biotechnology 2012-03
Post on 14-Jun-2015
173 Views
Preview:
TRANSCRIPT
Методы работы с ДНК
ПЦР
Рестрикция
Рестрикция ДНК
- Разрезание молекулы ДНК в определенной последовательности
Рестриктазы1 Узнают определенные
последовательности в ДНК
2 Разрезают молекулу ДНК в определенных местах
Рестрикция ДНК
Рестриктазы(обнаружено несколько тысяч)
Образуются laquoлипкиеraquo или laquoтупыеraquo концы
Type IIR
Рестриктазы Type II
Еще есть Type I и Type III
Частота встречаемости сайтов рестрикции
RsaI (four-base cutter)
EcoRI (six-base cutter)
NotI (eight-base cutter)
Рестрикционные карты
Подходы к изучению специфичных последовательностей ДНК
Синтез ДНК in vitro
Полимеразная цепная реакция (ПЦР)Polymerase chain reaction (PCR)
1983 г Кэри Муллис
ndash метод позволяющий избирательно синтезировать большие количества
определённых фрагментов ДНК
bull laquoПолимеразнаяraquo - используется фермент ДНК-полимеразаbull laquoЦепнаяraquo - состоит из повторяющихся циклов количество ДНК с каждым циклом увеличивается в геометрической прогрессии
ПЦР
ПЦР
Компоненты ПЦР
ПраймерыОпределяют амплифицируемый участокСлужат laquoзатравкойraquo для синтеза ДНК
dNTP laquoСтроительный материалraquo
KClМоновалентные катион необходим для оптимальной гибридизации праймеров
Tris Поддержание оптимального для ферментативной реакции рН
MgCl2 Бивалентный катион необходим для работы фермента
Полимераза Осуществляет синтез ДНК
Матрица Анализируемый образец ДНК
Буф
ер
Этапы ПЦРПредварительная денатурация
~950C 1-10 мин
25-50 циклов
Денатурация ~950C 10-60 сек
Отжиг 50-700C 10-60 сек
Элонгация 68-720C 10-180 сек
Финальная элонгация
68-720C 7-10 мин
График диссоциации праймера
Cds ndash концентрация гибридизованного праймера
Полимераза
5`-3` полимеразная активность
Полимераза Процессивность Активности
Taq
(Thermus aquaticus)3-5 тпн
5rarr3 полимеразная
5rarr3 экзонуклеазная
Pfu
(Pyrococcus furiosus)1-2 тпн
5rarr3 полимеразная
5rarr3 экзонуклеазная
3rarr5 экзонуклеазная
Tth
(Thermus thermophilus)
3-5 тпн
(800 пн для
ревертазной активности)
5rarr3 полимеразная
5rarr3 экзонуклеазная
5rarr3 ревертазная
Pwo
(Pyrococcus woesei)3 тпн
5rarr3 полимеразная
3rarr5 экзонуклеазная
Полимераза
5`-3` экзонуклеазная активность
3`-5` экзонуклеазная активность
Стадии ПЦР
Амплификаторы
Термостатированиеbull твёрдый термоблок (элемент Пельтье)bull жидкостьbull поток воздуха
Применение ПЦР
Получение материала
bull амплификация ДНК
Получение информации
bull поиск ДНК
Клонирование ДНК и кДНК
Применение ПЦР для диагностики генетических нарушений
RFLP - Restriction Fragment Length Polymorphism
ПДРФ ndash Полиморфизм Длин Рестрикционных Фрагментов
Серповидноклеточная анемия
Применение ПЦР для диагностики генетических нарушений
Болезнь Хантингтона
ДНК-дактилоскопия
Применение ПЦР для диагностики генетических нарушений
Анализ делеций Анализ транслокаций
Разновидности ПЦР
bull Hot-start PCR ndash для повышения специфичности реакции
bull Touch-down PCR ndash для повышения специфичности реакции
bull Allele-specific PCR ndash для выявления однонуклеотидных различий
bull RT-PCR (reverse transcriptase PCR) ndash для амплификации РНК
bull Asymmetric PCR ndash для получения одноцепочечного продукта ДНК
bull Real-time PCR qPCR
bull Inverse PCR ndash если известна небольшая последовательность внутри амплифицируемого участка
bull Nested PCR ndash две последовательные реакции (для повышения чувствительности и специфичности)
bull PCR mutagenesis ndash две направленного внесения замен в последовательность
Allele-specific PCR- анализ однонуклеотидных полиморфизмов
Inverse PCR- исследование фланкирующих областей
Asymmetric PCR- наработка одноцепочечного продукта
Nested PCR- уменьшение числа побочных продуктов реакции
PCR mutagenesis
Сайт-специфический мутагенез
ПЦР для клонирования в вектор
ПЦР в реальном времени(Real-time PCR)
bull одновременная амплификация и измерение количества продукта
bull наличие флюоресцентного красителя в смеси
bull наличие оптического блока в амплификаторе
линейный lg
33
Системы детекции
1 Неспецифичные
ndash интеркалирующие красители (SYBR Green и др)
2 Специфичные
ndash линейные разрушаемые пробы (TaqMan)
ndash laquoмолекулярные маячкиraquo (beacons)
ndash примыкающие пробы
SYBR Green
Метод TaqMan(линейные разрушаемые зонды)
флуоресцентные зонды и гашение флуоресценции
флуоресцентный
краситель
гаситель
флуоресценции
зонд
специфический фрагмент ДНК
FRET ndash Fluorescence Resonance Energy Transfer
FRET ndash Fluorescence Resonance Energy TransferРезонансный перенос энергии флуоресценции
Принцип метода TaqMan
bull 5`-3` экзонуклеазная активность Taq-полимеразы
Принцип метода TaqMan
bull 5`-3` экзонуклеазная активность Taq-полимеразы
Принцип метода TaqMan
bull 5`-3` экзонуклеазная активность Taq-полимеразы
Принцип метода TaqMan
bull 5`-3` экзонуклеазная активность Taq-полимеразы
Принцип метода TaqMan
bull 5`-3` экзонуклеазная активность Taq-полимеразы
Принцип метода TaqMan
bull 5`-3` экзонуклеазная активность Taq-полимеразы
bull нет участка для посадки праймера ndash нет сигнала
Принцип метода TaqMan
bull нет участка для посадки зонда ndash нет сигнала
Принцип метода TaqMan
Линейные разрушаемые пробы(TaqMan = Taq-polymerase + Pac-Man)
laquoМолекулярные маячкиraquo(molecular beacons)
Примыкающие пробы
Флюорофоры и гасители флюоресценции
Представление результатов ПЦР в реальном времени
линейный lg
Денатурация
Плавление после ПЦР
обратная производная
Плавление после ПЦР
Виды ПЦР-анализа
Качественный анализ
Сравнительный анализ
(полуколичественный)
Количественный анализ
есть нет
больше меньше Х раз
лечение
10 000 копий 1000 копий
Количественная ПЦР (qPCR)
bull Подсчёт числа копий генов
bull Анализ представленности транскриптов
bull Оценка инфекционной нагрузки
Количественная ПЦР
серия 10-кратных разведений
threshold ndash пороговая флюоресценцияCt ndash пороговый цикл
Преимущества Real-time PCR
bull возможность как качественной так и количественной оценки исходной матрицы
bull отсутствие манипуляций после проведения ПЦР (электрофорез)
bull большая чувствительность (от единичных копий) и специфичность
bull большой динамический диапазон концентраций (порядка 10^7)
bull возможность постановки Multiplex анализа
1 Научные исследования
ndash амплификация ДНК для гибридизации (блоттинг микрочипы)
ndash амплификация ДНК для секвенирования
ndash клонирование геномной ДНК кДНК
ndash филогенетическое сравнение геномов
ndash генетическое картирование
ndash анализ уровня транскрипции
Применение ПЦР
2 Медицина
ndash генетическое тестирование
ndash типирование тканей (для трансплантации)
ndash тестирование мутаций в онкогенах
ndash диагностика инфекций
3 Судебная медицина
ndash ДНК-дактилоскопия
ndash установление родства
4 Анализ пищевых продуктов детекция ГМО
Применение ПЦР
Применение ПЦР
Залог успеха ПЦР
bull высокая чувствительность
bull высокая специфичность
bull высокая устойчивость
bull низкая стоимость быстрота
Получение информации
bull анализ уровня транскрипции
bull ДНК-диагностика
bull генотипирование
Получение материала
bull клонирование ДНК
bull мутагенез
bull секвенирование
N
N
О
О
Н
Н
Н
N
N
О
О
Н
Н
С
НН
Н
ОН
ОCH2
ОP
О
Оndash
HО
3`
4`
5`
2`
1`
Н
Х
Использование UDG ndash метод борьбы с контаминацией продуктами ПЦР
Тимин
(типичен
для ДНК)
Урацил
(типичен
для РНК)
Х = урацил
дезоксиуридинтрифосфат (dUTP) ndash может быть встроен в
растущую цепь как и dTTP не нарушает комплементарности
N
N
О
О
Н
Н
Н
О-
ОCH2
ОP
О
Оndash
О-
3`
4`
5`
2`
1`
Н
UDG 45-550С
Использование UDG ndash метод борьбы с контаминацией продуктами ПЦР
1) Урацил ДНК-гликозилаза присутствующая в ПЦР-смеси отщепляет урацил от цепи ДНК оставляя тн АР-сайт
О-
ОCH2
ОP
О
Оndash
О-
3`
4`
5`
2`
1`
Н
UDG 45-550С
AP-сайт
1) Урацил ДНК-гликозилаза присутствующая в ПЦР-смеси отщепляет урацил от цепи ДНК оставляя тн АР-сайт
Использование UDG ndash метод борьбы с контаминацией продуктами ПЦР
О-
ОCH2
ОP
О
Оndash
О-
3`
4`
5`
2`
1`
Н
Использование UDG ndash метод борьбы с контаминацией продуктами ПЦР
2) При нагревании до 950С UDG инактивируется а AP-сайты расщепляются в результате урацил-содержащая ДНК попавшая в пробирку до начала ПЦР деградирует3) Проводится обычная ПЦР реакционная смесь очищена от продуктов предыдущей амплификации
Digital PCR (dPCR)
65
R
PM 1ln М ndash среднее количество целевой ДНК на сегмент реакции (на основе
распределения Пуассона)Р ndash доля сегментов содержащих ПЦР-продуктR ndash общее кол-во проанализированных сегментов
Лимитирующие факторы dPCR
bull Количество сегментов реакции
bull Концентрация целевой ДНК в анализируемом образце
bull Реакционный объѐм
Коммерчески доступные системы реализующие dPCR
66
Fluidigm - технология микрофлюидных чипов
Bio-Rad (QuantaLife) -dPCR в суспензии
(Digital Droplet PCR)
Life Technologies
dPCR в платах OpenArrayreg
Подготовка образцов
(смешивание ДНК и ПЦР-реагентов)
Создание капель (Droplet Generator)
АмплификацияРегистрация и
анализ результатов
Digital droplet PCR (ddPCR)
bull QX100 Droplet Digital PCR System
Сравнение с Real-Time PCR
68
Digital PCR a powerful new tool for noninvasive prenatal diagnosis Bernhard G Zimmermann Simon Grill Wolfgang Holzgreve Prenat Diagn 2008 28 1087ndash1093
Применение ПЦР в NGS
69
Спасибо за внимание
Рестрикция ДНК
- Разрезание молекулы ДНК в определенной последовательности
Рестриктазы1 Узнают определенные
последовательности в ДНК
2 Разрезают молекулу ДНК в определенных местах
Рестрикция ДНК
Рестриктазы(обнаружено несколько тысяч)
Образуются laquoлипкиеraquo или laquoтупыеraquo концы
Type IIR
Рестриктазы Type II
Еще есть Type I и Type III
Частота встречаемости сайтов рестрикции
RsaI (four-base cutter)
EcoRI (six-base cutter)
NotI (eight-base cutter)
Рестрикционные карты
Подходы к изучению специфичных последовательностей ДНК
Синтез ДНК in vitro
Полимеразная цепная реакция (ПЦР)Polymerase chain reaction (PCR)
1983 г Кэри Муллис
ndash метод позволяющий избирательно синтезировать большие количества
определённых фрагментов ДНК
bull laquoПолимеразнаяraquo - используется фермент ДНК-полимеразаbull laquoЦепнаяraquo - состоит из повторяющихся циклов количество ДНК с каждым циклом увеличивается в геометрической прогрессии
ПЦР
ПЦР
Компоненты ПЦР
ПраймерыОпределяют амплифицируемый участокСлужат laquoзатравкойraquo для синтеза ДНК
dNTP laquoСтроительный материалraquo
KClМоновалентные катион необходим для оптимальной гибридизации праймеров
Tris Поддержание оптимального для ферментативной реакции рН
MgCl2 Бивалентный катион необходим для работы фермента
Полимераза Осуществляет синтез ДНК
Матрица Анализируемый образец ДНК
Буф
ер
Этапы ПЦРПредварительная денатурация
~950C 1-10 мин
25-50 циклов
Денатурация ~950C 10-60 сек
Отжиг 50-700C 10-60 сек
Элонгация 68-720C 10-180 сек
Финальная элонгация
68-720C 7-10 мин
График диссоциации праймера
Cds ndash концентрация гибридизованного праймера
Полимераза
5`-3` полимеразная активность
Полимераза Процессивность Активности
Taq
(Thermus aquaticus)3-5 тпн
5rarr3 полимеразная
5rarr3 экзонуклеазная
Pfu
(Pyrococcus furiosus)1-2 тпн
5rarr3 полимеразная
5rarr3 экзонуклеазная
3rarr5 экзонуклеазная
Tth
(Thermus thermophilus)
3-5 тпн
(800 пн для
ревертазной активности)
5rarr3 полимеразная
5rarr3 экзонуклеазная
5rarr3 ревертазная
Pwo
(Pyrococcus woesei)3 тпн
5rarr3 полимеразная
3rarr5 экзонуклеазная
Полимераза
5`-3` экзонуклеазная активность
3`-5` экзонуклеазная активность
Стадии ПЦР
Амплификаторы
Термостатированиеbull твёрдый термоблок (элемент Пельтье)bull жидкостьbull поток воздуха
Применение ПЦР
Получение материала
bull амплификация ДНК
Получение информации
bull поиск ДНК
Клонирование ДНК и кДНК
Применение ПЦР для диагностики генетических нарушений
RFLP - Restriction Fragment Length Polymorphism
ПДРФ ndash Полиморфизм Длин Рестрикционных Фрагментов
Серповидноклеточная анемия
Применение ПЦР для диагностики генетических нарушений
Болезнь Хантингтона
ДНК-дактилоскопия
Применение ПЦР для диагностики генетических нарушений
Анализ делеций Анализ транслокаций
Разновидности ПЦР
bull Hot-start PCR ndash для повышения специфичности реакции
bull Touch-down PCR ndash для повышения специфичности реакции
bull Allele-specific PCR ndash для выявления однонуклеотидных различий
bull RT-PCR (reverse transcriptase PCR) ndash для амплификации РНК
bull Asymmetric PCR ndash для получения одноцепочечного продукта ДНК
bull Real-time PCR qPCR
bull Inverse PCR ndash если известна небольшая последовательность внутри амплифицируемого участка
bull Nested PCR ndash две последовательные реакции (для повышения чувствительности и специфичности)
bull PCR mutagenesis ndash две направленного внесения замен в последовательность
Allele-specific PCR- анализ однонуклеотидных полиморфизмов
Inverse PCR- исследование фланкирующих областей
Asymmetric PCR- наработка одноцепочечного продукта
Nested PCR- уменьшение числа побочных продуктов реакции
PCR mutagenesis
Сайт-специфический мутагенез
ПЦР для клонирования в вектор
ПЦР в реальном времени(Real-time PCR)
bull одновременная амплификация и измерение количества продукта
bull наличие флюоресцентного красителя в смеси
bull наличие оптического блока в амплификаторе
линейный lg
33
Системы детекции
1 Неспецифичные
ndash интеркалирующие красители (SYBR Green и др)
2 Специфичные
ndash линейные разрушаемые пробы (TaqMan)
ndash laquoмолекулярные маячкиraquo (beacons)
ndash примыкающие пробы
SYBR Green
Метод TaqMan(линейные разрушаемые зонды)
флуоресцентные зонды и гашение флуоресценции
флуоресцентный
краситель
гаситель
флуоресценции
зонд
специфический фрагмент ДНК
FRET ndash Fluorescence Resonance Energy Transfer
FRET ndash Fluorescence Resonance Energy TransferРезонансный перенос энергии флуоресценции
Принцип метода TaqMan
bull 5`-3` экзонуклеазная активность Taq-полимеразы
Принцип метода TaqMan
bull 5`-3` экзонуклеазная активность Taq-полимеразы
Принцип метода TaqMan
bull 5`-3` экзонуклеазная активность Taq-полимеразы
Принцип метода TaqMan
bull 5`-3` экзонуклеазная активность Taq-полимеразы
Принцип метода TaqMan
bull 5`-3` экзонуклеазная активность Taq-полимеразы
Принцип метода TaqMan
bull 5`-3` экзонуклеазная активность Taq-полимеразы
bull нет участка для посадки праймера ndash нет сигнала
Принцип метода TaqMan
bull нет участка для посадки зонда ndash нет сигнала
Принцип метода TaqMan
Линейные разрушаемые пробы(TaqMan = Taq-polymerase + Pac-Man)
laquoМолекулярные маячкиraquo(molecular beacons)
Примыкающие пробы
Флюорофоры и гасители флюоресценции
Представление результатов ПЦР в реальном времени
линейный lg
Денатурация
Плавление после ПЦР
обратная производная
Плавление после ПЦР
Виды ПЦР-анализа
Качественный анализ
Сравнительный анализ
(полуколичественный)
Количественный анализ
есть нет
больше меньше Х раз
лечение
10 000 копий 1000 копий
Количественная ПЦР (qPCR)
bull Подсчёт числа копий генов
bull Анализ представленности транскриптов
bull Оценка инфекционной нагрузки
Количественная ПЦР
серия 10-кратных разведений
threshold ndash пороговая флюоресценцияCt ndash пороговый цикл
Преимущества Real-time PCR
bull возможность как качественной так и количественной оценки исходной матрицы
bull отсутствие манипуляций после проведения ПЦР (электрофорез)
bull большая чувствительность (от единичных копий) и специфичность
bull большой динамический диапазон концентраций (порядка 10^7)
bull возможность постановки Multiplex анализа
1 Научные исследования
ndash амплификация ДНК для гибридизации (блоттинг микрочипы)
ndash амплификация ДНК для секвенирования
ndash клонирование геномной ДНК кДНК
ndash филогенетическое сравнение геномов
ndash генетическое картирование
ndash анализ уровня транскрипции
Применение ПЦР
2 Медицина
ndash генетическое тестирование
ndash типирование тканей (для трансплантации)
ndash тестирование мутаций в онкогенах
ndash диагностика инфекций
3 Судебная медицина
ndash ДНК-дактилоскопия
ndash установление родства
4 Анализ пищевых продуктов детекция ГМО
Применение ПЦР
Применение ПЦР
Залог успеха ПЦР
bull высокая чувствительность
bull высокая специфичность
bull высокая устойчивость
bull низкая стоимость быстрота
Получение информации
bull анализ уровня транскрипции
bull ДНК-диагностика
bull генотипирование
Получение материала
bull клонирование ДНК
bull мутагенез
bull секвенирование
N
N
О
О
Н
Н
Н
N
N
О
О
Н
Н
С
НН
Н
ОН
ОCH2
ОP
О
Оndash
HО
3`
4`
5`
2`
1`
Н
Х
Использование UDG ndash метод борьбы с контаминацией продуктами ПЦР
Тимин
(типичен
для ДНК)
Урацил
(типичен
для РНК)
Х = урацил
дезоксиуридинтрифосфат (dUTP) ndash может быть встроен в
растущую цепь как и dTTP не нарушает комплементарности
N
N
О
О
Н
Н
Н
О-
ОCH2
ОP
О
Оndash
О-
3`
4`
5`
2`
1`
Н
UDG 45-550С
Использование UDG ndash метод борьбы с контаминацией продуктами ПЦР
1) Урацил ДНК-гликозилаза присутствующая в ПЦР-смеси отщепляет урацил от цепи ДНК оставляя тн АР-сайт
О-
ОCH2
ОP
О
Оndash
О-
3`
4`
5`
2`
1`
Н
UDG 45-550С
AP-сайт
1) Урацил ДНК-гликозилаза присутствующая в ПЦР-смеси отщепляет урацил от цепи ДНК оставляя тн АР-сайт
Использование UDG ndash метод борьбы с контаминацией продуктами ПЦР
О-
ОCH2
ОP
О
Оndash
О-
3`
4`
5`
2`
1`
Н
Использование UDG ndash метод борьбы с контаминацией продуктами ПЦР
2) При нагревании до 950С UDG инактивируется а AP-сайты расщепляются в результате урацил-содержащая ДНК попавшая в пробирку до начала ПЦР деградирует3) Проводится обычная ПЦР реакционная смесь очищена от продуктов предыдущей амплификации
Digital PCR (dPCR)
65
R
PM 1ln М ndash среднее количество целевой ДНК на сегмент реакции (на основе
распределения Пуассона)Р ndash доля сегментов содержащих ПЦР-продуктR ndash общее кол-во проанализированных сегментов
Лимитирующие факторы dPCR
bull Количество сегментов реакции
bull Концентрация целевой ДНК в анализируемом образце
bull Реакционный объѐм
Коммерчески доступные системы реализующие dPCR
66
Fluidigm - технология микрофлюидных чипов
Bio-Rad (QuantaLife) -dPCR в суспензии
(Digital Droplet PCR)
Life Technologies
dPCR в платах OpenArrayreg
Подготовка образцов
(смешивание ДНК и ПЦР-реагентов)
Создание капель (Droplet Generator)
АмплификацияРегистрация и
анализ результатов
Digital droplet PCR (ddPCR)
bull QX100 Droplet Digital PCR System
Сравнение с Real-Time PCR
68
Digital PCR a powerful new tool for noninvasive prenatal diagnosis Bernhard G Zimmermann Simon Grill Wolfgang Holzgreve Prenat Diagn 2008 28 1087ndash1093
Применение ПЦР в NGS
69
Спасибо за внимание
Рестрикция ДНК
Рестриктазы(обнаружено несколько тысяч)
Образуются laquoлипкиеraquo или laquoтупыеraquo концы
Type IIR
Рестриктазы Type II
Еще есть Type I и Type III
Частота встречаемости сайтов рестрикции
RsaI (four-base cutter)
EcoRI (six-base cutter)
NotI (eight-base cutter)
Рестрикционные карты
Подходы к изучению специфичных последовательностей ДНК
Синтез ДНК in vitro
Полимеразная цепная реакция (ПЦР)Polymerase chain reaction (PCR)
1983 г Кэри Муллис
ndash метод позволяющий избирательно синтезировать большие количества
определённых фрагментов ДНК
bull laquoПолимеразнаяraquo - используется фермент ДНК-полимеразаbull laquoЦепнаяraquo - состоит из повторяющихся циклов количество ДНК с каждым циклом увеличивается в геометрической прогрессии
ПЦР
ПЦР
Компоненты ПЦР
ПраймерыОпределяют амплифицируемый участокСлужат laquoзатравкойraquo для синтеза ДНК
dNTP laquoСтроительный материалraquo
KClМоновалентные катион необходим для оптимальной гибридизации праймеров
Tris Поддержание оптимального для ферментативной реакции рН
MgCl2 Бивалентный катион необходим для работы фермента
Полимераза Осуществляет синтез ДНК
Матрица Анализируемый образец ДНК
Буф
ер
Этапы ПЦРПредварительная денатурация
~950C 1-10 мин
25-50 циклов
Денатурация ~950C 10-60 сек
Отжиг 50-700C 10-60 сек
Элонгация 68-720C 10-180 сек
Финальная элонгация
68-720C 7-10 мин
График диссоциации праймера
Cds ndash концентрация гибридизованного праймера
Полимераза
5`-3` полимеразная активность
Полимераза Процессивность Активности
Taq
(Thermus aquaticus)3-5 тпн
5rarr3 полимеразная
5rarr3 экзонуклеазная
Pfu
(Pyrococcus furiosus)1-2 тпн
5rarr3 полимеразная
5rarr3 экзонуклеазная
3rarr5 экзонуклеазная
Tth
(Thermus thermophilus)
3-5 тпн
(800 пн для
ревертазной активности)
5rarr3 полимеразная
5rarr3 экзонуклеазная
5rarr3 ревертазная
Pwo
(Pyrococcus woesei)3 тпн
5rarr3 полимеразная
3rarr5 экзонуклеазная
Полимераза
5`-3` экзонуклеазная активность
3`-5` экзонуклеазная активность
Стадии ПЦР
Амплификаторы
Термостатированиеbull твёрдый термоблок (элемент Пельтье)bull жидкостьbull поток воздуха
Применение ПЦР
Получение материала
bull амплификация ДНК
Получение информации
bull поиск ДНК
Клонирование ДНК и кДНК
Применение ПЦР для диагностики генетических нарушений
RFLP - Restriction Fragment Length Polymorphism
ПДРФ ndash Полиморфизм Длин Рестрикционных Фрагментов
Серповидноклеточная анемия
Применение ПЦР для диагностики генетических нарушений
Болезнь Хантингтона
ДНК-дактилоскопия
Применение ПЦР для диагностики генетических нарушений
Анализ делеций Анализ транслокаций
Разновидности ПЦР
bull Hot-start PCR ndash для повышения специфичности реакции
bull Touch-down PCR ndash для повышения специфичности реакции
bull Allele-specific PCR ndash для выявления однонуклеотидных различий
bull RT-PCR (reverse transcriptase PCR) ndash для амплификации РНК
bull Asymmetric PCR ndash для получения одноцепочечного продукта ДНК
bull Real-time PCR qPCR
bull Inverse PCR ndash если известна небольшая последовательность внутри амплифицируемого участка
bull Nested PCR ndash две последовательные реакции (для повышения чувствительности и специфичности)
bull PCR mutagenesis ndash две направленного внесения замен в последовательность
Allele-specific PCR- анализ однонуклеотидных полиморфизмов
Inverse PCR- исследование фланкирующих областей
Asymmetric PCR- наработка одноцепочечного продукта
Nested PCR- уменьшение числа побочных продуктов реакции
PCR mutagenesis
Сайт-специфический мутагенез
ПЦР для клонирования в вектор
ПЦР в реальном времени(Real-time PCR)
bull одновременная амплификация и измерение количества продукта
bull наличие флюоресцентного красителя в смеси
bull наличие оптического блока в амплификаторе
линейный lg
33
Системы детекции
1 Неспецифичные
ndash интеркалирующие красители (SYBR Green и др)
2 Специфичные
ndash линейные разрушаемые пробы (TaqMan)
ndash laquoмолекулярные маячкиraquo (beacons)
ndash примыкающие пробы
SYBR Green
Метод TaqMan(линейные разрушаемые зонды)
флуоресцентные зонды и гашение флуоресценции
флуоресцентный
краситель
гаситель
флуоресценции
зонд
специфический фрагмент ДНК
FRET ndash Fluorescence Resonance Energy Transfer
FRET ndash Fluorescence Resonance Energy TransferРезонансный перенос энергии флуоресценции
Принцип метода TaqMan
bull 5`-3` экзонуклеазная активность Taq-полимеразы
Принцип метода TaqMan
bull 5`-3` экзонуклеазная активность Taq-полимеразы
Принцип метода TaqMan
bull 5`-3` экзонуклеазная активность Taq-полимеразы
Принцип метода TaqMan
bull 5`-3` экзонуклеазная активность Taq-полимеразы
Принцип метода TaqMan
bull 5`-3` экзонуклеазная активность Taq-полимеразы
Принцип метода TaqMan
bull 5`-3` экзонуклеазная активность Taq-полимеразы
bull нет участка для посадки праймера ndash нет сигнала
Принцип метода TaqMan
bull нет участка для посадки зонда ndash нет сигнала
Принцип метода TaqMan
Линейные разрушаемые пробы(TaqMan = Taq-polymerase + Pac-Man)
laquoМолекулярные маячкиraquo(molecular beacons)
Примыкающие пробы
Флюорофоры и гасители флюоресценции
Представление результатов ПЦР в реальном времени
линейный lg
Денатурация
Плавление после ПЦР
обратная производная
Плавление после ПЦР
Виды ПЦР-анализа
Качественный анализ
Сравнительный анализ
(полуколичественный)
Количественный анализ
есть нет
больше меньше Х раз
лечение
10 000 копий 1000 копий
Количественная ПЦР (qPCR)
bull Подсчёт числа копий генов
bull Анализ представленности транскриптов
bull Оценка инфекционной нагрузки
Количественная ПЦР
серия 10-кратных разведений
threshold ndash пороговая флюоресценцияCt ndash пороговый цикл
Преимущества Real-time PCR
bull возможность как качественной так и количественной оценки исходной матрицы
bull отсутствие манипуляций после проведения ПЦР (электрофорез)
bull большая чувствительность (от единичных копий) и специфичность
bull большой динамический диапазон концентраций (порядка 10^7)
bull возможность постановки Multiplex анализа
1 Научные исследования
ndash амплификация ДНК для гибридизации (блоттинг микрочипы)
ndash амплификация ДНК для секвенирования
ndash клонирование геномной ДНК кДНК
ndash филогенетическое сравнение геномов
ndash генетическое картирование
ndash анализ уровня транскрипции
Применение ПЦР
2 Медицина
ndash генетическое тестирование
ndash типирование тканей (для трансплантации)
ndash тестирование мутаций в онкогенах
ndash диагностика инфекций
3 Судебная медицина
ndash ДНК-дактилоскопия
ndash установление родства
4 Анализ пищевых продуктов детекция ГМО
Применение ПЦР
Применение ПЦР
Залог успеха ПЦР
bull высокая чувствительность
bull высокая специфичность
bull высокая устойчивость
bull низкая стоимость быстрота
Получение информации
bull анализ уровня транскрипции
bull ДНК-диагностика
bull генотипирование
Получение материала
bull клонирование ДНК
bull мутагенез
bull секвенирование
N
N
О
О
Н
Н
Н
N
N
О
О
Н
Н
С
НН
Н
ОН
ОCH2
ОP
О
Оndash
HО
3`
4`
5`
2`
1`
Н
Х
Использование UDG ndash метод борьбы с контаминацией продуктами ПЦР
Тимин
(типичен
для ДНК)
Урацил
(типичен
для РНК)
Х = урацил
дезоксиуридинтрифосфат (dUTP) ndash может быть встроен в
растущую цепь как и dTTP не нарушает комплементарности
N
N
О
О
Н
Н
Н
О-
ОCH2
ОP
О
Оndash
О-
3`
4`
5`
2`
1`
Н
UDG 45-550С
Использование UDG ndash метод борьбы с контаминацией продуктами ПЦР
1) Урацил ДНК-гликозилаза присутствующая в ПЦР-смеси отщепляет урацил от цепи ДНК оставляя тн АР-сайт
О-
ОCH2
ОP
О
Оndash
О-
3`
4`
5`
2`
1`
Н
UDG 45-550С
AP-сайт
1) Урацил ДНК-гликозилаза присутствующая в ПЦР-смеси отщепляет урацил от цепи ДНК оставляя тн АР-сайт
Использование UDG ndash метод борьбы с контаминацией продуктами ПЦР
О-
ОCH2
ОP
О
Оndash
О-
3`
4`
5`
2`
1`
Н
Использование UDG ndash метод борьбы с контаминацией продуктами ПЦР
2) При нагревании до 950С UDG инактивируется а AP-сайты расщепляются в результате урацил-содержащая ДНК попавшая в пробирку до начала ПЦР деградирует3) Проводится обычная ПЦР реакционная смесь очищена от продуктов предыдущей амплификации
Digital PCR (dPCR)
65
R
PM 1ln М ndash среднее количество целевой ДНК на сегмент реакции (на основе
распределения Пуассона)Р ndash доля сегментов содержащих ПЦР-продуктR ndash общее кол-во проанализированных сегментов
Лимитирующие факторы dPCR
bull Количество сегментов реакции
bull Концентрация целевой ДНК в анализируемом образце
bull Реакционный объѐм
Коммерчески доступные системы реализующие dPCR
66
Fluidigm - технология микрофлюидных чипов
Bio-Rad (QuantaLife) -dPCR в суспензии
(Digital Droplet PCR)
Life Technologies
dPCR в платах OpenArrayreg
Подготовка образцов
(смешивание ДНК и ПЦР-реагентов)
Создание капель (Droplet Generator)
АмплификацияРегистрация и
анализ результатов
Digital droplet PCR (ddPCR)
bull QX100 Droplet Digital PCR System
Сравнение с Real-Time PCR
68
Digital PCR a powerful new tool for noninvasive prenatal diagnosis Bernhard G Zimmermann Simon Grill Wolfgang Holzgreve Prenat Diagn 2008 28 1087ndash1093
Применение ПЦР в NGS
69
Спасибо за внимание
Рестриктазы(обнаружено несколько тысяч)
Образуются laquoлипкиеraquo или laquoтупыеraquo концы
Type IIR
Рестриктазы Type II
Еще есть Type I и Type III
Частота встречаемости сайтов рестрикции
RsaI (four-base cutter)
EcoRI (six-base cutter)
NotI (eight-base cutter)
Рестрикционные карты
Подходы к изучению специфичных последовательностей ДНК
Синтез ДНК in vitro
Полимеразная цепная реакция (ПЦР)Polymerase chain reaction (PCR)
1983 г Кэри Муллис
ndash метод позволяющий избирательно синтезировать большие количества
определённых фрагментов ДНК
bull laquoПолимеразнаяraquo - используется фермент ДНК-полимеразаbull laquoЦепнаяraquo - состоит из повторяющихся циклов количество ДНК с каждым циклом увеличивается в геометрической прогрессии
ПЦР
ПЦР
Компоненты ПЦР
ПраймерыОпределяют амплифицируемый участокСлужат laquoзатравкойraquo для синтеза ДНК
dNTP laquoСтроительный материалraquo
KClМоновалентные катион необходим для оптимальной гибридизации праймеров
Tris Поддержание оптимального для ферментативной реакции рН
MgCl2 Бивалентный катион необходим для работы фермента
Полимераза Осуществляет синтез ДНК
Матрица Анализируемый образец ДНК
Буф
ер
Этапы ПЦРПредварительная денатурация
~950C 1-10 мин
25-50 циклов
Денатурация ~950C 10-60 сек
Отжиг 50-700C 10-60 сек
Элонгация 68-720C 10-180 сек
Финальная элонгация
68-720C 7-10 мин
График диссоциации праймера
Cds ndash концентрация гибридизованного праймера
Полимераза
5`-3` полимеразная активность
Полимераза Процессивность Активности
Taq
(Thermus aquaticus)3-5 тпн
5rarr3 полимеразная
5rarr3 экзонуклеазная
Pfu
(Pyrococcus furiosus)1-2 тпн
5rarr3 полимеразная
5rarr3 экзонуклеазная
3rarr5 экзонуклеазная
Tth
(Thermus thermophilus)
3-5 тпн
(800 пн для
ревертазной активности)
5rarr3 полимеразная
5rarr3 экзонуклеазная
5rarr3 ревертазная
Pwo
(Pyrococcus woesei)3 тпн
5rarr3 полимеразная
3rarr5 экзонуклеазная
Полимераза
5`-3` экзонуклеазная активность
3`-5` экзонуклеазная активность
Стадии ПЦР
Амплификаторы
Термостатированиеbull твёрдый термоблок (элемент Пельтье)bull жидкостьbull поток воздуха
Применение ПЦР
Получение материала
bull амплификация ДНК
Получение информации
bull поиск ДНК
Клонирование ДНК и кДНК
Применение ПЦР для диагностики генетических нарушений
RFLP - Restriction Fragment Length Polymorphism
ПДРФ ndash Полиморфизм Длин Рестрикционных Фрагментов
Серповидноклеточная анемия
Применение ПЦР для диагностики генетических нарушений
Болезнь Хантингтона
ДНК-дактилоскопия
Применение ПЦР для диагностики генетических нарушений
Анализ делеций Анализ транслокаций
Разновидности ПЦР
bull Hot-start PCR ndash для повышения специфичности реакции
bull Touch-down PCR ndash для повышения специфичности реакции
bull Allele-specific PCR ndash для выявления однонуклеотидных различий
bull RT-PCR (reverse transcriptase PCR) ndash для амплификации РНК
bull Asymmetric PCR ndash для получения одноцепочечного продукта ДНК
bull Real-time PCR qPCR
bull Inverse PCR ndash если известна небольшая последовательность внутри амплифицируемого участка
bull Nested PCR ndash две последовательные реакции (для повышения чувствительности и специфичности)
bull PCR mutagenesis ndash две направленного внесения замен в последовательность
Allele-specific PCR- анализ однонуклеотидных полиморфизмов
Inverse PCR- исследование фланкирующих областей
Asymmetric PCR- наработка одноцепочечного продукта
Nested PCR- уменьшение числа побочных продуктов реакции
PCR mutagenesis
Сайт-специфический мутагенез
ПЦР для клонирования в вектор
ПЦР в реальном времени(Real-time PCR)
bull одновременная амплификация и измерение количества продукта
bull наличие флюоресцентного красителя в смеси
bull наличие оптического блока в амплификаторе
линейный lg
33
Системы детекции
1 Неспецифичные
ndash интеркалирующие красители (SYBR Green и др)
2 Специфичные
ndash линейные разрушаемые пробы (TaqMan)
ndash laquoмолекулярные маячкиraquo (beacons)
ndash примыкающие пробы
SYBR Green
Метод TaqMan(линейные разрушаемые зонды)
флуоресцентные зонды и гашение флуоресценции
флуоресцентный
краситель
гаситель
флуоресценции
зонд
специфический фрагмент ДНК
FRET ndash Fluorescence Resonance Energy Transfer
FRET ndash Fluorescence Resonance Energy TransferРезонансный перенос энергии флуоресценции
Принцип метода TaqMan
bull 5`-3` экзонуклеазная активность Taq-полимеразы
Принцип метода TaqMan
bull 5`-3` экзонуклеазная активность Taq-полимеразы
Принцип метода TaqMan
bull 5`-3` экзонуклеазная активность Taq-полимеразы
Принцип метода TaqMan
bull 5`-3` экзонуклеазная активность Taq-полимеразы
Принцип метода TaqMan
bull 5`-3` экзонуклеазная активность Taq-полимеразы
Принцип метода TaqMan
bull 5`-3` экзонуклеазная активность Taq-полимеразы
bull нет участка для посадки праймера ndash нет сигнала
Принцип метода TaqMan
bull нет участка для посадки зонда ndash нет сигнала
Принцип метода TaqMan
Линейные разрушаемые пробы(TaqMan = Taq-polymerase + Pac-Man)
laquoМолекулярные маячкиraquo(molecular beacons)
Примыкающие пробы
Флюорофоры и гасители флюоресценции
Представление результатов ПЦР в реальном времени
линейный lg
Денатурация
Плавление после ПЦР
обратная производная
Плавление после ПЦР
Виды ПЦР-анализа
Качественный анализ
Сравнительный анализ
(полуколичественный)
Количественный анализ
есть нет
больше меньше Х раз
лечение
10 000 копий 1000 копий
Количественная ПЦР (qPCR)
bull Подсчёт числа копий генов
bull Анализ представленности транскриптов
bull Оценка инфекционной нагрузки
Количественная ПЦР
серия 10-кратных разведений
threshold ndash пороговая флюоресценцияCt ndash пороговый цикл
Преимущества Real-time PCR
bull возможность как качественной так и количественной оценки исходной матрицы
bull отсутствие манипуляций после проведения ПЦР (электрофорез)
bull большая чувствительность (от единичных копий) и специфичность
bull большой динамический диапазон концентраций (порядка 10^7)
bull возможность постановки Multiplex анализа
1 Научные исследования
ndash амплификация ДНК для гибридизации (блоттинг микрочипы)
ndash амплификация ДНК для секвенирования
ndash клонирование геномной ДНК кДНК
ndash филогенетическое сравнение геномов
ndash генетическое картирование
ndash анализ уровня транскрипции
Применение ПЦР
2 Медицина
ndash генетическое тестирование
ndash типирование тканей (для трансплантации)
ndash тестирование мутаций в онкогенах
ndash диагностика инфекций
3 Судебная медицина
ndash ДНК-дактилоскопия
ndash установление родства
4 Анализ пищевых продуктов детекция ГМО
Применение ПЦР
Применение ПЦР
Залог успеха ПЦР
bull высокая чувствительность
bull высокая специфичность
bull высокая устойчивость
bull низкая стоимость быстрота
Получение информации
bull анализ уровня транскрипции
bull ДНК-диагностика
bull генотипирование
Получение материала
bull клонирование ДНК
bull мутагенез
bull секвенирование
N
N
О
О
Н
Н
Н
N
N
О
О
Н
Н
С
НН
Н
ОН
ОCH2
ОP
О
Оndash
HО
3`
4`
5`
2`
1`
Н
Х
Использование UDG ndash метод борьбы с контаминацией продуктами ПЦР
Тимин
(типичен
для ДНК)
Урацил
(типичен
для РНК)
Х = урацил
дезоксиуридинтрифосфат (dUTP) ndash может быть встроен в
растущую цепь как и dTTP не нарушает комплементарности
N
N
О
О
Н
Н
Н
О-
ОCH2
ОP
О
Оndash
О-
3`
4`
5`
2`
1`
Н
UDG 45-550С
Использование UDG ndash метод борьбы с контаминацией продуктами ПЦР
1) Урацил ДНК-гликозилаза присутствующая в ПЦР-смеси отщепляет урацил от цепи ДНК оставляя тн АР-сайт
О-
ОCH2
ОP
О
Оndash
О-
3`
4`
5`
2`
1`
Н
UDG 45-550С
AP-сайт
1) Урацил ДНК-гликозилаза присутствующая в ПЦР-смеси отщепляет урацил от цепи ДНК оставляя тн АР-сайт
Использование UDG ndash метод борьбы с контаминацией продуктами ПЦР
О-
ОCH2
ОP
О
Оndash
О-
3`
4`
5`
2`
1`
Н
Использование UDG ndash метод борьбы с контаминацией продуктами ПЦР
2) При нагревании до 950С UDG инактивируется а AP-сайты расщепляются в результате урацил-содержащая ДНК попавшая в пробирку до начала ПЦР деградирует3) Проводится обычная ПЦР реакционная смесь очищена от продуктов предыдущей амплификации
Digital PCR (dPCR)
65
R
PM 1ln М ndash среднее количество целевой ДНК на сегмент реакции (на основе
распределения Пуассона)Р ndash доля сегментов содержащих ПЦР-продуктR ndash общее кол-во проанализированных сегментов
Лимитирующие факторы dPCR
bull Количество сегментов реакции
bull Концентрация целевой ДНК в анализируемом образце
bull Реакционный объѐм
Коммерчески доступные системы реализующие dPCR
66
Fluidigm - технология микрофлюидных чипов
Bio-Rad (QuantaLife) -dPCR в суспензии
(Digital Droplet PCR)
Life Technologies
dPCR в платах OpenArrayreg
Подготовка образцов
(смешивание ДНК и ПЦР-реагентов)
Создание капель (Droplet Generator)
АмплификацияРегистрация и
анализ результатов
Digital droplet PCR (ddPCR)
bull QX100 Droplet Digital PCR System
Сравнение с Real-Time PCR
68
Digital PCR a powerful new tool for noninvasive prenatal diagnosis Bernhard G Zimmermann Simon Grill Wolfgang Holzgreve Prenat Diagn 2008 28 1087ndash1093
Применение ПЦР в NGS
69
Спасибо за внимание
Рестриктазы Type II
Еще есть Type I и Type III
Частота встречаемости сайтов рестрикции
RsaI (four-base cutter)
EcoRI (six-base cutter)
NotI (eight-base cutter)
Рестрикционные карты
Подходы к изучению специфичных последовательностей ДНК
Синтез ДНК in vitro
Полимеразная цепная реакция (ПЦР)Polymerase chain reaction (PCR)
1983 г Кэри Муллис
ndash метод позволяющий избирательно синтезировать большие количества
определённых фрагментов ДНК
bull laquoПолимеразнаяraquo - используется фермент ДНК-полимеразаbull laquoЦепнаяraquo - состоит из повторяющихся циклов количество ДНК с каждым циклом увеличивается в геометрической прогрессии
ПЦР
ПЦР
Компоненты ПЦР
ПраймерыОпределяют амплифицируемый участокСлужат laquoзатравкойraquo для синтеза ДНК
dNTP laquoСтроительный материалraquo
KClМоновалентные катион необходим для оптимальной гибридизации праймеров
Tris Поддержание оптимального для ферментативной реакции рН
MgCl2 Бивалентный катион необходим для работы фермента
Полимераза Осуществляет синтез ДНК
Матрица Анализируемый образец ДНК
Буф
ер
Этапы ПЦРПредварительная денатурация
~950C 1-10 мин
25-50 циклов
Денатурация ~950C 10-60 сек
Отжиг 50-700C 10-60 сек
Элонгация 68-720C 10-180 сек
Финальная элонгация
68-720C 7-10 мин
График диссоциации праймера
Cds ndash концентрация гибридизованного праймера
Полимераза
5`-3` полимеразная активность
Полимераза Процессивность Активности
Taq
(Thermus aquaticus)3-5 тпн
5rarr3 полимеразная
5rarr3 экзонуклеазная
Pfu
(Pyrococcus furiosus)1-2 тпн
5rarr3 полимеразная
5rarr3 экзонуклеазная
3rarr5 экзонуклеазная
Tth
(Thermus thermophilus)
3-5 тпн
(800 пн для
ревертазной активности)
5rarr3 полимеразная
5rarr3 экзонуклеазная
5rarr3 ревертазная
Pwo
(Pyrococcus woesei)3 тпн
5rarr3 полимеразная
3rarr5 экзонуклеазная
Полимераза
5`-3` экзонуклеазная активность
3`-5` экзонуклеазная активность
Стадии ПЦР
Амплификаторы
Термостатированиеbull твёрдый термоблок (элемент Пельтье)bull жидкостьbull поток воздуха
Применение ПЦР
Получение материала
bull амплификация ДНК
Получение информации
bull поиск ДНК
Клонирование ДНК и кДНК
Применение ПЦР для диагностики генетических нарушений
RFLP - Restriction Fragment Length Polymorphism
ПДРФ ndash Полиморфизм Длин Рестрикционных Фрагментов
Серповидноклеточная анемия
Применение ПЦР для диагностики генетических нарушений
Болезнь Хантингтона
ДНК-дактилоскопия
Применение ПЦР для диагностики генетических нарушений
Анализ делеций Анализ транслокаций
Разновидности ПЦР
bull Hot-start PCR ndash для повышения специфичности реакции
bull Touch-down PCR ndash для повышения специфичности реакции
bull Allele-specific PCR ndash для выявления однонуклеотидных различий
bull RT-PCR (reverse transcriptase PCR) ndash для амплификации РНК
bull Asymmetric PCR ndash для получения одноцепочечного продукта ДНК
bull Real-time PCR qPCR
bull Inverse PCR ndash если известна небольшая последовательность внутри амплифицируемого участка
bull Nested PCR ndash две последовательные реакции (для повышения чувствительности и специфичности)
bull PCR mutagenesis ndash две направленного внесения замен в последовательность
Allele-specific PCR- анализ однонуклеотидных полиморфизмов
Inverse PCR- исследование фланкирующих областей
Asymmetric PCR- наработка одноцепочечного продукта
Nested PCR- уменьшение числа побочных продуктов реакции
PCR mutagenesis
Сайт-специфический мутагенез
ПЦР для клонирования в вектор
ПЦР в реальном времени(Real-time PCR)
bull одновременная амплификация и измерение количества продукта
bull наличие флюоресцентного красителя в смеси
bull наличие оптического блока в амплификаторе
линейный lg
33
Системы детекции
1 Неспецифичные
ndash интеркалирующие красители (SYBR Green и др)
2 Специфичные
ndash линейные разрушаемые пробы (TaqMan)
ndash laquoмолекулярные маячкиraquo (beacons)
ndash примыкающие пробы
SYBR Green
Метод TaqMan(линейные разрушаемые зонды)
флуоресцентные зонды и гашение флуоресценции
флуоресцентный
краситель
гаситель
флуоресценции
зонд
специфический фрагмент ДНК
FRET ndash Fluorescence Resonance Energy Transfer
FRET ndash Fluorescence Resonance Energy TransferРезонансный перенос энергии флуоресценции
Принцип метода TaqMan
bull 5`-3` экзонуклеазная активность Taq-полимеразы
Принцип метода TaqMan
bull 5`-3` экзонуклеазная активность Taq-полимеразы
Принцип метода TaqMan
bull 5`-3` экзонуклеазная активность Taq-полимеразы
Принцип метода TaqMan
bull 5`-3` экзонуклеазная активность Taq-полимеразы
Принцип метода TaqMan
bull 5`-3` экзонуклеазная активность Taq-полимеразы
Принцип метода TaqMan
bull 5`-3` экзонуклеазная активность Taq-полимеразы
bull нет участка для посадки праймера ndash нет сигнала
Принцип метода TaqMan
bull нет участка для посадки зонда ndash нет сигнала
Принцип метода TaqMan
Линейные разрушаемые пробы(TaqMan = Taq-polymerase + Pac-Man)
laquoМолекулярные маячкиraquo(molecular beacons)
Примыкающие пробы
Флюорофоры и гасители флюоресценции
Представление результатов ПЦР в реальном времени
линейный lg
Денатурация
Плавление после ПЦР
обратная производная
Плавление после ПЦР
Виды ПЦР-анализа
Качественный анализ
Сравнительный анализ
(полуколичественный)
Количественный анализ
есть нет
больше меньше Х раз
лечение
10 000 копий 1000 копий
Количественная ПЦР (qPCR)
bull Подсчёт числа копий генов
bull Анализ представленности транскриптов
bull Оценка инфекционной нагрузки
Количественная ПЦР
серия 10-кратных разведений
threshold ndash пороговая флюоресценцияCt ndash пороговый цикл
Преимущества Real-time PCR
bull возможность как качественной так и количественной оценки исходной матрицы
bull отсутствие манипуляций после проведения ПЦР (электрофорез)
bull большая чувствительность (от единичных копий) и специфичность
bull большой динамический диапазон концентраций (порядка 10^7)
bull возможность постановки Multiplex анализа
1 Научные исследования
ndash амплификация ДНК для гибридизации (блоттинг микрочипы)
ndash амплификация ДНК для секвенирования
ndash клонирование геномной ДНК кДНК
ndash филогенетическое сравнение геномов
ndash генетическое картирование
ndash анализ уровня транскрипции
Применение ПЦР
2 Медицина
ndash генетическое тестирование
ndash типирование тканей (для трансплантации)
ndash тестирование мутаций в онкогенах
ndash диагностика инфекций
3 Судебная медицина
ndash ДНК-дактилоскопия
ndash установление родства
4 Анализ пищевых продуктов детекция ГМО
Применение ПЦР
Применение ПЦР
Залог успеха ПЦР
bull высокая чувствительность
bull высокая специфичность
bull высокая устойчивость
bull низкая стоимость быстрота
Получение информации
bull анализ уровня транскрипции
bull ДНК-диагностика
bull генотипирование
Получение материала
bull клонирование ДНК
bull мутагенез
bull секвенирование
N
N
О
О
Н
Н
Н
N
N
О
О
Н
Н
С
НН
Н
ОН
ОCH2
ОP
О
Оndash
HО
3`
4`
5`
2`
1`
Н
Х
Использование UDG ndash метод борьбы с контаминацией продуктами ПЦР
Тимин
(типичен
для ДНК)
Урацил
(типичен
для РНК)
Х = урацил
дезоксиуридинтрифосфат (dUTP) ndash может быть встроен в
растущую цепь как и dTTP не нарушает комплементарности
N
N
О
О
Н
Н
Н
О-
ОCH2
ОP
О
Оndash
О-
3`
4`
5`
2`
1`
Н
UDG 45-550С
Использование UDG ndash метод борьбы с контаминацией продуктами ПЦР
1) Урацил ДНК-гликозилаза присутствующая в ПЦР-смеси отщепляет урацил от цепи ДНК оставляя тн АР-сайт
О-
ОCH2
ОP
О
Оndash
О-
3`
4`
5`
2`
1`
Н
UDG 45-550С
AP-сайт
1) Урацил ДНК-гликозилаза присутствующая в ПЦР-смеси отщепляет урацил от цепи ДНК оставляя тн АР-сайт
Использование UDG ndash метод борьбы с контаминацией продуктами ПЦР
О-
ОCH2
ОP
О
Оndash
О-
3`
4`
5`
2`
1`
Н
Использование UDG ndash метод борьбы с контаминацией продуктами ПЦР
2) При нагревании до 950С UDG инактивируется а AP-сайты расщепляются в результате урацил-содержащая ДНК попавшая в пробирку до начала ПЦР деградирует3) Проводится обычная ПЦР реакционная смесь очищена от продуктов предыдущей амплификации
Digital PCR (dPCR)
65
R
PM 1ln М ndash среднее количество целевой ДНК на сегмент реакции (на основе
распределения Пуассона)Р ndash доля сегментов содержащих ПЦР-продуктR ndash общее кол-во проанализированных сегментов
Лимитирующие факторы dPCR
bull Количество сегментов реакции
bull Концентрация целевой ДНК в анализируемом образце
bull Реакционный объѐм
Коммерчески доступные системы реализующие dPCR
66
Fluidigm - технология микрофлюидных чипов
Bio-Rad (QuantaLife) -dPCR в суспензии
(Digital Droplet PCR)
Life Technologies
dPCR в платах OpenArrayreg
Подготовка образцов
(смешивание ДНК и ПЦР-реагентов)
Создание капель (Droplet Generator)
АмплификацияРегистрация и
анализ результатов
Digital droplet PCR (ddPCR)
bull QX100 Droplet Digital PCR System
Сравнение с Real-Time PCR
68
Digital PCR a powerful new tool for noninvasive prenatal diagnosis Bernhard G Zimmermann Simon Grill Wolfgang Holzgreve Prenat Diagn 2008 28 1087ndash1093
Применение ПЦР в NGS
69
Спасибо за внимание
Частота встречаемости сайтов рестрикции
RsaI (four-base cutter)
EcoRI (six-base cutter)
NotI (eight-base cutter)
Рестрикционные карты
Подходы к изучению специфичных последовательностей ДНК
Синтез ДНК in vitro
Полимеразная цепная реакция (ПЦР)Polymerase chain reaction (PCR)
1983 г Кэри Муллис
ndash метод позволяющий избирательно синтезировать большие количества
определённых фрагментов ДНК
bull laquoПолимеразнаяraquo - используется фермент ДНК-полимеразаbull laquoЦепнаяraquo - состоит из повторяющихся циклов количество ДНК с каждым циклом увеличивается в геометрической прогрессии
ПЦР
ПЦР
Компоненты ПЦР
ПраймерыОпределяют амплифицируемый участокСлужат laquoзатравкойraquo для синтеза ДНК
dNTP laquoСтроительный материалraquo
KClМоновалентные катион необходим для оптимальной гибридизации праймеров
Tris Поддержание оптимального для ферментативной реакции рН
MgCl2 Бивалентный катион необходим для работы фермента
Полимераза Осуществляет синтез ДНК
Матрица Анализируемый образец ДНК
Буф
ер
Этапы ПЦРПредварительная денатурация
~950C 1-10 мин
25-50 циклов
Денатурация ~950C 10-60 сек
Отжиг 50-700C 10-60 сек
Элонгация 68-720C 10-180 сек
Финальная элонгация
68-720C 7-10 мин
График диссоциации праймера
Cds ndash концентрация гибридизованного праймера
Полимераза
5`-3` полимеразная активность
Полимераза Процессивность Активности
Taq
(Thermus aquaticus)3-5 тпн
5rarr3 полимеразная
5rarr3 экзонуклеазная
Pfu
(Pyrococcus furiosus)1-2 тпн
5rarr3 полимеразная
5rarr3 экзонуклеазная
3rarr5 экзонуклеазная
Tth
(Thermus thermophilus)
3-5 тпн
(800 пн для
ревертазной активности)
5rarr3 полимеразная
5rarr3 экзонуклеазная
5rarr3 ревертазная
Pwo
(Pyrococcus woesei)3 тпн
5rarr3 полимеразная
3rarr5 экзонуклеазная
Полимераза
5`-3` экзонуклеазная активность
3`-5` экзонуклеазная активность
Стадии ПЦР
Амплификаторы
Термостатированиеbull твёрдый термоблок (элемент Пельтье)bull жидкостьbull поток воздуха
Применение ПЦР
Получение материала
bull амплификация ДНК
Получение информации
bull поиск ДНК
Клонирование ДНК и кДНК
Применение ПЦР для диагностики генетических нарушений
RFLP - Restriction Fragment Length Polymorphism
ПДРФ ndash Полиморфизм Длин Рестрикционных Фрагментов
Серповидноклеточная анемия
Применение ПЦР для диагностики генетических нарушений
Болезнь Хантингтона
ДНК-дактилоскопия
Применение ПЦР для диагностики генетических нарушений
Анализ делеций Анализ транслокаций
Разновидности ПЦР
bull Hot-start PCR ndash для повышения специфичности реакции
bull Touch-down PCR ndash для повышения специфичности реакции
bull Allele-specific PCR ndash для выявления однонуклеотидных различий
bull RT-PCR (reverse transcriptase PCR) ndash для амплификации РНК
bull Asymmetric PCR ndash для получения одноцепочечного продукта ДНК
bull Real-time PCR qPCR
bull Inverse PCR ndash если известна небольшая последовательность внутри амплифицируемого участка
bull Nested PCR ndash две последовательные реакции (для повышения чувствительности и специфичности)
bull PCR mutagenesis ndash две направленного внесения замен в последовательность
Allele-specific PCR- анализ однонуклеотидных полиморфизмов
Inverse PCR- исследование фланкирующих областей
Asymmetric PCR- наработка одноцепочечного продукта
Nested PCR- уменьшение числа побочных продуктов реакции
PCR mutagenesis
Сайт-специфический мутагенез
ПЦР для клонирования в вектор
ПЦР в реальном времени(Real-time PCR)
bull одновременная амплификация и измерение количества продукта
bull наличие флюоресцентного красителя в смеси
bull наличие оптического блока в амплификаторе
линейный lg
33
Системы детекции
1 Неспецифичные
ndash интеркалирующие красители (SYBR Green и др)
2 Специфичные
ndash линейные разрушаемые пробы (TaqMan)
ndash laquoмолекулярные маячкиraquo (beacons)
ndash примыкающие пробы
SYBR Green
Метод TaqMan(линейные разрушаемые зонды)
флуоресцентные зонды и гашение флуоресценции
флуоресцентный
краситель
гаситель
флуоресценции
зонд
специфический фрагмент ДНК
FRET ndash Fluorescence Resonance Energy Transfer
FRET ndash Fluorescence Resonance Energy TransferРезонансный перенос энергии флуоресценции
Принцип метода TaqMan
bull 5`-3` экзонуклеазная активность Taq-полимеразы
Принцип метода TaqMan
bull 5`-3` экзонуклеазная активность Taq-полимеразы
Принцип метода TaqMan
bull 5`-3` экзонуклеазная активность Taq-полимеразы
Принцип метода TaqMan
bull 5`-3` экзонуклеазная активность Taq-полимеразы
Принцип метода TaqMan
bull 5`-3` экзонуклеазная активность Taq-полимеразы
Принцип метода TaqMan
bull 5`-3` экзонуклеазная активность Taq-полимеразы
bull нет участка для посадки праймера ndash нет сигнала
Принцип метода TaqMan
bull нет участка для посадки зонда ndash нет сигнала
Принцип метода TaqMan
Линейные разрушаемые пробы(TaqMan = Taq-polymerase + Pac-Man)
laquoМолекулярные маячкиraquo(molecular beacons)
Примыкающие пробы
Флюорофоры и гасители флюоресценции
Представление результатов ПЦР в реальном времени
линейный lg
Денатурация
Плавление после ПЦР
обратная производная
Плавление после ПЦР
Виды ПЦР-анализа
Качественный анализ
Сравнительный анализ
(полуколичественный)
Количественный анализ
есть нет
больше меньше Х раз
лечение
10 000 копий 1000 копий
Количественная ПЦР (qPCR)
bull Подсчёт числа копий генов
bull Анализ представленности транскриптов
bull Оценка инфекционной нагрузки
Количественная ПЦР
серия 10-кратных разведений
threshold ndash пороговая флюоресценцияCt ndash пороговый цикл
Преимущества Real-time PCR
bull возможность как качественной так и количественной оценки исходной матрицы
bull отсутствие манипуляций после проведения ПЦР (электрофорез)
bull большая чувствительность (от единичных копий) и специфичность
bull большой динамический диапазон концентраций (порядка 10^7)
bull возможность постановки Multiplex анализа
1 Научные исследования
ndash амплификация ДНК для гибридизации (блоттинг микрочипы)
ndash амплификация ДНК для секвенирования
ndash клонирование геномной ДНК кДНК
ndash филогенетическое сравнение геномов
ndash генетическое картирование
ndash анализ уровня транскрипции
Применение ПЦР
2 Медицина
ndash генетическое тестирование
ndash типирование тканей (для трансплантации)
ndash тестирование мутаций в онкогенах
ndash диагностика инфекций
3 Судебная медицина
ndash ДНК-дактилоскопия
ndash установление родства
4 Анализ пищевых продуктов детекция ГМО
Применение ПЦР
Применение ПЦР
Залог успеха ПЦР
bull высокая чувствительность
bull высокая специфичность
bull высокая устойчивость
bull низкая стоимость быстрота
Получение информации
bull анализ уровня транскрипции
bull ДНК-диагностика
bull генотипирование
Получение материала
bull клонирование ДНК
bull мутагенез
bull секвенирование
N
N
О
О
Н
Н
Н
N
N
О
О
Н
Н
С
НН
Н
ОН
ОCH2
ОP
О
Оndash
HО
3`
4`
5`
2`
1`
Н
Х
Использование UDG ndash метод борьбы с контаминацией продуктами ПЦР
Тимин
(типичен
для ДНК)
Урацил
(типичен
для РНК)
Х = урацил
дезоксиуридинтрифосфат (dUTP) ndash может быть встроен в
растущую цепь как и dTTP не нарушает комплементарности
N
N
О
О
Н
Н
Н
О-
ОCH2
ОP
О
Оndash
О-
3`
4`
5`
2`
1`
Н
UDG 45-550С
Использование UDG ndash метод борьбы с контаминацией продуктами ПЦР
1) Урацил ДНК-гликозилаза присутствующая в ПЦР-смеси отщепляет урацил от цепи ДНК оставляя тн АР-сайт
О-
ОCH2
ОP
О
Оndash
О-
3`
4`
5`
2`
1`
Н
UDG 45-550С
AP-сайт
1) Урацил ДНК-гликозилаза присутствующая в ПЦР-смеси отщепляет урацил от цепи ДНК оставляя тн АР-сайт
Использование UDG ndash метод борьбы с контаминацией продуктами ПЦР
О-
ОCH2
ОP
О
Оndash
О-
3`
4`
5`
2`
1`
Н
Использование UDG ndash метод борьбы с контаминацией продуктами ПЦР
2) При нагревании до 950С UDG инактивируется а AP-сайты расщепляются в результате урацил-содержащая ДНК попавшая в пробирку до начала ПЦР деградирует3) Проводится обычная ПЦР реакционная смесь очищена от продуктов предыдущей амплификации
Digital PCR (dPCR)
65
R
PM 1ln М ndash среднее количество целевой ДНК на сегмент реакции (на основе
распределения Пуассона)Р ndash доля сегментов содержащих ПЦР-продуктR ndash общее кол-во проанализированных сегментов
Лимитирующие факторы dPCR
bull Количество сегментов реакции
bull Концентрация целевой ДНК в анализируемом образце
bull Реакционный объѐм
Коммерчески доступные системы реализующие dPCR
66
Fluidigm - технология микрофлюидных чипов
Bio-Rad (QuantaLife) -dPCR в суспензии
(Digital Droplet PCR)
Life Technologies
dPCR в платах OpenArrayreg
Подготовка образцов
(смешивание ДНК и ПЦР-реагентов)
Создание капель (Droplet Generator)
АмплификацияРегистрация и
анализ результатов
Digital droplet PCR (ddPCR)
bull QX100 Droplet Digital PCR System
Сравнение с Real-Time PCR
68
Digital PCR a powerful new tool for noninvasive prenatal diagnosis Bernhard G Zimmermann Simon Grill Wolfgang Holzgreve Prenat Diagn 2008 28 1087ndash1093
Применение ПЦР в NGS
69
Спасибо за внимание
Рестрикционные карты
Подходы к изучению специфичных последовательностей ДНК
Синтез ДНК in vitro
Полимеразная цепная реакция (ПЦР)Polymerase chain reaction (PCR)
1983 г Кэри Муллис
ndash метод позволяющий избирательно синтезировать большие количества
определённых фрагментов ДНК
bull laquoПолимеразнаяraquo - используется фермент ДНК-полимеразаbull laquoЦепнаяraquo - состоит из повторяющихся циклов количество ДНК с каждым циклом увеличивается в геометрической прогрессии
ПЦР
ПЦР
Компоненты ПЦР
ПраймерыОпределяют амплифицируемый участокСлужат laquoзатравкойraquo для синтеза ДНК
dNTP laquoСтроительный материалraquo
KClМоновалентные катион необходим для оптимальной гибридизации праймеров
Tris Поддержание оптимального для ферментативной реакции рН
MgCl2 Бивалентный катион необходим для работы фермента
Полимераза Осуществляет синтез ДНК
Матрица Анализируемый образец ДНК
Буф
ер
Этапы ПЦРПредварительная денатурация
~950C 1-10 мин
25-50 циклов
Денатурация ~950C 10-60 сек
Отжиг 50-700C 10-60 сек
Элонгация 68-720C 10-180 сек
Финальная элонгация
68-720C 7-10 мин
График диссоциации праймера
Cds ndash концентрация гибридизованного праймера
Полимераза
5`-3` полимеразная активность
Полимераза Процессивность Активности
Taq
(Thermus aquaticus)3-5 тпн
5rarr3 полимеразная
5rarr3 экзонуклеазная
Pfu
(Pyrococcus furiosus)1-2 тпн
5rarr3 полимеразная
5rarr3 экзонуклеазная
3rarr5 экзонуклеазная
Tth
(Thermus thermophilus)
3-5 тпн
(800 пн для
ревертазной активности)
5rarr3 полимеразная
5rarr3 экзонуклеазная
5rarr3 ревертазная
Pwo
(Pyrococcus woesei)3 тпн
5rarr3 полимеразная
3rarr5 экзонуклеазная
Полимераза
5`-3` экзонуклеазная активность
3`-5` экзонуклеазная активность
Стадии ПЦР
Амплификаторы
Термостатированиеbull твёрдый термоблок (элемент Пельтье)bull жидкостьbull поток воздуха
Применение ПЦР
Получение материала
bull амплификация ДНК
Получение информации
bull поиск ДНК
Клонирование ДНК и кДНК
Применение ПЦР для диагностики генетических нарушений
RFLP - Restriction Fragment Length Polymorphism
ПДРФ ndash Полиморфизм Длин Рестрикционных Фрагментов
Серповидноклеточная анемия
Применение ПЦР для диагностики генетических нарушений
Болезнь Хантингтона
ДНК-дактилоскопия
Применение ПЦР для диагностики генетических нарушений
Анализ делеций Анализ транслокаций
Разновидности ПЦР
bull Hot-start PCR ndash для повышения специфичности реакции
bull Touch-down PCR ndash для повышения специфичности реакции
bull Allele-specific PCR ndash для выявления однонуклеотидных различий
bull RT-PCR (reverse transcriptase PCR) ndash для амплификации РНК
bull Asymmetric PCR ndash для получения одноцепочечного продукта ДНК
bull Real-time PCR qPCR
bull Inverse PCR ndash если известна небольшая последовательность внутри амплифицируемого участка
bull Nested PCR ndash две последовательные реакции (для повышения чувствительности и специфичности)
bull PCR mutagenesis ndash две направленного внесения замен в последовательность
Allele-specific PCR- анализ однонуклеотидных полиморфизмов
Inverse PCR- исследование фланкирующих областей
Asymmetric PCR- наработка одноцепочечного продукта
Nested PCR- уменьшение числа побочных продуктов реакции
PCR mutagenesis
Сайт-специфический мутагенез
ПЦР для клонирования в вектор
ПЦР в реальном времени(Real-time PCR)
bull одновременная амплификация и измерение количества продукта
bull наличие флюоресцентного красителя в смеси
bull наличие оптического блока в амплификаторе
линейный lg
33
Системы детекции
1 Неспецифичные
ndash интеркалирующие красители (SYBR Green и др)
2 Специфичные
ndash линейные разрушаемые пробы (TaqMan)
ndash laquoмолекулярные маячкиraquo (beacons)
ndash примыкающие пробы
SYBR Green
Метод TaqMan(линейные разрушаемые зонды)
флуоресцентные зонды и гашение флуоресценции
флуоресцентный
краситель
гаситель
флуоресценции
зонд
специфический фрагмент ДНК
FRET ndash Fluorescence Resonance Energy Transfer
FRET ndash Fluorescence Resonance Energy TransferРезонансный перенос энергии флуоресценции
Принцип метода TaqMan
bull 5`-3` экзонуклеазная активность Taq-полимеразы
Принцип метода TaqMan
bull 5`-3` экзонуклеазная активность Taq-полимеразы
Принцип метода TaqMan
bull 5`-3` экзонуклеазная активность Taq-полимеразы
Принцип метода TaqMan
bull 5`-3` экзонуклеазная активность Taq-полимеразы
Принцип метода TaqMan
bull 5`-3` экзонуклеазная активность Taq-полимеразы
Принцип метода TaqMan
bull 5`-3` экзонуклеазная активность Taq-полимеразы
bull нет участка для посадки праймера ndash нет сигнала
Принцип метода TaqMan
bull нет участка для посадки зонда ndash нет сигнала
Принцип метода TaqMan
Линейные разрушаемые пробы(TaqMan = Taq-polymerase + Pac-Man)
laquoМолекулярные маячкиraquo(molecular beacons)
Примыкающие пробы
Флюорофоры и гасители флюоресценции
Представление результатов ПЦР в реальном времени
линейный lg
Денатурация
Плавление после ПЦР
обратная производная
Плавление после ПЦР
Виды ПЦР-анализа
Качественный анализ
Сравнительный анализ
(полуколичественный)
Количественный анализ
есть нет
больше меньше Х раз
лечение
10 000 копий 1000 копий
Количественная ПЦР (qPCR)
bull Подсчёт числа копий генов
bull Анализ представленности транскриптов
bull Оценка инфекционной нагрузки
Количественная ПЦР
серия 10-кратных разведений
threshold ndash пороговая флюоресценцияCt ndash пороговый цикл
Преимущества Real-time PCR
bull возможность как качественной так и количественной оценки исходной матрицы
bull отсутствие манипуляций после проведения ПЦР (электрофорез)
bull большая чувствительность (от единичных копий) и специфичность
bull большой динамический диапазон концентраций (порядка 10^7)
bull возможность постановки Multiplex анализа
1 Научные исследования
ndash амплификация ДНК для гибридизации (блоттинг микрочипы)
ndash амплификация ДНК для секвенирования
ndash клонирование геномной ДНК кДНК
ndash филогенетическое сравнение геномов
ndash генетическое картирование
ndash анализ уровня транскрипции
Применение ПЦР
2 Медицина
ndash генетическое тестирование
ndash типирование тканей (для трансплантации)
ndash тестирование мутаций в онкогенах
ndash диагностика инфекций
3 Судебная медицина
ndash ДНК-дактилоскопия
ndash установление родства
4 Анализ пищевых продуктов детекция ГМО
Применение ПЦР
Применение ПЦР
Залог успеха ПЦР
bull высокая чувствительность
bull высокая специфичность
bull высокая устойчивость
bull низкая стоимость быстрота
Получение информации
bull анализ уровня транскрипции
bull ДНК-диагностика
bull генотипирование
Получение материала
bull клонирование ДНК
bull мутагенез
bull секвенирование
N
N
О
О
Н
Н
Н
N
N
О
О
Н
Н
С
НН
Н
ОН
ОCH2
ОP
О
Оndash
HО
3`
4`
5`
2`
1`
Н
Х
Использование UDG ndash метод борьбы с контаминацией продуктами ПЦР
Тимин
(типичен
для ДНК)
Урацил
(типичен
для РНК)
Х = урацил
дезоксиуридинтрифосфат (dUTP) ndash может быть встроен в
растущую цепь как и dTTP не нарушает комплементарности
N
N
О
О
Н
Н
Н
О-
ОCH2
ОP
О
Оndash
О-
3`
4`
5`
2`
1`
Н
UDG 45-550С
Использование UDG ndash метод борьбы с контаминацией продуктами ПЦР
1) Урацил ДНК-гликозилаза присутствующая в ПЦР-смеси отщепляет урацил от цепи ДНК оставляя тн АР-сайт
О-
ОCH2
ОP
О
Оndash
О-
3`
4`
5`
2`
1`
Н
UDG 45-550С
AP-сайт
1) Урацил ДНК-гликозилаза присутствующая в ПЦР-смеси отщепляет урацил от цепи ДНК оставляя тн АР-сайт
Использование UDG ndash метод борьбы с контаминацией продуктами ПЦР
О-
ОCH2
ОP
О
Оndash
О-
3`
4`
5`
2`
1`
Н
Использование UDG ndash метод борьбы с контаминацией продуктами ПЦР
2) При нагревании до 950С UDG инактивируется а AP-сайты расщепляются в результате урацил-содержащая ДНК попавшая в пробирку до начала ПЦР деградирует3) Проводится обычная ПЦР реакционная смесь очищена от продуктов предыдущей амплификации
Digital PCR (dPCR)
65
R
PM 1ln М ndash среднее количество целевой ДНК на сегмент реакции (на основе
распределения Пуассона)Р ndash доля сегментов содержащих ПЦР-продуктR ndash общее кол-во проанализированных сегментов
Лимитирующие факторы dPCR
bull Количество сегментов реакции
bull Концентрация целевой ДНК в анализируемом образце
bull Реакционный объѐм
Коммерчески доступные системы реализующие dPCR
66
Fluidigm - технология микрофлюидных чипов
Bio-Rad (QuantaLife) -dPCR в суспензии
(Digital Droplet PCR)
Life Technologies
dPCR в платах OpenArrayreg
Подготовка образцов
(смешивание ДНК и ПЦР-реагентов)
Создание капель (Droplet Generator)
АмплификацияРегистрация и
анализ результатов
Digital droplet PCR (ddPCR)
bull QX100 Droplet Digital PCR System
Сравнение с Real-Time PCR
68
Digital PCR a powerful new tool for noninvasive prenatal diagnosis Bernhard G Zimmermann Simon Grill Wolfgang Holzgreve Prenat Diagn 2008 28 1087ndash1093
Применение ПЦР в NGS
69
Спасибо за внимание
Подходы к изучению специфичных последовательностей ДНК
Синтез ДНК in vitro
Полимеразная цепная реакция (ПЦР)Polymerase chain reaction (PCR)
1983 г Кэри Муллис
ndash метод позволяющий избирательно синтезировать большие количества
определённых фрагментов ДНК
bull laquoПолимеразнаяraquo - используется фермент ДНК-полимеразаbull laquoЦепнаяraquo - состоит из повторяющихся циклов количество ДНК с каждым циклом увеличивается в геометрической прогрессии
ПЦР
ПЦР
Компоненты ПЦР
ПраймерыОпределяют амплифицируемый участокСлужат laquoзатравкойraquo для синтеза ДНК
dNTP laquoСтроительный материалraquo
KClМоновалентные катион необходим для оптимальной гибридизации праймеров
Tris Поддержание оптимального для ферментативной реакции рН
MgCl2 Бивалентный катион необходим для работы фермента
Полимераза Осуществляет синтез ДНК
Матрица Анализируемый образец ДНК
Буф
ер
Этапы ПЦРПредварительная денатурация
~950C 1-10 мин
25-50 циклов
Денатурация ~950C 10-60 сек
Отжиг 50-700C 10-60 сек
Элонгация 68-720C 10-180 сек
Финальная элонгация
68-720C 7-10 мин
График диссоциации праймера
Cds ndash концентрация гибридизованного праймера
Полимераза
5`-3` полимеразная активность
Полимераза Процессивность Активности
Taq
(Thermus aquaticus)3-5 тпн
5rarr3 полимеразная
5rarr3 экзонуклеазная
Pfu
(Pyrococcus furiosus)1-2 тпн
5rarr3 полимеразная
5rarr3 экзонуклеазная
3rarr5 экзонуклеазная
Tth
(Thermus thermophilus)
3-5 тпн
(800 пн для
ревертазной активности)
5rarr3 полимеразная
5rarr3 экзонуклеазная
5rarr3 ревертазная
Pwo
(Pyrococcus woesei)3 тпн
5rarr3 полимеразная
3rarr5 экзонуклеазная
Полимераза
5`-3` экзонуклеазная активность
3`-5` экзонуклеазная активность
Стадии ПЦР
Амплификаторы
Термостатированиеbull твёрдый термоблок (элемент Пельтье)bull жидкостьbull поток воздуха
Применение ПЦР
Получение материала
bull амплификация ДНК
Получение информации
bull поиск ДНК
Клонирование ДНК и кДНК
Применение ПЦР для диагностики генетических нарушений
RFLP - Restriction Fragment Length Polymorphism
ПДРФ ndash Полиморфизм Длин Рестрикционных Фрагментов
Серповидноклеточная анемия
Применение ПЦР для диагностики генетических нарушений
Болезнь Хантингтона
ДНК-дактилоскопия
Применение ПЦР для диагностики генетических нарушений
Анализ делеций Анализ транслокаций
Разновидности ПЦР
bull Hot-start PCR ndash для повышения специфичности реакции
bull Touch-down PCR ndash для повышения специфичности реакции
bull Allele-specific PCR ndash для выявления однонуклеотидных различий
bull RT-PCR (reverse transcriptase PCR) ndash для амплификации РНК
bull Asymmetric PCR ndash для получения одноцепочечного продукта ДНК
bull Real-time PCR qPCR
bull Inverse PCR ndash если известна небольшая последовательность внутри амплифицируемого участка
bull Nested PCR ndash две последовательные реакции (для повышения чувствительности и специфичности)
bull PCR mutagenesis ndash две направленного внесения замен в последовательность
Allele-specific PCR- анализ однонуклеотидных полиморфизмов
Inverse PCR- исследование фланкирующих областей
Asymmetric PCR- наработка одноцепочечного продукта
Nested PCR- уменьшение числа побочных продуктов реакции
PCR mutagenesis
Сайт-специфический мутагенез
ПЦР для клонирования в вектор
ПЦР в реальном времени(Real-time PCR)
bull одновременная амплификация и измерение количества продукта
bull наличие флюоресцентного красителя в смеси
bull наличие оптического блока в амплификаторе
линейный lg
33
Системы детекции
1 Неспецифичные
ndash интеркалирующие красители (SYBR Green и др)
2 Специфичные
ndash линейные разрушаемые пробы (TaqMan)
ndash laquoмолекулярные маячкиraquo (beacons)
ndash примыкающие пробы
SYBR Green
Метод TaqMan(линейные разрушаемые зонды)
флуоресцентные зонды и гашение флуоресценции
флуоресцентный
краситель
гаситель
флуоресценции
зонд
специфический фрагмент ДНК
FRET ndash Fluorescence Resonance Energy Transfer
FRET ndash Fluorescence Resonance Energy TransferРезонансный перенос энергии флуоресценции
Принцип метода TaqMan
bull 5`-3` экзонуклеазная активность Taq-полимеразы
Принцип метода TaqMan
bull 5`-3` экзонуклеазная активность Taq-полимеразы
Принцип метода TaqMan
bull 5`-3` экзонуклеазная активность Taq-полимеразы
Принцип метода TaqMan
bull 5`-3` экзонуклеазная активность Taq-полимеразы
Принцип метода TaqMan
bull 5`-3` экзонуклеазная активность Taq-полимеразы
Принцип метода TaqMan
bull 5`-3` экзонуклеазная активность Taq-полимеразы
bull нет участка для посадки праймера ndash нет сигнала
Принцип метода TaqMan
bull нет участка для посадки зонда ndash нет сигнала
Принцип метода TaqMan
Линейные разрушаемые пробы(TaqMan = Taq-polymerase + Pac-Man)
laquoМолекулярные маячкиraquo(molecular beacons)
Примыкающие пробы
Флюорофоры и гасители флюоресценции
Представление результатов ПЦР в реальном времени
линейный lg
Денатурация
Плавление после ПЦР
обратная производная
Плавление после ПЦР
Виды ПЦР-анализа
Качественный анализ
Сравнительный анализ
(полуколичественный)
Количественный анализ
есть нет
больше меньше Х раз
лечение
10 000 копий 1000 копий
Количественная ПЦР (qPCR)
bull Подсчёт числа копий генов
bull Анализ представленности транскриптов
bull Оценка инфекционной нагрузки
Количественная ПЦР
серия 10-кратных разведений
threshold ndash пороговая флюоресценцияCt ndash пороговый цикл
Преимущества Real-time PCR
bull возможность как качественной так и количественной оценки исходной матрицы
bull отсутствие манипуляций после проведения ПЦР (электрофорез)
bull большая чувствительность (от единичных копий) и специфичность
bull большой динамический диапазон концентраций (порядка 10^7)
bull возможность постановки Multiplex анализа
1 Научные исследования
ndash амплификация ДНК для гибридизации (блоттинг микрочипы)
ndash амплификация ДНК для секвенирования
ndash клонирование геномной ДНК кДНК
ndash филогенетическое сравнение геномов
ndash генетическое картирование
ndash анализ уровня транскрипции
Применение ПЦР
2 Медицина
ndash генетическое тестирование
ndash типирование тканей (для трансплантации)
ndash тестирование мутаций в онкогенах
ndash диагностика инфекций
3 Судебная медицина
ndash ДНК-дактилоскопия
ndash установление родства
4 Анализ пищевых продуктов детекция ГМО
Применение ПЦР
Применение ПЦР
Залог успеха ПЦР
bull высокая чувствительность
bull высокая специфичность
bull высокая устойчивость
bull низкая стоимость быстрота
Получение информации
bull анализ уровня транскрипции
bull ДНК-диагностика
bull генотипирование
Получение материала
bull клонирование ДНК
bull мутагенез
bull секвенирование
N
N
О
О
Н
Н
Н
N
N
О
О
Н
Н
С
НН
Н
ОН
ОCH2
ОP
О
Оndash
HО
3`
4`
5`
2`
1`
Н
Х
Использование UDG ndash метод борьбы с контаминацией продуктами ПЦР
Тимин
(типичен
для ДНК)
Урацил
(типичен
для РНК)
Х = урацил
дезоксиуридинтрифосфат (dUTP) ndash может быть встроен в
растущую цепь как и dTTP не нарушает комплементарности
N
N
О
О
Н
Н
Н
О-
ОCH2
ОP
О
Оndash
О-
3`
4`
5`
2`
1`
Н
UDG 45-550С
Использование UDG ndash метод борьбы с контаминацией продуктами ПЦР
1) Урацил ДНК-гликозилаза присутствующая в ПЦР-смеси отщепляет урацил от цепи ДНК оставляя тн АР-сайт
О-
ОCH2
ОP
О
Оndash
О-
3`
4`
5`
2`
1`
Н
UDG 45-550С
AP-сайт
1) Урацил ДНК-гликозилаза присутствующая в ПЦР-смеси отщепляет урацил от цепи ДНК оставляя тн АР-сайт
Использование UDG ndash метод борьбы с контаминацией продуктами ПЦР
О-
ОCH2
ОP
О
Оndash
О-
3`
4`
5`
2`
1`
Н
Использование UDG ndash метод борьбы с контаминацией продуктами ПЦР
2) При нагревании до 950С UDG инактивируется а AP-сайты расщепляются в результате урацил-содержащая ДНК попавшая в пробирку до начала ПЦР деградирует3) Проводится обычная ПЦР реакционная смесь очищена от продуктов предыдущей амплификации
Digital PCR (dPCR)
65
R
PM 1ln М ndash среднее количество целевой ДНК на сегмент реакции (на основе
распределения Пуассона)Р ndash доля сегментов содержащих ПЦР-продуктR ndash общее кол-во проанализированных сегментов
Лимитирующие факторы dPCR
bull Количество сегментов реакции
bull Концентрация целевой ДНК в анализируемом образце
bull Реакционный объѐм
Коммерчески доступные системы реализующие dPCR
66
Fluidigm - технология микрофлюидных чипов
Bio-Rad (QuantaLife) -dPCR в суспензии
(Digital Droplet PCR)
Life Technologies
dPCR в платах OpenArrayreg
Подготовка образцов
(смешивание ДНК и ПЦР-реагентов)
Создание капель (Droplet Generator)
АмплификацияРегистрация и
анализ результатов
Digital droplet PCR (ddPCR)
bull QX100 Droplet Digital PCR System
Сравнение с Real-Time PCR
68
Digital PCR a powerful new tool for noninvasive prenatal diagnosis Bernhard G Zimmermann Simon Grill Wolfgang Holzgreve Prenat Diagn 2008 28 1087ndash1093
Применение ПЦР в NGS
69
Спасибо за внимание
Синтез ДНК in vitro
Полимеразная цепная реакция (ПЦР)Polymerase chain reaction (PCR)
1983 г Кэри Муллис
ndash метод позволяющий избирательно синтезировать большие количества
определённых фрагментов ДНК
bull laquoПолимеразнаяraquo - используется фермент ДНК-полимеразаbull laquoЦепнаяraquo - состоит из повторяющихся циклов количество ДНК с каждым циклом увеличивается в геометрической прогрессии
ПЦР
ПЦР
Компоненты ПЦР
ПраймерыОпределяют амплифицируемый участокСлужат laquoзатравкойraquo для синтеза ДНК
dNTP laquoСтроительный материалraquo
KClМоновалентные катион необходим для оптимальной гибридизации праймеров
Tris Поддержание оптимального для ферментативной реакции рН
MgCl2 Бивалентный катион необходим для работы фермента
Полимераза Осуществляет синтез ДНК
Матрица Анализируемый образец ДНК
Буф
ер
Этапы ПЦРПредварительная денатурация
~950C 1-10 мин
25-50 циклов
Денатурация ~950C 10-60 сек
Отжиг 50-700C 10-60 сек
Элонгация 68-720C 10-180 сек
Финальная элонгация
68-720C 7-10 мин
График диссоциации праймера
Cds ndash концентрация гибридизованного праймера
Полимераза
5`-3` полимеразная активность
Полимераза Процессивность Активности
Taq
(Thermus aquaticus)3-5 тпн
5rarr3 полимеразная
5rarr3 экзонуклеазная
Pfu
(Pyrococcus furiosus)1-2 тпн
5rarr3 полимеразная
5rarr3 экзонуклеазная
3rarr5 экзонуклеазная
Tth
(Thermus thermophilus)
3-5 тпн
(800 пн для
ревертазной активности)
5rarr3 полимеразная
5rarr3 экзонуклеазная
5rarr3 ревертазная
Pwo
(Pyrococcus woesei)3 тпн
5rarr3 полимеразная
3rarr5 экзонуклеазная
Полимераза
5`-3` экзонуклеазная активность
3`-5` экзонуклеазная активность
Стадии ПЦР
Амплификаторы
Термостатированиеbull твёрдый термоблок (элемент Пельтье)bull жидкостьbull поток воздуха
Применение ПЦР
Получение материала
bull амплификация ДНК
Получение информации
bull поиск ДНК
Клонирование ДНК и кДНК
Применение ПЦР для диагностики генетических нарушений
RFLP - Restriction Fragment Length Polymorphism
ПДРФ ndash Полиморфизм Длин Рестрикционных Фрагментов
Серповидноклеточная анемия
Применение ПЦР для диагностики генетических нарушений
Болезнь Хантингтона
ДНК-дактилоскопия
Применение ПЦР для диагностики генетических нарушений
Анализ делеций Анализ транслокаций
Разновидности ПЦР
bull Hot-start PCR ndash для повышения специфичности реакции
bull Touch-down PCR ndash для повышения специфичности реакции
bull Allele-specific PCR ndash для выявления однонуклеотидных различий
bull RT-PCR (reverse transcriptase PCR) ndash для амплификации РНК
bull Asymmetric PCR ndash для получения одноцепочечного продукта ДНК
bull Real-time PCR qPCR
bull Inverse PCR ndash если известна небольшая последовательность внутри амплифицируемого участка
bull Nested PCR ndash две последовательные реакции (для повышения чувствительности и специфичности)
bull PCR mutagenesis ndash две направленного внесения замен в последовательность
Allele-specific PCR- анализ однонуклеотидных полиморфизмов
Inverse PCR- исследование фланкирующих областей
Asymmetric PCR- наработка одноцепочечного продукта
Nested PCR- уменьшение числа побочных продуктов реакции
PCR mutagenesis
Сайт-специфический мутагенез
ПЦР для клонирования в вектор
ПЦР в реальном времени(Real-time PCR)
bull одновременная амплификация и измерение количества продукта
bull наличие флюоресцентного красителя в смеси
bull наличие оптического блока в амплификаторе
линейный lg
33
Системы детекции
1 Неспецифичные
ndash интеркалирующие красители (SYBR Green и др)
2 Специфичные
ndash линейные разрушаемые пробы (TaqMan)
ndash laquoмолекулярные маячкиraquo (beacons)
ndash примыкающие пробы
SYBR Green
Метод TaqMan(линейные разрушаемые зонды)
флуоресцентные зонды и гашение флуоресценции
флуоресцентный
краситель
гаситель
флуоресценции
зонд
специфический фрагмент ДНК
FRET ndash Fluorescence Resonance Energy Transfer
FRET ndash Fluorescence Resonance Energy TransferРезонансный перенос энергии флуоресценции
Принцип метода TaqMan
bull 5`-3` экзонуклеазная активность Taq-полимеразы
Принцип метода TaqMan
bull 5`-3` экзонуклеазная активность Taq-полимеразы
Принцип метода TaqMan
bull 5`-3` экзонуклеазная активность Taq-полимеразы
Принцип метода TaqMan
bull 5`-3` экзонуклеазная активность Taq-полимеразы
Принцип метода TaqMan
bull 5`-3` экзонуклеазная активность Taq-полимеразы
Принцип метода TaqMan
bull 5`-3` экзонуклеазная активность Taq-полимеразы
bull нет участка для посадки праймера ndash нет сигнала
Принцип метода TaqMan
bull нет участка для посадки зонда ndash нет сигнала
Принцип метода TaqMan
Линейные разрушаемые пробы(TaqMan = Taq-polymerase + Pac-Man)
laquoМолекулярные маячкиraquo(molecular beacons)
Примыкающие пробы
Флюорофоры и гасители флюоресценции
Представление результатов ПЦР в реальном времени
линейный lg
Денатурация
Плавление после ПЦР
обратная производная
Плавление после ПЦР
Виды ПЦР-анализа
Качественный анализ
Сравнительный анализ
(полуколичественный)
Количественный анализ
есть нет
больше меньше Х раз
лечение
10 000 копий 1000 копий
Количественная ПЦР (qPCR)
bull Подсчёт числа копий генов
bull Анализ представленности транскриптов
bull Оценка инфекционной нагрузки
Количественная ПЦР
серия 10-кратных разведений
threshold ndash пороговая флюоресценцияCt ndash пороговый цикл
Преимущества Real-time PCR
bull возможность как качественной так и количественной оценки исходной матрицы
bull отсутствие манипуляций после проведения ПЦР (электрофорез)
bull большая чувствительность (от единичных копий) и специфичность
bull большой динамический диапазон концентраций (порядка 10^7)
bull возможность постановки Multiplex анализа
1 Научные исследования
ndash амплификация ДНК для гибридизации (блоттинг микрочипы)
ndash амплификация ДНК для секвенирования
ndash клонирование геномной ДНК кДНК
ndash филогенетическое сравнение геномов
ndash генетическое картирование
ndash анализ уровня транскрипции
Применение ПЦР
2 Медицина
ndash генетическое тестирование
ndash типирование тканей (для трансплантации)
ndash тестирование мутаций в онкогенах
ndash диагностика инфекций
3 Судебная медицина
ndash ДНК-дактилоскопия
ndash установление родства
4 Анализ пищевых продуктов детекция ГМО
Применение ПЦР
Применение ПЦР
Залог успеха ПЦР
bull высокая чувствительность
bull высокая специфичность
bull высокая устойчивость
bull низкая стоимость быстрота
Получение информации
bull анализ уровня транскрипции
bull ДНК-диагностика
bull генотипирование
Получение материала
bull клонирование ДНК
bull мутагенез
bull секвенирование
N
N
О
О
Н
Н
Н
N
N
О
О
Н
Н
С
НН
Н
ОН
ОCH2
ОP
О
Оndash
HО
3`
4`
5`
2`
1`
Н
Х
Использование UDG ndash метод борьбы с контаминацией продуктами ПЦР
Тимин
(типичен
для ДНК)
Урацил
(типичен
для РНК)
Х = урацил
дезоксиуридинтрифосфат (dUTP) ndash может быть встроен в
растущую цепь как и dTTP не нарушает комплементарности
N
N
О
О
Н
Н
Н
О-
ОCH2
ОP
О
Оndash
О-
3`
4`
5`
2`
1`
Н
UDG 45-550С
Использование UDG ndash метод борьбы с контаминацией продуктами ПЦР
1) Урацил ДНК-гликозилаза присутствующая в ПЦР-смеси отщепляет урацил от цепи ДНК оставляя тн АР-сайт
О-
ОCH2
ОP
О
Оndash
О-
3`
4`
5`
2`
1`
Н
UDG 45-550С
AP-сайт
1) Урацил ДНК-гликозилаза присутствующая в ПЦР-смеси отщепляет урацил от цепи ДНК оставляя тн АР-сайт
Использование UDG ndash метод борьбы с контаминацией продуктами ПЦР
О-
ОCH2
ОP
О
Оndash
О-
3`
4`
5`
2`
1`
Н
Использование UDG ndash метод борьбы с контаминацией продуктами ПЦР
2) При нагревании до 950С UDG инактивируется а AP-сайты расщепляются в результате урацил-содержащая ДНК попавшая в пробирку до начала ПЦР деградирует3) Проводится обычная ПЦР реакционная смесь очищена от продуктов предыдущей амплификации
Digital PCR (dPCR)
65
R
PM 1ln М ndash среднее количество целевой ДНК на сегмент реакции (на основе
распределения Пуассона)Р ndash доля сегментов содержащих ПЦР-продуктR ndash общее кол-во проанализированных сегментов
Лимитирующие факторы dPCR
bull Количество сегментов реакции
bull Концентрация целевой ДНК в анализируемом образце
bull Реакционный объѐм
Коммерчески доступные системы реализующие dPCR
66
Fluidigm - технология микрофлюидных чипов
Bio-Rad (QuantaLife) -dPCR в суспензии
(Digital Droplet PCR)
Life Technologies
dPCR в платах OpenArrayreg
Подготовка образцов
(смешивание ДНК и ПЦР-реагентов)
Создание капель (Droplet Generator)
АмплификацияРегистрация и
анализ результатов
Digital droplet PCR (ddPCR)
bull QX100 Droplet Digital PCR System
Сравнение с Real-Time PCR
68
Digital PCR a powerful new tool for noninvasive prenatal diagnosis Bernhard G Zimmermann Simon Grill Wolfgang Holzgreve Prenat Diagn 2008 28 1087ndash1093
Применение ПЦР в NGS
69
Спасибо за внимание
Полимеразная цепная реакция (ПЦР)Polymerase chain reaction (PCR)
1983 г Кэри Муллис
ndash метод позволяющий избирательно синтезировать большие количества
определённых фрагментов ДНК
bull laquoПолимеразнаяraquo - используется фермент ДНК-полимеразаbull laquoЦепнаяraquo - состоит из повторяющихся циклов количество ДНК с каждым циклом увеличивается в геометрической прогрессии
ПЦР
ПЦР
Компоненты ПЦР
ПраймерыОпределяют амплифицируемый участокСлужат laquoзатравкойraquo для синтеза ДНК
dNTP laquoСтроительный материалraquo
KClМоновалентные катион необходим для оптимальной гибридизации праймеров
Tris Поддержание оптимального для ферментативной реакции рН
MgCl2 Бивалентный катион необходим для работы фермента
Полимераза Осуществляет синтез ДНК
Матрица Анализируемый образец ДНК
Буф
ер
Этапы ПЦРПредварительная денатурация
~950C 1-10 мин
25-50 циклов
Денатурация ~950C 10-60 сек
Отжиг 50-700C 10-60 сек
Элонгация 68-720C 10-180 сек
Финальная элонгация
68-720C 7-10 мин
График диссоциации праймера
Cds ndash концентрация гибридизованного праймера
Полимераза
5`-3` полимеразная активность
Полимераза Процессивность Активности
Taq
(Thermus aquaticus)3-5 тпн
5rarr3 полимеразная
5rarr3 экзонуклеазная
Pfu
(Pyrococcus furiosus)1-2 тпн
5rarr3 полимеразная
5rarr3 экзонуклеазная
3rarr5 экзонуклеазная
Tth
(Thermus thermophilus)
3-5 тпн
(800 пн для
ревертазной активности)
5rarr3 полимеразная
5rarr3 экзонуклеазная
5rarr3 ревертазная
Pwo
(Pyrococcus woesei)3 тпн
5rarr3 полимеразная
3rarr5 экзонуклеазная
Полимераза
5`-3` экзонуклеазная активность
3`-5` экзонуклеазная активность
Стадии ПЦР
Амплификаторы
Термостатированиеbull твёрдый термоблок (элемент Пельтье)bull жидкостьbull поток воздуха
Применение ПЦР
Получение материала
bull амплификация ДНК
Получение информации
bull поиск ДНК
Клонирование ДНК и кДНК
Применение ПЦР для диагностики генетических нарушений
RFLP - Restriction Fragment Length Polymorphism
ПДРФ ndash Полиморфизм Длин Рестрикционных Фрагментов
Серповидноклеточная анемия
Применение ПЦР для диагностики генетических нарушений
Болезнь Хантингтона
ДНК-дактилоскопия
Применение ПЦР для диагностики генетических нарушений
Анализ делеций Анализ транслокаций
Разновидности ПЦР
bull Hot-start PCR ndash для повышения специфичности реакции
bull Touch-down PCR ndash для повышения специфичности реакции
bull Allele-specific PCR ndash для выявления однонуклеотидных различий
bull RT-PCR (reverse transcriptase PCR) ndash для амплификации РНК
bull Asymmetric PCR ndash для получения одноцепочечного продукта ДНК
bull Real-time PCR qPCR
bull Inverse PCR ndash если известна небольшая последовательность внутри амплифицируемого участка
bull Nested PCR ndash две последовательные реакции (для повышения чувствительности и специфичности)
bull PCR mutagenesis ndash две направленного внесения замен в последовательность
Allele-specific PCR- анализ однонуклеотидных полиморфизмов
Inverse PCR- исследование фланкирующих областей
Asymmetric PCR- наработка одноцепочечного продукта
Nested PCR- уменьшение числа побочных продуктов реакции
PCR mutagenesis
Сайт-специфический мутагенез
ПЦР для клонирования в вектор
ПЦР в реальном времени(Real-time PCR)
bull одновременная амплификация и измерение количества продукта
bull наличие флюоресцентного красителя в смеси
bull наличие оптического блока в амплификаторе
линейный lg
33
Системы детекции
1 Неспецифичные
ndash интеркалирующие красители (SYBR Green и др)
2 Специфичные
ndash линейные разрушаемые пробы (TaqMan)
ndash laquoмолекулярные маячкиraquo (beacons)
ndash примыкающие пробы
SYBR Green
Метод TaqMan(линейные разрушаемые зонды)
флуоресцентные зонды и гашение флуоресценции
флуоресцентный
краситель
гаситель
флуоресценции
зонд
специфический фрагмент ДНК
FRET ndash Fluorescence Resonance Energy Transfer
FRET ndash Fluorescence Resonance Energy TransferРезонансный перенос энергии флуоресценции
Принцип метода TaqMan
bull 5`-3` экзонуклеазная активность Taq-полимеразы
Принцип метода TaqMan
bull 5`-3` экзонуклеазная активность Taq-полимеразы
Принцип метода TaqMan
bull 5`-3` экзонуклеазная активность Taq-полимеразы
Принцип метода TaqMan
bull 5`-3` экзонуклеазная активность Taq-полимеразы
Принцип метода TaqMan
bull 5`-3` экзонуклеазная активность Taq-полимеразы
Принцип метода TaqMan
bull 5`-3` экзонуклеазная активность Taq-полимеразы
bull нет участка для посадки праймера ndash нет сигнала
Принцип метода TaqMan
bull нет участка для посадки зонда ndash нет сигнала
Принцип метода TaqMan
Линейные разрушаемые пробы(TaqMan = Taq-polymerase + Pac-Man)
laquoМолекулярные маячкиraquo(molecular beacons)
Примыкающие пробы
Флюорофоры и гасители флюоресценции
Представление результатов ПЦР в реальном времени
линейный lg
Денатурация
Плавление после ПЦР
обратная производная
Плавление после ПЦР
Виды ПЦР-анализа
Качественный анализ
Сравнительный анализ
(полуколичественный)
Количественный анализ
есть нет
больше меньше Х раз
лечение
10 000 копий 1000 копий
Количественная ПЦР (qPCR)
bull Подсчёт числа копий генов
bull Анализ представленности транскриптов
bull Оценка инфекционной нагрузки
Количественная ПЦР
серия 10-кратных разведений
threshold ndash пороговая флюоресценцияCt ndash пороговый цикл
Преимущества Real-time PCR
bull возможность как качественной так и количественной оценки исходной матрицы
bull отсутствие манипуляций после проведения ПЦР (электрофорез)
bull большая чувствительность (от единичных копий) и специфичность
bull большой динамический диапазон концентраций (порядка 10^7)
bull возможность постановки Multiplex анализа
1 Научные исследования
ndash амплификация ДНК для гибридизации (блоттинг микрочипы)
ndash амплификация ДНК для секвенирования
ndash клонирование геномной ДНК кДНК
ndash филогенетическое сравнение геномов
ndash генетическое картирование
ndash анализ уровня транскрипции
Применение ПЦР
2 Медицина
ndash генетическое тестирование
ndash типирование тканей (для трансплантации)
ndash тестирование мутаций в онкогенах
ndash диагностика инфекций
3 Судебная медицина
ndash ДНК-дактилоскопия
ndash установление родства
4 Анализ пищевых продуктов детекция ГМО
Применение ПЦР
Применение ПЦР
Залог успеха ПЦР
bull высокая чувствительность
bull высокая специфичность
bull высокая устойчивость
bull низкая стоимость быстрота
Получение информации
bull анализ уровня транскрипции
bull ДНК-диагностика
bull генотипирование
Получение материала
bull клонирование ДНК
bull мутагенез
bull секвенирование
N
N
О
О
Н
Н
Н
N
N
О
О
Н
Н
С
НН
Н
ОН
ОCH2
ОP
О
Оndash
HО
3`
4`
5`
2`
1`
Н
Х
Использование UDG ndash метод борьбы с контаминацией продуктами ПЦР
Тимин
(типичен
для ДНК)
Урацил
(типичен
для РНК)
Х = урацил
дезоксиуридинтрифосфат (dUTP) ndash может быть встроен в
растущую цепь как и dTTP не нарушает комплементарности
N
N
О
О
Н
Н
Н
О-
ОCH2
ОP
О
Оndash
О-
3`
4`
5`
2`
1`
Н
UDG 45-550С
Использование UDG ndash метод борьбы с контаминацией продуктами ПЦР
1) Урацил ДНК-гликозилаза присутствующая в ПЦР-смеси отщепляет урацил от цепи ДНК оставляя тн АР-сайт
О-
ОCH2
ОP
О
Оndash
О-
3`
4`
5`
2`
1`
Н
UDG 45-550С
AP-сайт
1) Урацил ДНК-гликозилаза присутствующая в ПЦР-смеси отщепляет урацил от цепи ДНК оставляя тн АР-сайт
Использование UDG ndash метод борьбы с контаминацией продуктами ПЦР
О-
ОCH2
ОP
О
Оndash
О-
3`
4`
5`
2`
1`
Н
Использование UDG ndash метод борьбы с контаминацией продуктами ПЦР
2) При нагревании до 950С UDG инактивируется а AP-сайты расщепляются в результате урацил-содержащая ДНК попавшая в пробирку до начала ПЦР деградирует3) Проводится обычная ПЦР реакционная смесь очищена от продуктов предыдущей амплификации
Digital PCR (dPCR)
65
R
PM 1ln М ndash среднее количество целевой ДНК на сегмент реакции (на основе
распределения Пуассона)Р ndash доля сегментов содержащих ПЦР-продуктR ndash общее кол-во проанализированных сегментов
Лимитирующие факторы dPCR
bull Количество сегментов реакции
bull Концентрация целевой ДНК в анализируемом образце
bull Реакционный объѐм
Коммерчески доступные системы реализующие dPCR
66
Fluidigm - технология микрофлюидных чипов
Bio-Rad (QuantaLife) -dPCR в суспензии
(Digital Droplet PCR)
Life Technologies
dPCR в платах OpenArrayreg
Подготовка образцов
(смешивание ДНК и ПЦР-реагентов)
Создание капель (Droplet Generator)
АмплификацияРегистрация и
анализ результатов
Digital droplet PCR (ddPCR)
bull QX100 Droplet Digital PCR System
Сравнение с Real-Time PCR
68
Digital PCR a powerful new tool for noninvasive prenatal diagnosis Bernhard G Zimmermann Simon Grill Wolfgang Holzgreve Prenat Diagn 2008 28 1087ndash1093
Применение ПЦР в NGS
69
Спасибо за внимание
ПЦР
ПЦР
Компоненты ПЦР
ПраймерыОпределяют амплифицируемый участокСлужат laquoзатравкойraquo для синтеза ДНК
dNTP laquoСтроительный материалraquo
KClМоновалентные катион необходим для оптимальной гибридизации праймеров
Tris Поддержание оптимального для ферментативной реакции рН
MgCl2 Бивалентный катион необходим для работы фермента
Полимераза Осуществляет синтез ДНК
Матрица Анализируемый образец ДНК
Буф
ер
Этапы ПЦРПредварительная денатурация
~950C 1-10 мин
25-50 циклов
Денатурация ~950C 10-60 сек
Отжиг 50-700C 10-60 сек
Элонгация 68-720C 10-180 сек
Финальная элонгация
68-720C 7-10 мин
График диссоциации праймера
Cds ndash концентрация гибридизованного праймера
Полимераза
5`-3` полимеразная активность
Полимераза Процессивность Активности
Taq
(Thermus aquaticus)3-5 тпн
5rarr3 полимеразная
5rarr3 экзонуклеазная
Pfu
(Pyrococcus furiosus)1-2 тпн
5rarr3 полимеразная
5rarr3 экзонуклеазная
3rarr5 экзонуклеазная
Tth
(Thermus thermophilus)
3-5 тпн
(800 пн для
ревертазной активности)
5rarr3 полимеразная
5rarr3 экзонуклеазная
5rarr3 ревертазная
Pwo
(Pyrococcus woesei)3 тпн
5rarr3 полимеразная
3rarr5 экзонуклеазная
Полимераза
5`-3` экзонуклеазная активность
3`-5` экзонуклеазная активность
Стадии ПЦР
Амплификаторы
Термостатированиеbull твёрдый термоблок (элемент Пельтье)bull жидкостьbull поток воздуха
Применение ПЦР
Получение материала
bull амплификация ДНК
Получение информации
bull поиск ДНК
Клонирование ДНК и кДНК
Применение ПЦР для диагностики генетических нарушений
RFLP - Restriction Fragment Length Polymorphism
ПДРФ ndash Полиморфизм Длин Рестрикционных Фрагментов
Серповидноклеточная анемия
Применение ПЦР для диагностики генетических нарушений
Болезнь Хантингтона
ДНК-дактилоскопия
Применение ПЦР для диагностики генетических нарушений
Анализ делеций Анализ транслокаций
Разновидности ПЦР
bull Hot-start PCR ndash для повышения специфичности реакции
bull Touch-down PCR ndash для повышения специфичности реакции
bull Allele-specific PCR ndash для выявления однонуклеотидных различий
bull RT-PCR (reverse transcriptase PCR) ndash для амплификации РНК
bull Asymmetric PCR ndash для получения одноцепочечного продукта ДНК
bull Real-time PCR qPCR
bull Inverse PCR ndash если известна небольшая последовательность внутри амплифицируемого участка
bull Nested PCR ndash две последовательные реакции (для повышения чувствительности и специфичности)
bull PCR mutagenesis ndash две направленного внесения замен в последовательность
Allele-specific PCR- анализ однонуклеотидных полиморфизмов
Inverse PCR- исследование фланкирующих областей
Asymmetric PCR- наработка одноцепочечного продукта
Nested PCR- уменьшение числа побочных продуктов реакции
PCR mutagenesis
Сайт-специфический мутагенез
ПЦР для клонирования в вектор
ПЦР в реальном времени(Real-time PCR)
bull одновременная амплификация и измерение количества продукта
bull наличие флюоресцентного красителя в смеси
bull наличие оптического блока в амплификаторе
линейный lg
33
Системы детекции
1 Неспецифичные
ndash интеркалирующие красители (SYBR Green и др)
2 Специфичные
ndash линейные разрушаемые пробы (TaqMan)
ndash laquoмолекулярные маячкиraquo (beacons)
ndash примыкающие пробы
SYBR Green
Метод TaqMan(линейные разрушаемые зонды)
флуоресцентные зонды и гашение флуоресценции
флуоресцентный
краситель
гаситель
флуоресценции
зонд
специфический фрагмент ДНК
FRET ndash Fluorescence Resonance Energy Transfer
FRET ndash Fluorescence Resonance Energy TransferРезонансный перенос энергии флуоресценции
Принцип метода TaqMan
bull 5`-3` экзонуклеазная активность Taq-полимеразы
Принцип метода TaqMan
bull 5`-3` экзонуклеазная активность Taq-полимеразы
Принцип метода TaqMan
bull 5`-3` экзонуклеазная активность Taq-полимеразы
Принцип метода TaqMan
bull 5`-3` экзонуклеазная активность Taq-полимеразы
Принцип метода TaqMan
bull 5`-3` экзонуклеазная активность Taq-полимеразы
Принцип метода TaqMan
bull 5`-3` экзонуклеазная активность Taq-полимеразы
bull нет участка для посадки праймера ndash нет сигнала
Принцип метода TaqMan
bull нет участка для посадки зонда ndash нет сигнала
Принцип метода TaqMan
Линейные разрушаемые пробы(TaqMan = Taq-polymerase + Pac-Man)
laquoМолекулярные маячкиraquo(molecular beacons)
Примыкающие пробы
Флюорофоры и гасители флюоресценции
Представление результатов ПЦР в реальном времени
линейный lg
Денатурация
Плавление после ПЦР
обратная производная
Плавление после ПЦР
Виды ПЦР-анализа
Качественный анализ
Сравнительный анализ
(полуколичественный)
Количественный анализ
есть нет
больше меньше Х раз
лечение
10 000 копий 1000 копий
Количественная ПЦР (qPCR)
bull Подсчёт числа копий генов
bull Анализ представленности транскриптов
bull Оценка инфекционной нагрузки
Количественная ПЦР
серия 10-кратных разведений
threshold ndash пороговая флюоресценцияCt ndash пороговый цикл
Преимущества Real-time PCR
bull возможность как качественной так и количественной оценки исходной матрицы
bull отсутствие манипуляций после проведения ПЦР (электрофорез)
bull большая чувствительность (от единичных копий) и специфичность
bull большой динамический диапазон концентраций (порядка 10^7)
bull возможность постановки Multiplex анализа
1 Научные исследования
ndash амплификация ДНК для гибридизации (блоттинг микрочипы)
ndash амплификация ДНК для секвенирования
ndash клонирование геномной ДНК кДНК
ndash филогенетическое сравнение геномов
ndash генетическое картирование
ndash анализ уровня транскрипции
Применение ПЦР
2 Медицина
ndash генетическое тестирование
ndash типирование тканей (для трансплантации)
ndash тестирование мутаций в онкогенах
ndash диагностика инфекций
3 Судебная медицина
ndash ДНК-дактилоскопия
ndash установление родства
4 Анализ пищевых продуктов детекция ГМО
Применение ПЦР
Применение ПЦР
Залог успеха ПЦР
bull высокая чувствительность
bull высокая специфичность
bull высокая устойчивость
bull низкая стоимость быстрота
Получение информации
bull анализ уровня транскрипции
bull ДНК-диагностика
bull генотипирование
Получение материала
bull клонирование ДНК
bull мутагенез
bull секвенирование
N
N
О
О
Н
Н
Н
N
N
О
О
Н
Н
С
НН
Н
ОН
ОCH2
ОP
О
Оndash
HО
3`
4`
5`
2`
1`
Н
Х
Использование UDG ndash метод борьбы с контаминацией продуктами ПЦР
Тимин
(типичен
для ДНК)
Урацил
(типичен
для РНК)
Х = урацил
дезоксиуридинтрифосфат (dUTP) ndash может быть встроен в
растущую цепь как и dTTP не нарушает комплементарности
N
N
О
О
Н
Н
Н
О-
ОCH2
ОP
О
Оndash
О-
3`
4`
5`
2`
1`
Н
UDG 45-550С
Использование UDG ndash метод борьбы с контаминацией продуктами ПЦР
1) Урацил ДНК-гликозилаза присутствующая в ПЦР-смеси отщепляет урацил от цепи ДНК оставляя тн АР-сайт
О-
ОCH2
ОP
О
Оndash
О-
3`
4`
5`
2`
1`
Н
UDG 45-550С
AP-сайт
1) Урацил ДНК-гликозилаза присутствующая в ПЦР-смеси отщепляет урацил от цепи ДНК оставляя тн АР-сайт
Использование UDG ndash метод борьбы с контаминацией продуктами ПЦР
О-
ОCH2
ОP
О
Оndash
О-
3`
4`
5`
2`
1`
Н
Использование UDG ndash метод борьбы с контаминацией продуктами ПЦР
2) При нагревании до 950С UDG инактивируется а AP-сайты расщепляются в результате урацил-содержащая ДНК попавшая в пробирку до начала ПЦР деградирует3) Проводится обычная ПЦР реакционная смесь очищена от продуктов предыдущей амплификации
Digital PCR (dPCR)
65
R
PM 1ln М ndash среднее количество целевой ДНК на сегмент реакции (на основе
распределения Пуассона)Р ndash доля сегментов содержащих ПЦР-продуктR ndash общее кол-во проанализированных сегментов
Лимитирующие факторы dPCR
bull Количество сегментов реакции
bull Концентрация целевой ДНК в анализируемом образце
bull Реакционный объѐм
Коммерчески доступные системы реализующие dPCR
66
Fluidigm - технология микрофлюидных чипов
Bio-Rad (QuantaLife) -dPCR в суспензии
(Digital Droplet PCR)
Life Technologies
dPCR в платах OpenArrayreg
Подготовка образцов
(смешивание ДНК и ПЦР-реагентов)
Создание капель (Droplet Generator)
АмплификацияРегистрация и
анализ результатов
Digital droplet PCR (ddPCR)
bull QX100 Droplet Digital PCR System
Сравнение с Real-Time PCR
68
Digital PCR a powerful new tool for noninvasive prenatal diagnosis Bernhard G Zimmermann Simon Grill Wolfgang Holzgreve Prenat Diagn 2008 28 1087ndash1093
Применение ПЦР в NGS
69
Спасибо за внимание
ПЦР
Компоненты ПЦР
ПраймерыОпределяют амплифицируемый участокСлужат laquoзатравкойraquo для синтеза ДНК
dNTP laquoСтроительный материалraquo
KClМоновалентные катион необходим для оптимальной гибридизации праймеров
Tris Поддержание оптимального для ферментативной реакции рН
MgCl2 Бивалентный катион необходим для работы фермента
Полимераза Осуществляет синтез ДНК
Матрица Анализируемый образец ДНК
Буф
ер
Этапы ПЦРПредварительная денатурация
~950C 1-10 мин
25-50 циклов
Денатурация ~950C 10-60 сек
Отжиг 50-700C 10-60 сек
Элонгация 68-720C 10-180 сек
Финальная элонгация
68-720C 7-10 мин
График диссоциации праймера
Cds ndash концентрация гибридизованного праймера
Полимераза
5`-3` полимеразная активность
Полимераза Процессивность Активности
Taq
(Thermus aquaticus)3-5 тпн
5rarr3 полимеразная
5rarr3 экзонуклеазная
Pfu
(Pyrococcus furiosus)1-2 тпн
5rarr3 полимеразная
5rarr3 экзонуклеазная
3rarr5 экзонуклеазная
Tth
(Thermus thermophilus)
3-5 тпн
(800 пн для
ревертазной активности)
5rarr3 полимеразная
5rarr3 экзонуклеазная
5rarr3 ревертазная
Pwo
(Pyrococcus woesei)3 тпн
5rarr3 полимеразная
3rarr5 экзонуклеазная
Полимераза
5`-3` экзонуклеазная активность
3`-5` экзонуклеазная активность
Стадии ПЦР
Амплификаторы
Термостатированиеbull твёрдый термоблок (элемент Пельтье)bull жидкостьbull поток воздуха
Применение ПЦР
Получение материала
bull амплификация ДНК
Получение информации
bull поиск ДНК
Клонирование ДНК и кДНК
Применение ПЦР для диагностики генетических нарушений
RFLP - Restriction Fragment Length Polymorphism
ПДРФ ndash Полиморфизм Длин Рестрикционных Фрагментов
Серповидноклеточная анемия
Применение ПЦР для диагностики генетических нарушений
Болезнь Хантингтона
ДНК-дактилоскопия
Применение ПЦР для диагностики генетических нарушений
Анализ делеций Анализ транслокаций
Разновидности ПЦР
bull Hot-start PCR ndash для повышения специфичности реакции
bull Touch-down PCR ndash для повышения специфичности реакции
bull Allele-specific PCR ndash для выявления однонуклеотидных различий
bull RT-PCR (reverse transcriptase PCR) ndash для амплификации РНК
bull Asymmetric PCR ndash для получения одноцепочечного продукта ДНК
bull Real-time PCR qPCR
bull Inverse PCR ndash если известна небольшая последовательность внутри амплифицируемого участка
bull Nested PCR ndash две последовательные реакции (для повышения чувствительности и специфичности)
bull PCR mutagenesis ndash две направленного внесения замен в последовательность
Allele-specific PCR- анализ однонуклеотидных полиморфизмов
Inverse PCR- исследование фланкирующих областей
Asymmetric PCR- наработка одноцепочечного продукта
Nested PCR- уменьшение числа побочных продуктов реакции
PCR mutagenesis
Сайт-специфический мутагенез
ПЦР для клонирования в вектор
ПЦР в реальном времени(Real-time PCR)
bull одновременная амплификация и измерение количества продукта
bull наличие флюоресцентного красителя в смеси
bull наличие оптического блока в амплификаторе
линейный lg
33
Системы детекции
1 Неспецифичные
ndash интеркалирующие красители (SYBR Green и др)
2 Специфичные
ndash линейные разрушаемые пробы (TaqMan)
ndash laquoмолекулярные маячкиraquo (beacons)
ndash примыкающие пробы
SYBR Green
Метод TaqMan(линейные разрушаемые зонды)
флуоресцентные зонды и гашение флуоресценции
флуоресцентный
краситель
гаситель
флуоресценции
зонд
специфический фрагмент ДНК
FRET ndash Fluorescence Resonance Energy Transfer
FRET ndash Fluorescence Resonance Energy TransferРезонансный перенос энергии флуоресценции
Принцип метода TaqMan
bull 5`-3` экзонуклеазная активность Taq-полимеразы
Принцип метода TaqMan
bull 5`-3` экзонуклеазная активность Taq-полимеразы
Принцип метода TaqMan
bull 5`-3` экзонуклеазная активность Taq-полимеразы
Принцип метода TaqMan
bull 5`-3` экзонуклеазная активность Taq-полимеразы
Принцип метода TaqMan
bull 5`-3` экзонуклеазная активность Taq-полимеразы
Принцип метода TaqMan
bull 5`-3` экзонуклеазная активность Taq-полимеразы
bull нет участка для посадки праймера ndash нет сигнала
Принцип метода TaqMan
bull нет участка для посадки зонда ndash нет сигнала
Принцип метода TaqMan
Линейные разрушаемые пробы(TaqMan = Taq-polymerase + Pac-Man)
laquoМолекулярные маячкиraquo(molecular beacons)
Примыкающие пробы
Флюорофоры и гасители флюоресценции
Представление результатов ПЦР в реальном времени
линейный lg
Денатурация
Плавление после ПЦР
обратная производная
Плавление после ПЦР
Виды ПЦР-анализа
Качественный анализ
Сравнительный анализ
(полуколичественный)
Количественный анализ
есть нет
больше меньше Х раз
лечение
10 000 копий 1000 копий
Количественная ПЦР (qPCR)
bull Подсчёт числа копий генов
bull Анализ представленности транскриптов
bull Оценка инфекционной нагрузки
Количественная ПЦР
серия 10-кратных разведений
threshold ndash пороговая флюоресценцияCt ndash пороговый цикл
Преимущества Real-time PCR
bull возможность как качественной так и количественной оценки исходной матрицы
bull отсутствие манипуляций после проведения ПЦР (электрофорез)
bull большая чувствительность (от единичных копий) и специфичность
bull большой динамический диапазон концентраций (порядка 10^7)
bull возможность постановки Multiplex анализа
1 Научные исследования
ndash амплификация ДНК для гибридизации (блоттинг микрочипы)
ndash амплификация ДНК для секвенирования
ndash клонирование геномной ДНК кДНК
ndash филогенетическое сравнение геномов
ndash генетическое картирование
ndash анализ уровня транскрипции
Применение ПЦР
2 Медицина
ndash генетическое тестирование
ndash типирование тканей (для трансплантации)
ndash тестирование мутаций в онкогенах
ndash диагностика инфекций
3 Судебная медицина
ndash ДНК-дактилоскопия
ndash установление родства
4 Анализ пищевых продуктов детекция ГМО
Применение ПЦР
Применение ПЦР
Залог успеха ПЦР
bull высокая чувствительность
bull высокая специфичность
bull высокая устойчивость
bull низкая стоимость быстрота
Получение информации
bull анализ уровня транскрипции
bull ДНК-диагностика
bull генотипирование
Получение материала
bull клонирование ДНК
bull мутагенез
bull секвенирование
N
N
О
О
Н
Н
Н
N
N
О
О
Н
Н
С
НН
Н
ОН
ОCH2
ОP
О
Оndash
HО
3`
4`
5`
2`
1`
Н
Х
Использование UDG ndash метод борьбы с контаминацией продуктами ПЦР
Тимин
(типичен
для ДНК)
Урацил
(типичен
для РНК)
Х = урацил
дезоксиуридинтрифосфат (dUTP) ndash может быть встроен в
растущую цепь как и dTTP не нарушает комплементарности
N
N
О
О
Н
Н
Н
О-
ОCH2
ОP
О
Оndash
О-
3`
4`
5`
2`
1`
Н
UDG 45-550С
Использование UDG ndash метод борьбы с контаминацией продуктами ПЦР
1) Урацил ДНК-гликозилаза присутствующая в ПЦР-смеси отщепляет урацил от цепи ДНК оставляя тн АР-сайт
О-
ОCH2
ОP
О
Оndash
О-
3`
4`
5`
2`
1`
Н
UDG 45-550С
AP-сайт
1) Урацил ДНК-гликозилаза присутствующая в ПЦР-смеси отщепляет урацил от цепи ДНК оставляя тн АР-сайт
Использование UDG ndash метод борьбы с контаминацией продуктами ПЦР
О-
ОCH2
ОP
О
Оndash
О-
3`
4`
5`
2`
1`
Н
Использование UDG ndash метод борьбы с контаминацией продуктами ПЦР
2) При нагревании до 950С UDG инактивируется а AP-сайты расщепляются в результате урацил-содержащая ДНК попавшая в пробирку до начала ПЦР деградирует3) Проводится обычная ПЦР реакционная смесь очищена от продуктов предыдущей амплификации
Digital PCR (dPCR)
65
R
PM 1ln М ndash среднее количество целевой ДНК на сегмент реакции (на основе
распределения Пуассона)Р ndash доля сегментов содержащих ПЦР-продуктR ndash общее кол-во проанализированных сегментов
Лимитирующие факторы dPCR
bull Количество сегментов реакции
bull Концентрация целевой ДНК в анализируемом образце
bull Реакционный объѐм
Коммерчески доступные системы реализующие dPCR
66
Fluidigm - технология микрофлюидных чипов
Bio-Rad (QuantaLife) -dPCR в суспензии
(Digital Droplet PCR)
Life Technologies
dPCR в платах OpenArrayreg
Подготовка образцов
(смешивание ДНК и ПЦР-реагентов)
Создание капель (Droplet Generator)
АмплификацияРегистрация и
анализ результатов
Digital droplet PCR (ddPCR)
bull QX100 Droplet Digital PCR System
Сравнение с Real-Time PCR
68
Digital PCR a powerful new tool for noninvasive prenatal diagnosis Bernhard G Zimmermann Simon Grill Wolfgang Holzgreve Prenat Diagn 2008 28 1087ndash1093
Применение ПЦР в NGS
69
Спасибо за внимание
Компоненты ПЦР
ПраймерыОпределяют амплифицируемый участокСлужат laquoзатравкойraquo для синтеза ДНК
dNTP laquoСтроительный материалraquo
KClМоновалентные катион необходим для оптимальной гибридизации праймеров
Tris Поддержание оптимального для ферментативной реакции рН
MgCl2 Бивалентный катион необходим для работы фермента
Полимераза Осуществляет синтез ДНК
Матрица Анализируемый образец ДНК
Буф
ер
Этапы ПЦРПредварительная денатурация
~950C 1-10 мин
25-50 циклов
Денатурация ~950C 10-60 сек
Отжиг 50-700C 10-60 сек
Элонгация 68-720C 10-180 сек
Финальная элонгация
68-720C 7-10 мин
График диссоциации праймера
Cds ndash концентрация гибридизованного праймера
Полимераза
5`-3` полимеразная активность
Полимераза Процессивность Активности
Taq
(Thermus aquaticus)3-5 тпн
5rarr3 полимеразная
5rarr3 экзонуклеазная
Pfu
(Pyrococcus furiosus)1-2 тпн
5rarr3 полимеразная
5rarr3 экзонуклеазная
3rarr5 экзонуклеазная
Tth
(Thermus thermophilus)
3-5 тпн
(800 пн для
ревертазной активности)
5rarr3 полимеразная
5rarr3 экзонуклеазная
5rarr3 ревертазная
Pwo
(Pyrococcus woesei)3 тпн
5rarr3 полимеразная
3rarr5 экзонуклеазная
Полимераза
5`-3` экзонуклеазная активность
3`-5` экзонуклеазная активность
Стадии ПЦР
Амплификаторы
Термостатированиеbull твёрдый термоблок (элемент Пельтье)bull жидкостьbull поток воздуха
Применение ПЦР
Получение материала
bull амплификация ДНК
Получение информации
bull поиск ДНК
Клонирование ДНК и кДНК
Применение ПЦР для диагностики генетических нарушений
RFLP - Restriction Fragment Length Polymorphism
ПДРФ ndash Полиморфизм Длин Рестрикционных Фрагментов
Серповидноклеточная анемия
Применение ПЦР для диагностики генетических нарушений
Болезнь Хантингтона
ДНК-дактилоскопия
Применение ПЦР для диагностики генетических нарушений
Анализ делеций Анализ транслокаций
Разновидности ПЦР
bull Hot-start PCR ndash для повышения специфичности реакции
bull Touch-down PCR ndash для повышения специфичности реакции
bull Allele-specific PCR ndash для выявления однонуклеотидных различий
bull RT-PCR (reverse transcriptase PCR) ndash для амплификации РНК
bull Asymmetric PCR ndash для получения одноцепочечного продукта ДНК
bull Real-time PCR qPCR
bull Inverse PCR ndash если известна небольшая последовательность внутри амплифицируемого участка
bull Nested PCR ndash две последовательные реакции (для повышения чувствительности и специфичности)
bull PCR mutagenesis ndash две направленного внесения замен в последовательность
Allele-specific PCR- анализ однонуклеотидных полиморфизмов
Inverse PCR- исследование фланкирующих областей
Asymmetric PCR- наработка одноцепочечного продукта
Nested PCR- уменьшение числа побочных продуктов реакции
PCR mutagenesis
Сайт-специфический мутагенез
ПЦР для клонирования в вектор
ПЦР в реальном времени(Real-time PCR)
bull одновременная амплификация и измерение количества продукта
bull наличие флюоресцентного красителя в смеси
bull наличие оптического блока в амплификаторе
линейный lg
33
Системы детекции
1 Неспецифичные
ndash интеркалирующие красители (SYBR Green и др)
2 Специфичные
ndash линейные разрушаемые пробы (TaqMan)
ndash laquoмолекулярные маячкиraquo (beacons)
ndash примыкающие пробы
SYBR Green
Метод TaqMan(линейные разрушаемые зонды)
флуоресцентные зонды и гашение флуоресценции
флуоресцентный
краситель
гаситель
флуоресценции
зонд
специфический фрагмент ДНК
FRET ndash Fluorescence Resonance Energy Transfer
FRET ndash Fluorescence Resonance Energy TransferРезонансный перенос энергии флуоресценции
Принцип метода TaqMan
bull 5`-3` экзонуклеазная активность Taq-полимеразы
Принцип метода TaqMan
bull 5`-3` экзонуклеазная активность Taq-полимеразы
Принцип метода TaqMan
bull 5`-3` экзонуклеазная активность Taq-полимеразы
Принцип метода TaqMan
bull 5`-3` экзонуклеазная активность Taq-полимеразы
Принцип метода TaqMan
bull 5`-3` экзонуклеазная активность Taq-полимеразы
Принцип метода TaqMan
bull 5`-3` экзонуклеазная активность Taq-полимеразы
bull нет участка для посадки праймера ndash нет сигнала
Принцип метода TaqMan
bull нет участка для посадки зонда ndash нет сигнала
Принцип метода TaqMan
Линейные разрушаемые пробы(TaqMan = Taq-polymerase + Pac-Man)
laquoМолекулярные маячкиraquo(molecular beacons)
Примыкающие пробы
Флюорофоры и гасители флюоресценции
Представление результатов ПЦР в реальном времени
линейный lg
Денатурация
Плавление после ПЦР
обратная производная
Плавление после ПЦР
Виды ПЦР-анализа
Качественный анализ
Сравнительный анализ
(полуколичественный)
Количественный анализ
есть нет
больше меньше Х раз
лечение
10 000 копий 1000 копий
Количественная ПЦР (qPCR)
bull Подсчёт числа копий генов
bull Анализ представленности транскриптов
bull Оценка инфекционной нагрузки
Количественная ПЦР
серия 10-кратных разведений
threshold ndash пороговая флюоресценцияCt ndash пороговый цикл
Преимущества Real-time PCR
bull возможность как качественной так и количественной оценки исходной матрицы
bull отсутствие манипуляций после проведения ПЦР (электрофорез)
bull большая чувствительность (от единичных копий) и специфичность
bull большой динамический диапазон концентраций (порядка 10^7)
bull возможность постановки Multiplex анализа
1 Научные исследования
ndash амплификация ДНК для гибридизации (блоттинг микрочипы)
ndash амплификация ДНК для секвенирования
ndash клонирование геномной ДНК кДНК
ndash филогенетическое сравнение геномов
ndash генетическое картирование
ndash анализ уровня транскрипции
Применение ПЦР
2 Медицина
ndash генетическое тестирование
ndash типирование тканей (для трансплантации)
ndash тестирование мутаций в онкогенах
ndash диагностика инфекций
3 Судебная медицина
ndash ДНК-дактилоскопия
ndash установление родства
4 Анализ пищевых продуктов детекция ГМО
Применение ПЦР
Применение ПЦР
Залог успеха ПЦР
bull высокая чувствительность
bull высокая специфичность
bull высокая устойчивость
bull низкая стоимость быстрота
Получение информации
bull анализ уровня транскрипции
bull ДНК-диагностика
bull генотипирование
Получение материала
bull клонирование ДНК
bull мутагенез
bull секвенирование
N
N
О
О
Н
Н
Н
N
N
О
О
Н
Н
С
НН
Н
ОН
ОCH2
ОP
О
Оndash
HО
3`
4`
5`
2`
1`
Н
Х
Использование UDG ndash метод борьбы с контаминацией продуктами ПЦР
Тимин
(типичен
для ДНК)
Урацил
(типичен
для РНК)
Х = урацил
дезоксиуридинтрифосфат (dUTP) ndash может быть встроен в
растущую цепь как и dTTP не нарушает комплементарности
N
N
О
О
Н
Н
Н
О-
ОCH2
ОP
О
Оndash
О-
3`
4`
5`
2`
1`
Н
UDG 45-550С
Использование UDG ndash метод борьбы с контаминацией продуктами ПЦР
1) Урацил ДНК-гликозилаза присутствующая в ПЦР-смеси отщепляет урацил от цепи ДНК оставляя тн АР-сайт
О-
ОCH2
ОP
О
Оndash
О-
3`
4`
5`
2`
1`
Н
UDG 45-550С
AP-сайт
1) Урацил ДНК-гликозилаза присутствующая в ПЦР-смеси отщепляет урацил от цепи ДНК оставляя тн АР-сайт
Использование UDG ndash метод борьбы с контаминацией продуктами ПЦР
О-
ОCH2
ОP
О
Оndash
О-
3`
4`
5`
2`
1`
Н
Использование UDG ndash метод борьбы с контаминацией продуктами ПЦР
2) При нагревании до 950С UDG инактивируется а AP-сайты расщепляются в результате урацил-содержащая ДНК попавшая в пробирку до начала ПЦР деградирует3) Проводится обычная ПЦР реакционная смесь очищена от продуктов предыдущей амплификации
Digital PCR (dPCR)
65
R
PM 1ln М ndash среднее количество целевой ДНК на сегмент реакции (на основе
распределения Пуассона)Р ndash доля сегментов содержащих ПЦР-продуктR ndash общее кол-во проанализированных сегментов
Лимитирующие факторы dPCR
bull Количество сегментов реакции
bull Концентрация целевой ДНК в анализируемом образце
bull Реакционный объѐм
Коммерчески доступные системы реализующие dPCR
66
Fluidigm - технология микрофлюидных чипов
Bio-Rad (QuantaLife) -dPCR в суспензии
(Digital Droplet PCR)
Life Technologies
dPCR в платах OpenArrayreg
Подготовка образцов
(смешивание ДНК и ПЦР-реагентов)
Создание капель (Droplet Generator)
АмплификацияРегистрация и
анализ результатов
Digital droplet PCR (ddPCR)
bull QX100 Droplet Digital PCR System
Сравнение с Real-Time PCR
68
Digital PCR a powerful new tool for noninvasive prenatal diagnosis Bernhard G Zimmermann Simon Grill Wolfgang Holzgreve Prenat Diagn 2008 28 1087ndash1093
Применение ПЦР в NGS
69
Спасибо за внимание
Этапы ПЦРПредварительная денатурация
~950C 1-10 мин
25-50 циклов
Денатурация ~950C 10-60 сек
Отжиг 50-700C 10-60 сек
Элонгация 68-720C 10-180 сек
Финальная элонгация
68-720C 7-10 мин
График диссоциации праймера
Cds ndash концентрация гибридизованного праймера
Полимераза
5`-3` полимеразная активность
Полимераза Процессивность Активности
Taq
(Thermus aquaticus)3-5 тпн
5rarr3 полимеразная
5rarr3 экзонуклеазная
Pfu
(Pyrococcus furiosus)1-2 тпн
5rarr3 полимеразная
5rarr3 экзонуклеазная
3rarr5 экзонуклеазная
Tth
(Thermus thermophilus)
3-5 тпн
(800 пн для
ревертазной активности)
5rarr3 полимеразная
5rarr3 экзонуклеазная
5rarr3 ревертазная
Pwo
(Pyrococcus woesei)3 тпн
5rarr3 полимеразная
3rarr5 экзонуклеазная
Полимераза
5`-3` экзонуклеазная активность
3`-5` экзонуклеазная активность
Стадии ПЦР
Амплификаторы
Термостатированиеbull твёрдый термоблок (элемент Пельтье)bull жидкостьbull поток воздуха
Применение ПЦР
Получение материала
bull амплификация ДНК
Получение информации
bull поиск ДНК
Клонирование ДНК и кДНК
Применение ПЦР для диагностики генетических нарушений
RFLP - Restriction Fragment Length Polymorphism
ПДРФ ndash Полиморфизм Длин Рестрикционных Фрагментов
Серповидноклеточная анемия
Применение ПЦР для диагностики генетических нарушений
Болезнь Хантингтона
ДНК-дактилоскопия
Применение ПЦР для диагностики генетических нарушений
Анализ делеций Анализ транслокаций
Разновидности ПЦР
bull Hot-start PCR ndash для повышения специфичности реакции
bull Touch-down PCR ndash для повышения специфичности реакции
bull Allele-specific PCR ndash для выявления однонуклеотидных различий
bull RT-PCR (reverse transcriptase PCR) ndash для амплификации РНК
bull Asymmetric PCR ndash для получения одноцепочечного продукта ДНК
bull Real-time PCR qPCR
bull Inverse PCR ndash если известна небольшая последовательность внутри амплифицируемого участка
bull Nested PCR ndash две последовательные реакции (для повышения чувствительности и специфичности)
bull PCR mutagenesis ndash две направленного внесения замен в последовательность
Allele-specific PCR- анализ однонуклеотидных полиморфизмов
Inverse PCR- исследование фланкирующих областей
Asymmetric PCR- наработка одноцепочечного продукта
Nested PCR- уменьшение числа побочных продуктов реакции
PCR mutagenesis
Сайт-специфический мутагенез
ПЦР для клонирования в вектор
ПЦР в реальном времени(Real-time PCR)
bull одновременная амплификация и измерение количества продукта
bull наличие флюоресцентного красителя в смеси
bull наличие оптического блока в амплификаторе
линейный lg
33
Системы детекции
1 Неспецифичные
ndash интеркалирующие красители (SYBR Green и др)
2 Специфичные
ndash линейные разрушаемые пробы (TaqMan)
ndash laquoмолекулярные маячкиraquo (beacons)
ndash примыкающие пробы
SYBR Green
Метод TaqMan(линейные разрушаемые зонды)
флуоресцентные зонды и гашение флуоресценции
флуоресцентный
краситель
гаситель
флуоресценции
зонд
специфический фрагмент ДНК
FRET ndash Fluorescence Resonance Energy Transfer
FRET ndash Fluorescence Resonance Energy TransferРезонансный перенос энергии флуоресценции
Принцип метода TaqMan
bull 5`-3` экзонуклеазная активность Taq-полимеразы
Принцип метода TaqMan
bull 5`-3` экзонуклеазная активность Taq-полимеразы
Принцип метода TaqMan
bull 5`-3` экзонуклеазная активность Taq-полимеразы
Принцип метода TaqMan
bull 5`-3` экзонуклеазная активность Taq-полимеразы
Принцип метода TaqMan
bull 5`-3` экзонуклеазная активность Taq-полимеразы
Принцип метода TaqMan
bull 5`-3` экзонуклеазная активность Taq-полимеразы
bull нет участка для посадки праймера ndash нет сигнала
Принцип метода TaqMan
bull нет участка для посадки зонда ndash нет сигнала
Принцип метода TaqMan
Линейные разрушаемые пробы(TaqMan = Taq-polymerase + Pac-Man)
laquoМолекулярные маячкиraquo(molecular beacons)
Примыкающие пробы
Флюорофоры и гасители флюоресценции
Представление результатов ПЦР в реальном времени
линейный lg
Денатурация
Плавление после ПЦР
обратная производная
Плавление после ПЦР
Виды ПЦР-анализа
Качественный анализ
Сравнительный анализ
(полуколичественный)
Количественный анализ
есть нет
больше меньше Х раз
лечение
10 000 копий 1000 копий
Количественная ПЦР (qPCR)
bull Подсчёт числа копий генов
bull Анализ представленности транскриптов
bull Оценка инфекционной нагрузки
Количественная ПЦР
серия 10-кратных разведений
threshold ndash пороговая флюоресценцияCt ndash пороговый цикл
Преимущества Real-time PCR
bull возможность как качественной так и количественной оценки исходной матрицы
bull отсутствие манипуляций после проведения ПЦР (электрофорез)
bull большая чувствительность (от единичных копий) и специфичность
bull большой динамический диапазон концентраций (порядка 10^7)
bull возможность постановки Multiplex анализа
1 Научные исследования
ndash амплификация ДНК для гибридизации (блоттинг микрочипы)
ndash амплификация ДНК для секвенирования
ndash клонирование геномной ДНК кДНК
ndash филогенетическое сравнение геномов
ndash генетическое картирование
ndash анализ уровня транскрипции
Применение ПЦР
2 Медицина
ndash генетическое тестирование
ndash типирование тканей (для трансплантации)
ndash тестирование мутаций в онкогенах
ndash диагностика инфекций
3 Судебная медицина
ndash ДНК-дактилоскопия
ndash установление родства
4 Анализ пищевых продуктов детекция ГМО
Применение ПЦР
Применение ПЦР
Залог успеха ПЦР
bull высокая чувствительность
bull высокая специфичность
bull высокая устойчивость
bull низкая стоимость быстрота
Получение информации
bull анализ уровня транскрипции
bull ДНК-диагностика
bull генотипирование
Получение материала
bull клонирование ДНК
bull мутагенез
bull секвенирование
N
N
О
О
Н
Н
Н
N
N
О
О
Н
Н
С
НН
Н
ОН
ОCH2
ОP
О
Оndash
HО
3`
4`
5`
2`
1`
Н
Х
Использование UDG ndash метод борьбы с контаминацией продуктами ПЦР
Тимин
(типичен
для ДНК)
Урацил
(типичен
для РНК)
Х = урацил
дезоксиуридинтрифосфат (dUTP) ndash может быть встроен в
растущую цепь как и dTTP не нарушает комплементарности
N
N
О
О
Н
Н
Н
О-
ОCH2
ОP
О
Оndash
О-
3`
4`
5`
2`
1`
Н
UDG 45-550С
Использование UDG ndash метод борьбы с контаминацией продуктами ПЦР
1) Урацил ДНК-гликозилаза присутствующая в ПЦР-смеси отщепляет урацил от цепи ДНК оставляя тн АР-сайт
О-
ОCH2
ОP
О
Оndash
О-
3`
4`
5`
2`
1`
Н
UDG 45-550С
AP-сайт
1) Урацил ДНК-гликозилаза присутствующая в ПЦР-смеси отщепляет урацил от цепи ДНК оставляя тн АР-сайт
Использование UDG ndash метод борьбы с контаминацией продуктами ПЦР
О-
ОCH2
ОP
О
Оndash
О-
3`
4`
5`
2`
1`
Н
Использование UDG ndash метод борьбы с контаминацией продуктами ПЦР
2) При нагревании до 950С UDG инактивируется а AP-сайты расщепляются в результате урацил-содержащая ДНК попавшая в пробирку до начала ПЦР деградирует3) Проводится обычная ПЦР реакционная смесь очищена от продуктов предыдущей амплификации
Digital PCR (dPCR)
65
R
PM 1ln М ndash среднее количество целевой ДНК на сегмент реакции (на основе
распределения Пуассона)Р ndash доля сегментов содержащих ПЦР-продуктR ndash общее кол-во проанализированных сегментов
Лимитирующие факторы dPCR
bull Количество сегментов реакции
bull Концентрация целевой ДНК в анализируемом образце
bull Реакционный объѐм
Коммерчески доступные системы реализующие dPCR
66
Fluidigm - технология микрофлюидных чипов
Bio-Rad (QuantaLife) -dPCR в суспензии
(Digital Droplet PCR)
Life Technologies
dPCR в платах OpenArrayreg
Подготовка образцов
(смешивание ДНК и ПЦР-реагентов)
Создание капель (Droplet Generator)
АмплификацияРегистрация и
анализ результатов
Digital droplet PCR (ddPCR)
bull QX100 Droplet Digital PCR System
Сравнение с Real-Time PCR
68
Digital PCR a powerful new tool for noninvasive prenatal diagnosis Bernhard G Zimmermann Simon Grill Wolfgang Holzgreve Prenat Diagn 2008 28 1087ndash1093
Применение ПЦР в NGS
69
Спасибо за внимание
Полимераза
5`-3` полимеразная активность
Полимераза Процессивность Активности
Taq
(Thermus aquaticus)3-5 тпн
5rarr3 полимеразная
5rarr3 экзонуклеазная
Pfu
(Pyrococcus furiosus)1-2 тпн
5rarr3 полимеразная
5rarr3 экзонуклеазная
3rarr5 экзонуклеазная
Tth
(Thermus thermophilus)
3-5 тпн
(800 пн для
ревертазной активности)
5rarr3 полимеразная
5rarr3 экзонуклеазная
5rarr3 ревертазная
Pwo
(Pyrococcus woesei)3 тпн
5rarr3 полимеразная
3rarr5 экзонуклеазная
Полимераза
5`-3` экзонуклеазная активность
3`-5` экзонуклеазная активность
Стадии ПЦР
Амплификаторы
Термостатированиеbull твёрдый термоблок (элемент Пельтье)bull жидкостьbull поток воздуха
Применение ПЦР
Получение материала
bull амплификация ДНК
Получение информации
bull поиск ДНК
Клонирование ДНК и кДНК
Применение ПЦР для диагностики генетических нарушений
RFLP - Restriction Fragment Length Polymorphism
ПДРФ ndash Полиморфизм Длин Рестрикционных Фрагментов
Серповидноклеточная анемия
Применение ПЦР для диагностики генетических нарушений
Болезнь Хантингтона
ДНК-дактилоскопия
Применение ПЦР для диагностики генетических нарушений
Анализ делеций Анализ транслокаций
Разновидности ПЦР
bull Hot-start PCR ndash для повышения специфичности реакции
bull Touch-down PCR ndash для повышения специфичности реакции
bull Allele-specific PCR ndash для выявления однонуклеотидных различий
bull RT-PCR (reverse transcriptase PCR) ndash для амплификации РНК
bull Asymmetric PCR ndash для получения одноцепочечного продукта ДНК
bull Real-time PCR qPCR
bull Inverse PCR ndash если известна небольшая последовательность внутри амплифицируемого участка
bull Nested PCR ndash две последовательные реакции (для повышения чувствительности и специфичности)
bull PCR mutagenesis ndash две направленного внесения замен в последовательность
Allele-specific PCR- анализ однонуклеотидных полиморфизмов
Inverse PCR- исследование фланкирующих областей
Asymmetric PCR- наработка одноцепочечного продукта
Nested PCR- уменьшение числа побочных продуктов реакции
PCR mutagenesis
Сайт-специфический мутагенез
ПЦР для клонирования в вектор
ПЦР в реальном времени(Real-time PCR)
bull одновременная амплификация и измерение количества продукта
bull наличие флюоресцентного красителя в смеси
bull наличие оптического блока в амплификаторе
линейный lg
33
Системы детекции
1 Неспецифичные
ndash интеркалирующие красители (SYBR Green и др)
2 Специфичные
ndash линейные разрушаемые пробы (TaqMan)
ndash laquoмолекулярные маячкиraquo (beacons)
ndash примыкающие пробы
SYBR Green
Метод TaqMan(линейные разрушаемые зонды)
флуоресцентные зонды и гашение флуоресценции
флуоресцентный
краситель
гаситель
флуоресценции
зонд
специфический фрагмент ДНК
FRET ndash Fluorescence Resonance Energy Transfer
FRET ndash Fluorescence Resonance Energy TransferРезонансный перенос энергии флуоресценции
Принцип метода TaqMan
bull 5`-3` экзонуклеазная активность Taq-полимеразы
Принцип метода TaqMan
bull 5`-3` экзонуклеазная активность Taq-полимеразы
Принцип метода TaqMan
bull 5`-3` экзонуклеазная активность Taq-полимеразы
Принцип метода TaqMan
bull 5`-3` экзонуклеазная активность Taq-полимеразы
Принцип метода TaqMan
bull 5`-3` экзонуклеазная активность Taq-полимеразы
Принцип метода TaqMan
bull 5`-3` экзонуклеазная активность Taq-полимеразы
bull нет участка для посадки праймера ndash нет сигнала
Принцип метода TaqMan
bull нет участка для посадки зонда ndash нет сигнала
Принцип метода TaqMan
Линейные разрушаемые пробы(TaqMan = Taq-polymerase + Pac-Man)
laquoМолекулярные маячкиraquo(molecular beacons)
Примыкающие пробы
Флюорофоры и гасители флюоресценции
Представление результатов ПЦР в реальном времени
линейный lg
Денатурация
Плавление после ПЦР
обратная производная
Плавление после ПЦР
Виды ПЦР-анализа
Качественный анализ
Сравнительный анализ
(полуколичественный)
Количественный анализ
есть нет
больше меньше Х раз
лечение
10 000 копий 1000 копий
Количественная ПЦР (qPCR)
bull Подсчёт числа копий генов
bull Анализ представленности транскриптов
bull Оценка инфекционной нагрузки
Количественная ПЦР
серия 10-кратных разведений
threshold ndash пороговая флюоресценцияCt ndash пороговый цикл
Преимущества Real-time PCR
bull возможность как качественной так и количественной оценки исходной матрицы
bull отсутствие манипуляций после проведения ПЦР (электрофорез)
bull большая чувствительность (от единичных копий) и специфичность
bull большой динамический диапазон концентраций (порядка 10^7)
bull возможность постановки Multiplex анализа
1 Научные исследования
ndash амплификация ДНК для гибридизации (блоттинг микрочипы)
ndash амплификация ДНК для секвенирования
ndash клонирование геномной ДНК кДНК
ndash филогенетическое сравнение геномов
ndash генетическое картирование
ndash анализ уровня транскрипции
Применение ПЦР
2 Медицина
ndash генетическое тестирование
ndash типирование тканей (для трансплантации)
ndash тестирование мутаций в онкогенах
ndash диагностика инфекций
3 Судебная медицина
ndash ДНК-дактилоскопия
ndash установление родства
4 Анализ пищевых продуктов детекция ГМО
Применение ПЦР
Применение ПЦР
Залог успеха ПЦР
bull высокая чувствительность
bull высокая специфичность
bull высокая устойчивость
bull низкая стоимость быстрота
Получение информации
bull анализ уровня транскрипции
bull ДНК-диагностика
bull генотипирование
Получение материала
bull клонирование ДНК
bull мутагенез
bull секвенирование
N
N
О
О
Н
Н
Н
N
N
О
О
Н
Н
С
НН
Н
ОН
ОCH2
ОP
О
Оndash
HО
3`
4`
5`
2`
1`
Н
Х
Использование UDG ndash метод борьбы с контаминацией продуктами ПЦР
Тимин
(типичен
для ДНК)
Урацил
(типичен
для РНК)
Х = урацил
дезоксиуридинтрифосфат (dUTP) ndash может быть встроен в
растущую цепь как и dTTP не нарушает комплементарности
N
N
О
О
Н
Н
Н
О-
ОCH2
ОP
О
Оndash
О-
3`
4`
5`
2`
1`
Н
UDG 45-550С
Использование UDG ndash метод борьбы с контаминацией продуктами ПЦР
1) Урацил ДНК-гликозилаза присутствующая в ПЦР-смеси отщепляет урацил от цепи ДНК оставляя тн АР-сайт
О-
ОCH2
ОP
О
Оndash
О-
3`
4`
5`
2`
1`
Н
UDG 45-550С
AP-сайт
1) Урацил ДНК-гликозилаза присутствующая в ПЦР-смеси отщепляет урацил от цепи ДНК оставляя тн АР-сайт
Использование UDG ndash метод борьбы с контаминацией продуктами ПЦР
О-
ОCH2
ОP
О
Оndash
О-
3`
4`
5`
2`
1`
Н
Использование UDG ndash метод борьбы с контаминацией продуктами ПЦР
2) При нагревании до 950С UDG инактивируется а AP-сайты расщепляются в результате урацил-содержащая ДНК попавшая в пробирку до начала ПЦР деградирует3) Проводится обычная ПЦР реакционная смесь очищена от продуктов предыдущей амплификации
Digital PCR (dPCR)
65
R
PM 1ln М ndash среднее количество целевой ДНК на сегмент реакции (на основе
распределения Пуассона)Р ndash доля сегментов содержащих ПЦР-продуктR ndash общее кол-во проанализированных сегментов
Лимитирующие факторы dPCR
bull Количество сегментов реакции
bull Концентрация целевой ДНК в анализируемом образце
bull Реакционный объѐм
Коммерчески доступные системы реализующие dPCR
66
Fluidigm - технология микрофлюидных чипов
Bio-Rad (QuantaLife) -dPCR в суспензии
(Digital Droplet PCR)
Life Technologies
dPCR в платах OpenArrayreg
Подготовка образцов
(смешивание ДНК и ПЦР-реагентов)
Создание капель (Droplet Generator)
АмплификацияРегистрация и
анализ результатов
Digital droplet PCR (ddPCR)
bull QX100 Droplet Digital PCR System
Сравнение с Real-Time PCR
68
Digital PCR a powerful new tool for noninvasive prenatal diagnosis Bernhard G Zimmermann Simon Grill Wolfgang Holzgreve Prenat Diagn 2008 28 1087ndash1093
Применение ПЦР в NGS
69
Спасибо за внимание
Полимераза
5`-3` экзонуклеазная активность
3`-5` экзонуклеазная активность
Стадии ПЦР
Амплификаторы
Термостатированиеbull твёрдый термоблок (элемент Пельтье)bull жидкостьbull поток воздуха
Применение ПЦР
Получение материала
bull амплификация ДНК
Получение информации
bull поиск ДНК
Клонирование ДНК и кДНК
Применение ПЦР для диагностики генетических нарушений
RFLP - Restriction Fragment Length Polymorphism
ПДРФ ndash Полиморфизм Длин Рестрикционных Фрагментов
Серповидноклеточная анемия
Применение ПЦР для диагностики генетических нарушений
Болезнь Хантингтона
ДНК-дактилоскопия
Применение ПЦР для диагностики генетических нарушений
Анализ делеций Анализ транслокаций
Разновидности ПЦР
bull Hot-start PCR ndash для повышения специфичности реакции
bull Touch-down PCR ndash для повышения специфичности реакции
bull Allele-specific PCR ndash для выявления однонуклеотидных различий
bull RT-PCR (reverse transcriptase PCR) ndash для амплификации РНК
bull Asymmetric PCR ndash для получения одноцепочечного продукта ДНК
bull Real-time PCR qPCR
bull Inverse PCR ndash если известна небольшая последовательность внутри амплифицируемого участка
bull Nested PCR ndash две последовательные реакции (для повышения чувствительности и специфичности)
bull PCR mutagenesis ndash две направленного внесения замен в последовательность
Allele-specific PCR- анализ однонуклеотидных полиморфизмов
Inverse PCR- исследование фланкирующих областей
Asymmetric PCR- наработка одноцепочечного продукта
Nested PCR- уменьшение числа побочных продуктов реакции
PCR mutagenesis
Сайт-специфический мутагенез
ПЦР для клонирования в вектор
ПЦР в реальном времени(Real-time PCR)
bull одновременная амплификация и измерение количества продукта
bull наличие флюоресцентного красителя в смеси
bull наличие оптического блока в амплификаторе
линейный lg
33
Системы детекции
1 Неспецифичные
ndash интеркалирующие красители (SYBR Green и др)
2 Специфичные
ndash линейные разрушаемые пробы (TaqMan)
ndash laquoмолекулярные маячкиraquo (beacons)
ndash примыкающие пробы
SYBR Green
Метод TaqMan(линейные разрушаемые зонды)
флуоресцентные зонды и гашение флуоресценции
флуоресцентный
краситель
гаситель
флуоресценции
зонд
специфический фрагмент ДНК
FRET ndash Fluorescence Resonance Energy Transfer
FRET ndash Fluorescence Resonance Energy TransferРезонансный перенос энергии флуоресценции
Принцип метода TaqMan
bull 5`-3` экзонуклеазная активность Taq-полимеразы
Принцип метода TaqMan
bull 5`-3` экзонуклеазная активность Taq-полимеразы
Принцип метода TaqMan
bull 5`-3` экзонуклеазная активность Taq-полимеразы
Принцип метода TaqMan
bull 5`-3` экзонуклеазная активность Taq-полимеразы
Принцип метода TaqMan
bull 5`-3` экзонуклеазная активность Taq-полимеразы
Принцип метода TaqMan
bull 5`-3` экзонуклеазная активность Taq-полимеразы
bull нет участка для посадки праймера ndash нет сигнала
Принцип метода TaqMan
bull нет участка для посадки зонда ndash нет сигнала
Принцип метода TaqMan
Линейные разрушаемые пробы(TaqMan = Taq-polymerase + Pac-Man)
laquoМолекулярные маячкиraquo(molecular beacons)
Примыкающие пробы
Флюорофоры и гасители флюоресценции
Представление результатов ПЦР в реальном времени
линейный lg
Денатурация
Плавление после ПЦР
обратная производная
Плавление после ПЦР
Виды ПЦР-анализа
Качественный анализ
Сравнительный анализ
(полуколичественный)
Количественный анализ
есть нет
больше меньше Х раз
лечение
10 000 копий 1000 копий
Количественная ПЦР (qPCR)
bull Подсчёт числа копий генов
bull Анализ представленности транскриптов
bull Оценка инфекционной нагрузки
Количественная ПЦР
серия 10-кратных разведений
threshold ndash пороговая флюоресценцияCt ndash пороговый цикл
Преимущества Real-time PCR
bull возможность как качественной так и количественной оценки исходной матрицы
bull отсутствие манипуляций после проведения ПЦР (электрофорез)
bull большая чувствительность (от единичных копий) и специфичность
bull большой динамический диапазон концентраций (порядка 10^7)
bull возможность постановки Multiplex анализа
1 Научные исследования
ndash амплификация ДНК для гибридизации (блоттинг микрочипы)
ndash амплификация ДНК для секвенирования
ndash клонирование геномной ДНК кДНК
ndash филогенетическое сравнение геномов
ndash генетическое картирование
ndash анализ уровня транскрипции
Применение ПЦР
2 Медицина
ndash генетическое тестирование
ndash типирование тканей (для трансплантации)
ndash тестирование мутаций в онкогенах
ndash диагностика инфекций
3 Судебная медицина
ndash ДНК-дактилоскопия
ndash установление родства
4 Анализ пищевых продуктов детекция ГМО
Применение ПЦР
Применение ПЦР
Залог успеха ПЦР
bull высокая чувствительность
bull высокая специфичность
bull высокая устойчивость
bull низкая стоимость быстрота
Получение информации
bull анализ уровня транскрипции
bull ДНК-диагностика
bull генотипирование
Получение материала
bull клонирование ДНК
bull мутагенез
bull секвенирование
N
N
О
О
Н
Н
Н
N
N
О
О
Н
Н
С
НН
Н
ОН
ОCH2
ОP
О
Оndash
HО
3`
4`
5`
2`
1`
Н
Х
Использование UDG ndash метод борьбы с контаминацией продуктами ПЦР
Тимин
(типичен
для ДНК)
Урацил
(типичен
для РНК)
Х = урацил
дезоксиуридинтрифосфат (dUTP) ndash может быть встроен в
растущую цепь как и dTTP не нарушает комплементарности
N
N
О
О
Н
Н
Н
О-
ОCH2
ОP
О
Оndash
О-
3`
4`
5`
2`
1`
Н
UDG 45-550С
Использование UDG ndash метод борьбы с контаминацией продуктами ПЦР
1) Урацил ДНК-гликозилаза присутствующая в ПЦР-смеси отщепляет урацил от цепи ДНК оставляя тн АР-сайт
О-
ОCH2
ОP
О
Оndash
О-
3`
4`
5`
2`
1`
Н
UDG 45-550С
AP-сайт
1) Урацил ДНК-гликозилаза присутствующая в ПЦР-смеси отщепляет урацил от цепи ДНК оставляя тн АР-сайт
Использование UDG ndash метод борьбы с контаминацией продуктами ПЦР
О-
ОCH2
ОP
О
Оndash
О-
3`
4`
5`
2`
1`
Н
Использование UDG ndash метод борьбы с контаминацией продуктами ПЦР
2) При нагревании до 950С UDG инактивируется а AP-сайты расщепляются в результате урацил-содержащая ДНК попавшая в пробирку до начала ПЦР деградирует3) Проводится обычная ПЦР реакционная смесь очищена от продуктов предыдущей амплификации
Digital PCR (dPCR)
65
R
PM 1ln М ndash среднее количество целевой ДНК на сегмент реакции (на основе
распределения Пуассона)Р ndash доля сегментов содержащих ПЦР-продуктR ndash общее кол-во проанализированных сегментов
Лимитирующие факторы dPCR
bull Количество сегментов реакции
bull Концентрация целевой ДНК в анализируемом образце
bull Реакционный объѐм
Коммерчески доступные системы реализующие dPCR
66
Fluidigm - технология микрофлюидных чипов
Bio-Rad (QuantaLife) -dPCR в суспензии
(Digital Droplet PCR)
Life Technologies
dPCR в платах OpenArrayreg
Подготовка образцов
(смешивание ДНК и ПЦР-реагентов)
Создание капель (Droplet Generator)
АмплификацияРегистрация и
анализ результатов
Digital droplet PCR (ddPCR)
bull QX100 Droplet Digital PCR System
Сравнение с Real-Time PCR
68
Digital PCR a powerful new tool for noninvasive prenatal diagnosis Bernhard G Zimmermann Simon Grill Wolfgang Holzgreve Prenat Diagn 2008 28 1087ndash1093
Применение ПЦР в NGS
69
Спасибо за внимание
Стадии ПЦР
Амплификаторы
Термостатированиеbull твёрдый термоблок (элемент Пельтье)bull жидкостьbull поток воздуха
Применение ПЦР
Получение материала
bull амплификация ДНК
Получение информации
bull поиск ДНК
Клонирование ДНК и кДНК
Применение ПЦР для диагностики генетических нарушений
RFLP - Restriction Fragment Length Polymorphism
ПДРФ ndash Полиморфизм Длин Рестрикционных Фрагментов
Серповидноклеточная анемия
Применение ПЦР для диагностики генетических нарушений
Болезнь Хантингтона
ДНК-дактилоскопия
Применение ПЦР для диагностики генетических нарушений
Анализ делеций Анализ транслокаций
Разновидности ПЦР
bull Hot-start PCR ndash для повышения специфичности реакции
bull Touch-down PCR ndash для повышения специфичности реакции
bull Allele-specific PCR ndash для выявления однонуклеотидных различий
bull RT-PCR (reverse transcriptase PCR) ndash для амплификации РНК
bull Asymmetric PCR ndash для получения одноцепочечного продукта ДНК
bull Real-time PCR qPCR
bull Inverse PCR ndash если известна небольшая последовательность внутри амплифицируемого участка
bull Nested PCR ndash две последовательные реакции (для повышения чувствительности и специфичности)
bull PCR mutagenesis ndash две направленного внесения замен в последовательность
Allele-specific PCR- анализ однонуклеотидных полиморфизмов
Inverse PCR- исследование фланкирующих областей
Asymmetric PCR- наработка одноцепочечного продукта
Nested PCR- уменьшение числа побочных продуктов реакции
PCR mutagenesis
Сайт-специфический мутагенез
ПЦР для клонирования в вектор
ПЦР в реальном времени(Real-time PCR)
bull одновременная амплификация и измерение количества продукта
bull наличие флюоресцентного красителя в смеси
bull наличие оптического блока в амплификаторе
линейный lg
33
Системы детекции
1 Неспецифичные
ndash интеркалирующие красители (SYBR Green и др)
2 Специфичные
ndash линейные разрушаемые пробы (TaqMan)
ndash laquoмолекулярные маячкиraquo (beacons)
ndash примыкающие пробы
SYBR Green
Метод TaqMan(линейные разрушаемые зонды)
флуоресцентные зонды и гашение флуоресценции
флуоресцентный
краситель
гаситель
флуоресценции
зонд
специфический фрагмент ДНК
FRET ndash Fluorescence Resonance Energy Transfer
FRET ndash Fluorescence Resonance Energy TransferРезонансный перенос энергии флуоресценции
Принцип метода TaqMan
bull 5`-3` экзонуклеазная активность Taq-полимеразы
Принцип метода TaqMan
bull 5`-3` экзонуклеазная активность Taq-полимеразы
Принцип метода TaqMan
bull 5`-3` экзонуклеазная активность Taq-полимеразы
Принцип метода TaqMan
bull 5`-3` экзонуклеазная активность Taq-полимеразы
Принцип метода TaqMan
bull 5`-3` экзонуклеазная активность Taq-полимеразы
Принцип метода TaqMan
bull 5`-3` экзонуклеазная активность Taq-полимеразы
bull нет участка для посадки праймера ndash нет сигнала
Принцип метода TaqMan
bull нет участка для посадки зонда ndash нет сигнала
Принцип метода TaqMan
Линейные разрушаемые пробы(TaqMan = Taq-polymerase + Pac-Man)
laquoМолекулярные маячкиraquo(molecular beacons)
Примыкающие пробы
Флюорофоры и гасители флюоресценции
Представление результатов ПЦР в реальном времени
линейный lg
Денатурация
Плавление после ПЦР
обратная производная
Плавление после ПЦР
Виды ПЦР-анализа
Качественный анализ
Сравнительный анализ
(полуколичественный)
Количественный анализ
есть нет
больше меньше Х раз
лечение
10 000 копий 1000 копий
Количественная ПЦР (qPCR)
bull Подсчёт числа копий генов
bull Анализ представленности транскриптов
bull Оценка инфекционной нагрузки
Количественная ПЦР
серия 10-кратных разведений
threshold ndash пороговая флюоресценцияCt ndash пороговый цикл
Преимущества Real-time PCR
bull возможность как качественной так и количественной оценки исходной матрицы
bull отсутствие манипуляций после проведения ПЦР (электрофорез)
bull большая чувствительность (от единичных копий) и специфичность
bull большой динамический диапазон концентраций (порядка 10^7)
bull возможность постановки Multiplex анализа
1 Научные исследования
ndash амплификация ДНК для гибридизации (блоттинг микрочипы)
ndash амплификация ДНК для секвенирования
ndash клонирование геномной ДНК кДНК
ndash филогенетическое сравнение геномов
ndash генетическое картирование
ndash анализ уровня транскрипции
Применение ПЦР
2 Медицина
ndash генетическое тестирование
ndash типирование тканей (для трансплантации)
ndash тестирование мутаций в онкогенах
ndash диагностика инфекций
3 Судебная медицина
ndash ДНК-дактилоскопия
ndash установление родства
4 Анализ пищевых продуктов детекция ГМО
Применение ПЦР
Применение ПЦР
Залог успеха ПЦР
bull высокая чувствительность
bull высокая специфичность
bull высокая устойчивость
bull низкая стоимость быстрота
Получение информации
bull анализ уровня транскрипции
bull ДНК-диагностика
bull генотипирование
Получение материала
bull клонирование ДНК
bull мутагенез
bull секвенирование
N
N
О
О
Н
Н
Н
N
N
О
О
Н
Н
С
НН
Н
ОН
ОCH2
ОP
О
Оndash
HО
3`
4`
5`
2`
1`
Н
Х
Использование UDG ndash метод борьбы с контаминацией продуктами ПЦР
Тимин
(типичен
для ДНК)
Урацил
(типичен
для РНК)
Х = урацил
дезоксиуридинтрифосфат (dUTP) ndash может быть встроен в
растущую цепь как и dTTP не нарушает комплементарности
N
N
О
О
Н
Н
Н
О-
ОCH2
ОP
О
Оndash
О-
3`
4`
5`
2`
1`
Н
UDG 45-550С
Использование UDG ndash метод борьбы с контаминацией продуктами ПЦР
1) Урацил ДНК-гликозилаза присутствующая в ПЦР-смеси отщепляет урацил от цепи ДНК оставляя тн АР-сайт
О-
ОCH2
ОP
О
Оndash
О-
3`
4`
5`
2`
1`
Н
UDG 45-550С
AP-сайт
1) Урацил ДНК-гликозилаза присутствующая в ПЦР-смеси отщепляет урацил от цепи ДНК оставляя тн АР-сайт
Использование UDG ndash метод борьбы с контаминацией продуктами ПЦР
О-
ОCH2
ОP
О
Оndash
О-
3`
4`
5`
2`
1`
Н
Использование UDG ndash метод борьбы с контаминацией продуктами ПЦР
2) При нагревании до 950С UDG инактивируется а AP-сайты расщепляются в результате урацил-содержащая ДНК попавшая в пробирку до начала ПЦР деградирует3) Проводится обычная ПЦР реакционная смесь очищена от продуктов предыдущей амплификации
Digital PCR (dPCR)
65
R
PM 1ln М ndash среднее количество целевой ДНК на сегмент реакции (на основе
распределения Пуассона)Р ndash доля сегментов содержащих ПЦР-продуктR ndash общее кол-во проанализированных сегментов
Лимитирующие факторы dPCR
bull Количество сегментов реакции
bull Концентрация целевой ДНК в анализируемом образце
bull Реакционный объѐм
Коммерчески доступные системы реализующие dPCR
66
Fluidigm - технология микрофлюидных чипов
Bio-Rad (QuantaLife) -dPCR в суспензии
(Digital Droplet PCR)
Life Technologies
dPCR в платах OpenArrayreg
Подготовка образцов
(смешивание ДНК и ПЦР-реагентов)
Создание капель (Droplet Generator)
АмплификацияРегистрация и
анализ результатов
Digital droplet PCR (ddPCR)
bull QX100 Droplet Digital PCR System
Сравнение с Real-Time PCR
68
Digital PCR a powerful new tool for noninvasive prenatal diagnosis Bernhard G Zimmermann Simon Grill Wolfgang Holzgreve Prenat Diagn 2008 28 1087ndash1093
Применение ПЦР в NGS
69
Спасибо за внимание
Амплификаторы
Термостатированиеbull твёрдый термоблок (элемент Пельтье)bull жидкостьbull поток воздуха
Применение ПЦР
Получение материала
bull амплификация ДНК
Получение информации
bull поиск ДНК
Клонирование ДНК и кДНК
Применение ПЦР для диагностики генетических нарушений
RFLP - Restriction Fragment Length Polymorphism
ПДРФ ndash Полиморфизм Длин Рестрикционных Фрагментов
Серповидноклеточная анемия
Применение ПЦР для диагностики генетических нарушений
Болезнь Хантингтона
ДНК-дактилоскопия
Применение ПЦР для диагностики генетических нарушений
Анализ делеций Анализ транслокаций
Разновидности ПЦР
bull Hot-start PCR ndash для повышения специфичности реакции
bull Touch-down PCR ndash для повышения специфичности реакции
bull Allele-specific PCR ndash для выявления однонуклеотидных различий
bull RT-PCR (reverse transcriptase PCR) ndash для амплификации РНК
bull Asymmetric PCR ndash для получения одноцепочечного продукта ДНК
bull Real-time PCR qPCR
bull Inverse PCR ndash если известна небольшая последовательность внутри амплифицируемого участка
bull Nested PCR ndash две последовательные реакции (для повышения чувствительности и специфичности)
bull PCR mutagenesis ndash две направленного внесения замен в последовательность
Allele-specific PCR- анализ однонуклеотидных полиморфизмов
Inverse PCR- исследование фланкирующих областей
Asymmetric PCR- наработка одноцепочечного продукта
Nested PCR- уменьшение числа побочных продуктов реакции
PCR mutagenesis
Сайт-специфический мутагенез
ПЦР для клонирования в вектор
ПЦР в реальном времени(Real-time PCR)
bull одновременная амплификация и измерение количества продукта
bull наличие флюоресцентного красителя в смеси
bull наличие оптического блока в амплификаторе
линейный lg
33
Системы детекции
1 Неспецифичные
ndash интеркалирующие красители (SYBR Green и др)
2 Специфичные
ndash линейные разрушаемые пробы (TaqMan)
ndash laquoмолекулярные маячкиraquo (beacons)
ndash примыкающие пробы
SYBR Green
Метод TaqMan(линейные разрушаемые зонды)
флуоресцентные зонды и гашение флуоресценции
флуоресцентный
краситель
гаситель
флуоресценции
зонд
специфический фрагмент ДНК
FRET ndash Fluorescence Resonance Energy Transfer
FRET ndash Fluorescence Resonance Energy TransferРезонансный перенос энергии флуоресценции
Принцип метода TaqMan
bull 5`-3` экзонуклеазная активность Taq-полимеразы
Принцип метода TaqMan
bull 5`-3` экзонуклеазная активность Taq-полимеразы
Принцип метода TaqMan
bull 5`-3` экзонуклеазная активность Taq-полимеразы
Принцип метода TaqMan
bull 5`-3` экзонуклеазная активность Taq-полимеразы
Принцип метода TaqMan
bull 5`-3` экзонуклеазная активность Taq-полимеразы
Принцип метода TaqMan
bull 5`-3` экзонуклеазная активность Taq-полимеразы
bull нет участка для посадки праймера ndash нет сигнала
Принцип метода TaqMan
bull нет участка для посадки зонда ndash нет сигнала
Принцип метода TaqMan
Линейные разрушаемые пробы(TaqMan = Taq-polymerase + Pac-Man)
laquoМолекулярные маячкиraquo(molecular beacons)
Примыкающие пробы
Флюорофоры и гасители флюоресценции
Представление результатов ПЦР в реальном времени
линейный lg
Денатурация
Плавление после ПЦР
обратная производная
Плавление после ПЦР
Виды ПЦР-анализа
Качественный анализ
Сравнительный анализ
(полуколичественный)
Количественный анализ
есть нет
больше меньше Х раз
лечение
10 000 копий 1000 копий
Количественная ПЦР (qPCR)
bull Подсчёт числа копий генов
bull Анализ представленности транскриптов
bull Оценка инфекционной нагрузки
Количественная ПЦР
серия 10-кратных разведений
threshold ndash пороговая флюоресценцияCt ndash пороговый цикл
Преимущества Real-time PCR
bull возможность как качественной так и количественной оценки исходной матрицы
bull отсутствие манипуляций после проведения ПЦР (электрофорез)
bull большая чувствительность (от единичных копий) и специфичность
bull большой динамический диапазон концентраций (порядка 10^7)
bull возможность постановки Multiplex анализа
1 Научные исследования
ndash амплификация ДНК для гибридизации (блоттинг микрочипы)
ndash амплификация ДНК для секвенирования
ndash клонирование геномной ДНК кДНК
ndash филогенетическое сравнение геномов
ndash генетическое картирование
ndash анализ уровня транскрипции
Применение ПЦР
2 Медицина
ndash генетическое тестирование
ndash типирование тканей (для трансплантации)
ndash тестирование мутаций в онкогенах
ndash диагностика инфекций
3 Судебная медицина
ndash ДНК-дактилоскопия
ndash установление родства
4 Анализ пищевых продуктов детекция ГМО
Применение ПЦР
Применение ПЦР
Залог успеха ПЦР
bull высокая чувствительность
bull высокая специфичность
bull высокая устойчивость
bull низкая стоимость быстрота
Получение информации
bull анализ уровня транскрипции
bull ДНК-диагностика
bull генотипирование
Получение материала
bull клонирование ДНК
bull мутагенез
bull секвенирование
N
N
О
О
Н
Н
Н
N
N
О
О
Н
Н
С
НН
Н
ОН
ОCH2
ОP
О
Оndash
HО
3`
4`
5`
2`
1`
Н
Х
Использование UDG ndash метод борьбы с контаминацией продуктами ПЦР
Тимин
(типичен
для ДНК)
Урацил
(типичен
для РНК)
Х = урацил
дезоксиуридинтрифосфат (dUTP) ndash может быть встроен в
растущую цепь как и dTTP не нарушает комплементарности
N
N
О
О
Н
Н
Н
О-
ОCH2
ОP
О
Оndash
О-
3`
4`
5`
2`
1`
Н
UDG 45-550С
Использование UDG ndash метод борьбы с контаминацией продуктами ПЦР
1) Урацил ДНК-гликозилаза присутствующая в ПЦР-смеси отщепляет урацил от цепи ДНК оставляя тн АР-сайт
О-
ОCH2
ОP
О
Оndash
О-
3`
4`
5`
2`
1`
Н
UDG 45-550С
AP-сайт
1) Урацил ДНК-гликозилаза присутствующая в ПЦР-смеси отщепляет урацил от цепи ДНК оставляя тн АР-сайт
Использование UDG ndash метод борьбы с контаминацией продуктами ПЦР
О-
ОCH2
ОP
О
Оndash
О-
3`
4`
5`
2`
1`
Н
Использование UDG ndash метод борьбы с контаминацией продуктами ПЦР
2) При нагревании до 950С UDG инактивируется а AP-сайты расщепляются в результате урацил-содержащая ДНК попавшая в пробирку до начала ПЦР деградирует3) Проводится обычная ПЦР реакционная смесь очищена от продуктов предыдущей амплификации
Digital PCR (dPCR)
65
R
PM 1ln М ndash среднее количество целевой ДНК на сегмент реакции (на основе
распределения Пуассона)Р ndash доля сегментов содержащих ПЦР-продуктR ndash общее кол-во проанализированных сегментов
Лимитирующие факторы dPCR
bull Количество сегментов реакции
bull Концентрация целевой ДНК в анализируемом образце
bull Реакционный объѐм
Коммерчески доступные системы реализующие dPCR
66
Fluidigm - технология микрофлюидных чипов
Bio-Rad (QuantaLife) -dPCR в суспензии
(Digital Droplet PCR)
Life Technologies
dPCR в платах OpenArrayreg
Подготовка образцов
(смешивание ДНК и ПЦР-реагентов)
Создание капель (Droplet Generator)
АмплификацияРегистрация и
анализ результатов
Digital droplet PCR (ddPCR)
bull QX100 Droplet Digital PCR System
Сравнение с Real-Time PCR
68
Digital PCR a powerful new tool for noninvasive prenatal diagnosis Bernhard G Zimmermann Simon Grill Wolfgang Holzgreve Prenat Diagn 2008 28 1087ndash1093
Применение ПЦР в NGS
69
Спасибо за внимание
Применение ПЦР
Получение материала
bull амплификация ДНК
Получение информации
bull поиск ДНК
Клонирование ДНК и кДНК
Применение ПЦР для диагностики генетических нарушений
RFLP - Restriction Fragment Length Polymorphism
ПДРФ ndash Полиморфизм Длин Рестрикционных Фрагментов
Серповидноклеточная анемия
Применение ПЦР для диагностики генетических нарушений
Болезнь Хантингтона
ДНК-дактилоскопия
Применение ПЦР для диагностики генетических нарушений
Анализ делеций Анализ транслокаций
Разновидности ПЦР
bull Hot-start PCR ndash для повышения специфичности реакции
bull Touch-down PCR ndash для повышения специфичности реакции
bull Allele-specific PCR ndash для выявления однонуклеотидных различий
bull RT-PCR (reverse transcriptase PCR) ndash для амплификации РНК
bull Asymmetric PCR ndash для получения одноцепочечного продукта ДНК
bull Real-time PCR qPCR
bull Inverse PCR ndash если известна небольшая последовательность внутри амплифицируемого участка
bull Nested PCR ndash две последовательные реакции (для повышения чувствительности и специфичности)
bull PCR mutagenesis ndash две направленного внесения замен в последовательность
Allele-specific PCR- анализ однонуклеотидных полиморфизмов
Inverse PCR- исследование фланкирующих областей
Asymmetric PCR- наработка одноцепочечного продукта
Nested PCR- уменьшение числа побочных продуктов реакции
PCR mutagenesis
Сайт-специфический мутагенез
ПЦР для клонирования в вектор
ПЦР в реальном времени(Real-time PCR)
bull одновременная амплификация и измерение количества продукта
bull наличие флюоресцентного красителя в смеси
bull наличие оптического блока в амплификаторе
линейный lg
33
Системы детекции
1 Неспецифичные
ndash интеркалирующие красители (SYBR Green и др)
2 Специфичные
ndash линейные разрушаемые пробы (TaqMan)
ndash laquoмолекулярные маячкиraquo (beacons)
ndash примыкающие пробы
SYBR Green
Метод TaqMan(линейные разрушаемые зонды)
флуоресцентные зонды и гашение флуоресценции
флуоресцентный
краситель
гаситель
флуоресценции
зонд
специфический фрагмент ДНК
FRET ndash Fluorescence Resonance Energy Transfer
FRET ndash Fluorescence Resonance Energy TransferРезонансный перенос энергии флуоресценции
Принцип метода TaqMan
bull 5`-3` экзонуклеазная активность Taq-полимеразы
Принцип метода TaqMan
bull 5`-3` экзонуклеазная активность Taq-полимеразы
Принцип метода TaqMan
bull 5`-3` экзонуклеазная активность Taq-полимеразы
Принцип метода TaqMan
bull 5`-3` экзонуклеазная активность Taq-полимеразы
Принцип метода TaqMan
bull 5`-3` экзонуклеазная активность Taq-полимеразы
Принцип метода TaqMan
bull 5`-3` экзонуклеазная активность Taq-полимеразы
bull нет участка для посадки праймера ndash нет сигнала
Принцип метода TaqMan
bull нет участка для посадки зонда ndash нет сигнала
Принцип метода TaqMan
Линейные разрушаемые пробы(TaqMan = Taq-polymerase + Pac-Man)
laquoМолекулярные маячкиraquo(molecular beacons)
Примыкающие пробы
Флюорофоры и гасители флюоресценции
Представление результатов ПЦР в реальном времени
линейный lg
Денатурация
Плавление после ПЦР
обратная производная
Плавление после ПЦР
Виды ПЦР-анализа
Качественный анализ
Сравнительный анализ
(полуколичественный)
Количественный анализ
есть нет
больше меньше Х раз
лечение
10 000 копий 1000 копий
Количественная ПЦР (qPCR)
bull Подсчёт числа копий генов
bull Анализ представленности транскриптов
bull Оценка инфекционной нагрузки
Количественная ПЦР
серия 10-кратных разведений
threshold ndash пороговая флюоресценцияCt ndash пороговый цикл
Преимущества Real-time PCR
bull возможность как качественной так и количественной оценки исходной матрицы
bull отсутствие манипуляций после проведения ПЦР (электрофорез)
bull большая чувствительность (от единичных копий) и специфичность
bull большой динамический диапазон концентраций (порядка 10^7)
bull возможность постановки Multiplex анализа
1 Научные исследования
ndash амплификация ДНК для гибридизации (блоттинг микрочипы)
ndash амплификация ДНК для секвенирования
ndash клонирование геномной ДНК кДНК
ndash филогенетическое сравнение геномов
ndash генетическое картирование
ndash анализ уровня транскрипции
Применение ПЦР
2 Медицина
ndash генетическое тестирование
ndash типирование тканей (для трансплантации)
ndash тестирование мутаций в онкогенах
ndash диагностика инфекций
3 Судебная медицина
ndash ДНК-дактилоскопия
ndash установление родства
4 Анализ пищевых продуктов детекция ГМО
Применение ПЦР
Применение ПЦР
Залог успеха ПЦР
bull высокая чувствительность
bull высокая специфичность
bull высокая устойчивость
bull низкая стоимость быстрота
Получение информации
bull анализ уровня транскрипции
bull ДНК-диагностика
bull генотипирование
Получение материала
bull клонирование ДНК
bull мутагенез
bull секвенирование
N
N
О
О
Н
Н
Н
N
N
О
О
Н
Н
С
НН
Н
ОН
ОCH2
ОP
О
Оndash
HО
3`
4`
5`
2`
1`
Н
Х
Использование UDG ndash метод борьбы с контаминацией продуктами ПЦР
Тимин
(типичен
для ДНК)
Урацил
(типичен
для РНК)
Х = урацил
дезоксиуридинтрифосфат (dUTP) ndash может быть встроен в
растущую цепь как и dTTP не нарушает комплементарности
N
N
О
О
Н
Н
Н
О-
ОCH2
ОP
О
Оndash
О-
3`
4`
5`
2`
1`
Н
UDG 45-550С
Использование UDG ndash метод борьбы с контаминацией продуктами ПЦР
1) Урацил ДНК-гликозилаза присутствующая в ПЦР-смеси отщепляет урацил от цепи ДНК оставляя тн АР-сайт
О-
ОCH2
ОP
О
Оndash
О-
3`
4`
5`
2`
1`
Н
UDG 45-550С
AP-сайт
1) Урацил ДНК-гликозилаза присутствующая в ПЦР-смеси отщепляет урацил от цепи ДНК оставляя тн АР-сайт
Использование UDG ndash метод борьбы с контаминацией продуктами ПЦР
О-
ОCH2
ОP
О
Оndash
О-
3`
4`
5`
2`
1`
Н
Использование UDG ndash метод борьбы с контаминацией продуктами ПЦР
2) При нагревании до 950С UDG инактивируется а AP-сайты расщепляются в результате урацил-содержащая ДНК попавшая в пробирку до начала ПЦР деградирует3) Проводится обычная ПЦР реакционная смесь очищена от продуктов предыдущей амплификации
Digital PCR (dPCR)
65
R
PM 1ln М ndash среднее количество целевой ДНК на сегмент реакции (на основе
распределения Пуассона)Р ndash доля сегментов содержащих ПЦР-продуктR ndash общее кол-во проанализированных сегментов
Лимитирующие факторы dPCR
bull Количество сегментов реакции
bull Концентрация целевой ДНК в анализируемом образце
bull Реакционный объѐм
Коммерчески доступные системы реализующие dPCR
66
Fluidigm - технология микрофлюидных чипов
Bio-Rad (QuantaLife) -dPCR в суспензии
(Digital Droplet PCR)
Life Technologies
dPCR в платах OpenArrayreg
Подготовка образцов
(смешивание ДНК и ПЦР-реагентов)
Создание капель (Droplet Generator)
АмплификацияРегистрация и
анализ результатов
Digital droplet PCR (ddPCR)
bull QX100 Droplet Digital PCR System
Сравнение с Real-Time PCR
68
Digital PCR a powerful new tool for noninvasive prenatal diagnosis Bernhard G Zimmermann Simon Grill Wolfgang Holzgreve Prenat Diagn 2008 28 1087ndash1093
Применение ПЦР в NGS
69
Спасибо за внимание
Клонирование ДНК и кДНК
Применение ПЦР для диагностики генетических нарушений
RFLP - Restriction Fragment Length Polymorphism
ПДРФ ndash Полиморфизм Длин Рестрикционных Фрагментов
Серповидноклеточная анемия
Применение ПЦР для диагностики генетических нарушений
Болезнь Хантингтона
ДНК-дактилоскопия
Применение ПЦР для диагностики генетических нарушений
Анализ делеций Анализ транслокаций
Разновидности ПЦР
bull Hot-start PCR ndash для повышения специфичности реакции
bull Touch-down PCR ndash для повышения специфичности реакции
bull Allele-specific PCR ndash для выявления однонуклеотидных различий
bull RT-PCR (reverse transcriptase PCR) ndash для амплификации РНК
bull Asymmetric PCR ndash для получения одноцепочечного продукта ДНК
bull Real-time PCR qPCR
bull Inverse PCR ndash если известна небольшая последовательность внутри амплифицируемого участка
bull Nested PCR ndash две последовательные реакции (для повышения чувствительности и специфичности)
bull PCR mutagenesis ndash две направленного внесения замен в последовательность
Allele-specific PCR- анализ однонуклеотидных полиморфизмов
Inverse PCR- исследование фланкирующих областей
Asymmetric PCR- наработка одноцепочечного продукта
Nested PCR- уменьшение числа побочных продуктов реакции
PCR mutagenesis
Сайт-специфический мутагенез
ПЦР для клонирования в вектор
ПЦР в реальном времени(Real-time PCR)
bull одновременная амплификация и измерение количества продукта
bull наличие флюоресцентного красителя в смеси
bull наличие оптического блока в амплификаторе
линейный lg
33
Системы детекции
1 Неспецифичные
ndash интеркалирующие красители (SYBR Green и др)
2 Специфичные
ndash линейные разрушаемые пробы (TaqMan)
ndash laquoмолекулярные маячкиraquo (beacons)
ndash примыкающие пробы
SYBR Green
Метод TaqMan(линейные разрушаемые зонды)
флуоресцентные зонды и гашение флуоресценции
флуоресцентный
краситель
гаситель
флуоресценции
зонд
специфический фрагмент ДНК
FRET ndash Fluorescence Resonance Energy Transfer
FRET ndash Fluorescence Resonance Energy TransferРезонансный перенос энергии флуоресценции
Принцип метода TaqMan
bull 5`-3` экзонуклеазная активность Taq-полимеразы
Принцип метода TaqMan
bull 5`-3` экзонуклеазная активность Taq-полимеразы
Принцип метода TaqMan
bull 5`-3` экзонуклеазная активность Taq-полимеразы
Принцип метода TaqMan
bull 5`-3` экзонуклеазная активность Taq-полимеразы
Принцип метода TaqMan
bull 5`-3` экзонуклеазная активность Taq-полимеразы
Принцип метода TaqMan
bull 5`-3` экзонуклеазная активность Taq-полимеразы
bull нет участка для посадки праймера ndash нет сигнала
Принцип метода TaqMan
bull нет участка для посадки зонда ndash нет сигнала
Принцип метода TaqMan
Линейные разрушаемые пробы(TaqMan = Taq-polymerase + Pac-Man)
laquoМолекулярные маячкиraquo(molecular beacons)
Примыкающие пробы
Флюорофоры и гасители флюоресценции
Представление результатов ПЦР в реальном времени
линейный lg
Денатурация
Плавление после ПЦР
обратная производная
Плавление после ПЦР
Виды ПЦР-анализа
Качественный анализ
Сравнительный анализ
(полуколичественный)
Количественный анализ
есть нет
больше меньше Х раз
лечение
10 000 копий 1000 копий
Количественная ПЦР (qPCR)
bull Подсчёт числа копий генов
bull Анализ представленности транскриптов
bull Оценка инфекционной нагрузки
Количественная ПЦР
серия 10-кратных разведений
threshold ndash пороговая флюоресценцияCt ndash пороговый цикл
Преимущества Real-time PCR
bull возможность как качественной так и количественной оценки исходной матрицы
bull отсутствие манипуляций после проведения ПЦР (электрофорез)
bull большая чувствительность (от единичных копий) и специфичность
bull большой динамический диапазон концентраций (порядка 10^7)
bull возможность постановки Multiplex анализа
1 Научные исследования
ndash амплификация ДНК для гибридизации (блоттинг микрочипы)
ndash амплификация ДНК для секвенирования
ndash клонирование геномной ДНК кДНК
ndash филогенетическое сравнение геномов
ndash генетическое картирование
ndash анализ уровня транскрипции
Применение ПЦР
2 Медицина
ndash генетическое тестирование
ndash типирование тканей (для трансплантации)
ndash тестирование мутаций в онкогенах
ndash диагностика инфекций
3 Судебная медицина
ndash ДНК-дактилоскопия
ndash установление родства
4 Анализ пищевых продуктов детекция ГМО
Применение ПЦР
Применение ПЦР
Залог успеха ПЦР
bull высокая чувствительность
bull высокая специфичность
bull высокая устойчивость
bull низкая стоимость быстрота
Получение информации
bull анализ уровня транскрипции
bull ДНК-диагностика
bull генотипирование
Получение материала
bull клонирование ДНК
bull мутагенез
bull секвенирование
N
N
О
О
Н
Н
Н
N
N
О
О
Н
Н
С
НН
Н
ОН
ОCH2
ОP
О
Оndash
HО
3`
4`
5`
2`
1`
Н
Х
Использование UDG ndash метод борьбы с контаминацией продуктами ПЦР
Тимин
(типичен
для ДНК)
Урацил
(типичен
для РНК)
Х = урацил
дезоксиуридинтрифосфат (dUTP) ndash может быть встроен в
растущую цепь как и dTTP не нарушает комплементарности
N
N
О
О
Н
Н
Н
О-
ОCH2
ОP
О
Оndash
О-
3`
4`
5`
2`
1`
Н
UDG 45-550С
Использование UDG ndash метод борьбы с контаминацией продуктами ПЦР
1) Урацил ДНК-гликозилаза присутствующая в ПЦР-смеси отщепляет урацил от цепи ДНК оставляя тн АР-сайт
О-
ОCH2
ОP
О
Оndash
О-
3`
4`
5`
2`
1`
Н
UDG 45-550С
AP-сайт
1) Урацил ДНК-гликозилаза присутствующая в ПЦР-смеси отщепляет урацил от цепи ДНК оставляя тн АР-сайт
Использование UDG ndash метод борьбы с контаминацией продуктами ПЦР
О-
ОCH2
ОP
О
Оndash
О-
3`
4`
5`
2`
1`
Н
Использование UDG ndash метод борьбы с контаминацией продуктами ПЦР
2) При нагревании до 950С UDG инактивируется а AP-сайты расщепляются в результате урацил-содержащая ДНК попавшая в пробирку до начала ПЦР деградирует3) Проводится обычная ПЦР реакционная смесь очищена от продуктов предыдущей амплификации
Digital PCR (dPCR)
65
R
PM 1ln М ndash среднее количество целевой ДНК на сегмент реакции (на основе
распределения Пуассона)Р ndash доля сегментов содержащих ПЦР-продуктR ndash общее кол-во проанализированных сегментов
Лимитирующие факторы dPCR
bull Количество сегментов реакции
bull Концентрация целевой ДНК в анализируемом образце
bull Реакционный объѐм
Коммерчески доступные системы реализующие dPCR
66
Fluidigm - технология микрофлюидных чипов
Bio-Rad (QuantaLife) -dPCR в суспензии
(Digital Droplet PCR)
Life Technologies
dPCR в платах OpenArrayreg
Подготовка образцов
(смешивание ДНК и ПЦР-реагентов)
Создание капель (Droplet Generator)
АмплификацияРегистрация и
анализ результатов
Digital droplet PCR (ddPCR)
bull QX100 Droplet Digital PCR System
Сравнение с Real-Time PCR
68
Digital PCR a powerful new tool for noninvasive prenatal diagnosis Bernhard G Zimmermann Simon Grill Wolfgang Holzgreve Prenat Diagn 2008 28 1087ndash1093
Применение ПЦР в NGS
69
Спасибо за внимание
Применение ПЦР для диагностики генетических нарушений
RFLP - Restriction Fragment Length Polymorphism
ПДРФ ndash Полиморфизм Длин Рестрикционных Фрагментов
Серповидноклеточная анемия
Применение ПЦР для диагностики генетических нарушений
Болезнь Хантингтона
ДНК-дактилоскопия
Применение ПЦР для диагностики генетических нарушений
Анализ делеций Анализ транслокаций
Разновидности ПЦР
bull Hot-start PCR ndash для повышения специфичности реакции
bull Touch-down PCR ndash для повышения специфичности реакции
bull Allele-specific PCR ndash для выявления однонуклеотидных различий
bull RT-PCR (reverse transcriptase PCR) ndash для амплификации РНК
bull Asymmetric PCR ndash для получения одноцепочечного продукта ДНК
bull Real-time PCR qPCR
bull Inverse PCR ndash если известна небольшая последовательность внутри амплифицируемого участка
bull Nested PCR ndash две последовательные реакции (для повышения чувствительности и специфичности)
bull PCR mutagenesis ndash две направленного внесения замен в последовательность
Allele-specific PCR- анализ однонуклеотидных полиморфизмов
Inverse PCR- исследование фланкирующих областей
Asymmetric PCR- наработка одноцепочечного продукта
Nested PCR- уменьшение числа побочных продуктов реакции
PCR mutagenesis
Сайт-специфический мутагенез
ПЦР для клонирования в вектор
ПЦР в реальном времени(Real-time PCR)
bull одновременная амплификация и измерение количества продукта
bull наличие флюоресцентного красителя в смеси
bull наличие оптического блока в амплификаторе
линейный lg
33
Системы детекции
1 Неспецифичные
ndash интеркалирующие красители (SYBR Green и др)
2 Специфичные
ndash линейные разрушаемые пробы (TaqMan)
ndash laquoмолекулярные маячкиraquo (beacons)
ndash примыкающие пробы
SYBR Green
Метод TaqMan(линейные разрушаемые зонды)
флуоресцентные зонды и гашение флуоресценции
флуоресцентный
краситель
гаситель
флуоресценции
зонд
специфический фрагмент ДНК
FRET ndash Fluorescence Resonance Energy Transfer
FRET ndash Fluorescence Resonance Energy TransferРезонансный перенос энергии флуоресценции
Принцип метода TaqMan
bull 5`-3` экзонуклеазная активность Taq-полимеразы
Принцип метода TaqMan
bull 5`-3` экзонуклеазная активность Taq-полимеразы
Принцип метода TaqMan
bull 5`-3` экзонуклеазная активность Taq-полимеразы
Принцип метода TaqMan
bull 5`-3` экзонуклеазная активность Taq-полимеразы
Принцип метода TaqMan
bull 5`-3` экзонуклеазная активность Taq-полимеразы
Принцип метода TaqMan
bull 5`-3` экзонуклеазная активность Taq-полимеразы
bull нет участка для посадки праймера ndash нет сигнала
Принцип метода TaqMan
bull нет участка для посадки зонда ndash нет сигнала
Принцип метода TaqMan
Линейные разрушаемые пробы(TaqMan = Taq-polymerase + Pac-Man)
laquoМолекулярные маячкиraquo(molecular beacons)
Примыкающие пробы
Флюорофоры и гасители флюоресценции
Представление результатов ПЦР в реальном времени
линейный lg
Денатурация
Плавление после ПЦР
обратная производная
Плавление после ПЦР
Виды ПЦР-анализа
Качественный анализ
Сравнительный анализ
(полуколичественный)
Количественный анализ
есть нет
больше меньше Х раз
лечение
10 000 копий 1000 копий
Количественная ПЦР (qPCR)
bull Подсчёт числа копий генов
bull Анализ представленности транскриптов
bull Оценка инфекционной нагрузки
Количественная ПЦР
серия 10-кратных разведений
threshold ndash пороговая флюоресценцияCt ndash пороговый цикл
Преимущества Real-time PCR
bull возможность как качественной так и количественной оценки исходной матрицы
bull отсутствие манипуляций после проведения ПЦР (электрофорез)
bull большая чувствительность (от единичных копий) и специфичность
bull большой динамический диапазон концентраций (порядка 10^7)
bull возможность постановки Multiplex анализа
1 Научные исследования
ndash амплификация ДНК для гибридизации (блоттинг микрочипы)
ndash амплификация ДНК для секвенирования
ndash клонирование геномной ДНК кДНК
ndash филогенетическое сравнение геномов
ndash генетическое картирование
ndash анализ уровня транскрипции
Применение ПЦР
2 Медицина
ndash генетическое тестирование
ndash типирование тканей (для трансплантации)
ndash тестирование мутаций в онкогенах
ndash диагностика инфекций
3 Судебная медицина
ndash ДНК-дактилоскопия
ndash установление родства
4 Анализ пищевых продуктов детекция ГМО
Применение ПЦР
Применение ПЦР
Залог успеха ПЦР
bull высокая чувствительность
bull высокая специфичность
bull высокая устойчивость
bull низкая стоимость быстрота
Получение информации
bull анализ уровня транскрипции
bull ДНК-диагностика
bull генотипирование
Получение материала
bull клонирование ДНК
bull мутагенез
bull секвенирование
N
N
О
О
Н
Н
Н
N
N
О
О
Н
Н
С
НН
Н
ОН
ОCH2
ОP
О
Оndash
HО
3`
4`
5`
2`
1`
Н
Х
Использование UDG ndash метод борьбы с контаминацией продуктами ПЦР
Тимин
(типичен
для ДНК)
Урацил
(типичен
для РНК)
Х = урацил
дезоксиуридинтрифосфат (dUTP) ndash может быть встроен в
растущую цепь как и dTTP не нарушает комплементарности
N
N
О
О
Н
Н
Н
О-
ОCH2
ОP
О
Оndash
О-
3`
4`
5`
2`
1`
Н
UDG 45-550С
Использование UDG ndash метод борьбы с контаминацией продуктами ПЦР
1) Урацил ДНК-гликозилаза присутствующая в ПЦР-смеси отщепляет урацил от цепи ДНК оставляя тн АР-сайт
О-
ОCH2
ОP
О
Оndash
О-
3`
4`
5`
2`
1`
Н
UDG 45-550С
AP-сайт
1) Урацил ДНК-гликозилаза присутствующая в ПЦР-смеси отщепляет урацил от цепи ДНК оставляя тн АР-сайт
Использование UDG ndash метод борьбы с контаминацией продуктами ПЦР
О-
ОCH2
ОP
О
Оndash
О-
3`
4`
5`
2`
1`
Н
Использование UDG ndash метод борьбы с контаминацией продуктами ПЦР
2) При нагревании до 950С UDG инактивируется а AP-сайты расщепляются в результате урацил-содержащая ДНК попавшая в пробирку до начала ПЦР деградирует3) Проводится обычная ПЦР реакционная смесь очищена от продуктов предыдущей амплификации
Digital PCR (dPCR)
65
R
PM 1ln М ndash среднее количество целевой ДНК на сегмент реакции (на основе
распределения Пуассона)Р ndash доля сегментов содержащих ПЦР-продуктR ndash общее кол-во проанализированных сегментов
Лимитирующие факторы dPCR
bull Количество сегментов реакции
bull Концентрация целевой ДНК в анализируемом образце
bull Реакционный объѐм
Коммерчески доступные системы реализующие dPCR
66
Fluidigm - технология микрофлюидных чипов
Bio-Rad (QuantaLife) -dPCR в суспензии
(Digital Droplet PCR)
Life Technologies
dPCR в платах OpenArrayreg
Подготовка образцов
(смешивание ДНК и ПЦР-реагентов)
Создание капель (Droplet Generator)
АмплификацияРегистрация и
анализ результатов
Digital droplet PCR (ddPCR)
bull QX100 Droplet Digital PCR System
Сравнение с Real-Time PCR
68
Digital PCR a powerful new tool for noninvasive prenatal diagnosis Bernhard G Zimmermann Simon Grill Wolfgang Holzgreve Prenat Diagn 2008 28 1087ndash1093
Применение ПЦР в NGS
69
Спасибо за внимание
Применение ПЦР для диагностики генетических нарушений
Болезнь Хантингтона
ДНК-дактилоскопия
Применение ПЦР для диагностики генетических нарушений
Анализ делеций Анализ транслокаций
Разновидности ПЦР
bull Hot-start PCR ndash для повышения специфичности реакции
bull Touch-down PCR ndash для повышения специфичности реакции
bull Allele-specific PCR ndash для выявления однонуклеотидных различий
bull RT-PCR (reverse transcriptase PCR) ndash для амплификации РНК
bull Asymmetric PCR ndash для получения одноцепочечного продукта ДНК
bull Real-time PCR qPCR
bull Inverse PCR ndash если известна небольшая последовательность внутри амплифицируемого участка
bull Nested PCR ndash две последовательные реакции (для повышения чувствительности и специфичности)
bull PCR mutagenesis ndash две направленного внесения замен в последовательность
Allele-specific PCR- анализ однонуклеотидных полиморфизмов
Inverse PCR- исследование фланкирующих областей
Asymmetric PCR- наработка одноцепочечного продукта
Nested PCR- уменьшение числа побочных продуктов реакции
PCR mutagenesis
Сайт-специфический мутагенез
ПЦР для клонирования в вектор
ПЦР в реальном времени(Real-time PCR)
bull одновременная амплификация и измерение количества продукта
bull наличие флюоресцентного красителя в смеси
bull наличие оптического блока в амплификаторе
линейный lg
33
Системы детекции
1 Неспецифичные
ndash интеркалирующие красители (SYBR Green и др)
2 Специфичные
ndash линейные разрушаемые пробы (TaqMan)
ndash laquoмолекулярные маячкиraquo (beacons)
ndash примыкающие пробы
SYBR Green
Метод TaqMan(линейные разрушаемые зонды)
флуоресцентные зонды и гашение флуоресценции
флуоресцентный
краситель
гаситель
флуоресценции
зонд
специфический фрагмент ДНК
FRET ndash Fluorescence Resonance Energy Transfer
FRET ndash Fluorescence Resonance Energy TransferРезонансный перенос энергии флуоресценции
Принцип метода TaqMan
bull 5`-3` экзонуклеазная активность Taq-полимеразы
Принцип метода TaqMan
bull 5`-3` экзонуклеазная активность Taq-полимеразы
Принцип метода TaqMan
bull 5`-3` экзонуклеазная активность Taq-полимеразы
Принцип метода TaqMan
bull 5`-3` экзонуклеазная активность Taq-полимеразы
Принцип метода TaqMan
bull 5`-3` экзонуклеазная активность Taq-полимеразы
Принцип метода TaqMan
bull 5`-3` экзонуклеазная активность Taq-полимеразы
bull нет участка для посадки праймера ndash нет сигнала
Принцип метода TaqMan
bull нет участка для посадки зонда ndash нет сигнала
Принцип метода TaqMan
Линейные разрушаемые пробы(TaqMan = Taq-polymerase + Pac-Man)
laquoМолекулярные маячкиraquo(molecular beacons)
Примыкающие пробы
Флюорофоры и гасители флюоресценции
Представление результатов ПЦР в реальном времени
линейный lg
Денатурация
Плавление после ПЦР
обратная производная
Плавление после ПЦР
Виды ПЦР-анализа
Качественный анализ
Сравнительный анализ
(полуколичественный)
Количественный анализ
есть нет
больше меньше Х раз
лечение
10 000 копий 1000 копий
Количественная ПЦР (qPCR)
bull Подсчёт числа копий генов
bull Анализ представленности транскриптов
bull Оценка инфекционной нагрузки
Количественная ПЦР
серия 10-кратных разведений
threshold ndash пороговая флюоресценцияCt ndash пороговый цикл
Преимущества Real-time PCR
bull возможность как качественной так и количественной оценки исходной матрицы
bull отсутствие манипуляций после проведения ПЦР (электрофорез)
bull большая чувствительность (от единичных копий) и специфичность
bull большой динамический диапазон концентраций (порядка 10^7)
bull возможность постановки Multiplex анализа
1 Научные исследования
ndash амплификация ДНК для гибридизации (блоттинг микрочипы)
ndash амплификация ДНК для секвенирования
ndash клонирование геномной ДНК кДНК
ndash филогенетическое сравнение геномов
ndash генетическое картирование
ndash анализ уровня транскрипции
Применение ПЦР
2 Медицина
ndash генетическое тестирование
ndash типирование тканей (для трансплантации)
ndash тестирование мутаций в онкогенах
ndash диагностика инфекций
3 Судебная медицина
ndash ДНК-дактилоскопия
ndash установление родства
4 Анализ пищевых продуктов детекция ГМО
Применение ПЦР
Применение ПЦР
Залог успеха ПЦР
bull высокая чувствительность
bull высокая специфичность
bull высокая устойчивость
bull низкая стоимость быстрота
Получение информации
bull анализ уровня транскрипции
bull ДНК-диагностика
bull генотипирование
Получение материала
bull клонирование ДНК
bull мутагенез
bull секвенирование
N
N
О
О
Н
Н
Н
N
N
О
О
Н
Н
С
НН
Н
ОН
ОCH2
ОP
О
Оndash
HО
3`
4`
5`
2`
1`
Н
Х
Использование UDG ndash метод борьбы с контаминацией продуктами ПЦР
Тимин
(типичен
для ДНК)
Урацил
(типичен
для РНК)
Х = урацил
дезоксиуридинтрифосфат (dUTP) ndash может быть встроен в
растущую цепь как и dTTP не нарушает комплементарности
N
N
О
О
Н
Н
Н
О-
ОCH2
ОP
О
Оndash
О-
3`
4`
5`
2`
1`
Н
UDG 45-550С
Использование UDG ndash метод борьбы с контаминацией продуктами ПЦР
1) Урацил ДНК-гликозилаза присутствующая в ПЦР-смеси отщепляет урацил от цепи ДНК оставляя тн АР-сайт
О-
ОCH2
ОP
О
Оndash
О-
3`
4`
5`
2`
1`
Н
UDG 45-550С
AP-сайт
1) Урацил ДНК-гликозилаза присутствующая в ПЦР-смеси отщепляет урацил от цепи ДНК оставляя тн АР-сайт
Использование UDG ndash метод борьбы с контаминацией продуктами ПЦР
О-
ОCH2
ОP
О
Оndash
О-
3`
4`
5`
2`
1`
Н
Использование UDG ndash метод борьбы с контаминацией продуктами ПЦР
2) При нагревании до 950С UDG инактивируется а AP-сайты расщепляются в результате урацил-содержащая ДНК попавшая в пробирку до начала ПЦР деградирует3) Проводится обычная ПЦР реакционная смесь очищена от продуктов предыдущей амплификации
Digital PCR (dPCR)
65
R
PM 1ln М ndash среднее количество целевой ДНК на сегмент реакции (на основе
распределения Пуассона)Р ndash доля сегментов содержащих ПЦР-продуктR ndash общее кол-во проанализированных сегментов
Лимитирующие факторы dPCR
bull Количество сегментов реакции
bull Концентрация целевой ДНК в анализируемом образце
bull Реакционный объѐм
Коммерчески доступные системы реализующие dPCR
66
Fluidigm - технология микрофлюидных чипов
Bio-Rad (QuantaLife) -dPCR в суспензии
(Digital Droplet PCR)
Life Technologies
dPCR в платах OpenArrayreg
Подготовка образцов
(смешивание ДНК и ПЦР-реагентов)
Создание капель (Droplet Generator)
АмплификацияРегистрация и
анализ результатов
Digital droplet PCR (ddPCR)
bull QX100 Droplet Digital PCR System
Сравнение с Real-Time PCR
68
Digital PCR a powerful new tool for noninvasive prenatal diagnosis Bernhard G Zimmermann Simon Grill Wolfgang Holzgreve Prenat Diagn 2008 28 1087ndash1093
Применение ПЦР в NGS
69
Спасибо за внимание
ДНК-дактилоскопия
Применение ПЦР для диагностики генетических нарушений
Анализ делеций Анализ транслокаций
Разновидности ПЦР
bull Hot-start PCR ndash для повышения специфичности реакции
bull Touch-down PCR ndash для повышения специфичности реакции
bull Allele-specific PCR ndash для выявления однонуклеотидных различий
bull RT-PCR (reverse transcriptase PCR) ndash для амплификации РНК
bull Asymmetric PCR ndash для получения одноцепочечного продукта ДНК
bull Real-time PCR qPCR
bull Inverse PCR ndash если известна небольшая последовательность внутри амплифицируемого участка
bull Nested PCR ndash две последовательные реакции (для повышения чувствительности и специфичности)
bull PCR mutagenesis ndash две направленного внесения замен в последовательность
Allele-specific PCR- анализ однонуклеотидных полиморфизмов
Inverse PCR- исследование фланкирующих областей
Asymmetric PCR- наработка одноцепочечного продукта
Nested PCR- уменьшение числа побочных продуктов реакции
PCR mutagenesis
Сайт-специфический мутагенез
ПЦР для клонирования в вектор
ПЦР в реальном времени(Real-time PCR)
bull одновременная амплификация и измерение количества продукта
bull наличие флюоресцентного красителя в смеси
bull наличие оптического блока в амплификаторе
линейный lg
33
Системы детекции
1 Неспецифичные
ndash интеркалирующие красители (SYBR Green и др)
2 Специфичные
ndash линейные разрушаемые пробы (TaqMan)
ndash laquoмолекулярные маячкиraquo (beacons)
ndash примыкающие пробы
SYBR Green
Метод TaqMan(линейные разрушаемые зонды)
флуоресцентные зонды и гашение флуоресценции
флуоресцентный
краситель
гаситель
флуоресценции
зонд
специфический фрагмент ДНК
FRET ndash Fluorescence Resonance Energy Transfer
FRET ndash Fluorescence Resonance Energy TransferРезонансный перенос энергии флуоресценции
Принцип метода TaqMan
bull 5`-3` экзонуклеазная активность Taq-полимеразы
Принцип метода TaqMan
bull 5`-3` экзонуклеазная активность Taq-полимеразы
Принцип метода TaqMan
bull 5`-3` экзонуклеазная активность Taq-полимеразы
Принцип метода TaqMan
bull 5`-3` экзонуклеазная активность Taq-полимеразы
Принцип метода TaqMan
bull 5`-3` экзонуклеазная активность Taq-полимеразы
Принцип метода TaqMan
bull 5`-3` экзонуклеазная активность Taq-полимеразы
bull нет участка для посадки праймера ndash нет сигнала
Принцип метода TaqMan
bull нет участка для посадки зонда ndash нет сигнала
Принцип метода TaqMan
Линейные разрушаемые пробы(TaqMan = Taq-polymerase + Pac-Man)
laquoМолекулярные маячкиraquo(molecular beacons)
Примыкающие пробы
Флюорофоры и гасители флюоресценции
Представление результатов ПЦР в реальном времени
линейный lg
Денатурация
Плавление после ПЦР
обратная производная
Плавление после ПЦР
Виды ПЦР-анализа
Качественный анализ
Сравнительный анализ
(полуколичественный)
Количественный анализ
есть нет
больше меньше Х раз
лечение
10 000 копий 1000 копий
Количественная ПЦР (qPCR)
bull Подсчёт числа копий генов
bull Анализ представленности транскриптов
bull Оценка инфекционной нагрузки
Количественная ПЦР
серия 10-кратных разведений
threshold ndash пороговая флюоресценцияCt ndash пороговый цикл
Преимущества Real-time PCR
bull возможность как качественной так и количественной оценки исходной матрицы
bull отсутствие манипуляций после проведения ПЦР (электрофорез)
bull большая чувствительность (от единичных копий) и специфичность
bull большой динамический диапазон концентраций (порядка 10^7)
bull возможность постановки Multiplex анализа
1 Научные исследования
ndash амплификация ДНК для гибридизации (блоттинг микрочипы)
ndash амплификация ДНК для секвенирования
ndash клонирование геномной ДНК кДНК
ndash филогенетическое сравнение геномов
ndash генетическое картирование
ndash анализ уровня транскрипции
Применение ПЦР
2 Медицина
ndash генетическое тестирование
ndash типирование тканей (для трансплантации)
ndash тестирование мутаций в онкогенах
ndash диагностика инфекций
3 Судебная медицина
ndash ДНК-дактилоскопия
ndash установление родства
4 Анализ пищевых продуктов детекция ГМО
Применение ПЦР
Применение ПЦР
Залог успеха ПЦР
bull высокая чувствительность
bull высокая специфичность
bull высокая устойчивость
bull низкая стоимость быстрота
Получение информации
bull анализ уровня транскрипции
bull ДНК-диагностика
bull генотипирование
Получение материала
bull клонирование ДНК
bull мутагенез
bull секвенирование
N
N
О
О
Н
Н
Н
N
N
О
О
Н
Н
С
НН
Н
ОН
ОCH2
ОP
О
Оndash
HО
3`
4`
5`
2`
1`
Н
Х
Использование UDG ndash метод борьбы с контаминацией продуктами ПЦР
Тимин
(типичен
для ДНК)
Урацил
(типичен
для РНК)
Х = урацил
дезоксиуридинтрифосфат (dUTP) ndash может быть встроен в
растущую цепь как и dTTP не нарушает комплементарности
N
N
О
О
Н
Н
Н
О-
ОCH2
ОP
О
Оndash
О-
3`
4`
5`
2`
1`
Н
UDG 45-550С
Использование UDG ndash метод борьбы с контаминацией продуктами ПЦР
1) Урацил ДНК-гликозилаза присутствующая в ПЦР-смеси отщепляет урацил от цепи ДНК оставляя тн АР-сайт
О-
ОCH2
ОP
О
Оndash
О-
3`
4`
5`
2`
1`
Н
UDG 45-550С
AP-сайт
1) Урацил ДНК-гликозилаза присутствующая в ПЦР-смеси отщепляет урацил от цепи ДНК оставляя тн АР-сайт
Использование UDG ndash метод борьбы с контаминацией продуктами ПЦР
О-
ОCH2
ОP
О
Оndash
О-
3`
4`
5`
2`
1`
Н
Использование UDG ndash метод борьбы с контаминацией продуктами ПЦР
2) При нагревании до 950С UDG инактивируется а AP-сайты расщепляются в результате урацил-содержащая ДНК попавшая в пробирку до начала ПЦР деградирует3) Проводится обычная ПЦР реакционная смесь очищена от продуктов предыдущей амплификации
Digital PCR (dPCR)
65
R
PM 1ln М ndash среднее количество целевой ДНК на сегмент реакции (на основе
распределения Пуассона)Р ndash доля сегментов содержащих ПЦР-продуктR ndash общее кол-во проанализированных сегментов
Лимитирующие факторы dPCR
bull Количество сегментов реакции
bull Концентрация целевой ДНК в анализируемом образце
bull Реакционный объѐм
Коммерчески доступные системы реализующие dPCR
66
Fluidigm - технология микрофлюидных чипов
Bio-Rad (QuantaLife) -dPCR в суспензии
(Digital Droplet PCR)
Life Technologies
dPCR в платах OpenArrayreg
Подготовка образцов
(смешивание ДНК и ПЦР-реагентов)
Создание капель (Droplet Generator)
АмплификацияРегистрация и
анализ результатов
Digital droplet PCR (ddPCR)
bull QX100 Droplet Digital PCR System
Сравнение с Real-Time PCR
68
Digital PCR a powerful new tool for noninvasive prenatal diagnosis Bernhard G Zimmermann Simon Grill Wolfgang Holzgreve Prenat Diagn 2008 28 1087ndash1093
Применение ПЦР в NGS
69
Спасибо за внимание
Применение ПЦР для диагностики генетических нарушений
Анализ делеций Анализ транслокаций
Разновидности ПЦР
bull Hot-start PCR ndash для повышения специфичности реакции
bull Touch-down PCR ndash для повышения специфичности реакции
bull Allele-specific PCR ndash для выявления однонуклеотидных различий
bull RT-PCR (reverse transcriptase PCR) ndash для амплификации РНК
bull Asymmetric PCR ndash для получения одноцепочечного продукта ДНК
bull Real-time PCR qPCR
bull Inverse PCR ndash если известна небольшая последовательность внутри амплифицируемого участка
bull Nested PCR ndash две последовательные реакции (для повышения чувствительности и специфичности)
bull PCR mutagenesis ndash две направленного внесения замен в последовательность
Allele-specific PCR- анализ однонуклеотидных полиморфизмов
Inverse PCR- исследование фланкирующих областей
Asymmetric PCR- наработка одноцепочечного продукта
Nested PCR- уменьшение числа побочных продуктов реакции
PCR mutagenesis
Сайт-специфический мутагенез
ПЦР для клонирования в вектор
ПЦР в реальном времени(Real-time PCR)
bull одновременная амплификация и измерение количества продукта
bull наличие флюоресцентного красителя в смеси
bull наличие оптического блока в амплификаторе
линейный lg
33
Системы детекции
1 Неспецифичные
ndash интеркалирующие красители (SYBR Green и др)
2 Специфичные
ndash линейные разрушаемые пробы (TaqMan)
ndash laquoмолекулярные маячкиraquo (beacons)
ndash примыкающие пробы
SYBR Green
Метод TaqMan(линейные разрушаемые зонды)
флуоресцентные зонды и гашение флуоресценции
флуоресцентный
краситель
гаситель
флуоресценции
зонд
специфический фрагмент ДНК
FRET ndash Fluorescence Resonance Energy Transfer
FRET ndash Fluorescence Resonance Energy TransferРезонансный перенос энергии флуоресценции
Принцип метода TaqMan
bull 5`-3` экзонуклеазная активность Taq-полимеразы
Принцип метода TaqMan
bull 5`-3` экзонуклеазная активность Taq-полимеразы
Принцип метода TaqMan
bull 5`-3` экзонуклеазная активность Taq-полимеразы
Принцип метода TaqMan
bull 5`-3` экзонуклеазная активность Taq-полимеразы
Принцип метода TaqMan
bull 5`-3` экзонуклеазная активность Taq-полимеразы
Принцип метода TaqMan
bull 5`-3` экзонуклеазная активность Taq-полимеразы
bull нет участка для посадки праймера ndash нет сигнала
Принцип метода TaqMan
bull нет участка для посадки зонда ndash нет сигнала
Принцип метода TaqMan
Линейные разрушаемые пробы(TaqMan = Taq-polymerase + Pac-Man)
laquoМолекулярные маячкиraquo(molecular beacons)
Примыкающие пробы
Флюорофоры и гасители флюоресценции
Представление результатов ПЦР в реальном времени
линейный lg
Денатурация
Плавление после ПЦР
обратная производная
Плавление после ПЦР
Виды ПЦР-анализа
Качественный анализ
Сравнительный анализ
(полуколичественный)
Количественный анализ
есть нет
больше меньше Х раз
лечение
10 000 копий 1000 копий
Количественная ПЦР (qPCR)
bull Подсчёт числа копий генов
bull Анализ представленности транскриптов
bull Оценка инфекционной нагрузки
Количественная ПЦР
серия 10-кратных разведений
threshold ndash пороговая флюоресценцияCt ndash пороговый цикл
Преимущества Real-time PCR
bull возможность как качественной так и количественной оценки исходной матрицы
bull отсутствие манипуляций после проведения ПЦР (электрофорез)
bull большая чувствительность (от единичных копий) и специфичность
bull большой динамический диапазон концентраций (порядка 10^7)
bull возможность постановки Multiplex анализа
1 Научные исследования
ndash амплификация ДНК для гибридизации (блоттинг микрочипы)
ndash амплификация ДНК для секвенирования
ndash клонирование геномной ДНК кДНК
ndash филогенетическое сравнение геномов
ndash генетическое картирование
ndash анализ уровня транскрипции
Применение ПЦР
2 Медицина
ndash генетическое тестирование
ndash типирование тканей (для трансплантации)
ndash тестирование мутаций в онкогенах
ndash диагностика инфекций
3 Судебная медицина
ndash ДНК-дактилоскопия
ndash установление родства
4 Анализ пищевых продуктов детекция ГМО
Применение ПЦР
Применение ПЦР
Залог успеха ПЦР
bull высокая чувствительность
bull высокая специфичность
bull высокая устойчивость
bull низкая стоимость быстрота
Получение информации
bull анализ уровня транскрипции
bull ДНК-диагностика
bull генотипирование
Получение материала
bull клонирование ДНК
bull мутагенез
bull секвенирование
N
N
О
О
Н
Н
Н
N
N
О
О
Н
Н
С
НН
Н
ОН
ОCH2
ОP
О
Оndash
HО
3`
4`
5`
2`
1`
Н
Х
Использование UDG ndash метод борьбы с контаминацией продуктами ПЦР
Тимин
(типичен
для ДНК)
Урацил
(типичен
для РНК)
Х = урацил
дезоксиуридинтрифосфат (dUTP) ndash может быть встроен в
растущую цепь как и dTTP не нарушает комплементарности
N
N
О
О
Н
Н
Н
О-
ОCH2
ОP
О
Оndash
О-
3`
4`
5`
2`
1`
Н
UDG 45-550С
Использование UDG ndash метод борьбы с контаминацией продуктами ПЦР
1) Урацил ДНК-гликозилаза присутствующая в ПЦР-смеси отщепляет урацил от цепи ДНК оставляя тн АР-сайт
О-
ОCH2
ОP
О
Оndash
О-
3`
4`
5`
2`
1`
Н
UDG 45-550С
AP-сайт
1) Урацил ДНК-гликозилаза присутствующая в ПЦР-смеси отщепляет урацил от цепи ДНК оставляя тн АР-сайт
Использование UDG ndash метод борьбы с контаминацией продуктами ПЦР
О-
ОCH2
ОP
О
Оndash
О-
3`
4`
5`
2`
1`
Н
Использование UDG ndash метод борьбы с контаминацией продуктами ПЦР
2) При нагревании до 950С UDG инактивируется а AP-сайты расщепляются в результате урацил-содержащая ДНК попавшая в пробирку до начала ПЦР деградирует3) Проводится обычная ПЦР реакционная смесь очищена от продуктов предыдущей амплификации
Digital PCR (dPCR)
65
R
PM 1ln М ndash среднее количество целевой ДНК на сегмент реакции (на основе
распределения Пуассона)Р ndash доля сегментов содержащих ПЦР-продуктR ndash общее кол-во проанализированных сегментов
Лимитирующие факторы dPCR
bull Количество сегментов реакции
bull Концентрация целевой ДНК в анализируемом образце
bull Реакционный объѐм
Коммерчески доступные системы реализующие dPCR
66
Fluidigm - технология микрофлюидных чипов
Bio-Rad (QuantaLife) -dPCR в суспензии
(Digital Droplet PCR)
Life Technologies
dPCR в платах OpenArrayreg
Подготовка образцов
(смешивание ДНК и ПЦР-реагентов)
Создание капель (Droplet Generator)
АмплификацияРегистрация и
анализ результатов
Digital droplet PCR (ddPCR)
bull QX100 Droplet Digital PCR System
Сравнение с Real-Time PCR
68
Digital PCR a powerful new tool for noninvasive prenatal diagnosis Bernhard G Zimmermann Simon Grill Wolfgang Holzgreve Prenat Diagn 2008 28 1087ndash1093
Применение ПЦР в NGS
69
Спасибо за внимание
Разновидности ПЦР
bull Hot-start PCR ndash для повышения специфичности реакции
bull Touch-down PCR ndash для повышения специфичности реакции
bull Allele-specific PCR ndash для выявления однонуклеотидных различий
bull RT-PCR (reverse transcriptase PCR) ndash для амплификации РНК
bull Asymmetric PCR ndash для получения одноцепочечного продукта ДНК
bull Real-time PCR qPCR
bull Inverse PCR ndash если известна небольшая последовательность внутри амплифицируемого участка
bull Nested PCR ndash две последовательные реакции (для повышения чувствительности и специфичности)
bull PCR mutagenesis ndash две направленного внесения замен в последовательность
Allele-specific PCR- анализ однонуклеотидных полиморфизмов
Inverse PCR- исследование фланкирующих областей
Asymmetric PCR- наработка одноцепочечного продукта
Nested PCR- уменьшение числа побочных продуктов реакции
PCR mutagenesis
Сайт-специфический мутагенез
ПЦР для клонирования в вектор
ПЦР в реальном времени(Real-time PCR)
bull одновременная амплификация и измерение количества продукта
bull наличие флюоресцентного красителя в смеси
bull наличие оптического блока в амплификаторе
линейный lg
33
Системы детекции
1 Неспецифичные
ndash интеркалирующие красители (SYBR Green и др)
2 Специфичные
ndash линейные разрушаемые пробы (TaqMan)
ndash laquoмолекулярные маячкиraquo (beacons)
ndash примыкающие пробы
SYBR Green
Метод TaqMan(линейные разрушаемые зонды)
флуоресцентные зонды и гашение флуоресценции
флуоресцентный
краситель
гаситель
флуоресценции
зонд
специфический фрагмент ДНК
FRET ndash Fluorescence Resonance Energy Transfer
FRET ndash Fluorescence Resonance Energy TransferРезонансный перенос энергии флуоресценции
Принцип метода TaqMan
bull 5`-3` экзонуклеазная активность Taq-полимеразы
Принцип метода TaqMan
bull 5`-3` экзонуклеазная активность Taq-полимеразы
Принцип метода TaqMan
bull 5`-3` экзонуклеазная активность Taq-полимеразы
Принцип метода TaqMan
bull 5`-3` экзонуклеазная активность Taq-полимеразы
Принцип метода TaqMan
bull 5`-3` экзонуклеазная активность Taq-полимеразы
Принцип метода TaqMan
bull 5`-3` экзонуклеазная активность Taq-полимеразы
bull нет участка для посадки праймера ndash нет сигнала
Принцип метода TaqMan
bull нет участка для посадки зонда ndash нет сигнала
Принцип метода TaqMan
Линейные разрушаемые пробы(TaqMan = Taq-polymerase + Pac-Man)
laquoМолекулярные маячкиraquo(molecular beacons)
Примыкающие пробы
Флюорофоры и гасители флюоресценции
Представление результатов ПЦР в реальном времени
линейный lg
Денатурация
Плавление после ПЦР
обратная производная
Плавление после ПЦР
Виды ПЦР-анализа
Качественный анализ
Сравнительный анализ
(полуколичественный)
Количественный анализ
есть нет
больше меньше Х раз
лечение
10 000 копий 1000 копий
Количественная ПЦР (qPCR)
bull Подсчёт числа копий генов
bull Анализ представленности транскриптов
bull Оценка инфекционной нагрузки
Количественная ПЦР
серия 10-кратных разведений
threshold ndash пороговая флюоресценцияCt ndash пороговый цикл
Преимущества Real-time PCR
bull возможность как качественной так и количественной оценки исходной матрицы
bull отсутствие манипуляций после проведения ПЦР (электрофорез)
bull большая чувствительность (от единичных копий) и специфичность
bull большой динамический диапазон концентраций (порядка 10^7)
bull возможность постановки Multiplex анализа
1 Научные исследования
ndash амплификация ДНК для гибридизации (блоттинг микрочипы)
ndash амплификация ДНК для секвенирования
ndash клонирование геномной ДНК кДНК
ndash филогенетическое сравнение геномов
ndash генетическое картирование
ndash анализ уровня транскрипции
Применение ПЦР
2 Медицина
ndash генетическое тестирование
ndash типирование тканей (для трансплантации)
ndash тестирование мутаций в онкогенах
ndash диагностика инфекций
3 Судебная медицина
ndash ДНК-дактилоскопия
ndash установление родства
4 Анализ пищевых продуктов детекция ГМО
Применение ПЦР
Применение ПЦР
Залог успеха ПЦР
bull высокая чувствительность
bull высокая специфичность
bull высокая устойчивость
bull низкая стоимость быстрота
Получение информации
bull анализ уровня транскрипции
bull ДНК-диагностика
bull генотипирование
Получение материала
bull клонирование ДНК
bull мутагенез
bull секвенирование
N
N
О
О
Н
Н
Н
N
N
О
О
Н
Н
С
НН
Н
ОН
ОCH2
ОP
О
Оndash
HО
3`
4`
5`
2`
1`
Н
Х
Использование UDG ndash метод борьбы с контаминацией продуктами ПЦР
Тимин
(типичен
для ДНК)
Урацил
(типичен
для РНК)
Х = урацил
дезоксиуридинтрифосфат (dUTP) ndash может быть встроен в
растущую цепь как и dTTP не нарушает комплементарности
N
N
О
О
Н
Н
Н
О-
ОCH2
ОP
О
Оndash
О-
3`
4`
5`
2`
1`
Н
UDG 45-550С
Использование UDG ndash метод борьбы с контаминацией продуктами ПЦР
1) Урацил ДНК-гликозилаза присутствующая в ПЦР-смеси отщепляет урацил от цепи ДНК оставляя тн АР-сайт
О-
ОCH2
ОP
О
Оndash
О-
3`
4`
5`
2`
1`
Н
UDG 45-550С
AP-сайт
1) Урацил ДНК-гликозилаза присутствующая в ПЦР-смеси отщепляет урацил от цепи ДНК оставляя тн АР-сайт
Использование UDG ndash метод борьбы с контаминацией продуктами ПЦР
О-
ОCH2
ОP
О
Оndash
О-
3`
4`
5`
2`
1`
Н
Использование UDG ndash метод борьбы с контаминацией продуктами ПЦР
2) При нагревании до 950С UDG инактивируется а AP-сайты расщепляются в результате урацил-содержащая ДНК попавшая в пробирку до начала ПЦР деградирует3) Проводится обычная ПЦР реакционная смесь очищена от продуктов предыдущей амплификации
Digital PCR (dPCR)
65
R
PM 1ln М ndash среднее количество целевой ДНК на сегмент реакции (на основе
распределения Пуассона)Р ndash доля сегментов содержащих ПЦР-продуктR ndash общее кол-во проанализированных сегментов
Лимитирующие факторы dPCR
bull Количество сегментов реакции
bull Концентрация целевой ДНК в анализируемом образце
bull Реакционный объѐм
Коммерчески доступные системы реализующие dPCR
66
Fluidigm - технология микрофлюидных чипов
Bio-Rad (QuantaLife) -dPCR в суспензии
(Digital Droplet PCR)
Life Technologies
dPCR в платах OpenArrayreg
Подготовка образцов
(смешивание ДНК и ПЦР-реагентов)
Создание капель (Droplet Generator)
АмплификацияРегистрация и
анализ результатов
Digital droplet PCR (ddPCR)
bull QX100 Droplet Digital PCR System
Сравнение с Real-Time PCR
68
Digital PCR a powerful new tool for noninvasive prenatal diagnosis Bernhard G Zimmermann Simon Grill Wolfgang Holzgreve Prenat Diagn 2008 28 1087ndash1093
Применение ПЦР в NGS
69
Спасибо за внимание
Allele-specific PCR- анализ однонуклеотидных полиморфизмов
Inverse PCR- исследование фланкирующих областей
Asymmetric PCR- наработка одноцепочечного продукта
Nested PCR- уменьшение числа побочных продуктов реакции
PCR mutagenesis
Сайт-специфический мутагенез
ПЦР для клонирования в вектор
ПЦР в реальном времени(Real-time PCR)
bull одновременная амплификация и измерение количества продукта
bull наличие флюоресцентного красителя в смеси
bull наличие оптического блока в амплификаторе
линейный lg
33
Системы детекции
1 Неспецифичные
ndash интеркалирующие красители (SYBR Green и др)
2 Специфичные
ndash линейные разрушаемые пробы (TaqMan)
ndash laquoмолекулярные маячкиraquo (beacons)
ndash примыкающие пробы
SYBR Green
Метод TaqMan(линейные разрушаемые зонды)
флуоресцентные зонды и гашение флуоресценции
флуоресцентный
краситель
гаситель
флуоресценции
зонд
специфический фрагмент ДНК
FRET ndash Fluorescence Resonance Energy Transfer
FRET ndash Fluorescence Resonance Energy TransferРезонансный перенос энергии флуоресценции
Принцип метода TaqMan
bull 5`-3` экзонуклеазная активность Taq-полимеразы
Принцип метода TaqMan
bull 5`-3` экзонуклеазная активность Taq-полимеразы
Принцип метода TaqMan
bull 5`-3` экзонуклеазная активность Taq-полимеразы
Принцип метода TaqMan
bull 5`-3` экзонуклеазная активность Taq-полимеразы
Принцип метода TaqMan
bull 5`-3` экзонуклеазная активность Taq-полимеразы
Принцип метода TaqMan
bull 5`-3` экзонуклеазная активность Taq-полимеразы
bull нет участка для посадки праймера ndash нет сигнала
Принцип метода TaqMan
bull нет участка для посадки зонда ndash нет сигнала
Принцип метода TaqMan
Линейные разрушаемые пробы(TaqMan = Taq-polymerase + Pac-Man)
laquoМолекулярные маячкиraquo(molecular beacons)
Примыкающие пробы
Флюорофоры и гасители флюоресценции
Представление результатов ПЦР в реальном времени
линейный lg
Денатурация
Плавление после ПЦР
обратная производная
Плавление после ПЦР
Виды ПЦР-анализа
Качественный анализ
Сравнительный анализ
(полуколичественный)
Количественный анализ
есть нет
больше меньше Х раз
лечение
10 000 копий 1000 копий
Количественная ПЦР (qPCR)
bull Подсчёт числа копий генов
bull Анализ представленности транскриптов
bull Оценка инфекционной нагрузки
Количественная ПЦР
серия 10-кратных разведений
threshold ndash пороговая флюоресценцияCt ndash пороговый цикл
Преимущества Real-time PCR
bull возможность как качественной так и количественной оценки исходной матрицы
bull отсутствие манипуляций после проведения ПЦР (электрофорез)
bull большая чувствительность (от единичных копий) и специфичность
bull большой динамический диапазон концентраций (порядка 10^7)
bull возможность постановки Multiplex анализа
1 Научные исследования
ndash амплификация ДНК для гибридизации (блоттинг микрочипы)
ndash амплификация ДНК для секвенирования
ndash клонирование геномной ДНК кДНК
ndash филогенетическое сравнение геномов
ndash генетическое картирование
ndash анализ уровня транскрипции
Применение ПЦР
2 Медицина
ndash генетическое тестирование
ndash типирование тканей (для трансплантации)
ndash тестирование мутаций в онкогенах
ndash диагностика инфекций
3 Судебная медицина
ndash ДНК-дактилоскопия
ndash установление родства
4 Анализ пищевых продуктов детекция ГМО
Применение ПЦР
Применение ПЦР
Залог успеха ПЦР
bull высокая чувствительность
bull высокая специфичность
bull высокая устойчивость
bull низкая стоимость быстрота
Получение информации
bull анализ уровня транскрипции
bull ДНК-диагностика
bull генотипирование
Получение материала
bull клонирование ДНК
bull мутагенез
bull секвенирование
N
N
О
О
Н
Н
Н
N
N
О
О
Н
Н
С
НН
Н
ОН
ОCH2
ОP
О
Оndash
HО
3`
4`
5`
2`
1`
Н
Х
Использование UDG ndash метод борьбы с контаминацией продуктами ПЦР
Тимин
(типичен
для ДНК)
Урацил
(типичен
для РНК)
Х = урацил
дезоксиуридинтрифосфат (dUTP) ndash может быть встроен в
растущую цепь как и dTTP не нарушает комплементарности
N
N
О
О
Н
Н
Н
О-
ОCH2
ОP
О
Оndash
О-
3`
4`
5`
2`
1`
Н
UDG 45-550С
Использование UDG ndash метод борьбы с контаминацией продуктами ПЦР
1) Урацил ДНК-гликозилаза присутствующая в ПЦР-смеси отщепляет урацил от цепи ДНК оставляя тн АР-сайт
О-
ОCH2
ОP
О
Оndash
О-
3`
4`
5`
2`
1`
Н
UDG 45-550С
AP-сайт
1) Урацил ДНК-гликозилаза присутствующая в ПЦР-смеси отщепляет урацил от цепи ДНК оставляя тн АР-сайт
Использование UDG ndash метод борьбы с контаминацией продуктами ПЦР
О-
ОCH2
ОP
О
Оndash
О-
3`
4`
5`
2`
1`
Н
Использование UDG ndash метод борьбы с контаминацией продуктами ПЦР
2) При нагревании до 950С UDG инактивируется а AP-сайты расщепляются в результате урацил-содержащая ДНК попавшая в пробирку до начала ПЦР деградирует3) Проводится обычная ПЦР реакционная смесь очищена от продуктов предыдущей амплификации
Digital PCR (dPCR)
65
R
PM 1ln М ndash среднее количество целевой ДНК на сегмент реакции (на основе
распределения Пуассона)Р ndash доля сегментов содержащих ПЦР-продуктR ndash общее кол-во проанализированных сегментов
Лимитирующие факторы dPCR
bull Количество сегментов реакции
bull Концентрация целевой ДНК в анализируемом образце
bull Реакционный объѐм
Коммерчески доступные системы реализующие dPCR
66
Fluidigm - технология микрофлюидных чипов
Bio-Rad (QuantaLife) -dPCR в суспензии
(Digital Droplet PCR)
Life Technologies
dPCR в платах OpenArrayreg
Подготовка образцов
(смешивание ДНК и ПЦР-реагентов)
Создание капель (Droplet Generator)
АмплификацияРегистрация и
анализ результатов
Digital droplet PCR (ddPCR)
bull QX100 Droplet Digital PCR System
Сравнение с Real-Time PCR
68
Digital PCR a powerful new tool for noninvasive prenatal diagnosis Bernhard G Zimmermann Simon Grill Wolfgang Holzgreve Prenat Diagn 2008 28 1087ndash1093
Применение ПЦР в NGS
69
Спасибо за внимание
Inverse PCR- исследование фланкирующих областей
Asymmetric PCR- наработка одноцепочечного продукта
Nested PCR- уменьшение числа побочных продуктов реакции
PCR mutagenesis
Сайт-специфический мутагенез
ПЦР для клонирования в вектор
ПЦР в реальном времени(Real-time PCR)
bull одновременная амплификация и измерение количества продукта
bull наличие флюоресцентного красителя в смеси
bull наличие оптического блока в амплификаторе
линейный lg
33
Системы детекции
1 Неспецифичные
ndash интеркалирующие красители (SYBR Green и др)
2 Специфичные
ndash линейные разрушаемые пробы (TaqMan)
ndash laquoмолекулярные маячкиraquo (beacons)
ndash примыкающие пробы
SYBR Green
Метод TaqMan(линейные разрушаемые зонды)
флуоресцентные зонды и гашение флуоресценции
флуоресцентный
краситель
гаситель
флуоресценции
зонд
специфический фрагмент ДНК
FRET ndash Fluorescence Resonance Energy Transfer
FRET ndash Fluorescence Resonance Energy TransferРезонансный перенос энергии флуоресценции
Принцип метода TaqMan
bull 5`-3` экзонуклеазная активность Taq-полимеразы
Принцип метода TaqMan
bull 5`-3` экзонуклеазная активность Taq-полимеразы
Принцип метода TaqMan
bull 5`-3` экзонуклеазная активность Taq-полимеразы
Принцип метода TaqMan
bull 5`-3` экзонуклеазная активность Taq-полимеразы
Принцип метода TaqMan
bull 5`-3` экзонуклеазная активность Taq-полимеразы
Принцип метода TaqMan
bull 5`-3` экзонуклеазная активность Taq-полимеразы
bull нет участка для посадки праймера ndash нет сигнала
Принцип метода TaqMan
bull нет участка для посадки зонда ndash нет сигнала
Принцип метода TaqMan
Линейные разрушаемые пробы(TaqMan = Taq-polymerase + Pac-Man)
laquoМолекулярные маячкиraquo(molecular beacons)
Примыкающие пробы
Флюорофоры и гасители флюоресценции
Представление результатов ПЦР в реальном времени
линейный lg
Денатурация
Плавление после ПЦР
обратная производная
Плавление после ПЦР
Виды ПЦР-анализа
Качественный анализ
Сравнительный анализ
(полуколичественный)
Количественный анализ
есть нет
больше меньше Х раз
лечение
10 000 копий 1000 копий
Количественная ПЦР (qPCR)
bull Подсчёт числа копий генов
bull Анализ представленности транскриптов
bull Оценка инфекционной нагрузки
Количественная ПЦР
серия 10-кратных разведений
threshold ndash пороговая флюоресценцияCt ndash пороговый цикл
Преимущества Real-time PCR
bull возможность как качественной так и количественной оценки исходной матрицы
bull отсутствие манипуляций после проведения ПЦР (электрофорез)
bull большая чувствительность (от единичных копий) и специфичность
bull большой динамический диапазон концентраций (порядка 10^7)
bull возможность постановки Multiplex анализа
1 Научные исследования
ndash амплификация ДНК для гибридизации (блоттинг микрочипы)
ndash амплификация ДНК для секвенирования
ndash клонирование геномной ДНК кДНК
ndash филогенетическое сравнение геномов
ndash генетическое картирование
ndash анализ уровня транскрипции
Применение ПЦР
2 Медицина
ndash генетическое тестирование
ndash типирование тканей (для трансплантации)
ndash тестирование мутаций в онкогенах
ndash диагностика инфекций
3 Судебная медицина
ndash ДНК-дактилоскопия
ndash установление родства
4 Анализ пищевых продуктов детекция ГМО
Применение ПЦР
Применение ПЦР
Залог успеха ПЦР
bull высокая чувствительность
bull высокая специфичность
bull высокая устойчивость
bull низкая стоимость быстрота
Получение информации
bull анализ уровня транскрипции
bull ДНК-диагностика
bull генотипирование
Получение материала
bull клонирование ДНК
bull мутагенез
bull секвенирование
N
N
О
О
Н
Н
Н
N
N
О
О
Н
Н
С
НН
Н
ОН
ОCH2
ОP
О
Оndash
HО
3`
4`
5`
2`
1`
Н
Х
Использование UDG ndash метод борьбы с контаминацией продуктами ПЦР
Тимин
(типичен
для ДНК)
Урацил
(типичен
для РНК)
Х = урацил
дезоксиуридинтрифосфат (dUTP) ndash может быть встроен в
растущую цепь как и dTTP не нарушает комплементарности
N
N
О
О
Н
Н
Н
О-
ОCH2
ОP
О
Оndash
О-
3`
4`
5`
2`
1`
Н
UDG 45-550С
Использование UDG ndash метод борьбы с контаминацией продуктами ПЦР
1) Урацил ДНК-гликозилаза присутствующая в ПЦР-смеси отщепляет урацил от цепи ДНК оставляя тн АР-сайт
О-
ОCH2
ОP
О
Оndash
О-
3`
4`
5`
2`
1`
Н
UDG 45-550С
AP-сайт
1) Урацил ДНК-гликозилаза присутствующая в ПЦР-смеси отщепляет урацил от цепи ДНК оставляя тн АР-сайт
Использование UDG ndash метод борьбы с контаминацией продуктами ПЦР
О-
ОCH2
ОP
О
Оndash
О-
3`
4`
5`
2`
1`
Н
Использование UDG ndash метод борьбы с контаминацией продуктами ПЦР
2) При нагревании до 950С UDG инактивируется а AP-сайты расщепляются в результате урацил-содержащая ДНК попавшая в пробирку до начала ПЦР деградирует3) Проводится обычная ПЦР реакционная смесь очищена от продуктов предыдущей амплификации
Digital PCR (dPCR)
65
R
PM 1ln М ndash среднее количество целевой ДНК на сегмент реакции (на основе
распределения Пуассона)Р ndash доля сегментов содержащих ПЦР-продуктR ndash общее кол-во проанализированных сегментов
Лимитирующие факторы dPCR
bull Количество сегментов реакции
bull Концентрация целевой ДНК в анализируемом образце
bull Реакционный объѐм
Коммерчески доступные системы реализующие dPCR
66
Fluidigm - технология микрофлюидных чипов
Bio-Rad (QuantaLife) -dPCR в суспензии
(Digital Droplet PCR)
Life Technologies
dPCR в платах OpenArrayreg
Подготовка образцов
(смешивание ДНК и ПЦР-реагентов)
Создание капель (Droplet Generator)
АмплификацияРегистрация и
анализ результатов
Digital droplet PCR (ddPCR)
bull QX100 Droplet Digital PCR System
Сравнение с Real-Time PCR
68
Digital PCR a powerful new tool for noninvasive prenatal diagnosis Bernhard G Zimmermann Simon Grill Wolfgang Holzgreve Prenat Diagn 2008 28 1087ndash1093
Применение ПЦР в NGS
69
Спасибо за внимание
Asymmetric PCR- наработка одноцепочечного продукта
Nested PCR- уменьшение числа побочных продуктов реакции
PCR mutagenesis
Сайт-специфический мутагенез
ПЦР для клонирования в вектор
ПЦР в реальном времени(Real-time PCR)
bull одновременная амплификация и измерение количества продукта
bull наличие флюоресцентного красителя в смеси
bull наличие оптического блока в амплификаторе
линейный lg
33
Системы детекции
1 Неспецифичные
ndash интеркалирующие красители (SYBR Green и др)
2 Специфичные
ndash линейные разрушаемые пробы (TaqMan)
ndash laquoмолекулярные маячкиraquo (beacons)
ndash примыкающие пробы
SYBR Green
Метод TaqMan(линейные разрушаемые зонды)
флуоресцентные зонды и гашение флуоресценции
флуоресцентный
краситель
гаситель
флуоресценции
зонд
специфический фрагмент ДНК
FRET ndash Fluorescence Resonance Energy Transfer
FRET ndash Fluorescence Resonance Energy TransferРезонансный перенос энергии флуоресценции
Принцип метода TaqMan
bull 5`-3` экзонуклеазная активность Taq-полимеразы
Принцип метода TaqMan
bull 5`-3` экзонуклеазная активность Taq-полимеразы
Принцип метода TaqMan
bull 5`-3` экзонуклеазная активность Taq-полимеразы
Принцип метода TaqMan
bull 5`-3` экзонуклеазная активность Taq-полимеразы
Принцип метода TaqMan
bull 5`-3` экзонуклеазная активность Taq-полимеразы
Принцип метода TaqMan
bull 5`-3` экзонуклеазная активность Taq-полимеразы
bull нет участка для посадки праймера ndash нет сигнала
Принцип метода TaqMan
bull нет участка для посадки зонда ndash нет сигнала
Принцип метода TaqMan
Линейные разрушаемые пробы(TaqMan = Taq-polymerase + Pac-Man)
laquoМолекулярные маячкиraquo(molecular beacons)
Примыкающие пробы
Флюорофоры и гасители флюоресценции
Представление результатов ПЦР в реальном времени
линейный lg
Денатурация
Плавление после ПЦР
обратная производная
Плавление после ПЦР
Виды ПЦР-анализа
Качественный анализ
Сравнительный анализ
(полуколичественный)
Количественный анализ
есть нет
больше меньше Х раз
лечение
10 000 копий 1000 копий
Количественная ПЦР (qPCR)
bull Подсчёт числа копий генов
bull Анализ представленности транскриптов
bull Оценка инфекционной нагрузки
Количественная ПЦР
серия 10-кратных разведений
threshold ndash пороговая флюоресценцияCt ndash пороговый цикл
Преимущества Real-time PCR
bull возможность как качественной так и количественной оценки исходной матрицы
bull отсутствие манипуляций после проведения ПЦР (электрофорез)
bull большая чувствительность (от единичных копий) и специфичность
bull большой динамический диапазон концентраций (порядка 10^7)
bull возможность постановки Multiplex анализа
1 Научные исследования
ndash амплификация ДНК для гибридизации (блоттинг микрочипы)
ndash амплификация ДНК для секвенирования
ndash клонирование геномной ДНК кДНК
ndash филогенетическое сравнение геномов
ndash генетическое картирование
ndash анализ уровня транскрипции
Применение ПЦР
2 Медицина
ndash генетическое тестирование
ndash типирование тканей (для трансплантации)
ndash тестирование мутаций в онкогенах
ndash диагностика инфекций
3 Судебная медицина
ndash ДНК-дактилоскопия
ndash установление родства
4 Анализ пищевых продуктов детекция ГМО
Применение ПЦР
Применение ПЦР
Залог успеха ПЦР
bull высокая чувствительность
bull высокая специфичность
bull высокая устойчивость
bull низкая стоимость быстрота
Получение информации
bull анализ уровня транскрипции
bull ДНК-диагностика
bull генотипирование
Получение материала
bull клонирование ДНК
bull мутагенез
bull секвенирование
N
N
О
О
Н
Н
Н
N
N
О
О
Н
Н
С
НН
Н
ОН
ОCH2
ОP
О
Оndash
HО
3`
4`
5`
2`
1`
Н
Х
Использование UDG ndash метод борьбы с контаминацией продуктами ПЦР
Тимин
(типичен
для ДНК)
Урацил
(типичен
для РНК)
Х = урацил
дезоксиуридинтрифосфат (dUTP) ndash может быть встроен в
растущую цепь как и dTTP не нарушает комплементарности
N
N
О
О
Н
Н
Н
О-
ОCH2
ОP
О
Оndash
О-
3`
4`
5`
2`
1`
Н
UDG 45-550С
Использование UDG ndash метод борьбы с контаминацией продуктами ПЦР
1) Урацил ДНК-гликозилаза присутствующая в ПЦР-смеси отщепляет урацил от цепи ДНК оставляя тн АР-сайт
О-
ОCH2
ОP
О
Оndash
О-
3`
4`
5`
2`
1`
Н
UDG 45-550С
AP-сайт
1) Урацил ДНК-гликозилаза присутствующая в ПЦР-смеси отщепляет урацил от цепи ДНК оставляя тн АР-сайт
Использование UDG ndash метод борьбы с контаминацией продуктами ПЦР
О-
ОCH2
ОP
О
Оndash
О-
3`
4`
5`
2`
1`
Н
Использование UDG ndash метод борьбы с контаминацией продуктами ПЦР
2) При нагревании до 950С UDG инактивируется а AP-сайты расщепляются в результате урацил-содержащая ДНК попавшая в пробирку до начала ПЦР деградирует3) Проводится обычная ПЦР реакционная смесь очищена от продуктов предыдущей амплификации
Digital PCR (dPCR)
65
R
PM 1ln М ndash среднее количество целевой ДНК на сегмент реакции (на основе
распределения Пуассона)Р ndash доля сегментов содержащих ПЦР-продуктR ndash общее кол-во проанализированных сегментов
Лимитирующие факторы dPCR
bull Количество сегментов реакции
bull Концентрация целевой ДНК в анализируемом образце
bull Реакционный объѐм
Коммерчески доступные системы реализующие dPCR
66
Fluidigm - технология микрофлюидных чипов
Bio-Rad (QuantaLife) -dPCR в суспензии
(Digital Droplet PCR)
Life Technologies
dPCR в платах OpenArrayreg
Подготовка образцов
(смешивание ДНК и ПЦР-реагентов)
Создание капель (Droplet Generator)
АмплификацияРегистрация и
анализ результатов
Digital droplet PCR (ddPCR)
bull QX100 Droplet Digital PCR System
Сравнение с Real-Time PCR
68
Digital PCR a powerful new tool for noninvasive prenatal diagnosis Bernhard G Zimmermann Simon Grill Wolfgang Holzgreve Prenat Diagn 2008 28 1087ndash1093
Применение ПЦР в NGS
69
Спасибо за внимание
Nested PCR- уменьшение числа побочных продуктов реакции
PCR mutagenesis
Сайт-специфический мутагенез
ПЦР для клонирования в вектор
ПЦР в реальном времени(Real-time PCR)
bull одновременная амплификация и измерение количества продукта
bull наличие флюоресцентного красителя в смеси
bull наличие оптического блока в амплификаторе
линейный lg
33
Системы детекции
1 Неспецифичные
ndash интеркалирующие красители (SYBR Green и др)
2 Специфичные
ndash линейные разрушаемые пробы (TaqMan)
ndash laquoмолекулярные маячкиraquo (beacons)
ndash примыкающие пробы
SYBR Green
Метод TaqMan(линейные разрушаемые зонды)
флуоресцентные зонды и гашение флуоресценции
флуоресцентный
краситель
гаситель
флуоресценции
зонд
специфический фрагмент ДНК
FRET ndash Fluorescence Resonance Energy Transfer
FRET ndash Fluorescence Resonance Energy TransferРезонансный перенос энергии флуоресценции
Принцип метода TaqMan
bull 5`-3` экзонуклеазная активность Taq-полимеразы
Принцип метода TaqMan
bull 5`-3` экзонуклеазная активность Taq-полимеразы
Принцип метода TaqMan
bull 5`-3` экзонуклеазная активность Taq-полимеразы
Принцип метода TaqMan
bull 5`-3` экзонуклеазная активность Taq-полимеразы
Принцип метода TaqMan
bull 5`-3` экзонуклеазная активность Taq-полимеразы
Принцип метода TaqMan
bull 5`-3` экзонуклеазная активность Taq-полимеразы
bull нет участка для посадки праймера ndash нет сигнала
Принцип метода TaqMan
bull нет участка для посадки зонда ndash нет сигнала
Принцип метода TaqMan
Линейные разрушаемые пробы(TaqMan = Taq-polymerase + Pac-Man)
laquoМолекулярные маячкиraquo(molecular beacons)
Примыкающие пробы
Флюорофоры и гасители флюоресценции
Представление результатов ПЦР в реальном времени
линейный lg
Денатурация
Плавление после ПЦР
обратная производная
Плавление после ПЦР
Виды ПЦР-анализа
Качественный анализ
Сравнительный анализ
(полуколичественный)
Количественный анализ
есть нет
больше меньше Х раз
лечение
10 000 копий 1000 копий
Количественная ПЦР (qPCR)
bull Подсчёт числа копий генов
bull Анализ представленности транскриптов
bull Оценка инфекционной нагрузки
Количественная ПЦР
серия 10-кратных разведений
threshold ndash пороговая флюоресценцияCt ndash пороговый цикл
Преимущества Real-time PCR
bull возможность как качественной так и количественной оценки исходной матрицы
bull отсутствие манипуляций после проведения ПЦР (электрофорез)
bull большая чувствительность (от единичных копий) и специфичность
bull большой динамический диапазон концентраций (порядка 10^7)
bull возможность постановки Multiplex анализа
1 Научные исследования
ndash амплификация ДНК для гибридизации (блоттинг микрочипы)
ndash амплификация ДНК для секвенирования
ndash клонирование геномной ДНК кДНК
ndash филогенетическое сравнение геномов
ndash генетическое картирование
ndash анализ уровня транскрипции
Применение ПЦР
2 Медицина
ndash генетическое тестирование
ndash типирование тканей (для трансплантации)
ndash тестирование мутаций в онкогенах
ndash диагностика инфекций
3 Судебная медицина
ndash ДНК-дактилоскопия
ndash установление родства
4 Анализ пищевых продуктов детекция ГМО
Применение ПЦР
Применение ПЦР
Залог успеха ПЦР
bull высокая чувствительность
bull высокая специфичность
bull высокая устойчивость
bull низкая стоимость быстрота
Получение информации
bull анализ уровня транскрипции
bull ДНК-диагностика
bull генотипирование
Получение материала
bull клонирование ДНК
bull мутагенез
bull секвенирование
N
N
О
О
Н
Н
Н
N
N
О
О
Н
Н
С
НН
Н
ОН
ОCH2
ОP
О
Оndash
HО
3`
4`
5`
2`
1`
Н
Х
Использование UDG ndash метод борьбы с контаминацией продуктами ПЦР
Тимин
(типичен
для ДНК)
Урацил
(типичен
для РНК)
Х = урацил
дезоксиуридинтрифосфат (dUTP) ndash может быть встроен в
растущую цепь как и dTTP не нарушает комплементарности
N
N
О
О
Н
Н
Н
О-
ОCH2
ОP
О
Оndash
О-
3`
4`
5`
2`
1`
Н
UDG 45-550С
Использование UDG ndash метод борьбы с контаминацией продуктами ПЦР
1) Урацил ДНК-гликозилаза присутствующая в ПЦР-смеси отщепляет урацил от цепи ДНК оставляя тн АР-сайт
О-
ОCH2
ОP
О
Оndash
О-
3`
4`
5`
2`
1`
Н
UDG 45-550С
AP-сайт
1) Урацил ДНК-гликозилаза присутствующая в ПЦР-смеси отщепляет урацил от цепи ДНК оставляя тн АР-сайт
Использование UDG ndash метод борьбы с контаминацией продуктами ПЦР
О-
ОCH2
ОP
О
Оndash
О-
3`
4`
5`
2`
1`
Н
Использование UDG ndash метод борьбы с контаминацией продуктами ПЦР
2) При нагревании до 950С UDG инактивируется а AP-сайты расщепляются в результате урацил-содержащая ДНК попавшая в пробирку до начала ПЦР деградирует3) Проводится обычная ПЦР реакционная смесь очищена от продуктов предыдущей амплификации
Digital PCR (dPCR)
65
R
PM 1ln М ndash среднее количество целевой ДНК на сегмент реакции (на основе
распределения Пуассона)Р ndash доля сегментов содержащих ПЦР-продуктR ndash общее кол-во проанализированных сегментов
Лимитирующие факторы dPCR
bull Количество сегментов реакции
bull Концентрация целевой ДНК в анализируемом образце
bull Реакционный объѐм
Коммерчески доступные системы реализующие dPCR
66
Fluidigm - технология микрофлюидных чипов
Bio-Rad (QuantaLife) -dPCR в суспензии
(Digital Droplet PCR)
Life Technologies
dPCR в платах OpenArrayreg
Подготовка образцов
(смешивание ДНК и ПЦР-реагентов)
Создание капель (Droplet Generator)
АмплификацияРегистрация и
анализ результатов
Digital droplet PCR (ddPCR)
bull QX100 Droplet Digital PCR System
Сравнение с Real-Time PCR
68
Digital PCR a powerful new tool for noninvasive prenatal diagnosis Bernhard G Zimmermann Simon Grill Wolfgang Holzgreve Prenat Diagn 2008 28 1087ndash1093
Применение ПЦР в NGS
69
Спасибо за внимание
PCR mutagenesis
Сайт-специфический мутагенез
ПЦР для клонирования в вектор
ПЦР в реальном времени(Real-time PCR)
bull одновременная амплификация и измерение количества продукта
bull наличие флюоресцентного красителя в смеси
bull наличие оптического блока в амплификаторе
линейный lg
33
Системы детекции
1 Неспецифичные
ndash интеркалирующие красители (SYBR Green и др)
2 Специфичные
ndash линейные разрушаемые пробы (TaqMan)
ndash laquoмолекулярные маячкиraquo (beacons)
ndash примыкающие пробы
SYBR Green
Метод TaqMan(линейные разрушаемые зонды)
флуоресцентные зонды и гашение флуоресценции
флуоресцентный
краситель
гаситель
флуоресценции
зонд
специфический фрагмент ДНК
FRET ndash Fluorescence Resonance Energy Transfer
FRET ndash Fluorescence Resonance Energy TransferРезонансный перенос энергии флуоресценции
Принцип метода TaqMan
bull 5`-3` экзонуклеазная активность Taq-полимеразы
Принцип метода TaqMan
bull 5`-3` экзонуклеазная активность Taq-полимеразы
Принцип метода TaqMan
bull 5`-3` экзонуклеазная активность Taq-полимеразы
Принцип метода TaqMan
bull 5`-3` экзонуклеазная активность Taq-полимеразы
Принцип метода TaqMan
bull 5`-3` экзонуклеазная активность Taq-полимеразы
Принцип метода TaqMan
bull 5`-3` экзонуклеазная активность Taq-полимеразы
bull нет участка для посадки праймера ndash нет сигнала
Принцип метода TaqMan
bull нет участка для посадки зонда ndash нет сигнала
Принцип метода TaqMan
Линейные разрушаемые пробы(TaqMan = Taq-polymerase + Pac-Man)
laquoМолекулярные маячкиraquo(molecular beacons)
Примыкающие пробы
Флюорофоры и гасители флюоресценции
Представление результатов ПЦР в реальном времени
линейный lg
Денатурация
Плавление после ПЦР
обратная производная
Плавление после ПЦР
Виды ПЦР-анализа
Качественный анализ
Сравнительный анализ
(полуколичественный)
Количественный анализ
есть нет
больше меньше Х раз
лечение
10 000 копий 1000 копий
Количественная ПЦР (qPCR)
bull Подсчёт числа копий генов
bull Анализ представленности транскриптов
bull Оценка инфекционной нагрузки
Количественная ПЦР
серия 10-кратных разведений
threshold ndash пороговая флюоресценцияCt ndash пороговый цикл
Преимущества Real-time PCR
bull возможность как качественной так и количественной оценки исходной матрицы
bull отсутствие манипуляций после проведения ПЦР (электрофорез)
bull большая чувствительность (от единичных копий) и специфичность
bull большой динамический диапазон концентраций (порядка 10^7)
bull возможность постановки Multiplex анализа
1 Научные исследования
ndash амплификация ДНК для гибридизации (блоттинг микрочипы)
ndash амплификация ДНК для секвенирования
ndash клонирование геномной ДНК кДНК
ndash филогенетическое сравнение геномов
ndash генетическое картирование
ndash анализ уровня транскрипции
Применение ПЦР
2 Медицина
ndash генетическое тестирование
ndash типирование тканей (для трансплантации)
ndash тестирование мутаций в онкогенах
ndash диагностика инфекций
3 Судебная медицина
ndash ДНК-дактилоскопия
ndash установление родства
4 Анализ пищевых продуктов детекция ГМО
Применение ПЦР
Применение ПЦР
Залог успеха ПЦР
bull высокая чувствительность
bull высокая специфичность
bull высокая устойчивость
bull низкая стоимость быстрота
Получение информации
bull анализ уровня транскрипции
bull ДНК-диагностика
bull генотипирование
Получение материала
bull клонирование ДНК
bull мутагенез
bull секвенирование
N
N
О
О
Н
Н
Н
N
N
О
О
Н
Н
С
НН
Н
ОН
ОCH2
ОP
О
Оndash
HО
3`
4`
5`
2`
1`
Н
Х
Использование UDG ndash метод борьбы с контаминацией продуктами ПЦР
Тимин
(типичен
для ДНК)
Урацил
(типичен
для РНК)
Х = урацил
дезоксиуридинтрифосфат (dUTP) ndash может быть встроен в
растущую цепь как и dTTP не нарушает комплементарности
N
N
О
О
Н
Н
Н
О-
ОCH2
ОP
О
Оndash
О-
3`
4`
5`
2`
1`
Н
UDG 45-550С
Использование UDG ndash метод борьбы с контаминацией продуктами ПЦР
1) Урацил ДНК-гликозилаза присутствующая в ПЦР-смеси отщепляет урацил от цепи ДНК оставляя тн АР-сайт
О-
ОCH2
ОP
О
Оndash
О-
3`
4`
5`
2`
1`
Н
UDG 45-550С
AP-сайт
1) Урацил ДНК-гликозилаза присутствующая в ПЦР-смеси отщепляет урацил от цепи ДНК оставляя тн АР-сайт
Использование UDG ndash метод борьбы с контаминацией продуктами ПЦР
О-
ОCH2
ОP
О
Оndash
О-
3`
4`
5`
2`
1`
Н
Использование UDG ndash метод борьбы с контаминацией продуктами ПЦР
2) При нагревании до 950С UDG инактивируется а AP-сайты расщепляются в результате урацил-содержащая ДНК попавшая в пробирку до начала ПЦР деградирует3) Проводится обычная ПЦР реакционная смесь очищена от продуктов предыдущей амплификации
Digital PCR (dPCR)
65
R
PM 1ln М ndash среднее количество целевой ДНК на сегмент реакции (на основе
распределения Пуассона)Р ndash доля сегментов содержащих ПЦР-продуктR ndash общее кол-во проанализированных сегментов
Лимитирующие факторы dPCR
bull Количество сегментов реакции
bull Концентрация целевой ДНК в анализируемом образце
bull Реакционный объѐм
Коммерчески доступные системы реализующие dPCR
66
Fluidigm - технология микрофлюидных чипов
Bio-Rad (QuantaLife) -dPCR в суспензии
(Digital Droplet PCR)
Life Technologies
dPCR в платах OpenArrayreg
Подготовка образцов
(смешивание ДНК и ПЦР-реагентов)
Создание капель (Droplet Generator)
АмплификацияРегистрация и
анализ результатов
Digital droplet PCR (ddPCR)
bull QX100 Droplet Digital PCR System
Сравнение с Real-Time PCR
68
Digital PCR a powerful new tool for noninvasive prenatal diagnosis Bernhard G Zimmermann Simon Grill Wolfgang Holzgreve Prenat Diagn 2008 28 1087ndash1093
Применение ПЦР в NGS
69
Спасибо за внимание
Сайт-специфический мутагенез
ПЦР для клонирования в вектор
ПЦР в реальном времени(Real-time PCR)
bull одновременная амплификация и измерение количества продукта
bull наличие флюоресцентного красителя в смеси
bull наличие оптического блока в амплификаторе
линейный lg
33
Системы детекции
1 Неспецифичные
ndash интеркалирующие красители (SYBR Green и др)
2 Специфичные
ndash линейные разрушаемые пробы (TaqMan)
ndash laquoмолекулярные маячкиraquo (beacons)
ndash примыкающие пробы
SYBR Green
Метод TaqMan(линейные разрушаемые зонды)
флуоресцентные зонды и гашение флуоресценции
флуоресцентный
краситель
гаситель
флуоресценции
зонд
специфический фрагмент ДНК
FRET ndash Fluorescence Resonance Energy Transfer
FRET ndash Fluorescence Resonance Energy TransferРезонансный перенос энергии флуоресценции
Принцип метода TaqMan
bull 5`-3` экзонуклеазная активность Taq-полимеразы
Принцип метода TaqMan
bull 5`-3` экзонуклеазная активность Taq-полимеразы
Принцип метода TaqMan
bull 5`-3` экзонуклеазная активность Taq-полимеразы
Принцип метода TaqMan
bull 5`-3` экзонуклеазная активность Taq-полимеразы
Принцип метода TaqMan
bull 5`-3` экзонуклеазная активность Taq-полимеразы
Принцип метода TaqMan
bull 5`-3` экзонуклеазная активность Taq-полимеразы
bull нет участка для посадки праймера ndash нет сигнала
Принцип метода TaqMan
bull нет участка для посадки зонда ndash нет сигнала
Принцип метода TaqMan
Линейные разрушаемые пробы(TaqMan = Taq-polymerase + Pac-Man)
laquoМолекулярные маячкиraquo(molecular beacons)
Примыкающие пробы
Флюорофоры и гасители флюоресценции
Представление результатов ПЦР в реальном времени
линейный lg
Денатурация
Плавление после ПЦР
обратная производная
Плавление после ПЦР
Виды ПЦР-анализа
Качественный анализ
Сравнительный анализ
(полуколичественный)
Количественный анализ
есть нет
больше меньше Х раз
лечение
10 000 копий 1000 копий
Количественная ПЦР (qPCR)
bull Подсчёт числа копий генов
bull Анализ представленности транскриптов
bull Оценка инфекционной нагрузки
Количественная ПЦР
серия 10-кратных разведений
threshold ndash пороговая флюоресценцияCt ndash пороговый цикл
Преимущества Real-time PCR
bull возможность как качественной так и количественной оценки исходной матрицы
bull отсутствие манипуляций после проведения ПЦР (электрофорез)
bull большая чувствительность (от единичных копий) и специфичность
bull большой динамический диапазон концентраций (порядка 10^7)
bull возможность постановки Multiplex анализа
1 Научные исследования
ndash амплификация ДНК для гибридизации (блоттинг микрочипы)
ndash амплификация ДНК для секвенирования
ndash клонирование геномной ДНК кДНК
ndash филогенетическое сравнение геномов
ndash генетическое картирование
ndash анализ уровня транскрипции
Применение ПЦР
2 Медицина
ndash генетическое тестирование
ndash типирование тканей (для трансплантации)
ndash тестирование мутаций в онкогенах
ndash диагностика инфекций
3 Судебная медицина
ndash ДНК-дактилоскопия
ndash установление родства
4 Анализ пищевых продуктов детекция ГМО
Применение ПЦР
Применение ПЦР
Залог успеха ПЦР
bull высокая чувствительность
bull высокая специфичность
bull высокая устойчивость
bull низкая стоимость быстрота
Получение информации
bull анализ уровня транскрипции
bull ДНК-диагностика
bull генотипирование
Получение материала
bull клонирование ДНК
bull мутагенез
bull секвенирование
N
N
О
О
Н
Н
Н
N
N
О
О
Н
Н
С
НН
Н
ОН
ОCH2
ОP
О
Оndash
HО
3`
4`
5`
2`
1`
Н
Х
Использование UDG ndash метод борьбы с контаминацией продуктами ПЦР
Тимин
(типичен
для ДНК)
Урацил
(типичен
для РНК)
Х = урацил
дезоксиуридинтрифосфат (dUTP) ndash может быть встроен в
растущую цепь как и dTTP не нарушает комплементарности
N
N
О
О
Н
Н
Н
О-
ОCH2
ОP
О
Оndash
О-
3`
4`
5`
2`
1`
Н
UDG 45-550С
Использование UDG ndash метод борьбы с контаминацией продуктами ПЦР
1) Урацил ДНК-гликозилаза присутствующая в ПЦР-смеси отщепляет урацил от цепи ДНК оставляя тн АР-сайт
О-
ОCH2
ОP
О
Оndash
О-
3`
4`
5`
2`
1`
Н
UDG 45-550С
AP-сайт
1) Урацил ДНК-гликозилаза присутствующая в ПЦР-смеси отщепляет урацил от цепи ДНК оставляя тн АР-сайт
Использование UDG ndash метод борьбы с контаминацией продуктами ПЦР
О-
ОCH2
ОP
О
Оndash
О-
3`
4`
5`
2`
1`
Н
Использование UDG ndash метод борьбы с контаминацией продуктами ПЦР
2) При нагревании до 950С UDG инактивируется а AP-сайты расщепляются в результате урацил-содержащая ДНК попавшая в пробирку до начала ПЦР деградирует3) Проводится обычная ПЦР реакционная смесь очищена от продуктов предыдущей амплификации
Digital PCR (dPCR)
65
R
PM 1ln М ndash среднее количество целевой ДНК на сегмент реакции (на основе
распределения Пуассона)Р ndash доля сегментов содержащих ПЦР-продуктR ndash общее кол-во проанализированных сегментов
Лимитирующие факторы dPCR
bull Количество сегментов реакции
bull Концентрация целевой ДНК в анализируемом образце
bull Реакционный объѐм
Коммерчески доступные системы реализующие dPCR
66
Fluidigm - технология микрофлюидных чипов
Bio-Rad (QuantaLife) -dPCR в суспензии
(Digital Droplet PCR)
Life Technologies
dPCR в платах OpenArrayreg
Подготовка образцов
(смешивание ДНК и ПЦР-реагентов)
Создание капель (Droplet Generator)
АмплификацияРегистрация и
анализ результатов
Digital droplet PCR (ddPCR)
bull QX100 Droplet Digital PCR System
Сравнение с Real-Time PCR
68
Digital PCR a powerful new tool for noninvasive prenatal diagnosis Bernhard G Zimmermann Simon Grill Wolfgang Holzgreve Prenat Diagn 2008 28 1087ndash1093
Применение ПЦР в NGS
69
Спасибо за внимание
ПЦР для клонирования в вектор
ПЦР в реальном времени(Real-time PCR)
bull одновременная амплификация и измерение количества продукта
bull наличие флюоресцентного красителя в смеси
bull наличие оптического блока в амплификаторе
линейный lg
33
Системы детекции
1 Неспецифичные
ndash интеркалирующие красители (SYBR Green и др)
2 Специфичные
ndash линейные разрушаемые пробы (TaqMan)
ndash laquoмолекулярные маячкиraquo (beacons)
ndash примыкающие пробы
SYBR Green
Метод TaqMan(линейные разрушаемые зонды)
флуоресцентные зонды и гашение флуоресценции
флуоресцентный
краситель
гаситель
флуоресценции
зонд
специфический фрагмент ДНК
FRET ndash Fluorescence Resonance Energy Transfer
FRET ndash Fluorescence Resonance Energy TransferРезонансный перенос энергии флуоресценции
Принцип метода TaqMan
bull 5`-3` экзонуклеазная активность Taq-полимеразы
Принцип метода TaqMan
bull 5`-3` экзонуклеазная активность Taq-полимеразы
Принцип метода TaqMan
bull 5`-3` экзонуклеазная активность Taq-полимеразы
Принцип метода TaqMan
bull 5`-3` экзонуклеазная активность Taq-полимеразы
Принцип метода TaqMan
bull 5`-3` экзонуклеазная активность Taq-полимеразы
Принцип метода TaqMan
bull 5`-3` экзонуклеазная активность Taq-полимеразы
bull нет участка для посадки праймера ndash нет сигнала
Принцип метода TaqMan
bull нет участка для посадки зонда ndash нет сигнала
Принцип метода TaqMan
Линейные разрушаемые пробы(TaqMan = Taq-polymerase + Pac-Man)
laquoМолекулярные маячкиraquo(molecular beacons)
Примыкающие пробы
Флюорофоры и гасители флюоресценции
Представление результатов ПЦР в реальном времени
линейный lg
Денатурация
Плавление после ПЦР
обратная производная
Плавление после ПЦР
Виды ПЦР-анализа
Качественный анализ
Сравнительный анализ
(полуколичественный)
Количественный анализ
есть нет
больше меньше Х раз
лечение
10 000 копий 1000 копий
Количественная ПЦР (qPCR)
bull Подсчёт числа копий генов
bull Анализ представленности транскриптов
bull Оценка инфекционной нагрузки
Количественная ПЦР
серия 10-кратных разведений
threshold ndash пороговая флюоресценцияCt ndash пороговый цикл
Преимущества Real-time PCR
bull возможность как качественной так и количественной оценки исходной матрицы
bull отсутствие манипуляций после проведения ПЦР (электрофорез)
bull большая чувствительность (от единичных копий) и специфичность
bull большой динамический диапазон концентраций (порядка 10^7)
bull возможность постановки Multiplex анализа
1 Научные исследования
ndash амплификация ДНК для гибридизации (блоттинг микрочипы)
ndash амплификация ДНК для секвенирования
ndash клонирование геномной ДНК кДНК
ndash филогенетическое сравнение геномов
ndash генетическое картирование
ndash анализ уровня транскрипции
Применение ПЦР
2 Медицина
ndash генетическое тестирование
ndash типирование тканей (для трансплантации)
ndash тестирование мутаций в онкогенах
ndash диагностика инфекций
3 Судебная медицина
ndash ДНК-дактилоскопия
ndash установление родства
4 Анализ пищевых продуктов детекция ГМО
Применение ПЦР
Применение ПЦР
Залог успеха ПЦР
bull высокая чувствительность
bull высокая специфичность
bull высокая устойчивость
bull низкая стоимость быстрота
Получение информации
bull анализ уровня транскрипции
bull ДНК-диагностика
bull генотипирование
Получение материала
bull клонирование ДНК
bull мутагенез
bull секвенирование
N
N
О
О
Н
Н
Н
N
N
О
О
Н
Н
С
НН
Н
ОН
ОCH2
ОP
О
Оndash
HО
3`
4`
5`
2`
1`
Н
Х
Использование UDG ndash метод борьбы с контаминацией продуктами ПЦР
Тимин
(типичен
для ДНК)
Урацил
(типичен
для РНК)
Х = урацил
дезоксиуридинтрифосфат (dUTP) ndash может быть встроен в
растущую цепь как и dTTP не нарушает комплементарности
N
N
О
О
Н
Н
Н
О-
ОCH2
ОP
О
Оndash
О-
3`
4`
5`
2`
1`
Н
UDG 45-550С
Использование UDG ndash метод борьбы с контаминацией продуктами ПЦР
1) Урацил ДНК-гликозилаза присутствующая в ПЦР-смеси отщепляет урацил от цепи ДНК оставляя тн АР-сайт
О-
ОCH2
ОP
О
Оndash
О-
3`
4`
5`
2`
1`
Н
UDG 45-550С
AP-сайт
1) Урацил ДНК-гликозилаза присутствующая в ПЦР-смеси отщепляет урацил от цепи ДНК оставляя тн АР-сайт
Использование UDG ndash метод борьбы с контаминацией продуктами ПЦР
О-
ОCH2
ОP
О
Оndash
О-
3`
4`
5`
2`
1`
Н
Использование UDG ndash метод борьбы с контаминацией продуктами ПЦР
2) При нагревании до 950С UDG инактивируется а AP-сайты расщепляются в результате урацил-содержащая ДНК попавшая в пробирку до начала ПЦР деградирует3) Проводится обычная ПЦР реакционная смесь очищена от продуктов предыдущей амплификации
Digital PCR (dPCR)
65
R
PM 1ln М ndash среднее количество целевой ДНК на сегмент реакции (на основе
распределения Пуассона)Р ndash доля сегментов содержащих ПЦР-продуктR ndash общее кол-во проанализированных сегментов
Лимитирующие факторы dPCR
bull Количество сегментов реакции
bull Концентрация целевой ДНК в анализируемом образце
bull Реакционный объѐм
Коммерчески доступные системы реализующие dPCR
66
Fluidigm - технология микрофлюидных чипов
Bio-Rad (QuantaLife) -dPCR в суспензии
(Digital Droplet PCR)
Life Technologies
dPCR в платах OpenArrayreg
Подготовка образцов
(смешивание ДНК и ПЦР-реагентов)
Создание капель (Droplet Generator)
АмплификацияРегистрация и
анализ результатов
Digital droplet PCR (ddPCR)
bull QX100 Droplet Digital PCR System
Сравнение с Real-Time PCR
68
Digital PCR a powerful new tool for noninvasive prenatal diagnosis Bernhard G Zimmermann Simon Grill Wolfgang Holzgreve Prenat Diagn 2008 28 1087ndash1093
Применение ПЦР в NGS
69
Спасибо за внимание
ПЦР в реальном времени(Real-time PCR)
bull одновременная амплификация и измерение количества продукта
bull наличие флюоресцентного красителя в смеси
bull наличие оптического блока в амплификаторе
линейный lg
33
Системы детекции
1 Неспецифичные
ndash интеркалирующие красители (SYBR Green и др)
2 Специфичные
ndash линейные разрушаемые пробы (TaqMan)
ndash laquoмолекулярные маячкиraquo (beacons)
ndash примыкающие пробы
SYBR Green
Метод TaqMan(линейные разрушаемые зонды)
флуоресцентные зонды и гашение флуоресценции
флуоресцентный
краситель
гаситель
флуоресценции
зонд
специфический фрагмент ДНК
FRET ndash Fluorescence Resonance Energy Transfer
FRET ndash Fluorescence Resonance Energy TransferРезонансный перенос энергии флуоресценции
Принцип метода TaqMan
bull 5`-3` экзонуклеазная активность Taq-полимеразы
Принцип метода TaqMan
bull 5`-3` экзонуклеазная активность Taq-полимеразы
Принцип метода TaqMan
bull 5`-3` экзонуклеазная активность Taq-полимеразы
Принцип метода TaqMan
bull 5`-3` экзонуклеазная активность Taq-полимеразы
Принцип метода TaqMan
bull 5`-3` экзонуклеазная активность Taq-полимеразы
Принцип метода TaqMan
bull 5`-3` экзонуклеазная активность Taq-полимеразы
bull нет участка для посадки праймера ndash нет сигнала
Принцип метода TaqMan
bull нет участка для посадки зонда ndash нет сигнала
Принцип метода TaqMan
Линейные разрушаемые пробы(TaqMan = Taq-polymerase + Pac-Man)
laquoМолекулярные маячкиraquo(molecular beacons)
Примыкающие пробы
Флюорофоры и гасители флюоресценции
Представление результатов ПЦР в реальном времени
линейный lg
Денатурация
Плавление после ПЦР
обратная производная
Плавление после ПЦР
Виды ПЦР-анализа
Качественный анализ
Сравнительный анализ
(полуколичественный)
Количественный анализ
есть нет
больше меньше Х раз
лечение
10 000 копий 1000 копий
Количественная ПЦР (qPCR)
bull Подсчёт числа копий генов
bull Анализ представленности транскриптов
bull Оценка инфекционной нагрузки
Количественная ПЦР
серия 10-кратных разведений
threshold ndash пороговая флюоресценцияCt ndash пороговый цикл
Преимущества Real-time PCR
bull возможность как качественной так и количественной оценки исходной матрицы
bull отсутствие манипуляций после проведения ПЦР (электрофорез)
bull большая чувствительность (от единичных копий) и специфичность
bull большой динамический диапазон концентраций (порядка 10^7)
bull возможность постановки Multiplex анализа
1 Научные исследования
ndash амплификация ДНК для гибридизации (блоттинг микрочипы)
ndash амплификация ДНК для секвенирования
ndash клонирование геномной ДНК кДНК
ndash филогенетическое сравнение геномов
ndash генетическое картирование
ndash анализ уровня транскрипции
Применение ПЦР
2 Медицина
ndash генетическое тестирование
ndash типирование тканей (для трансплантации)
ndash тестирование мутаций в онкогенах
ndash диагностика инфекций
3 Судебная медицина
ndash ДНК-дактилоскопия
ndash установление родства
4 Анализ пищевых продуктов детекция ГМО
Применение ПЦР
Применение ПЦР
Залог успеха ПЦР
bull высокая чувствительность
bull высокая специфичность
bull высокая устойчивость
bull низкая стоимость быстрота
Получение информации
bull анализ уровня транскрипции
bull ДНК-диагностика
bull генотипирование
Получение материала
bull клонирование ДНК
bull мутагенез
bull секвенирование
N
N
О
О
Н
Н
Н
N
N
О
О
Н
Н
С
НН
Н
ОН
ОCH2
ОP
О
Оndash
HО
3`
4`
5`
2`
1`
Н
Х
Использование UDG ndash метод борьбы с контаминацией продуктами ПЦР
Тимин
(типичен
для ДНК)
Урацил
(типичен
для РНК)
Х = урацил
дезоксиуридинтрифосфат (dUTP) ndash может быть встроен в
растущую цепь как и dTTP не нарушает комплементарности
N
N
О
О
Н
Н
Н
О-
ОCH2
ОP
О
Оndash
О-
3`
4`
5`
2`
1`
Н
UDG 45-550С
Использование UDG ndash метод борьбы с контаминацией продуктами ПЦР
1) Урацил ДНК-гликозилаза присутствующая в ПЦР-смеси отщепляет урацил от цепи ДНК оставляя тн АР-сайт
О-
ОCH2
ОP
О
Оndash
О-
3`
4`
5`
2`
1`
Н
UDG 45-550С
AP-сайт
1) Урацил ДНК-гликозилаза присутствующая в ПЦР-смеси отщепляет урацил от цепи ДНК оставляя тн АР-сайт
Использование UDG ndash метод борьбы с контаминацией продуктами ПЦР
О-
ОCH2
ОP
О
Оndash
О-
3`
4`
5`
2`
1`
Н
Использование UDG ndash метод борьбы с контаминацией продуктами ПЦР
2) При нагревании до 950С UDG инактивируется а AP-сайты расщепляются в результате урацил-содержащая ДНК попавшая в пробирку до начала ПЦР деградирует3) Проводится обычная ПЦР реакционная смесь очищена от продуктов предыдущей амплификации
Digital PCR (dPCR)
65
R
PM 1ln М ndash среднее количество целевой ДНК на сегмент реакции (на основе
распределения Пуассона)Р ndash доля сегментов содержащих ПЦР-продуктR ndash общее кол-во проанализированных сегментов
Лимитирующие факторы dPCR
bull Количество сегментов реакции
bull Концентрация целевой ДНК в анализируемом образце
bull Реакционный объѐм
Коммерчески доступные системы реализующие dPCR
66
Fluidigm - технология микрофлюидных чипов
Bio-Rad (QuantaLife) -dPCR в суспензии
(Digital Droplet PCR)
Life Technologies
dPCR в платах OpenArrayreg
Подготовка образцов
(смешивание ДНК и ПЦР-реагентов)
Создание капель (Droplet Generator)
АмплификацияРегистрация и
анализ результатов
Digital droplet PCR (ddPCR)
bull QX100 Droplet Digital PCR System
Сравнение с Real-Time PCR
68
Digital PCR a powerful new tool for noninvasive prenatal diagnosis Bernhard G Zimmermann Simon Grill Wolfgang Holzgreve Prenat Diagn 2008 28 1087ndash1093
Применение ПЦР в NGS
69
Спасибо за внимание
Системы детекции
1 Неспецифичные
ndash интеркалирующие красители (SYBR Green и др)
2 Специфичные
ndash линейные разрушаемые пробы (TaqMan)
ndash laquoмолекулярные маячкиraquo (beacons)
ndash примыкающие пробы
SYBR Green
Метод TaqMan(линейные разрушаемые зонды)
флуоресцентные зонды и гашение флуоресценции
флуоресцентный
краситель
гаситель
флуоресценции
зонд
специфический фрагмент ДНК
FRET ndash Fluorescence Resonance Energy Transfer
FRET ndash Fluorescence Resonance Energy TransferРезонансный перенос энергии флуоресценции
Принцип метода TaqMan
bull 5`-3` экзонуклеазная активность Taq-полимеразы
Принцип метода TaqMan
bull 5`-3` экзонуклеазная активность Taq-полимеразы
Принцип метода TaqMan
bull 5`-3` экзонуклеазная активность Taq-полимеразы
Принцип метода TaqMan
bull 5`-3` экзонуклеазная активность Taq-полимеразы
Принцип метода TaqMan
bull 5`-3` экзонуклеазная активность Taq-полимеразы
Принцип метода TaqMan
bull 5`-3` экзонуклеазная активность Taq-полимеразы
bull нет участка для посадки праймера ndash нет сигнала
Принцип метода TaqMan
bull нет участка для посадки зонда ndash нет сигнала
Принцип метода TaqMan
Линейные разрушаемые пробы(TaqMan = Taq-polymerase + Pac-Man)
laquoМолекулярные маячкиraquo(molecular beacons)
Примыкающие пробы
Флюорофоры и гасители флюоресценции
Представление результатов ПЦР в реальном времени
линейный lg
Денатурация
Плавление после ПЦР
обратная производная
Плавление после ПЦР
Виды ПЦР-анализа
Качественный анализ
Сравнительный анализ
(полуколичественный)
Количественный анализ
есть нет
больше меньше Х раз
лечение
10 000 копий 1000 копий
Количественная ПЦР (qPCR)
bull Подсчёт числа копий генов
bull Анализ представленности транскриптов
bull Оценка инфекционной нагрузки
Количественная ПЦР
серия 10-кратных разведений
threshold ndash пороговая флюоресценцияCt ndash пороговый цикл
Преимущества Real-time PCR
bull возможность как качественной так и количественной оценки исходной матрицы
bull отсутствие манипуляций после проведения ПЦР (электрофорез)
bull большая чувствительность (от единичных копий) и специфичность
bull большой динамический диапазон концентраций (порядка 10^7)
bull возможность постановки Multiplex анализа
1 Научные исследования
ndash амплификация ДНК для гибридизации (блоттинг микрочипы)
ndash амплификация ДНК для секвенирования
ndash клонирование геномной ДНК кДНК
ndash филогенетическое сравнение геномов
ndash генетическое картирование
ndash анализ уровня транскрипции
Применение ПЦР
2 Медицина
ndash генетическое тестирование
ndash типирование тканей (для трансплантации)
ndash тестирование мутаций в онкогенах
ndash диагностика инфекций
3 Судебная медицина
ndash ДНК-дактилоскопия
ndash установление родства
4 Анализ пищевых продуктов детекция ГМО
Применение ПЦР
Применение ПЦР
Залог успеха ПЦР
bull высокая чувствительность
bull высокая специфичность
bull высокая устойчивость
bull низкая стоимость быстрота
Получение информации
bull анализ уровня транскрипции
bull ДНК-диагностика
bull генотипирование
Получение материала
bull клонирование ДНК
bull мутагенез
bull секвенирование
N
N
О
О
Н
Н
Н
N
N
О
О
Н
Н
С
НН
Н
ОН
ОCH2
ОP
О
Оndash
HО
3`
4`
5`
2`
1`
Н
Х
Использование UDG ndash метод борьбы с контаминацией продуктами ПЦР
Тимин
(типичен
для ДНК)
Урацил
(типичен
для РНК)
Х = урацил
дезоксиуридинтрифосфат (dUTP) ndash может быть встроен в
растущую цепь как и dTTP не нарушает комплементарности
N
N
О
О
Н
Н
Н
О-
ОCH2
ОP
О
Оndash
О-
3`
4`
5`
2`
1`
Н
UDG 45-550С
Использование UDG ndash метод борьбы с контаминацией продуктами ПЦР
1) Урацил ДНК-гликозилаза присутствующая в ПЦР-смеси отщепляет урацил от цепи ДНК оставляя тн АР-сайт
О-
ОCH2
ОP
О
Оndash
О-
3`
4`
5`
2`
1`
Н
UDG 45-550С
AP-сайт
1) Урацил ДНК-гликозилаза присутствующая в ПЦР-смеси отщепляет урацил от цепи ДНК оставляя тн АР-сайт
Использование UDG ndash метод борьбы с контаминацией продуктами ПЦР
О-
ОCH2
ОP
О
Оndash
О-
3`
4`
5`
2`
1`
Н
Использование UDG ndash метод борьбы с контаминацией продуктами ПЦР
2) При нагревании до 950С UDG инактивируется а AP-сайты расщепляются в результате урацил-содержащая ДНК попавшая в пробирку до начала ПЦР деградирует3) Проводится обычная ПЦР реакционная смесь очищена от продуктов предыдущей амплификации
Digital PCR (dPCR)
65
R
PM 1ln М ndash среднее количество целевой ДНК на сегмент реакции (на основе
распределения Пуассона)Р ndash доля сегментов содержащих ПЦР-продуктR ndash общее кол-во проанализированных сегментов
Лимитирующие факторы dPCR
bull Количество сегментов реакции
bull Концентрация целевой ДНК в анализируемом образце
bull Реакционный объѐм
Коммерчески доступные системы реализующие dPCR
66
Fluidigm - технология микрофлюидных чипов
Bio-Rad (QuantaLife) -dPCR в суспензии
(Digital Droplet PCR)
Life Technologies
dPCR в платах OpenArrayreg
Подготовка образцов
(смешивание ДНК и ПЦР-реагентов)
Создание капель (Droplet Generator)
АмплификацияРегистрация и
анализ результатов
Digital droplet PCR (ddPCR)
bull QX100 Droplet Digital PCR System
Сравнение с Real-Time PCR
68
Digital PCR a powerful new tool for noninvasive prenatal diagnosis Bernhard G Zimmermann Simon Grill Wolfgang Holzgreve Prenat Diagn 2008 28 1087ndash1093
Применение ПЦР в NGS
69
Спасибо за внимание
SYBR Green
Метод TaqMan(линейные разрушаемые зонды)
флуоресцентные зонды и гашение флуоресценции
флуоресцентный
краситель
гаситель
флуоресценции
зонд
специфический фрагмент ДНК
FRET ndash Fluorescence Resonance Energy Transfer
FRET ndash Fluorescence Resonance Energy TransferРезонансный перенос энергии флуоресценции
Принцип метода TaqMan
bull 5`-3` экзонуклеазная активность Taq-полимеразы
Принцип метода TaqMan
bull 5`-3` экзонуклеазная активность Taq-полимеразы
Принцип метода TaqMan
bull 5`-3` экзонуклеазная активность Taq-полимеразы
Принцип метода TaqMan
bull 5`-3` экзонуклеазная активность Taq-полимеразы
Принцип метода TaqMan
bull 5`-3` экзонуклеазная активность Taq-полимеразы
Принцип метода TaqMan
bull 5`-3` экзонуклеазная активность Taq-полимеразы
bull нет участка для посадки праймера ndash нет сигнала
Принцип метода TaqMan
bull нет участка для посадки зонда ndash нет сигнала
Принцип метода TaqMan
Линейные разрушаемые пробы(TaqMan = Taq-polymerase + Pac-Man)
laquoМолекулярные маячкиraquo(molecular beacons)
Примыкающие пробы
Флюорофоры и гасители флюоресценции
Представление результатов ПЦР в реальном времени
линейный lg
Денатурация
Плавление после ПЦР
обратная производная
Плавление после ПЦР
Виды ПЦР-анализа
Качественный анализ
Сравнительный анализ
(полуколичественный)
Количественный анализ
есть нет
больше меньше Х раз
лечение
10 000 копий 1000 копий
Количественная ПЦР (qPCR)
bull Подсчёт числа копий генов
bull Анализ представленности транскриптов
bull Оценка инфекционной нагрузки
Количественная ПЦР
серия 10-кратных разведений
threshold ndash пороговая флюоресценцияCt ndash пороговый цикл
Преимущества Real-time PCR
bull возможность как качественной так и количественной оценки исходной матрицы
bull отсутствие манипуляций после проведения ПЦР (электрофорез)
bull большая чувствительность (от единичных копий) и специфичность
bull большой динамический диапазон концентраций (порядка 10^7)
bull возможность постановки Multiplex анализа
1 Научные исследования
ndash амплификация ДНК для гибридизации (блоттинг микрочипы)
ndash амплификация ДНК для секвенирования
ndash клонирование геномной ДНК кДНК
ndash филогенетическое сравнение геномов
ndash генетическое картирование
ndash анализ уровня транскрипции
Применение ПЦР
2 Медицина
ndash генетическое тестирование
ndash типирование тканей (для трансплантации)
ndash тестирование мутаций в онкогенах
ndash диагностика инфекций
3 Судебная медицина
ndash ДНК-дактилоскопия
ndash установление родства
4 Анализ пищевых продуктов детекция ГМО
Применение ПЦР
Применение ПЦР
Залог успеха ПЦР
bull высокая чувствительность
bull высокая специфичность
bull высокая устойчивость
bull низкая стоимость быстрота
Получение информации
bull анализ уровня транскрипции
bull ДНК-диагностика
bull генотипирование
Получение материала
bull клонирование ДНК
bull мутагенез
bull секвенирование
N
N
О
О
Н
Н
Н
N
N
О
О
Н
Н
С
НН
Н
ОН
ОCH2
ОP
О
Оndash
HО
3`
4`
5`
2`
1`
Н
Х
Использование UDG ndash метод борьбы с контаминацией продуктами ПЦР
Тимин
(типичен
для ДНК)
Урацил
(типичен
для РНК)
Х = урацил
дезоксиуридинтрифосфат (dUTP) ndash может быть встроен в
растущую цепь как и dTTP не нарушает комплементарности
N
N
О
О
Н
Н
Н
О-
ОCH2
ОP
О
Оndash
О-
3`
4`
5`
2`
1`
Н
UDG 45-550С
Использование UDG ndash метод борьбы с контаминацией продуктами ПЦР
1) Урацил ДНК-гликозилаза присутствующая в ПЦР-смеси отщепляет урацил от цепи ДНК оставляя тн АР-сайт
О-
ОCH2
ОP
О
Оndash
О-
3`
4`
5`
2`
1`
Н
UDG 45-550С
AP-сайт
1) Урацил ДНК-гликозилаза присутствующая в ПЦР-смеси отщепляет урацил от цепи ДНК оставляя тн АР-сайт
Использование UDG ndash метод борьбы с контаминацией продуктами ПЦР
О-
ОCH2
ОP
О
Оndash
О-
3`
4`
5`
2`
1`
Н
Использование UDG ndash метод борьбы с контаминацией продуктами ПЦР
2) При нагревании до 950С UDG инактивируется а AP-сайты расщепляются в результате урацил-содержащая ДНК попавшая в пробирку до начала ПЦР деградирует3) Проводится обычная ПЦР реакционная смесь очищена от продуктов предыдущей амплификации
Digital PCR (dPCR)
65
R
PM 1ln М ndash среднее количество целевой ДНК на сегмент реакции (на основе
распределения Пуассона)Р ndash доля сегментов содержащих ПЦР-продуктR ndash общее кол-во проанализированных сегментов
Лимитирующие факторы dPCR
bull Количество сегментов реакции
bull Концентрация целевой ДНК в анализируемом образце
bull Реакционный объѐм
Коммерчески доступные системы реализующие dPCR
66
Fluidigm - технология микрофлюидных чипов
Bio-Rad (QuantaLife) -dPCR в суспензии
(Digital Droplet PCR)
Life Technologies
dPCR в платах OpenArrayreg
Подготовка образцов
(смешивание ДНК и ПЦР-реагентов)
Создание капель (Droplet Generator)
АмплификацияРегистрация и
анализ результатов
Digital droplet PCR (ddPCR)
bull QX100 Droplet Digital PCR System
Сравнение с Real-Time PCR
68
Digital PCR a powerful new tool for noninvasive prenatal diagnosis Bernhard G Zimmermann Simon Grill Wolfgang Holzgreve Prenat Diagn 2008 28 1087ndash1093
Применение ПЦР в NGS
69
Спасибо за внимание
Метод TaqMan(линейные разрушаемые зонды)
флуоресцентные зонды и гашение флуоресценции
флуоресцентный
краситель
гаситель
флуоресценции
зонд
специфический фрагмент ДНК
FRET ndash Fluorescence Resonance Energy Transfer
FRET ndash Fluorescence Resonance Energy TransferРезонансный перенос энергии флуоресценции
Принцип метода TaqMan
bull 5`-3` экзонуклеазная активность Taq-полимеразы
Принцип метода TaqMan
bull 5`-3` экзонуклеазная активность Taq-полимеразы
Принцип метода TaqMan
bull 5`-3` экзонуклеазная активность Taq-полимеразы
Принцип метода TaqMan
bull 5`-3` экзонуклеазная активность Taq-полимеразы
Принцип метода TaqMan
bull 5`-3` экзонуклеазная активность Taq-полимеразы
Принцип метода TaqMan
bull 5`-3` экзонуклеазная активность Taq-полимеразы
bull нет участка для посадки праймера ndash нет сигнала
Принцип метода TaqMan
bull нет участка для посадки зонда ndash нет сигнала
Принцип метода TaqMan
Линейные разрушаемые пробы(TaqMan = Taq-polymerase + Pac-Man)
laquoМолекулярные маячкиraquo(molecular beacons)
Примыкающие пробы
Флюорофоры и гасители флюоресценции
Представление результатов ПЦР в реальном времени
линейный lg
Денатурация
Плавление после ПЦР
обратная производная
Плавление после ПЦР
Виды ПЦР-анализа
Качественный анализ
Сравнительный анализ
(полуколичественный)
Количественный анализ
есть нет
больше меньше Х раз
лечение
10 000 копий 1000 копий
Количественная ПЦР (qPCR)
bull Подсчёт числа копий генов
bull Анализ представленности транскриптов
bull Оценка инфекционной нагрузки
Количественная ПЦР
серия 10-кратных разведений
threshold ndash пороговая флюоресценцияCt ndash пороговый цикл
Преимущества Real-time PCR
bull возможность как качественной так и количественной оценки исходной матрицы
bull отсутствие манипуляций после проведения ПЦР (электрофорез)
bull большая чувствительность (от единичных копий) и специфичность
bull большой динамический диапазон концентраций (порядка 10^7)
bull возможность постановки Multiplex анализа
1 Научные исследования
ndash амплификация ДНК для гибридизации (блоттинг микрочипы)
ndash амплификация ДНК для секвенирования
ndash клонирование геномной ДНК кДНК
ndash филогенетическое сравнение геномов
ndash генетическое картирование
ndash анализ уровня транскрипции
Применение ПЦР
2 Медицина
ndash генетическое тестирование
ndash типирование тканей (для трансплантации)
ndash тестирование мутаций в онкогенах
ndash диагностика инфекций
3 Судебная медицина
ndash ДНК-дактилоскопия
ndash установление родства
4 Анализ пищевых продуктов детекция ГМО
Применение ПЦР
Применение ПЦР
Залог успеха ПЦР
bull высокая чувствительность
bull высокая специфичность
bull высокая устойчивость
bull низкая стоимость быстрота
Получение информации
bull анализ уровня транскрипции
bull ДНК-диагностика
bull генотипирование
Получение материала
bull клонирование ДНК
bull мутагенез
bull секвенирование
N
N
О
О
Н
Н
Н
N
N
О
О
Н
Н
С
НН
Н
ОН
ОCH2
ОP
О
Оndash
HО
3`
4`
5`
2`
1`
Н
Х
Использование UDG ndash метод борьбы с контаминацией продуктами ПЦР
Тимин
(типичен
для ДНК)
Урацил
(типичен
для РНК)
Х = урацил
дезоксиуридинтрифосфат (dUTP) ndash может быть встроен в
растущую цепь как и dTTP не нарушает комплементарности
N
N
О
О
Н
Н
Н
О-
ОCH2
ОP
О
Оndash
О-
3`
4`
5`
2`
1`
Н
UDG 45-550С
Использование UDG ndash метод борьбы с контаминацией продуктами ПЦР
1) Урацил ДНК-гликозилаза присутствующая в ПЦР-смеси отщепляет урацил от цепи ДНК оставляя тн АР-сайт
О-
ОCH2
ОP
О
Оndash
О-
3`
4`
5`
2`
1`
Н
UDG 45-550С
AP-сайт
1) Урацил ДНК-гликозилаза присутствующая в ПЦР-смеси отщепляет урацил от цепи ДНК оставляя тн АР-сайт
Использование UDG ndash метод борьбы с контаминацией продуктами ПЦР
О-
ОCH2
ОP
О
Оndash
О-
3`
4`
5`
2`
1`
Н
Использование UDG ndash метод борьбы с контаминацией продуктами ПЦР
2) При нагревании до 950С UDG инактивируется а AP-сайты расщепляются в результате урацил-содержащая ДНК попавшая в пробирку до начала ПЦР деградирует3) Проводится обычная ПЦР реакционная смесь очищена от продуктов предыдущей амплификации
Digital PCR (dPCR)
65
R
PM 1ln М ndash среднее количество целевой ДНК на сегмент реакции (на основе
распределения Пуассона)Р ndash доля сегментов содержащих ПЦР-продуктR ndash общее кол-во проанализированных сегментов
Лимитирующие факторы dPCR
bull Количество сегментов реакции
bull Концентрация целевой ДНК в анализируемом образце
bull Реакционный объѐм
Коммерчески доступные системы реализующие dPCR
66
Fluidigm - технология микрофлюидных чипов
Bio-Rad (QuantaLife) -dPCR в суспензии
(Digital Droplet PCR)
Life Technologies
dPCR в платах OpenArrayreg
Подготовка образцов
(смешивание ДНК и ПЦР-реагентов)
Создание капель (Droplet Generator)
АмплификацияРегистрация и
анализ результатов
Digital droplet PCR (ddPCR)
bull QX100 Droplet Digital PCR System
Сравнение с Real-Time PCR
68
Digital PCR a powerful new tool for noninvasive prenatal diagnosis Bernhard G Zimmermann Simon Grill Wolfgang Holzgreve Prenat Diagn 2008 28 1087ndash1093
Применение ПЦР в NGS
69
Спасибо за внимание
FRET ndash Fluorescence Resonance Energy TransferРезонансный перенос энергии флуоресценции
Принцип метода TaqMan
bull 5`-3` экзонуклеазная активность Taq-полимеразы
Принцип метода TaqMan
bull 5`-3` экзонуклеазная активность Taq-полимеразы
Принцип метода TaqMan
bull 5`-3` экзонуклеазная активность Taq-полимеразы
Принцип метода TaqMan
bull 5`-3` экзонуклеазная активность Taq-полимеразы
Принцип метода TaqMan
bull 5`-3` экзонуклеазная активность Taq-полимеразы
Принцип метода TaqMan
bull 5`-3` экзонуклеазная активность Taq-полимеразы
bull нет участка для посадки праймера ndash нет сигнала
Принцип метода TaqMan
bull нет участка для посадки зонда ndash нет сигнала
Принцип метода TaqMan
Линейные разрушаемые пробы(TaqMan = Taq-polymerase + Pac-Man)
laquoМолекулярные маячкиraquo(molecular beacons)
Примыкающие пробы
Флюорофоры и гасители флюоресценции
Представление результатов ПЦР в реальном времени
линейный lg
Денатурация
Плавление после ПЦР
обратная производная
Плавление после ПЦР
Виды ПЦР-анализа
Качественный анализ
Сравнительный анализ
(полуколичественный)
Количественный анализ
есть нет
больше меньше Х раз
лечение
10 000 копий 1000 копий
Количественная ПЦР (qPCR)
bull Подсчёт числа копий генов
bull Анализ представленности транскриптов
bull Оценка инфекционной нагрузки
Количественная ПЦР
серия 10-кратных разведений
threshold ndash пороговая флюоресценцияCt ndash пороговый цикл
Преимущества Real-time PCR
bull возможность как качественной так и количественной оценки исходной матрицы
bull отсутствие манипуляций после проведения ПЦР (электрофорез)
bull большая чувствительность (от единичных копий) и специфичность
bull большой динамический диапазон концентраций (порядка 10^7)
bull возможность постановки Multiplex анализа
1 Научные исследования
ndash амплификация ДНК для гибридизации (блоттинг микрочипы)
ndash амплификация ДНК для секвенирования
ndash клонирование геномной ДНК кДНК
ndash филогенетическое сравнение геномов
ndash генетическое картирование
ndash анализ уровня транскрипции
Применение ПЦР
2 Медицина
ndash генетическое тестирование
ndash типирование тканей (для трансплантации)
ndash тестирование мутаций в онкогенах
ndash диагностика инфекций
3 Судебная медицина
ndash ДНК-дактилоскопия
ndash установление родства
4 Анализ пищевых продуктов детекция ГМО
Применение ПЦР
Применение ПЦР
Залог успеха ПЦР
bull высокая чувствительность
bull высокая специфичность
bull высокая устойчивость
bull низкая стоимость быстрота
Получение информации
bull анализ уровня транскрипции
bull ДНК-диагностика
bull генотипирование
Получение материала
bull клонирование ДНК
bull мутагенез
bull секвенирование
N
N
О
О
Н
Н
Н
N
N
О
О
Н
Н
С
НН
Н
ОН
ОCH2
ОP
О
Оndash
HО
3`
4`
5`
2`
1`
Н
Х
Использование UDG ndash метод борьбы с контаминацией продуктами ПЦР
Тимин
(типичен
для ДНК)
Урацил
(типичен
для РНК)
Х = урацил
дезоксиуридинтрифосфат (dUTP) ndash может быть встроен в
растущую цепь как и dTTP не нарушает комплементарности
N
N
О
О
Н
Н
Н
О-
ОCH2
ОP
О
Оndash
О-
3`
4`
5`
2`
1`
Н
UDG 45-550С
Использование UDG ndash метод борьбы с контаминацией продуктами ПЦР
1) Урацил ДНК-гликозилаза присутствующая в ПЦР-смеси отщепляет урацил от цепи ДНК оставляя тн АР-сайт
О-
ОCH2
ОP
О
Оndash
О-
3`
4`
5`
2`
1`
Н
UDG 45-550С
AP-сайт
1) Урацил ДНК-гликозилаза присутствующая в ПЦР-смеси отщепляет урацил от цепи ДНК оставляя тн АР-сайт
Использование UDG ndash метод борьбы с контаминацией продуктами ПЦР
О-
ОCH2
ОP
О
Оndash
О-
3`
4`
5`
2`
1`
Н
Использование UDG ndash метод борьбы с контаминацией продуктами ПЦР
2) При нагревании до 950С UDG инактивируется а AP-сайты расщепляются в результате урацил-содержащая ДНК попавшая в пробирку до начала ПЦР деградирует3) Проводится обычная ПЦР реакционная смесь очищена от продуктов предыдущей амплификации
Digital PCR (dPCR)
65
R
PM 1ln М ndash среднее количество целевой ДНК на сегмент реакции (на основе
распределения Пуассона)Р ndash доля сегментов содержащих ПЦР-продуктR ndash общее кол-во проанализированных сегментов
Лимитирующие факторы dPCR
bull Количество сегментов реакции
bull Концентрация целевой ДНК в анализируемом образце
bull Реакционный объѐм
Коммерчески доступные системы реализующие dPCR
66
Fluidigm - технология микрофлюидных чипов
Bio-Rad (QuantaLife) -dPCR в суспензии
(Digital Droplet PCR)
Life Technologies
dPCR в платах OpenArrayreg
Подготовка образцов
(смешивание ДНК и ПЦР-реагентов)
Создание капель (Droplet Generator)
АмплификацияРегистрация и
анализ результатов
Digital droplet PCR (ddPCR)
bull QX100 Droplet Digital PCR System
Сравнение с Real-Time PCR
68
Digital PCR a powerful new tool for noninvasive prenatal diagnosis Bernhard G Zimmermann Simon Grill Wolfgang Holzgreve Prenat Diagn 2008 28 1087ndash1093
Применение ПЦР в NGS
69
Спасибо за внимание
Принцип метода TaqMan
bull 5`-3` экзонуклеазная активность Taq-полимеразы
Принцип метода TaqMan
bull 5`-3` экзонуклеазная активность Taq-полимеразы
Принцип метода TaqMan
bull 5`-3` экзонуклеазная активность Taq-полимеразы
Принцип метода TaqMan
bull 5`-3` экзонуклеазная активность Taq-полимеразы
Принцип метода TaqMan
bull 5`-3` экзонуклеазная активность Taq-полимеразы
Принцип метода TaqMan
bull 5`-3` экзонуклеазная активность Taq-полимеразы
bull нет участка для посадки праймера ndash нет сигнала
Принцип метода TaqMan
bull нет участка для посадки зонда ndash нет сигнала
Принцип метода TaqMan
Линейные разрушаемые пробы(TaqMan = Taq-polymerase + Pac-Man)
laquoМолекулярные маячкиraquo(molecular beacons)
Примыкающие пробы
Флюорофоры и гасители флюоресценции
Представление результатов ПЦР в реальном времени
линейный lg
Денатурация
Плавление после ПЦР
обратная производная
Плавление после ПЦР
Виды ПЦР-анализа
Качественный анализ
Сравнительный анализ
(полуколичественный)
Количественный анализ
есть нет
больше меньше Х раз
лечение
10 000 копий 1000 копий
Количественная ПЦР (qPCR)
bull Подсчёт числа копий генов
bull Анализ представленности транскриптов
bull Оценка инфекционной нагрузки
Количественная ПЦР
серия 10-кратных разведений
threshold ndash пороговая флюоресценцияCt ndash пороговый цикл
Преимущества Real-time PCR
bull возможность как качественной так и количественной оценки исходной матрицы
bull отсутствие манипуляций после проведения ПЦР (электрофорез)
bull большая чувствительность (от единичных копий) и специфичность
bull большой динамический диапазон концентраций (порядка 10^7)
bull возможность постановки Multiplex анализа
1 Научные исследования
ndash амплификация ДНК для гибридизации (блоттинг микрочипы)
ndash амплификация ДНК для секвенирования
ndash клонирование геномной ДНК кДНК
ndash филогенетическое сравнение геномов
ndash генетическое картирование
ndash анализ уровня транскрипции
Применение ПЦР
2 Медицина
ndash генетическое тестирование
ndash типирование тканей (для трансплантации)
ndash тестирование мутаций в онкогенах
ndash диагностика инфекций
3 Судебная медицина
ndash ДНК-дактилоскопия
ndash установление родства
4 Анализ пищевых продуктов детекция ГМО
Применение ПЦР
Применение ПЦР
Залог успеха ПЦР
bull высокая чувствительность
bull высокая специфичность
bull высокая устойчивость
bull низкая стоимость быстрота
Получение информации
bull анализ уровня транскрипции
bull ДНК-диагностика
bull генотипирование
Получение материала
bull клонирование ДНК
bull мутагенез
bull секвенирование
N
N
О
О
Н
Н
Н
N
N
О
О
Н
Н
С
НН
Н
ОН
ОCH2
ОP
О
Оndash
HО
3`
4`
5`
2`
1`
Н
Х
Использование UDG ndash метод борьбы с контаминацией продуктами ПЦР
Тимин
(типичен
для ДНК)
Урацил
(типичен
для РНК)
Х = урацил
дезоксиуридинтрифосфат (dUTP) ndash может быть встроен в
растущую цепь как и dTTP не нарушает комплементарности
N
N
О
О
Н
Н
Н
О-
ОCH2
ОP
О
Оndash
О-
3`
4`
5`
2`
1`
Н
UDG 45-550С
Использование UDG ndash метод борьбы с контаминацией продуктами ПЦР
1) Урацил ДНК-гликозилаза присутствующая в ПЦР-смеси отщепляет урацил от цепи ДНК оставляя тн АР-сайт
О-
ОCH2
ОP
О
Оndash
О-
3`
4`
5`
2`
1`
Н
UDG 45-550С
AP-сайт
1) Урацил ДНК-гликозилаза присутствующая в ПЦР-смеси отщепляет урацил от цепи ДНК оставляя тн АР-сайт
Использование UDG ndash метод борьбы с контаминацией продуктами ПЦР
О-
ОCH2
ОP
О
Оndash
О-
3`
4`
5`
2`
1`
Н
Использование UDG ndash метод борьбы с контаминацией продуктами ПЦР
2) При нагревании до 950С UDG инактивируется а AP-сайты расщепляются в результате урацил-содержащая ДНК попавшая в пробирку до начала ПЦР деградирует3) Проводится обычная ПЦР реакционная смесь очищена от продуктов предыдущей амплификации
Digital PCR (dPCR)
65
R
PM 1ln М ndash среднее количество целевой ДНК на сегмент реакции (на основе
распределения Пуассона)Р ndash доля сегментов содержащих ПЦР-продуктR ndash общее кол-во проанализированных сегментов
Лимитирующие факторы dPCR
bull Количество сегментов реакции
bull Концентрация целевой ДНК в анализируемом образце
bull Реакционный объѐм
Коммерчески доступные системы реализующие dPCR
66
Fluidigm - технология микрофлюидных чипов
Bio-Rad (QuantaLife) -dPCR в суспензии
(Digital Droplet PCR)
Life Technologies
dPCR в платах OpenArrayreg
Подготовка образцов
(смешивание ДНК и ПЦР-реагентов)
Создание капель (Droplet Generator)
АмплификацияРегистрация и
анализ результатов
Digital droplet PCR (ddPCR)
bull QX100 Droplet Digital PCR System
Сравнение с Real-Time PCR
68
Digital PCR a powerful new tool for noninvasive prenatal diagnosis Bernhard G Zimmermann Simon Grill Wolfgang Holzgreve Prenat Diagn 2008 28 1087ndash1093
Применение ПЦР в NGS
69
Спасибо за внимание
Принцип метода TaqMan
bull 5`-3` экзонуклеазная активность Taq-полимеразы
Принцип метода TaqMan
bull 5`-3` экзонуклеазная активность Taq-полимеразы
Принцип метода TaqMan
bull 5`-3` экзонуклеазная активность Taq-полимеразы
Принцип метода TaqMan
bull 5`-3` экзонуклеазная активность Taq-полимеразы
Принцип метода TaqMan
bull 5`-3` экзонуклеазная активность Taq-полимеразы
bull нет участка для посадки праймера ndash нет сигнала
Принцип метода TaqMan
bull нет участка для посадки зонда ndash нет сигнала
Принцип метода TaqMan
Линейные разрушаемые пробы(TaqMan = Taq-polymerase + Pac-Man)
laquoМолекулярные маячкиraquo(molecular beacons)
Примыкающие пробы
Флюорофоры и гасители флюоресценции
Представление результатов ПЦР в реальном времени
линейный lg
Денатурация
Плавление после ПЦР
обратная производная
Плавление после ПЦР
Виды ПЦР-анализа
Качественный анализ
Сравнительный анализ
(полуколичественный)
Количественный анализ
есть нет
больше меньше Х раз
лечение
10 000 копий 1000 копий
Количественная ПЦР (qPCR)
bull Подсчёт числа копий генов
bull Анализ представленности транскриптов
bull Оценка инфекционной нагрузки
Количественная ПЦР
серия 10-кратных разведений
threshold ndash пороговая флюоресценцияCt ndash пороговый цикл
Преимущества Real-time PCR
bull возможность как качественной так и количественной оценки исходной матрицы
bull отсутствие манипуляций после проведения ПЦР (электрофорез)
bull большая чувствительность (от единичных копий) и специфичность
bull большой динамический диапазон концентраций (порядка 10^7)
bull возможность постановки Multiplex анализа
1 Научные исследования
ndash амплификация ДНК для гибридизации (блоттинг микрочипы)
ndash амплификация ДНК для секвенирования
ndash клонирование геномной ДНК кДНК
ndash филогенетическое сравнение геномов
ndash генетическое картирование
ndash анализ уровня транскрипции
Применение ПЦР
2 Медицина
ndash генетическое тестирование
ndash типирование тканей (для трансплантации)
ndash тестирование мутаций в онкогенах
ndash диагностика инфекций
3 Судебная медицина
ndash ДНК-дактилоскопия
ndash установление родства
4 Анализ пищевых продуктов детекция ГМО
Применение ПЦР
Применение ПЦР
Залог успеха ПЦР
bull высокая чувствительность
bull высокая специфичность
bull высокая устойчивость
bull низкая стоимость быстрота
Получение информации
bull анализ уровня транскрипции
bull ДНК-диагностика
bull генотипирование
Получение материала
bull клонирование ДНК
bull мутагенез
bull секвенирование
N
N
О
О
Н
Н
Н
N
N
О
О
Н
Н
С
НН
Н
ОН
ОCH2
ОP
О
Оndash
HО
3`
4`
5`
2`
1`
Н
Х
Использование UDG ndash метод борьбы с контаминацией продуктами ПЦР
Тимин
(типичен
для ДНК)
Урацил
(типичен
для РНК)
Х = урацил
дезоксиуридинтрифосфат (dUTP) ndash может быть встроен в
растущую цепь как и dTTP не нарушает комплементарности
N
N
О
О
Н
Н
Н
О-
ОCH2
ОP
О
Оndash
О-
3`
4`
5`
2`
1`
Н
UDG 45-550С
Использование UDG ndash метод борьбы с контаминацией продуктами ПЦР
1) Урацил ДНК-гликозилаза присутствующая в ПЦР-смеси отщепляет урацил от цепи ДНК оставляя тн АР-сайт
О-
ОCH2
ОP
О
Оndash
О-
3`
4`
5`
2`
1`
Н
UDG 45-550С
AP-сайт
1) Урацил ДНК-гликозилаза присутствующая в ПЦР-смеси отщепляет урацил от цепи ДНК оставляя тн АР-сайт
Использование UDG ndash метод борьбы с контаминацией продуктами ПЦР
О-
ОCH2
ОP
О
Оndash
О-
3`
4`
5`
2`
1`
Н
Использование UDG ndash метод борьбы с контаминацией продуктами ПЦР
2) При нагревании до 950С UDG инактивируется а AP-сайты расщепляются в результате урацил-содержащая ДНК попавшая в пробирку до начала ПЦР деградирует3) Проводится обычная ПЦР реакционная смесь очищена от продуктов предыдущей амплификации
Digital PCR (dPCR)
65
R
PM 1ln М ndash среднее количество целевой ДНК на сегмент реакции (на основе
распределения Пуассона)Р ndash доля сегментов содержащих ПЦР-продуктR ndash общее кол-во проанализированных сегментов
Лимитирующие факторы dPCR
bull Количество сегментов реакции
bull Концентрация целевой ДНК в анализируемом образце
bull Реакционный объѐм
Коммерчески доступные системы реализующие dPCR
66
Fluidigm - технология микрофлюидных чипов
Bio-Rad (QuantaLife) -dPCR в суспензии
(Digital Droplet PCR)
Life Technologies
dPCR в платах OpenArrayreg
Подготовка образцов
(смешивание ДНК и ПЦР-реагентов)
Создание капель (Droplet Generator)
АмплификацияРегистрация и
анализ результатов
Digital droplet PCR (ddPCR)
bull QX100 Droplet Digital PCR System
Сравнение с Real-Time PCR
68
Digital PCR a powerful new tool for noninvasive prenatal diagnosis Bernhard G Zimmermann Simon Grill Wolfgang Holzgreve Prenat Diagn 2008 28 1087ndash1093
Применение ПЦР в NGS
69
Спасибо за внимание
Принцип метода TaqMan
bull 5`-3` экзонуклеазная активность Taq-полимеразы
Принцип метода TaqMan
bull 5`-3` экзонуклеазная активность Taq-полимеразы
Принцип метода TaqMan
bull 5`-3` экзонуклеазная активность Taq-полимеразы
Принцип метода TaqMan
bull 5`-3` экзонуклеазная активность Taq-полимеразы
bull нет участка для посадки праймера ndash нет сигнала
Принцип метода TaqMan
bull нет участка для посадки зонда ndash нет сигнала
Принцип метода TaqMan
Линейные разрушаемые пробы(TaqMan = Taq-polymerase + Pac-Man)
laquoМолекулярные маячкиraquo(molecular beacons)
Примыкающие пробы
Флюорофоры и гасители флюоресценции
Представление результатов ПЦР в реальном времени
линейный lg
Денатурация
Плавление после ПЦР
обратная производная
Плавление после ПЦР
Виды ПЦР-анализа
Качественный анализ
Сравнительный анализ
(полуколичественный)
Количественный анализ
есть нет
больше меньше Х раз
лечение
10 000 копий 1000 копий
Количественная ПЦР (qPCR)
bull Подсчёт числа копий генов
bull Анализ представленности транскриптов
bull Оценка инфекционной нагрузки
Количественная ПЦР
серия 10-кратных разведений
threshold ndash пороговая флюоресценцияCt ndash пороговый цикл
Преимущества Real-time PCR
bull возможность как качественной так и количественной оценки исходной матрицы
bull отсутствие манипуляций после проведения ПЦР (электрофорез)
bull большая чувствительность (от единичных копий) и специфичность
bull большой динамический диапазон концентраций (порядка 10^7)
bull возможность постановки Multiplex анализа
1 Научные исследования
ndash амплификация ДНК для гибридизации (блоттинг микрочипы)
ndash амплификация ДНК для секвенирования
ndash клонирование геномной ДНК кДНК
ndash филогенетическое сравнение геномов
ndash генетическое картирование
ndash анализ уровня транскрипции
Применение ПЦР
2 Медицина
ndash генетическое тестирование
ndash типирование тканей (для трансплантации)
ndash тестирование мутаций в онкогенах
ndash диагностика инфекций
3 Судебная медицина
ndash ДНК-дактилоскопия
ndash установление родства
4 Анализ пищевых продуктов детекция ГМО
Применение ПЦР
Применение ПЦР
Залог успеха ПЦР
bull высокая чувствительность
bull высокая специфичность
bull высокая устойчивость
bull низкая стоимость быстрота
Получение информации
bull анализ уровня транскрипции
bull ДНК-диагностика
bull генотипирование
Получение материала
bull клонирование ДНК
bull мутагенез
bull секвенирование
N
N
О
О
Н
Н
Н
N
N
О
О
Н
Н
С
НН
Н
ОН
ОCH2
ОP
О
Оndash
HО
3`
4`
5`
2`
1`
Н
Х
Использование UDG ndash метод борьбы с контаминацией продуктами ПЦР
Тимин
(типичен
для ДНК)
Урацил
(типичен
для РНК)
Х = урацил
дезоксиуридинтрифосфат (dUTP) ndash может быть встроен в
растущую цепь как и dTTP не нарушает комплементарности
N
N
О
О
Н
Н
Н
О-
ОCH2
ОP
О
Оndash
О-
3`
4`
5`
2`
1`
Н
UDG 45-550С
Использование UDG ndash метод борьбы с контаминацией продуктами ПЦР
1) Урацил ДНК-гликозилаза присутствующая в ПЦР-смеси отщепляет урацил от цепи ДНК оставляя тн АР-сайт
О-
ОCH2
ОP
О
Оndash
О-
3`
4`
5`
2`
1`
Н
UDG 45-550С
AP-сайт
1) Урацил ДНК-гликозилаза присутствующая в ПЦР-смеси отщепляет урацил от цепи ДНК оставляя тн АР-сайт
Использование UDG ndash метод борьбы с контаминацией продуктами ПЦР
О-
ОCH2
ОP
О
Оndash
О-
3`
4`
5`
2`
1`
Н
Использование UDG ndash метод борьбы с контаминацией продуктами ПЦР
2) При нагревании до 950С UDG инактивируется а AP-сайты расщепляются в результате урацил-содержащая ДНК попавшая в пробирку до начала ПЦР деградирует3) Проводится обычная ПЦР реакционная смесь очищена от продуктов предыдущей амплификации
Digital PCR (dPCR)
65
R
PM 1ln М ndash среднее количество целевой ДНК на сегмент реакции (на основе
распределения Пуассона)Р ndash доля сегментов содержащих ПЦР-продуктR ndash общее кол-во проанализированных сегментов
Лимитирующие факторы dPCR
bull Количество сегментов реакции
bull Концентрация целевой ДНК в анализируемом образце
bull Реакционный объѐм
Коммерчески доступные системы реализующие dPCR
66
Fluidigm - технология микрофлюидных чипов
Bio-Rad (QuantaLife) -dPCR в суспензии
(Digital Droplet PCR)
Life Technologies
dPCR в платах OpenArrayreg
Подготовка образцов
(смешивание ДНК и ПЦР-реагентов)
Создание капель (Droplet Generator)
АмплификацияРегистрация и
анализ результатов
Digital droplet PCR (ddPCR)
bull QX100 Droplet Digital PCR System
Сравнение с Real-Time PCR
68
Digital PCR a powerful new tool for noninvasive prenatal diagnosis Bernhard G Zimmermann Simon Grill Wolfgang Holzgreve Prenat Diagn 2008 28 1087ndash1093
Применение ПЦР в NGS
69
Спасибо за внимание
Принцип метода TaqMan
bull 5`-3` экзонуклеазная активность Taq-полимеразы
Принцип метода TaqMan
bull 5`-3` экзонуклеазная активность Taq-полимеразы
Принцип метода TaqMan
bull 5`-3` экзонуклеазная активность Taq-полимеразы
bull нет участка для посадки праймера ndash нет сигнала
Принцип метода TaqMan
bull нет участка для посадки зонда ndash нет сигнала
Принцип метода TaqMan
Линейные разрушаемые пробы(TaqMan = Taq-polymerase + Pac-Man)
laquoМолекулярные маячкиraquo(molecular beacons)
Примыкающие пробы
Флюорофоры и гасители флюоресценции
Представление результатов ПЦР в реальном времени
линейный lg
Денатурация
Плавление после ПЦР
обратная производная
Плавление после ПЦР
Виды ПЦР-анализа
Качественный анализ
Сравнительный анализ
(полуколичественный)
Количественный анализ
есть нет
больше меньше Х раз
лечение
10 000 копий 1000 копий
Количественная ПЦР (qPCR)
bull Подсчёт числа копий генов
bull Анализ представленности транскриптов
bull Оценка инфекционной нагрузки
Количественная ПЦР
серия 10-кратных разведений
threshold ndash пороговая флюоресценцияCt ndash пороговый цикл
Преимущества Real-time PCR
bull возможность как качественной так и количественной оценки исходной матрицы
bull отсутствие манипуляций после проведения ПЦР (электрофорез)
bull большая чувствительность (от единичных копий) и специфичность
bull большой динамический диапазон концентраций (порядка 10^7)
bull возможность постановки Multiplex анализа
1 Научные исследования
ndash амплификация ДНК для гибридизации (блоттинг микрочипы)
ndash амплификация ДНК для секвенирования
ndash клонирование геномной ДНК кДНК
ndash филогенетическое сравнение геномов
ndash генетическое картирование
ndash анализ уровня транскрипции
Применение ПЦР
2 Медицина
ndash генетическое тестирование
ndash типирование тканей (для трансплантации)
ndash тестирование мутаций в онкогенах
ndash диагностика инфекций
3 Судебная медицина
ndash ДНК-дактилоскопия
ndash установление родства
4 Анализ пищевых продуктов детекция ГМО
Применение ПЦР
Применение ПЦР
Залог успеха ПЦР
bull высокая чувствительность
bull высокая специфичность
bull высокая устойчивость
bull низкая стоимость быстрота
Получение информации
bull анализ уровня транскрипции
bull ДНК-диагностика
bull генотипирование
Получение материала
bull клонирование ДНК
bull мутагенез
bull секвенирование
N
N
О
О
Н
Н
Н
N
N
О
О
Н
Н
С
НН
Н
ОН
ОCH2
ОP
О
Оndash
HО
3`
4`
5`
2`
1`
Н
Х
Использование UDG ndash метод борьбы с контаминацией продуктами ПЦР
Тимин
(типичен
для ДНК)
Урацил
(типичен
для РНК)
Х = урацил
дезоксиуридинтрифосфат (dUTP) ndash может быть встроен в
растущую цепь как и dTTP не нарушает комплементарности
N
N
О
О
Н
Н
Н
О-
ОCH2
ОP
О
Оndash
О-
3`
4`
5`
2`
1`
Н
UDG 45-550С
Использование UDG ndash метод борьбы с контаминацией продуктами ПЦР
1) Урацил ДНК-гликозилаза присутствующая в ПЦР-смеси отщепляет урацил от цепи ДНК оставляя тн АР-сайт
О-
ОCH2
ОP
О
Оndash
О-
3`
4`
5`
2`
1`
Н
UDG 45-550С
AP-сайт
1) Урацил ДНК-гликозилаза присутствующая в ПЦР-смеси отщепляет урацил от цепи ДНК оставляя тн АР-сайт
Использование UDG ndash метод борьбы с контаминацией продуктами ПЦР
О-
ОCH2
ОP
О
Оndash
О-
3`
4`
5`
2`
1`
Н
Использование UDG ndash метод борьбы с контаминацией продуктами ПЦР
2) При нагревании до 950С UDG инактивируется а AP-сайты расщепляются в результате урацил-содержащая ДНК попавшая в пробирку до начала ПЦР деградирует3) Проводится обычная ПЦР реакционная смесь очищена от продуктов предыдущей амплификации
Digital PCR (dPCR)
65
R
PM 1ln М ndash среднее количество целевой ДНК на сегмент реакции (на основе
распределения Пуассона)Р ndash доля сегментов содержащих ПЦР-продуктR ndash общее кол-во проанализированных сегментов
Лимитирующие факторы dPCR
bull Количество сегментов реакции
bull Концентрация целевой ДНК в анализируемом образце
bull Реакционный объѐм
Коммерчески доступные системы реализующие dPCR
66
Fluidigm - технология микрофлюидных чипов
Bio-Rad (QuantaLife) -dPCR в суспензии
(Digital Droplet PCR)
Life Technologies
dPCR в платах OpenArrayreg
Подготовка образцов
(смешивание ДНК и ПЦР-реагентов)
Создание капель (Droplet Generator)
АмплификацияРегистрация и
анализ результатов
Digital droplet PCR (ddPCR)
bull QX100 Droplet Digital PCR System
Сравнение с Real-Time PCR
68
Digital PCR a powerful new tool for noninvasive prenatal diagnosis Bernhard G Zimmermann Simon Grill Wolfgang Holzgreve Prenat Diagn 2008 28 1087ndash1093
Применение ПЦР в NGS
69
Спасибо за внимание
Принцип метода TaqMan
bull 5`-3` экзонуклеазная активность Taq-полимеразы
Принцип метода TaqMan
bull 5`-3` экзонуклеазная активность Taq-полимеразы
bull нет участка для посадки праймера ndash нет сигнала
Принцип метода TaqMan
bull нет участка для посадки зонда ndash нет сигнала
Принцип метода TaqMan
Линейные разрушаемые пробы(TaqMan = Taq-polymerase + Pac-Man)
laquoМолекулярные маячкиraquo(molecular beacons)
Примыкающие пробы
Флюорофоры и гасители флюоресценции
Представление результатов ПЦР в реальном времени
линейный lg
Денатурация
Плавление после ПЦР
обратная производная
Плавление после ПЦР
Виды ПЦР-анализа
Качественный анализ
Сравнительный анализ
(полуколичественный)
Количественный анализ
есть нет
больше меньше Х раз
лечение
10 000 копий 1000 копий
Количественная ПЦР (qPCR)
bull Подсчёт числа копий генов
bull Анализ представленности транскриптов
bull Оценка инфекционной нагрузки
Количественная ПЦР
серия 10-кратных разведений
threshold ndash пороговая флюоресценцияCt ndash пороговый цикл
Преимущества Real-time PCR
bull возможность как качественной так и количественной оценки исходной матрицы
bull отсутствие манипуляций после проведения ПЦР (электрофорез)
bull большая чувствительность (от единичных копий) и специфичность
bull большой динамический диапазон концентраций (порядка 10^7)
bull возможность постановки Multiplex анализа
1 Научные исследования
ndash амплификация ДНК для гибридизации (блоттинг микрочипы)
ndash амплификация ДНК для секвенирования
ndash клонирование геномной ДНК кДНК
ndash филогенетическое сравнение геномов
ndash генетическое картирование
ndash анализ уровня транскрипции
Применение ПЦР
2 Медицина
ndash генетическое тестирование
ndash типирование тканей (для трансплантации)
ndash тестирование мутаций в онкогенах
ndash диагностика инфекций
3 Судебная медицина
ndash ДНК-дактилоскопия
ndash установление родства
4 Анализ пищевых продуктов детекция ГМО
Применение ПЦР
Применение ПЦР
Залог успеха ПЦР
bull высокая чувствительность
bull высокая специфичность
bull высокая устойчивость
bull низкая стоимость быстрота
Получение информации
bull анализ уровня транскрипции
bull ДНК-диагностика
bull генотипирование
Получение материала
bull клонирование ДНК
bull мутагенез
bull секвенирование
N
N
О
О
Н
Н
Н
N
N
О
О
Н
Н
С
НН
Н
ОН
ОCH2
ОP
О
Оndash
HО
3`
4`
5`
2`
1`
Н
Х
Использование UDG ndash метод борьбы с контаминацией продуктами ПЦР
Тимин
(типичен
для ДНК)
Урацил
(типичен
для РНК)
Х = урацил
дезоксиуридинтрифосфат (dUTP) ndash может быть встроен в
растущую цепь как и dTTP не нарушает комплементарности
N
N
О
О
Н
Н
Н
О-
ОCH2
ОP
О
Оndash
О-
3`
4`
5`
2`
1`
Н
UDG 45-550С
Использование UDG ndash метод борьбы с контаминацией продуктами ПЦР
1) Урацил ДНК-гликозилаза присутствующая в ПЦР-смеси отщепляет урацил от цепи ДНК оставляя тн АР-сайт
О-
ОCH2
ОP
О
Оndash
О-
3`
4`
5`
2`
1`
Н
UDG 45-550С
AP-сайт
1) Урацил ДНК-гликозилаза присутствующая в ПЦР-смеси отщепляет урацил от цепи ДНК оставляя тн АР-сайт
Использование UDG ndash метод борьбы с контаминацией продуктами ПЦР
О-
ОCH2
ОP
О
Оndash
О-
3`
4`
5`
2`
1`
Н
Использование UDG ndash метод борьбы с контаминацией продуктами ПЦР
2) При нагревании до 950С UDG инактивируется а AP-сайты расщепляются в результате урацил-содержащая ДНК попавшая в пробирку до начала ПЦР деградирует3) Проводится обычная ПЦР реакционная смесь очищена от продуктов предыдущей амплификации
Digital PCR (dPCR)
65
R
PM 1ln М ndash среднее количество целевой ДНК на сегмент реакции (на основе
распределения Пуассона)Р ndash доля сегментов содержащих ПЦР-продуктR ndash общее кол-во проанализированных сегментов
Лимитирующие факторы dPCR
bull Количество сегментов реакции
bull Концентрация целевой ДНК в анализируемом образце
bull Реакционный объѐм
Коммерчески доступные системы реализующие dPCR
66
Fluidigm - технология микрофлюидных чипов
Bio-Rad (QuantaLife) -dPCR в суспензии
(Digital Droplet PCR)
Life Technologies
dPCR в платах OpenArrayreg
Подготовка образцов
(смешивание ДНК и ПЦР-реагентов)
Создание капель (Droplet Generator)
АмплификацияРегистрация и
анализ результатов
Digital droplet PCR (ddPCR)
bull QX100 Droplet Digital PCR System
Сравнение с Real-Time PCR
68
Digital PCR a powerful new tool for noninvasive prenatal diagnosis Bernhard G Zimmermann Simon Grill Wolfgang Holzgreve Prenat Diagn 2008 28 1087ndash1093
Применение ПЦР в NGS
69
Спасибо за внимание
Принцип метода TaqMan
bull 5`-3` экзонуклеазная активность Taq-полимеразы
bull нет участка для посадки праймера ndash нет сигнала
Принцип метода TaqMan
bull нет участка для посадки зонда ndash нет сигнала
Принцип метода TaqMan
Линейные разрушаемые пробы(TaqMan = Taq-polymerase + Pac-Man)
laquoМолекулярные маячкиraquo(molecular beacons)
Примыкающие пробы
Флюорофоры и гасители флюоресценции
Представление результатов ПЦР в реальном времени
линейный lg
Денатурация
Плавление после ПЦР
обратная производная
Плавление после ПЦР
Виды ПЦР-анализа
Качественный анализ
Сравнительный анализ
(полуколичественный)
Количественный анализ
есть нет
больше меньше Х раз
лечение
10 000 копий 1000 копий
Количественная ПЦР (qPCR)
bull Подсчёт числа копий генов
bull Анализ представленности транскриптов
bull Оценка инфекционной нагрузки
Количественная ПЦР
серия 10-кратных разведений
threshold ndash пороговая флюоресценцияCt ndash пороговый цикл
Преимущества Real-time PCR
bull возможность как качественной так и количественной оценки исходной матрицы
bull отсутствие манипуляций после проведения ПЦР (электрофорез)
bull большая чувствительность (от единичных копий) и специфичность
bull большой динамический диапазон концентраций (порядка 10^7)
bull возможность постановки Multiplex анализа
1 Научные исследования
ndash амплификация ДНК для гибридизации (блоттинг микрочипы)
ndash амплификация ДНК для секвенирования
ndash клонирование геномной ДНК кДНК
ndash филогенетическое сравнение геномов
ndash генетическое картирование
ndash анализ уровня транскрипции
Применение ПЦР
2 Медицина
ndash генетическое тестирование
ndash типирование тканей (для трансплантации)
ndash тестирование мутаций в онкогенах
ndash диагностика инфекций
3 Судебная медицина
ndash ДНК-дактилоскопия
ndash установление родства
4 Анализ пищевых продуктов детекция ГМО
Применение ПЦР
Применение ПЦР
Залог успеха ПЦР
bull высокая чувствительность
bull высокая специфичность
bull высокая устойчивость
bull низкая стоимость быстрота
Получение информации
bull анализ уровня транскрипции
bull ДНК-диагностика
bull генотипирование
Получение материала
bull клонирование ДНК
bull мутагенез
bull секвенирование
N
N
О
О
Н
Н
Н
N
N
О
О
Н
Н
С
НН
Н
ОН
ОCH2
ОP
О
Оndash
HО
3`
4`
5`
2`
1`
Н
Х
Использование UDG ndash метод борьбы с контаминацией продуктами ПЦР
Тимин
(типичен
для ДНК)
Урацил
(типичен
для РНК)
Х = урацил
дезоксиуридинтрифосфат (dUTP) ndash может быть встроен в
растущую цепь как и dTTP не нарушает комплементарности
N
N
О
О
Н
Н
Н
О-
ОCH2
ОP
О
Оndash
О-
3`
4`
5`
2`
1`
Н
UDG 45-550С
Использование UDG ndash метод борьбы с контаминацией продуктами ПЦР
1) Урацил ДНК-гликозилаза присутствующая в ПЦР-смеси отщепляет урацил от цепи ДНК оставляя тн АР-сайт
О-
ОCH2
ОP
О
Оndash
О-
3`
4`
5`
2`
1`
Н
UDG 45-550С
AP-сайт
1) Урацил ДНК-гликозилаза присутствующая в ПЦР-смеси отщепляет урацил от цепи ДНК оставляя тн АР-сайт
Использование UDG ndash метод борьбы с контаминацией продуктами ПЦР
О-
ОCH2
ОP
О
Оndash
О-
3`
4`
5`
2`
1`
Н
Использование UDG ndash метод борьбы с контаминацией продуктами ПЦР
2) При нагревании до 950С UDG инактивируется а AP-сайты расщепляются в результате урацил-содержащая ДНК попавшая в пробирку до начала ПЦР деградирует3) Проводится обычная ПЦР реакционная смесь очищена от продуктов предыдущей амплификации
Digital PCR (dPCR)
65
R
PM 1ln М ndash среднее количество целевой ДНК на сегмент реакции (на основе
распределения Пуассона)Р ndash доля сегментов содержащих ПЦР-продуктR ndash общее кол-во проанализированных сегментов
Лимитирующие факторы dPCR
bull Количество сегментов реакции
bull Концентрация целевой ДНК в анализируемом образце
bull Реакционный объѐм
Коммерчески доступные системы реализующие dPCR
66
Fluidigm - технология микрофлюидных чипов
Bio-Rad (QuantaLife) -dPCR в суспензии
(Digital Droplet PCR)
Life Technologies
dPCR в платах OpenArrayreg
Подготовка образцов
(смешивание ДНК и ПЦР-реагентов)
Создание капель (Droplet Generator)
АмплификацияРегистрация и
анализ результатов
Digital droplet PCR (ddPCR)
bull QX100 Droplet Digital PCR System
Сравнение с Real-Time PCR
68
Digital PCR a powerful new tool for noninvasive prenatal diagnosis Bernhard G Zimmermann Simon Grill Wolfgang Holzgreve Prenat Diagn 2008 28 1087ndash1093
Применение ПЦР в NGS
69
Спасибо за внимание
bull нет участка для посадки праймера ndash нет сигнала
Принцип метода TaqMan
bull нет участка для посадки зонда ndash нет сигнала
Принцип метода TaqMan
Линейные разрушаемые пробы(TaqMan = Taq-polymerase + Pac-Man)
laquoМолекулярные маячкиraquo(molecular beacons)
Примыкающие пробы
Флюорофоры и гасители флюоресценции
Представление результатов ПЦР в реальном времени
линейный lg
Денатурация
Плавление после ПЦР
обратная производная
Плавление после ПЦР
Виды ПЦР-анализа
Качественный анализ
Сравнительный анализ
(полуколичественный)
Количественный анализ
есть нет
больше меньше Х раз
лечение
10 000 копий 1000 копий
Количественная ПЦР (qPCR)
bull Подсчёт числа копий генов
bull Анализ представленности транскриптов
bull Оценка инфекционной нагрузки
Количественная ПЦР
серия 10-кратных разведений
threshold ndash пороговая флюоресценцияCt ndash пороговый цикл
Преимущества Real-time PCR
bull возможность как качественной так и количественной оценки исходной матрицы
bull отсутствие манипуляций после проведения ПЦР (электрофорез)
bull большая чувствительность (от единичных копий) и специфичность
bull большой динамический диапазон концентраций (порядка 10^7)
bull возможность постановки Multiplex анализа
1 Научные исследования
ndash амплификация ДНК для гибридизации (блоттинг микрочипы)
ndash амплификация ДНК для секвенирования
ndash клонирование геномной ДНК кДНК
ndash филогенетическое сравнение геномов
ndash генетическое картирование
ndash анализ уровня транскрипции
Применение ПЦР
2 Медицина
ndash генетическое тестирование
ndash типирование тканей (для трансплантации)
ndash тестирование мутаций в онкогенах
ndash диагностика инфекций
3 Судебная медицина
ndash ДНК-дактилоскопия
ndash установление родства
4 Анализ пищевых продуктов детекция ГМО
Применение ПЦР
Применение ПЦР
Залог успеха ПЦР
bull высокая чувствительность
bull высокая специфичность
bull высокая устойчивость
bull низкая стоимость быстрота
Получение информации
bull анализ уровня транскрипции
bull ДНК-диагностика
bull генотипирование
Получение материала
bull клонирование ДНК
bull мутагенез
bull секвенирование
N
N
О
О
Н
Н
Н
N
N
О
О
Н
Н
С
НН
Н
ОН
ОCH2
ОP
О
Оndash
HО
3`
4`
5`
2`
1`
Н
Х
Использование UDG ndash метод борьбы с контаминацией продуктами ПЦР
Тимин
(типичен
для ДНК)
Урацил
(типичен
для РНК)
Х = урацил
дезоксиуридинтрифосфат (dUTP) ndash может быть встроен в
растущую цепь как и dTTP не нарушает комплементарности
N
N
О
О
Н
Н
Н
О-
ОCH2
ОP
О
Оndash
О-
3`
4`
5`
2`
1`
Н
UDG 45-550С
Использование UDG ndash метод борьбы с контаминацией продуктами ПЦР
1) Урацил ДНК-гликозилаза присутствующая в ПЦР-смеси отщепляет урацил от цепи ДНК оставляя тн АР-сайт
О-
ОCH2
ОP
О
Оndash
О-
3`
4`
5`
2`
1`
Н
UDG 45-550С
AP-сайт
1) Урацил ДНК-гликозилаза присутствующая в ПЦР-смеси отщепляет урацил от цепи ДНК оставляя тн АР-сайт
Использование UDG ndash метод борьбы с контаминацией продуктами ПЦР
О-
ОCH2
ОP
О
Оndash
О-
3`
4`
5`
2`
1`
Н
Использование UDG ndash метод борьбы с контаминацией продуктами ПЦР
2) При нагревании до 950С UDG инактивируется а AP-сайты расщепляются в результате урацил-содержащая ДНК попавшая в пробирку до начала ПЦР деградирует3) Проводится обычная ПЦР реакционная смесь очищена от продуктов предыдущей амплификации
Digital PCR (dPCR)
65
R
PM 1ln М ndash среднее количество целевой ДНК на сегмент реакции (на основе
распределения Пуассона)Р ndash доля сегментов содержащих ПЦР-продуктR ndash общее кол-во проанализированных сегментов
Лимитирующие факторы dPCR
bull Количество сегментов реакции
bull Концентрация целевой ДНК в анализируемом образце
bull Реакционный объѐм
Коммерчески доступные системы реализующие dPCR
66
Fluidigm - технология микрофлюидных чипов
Bio-Rad (QuantaLife) -dPCR в суспензии
(Digital Droplet PCR)
Life Technologies
dPCR в платах OpenArrayreg
Подготовка образцов
(смешивание ДНК и ПЦР-реагентов)
Создание капель (Droplet Generator)
АмплификацияРегистрация и
анализ результатов
Digital droplet PCR (ddPCR)
bull QX100 Droplet Digital PCR System
Сравнение с Real-Time PCR
68
Digital PCR a powerful new tool for noninvasive prenatal diagnosis Bernhard G Zimmermann Simon Grill Wolfgang Holzgreve Prenat Diagn 2008 28 1087ndash1093
Применение ПЦР в NGS
69
Спасибо за внимание
bull нет участка для посадки зонда ndash нет сигнала
Принцип метода TaqMan
Линейные разрушаемые пробы(TaqMan = Taq-polymerase + Pac-Man)
laquoМолекулярные маячкиraquo(molecular beacons)
Примыкающие пробы
Флюорофоры и гасители флюоресценции
Представление результатов ПЦР в реальном времени
линейный lg
Денатурация
Плавление после ПЦР
обратная производная
Плавление после ПЦР
Виды ПЦР-анализа
Качественный анализ
Сравнительный анализ
(полуколичественный)
Количественный анализ
есть нет
больше меньше Х раз
лечение
10 000 копий 1000 копий
Количественная ПЦР (qPCR)
bull Подсчёт числа копий генов
bull Анализ представленности транскриптов
bull Оценка инфекционной нагрузки
Количественная ПЦР
серия 10-кратных разведений
threshold ndash пороговая флюоресценцияCt ndash пороговый цикл
Преимущества Real-time PCR
bull возможность как качественной так и количественной оценки исходной матрицы
bull отсутствие манипуляций после проведения ПЦР (электрофорез)
bull большая чувствительность (от единичных копий) и специфичность
bull большой динамический диапазон концентраций (порядка 10^7)
bull возможность постановки Multiplex анализа
1 Научные исследования
ndash амплификация ДНК для гибридизации (блоттинг микрочипы)
ndash амплификация ДНК для секвенирования
ndash клонирование геномной ДНК кДНК
ndash филогенетическое сравнение геномов
ndash генетическое картирование
ndash анализ уровня транскрипции
Применение ПЦР
2 Медицина
ndash генетическое тестирование
ndash типирование тканей (для трансплантации)
ndash тестирование мутаций в онкогенах
ndash диагностика инфекций
3 Судебная медицина
ndash ДНК-дактилоскопия
ndash установление родства
4 Анализ пищевых продуктов детекция ГМО
Применение ПЦР
Применение ПЦР
Залог успеха ПЦР
bull высокая чувствительность
bull высокая специфичность
bull высокая устойчивость
bull низкая стоимость быстрота
Получение информации
bull анализ уровня транскрипции
bull ДНК-диагностика
bull генотипирование
Получение материала
bull клонирование ДНК
bull мутагенез
bull секвенирование
N
N
О
О
Н
Н
Н
N
N
О
О
Н
Н
С
НН
Н
ОН
ОCH2
ОP
О
Оndash
HО
3`
4`
5`
2`
1`
Н
Х
Использование UDG ndash метод борьбы с контаминацией продуктами ПЦР
Тимин
(типичен
для ДНК)
Урацил
(типичен
для РНК)
Х = урацил
дезоксиуридинтрифосфат (dUTP) ndash может быть встроен в
растущую цепь как и dTTP не нарушает комплементарности
N
N
О
О
Н
Н
Н
О-
ОCH2
ОP
О
Оndash
О-
3`
4`
5`
2`
1`
Н
UDG 45-550С
Использование UDG ndash метод борьбы с контаминацией продуктами ПЦР
1) Урацил ДНК-гликозилаза присутствующая в ПЦР-смеси отщепляет урацил от цепи ДНК оставляя тн АР-сайт
О-
ОCH2
ОP
О
Оndash
О-
3`
4`
5`
2`
1`
Н
UDG 45-550С
AP-сайт
1) Урацил ДНК-гликозилаза присутствующая в ПЦР-смеси отщепляет урацил от цепи ДНК оставляя тн АР-сайт
Использование UDG ndash метод борьбы с контаминацией продуктами ПЦР
О-
ОCH2
ОP
О
Оndash
О-
3`
4`
5`
2`
1`
Н
Использование UDG ndash метод борьбы с контаминацией продуктами ПЦР
2) При нагревании до 950С UDG инактивируется а AP-сайты расщепляются в результате урацил-содержащая ДНК попавшая в пробирку до начала ПЦР деградирует3) Проводится обычная ПЦР реакционная смесь очищена от продуктов предыдущей амплификации
Digital PCR (dPCR)
65
R
PM 1ln М ndash среднее количество целевой ДНК на сегмент реакции (на основе
распределения Пуассона)Р ndash доля сегментов содержащих ПЦР-продуктR ndash общее кол-во проанализированных сегментов
Лимитирующие факторы dPCR
bull Количество сегментов реакции
bull Концентрация целевой ДНК в анализируемом образце
bull Реакционный объѐм
Коммерчески доступные системы реализующие dPCR
66
Fluidigm - технология микрофлюидных чипов
Bio-Rad (QuantaLife) -dPCR в суспензии
(Digital Droplet PCR)
Life Technologies
dPCR в платах OpenArrayreg
Подготовка образцов
(смешивание ДНК и ПЦР-реагентов)
Создание капель (Droplet Generator)
АмплификацияРегистрация и
анализ результатов
Digital droplet PCR (ddPCR)
bull QX100 Droplet Digital PCR System
Сравнение с Real-Time PCR
68
Digital PCR a powerful new tool for noninvasive prenatal diagnosis Bernhard G Zimmermann Simon Grill Wolfgang Holzgreve Prenat Diagn 2008 28 1087ndash1093
Применение ПЦР в NGS
69
Спасибо за внимание
Линейные разрушаемые пробы(TaqMan = Taq-polymerase + Pac-Man)
laquoМолекулярные маячкиraquo(molecular beacons)
Примыкающие пробы
Флюорофоры и гасители флюоресценции
Представление результатов ПЦР в реальном времени
линейный lg
Денатурация
Плавление после ПЦР
обратная производная
Плавление после ПЦР
Виды ПЦР-анализа
Качественный анализ
Сравнительный анализ
(полуколичественный)
Количественный анализ
есть нет
больше меньше Х раз
лечение
10 000 копий 1000 копий
Количественная ПЦР (qPCR)
bull Подсчёт числа копий генов
bull Анализ представленности транскриптов
bull Оценка инфекционной нагрузки
Количественная ПЦР
серия 10-кратных разведений
threshold ndash пороговая флюоресценцияCt ndash пороговый цикл
Преимущества Real-time PCR
bull возможность как качественной так и количественной оценки исходной матрицы
bull отсутствие манипуляций после проведения ПЦР (электрофорез)
bull большая чувствительность (от единичных копий) и специфичность
bull большой динамический диапазон концентраций (порядка 10^7)
bull возможность постановки Multiplex анализа
1 Научные исследования
ndash амплификация ДНК для гибридизации (блоттинг микрочипы)
ndash амплификация ДНК для секвенирования
ndash клонирование геномной ДНК кДНК
ndash филогенетическое сравнение геномов
ndash генетическое картирование
ndash анализ уровня транскрипции
Применение ПЦР
2 Медицина
ndash генетическое тестирование
ndash типирование тканей (для трансплантации)
ndash тестирование мутаций в онкогенах
ndash диагностика инфекций
3 Судебная медицина
ndash ДНК-дактилоскопия
ndash установление родства
4 Анализ пищевых продуктов детекция ГМО
Применение ПЦР
Применение ПЦР
Залог успеха ПЦР
bull высокая чувствительность
bull высокая специфичность
bull высокая устойчивость
bull низкая стоимость быстрота
Получение информации
bull анализ уровня транскрипции
bull ДНК-диагностика
bull генотипирование
Получение материала
bull клонирование ДНК
bull мутагенез
bull секвенирование
N
N
О
О
Н
Н
Н
N
N
О
О
Н
Н
С
НН
Н
ОН
ОCH2
ОP
О
Оndash
HО
3`
4`
5`
2`
1`
Н
Х
Использование UDG ndash метод борьбы с контаминацией продуктами ПЦР
Тимин
(типичен
для ДНК)
Урацил
(типичен
для РНК)
Х = урацил
дезоксиуридинтрифосфат (dUTP) ndash может быть встроен в
растущую цепь как и dTTP не нарушает комплементарности
N
N
О
О
Н
Н
Н
О-
ОCH2
ОP
О
Оndash
О-
3`
4`
5`
2`
1`
Н
UDG 45-550С
Использование UDG ndash метод борьбы с контаминацией продуктами ПЦР
1) Урацил ДНК-гликозилаза присутствующая в ПЦР-смеси отщепляет урацил от цепи ДНК оставляя тн АР-сайт
О-
ОCH2
ОP
О
Оndash
О-
3`
4`
5`
2`
1`
Н
UDG 45-550С
AP-сайт
1) Урацил ДНК-гликозилаза присутствующая в ПЦР-смеси отщепляет урацил от цепи ДНК оставляя тн АР-сайт
Использование UDG ndash метод борьбы с контаминацией продуктами ПЦР
О-
ОCH2
ОP
О
Оndash
О-
3`
4`
5`
2`
1`
Н
Использование UDG ndash метод борьбы с контаминацией продуктами ПЦР
2) При нагревании до 950С UDG инактивируется а AP-сайты расщепляются в результате урацил-содержащая ДНК попавшая в пробирку до начала ПЦР деградирует3) Проводится обычная ПЦР реакционная смесь очищена от продуктов предыдущей амплификации
Digital PCR (dPCR)
65
R
PM 1ln М ndash среднее количество целевой ДНК на сегмент реакции (на основе
распределения Пуассона)Р ndash доля сегментов содержащих ПЦР-продуктR ndash общее кол-во проанализированных сегментов
Лимитирующие факторы dPCR
bull Количество сегментов реакции
bull Концентрация целевой ДНК в анализируемом образце
bull Реакционный объѐм
Коммерчески доступные системы реализующие dPCR
66
Fluidigm - технология микрофлюидных чипов
Bio-Rad (QuantaLife) -dPCR в суспензии
(Digital Droplet PCR)
Life Technologies
dPCR в платах OpenArrayreg
Подготовка образцов
(смешивание ДНК и ПЦР-реагентов)
Создание капель (Droplet Generator)
АмплификацияРегистрация и
анализ результатов
Digital droplet PCR (ddPCR)
bull QX100 Droplet Digital PCR System
Сравнение с Real-Time PCR
68
Digital PCR a powerful new tool for noninvasive prenatal diagnosis Bernhard G Zimmermann Simon Grill Wolfgang Holzgreve Prenat Diagn 2008 28 1087ndash1093
Применение ПЦР в NGS
69
Спасибо за внимание
laquoМолекулярные маячкиraquo(molecular beacons)
Примыкающие пробы
Флюорофоры и гасители флюоресценции
Представление результатов ПЦР в реальном времени
линейный lg
Денатурация
Плавление после ПЦР
обратная производная
Плавление после ПЦР
Виды ПЦР-анализа
Качественный анализ
Сравнительный анализ
(полуколичественный)
Количественный анализ
есть нет
больше меньше Х раз
лечение
10 000 копий 1000 копий
Количественная ПЦР (qPCR)
bull Подсчёт числа копий генов
bull Анализ представленности транскриптов
bull Оценка инфекционной нагрузки
Количественная ПЦР
серия 10-кратных разведений
threshold ndash пороговая флюоресценцияCt ndash пороговый цикл
Преимущества Real-time PCR
bull возможность как качественной так и количественной оценки исходной матрицы
bull отсутствие манипуляций после проведения ПЦР (электрофорез)
bull большая чувствительность (от единичных копий) и специфичность
bull большой динамический диапазон концентраций (порядка 10^7)
bull возможность постановки Multiplex анализа
1 Научные исследования
ndash амплификация ДНК для гибридизации (блоттинг микрочипы)
ndash амплификация ДНК для секвенирования
ndash клонирование геномной ДНК кДНК
ndash филогенетическое сравнение геномов
ndash генетическое картирование
ndash анализ уровня транскрипции
Применение ПЦР
2 Медицина
ndash генетическое тестирование
ndash типирование тканей (для трансплантации)
ndash тестирование мутаций в онкогенах
ndash диагностика инфекций
3 Судебная медицина
ndash ДНК-дактилоскопия
ndash установление родства
4 Анализ пищевых продуктов детекция ГМО
Применение ПЦР
Применение ПЦР
Залог успеха ПЦР
bull высокая чувствительность
bull высокая специфичность
bull высокая устойчивость
bull низкая стоимость быстрота
Получение информации
bull анализ уровня транскрипции
bull ДНК-диагностика
bull генотипирование
Получение материала
bull клонирование ДНК
bull мутагенез
bull секвенирование
N
N
О
О
Н
Н
Н
N
N
О
О
Н
Н
С
НН
Н
ОН
ОCH2
ОP
О
Оndash
HО
3`
4`
5`
2`
1`
Н
Х
Использование UDG ndash метод борьбы с контаминацией продуктами ПЦР
Тимин
(типичен
для ДНК)
Урацил
(типичен
для РНК)
Х = урацил
дезоксиуридинтрифосфат (dUTP) ndash может быть встроен в
растущую цепь как и dTTP не нарушает комплементарности
N
N
О
О
Н
Н
Н
О-
ОCH2
ОP
О
Оndash
О-
3`
4`
5`
2`
1`
Н
UDG 45-550С
Использование UDG ndash метод борьбы с контаминацией продуктами ПЦР
1) Урацил ДНК-гликозилаза присутствующая в ПЦР-смеси отщепляет урацил от цепи ДНК оставляя тн АР-сайт
О-
ОCH2
ОP
О
Оndash
О-
3`
4`
5`
2`
1`
Н
UDG 45-550С
AP-сайт
1) Урацил ДНК-гликозилаза присутствующая в ПЦР-смеси отщепляет урацил от цепи ДНК оставляя тн АР-сайт
Использование UDG ndash метод борьбы с контаминацией продуктами ПЦР
О-
ОCH2
ОP
О
Оndash
О-
3`
4`
5`
2`
1`
Н
Использование UDG ndash метод борьбы с контаминацией продуктами ПЦР
2) При нагревании до 950С UDG инактивируется а AP-сайты расщепляются в результате урацил-содержащая ДНК попавшая в пробирку до начала ПЦР деградирует3) Проводится обычная ПЦР реакционная смесь очищена от продуктов предыдущей амплификации
Digital PCR (dPCR)
65
R
PM 1ln М ndash среднее количество целевой ДНК на сегмент реакции (на основе
распределения Пуассона)Р ndash доля сегментов содержащих ПЦР-продуктR ndash общее кол-во проанализированных сегментов
Лимитирующие факторы dPCR
bull Количество сегментов реакции
bull Концентрация целевой ДНК в анализируемом образце
bull Реакционный объѐм
Коммерчески доступные системы реализующие dPCR
66
Fluidigm - технология микрофлюидных чипов
Bio-Rad (QuantaLife) -dPCR в суспензии
(Digital Droplet PCR)
Life Technologies
dPCR в платах OpenArrayreg
Подготовка образцов
(смешивание ДНК и ПЦР-реагентов)
Создание капель (Droplet Generator)
АмплификацияРегистрация и
анализ результатов
Digital droplet PCR (ddPCR)
bull QX100 Droplet Digital PCR System
Сравнение с Real-Time PCR
68
Digital PCR a powerful new tool for noninvasive prenatal diagnosis Bernhard G Zimmermann Simon Grill Wolfgang Holzgreve Prenat Diagn 2008 28 1087ndash1093
Применение ПЦР в NGS
69
Спасибо за внимание
Примыкающие пробы
Флюорофоры и гасители флюоресценции
Представление результатов ПЦР в реальном времени
линейный lg
Денатурация
Плавление после ПЦР
обратная производная
Плавление после ПЦР
Виды ПЦР-анализа
Качественный анализ
Сравнительный анализ
(полуколичественный)
Количественный анализ
есть нет
больше меньше Х раз
лечение
10 000 копий 1000 копий
Количественная ПЦР (qPCR)
bull Подсчёт числа копий генов
bull Анализ представленности транскриптов
bull Оценка инфекционной нагрузки
Количественная ПЦР
серия 10-кратных разведений
threshold ndash пороговая флюоресценцияCt ndash пороговый цикл
Преимущества Real-time PCR
bull возможность как качественной так и количественной оценки исходной матрицы
bull отсутствие манипуляций после проведения ПЦР (электрофорез)
bull большая чувствительность (от единичных копий) и специфичность
bull большой динамический диапазон концентраций (порядка 10^7)
bull возможность постановки Multiplex анализа
1 Научные исследования
ndash амплификация ДНК для гибридизации (блоттинг микрочипы)
ndash амплификация ДНК для секвенирования
ndash клонирование геномной ДНК кДНК
ndash филогенетическое сравнение геномов
ndash генетическое картирование
ndash анализ уровня транскрипции
Применение ПЦР
2 Медицина
ndash генетическое тестирование
ndash типирование тканей (для трансплантации)
ndash тестирование мутаций в онкогенах
ndash диагностика инфекций
3 Судебная медицина
ndash ДНК-дактилоскопия
ndash установление родства
4 Анализ пищевых продуктов детекция ГМО
Применение ПЦР
Применение ПЦР
Залог успеха ПЦР
bull высокая чувствительность
bull высокая специфичность
bull высокая устойчивость
bull низкая стоимость быстрота
Получение информации
bull анализ уровня транскрипции
bull ДНК-диагностика
bull генотипирование
Получение материала
bull клонирование ДНК
bull мутагенез
bull секвенирование
N
N
О
О
Н
Н
Н
N
N
О
О
Н
Н
С
НН
Н
ОН
ОCH2
ОP
О
Оndash
HО
3`
4`
5`
2`
1`
Н
Х
Использование UDG ndash метод борьбы с контаминацией продуктами ПЦР
Тимин
(типичен
для ДНК)
Урацил
(типичен
для РНК)
Х = урацил
дезоксиуридинтрифосфат (dUTP) ndash может быть встроен в
растущую цепь как и dTTP не нарушает комплементарности
N
N
О
О
Н
Н
Н
О-
ОCH2
ОP
О
Оndash
О-
3`
4`
5`
2`
1`
Н
UDG 45-550С
Использование UDG ndash метод борьбы с контаминацией продуктами ПЦР
1) Урацил ДНК-гликозилаза присутствующая в ПЦР-смеси отщепляет урацил от цепи ДНК оставляя тн АР-сайт
О-
ОCH2
ОP
О
Оndash
О-
3`
4`
5`
2`
1`
Н
UDG 45-550С
AP-сайт
1) Урацил ДНК-гликозилаза присутствующая в ПЦР-смеси отщепляет урацил от цепи ДНК оставляя тн АР-сайт
Использование UDG ndash метод борьбы с контаминацией продуктами ПЦР
О-
ОCH2
ОP
О
Оndash
О-
3`
4`
5`
2`
1`
Н
Использование UDG ndash метод борьбы с контаминацией продуктами ПЦР
2) При нагревании до 950С UDG инактивируется а AP-сайты расщепляются в результате урацил-содержащая ДНК попавшая в пробирку до начала ПЦР деградирует3) Проводится обычная ПЦР реакционная смесь очищена от продуктов предыдущей амплификации
Digital PCR (dPCR)
65
R
PM 1ln М ndash среднее количество целевой ДНК на сегмент реакции (на основе
распределения Пуассона)Р ndash доля сегментов содержащих ПЦР-продуктR ndash общее кол-во проанализированных сегментов
Лимитирующие факторы dPCR
bull Количество сегментов реакции
bull Концентрация целевой ДНК в анализируемом образце
bull Реакционный объѐм
Коммерчески доступные системы реализующие dPCR
66
Fluidigm - технология микрофлюидных чипов
Bio-Rad (QuantaLife) -dPCR в суспензии
(Digital Droplet PCR)
Life Technologies
dPCR в платах OpenArrayreg
Подготовка образцов
(смешивание ДНК и ПЦР-реагентов)
Создание капель (Droplet Generator)
АмплификацияРегистрация и
анализ результатов
Digital droplet PCR (ddPCR)
bull QX100 Droplet Digital PCR System
Сравнение с Real-Time PCR
68
Digital PCR a powerful new tool for noninvasive prenatal diagnosis Bernhard G Zimmermann Simon Grill Wolfgang Holzgreve Prenat Diagn 2008 28 1087ndash1093
Применение ПЦР в NGS
69
Спасибо за внимание
Флюорофоры и гасители флюоресценции
Представление результатов ПЦР в реальном времени
линейный lg
Денатурация
Плавление после ПЦР
обратная производная
Плавление после ПЦР
Виды ПЦР-анализа
Качественный анализ
Сравнительный анализ
(полуколичественный)
Количественный анализ
есть нет
больше меньше Х раз
лечение
10 000 копий 1000 копий
Количественная ПЦР (qPCR)
bull Подсчёт числа копий генов
bull Анализ представленности транскриптов
bull Оценка инфекционной нагрузки
Количественная ПЦР
серия 10-кратных разведений
threshold ndash пороговая флюоресценцияCt ndash пороговый цикл
Преимущества Real-time PCR
bull возможность как качественной так и количественной оценки исходной матрицы
bull отсутствие манипуляций после проведения ПЦР (электрофорез)
bull большая чувствительность (от единичных копий) и специфичность
bull большой динамический диапазон концентраций (порядка 10^7)
bull возможность постановки Multiplex анализа
1 Научные исследования
ndash амплификация ДНК для гибридизации (блоттинг микрочипы)
ndash амплификация ДНК для секвенирования
ndash клонирование геномной ДНК кДНК
ndash филогенетическое сравнение геномов
ndash генетическое картирование
ndash анализ уровня транскрипции
Применение ПЦР
2 Медицина
ndash генетическое тестирование
ndash типирование тканей (для трансплантации)
ndash тестирование мутаций в онкогенах
ndash диагностика инфекций
3 Судебная медицина
ndash ДНК-дактилоскопия
ndash установление родства
4 Анализ пищевых продуктов детекция ГМО
Применение ПЦР
Применение ПЦР
Залог успеха ПЦР
bull высокая чувствительность
bull высокая специфичность
bull высокая устойчивость
bull низкая стоимость быстрота
Получение информации
bull анализ уровня транскрипции
bull ДНК-диагностика
bull генотипирование
Получение материала
bull клонирование ДНК
bull мутагенез
bull секвенирование
N
N
О
О
Н
Н
Н
N
N
О
О
Н
Н
С
НН
Н
ОН
ОCH2
ОP
О
Оndash
HО
3`
4`
5`
2`
1`
Н
Х
Использование UDG ndash метод борьбы с контаминацией продуктами ПЦР
Тимин
(типичен
для ДНК)
Урацил
(типичен
для РНК)
Х = урацил
дезоксиуридинтрифосфат (dUTP) ndash может быть встроен в
растущую цепь как и dTTP не нарушает комплементарности
N
N
О
О
Н
Н
Н
О-
ОCH2
ОP
О
Оndash
О-
3`
4`
5`
2`
1`
Н
UDG 45-550С
Использование UDG ndash метод борьбы с контаминацией продуктами ПЦР
1) Урацил ДНК-гликозилаза присутствующая в ПЦР-смеси отщепляет урацил от цепи ДНК оставляя тн АР-сайт
О-
ОCH2
ОP
О
Оndash
О-
3`
4`
5`
2`
1`
Н
UDG 45-550С
AP-сайт
1) Урацил ДНК-гликозилаза присутствующая в ПЦР-смеси отщепляет урацил от цепи ДНК оставляя тн АР-сайт
Использование UDG ndash метод борьбы с контаминацией продуктами ПЦР
О-
ОCH2
ОP
О
Оndash
О-
3`
4`
5`
2`
1`
Н
Использование UDG ndash метод борьбы с контаминацией продуктами ПЦР
2) При нагревании до 950С UDG инактивируется а AP-сайты расщепляются в результате урацил-содержащая ДНК попавшая в пробирку до начала ПЦР деградирует3) Проводится обычная ПЦР реакционная смесь очищена от продуктов предыдущей амплификации
Digital PCR (dPCR)
65
R
PM 1ln М ndash среднее количество целевой ДНК на сегмент реакции (на основе
распределения Пуассона)Р ndash доля сегментов содержащих ПЦР-продуктR ndash общее кол-во проанализированных сегментов
Лимитирующие факторы dPCR
bull Количество сегментов реакции
bull Концентрация целевой ДНК в анализируемом образце
bull Реакционный объѐм
Коммерчески доступные системы реализующие dPCR
66
Fluidigm - технология микрофлюидных чипов
Bio-Rad (QuantaLife) -dPCR в суспензии
(Digital Droplet PCR)
Life Technologies
dPCR в платах OpenArrayreg
Подготовка образцов
(смешивание ДНК и ПЦР-реагентов)
Создание капель (Droplet Generator)
АмплификацияРегистрация и
анализ результатов
Digital droplet PCR (ddPCR)
bull QX100 Droplet Digital PCR System
Сравнение с Real-Time PCR
68
Digital PCR a powerful new tool for noninvasive prenatal diagnosis Bernhard G Zimmermann Simon Grill Wolfgang Holzgreve Prenat Diagn 2008 28 1087ndash1093
Применение ПЦР в NGS
69
Спасибо за внимание
Представление результатов ПЦР в реальном времени
линейный lg
Денатурация
Плавление после ПЦР
обратная производная
Плавление после ПЦР
Виды ПЦР-анализа
Качественный анализ
Сравнительный анализ
(полуколичественный)
Количественный анализ
есть нет
больше меньше Х раз
лечение
10 000 копий 1000 копий
Количественная ПЦР (qPCR)
bull Подсчёт числа копий генов
bull Анализ представленности транскриптов
bull Оценка инфекционной нагрузки
Количественная ПЦР
серия 10-кратных разведений
threshold ndash пороговая флюоресценцияCt ndash пороговый цикл
Преимущества Real-time PCR
bull возможность как качественной так и количественной оценки исходной матрицы
bull отсутствие манипуляций после проведения ПЦР (электрофорез)
bull большая чувствительность (от единичных копий) и специфичность
bull большой динамический диапазон концентраций (порядка 10^7)
bull возможность постановки Multiplex анализа
1 Научные исследования
ndash амплификация ДНК для гибридизации (блоттинг микрочипы)
ndash амплификация ДНК для секвенирования
ndash клонирование геномной ДНК кДНК
ndash филогенетическое сравнение геномов
ndash генетическое картирование
ndash анализ уровня транскрипции
Применение ПЦР
2 Медицина
ndash генетическое тестирование
ndash типирование тканей (для трансплантации)
ndash тестирование мутаций в онкогенах
ndash диагностика инфекций
3 Судебная медицина
ndash ДНК-дактилоскопия
ndash установление родства
4 Анализ пищевых продуктов детекция ГМО
Применение ПЦР
Применение ПЦР
Залог успеха ПЦР
bull высокая чувствительность
bull высокая специфичность
bull высокая устойчивость
bull низкая стоимость быстрота
Получение информации
bull анализ уровня транскрипции
bull ДНК-диагностика
bull генотипирование
Получение материала
bull клонирование ДНК
bull мутагенез
bull секвенирование
N
N
О
О
Н
Н
Н
N
N
О
О
Н
Н
С
НН
Н
ОН
ОCH2
ОP
О
Оndash
HО
3`
4`
5`
2`
1`
Н
Х
Использование UDG ndash метод борьбы с контаминацией продуктами ПЦР
Тимин
(типичен
для ДНК)
Урацил
(типичен
для РНК)
Х = урацил
дезоксиуридинтрифосфат (dUTP) ndash может быть встроен в
растущую цепь как и dTTP не нарушает комплементарности
N
N
О
О
Н
Н
Н
О-
ОCH2
ОP
О
Оndash
О-
3`
4`
5`
2`
1`
Н
UDG 45-550С
Использование UDG ndash метод борьбы с контаминацией продуктами ПЦР
1) Урацил ДНК-гликозилаза присутствующая в ПЦР-смеси отщепляет урацил от цепи ДНК оставляя тн АР-сайт
О-
ОCH2
ОP
О
Оndash
О-
3`
4`
5`
2`
1`
Н
UDG 45-550С
AP-сайт
1) Урацил ДНК-гликозилаза присутствующая в ПЦР-смеси отщепляет урацил от цепи ДНК оставляя тн АР-сайт
Использование UDG ndash метод борьбы с контаминацией продуктами ПЦР
О-
ОCH2
ОP
О
Оndash
О-
3`
4`
5`
2`
1`
Н
Использование UDG ndash метод борьбы с контаминацией продуктами ПЦР
2) При нагревании до 950С UDG инактивируется а AP-сайты расщепляются в результате урацил-содержащая ДНК попавшая в пробирку до начала ПЦР деградирует3) Проводится обычная ПЦР реакционная смесь очищена от продуктов предыдущей амплификации
Digital PCR (dPCR)
65
R
PM 1ln М ndash среднее количество целевой ДНК на сегмент реакции (на основе
распределения Пуассона)Р ndash доля сегментов содержащих ПЦР-продуктR ndash общее кол-во проанализированных сегментов
Лимитирующие факторы dPCR
bull Количество сегментов реакции
bull Концентрация целевой ДНК в анализируемом образце
bull Реакционный объѐм
Коммерчески доступные системы реализующие dPCR
66
Fluidigm - технология микрофлюидных чипов
Bio-Rad (QuantaLife) -dPCR в суспензии
(Digital Droplet PCR)
Life Technologies
dPCR в платах OpenArrayreg
Подготовка образцов
(смешивание ДНК и ПЦР-реагентов)
Создание капель (Droplet Generator)
АмплификацияРегистрация и
анализ результатов
Digital droplet PCR (ddPCR)
bull QX100 Droplet Digital PCR System
Сравнение с Real-Time PCR
68
Digital PCR a powerful new tool for noninvasive prenatal diagnosis Bernhard G Zimmermann Simon Grill Wolfgang Holzgreve Prenat Diagn 2008 28 1087ndash1093
Применение ПЦР в NGS
69
Спасибо за внимание
Денатурация
Плавление после ПЦР
обратная производная
Плавление после ПЦР
Виды ПЦР-анализа
Качественный анализ
Сравнительный анализ
(полуколичественный)
Количественный анализ
есть нет
больше меньше Х раз
лечение
10 000 копий 1000 копий
Количественная ПЦР (qPCR)
bull Подсчёт числа копий генов
bull Анализ представленности транскриптов
bull Оценка инфекционной нагрузки
Количественная ПЦР
серия 10-кратных разведений
threshold ndash пороговая флюоресценцияCt ndash пороговый цикл
Преимущества Real-time PCR
bull возможность как качественной так и количественной оценки исходной матрицы
bull отсутствие манипуляций после проведения ПЦР (электрофорез)
bull большая чувствительность (от единичных копий) и специфичность
bull большой динамический диапазон концентраций (порядка 10^7)
bull возможность постановки Multiplex анализа
1 Научные исследования
ndash амплификация ДНК для гибридизации (блоттинг микрочипы)
ndash амплификация ДНК для секвенирования
ndash клонирование геномной ДНК кДНК
ndash филогенетическое сравнение геномов
ndash генетическое картирование
ndash анализ уровня транскрипции
Применение ПЦР
2 Медицина
ndash генетическое тестирование
ndash типирование тканей (для трансплантации)
ndash тестирование мутаций в онкогенах
ndash диагностика инфекций
3 Судебная медицина
ndash ДНК-дактилоскопия
ndash установление родства
4 Анализ пищевых продуктов детекция ГМО
Применение ПЦР
Применение ПЦР
Залог успеха ПЦР
bull высокая чувствительность
bull высокая специфичность
bull высокая устойчивость
bull низкая стоимость быстрота
Получение информации
bull анализ уровня транскрипции
bull ДНК-диагностика
bull генотипирование
Получение материала
bull клонирование ДНК
bull мутагенез
bull секвенирование
N
N
О
О
Н
Н
Н
N
N
О
О
Н
Н
С
НН
Н
ОН
ОCH2
ОP
О
Оndash
HО
3`
4`
5`
2`
1`
Н
Х
Использование UDG ndash метод борьбы с контаминацией продуктами ПЦР
Тимин
(типичен
для ДНК)
Урацил
(типичен
для РНК)
Х = урацил
дезоксиуридинтрифосфат (dUTP) ndash может быть встроен в
растущую цепь как и dTTP не нарушает комплементарности
N
N
О
О
Н
Н
Н
О-
ОCH2
ОP
О
Оndash
О-
3`
4`
5`
2`
1`
Н
UDG 45-550С
Использование UDG ndash метод борьбы с контаминацией продуктами ПЦР
1) Урацил ДНК-гликозилаза присутствующая в ПЦР-смеси отщепляет урацил от цепи ДНК оставляя тн АР-сайт
О-
ОCH2
ОP
О
Оndash
О-
3`
4`
5`
2`
1`
Н
UDG 45-550С
AP-сайт
1) Урацил ДНК-гликозилаза присутствующая в ПЦР-смеси отщепляет урацил от цепи ДНК оставляя тн АР-сайт
Использование UDG ndash метод борьбы с контаминацией продуктами ПЦР
О-
ОCH2
ОP
О
Оndash
О-
3`
4`
5`
2`
1`
Н
Использование UDG ndash метод борьбы с контаминацией продуктами ПЦР
2) При нагревании до 950С UDG инактивируется а AP-сайты расщепляются в результате урацил-содержащая ДНК попавшая в пробирку до начала ПЦР деградирует3) Проводится обычная ПЦР реакционная смесь очищена от продуктов предыдущей амплификации
Digital PCR (dPCR)
65
R
PM 1ln М ndash среднее количество целевой ДНК на сегмент реакции (на основе
распределения Пуассона)Р ndash доля сегментов содержащих ПЦР-продуктR ndash общее кол-во проанализированных сегментов
Лимитирующие факторы dPCR
bull Количество сегментов реакции
bull Концентрация целевой ДНК в анализируемом образце
bull Реакционный объѐм
Коммерчески доступные системы реализующие dPCR
66
Fluidigm - технология микрофлюидных чипов
Bio-Rad (QuantaLife) -dPCR в суспензии
(Digital Droplet PCR)
Life Technologies
dPCR в платах OpenArrayreg
Подготовка образцов
(смешивание ДНК и ПЦР-реагентов)
Создание капель (Droplet Generator)
АмплификацияРегистрация и
анализ результатов
Digital droplet PCR (ddPCR)
bull QX100 Droplet Digital PCR System
Сравнение с Real-Time PCR
68
Digital PCR a powerful new tool for noninvasive prenatal diagnosis Bernhard G Zimmermann Simon Grill Wolfgang Holzgreve Prenat Diagn 2008 28 1087ndash1093
Применение ПЦР в NGS
69
Спасибо за внимание
Плавление после ПЦР
обратная производная
Плавление после ПЦР
Виды ПЦР-анализа
Качественный анализ
Сравнительный анализ
(полуколичественный)
Количественный анализ
есть нет
больше меньше Х раз
лечение
10 000 копий 1000 копий
Количественная ПЦР (qPCR)
bull Подсчёт числа копий генов
bull Анализ представленности транскриптов
bull Оценка инфекционной нагрузки
Количественная ПЦР
серия 10-кратных разведений
threshold ndash пороговая флюоресценцияCt ndash пороговый цикл
Преимущества Real-time PCR
bull возможность как качественной так и количественной оценки исходной матрицы
bull отсутствие манипуляций после проведения ПЦР (электрофорез)
bull большая чувствительность (от единичных копий) и специфичность
bull большой динамический диапазон концентраций (порядка 10^7)
bull возможность постановки Multiplex анализа
1 Научные исследования
ndash амплификация ДНК для гибридизации (блоттинг микрочипы)
ndash амплификация ДНК для секвенирования
ndash клонирование геномной ДНК кДНК
ndash филогенетическое сравнение геномов
ndash генетическое картирование
ndash анализ уровня транскрипции
Применение ПЦР
2 Медицина
ndash генетическое тестирование
ndash типирование тканей (для трансплантации)
ndash тестирование мутаций в онкогенах
ndash диагностика инфекций
3 Судебная медицина
ndash ДНК-дактилоскопия
ndash установление родства
4 Анализ пищевых продуктов детекция ГМО
Применение ПЦР
Применение ПЦР
Залог успеха ПЦР
bull высокая чувствительность
bull высокая специфичность
bull высокая устойчивость
bull низкая стоимость быстрота
Получение информации
bull анализ уровня транскрипции
bull ДНК-диагностика
bull генотипирование
Получение материала
bull клонирование ДНК
bull мутагенез
bull секвенирование
N
N
О
О
Н
Н
Н
N
N
О
О
Н
Н
С
НН
Н
ОН
ОCH2
ОP
О
Оndash
HО
3`
4`
5`
2`
1`
Н
Х
Использование UDG ndash метод борьбы с контаминацией продуктами ПЦР
Тимин
(типичен
для ДНК)
Урацил
(типичен
для РНК)
Х = урацил
дезоксиуридинтрифосфат (dUTP) ndash может быть встроен в
растущую цепь как и dTTP не нарушает комплементарности
N
N
О
О
Н
Н
Н
О-
ОCH2
ОP
О
Оndash
О-
3`
4`
5`
2`
1`
Н
UDG 45-550С
Использование UDG ndash метод борьбы с контаминацией продуктами ПЦР
1) Урацил ДНК-гликозилаза присутствующая в ПЦР-смеси отщепляет урацил от цепи ДНК оставляя тн АР-сайт
О-
ОCH2
ОP
О
Оndash
О-
3`
4`
5`
2`
1`
Н
UDG 45-550С
AP-сайт
1) Урацил ДНК-гликозилаза присутствующая в ПЦР-смеси отщепляет урацил от цепи ДНК оставляя тн АР-сайт
Использование UDG ndash метод борьбы с контаминацией продуктами ПЦР
О-
ОCH2
ОP
О
Оndash
О-
3`
4`
5`
2`
1`
Н
Использование UDG ndash метод борьбы с контаминацией продуктами ПЦР
2) При нагревании до 950С UDG инактивируется а AP-сайты расщепляются в результате урацил-содержащая ДНК попавшая в пробирку до начала ПЦР деградирует3) Проводится обычная ПЦР реакционная смесь очищена от продуктов предыдущей амплификации
Digital PCR (dPCR)
65
R
PM 1ln М ndash среднее количество целевой ДНК на сегмент реакции (на основе
распределения Пуассона)Р ndash доля сегментов содержащих ПЦР-продуктR ndash общее кол-во проанализированных сегментов
Лимитирующие факторы dPCR
bull Количество сегментов реакции
bull Концентрация целевой ДНК в анализируемом образце
bull Реакционный объѐм
Коммерчески доступные системы реализующие dPCR
66
Fluidigm - технология микрофлюидных чипов
Bio-Rad (QuantaLife) -dPCR в суспензии
(Digital Droplet PCR)
Life Technologies
dPCR в платах OpenArrayreg
Подготовка образцов
(смешивание ДНК и ПЦР-реагентов)
Создание капель (Droplet Generator)
АмплификацияРегистрация и
анализ результатов
Digital droplet PCR (ddPCR)
bull QX100 Droplet Digital PCR System
Сравнение с Real-Time PCR
68
Digital PCR a powerful new tool for noninvasive prenatal diagnosis Bernhard G Zimmermann Simon Grill Wolfgang Holzgreve Prenat Diagn 2008 28 1087ndash1093
Применение ПЦР в NGS
69
Спасибо за внимание
Плавление после ПЦР
Виды ПЦР-анализа
Качественный анализ
Сравнительный анализ
(полуколичественный)
Количественный анализ
есть нет
больше меньше Х раз
лечение
10 000 копий 1000 копий
Количественная ПЦР (qPCR)
bull Подсчёт числа копий генов
bull Анализ представленности транскриптов
bull Оценка инфекционной нагрузки
Количественная ПЦР
серия 10-кратных разведений
threshold ndash пороговая флюоресценцияCt ndash пороговый цикл
Преимущества Real-time PCR
bull возможность как качественной так и количественной оценки исходной матрицы
bull отсутствие манипуляций после проведения ПЦР (электрофорез)
bull большая чувствительность (от единичных копий) и специфичность
bull большой динамический диапазон концентраций (порядка 10^7)
bull возможность постановки Multiplex анализа
1 Научные исследования
ndash амплификация ДНК для гибридизации (блоттинг микрочипы)
ndash амплификация ДНК для секвенирования
ndash клонирование геномной ДНК кДНК
ndash филогенетическое сравнение геномов
ndash генетическое картирование
ndash анализ уровня транскрипции
Применение ПЦР
2 Медицина
ndash генетическое тестирование
ndash типирование тканей (для трансплантации)
ndash тестирование мутаций в онкогенах
ndash диагностика инфекций
3 Судебная медицина
ndash ДНК-дактилоскопия
ndash установление родства
4 Анализ пищевых продуктов детекция ГМО
Применение ПЦР
Применение ПЦР
Залог успеха ПЦР
bull высокая чувствительность
bull высокая специфичность
bull высокая устойчивость
bull низкая стоимость быстрота
Получение информации
bull анализ уровня транскрипции
bull ДНК-диагностика
bull генотипирование
Получение материала
bull клонирование ДНК
bull мутагенез
bull секвенирование
N
N
О
О
Н
Н
Н
N
N
О
О
Н
Н
С
НН
Н
ОН
ОCH2
ОP
О
Оndash
HО
3`
4`
5`
2`
1`
Н
Х
Использование UDG ndash метод борьбы с контаминацией продуктами ПЦР
Тимин
(типичен
для ДНК)
Урацил
(типичен
для РНК)
Х = урацил
дезоксиуридинтрифосфат (dUTP) ndash может быть встроен в
растущую цепь как и dTTP не нарушает комплементарности
N
N
О
О
Н
Н
Н
О-
ОCH2
ОP
О
Оndash
О-
3`
4`
5`
2`
1`
Н
UDG 45-550С
Использование UDG ndash метод борьбы с контаминацией продуктами ПЦР
1) Урацил ДНК-гликозилаза присутствующая в ПЦР-смеси отщепляет урацил от цепи ДНК оставляя тн АР-сайт
О-
ОCH2
ОP
О
Оndash
О-
3`
4`
5`
2`
1`
Н
UDG 45-550С
AP-сайт
1) Урацил ДНК-гликозилаза присутствующая в ПЦР-смеси отщепляет урацил от цепи ДНК оставляя тн АР-сайт
Использование UDG ndash метод борьбы с контаминацией продуктами ПЦР
О-
ОCH2
ОP
О
Оndash
О-
3`
4`
5`
2`
1`
Н
Использование UDG ndash метод борьбы с контаминацией продуктами ПЦР
2) При нагревании до 950С UDG инактивируется а AP-сайты расщепляются в результате урацил-содержащая ДНК попавшая в пробирку до начала ПЦР деградирует3) Проводится обычная ПЦР реакционная смесь очищена от продуктов предыдущей амплификации
Digital PCR (dPCR)
65
R
PM 1ln М ndash среднее количество целевой ДНК на сегмент реакции (на основе
распределения Пуассона)Р ndash доля сегментов содержащих ПЦР-продуктR ndash общее кол-во проанализированных сегментов
Лимитирующие факторы dPCR
bull Количество сегментов реакции
bull Концентрация целевой ДНК в анализируемом образце
bull Реакционный объѐм
Коммерчески доступные системы реализующие dPCR
66
Fluidigm - технология микрофлюидных чипов
Bio-Rad (QuantaLife) -dPCR в суспензии
(Digital Droplet PCR)
Life Technologies
dPCR в платах OpenArrayreg
Подготовка образцов
(смешивание ДНК и ПЦР-реагентов)
Создание капель (Droplet Generator)
АмплификацияРегистрация и
анализ результатов
Digital droplet PCR (ddPCR)
bull QX100 Droplet Digital PCR System
Сравнение с Real-Time PCR
68
Digital PCR a powerful new tool for noninvasive prenatal diagnosis Bernhard G Zimmermann Simon Grill Wolfgang Holzgreve Prenat Diagn 2008 28 1087ndash1093
Применение ПЦР в NGS
69
Спасибо за внимание
Виды ПЦР-анализа
Качественный анализ
Сравнительный анализ
(полуколичественный)
Количественный анализ
есть нет
больше меньше Х раз
лечение
10 000 копий 1000 копий
Количественная ПЦР (qPCR)
bull Подсчёт числа копий генов
bull Анализ представленности транскриптов
bull Оценка инфекционной нагрузки
Количественная ПЦР
серия 10-кратных разведений
threshold ndash пороговая флюоресценцияCt ndash пороговый цикл
Преимущества Real-time PCR
bull возможность как качественной так и количественной оценки исходной матрицы
bull отсутствие манипуляций после проведения ПЦР (электрофорез)
bull большая чувствительность (от единичных копий) и специфичность
bull большой динамический диапазон концентраций (порядка 10^7)
bull возможность постановки Multiplex анализа
1 Научные исследования
ndash амплификация ДНК для гибридизации (блоттинг микрочипы)
ndash амплификация ДНК для секвенирования
ndash клонирование геномной ДНК кДНК
ndash филогенетическое сравнение геномов
ndash генетическое картирование
ndash анализ уровня транскрипции
Применение ПЦР
2 Медицина
ndash генетическое тестирование
ndash типирование тканей (для трансплантации)
ndash тестирование мутаций в онкогенах
ndash диагностика инфекций
3 Судебная медицина
ndash ДНК-дактилоскопия
ndash установление родства
4 Анализ пищевых продуктов детекция ГМО
Применение ПЦР
Применение ПЦР
Залог успеха ПЦР
bull высокая чувствительность
bull высокая специфичность
bull высокая устойчивость
bull низкая стоимость быстрота
Получение информации
bull анализ уровня транскрипции
bull ДНК-диагностика
bull генотипирование
Получение материала
bull клонирование ДНК
bull мутагенез
bull секвенирование
N
N
О
О
Н
Н
Н
N
N
О
О
Н
Н
С
НН
Н
ОН
ОCH2
ОP
О
Оndash
HО
3`
4`
5`
2`
1`
Н
Х
Использование UDG ndash метод борьбы с контаминацией продуктами ПЦР
Тимин
(типичен
для ДНК)
Урацил
(типичен
для РНК)
Х = урацил
дезоксиуридинтрифосфат (dUTP) ndash может быть встроен в
растущую цепь как и dTTP не нарушает комплементарности
N
N
О
О
Н
Н
Н
О-
ОCH2
ОP
О
Оndash
О-
3`
4`
5`
2`
1`
Н
UDG 45-550С
Использование UDG ndash метод борьбы с контаминацией продуктами ПЦР
1) Урацил ДНК-гликозилаза присутствующая в ПЦР-смеси отщепляет урацил от цепи ДНК оставляя тн АР-сайт
О-
ОCH2
ОP
О
Оndash
О-
3`
4`
5`
2`
1`
Н
UDG 45-550С
AP-сайт
1) Урацил ДНК-гликозилаза присутствующая в ПЦР-смеси отщепляет урацил от цепи ДНК оставляя тн АР-сайт
Использование UDG ndash метод борьбы с контаминацией продуктами ПЦР
О-
ОCH2
ОP
О
Оndash
О-
3`
4`
5`
2`
1`
Н
Использование UDG ndash метод борьбы с контаминацией продуктами ПЦР
2) При нагревании до 950С UDG инактивируется а AP-сайты расщепляются в результате урацил-содержащая ДНК попавшая в пробирку до начала ПЦР деградирует3) Проводится обычная ПЦР реакционная смесь очищена от продуктов предыдущей амплификации
Digital PCR (dPCR)
65
R
PM 1ln М ndash среднее количество целевой ДНК на сегмент реакции (на основе
распределения Пуассона)Р ndash доля сегментов содержащих ПЦР-продуктR ndash общее кол-во проанализированных сегментов
Лимитирующие факторы dPCR
bull Количество сегментов реакции
bull Концентрация целевой ДНК в анализируемом образце
bull Реакционный объѐм
Коммерчески доступные системы реализующие dPCR
66
Fluidigm - технология микрофлюидных чипов
Bio-Rad (QuantaLife) -dPCR в суспензии
(Digital Droplet PCR)
Life Technologies
dPCR в платах OpenArrayreg
Подготовка образцов
(смешивание ДНК и ПЦР-реагентов)
Создание капель (Droplet Generator)
АмплификацияРегистрация и
анализ результатов
Digital droplet PCR (ddPCR)
bull QX100 Droplet Digital PCR System
Сравнение с Real-Time PCR
68
Digital PCR a powerful new tool for noninvasive prenatal diagnosis Bernhard G Zimmermann Simon Grill Wolfgang Holzgreve Prenat Diagn 2008 28 1087ndash1093
Применение ПЦР в NGS
69
Спасибо за внимание
Количественная ПЦР (qPCR)
bull Подсчёт числа копий генов
bull Анализ представленности транскриптов
bull Оценка инфекционной нагрузки
Количественная ПЦР
серия 10-кратных разведений
threshold ndash пороговая флюоресценцияCt ndash пороговый цикл
Преимущества Real-time PCR
bull возможность как качественной так и количественной оценки исходной матрицы
bull отсутствие манипуляций после проведения ПЦР (электрофорез)
bull большая чувствительность (от единичных копий) и специфичность
bull большой динамический диапазон концентраций (порядка 10^7)
bull возможность постановки Multiplex анализа
1 Научные исследования
ndash амплификация ДНК для гибридизации (блоттинг микрочипы)
ndash амплификация ДНК для секвенирования
ndash клонирование геномной ДНК кДНК
ndash филогенетическое сравнение геномов
ndash генетическое картирование
ndash анализ уровня транскрипции
Применение ПЦР
2 Медицина
ndash генетическое тестирование
ndash типирование тканей (для трансплантации)
ndash тестирование мутаций в онкогенах
ndash диагностика инфекций
3 Судебная медицина
ndash ДНК-дактилоскопия
ndash установление родства
4 Анализ пищевых продуктов детекция ГМО
Применение ПЦР
Применение ПЦР
Залог успеха ПЦР
bull высокая чувствительность
bull высокая специфичность
bull высокая устойчивость
bull низкая стоимость быстрота
Получение информации
bull анализ уровня транскрипции
bull ДНК-диагностика
bull генотипирование
Получение материала
bull клонирование ДНК
bull мутагенез
bull секвенирование
N
N
О
О
Н
Н
Н
N
N
О
О
Н
Н
С
НН
Н
ОН
ОCH2
ОP
О
Оndash
HО
3`
4`
5`
2`
1`
Н
Х
Использование UDG ndash метод борьбы с контаминацией продуктами ПЦР
Тимин
(типичен
для ДНК)
Урацил
(типичен
для РНК)
Х = урацил
дезоксиуридинтрифосфат (dUTP) ndash может быть встроен в
растущую цепь как и dTTP не нарушает комплементарности
N
N
О
О
Н
Н
Н
О-
ОCH2
ОP
О
Оndash
О-
3`
4`
5`
2`
1`
Н
UDG 45-550С
Использование UDG ndash метод борьбы с контаминацией продуктами ПЦР
1) Урацил ДНК-гликозилаза присутствующая в ПЦР-смеси отщепляет урацил от цепи ДНК оставляя тн АР-сайт
О-
ОCH2
ОP
О
Оndash
О-
3`
4`
5`
2`
1`
Н
UDG 45-550С
AP-сайт
1) Урацил ДНК-гликозилаза присутствующая в ПЦР-смеси отщепляет урацил от цепи ДНК оставляя тн АР-сайт
Использование UDG ndash метод борьбы с контаминацией продуктами ПЦР
О-
ОCH2
ОP
О
Оndash
О-
3`
4`
5`
2`
1`
Н
Использование UDG ndash метод борьбы с контаминацией продуктами ПЦР
2) При нагревании до 950С UDG инактивируется а AP-сайты расщепляются в результате урацил-содержащая ДНК попавшая в пробирку до начала ПЦР деградирует3) Проводится обычная ПЦР реакционная смесь очищена от продуктов предыдущей амплификации
Digital PCR (dPCR)
65
R
PM 1ln М ndash среднее количество целевой ДНК на сегмент реакции (на основе
распределения Пуассона)Р ndash доля сегментов содержащих ПЦР-продуктR ndash общее кол-во проанализированных сегментов
Лимитирующие факторы dPCR
bull Количество сегментов реакции
bull Концентрация целевой ДНК в анализируемом образце
bull Реакционный объѐм
Коммерчески доступные системы реализующие dPCR
66
Fluidigm - технология микрофлюидных чипов
Bio-Rad (QuantaLife) -dPCR в суспензии
(Digital Droplet PCR)
Life Technologies
dPCR в платах OpenArrayreg
Подготовка образцов
(смешивание ДНК и ПЦР-реагентов)
Создание капель (Droplet Generator)
АмплификацияРегистрация и
анализ результатов
Digital droplet PCR (ddPCR)
bull QX100 Droplet Digital PCR System
Сравнение с Real-Time PCR
68
Digital PCR a powerful new tool for noninvasive prenatal diagnosis Bernhard G Zimmermann Simon Grill Wolfgang Holzgreve Prenat Diagn 2008 28 1087ndash1093
Применение ПЦР в NGS
69
Спасибо за внимание
Количественная ПЦР
серия 10-кратных разведений
threshold ndash пороговая флюоресценцияCt ndash пороговый цикл
Преимущества Real-time PCR
bull возможность как качественной так и количественной оценки исходной матрицы
bull отсутствие манипуляций после проведения ПЦР (электрофорез)
bull большая чувствительность (от единичных копий) и специфичность
bull большой динамический диапазон концентраций (порядка 10^7)
bull возможность постановки Multiplex анализа
1 Научные исследования
ndash амплификация ДНК для гибридизации (блоттинг микрочипы)
ndash амплификация ДНК для секвенирования
ndash клонирование геномной ДНК кДНК
ndash филогенетическое сравнение геномов
ndash генетическое картирование
ndash анализ уровня транскрипции
Применение ПЦР
2 Медицина
ndash генетическое тестирование
ndash типирование тканей (для трансплантации)
ndash тестирование мутаций в онкогенах
ndash диагностика инфекций
3 Судебная медицина
ndash ДНК-дактилоскопия
ndash установление родства
4 Анализ пищевых продуктов детекция ГМО
Применение ПЦР
Применение ПЦР
Залог успеха ПЦР
bull высокая чувствительность
bull высокая специфичность
bull высокая устойчивость
bull низкая стоимость быстрота
Получение информации
bull анализ уровня транскрипции
bull ДНК-диагностика
bull генотипирование
Получение материала
bull клонирование ДНК
bull мутагенез
bull секвенирование
N
N
О
О
Н
Н
Н
N
N
О
О
Н
Н
С
НН
Н
ОН
ОCH2
ОP
О
Оndash
HО
3`
4`
5`
2`
1`
Н
Х
Использование UDG ndash метод борьбы с контаминацией продуктами ПЦР
Тимин
(типичен
для ДНК)
Урацил
(типичен
для РНК)
Х = урацил
дезоксиуридинтрифосфат (dUTP) ndash может быть встроен в
растущую цепь как и dTTP не нарушает комплементарности
N
N
О
О
Н
Н
Н
О-
ОCH2
ОP
О
Оndash
О-
3`
4`
5`
2`
1`
Н
UDG 45-550С
Использование UDG ndash метод борьбы с контаминацией продуктами ПЦР
1) Урацил ДНК-гликозилаза присутствующая в ПЦР-смеси отщепляет урацил от цепи ДНК оставляя тн АР-сайт
О-
ОCH2
ОP
О
Оndash
О-
3`
4`
5`
2`
1`
Н
UDG 45-550С
AP-сайт
1) Урацил ДНК-гликозилаза присутствующая в ПЦР-смеси отщепляет урацил от цепи ДНК оставляя тн АР-сайт
Использование UDG ndash метод борьбы с контаминацией продуктами ПЦР
О-
ОCH2
ОP
О
Оndash
О-
3`
4`
5`
2`
1`
Н
Использование UDG ndash метод борьбы с контаминацией продуктами ПЦР
2) При нагревании до 950С UDG инактивируется а AP-сайты расщепляются в результате урацил-содержащая ДНК попавшая в пробирку до начала ПЦР деградирует3) Проводится обычная ПЦР реакционная смесь очищена от продуктов предыдущей амплификации
Digital PCR (dPCR)
65
R
PM 1ln М ndash среднее количество целевой ДНК на сегмент реакции (на основе
распределения Пуассона)Р ndash доля сегментов содержащих ПЦР-продуктR ndash общее кол-во проанализированных сегментов
Лимитирующие факторы dPCR
bull Количество сегментов реакции
bull Концентрация целевой ДНК в анализируемом образце
bull Реакционный объѐм
Коммерчески доступные системы реализующие dPCR
66
Fluidigm - технология микрофлюидных чипов
Bio-Rad (QuantaLife) -dPCR в суспензии
(Digital Droplet PCR)
Life Technologies
dPCR в платах OpenArrayreg
Подготовка образцов
(смешивание ДНК и ПЦР-реагентов)
Создание капель (Droplet Generator)
АмплификацияРегистрация и
анализ результатов
Digital droplet PCR (ddPCR)
bull QX100 Droplet Digital PCR System
Сравнение с Real-Time PCR
68
Digital PCR a powerful new tool for noninvasive prenatal diagnosis Bernhard G Zimmermann Simon Grill Wolfgang Holzgreve Prenat Diagn 2008 28 1087ndash1093
Применение ПЦР в NGS
69
Спасибо за внимание
Преимущества Real-time PCR
bull возможность как качественной так и количественной оценки исходной матрицы
bull отсутствие манипуляций после проведения ПЦР (электрофорез)
bull большая чувствительность (от единичных копий) и специфичность
bull большой динамический диапазон концентраций (порядка 10^7)
bull возможность постановки Multiplex анализа
1 Научные исследования
ndash амплификация ДНК для гибридизации (блоттинг микрочипы)
ndash амплификация ДНК для секвенирования
ndash клонирование геномной ДНК кДНК
ndash филогенетическое сравнение геномов
ndash генетическое картирование
ndash анализ уровня транскрипции
Применение ПЦР
2 Медицина
ndash генетическое тестирование
ndash типирование тканей (для трансплантации)
ndash тестирование мутаций в онкогенах
ndash диагностика инфекций
3 Судебная медицина
ndash ДНК-дактилоскопия
ndash установление родства
4 Анализ пищевых продуктов детекция ГМО
Применение ПЦР
Применение ПЦР
Залог успеха ПЦР
bull высокая чувствительность
bull высокая специфичность
bull высокая устойчивость
bull низкая стоимость быстрота
Получение информации
bull анализ уровня транскрипции
bull ДНК-диагностика
bull генотипирование
Получение материала
bull клонирование ДНК
bull мутагенез
bull секвенирование
N
N
О
О
Н
Н
Н
N
N
О
О
Н
Н
С
НН
Н
ОН
ОCH2
ОP
О
Оndash
HО
3`
4`
5`
2`
1`
Н
Х
Использование UDG ndash метод борьбы с контаминацией продуктами ПЦР
Тимин
(типичен
для ДНК)
Урацил
(типичен
для РНК)
Х = урацил
дезоксиуридинтрифосфат (dUTP) ndash может быть встроен в
растущую цепь как и dTTP не нарушает комплементарности
N
N
О
О
Н
Н
Н
О-
ОCH2
ОP
О
Оndash
О-
3`
4`
5`
2`
1`
Н
UDG 45-550С
Использование UDG ndash метод борьбы с контаминацией продуктами ПЦР
1) Урацил ДНК-гликозилаза присутствующая в ПЦР-смеси отщепляет урацил от цепи ДНК оставляя тн АР-сайт
О-
ОCH2
ОP
О
Оndash
О-
3`
4`
5`
2`
1`
Н
UDG 45-550С
AP-сайт
1) Урацил ДНК-гликозилаза присутствующая в ПЦР-смеси отщепляет урацил от цепи ДНК оставляя тн АР-сайт
Использование UDG ndash метод борьбы с контаминацией продуктами ПЦР
О-
ОCH2
ОP
О
Оndash
О-
3`
4`
5`
2`
1`
Н
Использование UDG ndash метод борьбы с контаминацией продуктами ПЦР
2) При нагревании до 950С UDG инактивируется а AP-сайты расщепляются в результате урацил-содержащая ДНК попавшая в пробирку до начала ПЦР деградирует3) Проводится обычная ПЦР реакционная смесь очищена от продуктов предыдущей амплификации
Digital PCR (dPCR)
65
R
PM 1ln М ndash среднее количество целевой ДНК на сегмент реакции (на основе
распределения Пуассона)Р ndash доля сегментов содержащих ПЦР-продуктR ndash общее кол-во проанализированных сегментов
Лимитирующие факторы dPCR
bull Количество сегментов реакции
bull Концентрация целевой ДНК в анализируемом образце
bull Реакционный объѐм
Коммерчески доступные системы реализующие dPCR
66
Fluidigm - технология микрофлюидных чипов
Bio-Rad (QuantaLife) -dPCR в суспензии
(Digital Droplet PCR)
Life Technologies
dPCR в платах OpenArrayreg
Подготовка образцов
(смешивание ДНК и ПЦР-реагентов)
Создание капель (Droplet Generator)
АмплификацияРегистрация и
анализ результатов
Digital droplet PCR (ddPCR)
bull QX100 Droplet Digital PCR System
Сравнение с Real-Time PCR
68
Digital PCR a powerful new tool for noninvasive prenatal diagnosis Bernhard G Zimmermann Simon Grill Wolfgang Holzgreve Prenat Diagn 2008 28 1087ndash1093
Применение ПЦР в NGS
69
Спасибо за внимание
1 Научные исследования
ndash амплификация ДНК для гибридизации (блоттинг микрочипы)
ndash амплификация ДНК для секвенирования
ndash клонирование геномной ДНК кДНК
ndash филогенетическое сравнение геномов
ndash генетическое картирование
ndash анализ уровня транскрипции
Применение ПЦР
2 Медицина
ndash генетическое тестирование
ndash типирование тканей (для трансплантации)
ndash тестирование мутаций в онкогенах
ndash диагностика инфекций
3 Судебная медицина
ndash ДНК-дактилоскопия
ndash установление родства
4 Анализ пищевых продуктов детекция ГМО
Применение ПЦР
Применение ПЦР
Залог успеха ПЦР
bull высокая чувствительность
bull высокая специфичность
bull высокая устойчивость
bull низкая стоимость быстрота
Получение информации
bull анализ уровня транскрипции
bull ДНК-диагностика
bull генотипирование
Получение материала
bull клонирование ДНК
bull мутагенез
bull секвенирование
N
N
О
О
Н
Н
Н
N
N
О
О
Н
Н
С
НН
Н
ОН
ОCH2
ОP
О
Оndash
HО
3`
4`
5`
2`
1`
Н
Х
Использование UDG ndash метод борьбы с контаминацией продуктами ПЦР
Тимин
(типичен
для ДНК)
Урацил
(типичен
для РНК)
Х = урацил
дезоксиуридинтрифосфат (dUTP) ndash может быть встроен в
растущую цепь как и dTTP не нарушает комплементарности
N
N
О
О
Н
Н
Н
О-
ОCH2
ОP
О
Оndash
О-
3`
4`
5`
2`
1`
Н
UDG 45-550С
Использование UDG ndash метод борьбы с контаминацией продуктами ПЦР
1) Урацил ДНК-гликозилаза присутствующая в ПЦР-смеси отщепляет урацил от цепи ДНК оставляя тн АР-сайт
О-
ОCH2
ОP
О
Оndash
О-
3`
4`
5`
2`
1`
Н
UDG 45-550С
AP-сайт
1) Урацил ДНК-гликозилаза присутствующая в ПЦР-смеси отщепляет урацил от цепи ДНК оставляя тн АР-сайт
Использование UDG ndash метод борьбы с контаминацией продуктами ПЦР
О-
ОCH2
ОP
О
Оndash
О-
3`
4`
5`
2`
1`
Н
Использование UDG ndash метод борьбы с контаминацией продуктами ПЦР
2) При нагревании до 950С UDG инактивируется а AP-сайты расщепляются в результате урацил-содержащая ДНК попавшая в пробирку до начала ПЦР деградирует3) Проводится обычная ПЦР реакционная смесь очищена от продуктов предыдущей амплификации
Digital PCR (dPCR)
65
R
PM 1ln М ndash среднее количество целевой ДНК на сегмент реакции (на основе
распределения Пуассона)Р ndash доля сегментов содержащих ПЦР-продуктR ndash общее кол-во проанализированных сегментов
Лимитирующие факторы dPCR
bull Количество сегментов реакции
bull Концентрация целевой ДНК в анализируемом образце
bull Реакционный объѐм
Коммерчески доступные системы реализующие dPCR
66
Fluidigm - технология микрофлюидных чипов
Bio-Rad (QuantaLife) -dPCR в суспензии
(Digital Droplet PCR)
Life Technologies
dPCR в платах OpenArrayreg
Подготовка образцов
(смешивание ДНК и ПЦР-реагентов)
Создание капель (Droplet Generator)
АмплификацияРегистрация и
анализ результатов
Digital droplet PCR (ddPCR)
bull QX100 Droplet Digital PCR System
Сравнение с Real-Time PCR
68
Digital PCR a powerful new tool for noninvasive prenatal diagnosis Bernhard G Zimmermann Simon Grill Wolfgang Holzgreve Prenat Diagn 2008 28 1087ndash1093
Применение ПЦР в NGS
69
Спасибо за внимание
2 Медицина
ndash генетическое тестирование
ndash типирование тканей (для трансплантации)
ndash тестирование мутаций в онкогенах
ndash диагностика инфекций
3 Судебная медицина
ndash ДНК-дактилоскопия
ndash установление родства
4 Анализ пищевых продуктов детекция ГМО
Применение ПЦР
Применение ПЦР
Залог успеха ПЦР
bull высокая чувствительность
bull высокая специфичность
bull высокая устойчивость
bull низкая стоимость быстрота
Получение информации
bull анализ уровня транскрипции
bull ДНК-диагностика
bull генотипирование
Получение материала
bull клонирование ДНК
bull мутагенез
bull секвенирование
N
N
О
О
Н
Н
Н
N
N
О
О
Н
Н
С
НН
Н
ОН
ОCH2
ОP
О
Оndash
HО
3`
4`
5`
2`
1`
Н
Х
Использование UDG ndash метод борьбы с контаминацией продуктами ПЦР
Тимин
(типичен
для ДНК)
Урацил
(типичен
для РНК)
Х = урацил
дезоксиуридинтрифосфат (dUTP) ndash может быть встроен в
растущую цепь как и dTTP не нарушает комплементарности
N
N
О
О
Н
Н
Н
О-
ОCH2
ОP
О
Оndash
О-
3`
4`
5`
2`
1`
Н
UDG 45-550С
Использование UDG ndash метод борьбы с контаминацией продуктами ПЦР
1) Урацил ДНК-гликозилаза присутствующая в ПЦР-смеси отщепляет урацил от цепи ДНК оставляя тн АР-сайт
О-
ОCH2
ОP
О
Оndash
О-
3`
4`
5`
2`
1`
Н
UDG 45-550С
AP-сайт
1) Урацил ДНК-гликозилаза присутствующая в ПЦР-смеси отщепляет урацил от цепи ДНК оставляя тн АР-сайт
Использование UDG ndash метод борьбы с контаминацией продуктами ПЦР
О-
ОCH2
ОP
О
Оndash
О-
3`
4`
5`
2`
1`
Н
Использование UDG ndash метод борьбы с контаминацией продуктами ПЦР
2) При нагревании до 950С UDG инактивируется а AP-сайты расщепляются в результате урацил-содержащая ДНК попавшая в пробирку до начала ПЦР деградирует3) Проводится обычная ПЦР реакционная смесь очищена от продуктов предыдущей амплификации
Digital PCR (dPCR)
65
R
PM 1ln М ndash среднее количество целевой ДНК на сегмент реакции (на основе
распределения Пуассона)Р ndash доля сегментов содержащих ПЦР-продуктR ndash общее кол-во проанализированных сегментов
Лимитирующие факторы dPCR
bull Количество сегментов реакции
bull Концентрация целевой ДНК в анализируемом образце
bull Реакционный объѐм
Коммерчески доступные системы реализующие dPCR
66
Fluidigm - технология микрофлюидных чипов
Bio-Rad (QuantaLife) -dPCR в суспензии
(Digital Droplet PCR)
Life Technologies
dPCR в платах OpenArrayreg
Подготовка образцов
(смешивание ДНК и ПЦР-реагентов)
Создание капель (Droplet Generator)
АмплификацияРегистрация и
анализ результатов
Digital droplet PCR (ddPCR)
bull QX100 Droplet Digital PCR System
Сравнение с Real-Time PCR
68
Digital PCR a powerful new tool for noninvasive prenatal diagnosis Bernhard G Zimmermann Simon Grill Wolfgang Holzgreve Prenat Diagn 2008 28 1087ndash1093
Применение ПЦР в NGS
69
Спасибо за внимание
Применение ПЦР
Залог успеха ПЦР
bull высокая чувствительность
bull высокая специфичность
bull высокая устойчивость
bull низкая стоимость быстрота
Получение информации
bull анализ уровня транскрипции
bull ДНК-диагностика
bull генотипирование
Получение материала
bull клонирование ДНК
bull мутагенез
bull секвенирование
N
N
О
О
Н
Н
Н
N
N
О
О
Н
Н
С
НН
Н
ОН
ОCH2
ОP
О
Оndash
HО
3`
4`
5`
2`
1`
Н
Х
Использование UDG ndash метод борьбы с контаминацией продуктами ПЦР
Тимин
(типичен
для ДНК)
Урацил
(типичен
для РНК)
Х = урацил
дезоксиуридинтрифосфат (dUTP) ndash может быть встроен в
растущую цепь как и dTTP не нарушает комплементарности
N
N
О
О
Н
Н
Н
О-
ОCH2
ОP
О
Оndash
О-
3`
4`
5`
2`
1`
Н
UDG 45-550С
Использование UDG ndash метод борьбы с контаминацией продуктами ПЦР
1) Урацил ДНК-гликозилаза присутствующая в ПЦР-смеси отщепляет урацил от цепи ДНК оставляя тн АР-сайт
О-
ОCH2
ОP
О
Оndash
О-
3`
4`
5`
2`
1`
Н
UDG 45-550С
AP-сайт
1) Урацил ДНК-гликозилаза присутствующая в ПЦР-смеси отщепляет урацил от цепи ДНК оставляя тн АР-сайт
Использование UDG ndash метод борьбы с контаминацией продуктами ПЦР
О-
ОCH2
ОP
О
Оndash
О-
3`
4`
5`
2`
1`
Н
Использование UDG ndash метод борьбы с контаминацией продуктами ПЦР
2) При нагревании до 950С UDG инактивируется а AP-сайты расщепляются в результате урацил-содержащая ДНК попавшая в пробирку до начала ПЦР деградирует3) Проводится обычная ПЦР реакционная смесь очищена от продуктов предыдущей амплификации
Digital PCR (dPCR)
65
R
PM 1ln М ndash среднее количество целевой ДНК на сегмент реакции (на основе
распределения Пуассона)Р ndash доля сегментов содержащих ПЦР-продуктR ndash общее кол-во проанализированных сегментов
Лимитирующие факторы dPCR
bull Количество сегментов реакции
bull Концентрация целевой ДНК в анализируемом образце
bull Реакционный объѐм
Коммерчески доступные системы реализующие dPCR
66
Fluidigm - технология микрофлюидных чипов
Bio-Rad (QuantaLife) -dPCR в суспензии
(Digital Droplet PCR)
Life Technologies
dPCR в платах OpenArrayreg
Подготовка образцов
(смешивание ДНК и ПЦР-реагентов)
Создание капель (Droplet Generator)
АмплификацияРегистрация и
анализ результатов
Digital droplet PCR (ddPCR)
bull QX100 Droplet Digital PCR System
Сравнение с Real-Time PCR
68
Digital PCR a powerful new tool for noninvasive prenatal diagnosis Bernhard G Zimmermann Simon Grill Wolfgang Holzgreve Prenat Diagn 2008 28 1087ndash1093
Применение ПЦР в NGS
69
Спасибо за внимание
N
N
О
О
Н
Н
Н
N
N
О
О
Н
Н
С
НН
Н
ОН
ОCH2
ОP
О
Оndash
HО
3`
4`
5`
2`
1`
Н
Х
Использование UDG ndash метод борьбы с контаминацией продуктами ПЦР
Тимин
(типичен
для ДНК)
Урацил
(типичен
для РНК)
Х = урацил
дезоксиуридинтрифосфат (dUTP) ndash может быть встроен в
растущую цепь как и dTTP не нарушает комплементарности
N
N
О
О
Н
Н
Н
О-
ОCH2
ОP
О
Оndash
О-
3`
4`
5`
2`
1`
Н
UDG 45-550С
Использование UDG ndash метод борьбы с контаминацией продуктами ПЦР
1) Урацил ДНК-гликозилаза присутствующая в ПЦР-смеси отщепляет урацил от цепи ДНК оставляя тн АР-сайт
О-
ОCH2
ОP
О
Оndash
О-
3`
4`
5`
2`
1`
Н
UDG 45-550С
AP-сайт
1) Урацил ДНК-гликозилаза присутствующая в ПЦР-смеси отщепляет урацил от цепи ДНК оставляя тн АР-сайт
Использование UDG ndash метод борьбы с контаминацией продуктами ПЦР
О-
ОCH2
ОP
О
Оndash
О-
3`
4`
5`
2`
1`
Н
Использование UDG ndash метод борьбы с контаминацией продуктами ПЦР
2) При нагревании до 950С UDG инактивируется а AP-сайты расщепляются в результате урацил-содержащая ДНК попавшая в пробирку до начала ПЦР деградирует3) Проводится обычная ПЦР реакционная смесь очищена от продуктов предыдущей амплификации
Digital PCR (dPCR)
65
R
PM 1ln М ndash среднее количество целевой ДНК на сегмент реакции (на основе
распределения Пуассона)Р ndash доля сегментов содержащих ПЦР-продуктR ndash общее кол-во проанализированных сегментов
Лимитирующие факторы dPCR
bull Количество сегментов реакции
bull Концентрация целевой ДНК в анализируемом образце
bull Реакционный объѐм
Коммерчески доступные системы реализующие dPCR
66
Fluidigm - технология микрофлюидных чипов
Bio-Rad (QuantaLife) -dPCR в суспензии
(Digital Droplet PCR)
Life Technologies
dPCR в платах OpenArrayreg
Подготовка образцов
(смешивание ДНК и ПЦР-реагентов)
Создание капель (Droplet Generator)
АмплификацияРегистрация и
анализ результатов
Digital droplet PCR (ddPCR)
bull QX100 Droplet Digital PCR System
Сравнение с Real-Time PCR
68
Digital PCR a powerful new tool for noninvasive prenatal diagnosis Bernhard G Zimmermann Simon Grill Wolfgang Holzgreve Prenat Diagn 2008 28 1087ndash1093
Применение ПЦР в NGS
69
Спасибо за внимание
N
N
О
О
Н
Н
Н
О-
ОCH2
ОP
О
Оndash
О-
3`
4`
5`
2`
1`
Н
UDG 45-550С
Использование UDG ndash метод борьбы с контаминацией продуктами ПЦР
1) Урацил ДНК-гликозилаза присутствующая в ПЦР-смеси отщепляет урацил от цепи ДНК оставляя тн АР-сайт
О-
ОCH2
ОP
О
Оndash
О-
3`
4`
5`
2`
1`
Н
UDG 45-550С
AP-сайт
1) Урацил ДНК-гликозилаза присутствующая в ПЦР-смеси отщепляет урацил от цепи ДНК оставляя тн АР-сайт
Использование UDG ndash метод борьбы с контаминацией продуктами ПЦР
О-
ОCH2
ОP
О
Оndash
О-
3`
4`
5`
2`
1`
Н
Использование UDG ndash метод борьбы с контаминацией продуктами ПЦР
2) При нагревании до 950С UDG инактивируется а AP-сайты расщепляются в результате урацил-содержащая ДНК попавшая в пробирку до начала ПЦР деградирует3) Проводится обычная ПЦР реакционная смесь очищена от продуктов предыдущей амплификации
Digital PCR (dPCR)
65
R
PM 1ln М ndash среднее количество целевой ДНК на сегмент реакции (на основе
распределения Пуассона)Р ndash доля сегментов содержащих ПЦР-продуктR ndash общее кол-во проанализированных сегментов
Лимитирующие факторы dPCR
bull Количество сегментов реакции
bull Концентрация целевой ДНК в анализируемом образце
bull Реакционный объѐм
Коммерчески доступные системы реализующие dPCR
66
Fluidigm - технология микрофлюидных чипов
Bio-Rad (QuantaLife) -dPCR в суспензии
(Digital Droplet PCR)
Life Technologies
dPCR в платах OpenArrayreg
Подготовка образцов
(смешивание ДНК и ПЦР-реагентов)
Создание капель (Droplet Generator)
АмплификацияРегистрация и
анализ результатов
Digital droplet PCR (ddPCR)
bull QX100 Droplet Digital PCR System
Сравнение с Real-Time PCR
68
Digital PCR a powerful new tool for noninvasive prenatal diagnosis Bernhard G Zimmermann Simon Grill Wolfgang Holzgreve Prenat Diagn 2008 28 1087ndash1093
Применение ПЦР в NGS
69
Спасибо за внимание
О-
ОCH2
ОP
О
Оndash
О-
3`
4`
5`
2`
1`
Н
UDG 45-550С
AP-сайт
1) Урацил ДНК-гликозилаза присутствующая в ПЦР-смеси отщепляет урацил от цепи ДНК оставляя тн АР-сайт
Использование UDG ndash метод борьбы с контаминацией продуктами ПЦР
О-
ОCH2
ОP
О
Оndash
О-
3`
4`
5`
2`
1`
Н
Использование UDG ndash метод борьбы с контаминацией продуктами ПЦР
2) При нагревании до 950С UDG инактивируется а AP-сайты расщепляются в результате урацил-содержащая ДНК попавшая в пробирку до начала ПЦР деградирует3) Проводится обычная ПЦР реакционная смесь очищена от продуктов предыдущей амплификации
Digital PCR (dPCR)
65
R
PM 1ln М ndash среднее количество целевой ДНК на сегмент реакции (на основе
распределения Пуассона)Р ndash доля сегментов содержащих ПЦР-продуктR ndash общее кол-во проанализированных сегментов
Лимитирующие факторы dPCR
bull Количество сегментов реакции
bull Концентрация целевой ДНК в анализируемом образце
bull Реакционный объѐм
Коммерчески доступные системы реализующие dPCR
66
Fluidigm - технология микрофлюидных чипов
Bio-Rad (QuantaLife) -dPCR в суспензии
(Digital Droplet PCR)
Life Technologies
dPCR в платах OpenArrayreg
Подготовка образцов
(смешивание ДНК и ПЦР-реагентов)
Создание капель (Droplet Generator)
АмплификацияРегистрация и
анализ результатов
Digital droplet PCR (ddPCR)
bull QX100 Droplet Digital PCR System
Сравнение с Real-Time PCR
68
Digital PCR a powerful new tool for noninvasive prenatal diagnosis Bernhard G Zimmermann Simon Grill Wolfgang Holzgreve Prenat Diagn 2008 28 1087ndash1093
Применение ПЦР в NGS
69
Спасибо за внимание
О-
ОCH2
ОP
О
Оndash
О-
3`
4`
5`
2`
1`
Н
Использование UDG ndash метод борьбы с контаминацией продуктами ПЦР
2) При нагревании до 950С UDG инактивируется а AP-сайты расщепляются в результате урацил-содержащая ДНК попавшая в пробирку до начала ПЦР деградирует3) Проводится обычная ПЦР реакционная смесь очищена от продуктов предыдущей амплификации
Digital PCR (dPCR)
65
R
PM 1ln М ndash среднее количество целевой ДНК на сегмент реакции (на основе
распределения Пуассона)Р ndash доля сегментов содержащих ПЦР-продуктR ndash общее кол-во проанализированных сегментов
Лимитирующие факторы dPCR
bull Количество сегментов реакции
bull Концентрация целевой ДНК в анализируемом образце
bull Реакционный объѐм
Коммерчески доступные системы реализующие dPCR
66
Fluidigm - технология микрофлюидных чипов
Bio-Rad (QuantaLife) -dPCR в суспензии
(Digital Droplet PCR)
Life Technologies
dPCR в платах OpenArrayreg
Подготовка образцов
(смешивание ДНК и ПЦР-реагентов)
Создание капель (Droplet Generator)
АмплификацияРегистрация и
анализ результатов
Digital droplet PCR (ddPCR)
bull QX100 Droplet Digital PCR System
Сравнение с Real-Time PCR
68
Digital PCR a powerful new tool for noninvasive prenatal diagnosis Bernhard G Zimmermann Simon Grill Wolfgang Holzgreve Prenat Diagn 2008 28 1087ndash1093
Применение ПЦР в NGS
69
Спасибо за внимание
Digital PCR (dPCR)
65
R
PM 1ln М ndash среднее количество целевой ДНК на сегмент реакции (на основе
распределения Пуассона)Р ndash доля сегментов содержащих ПЦР-продуктR ndash общее кол-во проанализированных сегментов
Лимитирующие факторы dPCR
bull Количество сегментов реакции
bull Концентрация целевой ДНК в анализируемом образце
bull Реакционный объѐм
Коммерчески доступные системы реализующие dPCR
66
Fluidigm - технология микрофлюидных чипов
Bio-Rad (QuantaLife) -dPCR в суспензии
(Digital Droplet PCR)
Life Technologies
dPCR в платах OpenArrayreg
Подготовка образцов
(смешивание ДНК и ПЦР-реагентов)
Создание капель (Droplet Generator)
АмплификацияРегистрация и
анализ результатов
Digital droplet PCR (ddPCR)
bull QX100 Droplet Digital PCR System
Сравнение с Real-Time PCR
68
Digital PCR a powerful new tool for noninvasive prenatal diagnosis Bernhard G Zimmermann Simon Grill Wolfgang Holzgreve Prenat Diagn 2008 28 1087ndash1093
Применение ПЦР в NGS
69
Спасибо за внимание
Коммерчески доступные системы реализующие dPCR
66
Fluidigm - технология микрофлюидных чипов
Bio-Rad (QuantaLife) -dPCR в суспензии
(Digital Droplet PCR)
Life Technologies
dPCR в платах OpenArrayreg
Подготовка образцов
(смешивание ДНК и ПЦР-реагентов)
Создание капель (Droplet Generator)
АмплификацияРегистрация и
анализ результатов
Digital droplet PCR (ddPCR)
bull QX100 Droplet Digital PCR System
Сравнение с Real-Time PCR
68
Digital PCR a powerful new tool for noninvasive prenatal diagnosis Bernhard G Zimmermann Simon Grill Wolfgang Holzgreve Prenat Diagn 2008 28 1087ndash1093
Применение ПЦР в NGS
69
Спасибо за внимание
Подготовка образцов
(смешивание ДНК и ПЦР-реагентов)
Создание капель (Droplet Generator)
АмплификацияРегистрация и
анализ результатов
Digital droplet PCR (ddPCR)
bull QX100 Droplet Digital PCR System
Сравнение с Real-Time PCR
68
Digital PCR a powerful new tool for noninvasive prenatal diagnosis Bernhard G Zimmermann Simon Grill Wolfgang Holzgreve Prenat Diagn 2008 28 1087ndash1093
Применение ПЦР в NGS
69
Спасибо за внимание
Сравнение с Real-Time PCR
68
Digital PCR a powerful new tool for noninvasive prenatal diagnosis Bernhard G Zimmermann Simon Grill Wolfgang Holzgreve Prenat Diagn 2008 28 1087ndash1093
Применение ПЦР в NGS
69
Спасибо за внимание
Применение ПЦР в NGS
69
Спасибо за внимание
Спасибо за внимание
top related