematicamente em escala os genes kap3 neo e higro as regiotildees upstream e downstream e os siacutetios de clivagem da enzima KpnI
FIGURA 21 ANAacuteLISE DA ORGANIZACcedilAtildeO DOS GENES TCKAP7 NEO E HIGRO POR ENSAIO DO TIPO SOUTHERN BLOT LEGENDA A Autoradiograma e B Padrotildees dos fragmentos obtidos da digestatildeo do DNA com a enzima de restriccedilatildeo HindIII Foram utilizadas trecircs sondas TcKAP7 neomicina e higromicina 1) DNA de T cruzikap7kap7 (tipo selvagem) e 2) T cruzi kap7neokap7higro (duplo nocaute)
76
45 Comparaccedilatildeo da expressatildeo do gene TcKAP7 por western blot
O antisoro contra a proteiacutena TcKAP7 obtido apoacutes imunizaccedilatildeo dos
camundongos foi utilizado em ensaio do tipo western blot para avaliar se TcKAP7
ainda estava sendo expresso no T cruzi apoacutes o nocaute gecircnico
O que se observou foi novamente como esperado que a proteiacutena TcKAP7 natildeo eacute
mais expressa no T cruzi kap7neokap7higro (figura 22) Pode-se observar a presenccedila
de TcKAP7 ( aprox 28 kDa) no extrato das formas epimastigotas de T cruzi kap7kap7
(figura 22A) mas natildeo no extrato de epimastigotas de T cruzi
kap7neokap7higro (figura 22B)
FIGURA 22 COMPARACcedilAtildeO DA EXPRESSAtildeO DO GENE TcKAP7 POR WESTERN BLOT LEGENDA Imunoblot de extratos de epimastigotas de T cruzi kap7kap7 (A) e de T cruzi kap7neokap7higro (B) reagidos com anti-TcKAP7
46 Anaacutelise da morfologia e da ultraestrutura do cinetoplasto do mutante de T
cruzi para TcKAP7
Sabendo-se que TcKAP7 estaacute associada ao cinetoplasto e pode estar
envolvida na compactaccedilatildeo do kDNA do T cruzi como foi mostrado para as KAPs de
Crithidia fasciculata (XU amp RAY 1993 XU et al 1996 HINES amp RAY 1998) sua
ausecircncia poderia levar a alteraccedilatildeo na estrutura do DNA mitocondrial dos parasitas
nocauteados Portanto o primeiro passo foi verificar se havia alteraccedilotildees na
77
morforlogia do parasita Formas epimastigotas do mutante de T cruzi foram
analisadas ao microscoacutepio oacuteptico apoacutes coloraccedilatildeo Como pode ser observado na
figura 23 epimastigotas do mutante de T cruzi para TcKAP7 apresentam uma
morfologia fusiforme com o cinetoplasto caracteriacutestico em forma de barra localizado
anteriormente ao nuacutecleo natildeo se evidenciando portanto nenhuma alteraccedilatildeo em
relaccedilatildeo agrave morfologia dos parasitas do tipo selvagem
FIGURA 23 - COLORACcedilAtildeO PELO MEacuteTODO PANOacuteTICO RAacutePIDO DOS PARASITAS EPIMASTIGOTAS NOCAUTEADOS LEGENDA A) Formas epimastigotas B) Forma epimastigota em maior aumento
Formas epimastigotas de parasitas do tipo selvagem e nocauteados foram
entatildeo analisados pela teacutecnica de microscopia eletrocircnica de transmissatildeo para
visualizar com mais detalhe o cinetoplasto e verificar se sua estrutura estava
alterada pela ausecircncia da TcKAP7 (FIGURA 24) A figura 24A mostra um corte
ultrafino de um epimastigota de T cruzi do tipo selvagem que apresenta o
cinetoplasto compacto e em forma de bastatildeo caracteriacutestico de formas
epimastigotas sem nenhuma alteraccedilatildeo aparente O mesmo pode ser visto na figura
24B para o epimastigota de T cruzi nocauteado A disposiccedilatildeo estrutura e aspecto
do cinetoplasto de ambos os parasitas selvagem e nocauteado natildeo apresentaram
nenhuma diferenccedila entre si mostrando que mesmo apoacutes o nocaute da KAP7 a
estrutura do cinetoplasto permanece aparentemente inalterada
78
FIGURA 24 COMPARACcedilAtildeO ENTRE A ULTRAESTRUTURA DO CINETOPLASTO DO T cruzi DM28C TIPO SELVAGEM (A) E DO MUTANTE DE T cruzi PARA TcKAP7 (B) POR MICROSCOPIA ELETROcircNICA DE TRANSMISSAtildeO
79
47 Multiplicaccedilatildeo diferenciaccedilatildeo e infectividade do mutante de T cruzi para
TcKAP7
Os parasitas mutantes foram analisados a fim de verificar se alteraccedilotildees na
estrutura do kDNA pela ausecircncia de KAP7 natildeo estavam levando a alteraccedilotildees na
fisiologia do parasita alterando sua multiplicaccedilatildeo diferenciaccedilatildeo e infectividade
Inicialmente foi analisado o perfil da curva de crescimento das formas
epimastigotas Observou-se que natildeo havia diferenccedila na curva de crescimento dos
parasitas nocauteados em relaccedilatildeo ao parasita selvagem (FIGURA 25)
FIGURA 25 CURVA DE CRESCIMENTO DO MUTANTE DE T cruzi PARA TcKAP7 (KO) E DO T cruzi Dm28c SELVAGEM (WT)
LEGENDA Curva de crescimento do mutante de T cruzi para TcKAP7 () e do T cruzi Dm28c ()
Em seguida os parasitas nocauteados foram analisados quanto a sua capacidade
de diferenciaccedilatildeo em tripomastigotas metaciacuteclicos Foram realizadas contagens
diferenciais em cacircmara de Neubauer a partir do sobrenadante da metaciclogecircnese
a cada 24 h apoacutes a incubaccedilatildeo das ceacutelulas em meio TAU3AAG durante um periacuteodo
de 3 dias (72 h) A partir dessas contagens foram construiacutedos curva com a contagem
do nuacutemero de metaciacuteclicos ao longo dos trecircs dias (FIGURA 26)
Nenhuma alteraccedilatildeo foi observada quando os parasitas nocauteados foram
submetidos ao processo de metaciclogecircnese in vitro Ou seja pode-se afirmar que
80
mesmo apoacutes o nocaute do gene TcKAP7 as formas epimastigotas do parasita
conseguem se diferenciar em formas metaciacuteclicas
FIGURA 26 METACICLOGEcircNESE IN VITRO DE T cruzi Dm28c TIPO SELVAGEM E T cruzi NOCAUTEADO LEGENDA Metaciclogecircnese in vitro de T cruzi Dm28c tipo selvagem () e T cruzi nocauteado ()
Uma vez que os parasitas nocauteados foram capazes de se diferenciar de
epimastigota a tripomastigota metaciacuteclico resolveu-se investigar se estes eram
capazes de infectar ceacutelulas in vitro Foi possiacutevel perceber as formas amastigotas
dentro de ceacutelulas VERO em cultura mostrando que o parasita natildeo perdeu sua
capacidade de infecccedilatildeo (dados natildeo mostrados) Assim pode-se concluir que aleacutem
de sofrer diferenciaccedilatildeo os mutantes de T cruzi para KAP7 tambeacutem mantiveram sua
capacidade de infecccedilatildeo
48 Anaacutelise da funccedilatildeo do gene KAP7 de Trypanosoma brucei atraveacutes de
ensaios de RNA de interferecircncia
Para averiguar a importacircncia da proteiacutena TcKAP7 na biologia do parasita
recorremos a ensaios de RNA de interferecircncia (RNAi) jaacute que existe uma alta
similaridade entre TcKAP7 e seu ortoacutelogo em Trypanosoma brucei
81
A via de RNA de interferecircncia consiste em um mecanismo de silenciamento
gecircnico que para a ceacutelula funciona como sistema de defesa O mecanismo inicia-se
atraveacutes da expressatildeo de um RNA dupla fita (dsRNA) contendo uma sequecircncia
complementar ao gene de interesse Este dsRNA seraacute entatildeo clivado em pequenos
fragmentos de cerca de 22 a 25 nucleotiacutedeos atraveacutes da atividade de uma
ribonuclease do tipo III denominada Dicer Estes pequenos RNAs seratildeo
direcionados e permaneceratildeo unidos a um complexo proteico denominado RISC
(ldquoRNA-InducedSilencingComplexrdquo) Nesse complexo os pequenos RNAs de
interferecircncia (siRNA) ligam-se por complementaridade ao RNA mensageiro do gene
a ser inativado guiando-os para degradaccedilatildeo pelas nucleases presentes no
complexo impedindo a siacutentese da respectiva proteiacutena (ULLU et al 2002) O vetor
utilizado para promover o silenciamento do gene TbKAP7 foi o p2T7-177 Este
plasmiacutedeo integra-se aos minicromossomos do T brucei regiatildeo de repeticcedilotildees 177
(FOLDYNOVA-TRANTIRKOVA et al 2005) Este vetor apresenta dois promotores
de polimerase em oposiccedilatildeo induziacuteveis por tetraciclina flanqueando a sequumlecircncia de
interesse Desta forma satildeo geradas duas moleacuteculas de mRNA que pareadas
formam a moleacutecula de RNA fita dupla capaz de induzir a maquinaria de degradaccedilatildeo
A induccedilatildeo da inibiccedilatildeo de TbKAP7 atraveacutes de RNAi levou a uma diminuiccedilatildeo da
multiplicaccedilatildeo celular do parasita a partir do quarto dia do experimento (FIGURA 27)
Os resultados obtidos neste ensaio mostraram que a participaccedilatildeo da TbKAP7
no metabolismo do T brucei eacute essencial jaacute que o silenciamento do gene TbKAP7
levou agrave reduccedilatildeo da proliferaccedilatildeo celular do parasita
82
FIGURA 27 RNAi DE TbKAP7 INIBE O CRESCIMENTO DAS FORMAS PROCIacuteCLICAS DE T
brucei
LEGENDA Curva de crescimento de linhagem celular de RNAi de TbKAP7 em T brucei induzido por
tetraciclina As ceacutelulas foram diluiacutedas a uma densidade celular inicial de 1 X 106 ml na presenccedila e
ausecircncia de tetraciclina As densidades celulares foram determinadas pela contagem de ceacutelulas a
intervalos de 24 horas durante oito dias apoacutes iniacutecio de adiccedilatildeo de tetraciclina A linha com quadrados
mostra a curva de crescimento celular na presenccedila de tetraciclina (+TET) A linha com losangos
mostra a curva de crescimento celular na ausecircncia de tetraciclina (- TET)
49 Caracterizaccedilatildeo estrutural de TcKAP7
491 Produccedilatildeo recombinante de TcKAP7
O cultivo de E coli BL-21(DE3) STAR contendo o plasmiacutedeo pET28a-
TcKAP7 foi feito em meio LB a 37 oC com a induccedilatildeo da expressatildeo realizada a uma
densidade oacutetica de DO600 de 08 com a adiccedilatildeo de 05 mM de ITPG durante a noite a
37 oC
As ceacutelulas foram recuperadas por centrifugaccedilatildeo ressuspensas sonicadas e
centrifugadas para a purificaccedilatildeo de TcKAP7 atraveacutes da cromatografia de afinidade
em resina de Ni-NTA (Figura 28A) Foi possiacutevel obter grande quantidade de
83
amostra com grau de pureza alto como visualizado atraveacutes de anaacutelise por SDS-
PAGE (Figura 28B)
FIGURA28 PURIFICACcedilAtildeO DE TCKAP7 ATRAVEacuteS DE CROMATOGRAFIA DE AFINIDADE LEGENDA A) Cromatograma de afinidade B) SDS-PAGE da cromatografia de afinidade Os nuacutemeros agrave esquerda da figura representam os tamanhos das bandas do marcador de massa molecular (Benchmark) (Invitrogen) e P banda correspondente agrave TcKAP7 purificada Caixa em vermelho indica o pico que corresponde agrave fraccedilatildeo no SDS-PAGE
Devido agrave presenccedila de bandas com possiacuteveis contaminantes as fraccedilotildees que
continham a proteiacutena de interesse foram submetidas agrave purificaccedilatildeo por cromatografia
de troca iocircnica onde a purificaccedilatildeo eacute realizada baseada na afinidade por cargas
entre as proteiacutenas e a resina
Para esta purificaccedilatildeo utilizou-se a coluna SP Hitrap (GE Healthcare Life
Sciences) que eacute uma coluna de carga negativa Essa resina foi escolhida pois o pH
do tampatildeo em que se encontrava TcKAP7 era menor que o pI da proteiacutena Nessas
condiccedilotildees a carga superficial de TcKAP7 eacute positiva Para favorecer a interaccedilatildeo
TcKAP7 e resina foi feita uma diluiccedilatildeo de TcKAP7 para retirada de NaCl A eluiccedilatildeo
da proteiacutena foi realizada com um gradiente segmentado de tampatildeo B para
84
cromatografia de troca iocircnica TcKAP7 foi eluiacuteda com 68 do tampatildeo B (FIGURA
29)
FIGURA 29 PURIFICACcedilAtildeO DE TCKAP7 ATRAVEacuteS DE CROMATOGRAFIA DE TROCA IOcircNICA
LEGENDA A) Cromatografia de troca iocircnica B) SDS-PAGE da cromatografia de troca iocircnica Os nuacutemeros agrave esquerda da figura representam os tamanhos das bandas do marcador de massa molecular (Benchmark) (Invitrogen) e P banda correspondente agrave TcKAP7 purificada Caixa em vermelho indica o pico que corresponde agrave fraccedilatildeo no SDS-PAGE Curva em azul representa absorbacircncia em 280 nm Linha em verde indica concentraccedilatildeo de tampatildeo B para eluiccedilatildeo da amostra
410 Anaacutelise do estado oligomeacuterico de TcKAP7
A amostra purificada por troca iocircnica foi submetida agrave cromatografia de
exclusatildeo molecular tambeacutem chamada de gel filtraccedilatildeo que consiste na separaccedilatildeo
de biomoleacuteculas de acordo com seu tamanho e forma A coluna neste processo
conteacutem um poliacutemero com ligaccedilotildees cruzadas com poros de tamanho definido As
moleacuteculas maiores iratildeo migrar mais rapidamente que as menores pois natildeo satildeo
85
capazes de penetrar no interior dos poros da resina eluindo diretamente da coluna
As moleacuteculas menores por entrarem pelos poros da resina e levarem mais tempo
percorrendo os poros satildeo eluiacutedas mais tarde em relaccedilatildeo as que satildeo maiores
Ao comparar o volume de eluiccedilatildeo de TcKAP7 com o volume de eluiccedilatildeo de
proteiacutenas com massa molecular conhecidos (dados natildeo mostrados) foi possiacutevel
verificar que TcKAP7 parece ser um monocircmero em soluccedilatildeo Para confirmar esses
dados a mesma amostra foi submetida ao experimento de espalhamento dinacircmico
de luz (DLS)
O DLS eacute uma teacutecnica que se estima a distribuiccedilatildeo de tamanho das
populaccedilotildees de partiacuteculas que estatildeo presentes na amostra permitindo a detecccedilatildeo de
agregados proteicos ou de diferentes estados de oligomerizaccedilatildeo na amostra
indicando heterogeneidade Eacute importante ressaltar que para maiores chances de
sucesso em ensaios de cristalizaccedilatildeo a amostra deve encontrar-se monodispersa
Os dados de DLS mostram que 911 da massa de TcKAP7 analisada
apresenta um raio hidrodinacircmico (Rh) de 39 nm que representa uma massa
aparente de 29 kDa (FIGURA 30) Isto eacute condizente com um monocircmero cuja massa
teoacuterica seria de aproximadamente 28 kDa (incluindo a cauda de 6 histidinas) de
acordo com a prediccedilatildeo feita pelo servidor Expasy Protparam
(httpwebexpasyorgprotparam)A polidispersividade da amostra foi baixa
indicando que a mesma estava homogecircnea
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0 1 2 3 4 5 6 7
M
assa
Rh (nm)
fr80
fr82
fr84
fr85
86
FIGURA 30 ANAacuteLISE POR DLS DE TCKAP7 LEGENDA Anaacutelise por DLS de TcKAP7 contendo as fraccedilotildees obtidas na cromatografia de afinidade As fraccedilotildees 80 84 e 85 apresentam um raio hidrodinacircmico (Rh) de 39 nm
Aleacutem disso tambeacutem foram obtidas informaccedilotildees sobre o envelope de TcKAP7
a partir dos dados coletados atraveacutes da teacutecnica de SAXS mostrando que o raio de
giro (Rg) do envelope de TcKAP7 estaacute de acordo com o estimado por DLS (FIGURA
31)
FIGURA 31 ENVELOPE MOLECULAR DE SAXS
411 Anaacutelise do conteuacutedo de estrutura secundaacuteria de TcKAP7 recombinante
Atraveacutes da anaacutelise do espectro de dicroiacutesmo circular pode-se verificar o
conteuacutedo de estrutura secundaacuteria da proteiacutena e inferir enovelamento da proteiacutena
recombinante Os dados obtidos para a TcKAP7 revelaram a presenccedila de estruturas
α caracterizadas pelos miacutenimos pronunciados em 208 nm e 222 nm e de estruturas
coiled na amostra de TcKAP7 caracterizada pelos miacutenimos pronunciados em 205
nm (FIGURA 32) Este resultado estaacute de acordo a prediccedilatildeo de estrutura secundaacuteria
87
realizada pelo servidor PSIPRED (httpbioinfcsuclacukpsipred (FIGURA 33)
Esses resultados sugerem que a proteiacutena recombinante possui correto
enovelamento
FIGURA 32 ESPECTRO DE DICROIacuteSMO CIRCULAR DE TcKAP7
FIGURA 33 PREDICcedilAtildeO DE ESTRUTURA SECUNDAacuteRIA DE TcKAP7
412 Anaacutelise estrutural de TcKAP7
A fim de obter-se a estrutura tridimensional de TcKAP7 por cristalografia de
raios-X foram realizados ensaios de cristalizaccedilatildeoFoi possiacutevel observar a formaccedilatildeo
de um cristal em apenas uma condiccedilatildeo Imidazol 01 M Polietilenoglicol (PEG) 8000
10 wv e Acetato de caacutelcio 02 M
A visualizaccedilatildeo atraveacutes de luz ultra-violeta atraveacutes do equipamento Rock
Imager Fomulatrix permitiu identificaacute-lo como cristal de proteiacutena jaacute que este
diferencia-se de cristal de sal pela fluorescecircncia quando excitado em comprimento
de onda de 280 nm
-20
-18
-16
-14
-12
-10
-8
-6
-4
-2
0
2
200 210 220 230 240 250 260
Ɵ M
RV
x 1
03
(de
g cm
2d
mo
l-1)
Comprimento de onda (nm)
88
O perfil do cristal pode ser visualizado na figura 34 Esse cristal encontra-se
pequeno e mal-formado Aleacutem disso os meacutetodos para a determinaccedilatildeo estrutural de
uma estrutura ineacutedita (sem homologia com estruturas conhecidas) necessitam de
mais de um cristal Dessa forma foram realizados refinamentos dessas condiccedilotildees
iniciais visando aumentar q quantidade de cristais aumentar seu tamanho e
melhorar sua organizaccedilatildeo A concentraccedilatildeo de PEG (5 A 10) e do pH (6 a 9) com
intervalos de 1 unidade foram alterada Entretanto mesmo assim natildeo foi possiacutevel a
obtenccedilatildeo de cristais adequados para a difraccedilatildeo de raios X e novos refinamentos
seratildeo necessaacuterios
FIGURA 34 CRISTAL DE TcKAP7 DE T CRUZI LEGENDA AObtenccedilatildeo do cristal de TcKAP7 na condiccedilatildeo de Imidazol 01 M Polietilenoglicol (PEG) 8000 10 wv e Acetato de caacutelcio 02 M e B Cristal de TcKAP7 visto sob luz ultravioleta
Uma vez que natildeo foi possiacutevel durante o desenvolvimento desse projeto a
obtenccedilatildeo da estrutura cristalograacutefica de TcKAP7 procedeu-se com a construccedilatildeo de
seu modelo molecular
A modelagem molecular eacute uma ferramenta que permite a obtenccedilatildeo de
modelos da estrutura tridimensional de uma determinada proteiacutena com base em
homologia sequencial ou estrutural com proteiacutenas cujas estruturas tridimensional
foram experimentalmente resolvidas
Para a construccedilatildeo do modelo foi utilizado o programa MODELLER (SALI amp
BLUNDELL 1993) este programa eacute utilizado para a modelagem por homologia a
estruturas tridimensionais de proteiacutenas O programa automaticamente constroacutei um
modelo baseado na anaacutelise de um alinhamento de sequecircncias entre a proteiacutena para
a qual se deseja construir o modelo e uma proteiacutena relacionada cuja estrutura
tridimensional jaacute foi resolvida Nesse caso foram utilizadas estruturas de duas
A B
89
proteiacutenas como molde para a construccedilatildeo da estrutura de TcKAP7 A estrutura da
proteiacutena HMGB1(coacutedigo de acesso no banco de dados de proteiacutenas 2GZK)
(wwwpdborg) para a porccedilatildeo amino-terminal e a estrutura do fator A de transcriccedilatildeo
mitocondrial (coacutedigo de acesso 3TQ6) para a porccedilatildeo carboxi-terminal da proteiacutena
(FIGURA 35A) Duas proteiacutenas foram selecionadas para a construccedilatildeo do modelo de
TcKAP7 visto que a similaridade de sequencia entre TcKAP7 e proteiacutenas com
estruturas resolvidas eacute bastante baixo A similaridade sequencial de TcKAP7 e
proteiacutena HMGB1 eacute de 224 e entre TcKAP7 e o fator A de transcriccedilatildeo mitocondrial
eacute de 264 No entanto ambas proteiacutenas possuem alta similaridade em relaccedilatildeo agrave
estrutura secundaacuteria (mais de 90) Para aumentar a confiabilidade do modelo
utilizamos uma proteiacutena para construir a sequencia N-terminal de TcKAP7
(aminoaacutecidos 1-184) e outra para o C-terminal (aminoaacutecidos 185-248)
A qualidade do modelo pode ser avaliada por exemplo atraveacutes de graacuteficos e
tabelas que analisam restriccedilotildees quiacutemicas e fiacutesicas de cada aacutetomo constituinte do
modelo Neste trabalho foi utilizado o graacutefico de Ramachandran (FIGURA 35B) nele
pode-se visualizar todas as combinaccedilotildees possiacuteveis de acircngulos dieacutedricos Ψ (psi)
versus os Φ (phi) nos aminoaacutecidos de um polipeptiacutedeo e que contribuem para a
conformaccedilatildeo das estruturas das proteiacutenas (RAMACHANDRAN et al 1963) Dos 230
resiacuteduos apenas 5 estatildeo em regiotildees natildeo permitidas do graacutefico Esse eacute um
excelente valor pois eacute similar ao valor meacutedio encontrado para estruturas
experimentalmente determinadas com resoluccedilatildeo de no miacutenimo 20 Aring
(httpwwwebiacukthornton-srvdatabasesprofunc)
Tambeacutem eacute possiacutevel visualizar a topologia de TcKAP7 (FIGURA 35 C) que
mostra as regiotildees de α-heacutelices e regiotildees de coiled presentes na proteiacutena
corroborando com os dados obtidos na espectroscopia de dicroiacutesmo circular
90
FIGURA 35 ESTRUTURA DE TcKAP7 LEGENDA AModelo tridimensional de KAP7 B Graacutefico de Ramachandran e C Topologia de TcKAP7
A anaacutelise da superfiacutecie eletrostaacutetica de TcKAP7 mostra que existem regiotildees
ricas em aminoaacutecidos com cargas positivas que podem conferir afinidades agrave outras
proteiacutenas com carga carga superficial negativa ou mesmo aacutecidos nucleicos (FIGURA
36)
91
FIGURA 36 SUPERFIacuteCIE ELETROSTAacuteTICA DE TcKAP7 LEGENDA Visualizaccedilatildeo de diferentes regiotildees de TcKAP7 Vermelho potencial negativo Azul potencial positiva Branco Neutro
413 Investigaccedilatildeo de possiacuteveis funcionalidades baseadas na estrutura de
TcKAP7
4131 Prediccedilatildeo de funccedilatildeo paraTcKAP7
92
A prediccedilatildeo de funccedilatildeo para TcKAP7 foi realizada a partir do enovelamento de
proteiacutenas utilizando o servidor Profunc (httpwwwebiacukthornton-
srvdatabasesprofunc) O objetivo do servidor ProFunc eacute ajudar na identificaccedilatildeo de
uma possiacutevel funccedilatildeo bioquiacutemica de uma proteiacutena a partir da sua estrutura
tridimensional Ele utiliza uma seacuterie de meacutetodos incluindo comparaccedilatildeo de
enovelamento conservaccedilatildeo dos resiacuteduos e modelos 3D funcionais tanto para
identificar provaacuteveis siacutetios ativos da proteiacutena quanto possiacuteveis homoacutelogos no Protein
Data Bank (PDB) Neste procedimento tenta-se ajustar a estrutura da proteiacutena de
interesse aos tipos de enovelamentos de proteiacutenas conhecidas Atualmente mais de
1000 tipos jaacute foram registrados e depositados em bibliotecas de enovelamentos
Sabe-se que o alinhamento estrutural entre proteiacutenas consideradas de uma
mesma famiacutelia mesmo que seja apenas na regiatildeo do siacutetio ativo pode ser um
importante meacutetodo para se inferir a funccedilatildeo da sequecircncia em estudo (LASKOWSKI et
al 2003) A evoluccedilatildeo tende a conservar funccedilotildees que dependem mais diretamente
das estruturas 3D que das similaridades entre as sequecircncias de aminoaacutecidos das
proteiacutenas (SANCHEZ et al 2000)
Neste trabalho as quatro estruturas que possuem maior similaridade
estrutural com TcKAP7 estatildeo depositadas no Protein Data Bank (PDB) com os
coacutedigos 3TQ6 4NOD 3TMM 4NNU Todas as estruturas satildeo referentes agrave proteiacutena
TFAM (fator transcricional A mitocondrial)
As estruturas proteicas foram obtidas no banco de dados puacuteblicos de
proteiacutenas PDB (Protein Data Bank) e submetidas a um alinhamento estrutural com o
modelo de TcKAP7 (FIGURA 35A) no programa WinCoot Esse alinhamento pode
ser visualizado na figura 37 As regiotildees em vermelho representam as regiotildees de
TcKAP7 que apresentam interaccedilatildeo com DNA pois se alinham com as regiotildees de
ligaccedilatildeo agrave DNA das outras proteiacutenas e as regiotildees em azul representam regiotildees sem
homologia com as demais
Esse resultado sugere que TcKAP7 pode interagir com DNA com isso estes
dados podem ser utilizados para nortear mais estudos sobre a interaccedilatildeo das
proteiacutenas KAPrsquos com o DNA do cinetoplasto de T cruzi
93
FIGURA 37 ALINHAMENTO ESTRUTURAL DE 3TQ6 4NOD 3TTM 4NNU E TCKAP7 LEGENDA Em vermelho encontram-se as regiotildees de TcKAP7 que podem interagir com DNA (Resiacuteduos 1-67 e 140-166) e em azul regiotildees sem homologia com as demais
4132 Anaacutelises preliminares da possiacutevel interaccedilatildeo entre TcKAP7 e kDNA
As prediccedilotildees estruturais sugeriram que a proteiacutena TcKAP7 possui motivos
similares agrave proteiacutenas que interagem com DNA No entanto a sequecircncia de
aminoaacutecidos entre as proteiacutenas eacute bastante baixa Como a funccedilatildeo de TcKAP7
permanece obscura foram realizados alguns ensaios para tentar verificar a
possibilidade desta proteiacutena interagir com kDNA Para isto utilizou-se a teacutecnica de
dicroiacutesmo circular para avaliar se a presenccedila de kDNA poderia resultar em
alteraccedilotildees estruturais em TcKAP7 o que seria uma evidecircncia da possiacutevel interaccedilatildeo
entre esta proteiacutena e o aacutecido nucleico
Foram realizadas medidas de dicroiacutesmo circular com amostras de TcKAP7
kDNA e TcKAP7 na presenccedila de kDNA Para a anaacutelise de dados foi realizado o
somatoacuterio das curvas obtidas com as amostras de TcKAP7 e kDNA separadamente
Este somatoacuterio resultou em uma curva teoacuterica que indica o perfil teoacuterico de uma
amostra contendo TcKAP7 e kDNA sem interaccedilotildees presentes Aacute essa curva foi
sobreposta a curva experimental da medida de dicroiacutesmo circular de TcKAP7 na
94
presenccedila de kDNA A figura 38 ilustra essa sobreposiccedilatildeo onde pode-se verificar que
as curvas natildeo se sobrepotildeem portanto alteraccedilotildees estruturais ocorrem em TcKAP7
na presenccedila de kDNA
FIGURA 38 ESPECTRO DE DICROIacuteSMO CIRCULAR DE TcKAP7 LEGENDA Em azul encontra-se o espectro experimental de TcKap7 na presenccedila de DNA em vermelho o espectro teoacuterico de TcKAP7 e DNA
Para investigar mudanccedilas estruturais associadas a interaccedilatildeo com kDNA foi
realizada uma coleta de dados de SAXS na presenccedila de 1ug de kDNA
A comparaccedilatildeo dos modelos de baixa resoluccedilatildeo por SAXS indica uma
diferenccedila conformacional pontual da proteiacutena na presenccedila de kDNA As figuras 28 e
29 mostram os envelopes da proteiacutena TcKAP7na ausecircncia (FIGURAS 39A e 40A) e
presenccedila de kDNA de T cruzi (FIGURA 39B e FIGURA 40B) Percebe-se uma
diferenccedila de densidade eletrocircnica na regiatildeo da heacutelice (Residuos 140 - 166
evidenciados em vermelho) No envelope de TcKAP7 ela eacute bastante flexiacutevel e natildeo eacute
observada densidade eletrocircnica nessa regiatildeo no entanto na presenccedila de kDNA
essa mesma regiatildeo mostra-se mais riacutegida e eacute possiacutevel estimar seu posicionamento
baseado na densidade eletrocircnica Aleacutem disso essa heacutelice eacute predita como interatora
de DNA com base nas anaacutelises estruturais previamente realizadas nesse trabalho
Esses dados sugerem uma mudanccedila conformacional da proteiacutena na presenccedila
do kDNA fazendo com que esta mude seu arranjo estrutural para permanecer ligada
agrave moleacutecula de DNA sugerindo uma interaccedilatildeo entre TcKAP7 e DNA do cinetoplasto
-22
-17
-12
-7
-2
3
200 210 220 230 240 250 260
ϴM
RW
x 1
03
(de
g cm
-2 d
mo
l-1)
Comprimento de onda (nm)
Kap7+DNA
95
de T cruzi Esses dados corroboram com o que foi visto na superfiacutecie eletrostaacutetica
(FIGURA 36) e no alinhamento estrutural (FIGURA 37)
FIGURA 39 ENVELOPE MOLECULAR DETcKAP7 LEGENDA A Monocircmero de TcKAP7 ajustado ao envelope de SAXS B Monocircmero de TcKAP7 + kDNA ajustado ao envelope de SAXSResiduos 140- 166 evidenciados em vermelho
96
FIGURA 40 ENVELOPE MOLECULAR DE TcKAP7 VISTO EM DIFERENTES AcircNGULOS LEGENDA A Monocircmero de TcKAP7 ajustado ao envelope de SAXS B Monocircmero de TcKAP7 + kDNA ajustado ao envelope de SAXS Residuos 140- 166 evidenciados em vermelho
97
5 DISCUSSAtildeO
O Trypanosoma cruzi pertence a um grupo que divergiu muito cedo na
linhagem eucarioacutetica apresentando diversas caracteriacutesticas uacutenicas em relaccedilatildeo a
outros eucariotos Uma dessas caracteriacutesticas eacute a presenccedila de uma mitococircndria
uacutenica ramificada pelo corpo do protozoaacuterio contendo uma regiatildeo especializada o
cinetoplasto onde reside o DNA mitocondrial tambeacutem conhecido como kDNA O
kDNA eacute composto por uma rede de moleacuteculas interligadas entre si os maxiciacuterculos e
os miniciacuterculos (SHAPIRO amp ENGLUND 1995) Mais de 30 proteiacutenas envolvidas na
replicaccedilatildeo e na manutenccedilatildeo do kDNA jaacute foram identificadas e acredita-se que um
nuacutemero aproximado de 100 proteiacutenas muitas delas presentes apenas em
cinetoplastiacutedeos possam estar envolvidas nesses processos (LIU et al 2005) A
maioria dessas proteiacutenas foi identificada em T brucei e C fasciculata e
possivelmente vaacuterias delas principalmente aquelas envolvidas em replicaccedilatildeo
devem estar codificadas no genoma do T cruzi
Apesar de serem conhecidos muitos dos componentes da maquinaria de
replicaccedilatildeo dos miniciacuterculos e maxiciacuterculos natildeo se pode dizer o mesmo para as
proteiacutenas envolvidas na manutenccedilatildeo da estrutura do kDNA Com exceccedilatildeo de 4
proteiacutenas com caracteriacutesticas de histonas H1 (KAP1 a 4) encontradas associadas ao
cinetoplasto de C fasciculata pouco ainda eacute conhecido sobre as proteiacutenas que
participam da organizaccedilatildeo do kDNA em outros tripanosomatiacutedeos
Zavala-Castro e colaboradores (2002) identificaram sete proteiacutenas variando
de 19 a 31 kDa associadas ao kDNA de formas epimastigotas de T cruzi a partir
de kDNA extraiacutedo de ceacutelulas fixadas com formaldeiacutedo Os tamanhos observados satildeo
compatiacuteveis com aqueles das KAPs encontradas por Xu e Ray (1993) usando
experimento similar em C fasciculata entretanto nenhuma das possiacuteveis KAPs
descritas por Zavala-Castro e colaboradores foi caracterizada
Noacutes iniciamos estudos objetivando identificar proteiacutenas envolvidas na
organizaccedilatildeo e segregaccedilatildeo do kDNA de T cruzi a partir dos dados fornecidos pelo
sequenciamento do genoma desse parasita fazendo uma comparaccedilatildeo com as
KAPs de C fasciculata Estudos realizados por Cavalcanti e colaboradores (2009)
usando como modelo as sequecircncias de KAPs de C fasciculata identificaram 35
proteiacutenas relacionadas em diferentes tripanosomatiacutedeos cujos genomas estatildeo
sequenciados (11 em T cruzi 7 em L braziliensis 6 em L major e L infantum e 5
98
em T brucei) Essas sequecircncias puderam ser agrupadas em 7 tipos diferentes de
KAPs (KAP1 a 7) Das 7 KAPs T cruzi possui 5 (TcKAP3 a 7) cuja a sintenia
gecircnica eacute uma das caracteriacutesticas marcantes jaacute que alguns genes divergem em
relaccedilatildeo ao tamanho e portanto no tamanho da proteiacutena codificada As KAPs de T
cruzi e T brucei satildeo maiores do que as de C fasciculata e Leishmania spp Isso
pode sugerir que KAPs possam ter evoluiacutedo para um tamanho que comporte
basicamente suas funccedilotildees de associaccedilatildeo com o kDNA de maneira mais eficiente
Os resultados obtidos por Cavalcanti et al (2009) para TcKAP4 e TcKAP6
mostraram que em epimastigotas e amastigotas estas duas proteiacutenas estatildeo
distribuiacutedas ao longo de toda a rede de kDNA consistente com o que foi observado
em C fasciculata (XU et al 1996 HINES amp RAY 1998) poreacutem CfKAP4 tambeacutem
apresentou um padratildeo de marcaccedilatildeo nos poacutelos opostos do kDNA sugerindo que
essa KAP em particular se associe aos miniciacuterculos receacutem-replicados antes de sua
reintegraccedilatildeo agrave rede de kDNA (XU et al 1996) Contudo em tripomastigotas de T
cruzi estas duas proteiacutenas estatildeo distribuiacutedas na periferia da rede de kDNA
(CAVALCANTI et al 2009) indicando que diferente de C fasciculata elas
apresentam uma dinacircmica de associaccedilatildeo que depende da forma evolutiva do
parasita possivelmente refletindo distintas interaccedilotildees com proteiacutenas da rede de
kDNA em epimastigotas e tripomastigotas No presente trabalho ampliamos o
conhecimento sobre as KAPs de T cruzi estudando o papel da KAP7 na fisiologia
desse parasita
Em C fasciculata a regulaccedilatildeo da expressatildeo de vaacuterios genes que codificam
proteiacutenas mitocondriais ocorre durante o ciclo celular em parte por uma sequumlecircncia
consenso [(CA)AUAGAA(GA)] presente nas regiotildees 5rsquo e 3rsquo-UTR dos respectivos
mRNAs (BROWN amp RAY 1997 MAHMOOD et al 1999 MAHMOOD amp RAY 1998
PASION et al 1996) O mesmo foi observado para L major onde uma sequecircncia
parecida com aquela encontrada em C fasciculata (CATAGA) foi identificada nas
regiotildees 5rsquo e 3rsquo de vaacuterios genes cuja a expressatildeo era maior na fase S do ciclo celular
(ZICK et al 2005) Analisando as regiotildees 5rsquo e 3rsquo do transcrito do gene TOP2 de T
cruzi que codifica a topo II mitocondrial descrito por Fragoso e Goldenberg (1992)
tambeacutem podemos observar a sequecircncia CATAGA repetida duas vezes na regiatildeo
5rsquoUTR e uma vez na regiatildeo 3rsquo-UTR do transcrito desse gene
Como relatamos neste trabalho a sequecircncia da regiatildeo 5rsquo-UTR do transcrito
TcKAP7 natildeo mostrou nenhum elemento com as caracteriacutesticas daquele envolvido na
99
regulaccedilatildeo de genes expressos na fase S do ciclo celular de outros
tripanosomatiacutedeos
Em relaccedilatildeo agrave localizaccedilatildeo de TcKAP7 verificamos atraveacutes de ensaios de
imunofluorescecircncia a distribuiccedilatildeo de TcKAP7 na regiatildeo dos poacutelos da rede de kDNA
das formas epimastigotas de T cruzi poreacutem ainda natildeo analisamos como esta
proteiacutena estaacute distribuiacuteda nas formas tripomastigotas que possuem a rede de kDNA
com formato arredondado e menos compactada
A localizaccedilatildeo de KAP7 na regiatildeo dos poacutelos do cinetoplasto de T cruzi
sugere que ela tenha funccedilotildees na replicaccedilatildeo da rede de kDNA pois nessa regiatildeo
estatildeo concentradas diversas proteiacutenas necessaacuterias para finalizaccedilatildeo do processo de
replicaccedilatildeo de miniciacuterculos
Para a construccedilatildeo do modelo molecular de TcKAP7 foram utilizadas
estruturas de duas proteiacutenas a estrutura da proteiacutena HMGB1 (2GZK) para a porccedilatildeo
amino-terminal e a estrutura da proteiacutena fator A de transcriccedilatildeo mitocondrial (3TQ6)
para a porccedilatildeo carboxi-terminal da proteiacutena ambas apresentam alta similaridade em
relaccedilatildeo agrave estrutura secundaacuteria (mais de 90) e tratam-se de proteiacutenas de um
mesmo grupo HMG (High-mobility group) Em T brucei TbKAP6 uma proteiacutena do
grupo HMG estaacute envolvida na replicaccedilatildeo e manutenccedilatildeo do kDNA (WANG et al
2014) Baseado nesses dados juntamente com os dados da imunofluorescecircncia
indireta pode-se sugerir um papel de TcKAP7 na replicaccedilatildeo da rede de kDNA
Embora ainda natildeo saibamos como KAP7 se associa com o kDNA de T
cruzi eacute possiacutevel que isso ocorra de duas maneiras atraveacutes de ligaccedilotildees
eletrostaacuteticas natildeo-especiacuteficas ou de interaccedilotildees com regiotildees especiacuteficas dos
miniciacuterculos
Atraveacutes de ensaios de SAXS foi possiacutevel perceber que a proteiacutena sofre
alteraccedilotildees conformacionais na presenccedila do kDNA sugerindo sua interaccedilatildeo com
esse aacutecido nucleacuteico Esta interaccedilatildeo pode ser eletrostaacutetica uma vez que a anaacutelise da
superfiacutecie eletrostaacutetica de TcKAP7 mostrou a predominacircncia de regiotildees ricas em
aminoaacutecidos com cargas positivas que podem conferir afinidades agrave outras proteiacutenas
com carga superficial negativa ou mesmo aacutecidos nucleicos mais uma vez sugerindo
a interaccedilatildeo com kDNA
Poreacutem natildeo se pode descartar a possibilidade de que a interaccedilatildeo de TcKAP7
com o kDNA seja atraveacutes de interaccedilotildees com regiotildees especiacuteficas dos miniciacuterculos
Nos tripanosomatiacutedeos a rede de kDNA assume a forma de um disco achatado
100
perpendicular ao flagelo onde os miniciacuterculos estatildeo alinhados em fibrilas orientadas
paralelamente ao eixo do disco (LIU et al 2005) Acredita-se que a ordenaccedilatildeo e
compactaccedilatildeo dos miniciacuterculos estatildeo relacionadas agrave proacutepria estrutura da moleacutecula de
miniciacuterculo Os miniciacuterculos apresentam regiotildees ricas em A+T que podem causar
curvaturas na moleacutecula (MARINI et al 1984 NTAMBI et al 1984) facilitando sua
inserccedilatildeo de forma ordenada no disco de kDNA aleacutem disso possuem regiotildees
conservadas onde estatildeo localizadas as origens de replicaccedilatildeo Essas regiotildees por
sua vez podem ser reconhecidas por proteiacutenas tais como a KAP7 que ajudam a
estabilizar a estrutura Os resultados com C fasciculata mostram que KAP2 3 e 4 se
ligam em regiotildees especiacuteficas dos miniciacuterculos ricas em A+T mas que natildeo satildeo
aquelas que geram a curvatura das moleacuteculas (XU et al 1996) Contudo KAP1 se
liga de maneira inespeciacutefica aos miniciacuterculos (HINES amp RAY 1998) Aleacutem disso
existe a sequecircncia universal de miniciacuterculo (UMS) e as proteiacutenas que se ligam a
essa sequecircncia (UMSBP) as quais podem participar de interaccedilotildees com as KAPrsquos
Em C fasciculata CfKAP3 sozinha consegue condensar a rede de kDNA e inibir a
decatenaccedilatildeo pela enzima topo II Poreacutem a interaccedilatildeo entre CfKAP3 e CfUMSBP
pode descondensar a rede de kDNA e reestabelecer a decatenaccedilatildeo mediada pela
topo II indicando que as proteiacutenas KAPrsquos dos tripanosomatiacutedeos podem apresentar
diferentes funccedilotildees em diferentes espeacutecies (KAPELLER et al 2011)
Para investigar a importacircncia de TcKAP7 no T cruzi e seu envolvimento ou
natildeo com o rearranjo topoloacutegico do kDNA durante o processo de diferenciaccedilatildeo do
parasita realizamos a deleccedilatildeo do gene TcKAP7 Nenhuma alteraccedilatildeo estrutural ou
morfoloacutegica na rede de kDNA foi observada no mutante de T cruzi para TcKAP7 Do
mesmo modo o parasita mutante natildeo apresentou perfil de crescimento alterado e
foi capaz de se diferenciar nas formas tripomastigotas metaciacuteclicas e infectar ceacutelulas
VERO onde se diferenciaram em formas amastigotas O mesmo foi visto quando foi
realizado o nocaute do gene TcKAP3 (DE SOUZA et al 2010)
Uma das hipoacuteteses para explicar esse fato eacute que alguma outra KAP de T
cruzi possa estar assumindo o papel da TcKAP7 talvez a TcKAP4 que se localiza
nos poacutelos do cinetoplasto quando da inserccedilatildeo dos miniciacuterculos na rede apoacutes serem
replicados na regiatildeo cinetoflagelar A redundacircncia no papel das KAPs faz com que a
rede de kDNA seja compactada e segregada corretamente mesmo na ausecircncia de
uma delas (DE SOUZA et al 2010) Sabe-se que o nocaute do gene Cfkap2 ou do
gene Cfkap3 separadamente natildeo mostrou nenhuma alteraccedilatildeo no fenoacutetipo de C
101
fasciculata Poreacutem a deleccedilatildeo de ambos os genes causou diversas alteraccedilotildees
aumento nos niacuteveis de mRNAs mitocondriais reduccedilatildeo na respiraccedilatildeo inibiccedilatildeo da
divisatildeo celular e acuacutemulo de ceacutelulas com morfologias anormais (AVLIYAKULOV et
al 2004)
Com o intuito de complementar os estudos para a caracterizaccedilatildeo do gene
TcKAP7 foram realizados ensaios de RNA de interferecircncia visando analisar a
funccedilatildeo do gene TbKAP7 ortoacutelogo em T brucei jaacute que a maquinaria de RNAi em T
cruzi eacute inexistente (DA ROCHA et al 2003) Com isso foi visto que a participaccedilatildeo da
TbKAP7 no metabolismo do T brucei eacute essencial jaacute que o silenciamento do gene
TbKAP7 levou agrave reduccedilatildeo da proliferaccedilatildeo celular do parasita corroborando com os
dados encontrados para TbKAP6 (WANG et al 2014)
Esperamos que o conhecimento das diversas moleacuteculas envolvidas na
organizaccedilatildeo e replicaccedilatildeo da rede de kDNA assim como o entendimento dos
mecanismos fisioloacutegicos que ocorrem nesta estrutura tatildeo peculiar que eacute o
cinetoplasto dos tripanosomatiacutedeos possam nos ajudar a esclarecer vaacuterios aspectos
relacionados a biologia destes eucariotos primitivos e a evoluccedilatildeo do genoma
mitocondrial ao longo do processo evolutivo
102
6 CONCLUSOtildeES
Com base nos resultados observados neste trabalho foi possiacutevel concluir
1 ndash A proteiacutena TcKAP7 eacute uma proteiacutena associada ao cinetoplasto de T
cruzi e possui caracteriacutesticas que a identificam como KAPs do tipo histona H1
incluindo seu tamanho e sua composiccedilatildeo de aminoaacutecidos e sua superfiacutecie
eletrostaacutetica
2 ndash TcKAP7 estaacute localizada nos poacutelos do cinetoplasto de T cruzi podendo
estar envolvida na replicaccedilatildeo dos miniciacuterculos
3 - TcKAP7 sofre mudanccedilas conformacionais na presenccedila do kDNA de T
cruzi evidenciando sua interaccedilatildeo com o aacutecido nucleico
4 ndash O mutante de T cruzi para TcKAP7 natildeo apresentou alteraccedilatildeo na
estrutura do cinetoplasto e na morfologia do parasita
5 ndash A proliferaccedilatildeo e a diferenciaccedilatildeo do T cruzi natildeo foram alteradas quando
o parasita teve o gene TcKAP7 deletado do genoma
6 ndash O silenciamento do gene TbKAP7 eacute essencial no metabolismo do T
brucei levando agrave reduccedilatildeo da proliferaccedilatildeo celular do parasita
103
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ldquoTenho a impressatildeo de ter sido uma crianccedila brincando agrave
beira-mar divertindo-me em descobrir uma pedrinha
mais lisa ou uma concha mais bonita que as outras
enquanto o imenso oceano da verdade continua
misterioso diante de meus olhosrdquo
(Isaac Newton)
RESUMO
O DNA do cinetoplasto (kDNA) dos tripanosomatiacutedeos consiste numa rede de
moleacuteculas circulares catenadas entre si os miniciacuterculos e os maxiciacuterculos Os
miniciacuterculos codificam RNAs guias (gRNAs) e os maxiciacuterculos codificam para
algumas subunidades de enzimas mitocondriais e rRNA em um padratildeo
criptografado (ediccedilatildeo de RNA) Estudos com o tripanosomatiacutedeo Crithidia fasciculata
mostraram que proteiacutenas do tipo histona H1 associadas ao cinetoplasto (KAPs) satildeo
capazes de condensar a rede de kDNA Poreacutem pouco eacute conhecido sobre estas
proteiacutenas de Trypanosoma cruzi um protozoaacuterio parasita que sofre alteraccedilotildees na
estrutura do DNA do cinetoplasto ao longo de seu ciclo de vida Neste trabalho foi
caracterizada uma proteiacutena associada ao cinetoplasto de T cruzi denominada de
TcKAP7 que possui baixo peso molecular e natureza baacutesica condizente com um
papel na neutralizaccedilatildeo de carga e na condensaccedilatildeo do DNA Atraveacutes de ensaios
usando a teacutecnica de espalhamento de raios-X a baixo acircngulo (SAXS) foi possiacutevel
perceber que a proteiacutena TcKAP7 sofre mudanccedilas estruturais na presenccedila do kDNA
sugerindo uma interaccedilatildeo com essa estrutura seja atraveacutes de ligaccedilotildees eletrostaacuteticas
ou atraveacutes de ligaccedilotildees especiacuteficas com moleacuteculas presentes na rede A anaacutelise pela
teacutecnica de imunofluorescecircncia mostrou que proteiacutena TcKAP7 estaacute localizada na
regiatildeo dos poacutelos do cinetoplasto o que sugere que pode estar envolvida na
finalizaccedilatildeo da replicaccedilatildeo dos miniciacuterculos Mutante nulo para TcKAP7 foi gerado por
teacutecnicas de substituiccedilatildeo gecircnica a fim de verificar se na ausecircncia de TcKAP7
ocorriam alteraccedilotildees na estrutura do kDNA Contudo os parasitas mutantes para
TcKAP7 natildeo apresentavam alteraccedilotildees na estrutura e morfologia do cinetoplasto
quando analisados por microscopia eletrocircnica e foram capazes de se diferenciar
sem perder a capacidade infectiva Entretanto ensaios de RNA de interferecircncia
visando analisar a funccedilatildeo do gene TbKAP7 ortoacutelogo em T brucei levou agrave reduccedilatildeo
da proliferaccedilatildeo celular das formas prociacuteclicas desse parasita mostrando que este
gene eacute essencial para o metabolismo desse tripanosomatiacutedeo sugerindo que KAP7
possa ter papeis distintos em T cruzi e T brucei
Palavras-chaves Trypanosoma cruzi cinetoplasto nocaute KAPs
ABSTRACT
The kinetoplast DNA (kDNA) of trypanosomatids consists in a network of circular
molecules catenated each other the minicircles and maxicircles The minicircles
code RNAs guides (gRNAs) and the maxicircles code for some subunits of
mitochondrial enzymes and rRNA in a cryptic pattern (RNA editing) Studies in the
trypanosomatid protozoan Crithidia fasciculata showed that the kDNA is associated
with histone H1-like proteins known as kinetoplast-associated proteins (KAPs) wich
are capable of condensing the kDNA network However little is known about these
proteins of Trypanosoma cruzi a protozoan parasite which undergoes changes in
kinetoplast DNA structure over its life cycle Here we characterize a protein
associated with T cruzi kinetoplast named TcKAP7 TcKAP7 is a low molecular
weight protein with basic nature which is consistent with a role in DNA charge
neutralization and condensation Analysis by small angle X-Ray scattering technique
(SAXS) revealed that the TcKAP7 protein undergoes structural changes in the
presence kDNA suggesting an interaction with this DNA network either through
electrostatic bonds or through specific binding to molecules present on the network
The immunofluoresce analysis showed that TcKAP7 is located in the kinetoplast
poles suggesting that TcKAP7 might be involved in the late stages of the minicircle
replication A null mutant for TcKAP7 was obtained by gene replacement techniques
to study possible alterations in the kDNA structure However no modification in the
structure and morphology of the kinetoplast was observed by electron microscopy In
addition Tckap7 null mutant was able to differentiate without losing its infective
capacity Interference RNA assays was performed to analyze the function of
TbKAP7 the ortholog gene in T brucei The ablation of TbKAP7 expression leaded
to reduction in the procyclic proliferation suggesting that this gene is essential for the
metabolism of the parasite and might play distinct roles in T cruzi and T brucei
Key-words Trypanosoma cruzi kinetoplast gene knockout KAPs
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1 DISTRIBUICcedilAtildeO GEOGRAacuteFICA DA DOENCcedilA
DE CHAGAS19 FIGURA 2 CICLO DE TRANSMISSAtildeO DO
Trypanosoma cruzi20 FIGURA 3 ESQUEMA GERAL DAS PRINCIPAIS ESTRUTURAS
CELULARES DE T cruzi 22 FIGURA 4 REDE DE kDNA27 FIGURA 5 DIFERENTES ARRANJOS DO CINETOPLASTO
DE T cruzi29 FIGURA 6 MUDANCcedilAS NA POSICcedilAtildeO DO KDNA
NOS TRYPANOSOMAS29 FIGURA 7 REPOSICIONAMENTO DO KDNA EM RELACcedilAtildeO
AgraveS OUTRAS ORGANELAS DURANTEO CICLO DE VIDA DE UM FLAGELADO30
FIGURA 8 REPLICACcedilAtildeO DO kDNA32 FIGURA 9 REPRESENTACcedilAtildeO ESQUEMAacuteTICA DO
MICROFLUIDIFICADOR45 FIGURA 10 VETOR PARA EXPRESSAtildeO EM T CRUZI
P3XFLAG 50 FIGURA 11 ESQUEMA DA CONSTRUCcedilAtildeO DOS VETORES
UTILIZADOS PARA O NOCAUTE DO GENE TcKAP755
FIGURA 12 MAPA DO VETOR P2T7-177 UTILIZADO PARA ENSAIOS DE RNAi62
FIGURA 13 COMPARACcedilAtildeO ENTRE AS SEQUumlEcircNCIAS DE AMINOAacuteCIDOS DEDUZIDAS DO GENE KAP7 DE T cruzi Dm28C E DOS HAPLOacuteTIPOS DE CL BRENER65
FIGURA 14 COMPARACcedilAtildeO ENTRE AS SEQUumlEcircNCIAS DE AMINOAacuteCIDOS DEDUZIDAS DO GENE KAP7 EM DIFERENTES TRIPANOSOMATIacuteDEOS66
FIGURA 15 SINTENIA DE TcKAP7 COM OUTROS TRIPANOSOMATIacuteDEOS67
FIGURA 16 CARACTERIZACcedilAtildeO DA REGIAtildeO 5rsquo-UTR DO TRANSCRITO TcKAP769
FIGURA17 ANAacuteLISE DA EXPRESSAtildeO DA PROTEIacuteNA DE FUSAtildeO TCKAP7-FLAG EM FORMAS EPIMASTIGOTAS DE T CRUZI70
FIGURA 18 IMUNOLOCALIZACcedilAtildeO DE TcKAP7 EM EPIMASTIGOTAS DE T CRUZI71
FIGURA 19 ENSAIOS DE PCR UTILIZANDO DNA DE T cruzi kap7kap7 (WT) E T cruzi kap7neokap7higro (NO) COM DIFERENTES PRIMERS73
FIGURA 20 REPRESENTACcedilAtildeO ESQUEMAacuteTICA DOS SIacuteTIOS DA ENZIMA HindIII NO LOCUS DO GENE KAP7 DE T cruzi CL Brener75
FIGURA 21 ANAacuteLISE DA ORGANIZACcedilAtildeO DOS GENES TCKAP7 NEO E HIGRO POR ENSAIO DO TIPO SOUTHERN BLOT75
FIGURA 22 COMPARACcedilAtildeO DA EXPRESSAtildeO DO GENE TcKAP7 POR WESTERN BLOT76
FIGURA 23 COLORACcedilAtildeO PELO MEacuteTODO PANOacuteTICO RAacutePIDO DOS PARASITAS EPIMASTIGOTAS NOCAUTEADOS77
FIGURA 24 COMPARACcedilAtildeO ENTRE A ULTRAESTRUTURA DO CINETOPLASTO DO T cruzi DM28C TIPO SELVAGEM (A) E DO MUTANTE DE T cruzi PARA TcKAP7 (B) POR MICROSCOPIA ELETROcircNICA DE TRANSMISSAtildeO78
FIGURA 25 CURVA DE CRESCIMENTO DO MUTANTE DE T cruzi PARA TcKAP7 (KO) E DO T cruzi Dm28c SELVAGEM (WT) 79
FIGURA 26 METACICLOGEcircNESE IN VITRO DE T cruzi Dm28c TIPO SELVAGEM E T cruzi NOCAUTEADO80
FIGURA 27 RNAi DE TbKAP7 INIBE O CRESCIMENTO DAS FORMAS PROCIacuteCLICAS DE T brucei82
FIGURA 28 PURIFICACcedilAtildeO DE TCKAP7 ATRAVEacuteS DE CROMATOGRAFIA DE AFINIDADE83
FIGURA 29 PURIFICACcedilAtildeO DE TCKAP7 ATRAVEacuteS DE CROMATOGRAFIA DE TROCA IOcircNICA84
FIGURA 30 ANAacuteLISE POR DLS DE TCKAP785 FIGURA 31 ENVELOPE MOLECULAR DE SAXS86 FIGURA 32 ESPECTRO DE DICROIacuteSMO CIRCULAR DE
TcKAP787 FIGURA 33 PREDICcedilAtildeO DE ESTRUTURA SECUNDAacuteRIA DE
TcKAP787 FIGURA 34 CRISTAL DE TcKAP7 DE T CRUZI88 FIGURA 35 ESTRUTURA DE TcKAP790 FIGURA 36 SUPERFIacuteCIE ELETROSTAacuteTICA DE
TcKAP791 FIGURA 37 ALINHAMENTO ESTRUTURAL DE 3TQ6 4NOD
3TTM 4NNU E TCKAP793 FIGURA 38 ESPECTRO DE DICROIacuteSMO CIRCULAR
DE TcKAP794 FIGURA 39 ENVELOPE MOLECULAR DETcKAP795 FIGURA 40 ENVELOPE MOLECULAR DETcKAP7 VISTO EM
DIFERENTES AcircNGULOS96
LISTA DE TABELAS
TABELA 1 RELACcedilAtildeO DOS PRIMERS UTILIZADOS PARA A CLONAGEM DA REGIAtildeO UPSTREAM DE TcKAP7 NO VETOR pNEO153
TABELA 2 RELACcedilAtildeO DOS PRIMERS UTILIZADOS PARA A CLONAGEM DA REGIAtildeO DOWNSTREAM DE TcKAP7 NO VETOR pNEO153
TABELA 3 RELACcedilAtildeO DOS PRIMERS UTILIZADOS PARA A AMPLIFICACcedilAtildeO DO GENE TbKAP763
TABELA 4ndash PERCENTUAL DE IDENTIDADE ENTRE AS PROTEIacuteNAS KAP7 NOS TRIPANOSSOMATIacuteDEOS COM O GENOMA SEQUENCIADO67
TABELA 5 COMBINACcedilOtildeES DE PRIMERS UTILIZADOS NA PCR PARA CONFIRMAR O NOCAUTE DE TcKAP772
SUMAacuteRIO
1 INTRODUCcedilAtildeO18 11 O Trypanosoma cruzi18 12 Ciclo de vida do T cruzi20 13 Aspectos celulares de T cruzi21 14 O genoma de T cruzi24 15 Expressatildeo gecircnica de Tcruzi25 16 O cinetoplasto26 17 A rede de kDNA26 171 Replicaccedilatildeo do kDNA31 18 Proteiacutenas associadas ao cinetoplasto (KAPs)32 2 OBJETIVOS35 21 OBJETIVO GERAL35 211 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS35 3 MATERIAIS E MEacuteTODOS36 31 Reagentes e Soluccedilotildees Utilizados36 311 Reagentes36 312 Tampotildees e Soluccedilotildees36 313 Meios de cultura38 32 Cultivo do Trypanosoma cruzi38 321 Epimastigotas38 322 Tripomastigotas metaciacuteclicos39 33 Curva de crescimento de T cruzi39 34 Obtenccedilatildeo de DNA de T cruzi40 35 Obtenccedilatildeo de kDNA de T cruzi40 36 Obtenccedilatildeo de extrato proteico de T cruzi40 37 Clonagem do gene TcKAP741 38 Obtenccedilatildeo do cDNA de TcKAP7 atraveacutes de ensaio de RT-PCR41 39 Seleccedilatildeo dos clones recombinantes42 391 Teacutecnica de palitagem (toothpick)42 392 Teacutecnica de PCR de colocircnia43 310 Preparaccedilatildeo de plasmiacutedeo em pequena escala (miniprep)43 311 Expressatildeo da proteiacutena TcKAP7 em E coli43 312 Purificaccedilatildeo da proteiacutena recombinante TcKAP744 3121 Processamento da amostra44 3122 Cromatografia de afinidade45 3123 Cromatografia de troca iocircnica46 3124 Cromatografia de gel filtraccedilatildeo46 313 Espalhamento Dinacircmico de Luz ndash DLS46 314 Espectroscopia de dicroiacutesmo circular (CD)46 315 Quantificaccedilatildeo e concentraccedilatildeo47 316 Ensaios de Cristalizaccedilatildeo47 317 Espalhamento de raio-X a baixo acircngulo (SAXS)48 318 Modelagem de TcKAP748 319 Obtenccedilatildeo de antissoro policlonal contra TcKAP749 320 Anaacutelise da expressatildeo do gene TcKAP7 e de seu mutante por ensaio tipo western blot49 321 Superexpressatildeo de TcKAP750
3211 Amplificaccedilatildeo e clonagem do gene TcKAP7 no vetor pNEO3xFlag para superexpressatildeo da proteiacutena50 3212 Transfecccedilatildeo por eletroporaccedilatildeo52 3213 Seleccedilatildeo dos transfectantes52 322 Deleccedilatildeo do gene TcKAP7 por nocaute gecircnico53 3221 Amplificaccedilatildeo e clonagem das regiotildees a montante e a jusante do gene TcKAP753 3222 Amplificaccedilatildeo dos cassetes UPS-NEO-DOWN e UPS-HIGRO-DOWN para transfecccedilatildeo de T cruzi55 3223 Transfecccedilatildeo do T cruzi com o cassete UPS-NEO-DOWN56 3224 Extraccedilatildeo de DNA dos transfectantes57 3225 Anaacutelise por PCR do DNA dos parasitas transfectados com o cassete UPS-NEO-DOWN57 3226 Transfecccedilatildeo do T cruzi com o cassete UPS-HIGRO-DOWN57 3227 Anaacutelise por PCR do DNA dos parasitas transfectados com o cassete UPS-HIGRO-DOWN58 3228 Anaacutelise da organizaccedilatildeo do gene TcKAP7 e da eficiecircncia de seu nocaute atraveacutes de ensaio do tipo Southern blot58 323 Localizaccedilatildeo celular da proteiacutena TcKAP7 atraveacutes de ensaio de imunofluorescecircncia59 324 Anaacutelise da ultraestrutura do cinetoplasto do mutante de T cruzi para TcKAP7 por microscopia eletrocircnica de transmissatildeo60 325 Coloraccedilatildeo dos parasitas transfectados60 326 Infecccedilatildeo de ceacutelulas Vero com o mutante de T cruzi para TcKAP761 327 Anaacutelise da funccedilatildeo do gene TbKAP7 de Trypanosoma brucei atraveacutes de ensaios de RNA de interferecircncia61 3271 Induccedilatildeo do RNA dupla fita64 4 RESULTADOS65 41 Clonagem e caracterizaccedilatildeo do gene TcKAP765 42 Expressatildeo da proteiacutena TcKAP7 em T cruzi69 43 Localizaccedilatildeo celular de TcKAP7 atraveacutes de ensaio de imunofluorescecircncia70 44 Deleccedilatildeo do gene TcKAP7 por nocaute gecircnico71 441 Anaacutelise por PCR do DNA dos parasitas transfectados com os cassetes UPS-NEO-DOWN e UPS-HIGRO-DOWN72 442 Anaacutelise da organizaccedilatildeo dos genes TcKAP7 neo e higro por ensaio do tipo Southern blot74 45 Comparaccedilatildeo da expressatildeo do gene TcKAP7 por western blot76 46 Anaacutelise da morfologia e da ultraestrutura do cinetoplasto do mutante de T cruzi para TcKAP776 47 Multiplicaccedilatildeo diferenciaccedilatildeo e infectividade do mutante de T cruzi para TcKAP779 48 Anaacutelise da funccedilatildeo do gene KAP7 de Trypanosoma brucei atraveacutes de ensaios de RNA de interferecircncia80 49 Caracterizaccedilatildeo estrutural de TcKAP782 491 Produccedilatildeo recombinante de TcKAP782 410 Anaacutelise do estado oligomeacuterico de TcKAP784 411 Anaacutelise do conteuacutedo de estrutura secundaacuteria de TcKAP7 recombinante86 412 Anaacutelise estrutural de TcKAP787
413 Investigaccedilatildeo de possiacuteveis funcionalidades baseadas na estrutura de TcKAP791 4131 Prediccedilatildeo de funccedilatildeo paraTcKAP791 4132 Anaacutelises preliminares da possiacutevel interaccedilatildeo entre TcKAP7 e kDNA93 5 DISCUSSAtildeO97 6 CONCLUSOtildeES102 7 REFEREcircNCIAS103
18
1 INTRODUCcedilAtildeO
11 O Trypanosoma cruzi
Trypanosoma cruzi eacute um protozoaacuterio flagelado unicelular pertencente ao
reino Protista subreino Protozoa filo Sarcomastigophora subfilo Mastigophora
classe Zoomastigophora ordem Kinetoplastida e famiacutelia Trypanosomatidae (LEVINE
et al 1980) A principal caracteriacutestica dessa ordem eacute a presenccedila de uma estrutura
singular o cinetoplasto que abriga em uma massa de DNA extranuclear
concentrado na mitococircndria uacutenica deste protista (SHAPIRO amp ENGLUND 1995) A
famiacutelia Trypanosomatidae inclui os seguintes gecircneros importantes Blastocrithidia
Crithidia Endotrypanum Herpetomonas Leishmania Leptomonas Phytomonas e
Trypanosoma O gecircnero Trypanosoma eacute um dos mais importantes dentro da famiacutelia
Trypanosomatidae por incluir uma seacuterie de espeacutecies causadoras de doenccedilas
humanas importantes como o Trypanosoma cruzi agente da doenccedila de Chagas
Trypanosoma rhodesiense e Trypanosoma gambiense agentes da doenccedila do sono
e de animais o Trypanosoma brucei Trypanosoma equiperdum e Trypanosoma
equinum (DE SOUZA 2015)
Este protozoaacuterio eacute um microrganismo heteroxecircnico com ciclo bioloacutegico
alternado entre hospedeiros vertebrados (mamiacuteferos) e invertebrados (triatomiacuteneos)
Existem diferentes formas de transmissatildeo da doenccedila dentre as quais se destaca a
via vetorial que consiste na transmissatildeo do parasita atraveacutes de excretas do inseto
vetor hematoacutefago pertencente agrave ordem Hemiacuteptera famiacutelia Reduvidae subfamiacutelia
Triatominae (DIAS et al 1956) A principal caracteriacutestica bioloacutegica dos triatomiacuteneos
eacute que satildeo obrigatoriamente hematoacutefagos e necessitam do repasto sanguiacuteneo para
completar o desenvolvimento (DIAS 2000) O parasita pode ainda ser transmitido
aos mamiacuteferos por transfusatildeo sanguiacutenea ou via oral e com menos frequecircncia por
via congecircnita acidentes de laboratoacuterio e transplantes de oacutergatildeos (BELTRAO HDE et
al 2009 STEINDEL et al 2008 TANOWITZ et al 1992) Praticamente todo tipo
de ceacutelula nucleada do hospedeiro mamiacutefero pode ser parasitada considerando o
tropismo das diferentes cepas (LENZI et al 1996) Outra caracteriacutestica deste
parasita eacute apresentar diferentes morfologias durante o ciclo bioloacutegico A classificaccedilatildeo
19
de suas formas baseia-se tambeacutem na posiccedilatildeo do cinetoplasto em relaccedilatildeo ao nuacutecleo
e do local de onde emerge o flagelo (HOARE 1971)
Foi no ano de 1909 no estado de Minas Gerais que Carlos Chagas meacutedico
sanitarista identificou pela primeira vez o protozoaacuterio parasita Trypanosoma cruzi
agente causador da Doenccedila de Chagas A doenccedila de Chagas eacute endecircmica na
Ameacuterica Latina sendo conhecida a existecircncia de vetores da doenccedila desde o sul dos
Estados Unidos agrave Argentina (FIGURA 1)
FIGURA 1 DISTRIBUICcedilAtildeO GEOGRAacuteFICA DA DOENCcedilA DE CHAGAS FONTE Modificado de httpwwwwhointen
Em 2008 o nuacutemero de indiviacuteduos infectados era estimado entre 16 e 18
milhotildees sendo que aproximadamente 90 milhotildees de pessoas estariam sob risco
de contaminaccedilatildeo na Ameacuterica Latina (WHO 2010)
Apesar de existirem drogas (Nifurtimox e Benzonidazol) para o tratamento
da doenccedila sua ineficaacutecia no estaacutegio crocircnico e sua accedilatildeo toacutexica acabam prejudicando
o paciente sem conseguir eliminar o parasita (BRENER et al 2000) Sem vacinas
ou tratamento quimioteraacutepico eficiente a principal estrateacutegia de controle limita-se agrave
prevenccedilatildeo da transmissatildeo por transfusatildeo sanguiacutenea e ao controle populacional dos
vetores triatomiacuteneos Aleacutem da sua importacircncia como patoacutegeno humano este micro-
organismo apresenta caracteriacutesticas peculiares que o tornam um excelente modelo
para o estudo de questotildees bioloacutegicas baacutesicas
Regiotildees endecircmicas
20
12 Ciclo de vida do T cruzi
O T cruzi apresenta um ciclo complexo na natureza sofrendo mudanccedilas
estruturais bioquiacutemicas e morfoloacutegicas de acordo com o ambiente em que se
encontra Formas replicativas epimastigotas e amastigotas dos hospedeiros
invertebrado e mamiacutefero respectivamente alternam-se com as formas infectivas e
natildeo proliferativas tripomastigotas metaciacuteclicas (proveniente do inseto vetor) e
tripomastigota sanguiacutenea (originaacuteria do mamiacutefero infectado) (FIGURA 2) (DE
SOUZA 1984)
FIGURA 2 CICLO DE TRANSMISSAtildeO DO Trypanosoma cruzi FONTE Infograacutefico Veniacutecio Ribeiro ICICTFIOCRUZ
Durante o repasto sanguiacuteneo do inseto vetor formas tripomastigotas
metaciacuteclicas atingem a corrente sanguiacutenea do hospedeiro pela lesatildeo da picada Esta
forma infectiva eacute capaz de invadir todos os tipos de ceacutelulas com exceccedilatildeo das
21
hemaacutecias Apoacutes a entrada do parasita na ceacutelula os tripomastigotas diferenciam-se
em uma forma replicativa denominada amastigota que apoacutes diversas divisotildees sofre
uma diferenciaccedilatildeo para um estaacutegio intermediaacuterio o epimastigota intracelular e
posteriormente para tripomastigota Quando ocorre a lise celular os tripomastigotas
satildeo liberados ao meio extracelular podendo entatildeo invadir ceacutelulas vizinhas atingir
novos tecidos atraveacutes da corrente sanguiacutenea ou ainda infectar um inseto vetor
durante o processo de hematofagia recomeccedilando o ciclo no hospedeiro
invertebrado No inseto as formas tripomastigotas diferenciam-se em epimastigotas
no tubo digestivo e migram para o intestino onde ocorrem as divisotildees binaacuterias Ao
atingirem a porccedilatildeo terminal do tubo digestivo ocorre a diferenciaccedilatildeo em
tripomastigotas metaciacuteclicos que satildeo eliminados juntamente com as fezes e urina do
triatomiacutedeo
A transformaccedilatildeo da forma epimastigota do T cruzi em tripomastigota
metaciacuteclica denominada metaciclogecircnese eacute de grande interesse de estudo pois
neste processo ocorrem diversas alteraccedilotildees morfoloacutegicas metaboacutelicas e de
expressatildeo gecircnica (GOLDENBERG et al 1985) A metaciclogecircnese que ocorre
naturalmente no intestino do inseto vetor pode ser mimetizada in vitro utilizando-se
meio quimicamente definido que simula as condiccedilotildees da urina do inseto vetor
(CONTRERAS et al 1985)
13 Aspectos celulares de T cruzi
O Trypanosoma cruzi apresenta aleacutem das organelas tiacutepicas da maioria das
ceacutelulas eucarioacuteticas como nuacutecleo retiacuteculo endoplasmaacutetico aparato de Golgi e
mitococircndria algumas estruturas peculiares (FIGURA 3) como os microtuacutebulos
subpeliculares a estrutura paraflagelar os reservossomos o cinetoplasto os
glicossomos e os acidocalcisomos exclusivos dos tripanosomatiacutedeos (revisto por
DE SOUZA 1984 1999 2002)
22
FIGURA 3 ESQUEMA GERAL DAS PRINCIPAIS ESTRUTURAS CELULARES DE T cruzi FONTE DOCAMPO et al 1975
A superfiacutecie celular dos tripanossomatiacutedeos eacute composta principalmente
pela membrana plasmaacutetica e pelos microtuacutebulos subpeliculares Pequenos
filamentos conectam fortemente os microtuacutebulos subpeliculares os quais se
apresentam espaccedilados de forma regular entre si e com a membrana plasmaacutetica (DE
23
SOUZA SANTANNA CUNHA-E-SILVA 2009) conferindo rigidez agrave ceacutelula e
resistecircncia ao rompimento mecacircnico
Todos os membros da famiacutelia Trypanosomatidae apresentam um flagelo
que emerge de uma aacuterea de invaginaccedilatildeo da membrana plasmaacutetica conhecida como
bolsa flagelar Devido agrave localizaccedilatildeo especiacutefica de vaacuterios receptores nesta aacuterea
acredita-se que a maior parte do traacutefego vesicular e entrada de nutrientes ocorram
nesta regiatildeo Outra invaginaccedilatildeo menor localizada proacutexima agrave bolsa flagelar o
citoacutestomo tambeacutem estaacute envolvida com a absorccedilatildeo de nutrientes (PORTO-
CARREIRO et al 2000)
O flagelo do T cruzi apresenta uma estrutura baacutesica semelhante a outros
flagelos sendo envolvido por uma membrana flagelar e contendo um axonema
tiacutepico que apresenta um padratildeo de nove pares de microtuacutebulos perifeacutericos e um par
central Associado ao flagelo deste parasita eacute encontrado um complexo arranjo de
filamentos proteacuteicos denominado de estrutura paraflagelar (revisto por GULL 1999)
Na parte posterior da ceacutelula existem organelas usualmente esfeacutericas
denominadas reservossomos Os reservossomos satildeo organelas aacutecidas que
possuem em seu interior proteinases principalmente a cruzipaiacutena (uma
cisteiacutenoproteinase) e proteiacutenas ingeridas que chegam dentro de vesiacuteculas
endociacuteticas oriundas da bolsa flagelar e do citoacutestomo Com base nisso foi proposto
que os reservossomos seriam compartimentos preacute-lisossomais (SOARES et al
1992) Tambeacutem tem sido proposta a participaccedilatildeo dos reservossomos no processo
de metaciclogecircnese como principal fonte de energia para esta atividade (SOARES
1999)
O T cruzi assim como todos os membros da famiacutelia Tripanosomatidae
apresenta uma mitococircndria uacutenica e ramificada que se estende por todo o corpo do
protozoaacuterio Como em todas as ceacutelulas eucarioacuteticas a mitococircndria dos
tripanosomatiacutedeos tambeacutem apresenta DNA mitocondrial tambeacutem conhecido como
kDNA ou DNA do cinetoplasto que se concentra em uma determinada regiatildeo da
mitococircndria localizada logo abaixo do corpuacutesculo basal dando origem a uma
estrutura intramitocondrial chamada de cinetoplasto O cinetoplasto abriga o kDNA
o qual eacute constituiacutedo por moleacuteculas circulares que se encontram interligadas
formando uma extensa rede entre si (SHLOMAI 1994)
Distribuiacutedos pelo citoplasma estatildeo os glicossomos um tipo especializado de
peroxissomo Estes acumulam enzimas da via glicoliacutetica envolvidas na conversatildeo
24
da glicose a 3-fosfoglicerato que em outros organismos localizam-se no citoplasma
(HANNAERT et al 2003)
Outra particularidade dos tripanossomatiacutedeos estaacute na estocagem intracelular
de caacutelcio Este iacuteon importante nos processos de sinalizaccedilatildeo celular eacute estocado em
organelas denominadas acidocalcissomos Os acidocalcissomos provavelmente
estatildeo envolvidos em diversos processos bioloacutegicos tais como o armazenamento de
caacutelcio e polifosfatos adaptaccedilatildeo dos tripanosomatiacutedeos a condiccedilotildees de estresse
ambiental manutenccedilatildeo do pH intracelular e osmorregulaccedilatildeo (revisto por DOCAMPO
et al 2005)
14 O genoma de T cruzi
No ano de 2005 foi concluiacuteda a montagem do genoma do T cruzi (EL-
SAYED et al 2005) A cepa CL Brener foi a escolhida para o sequenciamento por
ser bem caracterizada bioquiacutemica e parasitologicamente (ZINGALES et al 1997) e
por ser considerada representativa para o universo de cepas circulantes de T cruzi
Com base na montagem do sequenciamento o genoma diploacuteide do parasita foi
calculado como sendo de 1064 1107 Mb com cada haploacutetipo contendo cerca de
12000 genes sendo que mais de 50 do genoma constituiu-se de sequecircncias
repetitivas compostas por famiacutelias de proteiacutenas de superfiacutecie retrotransposons e
elementos subtelomeacutericos (EL-SAYED et al 2005)
A comparaccedilatildeo das estruturas genocircmicas e proteiacutenas preditas obtidas a
partir do sequenciamento de Trypanosoma cruzi com as de Leishmania major e
Trypanosoma brucei indica mais similaridade entre T cruzi e T brucei uma grande
conservaccedilatildeo entre os respectivos proteomas (exceto para antiacutegenos de superfiacutecie) e
uma sintenia bastante conservada entre os trecircs tripanosomatiacutedeos apesar da
divergecircncia haacute 200-500 milhotildees de anos atraacutes (BERRIMAN et al 2005 EL SAYED
et al 2005 IVENS et al 2005)
Os tripanosomatiacutedeos possuem aleacutem do genoma nuclear um grande
genoma mitocondrial (kDNA) que tem sido extensivamente estudado sendo uacutenico
em estrutura funccedilatildeo e mecanismo de replicaccedilatildeo O kDNA eacute formado por milhares de
moleacuteculas circulares topologicamente relaxadas e interligadas umas as outras Este
arranjo conteacutem aproximadamente 20 - 30 do DNA total dos tripanosomatiacutedeos e eacute
composto por 2 tipos de moleacuteculas circulares os maxiciacuterculos e os miniciacuterculos Os
25
maxiciacuterculos apresentam um tamanho entre 22-37 kb e conteacutem basicamente os
genes codificadores de proteiacutenas envolvidas na fosforilaccedilatildeo oxidativa e RNA
ribossocircmico Os miniciacuterculos com um tamanho que varia de espeacutecie para espeacutecie
(05 a 25 kb) conteacutem os genes que codificam os RNAs guia envolvidos na
editoraccedilatildeo do RNA (STUART et al 1989 SHAPIRO amp ENGLUND 1995 MADISON-
ANTENUCCI et al 2002 SIMPSON et al 2003 ONN et al 2006 GLUENZ et al
2007)
15 Expressatildeo gecircnica de Tcruzi
T cruzi estaacute sujeito agraves frequentes mudanccedilas de ambientes decorrentes da
passagem por diferentes hospedeiros durante seu ciclo de vida (temperatura pH
quantidade de nutrientes evasatildeo do sistema imune) por esse motivo a expressatildeo
gecircnica deste parasita eacute regulada por diversos fatores A adaptaccedilatildeo raacutepida e eficiente
a estas diferentes condiccedilotildees torna-se uma importante tarefa para o parasita
Como os demais eucariotos o T cruzi apresenta trecircs RNAs polimerases a
RNA polimerase I transcreve os genes para RNAs ribossocircmicos a RNA polimerase
II os genes que codificam proteiacutenas e a RNA polimerase III pequenos RNAs como
o tRNA (RNA de transferecircncia) Nos tripanosomatiacutedeos promotores para as RNA
polimerase I e III jaacute foram identificados poreacutem ainda natildeo foram identificados
promotores para os genes transcritos pela RNA polimerase II com exceccedilatildeo de um
promotor associado ao gene do mini-exon (GILLINGER amp BELLOFATTO 2001
revisto por CAMPBELL et al 2003)
Os genes dos tripanosomatiacutedeos estatildeo organizados em unidades
policistrocircnicas e natildeo apresentam interrupccedilotildees por iacutentrons com exceccedilatildeo do gene da
poli-A polimerase (MAIR et al 2000)
Uma vez que em T cruzi como nos demais eucariotos somente mRNAs
monocistrocircnicos satildeo traduzidos os precursores de mRNA policistrocircnicos devem ser
processados ateacute mRNAs individuais Como caracteriacutestica desta famiacutelia os
transcritos de mRNA satildeo processados por mecanismos de trans-splicing (AGABIAN
1990) e poliadenilaccedilatildeo (LEBOWITZ et al 1993 MATTHEWS et al 1994
VANHAMME amp PAYS 1995)
No processo de trans-splicing as unidades codificadoras satildeo separadas e eacute
adicionada na extremidade 5rsquo uma sequecircncia extremamente conservada espeacutecie-
26
especiacutefica de 39 nucleotiacutedeos denominada sequumlecircncia liacuteder (SL) ou minieacutexon
(McCARTHY-BURKE et al 1989 NILSEN 1992 VANHAMME amp PAYS 1995)
Nesta reaccedilatildeo participam duas moleacuteculas de RNA uma doadora e outra aceptora A
doadora eacute um precursor do mini-exon e em T cruzi possui cerca de 110
nucleotiacutedeos (ZWIERZYNSKI amp BUCK 1991) A aceptora eacute o transcrito derivado da
unidade policistrocircnica ao qual o mini-exon eacute transferido O complexo enzimaacutetico
envolvido nesta reaccedilatildeo eacute semelhante ao descrito para a de cis-splicing (LAIRD
1989)
Os transcritos processados satildeo estabilizados pela estrutura cap 4 do mini-
exon (ULLU amp TSCHUDI 1991) e pela adiccedilatildeo de uma cauda poli-A agrave extremidade
3rsquo sendo que a adiccedilatildeo de ambos os elementos ocorrem em conjunto (LEBOWITZ et
al 1993) Regiotildees ricas em resiacuteduos de pirimidinas aleacutem da sequumlecircncia consenso
(AG) para o trans-splicing regulam a adiccedilatildeo do mini-exon e da cauda poli-A
Deleccedilotildees nestas regiotildees impedem o correto processamento destes transcritos
(MATTHEWS et al 1994)
A ocorrecircncia de transcriccedilatildeo policistrocircnica associada agrave ausecircncia de
promotores para RNA polimerase II e agrave presenccedila de niacuteveis distintos de mRNA
originados de uma mesma unidade policistrocircnica sugerem que a regulaccedilatildeo da
expressatildeo gecircnica nesses protozoaacuterios ocorra a niacutevel poacutes-transcricional baseada
principalmente em mecanismos que controlam a estabilidade e a traduccedilatildeo dos
mRNAs (CLAYTON 2002 BOUCHER et al 2002)
16 O cinetoplasto
O cinetoplasto eacute uma estrutura peculiar presente nos tripanosomatiacutedeos e
encontra-se inserida no interior da mitococircndria uacutenica abrigando fibrilas de DNA
conhecidas como kDNA O nome cinetoplasto (cineto=movimento e plasto=organela)
foi dado pois se acreditava que o mesmo fosse responsaacutevel pelo movimento do
flagelo
17 A rede de kDNA
O DNA do cinetoplasto eacute formado por dois tipos de moleacuteculas circulares os
miniciacuterculos de tamanho entre 05 e 25 kb e os maxiciacuterculos que apresentam
entre 20 e 40 kb Cerca de 10000 miniciacuterculos e 50 maxiciacuterculos se encontram
27
catenados formando uma extensa rede (SHAPIRO amp ENGLUND 1995 DE SOUZA amp
CAVALCANTI 2008) (FIGURA 4)
FIGURA 4 REDE DE kDNA
FONTE ROY CHOWDHURY et al 2010
As primeiras questotildees relacionadas ao arranjo das moleacuteculas na rede do
kDNA dos tripanosomatiacutedeos surgiram na deacutecada de 80 sugerindo que tal
organizaccedilatildeo poderia ter evoluiacutedo como um maneira mais eficaz de armazenar uma
grande quantidade de material em um pequeno espaccedilo (HAJDUK et al 1986)
Os maxiciacuterculos apresentam um tamanho de 22 a 37 kb e assim como o
DNA mitocondrial de outros eucariotos codificam RNAs ribossomais e diversas
proteiacutenas da cadeia respiratoacuteria incluindo subunidades da citocromo oxidase e
NADH desidrogenase (revisto por SHAPIRO amp ENGLUND 1995) Os transcritos dos
maxiciacuterculos satildeo processados poacutes-transcricionalmente para formar mRNAs
funcionais atraveacutes de um processo conhecido como ediccedilatildeo ou editoraccedilatildeo do RNA
A editoraccedilatildeo do RNA consiste na inserccedilatildeo ou retirada de resiacuteduos de uridina em
28
siacutetios especiacuteficos dos RNAs transcritos pelos maxiciacuterculos a fim de criar coacutedons de
iniciaccedilatildeo ou terminaccedilatildeo mudanccedilas na fase de leitura ou quadros abertos de leitura a
partir de sequumlecircncias sem sentido O processo de ediccedilatildeo eacute especificado por
pequenos RNAs guias produzidos pelos miniciacuterculos e maxiciacuterculos e catalisado
por um complexo muiltiproteacuteico o editosomo (revisto por Esteacutevez amp Simpson 1999
Stuart et al 2005) Esse processo constitui uma forma de regular poacutes-
transcricionalmente a expressatildeo de genes mitocondriais nas diferentes formas
evolutivas do parasita
Os miniciacuterculos caracterizam-se por apresentar um tamanho de 05 a 25 kb
e por transcrever os RNAs guia (gRNA) responsaacuteveis pela especificidade da ediccedilatildeo
dos mRNAs codificados pelos maxiciacuterculos por meio de uma sequumlecircncia presente na
porccedilatildeo central desses gRNAs (BENNE 1994 STUART et al 2005) A significacircncia
da variaccedilatildeo em tamanho e organizaccedilatildeo entre as espeacutecies ainda natildeo eacute aparente
contudo a diversidade das sequecircncias dos miniciacuterculos estaacute correlacionada com a
necessidade de mais ou menos ediccedilatildeo de mRNA de cada organismo (STUART
1991) Apesar desta diversidade os miniciacuterculos apresentam pelo menos duas
regiotildees conservadas o dodecacircmero GGGGTTGGTGTA conhecido como sequecircncia
universal dos miniciacuterculos (UMS) e o hexacircmero ACGCCC que correspondem agrave
origem de replicaccedilatildeo da fita L (light) e da fita H (heavy) respectivamente
(BIRKENMEYER amp RAY 1986 BIRKENMEYER et al 1987 RAY 1989 SHLOMAI
1994 HINES amp RAY 2008)
Embora o cinetoplasto de todos os tripanosomatiacutedeos seja formado por
moleacuteculas circulares relaxadas e catenadas diferentes arranjos da rede de kDNA
podem ser observados entre diferentes estaacutegios do ciclo de vida desses
protozoaacuterios como em T cruzi (FIGURA 5) assim como mudanccedilas na posiccedilatildeo do
kDNA satildeo utilizadas para identificar as diferentes formas evolutivas do parasita
(FIGURA 6)
29
FIGURA 5 ndash DIFERENTES ARRANJOS DO CINETOPLASTO DE T cruzi
LEGENDA As fibrilas de kDNA se apresentam bastante compactadas em forma de bastatildeo nas formas amastigotas (A) e epimastigotas (B) enquanto nas formas tripomastigotas a rede de kDNA torna-se menos compacta e a forma em bastatildeo do cinetoplasto daacute lugar a uma forma arredondada (C) FONTE DE SOUZA amp SOUTO-PADRON 1980 e DE SOUZA 1984
Nas formas amastigota (FIGURA 5A) e epimastigota (FIGURA 5B) de T
cruzi as fibrilas de kDNA se apresentam bastante compactadas em forma de
bastatildeo Em tripomastigotas (FIGURA 5C) de T cruzi a rede de kDNA torna-se
menos compacta e a forma em bastatildeo do cinetoplasto daacute lugar a uma forma
arredondada (DE SOUZA 1984) Os vaacuterios graus de compactaccedilatildeo do kDNA em
tripanosomatiacutedeos podem estar relacionados com a accedilatildeo de proteiacutenas que
condensam o DNA como seraacute visto mais adiante
FIGURA 6 MUDANCcedilAS NA POSICcedilAtildeO DO KDNA NOS TRYPANOSOMAS FONTE Modificado de DO CAMPO et al 2005
30
O cinetoplasto de todos os tripanosomatiacutedeos encontra-se localizado
proacuteximo ao corpo basal perpendicularmente ao eixo do flagelo Em alguns
tripanosomatiacutedeos que sofrem diferenciaccedilatildeo ao longo de seu ciclo de vida como o
T cruzi o cinetoplasto muda de posiccedilatildeo dentro da ceacutelula passando da regiatildeo
anterior (nos epimastigotas) para a regiatildeo posterior (nos tripomastigotas) poreacutem
permanecendo proacuteximo e perpendicular ao corpo basal (FIGURA 7) O cinetoplasto
eacute fisicamente conectado ao corpo basal atraveacutes de um grupo de filamentos
citoplasmaacuteticos chamado de complexo de ligaccedilatildeo tripartite (TAC) (OGBADOYI et al
2003) Este complexo eacute responsaacutevel pelo posicionamento espacial do cinetoplasto e
por sua segregaccedilatildeo
FIGURA 7 REPOSICIONAMENTO DO KDNA EM RELACcedilAtildeO AgraveS OUTRAS ORGANELAS DURANTE O CICLO DE VIDA DE UM FLAGELADO LEGENDA A morfologia eacute definida pelas posiccedilotildees do ponto onde emerge o flagelo e a bolsa flagelar (BF) (mostrada em laranja) nuacutecleo (mostrado em azul) e kDNA (mostrado em roxo) FONTE Modificado de FIELD amp CARRINGTON 2009
31
171 Replicaccedilatildeo do kDNA
Nos tripanosomatiacutedeos a replicaccedilatildeo do kDNA eacute restrita a fase S nuclear
(COSGROVE amp SKEEN 1970 WOODWARD amp GULL 1990) diferente do que
acontece na maioria dos eucariotos onde a replicaccedilatildeo do DNA mitocondrial ocorre
ao longo do ciclo celular (LIU et al 2005)
A replicaccedilatildeo dos miniciacuterculos se inicia quando estes satildeo individualmente
decatenados da rede de kDNA pela accedilatildeo de DNA topoisomerases do tipo II pois
estes natildeo se replicam enquanto estatildeo ligados agrave rede e termina quando os
miniciacuterculos retornam para a rede com a ajuda da mesma enzima (SHAPIRO amp
ENGLUND 1995)
Os miniciacuterculos satildeo liberados da rede em direccedilatildeo a zona cinetoflagelar
(KFZ) uma regiatildeo especializada da matriz mitocondrial entre o kDNA e o corpo
basal (FIGURA 8) que abriga proteiacutenas envolvidas com o iniacutecio da replicaccedilatildeo Em
seguida os ciacuterculos migram (ou satildeo transportados) para os poacutelos opostos da rede
de kDNA para completar sua replicaccedilatildeo O iniacutecio da replicaccedilatildeo dos miniciacuterculos na
regiatildeo cinetoflagelar envolve a montagem de um complexo proteacuteico na origem de
replicaccedilatildeo dos ciacuterculos com a participaccedilatildeo da primase polimerase e proteiacutenas que
se ligam agrave sequumlecircncia universal de miniciacuterculos (UMSBP) Estas juntamente com
outras proteiacutenas geram uma forquilha de replicaccedilatildeo que se propaga
unidirecionalmente ao redor do miniciacuterculo formando uma estrutura tipo
intermediaacuteria (LIU et al 2005 GLUENZ et al 2007)
Os miniciacuterculos receacutem-replicados migram da zona KFZ para dois complexos
proteacuteicos situados nos poacutelos diametralmente opostos do cinetoplasto onde os
proacuteximos passos de replicaccedilatildeo iratildeo ocorrer Estes passos incluem remoccedilatildeo dos
primers pela accedilatildeo de endonucleases preenchimento de alguns intervalos entre os
fragmentos de Okazaki pela DNA polimerase e uniatildeo dos cortes (nicks) por uma
DNA ligase Apoacutes estas etapas os novos ciacuterculos sintetizados que ainda possuem
pelo menos uma interrupccedilatildeo em sua sequumlecircncia satildeo reunidos agrave periferia da rede
pela accedilatildeo de topoisomerases II Apoacutes todos miniciacuterculos terem sido replicados os
intervalos satildeo reparados (Revisto por LIU et al 2005 POVELONES 2014)
Pouco se sabe sobre o processo de replicaccedilatildeo dos maxiciacuterculos Assim
como os miniciacuterculos os maxiciacuterculos tambeacutem sofrem replicaccedilatildeo unidirecional que
32
se inicia em uma origem contida na regiatildeo variaacutevel da moleacutecula formando estruturas
tipo- Entretanto ao contraacuterio dos miniciacuterculos eles permanecem ligados agrave rede de
kDNA durante o processo replicativo (revisto por KLINGBEIL et al 2001 Liu et al
2005)
FIGURA 8 REPLICACcedilAtildeO DO kDNA FONTE Modificado de LIU et al 2005
18 Proteiacutenas associadas ao cinetoplasto (KAPs)
Proteiacutenas que se ligam ao DNA tambeacutem foram identificadas na mitococircndria
de uma variedade de organismos eucarioacuteticos variando de levedura ateacute humanos
(MAIER et al 2001) Estas proteiacutenas satildeo codificadas no nuacutecleo da ceacutelula e satildeo poacutes-
traducionalmente importadas para a mitococircndria
Conceitualmente qualquer proteiacutena que se associe ao kDNA quer atuando
na replicaccedilatildeo e transcriccedilatildeo quer atuando na organizaccedilatildeo compactaccedilatildeo e
segregaccedilatildeo da rede pode ser chamada de KAP (KAP do inglecircs Kinetoplast-
33
Associated Protein) Observou-se que algumas dessas KAPs apresentam
caracteriacutesticas de proteiacutenas histonas H1 (H1 histone-like proteins) por serem
proteiacutenas pequenas (17 a 25 kDa) fortemente baacutesicas (pI de 11 a 125) interagindo
com a carga negativa das moleacuteculas de DNA e com grande conteuacutedo dos
aminoaacutecidos lisina e arginina elevado (aprox 30 a 50)
Proteiacutenas associadas com genoma mitochondrial (KAPs) dos
tripanosomatiacutedeos e que compartilham caracteriacutesticas com histonas H1 foram
inicialmente identificadas no cinetoplasto do tripanosomatiacutedeo de inseto Crithidia
fasciculata e denominadas de KAP1 a 5 As H1-KAPs de C fasciculata interagem
com miniciacuterculos (XU et al 1996) e desse modo podem facilitar a associaccedilatildeo
orientaccedilatildeo e organizaccedilatildeo dessas moleacuteculas na rede pela neutralizaccedilatildeo das cargas
negativas das moleacuteculas de DNA contribuindo para a condensaccedilatildeo organizaccedilatildeo e
segregaccedilatildeo da rede de kDNA Ateacute o momento foram caracterizadas quatro H1-KAPs
de C fasciculata (CfKAP1 2 3 and 4) Aleacutem das caracteriacutesticas de histona H1
possuem uma preacute-sequecircncia clivaacutevel de nove aminoaacutecidos em sua porccedilatildeo N-
terminal e que provavelmente estaacute envolvida no transporte da proteiacutena para o
cinetoplasto jaacute que natildeo aparece na proteiacutena madura (XU amp RAY 1993 XU et al
1996 HINES amp RAY 1998) Atraveacutes de ensaios de imunofluorescecircncia foi possiacutevel
confirmar que estas proteiacutenas estatildeo presentes em toda a rede de kDNA Pela
facilidade encontrada nas KAPs purificadas de condensar redes de kDNA in vitro
(XU et al 1996) sugere-se que estas estejam envolvidas na organizaccedilatildeo e
condensaccedilatildeo do kDNA in vivo (LUKES et al 2001)
As teacutecnicas de deleccedilatildeo de genes satildeo uma oacutetima ferramenta para elucidar as
possiacuteveis funccedilotildees que um gene pode apresentar Em C fasciculata foi utilizada a
teacutecnica de nocaute gecircnico para o gene Cfkap1 onde mutantes viaacuteveis foram
obtidos mostrando que a forma e a dimensatildeo do cinetoplasto natildeo foram alterados
ao contraacuterio da organizaccedilatildeo da rede de kDNA que passou a apresentar fibrilas de
DNA espessas e uma camada eleacutetron-densa no centro do disco Quando foi
realizada a reintroduccedilatildeo do gene na forma episomal o fenoacutetipo normal da rede de
kDNA foi restaurado (LUKES et al 2001) Tambeacutem foi realizado o duplo nocaute
dos genes Cfkap2 e Cfkap3 o qual da mesma maneira produziu mutantes viaacuteveis
poreacutem com o crescimento bastante reduzido uma reduccedilatildeo na respiraccedilatildeo e um
aumento nos niacuteveis de mRNAs codificados pelos maxiciacuterculos Apesar de todas
estas alteraccedilotildees o kDNA permaneceu inalterado mostrando que as proteiacutenas
34
CfKAP2 e CfKAP3 desempenham um papel diferente ao da CfKAP1 pois estatildeo
envolvidas com o metabolismo mitocondrial e proliferaccedilatildeo celular ao inveacutes de
estarem envolvidas na organizaccedilatildeo estrutural do kDNA (AVLIYAKULOV et al
2004)
Com base nesses estudos surgiu o interesse de nosso grupo no estudo de
KAPs em T cruzi visando verificar qual o papel dessas proteiacutenas na organizaccedilatildeo da
rede de kDNA e sua importacircncia nos diferentes estaacutegios do ciclo de vida do parasita
Atraveacutes de anaacutelises bioinformaacuteticas foram identificadas 6 diferentes H1-KAPs
codificadas no genoma do T cruzi levando em consideraccedilatildeo a similaridade com
KAPs de C fasciculata (CAVALCANTI et al 2009) Essas H1-KAPs foram
denominadas de KAP3 KAP4a KAP4b KAP4c KAP6 e KAP7 Nosso grupo iniciou
a caracterizaccedilatildeo das proteiacutenas TcKAP4 e TcKAP6 mostrando que elas se localizam
no cinetoplasto mas com padrotildees distintos de distribuiccedilatildeo dependendo da forma do
ciclo de vida do parasita (CAVALCANTI et al 2009) Mais recentemente mostramos
que o nocaute da TcKAP3 natildeo afeta a proliferaccedilatildeo diferenciaccedilatildeo e infectividade do
parasita (DE SOUZA et al 2010)
A complexidade da rede de kDNA sugere portanto que as diferentes KAPs
atuem em conjunto algumas vezes de modo redundante para desempenhar
funccedilotildees na condensaccedilatildeo replicaccedilatildeo segregaccedilatildeo dessa estrutura
35
2 OBJETIVOS
21 OBJETIVO GERAL
O objetivo principal deste trabalho eacute caracterizar a funccedilatildeo da TcKAP7 avaliando seu
papel na biologia do parasita
211 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS
a) Analisar a localizaccedilatildeo subcelular da TcKAP7 atraveacutes de ensaios de
imunofluorescecircncia
b) Produzir TcKAP7 recombinante em larga escala para ensaios de biologia
estrutural
c) Estudar a viabilidade do parasita na ausecircncia do gene TcKAP7 para os parasitas
viaacuteveis analisar morfologia e ultraestrutura do cinetoplasto multiplicaccedilatildeo
diferenciaccedilatildeo e infectividade
36
3 MATERIAIS E MEacuteTODOS
31 Reagentes e Soluccedilotildees Utilizados
311 Reagentes
AmershamBioscience dNTPs Hybond C Hybond N kit ECL de western blotting
filmes de raio-X Hyperfilmreg anticorpo monoclonal anti-Histidina
Bio-Rad Acrilamida Agarose (UltraPure DNA grade) Azul de Bromofenol Bis-
Acrilamida Persulfato de Amocircnia
Cult-lab RPMI 1640
Difco Baacutecto-Aacutegar Bactotriptona Extrato de levedura Infuso de fiacutegado Triptose
Invitrogen Inc EDTA Fenol TRIS Nick Translation kit Taq DNA polymerase
IPTG Agarose X-Gal DNA de λHindIII Marcador de massa molecular Benchmark
Alexa Fluacuteor 458 1 kb Plus DNA Ladder Soro Fetal Bovino T4 DNA ligase
Merck Acetato de Soacutedio Aacutecido Aceacutetico Glacial Cloreto de CaacutelcioCloreto de
Potaacutessio Cloreto de Soacutedio Etanol Absoluto Glicina Glicose Hidroacutexido de soacutedio
Isopropanol HCl Na2HPO4
New England Biolabs Endonucleases de restriccedilatildeo
Qiagen Qiaquick PCR Purification kit
Serva Electrophoresis Alu-Gel S
Sigma Acetato de amocircnia Ampicilina Brometo de Etiacutedeo BSA Kanamicina
Glicerol Hepes Cloreto de Magneacutesio Tetraciclina β-mercaptoetanol DEAE-
celulose Tween 20 adjuvante completo de Freund monoclonal M2 anti-FLAG
312 Tampotildees e Soluccedilotildees
PBS NaCl 137 mM KCl 27 mM Na2HPO4 43 mM e KH2PO4 15 mM
PSG Na2HPO4 (anidro) 4747 mM NaH2PO4 H2O 25 mM NaCl 3676 mM e
glicose 555 mM
Soluccedilatildeo de tripsinazaccedilatildeo tripsina 005 (mv) e EDTA 002 (mv) em PBS pH
80
37
Soluccedilatildeo de bloqueio para imunofluorescecircncia PBS e BSA 1 (albumina seacuterica
bovina)
Soluccedilatildeo de bloqueio para western blot TBST e leite em poacute desnatado 5
Soluccedilatildeo de lise para Toothpick NaOH 50 mM Glicerol 5 SDS 05 EDTA 5
mM e azul de bromofenol 0025
Soluccedilatildeo Ponceau S Ponceau S 05 em aacutecido aceacutetico 1
Soluccedilatildeo de coloraccedilatildeo para geacuteis de proteiacutena Coomassie blue R-250 01 em
metanolaacutecido aceacutetico (4510)
Soluccedilatildeo para descoloraccedilatildeo de geacuteis de proteiacutena Metanol 4 aacutecido aceacutetico 75
Tampatildeo de lise hipotocircnico Tris-HCl 10mM pH 75 NaCl 10mM MgCl2 5 mM β-
mercaptoetanol 5 mM
Tampatildeo A para cromatografia de afinidade Tris-HCl 20 mM pH 75 NaCl 500 mM
Tampatildeo B para cromatografia de afinidade Tampatildeo A contendo imidazol 1M
Tampatildeo B para cromatografia de troca iocircnica Tris-HCl 50 mM pH 80 NaCl 1M
Soluccedilatildeo de depurinaccedilatildeo para Southern blot HCl 025 M
Soluccedilatildeo desnaturante para Southern blot NaOH 05 M e NaCl 15 M
Soluccedilatildeo neutralizante para Southern blot Tris-HCl 05 M pH 75 e NaCl 15 M
Soluccedilatildeo Denhardt (50X) ficoll 05 polivinilpirrolidona 06 e albumina de soro
bovino 02
Soluccedilatildeo de hibridaccedilatildeo para Southern blot DNA de esperma de salmatildeo do tipo III
01 mgml fragmentado por ultra-som e desnaturado SSC 6X soluccedilatildeo de denhardt
6X e SDS 1
SSC 20X NaCl 3 M pH 70 e citrato de soacutedio 03 M
Soluccedilatildeo de baixa estringecircncia SSC 2X e SDS 01
Soluccedilatildeo de meacutedia estringecircncia SSC 1X e SDS 01
Soluccedilatildeo de alta estringecircncia SSC 01X e SDS 01
Tampatildeo de eletroporaccedilatildeo para T cruzi NaCl 140 mM HEPES (aacutecido) 25 mM e
Na2HPO4 074 mM pH 75
Tampatildeo ZPFM de eletroporaccedilatildeo de T brucei NaCl 129 mM KH2PO4 15mM KCl
8mM NaH2PO4 8mM MgCl2 15mM CaCl2 90 mM e CH3COONa 24 mM pH 70
Tampatildeo TELT Tris-HCl 50 mM pH 80 EDTA 625 mM pH 90 LiCl 25 M e Triton
X-100 4
Tampatildeo de amostra para DNA 10X Ficoll 400 25 azul de bromofenol 025 e
xileno cianol FF 025
38
Tampatildeo de amostra para proteiacutena 4X Tris-HCl 40 mM pH 68 SDS 1 β-
mercaptoetanol 25 glicerol 6 e azul de bromofenol 0005
Tampatildeo de eletroforese para SDS-PAGE 1X Tris-base 25 mM glicina 192 mM e
SDS 01
Tampatildeo de lise de bacteacuterias Tris-HCl 20 mM pH 75 NaCl 500 mM PMSF1 mM
Tampatildeo para transferecircncia (western blotting) 1X Tris-base 25 mM glicina 192
mM e metanol 20
Tampatildeo TBE Tris base 89 mM aacutecido boacuterico 89 mM e EDTA 2 mM
TBS Tris-HCl 20 mM pH 80 e NaCl 150 mM
TBST TBS e Tween 20 01
TE Tris-HCl 10 mM pH 80 e EDTA 1 mM
313 Meios de cultura
LB Triptona 1 extrato de levedura 5 e NaCl 1
Meio LIT (liver infusion tryptose) infuso de fiacutegado 05 NaCl 753 mM KCl 54
mM glicose 10 mM bacto-triptose 05 Na2HPO4 564 mM hemina 00025 soro
fetal bovino 10 e extrato de levedura 15 gl
Meio TAU NaCl 190 mM KCl 17 mM MgCl2 2 mM CaCl2 2 mM e tampatildeo fosfato 8
mM pH 60
Meio TAU3AAG meio TAU suplementado com L-prolina 10 mM glutamato soacutedico
50 mM aspartato soacutedico 2 mM e glicose 10 mM
32 Cultivo do Trypanosoma cruzi
Neste trabalho foi utilizado o clone Dm28c de T cruzi (CONTRERAS et al
1985 CONTRERAS et al 1988) nas formas epimastigota e tripomastigota
metaciacuteclico
321 Epimastigotas
Formas epimastigotas de T cruzi foram cultivadas em meio LIT (CAMARGO
1964) a 28 oC com passagens a cada trecircs dias e inoacuteculo de 1 x 106 ceacutelulasml As
formas epimastigotas foram coletadas por centrifugaccedilatildeo no terceiro dia de cultivo
39
(correspondente a fase logariacutetmica de crescimento baseada em curva de
crescimento realizada nas mesmas condiccedilotildees) quando a densidade celular
apresentava-se entre de 1 - 3 x 107 ceacutelulasml
322 Tripomastigotas metaciacuteclicos
As formas metaciacuteclicas foram obtidas atraveacutes do processo de diferenciaccedilatildeo
in vitro (BONALDO et al 1988) Formas epimastigotas em final de fase logariacutetmica
de crescimento (densidade celular entre 5 - 7 x 107 ceacutelulasml) foram coletadas por
centrifugaccedilatildeo a 7000 x g por 5 minutos a 10 oC e ressuspendidas em meio TAU
na concentraccedilatildeo de 5 x 108 ceacutelulasml e mantidas a 28 oC por 2 horas Apoacutes este
periacuteodo correspondente ao estresse nutricional as ceacutelulas foram transferidas para
garrafas de 300 cm2 contendo 200 ml de meio TAU3AAG (concentraccedilatildeo final de 5 x
106 ceacutelulasml) Uma proporccedilatildeo dos parasitas que se aderiram agrave superfiacutecie da
garrafa de cultivo se diferenciou em metaciacuteclicos os quais foram liberados no
sobrenadante (BONALDO et al 1988) Estas formas foram purificadas pela
passagem atraveacutes de uma coluna de afinidade contendo a resina DEAE celulose
equilibrada em PSG (SOUSA 1983) Este procedimento foi realizado com o tipo
selvagem para obtenccedilatildeo de extrato proteacuteico e tambeacutem com o mutante de T cruzi
para TcKAP7 para verificaccedilatildeo da capacidade de diferenciaccedilatildeo e infectividade onde
o nuacutemero de metaciacuteclicos no sobrenadante foi contado apoacutes 24 48 72 e 96 horas
da incubaccedilatildeo em meio TAU3AAG
33 Curva de crescimento de T cruzi
Formas epimastigotas de T cruzi clone Dm28c e do mutante de T cruzi para
TcKAP7 foram cultivadas como descrito no item 321 ateacute atingirem a fase
estacionaacuteria para a comparaccedilatildeo da taxa de crescimento de ambas Foram
inoculadas 1 x 106 epimastigotas por ml de meio LIT em garrafas de 25 cm2 e
incubadas em seguida a 28 degC Diariamente foi realizada a contagem das culturas
em cacircmaras de Neubauer em diluiccedilotildees apropriadas ateacute o deacutecimo dia O graacutefico da
curva de crescimento comparativa entre a cultura selvagem e a nocaute foi feito
utilizando o programa Microsoft Excel
40
34 Obtenccedilatildeo de DNA de T cruzi
A extraccedilatildeo de DNA foi realizada conforme descrito por Medina-Acosta amp
Cross (1993) Epimastigotas (1 x 107 ceacutelulas) foram coletadas por centrifugaccedilatildeo a
7000 x g por 5 min lavadas em PBS e ressuspendidas em 350 microl de tampatildeo TELT
Apoacutes 5 min de incubaccedilatildeo agrave temperatura ambiente foi adicionado agrave amostra 1
volume de fenolclorofoacutermio e o material foi centrifugado a 13000 x g por 5 min A
fase aquosa foi recolhida e o DNA foi precipitado com 2 volumes de etanol absoluto
e coletado por centrifugaccedilatildeo a 13000 x g por 10 min O DNA presente no sedimento
foi lavado com etanol 70 seco e em seguida ressuspendido em tampatildeo TE
contendo RNAse a 20 microgml
35 Obtenccedilatildeo de kDNA de T cruzi
A extraccedilatildeo do kDNA de T cruzi foi realizada de acordo com Morel e
colaboradores (1980) com modificaccedilotildees
Formas epimastigotas (1 x109 ceacutelulas) foram coletadas por centrifugaccedilatildeo a
4000 x g por 10 min lavadas em PBS e ressuspendidas em 20 ml de Tampatildeo de
Lise Hipotocircnico Posteriormente adicionou-se Sacarose 025 M e o material foi
centrifugado 6000 x g por 10 min O pellet foi ressuspendido em 20 ml de Tris-HCl
10 mM pH 75 NaCl 10 Mm EDTA 5 mM SDS 05 A esta soluccedilatildeo foi adicionado
100 ug de proteinase K e a mesma permaneceu a 37 ordmC durante a noite No dia
seguinte as ceacutelulas foram transferidas para uma seringa de 50 ml aonde ocorreu a
quebra mecacircnica do DNA nuclear Este material foi ultracentrifugado a 27000 rpm a
4ordm C durante 1 hora utilizando o rotor SW28 Apoacutes centrifugaccedilatildeo o sobrenadante foi
desprezado e o pellet ressuspendido em 25 ml de TE e novamente ultracentrifugado
nas mesmas condiccedilotildees Apoacutes centrifugaccedilatildeo o pellet foi ressuspendido em 1ml de TE
e foi realizada a purificaccedilatildeo por fenolclorofoacutermio Apoacutes purificaccedilatildeo o material foi
ressuspendido em 300 ul de TE e utilizado para ensaios de SAXS
36 Obtenccedilatildeo de extrato proteico de T cruzi
41
As ceacutelulas foram coletadas por centrifugaccedilatildeo (4000 x g 5 min a 10 degC) e
lavadas duas vezes em PBS pH 75 Apoacutes as lavagens os parasitas foram
ressuspendidos em PBS e tampatildeo de amostra 4x foi adicionado de tal maneira que
a concentraccedilatildeo final fosse de 1 x 106 ceacutelulas equivalentesmicrol Os extratos foram
fervidos por 5 min e armazenados a - 70 degC
37 Clonagem do gene TcKAP7
A sequecircncia do gene TcKAP7 (ID Tc00104705350871950) foi obtida a
partir do banco de dados do genoma do T cruzi disponiacutevel no portal da internet
wwwgenedborg e a sua regiatildeo codificante foi amplificada por PCR com os primers
KAP7F (5rsquo ndash AAAGGATCCATGCTAAGAACTGTTCTGCCACTG 3rsquo) e KAP7R (5rsquo ndash
TCAGCGTCGACTTATGACGGTGGTGCAGGATCAGCAGCTGCAGTATTTT3rsquo) a
partir do DNA genocircmico de T cruzi Dm28c As sequecircncias de reconhecimento das
enzimas de restriccedilatildeo BamHI e SalI (marcadas em negrito) foram adicionadas na
extremidade 5rsquo dos primers KAP7F e KAP7R respectivamente As condiccedilotildees da
reaccedilatildeo de PCR foram as seguintes 100 ng de DNA total T cruzi 10 pmol de cada
primer 200 μM de cada dNTP MgCl2 15 mM tampatildeo Taq DNA polimerase 1x 25
U de Taq DNA polimerase (Invitrogen) A reaccedilatildeo de PCR foi processada no
termociclador modelo 9700 (Applied Biosystems EUA) com a desnaturaccedilatildeo do
material por 4 min a 94 degC seguida de 30 ciclos constando de desnaturaccedilatildeo a 94 degC
por 30 s hibridizaccedilatildeo dos primers a 58 degC por 30 s e extensatildeo a 72 degC por 1 min O
material amplificado foi purificado usando o kit Qiaquick PCR Purification (Qiagen) e
digerido com as enzimas de restriccedilatildeo BamHI e SalI com uso de 20 U de cada
enzima e seus respectivos tampotildees em volume final de 20 μl por 4 h a 37 oC O
material foi novamente purificado e utilizado para ligaccedilatildeo com o vetor pET28a
previamente digerido com as respectivas enzimas Bacteacuterias E coli cepa DH5α
foram transformadas com a ligaccedilatildeo A seleccedilatildeo dos clones contendo plasmiacutedeo com
o inserto desejado foi realizada atraveacutes da teacutecnica de palitagem ou de PCR de
colocircnia
38 Obtenccedilatildeo do cDNA de TcKAP7 atraveacutes de ensaio de RT-PCR
42
Com o intuito de verificar a posiccedilatildeo do mini-exon no transcrito de TcKAP7
realizamos o ensaio de RT-PCR para a obtenccedilatildeo do cDNA de TcKAP7
O protocolo utilizado foi baseado no manual teacutecnico da Promega (ΙmProm-ΙΙ
Reverse Transcription System) assim como os reagentes utilizados para essa
reaccedilatildeo Aproximadamente 10 μg de RNA foram incubados com o oligonucleotiacutedeo
KAP7R por 10 min a 70 degC e imediatamente transferidos para o gelo Agrave mistura foi
adicionada uma soluccedilatildeo de dNTPs (concentraccedilatildeo final de 05 mM para cada dNTP)
MgCl2 (120 μM) RNAse OUT (2 unidades) (Invitrogen) Transcriptase reversa
ImProm-II e respectivo tampatildeo A reaccedilatildeo foi incubada por 2 h a 42 degC As amostras
de cDNA foram purificadas por Microcon YM-30 (Millipore) conforme descriccedilatildeo do
fabricante e armazenadas a -20 degC Posteriormente foi realizada uma reaccedilatildeo de
PCR utilizando as seguintes condiccedilotildees 10 ng do cDNA de TcKAP7 de T cruzi 10
pmol do primer ME (5rsquo-AACGCTATTATTGATACAGTTTCTGTACTATATTG -3rsquo) e 10
pmol do primer KAP7R 200 μM de cada dNTP MgCl2 15 mM tampatildeo Taq DNA
polimerase 1x 25 U de Taq DNA polimerase (Invitrogen) A reaccedilatildeo de PCR foi
processada no termociclador modelo 9700 (Applied Biosystems EUA) com a
desnaturaccedilatildeo do material por 3 min a 94 degC seguida de 35 ciclos constando de
desnaturaccedilatildeo a 94 degC por 30 s hibridizaccedilatildeo dos primers a 55 degC por 30 s e extensatildeo
a 72 degC por 1 min O material amplificado foi purificado usando o kit Qiaquick PCR
Purification (Qiagen) e clonado diretamente no vetor pGEMreg-T Easy (Promega)
Bacteacuterias E coli cepa TOP10Frsquo foram transformadas com a ligaccedilatildeo e os plasmiacutedeos
recombinantes foram selecionados pela teacutecnica da palitagem ou de PCR de colocircnia
(itens 391 e 392) Apoacutes a minipreparaccedilatildeo (item 310) o material foi submetido ao
sequenciamento de DNA usando o serviccedilo de sequenciamento da empresa
Macrogen (Coreacuteia do Sul)
39 Seleccedilatildeo dos clones recombinantes
391 Teacutecnica de palitagem (toothpick)
As colocircnias foram coletadas com o auxiacutelio de palitos de dente (toothpick)
esteacutereis e transferidas para o fundo de tubos de micro-centriacutefuga e para a superfiacutecie
do meio LB solidificado (com o antibioacutetico de seleccedilatildeo do plasmiacutedeo) para a obtenccedilatildeo
de uma reacuteplica das colocircnias que foram analisadas (placa-matildee) A cada um dos
43
tubos foram acrescentados 15 μl do tampatildeo de lise Os tubos foram incubados em
banho-maria a 65 degC por 10 min As amostras entatildeo foram analisadas por
eletroforese em gel de agarose 1 usando o plasmiacutedeo sem inserto como controle
Posteriormente o gel foi corado com brometo de etiacutedeo (05 μgml) por
aproximadamente 20 min lavado com aacutegua e analisado sob luz ultravioleta para em
seguida ser fotografado no sistema de fotodocumentaccedilatildeo L-Pix (Locus
Biotecnologia Brasil)
392 Teacutecnica de PCR de colocircnia
Depois de selecionadas as colocircnias foram transferidas para tubos de PCR
contendo os reagentes da PCR e os primers que hibridizam com regiotildees que
flanqueiam o fragmento de DNA clonado em um volume total de 10 microl As amostras
foram incubadas a 94 degC por 3 min e submetidas a 35 ciclos de PCR com as
seguintes etapas 94 degC por 30 s 55 degC por 30 s e 72 degC por 1 min finalizando com
uma etapa de extensatildeo a 72 degC por 10 min Os produtos amplificados foram
analisados em gel de agarose 1 Posteriormente o gel foi corado com brometo de
etiacutedeo (05 microgml) por aproximadamente 20 min lavado com aacutegua e analisado sob
luz ultravioleta O gel foi fotografado no sistema de foto-documentaccedilatildeo L-Pix (Locus
Biotecnologia Brasil)
310 Preparaccedilatildeo de plasmiacutedeo em pequena escala (miniprep)
Os clones recombinantes foram cultivados em 3 ml de meio LB contendo o
antibioacutetico apropriado durante 18 h As culturas foram entatildeo centrifugadas a 12000
x g por 1min a temperatura ambiente e os plasmiacutedeos recombinantes purificados
com o sistema de minipreparaccedilatildeo de plasmiacutedeo (Miniprep Qiagen Kit) (QIAGEN) de
acordo com as recomendaccedilotildees do fabricante
311 Expressatildeo da proteiacutena TcKAP7 em E coli
Para expressar a proteiacutena recombinante TcKAP7 E coli cepa
BL21(DE3)STAR transformada com o plasmiacutedeo pET28a contendo o gene TcKPA7
(pET28a-TcKAP7) foi cultivada em meio LB contendo 25 μgml do antibioacutetico
44
kanamicina a 37 ordmC sob agitaccedilatildeo (preacute-inoacuteculo) Apoacutes 18 horas de crescimento uma
diluiccedilatildeo (110) foi realizada em novos tubos contendo meio LB-kanamicina e a
cultura foi incubada por 1 h a 37 ordmC sob agitaccedilatildeo constante Apoacutes este periacuteodo 05
mM IPTG (isopropil-1-tio-β-D-galactopiranosideo) foi adicionado agraves culturas A
incubaccedilatildeo prosseguiu por mais 3 h nas mesmas condiccedilotildees Como controle negativo
as ceacutelulas tambeacutem foram cultivadas nas mesmas condiccedilotildees poreacutem sem a adiccedilatildeo de
IPTG (cultura natildeo induzida) Aliacutequotas das culturas induzidas e natildeo induzidas com
IPTG foram processadas para anaacutelise em SDS-PAGE
312 Purificaccedilatildeo da proteiacutena recombinante TcKAP7
3121 Processamento da amostra
As bacteacuterias apoacutes a expressatildeo de TcKAP7 foram sedimentadas por
centrifugaccedilatildeo e ressuspendidas em tampatildeo de lise e lisadas utilizando o
microfluidificador modelo M-110L (Microfluidics EUA) Este meacutetodo divide a amostra
em dois fluxos e os conduz sob alta pressatildeo gerada por uma vaacutelvula pneumaacutetica
para uma cacircmara de interaccedilatildeo tambeacutem chamada de aacuterea de choque Esta cacircmara
eacute formada por um sistema de micro-canais dentro de um bloco de ceracircmica Dentro
da cacircmara ocorre cavitaccedilatildeo sonicaccedilatildeo e impacto dos dois fluxos em que a amostra
foi dividida levando a lise das ceacutelulas bacterianas (FIGURA 9) Este processo
provoca o aumento da temperatura e todo o sistema de tubos que conduz a amostra
necessita ser refrigerado com gelo e aacutegua a 4degC para prevenir a precipitaccedilatildeo de
proteiacutenas soluacuteveis
45
FIGURA 9 - REPRESENTACcedilAtildeO ESQUEMAacuteTICA DO MICROFLUIDIFICADOR LEGENDA A suspensatildeo de bacteacuterias eacute dividida em dois fluxos que se chocam sob alta pressatildeo dentro de micro-canais presentes na cacircmara de interaccedilatildeo da vaacutelvula homogeneizadora Melhores resultados satildeo obtidos aumentando o nuacutemero de ciclos de passagens Seta preenchida direccedilatildeo da amostra Seta pontilhada repetindo o ciclo de passagem FONTE Modificado de MAA amp HSU 1999
Apoacutes a lise o extrato soluacutevel foi obtido apoacutes centrifugaccedilatildeo a 30000 x g por
30 min a 4 degC
3122 Cromatografia de afinidade
Por ser expressa fusionada a uma cauda de seis histidinas a proteiacutena
TcKAP7 pode ser separada dos extratos celulares a partir da utilizaccedilatildeo de resina de
niacutequel da qual posteriormente a proteiacutena seraacute eluiacuteda
A purificaccedilatildeo da proteiacutena TcKPA7 presente no sobrenadante foi realizada
em sistema FPLC (Fast Performance Liquid Chromatography ndash GE Healthcare) com
coluna HiTrap Chelating de 1 mL (GE Healthcare) A coluna foi carregada com
soluccedilatildeo NiSO4 100 mM e equilibrada com tampatildeo A para cromatografia de afinidade
Durante a purificaccedilatildeo foi utilizado um gradiente de 0-100 de tampatildeo B para
cromatografia de afinidade As fraccedilotildees provenientes da cromatografia foram
analisadas atraveacutes de SDS-PAGE
Suspensatildeo de bacteacuterias
Ceacutelulas lisadasBomba de
alta pressatildeo
Micro-canais
Vaacutelvula homogeneizadora
46
3123 Cromatografia de troca iocircnica
Para eliminar contaminantes remanescentes da cromatografia de afinidade
a amostra contendo a proteiacutena de interesse foi submetida a uma segunda etapa
cromatograacutefica cromatografia de troca iocircnica utilizando-se a coluna HiTraptrade SP (GE
Healthcare) no sistema de FPLC (GE Healthcare)
Primeiramente a amostra foi diluiacuteda para reduccedilatildeo da concentraccedilatildeo salina e
a coluna foi lavada com 2 volumes de tampatildeo B para cromatografia de troca iocircnica e
depois com 2 volumes de tampatildeo A utilizado na cromatografia de afinidade O
gradiente de passagem do tampatildeo B foi de 0 a 100 e a proteiacutena TcKAP7 foi
obtida na fraccedilatildeo de material natildeo ligado agrave resina (Flow-through) (FT)
3124 Cromatografia de gel filtraccedilatildeo
Amostras da cromatografia de troca iocircnica que continham a proteiacutena de
interesse foram concentradas atraveacutes de filtraccedilatildeo A soluccedilatildeo foi colocada em filtro
Amicon Ultra MWCO 10000 (Milipore) e centrifugada a 4000 rpm a 4 ordmC O
experimento foi realizado em sistema FPLC (GE Healthcare) com a coluna
Superdex 200 HR 1030 (GE Healthcare) em tampatildeo HEPES 20 mM pH 74 e de
cloreto de soacutedio100 mM
313 Espalhamento Dinacircmico de Luz ndash DLS
O experimento foi realizado em equipamento DynaPro Molecular instrument
a 4 ordmC As amostras foram previamente centrifugadas por 5 minutos a 15000 rpm a
4 ordmC A coleta de dados foi realizada com intervalos de 2 segundos com 100
aquisiccedilotildees Para cada leitura utilizou-se 5 microl de amostra proteica
314 Espectroscopia de dicroiacutesmo circular (CD)
O espectro de CD foi coletado usando espectropolariacutemetro Jasco J-715
(Jasco Corporation Toacutekio Japatildeo) sendo a temperatura mantida a 20 degC atraveacutes de
um Peltie rType Control System PFD425S (JASCO) Todos os dados foram
coletados usando cubeta de quartzo de 1 mm de caminho oacuteptico
47
Mediu-se a elipticidade em graus na regiatildeo do UV distante no intervalo de
comprimento de onda de 260 nm a 200 nm com uma velocidade de 100 nmmin
sendo feitas no total 30 leituras com resposta de 1 segundo em varredura contiacutenua
Os valores obtidos em miligraus foram convertidos para elipticidade molar
por resiacuteduo ([θ]MRW) em miligrauscm2dmol-1 que eacute definida pela equaccedilatildeo (Adler et
al 1973)
Onde θobs eacute a elipsidade observada em graus MRW eacute o peso molecular
meacutedio dos resiacuteduos da proteiacutena d eacute o caminho oacuteptico da cubeta em centiacutemetros e c
eacute a concentraccedilatildeo da proteiacutena em mgmL O MRW eacute calculado dividindo-se o peso
molecular da proteiacutena pelo nuacutemero de resiacuteduos
315 Quantificaccedilatildeo e concentraccedilatildeo
As amostras obtidas a partir da purificaccedilatildeo tiveram a concentraccedilatildeo calculada
utillizando a absorbacircncia mensurada pelo aparelho NanoDrop (Thermo Fisher
Scientific) levando-se em consideraccedilatildeo o coeficiente de extinccedilatildeo e teoacuterico da
proteiacutena obtido a partir do ProtParam (httpusexpasyorgtoolsprotparamhtml) e o
peso molecular da proteiacutena que eacute de cerca de 28 kDa
Obtidas as concentraccedilotildees a amostra foi concentrada pelo meacutetodo de
filtraccedilatildeo utilizando o filtro Amiconreg Ultra Centrifugal Filter (Millipore) com poro de
10000 Da A amostra foi centrifugada ateacute a obtenccedilatildeo de uma concentraccedilatildeo final de
5 mgml para os ensaios de cristalizaccedilatildeo Uma aliacutequota da proteiacutena concentrada foi
utilizada para anaacutelise por SDS-PAGE
316 Ensaios de Cristalizaccedilatildeo
Os ensaios de cristalizaccedilatildeo foram realizados empregando-se a teacutecnica de
difusatildeo de vapor em gota sentada utilizando-se os equipamentos disponiacuteveis no
Laboratoacuterio Robotizado de Cristalizaccedilatildeo de Proteiacutenas LNBio Os ensaios foram
feitos em placas de 96 poccedilos e as gotas preparadas pelo robocirc Honeybee
utilizando-se os kits disponiacuteveis no laboratoacuterio Crystal Screen HT (Hampton
Research) JCSG+ Suite (Molecular Dimensions) PACT Suite (Molecular
cd
MRWobs
10][
48
Dimensions) Precipitant Synergy (Rigaku Reagents) SaltRx HT (Hampton
Research) Wizard IampII (Rigaku Reagents)
317 Espalhamento de raio-X a baixo acircngulo (SAXS)
Atraveacutes da teacutecnica de SAXS informaccedilotildees sobre a massa molecular das
partiacuteculas espalhadoras e do raio de giro (Rg) da proteiacutena de estudo satildeo obtidos a
partir dos dados coletados Por meio de programas computacionais como DAMMIN
(SVERGUN1999) e GASBOR (SVERGUN et al 2001) um modelo de baixa
resoluccedilatildeo da forma da proteiacutena pode ser obtido
Os dados de SAXS foram obtidos na linha de luz D02A ndash SAXS2 no
Laboratoacuterio Nacional de Luz Siacutencrotron (LNLS) Campinas-SP Brasil usando
comprimento de onda de 148 A e um detector bidimensional com arranjo CCD
(MARCCD USA) de 165 mm A distacircncia do detector para a amostra foi de 106804
mm e os dados na faixa de 002 nm-1 para 021 nm-1 foram coletados usando
proteiacutena pura nas concentraccedilotildees de 5 mgml em tampatildeo em 20 mM HEPES pH 74
e 100 mM de cloreto de soacutedioExposiccedilotildees de 300 e 600 s foram realizadas e os
dados do tampatildeo foram coletados antes e depois dos dados da amostra para fazer a
correccedilatildeo do solvente e normalizaccedilatildeo do espalhamento
Ajuste dos dados experimentais e avaliaccedilatildeo da funccedilatildeo p(R) foram realizados
utilizando o programa GNOM (SVERGUN 1992) O envelope a baixa resoluccedilatildeo de
TcKAP7 foi determinado usando modelagem abnitio implementada no programa
DAMMIN O modelo a baixa resoluccedilatildeo e o modelo da estrutura tridimensional foram
superpostas usando o programa SUPCOMB (KOZIN amp SVERGUN 2001)
318 Modelagem de TcKAP7
Um modelo da estrutura tridimensional de TcKAP7 foi construiacutedo Para a
construccedilatildeo do modelo foi utilizado o programa MODELLER (SALI amp BLUNDELL
1993) este programa eacute utilizado para a modelagem por homologia a estruturas
tridimensionais de proteiacutenas O programa automaticamente constroacutei um modelo
baseado na anaacutelise de um alinhamento de sequecircncias entre a proteiacutena para a qual
se deseja construir o modelo e uma proteiacutena relacionada cuja estrutura
tridimensional jaacute foi resolvida A qualidade do modelo pode ser avaliada por
49
exemplo atraveacutes de graacuteficos e tabelas que analisam restriccedilotildees quiacutemicas e fiacutesicas de
cada aacutetomo constituinte do modelo
319 Obtenccedilatildeo de antissoro policlonal contra TcKAP7
A proteiacutena TcKPA7 recombinante purificada foi inoculada em camundongos
da linhagem BALBc por via intraperitonial com 4 aplicaccedilotildees de aproximadamente
20-50 μg de antiacutegeno em intervalos de 15 dias seguida de obtenccedilatildeo do soro apoacutes 1
semana da uacuteltima inoculaccedilatildeo O antiacutegeno foi emulsificado em adjuvante completo de
Freund na primeira inoculaccedilatildeo e com adjuvante a base de hidroacutexido de alumiacutenio
(Alu-Gel Serva) nas inoculaccedilotildees posteriores
320 Anaacutelise da expressatildeo do gene TcKAP7 e de seu mutante por ensaio tipo
western blot
Este procedimento foi executado segundo o meacutetodo de Towbin e
colaboradores (1979) Aliacutequotas de extratos de T cruzi equivalentes a 1 x 107
ceacutelulas foram submetidos agrave SDS-PAGE Apoacutes a separaccedilatildeo eletroforeacutetica as
proteiacutenas foram transferidas para membrana de nitrocelulose (Hybond C Amersham
Biosciences) em tampatildeo de western por 2 h a 60 V ou 20 V por 16 h Apoacutes a
transferecircncia a membrana foi corada com Ponceau S e descorada suavemente com
aacutegua bidestilada para a identificaccedilatildeo das bandas do marcador de massa molecular
A membrana foi entatildeo incubada em soluccedilatildeo de bloqueio por 30 min sob agitaccedilatildeo
suave
Apoacutes o bloqueio a membrana foi incubada com os soros policlonais ou
anticorpos monoclonais em TBST-leite por aproximadamente 1 h a 37degC A
membrana foi lavada 5 vezes com TBST Em seguida a membrana foi incubada
com anticorpo secundaacuterio anti-IgG de camundongo conjugado com a enzima
peroxidase (Pierce ndash Thermo Scientific) por 1h na diluiccedilatildeo de 16000 em TBST-leite
a temperatura ambiente A membrana foi submetida a mais cinco lavagens com
TBST e a reaccedilatildeo era evidenciada utilizando substrato quimioluminescente (West
Pico Pierce ndash ThermoScientific) sobre a membrana a qual era exposta a um filme
para raios-X (Hyperfilm ECL GE)
50
321 Superexpressatildeo de TcKAP7
3211 Amplificaccedilatildeo e clonagem do gene TcKAP7 no vetor pNEO3xFlag para
superexpressatildeo da proteiacutena
O gene TcKAP7 foi clonado no vetor pNEO3xFLAG construiacutedo no nosso
laboratoacuterio a partir do vetor pTcGW-ProtCcarboxi (BATISTA et al 2010) que utiliza
o sistema Gateway de clonagem (Invitrogen) Os vetores foram construiacutedos
utilizando-se como base o pBluescript II (Stratagene San Diego USA) onde foram
inseridas trecircs sequencias que codificam para regiotildees intergecircnicas (IR) de T cruzi A
primeira TcUIR eacute a regiatildeo intergecircnica do locus de ubiquitinacalmodulina de T
cruzi (BATISTA et al 2010) As outras duas regiotildees intergecircnicas ITR1 e ITR2 foram
selecionadas a partir de genes de copia uacutenica no genoma e que possuem um niacutevel
de expressatildeo constitutivo nos estaacutegios epimastigota e tripomastigota metaciclicos
avaliados por dados de proteocircmica e RNAseq (Comunicaccedilatildeo pessoal Michel
Batista) Aleacutem disso esse vetor confere agrave regiatildeo C-terminal da proteiacutena
recombinante resultante da clonagem neste vetor trecircs etiquetas FLAG (sequecircncia
DYKDDDDK) em tandem (FIGURA 10)
FIGURA 10 VETOR PARA EXPRESSAtildeO EM T CRUZI P3XFLAG
LEGENDA PR ndash PROMOTOR RIBOSOMAL TCUIR ITR1 E ITR2 - REGIOtildeES INTERGENICAS ATTR1 E ATTR2 ndash REGIOtildeES PARA RECOMBINACcedilAtildeO CMreg - RESISTEcircNCIA A CLORANFENICOL CCDB ndash GENE PARA SELECcedilAtildeO NEGATIVA DURANTE A CLONAGEM 3XFLAG ndash TREcircS ETIQUETAS DE FLAG (DYKDDDDK) NEOMICINA ndash GENE DE RESISTEcircNCIA A NEOMICINA
O gene TcKAP7 foi amplificado utilizando os primers especiacuteficos
KAP7GtwFor (5rsquo-
GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTGCCCGCGAAGTATTCAGCAGCCC)
e KAP7GtwRev (5rsquo-
GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCGTGGTACATGGCGTACGGGTTG)
PR TcUIR Att R1 Cmreg ccdB Att R2 3x Flag ITR1 Neomicina ITR2
51
os quais possuem os siacutetios attB indicados em negrito As condiccedilotildees desta reaccedilatildeo
de PCR foram as seguintes 100 ng de DNA genocircmico de T cruzi 10 pmol de cada
primer 200 μM de cada dNTP MgSO4 2 mM tampatildeo Taq DNA polimerase High
Fidelity 1x 1U de Platinum Taq DNA polimerase high fidelity (Invitrogen) A reaccedilatildeo
de PCR foi processada no termociclador modelo 9700 (AppliedBiosystems EUA)
com a desnaturaccedilatildeo do material por 5 min a 94 degC seguida de 35 ciclos constando
de desnaturaccedilatildeo a 94 degC por 30 s hibridizaccedilatildeo dos primers a 58 degC por 30 s e
extensatildeo a 72 degC por 15 min
O gene amplificado foi clonado no vetor de entrada pDONRtrade221
(Invitrogen) A reaccedilatildeo foi feita com 150 ng dos produtos de PCR contendo os siacutetios
attB 150 ng do plasmiacutedeo pDONRtrade221 1 μL de BP ClonaseTM enzyme mix e TE
para um volume final de 10 μL e com incubaccedilatildeo a 25 degC por 16 h Foi entatildeo
adicionado 1 microL de proteinase K (2 mgmL) com incubaccedilatildeo por 10 min a 37 degC Os
clones em pDONRtrade221 foram transformados em ceacutelulas caacutelcio-competentes E coli
DH5α conforme protocolo de transformaccedilatildeo de ceacutelulas caacutelcio-competentes Apoacutes
transformaccedilatildeo a cultura foi semeada em placa de LBKan (kanamicina 25 microgmL) e
incubada a 37 degC durante 16 h
Para verificar a presenccedila de clones com os insertos de interesse foi feita a
teacutecnica da palitagem As colocircnias selecionadas foram inoculadas em 5 mL de meio
LBKan e incubadas por 16 h a 37 degC com agitaccedilatildeo (190 rpm) A purificaccedilatildeo dos
plasmiacutedeos foi realizada com o kit QIAprepreg Spin Miniprep (Qiagen) conforme
orientaccedilotildees do fabricante
Apoacutes esta etapa foi necessaacuterio transferir os insertos para o vetor de destino
pNEO3xFlag A troca de insertos entre os vetores de entrada e destino denominada
de reaccedilatildeo LR foi realizada conforme orientaccedilotildees do fabricante (Gateway LR clonase
enzyme mix) e ceacutelulas caacutelcio-competentes foram transformadas com os produtos
das recombinaccedilotildees conforme descrito anteriormente semeadas em placas de
LBAmp e incubadas a 37 degC durante 16 h
A verificaccedilatildeo de clones positivos foi realizada atraveacutes de PCR de colocircnias
As colocircnias selecionadas foram inoculadas em 5 mL de meio LB contendo ampicilina
(100 μgmL) e incubada a 37deg C por 16 h sob agitaccedilatildeo (200 rpm)O plasmiacutedeo
contendo o gene TcKAP7 foi denominado de pNEO_KAP7_3xFLAG
52
3212 Transfecccedilatildeo por eletroporaccedilatildeo
A transfecccedilatildeo das formas epimastigotas de T cruzi foi feita pela teacutecnica de
eletroporaccedilatildeo utilizando o equipamento genepulserreg apparatus (Bio-Rad) e cubetas
esteacutereis de eletroporaccedilatildeo gene pulsermicro pulserreg 02 cm (Bio-Rad) Formas
epimastigotas de T cruzi foram cultivadas em meio LIT ateacute uma densidade celular
de 3 x 107 ceacutelulasml Um volume de cultura correspondendo a 1 x 109 parasitas foi
centrifugado (4000 x g 4 degC) O sobrenadante foi descartado e as ceacutelulas foram
ressuspendidas em tampatildeo de eletroporaccedilatildeo esteacuteril e submetidas a centrifugaccedilatildeo
nas condiccedilotildees acima O sedimento celular foi ressuspendido em 2 ml de tampatildeo de
eletroporaccedilatildeo Em cubetas de eletroporaccedilatildeo previamente resfriadas a 4 degC foram
misturados 400 μL (2 x 108 ceacutelulas) da suspensatildeo dos parasitas e 50 μL (20 microg) do
plasmiacutedeo para superexpressatildeo (pNEO_KAP7_3XFLAG) Em paralelo parasitas
foram submetidos agraves mesmas condiccedilotildees mas na ausecircncia de DNA (controle
negativo da transfecccedilatildeo)
As cubetas foram entatildeo mantidas em gelo por 10 min Em seguida os
parasitas foram transfectados com dois pulsos sequenciais de 500 μF e 450 volts
Apoacutes o esse procedimento as cubetas foram mantidas em gelo por mais 5 min A
suspensatildeo de parasitas transfectados foi entatildeo inoculada em 10 mL de meio LIT
suplementado com 10000 U de penicilina e estreptomicina a 10 μgmL
3213 Seleccedilatildeo dos transfectantes
O gene para a enzima neomicina fosfotransferase foi utilizado como
marcador de seleccedilatildeo dos parasitas carregando o plasmiacutedeo para a superexpressatildeo
pNEO_KAP7_3XFLAG Para tanto o antibioacutetico G418 foi adicionado agraves culturas
apoacutes 24 h da transfecccedilatildeo na concentraccedilatildeo final de 500 μgmL Entre 3 e 4 dias apoacutes
a transfecccedilatildeo foi realizada a primeira passagem (14) A partir desse ponto foram
feitas passagens semanais na proporccedilatildeo de 110 ateacute que natildeo fosse observado
crescimento nas duas uacuteltimas passagens da cultura do controle negativo da
transfecccedilatildeo
A expressatildeo da proteiacutena KAP7-FLAG foi analisada atraveacutes de ensaios de
western blot e imunofluorescecircncia
53
322 Deleccedilatildeo do gene TcKAP7 por nocaute gecircnico
3221 Amplificaccedilatildeo e clonagem das regiotildees a montante e a jusante do gene
TcKAP7
As regiotildees a montante (upstream) e a jusante (downstream) do gene TcKAP7
respectivamente denominadas de UPSKAP7 (521 pb) e DOWNKAP7 (500 pb)
foram amplificadas por PCR usando os primers descritos nas TABELAS 1 E 2 A
regiatildeo denominada DOWNKAP7 conteacutem ainda 139 pb do final da regiatildeo codante de
TcKAP7
QUADRO 1 - RELACcedilAtildeO DOS PRIMERS UTILIZADOS PARA A CLONAGEM DA
REGIAtildeO UPSTREAM DE TcKAP7 NO VETOR pNEO1
UPSKAP7F GGGGTCGACCGTTGCTGGTTTTTCTTTTGGTGT
UPSKAP7R GGGAAGCTTGCTTCAAAACGTCTATGCGGGC
Os siacutetios das enzimas de restriccedilatildeo SalI (GTCGAC) e HindIII (AAGCTT) adicionados aos primers estatildeo em negrito
QUADRO 2 - RELACcedilAtildeO DOS PRIMERS UTILIZADOS PARA A CLONAGEM DA
REGIAtildeO DOWNSTREAM DE TcKAP7 NO VETOR pNEO1
DOWNKAP7F GGGGAATTCGCCTCATATGACGCATCTCCCA
DOWNKAP7R GGGGGATCCTGTTGGCGCTGTCAAGGAAGTAAG
Os siacutetios das enzimas de restriccedilatildeo EcoRI (GAATTC) e BamHI (GGATCC) adicionados aos primers estatildeo em negrito
As reaccedilotildees de PCR foram realizadas nas seguintes condiccedilotildees 100 ng de
DNA total de T cruzi Dm28c 10 pmol dos oligonucleotiacutedeos F e R 200 μM de cada
dNTP MgCl2 15 mM tampatildeo Taq DNA polimerase 1x 25 unidades de Taq DNA
polimerase (Invitrogen EUA) A reaccedilatildeo de PCR foi processada no termociclador
modelo 9700 (Applied Biosystems EUA) nas seguintes condiccedilotildees Desnaturaccedilatildeo do
54
material por 4 min a 94 degC seguida de 35 ciclos de desnaturaccedilatildeo a 92 degC por 30 s
hibridizaccedilatildeo dos oligonucleotiacutedeos a 56 degC por 30 s e extensatildeo a 72 degC por 1 min O
material amplificado foi purificado usando o Qiaquick PCR Purification (Qiagen) O
DNA purificado foi digerido com enzimas de restriccedilatildeo apropriadas para a clonagem
dos fragmentos nos vetores pNEO1 O plasmiacutedeo resultante da clonagem das
regiotildees UPSKAP7 e DOWNKAP7 foi denominado de pNEO1kap7 (Figura 11A)
Uma vez que o genoma do T cruzi eacute diploide construiacutemos um segundo
plasmiacutedeo para o nocaute do segundo alelo do gene TcKAP7 tendo como marca de
seleccedilatildeo o gene que codifica resistecircncia a higromicina B Esse plasmiacutedeo foi
construiacutedo usando como molde o plasmiacutedeo pNEO1kap7 O plasmiacutedeo pNEO1kap7
foi digerido com HindIII para remoccedilatildeo do gene neo e uma pequena porccedilatildeo da regiatildeo
DOWNSTREAM (220 pb) O plasmiacutedeo linearizado foi purificado do gel de agarose
usando o kit Qiaquick PCR Purification (Qiagen) e ligado com o gene higro O gene
higro foi amplificado usando os primers HIGROF
(GGGGGAAGCTTATGAAAAAGCCTGAACTCACCGCGAC) e HIGROR
(GGGAAGCTTCTATTCCTTTGCCCTCGGACGAGTGCTG) ambos contendo na
extremidade 5rsquo o siacutetio para a enzima de restriccedilatildeo HindIII (em negrito) O plasmiacutedeo
resultante da ligaccedilatildeo foi denominado de pHIGRO1kap7 (FIGURA 11B)
55
FIGURA 11 ESQUEMA DA CONSTRUCcedilAtildeO DOS VETORES UTILIZADOS PARA O NOCAUTE DO GENE TcKAP7 LEGENDA Nesta figura eacute observada a inserccedilatildeo das sequecircncias flanqueadoras do gene TcKAP7 juntamente com os respectivos siacutetios para cada enzima de restriccedilatildeo nos vetores de clonagem pNEO1 e pHIGRO1
3222 Amplificaccedilatildeo dos cassetes UPS-NEO-DOWN e UPS-HIGRO-DOWN para
transfecccedilatildeo de T cruzi
Os dois plasmiacutedeos recombinantes foram purificados pelo meacutetodo da lise
alcalina utilizando o kit de minipreparaccedilatildeo de plasmiacutedeos (Qiagen) As minipreps
foram utilizadas para a amplificaccedilatildeo da regiatildeo UPS-NEO-DOWN (cassete NEO) e da
regiatildeo UPS-HIGRO-DOWN (cassete HYG) por PCR usando os primers UPSKAP7F
e DOWNKAP7R As reaccedilotildees de PCR foram realizadas nas seguintes condiccedilotildees 20
ng do plasmiacutedeo pNEO1kap7 ou pHIGRO1kap7 10 pmol dos primers UPSKAP7F e
DOWNKAP7R 200 μM de cada dNTP MgCl2 15 mM tampatildeo Taq DNA polimerase
1x 25 unidades de Taq DNA polimerase (Invitrogen EUA) A reaccedilatildeo de PCR foi
processada no termociclador modelo 9700 (AppliedBiosystems EUA) nas seguintes
condiccedilotildees Desnaturaccedilatildeo do material por 4 min a 94 degC seguida de 35 ciclos de
desnaturaccedilatildeo a 92 degC por 30 s hibridizaccedilatildeo dos oligonucleotiacutedeos a 56 degC por 30 s e
56
extensatildeo a 68 degC por 2 min O material amplificado foi submetido agrave eletroforese em
gel preparativo de agarose 1 O gel foi corado com brometo de etiacutedeo (1 μgml) e a
banda correspondente a cada cassete foi removida do gel com auxiacutelio de uma
lacircmina de bisturi O DNA foi purificado por eletroeluiccedilatildeo dentro de saco de diaacutelise
nas condiccedilotildees de 100 V por 1 hora em tampatildeo TBE Para obter massa de DNA
suficiente para a transfecccedilatildeo (20 μg) foram feitas 10 reaccedilotildees de PCR com 100 μl
cada uma
3223 Transfecccedilatildeo do T cruzi com o cassete UPS-NEO-DOWN
Formas epimastigotas de T cruzi foram cultivadas em meio LIT ateacute 2 x 107
ceacutelulasml Os parasitas (1 x 108 ceacutelulas) foram coletados por centrifugaccedilatildeo a 6000
x g por 10 min a 4 degC O sedimento celular foi lavado com PBS esteacuteril e
ressuspendido em 1 ml de soluccedilatildeo de eletroporaccedilatildeo Volumes correspondentes a
04 ml da suspensatildeo de ceacutelulas foram transferidos para cubetas de eletroporaccedilatildeo
esteacutereis (02 cm de gap) (BioRad) e preacute-resfriadas Em uma delas foram adicionados
de 20 μg do fragmento representando o cassete NEO A outra cubeta contendo
apenas a suspensatildeo de parasitas foi usada como controle Apoacutes 10 minutos no gelo
as amostras contidas nas cubetas foram submetidas a 2 pulsos de 450 volts 500
microF utilizando o eletroporadorGenePulserreg IIApparatus (Bio-Rad) As amostras
foram incubadas novamente por 5 a 10 minutos no gelo em seguida foram
transferidas para garrafas de cultura de 25 cm2 contendo 10 ml de meio LIT
(suplementado com 10000 U de penicilina e estreptomicina a 10 mgml) As culturas
foram entatildeo incubadas a 28 degC Apoacutes 24 horas de incubaccedilatildeo adicionou-se o
antibioacutetico G418 na concentraccedilatildeo de 500 μgml As culturas foram mantidas por
sucessivas passagens (diluiccedilatildeo de 110) em meio LIT suplementado com G418 a
cada 8-10 dias ateacute a ausecircncia de proliferaccedilatildeo celular na cultura controle Os
parasitas nos quais TcKAP7 foi substituiacutedo pelo gene neo foram denominados deT
cruzi(kap7kap7neo) e foram testados para a correta inserccedilatildeo do gene neo no locus
genocircmico de TcKAP7
57
3224 Extraccedilatildeo de DNA dos transfectantes
T cruzi transfectado com o cassete NEO (T cruzi(kap7kap7neo) foi cultivado
em meio LIT suplementado com G418 (500 μgml) ateacute uma densidade de 3 x 107
ceacutelulasml Os parasitas foram coletados por centrifugaccedilatildeo por 1 min a 6000 x g e
lavados com PBS Em seguida os parasitas foram lisados gentilmente em 350 μl de
tampatildeo TELT conforme descrito no item 34
3225 Anaacutelise por PCR do DNA dos parasitas transfectados com o cassete
UPS-NEO-DOWN
As reaccedilotildees de PCR foram realizadas utilizando primers externos EXTF
(CCCGCTACGACTGCCCTCCACGCGGAAGGGAA) e EXTR
(AAGTAAACGGGAGAAGCAACACGATGGGAGGCTC) que natildeo estatildeo presentes na
construccedilatildeo do cassete UPS-NEO-DOWN combinados com os primers NEOF
(GGGGAAGCTTATGATTGAACAAGATGGATTGCACGCAG) e NEOR
(GGGGGAATTCAGAAGAACTCGTCAAGAAGGCGATAGAA)
As condiccedilotildees das reaccedilotildees foram as seguintes 100 ng do DNA total de T
cruzi Dm28c tipo selvagem (T cruzi(kap7kap7) ou tipo selvagem) ou do DNA da
populaccedilatildeo T cruzi(kap7kap7neo) (mutante simples nocaute) 10 pmol dos primers EXTF
+ NEOR e NEOF + EXTR 200 μM de cada dNTP MgCl2 15 mM tampatildeo Taq DNA
polimerase 1x 25 unidades de Taq DNA polimerase (Invitrogen EUA) A reaccedilatildeo de
PCR foi processada no termociclador modelo 9700 (AppliedBiosystems EUA) nas
seguintes condiccedilotildees Desnaturaccedilatildeo do material por 4 min a 94 degC seguida de 35
ciclos de desnaturaccedilatildeo a 92 degC por 30 s hibridizaccedilatildeo dos oligonucleotiacutedeos a 55 degC
por 30 s e extensatildeo a 72 degC por 2 min
3226 Transfecccedilatildeo do T cruzi com o cassete UPS-HIGRO-DOWN
Formas epimastigotas da populaccedilatildeo mutante de T cruzi (kap7kap7neo) foram
cultivadas em meio LIT suplementado com G418 (500 μgml) ateacute a densidade de 2 x
107 ceacutelulasml Os parasitas (1 x 108 ceacutelulas) foram coletados por centrifugaccedilatildeo a
6000 x g por 10 min a 4 degC e submetidos ao processo de eletroporaccedilatildeo como
descrito no item 3202 Para a transfecccedilatildeo foram usados 20 μg do fragmento
58
representando o cassete UPS-HIGRO-DOWN As culturas (transfectada e controle)
foram entatildeo incubadas a 28 degC em LIT suplementado de G418 Apoacutes 24 horas de
incubaccedilatildeo foi adicionado o antibioacutetico higromicina ao meio de cultura na
concentraccedilatildeo de 500 μgml As culturas foram mantidas por sucessivas passagens
(diluiccedilatildeo de 110) em meio LIT suplementado com G418 e higromicina a cada 8-10
dias ateacute a ausecircncia de proliferaccedilatildeo celular na cultura controle Mutantes nos quais
os dois alelos de TcKAP7 foram removidos e substituiacutedos pelos genes NEO e
HIGRO foram denominados com genoacutetipo T cruzi (kap7neokap7higro)
3227 Anaacutelise por PCR do DNA dos parasitas transfectados com o cassete
UPS-HIGRO-DOWN
As reaccedilotildees de PCR foram realizadas utilizando primers externos EXTF e
EXTR (item 3225) combinados com os primers HIGROF e HIGROR (item 3221)
As reaccedilotildees de PCR foram realizadas nas seguintes condiccedilotildees 100 ng do
DNA total de T cruzi(kap7kap7) ou do DNA do T cruzi(kap7neokap7higro) 10 pmol dos
primers EXTF + HIGROR e HIGROF + EXTR 200 μM de cada dNTP MgCl2 15
mM tampatildeo Taq DNA polimerase 1x 25 unidades de Taq DNA polimerase
(Invitrogen EUA) A reaccedilatildeo de PCR foi processada no termociclador modelo 9700
(Applied Biosystems EUA) nas seguintes condiccedilotildees Desnaturaccedilatildeo do material por
4 min a 94 degC seguida de 35 ciclos de desnaturaccedilatildeo a 92 degC por 30 s hibridizaccedilatildeo
dos oligonucleotiacutedeos a 55 degC por 30 s e extensatildeo a 72 degC por 2 min
3228 Anaacutelise da organizaccedilatildeo do gene TcKAP7 e da eficiecircncia de seu nocaute
atraveacutes de ensaio do tipo Southern blot
O DNA genocircmico (5 μg) de T cruzikap7kap7 e T cruzikap7neokap7higro foi
submetido a digestatildeo com a enzima de restriccedilatildeo HindIII de acordo com as
especificaccedilotildees do fornecedor Apoacutes 3 horas o DNA digerido foi submetido agrave
eletroforese em gel de agarose 08 em tampatildeo TBE a 100 V O gel foi corado por
brometo de etiacutedio (05 μgmL) e fotografado sob a luz ultravioleta (310 nm)
Posteriormente o gel foi tratado com soluccedilotildees de depurinaccedilatildeo por 15 minutos de
desnaturaccedilatildeo por 30 minutos (2 vezes) e soluccedilatildeo de neutralizaccedilatildeo por 30 minutos (2
vezes) O DNA foi transferido para uma membrana de nylon (Hybond N
59
AmershamBiosciences) por capilaridade (SAMBROOK et al 1989) utilizando-se de
uma ldquoponterdquo de papel 3 MM embebido em SSC 20X Apoacutes a transferecircncia o DNA foi
fixado agrave membrana por exposiccedilatildeo agrave luz ultravioleta com uma dose de 120 mJcm2
usando o aparelho Spectrolinker (Spectronicscorp USA) A membrana contendo o
DNA de T cruzi foi preacute-hibridizada em soluccedilatildeo de hibridizaccedilatildeo de DNA por 1 hora a
65 ordmC seguido da adiccedilatildeo da sonda marcada radioativamente com α-[P32
]-dCTP (10
μCiμl 3000 Cimmol) (Amersham Biosciences) preparada segundo meacutetodo de nick
translation descrito por Rigbyet al (1977) utilizando-se o meacutetodo de iniciaccedilatildeo por
random primers (Megaprimer DNA labeling kit ndash GE) conforme recomendaccedilotildees do
fabricante
Foram utilizadas 3 sondas satildeo elas fragmento do gene TcKAP7
correspondendo a regiatildeo compreendida entre os nucleotiacutedeos 1 e 560 o gene neo e
o gene higro Apoacutes a marcaccedilatildeo as sondas foram purificadas em colunas de
Sephadex G-50 (ProbeQuant ndash Amersham Biosciences) e adicionadas ao tampatildeo de
hibridizaccedilatildeo na concentraccedilatildeo de 5 x 106
cpmml As membranas foram incubadas
por 16 horas a 65 C e em seguida lavadas nesta temperatura duas vezes por 30
minutos com soluccedilotildees de alta meacutedia e baixa estringecircncia As membranas foram
expostas a filme de raio-X (Hyperfilmreg Amersham Biosciences) na presenccedila de tela
intensificadora (Dupont Cronex Lightining Plus) por tempo que varia entre 1 a 3 dias
a ndash70 C
323 Localizaccedilatildeo celular da proteiacutena TcKAP7 atraveacutes de ensaio de
imunofluorescecircncia
Formas epimastigotas de T cruzi foram coletadas por centrifugaccedilatildeo (4000 times
g 3 a 10 ordmC) lavadas duas vezes em PBS e depositadas sobre lacircminas de vidro
previamente tratadas com poli-L-lisina 001 diluiacuteda em PBS Os parasitas foram
entatildeo fixados com paraformaldeiacutedo 4 em PBS permeabilizados com Triton X-100
01 em PBS por 2 min agrave temperatura ambiente e incubados a 4ordmC durante 16 h
em soluccedilatildeo de bloqueio para imunofluorescecircncia (PBS 1X + BSA 1 ) Apoacutes o
bloqueio os parasitas foram incubados agrave temperatura ambiente por 1 h com o
anticorpo monoclonal anti-FLAG em uma diluiccedilatildeo de 11000 em soluccedilatildeo de bloqueio
para imunofluorescecircncia Depois disso as lacircminas foram submetidas a 5 lavagens
60
de 5 min cada em PBS Em seguida os parasitas foram incubados agrave temperatura
ambiente por 1 hora com o anticorpo secundaacuterio anti-IgG de camundongo conjugado
ao fluoroacuteforo Alexa Fluacuteor 488 (Invitrogen) diluiacutedo 1600 em soluccedilatildeo de bloqueio As
lacircminas foram lavadas 5 vezes com PBS e posteriormente incubadas com o corante
Hoechst 33342 (Invitrogen) a 2 μgμL em PBS por 5 min Apoacutes cinco lavagens com
PBS as lacircminas foram montadas com ProLong Gold Antifade (Invitrogen) sobre uma
lacircmina de microscopia oacutetica O material foi observado nos microscoacutepios Leica SP5 e
DMI6000
324 Anaacutelise da ultraestrutura do cinetoplasto do mutante de T cruzi para
TcKAP7 por microscopia eletrocircnica de transmissatildeo
Os parasitas foram coletados lavados com PBS e fixados em soluccedilatildeo
contendo 25 de glutaraldeiacutedo 4 de paraformaldeiacutedo e tampatildeo cacodilato 01 M
Em seguida os parasitas foram fixados por 1 h em soluccedilatildeo de 1 de tetroacutexido de
Oacutesmio e 08 de ferricianeto de potaacutessio diluiacutedos em tampatildeo cacodilato 01 M As
ceacutelulas foram entatildeo desidratadas em soluccedilatildeo contendo concentraccedilotildees crescentes
de acetona e incluiacutedas em Epon Apoacutes a obtenccedilatildeo de cortes ultrafinos dos parasitas
os mesmos foram contrastados em acetato de uranila e citrato de Chumbo antes de
serem observados e fotografados no microscoacutepio eletrocircnico de transmissatildeo Zeiss
900
325 Coloraccedilatildeo dos parasitas transfectados
A coloraccedilatildeo dos parasitas foi realizada pelo meacutetodo panoacutetico raacutepido
(Laborclin Pinhais Paranaacute Brasil) modificado
Formas epimastigotas do mutante de T cruzi para TcKAP7 foram cultivadas
como descrito no item 321 Os parasitas foram coletados por centrifugaccedilatildeo de 1
min a 4000 x g e ressuspensos em PBS Desta suspensatildeo uma gota foi retirada e
depositada sobre lacircminas previamente limpas Quando secas as lacircminas foram
imersas individualmente na Soluccedilatildeo 1 (Fixador) Soluccedilatildeo 2 (Revelador) e Soluccedilatildeo 3
(Corante) em cada uma por 30 s Apoacutes este processo as lacircminas foram lavadas em
aacutegua corrente secas agrave temperatura ambiente e cobertas com Permount e lamiacutenula
Os parasitas foram visualizados em microscoacutepio Nikon E600
61
326 Infecccedilatildeo de ceacutelulas Vero com o mutante de T cruzi para TcKAP7
Ceacutelulas Vero (ATCCreg Nuacutemero CRL-2783trade) foram cultivadas em garrafas
de 150 cm2 contendo meio RPMI suplementado com 5 de soro fetal bovino
(GIBCO) penicilina 100 UIml streptomicina 10 microgml e glutamina 2 mM a 37 o C
com 5 de CO2 Ao atingirem a confluecircncia (80 a 100) realizou-se a passagem
atraveacutes de tripsinizaccedilatildeo e foi feito um inoacuteculo de 1 x 107 ceacutelulas para cada nova
garrafa de 150 cm2 Apoacutes 24 horas estas ceacutelulas (50 ndash 70 de confluecircncia) foram
infectadas com formas metaciacuteclicas obtidas da diferenciaccedilatildeo do mutante de T cruzi
para TcKAP7 em microplacas de 24 poccedilos contendo lamiacutenulas de vidro com
diacircmetro de 13 mm A cada poccedilo foram adicionadas 2 x 104 ceacutelulas Vero Apoacutes 24
horas de cultivo as ceacutelulas foram infectadas com tripomastigotas metaciacuteclicos
(obtidos do sobrenadante das culturas de T cruzi diferenciados em meio TAU3AAG
sem purificaccedilatildeo na coluna de DEAE celulose) A infecccedilatildeo das ceacutelulas Vero foi
acompanhada diariamente por microscopia de contraste de fase
327 Anaacutelise da funccedilatildeo do gene TbKAP7 de Trypanosoma brucei atraveacutes de
ensaios de RNA de interferecircncia
Com o intuito de complementar os estudos da funccedilatildeo do gene TcKAP7 foi
utilizada a teacutecnica de RNA de interferecircncia O uso dessa metodologia compreende
uma abordagem alternativa agrave anaacutelise da funccedilatildeo gecircnica para genes ortoacutelogos deT
brucei por anaacutelises de RNAi uma vez que a maquinaria de RNAi em T cruzi eacute
inexistente (DA ROCHA et al 2003) Os resultados podem gerar evidecircncias que
estejam relacionadas agrave funcionalidade dos genes em T cruzi Esta abordagem foi
utilizada neste trabalho para auxiliar no estudo da funccedilatildeo do gene TcKAP7 a partir
do ortoacutelogo em T brucei ainda natildeo caracterizadoTbKAP7 Os ensaios de RNAi
foram realizados em T brucei cepa 29-13 (WIRTZ et al 1999) com sistema induzido
por tetraciclina utilizando o vetor p2T7-177 ilustrado na figura 12 Este vetor quando
transfectado no parasita integra-se aos minicromossomos do T brucei regiatildeo de
repeticcedilotildees 177 (FOLDYNOVA-TRANTIRKOVA et al 2005)
62
FIGURA 12 MAPA DO VETOR p2T7-177 UTILIZADO PARA ENSAIOS DE RNAi LEGENDA T7 prom Promotor de T7 RNA Polimerase induzido por tetraciclina T7 term Terminador de transcriccedilatildeo 177 Sequumlecircncia repetitiva de 177 pares de bases para alvo de inserccedilatildeo em minicromossomos BLEO gene de resistecircncia agrave fleomicina GFP Proteiacutena Green FluorescentProtein os siacutetios para as enzimas de restriccedilatildeo estatildeo indicados AmpR gene de resistecircncia agrave ampicilina (FONTE WICKSTEAD et al 2002)
As regiotildees do mRNA para alvos nos ensaios de RNAi foram escolhidas com
o auxiacutelio da ferramenta RNAit da base de dados do Trypanofan - Genocircmica
funcional de Tbrucei (httptrypanofanpathcamacuktrypanofanmain)
(REDMOND et al 2003) Essas regiotildees foram amplificadas por PCR usando como
molde o DNA total de T brucei (100 ngreaccedilatildeo) 10 pmol dos primers listados na
tabela 3 200 mM de cada dNTP 15 mM de MgCl2 tampatildeo Taq DNA polimerase 1x
63
(Invitrogen) e 25 unidades de Taq DNA polimerase (Invitrogen) A reaccedilatildeo foi
aquecida por 4 min a 94 degC e entatildeo submetida a 35 ciclos de desnaturaccedilatildeo a 94 degC
por 30 s anelamento a 55 degC por 30 s e extensatildeo a 72 degC por 1 min Os primers
utilizados apresentam siacutetio para as enzimas de restriccedilatildeo BamHI (F) ou HindIII (R)
Os produtos de PCR foram purificados por extraccedilatildeo com fenol-clorofoacutermio e
digeridos com as referentes enzimas
QUADRO 3 - RELACcedilAtildeO DOS PRIMERS UTILIZADOS PARA A AMPLIFICACcedilAtildeO DO
GENE TbKAP7
KAP7RNAiF
AAAGGATCCCTAACCTAACCTGCAGGGTCTCTCG
KAP7RNAiR
GCGAAGCTTTTGTTCCTTTACAAACGCCC
Os siacutetios das enzimas de restriccedilatildeo BamHI (GGATCC) e HindIII (AAGCTT) adicionados aos primers estatildeo em negrito
As clonagens foram confirmadas por PCR de colocircnia e os plasmiacutedeos foram
purificados pelo kit QIAprep Spin Miniprep (Qiagen) Apoacutes purificaccedilatildeo 10 μg dos
plasmiacutedeos foram linearizados com a enzima NotI conforme descrito pelo fabricante
O DNA foi precipitado e ressuspenso em 50 μl de meio de eletroporaccedilatildeo ZPFM para
transfecccedilatildeo do T brucei
Para cada transfecccedilatildeo foi utilizado um total de 4 x 107parasitas em fase logariacutetmica
de crescimento Os parasitas foram obtidos por centrifugaccedilatildeo (5000 x g por 10 min
a 4 degC) lavados em meio ZPFM e ressuspensos em 500 μl do mesmo meio A
transfecccedilatildeo foi feita em cubetas de eletroporaccedilatildeo (4 mm) usando o eletroporador da
BioRad (GenePulser II Electroporator) As condiccedilotildees utilizadas foram dois pulsos de
1600 V e 25 microF Os parasitas foram entatildeo transferidos para garrafas contendo meio
SDM-79 SFB 10 higromicina 50 μgml e G418 15 μgml A seleccedilatildeo dos parasitas
transfectados foi atraveacutes da adiccedilatildeo de 5μgmL de fleomicina resistecircncia conferida
pelo vetor p2T7-177 apoacutes 24 horas de cultivo O tempo para seleccedilatildeo foi entre duas
e trecircs semanas
64
3271 Induccedilatildeo do RNA dupla fita
A induccedilatildeo da expressatildeo de RNA dupla fita referente agrave porccedilatildeo do gene
TbKAP7 clonado no plasmiacutedeo p2T7-177 deu-se pela adiccedilatildeo de tetraciclina 2 μgml
a uma cultura transfectada de T brucei em fase de crescimento exponencial (~2 x
106 parasitasml) Nos dias que se seguiram 1μgml de tetraciclina foi adicionada
diariamente agraves culturas A observaccedilatildeo dos efeitos na curva de crescimento causada
por RNAi em T brucei foi realizada ao longo de uma semana com a contagem de
ceacutelulas e adiccedilatildeo diaacuteria de tetraciclina 1 μgml
65
4 RESULTADOS
41 Clonagem e caracterizaccedilatildeo do gene TcKAP7
A regiatildeo codificante do gene TcKAP7 (ID Tc00104705350871950) foi
obtida a partir do banco de dados do genoma do T cruzi disponiacutevel no portal da
internet wwwgenedborg e amplificada por PCR com os primers descritos no item
37
No genoma do T cruzi cepa CL Brener (EL-SAYED et al 2005) foram
identificados dois haploacutetipos do gene TcKAP7 que foram denominados neste
trabalho de haploacutetipo A (Tc00104705350871950) e haploacutetipo B
(Tc00104705350979320) Neste trabalho foi utilizado o gene TcKAP7 proveniente
da cepa Dm28c de T cruzi Este gene apresenta uma regiatildeo codante de 747 pb e
codifica uma proteiacutena de 276 kDa assumindo que o primeiro ATG apoacutes a sequecircncia
do mini-eacutexon seja usada na iniciaccedilatildeo da traduccedilatildeo
A figura 13 abaixo mostra o alinhamento de TcKAP7 das cepas CL Brener e
Dm28c
FIGURA 13 - COMPARACcedilAtildeO ENTRE AS SEQUumlEcircNCIAS DE AMINOAacuteCIDOS DEDUZIDAS DO GENE KAP7 DE T cruzi Dm28C E DOS HAPLOacuteTIPOS DE CL BRENER
LEGENDA As posiccedilotildees com aminoaacutecidos idecircnticos em todas as sequumlecircncias estatildeo coloridas em preto
66
Embora o gene TcKAP7 natildeo possua grande identidade com os com genes
ortoacutelogos em Trypanosoma brucei TbKAP7 (714 pb) (Tb106k151470) Leishmania
major LmKAP7 (1044 pb) (LMJF_36_5840) Leishmania infantum LiKAP7 (1044 pb)
(LINJ_36_6090) e Leishmania braziliensis LbKAP7 (1038 pb) (LBRM_35_0010)
cujos genomas tambeacutem foram sequumlenciados (BERRIMAN et al 2005 IVENS et al
2005 PEACOCK et al 2007) as sequecircncias de aminoaacutecidos das respectivas
proteiacutenas deduzidas a partir desses genes ainda compartilham certo grau de
similaridade entre si (FIGURA 14) Na tabela 4 pode-se visualizar o percentual de
identidade entre as proteiacutenas KAP7 dos tripanossomatiacutedeos que possuem o genoma
sequenciado
FIGURA 14 COMPARACcedilAtildeO ENTRE AS SEQUumlEcircNCIAS DE AMINOAacuteCIDOS DEDUZIDAS DO GENE KAP7 EM DIFERENTES TRIPANOSOMATIacuteDEOS LEGENDA Em preto encontram-se os resiacuteduos de aminoaacutecidos idecircnticos em todas as sequumlecircncias e em cinza os resiacuteduos conservados na maioria delas
67
QUADRO 4 - PERCENTUAL DE IDENTIDADE ENTRE AS PROTEIacuteNAS KAP7 NOS
TRIPANOSSOMATIacuteDEOS COM O GENOMA SEQUENCIADO
Os valores foram obtidos pelo alinhamento utilizando a ferramenta Clustal21
Mesmo apresentando pouca identidade e variaccedilatildeo de tamanho alguns
dados do genoma sugerem que esses genes satildeo ortoacutelogos entre si Pode-se
perceber uma sintenia entre seus loci nas vaacuterias espeacutecies de tripanosomatiacutedeos
(Cavalcanti et al 2009) (FIGURA 15)
FIGURA 15- SINTENIA DE TcKAP7 COM OUTROS TRIPANOSOMATIacuteDEOS LEGENDA Os dois contigs de TcKAP7 (TcA e TcB) estatildeo representados nesta figura juntamente com os contigs de outros tripanosomatiacutedeos (Tb= T brucei Lm= L major Li= L infantum e Lb= L brasiliensis) mostrando que KAP7 representado pela cor amarela apresenta uma sintenia entre seus loci em todas as espeacutecies mostradas sendo flanqueado pelo gene KAP4 em T cruzi e T brucei representado em azul Portanto em L majorL infantum eL brasiliensis ao lado direito de KAP7 estaacute o gene de uma proteiacutena hipoteacutetica representado pela cor vermelha e ao lado esquerdo encontra-se o gene da KAP4 representado em azul como mencionado anteriormente FONTE CAVALCANTI et al 2009
68
A expressatildeo de vaacuterios genes mitocondriais de C fasciculata e L major eacute
regulada durante o ciclo celular em parte por uma sequumlecircncia consenso
[(CA)AUAGAA(GA)] presente nas regiotildees 5rsquo e 3rsquo-UTR dos respectivos mRNAs
(BROWN amp RAY 1997 MAHMOOD et al 1999 MAHMOOD amp RAY 1998 PASION
et al 1996 ZICK et al 2005)
Assim resolvemos caracterizar a regiatildeo 5rsquo-UTR do transcrito TcKAP7 na
tentativa de identificar sinais com identidade com aqueles encontrados em C
fasciculata Na figura 16 estaacute representada a regiatildeo 5rsquo-UTR do transcrito TcKAP7
com a sequumlecircncia parcial do mini-exon proveniente do primer usado na teacutecnica de
RT-PCR bem como parte da regiatildeo codificante do gene O mini-exon estaacute situado a
129 bases a jusante do iniacutecio da regiatildeo codificante do transcrito TcKAP7 e define
portanto uma regiatildeo 5rsquo-UTR de 168 bases considerando que o tamanho do mini-
exon eacute de 39 bases A anaacutelise da regiatildeo 5rsquo-UTR mostrou um elemento com
caracteriacutesticas muito semelhantes aquele envolvido na regulaccedilatildeo de genes em C
fasciculata (sequencia (G)ATAGAA(G) mostrada no retacircngulo preto na FIGURA
16B) sugerindo que TcKAP7 seja regulada durante o ciclo celular
69
A
B
FIGURA 16 CARACTERIZACcedilAtildeO DA REGIAtildeO 5rsquo-UTR DO TRANSCRITO TcKAP7 LEGENDA A Esquema geral da localizaccedilatildeo do mini-exon de TcKAP7 e B Localizaccedilatildeo especiacutefica do mini-exon de TcKAP7 O mini-exon de TcKAP7 (sequecircncia parcial em verde) estaacute localizado a 129 pb da regiatildeo codante (representada em parte pela cor azul) A regiatildeo 5rsquoUTR do transcrito Tckap7 estaacute representada na cor rosa A possiacutevel sequencia consenso de regulaccedilatildeo durante o ciclo celular estaacute indicada no retacircngulo preto
42 Expressatildeo da proteiacutena TcKAP7 em T cruzi
Formas epimastigotas foram transfectadas com o plasmiacutedeo pNEO3XFLAG
contendo o gene TcKAP7 (pNEO_KAP7_3xFLAG) A expressatildeo da proteiacutena
TcKAP7-FLAG foi analisada por ensaio de western blot Os resultados mostraram
que a expressatildeo da proteiacutena TcKAP7-FLAG foi satisfatoacuteria correspondendo ao
tamanho esperado (FIGURA 17 ) a qual foi confirmada pela reatividade do anticorpo
monoclonal especiacutefico para as etiquetas FLAG (anti-FLAG)
70
FIGURA 17 ANAacuteLISE DA EXPRESSAtildeO DA PROTEIacuteNA DE FUSAtildeO TCKAP7-FLAG EM FORMAS EPIMASTIGOTAS DE T CRUZI
43 Localizaccedilatildeo celular de TcKAP7 atraveacutes de ensaio de imunofluorescecircncia
Para verificar a localizaccedilatildeo celular de TcKAP7 foi realizado o ensaio de
imunofluorescecircncia Como natildeo foi possiacutevel a obtenccedilatildeo do anticorpo com alto tiacutetulo
contra a proteiacutena recombinante TcKAP7 neste ensaio foi utilizado o anticorpo
monoclonal anti-FLAG que reconhece a etiqueta FLAG a qual estaacute fusionada a
proteiacutena TcKAP7
Nessa figura pode-se observar que a proteiacutena de fusatildeo acumula-se na regiatildeo
dos poacutelos do cinetoplasto das formas epimastigotas do T cruzi (FIGURA 18)
indicando que TcKAP7 uma proteiacutena tipo histona H1 estaacute realmente associada com
o kDNA do parasita
71
FIGURA 18 IMUNOLOCALIZACcedilAtildeO DE TcKAP7 EM EPIMASTIGOTAS DE T CRUZI LEGENDAA contraste interferencial diferencial (DIC) B Hoechst marcando o nuacutecleo e o
cinetoplasto C fluorescecircncia mostrando a localizaccedilatildeo de TcKAP7 mais intensa na regiatildeo dos poacutelos
docinetoplasto dos protozoaacuterios D Aumento de C
44 Deleccedilatildeo do gene TcKAP7 por nocaute gecircnico
As teacutecnicas que permitem a remoccedilatildeo de um gene e sua substituiccedilatildeo por
genes repoacuterteres atraveacutes do processo de recombinaccedilatildeo tecircm sido usadas com
sucesso para verificaccedilatildeo da funccedilatildeo gecircnica em tripanosomatiacutedeos (MACRAE et al
2006) O nocaute gecircnico consiste na inserccedilatildeo de marcadores geneacuteticos de seleccedilatildeo
(gene codificando resistecircncia a neomicina ou higromicina entre outros) flanqueados
por sequumlecircncias pertencentes ao locus cromossocircmico de interesse Atraveacutes do
processo de recombinaccedilatildeo homoacuteloga o marcador pode entatildeo substituir o gene que
se quer estudar Desse modo pode ser possiacutevel analisar a funccedilatildeo de determinado
gene atraveacutes das alteraccedilotildees - decorrentes de sua ausecircncia - na fisiologia do
parasita No presente estudo os genes repoacuterteres que codificam resistecircncia aos
72
antibioacuteticos G418 e higromicina foram flanqueados por sequumlecircncias a montante e a
jusante da regiatildeo codificante do gene TcKAP7 As construccedilotildees foram usadas para
transfectarT cruzi e gerar mutantes para o gene TcKAP7 a fim de se estudar o
efeito que a ausecircncia do gene TcKAP7 causa no metabolismo do parasita
Apoacutes obtenccedilatildeo de uma populaccedilatildeo de T cruzi mutante para o gene TcKAP7
(kap7neokap7higro) resistente a ambos antibioacuteticos G418 e higromicina B o
DNA desta populaccedilatildeo foi extraiacutedo para anaacutelise por PCR e Southern blot a fim de
confirmar a eficiecircncia do nocaute
441 Anaacutelise por PCR do DNA dos parasitas transfectados com os cassetes
UPS-NEO-DOWN e UPS-HIGRO-DOWN
Foram realizadas vaacuterias reaccedilotildees de PCR a fim de confirmar a deleccedilatildeo do
gene TcKAP7 do genoma do T cruzi Dm28c e a substituiccedilatildeo dos seus alelos pelos
genes neo e higro As reaccedilotildees de PCR foram feitas com DNA de T cruzikap7kap7 (tipo
selvagem) e com DNA de T cruzikap7neokap7higro utilizando diversas combinaccedilotildees de
primers (TABELA 5) Na figura 32 observa-se que o gene TcKAP7 (747 pb) foi
amplificado somente na PCR realizada com DNA de T cruzi tipo selvagem (FIGURA
19 A canaleta 1) enquanto que os genes neo (795 pb) e higro (1026 pb) soacute foram
amplificados nas reaccedilotildees que conteacutem DNA da populaccedilatildeo do T cruzi kap7neokap7higro
(FIGURA 19 B canaletas 2 e 3) Os tamanhos esperados para amplificaccedilotildees usando
primers externos agraves construccedilotildees e os primers dos genes de resistecircncia foram
identificados no gel de agarose indicando que os cassetes se integraram
corretamente no locus do gene TcKAP7 (FIGURA 19 B canaletas 4 a 7) Um
esquema da localizaccedilatildeo dos primers utilizados nas reaccedilotildees de PCR pode ser
visualizado na figura 19 C
QUADRO 5 ndash COMBINACcedilOtildeES DE PRIMERS UTILIZADOS NA PCR PARA
CONFIRMAR O NOCAUTE DE TcKAP7
Pares de primers Tamanho esperado
(pb)
1 KAP7F + KAP7R 747
2 NEOF + NEOR 795
73
3 HIGROF + HIGROR 1026
4 EXTF + NEOR 1410
5 EXTF + HIGROR 1634
6 NEOF + EXTR 1358
7 HIGROF + EXTR 1360
74
FIGURA 19 ENSAIOS DE PCR UTILIZANDO DNA DE T cruzi kap7kap7 (WT) E
T cruzi kap7neokap7higro (NO) COM DIFERENTES PRIMERS
LEGENDA 1 KAP7F + KAP7R 2 NEOF + NEOR (795 pb) 3 HIGROF + HIGROR (1026 pb) 4
EXTF + NEOR (1410 pb) 5 EXTF + HIGROR (1634 pb) 6 NEOF + EXTR (1358 pb) e 7
HIGROF + EXTR (1360 pb) No quadro A encontram-se as PCRs realizadas com DNA de T cruzi kap7kap7 (WT) e no quadro B encontram-se as PCRs realizadas com DNA de T cruzi kap7neokap7higro
(NO) No quadro C estaacute um esquema da localizaccedilatildeo dos primers utilizados
442 Anaacutelise da organizaccedilatildeo dos genes TcKAP7 neo e higro por ensaio do
tipo Southern blot
Neste ensaio foi utilizado DNA total extraiacutedo de T cruzikap7kap7 (tipo selvagem)
e T cruzi kap7neokap7higro (duplo nocaute) Foram utilizadas trecircs sondas (1) Um
fragmento do gene TcKAP7 (primeiros 598 pb da CDS) (2) o gene neo e (3) o gene
higro O DNA total das duas amostras foi digerido com a enzima de restriccedilatildeo HindIII
O padratildeo de digestatildeo desta enzima pode ser visualizado na figura 20 De acordo
com o mapa de restriccedilatildeo a inserccedilatildeo do cassete neo no locus KAP7 geraria um
fragmento HindIIIHindIII de 1024 pb enquanto a inserccedilatildeo do cassete higro geraria
um fragmento de 1032 pb cujos tamanhos satildeo diferentes do fragmento
HindIIIHindIII do locus original (1776 pb) As hibridizaccedilotildees mostram bandas
compatiacuteveis com os tamanhos dos fragmentos HindIIIHindIII esperados para cada
situaccedilatildeo acima (FIGURA 21) Podemos observar que a sonda KAP7 somente
reconhece uma banda de tamanho esperado apenas no DNA do parasita selvagem
(canaleta 1 FIGURA 21) enquanto que bandas correspondentes aos genes neo e
higrosomente aparecem no DNA do mutante KAP7 (canaleta 2 FIGURA 21)
75
FIGURA 20 ndash REPRESENTACcedilAtildeO ESQUEMAacuteTICA DOS SIacuteTIOS DA ENZIMA HindIII NO LOCUS DO GENE KAP7 DE T cruzi CL Brener LEGENDA Este esquema representa esquematicamente em escala os genes kap3 neo e higro as regiotildees upstream e downstream e os siacutetios de clivagem da enzima KpnI
FIGURA 21 ANAacuteLISE DA ORGANIZACcedilAtildeO DOS GENES TCKAP7 NEO E HIGRO POR ENSAIO DO TIPO SOUTHERN BLOT LEGENDA A Autoradiograma e B Padrotildees dos fragmentos obtidos da digestatildeo do DNA com a enzima de restriccedilatildeo HindIII Foram utilizadas trecircs sondas TcKAP7 neomicina e higromicina 1) DNA de T cruzikap7kap7 (tipo selvagem) e 2) T cruzi kap7neokap7higro (duplo nocaute)
76
45 Comparaccedilatildeo da expressatildeo do gene TcKAP7 por western blot
O antisoro contra a proteiacutena TcKAP7 obtido apoacutes imunizaccedilatildeo dos
camundongos foi utilizado em ensaio do tipo western blot para avaliar se TcKAP7
ainda estava sendo expresso no T cruzi apoacutes o nocaute gecircnico
O que se observou foi novamente como esperado que a proteiacutena TcKAP7 natildeo eacute
mais expressa no T cruzi kap7neokap7higro (figura 22) Pode-se observar a presenccedila
de TcKAP7 ( aprox 28 kDa) no extrato das formas epimastigotas de T cruzi kap7kap7
(figura 22A) mas natildeo no extrato de epimastigotas de T cruzi
kap7neokap7higro (figura 22B)
FIGURA 22 COMPARACcedilAtildeO DA EXPRESSAtildeO DO GENE TcKAP7 POR WESTERN BLOT LEGENDA Imunoblot de extratos de epimastigotas de T cruzi kap7kap7 (A) e de T cruzi kap7neokap7higro (B) reagidos com anti-TcKAP7
46 Anaacutelise da morfologia e da ultraestrutura do cinetoplasto do mutante de T
cruzi para TcKAP7
Sabendo-se que TcKAP7 estaacute associada ao cinetoplasto e pode estar
envolvida na compactaccedilatildeo do kDNA do T cruzi como foi mostrado para as KAPs de
Crithidia fasciculata (XU amp RAY 1993 XU et al 1996 HINES amp RAY 1998) sua
ausecircncia poderia levar a alteraccedilatildeo na estrutura do DNA mitocondrial dos parasitas
nocauteados Portanto o primeiro passo foi verificar se havia alteraccedilotildees na
77
morforlogia do parasita Formas epimastigotas do mutante de T cruzi foram
analisadas ao microscoacutepio oacuteptico apoacutes coloraccedilatildeo Como pode ser observado na
figura 23 epimastigotas do mutante de T cruzi para TcKAP7 apresentam uma
morfologia fusiforme com o cinetoplasto caracteriacutestico em forma de barra localizado
anteriormente ao nuacutecleo natildeo se evidenciando portanto nenhuma alteraccedilatildeo em
relaccedilatildeo agrave morfologia dos parasitas do tipo selvagem
FIGURA 23 - COLORACcedilAtildeO PELO MEacuteTODO PANOacuteTICO RAacutePIDO DOS PARASITAS EPIMASTIGOTAS NOCAUTEADOS LEGENDA A) Formas epimastigotas B) Forma epimastigota em maior aumento
Formas epimastigotas de parasitas do tipo selvagem e nocauteados foram
entatildeo analisados pela teacutecnica de microscopia eletrocircnica de transmissatildeo para
visualizar com mais detalhe o cinetoplasto e verificar se sua estrutura estava
alterada pela ausecircncia da TcKAP7 (FIGURA 24) A figura 24A mostra um corte
ultrafino de um epimastigota de T cruzi do tipo selvagem que apresenta o
cinetoplasto compacto e em forma de bastatildeo caracteriacutestico de formas
epimastigotas sem nenhuma alteraccedilatildeo aparente O mesmo pode ser visto na figura
24B para o epimastigota de T cruzi nocauteado A disposiccedilatildeo estrutura e aspecto
do cinetoplasto de ambos os parasitas selvagem e nocauteado natildeo apresentaram
nenhuma diferenccedila entre si mostrando que mesmo apoacutes o nocaute da KAP7 a
estrutura do cinetoplasto permanece aparentemente inalterada
78
FIGURA 24 COMPARACcedilAtildeO ENTRE A ULTRAESTRUTURA DO CINETOPLASTO DO T cruzi DM28C TIPO SELVAGEM (A) E DO MUTANTE DE T cruzi PARA TcKAP7 (B) POR MICROSCOPIA ELETROcircNICA DE TRANSMISSAtildeO
79
47 Multiplicaccedilatildeo diferenciaccedilatildeo e infectividade do mutante de T cruzi para
TcKAP7
Os parasitas mutantes foram analisados a fim de verificar se alteraccedilotildees na
estrutura do kDNA pela ausecircncia de KAP7 natildeo estavam levando a alteraccedilotildees na
fisiologia do parasita alterando sua multiplicaccedilatildeo diferenciaccedilatildeo e infectividade
Inicialmente foi analisado o perfil da curva de crescimento das formas
epimastigotas Observou-se que natildeo havia diferenccedila na curva de crescimento dos
parasitas nocauteados em relaccedilatildeo ao parasita selvagem (FIGURA 25)
FIGURA 25 CURVA DE CRESCIMENTO DO MUTANTE DE T cruzi PARA TcKAP7 (KO) E DO T cruzi Dm28c SELVAGEM (WT)
LEGENDA Curva de crescimento do mutante de T cruzi para TcKAP7 () e do T cruzi Dm28c ()
Em seguida os parasitas nocauteados foram analisados quanto a sua capacidade
de diferenciaccedilatildeo em tripomastigotas metaciacuteclicos Foram realizadas contagens
diferenciais em cacircmara de Neubauer a partir do sobrenadante da metaciclogecircnese
a cada 24 h apoacutes a incubaccedilatildeo das ceacutelulas em meio TAU3AAG durante um periacuteodo
de 3 dias (72 h) A partir dessas contagens foram construiacutedos curva com a contagem
do nuacutemero de metaciacuteclicos ao longo dos trecircs dias (FIGURA 26)
Nenhuma alteraccedilatildeo foi observada quando os parasitas nocauteados foram
submetidos ao processo de metaciclogecircnese in vitro Ou seja pode-se afirmar que
80
mesmo apoacutes o nocaute do gene TcKAP7 as formas epimastigotas do parasita
conseguem se diferenciar em formas metaciacuteclicas
FIGURA 26 METACICLOGEcircNESE IN VITRO DE T cruzi Dm28c TIPO SELVAGEM E T cruzi NOCAUTEADO LEGENDA Metaciclogecircnese in vitro de T cruzi Dm28c tipo selvagem () e T cruzi nocauteado ()
Uma vez que os parasitas nocauteados foram capazes de se diferenciar de
epimastigota a tripomastigota metaciacuteclico resolveu-se investigar se estes eram
capazes de infectar ceacutelulas in vitro Foi possiacutevel perceber as formas amastigotas
dentro de ceacutelulas VERO em cultura mostrando que o parasita natildeo perdeu sua
capacidade de infecccedilatildeo (dados natildeo mostrados) Assim pode-se concluir que aleacutem
de sofrer diferenciaccedilatildeo os mutantes de T cruzi para KAP7 tambeacutem mantiveram sua
capacidade de infecccedilatildeo
48 Anaacutelise da funccedilatildeo do gene KAP7 de Trypanosoma brucei atraveacutes de
ensaios de RNA de interferecircncia
Para averiguar a importacircncia da proteiacutena TcKAP7 na biologia do parasita
recorremos a ensaios de RNA de interferecircncia (RNAi) jaacute que existe uma alta
similaridade entre TcKAP7 e seu ortoacutelogo em Trypanosoma brucei
81
A via de RNA de interferecircncia consiste em um mecanismo de silenciamento
gecircnico que para a ceacutelula funciona como sistema de defesa O mecanismo inicia-se
atraveacutes da expressatildeo de um RNA dupla fita (dsRNA) contendo uma sequecircncia
complementar ao gene de interesse Este dsRNA seraacute entatildeo clivado em pequenos
fragmentos de cerca de 22 a 25 nucleotiacutedeos atraveacutes da atividade de uma
ribonuclease do tipo III denominada Dicer Estes pequenos RNAs seratildeo
direcionados e permaneceratildeo unidos a um complexo proteico denominado RISC
(ldquoRNA-InducedSilencingComplexrdquo) Nesse complexo os pequenos RNAs de
interferecircncia (siRNA) ligam-se por complementaridade ao RNA mensageiro do gene
a ser inativado guiando-os para degradaccedilatildeo pelas nucleases presentes no
complexo impedindo a siacutentese da respectiva proteiacutena (ULLU et al 2002) O vetor
utilizado para promover o silenciamento do gene TbKAP7 foi o p2T7-177 Este
plasmiacutedeo integra-se aos minicromossomos do T brucei regiatildeo de repeticcedilotildees 177
(FOLDYNOVA-TRANTIRKOVA et al 2005) Este vetor apresenta dois promotores
de polimerase em oposiccedilatildeo induziacuteveis por tetraciclina flanqueando a sequumlecircncia de
interesse Desta forma satildeo geradas duas moleacuteculas de mRNA que pareadas
formam a moleacutecula de RNA fita dupla capaz de induzir a maquinaria de degradaccedilatildeo
A induccedilatildeo da inibiccedilatildeo de TbKAP7 atraveacutes de RNAi levou a uma diminuiccedilatildeo da
multiplicaccedilatildeo celular do parasita a partir do quarto dia do experimento (FIGURA 27)
Os resultados obtidos neste ensaio mostraram que a participaccedilatildeo da TbKAP7
no metabolismo do T brucei eacute essencial jaacute que o silenciamento do gene TbKAP7
levou agrave reduccedilatildeo da proliferaccedilatildeo celular do parasita
82
FIGURA 27 RNAi DE TbKAP7 INIBE O CRESCIMENTO DAS FORMAS PROCIacuteCLICAS DE T
brucei
LEGENDA Curva de crescimento de linhagem celular de RNAi de TbKAP7 em T brucei induzido por
tetraciclina As ceacutelulas foram diluiacutedas a uma densidade celular inicial de 1 X 106 ml na presenccedila e
ausecircncia de tetraciclina As densidades celulares foram determinadas pela contagem de ceacutelulas a
intervalos de 24 horas durante oito dias apoacutes iniacutecio de adiccedilatildeo de tetraciclina A linha com quadrados
mostra a curva de crescimento celular na presenccedila de tetraciclina (+TET) A linha com losangos
mostra a curva de crescimento celular na ausecircncia de tetraciclina (- TET)
49 Caracterizaccedilatildeo estrutural de TcKAP7
491 Produccedilatildeo recombinante de TcKAP7
O cultivo de E coli BL-21(DE3) STAR contendo o plasmiacutedeo pET28a-
TcKAP7 foi feito em meio LB a 37 oC com a induccedilatildeo da expressatildeo realizada a uma
densidade oacutetica de DO600 de 08 com a adiccedilatildeo de 05 mM de ITPG durante a noite a
37 oC
As ceacutelulas foram recuperadas por centrifugaccedilatildeo ressuspensas sonicadas e
centrifugadas para a purificaccedilatildeo de TcKAP7 atraveacutes da cromatografia de afinidade
em resina de Ni-NTA (Figura 28A) Foi possiacutevel obter grande quantidade de
83
amostra com grau de pureza alto como visualizado atraveacutes de anaacutelise por SDS-
PAGE (Figura 28B)
FIGURA28 PURIFICACcedilAtildeO DE TCKAP7 ATRAVEacuteS DE CROMATOGRAFIA DE AFINIDADE LEGENDA A) Cromatograma de afinidade B) SDS-PAGE da cromatografia de afinidade Os nuacutemeros agrave esquerda da figura representam os tamanhos das bandas do marcador de massa molecular (Benchmark) (Invitrogen) e P banda correspondente agrave TcKAP7 purificada Caixa em vermelho indica o pico que corresponde agrave fraccedilatildeo no SDS-PAGE
Devido agrave presenccedila de bandas com possiacuteveis contaminantes as fraccedilotildees que
continham a proteiacutena de interesse foram submetidas agrave purificaccedilatildeo por cromatografia
de troca iocircnica onde a purificaccedilatildeo eacute realizada baseada na afinidade por cargas
entre as proteiacutenas e a resina
Para esta purificaccedilatildeo utilizou-se a coluna SP Hitrap (GE Healthcare Life
Sciences) que eacute uma coluna de carga negativa Essa resina foi escolhida pois o pH
do tampatildeo em que se encontrava TcKAP7 era menor que o pI da proteiacutena Nessas
condiccedilotildees a carga superficial de TcKAP7 eacute positiva Para favorecer a interaccedilatildeo
TcKAP7 e resina foi feita uma diluiccedilatildeo de TcKAP7 para retirada de NaCl A eluiccedilatildeo
da proteiacutena foi realizada com um gradiente segmentado de tampatildeo B para
84
cromatografia de troca iocircnica TcKAP7 foi eluiacuteda com 68 do tampatildeo B (FIGURA
29)
FIGURA 29 PURIFICACcedilAtildeO DE TCKAP7 ATRAVEacuteS DE CROMATOGRAFIA DE TROCA IOcircNICA
LEGENDA A) Cromatografia de troca iocircnica B) SDS-PAGE da cromatografia de troca iocircnica Os nuacutemeros agrave esquerda da figura representam os tamanhos das bandas do marcador de massa molecular (Benchmark) (Invitrogen) e P banda correspondente agrave TcKAP7 purificada Caixa em vermelho indica o pico que corresponde agrave fraccedilatildeo no SDS-PAGE Curva em azul representa absorbacircncia em 280 nm Linha em verde indica concentraccedilatildeo de tampatildeo B para eluiccedilatildeo da amostra
410 Anaacutelise do estado oligomeacuterico de TcKAP7
A amostra purificada por troca iocircnica foi submetida agrave cromatografia de
exclusatildeo molecular tambeacutem chamada de gel filtraccedilatildeo que consiste na separaccedilatildeo
de biomoleacuteculas de acordo com seu tamanho e forma A coluna neste processo
conteacutem um poliacutemero com ligaccedilotildees cruzadas com poros de tamanho definido As
moleacuteculas maiores iratildeo migrar mais rapidamente que as menores pois natildeo satildeo
85
capazes de penetrar no interior dos poros da resina eluindo diretamente da coluna
As moleacuteculas menores por entrarem pelos poros da resina e levarem mais tempo
percorrendo os poros satildeo eluiacutedas mais tarde em relaccedilatildeo as que satildeo maiores
Ao comparar o volume de eluiccedilatildeo de TcKAP7 com o volume de eluiccedilatildeo de
proteiacutenas com massa molecular conhecidos (dados natildeo mostrados) foi possiacutevel
verificar que TcKAP7 parece ser um monocircmero em soluccedilatildeo Para confirmar esses
dados a mesma amostra foi submetida ao experimento de espalhamento dinacircmico
de luz (DLS)
O DLS eacute uma teacutecnica que se estima a distribuiccedilatildeo de tamanho das
populaccedilotildees de partiacuteculas que estatildeo presentes na amostra permitindo a detecccedilatildeo de
agregados proteicos ou de diferentes estados de oligomerizaccedilatildeo na amostra
indicando heterogeneidade Eacute importante ressaltar que para maiores chances de
sucesso em ensaios de cristalizaccedilatildeo a amostra deve encontrar-se monodispersa
Os dados de DLS mostram que 911 da massa de TcKAP7 analisada
apresenta um raio hidrodinacircmico (Rh) de 39 nm que representa uma massa
aparente de 29 kDa (FIGURA 30) Isto eacute condizente com um monocircmero cuja massa
teoacuterica seria de aproximadamente 28 kDa (incluindo a cauda de 6 histidinas) de
acordo com a prediccedilatildeo feita pelo servidor Expasy Protparam
(httpwebexpasyorgprotparam)A polidispersividade da amostra foi baixa
indicando que a mesma estava homogecircnea
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0 1 2 3 4 5 6 7
M
assa
Rh (nm)
fr80
fr82
fr84
fr85
86
FIGURA 30 ANAacuteLISE POR DLS DE TCKAP7 LEGENDA Anaacutelise por DLS de TcKAP7 contendo as fraccedilotildees obtidas na cromatografia de afinidade As fraccedilotildees 80 84 e 85 apresentam um raio hidrodinacircmico (Rh) de 39 nm
Aleacutem disso tambeacutem foram obtidas informaccedilotildees sobre o envelope de TcKAP7
a partir dos dados coletados atraveacutes da teacutecnica de SAXS mostrando que o raio de
giro (Rg) do envelope de TcKAP7 estaacute de acordo com o estimado por DLS (FIGURA
31)
FIGURA 31 ENVELOPE MOLECULAR DE SAXS
411 Anaacutelise do conteuacutedo de estrutura secundaacuteria de TcKAP7 recombinante
Atraveacutes da anaacutelise do espectro de dicroiacutesmo circular pode-se verificar o
conteuacutedo de estrutura secundaacuteria da proteiacutena e inferir enovelamento da proteiacutena
recombinante Os dados obtidos para a TcKAP7 revelaram a presenccedila de estruturas
α caracterizadas pelos miacutenimos pronunciados em 208 nm e 222 nm e de estruturas
coiled na amostra de TcKAP7 caracterizada pelos miacutenimos pronunciados em 205
nm (FIGURA 32) Este resultado estaacute de acordo a prediccedilatildeo de estrutura secundaacuteria
87
realizada pelo servidor PSIPRED (httpbioinfcsuclacukpsipred (FIGURA 33)
Esses resultados sugerem que a proteiacutena recombinante possui correto
enovelamento
FIGURA 32 ESPECTRO DE DICROIacuteSMO CIRCULAR DE TcKAP7
FIGURA 33 PREDICcedilAtildeO DE ESTRUTURA SECUNDAacuteRIA DE TcKAP7
412 Anaacutelise estrutural de TcKAP7
A fim de obter-se a estrutura tridimensional de TcKAP7 por cristalografia de
raios-X foram realizados ensaios de cristalizaccedilatildeoFoi possiacutevel observar a formaccedilatildeo
de um cristal em apenas uma condiccedilatildeo Imidazol 01 M Polietilenoglicol (PEG) 8000
10 wv e Acetato de caacutelcio 02 M
A visualizaccedilatildeo atraveacutes de luz ultra-violeta atraveacutes do equipamento Rock
Imager Fomulatrix permitiu identificaacute-lo como cristal de proteiacutena jaacute que este
diferencia-se de cristal de sal pela fluorescecircncia quando excitado em comprimento
de onda de 280 nm
-20
-18
-16
-14
-12
-10
-8
-6
-4
-2
0
2
200 210 220 230 240 250 260
Ɵ M
RV
x 1
03
(de
g cm
2d
mo
l-1)
Comprimento de onda (nm)
88
O perfil do cristal pode ser visualizado na figura 34 Esse cristal encontra-se
pequeno e mal-formado Aleacutem disso os meacutetodos para a determinaccedilatildeo estrutural de
uma estrutura ineacutedita (sem homologia com estruturas conhecidas) necessitam de
mais de um cristal Dessa forma foram realizados refinamentos dessas condiccedilotildees
iniciais visando aumentar q quantidade de cristais aumentar seu tamanho e
melhorar sua organizaccedilatildeo A concentraccedilatildeo de PEG (5 A 10) e do pH (6 a 9) com
intervalos de 1 unidade foram alterada Entretanto mesmo assim natildeo foi possiacutevel a
obtenccedilatildeo de cristais adequados para a difraccedilatildeo de raios X e novos refinamentos
seratildeo necessaacuterios
FIGURA 34 CRISTAL DE TcKAP7 DE T CRUZI LEGENDA AObtenccedilatildeo do cristal de TcKAP7 na condiccedilatildeo de Imidazol 01 M Polietilenoglicol (PEG) 8000 10 wv e Acetato de caacutelcio 02 M e B Cristal de TcKAP7 visto sob luz ultravioleta
Uma vez que natildeo foi possiacutevel durante o desenvolvimento desse projeto a
obtenccedilatildeo da estrutura cristalograacutefica de TcKAP7 procedeu-se com a construccedilatildeo de
seu modelo molecular
A modelagem molecular eacute uma ferramenta que permite a obtenccedilatildeo de
modelos da estrutura tridimensional de uma determinada proteiacutena com base em
homologia sequencial ou estrutural com proteiacutenas cujas estruturas tridimensional
foram experimentalmente resolvidas
Para a construccedilatildeo do modelo foi utilizado o programa MODELLER (SALI amp
BLUNDELL 1993) este programa eacute utilizado para a modelagem por homologia a
estruturas tridimensionais de proteiacutenas O programa automaticamente constroacutei um
modelo baseado na anaacutelise de um alinhamento de sequecircncias entre a proteiacutena para
a qual se deseja construir o modelo e uma proteiacutena relacionada cuja estrutura
tridimensional jaacute foi resolvida Nesse caso foram utilizadas estruturas de duas
A B
89
proteiacutenas como molde para a construccedilatildeo da estrutura de TcKAP7 A estrutura da
proteiacutena HMGB1(coacutedigo de acesso no banco de dados de proteiacutenas 2GZK)
(wwwpdborg) para a porccedilatildeo amino-terminal e a estrutura do fator A de transcriccedilatildeo
mitocondrial (coacutedigo de acesso 3TQ6) para a porccedilatildeo carboxi-terminal da proteiacutena
(FIGURA 35A) Duas proteiacutenas foram selecionadas para a construccedilatildeo do modelo de
TcKAP7 visto que a similaridade de sequencia entre TcKAP7 e proteiacutenas com
estruturas resolvidas eacute bastante baixo A similaridade sequencial de TcKAP7 e
proteiacutena HMGB1 eacute de 224 e entre TcKAP7 e o fator A de transcriccedilatildeo mitocondrial
eacute de 264 No entanto ambas proteiacutenas possuem alta similaridade em relaccedilatildeo agrave
estrutura secundaacuteria (mais de 90) Para aumentar a confiabilidade do modelo
utilizamos uma proteiacutena para construir a sequencia N-terminal de TcKAP7
(aminoaacutecidos 1-184) e outra para o C-terminal (aminoaacutecidos 185-248)
A qualidade do modelo pode ser avaliada por exemplo atraveacutes de graacuteficos e
tabelas que analisam restriccedilotildees quiacutemicas e fiacutesicas de cada aacutetomo constituinte do
modelo Neste trabalho foi utilizado o graacutefico de Ramachandran (FIGURA 35B) nele
pode-se visualizar todas as combinaccedilotildees possiacuteveis de acircngulos dieacutedricos Ψ (psi)
versus os Φ (phi) nos aminoaacutecidos de um polipeptiacutedeo e que contribuem para a
conformaccedilatildeo das estruturas das proteiacutenas (RAMACHANDRAN et al 1963) Dos 230
resiacuteduos apenas 5 estatildeo em regiotildees natildeo permitidas do graacutefico Esse eacute um
excelente valor pois eacute similar ao valor meacutedio encontrado para estruturas
experimentalmente determinadas com resoluccedilatildeo de no miacutenimo 20 Aring
(httpwwwebiacukthornton-srvdatabasesprofunc)
Tambeacutem eacute possiacutevel visualizar a topologia de TcKAP7 (FIGURA 35 C) que
mostra as regiotildees de α-heacutelices e regiotildees de coiled presentes na proteiacutena
corroborando com os dados obtidos na espectroscopia de dicroiacutesmo circular
90
FIGURA 35 ESTRUTURA DE TcKAP7 LEGENDA AModelo tridimensional de KAP7 B Graacutefico de Ramachandran e C Topologia de TcKAP7
A anaacutelise da superfiacutecie eletrostaacutetica de TcKAP7 mostra que existem regiotildees
ricas em aminoaacutecidos com cargas positivas que podem conferir afinidades agrave outras
proteiacutenas com carga carga superficial negativa ou mesmo aacutecidos nucleicos (FIGURA
36)
91
FIGURA 36 SUPERFIacuteCIE ELETROSTAacuteTICA DE TcKAP7 LEGENDA Visualizaccedilatildeo de diferentes regiotildees de TcKAP7 Vermelho potencial negativo Azul potencial positiva Branco Neutro
413 Investigaccedilatildeo de possiacuteveis funcionalidades baseadas na estrutura de
TcKAP7
4131 Prediccedilatildeo de funccedilatildeo paraTcKAP7
92
A prediccedilatildeo de funccedilatildeo para TcKAP7 foi realizada a partir do enovelamento de
proteiacutenas utilizando o servidor Profunc (httpwwwebiacukthornton-
srvdatabasesprofunc) O objetivo do servidor ProFunc eacute ajudar na identificaccedilatildeo de
uma possiacutevel funccedilatildeo bioquiacutemica de uma proteiacutena a partir da sua estrutura
tridimensional Ele utiliza uma seacuterie de meacutetodos incluindo comparaccedilatildeo de
enovelamento conservaccedilatildeo dos resiacuteduos e modelos 3D funcionais tanto para
identificar provaacuteveis siacutetios ativos da proteiacutena quanto possiacuteveis homoacutelogos no Protein
Data Bank (PDB) Neste procedimento tenta-se ajustar a estrutura da proteiacutena de
interesse aos tipos de enovelamentos de proteiacutenas conhecidas Atualmente mais de
1000 tipos jaacute foram registrados e depositados em bibliotecas de enovelamentos
Sabe-se que o alinhamento estrutural entre proteiacutenas consideradas de uma
mesma famiacutelia mesmo que seja apenas na regiatildeo do siacutetio ativo pode ser um
importante meacutetodo para se inferir a funccedilatildeo da sequecircncia em estudo (LASKOWSKI et
al 2003) A evoluccedilatildeo tende a conservar funccedilotildees que dependem mais diretamente
das estruturas 3D que das similaridades entre as sequecircncias de aminoaacutecidos das
proteiacutenas (SANCHEZ et al 2000)
Neste trabalho as quatro estruturas que possuem maior similaridade
estrutural com TcKAP7 estatildeo depositadas no Protein Data Bank (PDB) com os
coacutedigos 3TQ6 4NOD 3TMM 4NNU Todas as estruturas satildeo referentes agrave proteiacutena
TFAM (fator transcricional A mitocondrial)
As estruturas proteicas foram obtidas no banco de dados puacuteblicos de
proteiacutenas PDB (Protein Data Bank) e submetidas a um alinhamento estrutural com o
modelo de TcKAP7 (FIGURA 35A) no programa WinCoot Esse alinhamento pode
ser visualizado na figura 37 As regiotildees em vermelho representam as regiotildees de
TcKAP7 que apresentam interaccedilatildeo com DNA pois se alinham com as regiotildees de
ligaccedilatildeo agrave DNA das outras proteiacutenas e as regiotildees em azul representam regiotildees sem
homologia com as demais
Esse resultado sugere que TcKAP7 pode interagir com DNA com isso estes
dados podem ser utilizados para nortear mais estudos sobre a interaccedilatildeo das
proteiacutenas KAPrsquos com o DNA do cinetoplasto de T cruzi
93
FIGURA 37 ALINHAMENTO ESTRUTURAL DE 3TQ6 4NOD 3TTM 4NNU E TCKAP7 LEGENDA Em vermelho encontram-se as regiotildees de TcKAP7 que podem interagir com DNA (Resiacuteduos 1-67 e 140-166) e em azul regiotildees sem homologia com as demais
4132 Anaacutelises preliminares da possiacutevel interaccedilatildeo entre TcKAP7 e kDNA
As prediccedilotildees estruturais sugeriram que a proteiacutena TcKAP7 possui motivos
similares agrave proteiacutenas que interagem com DNA No entanto a sequecircncia de
aminoaacutecidos entre as proteiacutenas eacute bastante baixa Como a funccedilatildeo de TcKAP7
permanece obscura foram realizados alguns ensaios para tentar verificar a
possibilidade desta proteiacutena interagir com kDNA Para isto utilizou-se a teacutecnica de
dicroiacutesmo circular para avaliar se a presenccedila de kDNA poderia resultar em
alteraccedilotildees estruturais em TcKAP7 o que seria uma evidecircncia da possiacutevel interaccedilatildeo
entre esta proteiacutena e o aacutecido nucleico
Foram realizadas medidas de dicroiacutesmo circular com amostras de TcKAP7
kDNA e TcKAP7 na presenccedila de kDNA Para a anaacutelise de dados foi realizado o
somatoacuterio das curvas obtidas com as amostras de TcKAP7 e kDNA separadamente
Este somatoacuterio resultou em uma curva teoacuterica que indica o perfil teoacuterico de uma
amostra contendo TcKAP7 e kDNA sem interaccedilotildees presentes Aacute essa curva foi
sobreposta a curva experimental da medida de dicroiacutesmo circular de TcKAP7 na
94
presenccedila de kDNA A figura 38 ilustra essa sobreposiccedilatildeo onde pode-se verificar que
as curvas natildeo se sobrepotildeem portanto alteraccedilotildees estruturais ocorrem em TcKAP7
na presenccedila de kDNA
FIGURA 38 ESPECTRO DE DICROIacuteSMO CIRCULAR DE TcKAP7 LEGENDA Em azul encontra-se o espectro experimental de TcKap7 na presenccedila de DNA em vermelho o espectro teoacuterico de TcKAP7 e DNA
Para investigar mudanccedilas estruturais associadas a interaccedilatildeo com kDNA foi
realizada uma coleta de dados de SAXS na presenccedila de 1ug de kDNA
A comparaccedilatildeo dos modelos de baixa resoluccedilatildeo por SAXS indica uma
diferenccedila conformacional pontual da proteiacutena na presenccedila de kDNA As figuras 28 e
29 mostram os envelopes da proteiacutena TcKAP7na ausecircncia (FIGURAS 39A e 40A) e
presenccedila de kDNA de T cruzi (FIGURA 39B e FIGURA 40B) Percebe-se uma
diferenccedila de densidade eletrocircnica na regiatildeo da heacutelice (Residuos 140 - 166
evidenciados em vermelho) No envelope de TcKAP7 ela eacute bastante flexiacutevel e natildeo eacute
observada densidade eletrocircnica nessa regiatildeo no entanto na presenccedila de kDNA
essa mesma regiatildeo mostra-se mais riacutegida e eacute possiacutevel estimar seu posicionamento
baseado na densidade eletrocircnica Aleacutem disso essa heacutelice eacute predita como interatora
de DNA com base nas anaacutelises estruturais previamente realizadas nesse trabalho
Esses dados sugerem uma mudanccedila conformacional da proteiacutena na presenccedila
do kDNA fazendo com que esta mude seu arranjo estrutural para permanecer ligada
agrave moleacutecula de DNA sugerindo uma interaccedilatildeo entre TcKAP7 e DNA do cinetoplasto
-22
-17
-12
-7
-2
3
200 210 220 230 240 250 260
ϴM
RW
x 1
03
(de
g cm
-2 d
mo
l-1)
Comprimento de onda (nm)
Kap7+DNA
95
de T cruzi Esses dados corroboram com o que foi visto na superfiacutecie eletrostaacutetica
(FIGURA 36) e no alinhamento estrutural (FIGURA 37)
FIGURA 39 ENVELOPE MOLECULAR DETcKAP7 LEGENDA A Monocircmero de TcKAP7 ajustado ao envelope de SAXS B Monocircmero de TcKAP7 + kDNA ajustado ao envelope de SAXSResiduos 140- 166 evidenciados em vermelho
96
FIGURA 40 ENVELOPE MOLECULAR DE TcKAP7 VISTO EM DIFERENTES AcircNGULOS LEGENDA A Monocircmero de TcKAP7 ajustado ao envelope de SAXS B Monocircmero de TcKAP7 + kDNA ajustado ao envelope de SAXS Residuos 140- 166 evidenciados em vermelho
97
5 DISCUSSAtildeO
O Trypanosoma cruzi pertence a um grupo que divergiu muito cedo na
linhagem eucarioacutetica apresentando diversas caracteriacutesticas uacutenicas em relaccedilatildeo a
outros eucariotos Uma dessas caracteriacutesticas eacute a presenccedila de uma mitococircndria
uacutenica ramificada pelo corpo do protozoaacuterio contendo uma regiatildeo especializada o
cinetoplasto onde reside o DNA mitocondrial tambeacutem conhecido como kDNA O
kDNA eacute composto por uma rede de moleacuteculas interligadas entre si os maxiciacuterculos e
os miniciacuterculos (SHAPIRO amp ENGLUND 1995) Mais de 30 proteiacutenas envolvidas na
replicaccedilatildeo e na manutenccedilatildeo do kDNA jaacute foram identificadas e acredita-se que um
nuacutemero aproximado de 100 proteiacutenas muitas delas presentes apenas em
cinetoplastiacutedeos possam estar envolvidas nesses processos (LIU et al 2005) A
maioria dessas proteiacutenas foi identificada em T brucei e C fasciculata e
possivelmente vaacuterias delas principalmente aquelas envolvidas em replicaccedilatildeo
devem estar codificadas no genoma do T cruzi
Apesar de serem conhecidos muitos dos componentes da maquinaria de
replicaccedilatildeo dos miniciacuterculos e maxiciacuterculos natildeo se pode dizer o mesmo para as
proteiacutenas envolvidas na manutenccedilatildeo da estrutura do kDNA Com exceccedilatildeo de 4
proteiacutenas com caracteriacutesticas de histonas H1 (KAP1 a 4) encontradas associadas ao
cinetoplasto de C fasciculata pouco ainda eacute conhecido sobre as proteiacutenas que
participam da organizaccedilatildeo do kDNA em outros tripanosomatiacutedeos
Zavala-Castro e colaboradores (2002) identificaram sete proteiacutenas variando
de 19 a 31 kDa associadas ao kDNA de formas epimastigotas de T cruzi a partir
de kDNA extraiacutedo de ceacutelulas fixadas com formaldeiacutedo Os tamanhos observados satildeo
compatiacuteveis com aqueles das KAPs encontradas por Xu e Ray (1993) usando
experimento similar em C fasciculata entretanto nenhuma das possiacuteveis KAPs
descritas por Zavala-Castro e colaboradores foi caracterizada
Noacutes iniciamos estudos objetivando identificar proteiacutenas envolvidas na
organizaccedilatildeo e segregaccedilatildeo do kDNA de T cruzi a partir dos dados fornecidos pelo
sequenciamento do genoma desse parasita fazendo uma comparaccedilatildeo com as
KAPs de C fasciculata Estudos realizados por Cavalcanti e colaboradores (2009)
usando como modelo as sequecircncias de KAPs de C fasciculata identificaram 35
proteiacutenas relacionadas em diferentes tripanosomatiacutedeos cujos genomas estatildeo
sequenciados (11 em T cruzi 7 em L braziliensis 6 em L major e L infantum e 5
98
em T brucei) Essas sequecircncias puderam ser agrupadas em 7 tipos diferentes de
KAPs (KAP1 a 7) Das 7 KAPs T cruzi possui 5 (TcKAP3 a 7) cuja a sintenia
gecircnica eacute uma das caracteriacutesticas marcantes jaacute que alguns genes divergem em
relaccedilatildeo ao tamanho e portanto no tamanho da proteiacutena codificada As KAPs de T
cruzi e T brucei satildeo maiores do que as de C fasciculata e Leishmania spp Isso
pode sugerir que KAPs possam ter evoluiacutedo para um tamanho que comporte
basicamente suas funccedilotildees de associaccedilatildeo com o kDNA de maneira mais eficiente
Os resultados obtidos por Cavalcanti et al (2009) para TcKAP4 e TcKAP6
mostraram que em epimastigotas e amastigotas estas duas proteiacutenas estatildeo
distribuiacutedas ao longo de toda a rede de kDNA consistente com o que foi observado
em C fasciculata (XU et al 1996 HINES amp RAY 1998) poreacutem CfKAP4 tambeacutem
apresentou um padratildeo de marcaccedilatildeo nos poacutelos opostos do kDNA sugerindo que
essa KAP em particular se associe aos miniciacuterculos receacutem-replicados antes de sua
reintegraccedilatildeo agrave rede de kDNA (XU et al 1996) Contudo em tripomastigotas de T
cruzi estas duas proteiacutenas estatildeo distribuiacutedas na periferia da rede de kDNA
(CAVALCANTI et al 2009) indicando que diferente de C fasciculata elas
apresentam uma dinacircmica de associaccedilatildeo que depende da forma evolutiva do
parasita possivelmente refletindo distintas interaccedilotildees com proteiacutenas da rede de
kDNA em epimastigotas e tripomastigotas No presente trabalho ampliamos o
conhecimento sobre as KAPs de T cruzi estudando o papel da KAP7 na fisiologia
desse parasita
Em C fasciculata a regulaccedilatildeo da expressatildeo de vaacuterios genes que codificam
proteiacutenas mitocondriais ocorre durante o ciclo celular em parte por uma sequumlecircncia
consenso [(CA)AUAGAA(GA)] presente nas regiotildees 5rsquo e 3rsquo-UTR dos respectivos
mRNAs (BROWN amp RAY 1997 MAHMOOD et al 1999 MAHMOOD amp RAY 1998
PASION et al 1996) O mesmo foi observado para L major onde uma sequecircncia
parecida com aquela encontrada em C fasciculata (CATAGA) foi identificada nas
regiotildees 5rsquo e 3rsquo de vaacuterios genes cuja a expressatildeo era maior na fase S do ciclo celular
(ZICK et al 2005) Analisando as regiotildees 5rsquo e 3rsquo do transcrito do gene TOP2 de T
cruzi que codifica a topo II mitocondrial descrito por Fragoso e Goldenberg (1992)
tambeacutem podemos observar a sequecircncia CATAGA repetida duas vezes na regiatildeo
5rsquoUTR e uma vez na regiatildeo 3rsquo-UTR do transcrito desse gene
Como relatamos neste trabalho a sequecircncia da regiatildeo 5rsquo-UTR do transcrito
TcKAP7 natildeo mostrou nenhum elemento com as caracteriacutesticas daquele envolvido na
99
regulaccedilatildeo de genes expressos na fase S do ciclo celular de outros
tripanosomatiacutedeos
Em relaccedilatildeo agrave localizaccedilatildeo de TcKAP7 verificamos atraveacutes de ensaios de
imunofluorescecircncia a distribuiccedilatildeo de TcKAP7 na regiatildeo dos poacutelos da rede de kDNA
das formas epimastigotas de T cruzi poreacutem ainda natildeo analisamos como esta
proteiacutena estaacute distribuiacuteda nas formas tripomastigotas que possuem a rede de kDNA
com formato arredondado e menos compactada
A localizaccedilatildeo de KAP7 na regiatildeo dos poacutelos do cinetoplasto de T cruzi
sugere que ela tenha funccedilotildees na replicaccedilatildeo da rede de kDNA pois nessa regiatildeo
estatildeo concentradas diversas proteiacutenas necessaacuterias para finalizaccedilatildeo do processo de
replicaccedilatildeo de miniciacuterculos
Para a construccedilatildeo do modelo molecular de TcKAP7 foram utilizadas
estruturas de duas proteiacutenas a estrutura da proteiacutena HMGB1 (2GZK) para a porccedilatildeo
amino-terminal e a estrutura da proteiacutena fator A de transcriccedilatildeo mitocondrial (3TQ6)
para a porccedilatildeo carboxi-terminal da proteiacutena ambas apresentam alta similaridade em
relaccedilatildeo agrave estrutura secundaacuteria (mais de 90) e tratam-se de proteiacutenas de um
mesmo grupo HMG (High-mobility group) Em T brucei TbKAP6 uma proteiacutena do
grupo HMG estaacute envolvida na replicaccedilatildeo e manutenccedilatildeo do kDNA (WANG et al
2014) Baseado nesses dados juntamente com os dados da imunofluorescecircncia
indireta pode-se sugerir um papel de TcKAP7 na replicaccedilatildeo da rede de kDNA
Embora ainda natildeo saibamos como KAP7 se associa com o kDNA de T
cruzi eacute possiacutevel que isso ocorra de duas maneiras atraveacutes de ligaccedilotildees
eletrostaacuteticas natildeo-especiacuteficas ou de interaccedilotildees com regiotildees especiacuteficas dos
miniciacuterculos
Atraveacutes de ensaios de SAXS foi possiacutevel perceber que a proteiacutena sofre
alteraccedilotildees conformacionais na presenccedila do kDNA sugerindo sua interaccedilatildeo com
esse aacutecido nucleacuteico Esta interaccedilatildeo pode ser eletrostaacutetica uma vez que a anaacutelise da
superfiacutecie eletrostaacutetica de TcKAP7 mostrou a predominacircncia de regiotildees ricas em
aminoaacutecidos com cargas positivas que podem conferir afinidades agrave outras proteiacutenas
com carga superficial negativa ou mesmo aacutecidos nucleicos mais uma vez sugerindo
a interaccedilatildeo com kDNA
Poreacutem natildeo se pode descartar a possibilidade de que a interaccedilatildeo de TcKAP7
com o kDNA seja atraveacutes de interaccedilotildees com regiotildees especiacuteficas dos miniciacuterculos
Nos tripanosomatiacutedeos a rede de kDNA assume a forma de um disco achatado
100
perpendicular ao flagelo onde os miniciacuterculos estatildeo alinhados em fibrilas orientadas
paralelamente ao eixo do disco (LIU et al 2005) Acredita-se que a ordenaccedilatildeo e
compactaccedilatildeo dos miniciacuterculos estatildeo relacionadas agrave proacutepria estrutura da moleacutecula de
miniciacuterculo Os miniciacuterculos apresentam regiotildees ricas em A+T que podem causar
curvaturas na moleacutecula (MARINI et al 1984 NTAMBI et al 1984) facilitando sua
inserccedilatildeo de forma ordenada no disco de kDNA aleacutem disso possuem regiotildees
conservadas onde estatildeo localizadas as origens de replicaccedilatildeo Essas regiotildees por
sua vez podem ser reconhecidas por proteiacutenas tais como a KAP7 que ajudam a
estabilizar a estrutura Os resultados com C fasciculata mostram que KAP2 3 e 4 se
ligam em regiotildees especiacuteficas dos miniciacuterculos ricas em A+T mas que natildeo satildeo
aquelas que geram a curvatura das moleacuteculas (XU et al 1996) Contudo KAP1 se
liga de maneira inespeciacutefica aos miniciacuterculos (HINES amp RAY 1998) Aleacutem disso
existe a sequecircncia universal de miniciacuterculo (UMS) e as proteiacutenas que se ligam a
essa sequecircncia (UMSBP) as quais podem participar de interaccedilotildees com as KAPrsquos
Em C fasciculata CfKAP3 sozinha consegue condensar a rede de kDNA e inibir a
decatenaccedilatildeo pela enzima topo II Poreacutem a interaccedilatildeo entre CfKAP3 e CfUMSBP
pode descondensar a rede de kDNA e reestabelecer a decatenaccedilatildeo mediada pela
topo II indicando que as proteiacutenas KAPrsquos dos tripanosomatiacutedeos podem apresentar
diferentes funccedilotildees em diferentes espeacutecies (KAPELLER et al 2011)
Para investigar a importacircncia de TcKAP7 no T cruzi e seu envolvimento ou
natildeo com o rearranjo topoloacutegico do kDNA durante o processo de diferenciaccedilatildeo do
parasita realizamos a deleccedilatildeo do gene TcKAP7 Nenhuma alteraccedilatildeo estrutural ou
morfoloacutegica na rede de kDNA foi observada no mutante de T cruzi para TcKAP7 Do
mesmo modo o parasita mutante natildeo apresentou perfil de crescimento alterado e
foi capaz de se diferenciar nas formas tripomastigotas metaciacuteclicas e infectar ceacutelulas
VERO onde se diferenciaram em formas amastigotas O mesmo foi visto quando foi
realizado o nocaute do gene TcKAP3 (DE SOUZA et al 2010)
Uma das hipoacuteteses para explicar esse fato eacute que alguma outra KAP de T
cruzi possa estar assumindo o papel da TcKAP7 talvez a TcKAP4 que se localiza
nos poacutelos do cinetoplasto quando da inserccedilatildeo dos miniciacuterculos na rede apoacutes serem
replicados na regiatildeo cinetoflagelar A redundacircncia no papel das KAPs faz com que a
rede de kDNA seja compactada e segregada corretamente mesmo na ausecircncia de
uma delas (DE SOUZA et al 2010) Sabe-se que o nocaute do gene Cfkap2 ou do
gene Cfkap3 separadamente natildeo mostrou nenhuma alteraccedilatildeo no fenoacutetipo de C
101
fasciculata Poreacutem a deleccedilatildeo de ambos os genes causou diversas alteraccedilotildees
aumento nos niacuteveis de mRNAs mitocondriais reduccedilatildeo na respiraccedilatildeo inibiccedilatildeo da
divisatildeo celular e acuacutemulo de ceacutelulas com morfologias anormais (AVLIYAKULOV et
al 2004)
Com o intuito de complementar os estudos para a caracterizaccedilatildeo do gene
TcKAP7 foram realizados ensaios de RNA de interferecircncia visando analisar a
funccedilatildeo do gene TbKAP7 ortoacutelogo em T brucei jaacute que a maquinaria de RNAi em T
cruzi eacute inexistente (DA ROCHA et al 2003) Com isso foi visto que a participaccedilatildeo da
TbKAP7 no metabolismo do T brucei eacute essencial jaacute que o silenciamento do gene
TbKAP7 levou agrave reduccedilatildeo da proliferaccedilatildeo celular do parasita corroborando com os
dados encontrados para TbKAP6 (WANG et al 2014)
Esperamos que o conhecimento das diversas moleacuteculas envolvidas na
organizaccedilatildeo e replicaccedilatildeo da rede de kDNA assim como o entendimento dos
mecanismos fisioloacutegicos que ocorrem nesta estrutura tatildeo peculiar que eacute o
cinetoplasto dos tripanosomatiacutedeos possam nos ajudar a esclarecer vaacuterios aspectos
relacionados a biologia destes eucariotos primitivos e a evoluccedilatildeo do genoma
mitocondrial ao longo do processo evolutivo
102
6 CONCLUSOtildeES
Com base nos resultados observados neste trabalho foi possiacutevel concluir
1 ndash A proteiacutena TcKAP7 eacute uma proteiacutena associada ao cinetoplasto de T
cruzi e possui caracteriacutesticas que a identificam como KAPs do tipo histona H1
incluindo seu tamanho e sua composiccedilatildeo de aminoaacutecidos e sua superfiacutecie
eletrostaacutetica
2 ndash TcKAP7 estaacute localizada nos poacutelos do cinetoplasto de T cruzi podendo
estar envolvida na replicaccedilatildeo dos miniciacuterculos
3 - TcKAP7 sofre mudanccedilas conformacionais na presenccedila do kDNA de T
cruzi evidenciando sua interaccedilatildeo com o aacutecido nucleico
4 ndash O mutante de T cruzi para TcKAP7 natildeo apresentou alteraccedilatildeo na
estrutura do cinetoplasto e na morfologia do parasita
5 ndash A proliferaccedilatildeo e a diferenciaccedilatildeo do T cruzi natildeo foram alteradas quando
o parasita teve o gene TcKAP7 deletado do genoma
6 ndash O silenciamento do gene TbKAP7 eacute essencial no metabolismo do T
brucei levando agrave reduccedilatildeo da proliferaccedilatildeo celular do parasita
103
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RESUMO
O DNA do cinetoplasto (kDNA) dos tripanosomatiacutedeos consiste numa rede de
moleacuteculas circulares catenadas entre si os miniciacuterculos e os maxiciacuterculos Os
miniciacuterculos codificam RNAs guias (gRNAs) e os maxiciacuterculos codificam para
algumas subunidades de enzimas mitocondriais e rRNA em um padratildeo
criptografado (ediccedilatildeo de RNA) Estudos com o tripanosomatiacutedeo Crithidia fasciculata
mostraram que proteiacutenas do tipo histona H1 associadas ao cinetoplasto (KAPs) satildeo
capazes de condensar a rede de kDNA Poreacutem pouco eacute conhecido sobre estas
proteiacutenas de Trypanosoma cruzi um protozoaacuterio parasita que sofre alteraccedilotildees na
estrutura do DNA do cinetoplasto ao longo de seu ciclo de vida Neste trabalho foi
caracterizada uma proteiacutena associada ao cinetoplasto de T cruzi denominada de
TcKAP7 que possui baixo peso molecular e natureza baacutesica condizente com um
papel na neutralizaccedilatildeo de carga e na condensaccedilatildeo do DNA Atraveacutes de ensaios
usando a teacutecnica de espalhamento de raios-X a baixo acircngulo (SAXS) foi possiacutevel
perceber que a proteiacutena TcKAP7 sofre mudanccedilas estruturais na presenccedila do kDNA
sugerindo uma interaccedilatildeo com essa estrutura seja atraveacutes de ligaccedilotildees eletrostaacuteticas
ou atraveacutes de ligaccedilotildees especiacuteficas com moleacuteculas presentes na rede A anaacutelise pela
teacutecnica de imunofluorescecircncia mostrou que proteiacutena TcKAP7 estaacute localizada na
regiatildeo dos poacutelos do cinetoplasto o que sugere que pode estar envolvida na
finalizaccedilatildeo da replicaccedilatildeo dos miniciacuterculos Mutante nulo para TcKAP7 foi gerado por
teacutecnicas de substituiccedilatildeo gecircnica a fim de verificar se na ausecircncia de TcKAP7
ocorriam alteraccedilotildees na estrutura do kDNA Contudo os parasitas mutantes para
TcKAP7 natildeo apresentavam alteraccedilotildees na estrutura e morfologia do cinetoplasto
quando analisados por microscopia eletrocircnica e foram capazes de se diferenciar
sem perder a capacidade infectiva Entretanto ensaios de RNA de interferecircncia
visando analisar a funccedilatildeo do gene TbKAP7 ortoacutelogo em T brucei levou agrave reduccedilatildeo
da proliferaccedilatildeo celular das formas prociacuteclicas desse parasita mostrando que este
gene eacute essencial para o metabolismo desse tripanosomatiacutedeo sugerindo que KAP7
possa ter papeis distintos em T cruzi e T brucei
Palavras-chaves Trypanosoma cruzi cinetoplasto nocaute KAPs
ABSTRACT
The kinetoplast DNA (kDNA) of trypanosomatids consists in a network of circular
molecules catenated each other the minicircles and maxicircles The minicircles
code RNAs guides (gRNAs) and the maxicircles code for some subunits of
mitochondrial enzymes and rRNA in a cryptic pattern (RNA editing) Studies in the
trypanosomatid protozoan Crithidia fasciculata showed that the kDNA is associated
with histone H1-like proteins known as kinetoplast-associated proteins (KAPs) wich
are capable of condensing the kDNA network However little is known about these
proteins of Trypanosoma cruzi a protozoan parasite which undergoes changes in
kinetoplast DNA structure over its life cycle Here we characterize a protein
associated with T cruzi kinetoplast named TcKAP7 TcKAP7 is a low molecular
weight protein with basic nature which is consistent with a role in DNA charge
neutralization and condensation Analysis by small angle X-Ray scattering technique
(SAXS) revealed that the TcKAP7 protein undergoes structural changes in the
presence kDNA suggesting an interaction with this DNA network either through
electrostatic bonds or through specific binding to molecules present on the network
The immunofluoresce analysis showed that TcKAP7 is located in the kinetoplast
poles suggesting that TcKAP7 might be involved in the late stages of the minicircle
replication A null mutant for TcKAP7 was obtained by gene replacement techniques
to study possible alterations in the kDNA structure However no modification in the
structure and morphology of the kinetoplast was observed by electron microscopy In
addition Tckap7 null mutant was able to differentiate without losing its infective
capacity Interference RNA assays was performed to analyze the function of
TbKAP7 the ortholog gene in T brucei The ablation of TbKAP7 expression leaded
to reduction in the procyclic proliferation suggesting that this gene is essential for the
metabolism of the parasite and might play distinct roles in T cruzi and T brucei
Key-words Trypanosoma cruzi kinetoplast gene knockout KAPs
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1 DISTRIBUICcedilAtildeO GEOGRAacuteFICA DA DOENCcedilA
DE CHAGAS19 FIGURA 2 CICLO DE TRANSMISSAtildeO DO
Trypanosoma cruzi20 FIGURA 3 ESQUEMA GERAL DAS PRINCIPAIS ESTRUTURAS
CELULARES DE T cruzi 22 FIGURA 4 REDE DE kDNA27 FIGURA 5 DIFERENTES ARRANJOS DO CINETOPLASTO
DE T cruzi29 FIGURA 6 MUDANCcedilAS NA POSICcedilAtildeO DO KDNA
NOS TRYPANOSOMAS29 FIGURA 7 REPOSICIONAMENTO DO KDNA EM RELACcedilAtildeO
AgraveS OUTRAS ORGANELAS DURANTEO CICLO DE VIDA DE UM FLAGELADO30
FIGURA 8 REPLICACcedilAtildeO DO kDNA32 FIGURA 9 REPRESENTACcedilAtildeO ESQUEMAacuteTICA DO
MICROFLUIDIFICADOR45 FIGURA 10 VETOR PARA EXPRESSAtildeO EM T CRUZI
P3XFLAG 50 FIGURA 11 ESQUEMA DA CONSTRUCcedilAtildeO DOS VETORES
UTILIZADOS PARA O NOCAUTE DO GENE TcKAP755
FIGURA 12 MAPA DO VETOR P2T7-177 UTILIZADO PARA ENSAIOS DE RNAi62
FIGURA 13 COMPARACcedilAtildeO ENTRE AS SEQUumlEcircNCIAS DE AMINOAacuteCIDOS DEDUZIDAS DO GENE KAP7 DE T cruzi Dm28C E DOS HAPLOacuteTIPOS DE CL BRENER65
FIGURA 14 COMPARACcedilAtildeO ENTRE AS SEQUumlEcircNCIAS DE AMINOAacuteCIDOS DEDUZIDAS DO GENE KAP7 EM DIFERENTES TRIPANOSOMATIacuteDEOS66
FIGURA 15 SINTENIA DE TcKAP7 COM OUTROS TRIPANOSOMATIacuteDEOS67
FIGURA 16 CARACTERIZACcedilAtildeO DA REGIAtildeO 5rsquo-UTR DO TRANSCRITO TcKAP769
FIGURA17 ANAacuteLISE DA EXPRESSAtildeO DA PROTEIacuteNA DE FUSAtildeO TCKAP7-FLAG EM FORMAS EPIMASTIGOTAS DE T CRUZI70
FIGURA 18 IMUNOLOCALIZACcedilAtildeO DE TcKAP7 EM EPIMASTIGOTAS DE T CRUZI71
FIGURA 19 ENSAIOS DE PCR UTILIZANDO DNA DE T cruzi kap7kap7 (WT) E T cruzi kap7neokap7higro (NO) COM DIFERENTES PRIMERS73
FIGURA 20 REPRESENTACcedilAtildeO ESQUEMAacuteTICA DOS SIacuteTIOS DA ENZIMA HindIII NO LOCUS DO GENE KAP7 DE T cruzi CL Brener75
FIGURA 21 ANAacuteLISE DA ORGANIZACcedilAtildeO DOS GENES TCKAP7 NEO E HIGRO POR ENSAIO DO TIPO SOUTHERN BLOT75
FIGURA 22 COMPARACcedilAtildeO DA EXPRESSAtildeO DO GENE TcKAP7 POR WESTERN BLOT76
FIGURA 23 COLORACcedilAtildeO PELO MEacuteTODO PANOacuteTICO RAacutePIDO DOS PARASITAS EPIMASTIGOTAS NOCAUTEADOS77
FIGURA 24 COMPARACcedilAtildeO ENTRE A ULTRAESTRUTURA DO CINETOPLASTO DO T cruzi DM28C TIPO SELVAGEM (A) E DO MUTANTE DE T cruzi PARA TcKAP7 (B) POR MICROSCOPIA ELETROcircNICA DE TRANSMISSAtildeO78
FIGURA 25 CURVA DE CRESCIMENTO DO MUTANTE DE T cruzi PARA TcKAP7 (KO) E DO T cruzi Dm28c SELVAGEM (WT) 79
FIGURA 26 METACICLOGEcircNESE IN VITRO DE T cruzi Dm28c TIPO SELVAGEM E T cruzi NOCAUTEADO80
FIGURA 27 RNAi DE TbKAP7 INIBE O CRESCIMENTO DAS FORMAS PROCIacuteCLICAS DE T brucei82
FIGURA 28 PURIFICACcedilAtildeO DE TCKAP7 ATRAVEacuteS DE CROMATOGRAFIA DE AFINIDADE83
FIGURA 29 PURIFICACcedilAtildeO DE TCKAP7 ATRAVEacuteS DE CROMATOGRAFIA DE TROCA IOcircNICA84
FIGURA 30 ANAacuteLISE POR DLS DE TCKAP785 FIGURA 31 ENVELOPE MOLECULAR DE SAXS86 FIGURA 32 ESPECTRO DE DICROIacuteSMO CIRCULAR DE
TcKAP787 FIGURA 33 PREDICcedilAtildeO DE ESTRUTURA SECUNDAacuteRIA DE
TcKAP787 FIGURA 34 CRISTAL DE TcKAP7 DE T CRUZI88 FIGURA 35 ESTRUTURA DE TcKAP790 FIGURA 36 SUPERFIacuteCIE ELETROSTAacuteTICA DE
TcKAP791 FIGURA 37 ALINHAMENTO ESTRUTURAL DE 3TQ6 4NOD
3TTM 4NNU E TCKAP793 FIGURA 38 ESPECTRO DE DICROIacuteSMO CIRCULAR
DE TcKAP794 FIGURA 39 ENVELOPE MOLECULAR DETcKAP795 FIGURA 40 ENVELOPE MOLECULAR DETcKAP7 VISTO EM
DIFERENTES AcircNGULOS96
LISTA DE TABELAS
TABELA 1 RELACcedilAtildeO DOS PRIMERS UTILIZADOS PARA A CLONAGEM DA REGIAtildeO UPSTREAM DE TcKAP7 NO VETOR pNEO153
TABELA 2 RELACcedilAtildeO DOS PRIMERS UTILIZADOS PARA A CLONAGEM DA REGIAtildeO DOWNSTREAM DE TcKAP7 NO VETOR pNEO153
TABELA 3 RELACcedilAtildeO DOS PRIMERS UTILIZADOS PARA A AMPLIFICACcedilAtildeO DO GENE TbKAP763
TABELA 4ndash PERCENTUAL DE IDENTIDADE ENTRE AS PROTEIacuteNAS KAP7 NOS TRIPANOSSOMATIacuteDEOS COM O GENOMA SEQUENCIADO67
TABELA 5 COMBINACcedilOtildeES DE PRIMERS UTILIZADOS NA PCR PARA CONFIRMAR O NOCAUTE DE TcKAP772
SUMAacuteRIO
1 INTRODUCcedilAtildeO18 11 O Trypanosoma cruzi18 12 Ciclo de vida do T cruzi20 13 Aspectos celulares de T cruzi21 14 O genoma de T cruzi24 15 Expressatildeo gecircnica de Tcruzi25 16 O cinetoplasto26 17 A rede de kDNA26 171 Replicaccedilatildeo do kDNA31 18 Proteiacutenas associadas ao cinetoplasto (KAPs)32 2 OBJETIVOS35 21 OBJETIVO GERAL35 211 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS35 3 MATERIAIS E MEacuteTODOS36 31 Reagentes e Soluccedilotildees Utilizados36 311 Reagentes36 312 Tampotildees e Soluccedilotildees36 313 Meios de cultura38 32 Cultivo do Trypanosoma cruzi38 321 Epimastigotas38 322 Tripomastigotas metaciacuteclicos39 33 Curva de crescimento de T cruzi39 34 Obtenccedilatildeo de DNA de T cruzi40 35 Obtenccedilatildeo de kDNA de T cruzi40 36 Obtenccedilatildeo de extrato proteico de T cruzi40 37 Clonagem do gene TcKAP741 38 Obtenccedilatildeo do cDNA de TcKAP7 atraveacutes de ensaio de RT-PCR41 39 Seleccedilatildeo dos clones recombinantes42 391 Teacutecnica de palitagem (toothpick)42 392 Teacutecnica de PCR de colocircnia43 310 Preparaccedilatildeo de plasmiacutedeo em pequena escala (miniprep)43 311 Expressatildeo da proteiacutena TcKAP7 em E coli43 312 Purificaccedilatildeo da proteiacutena recombinante TcKAP744 3121 Processamento da amostra44 3122 Cromatografia de afinidade45 3123 Cromatografia de troca iocircnica46 3124 Cromatografia de gel filtraccedilatildeo46 313 Espalhamento Dinacircmico de Luz ndash DLS46 314 Espectroscopia de dicroiacutesmo circular (CD)46 315 Quantificaccedilatildeo e concentraccedilatildeo47 316 Ensaios de Cristalizaccedilatildeo47 317 Espalhamento de raio-X a baixo acircngulo (SAXS)48 318 Modelagem de TcKAP748 319 Obtenccedilatildeo de antissoro policlonal contra TcKAP749 320 Anaacutelise da expressatildeo do gene TcKAP7 e de seu mutante por ensaio tipo western blot49 321 Superexpressatildeo de TcKAP750
3211 Amplificaccedilatildeo e clonagem do gene TcKAP7 no vetor pNEO3xFlag para superexpressatildeo da proteiacutena50 3212 Transfecccedilatildeo por eletroporaccedilatildeo52 3213 Seleccedilatildeo dos transfectantes52 322 Deleccedilatildeo do gene TcKAP7 por nocaute gecircnico53 3221 Amplificaccedilatildeo e clonagem das regiotildees a montante e a jusante do gene TcKAP753 3222 Amplificaccedilatildeo dos cassetes UPS-NEO-DOWN e UPS-HIGRO-DOWN para transfecccedilatildeo de T cruzi55 3223 Transfecccedilatildeo do T cruzi com o cassete UPS-NEO-DOWN56 3224 Extraccedilatildeo de DNA dos transfectantes57 3225 Anaacutelise por PCR do DNA dos parasitas transfectados com o cassete UPS-NEO-DOWN57 3226 Transfecccedilatildeo do T cruzi com o cassete UPS-HIGRO-DOWN57 3227 Anaacutelise por PCR do DNA dos parasitas transfectados com o cassete UPS-HIGRO-DOWN58 3228 Anaacutelise da organizaccedilatildeo do gene TcKAP7 e da eficiecircncia de seu nocaute atraveacutes de ensaio do tipo Southern blot58 323 Localizaccedilatildeo celular da proteiacutena TcKAP7 atraveacutes de ensaio de imunofluorescecircncia59 324 Anaacutelise da ultraestrutura do cinetoplasto do mutante de T cruzi para TcKAP7 por microscopia eletrocircnica de transmissatildeo60 325 Coloraccedilatildeo dos parasitas transfectados60 326 Infecccedilatildeo de ceacutelulas Vero com o mutante de T cruzi para TcKAP761 327 Anaacutelise da funccedilatildeo do gene TbKAP7 de Trypanosoma brucei atraveacutes de ensaios de RNA de interferecircncia61 3271 Induccedilatildeo do RNA dupla fita64 4 RESULTADOS65 41 Clonagem e caracterizaccedilatildeo do gene TcKAP765 42 Expressatildeo da proteiacutena TcKAP7 em T cruzi69 43 Localizaccedilatildeo celular de TcKAP7 atraveacutes de ensaio de imunofluorescecircncia70 44 Deleccedilatildeo do gene TcKAP7 por nocaute gecircnico71 441 Anaacutelise por PCR do DNA dos parasitas transfectados com os cassetes UPS-NEO-DOWN e UPS-HIGRO-DOWN72 442 Anaacutelise da organizaccedilatildeo dos genes TcKAP7 neo e higro por ensaio do tipo Southern blot74 45 Comparaccedilatildeo da expressatildeo do gene TcKAP7 por western blot76 46 Anaacutelise da morfologia e da ultraestrutura do cinetoplasto do mutante de T cruzi para TcKAP776 47 Multiplicaccedilatildeo diferenciaccedilatildeo e infectividade do mutante de T cruzi para TcKAP779 48 Anaacutelise da funccedilatildeo do gene KAP7 de Trypanosoma brucei atraveacutes de ensaios de RNA de interferecircncia80 49 Caracterizaccedilatildeo estrutural de TcKAP782 491 Produccedilatildeo recombinante de TcKAP782 410 Anaacutelise do estado oligomeacuterico de TcKAP784 411 Anaacutelise do conteuacutedo de estrutura secundaacuteria de TcKAP7 recombinante86 412 Anaacutelise estrutural de TcKAP787
413 Investigaccedilatildeo de possiacuteveis funcionalidades baseadas na estrutura de TcKAP791 4131 Prediccedilatildeo de funccedilatildeo paraTcKAP791 4132 Anaacutelises preliminares da possiacutevel interaccedilatildeo entre TcKAP7 e kDNA93 5 DISCUSSAtildeO97 6 CONCLUSOtildeES102 7 REFEREcircNCIAS103
18
1 INTRODUCcedilAtildeO
11 O Trypanosoma cruzi
Trypanosoma cruzi eacute um protozoaacuterio flagelado unicelular pertencente ao
reino Protista subreino Protozoa filo Sarcomastigophora subfilo Mastigophora
classe Zoomastigophora ordem Kinetoplastida e famiacutelia Trypanosomatidae (LEVINE
et al 1980) A principal caracteriacutestica dessa ordem eacute a presenccedila de uma estrutura
singular o cinetoplasto que abriga em uma massa de DNA extranuclear
concentrado na mitococircndria uacutenica deste protista (SHAPIRO amp ENGLUND 1995) A
famiacutelia Trypanosomatidae inclui os seguintes gecircneros importantes Blastocrithidia
Crithidia Endotrypanum Herpetomonas Leishmania Leptomonas Phytomonas e
Trypanosoma O gecircnero Trypanosoma eacute um dos mais importantes dentro da famiacutelia
Trypanosomatidae por incluir uma seacuterie de espeacutecies causadoras de doenccedilas
humanas importantes como o Trypanosoma cruzi agente da doenccedila de Chagas
Trypanosoma rhodesiense e Trypanosoma gambiense agentes da doenccedila do sono
e de animais o Trypanosoma brucei Trypanosoma equiperdum e Trypanosoma
equinum (DE SOUZA 2015)
Este protozoaacuterio eacute um microrganismo heteroxecircnico com ciclo bioloacutegico
alternado entre hospedeiros vertebrados (mamiacuteferos) e invertebrados (triatomiacuteneos)
Existem diferentes formas de transmissatildeo da doenccedila dentre as quais se destaca a
via vetorial que consiste na transmissatildeo do parasita atraveacutes de excretas do inseto
vetor hematoacutefago pertencente agrave ordem Hemiacuteptera famiacutelia Reduvidae subfamiacutelia
Triatominae (DIAS et al 1956) A principal caracteriacutestica bioloacutegica dos triatomiacuteneos
eacute que satildeo obrigatoriamente hematoacutefagos e necessitam do repasto sanguiacuteneo para
completar o desenvolvimento (DIAS 2000) O parasita pode ainda ser transmitido
aos mamiacuteferos por transfusatildeo sanguiacutenea ou via oral e com menos frequecircncia por
via congecircnita acidentes de laboratoacuterio e transplantes de oacutergatildeos (BELTRAO HDE et
al 2009 STEINDEL et al 2008 TANOWITZ et al 1992) Praticamente todo tipo
de ceacutelula nucleada do hospedeiro mamiacutefero pode ser parasitada considerando o
tropismo das diferentes cepas (LENZI et al 1996) Outra caracteriacutestica deste
parasita eacute apresentar diferentes morfologias durante o ciclo bioloacutegico A classificaccedilatildeo
19
de suas formas baseia-se tambeacutem na posiccedilatildeo do cinetoplasto em relaccedilatildeo ao nuacutecleo
e do local de onde emerge o flagelo (HOARE 1971)
Foi no ano de 1909 no estado de Minas Gerais que Carlos Chagas meacutedico
sanitarista identificou pela primeira vez o protozoaacuterio parasita Trypanosoma cruzi
agente causador da Doenccedila de Chagas A doenccedila de Chagas eacute endecircmica na
Ameacuterica Latina sendo conhecida a existecircncia de vetores da doenccedila desde o sul dos
Estados Unidos agrave Argentina (FIGURA 1)
FIGURA 1 DISTRIBUICcedilAtildeO GEOGRAacuteFICA DA DOENCcedilA DE CHAGAS FONTE Modificado de httpwwwwhointen
Em 2008 o nuacutemero de indiviacuteduos infectados era estimado entre 16 e 18
milhotildees sendo que aproximadamente 90 milhotildees de pessoas estariam sob risco
de contaminaccedilatildeo na Ameacuterica Latina (WHO 2010)
Apesar de existirem drogas (Nifurtimox e Benzonidazol) para o tratamento
da doenccedila sua ineficaacutecia no estaacutegio crocircnico e sua accedilatildeo toacutexica acabam prejudicando
o paciente sem conseguir eliminar o parasita (BRENER et al 2000) Sem vacinas
ou tratamento quimioteraacutepico eficiente a principal estrateacutegia de controle limita-se agrave
prevenccedilatildeo da transmissatildeo por transfusatildeo sanguiacutenea e ao controle populacional dos
vetores triatomiacuteneos Aleacutem da sua importacircncia como patoacutegeno humano este micro-
organismo apresenta caracteriacutesticas peculiares que o tornam um excelente modelo
para o estudo de questotildees bioloacutegicas baacutesicas
Regiotildees endecircmicas
20
12 Ciclo de vida do T cruzi
O T cruzi apresenta um ciclo complexo na natureza sofrendo mudanccedilas
estruturais bioquiacutemicas e morfoloacutegicas de acordo com o ambiente em que se
encontra Formas replicativas epimastigotas e amastigotas dos hospedeiros
invertebrado e mamiacutefero respectivamente alternam-se com as formas infectivas e
natildeo proliferativas tripomastigotas metaciacuteclicas (proveniente do inseto vetor) e
tripomastigota sanguiacutenea (originaacuteria do mamiacutefero infectado) (FIGURA 2) (DE
SOUZA 1984)
FIGURA 2 CICLO DE TRANSMISSAtildeO DO Trypanosoma cruzi FONTE Infograacutefico Veniacutecio Ribeiro ICICTFIOCRUZ
Durante o repasto sanguiacuteneo do inseto vetor formas tripomastigotas
metaciacuteclicas atingem a corrente sanguiacutenea do hospedeiro pela lesatildeo da picada Esta
forma infectiva eacute capaz de invadir todos os tipos de ceacutelulas com exceccedilatildeo das
21
hemaacutecias Apoacutes a entrada do parasita na ceacutelula os tripomastigotas diferenciam-se
em uma forma replicativa denominada amastigota que apoacutes diversas divisotildees sofre
uma diferenciaccedilatildeo para um estaacutegio intermediaacuterio o epimastigota intracelular e
posteriormente para tripomastigota Quando ocorre a lise celular os tripomastigotas
satildeo liberados ao meio extracelular podendo entatildeo invadir ceacutelulas vizinhas atingir
novos tecidos atraveacutes da corrente sanguiacutenea ou ainda infectar um inseto vetor
durante o processo de hematofagia recomeccedilando o ciclo no hospedeiro
invertebrado No inseto as formas tripomastigotas diferenciam-se em epimastigotas
no tubo digestivo e migram para o intestino onde ocorrem as divisotildees binaacuterias Ao
atingirem a porccedilatildeo terminal do tubo digestivo ocorre a diferenciaccedilatildeo em
tripomastigotas metaciacuteclicos que satildeo eliminados juntamente com as fezes e urina do
triatomiacutedeo
A transformaccedilatildeo da forma epimastigota do T cruzi em tripomastigota
metaciacuteclica denominada metaciclogecircnese eacute de grande interesse de estudo pois
neste processo ocorrem diversas alteraccedilotildees morfoloacutegicas metaboacutelicas e de
expressatildeo gecircnica (GOLDENBERG et al 1985) A metaciclogecircnese que ocorre
naturalmente no intestino do inseto vetor pode ser mimetizada in vitro utilizando-se
meio quimicamente definido que simula as condiccedilotildees da urina do inseto vetor
(CONTRERAS et al 1985)
13 Aspectos celulares de T cruzi
O Trypanosoma cruzi apresenta aleacutem das organelas tiacutepicas da maioria das
ceacutelulas eucarioacuteticas como nuacutecleo retiacuteculo endoplasmaacutetico aparato de Golgi e
mitococircndria algumas estruturas peculiares (FIGURA 3) como os microtuacutebulos
subpeliculares a estrutura paraflagelar os reservossomos o cinetoplasto os
glicossomos e os acidocalcisomos exclusivos dos tripanosomatiacutedeos (revisto por
DE SOUZA 1984 1999 2002)
22
FIGURA 3 ESQUEMA GERAL DAS PRINCIPAIS ESTRUTURAS CELULARES DE T cruzi FONTE DOCAMPO et al 1975
A superfiacutecie celular dos tripanossomatiacutedeos eacute composta principalmente
pela membrana plasmaacutetica e pelos microtuacutebulos subpeliculares Pequenos
filamentos conectam fortemente os microtuacutebulos subpeliculares os quais se
apresentam espaccedilados de forma regular entre si e com a membrana plasmaacutetica (DE
23
SOUZA SANTANNA CUNHA-E-SILVA 2009) conferindo rigidez agrave ceacutelula e
resistecircncia ao rompimento mecacircnico
Todos os membros da famiacutelia Trypanosomatidae apresentam um flagelo
que emerge de uma aacuterea de invaginaccedilatildeo da membrana plasmaacutetica conhecida como
bolsa flagelar Devido agrave localizaccedilatildeo especiacutefica de vaacuterios receptores nesta aacuterea
acredita-se que a maior parte do traacutefego vesicular e entrada de nutrientes ocorram
nesta regiatildeo Outra invaginaccedilatildeo menor localizada proacutexima agrave bolsa flagelar o
citoacutestomo tambeacutem estaacute envolvida com a absorccedilatildeo de nutrientes (PORTO-
CARREIRO et al 2000)
O flagelo do T cruzi apresenta uma estrutura baacutesica semelhante a outros
flagelos sendo envolvido por uma membrana flagelar e contendo um axonema
tiacutepico que apresenta um padratildeo de nove pares de microtuacutebulos perifeacutericos e um par
central Associado ao flagelo deste parasita eacute encontrado um complexo arranjo de
filamentos proteacuteicos denominado de estrutura paraflagelar (revisto por GULL 1999)
Na parte posterior da ceacutelula existem organelas usualmente esfeacutericas
denominadas reservossomos Os reservossomos satildeo organelas aacutecidas que
possuem em seu interior proteinases principalmente a cruzipaiacutena (uma
cisteiacutenoproteinase) e proteiacutenas ingeridas que chegam dentro de vesiacuteculas
endociacuteticas oriundas da bolsa flagelar e do citoacutestomo Com base nisso foi proposto
que os reservossomos seriam compartimentos preacute-lisossomais (SOARES et al
1992) Tambeacutem tem sido proposta a participaccedilatildeo dos reservossomos no processo
de metaciclogecircnese como principal fonte de energia para esta atividade (SOARES
1999)
O T cruzi assim como todos os membros da famiacutelia Tripanosomatidae
apresenta uma mitococircndria uacutenica e ramificada que se estende por todo o corpo do
protozoaacuterio Como em todas as ceacutelulas eucarioacuteticas a mitococircndria dos
tripanosomatiacutedeos tambeacutem apresenta DNA mitocondrial tambeacutem conhecido como
kDNA ou DNA do cinetoplasto que se concentra em uma determinada regiatildeo da
mitococircndria localizada logo abaixo do corpuacutesculo basal dando origem a uma
estrutura intramitocondrial chamada de cinetoplasto O cinetoplasto abriga o kDNA
o qual eacute constituiacutedo por moleacuteculas circulares que se encontram interligadas
formando uma extensa rede entre si (SHLOMAI 1994)
Distribuiacutedos pelo citoplasma estatildeo os glicossomos um tipo especializado de
peroxissomo Estes acumulam enzimas da via glicoliacutetica envolvidas na conversatildeo
24
da glicose a 3-fosfoglicerato que em outros organismos localizam-se no citoplasma
(HANNAERT et al 2003)
Outra particularidade dos tripanossomatiacutedeos estaacute na estocagem intracelular
de caacutelcio Este iacuteon importante nos processos de sinalizaccedilatildeo celular eacute estocado em
organelas denominadas acidocalcissomos Os acidocalcissomos provavelmente
estatildeo envolvidos em diversos processos bioloacutegicos tais como o armazenamento de
caacutelcio e polifosfatos adaptaccedilatildeo dos tripanosomatiacutedeos a condiccedilotildees de estresse
ambiental manutenccedilatildeo do pH intracelular e osmorregulaccedilatildeo (revisto por DOCAMPO
et al 2005)
14 O genoma de T cruzi
No ano de 2005 foi concluiacuteda a montagem do genoma do T cruzi (EL-
SAYED et al 2005) A cepa CL Brener foi a escolhida para o sequenciamento por
ser bem caracterizada bioquiacutemica e parasitologicamente (ZINGALES et al 1997) e
por ser considerada representativa para o universo de cepas circulantes de T cruzi
Com base na montagem do sequenciamento o genoma diploacuteide do parasita foi
calculado como sendo de 1064 1107 Mb com cada haploacutetipo contendo cerca de
12000 genes sendo que mais de 50 do genoma constituiu-se de sequecircncias
repetitivas compostas por famiacutelias de proteiacutenas de superfiacutecie retrotransposons e
elementos subtelomeacutericos (EL-SAYED et al 2005)
A comparaccedilatildeo das estruturas genocircmicas e proteiacutenas preditas obtidas a
partir do sequenciamento de Trypanosoma cruzi com as de Leishmania major e
Trypanosoma brucei indica mais similaridade entre T cruzi e T brucei uma grande
conservaccedilatildeo entre os respectivos proteomas (exceto para antiacutegenos de superfiacutecie) e
uma sintenia bastante conservada entre os trecircs tripanosomatiacutedeos apesar da
divergecircncia haacute 200-500 milhotildees de anos atraacutes (BERRIMAN et al 2005 EL SAYED
et al 2005 IVENS et al 2005)
Os tripanosomatiacutedeos possuem aleacutem do genoma nuclear um grande
genoma mitocondrial (kDNA) que tem sido extensivamente estudado sendo uacutenico
em estrutura funccedilatildeo e mecanismo de replicaccedilatildeo O kDNA eacute formado por milhares de
moleacuteculas circulares topologicamente relaxadas e interligadas umas as outras Este
arranjo conteacutem aproximadamente 20 - 30 do DNA total dos tripanosomatiacutedeos e eacute
composto por 2 tipos de moleacuteculas circulares os maxiciacuterculos e os miniciacuterculos Os
25
maxiciacuterculos apresentam um tamanho entre 22-37 kb e conteacutem basicamente os
genes codificadores de proteiacutenas envolvidas na fosforilaccedilatildeo oxidativa e RNA
ribossocircmico Os miniciacuterculos com um tamanho que varia de espeacutecie para espeacutecie
(05 a 25 kb) conteacutem os genes que codificam os RNAs guia envolvidos na
editoraccedilatildeo do RNA (STUART et al 1989 SHAPIRO amp ENGLUND 1995 MADISON-
ANTENUCCI et al 2002 SIMPSON et al 2003 ONN et al 2006 GLUENZ et al
2007)
15 Expressatildeo gecircnica de Tcruzi
T cruzi estaacute sujeito agraves frequentes mudanccedilas de ambientes decorrentes da
passagem por diferentes hospedeiros durante seu ciclo de vida (temperatura pH
quantidade de nutrientes evasatildeo do sistema imune) por esse motivo a expressatildeo
gecircnica deste parasita eacute regulada por diversos fatores A adaptaccedilatildeo raacutepida e eficiente
a estas diferentes condiccedilotildees torna-se uma importante tarefa para o parasita
Como os demais eucariotos o T cruzi apresenta trecircs RNAs polimerases a
RNA polimerase I transcreve os genes para RNAs ribossocircmicos a RNA polimerase
II os genes que codificam proteiacutenas e a RNA polimerase III pequenos RNAs como
o tRNA (RNA de transferecircncia) Nos tripanosomatiacutedeos promotores para as RNA
polimerase I e III jaacute foram identificados poreacutem ainda natildeo foram identificados
promotores para os genes transcritos pela RNA polimerase II com exceccedilatildeo de um
promotor associado ao gene do mini-exon (GILLINGER amp BELLOFATTO 2001
revisto por CAMPBELL et al 2003)
Os genes dos tripanosomatiacutedeos estatildeo organizados em unidades
policistrocircnicas e natildeo apresentam interrupccedilotildees por iacutentrons com exceccedilatildeo do gene da
poli-A polimerase (MAIR et al 2000)
Uma vez que em T cruzi como nos demais eucariotos somente mRNAs
monocistrocircnicos satildeo traduzidos os precursores de mRNA policistrocircnicos devem ser
processados ateacute mRNAs individuais Como caracteriacutestica desta famiacutelia os
transcritos de mRNA satildeo processados por mecanismos de trans-splicing (AGABIAN
1990) e poliadenilaccedilatildeo (LEBOWITZ et al 1993 MATTHEWS et al 1994
VANHAMME amp PAYS 1995)
No processo de trans-splicing as unidades codificadoras satildeo separadas e eacute
adicionada na extremidade 5rsquo uma sequecircncia extremamente conservada espeacutecie-
26
especiacutefica de 39 nucleotiacutedeos denominada sequumlecircncia liacuteder (SL) ou minieacutexon
(McCARTHY-BURKE et al 1989 NILSEN 1992 VANHAMME amp PAYS 1995)
Nesta reaccedilatildeo participam duas moleacuteculas de RNA uma doadora e outra aceptora A
doadora eacute um precursor do mini-exon e em T cruzi possui cerca de 110
nucleotiacutedeos (ZWIERZYNSKI amp BUCK 1991) A aceptora eacute o transcrito derivado da
unidade policistrocircnica ao qual o mini-exon eacute transferido O complexo enzimaacutetico
envolvido nesta reaccedilatildeo eacute semelhante ao descrito para a de cis-splicing (LAIRD
1989)
Os transcritos processados satildeo estabilizados pela estrutura cap 4 do mini-
exon (ULLU amp TSCHUDI 1991) e pela adiccedilatildeo de uma cauda poli-A agrave extremidade
3rsquo sendo que a adiccedilatildeo de ambos os elementos ocorrem em conjunto (LEBOWITZ et
al 1993) Regiotildees ricas em resiacuteduos de pirimidinas aleacutem da sequumlecircncia consenso
(AG) para o trans-splicing regulam a adiccedilatildeo do mini-exon e da cauda poli-A
Deleccedilotildees nestas regiotildees impedem o correto processamento destes transcritos
(MATTHEWS et al 1994)
A ocorrecircncia de transcriccedilatildeo policistrocircnica associada agrave ausecircncia de
promotores para RNA polimerase II e agrave presenccedila de niacuteveis distintos de mRNA
originados de uma mesma unidade policistrocircnica sugerem que a regulaccedilatildeo da
expressatildeo gecircnica nesses protozoaacuterios ocorra a niacutevel poacutes-transcricional baseada
principalmente em mecanismos que controlam a estabilidade e a traduccedilatildeo dos
mRNAs (CLAYTON 2002 BOUCHER et al 2002)
16 O cinetoplasto
O cinetoplasto eacute uma estrutura peculiar presente nos tripanosomatiacutedeos e
encontra-se inserida no interior da mitococircndria uacutenica abrigando fibrilas de DNA
conhecidas como kDNA O nome cinetoplasto (cineto=movimento e plasto=organela)
foi dado pois se acreditava que o mesmo fosse responsaacutevel pelo movimento do
flagelo
17 A rede de kDNA
O DNA do cinetoplasto eacute formado por dois tipos de moleacuteculas circulares os
miniciacuterculos de tamanho entre 05 e 25 kb e os maxiciacuterculos que apresentam
entre 20 e 40 kb Cerca de 10000 miniciacuterculos e 50 maxiciacuterculos se encontram
27
catenados formando uma extensa rede (SHAPIRO amp ENGLUND 1995 DE SOUZA amp
CAVALCANTI 2008) (FIGURA 4)
FIGURA 4 REDE DE kDNA
FONTE ROY CHOWDHURY et al 2010
As primeiras questotildees relacionadas ao arranjo das moleacuteculas na rede do
kDNA dos tripanosomatiacutedeos surgiram na deacutecada de 80 sugerindo que tal
organizaccedilatildeo poderia ter evoluiacutedo como um maneira mais eficaz de armazenar uma
grande quantidade de material em um pequeno espaccedilo (HAJDUK et al 1986)
Os maxiciacuterculos apresentam um tamanho de 22 a 37 kb e assim como o
DNA mitocondrial de outros eucariotos codificam RNAs ribossomais e diversas
proteiacutenas da cadeia respiratoacuteria incluindo subunidades da citocromo oxidase e
NADH desidrogenase (revisto por SHAPIRO amp ENGLUND 1995) Os transcritos dos
maxiciacuterculos satildeo processados poacutes-transcricionalmente para formar mRNAs
funcionais atraveacutes de um processo conhecido como ediccedilatildeo ou editoraccedilatildeo do RNA
A editoraccedilatildeo do RNA consiste na inserccedilatildeo ou retirada de resiacuteduos de uridina em
28
siacutetios especiacuteficos dos RNAs transcritos pelos maxiciacuterculos a fim de criar coacutedons de
iniciaccedilatildeo ou terminaccedilatildeo mudanccedilas na fase de leitura ou quadros abertos de leitura a
partir de sequumlecircncias sem sentido O processo de ediccedilatildeo eacute especificado por
pequenos RNAs guias produzidos pelos miniciacuterculos e maxiciacuterculos e catalisado
por um complexo muiltiproteacuteico o editosomo (revisto por Esteacutevez amp Simpson 1999
Stuart et al 2005) Esse processo constitui uma forma de regular poacutes-
transcricionalmente a expressatildeo de genes mitocondriais nas diferentes formas
evolutivas do parasita
Os miniciacuterculos caracterizam-se por apresentar um tamanho de 05 a 25 kb
e por transcrever os RNAs guia (gRNA) responsaacuteveis pela especificidade da ediccedilatildeo
dos mRNAs codificados pelos maxiciacuterculos por meio de uma sequumlecircncia presente na
porccedilatildeo central desses gRNAs (BENNE 1994 STUART et al 2005) A significacircncia
da variaccedilatildeo em tamanho e organizaccedilatildeo entre as espeacutecies ainda natildeo eacute aparente
contudo a diversidade das sequecircncias dos miniciacuterculos estaacute correlacionada com a
necessidade de mais ou menos ediccedilatildeo de mRNA de cada organismo (STUART
1991) Apesar desta diversidade os miniciacuterculos apresentam pelo menos duas
regiotildees conservadas o dodecacircmero GGGGTTGGTGTA conhecido como sequecircncia
universal dos miniciacuterculos (UMS) e o hexacircmero ACGCCC que correspondem agrave
origem de replicaccedilatildeo da fita L (light) e da fita H (heavy) respectivamente
(BIRKENMEYER amp RAY 1986 BIRKENMEYER et al 1987 RAY 1989 SHLOMAI
1994 HINES amp RAY 2008)
Embora o cinetoplasto de todos os tripanosomatiacutedeos seja formado por
moleacuteculas circulares relaxadas e catenadas diferentes arranjos da rede de kDNA
podem ser observados entre diferentes estaacutegios do ciclo de vida desses
protozoaacuterios como em T cruzi (FIGURA 5) assim como mudanccedilas na posiccedilatildeo do
kDNA satildeo utilizadas para identificar as diferentes formas evolutivas do parasita
(FIGURA 6)
29
FIGURA 5 ndash DIFERENTES ARRANJOS DO CINETOPLASTO DE T cruzi
LEGENDA As fibrilas de kDNA se apresentam bastante compactadas em forma de bastatildeo nas formas amastigotas (A) e epimastigotas (B) enquanto nas formas tripomastigotas a rede de kDNA torna-se menos compacta e a forma em bastatildeo do cinetoplasto daacute lugar a uma forma arredondada (C) FONTE DE SOUZA amp SOUTO-PADRON 1980 e DE SOUZA 1984
Nas formas amastigota (FIGURA 5A) e epimastigota (FIGURA 5B) de T
cruzi as fibrilas de kDNA se apresentam bastante compactadas em forma de
bastatildeo Em tripomastigotas (FIGURA 5C) de T cruzi a rede de kDNA torna-se
menos compacta e a forma em bastatildeo do cinetoplasto daacute lugar a uma forma
arredondada (DE SOUZA 1984) Os vaacuterios graus de compactaccedilatildeo do kDNA em
tripanosomatiacutedeos podem estar relacionados com a accedilatildeo de proteiacutenas que
condensam o DNA como seraacute visto mais adiante
FIGURA 6 MUDANCcedilAS NA POSICcedilAtildeO DO KDNA NOS TRYPANOSOMAS FONTE Modificado de DO CAMPO et al 2005
30
O cinetoplasto de todos os tripanosomatiacutedeos encontra-se localizado
proacuteximo ao corpo basal perpendicularmente ao eixo do flagelo Em alguns
tripanosomatiacutedeos que sofrem diferenciaccedilatildeo ao longo de seu ciclo de vida como o
T cruzi o cinetoplasto muda de posiccedilatildeo dentro da ceacutelula passando da regiatildeo
anterior (nos epimastigotas) para a regiatildeo posterior (nos tripomastigotas) poreacutem
permanecendo proacuteximo e perpendicular ao corpo basal (FIGURA 7) O cinetoplasto
eacute fisicamente conectado ao corpo basal atraveacutes de um grupo de filamentos
citoplasmaacuteticos chamado de complexo de ligaccedilatildeo tripartite (TAC) (OGBADOYI et al
2003) Este complexo eacute responsaacutevel pelo posicionamento espacial do cinetoplasto e
por sua segregaccedilatildeo
FIGURA 7 REPOSICIONAMENTO DO KDNA EM RELACcedilAtildeO AgraveS OUTRAS ORGANELAS DURANTE O CICLO DE VIDA DE UM FLAGELADO LEGENDA A morfologia eacute definida pelas posiccedilotildees do ponto onde emerge o flagelo e a bolsa flagelar (BF) (mostrada em laranja) nuacutecleo (mostrado em azul) e kDNA (mostrado em roxo) FONTE Modificado de FIELD amp CARRINGTON 2009
31
171 Replicaccedilatildeo do kDNA
Nos tripanosomatiacutedeos a replicaccedilatildeo do kDNA eacute restrita a fase S nuclear
(COSGROVE amp SKEEN 1970 WOODWARD amp GULL 1990) diferente do que
acontece na maioria dos eucariotos onde a replicaccedilatildeo do DNA mitocondrial ocorre
ao longo do ciclo celular (LIU et al 2005)
A replicaccedilatildeo dos miniciacuterculos se inicia quando estes satildeo individualmente
decatenados da rede de kDNA pela accedilatildeo de DNA topoisomerases do tipo II pois
estes natildeo se replicam enquanto estatildeo ligados agrave rede e termina quando os
miniciacuterculos retornam para a rede com a ajuda da mesma enzima (SHAPIRO amp
ENGLUND 1995)
Os miniciacuterculos satildeo liberados da rede em direccedilatildeo a zona cinetoflagelar
(KFZ) uma regiatildeo especializada da matriz mitocondrial entre o kDNA e o corpo
basal (FIGURA 8) que abriga proteiacutenas envolvidas com o iniacutecio da replicaccedilatildeo Em
seguida os ciacuterculos migram (ou satildeo transportados) para os poacutelos opostos da rede
de kDNA para completar sua replicaccedilatildeo O iniacutecio da replicaccedilatildeo dos miniciacuterculos na
regiatildeo cinetoflagelar envolve a montagem de um complexo proteacuteico na origem de
replicaccedilatildeo dos ciacuterculos com a participaccedilatildeo da primase polimerase e proteiacutenas que
se ligam agrave sequumlecircncia universal de miniciacuterculos (UMSBP) Estas juntamente com
outras proteiacutenas geram uma forquilha de replicaccedilatildeo que se propaga
unidirecionalmente ao redor do miniciacuterculo formando uma estrutura tipo
intermediaacuteria (LIU et al 2005 GLUENZ et al 2007)
Os miniciacuterculos receacutem-replicados migram da zona KFZ para dois complexos
proteacuteicos situados nos poacutelos diametralmente opostos do cinetoplasto onde os
proacuteximos passos de replicaccedilatildeo iratildeo ocorrer Estes passos incluem remoccedilatildeo dos
primers pela accedilatildeo de endonucleases preenchimento de alguns intervalos entre os
fragmentos de Okazaki pela DNA polimerase e uniatildeo dos cortes (nicks) por uma
DNA ligase Apoacutes estas etapas os novos ciacuterculos sintetizados que ainda possuem
pelo menos uma interrupccedilatildeo em sua sequumlecircncia satildeo reunidos agrave periferia da rede
pela accedilatildeo de topoisomerases II Apoacutes todos miniciacuterculos terem sido replicados os
intervalos satildeo reparados (Revisto por LIU et al 2005 POVELONES 2014)
Pouco se sabe sobre o processo de replicaccedilatildeo dos maxiciacuterculos Assim
como os miniciacuterculos os maxiciacuterculos tambeacutem sofrem replicaccedilatildeo unidirecional que
32
se inicia em uma origem contida na regiatildeo variaacutevel da moleacutecula formando estruturas
tipo- Entretanto ao contraacuterio dos miniciacuterculos eles permanecem ligados agrave rede de
kDNA durante o processo replicativo (revisto por KLINGBEIL et al 2001 Liu et al
2005)
FIGURA 8 REPLICACcedilAtildeO DO kDNA FONTE Modificado de LIU et al 2005
18 Proteiacutenas associadas ao cinetoplasto (KAPs)
Proteiacutenas que se ligam ao DNA tambeacutem foram identificadas na mitococircndria
de uma variedade de organismos eucarioacuteticos variando de levedura ateacute humanos
(MAIER et al 2001) Estas proteiacutenas satildeo codificadas no nuacutecleo da ceacutelula e satildeo poacutes-
traducionalmente importadas para a mitococircndria
Conceitualmente qualquer proteiacutena que se associe ao kDNA quer atuando
na replicaccedilatildeo e transcriccedilatildeo quer atuando na organizaccedilatildeo compactaccedilatildeo e
segregaccedilatildeo da rede pode ser chamada de KAP (KAP do inglecircs Kinetoplast-
33
Associated Protein) Observou-se que algumas dessas KAPs apresentam
caracteriacutesticas de proteiacutenas histonas H1 (H1 histone-like proteins) por serem
proteiacutenas pequenas (17 a 25 kDa) fortemente baacutesicas (pI de 11 a 125) interagindo
com a carga negativa das moleacuteculas de DNA e com grande conteuacutedo dos
aminoaacutecidos lisina e arginina elevado (aprox 30 a 50)
Proteiacutenas associadas com genoma mitochondrial (KAPs) dos
tripanosomatiacutedeos e que compartilham caracteriacutesticas com histonas H1 foram
inicialmente identificadas no cinetoplasto do tripanosomatiacutedeo de inseto Crithidia
fasciculata e denominadas de KAP1 a 5 As H1-KAPs de C fasciculata interagem
com miniciacuterculos (XU et al 1996) e desse modo podem facilitar a associaccedilatildeo
orientaccedilatildeo e organizaccedilatildeo dessas moleacuteculas na rede pela neutralizaccedilatildeo das cargas
negativas das moleacuteculas de DNA contribuindo para a condensaccedilatildeo organizaccedilatildeo e
segregaccedilatildeo da rede de kDNA Ateacute o momento foram caracterizadas quatro H1-KAPs
de C fasciculata (CfKAP1 2 3 and 4) Aleacutem das caracteriacutesticas de histona H1
possuem uma preacute-sequecircncia clivaacutevel de nove aminoaacutecidos em sua porccedilatildeo N-
terminal e que provavelmente estaacute envolvida no transporte da proteiacutena para o
cinetoplasto jaacute que natildeo aparece na proteiacutena madura (XU amp RAY 1993 XU et al
1996 HINES amp RAY 1998) Atraveacutes de ensaios de imunofluorescecircncia foi possiacutevel
confirmar que estas proteiacutenas estatildeo presentes em toda a rede de kDNA Pela
facilidade encontrada nas KAPs purificadas de condensar redes de kDNA in vitro
(XU et al 1996) sugere-se que estas estejam envolvidas na organizaccedilatildeo e
condensaccedilatildeo do kDNA in vivo (LUKES et al 2001)
As teacutecnicas de deleccedilatildeo de genes satildeo uma oacutetima ferramenta para elucidar as
possiacuteveis funccedilotildees que um gene pode apresentar Em C fasciculata foi utilizada a
teacutecnica de nocaute gecircnico para o gene Cfkap1 onde mutantes viaacuteveis foram
obtidos mostrando que a forma e a dimensatildeo do cinetoplasto natildeo foram alterados
ao contraacuterio da organizaccedilatildeo da rede de kDNA que passou a apresentar fibrilas de
DNA espessas e uma camada eleacutetron-densa no centro do disco Quando foi
realizada a reintroduccedilatildeo do gene na forma episomal o fenoacutetipo normal da rede de
kDNA foi restaurado (LUKES et al 2001) Tambeacutem foi realizado o duplo nocaute
dos genes Cfkap2 e Cfkap3 o qual da mesma maneira produziu mutantes viaacuteveis
poreacutem com o crescimento bastante reduzido uma reduccedilatildeo na respiraccedilatildeo e um
aumento nos niacuteveis de mRNAs codificados pelos maxiciacuterculos Apesar de todas
estas alteraccedilotildees o kDNA permaneceu inalterado mostrando que as proteiacutenas
34
CfKAP2 e CfKAP3 desempenham um papel diferente ao da CfKAP1 pois estatildeo
envolvidas com o metabolismo mitocondrial e proliferaccedilatildeo celular ao inveacutes de
estarem envolvidas na organizaccedilatildeo estrutural do kDNA (AVLIYAKULOV et al
2004)
Com base nesses estudos surgiu o interesse de nosso grupo no estudo de
KAPs em T cruzi visando verificar qual o papel dessas proteiacutenas na organizaccedilatildeo da
rede de kDNA e sua importacircncia nos diferentes estaacutegios do ciclo de vida do parasita
Atraveacutes de anaacutelises bioinformaacuteticas foram identificadas 6 diferentes H1-KAPs
codificadas no genoma do T cruzi levando em consideraccedilatildeo a similaridade com
KAPs de C fasciculata (CAVALCANTI et al 2009) Essas H1-KAPs foram
denominadas de KAP3 KAP4a KAP4b KAP4c KAP6 e KAP7 Nosso grupo iniciou
a caracterizaccedilatildeo das proteiacutenas TcKAP4 e TcKAP6 mostrando que elas se localizam
no cinetoplasto mas com padrotildees distintos de distribuiccedilatildeo dependendo da forma do
ciclo de vida do parasita (CAVALCANTI et al 2009) Mais recentemente mostramos
que o nocaute da TcKAP3 natildeo afeta a proliferaccedilatildeo diferenciaccedilatildeo e infectividade do
parasita (DE SOUZA et al 2010)
A complexidade da rede de kDNA sugere portanto que as diferentes KAPs
atuem em conjunto algumas vezes de modo redundante para desempenhar
funccedilotildees na condensaccedilatildeo replicaccedilatildeo segregaccedilatildeo dessa estrutura
35
2 OBJETIVOS
21 OBJETIVO GERAL
O objetivo principal deste trabalho eacute caracterizar a funccedilatildeo da TcKAP7 avaliando seu
papel na biologia do parasita
211 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS
a) Analisar a localizaccedilatildeo subcelular da TcKAP7 atraveacutes de ensaios de
imunofluorescecircncia
b) Produzir TcKAP7 recombinante em larga escala para ensaios de biologia
estrutural
c) Estudar a viabilidade do parasita na ausecircncia do gene TcKAP7 para os parasitas
viaacuteveis analisar morfologia e ultraestrutura do cinetoplasto multiplicaccedilatildeo
diferenciaccedilatildeo e infectividade
36
3 MATERIAIS E MEacuteTODOS
31 Reagentes e Soluccedilotildees Utilizados
311 Reagentes
AmershamBioscience dNTPs Hybond C Hybond N kit ECL de western blotting
filmes de raio-X Hyperfilmreg anticorpo monoclonal anti-Histidina
Bio-Rad Acrilamida Agarose (UltraPure DNA grade) Azul de Bromofenol Bis-
Acrilamida Persulfato de Amocircnia
Cult-lab RPMI 1640
Difco Baacutecto-Aacutegar Bactotriptona Extrato de levedura Infuso de fiacutegado Triptose
Invitrogen Inc EDTA Fenol TRIS Nick Translation kit Taq DNA polymerase
IPTG Agarose X-Gal DNA de λHindIII Marcador de massa molecular Benchmark
Alexa Fluacuteor 458 1 kb Plus DNA Ladder Soro Fetal Bovino T4 DNA ligase
Merck Acetato de Soacutedio Aacutecido Aceacutetico Glacial Cloreto de CaacutelcioCloreto de
Potaacutessio Cloreto de Soacutedio Etanol Absoluto Glicina Glicose Hidroacutexido de soacutedio
Isopropanol HCl Na2HPO4
New England Biolabs Endonucleases de restriccedilatildeo
Qiagen Qiaquick PCR Purification kit
Serva Electrophoresis Alu-Gel S
Sigma Acetato de amocircnia Ampicilina Brometo de Etiacutedeo BSA Kanamicina
Glicerol Hepes Cloreto de Magneacutesio Tetraciclina β-mercaptoetanol DEAE-
celulose Tween 20 adjuvante completo de Freund monoclonal M2 anti-FLAG
312 Tampotildees e Soluccedilotildees
PBS NaCl 137 mM KCl 27 mM Na2HPO4 43 mM e KH2PO4 15 mM
PSG Na2HPO4 (anidro) 4747 mM NaH2PO4 H2O 25 mM NaCl 3676 mM e
glicose 555 mM
Soluccedilatildeo de tripsinazaccedilatildeo tripsina 005 (mv) e EDTA 002 (mv) em PBS pH
80
37
Soluccedilatildeo de bloqueio para imunofluorescecircncia PBS e BSA 1 (albumina seacuterica
bovina)
Soluccedilatildeo de bloqueio para western blot TBST e leite em poacute desnatado 5
Soluccedilatildeo de lise para Toothpick NaOH 50 mM Glicerol 5 SDS 05 EDTA 5
mM e azul de bromofenol 0025
Soluccedilatildeo Ponceau S Ponceau S 05 em aacutecido aceacutetico 1
Soluccedilatildeo de coloraccedilatildeo para geacuteis de proteiacutena Coomassie blue R-250 01 em
metanolaacutecido aceacutetico (4510)
Soluccedilatildeo para descoloraccedilatildeo de geacuteis de proteiacutena Metanol 4 aacutecido aceacutetico 75
Tampatildeo de lise hipotocircnico Tris-HCl 10mM pH 75 NaCl 10mM MgCl2 5 mM β-
mercaptoetanol 5 mM
Tampatildeo A para cromatografia de afinidade Tris-HCl 20 mM pH 75 NaCl 500 mM
Tampatildeo B para cromatografia de afinidade Tampatildeo A contendo imidazol 1M
Tampatildeo B para cromatografia de troca iocircnica Tris-HCl 50 mM pH 80 NaCl 1M
Soluccedilatildeo de depurinaccedilatildeo para Southern blot HCl 025 M
Soluccedilatildeo desnaturante para Southern blot NaOH 05 M e NaCl 15 M
Soluccedilatildeo neutralizante para Southern blot Tris-HCl 05 M pH 75 e NaCl 15 M
Soluccedilatildeo Denhardt (50X) ficoll 05 polivinilpirrolidona 06 e albumina de soro
bovino 02
Soluccedilatildeo de hibridaccedilatildeo para Southern blot DNA de esperma de salmatildeo do tipo III
01 mgml fragmentado por ultra-som e desnaturado SSC 6X soluccedilatildeo de denhardt
6X e SDS 1
SSC 20X NaCl 3 M pH 70 e citrato de soacutedio 03 M
Soluccedilatildeo de baixa estringecircncia SSC 2X e SDS 01
Soluccedilatildeo de meacutedia estringecircncia SSC 1X e SDS 01
Soluccedilatildeo de alta estringecircncia SSC 01X e SDS 01
Tampatildeo de eletroporaccedilatildeo para T cruzi NaCl 140 mM HEPES (aacutecido) 25 mM e
Na2HPO4 074 mM pH 75
Tampatildeo ZPFM de eletroporaccedilatildeo de T brucei NaCl 129 mM KH2PO4 15mM KCl
8mM NaH2PO4 8mM MgCl2 15mM CaCl2 90 mM e CH3COONa 24 mM pH 70
Tampatildeo TELT Tris-HCl 50 mM pH 80 EDTA 625 mM pH 90 LiCl 25 M e Triton
X-100 4
Tampatildeo de amostra para DNA 10X Ficoll 400 25 azul de bromofenol 025 e
xileno cianol FF 025
38
Tampatildeo de amostra para proteiacutena 4X Tris-HCl 40 mM pH 68 SDS 1 β-
mercaptoetanol 25 glicerol 6 e azul de bromofenol 0005
Tampatildeo de eletroforese para SDS-PAGE 1X Tris-base 25 mM glicina 192 mM e
SDS 01
Tampatildeo de lise de bacteacuterias Tris-HCl 20 mM pH 75 NaCl 500 mM PMSF1 mM
Tampatildeo para transferecircncia (western blotting) 1X Tris-base 25 mM glicina 192
mM e metanol 20
Tampatildeo TBE Tris base 89 mM aacutecido boacuterico 89 mM e EDTA 2 mM
TBS Tris-HCl 20 mM pH 80 e NaCl 150 mM
TBST TBS e Tween 20 01
TE Tris-HCl 10 mM pH 80 e EDTA 1 mM
313 Meios de cultura
LB Triptona 1 extrato de levedura 5 e NaCl 1
Meio LIT (liver infusion tryptose) infuso de fiacutegado 05 NaCl 753 mM KCl 54
mM glicose 10 mM bacto-triptose 05 Na2HPO4 564 mM hemina 00025 soro
fetal bovino 10 e extrato de levedura 15 gl
Meio TAU NaCl 190 mM KCl 17 mM MgCl2 2 mM CaCl2 2 mM e tampatildeo fosfato 8
mM pH 60
Meio TAU3AAG meio TAU suplementado com L-prolina 10 mM glutamato soacutedico
50 mM aspartato soacutedico 2 mM e glicose 10 mM
32 Cultivo do Trypanosoma cruzi
Neste trabalho foi utilizado o clone Dm28c de T cruzi (CONTRERAS et al
1985 CONTRERAS et al 1988) nas formas epimastigota e tripomastigota
metaciacuteclico
321 Epimastigotas
Formas epimastigotas de T cruzi foram cultivadas em meio LIT (CAMARGO
1964) a 28 oC com passagens a cada trecircs dias e inoacuteculo de 1 x 106 ceacutelulasml As
formas epimastigotas foram coletadas por centrifugaccedilatildeo no terceiro dia de cultivo
39
(correspondente a fase logariacutetmica de crescimento baseada em curva de
crescimento realizada nas mesmas condiccedilotildees) quando a densidade celular
apresentava-se entre de 1 - 3 x 107 ceacutelulasml
322 Tripomastigotas metaciacuteclicos
As formas metaciacuteclicas foram obtidas atraveacutes do processo de diferenciaccedilatildeo
in vitro (BONALDO et al 1988) Formas epimastigotas em final de fase logariacutetmica
de crescimento (densidade celular entre 5 - 7 x 107 ceacutelulasml) foram coletadas por
centrifugaccedilatildeo a 7000 x g por 5 minutos a 10 oC e ressuspendidas em meio TAU
na concentraccedilatildeo de 5 x 108 ceacutelulasml e mantidas a 28 oC por 2 horas Apoacutes este
periacuteodo correspondente ao estresse nutricional as ceacutelulas foram transferidas para
garrafas de 300 cm2 contendo 200 ml de meio TAU3AAG (concentraccedilatildeo final de 5 x
106 ceacutelulasml) Uma proporccedilatildeo dos parasitas que se aderiram agrave superfiacutecie da
garrafa de cultivo se diferenciou em metaciacuteclicos os quais foram liberados no
sobrenadante (BONALDO et al 1988) Estas formas foram purificadas pela
passagem atraveacutes de uma coluna de afinidade contendo a resina DEAE celulose
equilibrada em PSG (SOUSA 1983) Este procedimento foi realizado com o tipo
selvagem para obtenccedilatildeo de extrato proteacuteico e tambeacutem com o mutante de T cruzi
para TcKAP7 para verificaccedilatildeo da capacidade de diferenciaccedilatildeo e infectividade onde
o nuacutemero de metaciacuteclicos no sobrenadante foi contado apoacutes 24 48 72 e 96 horas
da incubaccedilatildeo em meio TAU3AAG
33 Curva de crescimento de T cruzi
Formas epimastigotas de T cruzi clone Dm28c e do mutante de T cruzi para
TcKAP7 foram cultivadas como descrito no item 321 ateacute atingirem a fase
estacionaacuteria para a comparaccedilatildeo da taxa de crescimento de ambas Foram
inoculadas 1 x 106 epimastigotas por ml de meio LIT em garrafas de 25 cm2 e
incubadas em seguida a 28 degC Diariamente foi realizada a contagem das culturas
em cacircmaras de Neubauer em diluiccedilotildees apropriadas ateacute o deacutecimo dia O graacutefico da
curva de crescimento comparativa entre a cultura selvagem e a nocaute foi feito
utilizando o programa Microsoft Excel
40
34 Obtenccedilatildeo de DNA de T cruzi
A extraccedilatildeo de DNA foi realizada conforme descrito por Medina-Acosta amp
Cross (1993) Epimastigotas (1 x 107 ceacutelulas) foram coletadas por centrifugaccedilatildeo a
7000 x g por 5 min lavadas em PBS e ressuspendidas em 350 microl de tampatildeo TELT
Apoacutes 5 min de incubaccedilatildeo agrave temperatura ambiente foi adicionado agrave amostra 1
volume de fenolclorofoacutermio e o material foi centrifugado a 13000 x g por 5 min A
fase aquosa foi recolhida e o DNA foi precipitado com 2 volumes de etanol absoluto
e coletado por centrifugaccedilatildeo a 13000 x g por 10 min O DNA presente no sedimento
foi lavado com etanol 70 seco e em seguida ressuspendido em tampatildeo TE
contendo RNAse a 20 microgml
35 Obtenccedilatildeo de kDNA de T cruzi
A extraccedilatildeo do kDNA de T cruzi foi realizada de acordo com Morel e
colaboradores (1980) com modificaccedilotildees
Formas epimastigotas (1 x109 ceacutelulas) foram coletadas por centrifugaccedilatildeo a
4000 x g por 10 min lavadas em PBS e ressuspendidas em 20 ml de Tampatildeo de
Lise Hipotocircnico Posteriormente adicionou-se Sacarose 025 M e o material foi
centrifugado 6000 x g por 10 min O pellet foi ressuspendido em 20 ml de Tris-HCl
10 mM pH 75 NaCl 10 Mm EDTA 5 mM SDS 05 A esta soluccedilatildeo foi adicionado
100 ug de proteinase K e a mesma permaneceu a 37 ordmC durante a noite No dia
seguinte as ceacutelulas foram transferidas para uma seringa de 50 ml aonde ocorreu a
quebra mecacircnica do DNA nuclear Este material foi ultracentrifugado a 27000 rpm a
4ordm C durante 1 hora utilizando o rotor SW28 Apoacutes centrifugaccedilatildeo o sobrenadante foi
desprezado e o pellet ressuspendido em 25 ml de TE e novamente ultracentrifugado
nas mesmas condiccedilotildees Apoacutes centrifugaccedilatildeo o pellet foi ressuspendido em 1ml de TE
e foi realizada a purificaccedilatildeo por fenolclorofoacutermio Apoacutes purificaccedilatildeo o material foi
ressuspendido em 300 ul de TE e utilizado para ensaios de SAXS
36 Obtenccedilatildeo de extrato proteico de T cruzi
41
As ceacutelulas foram coletadas por centrifugaccedilatildeo (4000 x g 5 min a 10 degC) e
lavadas duas vezes em PBS pH 75 Apoacutes as lavagens os parasitas foram
ressuspendidos em PBS e tampatildeo de amostra 4x foi adicionado de tal maneira que
a concentraccedilatildeo final fosse de 1 x 106 ceacutelulas equivalentesmicrol Os extratos foram
fervidos por 5 min e armazenados a - 70 degC
37 Clonagem do gene TcKAP7
A sequecircncia do gene TcKAP7 (ID Tc00104705350871950) foi obtida a
partir do banco de dados do genoma do T cruzi disponiacutevel no portal da internet
wwwgenedborg e a sua regiatildeo codificante foi amplificada por PCR com os primers
KAP7F (5rsquo ndash AAAGGATCCATGCTAAGAACTGTTCTGCCACTG 3rsquo) e KAP7R (5rsquo ndash
TCAGCGTCGACTTATGACGGTGGTGCAGGATCAGCAGCTGCAGTATTTT3rsquo) a
partir do DNA genocircmico de T cruzi Dm28c As sequecircncias de reconhecimento das
enzimas de restriccedilatildeo BamHI e SalI (marcadas em negrito) foram adicionadas na
extremidade 5rsquo dos primers KAP7F e KAP7R respectivamente As condiccedilotildees da
reaccedilatildeo de PCR foram as seguintes 100 ng de DNA total T cruzi 10 pmol de cada
primer 200 μM de cada dNTP MgCl2 15 mM tampatildeo Taq DNA polimerase 1x 25
U de Taq DNA polimerase (Invitrogen) A reaccedilatildeo de PCR foi processada no
termociclador modelo 9700 (Applied Biosystems EUA) com a desnaturaccedilatildeo do
material por 4 min a 94 degC seguida de 30 ciclos constando de desnaturaccedilatildeo a 94 degC
por 30 s hibridizaccedilatildeo dos primers a 58 degC por 30 s e extensatildeo a 72 degC por 1 min O
material amplificado foi purificado usando o kit Qiaquick PCR Purification (Qiagen) e
digerido com as enzimas de restriccedilatildeo BamHI e SalI com uso de 20 U de cada
enzima e seus respectivos tampotildees em volume final de 20 μl por 4 h a 37 oC O
material foi novamente purificado e utilizado para ligaccedilatildeo com o vetor pET28a
previamente digerido com as respectivas enzimas Bacteacuterias E coli cepa DH5α
foram transformadas com a ligaccedilatildeo A seleccedilatildeo dos clones contendo plasmiacutedeo com
o inserto desejado foi realizada atraveacutes da teacutecnica de palitagem ou de PCR de
colocircnia
38 Obtenccedilatildeo do cDNA de TcKAP7 atraveacutes de ensaio de RT-PCR
42
Com o intuito de verificar a posiccedilatildeo do mini-exon no transcrito de TcKAP7
realizamos o ensaio de RT-PCR para a obtenccedilatildeo do cDNA de TcKAP7
O protocolo utilizado foi baseado no manual teacutecnico da Promega (ΙmProm-ΙΙ
Reverse Transcription System) assim como os reagentes utilizados para essa
reaccedilatildeo Aproximadamente 10 μg de RNA foram incubados com o oligonucleotiacutedeo
KAP7R por 10 min a 70 degC e imediatamente transferidos para o gelo Agrave mistura foi
adicionada uma soluccedilatildeo de dNTPs (concentraccedilatildeo final de 05 mM para cada dNTP)
MgCl2 (120 μM) RNAse OUT (2 unidades) (Invitrogen) Transcriptase reversa
ImProm-II e respectivo tampatildeo A reaccedilatildeo foi incubada por 2 h a 42 degC As amostras
de cDNA foram purificadas por Microcon YM-30 (Millipore) conforme descriccedilatildeo do
fabricante e armazenadas a -20 degC Posteriormente foi realizada uma reaccedilatildeo de
PCR utilizando as seguintes condiccedilotildees 10 ng do cDNA de TcKAP7 de T cruzi 10
pmol do primer ME (5rsquo-AACGCTATTATTGATACAGTTTCTGTACTATATTG -3rsquo) e 10
pmol do primer KAP7R 200 μM de cada dNTP MgCl2 15 mM tampatildeo Taq DNA
polimerase 1x 25 U de Taq DNA polimerase (Invitrogen) A reaccedilatildeo de PCR foi
processada no termociclador modelo 9700 (Applied Biosystems EUA) com a
desnaturaccedilatildeo do material por 3 min a 94 degC seguida de 35 ciclos constando de
desnaturaccedilatildeo a 94 degC por 30 s hibridizaccedilatildeo dos primers a 55 degC por 30 s e extensatildeo
a 72 degC por 1 min O material amplificado foi purificado usando o kit Qiaquick PCR
Purification (Qiagen) e clonado diretamente no vetor pGEMreg-T Easy (Promega)
Bacteacuterias E coli cepa TOP10Frsquo foram transformadas com a ligaccedilatildeo e os plasmiacutedeos
recombinantes foram selecionados pela teacutecnica da palitagem ou de PCR de colocircnia
(itens 391 e 392) Apoacutes a minipreparaccedilatildeo (item 310) o material foi submetido ao
sequenciamento de DNA usando o serviccedilo de sequenciamento da empresa
Macrogen (Coreacuteia do Sul)
39 Seleccedilatildeo dos clones recombinantes
391 Teacutecnica de palitagem (toothpick)
As colocircnias foram coletadas com o auxiacutelio de palitos de dente (toothpick)
esteacutereis e transferidas para o fundo de tubos de micro-centriacutefuga e para a superfiacutecie
do meio LB solidificado (com o antibioacutetico de seleccedilatildeo do plasmiacutedeo) para a obtenccedilatildeo
de uma reacuteplica das colocircnias que foram analisadas (placa-matildee) A cada um dos
43
tubos foram acrescentados 15 μl do tampatildeo de lise Os tubos foram incubados em
banho-maria a 65 degC por 10 min As amostras entatildeo foram analisadas por
eletroforese em gel de agarose 1 usando o plasmiacutedeo sem inserto como controle
Posteriormente o gel foi corado com brometo de etiacutedeo (05 μgml) por
aproximadamente 20 min lavado com aacutegua e analisado sob luz ultravioleta para em
seguida ser fotografado no sistema de fotodocumentaccedilatildeo L-Pix (Locus
Biotecnologia Brasil)
392 Teacutecnica de PCR de colocircnia
Depois de selecionadas as colocircnias foram transferidas para tubos de PCR
contendo os reagentes da PCR e os primers que hibridizam com regiotildees que
flanqueiam o fragmento de DNA clonado em um volume total de 10 microl As amostras
foram incubadas a 94 degC por 3 min e submetidas a 35 ciclos de PCR com as
seguintes etapas 94 degC por 30 s 55 degC por 30 s e 72 degC por 1 min finalizando com
uma etapa de extensatildeo a 72 degC por 10 min Os produtos amplificados foram
analisados em gel de agarose 1 Posteriormente o gel foi corado com brometo de
etiacutedeo (05 microgml) por aproximadamente 20 min lavado com aacutegua e analisado sob
luz ultravioleta O gel foi fotografado no sistema de foto-documentaccedilatildeo L-Pix (Locus
Biotecnologia Brasil)
310 Preparaccedilatildeo de plasmiacutedeo em pequena escala (miniprep)
Os clones recombinantes foram cultivados em 3 ml de meio LB contendo o
antibioacutetico apropriado durante 18 h As culturas foram entatildeo centrifugadas a 12000
x g por 1min a temperatura ambiente e os plasmiacutedeos recombinantes purificados
com o sistema de minipreparaccedilatildeo de plasmiacutedeo (Miniprep Qiagen Kit) (QIAGEN) de
acordo com as recomendaccedilotildees do fabricante
311 Expressatildeo da proteiacutena TcKAP7 em E coli
Para expressar a proteiacutena recombinante TcKAP7 E coli cepa
BL21(DE3)STAR transformada com o plasmiacutedeo pET28a contendo o gene TcKPA7
(pET28a-TcKAP7) foi cultivada em meio LB contendo 25 μgml do antibioacutetico
44
kanamicina a 37 ordmC sob agitaccedilatildeo (preacute-inoacuteculo) Apoacutes 18 horas de crescimento uma
diluiccedilatildeo (110) foi realizada em novos tubos contendo meio LB-kanamicina e a
cultura foi incubada por 1 h a 37 ordmC sob agitaccedilatildeo constante Apoacutes este periacuteodo 05
mM IPTG (isopropil-1-tio-β-D-galactopiranosideo) foi adicionado agraves culturas A
incubaccedilatildeo prosseguiu por mais 3 h nas mesmas condiccedilotildees Como controle negativo
as ceacutelulas tambeacutem foram cultivadas nas mesmas condiccedilotildees poreacutem sem a adiccedilatildeo de
IPTG (cultura natildeo induzida) Aliacutequotas das culturas induzidas e natildeo induzidas com
IPTG foram processadas para anaacutelise em SDS-PAGE
312 Purificaccedilatildeo da proteiacutena recombinante TcKAP7
3121 Processamento da amostra
As bacteacuterias apoacutes a expressatildeo de TcKAP7 foram sedimentadas por
centrifugaccedilatildeo e ressuspendidas em tampatildeo de lise e lisadas utilizando o
microfluidificador modelo M-110L (Microfluidics EUA) Este meacutetodo divide a amostra
em dois fluxos e os conduz sob alta pressatildeo gerada por uma vaacutelvula pneumaacutetica
para uma cacircmara de interaccedilatildeo tambeacutem chamada de aacuterea de choque Esta cacircmara
eacute formada por um sistema de micro-canais dentro de um bloco de ceracircmica Dentro
da cacircmara ocorre cavitaccedilatildeo sonicaccedilatildeo e impacto dos dois fluxos em que a amostra
foi dividida levando a lise das ceacutelulas bacterianas (FIGURA 9) Este processo
provoca o aumento da temperatura e todo o sistema de tubos que conduz a amostra
necessita ser refrigerado com gelo e aacutegua a 4degC para prevenir a precipitaccedilatildeo de
proteiacutenas soluacuteveis
45
FIGURA 9 - REPRESENTACcedilAtildeO ESQUEMAacuteTICA DO MICROFLUIDIFICADOR LEGENDA A suspensatildeo de bacteacuterias eacute dividida em dois fluxos que se chocam sob alta pressatildeo dentro de micro-canais presentes na cacircmara de interaccedilatildeo da vaacutelvula homogeneizadora Melhores resultados satildeo obtidos aumentando o nuacutemero de ciclos de passagens Seta preenchida direccedilatildeo da amostra Seta pontilhada repetindo o ciclo de passagem FONTE Modificado de MAA amp HSU 1999
Apoacutes a lise o extrato soluacutevel foi obtido apoacutes centrifugaccedilatildeo a 30000 x g por
30 min a 4 degC
3122 Cromatografia de afinidade
Por ser expressa fusionada a uma cauda de seis histidinas a proteiacutena
TcKAP7 pode ser separada dos extratos celulares a partir da utilizaccedilatildeo de resina de
niacutequel da qual posteriormente a proteiacutena seraacute eluiacuteda
A purificaccedilatildeo da proteiacutena TcKPA7 presente no sobrenadante foi realizada
em sistema FPLC (Fast Performance Liquid Chromatography ndash GE Healthcare) com
coluna HiTrap Chelating de 1 mL (GE Healthcare) A coluna foi carregada com
soluccedilatildeo NiSO4 100 mM e equilibrada com tampatildeo A para cromatografia de afinidade
Durante a purificaccedilatildeo foi utilizado um gradiente de 0-100 de tampatildeo B para
cromatografia de afinidade As fraccedilotildees provenientes da cromatografia foram
analisadas atraveacutes de SDS-PAGE
Suspensatildeo de bacteacuterias
Ceacutelulas lisadasBomba de
alta pressatildeo
Micro-canais
Vaacutelvula homogeneizadora
46
3123 Cromatografia de troca iocircnica
Para eliminar contaminantes remanescentes da cromatografia de afinidade
a amostra contendo a proteiacutena de interesse foi submetida a uma segunda etapa
cromatograacutefica cromatografia de troca iocircnica utilizando-se a coluna HiTraptrade SP (GE
Healthcare) no sistema de FPLC (GE Healthcare)
Primeiramente a amostra foi diluiacuteda para reduccedilatildeo da concentraccedilatildeo salina e
a coluna foi lavada com 2 volumes de tampatildeo B para cromatografia de troca iocircnica e
depois com 2 volumes de tampatildeo A utilizado na cromatografia de afinidade O
gradiente de passagem do tampatildeo B foi de 0 a 100 e a proteiacutena TcKAP7 foi
obtida na fraccedilatildeo de material natildeo ligado agrave resina (Flow-through) (FT)
3124 Cromatografia de gel filtraccedilatildeo
Amostras da cromatografia de troca iocircnica que continham a proteiacutena de
interesse foram concentradas atraveacutes de filtraccedilatildeo A soluccedilatildeo foi colocada em filtro
Amicon Ultra MWCO 10000 (Milipore) e centrifugada a 4000 rpm a 4 ordmC O
experimento foi realizado em sistema FPLC (GE Healthcare) com a coluna
Superdex 200 HR 1030 (GE Healthcare) em tampatildeo HEPES 20 mM pH 74 e de
cloreto de soacutedio100 mM
313 Espalhamento Dinacircmico de Luz ndash DLS
O experimento foi realizado em equipamento DynaPro Molecular instrument
a 4 ordmC As amostras foram previamente centrifugadas por 5 minutos a 15000 rpm a
4 ordmC A coleta de dados foi realizada com intervalos de 2 segundos com 100
aquisiccedilotildees Para cada leitura utilizou-se 5 microl de amostra proteica
314 Espectroscopia de dicroiacutesmo circular (CD)
O espectro de CD foi coletado usando espectropolariacutemetro Jasco J-715
(Jasco Corporation Toacutekio Japatildeo) sendo a temperatura mantida a 20 degC atraveacutes de
um Peltie rType Control System PFD425S (JASCO) Todos os dados foram
coletados usando cubeta de quartzo de 1 mm de caminho oacuteptico
47
Mediu-se a elipticidade em graus na regiatildeo do UV distante no intervalo de
comprimento de onda de 260 nm a 200 nm com uma velocidade de 100 nmmin
sendo feitas no total 30 leituras com resposta de 1 segundo em varredura contiacutenua
Os valores obtidos em miligraus foram convertidos para elipticidade molar
por resiacuteduo ([θ]MRW) em miligrauscm2dmol-1 que eacute definida pela equaccedilatildeo (Adler et
al 1973)
Onde θobs eacute a elipsidade observada em graus MRW eacute o peso molecular
meacutedio dos resiacuteduos da proteiacutena d eacute o caminho oacuteptico da cubeta em centiacutemetros e c
eacute a concentraccedilatildeo da proteiacutena em mgmL O MRW eacute calculado dividindo-se o peso
molecular da proteiacutena pelo nuacutemero de resiacuteduos
315 Quantificaccedilatildeo e concentraccedilatildeo
As amostras obtidas a partir da purificaccedilatildeo tiveram a concentraccedilatildeo calculada
utillizando a absorbacircncia mensurada pelo aparelho NanoDrop (Thermo Fisher
Scientific) levando-se em consideraccedilatildeo o coeficiente de extinccedilatildeo e teoacuterico da
proteiacutena obtido a partir do ProtParam (httpusexpasyorgtoolsprotparamhtml) e o
peso molecular da proteiacutena que eacute de cerca de 28 kDa
Obtidas as concentraccedilotildees a amostra foi concentrada pelo meacutetodo de
filtraccedilatildeo utilizando o filtro Amiconreg Ultra Centrifugal Filter (Millipore) com poro de
10000 Da A amostra foi centrifugada ateacute a obtenccedilatildeo de uma concentraccedilatildeo final de
5 mgml para os ensaios de cristalizaccedilatildeo Uma aliacutequota da proteiacutena concentrada foi
utilizada para anaacutelise por SDS-PAGE
316 Ensaios de Cristalizaccedilatildeo
Os ensaios de cristalizaccedilatildeo foram realizados empregando-se a teacutecnica de
difusatildeo de vapor em gota sentada utilizando-se os equipamentos disponiacuteveis no
Laboratoacuterio Robotizado de Cristalizaccedilatildeo de Proteiacutenas LNBio Os ensaios foram
feitos em placas de 96 poccedilos e as gotas preparadas pelo robocirc Honeybee
utilizando-se os kits disponiacuteveis no laboratoacuterio Crystal Screen HT (Hampton
Research) JCSG+ Suite (Molecular Dimensions) PACT Suite (Molecular
cd
MRWobs
10][
48
Dimensions) Precipitant Synergy (Rigaku Reagents) SaltRx HT (Hampton
Research) Wizard IampII (Rigaku Reagents)
317 Espalhamento de raio-X a baixo acircngulo (SAXS)
Atraveacutes da teacutecnica de SAXS informaccedilotildees sobre a massa molecular das
partiacuteculas espalhadoras e do raio de giro (Rg) da proteiacutena de estudo satildeo obtidos a
partir dos dados coletados Por meio de programas computacionais como DAMMIN
(SVERGUN1999) e GASBOR (SVERGUN et al 2001) um modelo de baixa
resoluccedilatildeo da forma da proteiacutena pode ser obtido
Os dados de SAXS foram obtidos na linha de luz D02A ndash SAXS2 no
Laboratoacuterio Nacional de Luz Siacutencrotron (LNLS) Campinas-SP Brasil usando
comprimento de onda de 148 A e um detector bidimensional com arranjo CCD
(MARCCD USA) de 165 mm A distacircncia do detector para a amostra foi de 106804
mm e os dados na faixa de 002 nm-1 para 021 nm-1 foram coletados usando
proteiacutena pura nas concentraccedilotildees de 5 mgml em tampatildeo em 20 mM HEPES pH 74
e 100 mM de cloreto de soacutedioExposiccedilotildees de 300 e 600 s foram realizadas e os
dados do tampatildeo foram coletados antes e depois dos dados da amostra para fazer a
correccedilatildeo do solvente e normalizaccedilatildeo do espalhamento
Ajuste dos dados experimentais e avaliaccedilatildeo da funccedilatildeo p(R) foram realizados
utilizando o programa GNOM (SVERGUN 1992) O envelope a baixa resoluccedilatildeo de
TcKAP7 foi determinado usando modelagem abnitio implementada no programa
DAMMIN O modelo a baixa resoluccedilatildeo e o modelo da estrutura tridimensional foram
superpostas usando o programa SUPCOMB (KOZIN amp SVERGUN 2001)
318 Modelagem de TcKAP7
Um modelo da estrutura tridimensional de TcKAP7 foi construiacutedo Para a
construccedilatildeo do modelo foi utilizado o programa MODELLER (SALI amp BLUNDELL
1993) este programa eacute utilizado para a modelagem por homologia a estruturas
tridimensionais de proteiacutenas O programa automaticamente constroacutei um modelo
baseado na anaacutelise de um alinhamento de sequecircncias entre a proteiacutena para a qual
se deseja construir o modelo e uma proteiacutena relacionada cuja estrutura
tridimensional jaacute foi resolvida A qualidade do modelo pode ser avaliada por
49
exemplo atraveacutes de graacuteficos e tabelas que analisam restriccedilotildees quiacutemicas e fiacutesicas de
cada aacutetomo constituinte do modelo
319 Obtenccedilatildeo de antissoro policlonal contra TcKAP7
A proteiacutena TcKPA7 recombinante purificada foi inoculada em camundongos
da linhagem BALBc por via intraperitonial com 4 aplicaccedilotildees de aproximadamente
20-50 μg de antiacutegeno em intervalos de 15 dias seguida de obtenccedilatildeo do soro apoacutes 1
semana da uacuteltima inoculaccedilatildeo O antiacutegeno foi emulsificado em adjuvante completo de
Freund na primeira inoculaccedilatildeo e com adjuvante a base de hidroacutexido de alumiacutenio
(Alu-Gel Serva) nas inoculaccedilotildees posteriores
320 Anaacutelise da expressatildeo do gene TcKAP7 e de seu mutante por ensaio tipo
western blot
Este procedimento foi executado segundo o meacutetodo de Towbin e
colaboradores (1979) Aliacutequotas de extratos de T cruzi equivalentes a 1 x 107
ceacutelulas foram submetidos agrave SDS-PAGE Apoacutes a separaccedilatildeo eletroforeacutetica as
proteiacutenas foram transferidas para membrana de nitrocelulose (Hybond C Amersham
Biosciences) em tampatildeo de western por 2 h a 60 V ou 20 V por 16 h Apoacutes a
transferecircncia a membrana foi corada com Ponceau S e descorada suavemente com
aacutegua bidestilada para a identificaccedilatildeo das bandas do marcador de massa molecular
A membrana foi entatildeo incubada em soluccedilatildeo de bloqueio por 30 min sob agitaccedilatildeo
suave
Apoacutes o bloqueio a membrana foi incubada com os soros policlonais ou
anticorpos monoclonais em TBST-leite por aproximadamente 1 h a 37degC A
membrana foi lavada 5 vezes com TBST Em seguida a membrana foi incubada
com anticorpo secundaacuterio anti-IgG de camundongo conjugado com a enzima
peroxidase (Pierce ndash Thermo Scientific) por 1h na diluiccedilatildeo de 16000 em TBST-leite
a temperatura ambiente A membrana foi submetida a mais cinco lavagens com
TBST e a reaccedilatildeo era evidenciada utilizando substrato quimioluminescente (West
Pico Pierce ndash ThermoScientific) sobre a membrana a qual era exposta a um filme
para raios-X (Hyperfilm ECL GE)
50
321 Superexpressatildeo de TcKAP7
3211 Amplificaccedilatildeo e clonagem do gene TcKAP7 no vetor pNEO3xFlag para
superexpressatildeo da proteiacutena
O gene TcKAP7 foi clonado no vetor pNEO3xFLAG construiacutedo no nosso
laboratoacuterio a partir do vetor pTcGW-ProtCcarboxi (BATISTA et al 2010) que utiliza
o sistema Gateway de clonagem (Invitrogen) Os vetores foram construiacutedos
utilizando-se como base o pBluescript II (Stratagene San Diego USA) onde foram
inseridas trecircs sequencias que codificam para regiotildees intergecircnicas (IR) de T cruzi A
primeira TcUIR eacute a regiatildeo intergecircnica do locus de ubiquitinacalmodulina de T
cruzi (BATISTA et al 2010) As outras duas regiotildees intergecircnicas ITR1 e ITR2 foram
selecionadas a partir de genes de copia uacutenica no genoma e que possuem um niacutevel
de expressatildeo constitutivo nos estaacutegios epimastigota e tripomastigota metaciclicos
avaliados por dados de proteocircmica e RNAseq (Comunicaccedilatildeo pessoal Michel
Batista) Aleacutem disso esse vetor confere agrave regiatildeo C-terminal da proteiacutena
recombinante resultante da clonagem neste vetor trecircs etiquetas FLAG (sequecircncia
DYKDDDDK) em tandem (FIGURA 10)
FIGURA 10 VETOR PARA EXPRESSAtildeO EM T CRUZI P3XFLAG
LEGENDA PR ndash PROMOTOR RIBOSOMAL TCUIR ITR1 E ITR2 - REGIOtildeES INTERGENICAS ATTR1 E ATTR2 ndash REGIOtildeES PARA RECOMBINACcedilAtildeO CMreg - RESISTEcircNCIA A CLORANFENICOL CCDB ndash GENE PARA SELECcedilAtildeO NEGATIVA DURANTE A CLONAGEM 3XFLAG ndash TREcircS ETIQUETAS DE FLAG (DYKDDDDK) NEOMICINA ndash GENE DE RESISTEcircNCIA A NEOMICINA
O gene TcKAP7 foi amplificado utilizando os primers especiacuteficos
KAP7GtwFor (5rsquo-
GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTGCCCGCGAAGTATTCAGCAGCCC)
e KAP7GtwRev (5rsquo-
GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCGTGGTACATGGCGTACGGGTTG)
PR TcUIR Att R1 Cmreg ccdB Att R2 3x Flag ITR1 Neomicina ITR2
51
os quais possuem os siacutetios attB indicados em negrito As condiccedilotildees desta reaccedilatildeo
de PCR foram as seguintes 100 ng de DNA genocircmico de T cruzi 10 pmol de cada
primer 200 μM de cada dNTP MgSO4 2 mM tampatildeo Taq DNA polimerase High
Fidelity 1x 1U de Platinum Taq DNA polimerase high fidelity (Invitrogen) A reaccedilatildeo
de PCR foi processada no termociclador modelo 9700 (AppliedBiosystems EUA)
com a desnaturaccedilatildeo do material por 5 min a 94 degC seguida de 35 ciclos constando
de desnaturaccedilatildeo a 94 degC por 30 s hibridizaccedilatildeo dos primers a 58 degC por 30 s e
extensatildeo a 72 degC por 15 min
O gene amplificado foi clonado no vetor de entrada pDONRtrade221
(Invitrogen) A reaccedilatildeo foi feita com 150 ng dos produtos de PCR contendo os siacutetios
attB 150 ng do plasmiacutedeo pDONRtrade221 1 μL de BP ClonaseTM enzyme mix e TE
para um volume final de 10 μL e com incubaccedilatildeo a 25 degC por 16 h Foi entatildeo
adicionado 1 microL de proteinase K (2 mgmL) com incubaccedilatildeo por 10 min a 37 degC Os
clones em pDONRtrade221 foram transformados em ceacutelulas caacutelcio-competentes E coli
DH5α conforme protocolo de transformaccedilatildeo de ceacutelulas caacutelcio-competentes Apoacutes
transformaccedilatildeo a cultura foi semeada em placa de LBKan (kanamicina 25 microgmL) e
incubada a 37 degC durante 16 h
Para verificar a presenccedila de clones com os insertos de interesse foi feita a
teacutecnica da palitagem As colocircnias selecionadas foram inoculadas em 5 mL de meio
LBKan e incubadas por 16 h a 37 degC com agitaccedilatildeo (190 rpm) A purificaccedilatildeo dos
plasmiacutedeos foi realizada com o kit QIAprepreg Spin Miniprep (Qiagen) conforme
orientaccedilotildees do fabricante
Apoacutes esta etapa foi necessaacuterio transferir os insertos para o vetor de destino
pNEO3xFlag A troca de insertos entre os vetores de entrada e destino denominada
de reaccedilatildeo LR foi realizada conforme orientaccedilotildees do fabricante (Gateway LR clonase
enzyme mix) e ceacutelulas caacutelcio-competentes foram transformadas com os produtos
das recombinaccedilotildees conforme descrito anteriormente semeadas em placas de
LBAmp e incubadas a 37 degC durante 16 h
A verificaccedilatildeo de clones positivos foi realizada atraveacutes de PCR de colocircnias
As colocircnias selecionadas foram inoculadas em 5 mL de meio LB contendo ampicilina
(100 μgmL) e incubada a 37deg C por 16 h sob agitaccedilatildeo (200 rpm)O plasmiacutedeo
contendo o gene TcKAP7 foi denominado de pNEO_KAP7_3xFLAG
52
3212 Transfecccedilatildeo por eletroporaccedilatildeo
A transfecccedilatildeo das formas epimastigotas de T cruzi foi feita pela teacutecnica de
eletroporaccedilatildeo utilizando o equipamento genepulserreg apparatus (Bio-Rad) e cubetas
esteacutereis de eletroporaccedilatildeo gene pulsermicro pulserreg 02 cm (Bio-Rad) Formas
epimastigotas de T cruzi foram cultivadas em meio LIT ateacute uma densidade celular
de 3 x 107 ceacutelulasml Um volume de cultura correspondendo a 1 x 109 parasitas foi
centrifugado (4000 x g 4 degC) O sobrenadante foi descartado e as ceacutelulas foram
ressuspendidas em tampatildeo de eletroporaccedilatildeo esteacuteril e submetidas a centrifugaccedilatildeo
nas condiccedilotildees acima O sedimento celular foi ressuspendido em 2 ml de tampatildeo de
eletroporaccedilatildeo Em cubetas de eletroporaccedilatildeo previamente resfriadas a 4 degC foram
misturados 400 μL (2 x 108 ceacutelulas) da suspensatildeo dos parasitas e 50 μL (20 microg) do
plasmiacutedeo para superexpressatildeo (pNEO_KAP7_3XFLAG) Em paralelo parasitas
foram submetidos agraves mesmas condiccedilotildees mas na ausecircncia de DNA (controle
negativo da transfecccedilatildeo)
As cubetas foram entatildeo mantidas em gelo por 10 min Em seguida os
parasitas foram transfectados com dois pulsos sequenciais de 500 μF e 450 volts
Apoacutes o esse procedimento as cubetas foram mantidas em gelo por mais 5 min A
suspensatildeo de parasitas transfectados foi entatildeo inoculada em 10 mL de meio LIT
suplementado com 10000 U de penicilina e estreptomicina a 10 μgmL
3213 Seleccedilatildeo dos transfectantes
O gene para a enzima neomicina fosfotransferase foi utilizado como
marcador de seleccedilatildeo dos parasitas carregando o plasmiacutedeo para a superexpressatildeo
pNEO_KAP7_3XFLAG Para tanto o antibioacutetico G418 foi adicionado agraves culturas
apoacutes 24 h da transfecccedilatildeo na concentraccedilatildeo final de 500 μgmL Entre 3 e 4 dias apoacutes
a transfecccedilatildeo foi realizada a primeira passagem (14) A partir desse ponto foram
feitas passagens semanais na proporccedilatildeo de 110 ateacute que natildeo fosse observado
crescimento nas duas uacuteltimas passagens da cultura do controle negativo da
transfecccedilatildeo
A expressatildeo da proteiacutena KAP7-FLAG foi analisada atraveacutes de ensaios de
western blot e imunofluorescecircncia
53
322 Deleccedilatildeo do gene TcKAP7 por nocaute gecircnico
3221 Amplificaccedilatildeo e clonagem das regiotildees a montante e a jusante do gene
TcKAP7
As regiotildees a montante (upstream) e a jusante (downstream) do gene TcKAP7
respectivamente denominadas de UPSKAP7 (521 pb) e DOWNKAP7 (500 pb)
foram amplificadas por PCR usando os primers descritos nas TABELAS 1 E 2 A
regiatildeo denominada DOWNKAP7 conteacutem ainda 139 pb do final da regiatildeo codante de
TcKAP7
QUADRO 1 - RELACcedilAtildeO DOS PRIMERS UTILIZADOS PARA A CLONAGEM DA
REGIAtildeO UPSTREAM DE TcKAP7 NO VETOR pNEO1
UPSKAP7F GGGGTCGACCGTTGCTGGTTTTTCTTTTGGTGT
UPSKAP7R GGGAAGCTTGCTTCAAAACGTCTATGCGGGC
Os siacutetios das enzimas de restriccedilatildeo SalI (GTCGAC) e HindIII (AAGCTT) adicionados aos primers estatildeo em negrito
QUADRO 2 - RELACcedilAtildeO DOS PRIMERS UTILIZADOS PARA A CLONAGEM DA
REGIAtildeO DOWNSTREAM DE TcKAP7 NO VETOR pNEO1
DOWNKAP7F GGGGAATTCGCCTCATATGACGCATCTCCCA
DOWNKAP7R GGGGGATCCTGTTGGCGCTGTCAAGGAAGTAAG
Os siacutetios das enzimas de restriccedilatildeo EcoRI (GAATTC) e BamHI (GGATCC) adicionados aos primers estatildeo em negrito
As reaccedilotildees de PCR foram realizadas nas seguintes condiccedilotildees 100 ng de
DNA total de T cruzi Dm28c 10 pmol dos oligonucleotiacutedeos F e R 200 μM de cada
dNTP MgCl2 15 mM tampatildeo Taq DNA polimerase 1x 25 unidades de Taq DNA
polimerase (Invitrogen EUA) A reaccedilatildeo de PCR foi processada no termociclador
modelo 9700 (Applied Biosystems EUA) nas seguintes condiccedilotildees Desnaturaccedilatildeo do
54
material por 4 min a 94 degC seguida de 35 ciclos de desnaturaccedilatildeo a 92 degC por 30 s
hibridizaccedilatildeo dos oligonucleotiacutedeos a 56 degC por 30 s e extensatildeo a 72 degC por 1 min O
material amplificado foi purificado usando o Qiaquick PCR Purification (Qiagen) O
DNA purificado foi digerido com enzimas de restriccedilatildeo apropriadas para a clonagem
dos fragmentos nos vetores pNEO1 O plasmiacutedeo resultante da clonagem das
regiotildees UPSKAP7 e DOWNKAP7 foi denominado de pNEO1kap7 (Figura 11A)
Uma vez que o genoma do T cruzi eacute diploide construiacutemos um segundo
plasmiacutedeo para o nocaute do segundo alelo do gene TcKAP7 tendo como marca de
seleccedilatildeo o gene que codifica resistecircncia a higromicina B Esse plasmiacutedeo foi
construiacutedo usando como molde o plasmiacutedeo pNEO1kap7 O plasmiacutedeo pNEO1kap7
foi digerido com HindIII para remoccedilatildeo do gene neo e uma pequena porccedilatildeo da regiatildeo
DOWNSTREAM (220 pb) O plasmiacutedeo linearizado foi purificado do gel de agarose
usando o kit Qiaquick PCR Purification (Qiagen) e ligado com o gene higro O gene
higro foi amplificado usando os primers HIGROF
(GGGGGAAGCTTATGAAAAAGCCTGAACTCACCGCGAC) e HIGROR
(GGGAAGCTTCTATTCCTTTGCCCTCGGACGAGTGCTG) ambos contendo na
extremidade 5rsquo o siacutetio para a enzima de restriccedilatildeo HindIII (em negrito) O plasmiacutedeo
resultante da ligaccedilatildeo foi denominado de pHIGRO1kap7 (FIGURA 11B)
55
FIGURA 11 ESQUEMA DA CONSTRUCcedilAtildeO DOS VETORES UTILIZADOS PARA O NOCAUTE DO GENE TcKAP7 LEGENDA Nesta figura eacute observada a inserccedilatildeo das sequecircncias flanqueadoras do gene TcKAP7 juntamente com os respectivos siacutetios para cada enzima de restriccedilatildeo nos vetores de clonagem pNEO1 e pHIGRO1
3222 Amplificaccedilatildeo dos cassetes UPS-NEO-DOWN e UPS-HIGRO-DOWN para
transfecccedilatildeo de T cruzi
Os dois plasmiacutedeos recombinantes foram purificados pelo meacutetodo da lise
alcalina utilizando o kit de minipreparaccedilatildeo de plasmiacutedeos (Qiagen) As minipreps
foram utilizadas para a amplificaccedilatildeo da regiatildeo UPS-NEO-DOWN (cassete NEO) e da
regiatildeo UPS-HIGRO-DOWN (cassete HYG) por PCR usando os primers UPSKAP7F
e DOWNKAP7R As reaccedilotildees de PCR foram realizadas nas seguintes condiccedilotildees 20
ng do plasmiacutedeo pNEO1kap7 ou pHIGRO1kap7 10 pmol dos primers UPSKAP7F e
DOWNKAP7R 200 μM de cada dNTP MgCl2 15 mM tampatildeo Taq DNA polimerase
1x 25 unidades de Taq DNA polimerase (Invitrogen EUA) A reaccedilatildeo de PCR foi
processada no termociclador modelo 9700 (AppliedBiosystems EUA) nas seguintes
condiccedilotildees Desnaturaccedilatildeo do material por 4 min a 94 degC seguida de 35 ciclos de
desnaturaccedilatildeo a 92 degC por 30 s hibridizaccedilatildeo dos oligonucleotiacutedeos a 56 degC por 30 s e
56
extensatildeo a 68 degC por 2 min O material amplificado foi submetido agrave eletroforese em
gel preparativo de agarose 1 O gel foi corado com brometo de etiacutedeo (1 μgml) e a
banda correspondente a cada cassete foi removida do gel com auxiacutelio de uma
lacircmina de bisturi O DNA foi purificado por eletroeluiccedilatildeo dentro de saco de diaacutelise
nas condiccedilotildees de 100 V por 1 hora em tampatildeo TBE Para obter massa de DNA
suficiente para a transfecccedilatildeo (20 μg) foram feitas 10 reaccedilotildees de PCR com 100 μl
cada uma
3223 Transfecccedilatildeo do T cruzi com o cassete UPS-NEO-DOWN
Formas epimastigotas de T cruzi foram cultivadas em meio LIT ateacute 2 x 107
ceacutelulasml Os parasitas (1 x 108 ceacutelulas) foram coletados por centrifugaccedilatildeo a 6000
x g por 10 min a 4 degC O sedimento celular foi lavado com PBS esteacuteril e
ressuspendido em 1 ml de soluccedilatildeo de eletroporaccedilatildeo Volumes correspondentes a
04 ml da suspensatildeo de ceacutelulas foram transferidos para cubetas de eletroporaccedilatildeo
esteacutereis (02 cm de gap) (BioRad) e preacute-resfriadas Em uma delas foram adicionados
de 20 μg do fragmento representando o cassete NEO A outra cubeta contendo
apenas a suspensatildeo de parasitas foi usada como controle Apoacutes 10 minutos no gelo
as amostras contidas nas cubetas foram submetidas a 2 pulsos de 450 volts 500
microF utilizando o eletroporadorGenePulserreg IIApparatus (Bio-Rad) As amostras
foram incubadas novamente por 5 a 10 minutos no gelo em seguida foram
transferidas para garrafas de cultura de 25 cm2 contendo 10 ml de meio LIT
(suplementado com 10000 U de penicilina e estreptomicina a 10 mgml) As culturas
foram entatildeo incubadas a 28 degC Apoacutes 24 horas de incubaccedilatildeo adicionou-se o
antibioacutetico G418 na concentraccedilatildeo de 500 μgml As culturas foram mantidas por
sucessivas passagens (diluiccedilatildeo de 110) em meio LIT suplementado com G418 a
cada 8-10 dias ateacute a ausecircncia de proliferaccedilatildeo celular na cultura controle Os
parasitas nos quais TcKAP7 foi substituiacutedo pelo gene neo foram denominados deT
cruzi(kap7kap7neo) e foram testados para a correta inserccedilatildeo do gene neo no locus
genocircmico de TcKAP7
57
3224 Extraccedilatildeo de DNA dos transfectantes
T cruzi transfectado com o cassete NEO (T cruzi(kap7kap7neo) foi cultivado
em meio LIT suplementado com G418 (500 μgml) ateacute uma densidade de 3 x 107
ceacutelulasml Os parasitas foram coletados por centrifugaccedilatildeo por 1 min a 6000 x g e
lavados com PBS Em seguida os parasitas foram lisados gentilmente em 350 μl de
tampatildeo TELT conforme descrito no item 34
3225 Anaacutelise por PCR do DNA dos parasitas transfectados com o cassete
UPS-NEO-DOWN
As reaccedilotildees de PCR foram realizadas utilizando primers externos EXTF
(CCCGCTACGACTGCCCTCCACGCGGAAGGGAA) e EXTR
(AAGTAAACGGGAGAAGCAACACGATGGGAGGCTC) que natildeo estatildeo presentes na
construccedilatildeo do cassete UPS-NEO-DOWN combinados com os primers NEOF
(GGGGAAGCTTATGATTGAACAAGATGGATTGCACGCAG) e NEOR
(GGGGGAATTCAGAAGAACTCGTCAAGAAGGCGATAGAA)
As condiccedilotildees das reaccedilotildees foram as seguintes 100 ng do DNA total de T
cruzi Dm28c tipo selvagem (T cruzi(kap7kap7) ou tipo selvagem) ou do DNA da
populaccedilatildeo T cruzi(kap7kap7neo) (mutante simples nocaute) 10 pmol dos primers EXTF
+ NEOR e NEOF + EXTR 200 μM de cada dNTP MgCl2 15 mM tampatildeo Taq DNA
polimerase 1x 25 unidades de Taq DNA polimerase (Invitrogen EUA) A reaccedilatildeo de
PCR foi processada no termociclador modelo 9700 (AppliedBiosystems EUA) nas
seguintes condiccedilotildees Desnaturaccedilatildeo do material por 4 min a 94 degC seguida de 35
ciclos de desnaturaccedilatildeo a 92 degC por 30 s hibridizaccedilatildeo dos oligonucleotiacutedeos a 55 degC
por 30 s e extensatildeo a 72 degC por 2 min
3226 Transfecccedilatildeo do T cruzi com o cassete UPS-HIGRO-DOWN
Formas epimastigotas da populaccedilatildeo mutante de T cruzi (kap7kap7neo) foram
cultivadas em meio LIT suplementado com G418 (500 μgml) ateacute a densidade de 2 x
107 ceacutelulasml Os parasitas (1 x 108 ceacutelulas) foram coletados por centrifugaccedilatildeo a
6000 x g por 10 min a 4 degC e submetidos ao processo de eletroporaccedilatildeo como
descrito no item 3202 Para a transfecccedilatildeo foram usados 20 μg do fragmento
58
representando o cassete UPS-HIGRO-DOWN As culturas (transfectada e controle)
foram entatildeo incubadas a 28 degC em LIT suplementado de G418 Apoacutes 24 horas de
incubaccedilatildeo foi adicionado o antibioacutetico higromicina ao meio de cultura na
concentraccedilatildeo de 500 μgml As culturas foram mantidas por sucessivas passagens
(diluiccedilatildeo de 110) em meio LIT suplementado com G418 e higromicina a cada 8-10
dias ateacute a ausecircncia de proliferaccedilatildeo celular na cultura controle Mutantes nos quais
os dois alelos de TcKAP7 foram removidos e substituiacutedos pelos genes NEO e
HIGRO foram denominados com genoacutetipo T cruzi (kap7neokap7higro)
3227 Anaacutelise por PCR do DNA dos parasitas transfectados com o cassete
UPS-HIGRO-DOWN
As reaccedilotildees de PCR foram realizadas utilizando primers externos EXTF e
EXTR (item 3225) combinados com os primers HIGROF e HIGROR (item 3221)
As reaccedilotildees de PCR foram realizadas nas seguintes condiccedilotildees 100 ng do
DNA total de T cruzi(kap7kap7) ou do DNA do T cruzi(kap7neokap7higro) 10 pmol dos
primers EXTF + HIGROR e HIGROF + EXTR 200 μM de cada dNTP MgCl2 15
mM tampatildeo Taq DNA polimerase 1x 25 unidades de Taq DNA polimerase
(Invitrogen EUA) A reaccedilatildeo de PCR foi processada no termociclador modelo 9700
(Applied Biosystems EUA) nas seguintes condiccedilotildees Desnaturaccedilatildeo do material por
4 min a 94 degC seguida de 35 ciclos de desnaturaccedilatildeo a 92 degC por 30 s hibridizaccedilatildeo
dos oligonucleotiacutedeos a 55 degC por 30 s e extensatildeo a 72 degC por 2 min
3228 Anaacutelise da organizaccedilatildeo do gene TcKAP7 e da eficiecircncia de seu nocaute
atraveacutes de ensaio do tipo Southern blot
O DNA genocircmico (5 μg) de T cruzikap7kap7 e T cruzikap7neokap7higro foi
submetido a digestatildeo com a enzima de restriccedilatildeo HindIII de acordo com as
especificaccedilotildees do fornecedor Apoacutes 3 horas o DNA digerido foi submetido agrave
eletroforese em gel de agarose 08 em tampatildeo TBE a 100 V O gel foi corado por
brometo de etiacutedio (05 μgmL) e fotografado sob a luz ultravioleta (310 nm)
Posteriormente o gel foi tratado com soluccedilotildees de depurinaccedilatildeo por 15 minutos de
desnaturaccedilatildeo por 30 minutos (2 vezes) e soluccedilatildeo de neutralizaccedilatildeo por 30 minutos (2
vezes) O DNA foi transferido para uma membrana de nylon (Hybond N
59
AmershamBiosciences) por capilaridade (SAMBROOK et al 1989) utilizando-se de
uma ldquoponterdquo de papel 3 MM embebido em SSC 20X Apoacutes a transferecircncia o DNA foi
fixado agrave membrana por exposiccedilatildeo agrave luz ultravioleta com uma dose de 120 mJcm2
usando o aparelho Spectrolinker (Spectronicscorp USA) A membrana contendo o
DNA de T cruzi foi preacute-hibridizada em soluccedilatildeo de hibridizaccedilatildeo de DNA por 1 hora a
65 ordmC seguido da adiccedilatildeo da sonda marcada radioativamente com α-[P32
]-dCTP (10
μCiμl 3000 Cimmol) (Amersham Biosciences) preparada segundo meacutetodo de nick
translation descrito por Rigbyet al (1977) utilizando-se o meacutetodo de iniciaccedilatildeo por
random primers (Megaprimer DNA labeling kit ndash GE) conforme recomendaccedilotildees do
fabricante
Foram utilizadas 3 sondas satildeo elas fragmento do gene TcKAP7
correspondendo a regiatildeo compreendida entre os nucleotiacutedeos 1 e 560 o gene neo e
o gene higro Apoacutes a marcaccedilatildeo as sondas foram purificadas em colunas de
Sephadex G-50 (ProbeQuant ndash Amersham Biosciences) e adicionadas ao tampatildeo de
hibridizaccedilatildeo na concentraccedilatildeo de 5 x 106
cpmml As membranas foram incubadas
por 16 horas a 65 C e em seguida lavadas nesta temperatura duas vezes por 30
minutos com soluccedilotildees de alta meacutedia e baixa estringecircncia As membranas foram
expostas a filme de raio-X (Hyperfilmreg Amersham Biosciences) na presenccedila de tela
intensificadora (Dupont Cronex Lightining Plus) por tempo que varia entre 1 a 3 dias
a ndash70 C
323 Localizaccedilatildeo celular da proteiacutena TcKAP7 atraveacutes de ensaio de
imunofluorescecircncia
Formas epimastigotas de T cruzi foram coletadas por centrifugaccedilatildeo (4000 times
g 3 a 10 ordmC) lavadas duas vezes em PBS e depositadas sobre lacircminas de vidro
previamente tratadas com poli-L-lisina 001 diluiacuteda em PBS Os parasitas foram
entatildeo fixados com paraformaldeiacutedo 4 em PBS permeabilizados com Triton X-100
01 em PBS por 2 min agrave temperatura ambiente e incubados a 4ordmC durante 16 h
em soluccedilatildeo de bloqueio para imunofluorescecircncia (PBS 1X + BSA 1 ) Apoacutes o
bloqueio os parasitas foram incubados agrave temperatura ambiente por 1 h com o
anticorpo monoclonal anti-FLAG em uma diluiccedilatildeo de 11000 em soluccedilatildeo de bloqueio
para imunofluorescecircncia Depois disso as lacircminas foram submetidas a 5 lavagens
60
de 5 min cada em PBS Em seguida os parasitas foram incubados agrave temperatura
ambiente por 1 hora com o anticorpo secundaacuterio anti-IgG de camundongo conjugado
ao fluoroacuteforo Alexa Fluacuteor 488 (Invitrogen) diluiacutedo 1600 em soluccedilatildeo de bloqueio As
lacircminas foram lavadas 5 vezes com PBS e posteriormente incubadas com o corante
Hoechst 33342 (Invitrogen) a 2 μgμL em PBS por 5 min Apoacutes cinco lavagens com
PBS as lacircminas foram montadas com ProLong Gold Antifade (Invitrogen) sobre uma
lacircmina de microscopia oacutetica O material foi observado nos microscoacutepios Leica SP5 e
DMI6000
324 Anaacutelise da ultraestrutura do cinetoplasto do mutante de T cruzi para
TcKAP7 por microscopia eletrocircnica de transmissatildeo
Os parasitas foram coletados lavados com PBS e fixados em soluccedilatildeo
contendo 25 de glutaraldeiacutedo 4 de paraformaldeiacutedo e tampatildeo cacodilato 01 M
Em seguida os parasitas foram fixados por 1 h em soluccedilatildeo de 1 de tetroacutexido de
Oacutesmio e 08 de ferricianeto de potaacutessio diluiacutedos em tampatildeo cacodilato 01 M As
ceacutelulas foram entatildeo desidratadas em soluccedilatildeo contendo concentraccedilotildees crescentes
de acetona e incluiacutedas em Epon Apoacutes a obtenccedilatildeo de cortes ultrafinos dos parasitas
os mesmos foram contrastados em acetato de uranila e citrato de Chumbo antes de
serem observados e fotografados no microscoacutepio eletrocircnico de transmissatildeo Zeiss
900
325 Coloraccedilatildeo dos parasitas transfectados
A coloraccedilatildeo dos parasitas foi realizada pelo meacutetodo panoacutetico raacutepido
(Laborclin Pinhais Paranaacute Brasil) modificado
Formas epimastigotas do mutante de T cruzi para TcKAP7 foram cultivadas
como descrito no item 321 Os parasitas foram coletados por centrifugaccedilatildeo de 1
min a 4000 x g e ressuspensos em PBS Desta suspensatildeo uma gota foi retirada e
depositada sobre lacircminas previamente limpas Quando secas as lacircminas foram
imersas individualmente na Soluccedilatildeo 1 (Fixador) Soluccedilatildeo 2 (Revelador) e Soluccedilatildeo 3
(Corante) em cada uma por 30 s Apoacutes este processo as lacircminas foram lavadas em
aacutegua corrente secas agrave temperatura ambiente e cobertas com Permount e lamiacutenula
Os parasitas foram visualizados em microscoacutepio Nikon E600
61
326 Infecccedilatildeo de ceacutelulas Vero com o mutante de T cruzi para TcKAP7
Ceacutelulas Vero (ATCCreg Nuacutemero CRL-2783trade) foram cultivadas em garrafas
de 150 cm2 contendo meio RPMI suplementado com 5 de soro fetal bovino
(GIBCO) penicilina 100 UIml streptomicina 10 microgml e glutamina 2 mM a 37 o C
com 5 de CO2 Ao atingirem a confluecircncia (80 a 100) realizou-se a passagem
atraveacutes de tripsinizaccedilatildeo e foi feito um inoacuteculo de 1 x 107 ceacutelulas para cada nova
garrafa de 150 cm2 Apoacutes 24 horas estas ceacutelulas (50 ndash 70 de confluecircncia) foram
infectadas com formas metaciacuteclicas obtidas da diferenciaccedilatildeo do mutante de T cruzi
para TcKAP7 em microplacas de 24 poccedilos contendo lamiacutenulas de vidro com
diacircmetro de 13 mm A cada poccedilo foram adicionadas 2 x 104 ceacutelulas Vero Apoacutes 24
horas de cultivo as ceacutelulas foram infectadas com tripomastigotas metaciacuteclicos
(obtidos do sobrenadante das culturas de T cruzi diferenciados em meio TAU3AAG
sem purificaccedilatildeo na coluna de DEAE celulose) A infecccedilatildeo das ceacutelulas Vero foi
acompanhada diariamente por microscopia de contraste de fase
327 Anaacutelise da funccedilatildeo do gene TbKAP7 de Trypanosoma brucei atraveacutes de
ensaios de RNA de interferecircncia
Com o intuito de complementar os estudos da funccedilatildeo do gene TcKAP7 foi
utilizada a teacutecnica de RNA de interferecircncia O uso dessa metodologia compreende
uma abordagem alternativa agrave anaacutelise da funccedilatildeo gecircnica para genes ortoacutelogos deT
brucei por anaacutelises de RNAi uma vez que a maquinaria de RNAi em T cruzi eacute
inexistente (DA ROCHA et al 2003) Os resultados podem gerar evidecircncias que
estejam relacionadas agrave funcionalidade dos genes em T cruzi Esta abordagem foi
utilizada neste trabalho para auxiliar no estudo da funccedilatildeo do gene TcKAP7 a partir
do ortoacutelogo em T brucei ainda natildeo caracterizadoTbKAP7 Os ensaios de RNAi
foram realizados em T brucei cepa 29-13 (WIRTZ et al 1999) com sistema induzido
por tetraciclina utilizando o vetor p2T7-177 ilustrado na figura 12 Este vetor quando
transfectado no parasita integra-se aos minicromossomos do T brucei regiatildeo de
repeticcedilotildees 177 (FOLDYNOVA-TRANTIRKOVA et al 2005)
62
FIGURA 12 MAPA DO VETOR p2T7-177 UTILIZADO PARA ENSAIOS DE RNAi LEGENDA T7 prom Promotor de T7 RNA Polimerase induzido por tetraciclina T7 term Terminador de transcriccedilatildeo 177 Sequumlecircncia repetitiva de 177 pares de bases para alvo de inserccedilatildeo em minicromossomos BLEO gene de resistecircncia agrave fleomicina GFP Proteiacutena Green FluorescentProtein os siacutetios para as enzimas de restriccedilatildeo estatildeo indicados AmpR gene de resistecircncia agrave ampicilina (FONTE WICKSTEAD et al 2002)
As regiotildees do mRNA para alvos nos ensaios de RNAi foram escolhidas com
o auxiacutelio da ferramenta RNAit da base de dados do Trypanofan - Genocircmica
funcional de Tbrucei (httptrypanofanpathcamacuktrypanofanmain)
(REDMOND et al 2003) Essas regiotildees foram amplificadas por PCR usando como
molde o DNA total de T brucei (100 ngreaccedilatildeo) 10 pmol dos primers listados na
tabela 3 200 mM de cada dNTP 15 mM de MgCl2 tampatildeo Taq DNA polimerase 1x
63
(Invitrogen) e 25 unidades de Taq DNA polimerase (Invitrogen) A reaccedilatildeo foi
aquecida por 4 min a 94 degC e entatildeo submetida a 35 ciclos de desnaturaccedilatildeo a 94 degC
por 30 s anelamento a 55 degC por 30 s e extensatildeo a 72 degC por 1 min Os primers
utilizados apresentam siacutetio para as enzimas de restriccedilatildeo BamHI (F) ou HindIII (R)
Os produtos de PCR foram purificados por extraccedilatildeo com fenol-clorofoacutermio e
digeridos com as referentes enzimas
QUADRO 3 - RELACcedilAtildeO DOS PRIMERS UTILIZADOS PARA A AMPLIFICACcedilAtildeO DO
GENE TbKAP7
KAP7RNAiF
AAAGGATCCCTAACCTAACCTGCAGGGTCTCTCG
KAP7RNAiR
GCGAAGCTTTTGTTCCTTTACAAACGCCC
Os siacutetios das enzimas de restriccedilatildeo BamHI (GGATCC) e HindIII (AAGCTT) adicionados aos primers estatildeo em negrito
As clonagens foram confirmadas por PCR de colocircnia e os plasmiacutedeos foram
purificados pelo kit QIAprep Spin Miniprep (Qiagen) Apoacutes purificaccedilatildeo 10 μg dos
plasmiacutedeos foram linearizados com a enzima NotI conforme descrito pelo fabricante
O DNA foi precipitado e ressuspenso em 50 μl de meio de eletroporaccedilatildeo ZPFM para
transfecccedilatildeo do T brucei
Para cada transfecccedilatildeo foi utilizado um total de 4 x 107parasitas em fase logariacutetmica
de crescimento Os parasitas foram obtidos por centrifugaccedilatildeo (5000 x g por 10 min
a 4 degC) lavados em meio ZPFM e ressuspensos em 500 μl do mesmo meio A
transfecccedilatildeo foi feita em cubetas de eletroporaccedilatildeo (4 mm) usando o eletroporador da
BioRad (GenePulser II Electroporator) As condiccedilotildees utilizadas foram dois pulsos de
1600 V e 25 microF Os parasitas foram entatildeo transferidos para garrafas contendo meio
SDM-79 SFB 10 higromicina 50 μgml e G418 15 μgml A seleccedilatildeo dos parasitas
transfectados foi atraveacutes da adiccedilatildeo de 5μgmL de fleomicina resistecircncia conferida
pelo vetor p2T7-177 apoacutes 24 horas de cultivo O tempo para seleccedilatildeo foi entre duas
e trecircs semanas
64
3271 Induccedilatildeo do RNA dupla fita
A induccedilatildeo da expressatildeo de RNA dupla fita referente agrave porccedilatildeo do gene
TbKAP7 clonado no plasmiacutedeo p2T7-177 deu-se pela adiccedilatildeo de tetraciclina 2 μgml
a uma cultura transfectada de T brucei em fase de crescimento exponencial (~2 x
106 parasitasml) Nos dias que se seguiram 1μgml de tetraciclina foi adicionada
diariamente agraves culturas A observaccedilatildeo dos efeitos na curva de crescimento causada
por RNAi em T brucei foi realizada ao longo de uma semana com a contagem de
ceacutelulas e adiccedilatildeo diaacuteria de tetraciclina 1 μgml
65
4 RESULTADOS
41 Clonagem e caracterizaccedilatildeo do gene TcKAP7
A regiatildeo codificante do gene TcKAP7 (ID Tc00104705350871950) foi
obtida a partir do banco de dados do genoma do T cruzi disponiacutevel no portal da
internet wwwgenedborg e amplificada por PCR com os primers descritos no item
37
No genoma do T cruzi cepa CL Brener (EL-SAYED et al 2005) foram
identificados dois haploacutetipos do gene TcKAP7 que foram denominados neste
trabalho de haploacutetipo A (Tc00104705350871950) e haploacutetipo B
(Tc00104705350979320) Neste trabalho foi utilizado o gene TcKAP7 proveniente
da cepa Dm28c de T cruzi Este gene apresenta uma regiatildeo codante de 747 pb e
codifica uma proteiacutena de 276 kDa assumindo que o primeiro ATG apoacutes a sequecircncia
do mini-eacutexon seja usada na iniciaccedilatildeo da traduccedilatildeo
A figura 13 abaixo mostra o alinhamento de TcKAP7 das cepas CL Brener e
Dm28c
FIGURA 13 - COMPARACcedilAtildeO ENTRE AS SEQUumlEcircNCIAS DE AMINOAacuteCIDOS DEDUZIDAS DO GENE KAP7 DE T cruzi Dm28C E DOS HAPLOacuteTIPOS DE CL BRENER
LEGENDA As posiccedilotildees com aminoaacutecidos idecircnticos em todas as sequumlecircncias estatildeo coloridas em preto
66
Embora o gene TcKAP7 natildeo possua grande identidade com os com genes
ortoacutelogos em Trypanosoma brucei TbKAP7 (714 pb) (Tb106k151470) Leishmania
major LmKAP7 (1044 pb) (LMJF_36_5840) Leishmania infantum LiKAP7 (1044 pb)
(LINJ_36_6090) e Leishmania braziliensis LbKAP7 (1038 pb) (LBRM_35_0010)
cujos genomas tambeacutem foram sequumlenciados (BERRIMAN et al 2005 IVENS et al
2005 PEACOCK et al 2007) as sequecircncias de aminoaacutecidos das respectivas
proteiacutenas deduzidas a partir desses genes ainda compartilham certo grau de
similaridade entre si (FIGURA 14) Na tabela 4 pode-se visualizar o percentual de
identidade entre as proteiacutenas KAP7 dos tripanossomatiacutedeos que possuem o genoma
sequenciado
FIGURA 14 COMPARACcedilAtildeO ENTRE AS SEQUumlEcircNCIAS DE AMINOAacuteCIDOS DEDUZIDAS DO GENE KAP7 EM DIFERENTES TRIPANOSOMATIacuteDEOS LEGENDA Em preto encontram-se os resiacuteduos de aminoaacutecidos idecircnticos em todas as sequumlecircncias e em cinza os resiacuteduos conservados na maioria delas
67
QUADRO 4 - PERCENTUAL DE IDENTIDADE ENTRE AS PROTEIacuteNAS KAP7 NOS
TRIPANOSSOMATIacuteDEOS COM O GENOMA SEQUENCIADO
Os valores foram obtidos pelo alinhamento utilizando a ferramenta Clustal21
Mesmo apresentando pouca identidade e variaccedilatildeo de tamanho alguns
dados do genoma sugerem que esses genes satildeo ortoacutelogos entre si Pode-se
perceber uma sintenia entre seus loci nas vaacuterias espeacutecies de tripanosomatiacutedeos
(Cavalcanti et al 2009) (FIGURA 15)
FIGURA 15- SINTENIA DE TcKAP7 COM OUTROS TRIPANOSOMATIacuteDEOS LEGENDA Os dois contigs de TcKAP7 (TcA e TcB) estatildeo representados nesta figura juntamente com os contigs de outros tripanosomatiacutedeos (Tb= T brucei Lm= L major Li= L infantum e Lb= L brasiliensis) mostrando que KAP7 representado pela cor amarela apresenta uma sintenia entre seus loci em todas as espeacutecies mostradas sendo flanqueado pelo gene KAP4 em T cruzi e T brucei representado em azul Portanto em L majorL infantum eL brasiliensis ao lado direito de KAP7 estaacute o gene de uma proteiacutena hipoteacutetica representado pela cor vermelha e ao lado esquerdo encontra-se o gene da KAP4 representado em azul como mencionado anteriormente FONTE CAVALCANTI et al 2009
68
A expressatildeo de vaacuterios genes mitocondriais de C fasciculata e L major eacute
regulada durante o ciclo celular em parte por uma sequumlecircncia consenso
[(CA)AUAGAA(GA)] presente nas regiotildees 5rsquo e 3rsquo-UTR dos respectivos mRNAs
(BROWN amp RAY 1997 MAHMOOD et al 1999 MAHMOOD amp RAY 1998 PASION
et al 1996 ZICK et al 2005)
Assim resolvemos caracterizar a regiatildeo 5rsquo-UTR do transcrito TcKAP7 na
tentativa de identificar sinais com identidade com aqueles encontrados em C
fasciculata Na figura 16 estaacute representada a regiatildeo 5rsquo-UTR do transcrito TcKAP7
com a sequumlecircncia parcial do mini-exon proveniente do primer usado na teacutecnica de
RT-PCR bem como parte da regiatildeo codificante do gene O mini-exon estaacute situado a
129 bases a jusante do iniacutecio da regiatildeo codificante do transcrito TcKAP7 e define
portanto uma regiatildeo 5rsquo-UTR de 168 bases considerando que o tamanho do mini-
exon eacute de 39 bases A anaacutelise da regiatildeo 5rsquo-UTR mostrou um elemento com
caracteriacutesticas muito semelhantes aquele envolvido na regulaccedilatildeo de genes em C
fasciculata (sequencia (G)ATAGAA(G) mostrada no retacircngulo preto na FIGURA
16B) sugerindo que TcKAP7 seja regulada durante o ciclo celular
69
A
B
FIGURA 16 CARACTERIZACcedilAtildeO DA REGIAtildeO 5rsquo-UTR DO TRANSCRITO TcKAP7 LEGENDA A Esquema geral da localizaccedilatildeo do mini-exon de TcKAP7 e B Localizaccedilatildeo especiacutefica do mini-exon de TcKAP7 O mini-exon de TcKAP7 (sequecircncia parcial em verde) estaacute localizado a 129 pb da regiatildeo codante (representada em parte pela cor azul) A regiatildeo 5rsquoUTR do transcrito Tckap7 estaacute representada na cor rosa A possiacutevel sequencia consenso de regulaccedilatildeo durante o ciclo celular estaacute indicada no retacircngulo preto
42 Expressatildeo da proteiacutena TcKAP7 em T cruzi
Formas epimastigotas foram transfectadas com o plasmiacutedeo pNEO3XFLAG
contendo o gene TcKAP7 (pNEO_KAP7_3xFLAG) A expressatildeo da proteiacutena
TcKAP7-FLAG foi analisada por ensaio de western blot Os resultados mostraram
que a expressatildeo da proteiacutena TcKAP7-FLAG foi satisfatoacuteria correspondendo ao
tamanho esperado (FIGURA 17 ) a qual foi confirmada pela reatividade do anticorpo
monoclonal especiacutefico para as etiquetas FLAG (anti-FLAG)
70
FIGURA 17 ANAacuteLISE DA EXPRESSAtildeO DA PROTEIacuteNA DE FUSAtildeO TCKAP7-FLAG EM FORMAS EPIMASTIGOTAS DE T CRUZI
43 Localizaccedilatildeo celular de TcKAP7 atraveacutes de ensaio de imunofluorescecircncia
Para verificar a localizaccedilatildeo celular de TcKAP7 foi realizado o ensaio de
imunofluorescecircncia Como natildeo foi possiacutevel a obtenccedilatildeo do anticorpo com alto tiacutetulo
contra a proteiacutena recombinante TcKAP7 neste ensaio foi utilizado o anticorpo
monoclonal anti-FLAG que reconhece a etiqueta FLAG a qual estaacute fusionada a
proteiacutena TcKAP7
Nessa figura pode-se observar que a proteiacutena de fusatildeo acumula-se na regiatildeo
dos poacutelos do cinetoplasto das formas epimastigotas do T cruzi (FIGURA 18)
indicando que TcKAP7 uma proteiacutena tipo histona H1 estaacute realmente associada com
o kDNA do parasita
71
FIGURA 18 IMUNOLOCALIZACcedilAtildeO DE TcKAP7 EM EPIMASTIGOTAS DE T CRUZI LEGENDAA contraste interferencial diferencial (DIC) B Hoechst marcando o nuacutecleo e o
cinetoplasto C fluorescecircncia mostrando a localizaccedilatildeo de TcKAP7 mais intensa na regiatildeo dos poacutelos
docinetoplasto dos protozoaacuterios D Aumento de C
44 Deleccedilatildeo do gene TcKAP7 por nocaute gecircnico
As teacutecnicas que permitem a remoccedilatildeo de um gene e sua substituiccedilatildeo por
genes repoacuterteres atraveacutes do processo de recombinaccedilatildeo tecircm sido usadas com
sucesso para verificaccedilatildeo da funccedilatildeo gecircnica em tripanosomatiacutedeos (MACRAE et al
2006) O nocaute gecircnico consiste na inserccedilatildeo de marcadores geneacuteticos de seleccedilatildeo
(gene codificando resistecircncia a neomicina ou higromicina entre outros) flanqueados
por sequumlecircncias pertencentes ao locus cromossocircmico de interesse Atraveacutes do
processo de recombinaccedilatildeo homoacuteloga o marcador pode entatildeo substituir o gene que
se quer estudar Desse modo pode ser possiacutevel analisar a funccedilatildeo de determinado
gene atraveacutes das alteraccedilotildees - decorrentes de sua ausecircncia - na fisiologia do
parasita No presente estudo os genes repoacuterteres que codificam resistecircncia aos
72
antibioacuteticos G418 e higromicina foram flanqueados por sequumlecircncias a montante e a
jusante da regiatildeo codificante do gene TcKAP7 As construccedilotildees foram usadas para
transfectarT cruzi e gerar mutantes para o gene TcKAP7 a fim de se estudar o
efeito que a ausecircncia do gene TcKAP7 causa no metabolismo do parasita
Apoacutes obtenccedilatildeo de uma populaccedilatildeo de T cruzi mutante para o gene TcKAP7
(kap7neokap7higro) resistente a ambos antibioacuteticos G418 e higromicina B o
DNA desta populaccedilatildeo foi extraiacutedo para anaacutelise por PCR e Southern blot a fim de
confirmar a eficiecircncia do nocaute
441 Anaacutelise por PCR do DNA dos parasitas transfectados com os cassetes
UPS-NEO-DOWN e UPS-HIGRO-DOWN
Foram realizadas vaacuterias reaccedilotildees de PCR a fim de confirmar a deleccedilatildeo do
gene TcKAP7 do genoma do T cruzi Dm28c e a substituiccedilatildeo dos seus alelos pelos
genes neo e higro As reaccedilotildees de PCR foram feitas com DNA de T cruzikap7kap7 (tipo
selvagem) e com DNA de T cruzikap7neokap7higro utilizando diversas combinaccedilotildees de
primers (TABELA 5) Na figura 32 observa-se que o gene TcKAP7 (747 pb) foi
amplificado somente na PCR realizada com DNA de T cruzi tipo selvagem (FIGURA
19 A canaleta 1) enquanto que os genes neo (795 pb) e higro (1026 pb) soacute foram
amplificados nas reaccedilotildees que conteacutem DNA da populaccedilatildeo do T cruzi kap7neokap7higro
(FIGURA 19 B canaletas 2 e 3) Os tamanhos esperados para amplificaccedilotildees usando
primers externos agraves construccedilotildees e os primers dos genes de resistecircncia foram
identificados no gel de agarose indicando que os cassetes se integraram
corretamente no locus do gene TcKAP7 (FIGURA 19 B canaletas 4 a 7) Um
esquema da localizaccedilatildeo dos primers utilizados nas reaccedilotildees de PCR pode ser
visualizado na figura 19 C
QUADRO 5 ndash COMBINACcedilOtildeES DE PRIMERS UTILIZADOS NA PCR PARA
CONFIRMAR O NOCAUTE DE TcKAP7
Pares de primers Tamanho esperado
(pb)
1 KAP7F + KAP7R 747
2 NEOF + NEOR 795
73
3 HIGROF + HIGROR 1026
4 EXTF + NEOR 1410
5 EXTF + HIGROR 1634
6 NEOF + EXTR 1358
7 HIGROF + EXTR 1360
74
FIGURA 19 ENSAIOS DE PCR UTILIZANDO DNA DE T cruzi kap7kap7 (WT) E
T cruzi kap7neokap7higro (NO) COM DIFERENTES PRIMERS
LEGENDA 1 KAP7F + KAP7R 2 NEOF + NEOR (795 pb) 3 HIGROF + HIGROR (1026 pb) 4
EXTF + NEOR (1410 pb) 5 EXTF + HIGROR (1634 pb) 6 NEOF + EXTR (1358 pb) e 7
HIGROF + EXTR (1360 pb) No quadro A encontram-se as PCRs realizadas com DNA de T cruzi kap7kap7 (WT) e no quadro B encontram-se as PCRs realizadas com DNA de T cruzi kap7neokap7higro
(NO) No quadro C estaacute um esquema da localizaccedilatildeo dos primers utilizados
442 Anaacutelise da organizaccedilatildeo dos genes TcKAP7 neo e higro por ensaio do
tipo Southern blot
Neste ensaio foi utilizado DNA total extraiacutedo de T cruzikap7kap7 (tipo selvagem)
e T cruzi kap7neokap7higro (duplo nocaute) Foram utilizadas trecircs sondas (1) Um
fragmento do gene TcKAP7 (primeiros 598 pb da CDS) (2) o gene neo e (3) o gene
higro O DNA total das duas amostras foi digerido com a enzima de restriccedilatildeo HindIII
O padratildeo de digestatildeo desta enzima pode ser visualizado na figura 20 De acordo
com o mapa de restriccedilatildeo a inserccedilatildeo do cassete neo no locus KAP7 geraria um
fragmento HindIIIHindIII de 1024 pb enquanto a inserccedilatildeo do cassete higro geraria
um fragmento de 1032 pb cujos tamanhos satildeo diferentes do fragmento
HindIIIHindIII do locus original (1776 pb) As hibridizaccedilotildees mostram bandas
compatiacuteveis com os tamanhos dos fragmentos HindIIIHindIII esperados para cada
situaccedilatildeo acima (FIGURA 21) Podemos observar que a sonda KAP7 somente
reconhece uma banda de tamanho esperado apenas no DNA do parasita selvagem
(canaleta 1 FIGURA 21) enquanto que bandas correspondentes aos genes neo e
higrosomente aparecem no DNA do mutante KAP7 (canaleta 2 FIGURA 21)
75
FIGURA 20 ndash REPRESENTACcedilAtildeO ESQUEMAacuteTICA DOS SIacuteTIOS DA ENZIMA HindIII NO LOCUS DO GENE KAP7 DE T cruzi CL Brener LEGENDA Este esquema representa esquematicamente em escala os genes kap3 neo e higro as regiotildees upstream e downstream e os siacutetios de clivagem da enzima KpnI
FIGURA 21 ANAacuteLISE DA ORGANIZACcedilAtildeO DOS GENES TCKAP7 NEO E HIGRO POR ENSAIO DO TIPO SOUTHERN BLOT LEGENDA A Autoradiograma e B Padrotildees dos fragmentos obtidos da digestatildeo do DNA com a enzima de restriccedilatildeo HindIII Foram utilizadas trecircs sondas TcKAP7 neomicina e higromicina 1) DNA de T cruzikap7kap7 (tipo selvagem) e 2) T cruzi kap7neokap7higro (duplo nocaute)
76
45 Comparaccedilatildeo da expressatildeo do gene TcKAP7 por western blot
O antisoro contra a proteiacutena TcKAP7 obtido apoacutes imunizaccedilatildeo dos
camundongos foi utilizado em ensaio do tipo western blot para avaliar se TcKAP7
ainda estava sendo expresso no T cruzi apoacutes o nocaute gecircnico
O que se observou foi novamente como esperado que a proteiacutena TcKAP7 natildeo eacute
mais expressa no T cruzi kap7neokap7higro (figura 22) Pode-se observar a presenccedila
de TcKAP7 ( aprox 28 kDa) no extrato das formas epimastigotas de T cruzi kap7kap7
(figura 22A) mas natildeo no extrato de epimastigotas de T cruzi
kap7neokap7higro (figura 22B)
FIGURA 22 COMPARACcedilAtildeO DA EXPRESSAtildeO DO GENE TcKAP7 POR WESTERN BLOT LEGENDA Imunoblot de extratos de epimastigotas de T cruzi kap7kap7 (A) e de T cruzi kap7neokap7higro (B) reagidos com anti-TcKAP7
46 Anaacutelise da morfologia e da ultraestrutura do cinetoplasto do mutante de T
cruzi para TcKAP7
Sabendo-se que TcKAP7 estaacute associada ao cinetoplasto e pode estar
envolvida na compactaccedilatildeo do kDNA do T cruzi como foi mostrado para as KAPs de
Crithidia fasciculata (XU amp RAY 1993 XU et al 1996 HINES amp RAY 1998) sua
ausecircncia poderia levar a alteraccedilatildeo na estrutura do DNA mitocondrial dos parasitas
nocauteados Portanto o primeiro passo foi verificar se havia alteraccedilotildees na
77
morforlogia do parasita Formas epimastigotas do mutante de T cruzi foram
analisadas ao microscoacutepio oacuteptico apoacutes coloraccedilatildeo Como pode ser observado na
figura 23 epimastigotas do mutante de T cruzi para TcKAP7 apresentam uma
morfologia fusiforme com o cinetoplasto caracteriacutestico em forma de barra localizado
anteriormente ao nuacutecleo natildeo se evidenciando portanto nenhuma alteraccedilatildeo em
relaccedilatildeo agrave morfologia dos parasitas do tipo selvagem
FIGURA 23 - COLORACcedilAtildeO PELO MEacuteTODO PANOacuteTICO RAacutePIDO DOS PARASITAS EPIMASTIGOTAS NOCAUTEADOS LEGENDA A) Formas epimastigotas B) Forma epimastigota em maior aumento
Formas epimastigotas de parasitas do tipo selvagem e nocauteados foram
entatildeo analisados pela teacutecnica de microscopia eletrocircnica de transmissatildeo para
visualizar com mais detalhe o cinetoplasto e verificar se sua estrutura estava
alterada pela ausecircncia da TcKAP7 (FIGURA 24) A figura 24A mostra um corte
ultrafino de um epimastigota de T cruzi do tipo selvagem que apresenta o
cinetoplasto compacto e em forma de bastatildeo caracteriacutestico de formas
epimastigotas sem nenhuma alteraccedilatildeo aparente O mesmo pode ser visto na figura
24B para o epimastigota de T cruzi nocauteado A disposiccedilatildeo estrutura e aspecto
do cinetoplasto de ambos os parasitas selvagem e nocauteado natildeo apresentaram
nenhuma diferenccedila entre si mostrando que mesmo apoacutes o nocaute da KAP7 a
estrutura do cinetoplasto permanece aparentemente inalterada
78
FIGURA 24 COMPARACcedilAtildeO ENTRE A ULTRAESTRUTURA DO CINETOPLASTO DO T cruzi DM28C TIPO SELVAGEM (A) E DO MUTANTE DE T cruzi PARA TcKAP7 (B) POR MICROSCOPIA ELETROcircNICA DE TRANSMISSAtildeO
79
47 Multiplicaccedilatildeo diferenciaccedilatildeo e infectividade do mutante de T cruzi para
TcKAP7
Os parasitas mutantes foram analisados a fim de verificar se alteraccedilotildees na
estrutura do kDNA pela ausecircncia de KAP7 natildeo estavam levando a alteraccedilotildees na
fisiologia do parasita alterando sua multiplicaccedilatildeo diferenciaccedilatildeo e infectividade
Inicialmente foi analisado o perfil da curva de crescimento das formas
epimastigotas Observou-se que natildeo havia diferenccedila na curva de crescimento dos
parasitas nocauteados em relaccedilatildeo ao parasita selvagem (FIGURA 25)
FIGURA 25 CURVA DE CRESCIMENTO DO MUTANTE DE T cruzi PARA TcKAP7 (KO) E DO T cruzi Dm28c SELVAGEM (WT)
LEGENDA Curva de crescimento do mutante de T cruzi para TcKAP7 () e do T cruzi Dm28c ()
Em seguida os parasitas nocauteados foram analisados quanto a sua capacidade
de diferenciaccedilatildeo em tripomastigotas metaciacuteclicos Foram realizadas contagens
diferenciais em cacircmara de Neubauer a partir do sobrenadante da metaciclogecircnese
a cada 24 h apoacutes a incubaccedilatildeo das ceacutelulas em meio TAU3AAG durante um periacuteodo
de 3 dias (72 h) A partir dessas contagens foram construiacutedos curva com a contagem
do nuacutemero de metaciacuteclicos ao longo dos trecircs dias (FIGURA 26)
Nenhuma alteraccedilatildeo foi observada quando os parasitas nocauteados foram
submetidos ao processo de metaciclogecircnese in vitro Ou seja pode-se afirmar que
80
mesmo apoacutes o nocaute do gene TcKAP7 as formas epimastigotas do parasita
conseguem se diferenciar em formas metaciacuteclicas
FIGURA 26 METACICLOGEcircNESE IN VITRO DE T cruzi Dm28c TIPO SELVAGEM E T cruzi NOCAUTEADO LEGENDA Metaciclogecircnese in vitro de T cruzi Dm28c tipo selvagem () e T cruzi nocauteado ()
Uma vez que os parasitas nocauteados foram capazes de se diferenciar de
epimastigota a tripomastigota metaciacuteclico resolveu-se investigar se estes eram
capazes de infectar ceacutelulas in vitro Foi possiacutevel perceber as formas amastigotas
dentro de ceacutelulas VERO em cultura mostrando que o parasita natildeo perdeu sua
capacidade de infecccedilatildeo (dados natildeo mostrados) Assim pode-se concluir que aleacutem
de sofrer diferenciaccedilatildeo os mutantes de T cruzi para KAP7 tambeacutem mantiveram sua
capacidade de infecccedilatildeo
48 Anaacutelise da funccedilatildeo do gene KAP7 de Trypanosoma brucei atraveacutes de
ensaios de RNA de interferecircncia
Para averiguar a importacircncia da proteiacutena TcKAP7 na biologia do parasita
recorremos a ensaios de RNA de interferecircncia (RNAi) jaacute que existe uma alta
similaridade entre TcKAP7 e seu ortoacutelogo em Trypanosoma brucei
81
A via de RNA de interferecircncia consiste em um mecanismo de silenciamento
gecircnico que para a ceacutelula funciona como sistema de defesa O mecanismo inicia-se
atraveacutes da expressatildeo de um RNA dupla fita (dsRNA) contendo uma sequecircncia
complementar ao gene de interesse Este dsRNA seraacute entatildeo clivado em pequenos
fragmentos de cerca de 22 a 25 nucleotiacutedeos atraveacutes da atividade de uma
ribonuclease do tipo III denominada Dicer Estes pequenos RNAs seratildeo
direcionados e permaneceratildeo unidos a um complexo proteico denominado RISC
(ldquoRNA-InducedSilencingComplexrdquo) Nesse complexo os pequenos RNAs de
interferecircncia (siRNA) ligam-se por complementaridade ao RNA mensageiro do gene
a ser inativado guiando-os para degradaccedilatildeo pelas nucleases presentes no
complexo impedindo a siacutentese da respectiva proteiacutena (ULLU et al 2002) O vetor
utilizado para promover o silenciamento do gene TbKAP7 foi o p2T7-177 Este
plasmiacutedeo integra-se aos minicromossomos do T brucei regiatildeo de repeticcedilotildees 177
(FOLDYNOVA-TRANTIRKOVA et al 2005) Este vetor apresenta dois promotores
de polimerase em oposiccedilatildeo induziacuteveis por tetraciclina flanqueando a sequumlecircncia de
interesse Desta forma satildeo geradas duas moleacuteculas de mRNA que pareadas
formam a moleacutecula de RNA fita dupla capaz de induzir a maquinaria de degradaccedilatildeo
A induccedilatildeo da inibiccedilatildeo de TbKAP7 atraveacutes de RNAi levou a uma diminuiccedilatildeo da
multiplicaccedilatildeo celular do parasita a partir do quarto dia do experimento (FIGURA 27)
Os resultados obtidos neste ensaio mostraram que a participaccedilatildeo da TbKAP7
no metabolismo do T brucei eacute essencial jaacute que o silenciamento do gene TbKAP7
levou agrave reduccedilatildeo da proliferaccedilatildeo celular do parasita
82
FIGURA 27 RNAi DE TbKAP7 INIBE O CRESCIMENTO DAS FORMAS PROCIacuteCLICAS DE T
brucei
LEGENDA Curva de crescimento de linhagem celular de RNAi de TbKAP7 em T brucei induzido por
tetraciclina As ceacutelulas foram diluiacutedas a uma densidade celular inicial de 1 X 106 ml na presenccedila e
ausecircncia de tetraciclina As densidades celulares foram determinadas pela contagem de ceacutelulas a
intervalos de 24 horas durante oito dias apoacutes iniacutecio de adiccedilatildeo de tetraciclina A linha com quadrados
mostra a curva de crescimento celular na presenccedila de tetraciclina (+TET) A linha com losangos
mostra a curva de crescimento celular na ausecircncia de tetraciclina (- TET)
49 Caracterizaccedilatildeo estrutural de TcKAP7
491 Produccedilatildeo recombinante de TcKAP7
O cultivo de E coli BL-21(DE3) STAR contendo o plasmiacutedeo pET28a-
TcKAP7 foi feito em meio LB a 37 oC com a induccedilatildeo da expressatildeo realizada a uma
densidade oacutetica de DO600 de 08 com a adiccedilatildeo de 05 mM de ITPG durante a noite a
37 oC
As ceacutelulas foram recuperadas por centrifugaccedilatildeo ressuspensas sonicadas e
centrifugadas para a purificaccedilatildeo de TcKAP7 atraveacutes da cromatografia de afinidade
em resina de Ni-NTA (Figura 28A) Foi possiacutevel obter grande quantidade de
83
amostra com grau de pureza alto como visualizado atraveacutes de anaacutelise por SDS-
PAGE (Figura 28B)
FIGURA28 PURIFICACcedilAtildeO DE TCKAP7 ATRAVEacuteS DE CROMATOGRAFIA DE AFINIDADE LEGENDA A) Cromatograma de afinidade B) SDS-PAGE da cromatografia de afinidade Os nuacutemeros agrave esquerda da figura representam os tamanhos das bandas do marcador de massa molecular (Benchmark) (Invitrogen) e P banda correspondente agrave TcKAP7 purificada Caixa em vermelho indica o pico que corresponde agrave fraccedilatildeo no SDS-PAGE
Devido agrave presenccedila de bandas com possiacuteveis contaminantes as fraccedilotildees que
continham a proteiacutena de interesse foram submetidas agrave purificaccedilatildeo por cromatografia
de troca iocircnica onde a purificaccedilatildeo eacute realizada baseada na afinidade por cargas
entre as proteiacutenas e a resina
Para esta purificaccedilatildeo utilizou-se a coluna SP Hitrap (GE Healthcare Life
Sciences) que eacute uma coluna de carga negativa Essa resina foi escolhida pois o pH
do tampatildeo em que se encontrava TcKAP7 era menor que o pI da proteiacutena Nessas
condiccedilotildees a carga superficial de TcKAP7 eacute positiva Para favorecer a interaccedilatildeo
TcKAP7 e resina foi feita uma diluiccedilatildeo de TcKAP7 para retirada de NaCl A eluiccedilatildeo
da proteiacutena foi realizada com um gradiente segmentado de tampatildeo B para
84
cromatografia de troca iocircnica TcKAP7 foi eluiacuteda com 68 do tampatildeo B (FIGURA
29)
FIGURA 29 PURIFICACcedilAtildeO DE TCKAP7 ATRAVEacuteS DE CROMATOGRAFIA DE TROCA IOcircNICA
LEGENDA A) Cromatografia de troca iocircnica B) SDS-PAGE da cromatografia de troca iocircnica Os nuacutemeros agrave esquerda da figura representam os tamanhos das bandas do marcador de massa molecular (Benchmark) (Invitrogen) e P banda correspondente agrave TcKAP7 purificada Caixa em vermelho indica o pico que corresponde agrave fraccedilatildeo no SDS-PAGE Curva em azul representa absorbacircncia em 280 nm Linha em verde indica concentraccedilatildeo de tampatildeo B para eluiccedilatildeo da amostra
410 Anaacutelise do estado oligomeacuterico de TcKAP7
A amostra purificada por troca iocircnica foi submetida agrave cromatografia de
exclusatildeo molecular tambeacutem chamada de gel filtraccedilatildeo que consiste na separaccedilatildeo
de biomoleacuteculas de acordo com seu tamanho e forma A coluna neste processo
conteacutem um poliacutemero com ligaccedilotildees cruzadas com poros de tamanho definido As
moleacuteculas maiores iratildeo migrar mais rapidamente que as menores pois natildeo satildeo
85
capazes de penetrar no interior dos poros da resina eluindo diretamente da coluna
As moleacuteculas menores por entrarem pelos poros da resina e levarem mais tempo
percorrendo os poros satildeo eluiacutedas mais tarde em relaccedilatildeo as que satildeo maiores
Ao comparar o volume de eluiccedilatildeo de TcKAP7 com o volume de eluiccedilatildeo de
proteiacutenas com massa molecular conhecidos (dados natildeo mostrados) foi possiacutevel
verificar que TcKAP7 parece ser um monocircmero em soluccedilatildeo Para confirmar esses
dados a mesma amostra foi submetida ao experimento de espalhamento dinacircmico
de luz (DLS)
O DLS eacute uma teacutecnica que se estima a distribuiccedilatildeo de tamanho das
populaccedilotildees de partiacuteculas que estatildeo presentes na amostra permitindo a detecccedilatildeo de
agregados proteicos ou de diferentes estados de oligomerizaccedilatildeo na amostra
indicando heterogeneidade Eacute importante ressaltar que para maiores chances de
sucesso em ensaios de cristalizaccedilatildeo a amostra deve encontrar-se monodispersa
Os dados de DLS mostram que 911 da massa de TcKAP7 analisada
apresenta um raio hidrodinacircmico (Rh) de 39 nm que representa uma massa
aparente de 29 kDa (FIGURA 30) Isto eacute condizente com um monocircmero cuja massa
teoacuterica seria de aproximadamente 28 kDa (incluindo a cauda de 6 histidinas) de
acordo com a prediccedilatildeo feita pelo servidor Expasy Protparam
(httpwebexpasyorgprotparam)A polidispersividade da amostra foi baixa
indicando que a mesma estava homogecircnea
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0 1 2 3 4 5 6 7
M
assa
Rh (nm)
fr80
fr82
fr84
fr85
86
FIGURA 30 ANAacuteLISE POR DLS DE TCKAP7 LEGENDA Anaacutelise por DLS de TcKAP7 contendo as fraccedilotildees obtidas na cromatografia de afinidade As fraccedilotildees 80 84 e 85 apresentam um raio hidrodinacircmico (Rh) de 39 nm
Aleacutem disso tambeacutem foram obtidas informaccedilotildees sobre o envelope de TcKAP7
a partir dos dados coletados atraveacutes da teacutecnica de SAXS mostrando que o raio de
giro (Rg) do envelope de TcKAP7 estaacute de acordo com o estimado por DLS (FIGURA
31)
FIGURA 31 ENVELOPE MOLECULAR DE SAXS
411 Anaacutelise do conteuacutedo de estrutura secundaacuteria de TcKAP7 recombinante
Atraveacutes da anaacutelise do espectro de dicroiacutesmo circular pode-se verificar o
conteuacutedo de estrutura secundaacuteria da proteiacutena e inferir enovelamento da proteiacutena
recombinante Os dados obtidos para a TcKAP7 revelaram a presenccedila de estruturas
α caracterizadas pelos miacutenimos pronunciados em 208 nm e 222 nm e de estruturas
coiled na amostra de TcKAP7 caracterizada pelos miacutenimos pronunciados em 205
nm (FIGURA 32) Este resultado estaacute de acordo a prediccedilatildeo de estrutura secundaacuteria
87
realizada pelo servidor PSIPRED (httpbioinfcsuclacukpsipred (FIGURA 33)
Esses resultados sugerem que a proteiacutena recombinante possui correto
enovelamento
FIGURA 32 ESPECTRO DE DICROIacuteSMO CIRCULAR DE TcKAP7
FIGURA 33 PREDICcedilAtildeO DE ESTRUTURA SECUNDAacuteRIA DE TcKAP7
412 Anaacutelise estrutural de TcKAP7
A fim de obter-se a estrutura tridimensional de TcKAP7 por cristalografia de
raios-X foram realizados ensaios de cristalizaccedilatildeoFoi possiacutevel observar a formaccedilatildeo
de um cristal em apenas uma condiccedilatildeo Imidazol 01 M Polietilenoglicol (PEG) 8000
10 wv e Acetato de caacutelcio 02 M
A visualizaccedilatildeo atraveacutes de luz ultra-violeta atraveacutes do equipamento Rock
Imager Fomulatrix permitiu identificaacute-lo como cristal de proteiacutena jaacute que este
diferencia-se de cristal de sal pela fluorescecircncia quando excitado em comprimento
de onda de 280 nm
-20
-18
-16
-14
-12
-10
-8
-6
-4
-2
0
2
200 210 220 230 240 250 260
Ɵ M
RV
x 1
03
(de
g cm
2d
mo
l-1)
Comprimento de onda (nm)
88
O perfil do cristal pode ser visualizado na figura 34 Esse cristal encontra-se
pequeno e mal-formado Aleacutem disso os meacutetodos para a determinaccedilatildeo estrutural de
uma estrutura ineacutedita (sem homologia com estruturas conhecidas) necessitam de
mais de um cristal Dessa forma foram realizados refinamentos dessas condiccedilotildees
iniciais visando aumentar q quantidade de cristais aumentar seu tamanho e
melhorar sua organizaccedilatildeo A concentraccedilatildeo de PEG (5 A 10) e do pH (6 a 9) com
intervalos de 1 unidade foram alterada Entretanto mesmo assim natildeo foi possiacutevel a
obtenccedilatildeo de cristais adequados para a difraccedilatildeo de raios X e novos refinamentos
seratildeo necessaacuterios
FIGURA 34 CRISTAL DE TcKAP7 DE T CRUZI LEGENDA AObtenccedilatildeo do cristal de TcKAP7 na condiccedilatildeo de Imidazol 01 M Polietilenoglicol (PEG) 8000 10 wv e Acetato de caacutelcio 02 M e B Cristal de TcKAP7 visto sob luz ultravioleta
Uma vez que natildeo foi possiacutevel durante o desenvolvimento desse projeto a
obtenccedilatildeo da estrutura cristalograacutefica de TcKAP7 procedeu-se com a construccedilatildeo de
seu modelo molecular
A modelagem molecular eacute uma ferramenta que permite a obtenccedilatildeo de
modelos da estrutura tridimensional de uma determinada proteiacutena com base em
homologia sequencial ou estrutural com proteiacutenas cujas estruturas tridimensional
foram experimentalmente resolvidas
Para a construccedilatildeo do modelo foi utilizado o programa MODELLER (SALI amp
BLUNDELL 1993) este programa eacute utilizado para a modelagem por homologia a
estruturas tridimensionais de proteiacutenas O programa automaticamente constroacutei um
modelo baseado na anaacutelise de um alinhamento de sequecircncias entre a proteiacutena para
a qual se deseja construir o modelo e uma proteiacutena relacionada cuja estrutura
tridimensional jaacute foi resolvida Nesse caso foram utilizadas estruturas de duas
A B
89
proteiacutenas como molde para a construccedilatildeo da estrutura de TcKAP7 A estrutura da
proteiacutena HMGB1(coacutedigo de acesso no banco de dados de proteiacutenas 2GZK)
(wwwpdborg) para a porccedilatildeo amino-terminal e a estrutura do fator A de transcriccedilatildeo
mitocondrial (coacutedigo de acesso 3TQ6) para a porccedilatildeo carboxi-terminal da proteiacutena
(FIGURA 35A) Duas proteiacutenas foram selecionadas para a construccedilatildeo do modelo de
TcKAP7 visto que a similaridade de sequencia entre TcKAP7 e proteiacutenas com
estruturas resolvidas eacute bastante baixo A similaridade sequencial de TcKAP7 e
proteiacutena HMGB1 eacute de 224 e entre TcKAP7 e o fator A de transcriccedilatildeo mitocondrial
eacute de 264 No entanto ambas proteiacutenas possuem alta similaridade em relaccedilatildeo agrave
estrutura secundaacuteria (mais de 90) Para aumentar a confiabilidade do modelo
utilizamos uma proteiacutena para construir a sequencia N-terminal de TcKAP7
(aminoaacutecidos 1-184) e outra para o C-terminal (aminoaacutecidos 185-248)
A qualidade do modelo pode ser avaliada por exemplo atraveacutes de graacuteficos e
tabelas que analisam restriccedilotildees quiacutemicas e fiacutesicas de cada aacutetomo constituinte do
modelo Neste trabalho foi utilizado o graacutefico de Ramachandran (FIGURA 35B) nele
pode-se visualizar todas as combinaccedilotildees possiacuteveis de acircngulos dieacutedricos Ψ (psi)
versus os Φ (phi) nos aminoaacutecidos de um polipeptiacutedeo e que contribuem para a
conformaccedilatildeo das estruturas das proteiacutenas (RAMACHANDRAN et al 1963) Dos 230
resiacuteduos apenas 5 estatildeo em regiotildees natildeo permitidas do graacutefico Esse eacute um
excelente valor pois eacute similar ao valor meacutedio encontrado para estruturas
experimentalmente determinadas com resoluccedilatildeo de no miacutenimo 20 Aring
(httpwwwebiacukthornton-srvdatabasesprofunc)
Tambeacutem eacute possiacutevel visualizar a topologia de TcKAP7 (FIGURA 35 C) que
mostra as regiotildees de α-heacutelices e regiotildees de coiled presentes na proteiacutena
corroborando com os dados obtidos na espectroscopia de dicroiacutesmo circular
90
FIGURA 35 ESTRUTURA DE TcKAP7 LEGENDA AModelo tridimensional de KAP7 B Graacutefico de Ramachandran e C Topologia de TcKAP7
A anaacutelise da superfiacutecie eletrostaacutetica de TcKAP7 mostra que existem regiotildees
ricas em aminoaacutecidos com cargas positivas que podem conferir afinidades agrave outras
proteiacutenas com carga carga superficial negativa ou mesmo aacutecidos nucleicos (FIGURA
36)
91
FIGURA 36 SUPERFIacuteCIE ELETROSTAacuteTICA DE TcKAP7 LEGENDA Visualizaccedilatildeo de diferentes regiotildees de TcKAP7 Vermelho potencial negativo Azul potencial positiva Branco Neutro
413 Investigaccedilatildeo de possiacuteveis funcionalidades baseadas na estrutura de
TcKAP7
4131 Prediccedilatildeo de funccedilatildeo paraTcKAP7
92
A prediccedilatildeo de funccedilatildeo para TcKAP7 foi realizada a partir do enovelamento de
proteiacutenas utilizando o servidor Profunc (httpwwwebiacukthornton-
srvdatabasesprofunc) O objetivo do servidor ProFunc eacute ajudar na identificaccedilatildeo de
uma possiacutevel funccedilatildeo bioquiacutemica de uma proteiacutena a partir da sua estrutura
tridimensional Ele utiliza uma seacuterie de meacutetodos incluindo comparaccedilatildeo de
enovelamento conservaccedilatildeo dos resiacuteduos e modelos 3D funcionais tanto para
identificar provaacuteveis siacutetios ativos da proteiacutena quanto possiacuteveis homoacutelogos no Protein
Data Bank (PDB) Neste procedimento tenta-se ajustar a estrutura da proteiacutena de
interesse aos tipos de enovelamentos de proteiacutenas conhecidas Atualmente mais de
1000 tipos jaacute foram registrados e depositados em bibliotecas de enovelamentos
Sabe-se que o alinhamento estrutural entre proteiacutenas consideradas de uma
mesma famiacutelia mesmo que seja apenas na regiatildeo do siacutetio ativo pode ser um
importante meacutetodo para se inferir a funccedilatildeo da sequecircncia em estudo (LASKOWSKI et
al 2003) A evoluccedilatildeo tende a conservar funccedilotildees que dependem mais diretamente
das estruturas 3D que das similaridades entre as sequecircncias de aminoaacutecidos das
proteiacutenas (SANCHEZ et al 2000)
Neste trabalho as quatro estruturas que possuem maior similaridade
estrutural com TcKAP7 estatildeo depositadas no Protein Data Bank (PDB) com os
coacutedigos 3TQ6 4NOD 3TMM 4NNU Todas as estruturas satildeo referentes agrave proteiacutena
TFAM (fator transcricional A mitocondrial)
As estruturas proteicas foram obtidas no banco de dados puacuteblicos de
proteiacutenas PDB (Protein Data Bank) e submetidas a um alinhamento estrutural com o
modelo de TcKAP7 (FIGURA 35A) no programa WinCoot Esse alinhamento pode
ser visualizado na figura 37 As regiotildees em vermelho representam as regiotildees de
TcKAP7 que apresentam interaccedilatildeo com DNA pois se alinham com as regiotildees de
ligaccedilatildeo agrave DNA das outras proteiacutenas e as regiotildees em azul representam regiotildees sem
homologia com as demais
Esse resultado sugere que TcKAP7 pode interagir com DNA com isso estes
dados podem ser utilizados para nortear mais estudos sobre a interaccedilatildeo das
proteiacutenas KAPrsquos com o DNA do cinetoplasto de T cruzi
93
FIGURA 37 ALINHAMENTO ESTRUTURAL DE 3TQ6 4NOD 3TTM 4NNU E TCKAP7 LEGENDA Em vermelho encontram-se as regiotildees de TcKAP7 que podem interagir com DNA (Resiacuteduos 1-67 e 140-166) e em azul regiotildees sem homologia com as demais
4132 Anaacutelises preliminares da possiacutevel interaccedilatildeo entre TcKAP7 e kDNA
As prediccedilotildees estruturais sugeriram que a proteiacutena TcKAP7 possui motivos
similares agrave proteiacutenas que interagem com DNA No entanto a sequecircncia de
aminoaacutecidos entre as proteiacutenas eacute bastante baixa Como a funccedilatildeo de TcKAP7
permanece obscura foram realizados alguns ensaios para tentar verificar a
possibilidade desta proteiacutena interagir com kDNA Para isto utilizou-se a teacutecnica de
dicroiacutesmo circular para avaliar se a presenccedila de kDNA poderia resultar em
alteraccedilotildees estruturais em TcKAP7 o que seria uma evidecircncia da possiacutevel interaccedilatildeo
entre esta proteiacutena e o aacutecido nucleico
Foram realizadas medidas de dicroiacutesmo circular com amostras de TcKAP7
kDNA e TcKAP7 na presenccedila de kDNA Para a anaacutelise de dados foi realizado o
somatoacuterio das curvas obtidas com as amostras de TcKAP7 e kDNA separadamente
Este somatoacuterio resultou em uma curva teoacuterica que indica o perfil teoacuterico de uma
amostra contendo TcKAP7 e kDNA sem interaccedilotildees presentes Aacute essa curva foi
sobreposta a curva experimental da medida de dicroiacutesmo circular de TcKAP7 na
94
presenccedila de kDNA A figura 38 ilustra essa sobreposiccedilatildeo onde pode-se verificar que
as curvas natildeo se sobrepotildeem portanto alteraccedilotildees estruturais ocorrem em TcKAP7
na presenccedila de kDNA
FIGURA 38 ESPECTRO DE DICROIacuteSMO CIRCULAR DE TcKAP7 LEGENDA Em azul encontra-se o espectro experimental de TcKap7 na presenccedila de DNA em vermelho o espectro teoacuterico de TcKAP7 e DNA
Para investigar mudanccedilas estruturais associadas a interaccedilatildeo com kDNA foi
realizada uma coleta de dados de SAXS na presenccedila de 1ug de kDNA
A comparaccedilatildeo dos modelos de baixa resoluccedilatildeo por SAXS indica uma
diferenccedila conformacional pontual da proteiacutena na presenccedila de kDNA As figuras 28 e
29 mostram os envelopes da proteiacutena TcKAP7na ausecircncia (FIGURAS 39A e 40A) e
presenccedila de kDNA de T cruzi (FIGURA 39B e FIGURA 40B) Percebe-se uma
diferenccedila de densidade eletrocircnica na regiatildeo da heacutelice (Residuos 140 - 166
evidenciados em vermelho) No envelope de TcKAP7 ela eacute bastante flexiacutevel e natildeo eacute
observada densidade eletrocircnica nessa regiatildeo no entanto na presenccedila de kDNA
essa mesma regiatildeo mostra-se mais riacutegida e eacute possiacutevel estimar seu posicionamento
baseado na densidade eletrocircnica Aleacutem disso essa heacutelice eacute predita como interatora
de DNA com base nas anaacutelises estruturais previamente realizadas nesse trabalho
Esses dados sugerem uma mudanccedila conformacional da proteiacutena na presenccedila
do kDNA fazendo com que esta mude seu arranjo estrutural para permanecer ligada
agrave moleacutecula de DNA sugerindo uma interaccedilatildeo entre TcKAP7 e DNA do cinetoplasto
-22
-17
-12
-7
-2
3
200 210 220 230 240 250 260
ϴM
RW
x 1
03
(de
g cm
-2 d
mo
l-1)
Comprimento de onda (nm)
Kap7+DNA
95
de T cruzi Esses dados corroboram com o que foi visto na superfiacutecie eletrostaacutetica
(FIGURA 36) e no alinhamento estrutural (FIGURA 37)
FIGURA 39 ENVELOPE MOLECULAR DETcKAP7 LEGENDA A Monocircmero de TcKAP7 ajustado ao envelope de SAXS B Monocircmero de TcKAP7 + kDNA ajustado ao envelope de SAXSResiduos 140- 166 evidenciados em vermelho
96
FIGURA 40 ENVELOPE MOLECULAR DE TcKAP7 VISTO EM DIFERENTES AcircNGULOS LEGENDA A Monocircmero de TcKAP7 ajustado ao envelope de SAXS B Monocircmero de TcKAP7 + kDNA ajustado ao envelope de SAXS Residuos 140- 166 evidenciados em vermelho
97
5 DISCUSSAtildeO
O Trypanosoma cruzi pertence a um grupo que divergiu muito cedo na
linhagem eucarioacutetica apresentando diversas caracteriacutesticas uacutenicas em relaccedilatildeo a
outros eucariotos Uma dessas caracteriacutesticas eacute a presenccedila de uma mitococircndria
uacutenica ramificada pelo corpo do protozoaacuterio contendo uma regiatildeo especializada o
cinetoplasto onde reside o DNA mitocondrial tambeacutem conhecido como kDNA O
kDNA eacute composto por uma rede de moleacuteculas interligadas entre si os maxiciacuterculos e
os miniciacuterculos (SHAPIRO amp ENGLUND 1995) Mais de 30 proteiacutenas envolvidas na
replicaccedilatildeo e na manutenccedilatildeo do kDNA jaacute foram identificadas e acredita-se que um
nuacutemero aproximado de 100 proteiacutenas muitas delas presentes apenas em
cinetoplastiacutedeos possam estar envolvidas nesses processos (LIU et al 2005) A
maioria dessas proteiacutenas foi identificada em T brucei e C fasciculata e
possivelmente vaacuterias delas principalmente aquelas envolvidas em replicaccedilatildeo
devem estar codificadas no genoma do T cruzi
Apesar de serem conhecidos muitos dos componentes da maquinaria de
replicaccedilatildeo dos miniciacuterculos e maxiciacuterculos natildeo se pode dizer o mesmo para as
proteiacutenas envolvidas na manutenccedilatildeo da estrutura do kDNA Com exceccedilatildeo de 4
proteiacutenas com caracteriacutesticas de histonas H1 (KAP1 a 4) encontradas associadas ao
cinetoplasto de C fasciculata pouco ainda eacute conhecido sobre as proteiacutenas que
participam da organizaccedilatildeo do kDNA em outros tripanosomatiacutedeos
Zavala-Castro e colaboradores (2002) identificaram sete proteiacutenas variando
de 19 a 31 kDa associadas ao kDNA de formas epimastigotas de T cruzi a partir
de kDNA extraiacutedo de ceacutelulas fixadas com formaldeiacutedo Os tamanhos observados satildeo
compatiacuteveis com aqueles das KAPs encontradas por Xu e Ray (1993) usando
experimento similar em C fasciculata entretanto nenhuma das possiacuteveis KAPs
descritas por Zavala-Castro e colaboradores foi caracterizada
Noacutes iniciamos estudos objetivando identificar proteiacutenas envolvidas na
organizaccedilatildeo e segregaccedilatildeo do kDNA de T cruzi a partir dos dados fornecidos pelo
sequenciamento do genoma desse parasita fazendo uma comparaccedilatildeo com as
KAPs de C fasciculata Estudos realizados por Cavalcanti e colaboradores (2009)
usando como modelo as sequecircncias de KAPs de C fasciculata identificaram 35
proteiacutenas relacionadas em diferentes tripanosomatiacutedeos cujos genomas estatildeo
sequenciados (11 em T cruzi 7 em L braziliensis 6 em L major e L infantum e 5
98
em T brucei) Essas sequecircncias puderam ser agrupadas em 7 tipos diferentes de
KAPs (KAP1 a 7) Das 7 KAPs T cruzi possui 5 (TcKAP3 a 7) cuja a sintenia
gecircnica eacute uma das caracteriacutesticas marcantes jaacute que alguns genes divergem em
relaccedilatildeo ao tamanho e portanto no tamanho da proteiacutena codificada As KAPs de T
cruzi e T brucei satildeo maiores do que as de C fasciculata e Leishmania spp Isso
pode sugerir que KAPs possam ter evoluiacutedo para um tamanho que comporte
basicamente suas funccedilotildees de associaccedilatildeo com o kDNA de maneira mais eficiente
Os resultados obtidos por Cavalcanti et al (2009) para TcKAP4 e TcKAP6
mostraram que em epimastigotas e amastigotas estas duas proteiacutenas estatildeo
distribuiacutedas ao longo de toda a rede de kDNA consistente com o que foi observado
em C fasciculata (XU et al 1996 HINES amp RAY 1998) poreacutem CfKAP4 tambeacutem
apresentou um padratildeo de marcaccedilatildeo nos poacutelos opostos do kDNA sugerindo que
essa KAP em particular se associe aos miniciacuterculos receacutem-replicados antes de sua
reintegraccedilatildeo agrave rede de kDNA (XU et al 1996) Contudo em tripomastigotas de T
cruzi estas duas proteiacutenas estatildeo distribuiacutedas na periferia da rede de kDNA
(CAVALCANTI et al 2009) indicando que diferente de C fasciculata elas
apresentam uma dinacircmica de associaccedilatildeo que depende da forma evolutiva do
parasita possivelmente refletindo distintas interaccedilotildees com proteiacutenas da rede de
kDNA em epimastigotas e tripomastigotas No presente trabalho ampliamos o
conhecimento sobre as KAPs de T cruzi estudando o papel da KAP7 na fisiologia
desse parasita
Em C fasciculata a regulaccedilatildeo da expressatildeo de vaacuterios genes que codificam
proteiacutenas mitocondriais ocorre durante o ciclo celular em parte por uma sequumlecircncia
consenso [(CA)AUAGAA(GA)] presente nas regiotildees 5rsquo e 3rsquo-UTR dos respectivos
mRNAs (BROWN amp RAY 1997 MAHMOOD et al 1999 MAHMOOD amp RAY 1998
PASION et al 1996) O mesmo foi observado para L major onde uma sequecircncia
parecida com aquela encontrada em C fasciculata (CATAGA) foi identificada nas
regiotildees 5rsquo e 3rsquo de vaacuterios genes cuja a expressatildeo era maior na fase S do ciclo celular
(ZICK et al 2005) Analisando as regiotildees 5rsquo e 3rsquo do transcrito do gene TOP2 de T
cruzi que codifica a topo II mitocondrial descrito por Fragoso e Goldenberg (1992)
tambeacutem podemos observar a sequecircncia CATAGA repetida duas vezes na regiatildeo
5rsquoUTR e uma vez na regiatildeo 3rsquo-UTR do transcrito desse gene
Como relatamos neste trabalho a sequecircncia da regiatildeo 5rsquo-UTR do transcrito
TcKAP7 natildeo mostrou nenhum elemento com as caracteriacutesticas daquele envolvido na
99
regulaccedilatildeo de genes expressos na fase S do ciclo celular de outros
tripanosomatiacutedeos
Em relaccedilatildeo agrave localizaccedilatildeo de TcKAP7 verificamos atraveacutes de ensaios de
imunofluorescecircncia a distribuiccedilatildeo de TcKAP7 na regiatildeo dos poacutelos da rede de kDNA
das formas epimastigotas de T cruzi poreacutem ainda natildeo analisamos como esta
proteiacutena estaacute distribuiacuteda nas formas tripomastigotas que possuem a rede de kDNA
com formato arredondado e menos compactada
A localizaccedilatildeo de KAP7 na regiatildeo dos poacutelos do cinetoplasto de T cruzi
sugere que ela tenha funccedilotildees na replicaccedilatildeo da rede de kDNA pois nessa regiatildeo
estatildeo concentradas diversas proteiacutenas necessaacuterias para finalizaccedilatildeo do processo de
replicaccedilatildeo de miniciacuterculos
Para a construccedilatildeo do modelo molecular de TcKAP7 foram utilizadas
estruturas de duas proteiacutenas a estrutura da proteiacutena HMGB1 (2GZK) para a porccedilatildeo
amino-terminal e a estrutura da proteiacutena fator A de transcriccedilatildeo mitocondrial (3TQ6)
para a porccedilatildeo carboxi-terminal da proteiacutena ambas apresentam alta similaridade em
relaccedilatildeo agrave estrutura secundaacuteria (mais de 90) e tratam-se de proteiacutenas de um
mesmo grupo HMG (High-mobility group) Em T brucei TbKAP6 uma proteiacutena do
grupo HMG estaacute envolvida na replicaccedilatildeo e manutenccedilatildeo do kDNA (WANG et al
2014) Baseado nesses dados juntamente com os dados da imunofluorescecircncia
indireta pode-se sugerir um papel de TcKAP7 na replicaccedilatildeo da rede de kDNA
Embora ainda natildeo saibamos como KAP7 se associa com o kDNA de T
cruzi eacute possiacutevel que isso ocorra de duas maneiras atraveacutes de ligaccedilotildees
eletrostaacuteticas natildeo-especiacuteficas ou de interaccedilotildees com regiotildees especiacuteficas dos
miniciacuterculos
Atraveacutes de ensaios de SAXS foi possiacutevel perceber que a proteiacutena sofre
alteraccedilotildees conformacionais na presenccedila do kDNA sugerindo sua interaccedilatildeo com
esse aacutecido nucleacuteico Esta interaccedilatildeo pode ser eletrostaacutetica uma vez que a anaacutelise da
superfiacutecie eletrostaacutetica de TcKAP7 mostrou a predominacircncia de regiotildees ricas em
aminoaacutecidos com cargas positivas que podem conferir afinidades agrave outras proteiacutenas
com carga superficial negativa ou mesmo aacutecidos nucleicos mais uma vez sugerindo
a interaccedilatildeo com kDNA
Poreacutem natildeo se pode descartar a possibilidade de que a interaccedilatildeo de TcKAP7
com o kDNA seja atraveacutes de interaccedilotildees com regiotildees especiacuteficas dos miniciacuterculos
Nos tripanosomatiacutedeos a rede de kDNA assume a forma de um disco achatado
100
perpendicular ao flagelo onde os miniciacuterculos estatildeo alinhados em fibrilas orientadas
paralelamente ao eixo do disco (LIU et al 2005) Acredita-se que a ordenaccedilatildeo e
compactaccedilatildeo dos miniciacuterculos estatildeo relacionadas agrave proacutepria estrutura da moleacutecula de
miniciacuterculo Os miniciacuterculos apresentam regiotildees ricas em A+T que podem causar
curvaturas na moleacutecula (MARINI et al 1984 NTAMBI et al 1984) facilitando sua
inserccedilatildeo de forma ordenada no disco de kDNA aleacutem disso possuem regiotildees
conservadas onde estatildeo localizadas as origens de replicaccedilatildeo Essas regiotildees por
sua vez podem ser reconhecidas por proteiacutenas tais como a KAP7 que ajudam a
estabilizar a estrutura Os resultados com C fasciculata mostram que KAP2 3 e 4 se
ligam em regiotildees especiacuteficas dos miniciacuterculos ricas em A+T mas que natildeo satildeo
aquelas que geram a curvatura das moleacuteculas (XU et al 1996) Contudo KAP1 se
liga de maneira inespeciacutefica aos miniciacuterculos (HINES amp RAY 1998) Aleacutem disso
existe a sequecircncia universal de miniciacuterculo (UMS) e as proteiacutenas que se ligam a
essa sequecircncia (UMSBP) as quais podem participar de interaccedilotildees com as KAPrsquos
Em C fasciculata CfKAP3 sozinha consegue condensar a rede de kDNA e inibir a
decatenaccedilatildeo pela enzima topo II Poreacutem a interaccedilatildeo entre CfKAP3 e CfUMSBP
pode descondensar a rede de kDNA e reestabelecer a decatenaccedilatildeo mediada pela
topo II indicando que as proteiacutenas KAPrsquos dos tripanosomatiacutedeos podem apresentar
diferentes funccedilotildees em diferentes espeacutecies (KAPELLER et al 2011)
Para investigar a importacircncia de TcKAP7 no T cruzi e seu envolvimento ou
natildeo com o rearranjo topoloacutegico do kDNA durante o processo de diferenciaccedilatildeo do
parasita realizamos a deleccedilatildeo do gene TcKAP7 Nenhuma alteraccedilatildeo estrutural ou
morfoloacutegica na rede de kDNA foi observada no mutante de T cruzi para TcKAP7 Do
mesmo modo o parasita mutante natildeo apresentou perfil de crescimento alterado e
foi capaz de se diferenciar nas formas tripomastigotas metaciacuteclicas e infectar ceacutelulas
VERO onde se diferenciaram em formas amastigotas O mesmo foi visto quando foi
realizado o nocaute do gene TcKAP3 (DE SOUZA et al 2010)
Uma das hipoacuteteses para explicar esse fato eacute que alguma outra KAP de T
cruzi possa estar assumindo o papel da TcKAP7 talvez a TcKAP4 que se localiza
nos poacutelos do cinetoplasto quando da inserccedilatildeo dos miniciacuterculos na rede apoacutes serem
replicados na regiatildeo cinetoflagelar A redundacircncia no papel das KAPs faz com que a
rede de kDNA seja compactada e segregada corretamente mesmo na ausecircncia de
uma delas (DE SOUZA et al 2010) Sabe-se que o nocaute do gene Cfkap2 ou do
gene Cfkap3 separadamente natildeo mostrou nenhuma alteraccedilatildeo no fenoacutetipo de C
101
fasciculata Poreacutem a deleccedilatildeo de ambos os genes causou diversas alteraccedilotildees
aumento nos niacuteveis de mRNAs mitocondriais reduccedilatildeo na respiraccedilatildeo inibiccedilatildeo da
divisatildeo celular e acuacutemulo de ceacutelulas com morfologias anormais (AVLIYAKULOV et
al 2004)
Com o intuito de complementar os estudos para a caracterizaccedilatildeo do gene
TcKAP7 foram realizados ensaios de RNA de interferecircncia visando analisar a
funccedilatildeo do gene TbKAP7 ortoacutelogo em T brucei jaacute que a maquinaria de RNAi em T
cruzi eacute inexistente (DA ROCHA et al 2003) Com isso foi visto que a participaccedilatildeo da
TbKAP7 no metabolismo do T brucei eacute essencial jaacute que o silenciamento do gene
TbKAP7 levou agrave reduccedilatildeo da proliferaccedilatildeo celular do parasita corroborando com os
dados encontrados para TbKAP6 (WANG et al 2014)
Esperamos que o conhecimento das diversas moleacuteculas envolvidas na
organizaccedilatildeo e replicaccedilatildeo da rede de kDNA assim como o entendimento dos
mecanismos fisioloacutegicos que ocorrem nesta estrutura tatildeo peculiar que eacute o
cinetoplasto dos tripanosomatiacutedeos possam nos ajudar a esclarecer vaacuterios aspectos
relacionados a biologia destes eucariotos primitivos e a evoluccedilatildeo do genoma
mitocondrial ao longo do processo evolutivo
102
6 CONCLUSOtildeES
Com base nos resultados observados neste trabalho foi possiacutevel concluir
1 ndash A proteiacutena TcKAP7 eacute uma proteiacutena associada ao cinetoplasto de T
cruzi e possui caracteriacutesticas que a identificam como KAPs do tipo histona H1
incluindo seu tamanho e sua composiccedilatildeo de aminoaacutecidos e sua superfiacutecie
eletrostaacutetica
2 ndash TcKAP7 estaacute localizada nos poacutelos do cinetoplasto de T cruzi podendo
estar envolvida na replicaccedilatildeo dos miniciacuterculos
3 - TcKAP7 sofre mudanccedilas conformacionais na presenccedila do kDNA de T
cruzi evidenciando sua interaccedilatildeo com o aacutecido nucleico
4 ndash O mutante de T cruzi para TcKAP7 natildeo apresentou alteraccedilatildeo na
estrutura do cinetoplasto e na morfologia do parasita
5 ndash A proliferaccedilatildeo e a diferenciaccedilatildeo do T cruzi natildeo foram alteradas quando
o parasita teve o gene TcKAP7 deletado do genoma
6 ndash O silenciamento do gene TbKAP7 eacute essencial no metabolismo do T
brucei levando agrave reduccedilatildeo da proliferaccedilatildeo celular do parasita
103
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ABSTRACT
The kinetoplast DNA (kDNA) of trypanosomatids consists in a network of circular
molecules catenated each other the minicircles and maxicircles The minicircles
code RNAs guides (gRNAs) and the maxicircles code for some subunits of
mitochondrial enzymes and rRNA in a cryptic pattern (RNA editing) Studies in the
trypanosomatid protozoan Crithidia fasciculata showed that the kDNA is associated
with histone H1-like proteins known as kinetoplast-associated proteins (KAPs) wich
are capable of condensing the kDNA network However little is known about these
proteins of Trypanosoma cruzi a protozoan parasite which undergoes changes in
kinetoplast DNA structure over its life cycle Here we characterize a protein
associated with T cruzi kinetoplast named TcKAP7 TcKAP7 is a low molecular
weight protein with basic nature which is consistent with a role in DNA charge
neutralization and condensation Analysis by small angle X-Ray scattering technique
(SAXS) revealed that the TcKAP7 protein undergoes structural changes in the
presence kDNA suggesting an interaction with this DNA network either through
electrostatic bonds or through specific binding to molecules present on the network
The immunofluoresce analysis showed that TcKAP7 is located in the kinetoplast
poles suggesting that TcKAP7 might be involved in the late stages of the minicircle
replication A null mutant for TcKAP7 was obtained by gene replacement techniques
to study possible alterations in the kDNA structure However no modification in the
structure and morphology of the kinetoplast was observed by electron microscopy In
addition Tckap7 null mutant was able to differentiate without losing its infective
capacity Interference RNA assays was performed to analyze the function of
TbKAP7 the ortholog gene in T brucei The ablation of TbKAP7 expression leaded
to reduction in the procyclic proliferation suggesting that this gene is essential for the
metabolism of the parasite and might play distinct roles in T cruzi and T brucei
Key-words Trypanosoma cruzi kinetoplast gene knockout KAPs
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1 DISTRIBUICcedilAtildeO GEOGRAacuteFICA DA DOENCcedilA
DE CHAGAS19 FIGURA 2 CICLO DE TRANSMISSAtildeO DO
Trypanosoma cruzi20 FIGURA 3 ESQUEMA GERAL DAS PRINCIPAIS ESTRUTURAS
CELULARES DE T cruzi 22 FIGURA 4 REDE DE kDNA27 FIGURA 5 DIFERENTES ARRANJOS DO CINETOPLASTO
DE T cruzi29 FIGURA 6 MUDANCcedilAS NA POSICcedilAtildeO DO KDNA
NOS TRYPANOSOMAS29 FIGURA 7 REPOSICIONAMENTO DO KDNA EM RELACcedilAtildeO
AgraveS OUTRAS ORGANELAS DURANTEO CICLO DE VIDA DE UM FLAGELADO30
FIGURA 8 REPLICACcedilAtildeO DO kDNA32 FIGURA 9 REPRESENTACcedilAtildeO ESQUEMAacuteTICA DO
MICROFLUIDIFICADOR45 FIGURA 10 VETOR PARA EXPRESSAtildeO EM T CRUZI
P3XFLAG 50 FIGURA 11 ESQUEMA DA CONSTRUCcedilAtildeO DOS VETORES
UTILIZADOS PARA O NOCAUTE DO GENE TcKAP755
FIGURA 12 MAPA DO VETOR P2T7-177 UTILIZADO PARA ENSAIOS DE RNAi62
FIGURA 13 COMPARACcedilAtildeO ENTRE AS SEQUumlEcircNCIAS DE AMINOAacuteCIDOS DEDUZIDAS DO GENE KAP7 DE T cruzi Dm28C E DOS HAPLOacuteTIPOS DE CL BRENER65
FIGURA 14 COMPARACcedilAtildeO ENTRE AS SEQUumlEcircNCIAS DE AMINOAacuteCIDOS DEDUZIDAS DO GENE KAP7 EM DIFERENTES TRIPANOSOMATIacuteDEOS66
FIGURA 15 SINTENIA DE TcKAP7 COM OUTROS TRIPANOSOMATIacuteDEOS67
FIGURA 16 CARACTERIZACcedilAtildeO DA REGIAtildeO 5rsquo-UTR DO TRANSCRITO TcKAP769
FIGURA17 ANAacuteLISE DA EXPRESSAtildeO DA PROTEIacuteNA DE FUSAtildeO TCKAP7-FLAG EM FORMAS EPIMASTIGOTAS DE T CRUZI70
FIGURA 18 IMUNOLOCALIZACcedilAtildeO DE TcKAP7 EM EPIMASTIGOTAS DE T CRUZI71
FIGURA 19 ENSAIOS DE PCR UTILIZANDO DNA DE T cruzi kap7kap7 (WT) E T cruzi kap7neokap7higro (NO) COM DIFERENTES PRIMERS73
FIGURA 20 REPRESENTACcedilAtildeO ESQUEMAacuteTICA DOS SIacuteTIOS DA ENZIMA HindIII NO LOCUS DO GENE KAP7 DE T cruzi CL Brener75
FIGURA 21 ANAacuteLISE DA ORGANIZACcedilAtildeO DOS GENES TCKAP7 NEO E HIGRO POR ENSAIO DO TIPO SOUTHERN BLOT75
FIGURA 22 COMPARACcedilAtildeO DA EXPRESSAtildeO DO GENE TcKAP7 POR WESTERN BLOT76
FIGURA 23 COLORACcedilAtildeO PELO MEacuteTODO PANOacuteTICO RAacutePIDO DOS PARASITAS EPIMASTIGOTAS NOCAUTEADOS77
FIGURA 24 COMPARACcedilAtildeO ENTRE A ULTRAESTRUTURA DO CINETOPLASTO DO T cruzi DM28C TIPO SELVAGEM (A) E DO MUTANTE DE T cruzi PARA TcKAP7 (B) POR MICROSCOPIA ELETROcircNICA DE TRANSMISSAtildeO78
FIGURA 25 CURVA DE CRESCIMENTO DO MUTANTE DE T cruzi PARA TcKAP7 (KO) E DO T cruzi Dm28c SELVAGEM (WT) 79
FIGURA 26 METACICLOGEcircNESE IN VITRO DE T cruzi Dm28c TIPO SELVAGEM E T cruzi NOCAUTEADO80
FIGURA 27 RNAi DE TbKAP7 INIBE O CRESCIMENTO DAS FORMAS PROCIacuteCLICAS DE T brucei82
FIGURA 28 PURIFICACcedilAtildeO DE TCKAP7 ATRAVEacuteS DE CROMATOGRAFIA DE AFINIDADE83
FIGURA 29 PURIFICACcedilAtildeO DE TCKAP7 ATRAVEacuteS DE CROMATOGRAFIA DE TROCA IOcircNICA84
FIGURA 30 ANAacuteLISE POR DLS DE TCKAP785 FIGURA 31 ENVELOPE MOLECULAR DE SAXS86 FIGURA 32 ESPECTRO DE DICROIacuteSMO CIRCULAR DE
TcKAP787 FIGURA 33 PREDICcedilAtildeO DE ESTRUTURA SECUNDAacuteRIA DE
TcKAP787 FIGURA 34 CRISTAL DE TcKAP7 DE T CRUZI88 FIGURA 35 ESTRUTURA DE TcKAP790 FIGURA 36 SUPERFIacuteCIE ELETROSTAacuteTICA DE
TcKAP791 FIGURA 37 ALINHAMENTO ESTRUTURAL DE 3TQ6 4NOD
3TTM 4NNU E TCKAP793 FIGURA 38 ESPECTRO DE DICROIacuteSMO CIRCULAR
DE TcKAP794 FIGURA 39 ENVELOPE MOLECULAR DETcKAP795 FIGURA 40 ENVELOPE MOLECULAR DETcKAP7 VISTO EM
DIFERENTES AcircNGULOS96
LISTA DE TABELAS
TABELA 1 RELACcedilAtildeO DOS PRIMERS UTILIZADOS PARA A CLONAGEM DA REGIAtildeO UPSTREAM DE TcKAP7 NO VETOR pNEO153
TABELA 2 RELACcedilAtildeO DOS PRIMERS UTILIZADOS PARA A CLONAGEM DA REGIAtildeO DOWNSTREAM DE TcKAP7 NO VETOR pNEO153
TABELA 3 RELACcedilAtildeO DOS PRIMERS UTILIZADOS PARA A AMPLIFICACcedilAtildeO DO GENE TbKAP763
TABELA 4ndash PERCENTUAL DE IDENTIDADE ENTRE AS PROTEIacuteNAS KAP7 NOS TRIPANOSSOMATIacuteDEOS COM O GENOMA SEQUENCIADO67
TABELA 5 COMBINACcedilOtildeES DE PRIMERS UTILIZADOS NA PCR PARA CONFIRMAR O NOCAUTE DE TcKAP772
SUMAacuteRIO
1 INTRODUCcedilAtildeO18 11 O Trypanosoma cruzi18 12 Ciclo de vida do T cruzi20 13 Aspectos celulares de T cruzi21 14 O genoma de T cruzi24 15 Expressatildeo gecircnica de Tcruzi25 16 O cinetoplasto26 17 A rede de kDNA26 171 Replicaccedilatildeo do kDNA31 18 Proteiacutenas associadas ao cinetoplasto (KAPs)32 2 OBJETIVOS35 21 OBJETIVO GERAL35 211 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS35 3 MATERIAIS E MEacuteTODOS36 31 Reagentes e Soluccedilotildees Utilizados36 311 Reagentes36 312 Tampotildees e Soluccedilotildees36 313 Meios de cultura38 32 Cultivo do Trypanosoma cruzi38 321 Epimastigotas38 322 Tripomastigotas metaciacuteclicos39 33 Curva de crescimento de T cruzi39 34 Obtenccedilatildeo de DNA de T cruzi40 35 Obtenccedilatildeo de kDNA de T cruzi40 36 Obtenccedilatildeo de extrato proteico de T cruzi40 37 Clonagem do gene TcKAP741 38 Obtenccedilatildeo do cDNA de TcKAP7 atraveacutes de ensaio de RT-PCR41 39 Seleccedilatildeo dos clones recombinantes42 391 Teacutecnica de palitagem (toothpick)42 392 Teacutecnica de PCR de colocircnia43 310 Preparaccedilatildeo de plasmiacutedeo em pequena escala (miniprep)43 311 Expressatildeo da proteiacutena TcKAP7 em E coli43 312 Purificaccedilatildeo da proteiacutena recombinante TcKAP744 3121 Processamento da amostra44 3122 Cromatografia de afinidade45 3123 Cromatografia de troca iocircnica46 3124 Cromatografia de gel filtraccedilatildeo46 313 Espalhamento Dinacircmico de Luz ndash DLS46 314 Espectroscopia de dicroiacutesmo circular (CD)46 315 Quantificaccedilatildeo e concentraccedilatildeo47 316 Ensaios de Cristalizaccedilatildeo47 317 Espalhamento de raio-X a baixo acircngulo (SAXS)48 318 Modelagem de TcKAP748 319 Obtenccedilatildeo de antissoro policlonal contra TcKAP749 320 Anaacutelise da expressatildeo do gene TcKAP7 e de seu mutante por ensaio tipo western blot49 321 Superexpressatildeo de TcKAP750
3211 Amplificaccedilatildeo e clonagem do gene TcKAP7 no vetor pNEO3xFlag para superexpressatildeo da proteiacutena50 3212 Transfecccedilatildeo por eletroporaccedilatildeo52 3213 Seleccedilatildeo dos transfectantes52 322 Deleccedilatildeo do gene TcKAP7 por nocaute gecircnico53 3221 Amplificaccedilatildeo e clonagem das regiotildees a montante e a jusante do gene TcKAP753 3222 Amplificaccedilatildeo dos cassetes UPS-NEO-DOWN e UPS-HIGRO-DOWN para transfecccedilatildeo de T cruzi55 3223 Transfecccedilatildeo do T cruzi com o cassete UPS-NEO-DOWN56 3224 Extraccedilatildeo de DNA dos transfectantes57 3225 Anaacutelise por PCR do DNA dos parasitas transfectados com o cassete UPS-NEO-DOWN57 3226 Transfecccedilatildeo do T cruzi com o cassete UPS-HIGRO-DOWN57 3227 Anaacutelise por PCR do DNA dos parasitas transfectados com o cassete UPS-HIGRO-DOWN58 3228 Anaacutelise da organizaccedilatildeo do gene TcKAP7 e da eficiecircncia de seu nocaute atraveacutes de ensaio do tipo Southern blot58 323 Localizaccedilatildeo celular da proteiacutena TcKAP7 atraveacutes de ensaio de imunofluorescecircncia59 324 Anaacutelise da ultraestrutura do cinetoplasto do mutante de T cruzi para TcKAP7 por microscopia eletrocircnica de transmissatildeo60 325 Coloraccedilatildeo dos parasitas transfectados60 326 Infecccedilatildeo de ceacutelulas Vero com o mutante de T cruzi para TcKAP761 327 Anaacutelise da funccedilatildeo do gene TbKAP7 de Trypanosoma brucei atraveacutes de ensaios de RNA de interferecircncia61 3271 Induccedilatildeo do RNA dupla fita64 4 RESULTADOS65 41 Clonagem e caracterizaccedilatildeo do gene TcKAP765 42 Expressatildeo da proteiacutena TcKAP7 em T cruzi69 43 Localizaccedilatildeo celular de TcKAP7 atraveacutes de ensaio de imunofluorescecircncia70 44 Deleccedilatildeo do gene TcKAP7 por nocaute gecircnico71 441 Anaacutelise por PCR do DNA dos parasitas transfectados com os cassetes UPS-NEO-DOWN e UPS-HIGRO-DOWN72 442 Anaacutelise da organizaccedilatildeo dos genes TcKAP7 neo e higro por ensaio do tipo Southern blot74 45 Comparaccedilatildeo da expressatildeo do gene TcKAP7 por western blot76 46 Anaacutelise da morfologia e da ultraestrutura do cinetoplasto do mutante de T cruzi para TcKAP776 47 Multiplicaccedilatildeo diferenciaccedilatildeo e infectividade do mutante de T cruzi para TcKAP779 48 Anaacutelise da funccedilatildeo do gene KAP7 de Trypanosoma brucei atraveacutes de ensaios de RNA de interferecircncia80 49 Caracterizaccedilatildeo estrutural de TcKAP782 491 Produccedilatildeo recombinante de TcKAP782 410 Anaacutelise do estado oligomeacuterico de TcKAP784 411 Anaacutelise do conteuacutedo de estrutura secundaacuteria de TcKAP7 recombinante86 412 Anaacutelise estrutural de TcKAP787
413 Investigaccedilatildeo de possiacuteveis funcionalidades baseadas na estrutura de TcKAP791 4131 Prediccedilatildeo de funccedilatildeo paraTcKAP791 4132 Anaacutelises preliminares da possiacutevel interaccedilatildeo entre TcKAP7 e kDNA93 5 DISCUSSAtildeO97 6 CONCLUSOtildeES102 7 REFEREcircNCIAS103
18
1 INTRODUCcedilAtildeO
11 O Trypanosoma cruzi
Trypanosoma cruzi eacute um protozoaacuterio flagelado unicelular pertencente ao
reino Protista subreino Protozoa filo Sarcomastigophora subfilo Mastigophora
classe Zoomastigophora ordem Kinetoplastida e famiacutelia Trypanosomatidae (LEVINE
et al 1980) A principal caracteriacutestica dessa ordem eacute a presenccedila de uma estrutura
singular o cinetoplasto que abriga em uma massa de DNA extranuclear
concentrado na mitococircndria uacutenica deste protista (SHAPIRO amp ENGLUND 1995) A
famiacutelia Trypanosomatidae inclui os seguintes gecircneros importantes Blastocrithidia
Crithidia Endotrypanum Herpetomonas Leishmania Leptomonas Phytomonas e
Trypanosoma O gecircnero Trypanosoma eacute um dos mais importantes dentro da famiacutelia
Trypanosomatidae por incluir uma seacuterie de espeacutecies causadoras de doenccedilas
humanas importantes como o Trypanosoma cruzi agente da doenccedila de Chagas
Trypanosoma rhodesiense e Trypanosoma gambiense agentes da doenccedila do sono
e de animais o Trypanosoma brucei Trypanosoma equiperdum e Trypanosoma
equinum (DE SOUZA 2015)
Este protozoaacuterio eacute um microrganismo heteroxecircnico com ciclo bioloacutegico
alternado entre hospedeiros vertebrados (mamiacuteferos) e invertebrados (triatomiacuteneos)
Existem diferentes formas de transmissatildeo da doenccedila dentre as quais se destaca a
via vetorial que consiste na transmissatildeo do parasita atraveacutes de excretas do inseto
vetor hematoacutefago pertencente agrave ordem Hemiacuteptera famiacutelia Reduvidae subfamiacutelia
Triatominae (DIAS et al 1956) A principal caracteriacutestica bioloacutegica dos triatomiacuteneos
eacute que satildeo obrigatoriamente hematoacutefagos e necessitam do repasto sanguiacuteneo para
completar o desenvolvimento (DIAS 2000) O parasita pode ainda ser transmitido
aos mamiacuteferos por transfusatildeo sanguiacutenea ou via oral e com menos frequecircncia por
via congecircnita acidentes de laboratoacuterio e transplantes de oacutergatildeos (BELTRAO HDE et
al 2009 STEINDEL et al 2008 TANOWITZ et al 1992) Praticamente todo tipo
de ceacutelula nucleada do hospedeiro mamiacutefero pode ser parasitada considerando o
tropismo das diferentes cepas (LENZI et al 1996) Outra caracteriacutestica deste
parasita eacute apresentar diferentes morfologias durante o ciclo bioloacutegico A classificaccedilatildeo
19
de suas formas baseia-se tambeacutem na posiccedilatildeo do cinetoplasto em relaccedilatildeo ao nuacutecleo
e do local de onde emerge o flagelo (HOARE 1971)
Foi no ano de 1909 no estado de Minas Gerais que Carlos Chagas meacutedico
sanitarista identificou pela primeira vez o protozoaacuterio parasita Trypanosoma cruzi
agente causador da Doenccedila de Chagas A doenccedila de Chagas eacute endecircmica na
Ameacuterica Latina sendo conhecida a existecircncia de vetores da doenccedila desde o sul dos
Estados Unidos agrave Argentina (FIGURA 1)
FIGURA 1 DISTRIBUICcedilAtildeO GEOGRAacuteFICA DA DOENCcedilA DE CHAGAS FONTE Modificado de httpwwwwhointen
Em 2008 o nuacutemero de indiviacuteduos infectados era estimado entre 16 e 18
milhotildees sendo que aproximadamente 90 milhotildees de pessoas estariam sob risco
de contaminaccedilatildeo na Ameacuterica Latina (WHO 2010)
Apesar de existirem drogas (Nifurtimox e Benzonidazol) para o tratamento
da doenccedila sua ineficaacutecia no estaacutegio crocircnico e sua accedilatildeo toacutexica acabam prejudicando
o paciente sem conseguir eliminar o parasita (BRENER et al 2000) Sem vacinas
ou tratamento quimioteraacutepico eficiente a principal estrateacutegia de controle limita-se agrave
prevenccedilatildeo da transmissatildeo por transfusatildeo sanguiacutenea e ao controle populacional dos
vetores triatomiacuteneos Aleacutem da sua importacircncia como patoacutegeno humano este micro-
organismo apresenta caracteriacutesticas peculiares que o tornam um excelente modelo
para o estudo de questotildees bioloacutegicas baacutesicas
Regiotildees endecircmicas
20
12 Ciclo de vida do T cruzi
O T cruzi apresenta um ciclo complexo na natureza sofrendo mudanccedilas
estruturais bioquiacutemicas e morfoloacutegicas de acordo com o ambiente em que se
encontra Formas replicativas epimastigotas e amastigotas dos hospedeiros
invertebrado e mamiacutefero respectivamente alternam-se com as formas infectivas e
natildeo proliferativas tripomastigotas metaciacuteclicas (proveniente do inseto vetor) e
tripomastigota sanguiacutenea (originaacuteria do mamiacutefero infectado) (FIGURA 2) (DE
SOUZA 1984)
FIGURA 2 CICLO DE TRANSMISSAtildeO DO Trypanosoma cruzi FONTE Infograacutefico Veniacutecio Ribeiro ICICTFIOCRUZ
Durante o repasto sanguiacuteneo do inseto vetor formas tripomastigotas
metaciacuteclicas atingem a corrente sanguiacutenea do hospedeiro pela lesatildeo da picada Esta
forma infectiva eacute capaz de invadir todos os tipos de ceacutelulas com exceccedilatildeo das
21
hemaacutecias Apoacutes a entrada do parasita na ceacutelula os tripomastigotas diferenciam-se
em uma forma replicativa denominada amastigota que apoacutes diversas divisotildees sofre
uma diferenciaccedilatildeo para um estaacutegio intermediaacuterio o epimastigota intracelular e
posteriormente para tripomastigota Quando ocorre a lise celular os tripomastigotas
satildeo liberados ao meio extracelular podendo entatildeo invadir ceacutelulas vizinhas atingir
novos tecidos atraveacutes da corrente sanguiacutenea ou ainda infectar um inseto vetor
durante o processo de hematofagia recomeccedilando o ciclo no hospedeiro
invertebrado No inseto as formas tripomastigotas diferenciam-se em epimastigotas
no tubo digestivo e migram para o intestino onde ocorrem as divisotildees binaacuterias Ao
atingirem a porccedilatildeo terminal do tubo digestivo ocorre a diferenciaccedilatildeo em
tripomastigotas metaciacuteclicos que satildeo eliminados juntamente com as fezes e urina do
triatomiacutedeo
A transformaccedilatildeo da forma epimastigota do T cruzi em tripomastigota
metaciacuteclica denominada metaciclogecircnese eacute de grande interesse de estudo pois
neste processo ocorrem diversas alteraccedilotildees morfoloacutegicas metaboacutelicas e de
expressatildeo gecircnica (GOLDENBERG et al 1985) A metaciclogecircnese que ocorre
naturalmente no intestino do inseto vetor pode ser mimetizada in vitro utilizando-se
meio quimicamente definido que simula as condiccedilotildees da urina do inseto vetor
(CONTRERAS et al 1985)
13 Aspectos celulares de T cruzi
O Trypanosoma cruzi apresenta aleacutem das organelas tiacutepicas da maioria das
ceacutelulas eucarioacuteticas como nuacutecleo retiacuteculo endoplasmaacutetico aparato de Golgi e
mitococircndria algumas estruturas peculiares (FIGURA 3) como os microtuacutebulos
subpeliculares a estrutura paraflagelar os reservossomos o cinetoplasto os
glicossomos e os acidocalcisomos exclusivos dos tripanosomatiacutedeos (revisto por
DE SOUZA 1984 1999 2002)
22
FIGURA 3 ESQUEMA GERAL DAS PRINCIPAIS ESTRUTURAS CELULARES DE T cruzi FONTE DOCAMPO et al 1975
A superfiacutecie celular dos tripanossomatiacutedeos eacute composta principalmente
pela membrana plasmaacutetica e pelos microtuacutebulos subpeliculares Pequenos
filamentos conectam fortemente os microtuacutebulos subpeliculares os quais se
apresentam espaccedilados de forma regular entre si e com a membrana plasmaacutetica (DE
23
SOUZA SANTANNA CUNHA-E-SILVA 2009) conferindo rigidez agrave ceacutelula e
resistecircncia ao rompimento mecacircnico
Todos os membros da famiacutelia Trypanosomatidae apresentam um flagelo
que emerge de uma aacuterea de invaginaccedilatildeo da membrana plasmaacutetica conhecida como
bolsa flagelar Devido agrave localizaccedilatildeo especiacutefica de vaacuterios receptores nesta aacuterea
acredita-se que a maior parte do traacutefego vesicular e entrada de nutrientes ocorram
nesta regiatildeo Outra invaginaccedilatildeo menor localizada proacutexima agrave bolsa flagelar o
citoacutestomo tambeacutem estaacute envolvida com a absorccedilatildeo de nutrientes (PORTO-
CARREIRO et al 2000)
O flagelo do T cruzi apresenta uma estrutura baacutesica semelhante a outros
flagelos sendo envolvido por uma membrana flagelar e contendo um axonema
tiacutepico que apresenta um padratildeo de nove pares de microtuacutebulos perifeacutericos e um par
central Associado ao flagelo deste parasita eacute encontrado um complexo arranjo de
filamentos proteacuteicos denominado de estrutura paraflagelar (revisto por GULL 1999)
Na parte posterior da ceacutelula existem organelas usualmente esfeacutericas
denominadas reservossomos Os reservossomos satildeo organelas aacutecidas que
possuem em seu interior proteinases principalmente a cruzipaiacutena (uma
cisteiacutenoproteinase) e proteiacutenas ingeridas que chegam dentro de vesiacuteculas
endociacuteticas oriundas da bolsa flagelar e do citoacutestomo Com base nisso foi proposto
que os reservossomos seriam compartimentos preacute-lisossomais (SOARES et al
1992) Tambeacutem tem sido proposta a participaccedilatildeo dos reservossomos no processo
de metaciclogecircnese como principal fonte de energia para esta atividade (SOARES
1999)
O T cruzi assim como todos os membros da famiacutelia Tripanosomatidae
apresenta uma mitococircndria uacutenica e ramificada que se estende por todo o corpo do
protozoaacuterio Como em todas as ceacutelulas eucarioacuteticas a mitococircndria dos
tripanosomatiacutedeos tambeacutem apresenta DNA mitocondrial tambeacutem conhecido como
kDNA ou DNA do cinetoplasto que se concentra em uma determinada regiatildeo da
mitococircndria localizada logo abaixo do corpuacutesculo basal dando origem a uma
estrutura intramitocondrial chamada de cinetoplasto O cinetoplasto abriga o kDNA
o qual eacute constituiacutedo por moleacuteculas circulares que se encontram interligadas
formando uma extensa rede entre si (SHLOMAI 1994)
Distribuiacutedos pelo citoplasma estatildeo os glicossomos um tipo especializado de
peroxissomo Estes acumulam enzimas da via glicoliacutetica envolvidas na conversatildeo
24
da glicose a 3-fosfoglicerato que em outros organismos localizam-se no citoplasma
(HANNAERT et al 2003)
Outra particularidade dos tripanossomatiacutedeos estaacute na estocagem intracelular
de caacutelcio Este iacuteon importante nos processos de sinalizaccedilatildeo celular eacute estocado em
organelas denominadas acidocalcissomos Os acidocalcissomos provavelmente
estatildeo envolvidos em diversos processos bioloacutegicos tais como o armazenamento de
caacutelcio e polifosfatos adaptaccedilatildeo dos tripanosomatiacutedeos a condiccedilotildees de estresse
ambiental manutenccedilatildeo do pH intracelular e osmorregulaccedilatildeo (revisto por DOCAMPO
et al 2005)
14 O genoma de T cruzi
No ano de 2005 foi concluiacuteda a montagem do genoma do T cruzi (EL-
SAYED et al 2005) A cepa CL Brener foi a escolhida para o sequenciamento por
ser bem caracterizada bioquiacutemica e parasitologicamente (ZINGALES et al 1997) e
por ser considerada representativa para o universo de cepas circulantes de T cruzi
Com base na montagem do sequenciamento o genoma diploacuteide do parasita foi
calculado como sendo de 1064 1107 Mb com cada haploacutetipo contendo cerca de
12000 genes sendo que mais de 50 do genoma constituiu-se de sequecircncias
repetitivas compostas por famiacutelias de proteiacutenas de superfiacutecie retrotransposons e
elementos subtelomeacutericos (EL-SAYED et al 2005)
A comparaccedilatildeo das estruturas genocircmicas e proteiacutenas preditas obtidas a
partir do sequenciamento de Trypanosoma cruzi com as de Leishmania major e
Trypanosoma brucei indica mais similaridade entre T cruzi e T brucei uma grande
conservaccedilatildeo entre os respectivos proteomas (exceto para antiacutegenos de superfiacutecie) e
uma sintenia bastante conservada entre os trecircs tripanosomatiacutedeos apesar da
divergecircncia haacute 200-500 milhotildees de anos atraacutes (BERRIMAN et al 2005 EL SAYED
et al 2005 IVENS et al 2005)
Os tripanosomatiacutedeos possuem aleacutem do genoma nuclear um grande
genoma mitocondrial (kDNA) que tem sido extensivamente estudado sendo uacutenico
em estrutura funccedilatildeo e mecanismo de replicaccedilatildeo O kDNA eacute formado por milhares de
moleacuteculas circulares topologicamente relaxadas e interligadas umas as outras Este
arranjo conteacutem aproximadamente 20 - 30 do DNA total dos tripanosomatiacutedeos e eacute
composto por 2 tipos de moleacuteculas circulares os maxiciacuterculos e os miniciacuterculos Os
25
maxiciacuterculos apresentam um tamanho entre 22-37 kb e conteacutem basicamente os
genes codificadores de proteiacutenas envolvidas na fosforilaccedilatildeo oxidativa e RNA
ribossocircmico Os miniciacuterculos com um tamanho que varia de espeacutecie para espeacutecie
(05 a 25 kb) conteacutem os genes que codificam os RNAs guia envolvidos na
editoraccedilatildeo do RNA (STUART et al 1989 SHAPIRO amp ENGLUND 1995 MADISON-
ANTENUCCI et al 2002 SIMPSON et al 2003 ONN et al 2006 GLUENZ et al
2007)
15 Expressatildeo gecircnica de Tcruzi
T cruzi estaacute sujeito agraves frequentes mudanccedilas de ambientes decorrentes da
passagem por diferentes hospedeiros durante seu ciclo de vida (temperatura pH
quantidade de nutrientes evasatildeo do sistema imune) por esse motivo a expressatildeo
gecircnica deste parasita eacute regulada por diversos fatores A adaptaccedilatildeo raacutepida e eficiente
a estas diferentes condiccedilotildees torna-se uma importante tarefa para o parasita
Como os demais eucariotos o T cruzi apresenta trecircs RNAs polimerases a
RNA polimerase I transcreve os genes para RNAs ribossocircmicos a RNA polimerase
II os genes que codificam proteiacutenas e a RNA polimerase III pequenos RNAs como
o tRNA (RNA de transferecircncia) Nos tripanosomatiacutedeos promotores para as RNA
polimerase I e III jaacute foram identificados poreacutem ainda natildeo foram identificados
promotores para os genes transcritos pela RNA polimerase II com exceccedilatildeo de um
promotor associado ao gene do mini-exon (GILLINGER amp BELLOFATTO 2001
revisto por CAMPBELL et al 2003)
Os genes dos tripanosomatiacutedeos estatildeo organizados em unidades
policistrocircnicas e natildeo apresentam interrupccedilotildees por iacutentrons com exceccedilatildeo do gene da
poli-A polimerase (MAIR et al 2000)
Uma vez que em T cruzi como nos demais eucariotos somente mRNAs
monocistrocircnicos satildeo traduzidos os precursores de mRNA policistrocircnicos devem ser
processados ateacute mRNAs individuais Como caracteriacutestica desta famiacutelia os
transcritos de mRNA satildeo processados por mecanismos de trans-splicing (AGABIAN
1990) e poliadenilaccedilatildeo (LEBOWITZ et al 1993 MATTHEWS et al 1994
VANHAMME amp PAYS 1995)
No processo de trans-splicing as unidades codificadoras satildeo separadas e eacute
adicionada na extremidade 5rsquo uma sequecircncia extremamente conservada espeacutecie-
26
especiacutefica de 39 nucleotiacutedeos denominada sequumlecircncia liacuteder (SL) ou minieacutexon
(McCARTHY-BURKE et al 1989 NILSEN 1992 VANHAMME amp PAYS 1995)
Nesta reaccedilatildeo participam duas moleacuteculas de RNA uma doadora e outra aceptora A
doadora eacute um precursor do mini-exon e em T cruzi possui cerca de 110
nucleotiacutedeos (ZWIERZYNSKI amp BUCK 1991) A aceptora eacute o transcrito derivado da
unidade policistrocircnica ao qual o mini-exon eacute transferido O complexo enzimaacutetico
envolvido nesta reaccedilatildeo eacute semelhante ao descrito para a de cis-splicing (LAIRD
1989)
Os transcritos processados satildeo estabilizados pela estrutura cap 4 do mini-
exon (ULLU amp TSCHUDI 1991) e pela adiccedilatildeo de uma cauda poli-A agrave extremidade
3rsquo sendo que a adiccedilatildeo de ambos os elementos ocorrem em conjunto (LEBOWITZ et
al 1993) Regiotildees ricas em resiacuteduos de pirimidinas aleacutem da sequumlecircncia consenso
(AG) para o trans-splicing regulam a adiccedilatildeo do mini-exon e da cauda poli-A
Deleccedilotildees nestas regiotildees impedem o correto processamento destes transcritos
(MATTHEWS et al 1994)
A ocorrecircncia de transcriccedilatildeo policistrocircnica associada agrave ausecircncia de
promotores para RNA polimerase II e agrave presenccedila de niacuteveis distintos de mRNA
originados de uma mesma unidade policistrocircnica sugerem que a regulaccedilatildeo da
expressatildeo gecircnica nesses protozoaacuterios ocorra a niacutevel poacutes-transcricional baseada
principalmente em mecanismos que controlam a estabilidade e a traduccedilatildeo dos
mRNAs (CLAYTON 2002 BOUCHER et al 2002)
16 O cinetoplasto
O cinetoplasto eacute uma estrutura peculiar presente nos tripanosomatiacutedeos e
encontra-se inserida no interior da mitococircndria uacutenica abrigando fibrilas de DNA
conhecidas como kDNA O nome cinetoplasto (cineto=movimento e plasto=organela)
foi dado pois se acreditava que o mesmo fosse responsaacutevel pelo movimento do
flagelo
17 A rede de kDNA
O DNA do cinetoplasto eacute formado por dois tipos de moleacuteculas circulares os
miniciacuterculos de tamanho entre 05 e 25 kb e os maxiciacuterculos que apresentam
entre 20 e 40 kb Cerca de 10000 miniciacuterculos e 50 maxiciacuterculos se encontram
27
catenados formando uma extensa rede (SHAPIRO amp ENGLUND 1995 DE SOUZA amp
CAVALCANTI 2008) (FIGURA 4)
FIGURA 4 REDE DE kDNA
FONTE ROY CHOWDHURY et al 2010
As primeiras questotildees relacionadas ao arranjo das moleacuteculas na rede do
kDNA dos tripanosomatiacutedeos surgiram na deacutecada de 80 sugerindo que tal
organizaccedilatildeo poderia ter evoluiacutedo como um maneira mais eficaz de armazenar uma
grande quantidade de material em um pequeno espaccedilo (HAJDUK et al 1986)
Os maxiciacuterculos apresentam um tamanho de 22 a 37 kb e assim como o
DNA mitocondrial de outros eucariotos codificam RNAs ribossomais e diversas
proteiacutenas da cadeia respiratoacuteria incluindo subunidades da citocromo oxidase e
NADH desidrogenase (revisto por SHAPIRO amp ENGLUND 1995) Os transcritos dos
maxiciacuterculos satildeo processados poacutes-transcricionalmente para formar mRNAs
funcionais atraveacutes de um processo conhecido como ediccedilatildeo ou editoraccedilatildeo do RNA
A editoraccedilatildeo do RNA consiste na inserccedilatildeo ou retirada de resiacuteduos de uridina em
28
siacutetios especiacuteficos dos RNAs transcritos pelos maxiciacuterculos a fim de criar coacutedons de
iniciaccedilatildeo ou terminaccedilatildeo mudanccedilas na fase de leitura ou quadros abertos de leitura a
partir de sequumlecircncias sem sentido O processo de ediccedilatildeo eacute especificado por
pequenos RNAs guias produzidos pelos miniciacuterculos e maxiciacuterculos e catalisado
por um complexo muiltiproteacuteico o editosomo (revisto por Esteacutevez amp Simpson 1999
Stuart et al 2005) Esse processo constitui uma forma de regular poacutes-
transcricionalmente a expressatildeo de genes mitocondriais nas diferentes formas
evolutivas do parasita
Os miniciacuterculos caracterizam-se por apresentar um tamanho de 05 a 25 kb
e por transcrever os RNAs guia (gRNA) responsaacuteveis pela especificidade da ediccedilatildeo
dos mRNAs codificados pelos maxiciacuterculos por meio de uma sequumlecircncia presente na
porccedilatildeo central desses gRNAs (BENNE 1994 STUART et al 2005) A significacircncia
da variaccedilatildeo em tamanho e organizaccedilatildeo entre as espeacutecies ainda natildeo eacute aparente
contudo a diversidade das sequecircncias dos miniciacuterculos estaacute correlacionada com a
necessidade de mais ou menos ediccedilatildeo de mRNA de cada organismo (STUART
1991) Apesar desta diversidade os miniciacuterculos apresentam pelo menos duas
regiotildees conservadas o dodecacircmero GGGGTTGGTGTA conhecido como sequecircncia
universal dos miniciacuterculos (UMS) e o hexacircmero ACGCCC que correspondem agrave
origem de replicaccedilatildeo da fita L (light) e da fita H (heavy) respectivamente
(BIRKENMEYER amp RAY 1986 BIRKENMEYER et al 1987 RAY 1989 SHLOMAI
1994 HINES amp RAY 2008)
Embora o cinetoplasto de todos os tripanosomatiacutedeos seja formado por
moleacuteculas circulares relaxadas e catenadas diferentes arranjos da rede de kDNA
podem ser observados entre diferentes estaacutegios do ciclo de vida desses
protozoaacuterios como em T cruzi (FIGURA 5) assim como mudanccedilas na posiccedilatildeo do
kDNA satildeo utilizadas para identificar as diferentes formas evolutivas do parasita
(FIGURA 6)
29
FIGURA 5 ndash DIFERENTES ARRANJOS DO CINETOPLASTO DE T cruzi
LEGENDA As fibrilas de kDNA se apresentam bastante compactadas em forma de bastatildeo nas formas amastigotas (A) e epimastigotas (B) enquanto nas formas tripomastigotas a rede de kDNA torna-se menos compacta e a forma em bastatildeo do cinetoplasto daacute lugar a uma forma arredondada (C) FONTE DE SOUZA amp SOUTO-PADRON 1980 e DE SOUZA 1984
Nas formas amastigota (FIGURA 5A) e epimastigota (FIGURA 5B) de T
cruzi as fibrilas de kDNA se apresentam bastante compactadas em forma de
bastatildeo Em tripomastigotas (FIGURA 5C) de T cruzi a rede de kDNA torna-se
menos compacta e a forma em bastatildeo do cinetoplasto daacute lugar a uma forma
arredondada (DE SOUZA 1984) Os vaacuterios graus de compactaccedilatildeo do kDNA em
tripanosomatiacutedeos podem estar relacionados com a accedilatildeo de proteiacutenas que
condensam o DNA como seraacute visto mais adiante
FIGURA 6 MUDANCcedilAS NA POSICcedilAtildeO DO KDNA NOS TRYPANOSOMAS FONTE Modificado de DO CAMPO et al 2005
30
O cinetoplasto de todos os tripanosomatiacutedeos encontra-se localizado
proacuteximo ao corpo basal perpendicularmente ao eixo do flagelo Em alguns
tripanosomatiacutedeos que sofrem diferenciaccedilatildeo ao longo de seu ciclo de vida como o
T cruzi o cinetoplasto muda de posiccedilatildeo dentro da ceacutelula passando da regiatildeo
anterior (nos epimastigotas) para a regiatildeo posterior (nos tripomastigotas) poreacutem
permanecendo proacuteximo e perpendicular ao corpo basal (FIGURA 7) O cinetoplasto
eacute fisicamente conectado ao corpo basal atraveacutes de um grupo de filamentos
citoplasmaacuteticos chamado de complexo de ligaccedilatildeo tripartite (TAC) (OGBADOYI et al
2003) Este complexo eacute responsaacutevel pelo posicionamento espacial do cinetoplasto e
por sua segregaccedilatildeo
FIGURA 7 REPOSICIONAMENTO DO KDNA EM RELACcedilAtildeO AgraveS OUTRAS ORGANELAS DURANTE O CICLO DE VIDA DE UM FLAGELADO LEGENDA A morfologia eacute definida pelas posiccedilotildees do ponto onde emerge o flagelo e a bolsa flagelar (BF) (mostrada em laranja) nuacutecleo (mostrado em azul) e kDNA (mostrado em roxo) FONTE Modificado de FIELD amp CARRINGTON 2009
31
171 Replicaccedilatildeo do kDNA
Nos tripanosomatiacutedeos a replicaccedilatildeo do kDNA eacute restrita a fase S nuclear
(COSGROVE amp SKEEN 1970 WOODWARD amp GULL 1990) diferente do que
acontece na maioria dos eucariotos onde a replicaccedilatildeo do DNA mitocondrial ocorre
ao longo do ciclo celular (LIU et al 2005)
A replicaccedilatildeo dos miniciacuterculos se inicia quando estes satildeo individualmente
decatenados da rede de kDNA pela accedilatildeo de DNA topoisomerases do tipo II pois
estes natildeo se replicam enquanto estatildeo ligados agrave rede e termina quando os
miniciacuterculos retornam para a rede com a ajuda da mesma enzima (SHAPIRO amp
ENGLUND 1995)
Os miniciacuterculos satildeo liberados da rede em direccedilatildeo a zona cinetoflagelar
(KFZ) uma regiatildeo especializada da matriz mitocondrial entre o kDNA e o corpo
basal (FIGURA 8) que abriga proteiacutenas envolvidas com o iniacutecio da replicaccedilatildeo Em
seguida os ciacuterculos migram (ou satildeo transportados) para os poacutelos opostos da rede
de kDNA para completar sua replicaccedilatildeo O iniacutecio da replicaccedilatildeo dos miniciacuterculos na
regiatildeo cinetoflagelar envolve a montagem de um complexo proteacuteico na origem de
replicaccedilatildeo dos ciacuterculos com a participaccedilatildeo da primase polimerase e proteiacutenas que
se ligam agrave sequumlecircncia universal de miniciacuterculos (UMSBP) Estas juntamente com
outras proteiacutenas geram uma forquilha de replicaccedilatildeo que se propaga
unidirecionalmente ao redor do miniciacuterculo formando uma estrutura tipo
intermediaacuteria (LIU et al 2005 GLUENZ et al 2007)
Os miniciacuterculos receacutem-replicados migram da zona KFZ para dois complexos
proteacuteicos situados nos poacutelos diametralmente opostos do cinetoplasto onde os
proacuteximos passos de replicaccedilatildeo iratildeo ocorrer Estes passos incluem remoccedilatildeo dos
primers pela accedilatildeo de endonucleases preenchimento de alguns intervalos entre os
fragmentos de Okazaki pela DNA polimerase e uniatildeo dos cortes (nicks) por uma
DNA ligase Apoacutes estas etapas os novos ciacuterculos sintetizados que ainda possuem
pelo menos uma interrupccedilatildeo em sua sequumlecircncia satildeo reunidos agrave periferia da rede
pela accedilatildeo de topoisomerases II Apoacutes todos miniciacuterculos terem sido replicados os
intervalos satildeo reparados (Revisto por LIU et al 2005 POVELONES 2014)
Pouco se sabe sobre o processo de replicaccedilatildeo dos maxiciacuterculos Assim
como os miniciacuterculos os maxiciacuterculos tambeacutem sofrem replicaccedilatildeo unidirecional que
32
se inicia em uma origem contida na regiatildeo variaacutevel da moleacutecula formando estruturas
tipo- Entretanto ao contraacuterio dos miniciacuterculos eles permanecem ligados agrave rede de
kDNA durante o processo replicativo (revisto por KLINGBEIL et al 2001 Liu et al
2005)
FIGURA 8 REPLICACcedilAtildeO DO kDNA FONTE Modificado de LIU et al 2005
18 Proteiacutenas associadas ao cinetoplasto (KAPs)
Proteiacutenas que se ligam ao DNA tambeacutem foram identificadas na mitococircndria
de uma variedade de organismos eucarioacuteticos variando de levedura ateacute humanos
(MAIER et al 2001) Estas proteiacutenas satildeo codificadas no nuacutecleo da ceacutelula e satildeo poacutes-
traducionalmente importadas para a mitococircndria
Conceitualmente qualquer proteiacutena que se associe ao kDNA quer atuando
na replicaccedilatildeo e transcriccedilatildeo quer atuando na organizaccedilatildeo compactaccedilatildeo e
segregaccedilatildeo da rede pode ser chamada de KAP (KAP do inglecircs Kinetoplast-
33
Associated Protein) Observou-se que algumas dessas KAPs apresentam
caracteriacutesticas de proteiacutenas histonas H1 (H1 histone-like proteins) por serem
proteiacutenas pequenas (17 a 25 kDa) fortemente baacutesicas (pI de 11 a 125) interagindo
com a carga negativa das moleacuteculas de DNA e com grande conteuacutedo dos
aminoaacutecidos lisina e arginina elevado (aprox 30 a 50)
Proteiacutenas associadas com genoma mitochondrial (KAPs) dos
tripanosomatiacutedeos e que compartilham caracteriacutesticas com histonas H1 foram
inicialmente identificadas no cinetoplasto do tripanosomatiacutedeo de inseto Crithidia
fasciculata e denominadas de KAP1 a 5 As H1-KAPs de C fasciculata interagem
com miniciacuterculos (XU et al 1996) e desse modo podem facilitar a associaccedilatildeo
orientaccedilatildeo e organizaccedilatildeo dessas moleacuteculas na rede pela neutralizaccedilatildeo das cargas
negativas das moleacuteculas de DNA contribuindo para a condensaccedilatildeo organizaccedilatildeo e
segregaccedilatildeo da rede de kDNA Ateacute o momento foram caracterizadas quatro H1-KAPs
de C fasciculata (CfKAP1 2 3 and 4) Aleacutem das caracteriacutesticas de histona H1
possuem uma preacute-sequecircncia clivaacutevel de nove aminoaacutecidos em sua porccedilatildeo N-
terminal e que provavelmente estaacute envolvida no transporte da proteiacutena para o
cinetoplasto jaacute que natildeo aparece na proteiacutena madura (XU amp RAY 1993 XU et al
1996 HINES amp RAY 1998) Atraveacutes de ensaios de imunofluorescecircncia foi possiacutevel
confirmar que estas proteiacutenas estatildeo presentes em toda a rede de kDNA Pela
facilidade encontrada nas KAPs purificadas de condensar redes de kDNA in vitro
(XU et al 1996) sugere-se que estas estejam envolvidas na organizaccedilatildeo e
condensaccedilatildeo do kDNA in vivo (LUKES et al 2001)
As teacutecnicas de deleccedilatildeo de genes satildeo uma oacutetima ferramenta para elucidar as
possiacuteveis funccedilotildees que um gene pode apresentar Em C fasciculata foi utilizada a
teacutecnica de nocaute gecircnico para o gene Cfkap1 onde mutantes viaacuteveis foram
obtidos mostrando que a forma e a dimensatildeo do cinetoplasto natildeo foram alterados
ao contraacuterio da organizaccedilatildeo da rede de kDNA que passou a apresentar fibrilas de
DNA espessas e uma camada eleacutetron-densa no centro do disco Quando foi
realizada a reintroduccedilatildeo do gene na forma episomal o fenoacutetipo normal da rede de
kDNA foi restaurado (LUKES et al 2001) Tambeacutem foi realizado o duplo nocaute
dos genes Cfkap2 e Cfkap3 o qual da mesma maneira produziu mutantes viaacuteveis
poreacutem com o crescimento bastante reduzido uma reduccedilatildeo na respiraccedilatildeo e um
aumento nos niacuteveis de mRNAs codificados pelos maxiciacuterculos Apesar de todas
estas alteraccedilotildees o kDNA permaneceu inalterado mostrando que as proteiacutenas
34
CfKAP2 e CfKAP3 desempenham um papel diferente ao da CfKAP1 pois estatildeo
envolvidas com o metabolismo mitocondrial e proliferaccedilatildeo celular ao inveacutes de
estarem envolvidas na organizaccedilatildeo estrutural do kDNA (AVLIYAKULOV et al
2004)
Com base nesses estudos surgiu o interesse de nosso grupo no estudo de
KAPs em T cruzi visando verificar qual o papel dessas proteiacutenas na organizaccedilatildeo da
rede de kDNA e sua importacircncia nos diferentes estaacutegios do ciclo de vida do parasita
Atraveacutes de anaacutelises bioinformaacuteticas foram identificadas 6 diferentes H1-KAPs
codificadas no genoma do T cruzi levando em consideraccedilatildeo a similaridade com
KAPs de C fasciculata (CAVALCANTI et al 2009) Essas H1-KAPs foram
denominadas de KAP3 KAP4a KAP4b KAP4c KAP6 e KAP7 Nosso grupo iniciou
a caracterizaccedilatildeo das proteiacutenas TcKAP4 e TcKAP6 mostrando que elas se localizam
no cinetoplasto mas com padrotildees distintos de distribuiccedilatildeo dependendo da forma do
ciclo de vida do parasita (CAVALCANTI et al 2009) Mais recentemente mostramos
que o nocaute da TcKAP3 natildeo afeta a proliferaccedilatildeo diferenciaccedilatildeo e infectividade do
parasita (DE SOUZA et al 2010)
A complexidade da rede de kDNA sugere portanto que as diferentes KAPs
atuem em conjunto algumas vezes de modo redundante para desempenhar
funccedilotildees na condensaccedilatildeo replicaccedilatildeo segregaccedilatildeo dessa estrutura
35
2 OBJETIVOS
21 OBJETIVO GERAL
O objetivo principal deste trabalho eacute caracterizar a funccedilatildeo da TcKAP7 avaliando seu
papel na biologia do parasita
211 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS
a) Analisar a localizaccedilatildeo subcelular da TcKAP7 atraveacutes de ensaios de
imunofluorescecircncia
b) Produzir TcKAP7 recombinante em larga escala para ensaios de biologia
estrutural
c) Estudar a viabilidade do parasita na ausecircncia do gene TcKAP7 para os parasitas
viaacuteveis analisar morfologia e ultraestrutura do cinetoplasto multiplicaccedilatildeo
diferenciaccedilatildeo e infectividade
36
3 MATERIAIS E MEacuteTODOS
31 Reagentes e Soluccedilotildees Utilizados
311 Reagentes
AmershamBioscience dNTPs Hybond C Hybond N kit ECL de western blotting
filmes de raio-X Hyperfilmreg anticorpo monoclonal anti-Histidina
Bio-Rad Acrilamida Agarose (UltraPure DNA grade) Azul de Bromofenol Bis-
Acrilamida Persulfato de Amocircnia
Cult-lab RPMI 1640
Difco Baacutecto-Aacutegar Bactotriptona Extrato de levedura Infuso de fiacutegado Triptose
Invitrogen Inc EDTA Fenol TRIS Nick Translation kit Taq DNA polymerase
IPTG Agarose X-Gal DNA de λHindIII Marcador de massa molecular Benchmark
Alexa Fluacuteor 458 1 kb Plus DNA Ladder Soro Fetal Bovino T4 DNA ligase
Merck Acetato de Soacutedio Aacutecido Aceacutetico Glacial Cloreto de CaacutelcioCloreto de
Potaacutessio Cloreto de Soacutedio Etanol Absoluto Glicina Glicose Hidroacutexido de soacutedio
Isopropanol HCl Na2HPO4
New England Biolabs Endonucleases de restriccedilatildeo
Qiagen Qiaquick PCR Purification kit
Serva Electrophoresis Alu-Gel S
Sigma Acetato de amocircnia Ampicilina Brometo de Etiacutedeo BSA Kanamicina
Glicerol Hepes Cloreto de Magneacutesio Tetraciclina β-mercaptoetanol DEAE-
celulose Tween 20 adjuvante completo de Freund monoclonal M2 anti-FLAG
312 Tampotildees e Soluccedilotildees
PBS NaCl 137 mM KCl 27 mM Na2HPO4 43 mM e KH2PO4 15 mM
PSG Na2HPO4 (anidro) 4747 mM NaH2PO4 H2O 25 mM NaCl 3676 mM e
glicose 555 mM
Soluccedilatildeo de tripsinazaccedilatildeo tripsina 005 (mv) e EDTA 002 (mv) em PBS pH
80
37
Soluccedilatildeo de bloqueio para imunofluorescecircncia PBS e BSA 1 (albumina seacuterica
bovina)
Soluccedilatildeo de bloqueio para western blot TBST e leite em poacute desnatado 5
Soluccedilatildeo de lise para Toothpick NaOH 50 mM Glicerol 5 SDS 05 EDTA 5
mM e azul de bromofenol 0025
Soluccedilatildeo Ponceau S Ponceau S 05 em aacutecido aceacutetico 1
Soluccedilatildeo de coloraccedilatildeo para geacuteis de proteiacutena Coomassie blue R-250 01 em
metanolaacutecido aceacutetico (4510)
Soluccedilatildeo para descoloraccedilatildeo de geacuteis de proteiacutena Metanol 4 aacutecido aceacutetico 75
Tampatildeo de lise hipotocircnico Tris-HCl 10mM pH 75 NaCl 10mM MgCl2 5 mM β-
mercaptoetanol 5 mM
Tampatildeo A para cromatografia de afinidade Tris-HCl 20 mM pH 75 NaCl 500 mM
Tampatildeo B para cromatografia de afinidade Tampatildeo A contendo imidazol 1M
Tampatildeo B para cromatografia de troca iocircnica Tris-HCl 50 mM pH 80 NaCl 1M
Soluccedilatildeo de depurinaccedilatildeo para Southern blot HCl 025 M
Soluccedilatildeo desnaturante para Southern blot NaOH 05 M e NaCl 15 M
Soluccedilatildeo neutralizante para Southern blot Tris-HCl 05 M pH 75 e NaCl 15 M
Soluccedilatildeo Denhardt (50X) ficoll 05 polivinilpirrolidona 06 e albumina de soro
bovino 02
Soluccedilatildeo de hibridaccedilatildeo para Southern blot DNA de esperma de salmatildeo do tipo III
01 mgml fragmentado por ultra-som e desnaturado SSC 6X soluccedilatildeo de denhardt
6X e SDS 1
SSC 20X NaCl 3 M pH 70 e citrato de soacutedio 03 M
Soluccedilatildeo de baixa estringecircncia SSC 2X e SDS 01
Soluccedilatildeo de meacutedia estringecircncia SSC 1X e SDS 01
Soluccedilatildeo de alta estringecircncia SSC 01X e SDS 01
Tampatildeo de eletroporaccedilatildeo para T cruzi NaCl 140 mM HEPES (aacutecido) 25 mM e
Na2HPO4 074 mM pH 75
Tampatildeo ZPFM de eletroporaccedilatildeo de T brucei NaCl 129 mM KH2PO4 15mM KCl
8mM NaH2PO4 8mM MgCl2 15mM CaCl2 90 mM e CH3COONa 24 mM pH 70
Tampatildeo TELT Tris-HCl 50 mM pH 80 EDTA 625 mM pH 90 LiCl 25 M e Triton
X-100 4
Tampatildeo de amostra para DNA 10X Ficoll 400 25 azul de bromofenol 025 e
xileno cianol FF 025
38
Tampatildeo de amostra para proteiacutena 4X Tris-HCl 40 mM pH 68 SDS 1 β-
mercaptoetanol 25 glicerol 6 e azul de bromofenol 0005
Tampatildeo de eletroforese para SDS-PAGE 1X Tris-base 25 mM glicina 192 mM e
SDS 01
Tampatildeo de lise de bacteacuterias Tris-HCl 20 mM pH 75 NaCl 500 mM PMSF1 mM
Tampatildeo para transferecircncia (western blotting) 1X Tris-base 25 mM glicina 192
mM e metanol 20
Tampatildeo TBE Tris base 89 mM aacutecido boacuterico 89 mM e EDTA 2 mM
TBS Tris-HCl 20 mM pH 80 e NaCl 150 mM
TBST TBS e Tween 20 01
TE Tris-HCl 10 mM pH 80 e EDTA 1 mM
313 Meios de cultura
LB Triptona 1 extrato de levedura 5 e NaCl 1
Meio LIT (liver infusion tryptose) infuso de fiacutegado 05 NaCl 753 mM KCl 54
mM glicose 10 mM bacto-triptose 05 Na2HPO4 564 mM hemina 00025 soro
fetal bovino 10 e extrato de levedura 15 gl
Meio TAU NaCl 190 mM KCl 17 mM MgCl2 2 mM CaCl2 2 mM e tampatildeo fosfato 8
mM pH 60
Meio TAU3AAG meio TAU suplementado com L-prolina 10 mM glutamato soacutedico
50 mM aspartato soacutedico 2 mM e glicose 10 mM
32 Cultivo do Trypanosoma cruzi
Neste trabalho foi utilizado o clone Dm28c de T cruzi (CONTRERAS et al
1985 CONTRERAS et al 1988) nas formas epimastigota e tripomastigota
metaciacuteclico
321 Epimastigotas
Formas epimastigotas de T cruzi foram cultivadas em meio LIT (CAMARGO
1964) a 28 oC com passagens a cada trecircs dias e inoacuteculo de 1 x 106 ceacutelulasml As
formas epimastigotas foram coletadas por centrifugaccedilatildeo no terceiro dia de cultivo
39
(correspondente a fase logariacutetmica de crescimento baseada em curva de
crescimento realizada nas mesmas condiccedilotildees) quando a densidade celular
apresentava-se entre de 1 - 3 x 107 ceacutelulasml
322 Tripomastigotas metaciacuteclicos
As formas metaciacuteclicas foram obtidas atraveacutes do processo de diferenciaccedilatildeo
in vitro (BONALDO et al 1988) Formas epimastigotas em final de fase logariacutetmica
de crescimento (densidade celular entre 5 - 7 x 107 ceacutelulasml) foram coletadas por
centrifugaccedilatildeo a 7000 x g por 5 minutos a 10 oC e ressuspendidas em meio TAU
na concentraccedilatildeo de 5 x 108 ceacutelulasml e mantidas a 28 oC por 2 horas Apoacutes este
periacuteodo correspondente ao estresse nutricional as ceacutelulas foram transferidas para
garrafas de 300 cm2 contendo 200 ml de meio TAU3AAG (concentraccedilatildeo final de 5 x
106 ceacutelulasml) Uma proporccedilatildeo dos parasitas que se aderiram agrave superfiacutecie da
garrafa de cultivo se diferenciou em metaciacuteclicos os quais foram liberados no
sobrenadante (BONALDO et al 1988) Estas formas foram purificadas pela
passagem atraveacutes de uma coluna de afinidade contendo a resina DEAE celulose
equilibrada em PSG (SOUSA 1983) Este procedimento foi realizado com o tipo
selvagem para obtenccedilatildeo de extrato proteacuteico e tambeacutem com o mutante de T cruzi
para TcKAP7 para verificaccedilatildeo da capacidade de diferenciaccedilatildeo e infectividade onde
o nuacutemero de metaciacuteclicos no sobrenadante foi contado apoacutes 24 48 72 e 96 horas
da incubaccedilatildeo em meio TAU3AAG
33 Curva de crescimento de T cruzi
Formas epimastigotas de T cruzi clone Dm28c e do mutante de T cruzi para
TcKAP7 foram cultivadas como descrito no item 321 ateacute atingirem a fase
estacionaacuteria para a comparaccedilatildeo da taxa de crescimento de ambas Foram
inoculadas 1 x 106 epimastigotas por ml de meio LIT em garrafas de 25 cm2 e
incubadas em seguida a 28 degC Diariamente foi realizada a contagem das culturas
em cacircmaras de Neubauer em diluiccedilotildees apropriadas ateacute o deacutecimo dia O graacutefico da
curva de crescimento comparativa entre a cultura selvagem e a nocaute foi feito
utilizando o programa Microsoft Excel
40
34 Obtenccedilatildeo de DNA de T cruzi
A extraccedilatildeo de DNA foi realizada conforme descrito por Medina-Acosta amp
Cross (1993) Epimastigotas (1 x 107 ceacutelulas) foram coletadas por centrifugaccedilatildeo a
7000 x g por 5 min lavadas em PBS e ressuspendidas em 350 microl de tampatildeo TELT
Apoacutes 5 min de incubaccedilatildeo agrave temperatura ambiente foi adicionado agrave amostra 1
volume de fenolclorofoacutermio e o material foi centrifugado a 13000 x g por 5 min A
fase aquosa foi recolhida e o DNA foi precipitado com 2 volumes de etanol absoluto
e coletado por centrifugaccedilatildeo a 13000 x g por 10 min O DNA presente no sedimento
foi lavado com etanol 70 seco e em seguida ressuspendido em tampatildeo TE
contendo RNAse a 20 microgml
35 Obtenccedilatildeo de kDNA de T cruzi
A extraccedilatildeo do kDNA de T cruzi foi realizada de acordo com Morel e
colaboradores (1980) com modificaccedilotildees
Formas epimastigotas (1 x109 ceacutelulas) foram coletadas por centrifugaccedilatildeo a
4000 x g por 10 min lavadas em PBS e ressuspendidas em 20 ml de Tampatildeo de
Lise Hipotocircnico Posteriormente adicionou-se Sacarose 025 M e o material foi
centrifugado 6000 x g por 10 min O pellet foi ressuspendido em 20 ml de Tris-HCl
10 mM pH 75 NaCl 10 Mm EDTA 5 mM SDS 05 A esta soluccedilatildeo foi adicionado
100 ug de proteinase K e a mesma permaneceu a 37 ordmC durante a noite No dia
seguinte as ceacutelulas foram transferidas para uma seringa de 50 ml aonde ocorreu a
quebra mecacircnica do DNA nuclear Este material foi ultracentrifugado a 27000 rpm a
4ordm C durante 1 hora utilizando o rotor SW28 Apoacutes centrifugaccedilatildeo o sobrenadante foi
desprezado e o pellet ressuspendido em 25 ml de TE e novamente ultracentrifugado
nas mesmas condiccedilotildees Apoacutes centrifugaccedilatildeo o pellet foi ressuspendido em 1ml de TE
e foi realizada a purificaccedilatildeo por fenolclorofoacutermio Apoacutes purificaccedilatildeo o material foi
ressuspendido em 300 ul de TE e utilizado para ensaios de SAXS
36 Obtenccedilatildeo de extrato proteico de T cruzi
41
As ceacutelulas foram coletadas por centrifugaccedilatildeo (4000 x g 5 min a 10 degC) e
lavadas duas vezes em PBS pH 75 Apoacutes as lavagens os parasitas foram
ressuspendidos em PBS e tampatildeo de amostra 4x foi adicionado de tal maneira que
a concentraccedilatildeo final fosse de 1 x 106 ceacutelulas equivalentesmicrol Os extratos foram
fervidos por 5 min e armazenados a - 70 degC
37 Clonagem do gene TcKAP7
A sequecircncia do gene TcKAP7 (ID Tc00104705350871950) foi obtida a
partir do banco de dados do genoma do T cruzi disponiacutevel no portal da internet
wwwgenedborg e a sua regiatildeo codificante foi amplificada por PCR com os primers
KAP7F (5rsquo ndash AAAGGATCCATGCTAAGAACTGTTCTGCCACTG 3rsquo) e KAP7R (5rsquo ndash
TCAGCGTCGACTTATGACGGTGGTGCAGGATCAGCAGCTGCAGTATTTT3rsquo) a
partir do DNA genocircmico de T cruzi Dm28c As sequecircncias de reconhecimento das
enzimas de restriccedilatildeo BamHI e SalI (marcadas em negrito) foram adicionadas na
extremidade 5rsquo dos primers KAP7F e KAP7R respectivamente As condiccedilotildees da
reaccedilatildeo de PCR foram as seguintes 100 ng de DNA total T cruzi 10 pmol de cada
primer 200 μM de cada dNTP MgCl2 15 mM tampatildeo Taq DNA polimerase 1x 25
U de Taq DNA polimerase (Invitrogen) A reaccedilatildeo de PCR foi processada no
termociclador modelo 9700 (Applied Biosystems EUA) com a desnaturaccedilatildeo do
material por 4 min a 94 degC seguida de 30 ciclos constando de desnaturaccedilatildeo a 94 degC
por 30 s hibridizaccedilatildeo dos primers a 58 degC por 30 s e extensatildeo a 72 degC por 1 min O
material amplificado foi purificado usando o kit Qiaquick PCR Purification (Qiagen) e
digerido com as enzimas de restriccedilatildeo BamHI e SalI com uso de 20 U de cada
enzima e seus respectivos tampotildees em volume final de 20 μl por 4 h a 37 oC O
material foi novamente purificado e utilizado para ligaccedilatildeo com o vetor pET28a
previamente digerido com as respectivas enzimas Bacteacuterias E coli cepa DH5α
foram transformadas com a ligaccedilatildeo A seleccedilatildeo dos clones contendo plasmiacutedeo com
o inserto desejado foi realizada atraveacutes da teacutecnica de palitagem ou de PCR de
colocircnia
38 Obtenccedilatildeo do cDNA de TcKAP7 atraveacutes de ensaio de RT-PCR
42
Com o intuito de verificar a posiccedilatildeo do mini-exon no transcrito de TcKAP7
realizamos o ensaio de RT-PCR para a obtenccedilatildeo do cDNA de TcKAP7
O protocolo utilizado foi baseado no manual teacutecnico da Promega (ΙmProm-ΙΙ
Reverse Transcription System) assim como os reagentes utilizados para essa
reaccedilatildeo Aproximadamente 10 μg de RNA foram incubados com o oligonucleotiacutedeo
KAP7R por 10 min a 70 degC e imediatamente transferidos para o gelo Agrave mistura foi
adicionada uma soluccedilatildeo de dNTPs (concentraccedilatildeo final de 05 mM para cada dNTP)
MgCl2 (120 μM) RNAse OUT (2 unidades) (Invitrogen) Transcriptase reversa
ImProm-II e respectivo tampatildeo A reaccedilatildeo foi incubada por 2 h a 42 degC As amostras
de cDNA foram purificadas por Microcon YM-30 (Millipore) conforme descriccedilatildeo do
fabricante e armazenadas a -20 degC Posteriormente foi realizada uma reaccedilatildeo de
PCR utilizando as seguintes condiccedilotildees 10 ng do cDNA de TcKAP7 de T cruzi 10
pmol do primer ME (5rsquo-AACGCTATTATTGATACAGTTTCTGTACTATATTG -3rsquo) e 10
pmol do primer KAP7R 200 μM de cada dNTP MgCl2 15 mM tampatildeo Taq DNA
polimerase 1x 25 U de Taq DNA polimerase (Invitrogen) A reaccedilatildeo de PCR foi
processada no termociclador modelo 9700 (Applied Biosystems EUA) com a
desnaturaccedilatildeo do material por 3 min a 94 degC seguida de 35 ciclos constando de
desnaturaccedilatildeo a 94 degC por 30 s hibridizaccedilatildeo dos primers a 55 degC por 30 s e extensatildeo
a 72 degC por 1 min O material amplificado foi purificado usando o kit Qiaquick PCR
Purification (Qiagen) e clonado diretamente no vetor pGEMreg-T Easy (Promega)
Bacteacuterias E coli cepa TOP10Frsquo foram transformadas com a ligaccedilatildeo e os plasmiacutedeos
recombinantes foram selecionados pela teacutecnica da palitagem ou de PCR de colocircnia
(itens 391 e 392) Apoacutes a minipreparaccedilatildeo (item 310) o material foi submetido ao
sequenciamento de DNA usando o serviccedilo de sequenciamento da empresa
Macrogen (Coreacuteia do Sul)
39 Seleccedilatildeo dos clones recombinantes
391 Teacutecnica de palitagem (toothpick)
As colocircnias foram coletadas com o auxiacutelio de palitos de dente (toothpick)
esteacutereis e transferidas para o fundo de tubos de micro-centriacutefuga e para a superfiacutecie
do meio LB solidificado (com o antibioacutetico de seleccedilatildeo do plasmiacutedeo) para a obtenccedilatildeo
de uma reacuteplica das colocircnias que foram analisadas (placa-matildee) A cada um dos
43
tubos foram acrescentados 15 μl do tampatildeo de lise Os tubos foram incubados em
banho-maria a 65 degC por 10 min As amostras entatildeo foram analisadas por
eletroforese em gel de agarose 1 usando o plasmiacutedeo sem inserto como controle
Posteriormente o gel foi corado com brometo de etiacutedeo (05 μgml) por
aproximadamente 20 min lavado com aacutegua e analisado sob luz ultravioleta para em
seguida ser fotografado no sistema de fotodocumentaccedilatildeo L-Pix (Locus
Biotecnologia Brasil)
392 Teacutecnica de PCR de colocircnia
Depois de selecionadas as colocircnias foram transferidas para tubos de PCR
contendo os reagentes da PCR e os primers que hibridizam com regiotildees que
flanqueiam o fragmento de DNA clonado em um volume total de 10 microl As amostras
foram incubadas a 94 degC por 3 min e submetidas a 35 ciclos de PCR com as
seguintes etapas 94 degC por 30 s 55 degC por 30 s e 72 degC por 1 min finalizando com
uma etapa de extensatildeo a 72 degC por 10 min Os produtos amplificados foram
analisados em gel de agarose 1 Posteriormente o gel foi corado com brometo de
etiacutedeo (05 microgml) por aproximadamente 20 min lavado com aacutegua e analisado sob
luz ultravioleta O gel foi fotografado no sistema de foto-documentaccedilatildeo L-Pix (Locus
Biotecnologia Brasil)
310 Preparaccedilatildeo de plasmiacutedeo em pequena escala (miniprep)
Os clones recombinantes foram cultivados em 3 ml de meio LB contendo o
antibioacutetico apropriado durante 18 h As culturas foram entatildeo centrifugadas a 12000
x g por 1min a temperatura ambiente e os plasmiacutedeos recombinantes purificados
com o sistema de minipreparaccedilatildeo de plasmiacutedeo (Miniprep Qiagen Kit) (QIAGEN) de
acordo com as recomendaccedilotildees do fabricante
311 Expressatildeo da proteiacutena TcKAP7 em E coli
Para expressar a proteiacutena recombinante TcKAP7 E coli cepa
BL21(DE3)STAR transformada com o plasmiacutedeo pET28a contendo o gene TcKPA7
(pET28a-TcKAP7) foi cultivada em meio LB contendo 25 μgml do antibioacutetico
44
kanamicina a 37 ordmC sob agitaccedilatildeo (preacute-inoacuteculo) Apoacutes 18 horas de crescimento uma
diluiccedilatildeo (110) foi realizada em novos tubos contendo meio LB-kanamicina e a
cultura foi incubada por 1 h a 37 ordmC sob agitaccedilatildeo constante Apoacutes este periacuteodo 05
mM IPTG (isopropil-1-tio-β-D-galactopiranosideo) foi adicionado agraves culturas A
incubaccedilatildeo prosseguiu por mais 3 h nas mesmas condiccedilotildees Como controle negativo
as ceacutelulas tambeacutem foram cultivadas nas mesmas condiccedilotildees poreacutem sem a adiccedilatildeo de
IPTG (cultura natildeo induzida) Aliacutequotas das culturas induzidas e natildeo induzidas com
IPTG foram processadas para anaacutelise em SDS-PAGE
312 Purificaccedilatildeo da proteiacutena recombinante TcKAP7
3121 Processamento da amostra
As bacteacuterias apoacutes a expressatildeo de TcKAP7 foram sedimentadas por
centrifugaccedilatildeo e ressuspendidas em tampatildeo de lise e lisadas utilizando o
microfluidificador modelo M-110L (Microfluidics EUA) Este meacutetodo divide a amostra
em dois fluxos e os conduz sob alta pressatildeo gerada por uma vaacutelvula pneumaacutetica
para uma cacircmara de interaccedilatildeo tambeacutem chamada de aacuterea de choque Esta cacircmara
eacute formada por um sistema de micro-canais dentro de um bloco de ceracircmica Dentro
da cacircmara ocorre cavitaccedilatildeo sonicaccedilatildeo e impacto dos dois fluxos em que a amostra
foi dividida levando a lise das ceacutelulas bacterianas (FIGURA 9) Este processo
provoca o aumento da temperatura e todo o sistema de tubos que conduz a amostra
necessita ser refrigerado com gelo e aacutegua a 4degC para prevenir a precipitaccedilatildeo de
proteiacutenas soluacuteveis
45
FIGURA 9 - REPRESENTACcedilAtildeO ESQUEMAacuteTICA DO MICROFLUIDIFICADOR LEGENDA A suspensatildeo de bacteacuterias eacute dividida em dois fluxos que se chocam sob alta pressatildeo dentro de micro-canais presentes na cacircmara de interaccedilatildeo da vaacutelvula homogeneizadora Melhores resultados satildeo obtidos aumentando o nuacutemero de ciclos de passagens Seta preenchida direccedilatildeo da amostra Seta pontilhada repetindo o ciclo de passagem FONTE Modificado de MAA amp HSU 1999
Apoacutes a lise o extrato soluacutevel foi obtido apoacutes centrifugaccedilatildeo a 30000 x g por
30 min a 4 degC
3122 Cromatografia de afinidade
Por ser expressa fusionada a uma cauda de seis histidinas a proteiacutena
TcKAP7 pode ser separada dos extratos celulares a partir da utilizaccedilatildeo de resina de
niacutequel da qual posteriormente a proteiacutena seraacute eluiacuteda
A purificaccedilatildeo da proteiacutena TcKPA7 presente no sobrenadante foi realizada
em sistema FPLC (Fast Performance Liquid Chromatography ndash GE Healthcare) com
coluna HiTrap Chelating de 1 mL (GE Healthcare) A coluna foi carregada com
soluccedilatildeo NiSO4 100 mM e equilibrada com tampatildeo A para cromatografia de afinidade
Durante a purificaccedilatildeo foi utilizado um gradiente de 0-100 de tampatildeo B para
cromatografia de afinidade As fraccedilotildees provenientes da cromatografia foram
analisadas atraveacutes de SDS-PAGE
Suspensatildeo de bacteacuterias
Ceacutelulas lisadasBomba de
alta pressatildeo
Micro-canais
Vaacutelvula homogeneizadora
46
3123 Cromatografia de troca iocircnica
Para eliminar contaminantes remanescentes da cromatografia de afinidade
a amostra contendo a proteiacutena de interesse foi submetida a uma segunda etapa
cromatograacutefica cromatografia de troca iocircnica utilizando-se a coluna HiTraptrade SP (GE
Healthcare) no sistema de FPLC (GE Healthcare)
Primeiramente a amostra foi diluiacuteda para reduccedilatildeo da concentraccedilatildeo salina e
a coluna foi lavada com 2 volumes de tampatildeo B para cromatografia de troca iocircnica e
depois com 2 volumes de tampatildeo A utilizado na cromatografia de afinidade O
gradiente de passagem do tampatildeo B foi de 0 a 100 e a proteiacutena TcKAP7 foi
obtida na fraccedilatildeo de material natildeo ligado agrave resina (Flow-through) (FT)
3124 Cromatografia de gel filtraccedilatildeo
Amostras da cromatografia de troca iocircnica que continham a proteiacutena de
interesse foram concentradas atraveacutes de filtraccedilatildeo A soluccedilatildeo foi colocada em filtro
Amicon Ultra MWCO 10000 (Milipore) e centrifugada a 4000 rpm a 4 ordmC O
experimento foi realizado em sistema FPLC (GE Healthcare) com a coluna
Superdex 200 HR 1030 (GE Healthcare) em tampatildeo HEPES 20 mM pH 74 e de
cloreto de soacutedio100 mM
313 Espalhamento Dinacircmico de Luz ndash DLS
O experimento foi realizado em equipamento DynaPro Molecular instrument
a 4 ordmC As amostras foram previamente centrifugadas por 5 minutos a 15000 rpm a
4 ordmC A coleta de dados foi realizada com intervalos de 2 segundos com 100
aquisiccedilotildees Para cada leitura utilizou-se 5 microl de amostra proteica
314 Espectroscopia de dicroiacutesmo circular (CD)
O espectro de CD foi coletado usando espectropolariacutemetro Jasco J-715
(Jasco Corporation Toacutekio Japatildeo) sendo a temperatura mantida a 20 degC atraveacutes de
um Peltie rType Control System PFD425S (JASCO) Todos os dados foram
coletados usando cubeta de quartzo de 1 mm de caminho oacuteptico
47
Mediu-se a elipticidade em graus na regiatildeo do UV distante no intervalo de
comprimento de onda de 260 nm a 200 nm com uma velocidade de 100 nmmin
sendo feitas no total 30 leituras com resposta de 1 segundo em varredura contiacutenua
Os valores obtidos em miligraus foram convertidos para elipticidade molar
por resiacuteduo ([θ]MRW) em miligrauscm2dmol-1 que eacute definida pela equaccedilatildeo (Adler et
al 1973)
Onde θobs eacute a elipsidade observada em graus MRW eacute o peso molecular
meacutedio dos resiacuteduos da proteiacutena d eacute o caminho oacuteptico da cubeta em centiacutemetros e c
eacute a concentraccedilatildeo da proteiacutena em mgmL O MRW eacute calculado dividindo-se o peso
molecular da proteiacutena pelo nuacutemero de resiacuteduos
315 Quantificaccedilatildeo e concentraccedilatildeo
As amostras obtidas a partir da purificaccedilatildeo tiveram a concentraccedilatildeo calculada
utillizando a absorbacircncia mensurada pelo aparelho NanoDrop (Thermo Fisher
Scientific) levando-se em consideraccedilatildeo o coeficiente de extinccedilatildeo e teoacuterico da
proteiacutena obtido a partir do ProtParam (httpusexpasyorgtoolsprotparamhtml) e o
peso molecular da proteiacutena que eacute de cerca de 28 kDa
Obtidas as concentraccedilotildees a amostra foi concentrada pelo meacutetodo de
filtraccedilatildeo utilizando o filtro Amiconreg Ultra Centrifugal Filter (Millipore) com poro de
10000 Da A amostra foi centrifugada ateacute a obtenccedilatildeo de uma concentraccedilatildeo final de
5 mgml para os ensaios de cristalizaccedilatildeo Uma aliacutequota da proteiacutena concentrada foi
utilizada para anaacutelise por SDS-PAGE
316 Ensaios de Cristalizaccedilatildeo
Os ensaios de cristalizaccedilatildeo foram realizados empregando-se a teacutecnica de
difusatildeo de vapor em gota sentada utilizando-se os equipamentos disponiacuteveis no
Laboratoacuterio Robotizado de Cristalizaccedilatildeo de Proteiacutenas LNBio Os ensaios foram
feitos em placas de 96 poccedilos e as gotas preparadas pelo robocirc Honeybee
utilizando-se os kits disponiacuteveis no laboratoacuterio Crystal Screen HT (Hampton
Research) JCSG+ Suite (Molecular Dimensions) PACT Suite (Molecular
cd
MRWobs
10][
48
Dimensions) Precipitant Synergy (Rigaku Reagents) SaltRx HT (Hampton
Research) Wizard IampII (Rigaku Reagents)
317 Espalhamento de raio-X a baixo acircngulo (SAXS)
Atraveacutes da teacutecnica de SAXS informaccedilotildees sobre a massa molecular das
partiacuteculas espalhadoras e do raio de giro (Rg) da proteiacutena de estudo satildeo obtidos a
partir dos dados coletados Por meio de programas computacionais como DAMMIN
(SVERGUN1999) e GASBOR (SVERGUN et al 2001) um modelo de baixa
resoluccedilatildeo da forma da proteiacutena pode ser obtido
Os dados de SAXS foram obtidos na linha de luz D02A ndash SAXS2 no
Laboratoacuterio Nacional de Luz Siacutencrotron (LNLS) Campinas-SP Brasil usando
comprimento de onda de 148 A e um detector bidimensional com arranjo CCD
(MARCCD USA) de 165 mm A distacircncia do detector para a amostra foi de 106804
mm e os dados na faixa de 002 nm-1 para 021 nm-1 foram coletados usando
proteiacutena pura nas concentraccedilotildees de 5 mgml em tampatildeo em 20 mM HEPES pH 74
e 100 mM de cloreto de soacutedioExposiccedilotildees de 300 e 600 s foram realizadas e os
dados do tampatildeo foram coletados antes e depois dos dados da amostra para fazer a
correccedilatildeo do solvente e normalizaccedilatildeo do espalhamento
Ajuste dos dados experimentais e avaliaccedilatildeo da funccedilatildeo p(R) foram realizados
utilizando o programa GNOM (SVERGUN 1992) O envelope a baixa resoluccedilatildeo de
TcKAP7 foi determinado usando modelagem abnitio implementada no programa
DAMMIN O modelo a baixa resoluccedilatildeo e o modelo da estrutura tridimensional foram
superpostas usando o programa SUPCOMB (KOZIN amp SVERGUN 2001)
318 Modelagem de TcKAP7
Um modelo da estrutura tridimensional de TcKAP7 foi construiacutedo Para a
construccedilatildeo do modelo foi utilizado o programa MODELLER (SALI amp BLUNDELL
1993) este programa eacute utilizado para a modelagem por homologia a estruturas
tridimensionais de proteiacutenas O programa automaticamente constroacutei um modelo
baseado na anaacutelise de um alinhamento de sequecircncias entre a proteiacutena para a qual
se deseja construir o modelo e uma proteiacutena relacionada cuja estrutura
tridimensional jaacute foi resolvida A qualidade do modelo pode ser avaliada por
49
exemplo atraveacutes de graacuteficos e tabelas que analisam restriccedilotildees quiacutemicas e fiacutesicas de
cada aacutetomo constituinte do modelo
319 Obtenccedilatildeo de antissoro policlonal contra TcKAP7
A proteiacutena TcKPA7 recombinante purificada foi inoculada em camundongos
da linhagem BALBc por via intraperitonial com 4 aplicaccedilotildees de aproximadamente
20-50 μg de antiacutegeno em intervalos de 15 dias seguida de obtenccedilatildeo do soro apoacutes 1
semana da uacuteltima inoculaccedilatildeo O antiacutegeno foi emulsificado em adjuvante completo de
Freund na primeira inoculaccedilatildeo e com adjuvante a base de hidroacutexido de alumiacutenio
(Alu-Gel Serva) nas inoculaccedilotildees posteriores
320 Anaacutelise da expressatildeo do gene TcKAP7 e de seu mutante por ensaio tipo
western blot
Este procedimento foi executado segundo o meacutetodo de Towbin e
colaboradores (1979) Aliacutequotas de extratos de T cruzi equivalentes a 1 x 107
ceacutelulas foram submetidos agrave SDS-PAGE Apoacutes a separaccedilatildeo eletroforeacutetica as
proteiacutenas foram transferidas para membrana de nitrocelulose (Hybond C Amersham
Biosciences) em tampatildeo de western por 2 h a 60 V ou 20 V por 16 h Apoacutes a
transferecircncia a membrana foi corada com Ponceau S e descorada suavemente com
aacutegua bidestilada para a identificaccedilatildeo das bandas do marcador de massa molecular
A membrana foi entatildeo incubada em soluccedilatildeo de bloqueio por 30 min sob agitaccedilatildeo
suave
Apoacutes o bloqueio a membrana foi incubada com os soros policlonais ou
anticorpos monoclonais em TBST-leite por aproximadamente 1 h a 37degC A
membrana foi lavada 5 vezes com TBST Em seguida a membrana foi incubada
com anticorpo secundaacuterio anti-IgG de camundongo conjugado com a enzima
peroxidase (Pierce ndash Thermo Scientific) por 1h na diluiccedilatildeo de 16000 em TBST-leite
a temperatura ambiente A membrana foi submetida a mais cinco lavagens com
TBST e a reaccedilatildeo era evidenciada utilizando substrato quimioluminescente (West
Pico Pierce ndash ThermoScientific) sobre a membrana a qual era exposta a um filme
para raios-X (Hyperfilm ECL GE)
50
321 Superexpressatildeo de TcKAP7
3211 Amplificaccedilatildeo e clonagem do gene TcKAP7 no vetor pNEO3xFlag para
superexpressatildeo da proteiacutena
O gene TcKAP7 foi clonado no vetor pNEO3xFLAG construiacutedo no nosso
laboratoacuterio a partir do vetor pTcGW-ProtCcarboxi (BATISTA et al 2010) que utiliza
o sistema Gateway de clonagem (Invitrogen) Os vetores foram construiacutedos
utilizando-se como base o pBluescript II (Stratagene San Diego USA) onde foram
inseridas trecircs sequencias que codificam para regiotildees intergecircnicas (IR) de T cruzi A
primeira TcUIR eacute a regiatildeo intergecircnica do locus de ubiquitinacalmodulina de T
cruzi (BATISTA et al 2010) As outras duas regiotildees intergecircnicas ITR1 e ITR2 foram
selecionadas a partir de genes de copia uacutenica no genoma e que possuem um niacutevel
de expressatildeo constitutivo nos estaacutegios epimastigota e tripomastigota metaciclicos
avaliados por dados de proteocircmica e RNAseq (Comunicaccedilatildeo pessoal Michel
Batista) Aleacutem disso esse vetor confere agrave regiatildeo C-terminal da proteiacutena
recombinante resultante da clonagem neste vetor trecircs etiquetas FLAG (sequecircncia
DYKDDDDK) em tandem (FIGURA 10)
FIGURA 10 VETOR PARA EXPRESSAtildeO EM T CRUZI P3XFLAG
LEGENDA PR ndash PROMOTOR RIBOSOMAL TCUIR ITR1 E ITR2 - REGIOtildeES INTERGENICAS ATTR1 E ATTR2 ndash REGIOtildeES PARA RECOMBINACcedilAtildeO CMreg - RESISTEcircNCIA A CLORANFENICOL CCDB ndash GENE PARA SELECcedilAtildeO NEGATIVA DURANTE A CLONAGEM 3XFLAG ndash TREcircS ETIQUETAS DE FLAG (DYKDDDDK) NEOMICINA ndash GENE DE RESISTEcircNCIA A NEOMICINA
O gene TcKAP7 foi amplificado utilizando os primers especiacuteficos
KAP7GtwFor (5rsquo-
GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTGCCCGCGAAGTATTCAGCAGCCC)
e KAP7GtwRev (5rsquo-
GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCGTGGTACATGGCGTACGGGTTG)
PR TcUIR Att R1 Cmreg ccdB Att R2 3x Flag ITR1 Neomicina ITR2
51
os quais possuem os siacutetios attB indicados em negrito As condiccedilotildees desta reaccedilatildeo
de PCR foram as seguintes 100 ng de DNA genocircmico de T cruzi 10 pmol de cada
primer 200 μM de cada dNTP MgSO4 2 mM tampatildeo Taq DNA polimerase High
Fidelity 1x 1U de Platinum Taq DNA polimerase high fidelity (Invitrogen) A reaccedilatildeo
de PCR foi processada no termociclador modelo 9700 (AppliedBiosystems EUA)
com a desnaturaccedilatildeo do material por 5 min a 94 degC seguida de 35 ciclos constando
de desnaturaccedilatildeo a 94 degC por 30 s hibridizaccedilatildeo dos primers a 58 degC por 30 s e
extensatildeo a 72 degC por 15 min
O gene amplificado foi clonado no vetor de entrada pDONRtrade221
(Invitrogen) A reaccedilatildeo foi feita com 150 ng dos produtos de PCR contendo os siacutetios
attB 150 ng do plasmiacutedeo pDONRtrade221 1 μL de BP ClonaseTM enzyme mix e TE
para um volume final de 10 μL e com incubaccedilatildeo a 25 degC por 16 h Foi entatildeo
adicionado 1 microL de proteinase K (2 mgmL) com incubaccedilatildeo por 10 min a 37 degC Os
clones em pDONRtrade221 foram transformados em ceacutelulas caacutelcio-competentes E coli
DH5α conforme protocolo de transformaccedilatildeo de ceacutelulas caacutelcio-competentes Apoacutes
transformaccedilatildeo a cultura foi semeada em placa de LBKan (kanamicina 25 microgmL) e
incubada a 37 degC durante 16 h
Para verificar a presenccedila de clones com os insertos de interesse foi feita a
teacutecnica da palitagem As colocircnias selecionadas foram inoculadas em 5 mL de meio
LBKan e incubadas por 16 h a 37 degC com agitaccedilatildeo (190 rpm) A purificaccedilatildeo dos
plasmiacutedeos foi realizada com o kit QIAprepreg Spin Miniprep (Qiagen) conforme
orientaccedilotildees do fabricante
Apoacutes esta etapa foi necessaacuterio transferir os insertos para o vetor de destino
pNEO3xFlag A troca de insertos entre os vetores de entrada e destino denominada
de reaccedilatildeo LR foi realizada conforme orientaccedilotildees do fabricante (Gateway LR clonase
enzyme mix) e ceacutelulas caacutelcio-competentes foram transformadas com os produtos
das recombinaccedilotildees conforme descrito anteriormente semeadas em placas de
LBAmp e incubadas a 37 degC durante 16 h
A verificaccedilatildeo de clones positivos foi realizada atraveacutes de PCR de colocircnias
As colocircnias selecionadas foram inoculadas em 5 mL de meio LB contendo ampicilina
(100 μgmL) e incubada a 37deg C por 16 h sob agitaccedilatildeo (200 rpm)O plasmiacutedeo
contendo o gene TcKAP7 foi denominado de pNEO_KAP7_3xFLAG
52
3212 Transfecccedilatildeo por eletroporaccedilatildeo
A transfecccedilatildeo das formas epimastigotas de T cruzi foi feita pela teacutecnica de
eletroporaccedilatildeo utilizando o equipamento genepulserreg apparatus (Bio-Rad) e cubetas
esteacutereis de eletroporaccedilatildeo gene pulsermicro pulserreg 02 cm (Bio-Rad) Formas
epimastigotas de T cruzi foram cultivadas em meio LIT ateacute uma densidade celular
de 3 x 107 ceacutelulasml Um volume de cultura correspondendo a 1 x 109 parasitas foi
centrifugado (4000 x g 4 degC) O sobrenadante foi descartado e as ceacutelulas foram
ressuspendidas em tampatildeo de eletroporaccedilatildeo esteacuteril e submetidas a centrifugaccedilatildeo
nas condiccedilotildees acima O sedimento celular foi ressuspendido em 2 ml de tampatildeo de
eletroporaccedilatildeo Em cubetas de eletroporaccedilatildeo previamente resfriadas a 4 degC foram
misturados 400 μL (2 x 108 ceacutelulas) da suspensatildeo dos parasitas e 50 μL (20 microg) do
plasmiacutedeo para superexpressatildeo (pNEO_KAP7_3XFLAG) Em paralelo parasitas
foram submetidos agraves mesmas condiccedilotildees mas na ausecircncia de DNA (controle
negativo da transfecccedilatildeo)
As cubetas foram entatildeo mantidas em gelo por 10 min Em seguida os
parasitas foram transfectados com dois pulsos sequenciais de 500 μF e 450 volts
Apoacutes o esse procedimento as cubetas foram mantidas em gelo por mais 5 min A
suspensatildeo de parasitas transfectados foi entatildeo inoculada em 10 mL de meio LIT
suplementado com 10000 U de penicilina e estreptomicina a 10 μgmL
3213 Seleccedilatildeo dos transfectantes
O gene para a enzima neomicina fosfotransferase foi utilizado como
marcador de seleccedilatildeo dos parasitas carregando o plasmiacutedeo para a superexpressatildeo
pNEO_KAP7_3XFLAG Para tanto o antibioacutetico G418 foi adicionado agraves culturas
apoacutes 24 h da transfecccedilatildeo na concentraccedilatildeo final de 500 μgmL Entre 3 e 4 dias apoacutes
a transfecccedilatildeo foi realizada a primeira passagem (14) A partir desse ponto foram
feitas passagens semanais na proporccedilatildeo de 110 ateacute que natildeo fosse observado
crescimento nas duas uacuteltimas passagens da cultura do controle negativo da
transfecccedilatildeo
A expressatildeo da proteiacutena KAP7-FLAG foi analisada atraveacutes de ensaios de
western blot e imunofluorescecircncia
53
322 Deleccedilatildeo do gene TcKAP7 por nocaute gecircnico
3221 Amplificaccedilatildeo e clonagem das regiotildees a montante e a jusante do gene
TcKAP7
As regiotildees a montante (upstream) e a jusante (downstream) do gene TcKAP7
respectivamente denominadas de UPSKAP7 (521 pb) e DOWNKAP7 (500 pb)
foram amplificadas por PCR usando os primers descritos nas TABELAS 1 E 2 A
regiatildeo denominada DOWNKAP7 conteacutem ainda 139 pb do final da regiatildeo codante de
TcKAP7
QUADRO 1 - RELACcedilAtildeO DOS PRIMERS UTILIZADOS PARA A CLONAGEM DA
REGIAtildeO UPSTREAM DE TcKAP7 NO VETOR pNEO1
UPSKAP7F GGGGTCGACCGTTGCTGGTTTTTCTTTTGGTGT
UPSKAP7R GGGAAGCTTGCTTCAAAACGTCTATGCGGGC
Os siacutetios das enzimas de restriccedilatildeo SalI (GTCGAC) e HindIII (AAGCTT) adicionados aos primers estatildeo em negrito
QUADRO 2 - RELACcedilAtildeO DOS PRIMERS UTILIZADOS PARA A CLONAGEM DA
REGIAtildeO DOWNSTREAM DE TcKAP7 NO VETOR pNEO1
DOWNKAP7F GGGGAATTCGCCTCATATGACGCATCTCCCA
DOWNKAP7R GGGGGATCCTGTTGGCGCTGTCAAGGAAGTAAG
Os siacutetios das enzimas de restriccedilatildeo EcoRI (GAATTC) e BamHI (GGATCC) adicionados aos primers estatildeo em negrito
As reaccedilotildees de PCR foram realizadas nas seguintes condiccedilotildees 100 ng de
DNA total de T cruzi Dm28c 10 pmol dos oligonucleotiacutedeos F e R 200 μM de cada
dNTP MgCl2 15 mM tampatildeo Taq DNA polimerase 1x 25 unidades de Taq DNA
polimerase (Invitrogen EUA) A reaccedilatildeo de PCR foi processada no termociclador
modelo 9700 (Applied Biosystems EUA) nas seguintes condiccedilotildees Desnaturaccedilatildeo do
54
material por 4 min a 94 degC seguida de 35 ciclos de desnaturaccedilatildeo a 92 degC por 30 s
hibridizaccedilatildeo dos oligonucleotiacutedeos a 56 degC por 30 s e extensatildeo a 72 degC por 1 min O
material amplificado foi purificado usando o Qiaquick PCR Purification (Qiagen) O
DNA purificado foi digerido com enzimas de restriccedilatildeo apropriadas para a clonagem
dos fragmentos nos vetores pNEO1 O plasmiacutedeo resultante da clonagem das
regiotildees UPSKAP7 e DOWNKAP7 foi denominado de pNEO1kap7 (Figura 11A)
Uma vez que o genoma do T cruzi eacute diploide construiacutemos um segundo
plasmiacutedeo para o nocaute do segundo alelo do gene TcKAP7 tendo como marca de
seleccedilatildeo o gene que codifica resistecircncia a higromicina B Esse plasmiacutedeo foi
construiacutedo usando como molde o plasmiacutedeo pNEO1kap7 O plasmiacutedeo pNEO1kap7
foi digerido com HindIII para remoccedilatildeo do gene neo e uma pequena porccedilatildeo da regiatildeo
DOWNSTREAM (220 pb) O plasmiacutedeo linearizado foi purificado do gel de agarose
usando o kit Qiaquick PCR Purification (Qiagen) e ligado com o gene higro O gene
higro foi amplificado usando os primers HIGROF
(GGGGGAAGCTTATGAAAAAGCCTGAACTCACCGCGAC) e HIGROR
(GGGAAGCTTCTATTCCTTTGCCCTCGGACGAGTGCTG) ambos contendo na
extremidade 5rsquo o siacutetio para a enzima de restriccedilatildeo HindIII (em negrito) O plasmiacutedeo
resultante da ligaccedilatildeo foi denominado de pHIGRO1kap7 (FIGURA 11B)
55
FIGURA 11 ESQUEMA DA CONSTRUCcedilAtildeO DOS VETORES UTILIZADOS PARA O NOCAUTE DO GENE TcKAP7 LEGENDA Nesta figura eacute observada a inserccedilatildeo das sequecircncias flanqueadoras do gene TcKAP7 juntamente com os respectivos siacutetios para cada enzima de restriccedilatildeo nos vetores de clonagem pNEO1 e pHIGRO1
3222 Amplificaccedilatildeo dos cassetes UPS-NEO-DOWN e UPS-HIGRO-DOWN para
transfecccedilatildeo de T cruzi
Os dois plasmiacutedeos recombinantes foram purificados pelo meacutetodo da lise
alcalina utilizando o kit de minipreparaccedilatildeo de plasmiacutedeos (Qiagen) As minipreps
foram utilizadas para a amplificaccedilatildeo da regiatildeo UPS-NEO-DOWN (cassete NEO) e da
regiatildeo UPS-HIGRO-DOWN (cassete HYG) por PCR usando os primers UPSKAP7F
e DOWNKAP7R As reaccedilotildees de PCR foram realizadas nas seguintes condiccedilotildees 20
ng do plasmiacutedeo pNEO1kap7 ou pHIGRO1kap7 10 pmol dos primers UPSKAP7F e
DOWNKAP7R 200 μM de cada dNTP MgCl2 15 mM tampatildeo Taq DNA polimerase
1x 25 unidades de Taq DNA polimerase (Invitrogen EUA) A reaccedilatildeo de PCR foi
processada no termociclador modelo 9700 (AppliedBiosystems EUA) nas seguintes
condiccedilotildees Desnaturaccedilatildeo do material por 4 min a 94 degC seguida de 35 ciclos de
desnaturaccedilatildeo a 92 degC por 30 s hibridizaccedilatildeo dos oligonucleotiacutedeos a 56 degC por 30 s e
56
extensatildeo a 68 degC por 2 min O material amplificado foi submetido agrave eletroforese em
gel preparativo de agarose 1 O gel foi corado com brometo de etiacutedeo (1 μgml) e a
banda correspondente a cada cassete foi removida do gel com auxiacutelio de uma
lacircmina de bisturi O DNA foi purificado por eletroeluiccedilatildeo dentro de saco de diaacutelise
nas condiccedilotildees de 100 V por 1 hora em tampatildeo TBE Para obter massa de DNA
suficiente para a transfecccedilatildeo (20 μg) foram feitas 10 reaccedilotildees de PCR com 100 μl
cada uma
3223 Transfecccedilatildeo do T cruzi com o cassete UPS-NEO-DOWN
Formas epimastigotas de T cruzi foram cultivadas em meio LIT ateacute 2 x 107
ceacutelulasml Os parasitas (1 x 108 ceacutelulas) foram coletados por centrifugaccedilatildeo a 6000
x g por 10 min a 4 degC O sedimento celular foi lavado com PBS esteacuteril e
ressuspendido em 1 ml de soluccedilatildeo de eletroporaccedilatildeo Volumes correspondentes a
04 ml da suspensatildeo de ceacutelulas foram transferidos para cubetas de eletroporaccedilatildeo
esteacutereis (02 cm de gap) (BioRad) e preacute-resfriadas Em uma delas foram adicionados
de 20 μg do fragmento representando o cassete NEO A outra cubeta contendo
apenas a suspensatildeo de parasitas foi usada como controle Apoacutes 10 minutos no gelo
as amostras contidas nas cubetas foram submetidas a 2 pulsos de 450 volts 500
microF utilizando o eletroporadorGenePulserreg IIApparatus (Bio-Rad) As amostras
foram incubadas novamente por 5 a 10 minutos no gelo em seguida foram
transferidas para garrafas de cultura de 25 cm2 contendo 10 ml de meio LIT
(suplementado com 10000 U de penicilina e estreptomicina a 10 mgml) As culturas
foram entatildeo incubadas a 28 degC Apoacutes 24 horas de incubaccedilatildeo adicionou-se o
antibioacutetico G418 na concentraccedilatildeo de 500 μgml As culturas foram mantidas por
sucessivas passagens (diluiccedilatildeo de 110) em meio LIT suplementado com G418 a
cada 8-10 dias ateacute a ausecircncia de proliferaccedilatildeo celular na cultura controle Os
parasitas nos quais TcKAP7 foi substituiacutedo pelo gene neo foram denominados deT
cruzi(kap7kap7neo) e foram testados para a correta inserccedilatildeo do gene neo no locus
genocircmico de TcKAP7
57
3224 Extraccedilatildeo de DNA dos transfectantes
T cruzi transfectado com o cassete NEO (T cruzi(kap7kap7neo) foi cultivado
em meio LIT suplementado com G418 (500 μgml) ateacute uma densidade de 3 x 107
ceacutelulasml Os parasitas foram coletados por centrifugaccedilatildeo por 1 min a 6000 x g e
lavados com PBS Em seguida os parasitas foram lisados gentilmente em 350 μl de
tampatildeo TELT conforme descrito no item 34
3225 Anaacutelise por PCR do DNA dos parasitas transfectados com o cassete
UPS-NEO-DOWN
As reaccedilotildees de PCR foram realizadas utilizando primers externos EXTF
(CCCGCTACGACTGCCCTCCACGCGGAAGGGAA) e EXTR
(AAGTAAACGGGAGAAGCAACACGATGGGAGGCTC) que natildeo estatildeo presentes na
construccedilatildeo do cassete UPS-NEO-DOWN combinados com os primers NEOF
(GGGGAAGCTTATGATTGAACAAGATGGATTGCACGCAG) e NEOR
(GGGGGAATTCAGAAGAACTCGTCAAGAAGGCGATAGAA)
As condiccedilotildees das reaccedilotildees foram as seguintes 100 ng do DNA total de T
cruzi Dm28c tipo selvagem (T cruzi(kap7kap7) ou tipo selvagem) ou do DNA da
populaccedilatildeo T cruzi(kap7kap7neo) (mutante simples nocaute) 10 pmol dos primers EXTF
+ NEOR e NEOF + EXTR 200 μM de cada dNTP MgCl2 15 mM tampatildeo Taq DNA
polimerase 1x 25 unidades de Taq DNA polimerase (Invitrogen EUA) A reaccedilatildeo de
PCR foi processada no termociclador modelo 9700 (AppliedBiosystems EUA) nas
seguintes condiccedilotildees Desnaturaccedilatildeo do material por 4 min a 94 degC seguida de 35
ciclos de desnaturaccedilatildeo a 92 degC por 30 s hibridizaccedilatildeo dos oligonucleotiacutedeos a 55 degC
por 30 s e extensatildeo a 72 degC por 2 min
3226 Transfecccedilatildeo do T cruzi com o cassete UPS-HIGRO-DOWN
Formas epimastigotas da populaccedilatildeo mutante de T cruzi (kap7kap7neo) foram
cultivadas em meio LIT suplementado com G418 (500 μgml) ateacute a densidade de 2 x
107 ceacutelulasml Os parasitas (1 x 108 ceacutelulas) foram coletados por centrifugaccedilatildeo a
6000 x g por 10 min a 4 degC e submetidos ao processo de eletroporaccedilatildeo como
descrito no item 3202 Para a transfecccedilatildeo foram usados 20 μg do fragmento
58
representando o cassete UPS-HIGRO-DOWN As culturas (transfectada e controle)
foram entatildeo incubadas a 28 degC em LIT suplementado de G418 Apoacutes 24 horas de
incubaccedilatildeo foi adicionado o antibioacutetico higromicina ao meio de cultura na
concentraccedilatildeo de 500 μgml As culturas foram mantidas por sucessivas passagens
(diluiccedilatildeo de 110) em meio LIT suplementado com G418 e higromicina a cada 8-10
dias ateacute a ausecircncia de proliferaccedilatildeo celular na cultura controle Mutantes nos quais
os dois alelos de TcKAP7 foram removidos e substituiacutedos pelos genes NEO e
HIGRO foram denominados com genoacutetipo T cruzi (kap7neokap7higro)
3227 Anaacutelise por PCR do DNA dos parasitas transfectados com o cassete
UPS-HIGRO-DOWN
As reaccedilotildees de PCR foram realizadas utilizando primers externos EXTF e
EXTR (item 3225) combinados com os primers HIGROF e HIGROR (item 3221)
As reaccedilotildees de PCR foram realizadas nas seguintes condiccedilotildees 100 ng do
DNA total de T cruzi(kap7kap7) ou do DNA do T cruzi(kap7neokap7higro) 10 pmol dos
primers EXTF + HIGROR e HIGROF + EXTR 200 μM de cada dNTP MgCl2 15
mM tampatildeo Taq DNA polimerase 1x 25 unidades de Taq DNA polimerase
(Invitrogen EUA) A reaccedilatildeo de PCR foi processada no termociclador modelo 9700
(Applied Biosystems EUA) nas seguintes condiccedilotildees Desnaturaccedilatildeo do material por
4 min a 94 degC seguida de 35 ciclos de desnaturaccedilatildeo a 92 degC por 30 s hibridizaccedilatildeo
dos oligonucleotiacutedeos a 55 degC por 30 s e extensatildeo a 72 degC por 2 min
3228 Anaacutelise da organizaccedilatildeo do gene TcKAP7 e da eficiecircncia de seu nocaute
atraveacutes de ensaio do tipo Southern blot
O DNA genocircmico (5 μg) de T cruzikap7kap7 e T cruzikap7neokap7higro foi
submetido a digestatildeo com a enzima de restriccedilatildeo HindIII de acordo com as
especificaccedilotildees do fornecedor Apoacutes 3 horas o DNA digerido foi submetido agrave
eletroforese em gel de agarose 08 em tampatildeo TBE a 100 V O gel foi corado por
brometo de etiacutedio (05 μgmL) e fotografado sob a luz ultravioleta (310 nm)
Posteriormente o gel foi tratado com soluccedilotildees de depurinaccedilatildeo por 15 minutos de
desnaturaccedilatildeo por 30 minutos (2 vezes) e soluccedilatildeo de neutralizaccedilatildeo por 30 minutos (2
vezes) O DNA foi transferido para uma membrana de nylon (Hybond N
59
AmershamBiosciences) por capilaridade (SAMBROOK et al 1989) utilizando-se de
uma ldquoponterdquo de papel 3 MM embebido em SSC 20X Apoacutes a transferecircncia o DNA foi
fixado agrave membrana por exposiccedilatildeo agrave luz ultravioleta com uma dose de 120 mJcm2
usando o aparelho Spectrolinker (Spectronicscorp USA) A membrana contendo o
DNA de T cruzi foi preacute-hibridizada em soluccedilatildeo de hibridizaccedilatildeo de DNA por 1 hora a
65 ordmC seguido da adiccedilatildeo da sonda marcada radioativamente com α-[P32
]-dCTP (10
μCiμl 3000 Cimmol) (Amersham Biosciences) preparada segundo meacutetodo de nick
translation descrito por Rigbyet al (1977) utilizando-se o meacutetodo de iniciaccedilatildeo por
random primers (Megaprimer DNA labeling kit ndash GE) conforme recomendaccedilotildees do
fabricante
Foram utilizadas 3 sondas satildeo elas fragmento do gene TcKAP7
correspondendo a regiatildeo compreendida entre os nucleotiacutedeos 1 e 560 o gene neo e
o gene higro Apoacutes a marcaccedilatildeo as sondas foram purificadas em colunas de
Sephadex G-50 (ProbeQuant ndash Amersham Biosciences) e adicionadas ao tampatildeo de
hibridizaccedilatildeo na concentraccedilatildeo de 5 x 106
cpmml As membranas foram incubadas
por 16 horas a 65 C e em seguida lavadas nesta temperatura duas vezes por 30
minutos com soluccedilotildees de alta meacutedia e baixa estringecircncia As membranas foram
expostas a filme de raio-X (Hyperfilmreg Amersham Biosciences) na presenccedila de tela
intensificadora (Dupont Cronex Lightining Plus) por tempo que varia entre 1 a 3 dias
a ndash70 C
323 Localizaccedilatildeo celular da proteiacutena TcKAP7 atraveacutes de ensaio de
imunofluorescecircncia
Formas epimastigotas de T cruzi foram coletadas por centrifugaccedilatildeo (4000 times
g 3 a 10 ordmC) lavadas duas vezes em PBS e depositadas sobre lacircminas de vidro
previamente tratadas com poli-L-lisina 001 diluiacuteda em PBS Os parasitas foram
entatildeo fixados com paraformaldeiacutedo 4 em PBS permeabilizados com Triton X-100
01 em PBS por 2 min agrave temperatura ambiente e incubados a 4ordmC durante 16 h
em soluccedilatildeo de bloqueio para imunofluorescecircncia (PBS 1X + BSA 1 ) Apoacutes o
bloqueio os parasitas foram incubados agrave temperatura ambiente por 1 h com o
anticorpo monoclonal anti-FLAG em uma diluiccedilatildeo de 11000 em soluccedilatildeo de bloqueio
para imunofluorescecircncia Depois disso as lacircminas foram submetidas a 5 lavagens
60
de 5 min cada em PBS Em seguida os parasitas foram incubados agrave temperatura
ambiente por 1 hora com o anticorpo secundaacuterio anti-IgG de camundongo conjugado
ao fluoroacuteforo Alexa Fluacuteor 488 (Invitrogen) diluiacutedo 1600 em soluccedilatildeo de bloqueio As
lacircminas foram lavadas 5 vezes com PBS e posteriormente incubadas com o corante
Hoechst 33342 (Invitrogen) a 2 μgμL em PBS por 5 min Apoacutes cinco lavagens com
PBS as lacircminas foram montadas com ProLong Gold Antifade (Invitrogen) sobre uma
lacircmina de microscopia oacutetica O material foi observado nos microscoacutepios Leica SP5 e
DMI6000
324 Anaacutelise da ultraestrutura do cinetoplasto do mutante de T cruzi para
TcKAP7 por microscopia eletrocircnica de transmissatildeo
Os parasitas foram coletados lavados com PBS e fixados em soluccedilatildeo
contendo 25 de glutaraldeiacutedo 4 de paraformaldeiacutedo e tampatildeo cacodilato 01 M
Em seguida os parasitas foram fixados por 1 h em soluccedilatildeo de 1 de tetroacutexido de
Oacutesmio e 08 de ferricianeto de potaacutessio diluiacutedos em tampatildeo cacodilato 01 M As
ceacutelulas foram entatildeo desidratadas em soluccedilatildeo contendo concentraccedilotildees crescentes
de acetona e incluiacutedas em Epon Apoacutes a obtenccedilatildeo de cortes ultrafinos dos parasitas
os mesmos foram contrastados em acetato de uranila e citrato de Chumbo antes de
serem observados e fotografados no microscoacutepio eletrocircnico de transmissatildeo Zeiss
900
325 Coloraccedilatildeo dos parasitas transfectados
A coloraccedilatildeo dos parasitas foi realizada pelo meacutetodo panoacutetico raacutepido
(Laborclin Pinhais Paranaacute Brasil) modificado
Formas epimastigotas do mutante de T cruzi para TcKAP7 foram cultivadas
como descrito no item 321 Os parasitas foram coletados por centrifugaccedilatildeo de 1
min a 4000 x g e ressuspensos em PBS Desta suspensatildeo uma gota foi retirada e
depositada sobre lacircminas previamente limpas Quando secas as lacircminas foram
imersas individualmente na Soluccedilatildeo 1 (Fixador) Soluccedilatildeo 2 (Revelador) e Soluccedilatildeo 3
(Corante) em cada uma por 30 s Apoacutes este processo as lacircminas foram lavadas em
aacutegua corrente secas agrave temperatura ambiente e cobertas com Permount e lamiacutenula
Os parasitas foram visualizados em microscoacutepio Nikon E600
61
326 Infecccedilatildeo de ceacutelulas Vero com o mutante de T cruzi para TcKAP7
Ceacutelulas Vero (ATCCreg Nuacutemero CRL-2783trade) foram cultivadas em garrafas
de 150 cm2 contendo meio RPMI suplementado com 5 de soro fetal bovino
(GIBCO) penicilina 100 UIml streptomicina 10 microgml e glutamina 2 mM a 37 o C
com 5 de CO2 Ao atingirem a confluecircncia (80 a 100) realizou-se a passagem
atraveacutes de tripsinizaccedilatildeo e foi feito um inoacuteculo de 1 x 107 ceacutelulas para cada nova
garrafa de 150 cm2 Apoacutes 24 horas estas ceacutelulas (50 ndash 70 de confluecircncia) foram
infectadas com formas metaciacuteclicas obtidas da diferenciaccedilatildeo do mutante de T cruzi
para TcKAP7 em microplacas de 24 poccedilos contendo lamiacutenulas de vidro com
diacircmetro de 13 mm A cada poccedilo foram adicionadas 2 x 104 ceacutelulas Vero Apoacutes 24
horas de cultivo as ceacutelulas foram infectadas com tripomastigotas metaciacuteclicos
(obtidos do sobrenadante das culturas de T cruzi diferenciados em meio TAU3AAG
sem purificaccedilatildeo na coluna de DEAE celulose) A infecccedilatildeo das ceacutelulas Vero foi
acompanhada diariamente por microscopia de contraste de fase
327 Anaacutelise da funccedilatildeo do gene TbKAP7 de Trypanosoma brucei atraveacutes de
ensaios de RNA de interferecircncia
Com o intuito de complementar os estudos da funccedilatildeo do gene TcKAP7 foi
utilizada a teacutecnica de RNA de interferecircncia O uso dessa metodologia compreende
uma abordagem alternativa agrave anaacutelise da funccedilatildeo gecircnica para genes ortoacutelogos deT
brucei por anaacutelises de RNAi uma vez que a maquinaria de RNAi em T cruzi eacute
inexistente (DA ROCHA et al 2003) Os resultados podem gerar evidecircncias que
estejam relacionadas agrave funcionalidade dos genes em T cruzi Esta abordagem foi
utilizada neste trabalho para auxiliar no estudo da funccedilatildeo do gene TcKAP7 a partir
do ortoacutelogo em T brucei ainda natildeo caracterizadoTbKAP7 Os ensaios de RNAi
foram realizados em T brucei cepa 29-13 (WIRTZ et al 1999) com sistema induzido
por tetraciclina utilizando o vetor p2T7-177 ilustrado na figura 12 Este vetor quando
transfectado no parasita integra-se aos minicromossomos do T brucei regiatildeo de
repeticcedilotildees 177 (FOLDYNOVA-TRANTIRKOVA et al 2005)
62
FIGURA 12 MAPA DO VETOR p2T7-177 UTILIZADO PARA ENSAIOS DE RNAi LEGENDA T7 prom Promotor de T7 RNA Polimerase induzido por tetraciclina T7 term Terminador de transcriccedilatildeo 177 Sequumlecircncia repetitiva de 177 pares de bases para alvo de inserccedilatildeo em minicromossomos BLEO gene de resistecircncia agrave fleomicina GFP Proteiacutena Green FluorescentProtein os siacutetios para as enzimas de restriccedilatildeo estatildeo indicados AmpR gene de resistecircncia agrave ampicilina (FONTE WICKSTEAD et al 2002)
As regiotildees do mRNA para alvos nos ensaios de RNAi foram escolhidas com
o auxiacutelio da ferramenta RNAit da base de dados do Trypanofan - Genocircmica
funcional de Tbrucei (httptrypanofanpathcamacuktrypanofanmain)
(REDMOND et al 2003) Essas regiotildees foram amplificadas por PCR usando como
molde o DNA total de T brucei (100 ngreaccedilatildeo) 10 pmol dos primers listados na
tabela 3 200 mM de cada dNTP 15 mM de MgCl2 tampatildeo Taq DNA polimerase 1x
63
(Invitrogen) e 25 unidades de Taq DNA polimerase (Invitrogen) A reaccedilatildeo foi
aquecida por 4 min a 94 degC e entatildeo submetida a 35 ciclos de desnaturaccedilatildeo a 94 degC
por 30 s anelamento a 55 degC por 30 s e extensatildeo a 72 degC por 1 min Os primers
utilizados apresentam siacutetio para as enzimas de restriccedilatildeo BamHI (F) ou HindIII (R)
Os produtos de PCR foram purificados por extraccedilatildeo com fenol-clorofoacutermio e
digeridos com as referentes enzimas
QUADRO 3 - RELACcedilAtildeO DOS PRIMERS UTILIZADOS PARA A AMPLIFICACcedilAtildeO DO
GENE TbKAP7
KAP7RNAiF
AAAGGATCCCTAACCTAACCTGCAGGGTCTCTCG
KAP7RNAiR
GCGAAGCTTTTGTTCCTTTACAAACGCCC
Os siacutetios das enzimas de restriccedilatildeo BamHI (GGATCC) e HindIII (AAGCTT) adicionados aos primers estatildeo em negrito
As clonagens foram confirmadas por PCR de colocircnia e os plasmiacutedeos foram
purificados pelo kit QIAprep Spin Miniprep (Qiagen) Apoacutes purificaccedilatildeo 10 μg dos
plasmiacutedeos foram linearizados com a enzima NotI conforme descrito pelo fabricante
O DNA foi precipitado e ressuspenso em 50 μl de meio de eletroporaccedilatildeo ZPFM para
transfecccedilatildeo do T brucei
Para cada transfecccedilatildeo foi utilizado um total de 4 x 107parasitas em fase logariacutetmica
de crescimento Os parasitas foram obtidos por centrifugaccedilatildeo (5000 x g por 10 min
a 4 degC) lavados em meio ZPFM e ressuspensos em 500 μl do mesmo meio A
transfecccedilatildeo foi feita em cubetas de eletroporaccedilatildeo (4 mm) usando o eletroporador da
BioRad (GenePulser II Electroporator) As condiccedilotildees utilizadas foram dois pulsos de
1600 V e 25 microF Os parasitas foram entatildeo transferidos para garrafas contendo meio
SDM-79 SFB 10 higromicina 50 μgml e G418 15 μgml A seleccedilatildeo dos parasitas
transfectados foi atraveacutes da adiccedilatildeo de 5μgmL de fleomicina resistecircncia conferida
pelo vetor p2T7-177 apoacutes 24 horas de cultivo O tempo para seleccedilatildeo foi entre duas
e trecircs semanas
64
3271 Induccedilatildeo do RNA dupla fita
A induccedilatildeo da expressatildeo de RNA dupla fita referente agrave porccedilatildeo do gene
TbKAP7 clonado no plasmiacutedeo p2T7-177 deu-se pela adiccedilatildeo de tetraciclina 2 μgml
a uma cultura transfectada de T brucei em fase de crescimento exponencial (~2 x
106 parasitasml) Nos dias que se seguiram 1μgml de tetraciclina foi adicionada
diariamente agraves culturas A observaccedilatildeo dos efeitos na curva de crescimento causada
por RNAi em T brucei foi realizada ao longo de uma semana com a contagem de
ceacutelulas e adiccedilatildeo diaacuteria de tetraciclina 1 μgml
65
4 RESULTADOS
41 Clonagem e caracterizaccedilatildeo do gene TcKAP7
A regiatildeo codificante do gene TcKAP7 (ID Tc00104705350871950) foi
obtida a partir do banco de dados do genoma do T cruzi disponiacutevel no portal da
internet wwwgenedborg e amplificada por PCR com os primers descritos no item
37
No genoma do T cruzi cepa CL Brener (EL-SAYED et al 2005) foram
identificados dois haploacutetipos do gene TcKAP7 que foram denominados neste
trabalho de haploacutetipo A (Tc00104705350871950) e haploacutetipo B
(Tc00104705350979320) Neste trabalho foi utilizado o gene TcKAP7 proveniente
da cepa Dm28c de T cruzi Este gene apresenta uma regiatildeo codante de 747 pb e
codifica uma proteiacutena de 276 kDa assumindo que o primeiro ATG apoacutes a sequecircncia
do mini-eacutexon seja usada na iniciaccedilatildeo da traduccedilatildeo
A figura 13 abaixo mostra o alinhamento de TcKAP7 das cepas CL Brener e
Dm28c
FIGURA 13 - COMPARACcedilAtildeO ENTRE AS SEQUumlEcircNCIAS DE AMINOAacuteCIDOS DEDUZIDAS DO GENE KAP7 DE T cruzi Dm28C E DOS HAPLOacuteTIPOS DE CL BRENER
LEGENDA As posiccedilotildees com aminoaacutecidos idecircnticos em todas as sequumlecircncias estatildeo coloridas em preto
66
Embora o gene TcKAP7 natildeo possua grande identidade com os com genes
ortoacutelogos em Trypanosoma brucei TbKAP7 (714 pb) (Tb106k151470) Leishmania
major LmKAP7 (1044 pb) (LMJF_36_5840) Leishmania infantum LiKAP7 (1044 pb)
(LINJ_36_6090) e Leishmania braziliensis LbKAP7 (1038 pb) (LBRM_35_0010)
cujos genomas tambeacutem foram sequumlenciados (BERRIMAN et al 2005 IVENS et al
2005 PEACOCK et al 2007) as sequecircncias de aminoaacutecidos das respectivas
proteiacutenas deduzidas a partir desses genes ainda compartilham certo grau de
similaridade entre si (FIGURA 14) Na tabela 4 pode-se visualizar o percentual de
identidade entre as proteiacutenas KAP7 dos tripanossomatiacutedeos que possuem o genoma
sequenciado
FIGURA 14 COMPARACcedilAtildeO ENTRE AS SEQUumlEcircNCIAS DE AMINOAacuteCIDOS DEDUZIDAS DO GENE KAP7 EM DIFERENTES TRIPANOSOMATIacuteDEOS LEGENDA Em preto encontram-se os resiacuteduos de aminoaacutecidos idecircnticos em todas as sequumlecircncias e em cinza os resiacuteduos conservados na maioria delas
67
QUADRO 4 - PERCENTUAL DE IDENTIDADE ENTRE AS PROTEIacuteNAS KAP7 NOS
TRIPANOSSOMATIacuteDEOS COM O GENOMA SEQUENCIADO
Os valores foram obtidos pelo alinhamento utilizando a ferramenta Clustal21
Mesmo apresentando pouca identidade e variaccedilatildeo de tamanho alguns
dados do genoma sugerem que esses genes satildeo ortoacutelogos entre si Pode-se
perceber uma sintenia entre seus loci nas vaacuterias espeacutecies de tripanosomatiacutedeos
(Cavalcanti et al 2009) (FIGURA 15)
FIGURA 15- SINTENIA DE TcKAP7 COM OUTROS TRIPANOSOMATIacuteDEOS LEGENDA Os dois contigs de TcKAP7 (TcA e TcB) estatildeo representados nesta figura juntamente com os contigs de outros tripanosomatiacutedeos (Tb= T brucei Lm= L major Li= L infantum e Lb= L brasiliensis) mostrando que KAP7 representado pela cor amarela apresenta uma sintenia entre seus loci em todas as espeacutecies mostradas sendo flanqueado pelo gene KAP4 em T cruzi e T brucei representado em azul Portanto em L majorL infantum eL brasiliensis ao lado direito de KAP7 estaacute o gene de uma proteiacutena hipoteacutetica representado pela cor vermelha e ao lado esquerdo encontra-se o gene da KAP4 representado em azul como mencionado anteriormente FONTE CAVALCANTI et al 2009
68
A expressatildeo de vaacuterios genes mitocondriais de C fasciculata e L major eacute
regulada durante o ciclo celular em parte por uma sequumlecircncia consenso
[(CA)AUAGAA(GA)] presente nas regiotildees 5rsquo e 3rsquo-UTR dos respectivos mRNAs
(BROWN amp RAY 1997 MAHMOOD et al 1999 MAHMOOD amp RAY 1998 PASION
et al 1996 ZICK et al 2005)
Assim resolvemos caracterizar a regiatildeo 5rsquo-UTR do transcrito TcKAP7 na
tentativa de identificar sinais com identidade com aqueles encontrados em C
fasciculata Na figura 16 estaacute representada a regiatildeo 5rsquo-UTR do transcrito TcKAP7
com a sequumlecircncia parcial do mini-exon proveniente do primer usado na teacutecnica de
RT-PCR bem como parte da regiatildeo codificante do gene O mini-exon estaacute situado a
129 bases a jusante do iniacutecio da regiatildeo codificante do transcrito TcKAP7 e define
portanto uma regiatildeo 5rsquo-UTR de 168 bases considerando que o tamanho do mini-
exon eacute de 39 bases A anaacutelise da regiatildeo 5rsquo-UTR mostrou um elemento com
caracteriacutesticas muito semelhantes aquele envolvido na regulaccedilatildeo de genes em C
fasciculata (sequencia (G)ATAGAA(G) mostrada no retacircngulo preto na FIGURA
16B) sugerindo que TcKAP7 seja regulada durante o ciclo celular
69
A
B
FIGURA 16 CARACTERIZACcedilAtildeO DA REGIAtildeO 5rsquo-UTR DO TRANSCRITO TcKAP7 LEGENDA A Esquema geral da localizaccedilatildeo do mini-exon de TcKAP7 e B Localizaccedilatildeo especiacutefica do mini-exon de TcKAP7 O mini-exon de TcKAP7 (sequecircncia parcial em verde) estaacute localizado a 129 pb da regiatildeo codante (representada em parte pela cor azul) A regiatildeo 5rsquoUTR do transcrito Tckap7 estaacute representada na cor rosa A possiacutevel sequencia consenso de regulaccedilatildeo durante o ciclo celular estaacute indicada no retacircngulo preto
42 Expressatildeo da proteiacutena TcKAP7 em T cruzi
Formas epimastigotas foram transfectadas com o plasmiacutedeo pNEO3XFLAG
contendo o gene TcKAP7 (pNEO_KAP7_3xFLAG) A expressatildeo da proteiacutena
TcKAP7-FLAG foi analisada por ensaio de western blot Os resultados mostraram
que a expressatildeo da proteiacutena TcKAP7-FLAG foi satisfatoacuteria correspondendo ao
tamanho esperado (FIGURA 17 ) a qual foi confirmada pela reatividade do anticorpo
monoclonal especiacutefico para as etiquetas FLAG (anti-FLAG)
70
FIGURA 17 ANAacuteLISE DA EXPRESSAtildeO DA PROTEIacuteNA DE FUSAtildeO TCKAP7-FLAG EM FORMAS EPIMASTIGOTAS DE T CRUZI
43 Localizaccedilatildeo celular de TcKAP7 atraveacutes de ensaio de imunofluorescecircncia
Para verificar a localizaccedilatildeo celular de TcKAP7 foi realizado o ensaio de
imunofluorescecircncia Como natildeo foi possiacutevel a obtenccedilatildeo do anticorpo com alto tiacutetulo
contra a proteiacutena recombinante TcKAP7 neste ensaio foi utilizado o anticorpo
monoclonal anti-FLAG que reconhece a etiqueta FLAG a qual estaacute fusionada a
proteiacutena TcKAP7
Nessa figura pode-se observar que a proteiacutena de fusatildeo acumula-se na regiatildeo
dos poacutelos do cinetoplasto das formas epimastigotas do T cruzi (FIGURA 18)
indicando que TcKAP7 uma proteiacutena tipo histona H1 estaacute realmente associada com
o kDNA do parasita
71
FIGURA 18 IMUNOLOCALIZACcedilAtildeO DE TcKAP7 EM EPIMASTIGOTAS DE T CRUZI LEGENDAA contraste interferencial diferencial (DIC) B Hoechst marcando o nuacutecleo e o
cinetoplasto C fluorescecircncia mostrando a localizaccedilatildeo de TcKAP7 mais intensa na regiatildeo dos poacutelos
docinetoplasto dos protozoaacuterios D Aumento de C
44 Deleccedilatildeo do gene TcKAP7 por nocaute gecircnico
As teacutecnicas que permitem a remoccedilatildeo de um gene e sua substituiccedilatildeo por
genes repoacuterteres atraveacutes do processo de recombinaccedilatildeo tecircm sido usadas com
sucesso para verificaccedilatildeo da funccedilatildeo gecircnica em tripanosomatiacutedeos (MACRAE et al
2006) O nocaute gecircnico consiste na inserccedilatildeo de marcadores geneacuteticos de seleccedilatildeo
(gene codificando resistecircncia a neomicina ou higromicina entre outros) flanqueados
por sequumlecircncias pertencentes ao locus cromossocircmico de interesse Atraveacutes do
processo de recombinaccedilatildeo homoacuteloga o marcador pode entatildeo substituir o gene que
se quer estudar Desse modo pode ser possiacutevel analisar a funccedilatildeo de determinado
gene atraveacutes das alteraccedilotildees - decorrentes de sua ausecircncia - na fisiologia do
parasita No presente estudo os genes repoacuterteres que codificam resistecircncia aos
72
antibioacuteticos G418 e higromicina foram flanqueados por sequumlecircncias a montante e a
jusante da regiatildeo codificante do gene TcKAP7 As construccedilotildees foram usadas para
transfectarT cruzi e gerar mutantes para o gene TcKAP7 a fim de se estudar o
efeito que a ausecircncia do gene TcKAP7 causa no metabolismo do parasita
Apoacutes obtenccedilatildeo de uma populaccedilatildeo de T cruzi mutante para o gene TcKAP7
(kap7neokap7higro) resistente a ambos antibioacuteticos G418 e higromicina B o
DNA desta populaccedilatildeo foi extraiacutedo para anaacutelise por PCR e Southern blot a fim de
confirmar a eficiecircncia do nocaute
441 Anaacutelise por PCR do DNA dos parasitas transfectados com os cassetes
UPS-NEO-DOWN e UPS-HIGRO-DOWN
Foram realizadas vaacuterias reaccedilotildees de PCR a fim de confirmar a deleccedilatildeo do
gene TcKAP7 do genoma do T cruzi Dm28c e a substituiccedilatildeo dos seus alelos pelos
genes neo e higro As reaccedilotildees de PCR foram feitas com DNA de T cruzikap7kap7 (tipo
selvagem) e com DNA de T cruzikap7neokap7higro utilizando diversas combinaccedilotildees de
primers (TABELA 5) Na figura 32 observa-se que o gene TcKAP7 (747 pb) foi
amplificado somente na PCR realizada com DNA de T cruzi tipo selvagem (FIGURA
19 A canaleta 1) enquanto que os genes neo (795 pb) e higro (1026 pb) soacute foram
amplificados nas reaccedilotildees que conteacutem DNA da populaccedilatildeo do T cruzi kap7neokap7higro
(FIGURA 19 B canaletas 2 e 3) Os tamanhos esperados para amplificaccedilotildees usando
primers externos agraves construccedilotildees e os primers dos genes de resistecircncia foram
identificados no gel de agarose indicando que os cassetes se integraram
corretamente no locus do gene TcKAP7 (FIGURA 19 B canaletas 4 a 7) Um
esquema da localizaccedilatildeo dos primers utilizados nas reaccedilotildees de PCR pode ser
visualizado na figura 19 C
QUADRO 5 ndash COMBINACcedilOtildeES DE PRIMERS UTILIZADOS NA PCR PARA
CONFIRMAR O NOCAUTE DE TcKAP7
Pares de primers Tamanho esperado
(pb)
1 KAP7F + KAP7R 747
2 NEOF + NEOR 795
73
3 HIGROF + HIGROR 1026
4 EXTF + NEOR 1410
5 EXTF + HIGROR 1634
6 NEOF + EXTR 1358
7 HIGROF + EXTR 1360
74
FIGURA 19 ENSAIOS DE PCR UTILIZANDO DNA DE T cruzi kap7kap7 (WT) E
T cruzi kap7neokap7higro (NO) COM DIFERENTES PRIMERS
LEGENDA 1 KAP7F + KAP7R 2 NEOF + NEOR (795 pb) 3 HIGROF + HIGROR (1026 pb) 4
EXTF + NEOR (1410 pb) 5 EXTF + HIGROR (1634 pb) 6 NEOF + EXTR (1358 pb) e 7
HIGROF + EXTR (1360 pb) No quadro A encontram-se as PCRs realizadas com DNA de T cruzi kap7kap7 (WT) e no quadro B encontram-se as PCRs realizadas com DNA de T cruzi kap7neokap7higro
(NO) No quadro C estaacute um esquema da localizaccedilatildeo dos primers utilizados
442 Anaacutelise da organizaccedilatildeo dos genes TcKAP7 neo e higro por ensaio do
tipo Southern blot
Neste ensaio foi utilizado DNA total extraiacutedo de T cruzikap7kap7 (tipo selvagem)
e T cruzi kap7neokap7higro (duplo nocaute) Foram utilizadas trecircs sondas (1) Um
fragmento do gene TcKAP7 (primeiros 598 pb da CDS) (2) o gene neo e (3) o gene
higro O DNA total das duas amostras foi digerido com a enzima de restriccedilatildeo HindIII
O padratildeo de digestatildeo desta enzima pode ser visualizado na figura 20 De acordo
com o mapa de restriccedilatildeo a inserccedilatildeo do cassete neo no locus KAP7 geraria um
fragmento HindIIIHindIII de 1024 pb enquanto a inserccedilatildeo do cassete higro geraria
um fragmento de 1032 pb cujos tamanhos satildeo diferentes do fragmento
HindIIIHindIII do locus original (1776 pb) As hibridizaccedilotildees mostram bandas
compatiacuteveis com os tamanhos dos fragmentos HindIIIHindIII esperados para cada
situaccedilatildeo acima (FIGURA 21) Podemos observar que a sonda KAP7 somente
reconhece uma banda de tamanho esperado apenas no DNA do parasita selvagem
(canaleta 1 FIGURA 21) enquanto que bandas correspondentes aos genes neo e
higrosomente aparecem no DNA do mutante KAP7 (canaleta 2 FIGURA 21)
75
FIGURA 20 ndash REPRESENTACcedilAtildeO ESQUEMAacuteTICA DOS SIacuteTIOS DA ENZIMA HindIII NO LOCUS DO GENE KAP7 DE T cruzi CL Brener LEGENDA Este esquema representa esquematicamente em escala os genes kap3 neo e higro as regiotildees upstream e downstream e os siacutetios de clivagem da enzima KpnI
FIGURA 21 ANAacuteLISE DA ORGANIZACcedilAtildeO DOS GENES TCKAP7 NEO E HIGRO POR ENSAIO DO TIPO SOUTHERN BLOT LEGENDA A Autoradiograma e B Padrotildees dos fragmentos obtidos da digestatildeo do DNA com a enzima de restriccedilatildeo HindIII Foram utilizadas trecircs sondas TcKAP7 neomicina e higromicina 1) DNA de T cruzikap7kap7 (tipo selvagem) e 2) T cruzi kap7neokap7higro (duplo nocaute)
76
45 Comparaccedilatildeo da expressatildeo do gene TcKAP7 por western blot
O antisoro contra a proteiacutena TcKAP7 obtido apoacutes imunizaccedilatildeo dos
camundongos foi utilizado em ensaio do tipo western blot para avaliar se TcKAP7
ainda estava sendo expresso no T cruzi apoacutes o nocaute gecircnico
O que se observou foi novamente como esperado que a proteiacutena TcKAP7 natildeo eacute
mais expressa no T cruzi kap7neokap7higro (figura 22) Pode-se observar a presenccedila
de TcKAP7 ( aprox 28 kDa) no extrato das formas epimastigotas de T cruzi kap7kap7
(figura 22A) mas natildeo no extrato de epimastigotas de T cruzi
kap7neokap7higro (figura 22B)
FIGURA 22 COMPARACcedilAtildeO DA EXPRESSAtildeO DO GENE TcKAP7 POR WESTERN BLOT LEGENDA Imunoblot de extratos de epimastigotas de T cruzi kap7kap7 (A) e de T cruzi kap7neokap7higro (B) reagidos com anti-TcKAP7
46 Anaacutelise da morfologia e da ultraestrutura do cinetoplasto do mutante de T
cruzi para TcKAP7
Sabendo-se que TcKAP7 estaacute associada ao cinetoplasto e pode estar
envolvida na compactaccedilatildeo do kDNA do T cruzi como foi mostrado para as KAPs de
Crithidia fasciculata (XU amp RAY 1993 XU et al 1996 HINES amp RAY 1998) sua
ausecircncia poderia levar a alteraccedilatildeo na estrutura do DNA mitocondrial dos parasitas
nocauteados Portanto o primeiro passo foi verificar se havia alteraccedilotildees na
77
morforlogia do parasita Formas epimastigotas do mutante de T cruzi foram
analisadas ao microscoacutepio oacuteptico apoacutes coloraccedilatildeo Como pode ser observado na
figura 23 epimastigotas do mutante de T cruzi para TcKAP7 apresentam uma
morfologia fusiforme com o cinetoplasto caracteriacutestico em forma de barra localizado
anteriormente ao nuacutecleo natildeo se evidenciando portanto nenhuma alteraccedilatildeo em
relaccedilatildeo agrave morfologia dos parasitas do tipo selvagem
FIGURA 23 - COLORACcedilAtildeO PELO MEacuteTODO PANOacuteTICO RAacutePIDO DOS PARASITAS EPIMASTIGOTAS NOCAUTEADOS LEGENDA A) Formas epimastigotas B) Forma epimastigota em maior aumento
Formas epimastigotas de parasitas do tipo selvagem e nocauteados foram
entatildeo analisados pela teacutecnica de microscopia eletrocircnica de transmissatildeo para
visualizar com mais detalhe o cinetoplasto e verificar se sua estrutura estava
alterada pela ausecircncia da TcKAP7 (FIGURA 24) A figura 24A mostra um corte
ultrafino de um epimastigota de T cruzi do tipo selvagem que apresenta o
cinetoplasto compacto e em forma de bastatildeo caracteriacutestico de formas
epimastigotas sem nenhuma alteraccedilatildeo aparente O mesmo pode ser visto na figura
24B para o epimastigota de T cruzi nocauteado A disposiccedilatildeo estrutura e aspecto
do cinetoplasto de ambos os parasitas selvagem e nocauteado natildeo apresentaram
nenhuma diferenccedila entre si mostrando que mesmo apoacutes o nocaute da KAP7 a
estrutura do cinetoplasto permanece aparentemente inalterada
78
FIGURA 24 COMPARACcedilAtildeO ENTRE A ULTRAESTRUTURA DO CINETOPLASTO DO T cruzi DM28C TIPO SELVAGEM (A) E DO MUTANTE DE T cruzi PARA TcKAP7 (B) POR MICROSCOPIA ELETROcircNICA DE TRANSMISSAtildeO
79
47 Multiplicaccedilatildeo diferenciaccedilatildeo e infectividade do mutante de T cruzi para
TcKAP7
Os parasitas mutantes foram analisados a fim de verificar se alteraccedilotildees na
estrutura do kDNA pela ausecircncia de KAP7 natildeo estavam levando a alteraccedilotildees na
fisiologia do parasita alterando sua multiplicaccedilatildeo diferenciaccedilatildeo e infectividade
Inicialmente foi analisado o perfil da curva de crescimento das formas
epimastigotas Observou-se que natildeo havia diferenccedila na curva de crescimento dos
parasitas nocauteados em relaccedilatildeo ao parasita selvagem (FIGURA 25)
FIGURA 25 CURVA DE CRESCIMENTO DO MUTANTE DE T cruzi PARA TcKAP7 (KO) E DO T cruzi Dm28c SELVAGEM (WT)
LEGENDA Curva de crescimento do mutante de T cruzi para TcKAP7 () e do T cruzi Dm28c ()
Em seguida os parasitas nocauteados foram analisados quanto a sua capacidade
de diferenciaccedilatildeo em tripomastigotas metaciacuteclicos Foram realizadas contagens
diferenciais em cacircmara de Neubauer a partir do sobrenadante da metaciclogecircnese
a cada 24 h apoacutes a incubaccedilatildeo das ceacutelulas em meio TAU3AAG durante um periacuteodo
de 3 dias (72 h) A partir dessas contagens foram construiacutedos curva com a contagem
do nuacutemero de metaciacuteclicos ao longo dos trecircs dias (FIGURA 26)
Nenhuma alteraccedilatildeo foi observada quando os parasitas nocauteados foram
submetidos ao processo de metaciclogecircnese in vitro Ou seja pode-se afirmar que
80
mesmo apoacutes o nocaute do gene TcKAP7 as formas epimastigotas do parasita
conseguem se diferenciar em formas metaciacuteclicas
FIGURA 26 METACICLOGEcircNESE IN VITRO DE T cruzi Dm28c TIPO SELVAGEM E T cruzi NOCAUTEADO LEGENDA Metaciclogecircnese in vitro de T cruzi Dm28c tipo selvagem () e T cruzi nocauteado ()
Uma vez que os parasitas nocauteados foram capazes de se diferenciar de
epimastigota a tripomastigota metaciacuteclico resolveu-se investigar se estes eram
capazes de infectar ceacutelulas in vitro Foi possiacutevel perceber as formas amastigotas
dentro de ceacutelulas VERO em cultura mostrando que o parasita natildeo perdeu sua
capacidade de infecccedilatildeo (dados natildeo mostrados) Assim pode-se concluir que aleacutem
de sofrer diferenciaccedilatildeo os mutantes de T cruzi para KAP7 tambeacutem mantiveram sua
capacidade de infecccedilatildeo
48 Anaacutelise da funccedilatildeo do gene KAP7 de Trypanosoma brucei atraveacutes de
ensaios de RNA de interferecircncia
Para averiguar a importacircncia da proteiacutena TcKAP7 na biologia do parasita
recorremos a ensaios de RNA de interferecircncia (RNAi) jaacute que existe uma alta
similaridade entre TcKAP7 e seu ortoacutelogo em Trypanosoma brucei
81
A via de RNA de interferecircncia consiste em um mecanismo de silenciamento
gecircnico que para a ceacutelula funciona como sistema de defesa O mecanismo inicia-se
atraveacutes da expressatildeo de um RNA dupla fita (dsRNA) contendo uma sequecircncia
complementar ao gene de interesse Este dsRNA seraacute entatildeo clivado em pequenos
fragmentos de cerca de 22 a 25 nucleotiacutedeos atraveacutes da atividade de uma
ribonuclease do tipo III denominada Dicer Estes pequenos RNAs seratildeo
direcionados e permaneceratildeo unidos a um complexo proteico denominado RISC
(ldquoRNA-InducedSilencingComplexrdquo) Nesse complexo os pequenos RNAs de
interferecircncia (siRNA) ligam-se por complementaridade ao RNA mensageiro do gene
a ser inativado guiando-os para degradaccedilatildeo pelas nucleases presentes no
complexo impedindo a siacutentese da respectiva proteiacutena (ULLU et al 2002) O vetor
utilizado para promover o silenciamento do gene TbKAP7 foi o p2T7-177 Este
plasmiacutedeo integra-se aos minicromossomos do T brucei regiatildeo de repeticcedilotildees 177
(FOLDYNOVA-TRANTIRKOVA et al 2005) Este vetor apresenta dois promotores
de polimerase em oposiccedilatildeo induziacuteveis por tetraciclina flanqueando a sequumlecircncia de
interesse Desta forma satildeo geradas duas moleacuteculas de mRNA que pareadas
formam a moleacutecula de RNA fita dupla capaz de induzir a maquinaria de degradaccedilatildeo
A induccedilatildeo da inibiccedilatildeo de TbKAP7 atraveacutes de RNAi levou a uma diminuiccedilatildeo da
multiplicaccedilatildeo celular do parasita a partir do quarto dia do experimento (FIGURA 27)
Os resultados obtidos neste ensaio mostraram que a participaccedilatildeo da TbKAP7
no metabolismo do T brucei eacute essencial jaacute que o silenciamento do gene TbKAP7
levou agrave reduccedilatildeo da proliferaccedilatildeo celular do parasita
82
FIGURA 27 RNAi DE TbKAP7 INIBE O CRESCIMENTO DAS FORMAS PROCIacuteCLICAS DE T
brucei
LEGENDA Curva de crescimento de linhagem celular de RNAi de TbKAP7 em T brucei induzido por
tetraciclina As ceacutelulas foram diluiacutedas a uma densidade celular inicial de 1 X 106 ml na presenccedila e
ausecircncia de tetraciclina As densidades celulares foram determinadas pela contagem de ceacutelulas a
intervalos de 24 horas durante oito dias apoacutes iniacutecio de adiccedilatildeo de tetraciclina A linha com quadrados
mostra a curva de crescimento celular na presenccedila de tetraciclina (+TET) A linha com losangos
mostra a curva de crescimento celular na ausecircncia de tetraciclina (- TET)
49 Caracterizaccedilatildeo estrutural de TcKAP7
491 Produccedilatildeo recombinante de TcKAP7
O cultivo de E coli BL-21(DE3) STAR contendo o plasmiacutedeo pET28a-
TcKAP7 foi feito em meio LB a 37 oC com a induccedilatildeo da expressatildeo realizada a uma
densidade oacutetica de DO600 de 08 com a adiccedilatildeo de 05 mM de ITPG durante a noite a
37 oC
As ceacutelulas foram recuperadas por centrifugaccedilatildeo ressuspensas sonicadas e
centrifugadas para a purificaccedilatildeo de TcKAP7 atraveacutes da cromatografia de afinidade
em resina de Ni-NTA (Figura 28A) Foi possiacutevel obter grande quantidade de
83
amostra com grau de pureza alto como visualizado atraveacutes de anaacutelise por SDS-
PAGE (Figura 28B)
FIGURA28 PURIFICACcedilAtildeO DE TCKAP7 ATRAVEacuteS DE CROMATOGRAFIA DE AFINIDADE LEGENDA A) Cromatograma de afinidade B) SDS-PAGE da cromatografia de afinidade Os nuacutemeros agrave esquerda da figura representam os tamanhos das bandas do marcador de massa molecular (Benchmark) (Invitrogen) e P banda correspondente agrave TcKAP7 purificada Caixa em vermelho indica o pico que corresponde agrave fraccedilatildeo no SDS-PAGE
Devido agrave presenccedila de bandas com possiacuteveis contaminantes as fraccedilotildees que
continham a proteiacutena de interesse foram submetidas agrave purificaccedilatildeo por cromatografia
de troca iocircnica onde a purificaccedilatildeo eacute realizada baseada na afinidade por cargas
entre as proteiacutenas e a resina
Para esta purificaccedilatildeo utilizou-se a coluna SP Hitrap (GE Healthcare Life
Sciences) que eacute uma coluna de carga negativa Essa resina foi escolhida pois o pH
do tampatildeo em que se encontrava TcKAP7 era menor que o pI da proteiacutena Nessas
condiccedilotildees a carga superficial de TcKAP7 eacute positiva Para favorecer a interaccedilatildeo
TcKAP7 e resina foi feita uma diluiccedilatildeo de TcKAP7 para retirada de NaCl A eluiccedilatildeo
da proteiacutena foi realizada com um gradiente segmentado de tampatildeo B para
84
cromatografia de troca iocircnica TcKAP7 foi eluiacuteda com 68 do tampatildeo B (FIGURA
29)
FIGURA 29 PURIFICACcedilAtildeO DE TCKAP7 ATRAVEacuteS DE CROMATOGRAFIA DE TROCA IOcircNICA
LEGENDA A) Cromatografia de troca iocircnica B) SDS-PAGE da cromatografia de troca iocircnica Os nuacutemeros agrave esquerda da figura representam os tamanhos das bandas do marcador de massa molecular (Benchmark) (Invitrogen) e P banda correspondente agrave TcKAP7 purificada Caixa em vermelho indica o pico que corresponde agrave fraccedilatildeo no SDS-PAGE Curva em azul representa absorbacircncia em 280 nm Linha em verde indica concentraccedilatildeo de tampatildeo B para eluiccedilatildeo da amostra
410 Anaacutelise do estado oligomeacuterico de TcKAP7
A amostra purificada por troca iocircnica foi submetida agrave cromatografia de
exclusatildeo molecular tambeacutem chamada de gel filtraccedilatildeo que consiste na separaccedilatildeo
de biomoleacuteculas de acordo com seu tamanho e forma A coluna neste processo
conteacutem um poliacutemero com ligaccedilotildees cruzadas com poros de tamanho definido As
moleacuteculas maiores iratildeo migrar mais rapidamente que as menores pois natildeo satildeo
85
capazes de penetrar no interior dos poros da resina eluindo diretamente da coluna
As moleacuteculas menores por entrarem pelos poros da resina e levarem mais tempo
percorrendo os poros satildeo eluiacutedas mais tarde em relaccedilatildeo as que satildeo maiores
Ao comparar o volume de eluiccedilatildeo de TcKAP7 com o volume de eluiccedilatildeo de
proteiacutenas com massa molecular conhecidos (dados natildeo mostrados) foi possiacutevel
verificar que TcKAP7 parece ser um monocircmero em soluccedilatildeo Para confirmar esses
dados a mesma amostra foi submetida ao experimento de espalhamento dinacircmico
de luz (DLS)
O DLS eacute uma teacutecnica que se estima a distribuiccedilatildeo de tamanho das
populaccedilotildees de partiacuteculas que estatildeo presentes na amostra permitindo a detecccedilatildeo de
agregados proteicos ou de diferentes estados de oligomerizaccedilatildeo na amostra
indicando heterogeneidade Eacute importante ressaltar que para maiores chances de
sucesso em ensaios de cristalizaccedilatildeo a amostra deve encontrar-se monodispersa
Os dados de DLS mostram que 911 da massa de TcKAP7 analisada
apresenta um raio hidrodinacircmico (Rh) de 39 nm que representa uma massa
aparente de 29 kDa (FIGURA 30) Isto eacute condizente com um monocircmero cuja massa
teoacuterica seria de aproximadamente 28 kDa (incluindo a cauda de 6 histidinas) de
acordo com a prediccedilatildeo feita pelo servidor Expasy Protparam
(httpwebexpasyorgprotparam)A polidispersividade da amostra foi baixa
indicando que a mesma estava homogecircnea
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0 1 2 3 4 5 6 7
M
assa
Rh (nm)
fr80
fr82
fr84
fr85
86
FIGURA 30 ANAacuteLISE POR DLS DE TCKAP7 LEGENDA Anaacutelise por DLS de TcKAP7 contendo as fraccedilotildees obtidas na cromatografia de afinidade As fraccedilotildees 80 84 e 85 apresentam um raio hidrodinacircmico (Rh) de 39 nm
Aleacutem disso tambeacutem foram obtidas informaccedilotildees sobre o envelope de TcKAP7
a partir dos dados coletados atraveacutes da teacutecnica de SAXS mostrando que o raio de
giro (Rg) do envelope de TcKAP7 estaacute de acordo com o estimado por DLS (FIGURA
31)
FIGURA 31 ENVELOPE MOLECULAR DE SAXS
411 Anaacutelise do conteuacutedo de estrutura secundaacuteria de TcKAP7 recombinante
Atraveacutes da anaacutelise do espectro de dicroiacutesmo circular pode-se verificar o
conteuacutedo de estrutura secundaacuteria da proteiacutena e inferir enovelamento da proteiacutena
recombinante Os dados obtidos para a TcKAP7 revelaram a presenccedila de estruturas
α caracterizadas pelos miacutenimos pronunciados em 208 nm e 222 nm e de estruturas
coiled na amostra de TcKAP7 caracterizada pelos miacutenimos pronunciados em 205
nm (FIGURA 32) Este resultado estaacute de acordo a prediccedilatildeo de estrutura secundaacuteria
87
realizada pelo servidor PSIPRED (httpbioinfcsuclacukpsipred (FIGURA 33)
Esses resultados sugerem que a proteiacutena recombinante possui correto
enovelamento
FIGURA 32 ESPECTRO DE DICROIacuteSMO CIRCULAR DE TcKAP7
FIGURA 33 PREDICcedilAtildeO DE ESTRUTURA SECUNDAacuteRIA DE TcKAP7
412 Anaacutelise estrutural de TcKAP7
A fim de obter-se a estrutura tridimensional de TcKAP7 por cristalografia de
raios-X foram realizados ensaios de cristalizaccedilatildeoFoi possiacutevel observar a formaccedilatildeo
de um cristal em apenas uma condiccedilatildeo Imidazol 01 M Polietilenoglicol (PEG) 8000
10 wv e Acetato de caacutelcio 02 M
A visualizaccedilatildeo atraveacutes de luz ultra-violeta atraveacutes do equipamento Rock
Imager Fomulatrix permitiu identificaacute-lo como cristal de proteiacutena jaacute que este
diferencia-se de cristal de sal pela fluorescecircncia quando excitado em comprimento
de onda de 280 nm
-20
-18
-16
-14
-12
-10
-8
-6
-4
-2
0
2
200 210 220 230 240 250 260
Ɵ M
RV
x 1
03
(de
g cm
2d
mo
l-1)
Comprimento de onda (nm)
88
O perfil do cristal pode ser visualizado na figura 34 Esse cristal encontra-se
pequeno e mal-formado Aleacutem disso os meacutetodos para a determinaccedilatildeo estrutural de
uma estrutura ineacutedita (sem homologia com estruturas conhecidas) necessitam de
mais de um cristal Dessa forma foram realizados refinamentos dessas condiccedilotildees
iniciais visando aumentar q quantidade de cristais aumentar seu tamanho e
melhorar sua organizaccedilatildeo A concentraccedilatildeo de PEG (5 A 10) e do pH (6 a 9) com
intervalos de 1 unidade foram alterada Entretanto mesmo assim natildeo foi possiacutevel a
obtenccedilatildeo de cristais adequados para a difraccedilatildeo de raios X e novos refinamentos
seratildeo necessaacuterios
FIGURA 34 CRISTAL DE TcKAP7 DE T CRUZI LEGENDA AObtenccedilatildeo do cristal de TcKAP7 na condiccedilatildeo de Imidazol 01 M Polietilenoglicol (PEG) 8000 10 wv e Acetato de caacutelcio 02 M e B Cristal de TcKAP7 visto sob luz ultravioleta
Uma vez que natildeo foi possiacutevel durante o desenvolvimento desse projeto a
obtenccedilatildeo da estrutura cristalograacutefica de TcKAP7 procedeu-se com a construccedilatildeo de
seu modelo molecular
A modelagem molecular eacute uma ferramenta que permite a obtenccedilatildeo de
modelos da estrutura tridimensional de uma determinada proteiacutena com base em
homologia sequencial ou estrutural com proteiacutenas cujas estruturas tridimensional
foram experimentalmente resolvidas
Para a construccedilatildeo do modelo foi utilizado o programa MODELLER (SALI amp
BLUNDELL 1993) este programa eacute utilizado para a modelagem por homologia a
estruturas tridimensionais de proteiacutenas O programa automaticamente constroacutei um
modelo baseado na anaacutelise de um alinhamento de sequecircncias entre a proteiacutena para
a qual se deseja construir o modelo e uma proteiacutena relacionada cuja estrutura
tridimensional jaacute foi resolvida Nesse caso foram utilizadas estruturas de duas
A B
89
proteiacutenas como molde para a construccedilatildeo da estrutura de TcKAP7 A estrutura da
proteiacutena HMGB1(coacutedigo de acesso no banco de dados de proteiacutenas 2GZK)
(wwwpdborg) para a porccedilatildeo amino-terminal e a estrutura do fator A de transcriccedilatildeo
mitocondrial (coacutedigo de acesso 3TQ6) para a porccedilatildeo carboxi-terminal da proteiacutena
(FIGURA 35A) Duas proteiacutenas foram selecionadas para a construccedilatildeo do modelo de
TcKAP7 visto que a similaridade de sequencia entre TcKAP7 e proteiacutenas com
estruturas resolvidas eacute bastante baixo A similaridade sequencial de TcKAP7 e
proteiacutena HMGB1 eacute de 224 e entre TcKAP7 e o fator A de transcriccedilatildeo mitocondrial
eacute de 264 No entanto ambas proteiacutenas possuem alta similaridade em relaccedilatildeo agrave
estrutura secundaacuteria (mais de 90) Para aumentar a confiabilidade do modelo
utilizamos uma proteiacutena para construir a sequencia N-terminal de TcKAP7
(aminoaacutecidos 1-184) e outra para o C-terminal (aminoaacutecidos 185-248)
A qualidade do modelo pode ser avaliada por exemplo atraveacutes de graacuteficos e
tabelas que analisam restriccedilotildees quiacutemicas e fiacutesicas de cada aacutetomo constituinte do
modelo Neste trabalho foi utilizado o graacutefico de Ramachandran (FIGURA 35B) nele
pode-se visualizar todas as combinaccedilotildees possiacuteveis de acircngulos dieacutedricos Ψ (psi)
versus os Φ (phi) nos aminoaacutecidos de um polipeptiacutedeo e que contribuem para a
conformaccedilatildeo das estruturas das proteiacutenas (RAMACHANDRAN et al 1963) Dos 230
resiacuteduos apenas 5 estatildeo em regiotildees natildeo permitidas do graacutefico Esse eacute um
excelente valor pois eacute similar ao valor meacutedio encontrado para estruturas
experimentalmente determinadas com resoluccedilatildeo de no miacutenimo 20 Aring
(httpwwwebiacukthornton-srvdatabasesprofunc)
Tambeacutem eacute possiacutevel visualizar a topologia de TcKAP7 (FIGURA 35 C) que
mostra as regiotildees de α-heacutelices e regiotildees de coiled presentes na proteiacutena
corroborando com os dados obtidos na espectroscopia de dicroiacutesmo circular
90
FIGURA 35 ESTRUTURA DE TcKAP7 LEGENDA AModelo tridimensional de KAP7 B Graacutefico de Ramachandran e C Topologia de TcKAP7
A anaacutelise da superfiacutecie eletrostaacutetica de TcKAP7 mostra que existem regiotildees
ricas em aminoaacutecidos com cargas positivas que podem conferir afinidades agrave outras
proteiacutenas com carga carga superficial negativa ou mesmo aacutecidos nucleicos (FIGURA
36)
91
FIGURA 36 SUPERFIacuteCIE ELETROSTAacuteTICA DE TcKAP7 LEGENDA Visualizaccedilatildeo de diferentes regiotildees de TcKAP7 Vermelho potencial negativo Azul potencial positiva Branco Neutro
413 Investigaccedilatildeo de possiacuteveis funcionalidades baseadas na estrutura de
TcKAP7
4131 Prediccedilatildeo de funccedilatildeo paraTcKAP7
92
A prediccedilatildeo de funccedilatildeo para TcKAP7 foi realizada a partir do enovelamento de
proteiacutenas utilizando o servidor Profunc (httpwwwebiacukthornton-
srvdatabasesprofunc) O objetivo do servidor ProFunc eacute ajudar na identificaccedilatildeo de
uma possiacutevel funccedilatildeo bioquiacutemica de uma proteiacutena a partir da sua estrutura
tridimensional Ele utiliza uma seacuterie de meacutetodos incluindo comparaccedilatildeo de
enovelamento conservaccedilatildeo dos resiacuteduos e modelos 3D funcionais tanto para
identificar provaacuteveis siacutetios ativos da proteiacutena quanto possiacuteveis homoacutelogos no Protein
Data Bank (PDB) Neste procedimento tenta-se ajustar a estrutura da proteiacutena de
interesse aos tipos de enovelamentos de proteiacutenas conhecidas Atualmente mais de
1000 tipos jaacute foram registrados e depositados em bibliotecas de enovelamentos
Sabe-se que o alinhamento estrutural entre proteiacutenas consideradas de uma
mesma famiacutelia mesmo que seja apenas na regiatildeo do siacutetio ativo pode ser um
importante meacutetodo para se inferir a funccedilatildeo da sequecircncia em estudo (LASKOWSKI et
al 2003) A evoluccedilatildeo tende a conservar funccedilotildees que dependem mais diretamente
das estruturas 3D que das similaridades entre as sequecircncias de aminoaacutecidos das
proteiacutenas (SANCHEZ et al 2000)
Neste trabalho as quatro estruturas que possuem maior similaridade
estrutural com TcKAP7 estatildeo depositadas no Protein Data Bank (PDB) com os
coacutedigos 3TQ6 4NOD 3TMM 4NNU Todas as estruturas satildeo referentes agrave proteiacutena
TFAM (fator transcricional A mitocondrial)
As estruturas proteicas foram obtidas no banco de dados puacuteblicos de
proteiacutenas PDB (Protein Data Bank) e submetidas a um alinhamento estrutural com o
modelo de TcKAP7 (FIGURA 35A) no programa WinCoot Esse alinhamento pode
ser visualizado na figura 37 As regiotildees em vermelho representam as regiotildees de
TcKAP7 que apresentam interaccedilatildeo com DNA pois se alinham com as regiotildees de
ligaccedilatildeo agrave DNA das outras proteiacutenas e as regiotildees em azul representam regiotildees sem
homologia com as demais
Esse resultado sugere que TcKAP7 pode interagir com DNA com isso estes
dados podem ser utilizados para nortear mais estudos sobre a interaccedilatildeo das
proteiacutenas KAPrsquos com o DNA do cinetoplasto de T cruzi
93
FIGURA 37 ALINHAMENTO ESTRUTURAL DE 3TQ6 4NOD 3TTM 4NNU E TCKAP7 LEGENDA Em vermelho encontram-se as regiotildees de TcKAP7 que podem interagir com DNA (Resiacuteduos 1-67 e 140-166) e em azul regiotildees sem homologia com as demais
4132 Anaacutelises preliminares da possiacutevel interaccedilatildeo entre TcKAP7 e kDNA
As prediccedilotildees estruturais sugeriram que a proteiacutena TcKAP7 possui motivos
similares agrave proteiacutenas que interagem com DNA No entanto a sequecircncia de
aminoaacutecidos entre as proteiacutenas eacute bastante baixa Como a funccedilatildeo de TcKAP7
permanece obscura foram realizados alguns ensaios para tentar verificar a
possibilidade desta proteiacutena interagir com kDNA Para isto utilizou-se a teacutecnica de
dicroiacutesmo circular para avaliar se a presenccedila de kDNA poderia resultar em
alteraccedilotildees estruturais em TcKAP7 o que seria uma evidecircncia da possiacutevel interaccedilatildeo
entre esta proteiacutena e o aacutecido nucleico
Foram realizadas medidas de dicroiacutesmo circular com amostras de TcKAP7
kDNA e TcKAP7 na presenccedila de kDNA Para a anaacutelise de dados foi realizado o
somatoacuterio das curvas obtidas com as amostras de TcKAP7 e kDNA separadamente
Este somatoacuterio resultou em uma curva teoacuterica que indica o perfil teoacuterico de uma
amostra contendo TcKAP7 e kDNA sem interaccedilotildees presentes Aacute essa curva foi
sobreposta a curva experimental da medida de dicroiacutesmo circular de TcKAP7 na
94
presenccedila de kDNA A figura 38 ilustra essa sobreposiccedilatildeo onde pode-se verificar que
as curvas natildeo se sobrepotildeem portanto alteraccedilotildees estruturais ocorrem em TcKAP7
na presenccedila de kDNA
FIGURA 38 ESPECTRO DE DICROIacuteSMO CIRCULAR DE TcKAP7 LEGENDA Em azul encontra-se o espectro experimental de TcKap7 na presenccedila de DNA em vermelho o espectro teoacuterico de TcKAP7 e DNA
Para investigar mudanccedilas estruturais associadas a interaccedilatildeo com kDNA foi
realizada uma coleta de dados de SAXS na presenccedila de 1ug de kDNA
A comparaccedilatildeo dos modelos de baixa resoluccedilatildeo por SAXS indica uma
diferenccedila conformacional pontual da proteiacutena na presenccedila de kDNA As figuras 28 e
29 mostram os envelopes da proteiacutena TcKAP7na ausecircncia (FIGURAS 39A e 40A) e
presenccedila de kDNA de T cruzi (FIGURA 39B e FIGURA 40B) Percebe-se uma
diferenccedila de densidade eletrocircnica na regiatildeo da heacutelice (Residuos 140 - 166
evidenciados em vermelho) No envelope de TcKAP7 ela eacute bastante flexiacutevel e natildeo eacute
observada densidade eletrocircnica nessa regiatildeo no entanto na presenccedila de kDNA
essa mesma regiatildeo mostra-se mais riacutegida e eacute possiacutevel estimar seu posicionamento
baseado na densidade eletrocircnica Aleacutem disso essa heacutelice eacute predita como interatora
de DNA com base nas anaacutelises estruturais previamente realizadas nesse trabalho
Esses dados sugerem uma mudanccedila conformacional da proteiacutena na presenccedila
do kDNA fazendo com que esta mude seu arranjo estrutural para permanecer ligada
agrave moleacutecula de DNA sugerindo uma interaccedilatildeo entre TcKAP7 e DNA do cinetoplasto
-22
-17
-12
-7
-2
3
200 210 220 230 240 250 260
ϴM
RW
x 1
03
(de
g cm
-2 d
mo
l-1)
Comprimento de onda (nm)
Kap7+DNA
95
de T cruzi Esses dados corroboram com o que foi visto na superfiacutecie eletrostaacutetica
(FIGURA 36) e no alinhamento estrutural (FIGURA 37)
FIGURA 39 ENVELOPE MOLECULAR DETcKAP7 LEGENDA A Monocircmero de TcKAP7 ajustado ao envelope de SAXS B Monocircmero de TcKAP7 + kDNA ajustado ao envelope de SAXSResiduos 140- 166 evidenciados em vermelho
96
FIGURA 40 ENVELOPE MOLECULAR DE TcKAP7 VISTO EM DIFERENTES AcircNGULOS LEGENDA A Monocircmero de TcKAP7 ajustado ao envelope de SAXS B Monocircmero de TcKAP7 + kDNA ajustado ao envelope de SAXS Residuos 140- 166 evidenciados em vermelho
97
5 DISCUSSAtildeO
O Trypanosoma cruzi pertence a um grupo que divergiu muito cedo na
linhagem eucarioacutetica apresentando diversas caracteriacutesticas uacutenicas em relaccedilatildeo a
outros eucariotos Uma dessas caracteriacutesticas eacute a presenccedila de uma mitococircndria
uacutenica ramificada pelo corpo do protozoaacuterio contendo uma regiatildeo especializada o
cinetoplasto onde reside o DNA mitocondrial tambeacutem conhecido como kDNA O
kDNA eacute composto por uma rede de moleacuteculas interligadas entre si os maxiciacuterculos e
os miniciacuterculos (SHAPIRO amp ENGLUND 1995) Mais de 30 proteiacutenas envolvidas na
replicaccedilatildeo e na manutenccedilatildeo do kDNA jaacute foram identificadas e acredita-se que um
nuacutemero aproximado de 100 proteiacutenas muitas delas presentes apenas em
cinetoplastiacutedeos possam estar envolvidas nesses processos (LIU et al 2005) A
maioria dessas proteiacutenas foi identificada em T brucei e C fasciculata e
possivelmente vaacuterias delas principalmente aquelas envolvidas em replicaccedilatildeo
devem estar codificadas no genoma do T cruzi
Apesar de serem conhecidos muitos dos componentes da maquinaria de
replicaccedilatildeo dos miniciacuterculos e maxiciacuterculos natildeo se pode dizer o mesmo para as
proteiacutenas envolvidas na manutenccedilatildeo da estrutura do kDNA Com exceccedilatildeo de 4
proteiacutenas com caracteriacutesticas de histonas H1 (KAP1 a 4) encontradas associadas ao
cinetoplasto de C fasciculata pouco ainda eacute conhecido sobre as proteiacutenas que
participam da organizaccedilatildeo do kDNA em outros tripanosomatiacutedeos
Zavala-Castro e colaboradores (2002) identificaram sete proteiacutenas variando
de 19 a 31 kDa associadas ao kDNA de formas epimastigotas de T cruzi a partir
de kDNA extraiacutedo de ceacutelulas fixadas com formaldeiacutedo Os tamanhos observados satildeo
compatiacuteveis com aqueles das KAPs encontradas por Xu e Ray (1993) usando
experimento similar em C fasciculata entretanto nenhuma das possiacuteveis KAPs
descritas por Zavala-Castro e colaboradores foi caracterizada
Noacutes iniciamos estudos objetivando identificar proteiacutenas envolvidas na
organizaccedilatildeo e segregaccedilatildeo do kDNA de T cruzi a partir dos dados fornecidos pelo
sequenciamento do genoma desse parasita fazendo uma comparaccedilatildeo com as
KAPs de C fasciculata Estudos realizados por Cavalcanti e colaboradores (2009)
usando como modelo as sequecircncias de KAPs de C fasciculata identificaram 35
proteiacutenas relacionadas em diferentes tripanosomatiacutedeos cujos genomas estatildeo
sequenciados (11 em T cruzi 7 em L braziliensis 6 em L major e L infantum e 5
98
em T brucei) Essas sequecircncias puderam ser agrupadas em 7 tipos diferentes de
KAPs (KAP1 a 7) Das 7 KAPs T cruzi possui 5 (TcKAP3 a 7) cuja a sintenia
gecircnica eacute uma das caracteriacutesticas marcantes jaacute que alguns genes divergem em
relaccedilatildeo ao tamanho e portanto no tamanho da proteiacutena codificada As KAPs de T
cruzi e T brucei satildeo maiores do que as de C fasciculata e Leishmania spp Isso
pode sugerir que KAPs possam ter evoluiacutedo para um tamanho que comporte
basicamente suas funccedilotildees de associaccedilatildeo com o kDNA de maneira mais eficiente
Os resultados obtidos por Cavalcanti et al (2009) para TcKAP4 e TcKAP6
mostraram que em epimastigotas e amastigotas estas duas proteiacutenas estatildeo
distribuiacutedas ao longo de toda a rede de kDNA consistente com o que foi observado
em C fasciculata (XU et al 1996 HINES amp RAY 1998) poreacutem CfKAP4 tambeacutem
apresentou um padratildeo de marcaccedilatildeo nos poacutelos opostos do kDNA sugerindo que
essa KAP em particular se associe aos miniciacuterculos receacutem-replicados antes de sua
reintegraccedilatildeo agrave rede de kDNA (XU et al 1996) Contudo em tripomastigotas de T
cruzi estas duas proteiacutenas estatildeo distribuiacutedas na periferia da rede de kDNA
(CAVALCANTI et al 2009) indicando que diferente de C fasciculata elas
apresentam uma dinacircmica de associaccedilatildeo que depende da forma evolutiva do
parasita possivelmente refletindo distintas interaccedilotildees com proteiacutenas da rede de
kDNA em epimastigotas e tripomastigotas No presente trabalho ampliamos o
conhecimento sobre as KAPs de T cruzi estudando o papel da KAP7 na fisiologia
desse parasita
Em C fasciculata a regulaccedilatildeo da expressatildeo de vaacuterios genes que codificam
proteiacutenas mitocondriais ocorre durante o ciclo celular em parte por uma sequumlecircncia
consenso [(CA)AUAGAA(GA)] presente nas regiotildees 5rsquo e 3rsquo-UTR dos respectivos
mRNAs (BROWN amp RAY 1997 MAHMOOD et al 1999 MAHMOOD amp RAY 1998
PASION et al 1996) O mesmo foi observado para L major onde uma sequecircncia
parecida com aquela encontrada em C fasciculata (CATAGA) foi identificada nas
regiotildees 5rsquo e 3rsquo de vaacuterios genes cuja a expressatildeo era maior na fase S do ciclo celular
(ZICK et al 2005) Analisando as regiotildees 5rsquo e 3rsquo do transcrito do gene TOP2 de T
cruzi que codifica a topo II mitocondrial descrito por Fragoso e Goldenberg (1992)
tambeacutem podemos observar a sequecircncia CATAGA repetida duas vezes na regiatildeo
5rsquoUTR e uma vez na regiatildeo 3rsquo-UTR do transcrito desse gene
Como relatamos neste trabalho a sequecircncia da regiatildeo 5rsquo-UTR do transcrito
TcKAP7 natildeo mostrou nenhum elemento com as caracteriacutesticas daquele envolvido na
99
regulaccedilatildeo de genes expressos na fase S do ciclo celular de outros
tripanosomatiacutedeos
Em relaccedilatildeo agrave localizaccedilatildeo de TcKAP7 verificamos atraveacutes de ensaios de
imunofluorescecircncia a distribuiccedilatildeo de TcKAP7 na regiatildeo dos poacutelos da rede de kDNA
das formas epimastigotas de T cruzi poreacutem ainda natildeo analisamos como esta
proteiacutena estaacute distribuiacuteda nas formas tripomastigotas que possuem a rede de kDNA
com formato arredondado e menos compactada
A localizaccedilatildeo de KAP7 na regiatildeo dos poacutelos do cinetoplasto de T cruzi
sugere que ela tenha funccedilotildees na replicaccedilatildeo da rede de kDNA pois nessa regiatildeo
estatildeo concentradas diversas proteiacutenas necessaacuterias para finalizaccedilatildeo do processo de
replicaccedilatildeo de miniciacuterculos
Para a construccedilatildeo do modelo molecular de TcKAP7 foram utilizadas
estruturas de duas proteiacutenas a estrutura da proteiacutena HMGB1 (2GZK) para a porccedilatildeo
amino-terminal e a estrutura da proteiacutena fator A de transcriccedilatildeo mitocondrial (3TQ6)
para a porccedilatildeo carboxi-terminal da proteiacutena ambas apresentam alta similaridade em
relaccedilatildeo agrave estrutura secundaacuteria (mais de 90) e tratam-se de proteiacutenas de um
mesmo grupo HMG (High-mobility group) Em T brucei TbKAP6 uma proteiacutena do
grupo HMG estaacute envolvida na replicaccedilatildeo e manutenccedilatildeo do kDNA (WANG et al
2014) Baseado nesses dados juntamente com os dados da imunofluorescecircncia
indireta pode-se sugerir um papel de TcKAP7 na replicaccedilatildeo da rede de kDNA
Embora ainda natildeo saibamos como KAP7 se associa com o kDNA de T
cruzi eacute possiacutevel que isso ocorra de duas maneiras atraveacutes de ligaccedilotildees
eletrostaacuteticas natildeo-especiacuteficas ou de interaccedilotildees com regiotildees especiacuteficas dos
miniciacuterculos
Atraveacutes de ensaios de SAXS foi possiacutevel perceber que a proteiacutena sofre
alteraccedilotildees conformacionais na presenccedila do kDNA sugerindo sua interaccedilatildeo com
esse aacutecido nucleacuteico Esta interaccedilatildeo pode ser eletrostaacutetica uma vez que a anaacutelise da
superfiacutecie eletrostaacutetica de TcKAP7 mostrou a predominacircncia de regiotildees ricas em
aminoaacutecidos com cargas positivas que podem conferir afinidades agrave outras proteiacutenas
com carga superficial negativa ou mesmo aacutecidos nucleicos mais uma vez sugerindo
a interaccedilatildeo com kDNA
Poreacutem natildeo se pode descartar a possibilidade de que a interaccedilatildeo de TcKAP7
com o kDNA seja atraveacutes de interaccedilotildees com regiotildees especiacuteficas dos miniciacuterculos
Nos tripanosomatiacutedeos a rede de kDNA assume a forma de um disco achatado
100
perpendicular ao flagelo onde os miniciacuterculos estatildeo alinhados em fibrilas orientadas
paralelamente ao eixo do disco (LIU et al 2005) Acredita-se que a ordenaccedilatildeo e
compactaccedilatildeo dos miniciacuterculos estatildeo relacionadas agrave proacutepria estrutura da moleacutecula de
miniciacuterculo Os miniciacuterculos apresentam regiotildees ricas em A+T que podem causar
curvaturas na moleacutecula (MARINI et al 1984 NTAMBI et al 1984) facilitando sua
inserccedilatildeo de forma ordenada no disco de kDNA aleacutem disso possuem regiotildees
conservadas onde estatildeo localizadas as origens de replicaccedilatildeo Essas regiotildees por
sua vez podem ser reconhecidas por proteiacutenas tais como a KAP7 que ajudam a
estabilizar a estrutura Os resultados com C fasciculata mostram que KAP2 3 e 4 se
ligam em regiotildees especiacuteficas dos miniciacuterculos ricas em A+T mas que natildeo satildeo
aquelas que geram a curvatura das moleacuteculas (XU et al 1996) Contudo KAP1 se
liga de maneira inespeciacutefica aos miniciacuterculos (HINES amp RAY 1998) Aleacutem disso
existe a sequecircncia universal de miniciacuterculo (UMS) e as proteiacutenas que se ligam a
essa sequecircncia (UMSBP) as quais podem participar de interaccedilotildees com as KAPrsquos
Em C fasciculata CfKAP3 sozinha consegue condensar a rede de kDNA e inibir a
decatenaccedilatildeo pela enzima topo II Poreacutem a interaccedilatildeo entre CfKAP3 e CfUMSBP
pode descondensar a rede de kDNA e reestabelecer a decatenaccedilatildeo mediada pela
topo II indicando que as proteiacutenas KAPrsquos dos tripanosomatiacutedeos podem apresentar
diferentes funccedilotildees em diferentes espeacutecies (KAPELLER et al 2011)
Para investigar a importacircncia de TcKAP7 no T cruzi e seu envolvimento ou
natildeo com o rearranjo topoloacutegico do kDNA durante o processo de diferenciaccedilatildeo do
parasita realizamos a deleccedilatildeo do gene TcKAP7 Nenhuma alteraccedilatildeo estrutural ou
morfoloacutegica na rede de kDNA foi observada no mutante de T cruzi para TcKAP7 Do
mesmo modo o parasita mutante natildeo apresentou perfil de crescimento alterado e
foi capaz de se diferenciar nas formas tripomastigotas metaciacuteclicas e infectar ceacutelulas
VERO onde se diferenciaram em formas amastigotas O mesmo foi visto quando foi
realizado o nocaute do gene TcKAP3 (DE SOUZA et al 2010)
Uma das hipoacuteteses para explicar esse fato eacute que alguma outra KAP de T
cruzi possa estar assumindo o papel da TcKAP7 talvez a TcKAP4 que se localiza
nos poacutelos do cinetoplasto quando da inserccedilatildeo dos miniciacuterculos na rede apoacutes serem
replicados na regiatildeo cinetoflagelar A redundacircncia no papel das KAPs faz com que a
rede de kDNA seja compactada e segregada corretamente mesmo na ausecircncia de
uma delas (DE SOUZA et al 2010) Sabe-se que o nocaute do gene Cfkap2 ou do
gene Cfkap3 separadamente natildeo mostrou nenhuma alteraccedilatildeo no fenoacutetipo de C
101
fasciculata Poreacutem a deleccedilatildeo de ambos os genes causou diversas alteraccedilotildees
aumento nos niacuteveis de mRNAs mitocondriais reduccedilatildeo na respiraccedilatildeo inibiccedilatildeo da
divisatildeo celular e acuacutemulo de ceacutelulas com morfologias anormais (AVLIYAKULOV et
al 2004)
Com o intuito de complementar os estudos para a caracterizaccedilatildeo do gene
TcKAP7 foram realizados ensaios de RNA de interferecircncia visando analisar a
funccedilatildeo do gene TbKAP7 ortoacutelogo em T brucei jaacute que a maquinaria de RNAi em T
cruzi eacute inexistente (DA ROCHA et al 2003) Com isso foi visto que a participaccedilatildeo da
TbKAP7 no metabolismo do T brucei eacute essencial jaacute que o silenciamento do gene
TbKAP7 levou agrave reduccedilatildeo da proliferaccedilatildeo celular do parasita corroborando com os
dados encontrados para TbKAP6 (WANG et al 2014)
Esperamos que o conhecimento das diversas moleacuteculas envolvidas na
organizaccedilatildeo e replicaccedilatildeo da rede de kDNA assim como o entendimento dos
mecanismos fisioloacutegicos que ocorrem nesta estrutura tatildeo peculiar que eacute o
cinetoplasto dos tripanosomatiacutedeos possam nos ajudar a esclarecer vaacuterios aspectos
relacionados a biologia destes eucariotos primitivos e a evoluccedilatildeo do genoma
mitocondrial ao longo do processo evolutivo
102
6 CONCLUSOtildeES
Com base nos resultados observados neste trabalho foi possiacutevel concluir
1 ndash A proteiacutena TcKAP7 eacute uma proteiacutena associada ao cinetoplasto de T
cruzi e possui caracteriacutesticas que a identificam como KAPs do tipo histona H1
incluindo seu tamanho e sua composiccedilatildeo de aminoaacutecidos e sua superfiacutecie
eletrostaacutetica
2 ndash TcKAP7 estaacute localizada nos poacutelos do cinetoplasto de T cruzi podendo
estar envolvida na replicaccedilatildeo dos miniciacuterculos
3 - TcKAP7 sofre mudanccedilas conformacionais na presenccedila do kDNA de T
cruzi evidenciando sua interaccedilatildeo com o aacutecido nucleico
4 ndash O mutante de T cruzi para TcKAP7 natildeo apresentou alteraccedilatildeo na
estrutura do cinetoplasto e na morfologia do parasita
5 ndash A proliferaccedilatildeo e a diferenciaccedilatildeo do T cruzi natildeo foram alteradas quando
o parasita teve o gene TcKAP7 deletado do genoma
6 ndash O silenciamento do gene TbKAP7 eacute essencial no metabolismo do T
brucei levando agrave reduccedilatildeo da proliferaccedilatildeo celular do parasita
103
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LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1 DISTRIBUICcedilAtildeO GEOGRAacuteFICA DA DOENCcedilA
DE CHAGAS19 FIGURA 2 CICLO DE TRANSMISSAtildeO DO
Trypanosoma cruzi20 FIGURA 3 ESQUEMA GERAL DAS PRINCIPAIS ESTRUTURAS
CELULARES DE T cruzi 22 FIGURA 4 REDE DE kDNA27 FIGURA 5 DIFERENTES ARRANJOS DO CINETOPLASTO
DE T cruzi29 FIGURA 6 MUDANCcedilAS NA POSICcedilAtildeO DO KDNA
NOS TRYPANOSOMAS29 FIGURA 7 REPOSICIONAMENTO DO KDNA EM RELACcedilAtildeO
AgraveS OUTRAS ORGANELAS DURANTEO CICLO DE VIDA DE UM FLAGELADO30
FIGURA 8 REPLICACcedilAtildeO DO kDNA32 FIGURA 9 REPRESENTACcedilAtildeO ESQUEMAacuteTICA DO
MICROFLUIDIFICADOR45 FIGURA 10 VETOR PARA EXPRESSAtildeO EM T CRUZI
P3XFLAG 50 FIGURA 11 ESQUEMA DA CONSTRUCcedilAtildeO DOS VETORES
UTILIZADOS PARA O NOCAUTE DO GENE TcKAP755
FIGURA 12 MAPA DO VETOR P2T7-177 UTILIZADO PARA ENSAIOS DE RNAi62
FIGURA 13 COMPARACcedilAtildeO ENTRE AS SEQUumlEcircNCIAS DE AMINOAacuteCIDOS DEDUZIDAS DO GENE KAP7 DE T cruzi Dm28C E DOS HAPLOacuteTIPOS DE CL BRENER65
FIGURA 14 COMPARACcedilAtildeO ENTRE AS SEQUumlEcircNCIAS DE AMINOAacuteCIDOS DEDUZIDAS DO GENE KAP7 EM DIFERENTES TRIPANOSOMATIacuteDEOS66
FIGURA 15 SINTENIA DE TcKAP7 COM OUTROS TRIPANOSOMATIacuteDEOS67
FIGURA 16 CARACTERIZACcedilAtildeO DA REGIAtildeO 5rsquo-UTR DO TRANSCRITO TcKAP769
FIGURA17 ANAacuteLISE DA EXPRESSAtildeO DA PROTEIacuteNA DE FUSAtildeO TCKAP7-FLAG EM FORMAS EPIMASTIGOTAS DE T CRUZI70
FIGURA 18 IMUNOLOCALIZACcedilAtildeO DE TcKAP7 EM EPIMASTIGOTAS DE T CRUZI71
FIGURA 19 ENSAIOS DE PCR UTILIZANDO DNA DE T cruzi kap7kap7 (WT) E T cruzi kap7neokap7higro (NO) COM DIFERENTES PRIMERS73
FIGURA 20 REPRESENTACcedilAtildeO ESQUEMAacuteTICA DOS SIacuteTIOS DA ENZIMA HindIII NO LOCUS DO GENE KAP7 DE T cruzi CL Brener75
FIGURA 21 ANAacuteLISE DA ORGANIZACcedilAtildeO DOS GENES TCKAP7 NEO E HIGRO POR ENSAIO DO TIPO SOUTHERN BLOT75
FIGURA 22 COMPARACcedilAtildeO DA EXPRESSAtildeO DO GENE TcKAP7 POR WESTERN BLOT76
FIGURA 23 COLORACcedilAtildeO PELO MEacuteTODO PANOacuteTICO RAacutePIDO DOS PARASITAS EPIMASTIGOTAS NOCAUTEADOS77
FIGURA 24 COMPARACcedilAtildeO ENTRE A ULTRAESTRUTURA DO CINETOPLASTO DO T cruzi DM28C TIPO SELVAGEM (A) E DO MUTANTE DE T cruzi PARA TcKAP7 (B) POR MICROSCOPIA ELETROcircNICA DE TRANSMISSAtildeO78
FIGURA 25 CURVA DE CRESCIMENTO DO MUTANTE DE T cruzi PARA TcKAP7 (KO) E DO T cruzi Dm28c SELVAGEM (WT) 79
FIGURA 26 METACICLOGEcircNESE IN VITRO DE T cruzi Dm28c TIPO SELVAGEM E T cruzi NOCAUTEADO80
FIGURA 27 RNAi DE TbKAP7 INIBE O CRESCIMENTO DAS FORMAS PROCIacuteCLICAS DE T brucei82
FIGURA 28 PURIFICACcedilAtildeO DE TCKAP7 ATRAVEacuteS DE CROMATOGRAFIA DE AFINIDADE83
FIGURA 29 PURIFICACcedilAtildeO DE TCKAP7 ATRAVEacuteS DE CROMATOGRAFIA DE TROCA IOcircNICA84
FIGURA 30 ANAacuteLISE POR DLS DE TCKAP785 FIGURA 31 ENVELOPE MOLECULAR DE SAXS86 FIGURA 32 ESPECTRO DE DICROIacuteSMO CIRCULAR DE
TcKAP787 FIGURA 33 PREDICcedilAtildeO DE ESTRUTURA SECUNDAacuteRIA DE
TcKAP787 FIGURA 34 CRISTAL DE TcKAP7 DE T CRUZI88 FIGURA 35 ESTRUTURA DE TcKAP790 FIGURA 36 SUPERFIacuteCIE ELETROSTAacuteTICA DE
TcKAP791 FIGURA 37 ALINHAMENTO ESTRUTURAL DE 3TQ6 4NOD
3TTM 4NNU E TCKAP793 FIGURA 38 ESPECTRO DE DICROIacuteSMO CIRCULAR
DE TcKAP794 FIGURA 39 ENVELOPE MOLECULAR DETcKAP795 FIGURA 40 ENVELOPE MOLECULAR DETcKAP7 VISTO EM
DIFERENTES AcircNGULOS96
LISTA DE TABELAS
TABELA 1 RELACcedilAtildeO DOS PRIMERS UTILIZADOS PARA A CLONAGEM DA REGIAtildeO UPSTREAM DE TcKAP7 NO VETOR pNEO153
TABELA 2 RELACcedilAtildeO DOS PRIMERS UTILIZADOS PARA A CLONAGEM DA REGIAtildeO DOWNSTREAM DE TcKAP7 NO VETOR pNEO153
TABELA 3 RELACcedilAtildeO DOS PRIMERS UTILIZADOS PARA A AMPLIFICACcedilAtildeO DO GENE TbKAP763
TABELA 4ndash PERCENTUAL DE IDENTIDADE ENTRE AS PROTEIacuteNAS KAP7 NOS TRIPANOSSOMATIacuteDEOS COM O GENOMA SEQUENCIADO67
TABELA 5 COMBINACcedilOtildeES DE PRIMERS UTILIZADOS NA PCR PARA CONFIRMAR O NOCAUTE DE TcKAP772
SUMAacuteRIO
1 INTRODUCcedilAtildeO18 11 O Trypanosoma cruzi18 12 Ciclo de vida do T cruzi20 13 Aspectos celulares de T cruzi21 14 O genoma de T cruzi24 15 Expressatildeo gecircnica de Tcruzi25 16 O cinetoplasto26 17 A rede de kDNA26 171 Replicaccedilatildeo do kDNA31 18 Proteiacutenas associadas ao cinetoplasto (KAPs)32 2 OBJETIVOS35 21 OBJETIVO GERAL35 211 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS35 3 MATERIAIS E MEacuteTODOS36 31 Reagentes e Soluccedilotildees Utilizados36 311 Reagentes36 312 Tampotildees e Soluccedilotildees36 313 Meios de cultura38 32 Cultivo do Trypanosoma cruzi38 321 Epimastigotas38 322 Tripomastigotas metaciacuteclicos39 33 Curva de crescimento de T cruzi39 34 Obtenccedilatildeo de DNA de T cruzi40 35 Obtenccedilatildeo de kDNA de T cruzi40 36 Obtenccedilatildeo de extrato proteico de T cruzi40 37 Clonagem do gene TcKAP741 38 Obtenccedilatildeo do cDNA de TcKAP7 atraveacutes de ensaio de RT-PCR41 39 Seleccedilatildeo dos clones recombinantes42 391 Teacutecnica de palitagem (toothpick)42 392 Teacutecnica de PCR de colocircnia43 310 Preparaccedilatildeo de plasmiacutedeo em pequena escala (miniprep)43 311 Expressatildeo da proteiacutena TcKAP7 em E coli43 312 Purificaccedilatildeo da proteiacutena recombinante TcKAP744 3121 Processamento da amostra44 3122 Cromatografia de afinidade45 3123 Cromatografia de troca iocircnica46 3124 Cromatografia de gel filtraccedilatildeo46 313 Espalhamento Dinacircmico de Luz ndash DLS46 314 Espectroscopia de dicroiacutesmo circular (CD)46 315 Quantificaccedilatildeo e concentraccedilatildeo47 316 Ensaios de Cristalizaccedilatildeo47 317 Espalhamento de raio-X a baixo acircngulo (SAXS)48 318 Modelagem de TcKAP748 319 Obtenccedilatildeo de antissoro policlonal contra TcKAP749 320 Anaacutelise da expressatildeo do gene TcKAP7 e de seu mutante por ensaio tipo western blot49 321 Superexpressatildeo de TcKAP750
3211 Amplificaccedilatildeo e clonagem do gene TcKAP7 no vetor pNEO3xFlag para superexpressatildeo da proteiacutena50 3212 Transfecccedilatildeo por eletroporaccedilatildeo52 3213 Seleccedilatildeo dos transfectantes52 322 Deleccedilatildeo do gene TcKAP7 por nocaute gecircnico53 3221 Amplificaccedilatildeo e clonagem das regiotildees a montante e a jusante do gene TcKAP753 3222 Amplificaccedilatildeo dos cassetes UPS-NEO-DOWN e UPS-HIGRO-DOWN para transfecccedilatildeo de T cruzi55 3223 Transfecccedilatildeo do T cruzi com o cassete UPS-NEO-DOWN56 3224 Extraccedilatildeo de DNA dos transfectantes57 3225 Anaacutelise por PCR do DNA dos parasitas transfectados com o cassete UPS-NEO-DOWN57 3226 Transfecccedilatildeo do T cruzi com o cassete UPS-HIGRO-DOWN57 3227 Anaacutelise por PCR do DNA dos parasitas transfectados com o cassete UPS-HIGRO-DOWN58 3228 Anaacutelise da organizaccedilatildeo do gene TcKAP7 e da eficiecircncia de seu nocaute atraveacutes de ensaio do tipo Southern blot58 323 Localizaccedilatildeo celular da proteiacutena TcKAP7 atraveacutes de ensaio de imunofluorescecircncia59 324 Anaacutelise da ultraestrutura do cinetoplasto do mutante de T cruzi para TcKAP7 por microscopia eletrocircnica de transmissatildeo60 325 Coloraccedilatildeo dos parasitas transfectados60 326 Infecccedilatildeo de ceacutelulas Vero com o mutante de T cruzi para TcKAP761 327 Anaacutelise da funccedilatildeo do gene TbKAP7 de Trypanosoma brucei atraveacutes de ensaios de RNA de interferecircncia61 3271 Induccedilatildeo do RNA dupla fita64 4 RESULTADOS65 41 Clonagem e caracterizaccedilatildeo do gene TcKAP765 42 Expressatildeo da proteiacutena TcKAP7 em T cruzi69 43 Localizaccedilatildeo celular de TcKAP7 atraveacutes de ensaio de imunofluorescecircncia70 44 Deleccedilatildeo do gene TcKAP7 por nocaute gecircnico71 441 Anaacutelise por PCR do DNA dos parasitas transfectados com os cassetes UPS-NEO-DOWN e UPS-HIGRO-DOWN72 442 Anaacutelise da organizaccedilatildeo dos genes TcKAP7 neo e higro por ensaio do tipo Southern blot74 45 Comparaccedilatildeo da expressatildeo do gene TcKAP7 por western blot76 46 Anaacutelise da morfologia e da ultraestrutura do cinetoplasto do mutante de T cruzi para TcKAP776 47 Multiplicaccedilatildeo diferenciaccedilatildeo e infectividade do mutante de T cruzi para TcKAP779 48 Anaacutelise da funccedilatildeo do gene KAP7 de Trypanosoma brucei atraveacutes de ensaios de RNA de interferecircncia80 49 Caracterizaccedilatildeo estrutural de TcKAP782 491 Produccedilatildeo recombinante de TcKAP782 410 Anaacutelise do estado oligomeacuterico de TcKAP784 411 Anaacutelise do conteuacutedo de estrutura secundaacuteria de TcKAP7 recombinante86 412 Anaacutelise estrutural de TcKAP787
413 Investigaccedilatildeo de possiacuteveis funcionalidades baseadas na estrutura de TcKAP791 4131 Prediccedilatildeo de funccedilatildeo paraTcKAP791 4132 Anaacutelises preliminares da possiacutevel interaccedilatildeo entre TcKAP7 e kDNA93 5 DISCUSSAtildeO97 6 CONCLUSOtildeES102 7 REFEREcircNCIAS103
18
1 INTRODUCcedilAtildeO
11 O Trypanosoma cruzi
Trypanosoma cruzi eacute um protozoaacuterio flagelado unicelular pertencente ao
reino Protista subreino Protozoa filo Sarcomastigophora subfilo Mastigophora
classe Zoomastigophora ordem Kinetoplastida e famiacutelia Trypanosomatidae (LEVINE
et al 1980) A principal caracteriacutestica dessa ordem eacute a presenccedila de uma estrutura
singular o cinetoplasto que abriga em uma massa de DNA extranuclear
concentrado na mitococircndria uacutenica deste protista (SHAPIRO amp ENGLUND 1995) A
famiacutelia Trypanosomatidae inclui os seguintes gecircneros importantes Blastocrithidia
Crithidia Endotrypanum Herpetomonas Leishmania Leptomonas Phytomonas e
Trypanosoma O gecircnero Trypanosoma eacute um dos mais importantes dentro da famiacutelia
Trypanosomatidae por incluir uma seacuterie de espeacutecies causadoras de doenccedilas
humanas importantes como o Trypanosoma cruzi agente da doenccedila de Chagas
Trypanosoma rhodesiense e Trypanosoma gambiense agentes da doenccedila do sono
e de animais o Trypanosoma brucei Trypanosoma equiperdum e Trypanosoma
equinum (DE SOUZA 2015)
Este protozoaacuterio eacute um microrganismo heteroxecircnico com ciclo bioloacutegico
alternado entre hospedeiros vertebrados (mamiacuteferos) e invertebrados (triatomiacuteneos)
Existem diferentes formas de transmissatildeo da doenccedila dentre as quais se destaca a
via vetorial que consiste na transmissatildeo do parasita atraveacutes de excretas do inseto
vetor hematoacutefago pertencente agrave ordem Hemiacuteptera famiacutelia Reduvidae subfamiacutelia
Triatominae (DIAS et al 1956) A principal caracteriacutestica bioloacutegica dos triatomiacuteneos
eacute que satildeo obrigatoriamente hematoacutefagos e necessitam do repasto sanguiacuteneo para
completar o desenvolvimento (DIAS 2000) O parasita pode ainda ser transmitido
aos mamiacuteferos por transfusatildeo sanguiacutenea ou via oral e com menos frequecircncia por
via congecircnita acidentes de laboratoacuterio e transplantes de oacutergatildeos (BELTRAO HDE et
al 2009 STEINDEL et al 2008 TANOWITZ et al 1992) Praticamente todo tipo
de ceacutelula nucleada do hospedeiro mamiacutefero pode ser parasitada considerando o
tropismo das diferentes cepas (LENZI et al 1996) Outra caracteriacutestica deste
parasita eacute apresentar diferentes morfologias durante o ciclo bioloacutegico A classificaccedilatildeo
19
de suas formas baseia-se tambeacutem na posiccedilatildeo do cinetoplasto em relaccedilatildeo ao nuacutecleo
e do local de onde emerge o flagelo (HOARE 1971)
Foi no ano de 1909 no estado de Minas Gerais que Carlos Chagas meacutedico
sanitarista identificou pela primeira vez o protozoaacuterio parasita Trypanosoma cruzi
agente causador da Doenccedila de Chagas A doenccedila de Chagas eacute endecircmica na
Ameacuterica Latina sendo conhecida a existecircncia de vetores da doenccedila desde o sul dos
Estados Unidos agrave Argentina (FIGURA 1)
FIGURA 1 DISTRIBUICcedilAtildeO GEOGRAacuteFICA DA DOENCcedilA DE CHAGAS FONTE Modificado de httpwwwwhointen
Em 2008 o nuacutemero de indiviacuteduos infectados era estimado entre 16 e 18
milhotildees sendo que aproximadamente 90 milhotildees de pessoas estariam sob risco
de contaminaccedilatildeo na Ameacuterica Latina (WHO 2010)
Apesar de existirem drogas (Nifurtimox e Benzonidazol) para o tratamento
da doenccedila sua ineficaacutecia no estaacutegio crocircnico e sua accedilatildeo toacutexica acabam prejudicando
o paciente sem conseguir eliminar o parasita (BRENER et al 2000) Sem vacinas
ou tratamento quimioteraacutepico eficiente a principal estrateacutegia de controle limita-se agrave
prevenccedilatildeo da transmissatildeo por transfusatildeo sanguiacutenea e ao controle populacional dos
vetores triatomiacuteneos Aleacutem da sua importacircncia como patoacutegeno humano este micro-
organismo apresenta caracteriacutesticas peculiares que o tornam um excelente modelo
para o estudo de questotildees bioloacutegicas baacutesicas
Regiotildees endecircmicas
20
12 Ciclo de vida do T cruzi
O T cruzi apresenta um ciclo complexo na natureza sofrendo mudanccedilas
estruturais bioquiacutemicas e morfoloacutegicas de acordo com o ambiente em que se
encontra Formas replicativas epimastigotas e amastigotas dos hospedeiros
invertebrado e mamiacutefero respectivamente alternam-se com as formas infectivas e
natildeo proliferativas tripomastigotas metaciacuteclicas (proveniente do inseto vetor) e
tripomastigota sanguiacutenea (originaacuteria do mamiacutefero infectado) (FIGURA 2) (DE
SOUZA 1984)
FIGURA 2 CICLO DE TRANSMISSAtildeO DO Trypanosoma cruzi FONTE Infograacutefico Veniacutecio Ribeiro ICICTFIOCRUZ
Durante o repasto sanguiacuteneo do inseto vetor formas tripomastigotas
metaciacuteclicas atingem a corrente sanguiacutenea do hospedeiro pela lesatildeo da picada Esta
forma infectiva eacute capaz de invadir todos os tipos de ceacutelulas com exceccedilatildeo das
21
hemaacutecias Apoacutes a entrada do parasita na ceacutelula os tripomastigotas diferenciam-se
em uma forma replicativa denominada amastigota que apoacutes diversas divisotildees sofre
uma diferenciaccedilatildeo para um estaacutegio intermediaacuterio o epimastigota intracelular e
posteriormente para tripomastigota Quando ocorre a lise celular os tripomastigotas
satildeo liberados ao meio extracelular podendo entatildeo invadir ceacutelulas vizinhas atingir
novos tecidos atraveacutes da corrente sanguiacutenea ou ainda infectar um inseto vetor
durante o processo de hematofagia recomeccedilando o ciclo no hospedeiro
invertebrado No inseto as formas tripomastigotas diferenciam-se em epimastigotas
no tubo digestivo e migram para o intestino onde ocorrem as divisotildees binaacuterias Ao
atingirem a porccedilatildeo terminal do tubo digestivo ocorre a diferenciaccedilatildeo em
tripomastigotas metaciacuteclicos que satildeo eliminados juntamente com as fezes e urina do
triatomiacutedeo
A transformaccedilatildeo da forma epimastigota do T cruzi em tripomastigota
metaciacuteclica denominada metaciclogecircnese eacute de grande interesse de estudo pois
neste processo ocorrem diversas alteraccedilotildees morfoloacutegicas metaboacutelicas e de
expressatildeo gecircnica (GOLDENBERG et al 1985) A metaciclogecircnese que ocorre
naturalmente no intestino do inseto vetor pode ser mimetizada in vitro utilizando-se
meio quimicamente definido que simula as condiccedilotildees da urina do inseto vetor
(CONTRERAS et al 1985)
13 Aspectos celulares de T cruzi
O Trypanosoma cruzi apresenta aleacutem das organelas tiacutepicas da maioria das
ceacutelulas eucarioacuteticas como nuacutecleo retiacuteculo endoplasmaacutetico aparato de Golgi e
mitococircndria algumas estruturas peculiares (FIGURA 3) como os microtuacutebulos
subpeliculares a estrutura paraflagelar os reservossomos o cinetoplasto os
glicossomos e os acidocalcisomos exclusivos dos tripanosomatiacutedeos (revisto por
DE SOUZA 1984 1999 2002)
22
FIGURA 3 ESQUEMA GERAL DAS PRINCIPAIS ESTRUTURAS CELULARES DE T cruzi FONTE DOCAMPO et al 1975
A superfiacutecie celular dos tripanossomatiacutedeos eacute composta principalmente
pela membrana plasmaacutetica e pelos microtuacutebulos subpeliculares Pequenos
filamentos conectam fortemente os microtuacutebulos subpeliculares os quais se
apresentam espaccedilados de forma regular entre si e com a membrana plasmaacutetica (DE
23
SOUZA SANTANNA CUNHA-E-SILVA 2009) conferindo rigidez agrave ceacutelula e
resistecircncia ao rompimento mecacircnico
Todos os membros da famiacutelia Trypanosomatidae apresentam um flagelo
que emerge de uma aacuterea de invaginaccedilatildeo da membrana plasmaacutetica conhecida como
bolsa flagelar Devido agrave localizaccedilatildeo especiacutefica de vaacuterios receptores nesta aacuterea
acredita-se que a maior parte do traacutefego vesicular e entrada de nutrientes ocorram
nesta regiatildeo Outra invaginaccedilatildeo menor localizada proacutexima agrave bolsa flagelar o
citoacutestomo tambeacutem estaacute envolvida com a absorccedilatildeo de nutrientes (PORTO-
CARREIRO et al 2000)
O flagelo do T cruzi apresenta uma estrutura baacutesica semelhante a outros
flagelos sendo envolvido por uma membrana flagelar e contendo um axonema
tiacutepico que apresenta um padratildeo de nove pares de microtuacutebulos perifeacutericos e um par
central Associado ao flagelo deste parasita eacute encontrado um complexo arranjo de
filamentos proteacuteicos denominado de estrutura paraflagelar (revisto por GULL 1999)
Na parte posterior da ceacutelula existem organelas usualmente esfeacutericas
denominadas reservossomos Os reservossomos satildeo organelas aacutecidas que
possuem em seu interior proteinases principalmente a cruzipaiacutena (uma
cisteiacutenoproteinase) e proteiacutenas ingeridas que chegam dentro de vesiacuteculas
endociacuteticas oriundas da bolsa flagelar e do citoacutestomo Com base nisso foi proposto
que os reservossomos seriam compartimentos preacute-lisossomais (SOARES et al
1992) Tambeacutem tem sido proposta a participaccedilatildeo dos reservossomos no processo
de metaciclogecircnese como principal fonte de energia para esta atividade (SOARES
1999)
O T cruzi assim como todos os membros da famiacutelia Tripanosomatidae
apresenta uma mitococircndria uacutenica e ramificada que se estende por todo o corpo do
protozoaacuterio Como em todas as ceacutelulas eucarioacuteticas a mitococircndria dos
tripanosomatiacutedeos tambeacutem apresenta DNA mitocondrial tambeacutem conhecido como
kDNA ou DNA do cinetoplasto que se concentra em uma determinada regiatildeo da
mitococircndria localizada logo abaixo do corpuacutesculo basal dando origem a uma
estrutura intramitocondrial chamada de cinetoplasto O cinetoplasto abriga o kDNA
o qual eacute constituiacutedo por moleacuteculas circulares que se encontram interligadas
formando uma extensa rede entre si (SHLOMAI 1994)
Distribuiacutedos pelo citoplasma estatildeo os glicossomos um tipo especializado de
peroxissomo Estes acumulam enzimas da via glicoliacutetica envolvidas na conversatildeo
24
da glicose a 3-fosfoglicerato que em outros organismos localizam-se no citoplasma
(HANNAERT et al 2003)
Outra particularidade dos tripanossomatiacutedeos estaacute na estocagem intracelular
de caacutelcio Este iacuteon importante nos processos de sinalizaccedilatildeo celular eacute estocado em
organelas denominadas acidocalcissomos Os acidocalcissomos provavelmente
estatildeo envolvidos em diversos processos bioloacutegicos tais como o armazenamento de
caacutelcio e polifosfatos adaptaccedilatildeo dos tripanosomatiacutedeos a condiccedilotildees de estresse
ambiental manutenccedilatildeo do pH intracelular e osmorregulaccedilatildeo (revisto por DOCAMPO
et al 2005)
14 O genoma de T cruzi
No ano de 2005 foi concluiacuteda a montagem do genoma do T cruzi (EL-
SAYED et al 2005) A cepa CL Brener foi a escolhida para o sequenciamento por
ser bem caracterizada bioquiacutemica e parasitologicamente (ZINGALES et al 1997) e
por ser considerada representativa para o universo de cepas circulantes de T cruzi
Com base na montagem do sequenciamento o genoma diploacuteide do parasita foi
calculado como sendo de 1064 1107 Mb com cada haploacutetipo contendo cerca de
12000 genes sendo que mais de 50 do genoma constituiu-se de sequecircncias
repetitivas compostas por famiacutelias de proteiacutenas de superfiacutecie retrotransposons e
elementos subtelomeacutericos (EL-SAYED et al 2005)
A comparaccedilatildeo das estruturas genocircmicas e proteiacutenas preditas obtidas a
partir do sequenciamento de Trypanosoma cruzi com as de Leishmania major e
Trypanosoma brucei indica mais similaridade entre T cruzi e T brucei uma grande
conservaccedilatildeo entre os respectivos proteomas (exceto para antiacutegenos de superfiacutecie) e
uma sintenia bastante conservada entre os trecircs tripanosomatiacutedeos apesar da
divergecircncia haacute 200-500 milhotildees de anos atraacutes (BERRIMAN et al 2005 EL SAYED
et al 2005 IVENS et al 2005)
Os tripanosomatiacutedeos possuem aleacutem do genoma nuclear um grande
genoma mitocondrial (kDNA) que tem sido extensivamente estudado sendo uacutenico
em estrutura funccedilatildeo e mecanismo de replicaccedilatildeo O kDNA eacute formado por milhares de
moleacuteculas circulares topologicamente relaxadas e interligadas umas as outras Este
arranjo conteacutem aproximadamente 20 - 30 do DNA total dos tripanosomatiacutedeos e eacute
composto por 2 tipos de moleacuteculas circulares os maxiciacuterculos e os miniciacuterculos Os
25
maxiciacuterculos apresentam um tamanho entre 22-37 kb e conteacutem basicamente os
genes codificadores de proteiacutenas envolvidas na fosforilaccedilatildeo oxidativa e RNA
ribossocircmico Os miniciacuterculos com um tamanho que varia de espeacutecie para espeacutecie
(05 a 25 kb) conteacutem os genes que codificam os RNAs guia envolvidos na
editoraccedilatildeo do RNA (STUART et al 1989 SHAPIRO amp ENGLUND 1995 MADISON-
ANTENUCCI et al 2002 SIMPSON et al 2003 ONN et al 2006 GLUENZ et al
2007)
15 Expressatildeo gecircnica de Tcruzi
T cruzi estaacute sujeito agraves frequentes mudanccedilas de ambientes decorrentes da
passagem por diferentes hospedeiros durante seu ciclo de vida (temperatura pH
quantidade de nutrientes evasatildeo do sistema imune) por esse motivo a expressatildeo
gecircnica deste parasita eacute regulada por diversos fatores A adaptaccedilatildeo raacutepida e eficiente
a estas diferentes condiccedilotildees torna-se uma importante tarefa para o parasita
Como os demais eucariotos o T cruzi apresenta trecircs RNAs polimerases a
RNA polimerase I transcreve os genes para RNAs ribossocircmicos a RNA polimerase
II os genes que codificam proteiacutenas e a RNA polimerase III pequenos RNAs como
o tRNA (RNA de transferecircncia) Nos tripanosomatiacutedeos promotores para as RNA
polimerase I e III jaacute foram identificados poreacutem ainda natildeo foram identificados
promotores para os genes transcritos pela RNA polimerase II com exceccedilatildeo de um
promotor associado ao gene do mini-exon (GILLINGER amp BELLOFATTO 2001
revisto por CAMPBELL et al 2003)
Os genes dos tripanosomatiacutedeos estatildeo organizados em unidades
policistrocircnicas e natildeo apresentam interrupccedilotildees por iacutentrons com exceccedilatildeo do gene da
poli-A polimerase (MAIR et al 2000)
Uma vez que em T cruzi como nos demais eucariotos somente mRNAs
monocistrocircnicos satildeo traduzidos os precursores de mRNA policistrocircnicos devem ser
processados ateacute mRNAs individuais Como caracteriacutestica desta famiacutelia os
transcritos de mRNA satildeo processados por mecanismos de trans-splicing (AGABIAN
1990) e poliadenilaccedilatildeo (LEBOWITZ et al 1993 MATTHEWS et al 1994
VANHAMME amp PAYS 1995)
No processo de trans-splicing as unidades codificadoras satildeo separadas e eacute
adicionada na extremidade 5rsquo uma sequecircncia extremamente conservada espeacutecie-
26
especiacutefica de 39 nucleotiacutedeos denominada sequumlecircncia liacuteder (SL) ou minieacutexon
(McCARTHY-BURKE et al 1989 NILSEN 1992 VANHAMME amp PAYS 1995)
Nesta reaccedilatildeo participam duas moleacuteculas de RNA uma doadora e outra aceptora A
doadora eacute um precursor do mini-exon e em T cruzi possui cerca de 110
nucleotiacutedeos (ZWIERZYNSKI amp BUCK 1991) A aceptora eacute o transcrito derivado da
unidade policistrocircnica ao qual o mini-exon eacute transferido O complexo enzimaacutetico
envolvido nesta reaccedilatildeo eacute semelhante ao descrito para a de cis-splicing (LAIRD
1989)
Os transcritos processados satildeo estabilizados pela estrutura cap 4 do mini-
exon (ULLU amp TSCHUDI 1991) e pela adiccedilatildeo de uma cauda poli-A agrave extremidade
3rsquo sendo que a adiccedilatildeo de ambos os elementos ocorrem em conjunto (LEBOWITZ et
al 1993) Regiotildees ricas em resiacuteduos de pirimidinas aleacutem da sequumlecircncia consenso
(AG) para o trans-splicing regulam a adiccedilatildeo do mini-exon e da cauda poli-A
Deleccedilotildees nestas regiotildees impedem o correto processamento destes transcritos
(MATTHEWS et al 1994)
A ocorrecircncia de transcriccedilatildeo policistrocircnica associada agrave ausecircncia de
promotores para RNA polimerase II e agrave presenccedila de niacuteveis distintos de mRNA
originados de uma mesma unidade policistrocircnica sugerem que a regulaccedilatildeo da
expressatildeo gecircnica nesses protozoaacuterios ocorra a niacutevel poacutes-transcricional baseada
principalmente em mecanismos que controlam a estabilidade e a traduccedilatildeo dos
mRNAs (CLAYTON 2002 BOUCHER et al 2002)
16 O cinetoplasto
O cinetoplasto eacute uma estrutura peculiar presente nos tripanosomatiacutedeos e
encontra-se inserida no interior da mitococircndria uacutenica abrigando fibrilas de DNA
conhecidas como kDNA O nome cinetoplasto (cineto=movimento e plasto=organela)
foi dado pois se acreditava que o mesmo fosse responsaacutevel pelo movimento do
flagelo
17 A rede de kDNA
O DNA do cinetoplasto eacute formado por dois tipos de moleacuteculas circulares os
miniciacuterculos de tamanho entre 05 e 25 kb e os maxiciacuterculos que apresentam
entre 20 e 40 kb Cerca de 10000 miniciacuterculos e 50 maxiciacuterculos se encontram
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catenados formando uma extensa rede (SHAPIRO amp ENGLUND 1995 DE SOUZA amp
CAVALCANTI 2008) (FIGURA 4)
FIGURA 4 REDE DE kDNA
FONTE ROY CHOWDHURY et al 2010
As primeiras questotildees relacionadas ao arranjo das moleacuteculas na rede do
kDNA dos tripanosomatiacutedeos surgiram na deacutecada de 80 sugerindo que tal
organizaccedilatildeo poderia ter evoluiacutedo como um maneira mais eficaz de armazenar uma
grande quantidade de material em um pequeno espaccedilo (HAJDUK et al 1986)
Os maxiciacuterculos apresentam um tamanho de 22 a 37 kb e assim como o
DNA mitocondrial de outros eucariotos codificam RNAs ribossomais e diversas
proteiacutenas da cadeia respiratoacuteria incluindo subunidades da citocromo oxidase e
NADH desidrogenase (revisto por SHAPIRO amp ENGLUND 1995) Os transcritos dos
maxiciacuterculos satildeo processados poacutes-transcricionalmente para formar mRNAs
funcionais atraveacutes de um processo conhecido como ediccedilatildeo ou editoraccedilatildeo do RNA
A editoraccedilatildeo do RNA consiste na inserccedilatildeo ou retirada de resiacuteduos de uridina em
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siacutetios especiacuteficos dos RNAs transcritos pelos maxiciacuterculos a fim de criar coacutedons de
iniciaccedilatildeo ou terminaccedilatildeo mudanccedilas na fase de leitura ou quadros abertos de leitura a
partir de sequumlecircncias sem sentido O processo de ediccedilatildeo eacute especificado por
pequenos RNAs guias produzidos pelos miniciacuterculos e maxiciacuterculos e catalisado
por um complexo muiltiproteacuteico o editosomo (revisto por Esteacutevez amp Simpson 1999
Stuart et al 2005) Esse processo constitui uma forma de regular poacutes-
transcricionalmente a expressatildeo de genes mitocondriais nas diferentes formas
evolutivas do parasita
Os miniciacuterculos caracterizam-se por apresentar um tamanho de 05 a 25 kb
e por transcrever os RNAs guia (gRNA) responsaacuteveis pela especificidade da ediccedilatildeo
dos mRNAs codificados pelos maxiciacuterculos por meio de uma sequumlecircncia presente na
porccedilatildeo central desses gRNAs (BENNE 1994 STUART et al 2005) A significacircncia
da variaccedilatildeo em tamanho e organizaccedilatildeo entre as espeacutecies ainda natildeo eacute aparente
contudo a diversidade das sequecircncias dos miniciacuterculos estaacute correlacionada com a
necessidade de mais ou menos ediccedilatildeo de mRNA de cada organismo (STUART
1991) Apesar desta diversidade os miniciacuterculos apresentam pelo menos duas
regiotildees conservadas o dodecacircmero GGGGTTGGTGTA conhecido como sequecircncia
universal dos miniciacuterculos (UMS) e o hexacircmero ACGCCC que correspondem agrave
origem de replicaccedilatildeo da fita L (light) e da fita H (heavy) respectivamente
(BIRKENMEYER amp RAY 1986 BIRKENMEYER et al 1987 RAY 1989 SHLOMAI
1994 HINES amp RAY 2008)
Embora o cinetoplasto de todos os tripanosomatiacutedeos seja formado por
moleacuteculas circulares relaxadas e catenadas diferentes arranjos da rede de kDNA
podem ser observados entre diferentes estaacutegios do ciclo de vida desses
protozoaacuterios como em T cruzi (FIGURA 5) assim como mudanccedilas na posiccedilatildeo do
kDNA satildeo utilizadas para identificar as diferentes formas evolutivas do parasita
(FIGURA 6)
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FIGURA 5 ndash DIFERENTES ARRANJOS DO CINETOPLASTO DE T cruzi
LEGENDA As fibrilas de kDNA se apresentam bastante compactadas em forma de bastatildeo nas formas amastigotas (A) e epimastigotas (B) enquanto nas formas tripomastigotas a rede de kDNA torna-se menos compacta e a forma em bastatildeo do cinetoplasto daacute lugar a uma forma arredondada (C) FONTE DE SOUZA amp SOUTO-PADRON 1980 e DE SOUZA 1984
Nas formas amastigota (FIGURA 5A) e epimastigota (FIGURA 5B) de T
cruzi as fibrilas de kDNA se apresentam bastante compactadas em forma de
bastatildeo Em tripomastigotas (FIGURA 5C) de T cruzi a rede de kDNA torna-se
menos compacta e a forma em bastatildeo do cinetoplasto daacute lugar a uma forma
arredondada (DE SOUZA 1984) Os vaacuterios graus de compactaccedilatildeo do kDNA em
tripanosomatiacutedeos podem estar relacionados com a accedilatildeo de proteiacutenas que
condensam o DNA como seraacute visto mais adiante
FIGURA 6 MUDANCcedilAS NA POSICcedilAtildeO DO KDNA NOS TRYPANOSOMAS FONTE Modificado de DO CAMPO et al 2005
30
O cinetoplasto de todos os tripanosomatiacutedeos encontra-se localizado
proacuteximo ao corpo basal perpendicularmente ao eixo do flagelo Em alguns
tripanosomatiacutedeos que sofrem diferenciaccedilatildeo ao longo de seu ciclo de vida como o
T cruzi o cinetoplasto muda de posiccedilatildeo dentro da ceacutelula passando da regiatildeo
anterior (nos epimastigotas) para a regiatildeo posterior (nos tripomastigotas) poreacutem
permanecendo proacuteximo e perpendicular ao corpo basal (FIGURA 7) O cinetoplasto
eacute fisicamente conectado ao corpo basal atraveacutes de um grupo de filamentos
citoplasmaacuteticos chamado de complexo de ligaccedilatildeo tripartite (TAC) (OGBADOYI et al
2003) Este complexo eacute responsaacutevel pelo posicionamento espacial do cinetoplasto e
por sua segregaccedilatildeo
FIGURA 7 REPOSICIONAMENTO DO KDNA EM RELACcedilAtildeO AgraveS OUTRAS ORGANELAS DURANTE O CICLO DE VIDA DE UM FLAGELADO LEGENDA A morfologia eacute definida pelas posiccedilotildees do ponto onde emerge o flagelo e a bolsa flagelar (BF) (mostrada em laranja) nuacutecleo (mostrado em azul) e kDNA (mostrado em roxo) FONTE Modificado de FIELD amp CARRINGTON 2009
31
171 Replicaccedilatildeo do kDNA
Nos tripanosomatiacutedeos a replicaccedilatildeo do kDNA eacute restrita a fase S nuclear
(COSGROVE amp SKEEN 1970 WOODWARD amp GULL 1990) diferente do que
acontece na maioria dos eucariotos onde a replicaccedilatildeo do DNA mitocondrial ocorre
ao longo do ciclo celular (LIU et al 2005)
A replicaccedilatildeo dos miniciacuterculos se inicia quando estes satildeo individualmente
decatenados da rede de kDNA pela accedilatildeo de DNA topoisomerases do tipo II pois
estes natildeo se replicam enquanto estatildeo ligados agrave rede e termina quando os
miniciacuterculos retornam para a rede com a ajuda da mesma enzima (SHAPIRO amp
ENGLUND 1995)
Os miniciacuterculos satildeo liberados da rede em direccedilatildeo a zona cinetoflagelar
(KFZ) uma regiatildeo especializada da matriz mitocondrial entre o kDNA e o corpo
basal (FIGURA 8) que abriga proteiacutenas envolvidas com o iniacutecio da replicaccedilatildeo Em
seguida os ciacuterculos migram (ou satildeo transportados) para os poacutelos opostos da rede
de kDNA para completar sua replicaccedilatildeo O iniacutecio da replicaccedilatildeo dos miniciacuterculos na
regiatildeo cinetoflagelar envolve a montagem de um complexo proteacuteico na origem de
replicaccedilatildeo dos ciacuterculos com a participaccedilatildeo da primase polimerase e proteiacutenas que
se ligam agrave sequumlecircncia universal de miniciacuterculos (UMSBP) Estas juntamente com
outras proteiacutenas geram uma forquilha de replicaccedilatildeo que se propaga
unidirecionalmente ao redor do miniciacuterculo formando uma estrutura tipo
intermediaacuteria (LIU et al 2005 GLUENZ et al 2007)
Os miniciacuterculos receacutem-replicados migram da zona KFZ para dois complexos
proteacuteicos situados nos poacutelos diametralmente opostos do cinetoplasto onde os
proacuteximos passos de replicaccedilatildeo iratildeo ocorrer Estes passos incluem remoccedilatildeo dos
primers pela accedilatildeo de endonucleases preenchimento de alguns intervalos entre os
fragmentos de Okazaki pela DNA polimerase e uniatildeo dos cortes (nicks) por uma
DNA ligase Apoacutes estas etapas os novos ciacuterculos sintetizados que ainda possuem
pelo menos uma interrupccedilatildeo em sua sequumlecircncia satildeo reunidos agrave periferia da rede
pela accedilatildeo de topoisomerases II Apoacutes todos miniciacuterculos terem sido replicados os
intervalos satildeo reparados (Revisto por LIU et al 2005 POVELONES 2014)
Pouco se sabe sobre o processo de replicaccedilatildeo dos maxiciacuterculos Assim
como os miniciacuterculos os maxiciacuterculos tambeacutem sofrem replicaccedilatildeo unidirecional que
32
se inicia em uma origem contida na regiatildeo variaacutevel da moleacutecula formando estruturas
tipo- Entretanto ao contraacuterio dos miniciacuterculos eles permanecem ligados agrave rede de
kDNA durante o processo replicativo (revisto por KLINGBEIL et al 2001 Liu et al
2005)
FIGURA 8 REPLICACcedilAtildeO DO kDNA FONTE Modificado de LIU et al 2005
18 Proteiacutenas associadas ao cinetoplasto (KAPs)
Proteiacutenas que se ligam ao DNA tambeacutem foram identificadas na mitococircndria
de uma variedade de organismos eucarioacuteticos variando de levedura ateacute humanos
(MAIER et al 2001) Estas proteiacutenas satildeo codificadas no nuacutecleo da ceacutelula e satildeo poacutes-
traducionalmente importadas para a mitococircndria
Conceitualmente qualquer proteiacutena que se associe ao kDNA quer atuando
na replicaccedilatildeo e transcriccedilatildeo quer atuando na organizaccedilatildeo compactaccedilatildeo e
segregaccedilatildeo da rede pode ser chamada de KAP (KAP do inglecircs Kinetoplast-
33
Associated Protein) Observou-se que algumas dessas KAPs apresentam
caracteriacutesticas de proteiacutenas histonas H1 (H1 histone-like proteins) por serem
proteiacutenas pequenas (17 a 25 kDa) fortemente baacutesicas (pI de 11 a 125) interagindo
com a carga negativa das moleacuteculas de DNA e com grande conteuacutedo dos
aminoaacutecidos lisina e arginina elevado (aprox 30 a 50)
Proteiacutenas associadas com genoma mitochondrial (KAPs) dos
tripanosomatiacutedeos e que compartilham caracteriacutesticas com histonas H1 foram
inicialmente identificadas no cinetoplasto do tripanosomatiacutedeo de inseto Crithidia
fasciculata e denominadas de KAP1 a 5 As H1-KAPs de C fasciculata interagem
com miniciacuterculos (XU et al 1996) e desse modo podem facilitar a associaccedilatildeo
orientaccedilatildeo e organizaccedilatildeo dessas moleacuteculas na rede pela neutralizaccedilatildeo das cargas
negativas das moleacuteculas de DNA contribuindo para a condensaccedilatildeo organizaccedilatildeo e
segregaccedilatildeo da rede de kDNA Ateacute o momento foram caracterizadas quatro H1-KAPs
de C fasciculata (CfKAP1 2 3 and 4) Aleacutem das caracteriacutesticas de histona H1
possuem uma preacute-sequecircncia clivaacutevel de nove aminoaacutecidos em sua porccedilatildeo N-
terminal e que provavelmente estaacute envolvida no transporte da proteiacutena para o
cinetoplasto jaacute que natildeo aparece na proteiacutena madura (XU amp RAY 1993 XU et al
1996 HINES amp RAY 1998) Atraveacutes de ensaios de imunofluorescecircncia foi possiacutevel
confirmar que estas proteiacutenas estatildeo presentes em toda a rede de kDNA Pela
facilidade encontrada nas KAPs purificadas de condensar redes de kDNA in vitro
(XU et al 1996) sugere-se que estas estejam envolvidas na organizaccedilatildeo e
condensaccedilatildeo do kDNA in vivo (LUKES et al 2001)
As teacutecnicas de deleccedilatildeo de genes satildeo uma oacutetima ferramenta para elucidar as
possiacuteveis funccedilotildees que um gene pode apresentar Em C fasciculata foi utilizada a
teacutecnica de nocaute gecircnico para o gene Cfkap1 onde mutantes viaacuteveis foram
obtidos mostrando que a forma e a dimensatildeo do cinetoplasto natildeo foram alterados
ao contraacuterio da organizaccedilatildeo da rede de kDNA que passou a apresentar fibrilas de
DNA espessas e uma camada eleacutetron-densa no centro do disco Quando foi
realizada a reintroduccedilatildeo do gene na forma episomal o fenoacutetipo normal da rede de
kDNA foi restaurado (LUKES et al 2001) Tambeacutem foi realizado o duplo nocaute
dos genes Cfkap2 e Cfkap3 o qual da mesma maneira produziu mutantes viaacuteveis
poreacutem com o crescimento bastante reduzido uma reduccedilatildeo na respiraccedilatildeo e um
aumento nos niacuteveis de mRNAs codificados pelos maxiciacuterculos Apesar de todas
estas alteraccedilotildees o kDNA permaneceu inalterado mostrando que as proteiacutenas
34
CfKAP2 e CfKAP3 desempenham um papel diferente ao da CfKAP1 pois estatildeo
envolvidas com o metabolismo mitocondrial e proliferaccedilatildeo celular ao inveacutes de
estarem envolvidas na organizaccedilatildeo estrutural do kDNA (AVLIYAKULOV et al
2004)
Com base nesses estudos surgiu o interesse de nosso grupo no estudo de
KAPs em T cruzi visando verificar qual o papel dessas proteiacutenas na organizaccedilatildeo da
rede de kDNA e sua importacircncia nos diferentes estaacutegios do ciclo de vida do parasita
Atraveacutes de anaacutelises bioinformaacuteticas foram identificadas 6 diferentes H1-KAPs
codificadas no genoma do T cruzi levando em consideraccedilatildeo a similaridade com
KAPs de C fasciculata (CAVALCANTI et al 2009) Essas H1-KAPs foram
denominadas de KAP3 KAP4a KAP4b KAP4c KAP6 e KAP7 Nosso grupo iniciou
a caracterizaccedilatildeo das proteiacutenas TcKAP4 e TcKAP6 mostrando que elas se localizam
no cinetoplasto mas com padrotildees distintos de distribuiccedilatildeo dependendo da forma do
ciclo de vida do parasita (CAVALCANTI et al 2009) Mais recentemente mostramos
que o nocaute da TcKAP3 natildeo afeta a proliferaccedilatildeo diferenciaccedilatildeo e infectividade do
parasita (DE SOUZA et al 2010)
A complexidade da rede de kDNA sugere portanto que as diferentes KAPs
atuem em conjunto algumas vezes de modo redundante para desempenhar
funccedilotildees na condensaccedilatildeo replicaccedilatildeo segregaccedilatildeo dessa estrutura
35
2 OBJETIVOS
21 OBJETIVO GERAL
O objetivo principal deste trabalho eacute caracterizar a funccedilatildeo da TcKAP7 avaliando seu
papel na biologia do parasita
211 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS
a) Analisar a localizaccedilatildeo subcelular da TcKAP7 atraveacutes de ensaios de
imunofluorescecircncia
b) Produzir TcKAP7 recombinante em larga escala para ensaios de biologia
estrutural
c) Estudar a viabilidade do parasita na ausecircncia do gene TcKAP7 para os parasitas
viaacuteveis analisar morfologia e ultraestrutura do cinetoplasto multiplicaccedilatildeo
diferenciaccedilatildeo e infectividade
36
3 MATERIAIS E MEacuteTODOS
31 Reagentes e Soluccedilotildees Utilizados
311 Reagentes
AmershamBioscience dNTPs Hybond C Hybond N kit ECL de western blotting
filmes de raio-X Hyperfilmreg anticorpo monoclonal anti-Histidina
Bio-Rad Acrilamida Agarose (UltraPure DNA grade) Azul de Bromofenol Bis-
Acrilamida Persulfato de Amocircnia
Cult-lab RPMI 1640
Difco Baacutecto-Aacutegar Bactotriptona Extrato de levedura Infuso de fiacutegado Triptose
Invitrogen Inc EDTA Fenol TRIS Nick Translation kit Taq DNA polymerase
IPTG Agarose X-Gal DNA de λHindIII Marcador de massa molecular Benchmark
Alexa Fluacuteor 458 1 kb Plus DNA Ladder Soro Fetal Bovino T4 DNA ligase
Merck Acetato de Soacutedio Aacutecido Aceacutetico Glacial Cloreto de CaacutelcioCloreto de
Potaacutessio Cloreto de Soacutedio Etanol Absoluto Glicina Glicose Hidroacutexido de soacutedio
Isopropanol HCl Na2HPO4
New England Biolabs Endonucleases de restriccedilatildeo
Qiagen Qiaquick PCR Purification kit
Serva Electrophoresis Alu-Gel S
Sigma Acetato de amocircnia Ampicilina Brometo de Etiacutedeo BSA Kanamicina
Glicerol Hepes Cloreto de Magneacutesio Tetraciclina β-mercaptoetanol DEAE-
celulose Tween 20 adjuvante completo de Freund monoclonal M2 anti-FLAG
312 Tampotildees e Soluccedilotildees
PBS NaCl 137 mM KCl 27 mM Na2HPO4 43 mM e KH2PO4 15 mM
PSG Na2HPO4 (anidro) 4747 mM NaH2PO4 H2O 25 mM NaCl 3676 mM e
glicose 555 mM
Soluccedilatildeo de tripsinazaccedilatildeo tripsina 005 (mv) e EDTA 002 (mv) em PBS pH
80
37
Soluccedilatildeo de bloqueio para imunofluorescecircncia PBS e BSA 1 (albumina seacuterica
bovina)
Soluccedilatildeo de bloqueio para western blot TBST e leite em poacute desnatado 5
Soluccedilatildeo de lise para Toothpick NaOH 50 mM Glicerol 5 SDS 05 EDTA 5
mM e azul de bromofenol 0025
Soluccedilatildeo Ponceau S Ponceau S 05 em aacutecido aceacutetico 1
Soluccedilatildeo de coloraccedilatildeo para geacuteis de proteiacutena Coomassie blue R-250 01 em
metanolaacutecido aceacutetico (4510)
Soluccedilatildeo para descoloraccedilatildeo de geacuteis de proteiacutena Metanol 4 aacutecido aceacutetico 75
Tampatildeo de lise hipotocircnico Tris-HCl 10mM pH 75 NaCl 10mM MgCl2 5 mM β-
mercaptoetanol 5 mM
Tampatildeo A para cromatografia de afinidade Tris-HCl 20 mM pH 75 NaCl 500 mM
Tampatildeo B para cromatografia de afinidade Tampatildeo A contendo imidazol 1M
Tampatildeo B para cromatografia de troca iocircnica Tris-HCl 50 mM pH 80 NaCl 1M
Soluccedilatildeo de depurinaccedilatildeo para Southern blot HCl 025 M
Soluccedilatildeo desnaturante para Southern blot NaOH 05 M e NaCl 15 M
Soluccedilatildeo neutralizante para Southern blot Tris-HCl 05 M pH 75 e NaCl 15 M
Soluccedilatildeo Denhardt (50X) ficoll 05 polivinilpirrolidona 06 e albumina de soro
bovino 02
Soluccedilatildeo de hibridaccedilatildeo para Southern blot DNA de esperma de salmatildeo do tipo III
01 mgml fragmentado por ultra-som e desnaturado SSC 6X soluccedilatildeo de denhardt
6X e SDS 1
SSC 20X NaCl 3 M pH 70 e citrato de soacutedio 03 M
Soluccedilatildeo de baixa estringecircncia SSC 2X e SDS 01
Soluccedilatildeo de meacutedia estringecircncia SSC 1X e SDS 01
Soluccedilatildeo de alta estringecircncia SSC 01X e SDS 01
Tampatildeo de eletroporaccedilatildeo para T cruzi NaCl 140 mM HEPES (aacutecido) 25 mM e
Na2HPO4 074 mM pH 75
Tampatildeo ZPFM de eletroporaccedilatildeo de T brucei NaCl 129 mM KH2PO4 15mM KCl
8mM NaH2PO4 8mM MgCl2 15mM CaCl2 90 mM e CH3COONa 24 mM pH 70
Tampatildeo TELT Tris-HCl 50 mM pH 80 EDTA 625 mM pH 90 LiCl 25 M e Triton
X-100 4
Tampatildeo de amostra para DNA 10X Ficoll 400 25 azul de bromofenol 025 e
xileno cianol FF 025
38
Tampatildeo de amostra para proteiacutena 4X Tris-HCl 40 mM pH 68 SDS 1 β-
mercaptoetanol 25 glicerol 6 e azul de bromofenol 0005
Tampatildeo de eletroforese para SDS-PAGE 1X Tris-base 25 mM glicina 192 mM e
SDS 01
Tampatildeo de lise de bacteacuterias Tris-HCl 20 mM pH 75 NaCl 500 mM PMSF1 mM
Tampatildeo para transferecircncia (western blotting) 1X Tris-base 25 mM glicina 192
mM e metanol 20
Tampatildeo TBE Tris base 89 mM aacutecido boacuterico 89 mM e EDTA 2 mM
TBS Tris-HCl 20 mM pH 80 e NaCl 150 mM
TBST TBS e Tween 20 01
TE Tris-HCl 10 mM pH 80 e EDTA 1 mM
313 Meios de cultura
LB Triptona 1 extrato de levedura 5 e NaCl 1
Meio LIT (liver infusion tryptose) infuso de fiacutegado 05 NaCl 753 mM KCl 54
mM glicose 10 mM bacto-triptose 05 Na2HPO4 564 mM hemina 00025 soro
fetal bovino 10 e extrato de levedura 15 gl
Meio TAU NaCl 190 mM KCl 17 mM MgCl2 2 mM CaCl2 2 mM e tampatildeo fosfato 8
mM pH 60
Meio TAU3AAG meio TAU suplementado com L-prolina 10 mM glutamato soacutedico
50 mM aspartato soacutedico 2 mM e glicose 10 mM
32 Cultivo do Trypanosoma cruzi
Neste trabalho foi utilizado o clone Dm28c de T cruzi (CONTRERAS et al
1985 CONTRERAS et al 1988) nas formas epimastigota e tripomastigota
metaciacuteclico
321 Epimastigotas
Formas epimastigotas de T cruzi foram cultivadas em meio LIT (CAMARGO
1964) a 28 oC com passagens a cada trecircs dias e inoacuteculo de 1 x 106 ceacutelulasml As
formas epimastigotas foram coletadas por centrifugaccedilatildeo no terceiro dia de cultivo
39
(correspondente a fase logariacutetmica de crescimento baseada em curva de
crescimento realizada nas mesmas condiccedilotildees) quando a densidade celular
apresentava-se entre de 1 - 3 x 107 ceacutelulasml
322 Tripomastigotas metaciacuteclicos
As formas metaciacuteclicas foram obtidas atraveacutes do processo de diferenciaccedilatildeo
in vitro (BONALDO et al 1988) Formas epimastigotas em final de fase logariacutetmica
de crescimento (densidade celular entre 5 - 7 x 107 ceacutelulasml) foram coletadas por
centrifugaccedilatildeo a 7000 x g por 5 minutos a 10 oC e ressuspendidas em meio TAU
na concentraccedilatildeo de 5 x 108 ceacutelulasml e mantidas a 28 oC por 2 horas Apoacutes este
periacuteodo correspondente ao estresse nutricional as ceacutelulas foram transferidas para
garrafas de 300 cm2 contendo 200 ml de meio TAU3AAG (concentraccedilatildeo final de 5 x
106 ceacutelulasml) Uma proporccedilatildeo dos parasitas que se aderiram agrave superfiacutecie da
garrafa de cultivo se diferenciou em metaciacuteclicos os quais foram liberados no
sobrenadante (BONALDO et al 1988) Estas formas foram purificadas pela
passagem atraveacutes de uma coluna de afinidade contendo a resina DEAE celulose
equilibrada em PSG (SOUSA 1983) Este procedimento foi realizado com o tipo
selvagem para obtenccedilatildeo de extrato proteacuteico e tambeacutem com o mutante de T cruzi
para TcKAP7 para verificaccedilatildeo da capacidade de diferenciaccedilatildeo e infectividade onde
o nuacutemero de metaciacuteclicos no sobrenadante foi contado apoacutes 24 48 72 e 96 horas
da incubaccedilatildeo em meio TAU3AAG
33 Curva de crescimento de T cruzi
Formas epimastigotas de T cruzi clone Dm28c e do mutante de T cruzi para
TcKAP7 foram cultivadas como descrito no item 321 ateacute atingirem a fase
estacionaacuteria para a comparaccedilatildeo da taxa de crescimento de ambas Foram
inoculadas 1 x 106 epimastigotas por ml de meio LIT em garrafas de 25 cm2 e
incubadas em seguida a 28 degC Diariamente foi realizada a contagem das culturas
em cacircmaras de Neubauer em diluiccedilotildees apropriadas ateacute o deacutecimo dia O graacutefico da
curva de crescimento comparativa entre a cultura selvagem e a nocaute foi feito
utilizando o programa Microsoft Excel
40
34 Obtenccedilatildeo de DNA de T cruzi
A extraccedilatildeo de DNA foi realizada conforme descrito por Medina-Acosta amp
Cross (1993) Epimastigotas (1 x 107 ceacutelulas) foram coletadas por centrifugaccedilatildeo a
7000 x g por 5 min lavadas em PBS e ressuspendidas em 350 microl de tampatildeo TELT
Apoacutes 5 min de incubaccedilatildeo agrave temperatura ambiente foi adicionado agrave amostra 1
volume de fenolclorofoacutermio e o material foi centrifugado a 13000 x g por 5 min A
fase aquosa foi recolhida e o DNA foi precipitado com 2 volumes de etanol absoluto
e coletado por centrifugaccedilatildeo a 13000 x g por 10 min O DNA presente no sedimento
foi lavado com etanol 70 seco e em seguida ressuspendido em tampatildeo TE
contendo RNAse a 20 microgml
35 Obtenccedilatildeo de kDNA de T cruzi
A extraccedilatildeo do kDNA de T cruzi foi realizada de acordo com Morel e
colaboradores (1980) com modificaccedilotildees
Formas epimastigotas (1 x109 ceacutelulas) foram coletadas por centrifugaccedilatildeo a
4000 x g por 10 min lavadas em PBS e ressuspendidas em 20 ml de Tampatildeo de
Lise Hipotocircnico Posteriormente adicionou-se Sacarose 025 M e o material foi
centrifugado 6000 x g por 10 min O pellet foi ressuspendido em 20 ml de Tris-HCl
10 mM pH 75 NaCl 10 Mm EDTA 5 mM SDS 05 A esta soluccedilatildeo foi adicionado
100 ug de proteinase K e a mesma permaneceu a 37 ordmC durante a noite No dia
seguinte as ceacutelulas foram transferidas para uma seringa de 50 ml aonde ocorreu a
quebra mecacircnica do DNA nuclear Este material foi ultracentrifugado a 27000 rpm a
4ordm C durante 1 hora utilizando o rotor SW28 Apoacutes centrifugaccedilatildeo o sobrenadante foi
desprezado e o pellet ressuspendido em 25 ml de TE e novamente ultracentrifugado
nas mesmas condiccedilotildees Apoacutes centrifugaccedilatildeo o pellet foi ressuspendido em 1ml de TE
e foi realizada a purificaccedilatildeo por fenolclorofoacutermio Apoacutes purificaccedilatildeo o material foi
ressuspendido em 300 ul de TE e utilizado para ensaios de SAXS
36 Obtenccedilatildeo de extrato proteico de T cruzi
41
As ceacutelulas foram coletadas por centrifugaccedilatildeo (4000 x g 5 min a 10 degC) e
lavadas duas vezes em PBS pH 75 Apoacutes as lavagens os parasitas foram
ressuspendidos em PBS e tampatildeo de amostra 4x foi adicionado de tal maneira que
a concentraccedilatildeo final fosse de 1 x 106 ceacutelulas equivalentesmicrol Os extratos foram
fervidos por 5 min e armazenados a - 70 degC
37 Clonagem do gene TcKAP7
A sequecircncia do gene TcKAP7 (ID Tc00104705350871950) foi obtida a
partir do banco de dados do genoma do T cruzi disponiacutevel no portal da internet
wwwgenedborg e a sua regiatildeo codificante foi amplificada por PCR com os primers
KAP7F (5rsquo ndash AAAGGATCCATGCTAAGAACTGTTCTGCCACTG 3rsquo) e KAP7R (5rsquo ndash
TCAGCGTCGACTTATGACGGTGGTGCAGGATCAGCAGCTGCAGTATTTT3rsquo) a
partir do DNA genocircmico de T cruzi Dm28c As sequecircncias de reconhecimento das
enzimas de restriccedilatildeo BamHI e SalI (marcadas em negrito) foram adicionadas na
extremidade 5rsquo dos primers KAP7F e KAP7R respectivamente As condiccedilotildees da
reaccedilatildeo de PCR foram as seguintes 100 ng de DNA total T cruzi 10 pmol de cada
primer 200 μM de cada dNTP MgCl2 15 mM tampatildeo Taq DNA polimerase 1x 25
U de Taq DNA polimerase (Invitrogen) A reaccedilatildeo de PCR foi processada no
termociclador modelo 9700 (Applied Biosystems EUA) com a desnaturaccedilatildeo do
material por 4 min a 94 degC seguida de 30 ciclos constando de desnaturaccedilatildeo a 94 degC
por 30 s hibridizaccedilatildeo dos primers a 58 degC por 30 s e extensatildeo a 72 degC por 1 min O
material amplificado foi purificado usando o kit Qiaquick PCR Purification (Qiagen) e
digerido com as enzimas de restriccedilatildeo BamHI e SalI com uso de 20 U de cada
enzima e seus respectivos tampotildees em volume final de 20 μl por 4 h a 37 oC O
material foi novamente purificado e utilizado para ligaccedilatildeo com o vetor pET28a
previamente digerido com as respectivas enzimas Bacteacuterias E coli cepa DH5α
foram transformadas com a ligaccedilatildeo A seleccedilatildeo dos clones contendo plasmiacutedeo com
o inserto desejado foi realizada atraveacutes da teacutecnica de palitagem ou de PCR de
colocircnia
38 Obtenccedilatildeo do cDNA de TcKAP7 atraveacutes de ensaio de RT-PCR
42
Com o intuito de verificar a posiccedilatildeo do mini-exon no transcrito de TcKAP7
realizamos o ensaio de RT-PCR para a obtenccedilatildeo do cDNA de TcKAP7
O protocolo utilizado foi baseado no manual teacutecnico da Promega (ΙmProm-ΙΙ
Reverse Transcription System) assim como os reagentes utilizados para essa
reaccedilatildeo Aproximadamente 10 μg de RNA foram incubados com o oligonucleotiacutedeo
KAP7R por 10 min a 70 degC e imediatamente transferidos para o gelo Agrave mistura foi
adicionada uma soluccedilatildeo de dNTPs (concentraccedilatildeo final de 05 mM para cada dNTP)
MgCl2 (120 μM) RNAse OUT (2 unidades) (Invitrogen) Transcriptase reversa
ImProm-II e respectivo tampatildeo A reaccedilatildeo foi incubada por 2 h a 42 degC As amostras
de cDNA foram purificadas por Microcon YM-30 (Millipore) conforme descriccedilatildeo do
fabricante e armazenadas a -20 degC Posteriormente foi realizada uma reaccedilatildeo de
PCR utilizando as seguintes condiccedilotildees 10 ng do cDNA de TcKAP7 de T cruzi 10
pmol do primer ME (5rsquo-AACGCTATTATTGATACAGTTTCTGTACTATATTG -3rsquo) e 10
pmol do primer KAP7R 200 μM de cada dNTP MgCl2 15 mM tampatildeo Taq DNA
polimerase 1x 25 U de Taq DNA polimerase (Invitrogen) A reaccedilatildeo de PCR foi
processada no termociclador modelo 9700 (Applied Biosystems EUA) com a
desnaturaccedilatildeo do material por 3 min a 94 degC seguida de 35 ciclos constando de
desnaturaccedilatildeo a 94 degC por 30 s hibridizaccedilatildeo dos primers a 55 degC por 30 s e extensatildeo
a 72 degC por 1 min O material amplificado foi purificado usando o kit Qiaquick PCR
Purification (Qiagen) e clonado diretamente no vetor pGEMreg-T Easy (Promega)
Bacteacuterias E coli cepa TOP10Frsquo foram transformadas com a ligaccedilatildeo e os plasmiacutedeos
recombinantes foram selecionados pela teacutecnica da palitagem ou de PCR de colocircnia
(itens 391 e 392) Apoacutes a minipreparaccedilatildeo (item 310) o material foi submetido ao
sequenciamento de DNA usando o serviccedilo de sequenciamento da empresa
Macrogen (Coreacuteia do Sul)
39 Seleccedilatildeo dos clones recombinantes
391 Teacutecnica de palitagem (toothpick)
As colocircnias foram coletadas com o auxiacutelio de palitos de dente (toothpick)
esteacutereis e transferidas para o fundo de tubos de micro-centriacutefuga e para a superfiacutecie
do meio LB solidificado (com o antibioacutetico de seleccedilatildeo do plasmiacutedeo) para a obtenccedilatildeo
de uma reacuteplica das colocircnias que foram analisadas (placa-matildee) A cada um dos
43
tubos foram acrescentados 15 μl do tampatildeo de lise Os tubos foram incubados em
banho-maria a 65 degC por 10 min As amostras entatildeo foram analisadas por
eletroforese em gel de agarose 1 usando o plasmiacutedeo sem inserto como controle
Posteriormente o gel foi corado com brometo de etiacutedeo (05 μgml) por
aproximadamente 20 min lavado com aacutegua e analisado sob luz ultravioleta para em
seguida ser fotografado no sistema de fotodocumentaccedilatildeo L-Pix (Locus
Biotecnologia Brasil)
392 Teacutecnica de PCR de colocircnia
Depois de selecionadas as colocircnias foram transferidas para tubos de PCR
contendo os reagentes da PCR e os primers que hibridizam com regiotildees que
flanqueiam o fragmento de DNA clonado em um volume total de 10 microl As amostras
foram incubadas a 94 degC por 3 min e submetidas a 35 ciclos de PCR com as
seguintes etapas 94 degC por 30 s 55 degC por 30 s e 72 degC por 1 min finalizando com
uma etapa de extensatildeo a 72 degC por 10 min Os produtos amplificados foram
analisados em gel de agarose 1 Posteriormente o gel foi corado com brometo de
etiacutedeo (05 microgml) por aproximadamente 20 min lavado com aacutegua e analisado sob
luz ultravioleta O gel foi fotografado no sistema de foto-documentaccedilatildeo L-Pix (Locus
Biotecnologia Brasil)
310 Preparaccedilatildeo de plasmiacutedeo em pequena escala (miniprep)
Os clones recombinantes foram cultivados em 3 ml de meio LB contendo o
antibioacutetico apropriado durante 18 h As culturas foram entatildeo centrifugadas a 12000
x g por 1min a temperatura ambiente e os plasmiacutedeos recombinantes purificados
com o sistema de minipreparaccedilatildeo de plasmiacutedeo (Miniprep Qiagen Kit) (QIAGEN) de
acordo com as recomendaccedilotildees do fabricante
311 Expressatildeo da proteiacutena TcKAP7 em E coli
Para expressar a proteiacutena recombinante TcKAP7 E coli cepa
BL21(DE3)STAR transformada com o plasmiacutedeo pET28a contendo o gene TcKPA7
(pET28a-TcKAP7) foi cultivada em meio LB contendo 25 μgml do antibioacutetico
44
kanamicina a 37 ordmC sob agitaccedilatildeo (preacute-inoacuteculo) Apoacutes 18 horas de crescimento uma
diluiccedilatildeo (110) foi realizada em novos tubos contendo meio LB-kanamicina e a
cultura foi incubada por 1 h a 37 ordmC sob agitaccedilatildeo constante Apoacutes este periacuteodo 05
mM IPTG (isopropil-1-tio-β-D-galactopiranosideo) foi adicionado agraves culturas A
incubaccedilatildeo prosseguiu por mais 3 h nas mesmas condiccedilotildees Como controle negativo
as ceacutelulas tambeacutem foram cultivadas nas mesmas condiccedilotildees poreacutem sem a adiccedilatildeo de
IPTG (cultura natildeo induzida) Aliacutequotas das culturas induzidas e natildeo induzidas com
IPTG foram processadas para anaacutelise em SDS-PAGE
312 Purificaccedilatildeo da proteiacutena recombinante TcKAP7
3121 Processamento da amostra
As bacteacuterias apoacutes a expressatildeo de TcKAP7 foram sedimentadas por
centrifugaccedilatildeo e ressuspendidas em tampatildeo de lise e lisadas utilizando o
microfluidificador modelo M-110L (Microfluidics EUA) Este meacutetodo divide a amostra
em dois fluxos e os conduz sob alta pressatildeo gerada por uma vaacutelvula pneumaacutetica
para uma cacircmara de interaccedilatildeo tambeacutem chamada de aacuterea de choque Esta cacircmara
eacute formada por um sistema de micro-canais dentro de um bloco de ceracircmica Dentro
da cacircmara ocorre cavitaccedilatildeo sonicaccedilatildeo e impacto dos dois fluxos em que a amostra
foi dividida levando a lise das ceacutelulas bacterianas (FIGURA 9) Este processo
provoca o aumento da temperatura e todo o sistema de tubos que conduz a amostra
necessita ser refrigerado com gelo e aacutegua a 4degC para prevenir a precipitaccedilatildeo de
proteiacutenas soluacuteveis
45
FIGURA 9 - REPRESENTACcedilAtildeO ESQUEMAacuteTICA DO MICROFLUIDIFICADOR LEGENDA A suspensatildeo de bacteacuterias eacute dividida em dois fluxos que se chocam sob alta pressatildeo dentro de micro-canais presentes na cacircmara de interaccedilatildeo da vaacutelvula homogeneizadora Melhores resultados satildeo obtidos aumentando o nuacutemero de ciclos de passagens Seta preenchida direccedilatildeo da amostra Seta pontilhada repetindo o ciclo de passagem FONTE Modificado de MAA amp HSU 1999
Apoacutes a lise o extrato soluacutevel foi obtido apoacutes centrifugaccedilatildeo a 30000 x g por
30 min a 4 degC
3122 Cromatografia de afinidade
Por ser expressa fusionada a uma cauda de seis histidinas a proteiacutena
TcKAP7 pode ser separada dos extratos celulares a partir da utilizaccedilatildeo de resina de
niacutequel da qual posteriormente a proteiacutena seraacute eluiacuteda
A purificaccedilatildeo da proteiacutena TcKPA7 presente no sobrenadante foi realizada
em sistema FPLC (Fast Performance Liquid Chromatography ndash GE Healthcare) com
coluna HiTrap Chelating de 1 mL (GE Healthcare) A coluna foi carregada com
soluccedilatildeo NiSO4 100 mM e equilibrada com tampatildeo A para cromatografia de afinidade
Durante a purificaccedilatildeo foi utilizado um gradiente de 0-100 de tampatildeo B para
cromatografia de afinidade As fraccedilotildees provenientes da cromatografia foram
analisadas atraveacutes de SDS-PAGE
Suspensatildeo de bacteacuterias
Ceacutelulas lisadasBomba de
alta pressatildeo
Micro-canais
Vaacutelvula homogeneizadora
46
3123 Cromatografia de troca iocircnica
Para eliminar contaminantes remanescentes da cromatografia de afinidade
a amostra contendo a proteiacutena de interesse foi submetida a uma segunda etapa
cromatograacutefica cromatografia de troca iocircnica utilizando-se a coluna HiTraptrade SP (GE
Healthcare) no sistema de FPLC (GE Healthcare)
Primeiramente a amostra foi diluiacuteda para reduccedilatildeo da concentraccedilatildeo salina e
a coluna foi lavada com 2 volumes de tampatildeo B para cromatografia de troca iocircnica e
depois com 2 volumes de tampatildeo A utilizado na cromatografia de afinidade O
gradiente de passagem do tampatildeo B foi de 0 a 100 e a proteiacutena TcKAP7 foi
obtida na fraccedilatildeo de material natildeo ligado agrave resina (Flow-through) (FT)
3124 Cromatografia de gel filtraccedilatildeo
Amostras da cromatografia de troca iocircnica que continham a proteiacutena de
interesse foram concentradas atraveacutes de filtraccedilatildeo A soluccedilatildeo foi colocada em filtro
Amicon Ultra MWCO 10000 (Milipore) e centrifugada a 4000 rpm a 4 ordmC O
experimento foi realizado em sistema FPLC (GE Healthcare) com a coluna
Superdex 200 HR 1030 (GE Healthcare) em tampatildeo HEPES 20 mM pH 74 e de
cloreto de soacutedio100 mM
313 Espalhamento Dinacircmico de Luz ndash DLS
O experimento foi realizado em equipamento DynaPro Molecular instrument
a 4 ordmC As amostras foram previamente centrifugadas por 5 minutos a 15000 rpm a
4 ordmC A coleta de dados foi realizada com intervalos de 2 segundos com 100
aquisiccedilotildees Para cada leitura utilizou-se 5 microl de amostra proteica
314 Espectroscopia de dicroiacutesmo circular (CD)
O espectro de CD foi coletado usando espectropolariacutemetro Jasco J-715
(Jasco Corporation Toacutekio Japatildeo) sendo a temperatura mantida a 20 degC atraveacutes de
um Peltie rType Control System PFD425S (JASCO) Todos os dados foram
coletados usando cubeta de quartzo de 1 mm de caminho oacuteptico
47
Mediu-se a elipticidade em graus na regiatildeo do UV distante no intervalo de
comprimento de onda de 260 nm a 200 nm com uma velocidade de 100 nmmin
sendo feitas no total 30 leituras com resposta de 1 segundo em varredura contiacutenua
Os valores obtidos em miligraus foram convertidos para elipticidade molar
por resiacuteduo ([θ]MRW) em miligrauscm2dmol-1 que eacute definida pela equaccedilatildeo (Adler et
al 1973)
Onde θobs eacute a elipsidade observada em graus MRW eacute o peso molecular
meacutedio dos resiacuteduos da proteiacutena d eacute o caminho oacuteptico da cubeta em centiacutemetros e c
eacute a concentraccedilatildeo da proteiacutena em mgmL O MRW eacute calculado dividindo-se o peso
molecular da proteiacutena pelo nuacutemero de resiacuteduos
315 Quantificaccedilatildeo e concentraccedilatildeo
As amostras obtidas a partir da purificaccedilatildeo tiveram a concentraccedilatildeo calculada
utillizando a absorbacircncia mensurada pelo aparelho NanoDrop (Thermo Fisher
Scientific) levando-se em consideraccedilatildeo o coeficiente de extinccedilatildeo e teoacuterico da
proteiacutena obtido a partir do ProtParam (httpusexpasyorgtoolsprotparamhtml) e o
peso molecular da proteiacutena que eacute de cerca de 28 kDa
Obtidas as concentraccedilotildees a amostra foi concentrada pelo meacutetodo de
filtraccedilatildeo utilizando o filtro Amiconreg Ultra Centrifugal Filter (Millipore) com poro de
10000 Da A amostra foi centrifugada ateacute a obtenccedilatildeo de uma concentraccedilatildeo final de
5 mgml para os ensaios de cristalizaccedilatildeo Uma aliacutequota da proteiacutena concentrada foi
utilizada para anaacutelise por SDS-PAGE
316 Ensaios de Cristalizaccedilatildeo
Os ensaios de cristalizaccedilatildeo foram realizados empregando-se a teacutecnica de
difusatildeo de vapor em gota sentada utilizando-se os equipamentos disponiacuteveis no
Laboratoacuterio Robotizado de Cristalizaccedilatildeo de Proteiacutenas LNBio Os ensaios foram
feitos em placas de 96 poccedilos e as gotas preparadas pelo robocirc Honeybee
utilizando-se os kits disponiacuteveis no laboratoacuterio Crystal Screen HT (Hampton
Research) JCSG+ Suite (Molecular Dimensions) PACT Suite (Molecular
cd
MRWobs
10][
48
Dimensions) Precipitant Synergy (Rigaku Reagents) SaltRx HT (Hampton
Research) Wizard IampII (Rigaku Reagents)
317 Espalhamento de raio-X a baixo acircngulo (SAXS)
Atraveacutes da teacutecnica de SAXS informaccedilotildees sobre a massa molecular das
partiacuteculas espalhadoras e do raio de giro (Rg) da proteiacutena de estudo satildeo obtidos a
partir dos dados coletados Por meio de programas computacionais como DAMMIN
(SVERGUN1999) e GASBOR (SVERGUN et al 2001) um modelo de baixa
resoluccedilatildeo da forma da proteiacutena pode ser obtido
Os dados de SAXS foram obtidos na linha de luz D02A ndash SAXS2 no
Laboratoacuterio Nacional de Luz Siacutencrotron (LNLS) Campinas-SP Brasil usando
comprimento de onda de 148 A e um detector bidimensional com arranjo CCD
(MARCCD USA) de 165 mm A distacircncia do detector para a amostra foi de 106804
mm e os dados na faixa de 002 nm-1 para 021 nm-1 foram coletados usando
proteiacutena pura nas concentraccedilotildees de 5 mgml em tampatildeo em 20 mM HEPES pH 74
e 100 mM de cloreto de soacutedioExposiccedilotildees de 300 e 600 s foram realizadas e os
dados do tampatildeo foram coletados antes e depois dos dados da amostra para fazer a
correccedilatildeo do solvente e normalizaccedilatildeo do espalhamento
Ajuste dos dados experimentais e avaliaccedilatildeo da funccedilatildeo p(R) foram realizados
utilizando o programa GNOM (SVERGUN 1992) O envelope a baixa resoluccedilatildeo de
TcKAP7 foi determinado usando modelagem abnitio implementada no programa
DAMMIN O modelo a baixa resoluccedilatildeo e o modelo da estrutura tridimensional foram
superpostas usando o programa SUPCOMB (KOZIN amp SVERGUN 2001)
318 Modelagem de TcKAP7
Um modelo da estrutura tridimensional de TcKAP7 foi construiacutedo Para a
construccedilatildeo do modelo foi utilizado o programa MODELLER (SALI amp BLUNDELL
1993) este programa eacute utilizado para a modelagem por homologia a estruturas
tridimensionais de proteiacutenas O programa automaticamente constroacutei um modelo
baseado na anaacutelise de um alinhamento de sequecircncias entre a proteiacutena para a qual
se deseja construir o modelo e uma proteiacutena relacionada cuja estrutura
tridimensional jaacute foi resolvida A qualidade do modelo pode ser avaliada por
49
exemplo atraveacutes de graacuteficos e tabelas que analisam restriccedilotildees quiacutemicas e fiacutesicas de
cada aacutetomo constituinte do modelo
319 Obtenccedilatildeo de antissoro policlonal contra TcKAP7
A proteiacutena TcKPA7 recombinante purificada foi inoculada em camundongos
da linhagem BALBc por via intraperitonial com 4 aplicaccedilotildees de aproximadamente
20-50 μg de antiacutegeno em intervalos de 15 dias seguida de obtenccedilatildeo do soro apoacutes 1
semana da uacuteltima inoculaccedilatildeo O antiacutegeno foi emulsificado em adjuvante completo de
Freund na primeira inoculaccedilatildeo e com adjuvante a base de hidroacutexido de alumiacutenio
(Alu-Gel Serva) nas inoculaccedilotildees posteriores
320 Anaacutelise da expressatildeo do gene TcKAP7 e de seu mutante por ensaio tipo
western blot
Este procedimento foi executado segundo o meacutetodo de Towbin e
colaboradores (1979) Aliacutequotas de extratos de T cruzi equivalentes a 1 x 107
ceacutelulas foram submetidos agrave SDS-PAGE Apoacutes a separaccedilatildeo eletroforeacutetica as
proteiacutenas foram transferidas para membrana de nitrocelulose (Hybond C Amersham
Biosciences) em tampatildeo de western por 2 h a 60 V ou 20 V por 16 h Apoacutes a
transferecircncia a membrana foi corada com Ponceau S e descorada suavemente com
aacutegua bidestilada para a identificaccedilatildeo das bandas do marcador de massa molecular
A membrana foi entatildeo incubada em soluccedilatildeo de bloqueio por 30 min sob agitaccedilatildeo
suave
Apoacutes o bloqueio a membrana foi incubada com os soros policlonais ou
anticorpos monoclonais em TBST-leite por aproximadamente 1 h a 37degC A
membrana foi lavada 5 vezes com TBST Em seguida a membrana foi incubada
com anticorpo secundaacuterio anti-IgG de camundongo conjugado com a enzima
peroxidase (Pierce ndash Thermo Scientific) por 1h na diluiccedilatildeo de 16000 em TBST-leite
a temperatura ambiente A membrana foi submetida a mais cinco lavagens com
TBST e a reaccedilatildeo era evidenciada utilizando substrato quimioluminescente (West
Pico Pierce ndash ThermoScientific) sobre a membrana a qual era exposta a um filme
para raios-X (Hyperfilm ECL GE)
50
321 Superexpressatildeo de TcKAP7
3211 Amplificaccedilatildeo e clonagem do gene TcKAP7 no vetor pNEO3xFlag para
superexpressatildeo da proteiacutena
O gene TcKAP7 foi clonado no vetor pNEO3xFLAG construiacutedo no nosso
laboratoacuterio a partir do vetor pTcGW-ProtCcarboxi (BATISTA et al 2010) que utiliza
o sistema Gateway de clonagem (Invitrogen) Os vetores foram construiacutedos
utilizando-se como base o pBluescript II (Stratagene San Diego USA) onde foram
inseridas trecircs sequencias que codificam para regiotildees intergecircnicas (IR) de T cruzi A
primeira TcUIR eacute a regiatildeo intergecircnica do locus de ubiquitinacalmodulina de T
cruzi (BATISTA et al 2010) As outras duas regiotildees intergecircnicas ITR1 e ITR2 foram
selecionadas a partir de genes de copia uacutenica no genoma e que possuem um niacutevel
de expressatildeo constitutivo nos estaacutegios epimastigota e tripomastigota metaciclicos
avaliados por dados de proteocircmica e RNAseq (Comunicaccedilatildeo pessoal Michel
Batista) Aleacutem disso esse vetor confere agrave regiatildeo C-terminal da proteiacutena
recombinante resultante da clonagem neste vetor trecircs etiquetas FLAG (sequecircncia
DYKDDDDK) em tandem (FIGURA 10)
FIGURA 10 VETOR PARA EXPRESSAtildeO EM T CRUZI P3XFLAG
LEGENDA PR ndash PROMOTOR RIBOSOMAL TCUIR ITR1 E ITR2 - REGIOtildeES INTERGENICAS ATTR1 E ATTR2 ndash REGIOtildeES PARA RECOMBINACcedilAtildeO CMreg - RESISTEcircNCIA A CLORANFENICOL CCDB ndash GENE PARA SELECcedilAtildeO NEGATIVA DURANTE A CLONAGEM 3XFLAG ndash TREcircS ETIQUETAS DE FLAG (DYKDDDDK) NEOMICINA ndash GENE DE RESISTEcircNCIA A NEOMICINA
O gene TcKAP7 foi amplificado utilizando os primers especiacuteficos
KAP7GtwFor (5rsquo-
GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTGCCCGCGAAGTATTCAGCAGCCC)
e KAP7GtwRev (5rsquo-
GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCGTGGTACATGGCGTACGGGTTG)
PR TcUIR Att R1 Cmreg ccdB Att R2 3x Flag ITR1 Neomicina ITR2
51
os quais possuem os siacutetios attB indicados em negrito As condiccedilotildees desta reaccedilatildeo
de PCR foram as seguintes 100 ng de DNA genocircmico de T cruzi 10 pmol de cada
primer 200 μM de cada dNTP MgSO4 2 mM tampatildeo Taq DNA polimerase High
Fidelity 1x 1U de Platinum Taq DNA polimerase high fidelity (Invitrogen) A reaccedilatildeo
de PCR foi processada no termociclador modelo 9700 (AppliedBiosystems EUA)
com a desnaturaccedilatildeo do material por 5 min a 94 degC seguida de 35 ciclos constando
de desnaturaccedilatildeo a 94 degC por 30 s hibridizaccedilatildeo dos primers a 58 degC por 30 s e
extensatildeo a 72 degC por 15 min
O gene amplificado foi clonado no vetor de entrada pDONRtrade221
(Invitrogen) A reaccedilatildeo foi feita com 150 ng dos produtos de PCR contendo os siacutetios
attB 150 ng do plasmiacutedeo pDONRtrade221 1 μL de BP ClonaseTM enzyme mix e TE
para um volume final de 10 μL e com incubaccedilatildeo a 25 degC por 16 h Foi entatildeo
adicionado 1 microL de proteinase K (2 mgmL) com incubaccedilatildeo por 10 min a 37 degC Os
clones em pDONRtrade221 foram transformados em ceacutelulas caacutelcio-competentes E coli
DH5α conforme protocolo de transformaccedilatildeo de ceacutelulas caacutelcio-competentes Apoacutes
transformaccedilatildeo a cultura foi semeada em placa de LBKan (kanamicina 25 microgmL) e
incubada a 37 degC durante 16 h
Para verificar a presenccedila de clones com os insertos de interesse foi feita a
teacutecnica da palitagem As colocircnias selecionadas foram inoculadas em 5 mL de meio
LBKan e incubadas por 16 h a 37 degC com agitaccedilatildeo (190 rpm) A purificaccedilatildeo dos
plasmiacutedeos foi realizada com o kit QIAprepreg Spin Miniprep (Qiagen) conforme
orientaccedilotildees do fabricante
Apoacutes esta etapa foi necessaacuterio transferir os insertos para o vetor de destino
pNEO3xFlag A troca de insertos entre os vetores de entrada e destino denominada
de reaccedilatildeo LR foi realizada conforme orientaccedilotildees do fabricante (Gateway LR clonase
enzyme mix) e ceacutelulas caacutelcio-competentes foram transformadas com os produtos
das recombinaccedilotildees conforme descrito anteriormente semeadas em placas de
LBAmp e incubadas a 37 degC durante 16 h
A verificaccedilatildeo de clones positivos foi realizada atraveacutes de PCR de colocircnias
As colocircnias selecionadas foram inoculadas em 5 mL de meio LB contendo ampicilina
(100 μgmL) e incubada a 37deg C por 16 h sob agitaccedilatildeo (200 rpm)O plasmiacutedeo
contendo o gene TcKAP7 foi denominado de pNEO_KAP7_3xFLAG
52
3212 Transfecccedilatildeo por eletroporaccedilatildeo
A transfecccedilatildeo das formas epimastigotas de T cruzi foi feita pela teacutecnica de
eletroporaccedilatildeo utilizando o equipamento genepulserreg apparatus (Bio-Rad) e cubetas
esteacutereis de eletroporaccedilatildeo gene pulsermicro pulserreg 02 cm (Bio-Rad) Formas
epimastigotas de T cruzi foram cultivadas em meio LIT ateacute uma densidade celular
de 3 x 107 ceacutelulasml Um volume de cultura correspondendo a 1 x 109 parasitas foi
centrifugado (4000 x g 4 degC) O sobrenadante foi descartado e as ceacutelulas foram
ressuspendidas em tampatildeo de eletroporaccedilatildeo esteacuteril e submetidas a centrifugaccedilatildeo
nas condiccedilotildees acima O sedimento celular foi ressuspendido em 2 ml de tampatildeo de
eletroporaccedilatildeo Em cubetas de eletroporaccedilatildeo previamente resfriadas a 4 degC foram
misturados 400 μL (2 x 108 ceacutelulas) da suspensatildeo dos parasitas e 50 μL (20 microg) do
plasmiacutedeo para superexpressatildeo (pNEO_KAP7_3XFLAG) Em paralelo parasitas
foram submetidos agraves mesmas condiccedilotildees mas na ausecircncia de DNA (controle
negativo da transfecccedilatildeo)
As cubetas foram entatildeo mantidas em gelo por 10 min Em seguida os
parasitas foram transfectados com dois pulsos sequenciais de 500 μF e 450 volts
Apoacutes o esse procedimento as cubetas foram mantidas em gelo por mais 5 min A
suspensatildeo de parasitas transfectados foi entatildeo inoculada em 10 mL de meio LIT
suplementado com 10000 U de penicilina e estreptomicina a 10 μgmL
3213 Seleccedilatildeo dos transfectantes
O gene para a enzima neomicina fosfotransferase foi utilizado como
marcador de seleccedilatildeo dos parasitas carregando o plasmiacutedeo para a superexpressatildeo
pNEO_KAP7_3XFLAG Para tanto o antibioacutetico G418 foi adicionado agraves culturas
apoacutes 24 h da transfecccedilatildeo na concentraccedilatildeo final de 500 μgmL Entre 3 e 4 dias apoacutes
a transfecccedilatildeo foi realizada a primeira passagem (14) A partir desse ponto foram
feitas passagens semanais na proporccedilatildeo de 110 ateacute que natildeo fosse observado
crescimento nas duas uacuteltimas passagens da cultura do controle negativo da
transfecccedilatildeo
A expressatildeo da proteiacutena KAP7-FLAG foi analisada atraveacutes de ensaios de
western blot e imunofluorescecircncia
53
322 Deleccedilatildeo do gene TcKAP7 por nocaute gecircnico
3221 Amplificaccedilatildeo e clonagem das regiotildees a montante e a jusante do gene
TcKAP7
As regiotildees a montante (upstream) e a jusante (downstream) do gene TcKAP7
respectivamente denominadas de UPSKAP7 (521 pb) e DOWNKAP7 (500 pb)
foram amplificadas por PCR usando os primers descritos nas TABELAS 1 E 2 A
regiatildeo denominada DOWNKAP7 conteacutem ainda 139 pb do final da regiatildeo codante de
TcKAP7
QUADRO 1 - RELACcedilAtildeO DOS PRIMERS UTILIZADOS PARA A CLONAGEM DA
REGIAtildeO UPSTREAM DE TcKAP7 NO VETOR pNEO1
UPSKAP7F GGGGTCGACCGTTGCTGGTTTTTCTTTTGGTGT
UPSKAP7R GGGAAGCTTGCTTCAAAACGTCTATGCGGGC
Os siacutetios das enzimas de restriccedilatildeo SalI (GTCGAC) e HindIII (AAGCTT) adicionados aos primers estatildeo em negrito
QUADRO 2 - RELACcedilAtildeO DOS PRIMERS UTILIZADOS PARA A CLONAGEM DA
REGIAtildeO DOWNSTREAM DE TcKAP7 NO VETOR pNEO1
DOWNKAP7F GGGGAATTCGCCTCATATGACGCATCTCCCA
DOWNKAP7R GGGGGATCCTGTTGGCGCTGTCAAGGAAGTAAG
Os siacutetios das enzimas de restriccedilatildeo EcoRI (GAATTC) e BamHI (GGATCC) adicionados aos primers estatildeo em negrito
As reaccedilotildees de PCR foram realizadas nas seguintes condiccedilotildees 100 ng de
DNA total de T cruzi Dm28c 10 pmol dos oligonucleotiacutedeos F e R 200 μM de cada
dNTP MgCl2 15 mM tampatildeo Taq DNA polimerase 1x 25 unidades de Taq DNA
polimerase (Invitrogen EUA) A reaccedilatildeo de PCR foi processada no termociclador
modelo 9700 (Applied Biosystems EUA) nas seguintes condiccedilotildees Desnaturaccedilatildeo do
54
material por 4 min a 94 degC seguida de 35 ciclos de desnaturaccedilatildeo a 92 degC por 30 s
hibridizaccedilatildeo dos oligonucleotiacutedeos a 56 degC por 30 s e extensatildeo a 72 degC por 1 min O
material amplificado foi purificado usando o Qiaquick PCR Purification (Qiagen) O
DNA purificado foi digerido com enzimas de restriccedilatildeo apropriadas para a clonagem
dos fragmentos nos vetores pNEO1 O plasmiacutedeo resultante da clonagem das
regiotildees UPSKAP7 e DOWNKAP7 foi denominado de pNEO1kap7 (Figura 11A)
Uma vez que o genoma do T cruzi eacute diploide construiacutemos um segundo
plasmiacutedeo para o nocaute do segundo alelo do gene TcKAP7 tendo como marca de
seleccedilatildeo o gene que codifica resistecircncia a higromicina B Esse plasmiacutedeo foi
construiacutedo usando como molde o plasmiacutedeo pNEO1kap7 O plasmiacutedeo pNEO1kap7
foi digerido com HindIII para remoccedilatildeo do gene neo e uma pequena porccedilatildeo da regiatildeo
DOWNSTREAM (220 pb) O plasmiacutedeo linearizado foi purificado do gel de agarose
usando o kit Qiaquick PCR Purification (Qiagen) e ligado com o gene higro O gene
higro foi amplificado usando os primers HIGROF
(GGGGGAAGCTTATGAAAAAGCCTGAACTCACCGCGAC) e HIGROR
(GGGAAGCTTCTATTCCTTTGCCCTCGGACGAGTGCTG) ambos contendo na
extremidade 5rsquo o siacutetio para a enzima de restriccedilatildeo HindIII (em negrito) O plasmiacutedeo
resultante da ligaccedilatildeo foi denominado de pHIGRO1kap7 (FIGURA 11B)
55
FIGURA 11 ESQUEMA DA CONSTRUCcedilAtildeO DOS VETORES UTILIZADOS PARA O NOCAUTE DO GENE TcKAP7 LEGENDA Nesta figura eacute observada a inserccedilatildeo das sequecircncias flanqueadoras do gene TcKAP7 juntamente com os respectivos siacutetios para cada enzima de restriccedilatildeo nos vetores de clonagem pNEO1 e pHIGRO1
3222 Amplificaccedilatildeo dos cassetes UPS-NEO-DOWN e UPS-HIGRO-DOWN para
transfecccedilatildeo de T cruzi
Os dois plasmiacutedeos recombinantes foram purificados pelo meacutetodo da lise
alcalina utilizando o kit de minipreparaccedilatildeo de plasmiacutedeos (Qiagen) As minipreps
foram utilizadas para a amplificaccedilatildeo da regiatildeo UPS-NEO-DOWN (cassete NEO) e da
regiatildeo UPS-HIGRO-DOWN (cassete HYG) por PCR usando os primers UPSKAP7F
e DOWNKAP7R As reaccedilotildees de PCR foram realizadas nas seguintes condiccedilotildees 20
ng do plasmiacutedeo pNEO1kap7 ou pHIGRO1kap7 10 pmol dos primers UPSKAP7F e
DOWNKAP7R 200 μM de cada dNTP MgCl2 15 mM tampatildeo Taq DNA polimerase
1x 25 unidades de Taq DNA polimerase (Invitrogen EUA) A reaccedilatildeo de PCR foi
processada no termociclador modelo 9700 (AppliedBiosystems EUA) nas seguintes
condiccedilotildees Desnaturaccedilatildeo do material por 4 min a 94 degC seguida de 35 ciclos de
desnaturaccedilatildeo a 92 degC por 30 s hibridizaccedilatildeo dos oligonucleotiacutedeos a 56 degC por 30 s e
56
extensatildeo a 68 degC por 2 min O material amplificado foi submetido agrave eletroforese em
gel preparativo de agarose 1 O gel foi corado com brometo de etiacutedeo (1 μgml) e a
banda correspondente a cada cassete foi removida do gel com auxiacutelio de uma
lacircmina de bisturi O DNA foi purificado por eletroeluiccedilatildeo dentro de saco de diaacutelise
nas condiccedilotildees de 100 V por 1 hora em tampatildeo TBE Para obter massa de DNA
suficiente para a transfecccedilatildeo (20 μg) foram feitas 10 reaccedilotildees de PCR com 100 μl
cada uma
3223 Transfecccedilatildeo do T cruzi com o cassete UPS-NEO-DOWN
Formas epimastigotas de T cruzi foram cultivadas em meio LIT ateacute 2 x 107
ceacutelulasml Os parasitas (1 x 108 ceacutelulas) foram coletados por centrifugaccedilatildeo a 6000
x g por 10 min a 4 degC O sedimento celular foi lavado com PBS esteacuteril e
ressuspendido em 1 ml de soluccedilatildeo de eletroporaccedilatildeo Volumes correspondentes a
04 ml da suspensatildeo de ceacutelulas foram transferidos para cubetas de eletroporaccedilatildeo
esteacutereis (02 cm de gap) (BioRad) e preacute-resfriadas Em uma delas foram adicionados
de 20 μg do fragmento representando o cassete NEO A outra cubeta contendo
apenas a suspensatildeo de parasitas foi usada como controle Apoacutes 10 minutos no gelo
as amostras contidas nas cubetas foram submetidas a 2 pulsos de 450 volts 500
microF utilizando o eletroporadorGenePulserreg IIApparatus (Bio-Rad) As amostras
foram incubadas novamente por 5 a 10 minutos no gelo em seguida foram
transferidas para garrafas de cultura de 25 cm2 contendo 10 ml de meio LIT
(suplementado com 10000 U de penicilina e estreptomicina a 10 mgml) As culturas
foram entatildeo incubadas a 28 degC Apoacutes 24 horas de incubaccedilatildeo adicionou-se o
antibioacutetico G418 na concentraccedilatildeo de 500 μgml As culturas foram mantidas por
sucessivas passagens (diluiccedilatildeo de 110) em meio LIT suplementado com G418 a
cada 8-10 dias ateacute a ausecircncia de proliferaccedilatildeo celular na cultura controle Os
parasitas nos quais TcKAP7 foi substituiacutedo pelo gene neo foram denominados deT
cruzi(kap7kap7neo) e foram testados para a correta inserccedilatildeo do gene neo no locus
genocircmico de TcKAP7
57
3224 Extraccedilatildeo de DNA dos transfectantes
T cruzi transfectado com o cassete NEO (T cruzi(kap7kap7neo) foi cultivado
em meio LIT suplementado com G418 (500 μgml) ateacute uma densidade de 3 x 107
ceacutelulasml Os parasitas foram coletados por centrifugaccedilatildeo por 1 min a 6000 x g e
lavados com PBS Em seguida os parasitas foram lisados gentilmente em 350 μl de
tampatildeo TELT conforme descrito no item 34
3225 Anaacutelise por PCR do DNA dos parasitas transfectados com o cassete
UPS-NEO-DOWN
As reaccedilotildees de PCR foram realizadas utilizando primers externos EXTF
(CCCGCTACGACTGCCCTCCACGCGGAAGGGAA) e EXTR
(AAGTAAACGGGAGAAGCAACACGATGGGAGGCTC) que natildeo estatildeo presentes na
construccedilatildeo do cassete UPS-NEO-DOWN combinados com os primers NEOF
(GGGGAAGCTTATGATTGAACAAGATGGATTGCACGCAG) e NEOR
(GGGGGAATTCAGAAGAACTCGTCAAGAAGGCGATAGAA)
As condiccedilotildees das reaccedilotildees foram as seguintes 100 ng do DNA total de T
cruzi Dm28c tipo selvagem (T cruzi(kap7kap7) ou tipo selvagem) ou do DNA da
populaccedilatildeo T cruzi(kap7kap7neo) (mutante simples nocaute) 10 pmol dos primers EXTF
+ NEOR e NEOF + EXTR 200 μM de cada dNTP MgCl2 15 mM tampatildeo Taq DNA
polimerase 1x 25 unidades de Taq DNA polimerase (Invitrogen EUA) A reaccedilatildeo de
PCR foi processada no termociclador modelo 9700 (AppliedBiosystems EUA) nas
seguintes condiccedilotildees Desnaturaccedilatildeo do material por 4 min a 94 degC seguida de 35
ciclos de desnaturaccedilatildeo a 92 degC por 30 s hibridizaccedilatildeo dos oligonucleotiacutedeos a 55 degC
por 30 s e extensatildeo a 72 degC por 2 min
3226 Transfecccedilatildeo do T cruzi com o cassete UPS-HIGRO-DOWN
Formas epimastigotas da populaccedilatildeo mutante de T cruzi (kap7kap7neo) foram
cultivadas em meio LIT suplementado com G418 (500 μgml) ateacute a densidade de 2 x
107 ceacutelulasml Os parasitas (1 x 108 ceacutelulas) foram coletados por centrifugaccedilatildeo a
6000 x g por 10 min a 4 degC e submetidos ao processo de eletroporaccedilatildeo como
descrito no item 3202 Para a transfecccedilatildeo foram usados 20 μg do fragmento
58
representando o cassete UPS-HIGRO-DOWN As culturas (transfectada e controle)
foram entatildeo incubadas a 28 degC em LIT suplementado de G418 Apoacutes 24 horas de
incubaccedilatildeo foi adicionado o antibioacutetico higromicina ao meio de cultura na
concentraccedilatildeo de 500 μgml As culturas foram mantidas por sucessivas passagens
(diluiccedilatildeo de 110) em meio LIT suplementado com G418 e higromicina a cada 8-10
dias ateacute a ausecircncia de proliferaccedilatildeo celular na cultura controle Mutantes nos quais
os dois alelos de TcKAP7 foram removidos e substituiacutedos pelos genes NEO e
HIGRO foram denominados com genoacutetipo T cruzi (kap7neokap7higro)
3227 Anaacutelise por PCR do DNA dos parasitas transfectados com o cassete
UPS-HIGRO-DOWN
As reaccedilotildees de PCR foram realizadas utilizando primers externos EXTF e
EXTR (item 3225) combinados com os primers HIGROF e HIGROR (item 3221)
As reaccedilotildees de PCR foram realizadas nas seguintes condiccedilotildees 100 ng do
DNA total de T cruzi(kap7kap7) ou do DNA do T cruzi(kap7neokap7higro) 10 pmol dos
primers EXTF + HIGROR e HIGROF + EXTR 200 μM de cada dNTP MgCl2 15
mM tampatildeo Taq DNA polimerase 1x 25 unidades de Taq DNA polimerase
(Invitrogen EUA) A reaccedilatildeo de PCR foi processada no termociclador modelo 9700
(Applied Biosystems EUA) nas seguintes condiccedilotildees Desnaturaccedilatildeo do material por
4 min a 94 degC seguida de 35 ciclos de desnaturaccedilatildeo a 92 degC por 30 s hibridizaccedilatildeo
dos oligonucleotiacutedeos a 55 degC por 30 s e extensatildeo a 72 degC por 2 min
3228 Anaacutelise da organizaccedilatildeo do gene TcKAP7 e da eficiecircncia de seu nocaute
atraveacutes de ensaio do tipo Southern blot
O DNA genocircmico (5 μg) de T cruzikap7kap7 e T cruzikap7neokap7higro foi
submetido a digestatildeo com a enzima de restriccedilatildeo HindIII de acordo com as
especificaccedilotildees do fornecedor Apoacutes 3 horas o DNA digerido foi submetido agrave
eletroforese em gel de agarose 08 em tampatildeo TBE a 100 V O gel foi corado por
brometo de etiacutedio (05 μgmL) e fotografado sob a luz ultravioleta (310 nm)
Posteriormente o gel foi tratado com soluccedilotildees de depurinaccedilatildeo por 15 minutos de
desnaturaccedilatildeo por 30 minutos (2 vezes) e soluccedilatildeo de neutralizaccedilatildeo por 30 minutos (2
vezes) O DNA foi transferido para uma membrana de nylon (Hybond N
59
AmershamBiosciences) por capilaridade (SAMBROOK et al 1989) utilizando-se de
uma ldquoponterdquo de papel 3 MM embebido em SSC 20X Apoacutes a transferecircncia o DNA foi
fixado agrave membrana por exposiccedilatildeo agrave luz ultravioleta com uma dose de 120 mJcm2
usando o aparelho Spectrolinker (Spectronicscorp USA) A membrana contendo o
DNA de T cruzi foi preacute-hibridizada em soluccedilatildeo de hibridizaccedilatildeo de DNA por 1 hora a
65 ordmC seguido da adiccedilatildeo da sonda marcada radioativamente com α-[P32
]-dCTP (10
μCiμl 3000 Cimmol) (Amersham Biosciences) preparada segundo meacutetodo de nick
translation descrito por Rigbyet al (1977) utilizando-se o meacutetodo de iniciaccedilatildeo por
random primers (Megaprimer DNA labeling kit ndash GE) conforme recomendaccedilotildees do
fabricante
Foram utilizadas 3 sondas satildeo elas fragmento do gene TcKAP7
correspondendo a regiatildeo compreendida entre os nucleotiacutedeos 1 e 560 o gene neo e
o gene higro Apoacutes a marcaccedilatildeo as sondas foram purificadas em colunas de
Sephadex G-50 (ProbeQuant ndash Amersham Biosciences) e adicionadas ao tampatildeo de
hibridizaccedilatildeo na concentraccedilatildeo de 5 x 106
cpmml As membranas foram incubadas
por 16 horas a 65 C e em seguida lavadas nesta temperatura duas vezes por 30
minutos com soluccedilotildees de alta meacutedia e baixa estringecircncia As membranas foram
expostas a filme de raio-X (Hyperfilmreg Amersham Biosciences) na presenccedila de tela
intensificadora (Dupont Cronex Lightining Plus) por tempo que varia entre 1 a 3 dias
a ndash70 C
323 Localizaccedilatildeo celular da proteiacutena TcKAP7 atraveacutes de ensaio de
imunofluorescecircncia
Formas epimastigotas de T cruzi foram coletadas por centrifugaccedilatildeo (4000 times
g 3 a 10 ordmC) lavadas duas vezes em PBS e depositadas sobre lacircminas de vidro
previamente tratadas com poli-L-lisina 001 diluiacuteda em PBS Os parasitas foram
entatildeo fixados com paraformaldeiacutedo 4 em PBS permeabilizados com Triton X-100
01 em PBS por 2 min agrave temperatura ambiente e incubados a 4ordmC durante 16 h
em soluccedilatildeo de bloqueio para imunofluorescecircncia (PBS 1X + BSA 1 ) Apoacutes o
bloqueio os parasitas foram incubados agrave temperatura ambiente por 1 h com o
anticorpo monoclonal anti-FLAG em uma diluiccedilatildeo de 11000 em soluccedilatildeo de bloqueio
para imunofluorescecircncia Depois disso as lacircminas foram submetidas a 5 lavagens
60
de 5 min cada em PBS Em seguida os parasitas foram incubados agrave temperatura
ambiente por 1 hora com o anticorpo secundaacuterio anti-IgG de camundongo conjugado
ao fluoroacuteforo Alexa Fluacuteor 488 (Invitrogen) diluiacutedo 1600 em soluccedilatildeo de bloqueio As
lacircminas foram lavadas 5 vezes com PBS e posteriormente incubadas com o corante
Hoechst 33342 (Invitrogen) a 2 μgμL em PBS por 5 min Apoacutes cinco lavagens com
PBS as lacircminas foram montadas com ProLong Gold Antifade (Invitrogen) sobre uma
lacircmina de microscopia oacutetica O material foi observado nos microscoacutepios Leica SP5 e
DMI6000
324 Anaacutelise da ultraestrutura do cinetoplasto do mutante de T cruzi para
TcKAP7 por microscopia eletrocircnica de transmissatildeo
Os parasitas foram coletados lavados com PBS e fixados em soluccedilatildeo
contendo 25 de glutaraldeiacutedo 4 de paraformaldeiacutedo e tampatildeo cacodilato 01 M
Em seguida os parasitas foram fixados por 1 h em soluccedilatildeo de 1 de tetroacutexido de
Oacutesmio e 08 de ferricianeto de potaacutessio diluiacutedos em tampatildeo cacodilato 01 M As
ceacutelulas foram entatildeo desidratadas em soluccedilatildeo contendo concentraccedilotildees crescentes
de acetona e incluiacutedas em Epon Apoacutes a obtenccedilatildeo de cortes ultrafinos dos parasitas
os mesmos foram contrastados em acetato de uranila e citrato de Chumbo antes de
serem observados e fotografados no microscoacutepio eletrocircnico de transmissatildeo Zeiss
900
325 Coloraccedilatildeo dos parasitas transfectados
A coloraccedilatildeo dos parasitas foi realizada pelo meacutetodo panoacutetico raacutepido
(Laborclin Pinhais Paranaacute Brasil) modificado
Formas epimastigotas do mutante de T cruzi para TcKAP7 foram cultivadas
como descrito no item 321 Os parasitas foram coletados por centrifugaccedilatildeo de 1
min a 4000 x g e ressuspensos em PBS Desta suspensatildeo uma gota foi retirada e
depositada sobre lacircminas previamente limpas Quando secas as lacircminas foram
imersas individualmente na Soluccedilatildeo 1 (Fixador) Soluccedilatildeo 2 (Revelador) e Soluccedilatildeo 3
(Corante) em cada uma por 30 s Apoacutes este processo as lacircminas foram lavadas em
aacutegua corrente secas agrave temperatura ambiente e cobertas com Permount e lamiacutenula
Os parasitas foram visualizados em microscoacutepio Nikon E600
61
326 Infecccedilatildeo de ceacutelulas Vero com o mutante de T cruzi para TcKAP7
Ceacutelulas Vero (ATCCreg Nuacutemero CRL-2783trade) foram cultivadas em garrafas
de 150 cm2 contendo meio RPMI suplementado com 5 de soro fetal bovino
(GIBCO) penicilina 100 UIml streptomicina 10 microgml e glutamina 2 mM a 37 o C
com 5 de CO2 Ao atingirem a confluecircncia (80 a 100) realizou-se a passagem
atraveacutes de tripsinizaccedilatildeo e foi feito um inoacuteculo de 1 x 107 ceacutelulas para cada nova
garrafa de 150 cm2 Apoacutes 24 horas estas ceacutelulas (50 ndash 70 de confluecircncia) foram
infectadas com formas metaciacuteclicas obtidas da diferenciaccedilatildeo do mutante de T cruzi
para TcKAP7 em microplacas de 24 poccedilos contendo lamiacutenulas de vidro com
diacircmetro de 13 mm A cada poccedilo foram adicionadas 2 x 104 ceacutelulas Vero Apoacutes 24
horas de cultivo as ceacutelulas foram infectadas com tripomastigotas metaciacuteclicos
(obtidos do sobrenadante das culturas de T cruzi diferenciados em meio TAU3AAG
sem purificaccedilatildeo na coluna de DEAE celulose) A infecccedilatildeo das ceacutelulas Vero foi
acompanhada diariamente por microscopia de contraste de fase
327 Anaacutelise da funccedilatildeo do gene TbKAP7 de Trypanosoma brucei atraveacutes de
ensaios de RNA de interferecircncia
Com o intuito de complementar os estudos da funccedilatildeo do gene TcKAP7 foi
utilizada a teacutecnica de RNA de interferecircncia O uso dessa metodologia compreende
uma abordagem alternativa agrave anaacutelise da funccedilatildeo gecircnica para genes ortoacutelogos deT
brucei por anaacutelises de RNAi uma vez que a maquinaria de RNAi em T cruzi eacute
inexistente (DA ROCHA et al 2003) Os resultados podem gerar evidecircncias que
estejam relacionadas agrave funcionalidade dos genes em T cruzi Esta abordagem foi
utilizada neste trabalho para auxiliar no estudo da funccedilatildeo do gene TcKAP7 a partir
do ortoacutelogo em T brucei ainda natildeo caracterizadoTbKAP7 Os ensaios de RNAi
foram realizados em T brucei cepa 29-13 (WIRTZ et al 1999) com sistema induzido
por tetraciclina utilizando o vetor p2T7-177 ilustrado na figura 12 Este vetor quando
transfectado no parasita integra-se aos minicromossomos do T brucei regiatildeo de
repeticcedilotildees 177 (FOLDYNOVA-TRANTIRKOVA et al 2005)
62
FIGURA 12 MAPA DO VETOR p2T7-177 UTILIZADO PARA ENSAIOS DE RNAi LEGENDA T7 prom Promotor de T7 RNA Polimerase induzido por tetraciclina T7 term Terminador de transcriccedilatildeo 177 Sequumlecircncia repetitiva de 177 pares de bases para alvo de inserccedilatildeo em minicromossomos BLEO gene de resistecircncia agrave fleomicina GFP Proteiacutena Green FluorescentProtein os siacutetios para as enzimas de restriccedilatildeo estatildeo indicados AmpR gene de resistecircncia agrave ampicilina (FONTE WICKSTEAD et al 2002)
As regiotildees do mRNA para alvos nos ensaios de RNAi foram escolhidas com
o auxiacutelio da ferramenta RNAit da base de dados do Trypanofan - Genocircmica
funcional de Tbrucei (httptrypanofanpathcamacuktrypanofanmain)
(REDMOND et al 2003) Essas regiotildees foram amplificadas por PCR usando como
molde o DNA total de T brucei (100 ngreaccedilatildeo) 10 pmol dos primers listados na
tabela 3 200 mM de cada dNTP 15 mM de MgCl2 tampatildeo Taq DNA polimerase 1x
63
(Invitrogen) e 25 unidades de Taq DNA polimerase (Invitrogen) A reaccedilatildeo foi
aquecida por 4 min a 94 degC e entatildeo submetida a 35 ciclos de desnaturaccedilatildeo a 94 degC
por 30 s anelamento a 55 degC por 30 s e extensatildeo a 72 degC por 1 min Os primers
utilizados apresentam siacutetio para as enzimas de restriccedilatildeo BamHI (F) ou HindIII (R)
Os produtos de PCR foram purificados por extraccedilatildeo com fenol-clorofoacutermio e
digeridos com as referentes enzimas
QUADRO 3 - RELACcedilAtildeO DOS PRIMERS UTILIZADOS PARA A AMPLIFICACcedilAtildeO DO
GENE TbKAP7
KAP7RNAiF
AAAGGATCCCTAACCTAACCTGCAGGGTCTCTCG
KAP7RNAiR
GCGAAGCTTTTGTTCCTTTACAAACGCCC
Os siacutetios das enzimas de restriccedilatildeo BamHI (GGATCC) e HindIII (AAGCTT) adicionados aos primers estatildeo em negrito
As clonagens foram confirmadas por PCR de colocircnia e os plasmiacutedeos foram
purificados pelo kit QIAprep Spin Miniprep (Qiagen) Apoacutes purificaccedilatildeo 10 μg dos
plasmiacutedeos foram linearizados com a enzima NotI conforme descrito pelo fabricante
O DNA foi precipitado e ressuspenso em 50 μl de meio de eletroporaccedilatildeo ZPFM para
transfecccedilatildeo do T brucei
Para cada transfecccedilatildeo foi utilizado um total de 4 x 107parasitas em fase logariacutetmica
de crescimento Os parasitas foram obtidos por centrifugaccedilatildeo (5000 x g por 10 min
a 4 degC) lavados em meio ZPFM e ressuspensos em 500 μl do mesmo meio A
transfecccedilatildeo foi feita em cubetas de eletroporaccedilatildeo (4 mm) usando o eletroporador da
BioRad (GenePulser II Electroporator) As condiccedilotildees utilizadas foram dois pulsos de
1600 V e 25 microF Os parasitas foram entatildeo transferidos para garrafas contendo meio
SDM-79 SFB 10 higromicina 50 μgml e G418 15 μgml A seleccedilatildeo dos parasitas
transfectados foi atraveacutes da adiccedilatildeo de 5μgmL de fleomicina resistecircncia conferida
pelo vetor p2T7-177 apoacutes 24 horas de cultivo O tempo para seleccedilatildeo foi entre duas
e trecircs semanas
64
3271 Induccedilatildeo do RNA dupla fita
A induccedilatildeo da expressatildeo de RNA dupla fita referente agrave porccedilatildeo do gene
TbKAP7 clonado no plasmiacutedeo p2T7-177 deu-se pela adiccedilatildeo de tetraciclina 2 μgml
a uma cultura transfectada de T brucei em fase de crescimento exponencial (~2 x
106 parasitasml) Nos dias que se seguiram 1μgml de tetraciclina foi adicionada
diariamente agraves culturas A observaccedilatildeo dos efeitos na curva de crescimento causada
por RNAi em T brucei foi realizada ao longo de uma semana com a contagem de
ceacutelulas e adiccedilatildeo diaacuteria de tetraciclina 1 μgml
65
4 RESULTADOS
41 Clonagem e caracterizaccedilatildeo do gene TcKAP7
A regiatildeo codificante do gene TcKAP7 (ID Tc00104705350871950) foi
obtida a partir do banco de dados do genoma do T cruzi disponiacutevel no portal da
internet wwwgenedborg e amplificada por PCR com os primers descritos no item
37
No genoma do T cruzi cepa CL Brener (EL-SAYED et al 2005) foram
identificados dois haploacutetipos do gene TcKAP7 que foram denominados neste
trabalho de haploacutetipo A (Tc00104705350871950) e haploacutetipo B
(Tc00104705350979320) Neste trabalho foi utilizado o gene TcKAP7 proveniente
da cepa Dm28c de T cruzi Este gene apresenta uma regiatildeo codante de 747 pb e
codifica uma proteiacutena de 276 kDa assumindo que o primeiro ATG apoacutes a sequecircncia
do mini-eacutexon seja usada na iniciaccedilatildeo da traduccedilatildeo
A figura 13 abaixo mostra o alinhamento de TcKAP7 das cepas CL Brener e
Dm28c
FIGURA 13 - COMPARACcedilAtildeO ENTRE AS SEQUumlEcircNCIAS DE AMINOAacuteCIDOS DEDUZIDAS DO GENE KAP7 DE T cruzi Dm28C E DOS HAPLOacuteTIPOS DE CL BRENER
LEGENDA As posiccedilotildees com aminoaacutecidos idecircnticos em todas as sequumlecircncias estatildeo coloridas em preto
66
Embora o gene TcKAP7 natildeo possua grande identidade com os com genes
ortoacutelogos em Trypanosoma brucei TbKAP7 (714 pb) (Tb106k151470) Leishmania
major LmKAP7 (1044 pb) (LMJF_36_5840) Leishmania infantum LiKAP7 (1044 pb)
(LINJ_36_6090) e Leishmania braziliensis LbKAP7 (1038 pb) (LBRM_35_0010)
cujos genomas tambeacutem foram sequumlenciados (BERRIMAN et al 2005 IVENS et al
2005 PEACOCK et al 2007) as sequecircncias de aminoaacutecidos das respectivas
proteiacutenas deduzidas a partir desses genes ainda compartilham certo grau de
similaridade entre si (FIGURA 14) Na tabela 4 pode-se visualizar o percentual de
identidade entre as proteiacutenas KAP7 dos tripanossomatiacutedeos que possuem o genoma
sequenciado
FIGURA 14 COMPARACcedilAtildeO ENTRE AS SEQUumlEcircNCIAS DE AMINOAacuteCIDOS DEDUZIDAS DO GENE KAP7 EM DIFERENTES TRIPANOSOMATIacuteDEOS LEGENDA Em preto encontram-se os resiacuteduos de aminoaacutecidos idecircnticos em todas as sequumlecircncias e em cinza os resiacuteduos conservados na maioria delas
67
QUADRO 4 - PERCENTUAL DE IDENTIDADE ENTRE AS PROTEIacuteNAS KAP7 NOS
TRIPANOSSOMATIacuteDEOS COM O GENOMA SEQUENCIADO
Os valores foram obtidos pelo alinhamento utilizando a ferramenta Clustal21
Mesmo apresentando pouca identidade e variaccedilatildeo de tamanho alguns
dados do genoma sugerem que esses genes satildeo ortoacutelogos entre si Pode-se
perceber uma sintenia entre seus loci nas vaacuterias espeacutecies de tripanosomatiacutedeos
(Cavalcanti et al 2009) (FIGURA 15)
FIGURA 15- SINTENIA DE TcKAP7 COM OUTROS TRIPANOSOMATIacuteDEOS LEGENDA Os dois contigs de TcKAP7 (TcA e TcB) estatildeo representados nesta figura juntamente com os contigs de outros tripanosomatiacutedeos (Tb= T brucei Lm= L major Li= L infantum e Lb= L brasiliensis) mostrando que KAP7 representado pela cor amarela apresenta uma sintenia entre seus loci em todas as espeacutecies mostradas sendo flanqueado pelo gene KAP4 em T cruzi e T brucei representado em azul Portanto em L majorL infantum eL brasiliensis ao lado direito de KAP7 estaacute o gene de uma proteiacutena hipoteacutetica representado pela cor vermelha e ao lado esquerdo encontra-se o gene da KAP4 representado em azul como mencionado anteriormente FONTE CAVALCANTI et al 2009
68
A expressatildeo de vaacuterios genes mitocondriais de C fasciculata e L major eacute
regulada durante o ciclo celular em parte por uma sequumlecircncia consenso
[(CA)AUAGAA(GA)] presente nas regiotildees 5rsquo e 3rsquo-UTR dos respectivos mRNAs
(BROWN amp RAY 1997 MAHMOOD et al 1999 MAHMOOD amp RAY 1998 PASION
et al 1996 ZICK et al 2005)
Assim resolvemos caracterizar a regiatildeo 5rsquo-UTR do transcrito TcKAP7 na
tentativa de identificar sinais com identidade com aqueles encontrados em C
fasciculata Na figura 16 estaacute representada a regiatildeo 5rsquo-UTR do transcrito TcKAP7
com a sequumlecircncia parcial do mini-exon proveniente do primer usado na teacutecnica de
RT-PCR bem como parte da regiatildeo codificante do gene O mini-exon estaacute situado a
129 bases a jusante do iniacutecio da regiatildeo codificante do transcrito TcKAP7 e define
portanto uma regiatildeo 5rsquo-UTR de 168 bases considerando que o tamanho do mini-
exon eacute de 39 bases A anaacutelise da regiatildeo 5rsquo-UTR mostrou um elemento com
caracteriacutesticas muito semelhantes aquele envolvido na regulaccedilatildeo de genes em C
fasciculata (sequencia (G)ATAGAA(G) mostrada no retacircngulo preto na FIGURA
16B) sugerindo que TcKAP7 seja regulada durante o ciclo celular
69
A
B
FIGURA 16 CARACTERIZACcedilAtildeO DA REGIAtildeO 5rsquo-UTR DO TRANSCRITO TcKAP7 LEGENDA A Esquema geral da localizaccedilatildeo do mini-exon de TcKAP7 e B Localizaccedilatildeo especiacutefica do mini-exon de TcKAP7 O mini-exon de TcKAP7 (sequecircncia parcial em verde) estaacute localizado a 129 pb da regiatildeo codante (representada em parte pela cor azul) A regiatildeo 5rsquoUTR do transcrito Tckap7 estaacute representada na cor rosa A possiacutevel sequencia consenso de regulaccedilatildeo durante o ciclo celular estaacute indicada no retacircngulo preto
42 Expressatildeo da proteiacutena TcKAP7 em T cruzi
Formas epimastigotas foram transfectadas com o plasmiacutedeo pNEO3XFLAG
contendo o gene TcKAP7 (pNEO_KAP7_3xFLAG) A expressatildeo da proteiacutena
TcKAP7-FLAG foi analisada por ensaio de western blot Os resultados mostraram
que a expressatildeo da proteiacutena TcKAP7-FLAG foi satisfatoacuteria correspondendo ao
tamanho esperado (FIGURA 17 ) a qual foi confirmada pela reatividade do anticorpo
monoclonal especiacutefico para as etiquetas FLAG (anti-FLAG)
70
FIGURA 17 ANAacuteLISE DA EXPRESSAtildeO DA PROTEIacuteNA DE FUSAtildeO TCKAP7-FLAG EM FORMAS EPIMASTIGOTAS DE T CRUZI
43 Localizaccedilatildeo celular de TcKAP7 atraveacutes de ensaio de imunofluorescecircncia
Para verificar a localizaccedilatildeo celular de TcKAP7 foi realizado o ensaio de
imunofluorescecircncia Como natildeo foi possiacutevel a obtenccedilatildeo do anticorpo com alto tiacutetulo
contra a proteiacutena recombinante TcKAP7 neste ensaio foi utilizado o anticorpo
monoclonal anti-FLAG que reconhece a etiqueta FLAG a qual estaacute fusionada a
proteiacutena TcKAP7
Nessa figura pode-se observar que a proteiacutena de fusatildeo acumula-se na regiatildeo
dos poacutelos do cinetoplasto das formas epimastigotas do T cruzi (FIGURA 18)
indicando que TcKAP7 uma proteiacutena tipo histona H1 estaacute realmente associada com
o kDNA do parasita
71
FIGURA 18 IMUNOLOCALIZACcedilAtildeO DE TcKAP7 EM EPIMASTIGOTAS DE T CRUZI LEGENDAA contraste interferencial diferencial (DIC) B Hoechst marcando o nuacutecleo e o
cinetoplasto C fluorescecircncia mostrando a localizaccedilatildeo de TcKAP7 mais intensa na regiatildeo dos poacutelos
docinetoplasto dos protozoaacuterios D Aumento de C
44 Deleccedilatildeo do gene TcKAP7 por nocaute gecircnico
As teacutecnicas que permitem a remoccedilatildeo de um gene e sua substituiccedilatildeo por
genes repoacuterteres atraveacutes do processo de recombinaccedilatildeo tecircm sido usadas com
sucesso para verificaccedilatildeo da funccedilatildeo gecircnica em tripanosomatiacutedeos (MACRAE et al
2006) O nocaute gecircnico consiste na inserccedilatildeo de marcadores geneacuteticos de seleccedilatildeo
(gene codificando resistecircncia a neomicina ou higromicina entre outros) flanqueados
por sequumlecircncias pertencentes ao locus cromossocircmico de interesse Atraveacutes do
processo de recombinaccedilatildeo homoacuteloga o marcador pode entatildeo substituir o gene que
se quer estudar Desse modo pode ser possiacutevel analisar a funccedilatildeo de determinado
gene atraveacutes das alteraccedilotildees - decorrentes de sua ausecircncia - na fisiologia do
parasita No presente estudo os genes repoacuterteres que codificam resistecircncia aos
72
antibioacuteticos G418 e higromicina foram flanqueados por sequumlecircncias a montante e a
jusante da regiatildeo codificante do gene TcKAP7 As construccedilotildees foram usadas para
transfectarT cruzi e gerar mutantes para o gene TcKAP7 a fim de se estudar o
efeito que a ausecircncia do gene TcKAP7 causa no metabolismo do parasita
Apoacutes obtenccedilatildeo de uma populaccedilatildeo de T cruzi mutante para o gene TcKAP7
(kap7neokap7higro) resistente a ambos antibioacuteticos G418 e higromicina B o
DNA desta populaccedilatildeo foi extraiacutedo para anaacutelise por PCR e Southern blot a fim de
confirmar a eficiecircncia do nocaute
441 Anaacutelise por PCR do DNA dos parasitas transfectados com os cassetes
UPS-NEO-DOWN e UPS-HIGRO-DOWN
Foram realizadas vaacuterias reaccedilotildees de PCR a fim de confirmar a deleccedilatildeo do
gene TcKAP7 do genoma do T cruzi Dm28c e a substituiccedilatildeo dos seus alelos pelos
genes neo e higro As reaccedilotildees de PCR foram feitas com DNA de T cruzikap7kap7 (tipo
selvagem) e com DNA de T cruzikap7neokap7higro utilizando diversas combinaccedilotildees de
primers (TABELA 5) Na figura 32 observa-se que o gene TcKAP7 (747 pb) foi
amplificado somente na PCR realizada com DNA de T cruzi tipo selvagem (FIGURA
19 A canaleta 1) enquanto que os genes neo (795 pb) e higro (1026 pb) soacute foram
amplificados nas reaccedilotildees que conteacutem DNA da populaccedilatildeo do T cruzi kap7neokap7higro
(FIGURA 19 B canaletas 2 e 3) Os tamanhos esperados para amplificaccedilotildees usando
primers externos agraves construccedilotildees e os primers dos genes de resistecircncia foram
identificados no gel de agarose indicando que os cassetes se integraram
corretamente no locus do gene TcKAP7 (FIGURA 19 B canaletas 4 a 7) Um
esquema da localizaccedilatildeo dos primers utilizados nas reaccedilotildees de PCR pode ser
visualizado na figura 19 C
QUADRO 5 ndash COMBINACcedilOtildeES DE PRIMERS UTILIZADOS NA PCR PARA
CONFIRMAR O NOCAUTE DE TcKAP7
Pares de primers Tamanho esperado
(pb)
1 KAP7F + KAP7R 747
2 NEOF + NEOR 795
73
3 HIGROF + HIGROR 1026
4 EXTF + NEOR 1410
5 EXTF + HIGROR 1634
6 NEOF + EXTR 1358
7 HIGROF + EXTR 1360
74
FIGURA 19 ENSAIOS DE PCR UTILIZANDO DNA DE T cruzi kap7kap7 (WT) E
T cruzi kap7neokap7higro (NO) COM DIFERENTES PRIMERS
LEGENDA 1 KAP7F + KAP7R 2 NEOF + NEOR (795 pb) 3 HIGROF + HIGROR (1026 pb) 4
EXTF + NEOR (1410 pb) 5 EXTF + HIGROR (1634 pb) 6 NEOF + EXTR (1358 pb) e 7
HIGROF + EXTR (1360 pb) No quadro A encontram-se as PCRs realizadas com DNA de T cruzi kap7kap7 (WT) e no quadro B encontram-se as PCRs realizadas com DNA de T cruzi kap7neokap7higro
(NO) No quadro C estaacute um esquema da localizaccedilatildeo dos primers utilizados
442 Anaacutelise da organizaccedilatildeo dos genes TcKAP7 neo e higro por ensaio do
tipo Southern blot
Neste ensaio foi utilizado DNA total extraiacutedo de T cruzikap7kap7 (tipo selvagem)
e T cruzi kap7neokap7higro (duplo nocaute) Foram utilizadas trecircs sondas (1) Um
fragmento do gene TcKAP7 (primeiros 598 pb da CDS) (2) o gene neo e (3) o gene
higro O DNA total das duas amostras foi digerido com a enzima de restriccedilatildeo HindIII
O padratildeo de digestatildeo desta enzima pode ser visualizado na figura 20 De acordo
com o mapa de restriccedilatildeo a inserccedilatildeo do cassete neo no locus KAP7 geraria um
fragmento HindIIIHindIII de 1024 pb enquanto a inserccedilatildeo do cassete higro geraria
um fragmento de 1032 pb cujos tamanhos satildeo diferentes do fragmento
HindIIIHindIII do locus original (1776 pb) As hibridizaccedilotildees mostram bandas
compatiacuteveis com os tamanhos dos fragmentos HindIIIHindIII esperados para cada
situaccedilatildeo acima (FIGURA 21) Podemos observar que a sonda KAP7 somente
reconhece uma banda de tamanho esperado apenas no DNA do parasita selvagem
(canaleta 1 FIGURA 21) enquanto que bandas correspondentes aos genes neo e
higrosomente aparecem no DNA do mutante KAP7 (canaleta 2 FIGURA 21)
75
FIGURA 20 ndash REPRESENTACcedilAtildeO ESQUEMAacuteTICA DOS SIacuteTIOS DA ENZIMA HindIII NO LOCUS DO GENE KAP7 DE T cruzi CL Brener LEGENDA Este esquema representa esquematicamente em escala os genes kap3 neo e higro as regiotildees upstream e downstream e os siacutetios de clivagem da enzima KpnI
FIGURA 21 ANAacuteLISE DA ORGANIZACcedilAtildeO DOS GENES TCKAP7 NEO E HIGRO POR ENSAIO DO TIPO SOUTHERN BLOT LEGENDA A Autoradiograma e B Padrotildees dos fragmentos obtidos da digestatildeo do DNA com a enzima de restriccedilatildeo HindIII Foram utilizadas trecircs sondas TcKAP7 neomicina e higromicina 1) DNA de T cruzikap7kap7 (tipo selvagem) e 2) T cruzi kap7neokap7higro (duplo nocaute)
76
45 Comparaccedilatildeo da expressatildeo do gene TcKAP7 por western blot
O antisoro contra a proteiacutena TcKAP7 obtido apoacutes imunizaccedilatildeo dos
camundongos foi utilizado em ensaio do tipo western blot para avaliar se TcKAP7
ainda estava sendo expresso no T cruzi apoacutes o nocaute gecircnico
O que se observou foi novamente como esperado que a proteiacutena TcKAP7 natildeo eacute
mais expressa no T cruzi kap7neokap7higro (figura 22) Pode-se observar a presenccedila
de TcKAP7 ( aprox 28 kDa) no extrato das formas epimastigotas de T cruzi kap7kap7
(figura 22A) mas natildeo no extrato de epimastigotas de T cruzi
kap7neokap7higro (figura 22B)
FIGURA 22 COMPARACcedilAtildeO DA EXPRESSAtildeO DO GENE TcKAP7 POR WESTERN BLOT LEGENDA Imunoblot de extratos de epimastigotas de T cruzi kap7kap7 (A) e de T cruzi kap7neokap7higro (B) reagidos com anti-TcKAP7
46 Anaacutelise da morfologia e da ultraestrutura do cinetoplasto do mutante de T
cruzi para TcKAP7
Sabendo-se que TcKAP7 estaacute associada ao cinetoplasto e pode estar
envolvida na compactaccedilatildeo do kDNA do T cruzi como foi mostrado para as KAPs de
Crithidia fasciculata (XU amp RAY 1993 XU et al 1996 HINES amp RAY 1998) sua
ausecircncia poderia levar a alteraccedilatildeo na estrutura do DNA mitocondrial dos parasitas
nocauteados Portanto o primeiro passo foi verificar se havia alteraccedilotildees na
77
morforlogia do parasita Formas epimastigotas do mutante de T cruzi foram
analisadas ao microscoacutepio oacuteptico apoacutes coloraccedilatildeo Como pode ser observado na
figura 23 epimastigotas do mutante de T cruzi para TcKAP7 apresentam uma
morfologia fusiforme com o cinetoplasto caracteriacutestico em forma de barra localizado
anteriormente ao nuacutecleo natildeo se evidenciando portanto nenhuma alteraccedilatildeo em
relaccedilatildeo agrave morfologia dos parasitas do tipo selvagem
FIGURA 23 - COLORACcedilAtildeO PELO MEacuteTODO PANOacuteTICO RAacutePIDO DOS PARASITAS EPIMASTIGOTAS NOCAUTEADOS LEGENDA A) Formas epimastigotas B) Forma epimastigota em maior aumento
Formas epimastigotas de parasitas do tipo selvagem e nocauteados foram
entatildeo analisados pela teacutecnica de microscopia eletrocircnica de transmissatildeo para
visualizar com mais detalhe o cinetoplasto e verificar se sua estrutura estava
alterada pela ausecircncia da TcKAP7 (FIGURA 24) A figura 24A mostra um corte
ultrafino de um epimastigota de T cruzi do tipo selvagem que apresenta o
cinetoplasto compacto e em forma de bastatildeo caracteriacutestico de formas
epimastigotas sem nenhuma alteraccedilatildeo aparente O mesmo pode ser visto na figura
24B para o epimastigota de T cruzi nocauteado A disposiccedilatildeo estrutura e aspecto
do cinetoplasto de ambos os parasitas selvagem e nocauteado natildeo apresentaram
nenhuma diferenccedila entre si mostrando que mesmo apoacutes o nocaute da KAP7 a
estrutura do cinetoplasto permanece aparentemente inalterada
78
FIGURA 24 COMPARACcedilAtildeO ENTRE A ULTRAESTRUTURA DO CINETOPLASTO DO T cruzi DM28C TIPO SELVAGEM (A) E DO MUTANTE DE T cruzi PARA TcKAP7 (B) POR MICROSCOPIA ELETROcircNICA DE TRANSMISSAtildeO
79
47 Multiplicaccedilatildeo diferenciaccedilatildeo e infectividade do mutante de T cruzi para
TcKAP7
Os parasitas mutantes foram analisados a fim de verificar se alteraccedilotildees na
estrutura do kDNA pela ausecircncia de KAP7 natildeo estavam levando a alteraccedilotildees na
fisiologia do parasita alterando sua multiplicaccedilatildeo diferenciaccedilatildeo e infectividade
Inicialmente foi analisado o perfil da curva de crescimento das formas
epimastigotas Observou-se que natildeo havia diferenccedila na curva de crescimento dos
parasitas nocauteados em relaccedilatildeo ao parasita selvagem (FIGURA 25)
FIGURA 25 CURVA DE CRESCIMENTO DO MUTANTE DE T cruzi PARA TcKAP7 (KO) E DO T cruzi Dm28c SELVAGEM (WT)
LEGENDA Curva de crescimento do mutante de T cruzi para TcKAP7 () e do T cruzi Dm28c ()
Em seguida os parasitas nocauteados foram analisados quanto a sua capacidade
de diferenciaccedilatildeo em tripomastigotas metaciacuteclicos Foram realizadas contagens
diferenciais em cacircmara de Neubauer a partir do sobrenadante da metaciclogecircnese
a cada 24 h apoacutes a incubaccedilatildeo das ceacutelulas em meio TAU3AAG durante um periacuteodo
de 3 dias (72 h) A partir dessas contagens foram construiacutedos curva com a contagem
do nuacutemero de metaciacuteclicos ao longo dos trecircs dias (FIGURA 26)
Nenhuma alteraccedilatildeo foi observada quando os parasitas nocauteados foram
submetidos ao processo de metaciclogecircnese in vitro Ou seja pode-se afirmar que
80
mesmo apoacutes o nocaute do gene TcKAP7 as formas epimastigotas do parasita
conseguem se diferenciar em formas metaciacuteclicas
FIGURA 26 METACICLOGEcircNESE IN VITRO DE T cruzi Dm28c TIPO SELVAGEM E T cruzi NOCAUTEADO LEGENDA Metaciclogecircnese in vitro de T cruzi Dm28c tipo selvagem () e T cruzi nocauteado ()
Uma vez que os parasitas nocauteados foram capazes de se diferenciar de
epimastigota a tripomastigota metaciacuteclico resolveu-se investigar se estes eram
capazes de infectar ceacutelulas in vitro Foi possiacutevel perceber as formas amastigotas
dentro de ceacutelulas VERO em cultura mostrando que o parasita natildeo perdeu sua
capacidade de infecccedilatildeo (dados natildeo mostrados) Assim pode-se concluir que aleacutem
de sofrer diferenciaccedilatildeo os mutantes de T cruzi para KAP7 tambeacutem mantiveram sua
capacidade de infecccedilatildeo
48 Anaacutelise da funccedilatildeo do gene KAP7 de Trypanosoma brucei atraveacutes de
ensaios de RNA de interferecircncia
Para averiguar a importacircncia da proteiacutena TcKAP7 na biologia do parasita
recorremos a ensaios de RNA de interferecircncia (RNAi) jaacute que existe uma alta
similaridade entre TcKAP7 e seu ortoacutelogo em Trypanosoma brucei
81
A via de RNA de interferecircncia consiste em um mecanismo de silenciamento
gecircnico que para a ceacutelula funciona como sistema de defesa O mecanismo inicia-se
atraveacutes da expressatildeo de um RNA dupla fita (dsRNA) contendo uma sequecircncia
complementar ao gene de interesse Este dsRNA seraacute entatildeo clivado em pequenos
fragmentos de cerca de 22 a 25 nucleotiacutedeos atraveacutes da atividade de uma
ribonuclease do tipo III denominada Dicer Estes pequenos RNAs seratildeo
direcionados e permaneceratildeo unidos a um complexo proteico denominado RISC
(ldquoRNA-InducedSilencingComplexrdquo) Nesse complexo os pequenos RNAs de
interferecircncia (siRNA) ligam-se por complementaridade ao RNA mensageiro do gene
a ser inativado guiando-os para degradaccedilatildeo pelas nucleases presentes no
complexo impedindo a siacutentese da respectiva proteiacutena (ULLU et al 2002) O vetor
utilizado para promover o silenciamento do gene TbKAP7 foi o p2T7-177 Este
plasmiacutedeo integra-se aos minicromossomos do T brucei regiatildeo de repeticcedilotildees 177
(FOLDYNOVA-TRANTIRKOVA et al 2005) Este vetor apresenta dois promotores
de polimerase em oposiccedilatildeo induziacuteveis por tetraciclina flanqueando a sequumlecircncia de
interesse Desta forma satildeo geradas duas moleacuteculas de mRNA que pareadas
formam a moleacutecula de RNA fita dupla capaz de induzir a maquinaria de degradaccedilatildeo
A induccedilatildeo da inibiccedilatildeo de TbKAP7 atraveacutes de RNAi levou a uma diminuiccedilatildeo da
multiplicaccedilatildeo celular do parasita a partir do quarto dia do experimento (FIGURA 27)
Os resultados obtidos neste ensaio mostraram que a participaccedilatildeo da TbKAP7
no metabolismo do T brucei eacute essencial jaacute que o silenciamento do gene TbKAP7
levou agrave reduccedilatildeo da proliferaccedilatildeo celular do parasita
82
FIGURA 27 RNAi DE TbKAP7 INIBE O CRESCIMENTO DAS FORMAS PROCIacuteCLICAS DE T
brucei
LEGENDA Curva de crescimento de linhagem celular de RNAi de TbKAP7 em T brucei induzido por
tetraciclina As ceacutelulas foram diluiacutedas a uma densidade celular inicial de 1 X 106 ml na presenccedila e
ausecircncia de tetraciclina As densidades celulares foram determinadas pela contagem de ceacutelulas a
intervalos de 24 horas durante oito dias apoacutes iniacutecio de adiccedilatildeo de tetraciclina A linha com quadrados
mostra a curva de crescimento celular na presenccedila de tetraciclina (+TET) A linha com losangos
mostra a curva de crescimento celular na ausecircncia de tetraciclina (- TET)
49 Caracterizaccedilatildeo estrutural de TcKAP7
491 Produccedilatildeo recombinante de TcKAP7
O cultivo de E coli BL-21(DE3) STAR contendo o plasmiacutedeo pET28a-
TcKAP7 foi feito em meio LB a 37 oC com a induccedilatildeo da expressatildeo realizada a uma
densidade oacutetica de DO600 de 08 com a adiccedilatildeo de 05 mM de ITPG durante a noite a
37 oC
As ceacutelulas foram recuperadas por centrifugaccedilatildeo ressuspensas sonicadas e
centrifugadas para a purificaccedilatildeo de TcKAP7 atraveacutes da cromatografia de afinidade
em resina de Ni-NTA (Figura 28A) Foi possiacutevel obter grande quantidade de
83
amostra com grau de pureza alto como visualizado atraveacutes de anaacutelise por SDS-
PAGE (Figura 28B)
FIGURA28 PURIFICACcedilAtildeO DE TCKAP7 ATRAVEacuteS DE CROMATOGRAFIA DE AFINIDADE LEGENDA A) Cromatograma de afinidade B) SDS-PAGE da cromatografia de afinidade Os nuacutemeros agrave esquerda da figura representam os tamanhos das bandas do marcador de massa molecular (Benchmark) (Invitrogen) e P banda correspondente agrave TcKAP7 purificada Caixa em vermelho indica o pico que corresponde agrave fraccedilatildeo no SDS-PAGE
Devido agrave presenccedila de bandas com possiacuteveis contaminantes as fraccedilotildees que
continham a proteiacutena de interesse foram submetidas agrave purificaccedilatildeo por cromatografia
de troca iocircnica onde a purificaccedilatildeo eacute realizada baseada na afinidade por cargas
entre as proteiacutenas e a resina
Para esta purificaccedilatildeo utilizou-se a coluna SP Hitrap (GE Healthcare Life
Sciences) que eacute uma coluna de carga negativa Essa resina foi escolhida pois o pH
do tampatildeo em que se encontrava TcKAP7 era menor que o pI da proteiacutena Nessas
condiccedilotildees a carga superficial de TcKAP7 eacute positiva Para favorecer a interaccedilatildeo
TcKAP7 e resina foi feita uma diluiccedilatildeo de TcKAP7 para retirada de NaCl A eluiccedilatildeo
da proteiacutena foi realizada com um gradiente segmentado de tampatildeo B para
84
cromatografia de troca iocircnica TcKAP7 foi eluiacuteda com 68 do tampatildeo B (FIGURA
29)
FIGURA 29 PURIFICACcedilAtildeO DE TCKAP7 ATRAVEacuteS DE CROMATOGRAFIA DE TROCA IOcircNICA
LEGENDA A) Cromatografia de troca iocircnica B) SDS-PAGE da cromatografia de troca iocircnica Os nuacutemeros agrave esquerda da figura representam os tamanhos das bandas do marcador de massa molecular (Benchmark) (Invitrogen) e P banda correspondente agrave TcKAP7 purificada Caixa em vermelho indica o pico que corresponde agrave fraccedilatildeo no SDS-PAGE Curva em azul representa absorbacircncia em 280 nm Linha em verde indica concentraccedilatildeo de tampatildeo B para eluiccedilatildeo da amostra
410 Anaacutelise do estado oligomeacuterico de TcKAP7
A amostra purificada por troca iocircnica foi submetida agrave cromatografia de
exclusatildeo molecular tambeacutem chamada de gel filtraccedilatildeo que consiste na separaccedilatildeo
de biomoleacuteculas de acordo com seu tamanho e forma A coluna neste processo
conteacutem um poliacutemero com ligaccedilotildees cruzadas com poros de tamanho definido As
moleacuteculas maiores iratildeo migrar mais rapidamente que as menores pois natildeo satildeo
85
capazes de penetrar no interior dos poros da resina eluindo diretamente da coluna
As moleacuteculas menores por entrarem pelos poros da resina e levarem mais tempo
percorrendo os poros satildeo eluiacutedas mais tarde em relaccedilatildeo as que satildeo maiores
Ao comparar o volume de eluiccedilatildeo de TcKAP7 com o volume de eluiccedilatildeo de
proteiacutenas com massa molecular conhecidos (dados natildeo mostrados) foi possiacutevel
verificar que TcKAP7 parece ser um monocircmero em soluccedilatildeo Para confirmar esses
dados a mesma amostra foi submetida ao experimento de espalhamento dinacircmico
de luz (DLS)
O DLS eacute uma teacutecnica que se estima a distribuiccedilatildeo de tamanho das
populaccedilotildees de partiacuteculas que estatildeo presentes na amostra permitindo a detecccedilatildeo de
agregados proteicos ou de diferentes estados de oligomerizaccedilatildeo na amostra
indicando heterogeneidade Eacute importante ressaltar que para maiores chances de
sucesso em ensaios de cristalizaccedilatildeo a amostra deve encontrar-se monodispersa
Os dados de DLS mostram que 911 da massa de TcKAP7 analisada
apresenta um raio hidrodinacircmico (Rh) de 39 nm que representa uma massa
aparente de 29 kDa (FIGURA 30) Isto eacute condizente com um monocircmero cuja massa
teoacuterica seria de aproximadamente 28 kDa (incluindo a cauda de 6 histidinas) de
acordo com a prediccedilatildeo feita pelo servidor Expasy Protparam
(httpwebexpasyorgprotparam)A polidispersividade da amostra foi baixa
indicando que a mesma estava homogecircnea
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0 1 2 3 4 5 6 7
M
assa
Rh (nm)
fr80
fr82
fr84
fr85
86
FIGURA 30 ANAacuteLISE POR DLS DE TCKAP7 LEGENDA Anaacutelise por DLS de TcKAP7 contendo as fraccedilotildees obtidas na cromatografia de afinidade As fraccedilotildees 80 84 e 85 apresentam um raio hidrodinacircmico (Rh) de 39 nm
Aleacutem disso tambeacutem foram obtidas informaccedilotildees sobre o envelope de TcKAP7
a partir dos dados coletados atraveacutes da teacutecnica de SAXS mostrando que o raio de
giro (Rg) do envelope de TcKAP7 estaacute de acordo com o estimado por DLS (FIGURA
31)
FIGURA 31 ENVELOPE MOLECULAR DE SAXS
411 Anaacutelise do conteuacutedo de estrutura secundaacuteria de TcKAP7 recombinante
Atraveacutes da anaacutelise do espectro de dicroiacutesmo circular pode-se verificar o
conteuacutedo de estrutura secundaacuteria da proteiacutena e inferir enovelamento da proteiacutena
recombinante Os dados obtidos para a TcKAP7 revelaram a presenccedila de estruturas
α caracterizadas pelos miacutenimos pronunciados em 208 nm e 222 nm e de estruturas
coiled na amostra de TcKAP7 caracterizada pelos miacutenimos pronunciados em 205
nm (FIGURA 32) Este resultado estaacute de acordo a prediccedilatildeo de estrutura secundaacuteria
87
realizada pelo servidor PSIPRED (httpbioinfcsuclacukpsipred (FIGURA 33)
Esses resultados sugerem que a proteiacutena recombinante possui correto
enovelamento
FIGURA 32 ESPECTRO DE DICROIacuteSMO CIRCULAR DE TcKAP7
FIGURA 33 PREDICcedilAtildeO DE ESTRUTURA SECUNDAacuteRIA DE TcKAP7
412 Anaacutelise estrutural de TcKAP7
A fim de obter-se a estrutura tridimensional de TcKAP7 por cristalografia de
raios-X foram realizados ensaios de cristalizaccedilatildeoFoi possiacutevel observar a formaccedilatildeo
de um cristal em apenas uma condiccedilatildeo Imidazol 01 M Polietilenoglicol (PEG) 8000
10 wv e Acetato de caacutelcio 02 M
A visualizaccedilatildeo atraveacutes de luz ultra-violeta atraveacutes do equipamento Rock
Imager Fomulatrix permitiu identificaacute-lo como cristal de proteiacutena jaacute que este
diferencia-se de cristal de sal pela fluorescecircncia quando excitado em comprimento
de onda de 280 nm
-20
-18
-16
-14
-12
-10
-8
-6
-4
-2
0
2
200 210 220 230 240 250 260
Ɵ M
RV
x 1
03
(de
g cm
2d
mo
l-1)
Comprimento de onda (nm)
88
O perfil do cristal pode ser visualizado na figura 34 Esse cristal encontra-se
pequeno e mal-formado Aleacutem disso os meacutetodos para a determinaccedilatildeo estrutural de
uma estrutura ineacutedita (sem homologia com estruturas conhecidas) necessitam de
mais de um cristal Dessa forma foram realizados refinamentos dessas condiccedilotildees
iniciais visando aumentar q quantidade de cristais aumentar seu tamanho e
melhorar sua organizaccedilatildeo A concentraccedilatildeo de PEG (5 A 10) e do pH (6 a 9) com
intervalos de 1 unidade foram alterada Entretanto mesmo assim natildeo foi possiacutevel a
obtenccedilatildeo de cristais adequados para a difraccedilatildeo de raios X e novos refinamentos
seratildeo necessaacuterios
FIGURA 34 CRISTAL DE TcKAP7 DE T CRUZI LEGENDA AObtenccedilatildeo do cristal de TcKAP7 na condiccedilatildeo de Imidazol 01 M Polietilenoglicol (PEG) 8000 10 wv e Acetato de caacutelcio 02 M e B Cristal de TcKAP7 visto sob luz ultravioleta
Uma vez que natildeo foi possiacutevel durante o desenvolvimento desse projeto a
obtenccedilatildeo da estrutura cristalograacutefica de TcKAP7 procedeu-se com a construccedilatildeo de
seu modelo molecular
A modelagem molecular eacute uma ferramenta que permite a obtenccedilatildeo de
modelos da estrutura tridimensional de uma determinada proteiacutena com base em
homologia sequencial ou estrutural com proteiacutenas cujas estruturas tridimensional
foram experimentalmente resolvidas
Para a construccedilatildeo do modelo foi utilizado o programa MODELLER (SALI amp
BLUNDELL 1993) este programa eacute utilizado para a modelagem por homologia a
estruturas tridimensionais de proteiacutenas O programa automaticamente constroacutei um
modelo baseado na anaacutelise de um alinhamento de sequecircncias entre a proteiacutena para
a qual se deseja construir o modelo e uma proteiacutena relacionada cuja estrutura
tridimensional jaacute foi resolvida Nesse caso foram utilizadas estruturas de duas
A B
89
proteiacutenas como molde para a construccedilatildeo da estrutura de TcKAP7 A estrutura da
proteiacutena HMGB1(coacutedigo de acesso no banco de dados de proteiacutenas 2GZK)
(wwwpdborg) para a porccedilatildeo amino-terminal e a estrutura do fator A de transcriccedilatildeo
mitocondrial (coacutedigo de acesso 3TQ6) para a porccedilatildeo carboxi-terminal da proteiacutena
(FIGURA 35A) Duas proteiacutenas foram selecionadas para a construccedilatildeo do modelo de
TcKAP7 visto que a similaridade de sequencia entre TcKAP7 e proteiacutenas com
estruturas resolvidas eacute bastante baixo A similaridade sequencial de TcKAP7 e
proteiacutena HMGB1 eacute de 224 e entre TcKAP7 e o fator A de transcriccedilatildeo mitocondrial
eacute de 264 No entanto ambas proteiacutenas possuem alta similaridade em relaccedilatildeo agrave
estrutura secundaacuteria (mais de 90) Para aumentar a confiabilidade do modelo
utilizamos uma proteiacutena para construir a sequencia N-terminal de TcKAP7
(aminoaacutecidos 1-184) e outra para o C-terminal (aminoaacutecidos 185-248)
A qualidade do modelo pode ser avaliada por exemplo atraveacutes de graacuteficos e
tabelas que analisam restriccedilotildees quiacutemicas e fiacutesicas de cada aacutetomo constituinte do
modelo Neste trabalho foi utilizado o graacutefico de Ramachandran (FIGURA 35B) nele
pode-se visualizar todas as combinaccedilotildees possiacuteveis de acircngulos dieacutedricos Ψ (psi)
versus os Φ (phi) nos aminoaacutecidos de um polipeptiacutedeo e que contribuem para a
conformaccedilatildeo das estruturas das proteiacutenas (RAMACHANDRAN et al 1963) Dos 230
resiacuteduos apenas 5 estatildeo em regiotildees natildeo permitidas do graacutefico Esse eacute um
excelente valor pois eacute similar ao valor meacutedio encontrado para estruturas
experimentalmente determinadas com resoluccedilatildeo de no miacutenimo 20 Aring
(httpwwwebiacukthornton-srvdatabasesprofunc)
Tambeacutem eacute possiacutevel visualizar a topologia de TcKAP7 (FIGURA 35 C) que
mostra as regiotildees de α-heacutelices e regiotildees de coiled presentes na proteiacutena
corroborando com os dados obtidos na espectroscopia de dicroiacutesmo circular
90
FIGURA 35 ESTRUTURA DE TcKAP7 LEGENDA AModelo tridimensional de KAP7 B Graacutefico de Ramachandran e C Topologia de TcKAP7
A anaacutelise da superfiacutecie eletrostaacutetica de TcKAP7 mostra que existem regiotildees
ricas em aminoaacutecidos com cargas positivas que podem conferir afinidades agrave outras
proteiacutenas com carga carga superficial negativa ou mesmo aacutecidos nucleicos (FIGURA
36)
91
FIGURA 36 SUPERFIacuteCIE ELETROSTAacuteTICA DE TcKAP7 LEGENDA Visualizaccedilatildeo de diferentes regiotildees de TcKAP7 Vermelho potencial negativo Azul potencial positiva Branco Neutro
413 Investigaccedilatildeo de possiacuteveis funcionalidades baseadas na estrutura de
TcKAP7
4131 Prediccedilatildeo de funccedilatildeo paraTcKAP7
92
A prediccedilatildeo de funccedilatildeo para TcKAP7 foi realizada a partir do enovelamento de
proteiacutenas utilizando o servidor Profunc (httpwwwebiacukthornton-
srvdatabasesprofunc) O objetivo do servidor ProFunc eacute ajudar na identificaccedilatildeo de
uma possiacutevel funccedilatildeo bioquiacutemica de uma proteiacutena a partir da sua estrutura
tridimensional Ele utiliza uma seacuterie de meacutetodos incluindo comparaccedilatildeo de
enovelamento conservaccedilatildeo dos resiacuteduos e modelos 3D funcionais tanto para
identificar provaacuteveis siacutetios ativos da proteiacutena quanto possiacuteveis homoacutelogos no Protein
Data Bank (PDB) Neste procedimento tenta-se ajustar a estrutura da proteiacutena de
interesse aos tipos de enovelamentos de proteiacutenas conhecidas Atualmente mais de
1000 tipos jaacute foram registrados e depositados em bibliotecas de enovelamentos
Sabe-se que o alinhamento estrutural entre proteiacutenas consideradas de uma
mesma famiacutelia mesmo que seja apenas na regiatildeo do siacutetio ativo pode ser um
importante meacutetodo para se inferir a funccedilatildeo da sequecircncia em estudo (LASKOWSKI et
al 2003) A evoluccedilatildeo tende a conservar funccedilotildees que dependem mais diretamente
das estruturas 3D que das similaridades entre as sequecircncias de aminoaacutecidos das
proteiacutenas (SANCHEZ et al 2000)
Neste trabalho as quatro estruturas que possuem maior similaridade
estrutural com TcKAP7 estatildeo depositadas no Protein Data Bank (PDB) com os
coacutedigos 3TQ6 4NOD 3TMM 4NNU Todas as estruturas satildeo referentes agrave proteiacutena
TFAM (fator transcricional A mitocondrial)
As estruturas proteicas foram obtidas no banco de dados puacuteblicos de
proteiacutenas PDB (Protein Data Bank) e submetidas a um alinhamento estrutural com o
modelo de TcKAP7 (FIGURA 35A) no programa WinCoot Esse alinhamento pode
ser visualizado na figura 37 As regiotildees em vermelho representam as regiotildees de
TcKAP7 que apresentam interaccedilatildeo com DNA pois se alinham com as regiotildees de
ligaccedilatildeo agrave DNA das outras proteiacutenas e as regiotildees em azul representam regiotildees sem
homologia com as demais
Esse resultado sugere que TcKAP7 pode interagir com DNA com isso estes
dados podem ser utilizados para nortear mais estudos sobre a interaccedilatildeo das
proteiacutenas KAPrsquos com o DNA do cinetoplasto de T cruzi
93
FIGURA 37 ALINHAMENTO ESTRUTURAL DE 3TQ6 4NOD 3TTM 4NNU E TCKAP7 LEGENDA Em vermelho encontram-se as regiotildees de TcKAP7 que podem interagir com DNA (Resiacuteduos 1-67 e 140-166) e em azul regiotildees sem homologia com as demais
4132 Anaacutelises preliminares da possiacutevel interaccedilatildeo entre TcKAP7 e kDNA
As prediccedilotildees estruturais sugeriram que a proteiacutena TcKAP7 possui motivos
similares agrave proteiacutenas que interagem com DNA No entanto a sequecircncia de
aminoaacutecidos entre as proteiacutenas eacute bastante baixa Como a funccedilatildeo de TcKAP7
permanece obscura foram realizados alguns ensaios para tentar verificar a
possibilidade desta proteiacutena interagir com kDNA Para isto utilizou-se a teacutecnica de
dicroiacutesmo circular para avaliar se a presenccedila de kDNA poderia resultar em
alteraccedilotildees estruturais em TcKAP7 o que seria uma evidecircncia da possiacutevel interaccedilatildeo
entre esta proteiacutena e o aacutecido nucleico
Foram realizadas medidas de dicroiacutesmo circular com amostras de TcKAP7
kDNA e TcKAP7 na presenccedila de kDNA Para a anaacutelise de dados foi realizado o
somatoacuterio das curvas obtidas com as amostras de TcKAP7 e kDNA separadamente
Este somatoacuterio resultou em uma curva teoacuterica que indica o perfil teoacuterico de uma
amostra contendo TcKAP7 e kDNA sem interaccedilotildees presentes Aacute essa curva foi
sobreposta a curva experimental da medida de dicroiacutesmo circular de TcKAP7 na
94
presenccedila de kDNA A figura 38 ilustra essa sobreposiccedilatildeo onde pode-se verificar que
as curvas natildeo se sobrepotildeem portanto alteraccedilotildees estruturais ocorrem em TcKAP7
na presenccedila de kDNA
FIGURA 38 ESPECTRO DE DICROIacuteSMO CIRCULAR DE TcKAP7 LEGENDA Em azul encontra-se o espectro experimental de TcKap7 na presenccedila de DNA em vermelho o espectro teoacuterico de TcKAP7 e DNA
Para investigar mudanccedilas estruturais associadas a interaccedilatildeo com kDNA foi
realizada uma coleta de dados de SAXS na presenccedila de 1ug de kDNA
A comparaccedilatildeo dos modelos de baixa resoluccedilatildeo por SAXS indica uma
diferenccedila conformacional pontual da proteiacutena na presenccedila de kDNA As figuras 28 e
29 mostram os envelopes da proteiacutena TcKAP7na ausecircncia (FIGURAS 39A e 40A) e
presenccedila de kDNA de T cruzi (FIGURA 39B e FIGURA 40B) Percebe-se uma
diferenccedila de densidade eletrocircnica na regiatildeo da heacutelice (Residuos 140 - 166
evidenciados em vermelho) No envelope de TcKAP7 ela eacute bastante flexiacutevel e natildeo eacute
observada densidade eletrocircnica nessa regiatildeo no entanto na presenccedila de kDNA
essa mesma regiatildeo mostra-se mais riacutegida e eacute possiacutevel estimar seu posicionamento
baseado na densidade eletrocircnica Aleacutem disso essa heacutelice eacute predita como interatora
de DNA com base nas anaacutelises estruturais previamente realizadas nesse trabalho
Esses dados sugerem uma mudanccedila conformacional da proteiacutena na presenccedila
do kDNA fazendo com que esta mude seu arranjo estrutural para permanecer ligada
agrave moleacutecula de DNA sugerindo uma interaccedilatildeo entre TcKAP7 e DNA do cinetoplasto
-22
-17
-12
-7
-2
3
200 210 220 230 240 250 260
ϴM
RW
x 1
03
(de
g cm
-2 d
mo
l-1)
Comprimento de onda (nm)
Kap7+DNA
95
de T cruzi Esses dados corroboram com o que foi visto na superfiacutecie eletrostaacutetica
(FIGURA 36) e no alinhamento estrutural (FIGURA 37)
FIGURA 39 ENVELOPE MOLECULAR DETcKAP7 LEGENDA A Monocircmero de TcKAP7 ajustado ao envelope de SAXS B Monocircmero de TcKAP7 + kDNA ajustado ao envelope de SAXSResiduos 140- 166 evidenciados em vermelho
96
FIGURA 40 ENVELOPE MOLECULAR DE TcKAP7 VISTO EM DIFERENTES AcircNGULOS LEGENDA A Monocircmero de TcKAP7 ajustado ao envelope de SAXS B Monocircmero de TcKAP7 + kDNA ajustado ao envelope de SAXS Residuos 140- 166 evidenciados em vermelho
97
5 DISCUSSAtildeO
O Trypanosoma cruzi pertence a um grupo que divergiu muito cedo na
linhagem eucarioacutetica apresentando diversas caracteriacutesticas uacutenicas em relaccedilatildeo a
outros eucariotos Uma dessas caracteriacutesticas eacute a presenccedila de uma mitococircndria
uacutenica ramificada pelo corpo do protozoaacuterio contendo uma regiatildeo especializada o
cinetoplasto onde reside o DNA mitocondrial tambeacutem conhecido como kDNA O
kDNA eacute composto por uma rede de moleacuteculas interligadas entre si os maxiciacuterculos e
os miniciacuterculos (SHAPIRO amp ENGLUND 1995) Mais de 30 proteiacutenas envolvidas na
replicaccedilatildeo e na manutenccedilatildeo do kDNA jaacute foram identificadas e acredita-se que um
nuacutemero aproximado de 100 proteiacutenas muitas delas presentes apenas em
cinetoplastiacutedeos possam estar envolvidas nesses processos (LIU et al 2005) A
maioria dessas proteiacutenas foi identificada em T brucei e C fasciculata e
possivelmente vaacuterias delas principalmente aquelas envolvidas em replicaccedilatildeo
devem estar codificadas no genoma do T cruzi
Apesar de serem conhecidos muitos dos componentes da maquinaria de
replicaccedilatildeo dos miniciacuterculos e maxiciacuterculos natildeo se pode dizer o mesmo para as
proteiacutenas envolvidas na manutenccedilatildeo da estrutura do kDNA Com exceccedilatildeo de 4
proteiacutenas com caracteriacutesticas de histonas H1 (KAP1 a 4) encontradas associadas ao
cinetoplasto de C fasciculata pouco ainda eacute conhecido sobre as proteiacutenas que
participam da organizaccedilatildeo do kDNA em outros tripanosomatiacutedeos
Zavala-Castro e colaboradores (2002) identificaram sete proteiacutenas variando
de 19 a 31 kDa associadas ao kDNA de formas epimastigotas de T cruzi a partir
de kDNA extraiacutedo de ceacutelulas fixadas com formaldeiacutedo Os tamanhos observados satildeo
compatiacuteveis com aqueles das KAPs encontradas por Xu e Ray (1993) usando
experimento similar em C fasciculata entretanto nenhuma das possiacuteveis KAPs
descritas por Zavala-Castro e colaboradores foi caracterizada
Noacutes iniciamos estudos objetivando identificar proteiacutenas envolvidas na
organizaccedilatildeo e segregaccedilatildeo do kDNA de T cruzi a partir dos dados fornecidos pelo
sequenciamento do genoma desse parasita fazendo uma comparaccedilatildeo com as
KAPs de C fasciculata Estudos realizados por Cavalcanti e colaboradores (2009)
usando como modelo as sequecircncias de KAPs de C fasciculata identificaram 35
proteiacutenas relacionadas em diferentes tripanosomatiacutedeos cujos genomas estatildeo
sequenciados (11 em T cruzi 7 em L braziliensis 6 em L major e L infantum e 5
98
em T brucei) Essas sequecircncias puderam ser agrupadas em 7 tipos diferentes de
KAPs (KAP1 a 7) Das 7 KAPs T cruzi possui 5 (TcKAP3 a 7) cuja a sintenia
gecircnica eacute uma das caracteriacutesticas marcantes jaacute que alguns genes divergem em
relaccedilatildeo ao tamanho e portanto no tamanho da proteiacutena codificada As KAPs de T
cruzi e T brucei satildeo maiores do que as de C fasciculata e Leishmania spp Isso
pode sugerir que KAPs possam ter evoluiacutedo para um tamanho que comporte
basicamente suas funccedilotildees de associaccedilatildeo com o kDNA de maneira mais eficiente
Os resultados obtidos por Cavalcanti et al (2009) para TcKAP4 e TcKAP6
mostraram que em epimastigotas e amastigotas estas duas proteiacutenas estatildeo
distribuiacutedas ao longo de toda a rede de kDNA consistente com o que foi observado
em C fasciculata (XU et al 1996 HINES amp RAY 1998) poreacutem CfKAP4 tambeacutem
apresentou um padratildeo de marcaccedilatildeo nos poacutelos opostos do kDNA sugerindo que
essa KAP em particular se associe aos miniciacuterculos receacutem-replicados antes de sua
reintegraccedilatildeo agrave rede de kDNA (XU et al 1996) Contudo em tripomastigotas de T
cruzi estas duas proteiacutenas estatildeo distribuiacutedas na periferia da rede de kDNA
(CAVALCANTI et al 2009) indicando que diferente de C fasciculata elas
apresentam uma dinacircmica de associaccedilatildeo que depende da forma evolutiva do
parasita possivelmente refletindo distintas interaccedilotildees com proteiacutenas da rede de
kDNA em epimastigotas e tripomastigotas No presente trabalho ampliamos o
conhecimento sobre as KAPs de T cruzi estudando o papel da KAP7 na fisiologia
desse parasita
Em C fasciculata a regulaccedilatildeo da expressatildeo de vaacuterios genes que codificam
proteiacutenas mitocondriais ocorre durante o ciclo celular em parte por uma sequumlecircncia
consenso [(CA)AUAGAA(GA)] presente nas regiotildees 5rsquo e 3rsquo-UTR dos respectivos
mRNAs (BROWN amp RAY 1997 MAHMOOD et al 1999 MAHMOOD amp RAY 1998
PASION et al 1996) O mesmo foi observado para L major onde uma sequecircncia
parecida com aquela encontrada em C fasciculata (CATAGA) foi identificada nas
regiotildees 5rsquo e 3rsquo de vaacuterios genes cuja a expressatildeo era maior na fase S do ciclo celular
(ZICK et al 2005) Analisando as regiotildees 5rsquo e 3rsquo do transcrito do gene TOP2 de T
cruzi que codifica a topo II mitocondrial descrito por Fragoso e Goldenberg (1992)
tambeacutem podemos observar a sequecircncia CATAGA repetida duas vezes na regiatildeo
5rsquoUTR e uma vez na regiatildeo 3rsquo-UTR do transcrito desse gene
Como relatamos neste trabalho a sequecircncia da regiatildeo 5rsquo-UTR do transcrito
TcKAP7 natildeo mostrou nenhum elemento com as caracteriacutesticas daquele envolvido na
99
regulaccedilatildeo de genes expressos na fase S do ciclo celular de outros
tripanosomatiacutedeos
Em relaccedilatildeo agrave localizaccedilatildeo de TcKAP7 verificamos atraveacutes de ensaios de
imunofluorescecircncia a distribuiccedilatildeo de TcKAP7 na regiatildeo dos poacutelos da rede de kDNA
das formas epimastigotas de T cruzi poreacutem ainda natildeo analisamos como esta
proteiacutena estaacute distribuiacuteda nas formas tripomastigotas que possuem a rede de kDNA
com formato arredondado e menos compactada
A localizaccedilatildeo de KAP7 na regiatildeo dos poacutelos do cinetoplasto de T cruzi
sugere que ela tenha funccedilotildees na replicaccedilatildeo da rede de kDNA pois nessa regiatildeo
estatildeo concentradas diversas proteiacutenas necessaacuterias para finalizaccedilatildeo do processo de
replicaccedilatildeo de miniciacuterculos
Para a construccedilatildeo do modelo molecular de TcKAP7 foram utilizadas
estruturas de duas proteiacutenas a estrutura da proteiacutena HMGB1 (2GZK) para a porccedilatildeo
amino-terminal e a estrutura da proteiacutena fator A de transcriccedilatildeo mitocondrial (3TQ6)
para a porccedilatildeo carboxi-terminal da proteiacutena ambas apresentam alta similaridade em
relaccedilatildeo agrave estrutura secundaacuteria (mais de 90) e tratam-se de proteiacutenas de um
mesmo grupo HMG (High-mobility group) Em T brucei TbKAP6 uma proteiacutena do
grupo HMG estaacute envolvida na replicaccedilatildeo e manutenccedilatildeo do kDNA (WANG et al
2014) Baseado nesses dados juntamente com os dados da imunofluorescecircncia
indireta pode-se sugerir um papel de TcKAP7 na replicaccedilatildeo da rede de kDNA
Embora ainda natildeo saibamos como KAP7 se associa com o kDNA de T
cruzi eacute possiacutevel que isso ocorra de duas maneiras atraveacutes de ligaccedilotildees
eletrostaacuteticas natildeo-especiacuteficas ou de interaccedilotildees com regiotildees especiacuteficas dos
miniciacuterculos
Atraveacutes de ensaios de SAXS foi possiacutevel perceber que a proteiacutena sofre
alteraccedilotildees conformacionais na presenccedila do kDNA sugerindo sua interaccedilatildeo com
esse aacutecido nucleacuteico Esta interaccedilatildeo pode ser eletrostaacutetica uma vez que a anaacutelise da
superfiacutecie eletrostaacutetica de TcKAP7 mostrou a predominacircncia de regiotildees ricas em
aminoaacutecidos com cargas positivas que podem conferir afinidades agrave outras proteiacutenas
com carga superficial negativa ou mesmo aacutecidos nucleicos mais uma vez sugerindo
a interaccedilatildeo com kDNA
Poreacutem natildeo se pode descartar a possibilidade de que a interaccedilatildeo de TcKAP7
com o kDNA seja atraveacutes de interaccedilotildees com regiotildees especiacuteficas dos miniciacuterculos
Nos tripanosomatiacutedeos a rede de kDNA assume a forma de um disco achatado
100
perpendicular ao flagelo onde os miniciacuterculos estatildeo alinhados em fibrilas orientadas
paralelamente ao eixo do disco (LIU et al 2005) Acredita-se que a ordenaccedilatildeo e
compactaccedilatildeo dos miniciacuterculos estatildeo relacionadas agrave proacutepria estrutura da moleacutecula de
miniciacuterculo Os miniciacuterculos apresentam regiotildees ricas em A+T que podem causar
curvaturas na moleacutecula (MARINI et al 1984 NTAMBI et al 1984) facilitando sua
inserccedilatildeo de forma ordenada no disco de kDNA aleacutem disso possuem regiotildees
conservadas onde estatildeo localizadas as origens de replicaccedilatildeo Essas regiotildees por
sua vez podem ser reconhecidas por proteiacutenas tais como a KAP7 que ajudam a
estabilizar a estrutura Os resultados com C fasciculata mostram que KAP2 3 e 4 se
ligam em regiotildees especiacuteficas dos miniciacuterculos ricas em A+T mas que natildeo satildeo
aquelas que geram a curvatura das moleacuteculas (XU et al 1996) Contudo KAP1 se
liga de maneira inespeciacutefica aos miniciacuterculos (HINES amp RAY 1998) Aleacutem disso
existe a sequecircncia universal de miniciacuterculo (UMS) e as proteiacutenas que se ligam a
essa sequecircncia (UMSBP) as quais podem participar de interaccedilotildees com as KAPrsquos
Em C fasciculata CfKAP3 sozinha consegue condensar a rede de kDNA e inibir a
decatenaccedilatildeo pela enzima topo II Poreacutem a interaccedilatildeo entre CfKAP3 e CfUMSBP
pode descondensar a rede de kDNA e reestabelecer a decatenaccedilatildeo mediada pela
topo II indicando que as proteiacutenas KAPrsquos dos tripanosomatiacutedeos podem apresentar
diferentes funccedilotildees em diferentes espeacutecies (KAPELLER et al 2011)
Para investigar a importacircncia de TcKAP7 no T cruzi e seu envolvimento ou
natildeo com o rearranjo topoloacutegico do kDNA durante o processo de diferenciaccedilatildeo do
parasita realizamos a deleccedilatildeo do gene TcKAP7 Nenhuma alteraccedilatildeo estrutural ou
morfoloacutegica na rede de kDNA foi observada no mutante de T cruzi para TcKAP7 Do
mesmo modo o parasita mutante natildeo apresentou perfil de crescimento alterado e
foi capaz de se diferenciar nas formas tripomastigotas metaciacuteclicas e infectar ceacutelulas
VERO onde se diferenciaram em formas amastigotas O mesmo foi visto quando foi
realizado o nocaute do gene TcKAP3 (DE SOUZA et al 2010)
Uma das hipoacuteteses para explicar esse fato eacute que alguma outra KAP de T
cruzi possa estar assumindo o papel da TcKAP7 talvez a TcKAP4 que se localiza
nos poacutelos do cinetoplasto quando da inserccedilatildeo dos miniciacuterculos na rede apoacutes serem
replicados na regiatildeo cinetoflagelar A redundacircncia no papel das KAPs faz com que a
rede de kDNA seja compactada e segregada corretamente mesmo na ausecircncia de
uma delas (DE SOUZA et al 2010) Sabe-se que o nocaute do gene Cfkap2 ou do
gene Cfkap3 separadamente natildeo mostrou nenhuma alteraccedilatildeo no fenoacutetipo de C
101
fasciculata Poreacutem a deleccedilatildeo de ambos os genes causou diversas alteraccedilotildees
aumento nos niacuteveis de mRNAs mitocondriais reduccedilatildeo na respiraccedilatildeo inibiccedilatildeo da
divisatildeo celular e acuacutemulo de ceacutelulas com morfologias anormais (AVLIYAKULOV et
al 2004)
Com o intuito de complementar os estudos para a caracterizaccedilatildeo do gene
TcKAP7 foram realizados ensaios de RNA de interferecircncia visando analisar a
funccedilatildeo do gene TbKAP7 ortoacutelogo em T brucei jaacute que a maquinaria de RNAi em T
cruzi eacute inexistente (DA ROCHA et al 2003) Com isso foi visto que a participaccedilatildeo da
TbKAP7 no metabolismo do T brucei eacute essencial jaacute que o silenciamento do gene
TbKAP7 levou agrave reduccedilatildeo da proliferaccedilatildeo celular do parasita corroborando com os
dados encontrados para TbKAP6 (WANG et al 2014)
Esperamos que o conhecimento das diversas moleacuteculas envolvidas na
organizaccedilatildeo e replicaccedilatildeo da rede de kDNA assim como o entendimento dos
mecanismos fisioloacutegicos que ocorrem nesta estrutura tatildeo peculiar que eacute o
cinetoplasto dos tripanosomatiacutedeos possam nos ajudar a esclarecer vaacuterios aspectos
relacionados a biologia destes eucariotos primitivos e a evoluccedilatildeo do genoma
mitocondrial ao longo do processo evolutivo
102
6 CONCLUSOtildeES
Com base nos resultados observados neste trabalho foi possiacutevel concluir
1 ndash A proteiacutena TcKAP7 eacute uma proteiacutena associada ao cinetoplasto de T
cruzi e possui caracteriacutesticas que a identificam como KAPs do tipo histona H1
incluindo seu tamanho e sua composiccedilatildeo de aminoaacutecidos e sua superfiacutecie
eletrostaacutetica
2 ndash TcKAP7 estaacute localizada nos poacutelos do cinetoplasto de T cruzi podendo
estar envolvida na replicaccedilatildeo dos miniciacuterculos
3 - TcKAP7 sofre mudanccedilas conformacionais na presenccedila do kDNA de T
cruzi evidenciando sua interaccedilatildeo com o aacutecido nucleico
4 ndash O mutante de T cruzi para TcKAP7 natildeo apresentou alteraccedilatildeo na
estrutura do cinetoplasto e na morfologia do parasita
5 ndash A proliferaccedilatildeo e a diferenciaccedilatildeo do T cruzi natildeo foram alteradas quando
o parasita teve o gene TcKAP7 deletado do genoma
6 ndash O silenciamento do gene TbKAP7 eacute essencial no metabolismo do T
brucei levando agrave reduccedilatildeo da proliferaccedilatildeo celular do parasita
103
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