biosintesis del etileno en kiwi
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Characterization of ethylene biosynthesisCharacterization of ethylene biosynthesis and its regulation during fruit ripening in kiwifruit Actinidia chinensis ‘Sanuki Gold’kiwifruit, Actinidia chinensis ‘Sanuki Gold’
Sandra Casimiro Gonzáles
Juan Carlos Dávila Romero
James Euler Villar
Conceptos Previos.
BIOSÍNTESIS DE ETILENO
MET
SAM
ACCETHSAM
ACS
ACO
Conceptos Previos.MECANISMO DE ACCIÓN DEL ETILENO
EN PRESENCIA DE ETILENO
EN PRESENCIA DE 1‐MCP
MECANISMO DE ACCION DEL 1‐MCP
Conceptos Previos.RELACIÓN KIWI ‐ PRODUCCIÓN DE ETILENO.
• Rara vez produce etileno .p
• Biosíntesis desencadenada por:
– Presencia de etileno exógeno– Presencia de etileno exógeno.
– Daño físico.
Ataque de patógenos– Ataque de patógenos.
Conceptos Previos.1 – MCP.• Metil Ciclo Propano: olefina cíclica sintética.• Bloquea el acceso del etileno a sus receptoresBloquea el acceso del etileno a sus receptores.• El efecto varía según frutos, estadíos de madurez.• En tomates, peras, melones: retrasa la producción de
etileno; inhibe la expresión de ACS y ACO (biosíntesisetileno; inhibe la expresión de ACS y ACO (biosíntesisregulada por el sistema autocatalítico).
• En plátanos y duraznos: no presenta efecto (biosíntesis noregulada por el sistema autocatalítico)regulada por el sistema autocatalítico).
• No ha sido estudiada la duración de su efecto inhibitorioen presencia de etileno en frutos recien cosechados dekiwikiwi.
Materiales. KIWI.
• Actinidia chinensis “Sanuki gold”g
• Orígen: China
• Bajo contenido de azúcar• Bajo contenido de azúcar.
• Alto contenido de ácidos orgánicos.
Metodología. 1. DETECCIÓN DE LA PRODUCCIÓN DE ETILENO.
OBJETIVO:Conocer el tiempoen que se generail l
Jarra 1.3 lѲ incub. = 2h
etileno en losfrutos maduros
1 ml gas
GC – FID: Detección de etileno
Metodología. 2. TRATAMIENTO CON PROPILENO.
OBJETIVO:Determinar lasensibilidad de labi í i d
96 DAP 143 DAP 154 DAP1 DAPMadurez comercial
Madurez comercial
Fruto j
66 DAPFruto j biosíntesis de
etileno ante laexposición alpropileno, en
comercial temprana
comercialjovenjoven
5000 µL/Lp p ,frutos de diferenteestado demadurez.
Bolsa 15 l15 frutas
5000 µL/Lpropileno
Incubar 12h/25°C12h/25 C
Abrir y evacuar aire
Reinyectar 5000 µL/Lpropileno Continuar el proceso
hasta detectar la producción de etileno
Metodología.3. TRATAMIENTO CON 1 – MCP.
OBJETIVOS:1. Estudiar laregulación de laí i d il
Seleccionar frutos que producen etileno
síntesis de etileno.2. Determinar laconcentración de1‐MCP requerida
Bolsa 15 l15 frutas
Incubar 12h/25°C
qpara la supresiónde la actividad deetileno.
1 µL/L 5 µL/L 10 µL/L 100 µL/L
Metodología.4. EFECTIVIDAD DEL 1 – MCP.
Control150 DAP25°C
Tratamiento con 1‐MCP10 µL/L x 12h
Para todos los frutos:
5000 µL/L propileno
Jarra 1.3 l2 h incub.
1 ml gasGC – FID:
Detección de etileno
Conservar el fruto a ‐80°C
Extracción de RNAExtracción de RNAAnálisis de Expresión de Genes
Metodología.5. CLONACIÓN DE FRAGMENTOS DE DNA.
Fruto ‐80°C
Extracción de RNA
RNA + Oligo (dt)
Obtención de cDNA(primera cadena)
Amplificación de la Primera Cadena
Identificación de Clonación de genesIdentificación de fragmentos
(SAM, ACS, ACO)
RT – PCR + TAClonación de genes responsables de la
biosíntesis de etileno
Metodología.6. ANALISIS DE GENES.
De cada muestra RNA (5 µg)
Electroforesis 1.2% Gel AgarosaGel Agarosa
Transferencia a membrana Hybond‐N+
Hibridización de los genes
L d iLavados sucesivos
Detección inmunológica
CDP‐Star(sustrato quimioluminiscente)
+ Exposición a HP‐CFg
(placa de luminiscencia)
Resultados.
Respuesta de la fruta kiwi cosechada en diferentes etapas de desarrollo para eltratamiento con propileno para determinar la respuesta de la biosíntesis de etileno
Cosechada a etapa de explotación comercial
Niveles del pico deproducción de etilenodisminuye a medida que lafruta avanza en su madurezfruta avanza en su madurez
Resultados.
Supresión de la biosíntesis de etileno por 1‐MCP en el tratamiento de maduración delos frutos
Recolección de frutos en laetapa de madurez comercialpde 154 DAP y 4 días deexposición a propileno.
Control no produjoniveles detectables deetileno
Resultados.
La inhibición de la producción de etileno de 1‐MCP en el tratamientofruta madura
se observa después del día 2 antes de producir etileno
De manera constante
Coincide con producción de etileno
Se observa después de 5 días
Conclusiones.
1. El fruto no inicia la biosíntesis de etileno sinexposición previa a factores que desencadenanla reacción.
2 La sensibilidad de la biosíntesis del etileno ante2. La sensibilidad de la biosíntesis del etileno anteel tratamiento con propileno disminuye amedida que el fruto madura.
3. La biosíntesis del etileno está regulada por unaretroalimentación positiva (presencia deestímulos externos)estímulos externos).
4. El 1‐MCP aplicado en la cosecha, protege alfruto de los efectos del etileno.
Limitaciones de la Investigación.
• No se evalúan los compuestos volátiles.No se evalúan los compuestos volátiles.
• Se desconoce el comportamiento de los componentes volátiles y el flavor del frutocomponentes volátiles y el flavor del fruto.
• Ambiguedad en la interpretación del blotting.
Futuras Investigaciones en el Tema.
• Niveles de proteínas del receptor de etileno durante lafase inmad ra e al ar hasta la senescenciafase inmadura; evaluar hasta la senescencia.
• Efecto de otros inhibidores de etileno como laaminoetoxivinilglicina (AVG) o el ácidoaminoetoxivinilglicina (AVG) o el ácidoaminooxiacetico (AOA) que actúan como inhibidoresde enzimas bloqueando la conversión de SAM en ACC(Salisburry y Ross 2000)(Salisburry y Ross, 2000) .
• Influencia en la capacidad antioxidante y compuestosbioactivos, después de los tratamientos con propileno,, p p p ,1‐MCP y al 1‐MCP‐propileno al que será sometido elfruto de kiwi.
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