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UNIVERSIDAD DE CHILE
FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS Y FARMACÉUTICAS DEPARTAMENTO DE QUÍMICA FARMACOLÓGICA Y TOXICOLÓGICA LABORATORIOS DE BIOELECTROQUÍMICA Y FARMACOQUÍMICA
“ESTUDIO DEL COMPORTAMIENTO ELECTROQUÍMICO DE BENSERAZIDA Y APLICACIONES ANALÍTICAS”
PROFESOR PATROCINANTE DIRECTORES DE MEMORIA Dr. Alejandro Álvarez Lueje Dr. Alejandro Álvarez Lueje Departamento de Química Dra. Soledad Bollo Dragnic Farmacológica y Toxicológica Departamento de Química
Farmacológica y Toxicológica
Memoria para optar al título de Químico Farmacéutico
MARÍA MAGDALENA PÉREZ ORTIZ SANTIAGO DE CHILE
2008
A mi madre, por todo su esfuerzo, apoyo y amor incondicional
Agradecimientos Agradezco primeramente a Dios por permitirme terminar este camino, por darme valor, perseverancia y fuerza para afrontarlo en los momentos difíciles, y capacidad para disfrutarlo en los momentos felices. A mi madre, a quién amo y admiro, por ser siempre un ejemplo para mi y mis hermanos, y por haber estado presente a lo largo de mi vida y de mi carrera. A mi abuela y a mis hermanos, por el cariño y el apoyo que cada uno me brinda a su manera. A mi director, profesor Alejandro Álvarez, por brindarme sus conocimientos y guiarme con paciencia al logro de esta meta. A los profesores Claudia Yánez, Soledad bollo y Pablo Richter, por sus consejos y correcciones. A mis compañeros del laboratorio de Bioelectroquímica, Marcia, Paola, Mauricio y Ricardo, por sus conocimientos electroquímicos tan necesarios en el desarrollo de esta memoria. A mis pocos pero buenos amigos, Kathy, Claudio y Cecilia, por enseñarme el valor de la amistad y todos los momentos vividos. Finalmente, a todos aquéllos que hicieron posible que este día llegara y contribuyeron a la realización de este trabajo.
ii
ÍNDICE
RESUMEN............................................................................................... iii
SUMMARY .............................................................................................. iv
1. INTRODUCCIÓN ..................................................................................1
2. MATERIALES Y MÉTODOS ....................................................................4
2.1 Materiales................................................................................................. 4
2.1.1 Fármacos estudiados.......................................................................... 4
2.1.2 Reactivos y disolventes ...................................................................... 4
2.1.3 Disoluciones tampón .......................................................................... 5
2.1.4 Material de vidrio ............................................................................... 5
2.1.5 Instrumental de uso general y otros materiales.................................. 5
2.1.6 Equipos .............................................................................................. 6
2.2 Métodos.................................................................................................... 7
2.2.1 Caracterización electroquímica ........................................................... 7
2.2.1.1 Preparación de disoluciones......................................................... 7
2.2.1.2 Voltamperometría de pulso diferencial......................................... 8
2.2.1.3 Voltamperometría cíclica ............................................................. 9
2.2.1.4 Electrólisis a potencial controlado...............................................10
2.2.1.5 Espectroelectroquímica...............................................................13
2.2.2 Desarrollo de la metodología electroanalítica ....................................14
2.2.3 Aplicación a forma farmacéutica........................................................18
2.2.4 Cromatografía líquida de alta eficiencia .............................................19
2.2.5. Estudio de estabilidad por voltamperometría de pulso diferencial .....19
2.2.6. Determinación de la constante de disociación...................................21
i
3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN ..............................................................23
3.1 Caracterización electroquímica ................................................................23
3.1.1 Comportamiento electroquímico de benserazida ...................................23
3.1.1.1 Voltamperometría de pulso diferencial en medio acuoso.................23
3.1.1.3 Voltamperometría hidrodinámica....................................................31
3.1.2 Comportamiento electroquímico de levodopa ........................................38
3.1.2.1 Voltamperometría de pulso diferencial en medio acuoso.................38
3.1.2.2 Voltamperometría cíclica ................................................................39
3.2. Desarrollo de la metodología electroanalítica ..........................................41
3.2.1 Selección de condiciones óptimas ......................................................41
3.2.2 Curva de calibración ..........................................................................43
3.2.3 Estudios de Selectividad ....................................................................45
3.3 Aplicaciones de la metodología analítica ..................................................50
3.3.1 Cuantificación de benserazida en forma farmacéutica........................50
3.3.2 Estudio de estabilidad hidrolítica de benserazida ...............................52
CONCLUSIONES ....................................................................................56
REFERENCIAS .......................................................................................58
ii
Resumen
RESUMEN
En esta Memoria se presenta el estudio del comportamiento anódico del
fármaco antiparkinsoniano benserazida, haciendo uso de las técnicas de
voltamperometrías de pulso diferencial (VPD), cíclica (VC), lineal (VL), y
electrólisis a potencial controlado (EPC) y el desarrollo de una metodología por
VPD para su determinación, ya sea como materia prima o forma farmacéutica.
Empleando VPD, benserazida exhibe una señal de oxidación principal, bien
definida, a potenciales relativamente bajos en un amplio rango de pH (2-10) y
otras tres señales a potenciales más anódicos, menos resueltas, sobre el
electrodo de carbón vítreo en medio acuoso. Las señales son pH dependientes y
se desplazan hacia potenciales menos positivos conforme aumenta el pH del
medio. Por otra parte, los resultados de VC y VL en medio acuoso revelan que el
proceso de oxidación es irreversible y está controlado por difusión de la especie
electroactiva a la superficie del electrodo de carbón vítreo.
La metodología analítica para la determinación de benserazida se realizó
por VPD, en disolución tampón Britton-Robinson 0.1 M, pH 6, presentando
valores de repetibilidad y reproducibilidad adecuados (CV<2%), porcentajes de
recuperación superiores a 98%, en un rango dinámico entre 2.5×10-5 y
2.5×10-4 M. Además, la metodología desarrollada fue selectiva frente a los
excipientes contenidos en la formulación farmacéutica. Esta metodología fue
aplicada a la valoración y determinación de la uniformidad de contenido de
benserazida en asociación con levodopa en comprimidos, obteniéndose
resultados comparables con el método oficial descrito en la Farmacopea Británica
2003.
Finalmente, la metodología voltamperométrica se aplicó al ensayo de la
cinética de degradación hidrolítica de benserazida, encontrando una cinética de
orden uno en las condiciones ensayadas.
iii
Summary
SUMMARY
ELECTROCHEMICAL BEHAVIOR OF BENSERAZIDE AND ANALYTICAL APPLICATIONS
In this Thesis, the electrochemical behavior of the anti Parkinson drug
benserazide and its analytical determination is presented. These studies were
carried out by using differential pulse (DPV), cyclic (CV) and linear (LV)
voltammetries techniques and also electrolysis experiments. Furthermore, a DPV
methodology was developed in order to quantify benserazide in both
pharmaceuticals and raw material.
By using DPV, benserazide exhibited a main well-defined oxidation signal
at low potentials in a broad pH range (2-10), and also three bad resolved signals
at higher anodic potentials on glassy carbon electrode in aqueous media. These
signals were pH-dependents and shifting towards less positive potentials with pH.
On the other hand, CV and LV experiments reveal that in aqueous medium, the
oxidation process was irreversible and diffusion-controlled.
The developed analytical methodology was carried out by using DPV, in
0.1 M Britton-Robinson buffer pH 6, and exhibited adequate repeatability and
reproducibility values with RSD < 2% and percentages recoveries higher than
98% in a concentration range of 2.5×10-5 y 2.5×10-4 M. Also, pharmaceutical
excipients do not interfered in the proposed method. Additionally, the developed
DPV method was successfully applied to both the assay and the uniformity
content of benserazide in presence of levodopa in tablets and the results were
compared with the official one, described by Britannic Pharmacopoeia 2003.
Finally, the voltammetric method was also applied to the hydrolytic
degradation studies of benserazide, finding that benserazide exhibits a pseudo
first order kinetic in the experimental conditions tested.
iv
Magdalena Pérez O.
1. INTRODUCCIÓN
La enfermedad de Parkinson es una enfermedad neurodegenerativa del
sistema nervioso central, cuya principal característica es la muerte progresiva de
neuronas en una parte del cerebro, denominada sustancia negra. La
consecuencia más importante de esta pérdida neuronal es una marcada
disminución en la disponibilidad cerebral de dopamina, principal neurotrasmisor
sintetizado por estas neuronas, originándose una disfunción en la regulación de
las principales estructuras cerebrales implicadas en el control del movimiento1- 5
De esta manera, la enfermedad de Parkinson se caracteriza por ser un
trastorno motor progresivo, cuyos principales síntomas son la torpeza
generalizada, con lentitud en la realización de movimientos, escasez de motilidad
espontánea, temblor de reposo y rigidez1,6.
En la actualidad se puede resumir que la enfermedad de Parkinson no
tiene una causa única, existiendo casos familiares con anomalías genéticas
conocidas y otros casos en los que una conjunción de factores genéticos y
ambientales, serían los responsables de la muerte neuronal3,7.
El tratamiento farmacológico fundamental es la reposición de dopamina
cerebral, mediante la administración de su precursor levodopa, pues la dopamina
no es capaz de atravesar la barrera hematoencefálica. Sin embargo, aún cuando
levodopa atraviesa la barrera hematoencefálica y se transforma en dopamina por
acción de la enzima dopa-descarboxilasa, un 95% de ella es transformada en
dopamina fuera del sistema nervioso central. Ello implica administrar altas dosis
del fármaco, lo que se asocia con complicaciones motoras a mediano-largo plazo
y otros efectos adversos, como taquicardias y arritmias, producto de su
conversión periférica8,9.
Con el fin de prevenir las complicaciones ya mencionadas, asociadas a la
conversión periférica de levodopa en dopamina y a la vez aumentar sus niveles
1
Summary
en el sistema nervioso central, se ha asociado a levodopa un inhibidor de la
descarboxilasa periférica (carbidopa o benserazida), de manera de reducir así sus
dosis y los efectos secundarios relacionados1,8.
Benserazida, 2-amino-3-hidroxi-2´-(2,3,4-trihidroxibencil) propiono-
hidrazida (Figura 1), es un inhibidor periférico de la enzima dopa descarboxilasa,
empleado conjuntamente con levodopa [3-(3,4-dihidroxifenil)-l-alanina] para el
tratamiento de la enfermedad de Parkinson, en proporción 1:4, respectivamente.
Se emplea en dosis diarias de 50 mg, que pueden ser incrementadas a
100 ó
Desde el punto de vista analítico, benserazida ha sido determinada
simultá
OH
OH
NN
O
NH2
OHH
H
250 mg, conjuntamente con levodopa. Es rápidamente absorbida y
metabolizada a trihidroxibenzilhidrazina en la mucosa intestinal e hígado después
de una administración oral, alcanzando niveles plasmáticos de 1 mg/L después
de 1 h de una administración oral de 50 mg. Aproximadamente el 50 a 60 % de
una dosis oral y el 80 % de una dosis IV es excretado en 12 h, principalmente
como metabolitos, los cuales se excretan en su mayor parte por la orina y en
menor proporción por las heces1,10.
neamente con levodopa en formulaciones farmacéuticas, empleando
distintos métodos, como electroforesis capilar11- 13, espectrofotometría
derivativa14- 16, multivariada17- 20 y por complejación con dióxido de germanio21,
mientras que la Farmacopea Británica emplea la cromatografía líquida en fase
reversa con detector ultravioleta, como método oficial para la determinación
simultánea de levodopa y benserazida22.
OH
Figura 1. Estructura química de benserazida
2
Magdalena Pérez O.
Por otra parte, benserazida ha sido determinada en fluidos biológicos por
HPLC con detector electroquímico, al igual que muchos congéneres catecólicos,
como levodopa, carbidopa y catecolaminas endógenas, en función de la oxidación
electroquímica de los hidroxilos fenólicos presentes en la estructura23- 26.
Pese a lo anteriormente expuesto, no existen estudios que describan el
comportamiento electroquímico de benserazida ni tampoco su determinación
analítica empleando algún método voltamperométrico.
En función de los antecedentes expuestos, en esta Memoria se plantea
como objetivo general el estudio del comportamiento electroquímico de
benserazida, con vistas a desarrollar una metodología electroanalítica adecuada
para su cuantificación como materia prima y formas farmacéuticas.
De acuerdo a lo anterior, se plantean los siguientes objetivos específicos:
1. Caracterizar del comportamiento electroquímico de benserazida sobre el
electrodo de carbón vítreo, empleando las técnicas de voltamperometría de
pulso diferencial (VPD), voltamperometría cíclica (VC) y electrólisis a potencial
controlado (EPC).
2. Desarrollar una metodología electroanalítica reproducible y selectiva, que
permita la posterior determinación de benserazida en formas farmacéuticas
del mercado nacional y a su vez aplicarla al estudio de estabilidad de este
principio activo.
3
Materiales y métodos
2. MATERIALES Y MÉTODOS
2.1 Materiales
2.1.1 Fármacos estudiados
a) DCI : Benserazida clorhidrato (98.5%, Laboratorio Tecnofarma)
Fórmula global : C10H15N3O5. HCl
Nomenclatura : 2-amino-3-hidroxi-2’-(2,3,4-trihidroxibencil)
propionohidrazida
Peso molecular : 293.71 g/mol
Rango de fusión: 146-148ºC27
Forma farmacéutica: Comprimidos de 250 mg, Prolopa®. Laboratorio Roche.
b) DCI : Levodopa (99.3%, Laboratorio Chile)
Fórmula global : C9H11NO4
Nomenclatura : 3-(3,4-dihidroxifenil)-l-alanina
Peso molecular : 197.19 g/mol
Rango de fusión: 276-278°C
Forma farmacéutica: Comprimidos de 250 mg, Prolopa®. Laboratorio Roche.
2.1.2 Reactivos y disolventes
Acetonitrilo (99.0%) grado gradiente, Merck.
Ácido acético glacial (100.0 %) p.a. Merck.
Ácido bórico p.a., Merck.
Ácido clorhídrico (36.5%) p.a Equilab.
Ácido ortofosfórico (85.0%) p.a., Merck.
Agua calidad HPLC (Milli-Q).
Almidón, calidad técnica.
Celulosa microcristalina, calidad técnica.
Cloruro de potasio p.a. Merck.
4
Magdalena Pérez O.
Decanosulfonato de sodio, para síntesis. Merck
Diclorometano, p.a., Merck
Dióxido de titanio, calidad técnica.
Estearato de magnesio, calidad técnica.
Etanol absoluto (99.8%) p.a., Merck.
Fosfato de sodio dibásico anhidro, p.a., Merck.
Helio extrapuro AGA.
Hidróxido de sodio (NaOH) (pellets) p.a. Merck.
Hidroxipropilcelulosa, calidad técnica.
Hidroxipropilmetilcelulosa, calidad técnica.
Lactosa, calidad técnica.
Nitrógeno extrapuro AGA.
Ortofosfato dihidrogeno de potasio, p.a., Merck
Sorbitol, calidad técnica.
Talco, calidad técnica.
2.1.3 Disoluciones tampón
Tampón calibrador pH-metro, 4.00 Hanna Instruments.
Tampón calibrador pH-metro, 7.00 Hanna Instruments.
Tampón calibrador pH-metro, 10.00 Hanna Instruments.
Tampón Britton-Robinson 0.1 M.
2.1.4 Material de vidrio
Todo el material de vidrio utilizado fue clase A.
2.1.5 Instrumental de uso general y otros materiales
Pipetas automáticas, Eppendorf Research de volumen variable 10-1000 μL.
Jeringa de inyección Hamilton de 50 μL.
Filtros Millipore para jeringa de 0.45 μL.
5
Materiales y métodos
Viales ámbar de 2 mL, Hewlett Packard.
Sellos de viales, Hewlett Packard.
Engargoladora, Hewlett Packard.
Desengargoladora, Hewlett Packard.
2.1.6 Equipos
a) Sistema voltamperométrico
Analizador voltamperométrico BAS CV-50W y BAS CV-100W.
Celda electroquímica BAS (5 y 10 mL).
Electrodo de trabajo : electrodo de carbón vítreo (CHI 104).
Electrodo auxiliar : platino BAS MW-1032.
Electrodo de referencia : Ag/AgCl BAS RE-5B.
Computador Pentium, con programa de adquisición y tratamiento de datos
CV-50W, CV-100W.
b) Sistema cromatográfico
Bomba Waters® 600 Controller Millipore Model Code 6CE.
Detector con arreglo de fotodiodos Waters® 996.
Columna cromatográfica Phenomenex 100-5C-8 (4.60 mm×150 mm).
Precolumna C18 μBondapak (30 mm×4.6 mm).
Inyector Rheodyne de 20 μL.
Horno columna, Waters® 600.
Computador Pentium II con programa de adquisición y tratamiento de datos
MILLENIUM versión 3.05.
c) Sistema espectrofotométrico (UV-VIS)
i) Espectrofotómetro UV-VIS Unicam UV2.
Celdas de cuarzo de paso óptico 10 mm.
6
Magdalena Pérez O.
Computador Pentium III, con programa de adquisición y tratamiento de datos
VISION 2.2.
ii) Espectrofotometro UV-Vis CHEMSTATION diodo array
Sofware 845X UV-Visible System
Copyright Agilent Technologies 95-03 para tratamiento y adquisición de datos.
e) Equipos de uso general
Agitador magnético Hotplate Stirrer
Balanza analítica de precisión, Precisa 40SM-200A (sensibilidad 0.01 mg).
Baño de ultrasonido, Branson 2210.
Estufa WTC Bindert.
Medidor de pH, WTW pMX 537.
Medidor de pH WTW modelo pMx 3000.
Sistema purificador de agua, Milli-Q Ultra-Pure Water System.
2.2 Métodos
2.2.1 Caracterización electroquímica
2.2.1.1 Preparación de disoluciones
a) Disolución stock de los compuestos en estudio
En forma independiente se pesó, exactamente, alrededor de 14.68 mg de
benserazida clorhidrato y 9.86 mg de levodopa. El polvo fue disuelto en agua con
ayuda de ultrasonido al interior de un matraz aforado de 5 mL, finalmente se
enrasó con agua obteniéndose una disolución 1×10-2 M para cada fármaco.
7
Materiales y métodos
b) Tampón Britton-Robinson 0.1 M
Se disolvieron 6.20 g de ácido bórico en agua Milli-Q, con ayuda de ultrasonido,
en un matraz aforado de 1000 mL. Se agregó 6.8 mL de ácido ortofosfórico,
5.8 mL de ácido acético y se completó volumen con agua Milli-Q.
2.2.1.2 Voltamperometría de pulso diferencial
a) Condiciones experimentales
Los electrodos utilizados fueron:
Electrodo de trabajo : Electrodo de carbón vítreo BAS.
Electrodo Auxiliar : Electrodo de platino.
Electrodo de referencia : Electrodo de Ag/AgCl.
Las condiciones de operación fueron:
Potencial inicial : -200 mV
Potencial final : 1300 mV
Velocidad de barrido : 20 mV/s
Escala de sensibilidad : 10 – 100 µA/V
Las disoluciones de trabajo en la celda electroquímica no fueron protegidas de la
luz ni burbujeadas con nitrógeno previa medición. La temperatura de trabajo fue
la ambiental.
Después de cada medición se procedió a limpiar el electrodo de carbón vítreo,
puliéndolo primero en alúmina de 0.3 µm y posteriormente en alúmina de
0.05 µm.
8
Magdalena Pérez O.
b) Estudio de la influencia de pH
Se determinó el comportamiento electroquímico para cada fármaco en un rango
de pH entre 2.0-7.0 para levodopa y 2.0-10.0 para benserazida, a una disolución
de trabajo de concentración 1.0×10-4 M. Para ello se transfirieron alícuotas de 50
µL de las disoluciones stock de cada fármaco a matraces de 5 mL y se aforó con
tampón Britton-Robinson 0.1 M. El pH de estas disoluciones se ajustó empleando
una disolución concentrada de NaOH, incrementándose en una unidad a partir de
pH 2. Para cada pH se realizaron mediciones por triplicado, registrando cada
voltamperograma.
c) Estudio de concentración
Para cada fármaco de determinó el efecto de la concentración en el
comportamiento electroquímico, en un rango de concentración de trabajo entre
2.5×10-5 M y 2.5×10-3 M. Para ello se transfirió una cantidad de volumen
adecuado de disolución stock del fármaco correspondiente a un matraz aforado
de 5 mL, enrasando con tampón Britton-Robinson 0.1 M ajustado a pH 6. Las
mediciones correspondientes a cada concentración se realizaron por triplicado,
registrando cada voltamperograma.
2.2.1.3 Voltamperometría cíclica
a) Condiciones experimentales
Los electrodos utilizados fueron:
Electrodo de trabajo : Electrodo de carbón vítreo BAS.
Electrodo Auxiliar : Electrodo de platino.
Electrodo de referencia : Electrodo de Ag/AgCl.
9
Materiales y métodos
Las condiciones de operación fueron:
Potencial inicial: -200 mV
Potencial final: 1200 mV
Velocidad de barrido : 0.1 - 5 V/s
Escala de sensibilidad: 10 – 100 µA/V
Las disoluciones de trabajo en la celda electroquímica no fueron protegidas de la
luz ni burbujeadas con nitrógeno previa medición. La temperatura de trabajo fue
la ambiental.
Después de cada medición se procedió a limpiar el electrodo de carbón vítreo,
puliéndolo primero en alúmina de 0.3 µm y posteriormente en alúmina de
0.05 µm.
b) Estudio de la influencia de pH
Se determinó el comportamiento electroquímico de benserazida a disoluciones de
trabajo de concentración 1.0×10-3 M a tres valores de pH: 2.0, 6.0 y 8.0. Para
ello se transfirió una alícuota de 500 µL de la disolución stock del fármaco a un
matraz de 5 mL y se aforó con tampón Britton-Robinson 0.1 M. El pH de cada
disolución fue ajustado utilizando disoluciones concentradas de NaOH y HCl. Para
cada pH y velocidad de barrido se realizaron mediciones por triplicado,
registrando los voltamperogramas.
2.2.1.4 Electrólisis a potencial controlado
La electrólisis a potencial controlado se llevó a cabo a tres valores de pH
distintos: 2.0, 3.0 y 7.0, en tampón Britton-Robinson 0.1 M.
10
Magdalena Pérez O.
a) Disolución de trabajo
Para los ensayos realizados a pH 2.0 y 3.0, se transfirió una alícuota de 375 µL
de la disolución stock del fármaco a un matraz de 50 mL y se llevó a volumen
con tampón Britton-Robinson 0.1 M previamente ajustado al pH de trabajo,
obteniéndose una disolución de concentración final 7.5×10-5 M.
Para el estudio realizado a pH 7.0, se tomó una alícuota de 1000 µL de la
solución stock del fármaco y luego se procedió de manera análoga a lo descrito
anteriormente, obteniéndose, en este caso, una disolución de concentración final
2.0×10-4 M.
b) Condiciones experimentales
Los electrodos utilizados fueron:
Electrodo de trabajo : Malla de carbón vítreo reticulado.
Electrodo Auxiliar : Electrodo de platino
Electrodo de referencia : Electrodo de Ag/AgCl.
Las condiciones de operación fueron:
Intervalo de electrólisis : 1000 mseg
Proporción de corriente final : 10 / 1000
Escala de sensibilidad : automática
Dado que benserazida presenta más de una señal de oxidación, los potenciales
aplicados variaron según el potencial de oxidación de la señal principal de
benserazida con el pH, así para los pH 2 y 7 se aplicó el potencial necesario más
100 mV para oxidar sólo la seña principal, mientras que para pH 3 se aplicó
potencial necesario para lograr la oxidación de todas las señales y por tanto
calcular el número de electrones transferidos en el proceso completo.
11
Materiales y métodos
Las disoluciones de trabajo no fueron protegidas de la luz en la celda
electroquímica, pero sí burbujeadas con nitrógeno durante 10 minutos previa
electrólisis. La temperatura de trabajo fue la ambiental.
c) Procedimiento
La electrólisis a potencial controlado se realizó durante el tiempo necesario, para
observar una disminución notoria en la señal principal de benserazida al pH
ensayado, registrándose cada tres minutos las gráficas de carga versus tiempo.
Posteriormente, en cada caso, se realizó la electrólisis del disolvente bajo las
mismas condiciones experimentales en que se realizó la electrólisis de
benserazida, con el propósito de obtener la carga neta total correspondiente a la
electrólisis del fármaco. En forma paralela, se realizó el seguimiento de ésta por
voltamperometría de pulso diferencial.
d) Cálculo del número de electrones
Para el cálculo del número de electrones se estimó la sumatoria de las cargas
finales de electrólisis sucesivas, con corrección de la carga basal. A partir de la
carga total neta y empleando la ecuación de Faraday (ecuación 1), se calculó el
número de electrones transferidos por mol de benserazida.
Ecuación 1. Q neta = n F e Donde:
n = número de moles F = constante de Faraday (96500 C/ mol) e = número de electrones.
12
Magdalena Pérez O.
2.2.1.5 Espectro-electroquímica
A. Preparación de disoluciones
a) Disolución de trabajo
Se tomaron 500 µL de disolución stock de benserazida, los que fueron llevados a
un matraz aforado de 5 mL, enrasado con tampón Britton-Robinson 0.1 M
previamente ajustado a pH 6, obteniéndose una disolución de concentración final
1.0×10-3 M.
b) Disolución blanco
Se realizó con tampón Britton-Robinson 0.1 M ajustado a pH 6.
B. Procedimiento
a) Condiciones experimentales
Los electrodos utilizados fueron:
Electrodo de trabajo : Malla de carbón vítreo reticulado.
Electrodo Auxiliar : Electrodo de platino
Electrodo de referencia : Electrodo de Ag/AgCl.
La disolución de trabajo, contenida en una cubeta de cuarzo, fue burbujeada con
nitrógeno previamente y durante la electrólisis, la cual se efectuó durante 90
minutos aplicando un potencial de 200 mV a intervalos de 5 minutos, al cabo de
los cuales se deja de aplicar el potencial y el burbujeo de nitrógeno, para
registrar el espectro correspondiente.
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Materiales y métodos
2.2.2 Desarrollo de la metodología electroanalítica
A. Voltamperometría de pulso diferencial
a) Curva de calibración
A partir de una disolución stock de benserazida de concentración 1×10-2 M, se
prepararon 9 disoluciones de concentraciones entre 2.5×10-5 M hasta 2.5×10-4 M.
Para ello, alícuotas de la disolución stock de benserazida fueron transferidas a un
matraz aforado de 5 mL, completando volumen con tampón Britton-Robinson 0.1
M ajustado a pH 6. Las disoluciones así preparadas fueron medidas por
voltamperometría de pulso diferencial.
b) Estudio de repetibilidad
Se midieron 8 veces consecutivas, por la técnica de voltamperometría de pulso
diferencial, 5 mL de las disoluciones de trabajo de concentración 4.0×10-5 M,
1.0×10-4 M, 2.0×10-4 M de benserazida, tampón Britton-Robinson a pH 6.0. Como
parámetro estadístico se consideró el coeficiente de variación de la corriente de
pico de la señal obtenida.
c) Estudio de reproducibilidad
Se midieron 10 veces consecutivas, por la técnica de voltamperometría de pulso
diferencial, 5 mL de las disoluciones de trabajo de concentración 4.0×10-5 M,
1.0×10-4 M, 2.0×10-4 M de benserazida, tampón Britton-Robinson a pH 6.0,
variando el día de medición. Como parámetro estadístico se consideró el
coeficiente de variación de la corriente de pico de la señal obtenida.
d) Límite de detección y límite de cuantificación
Para la estimación del límite de detección y cuantificación se procedió como
sigue:
14
Magdalena Pérez O.
- A partir de la curva de calibración se obtuvo el valor de la pendiente de
la recta (m).
- Se midió por duplicado cuatro disoluciones en el rango inferior de la
curva de calibración (2.5×10-5 M, 3.0×10-5 M, 3.5×10-5 M, 4.0×10-5 M). Para
estas cuatro disoluciones se obtuvo los valores promedios de la corriente de pico
(XIp) y la desviación estándar (σ).
- Se representó gráficamente XIp versus la concentración de la muestra y
se determinó la ecuación de la nueva recta. Al extrapolar la respuesta a
concentración cero se obtuvo la respuesta del blanco (Ybl).
- Se representó gráficamente σ versus la concentración de muestra y al
extrapolar la respuesta a concentración cero, se obtuvo el valor de la respuesta
de la desviación estándar del blanco (σbl).
El límite de detección (LD) (Ecuación 2) y el límite de cuantificación (LC)
(Ecuación 3) se calcularon según las siguientes ecuaciones:
Donde:
m = Pendiente de curva de calibración
Ybl = Respuesta del blanco σbl = Desviación estándar del blanco
Ecuación 2.
cuación 3.
udios de selectividad
Para la validación de la metodología electroanalítica desarrollada, se realizaron
los siguientes ensayos de degradación acelerados:
i) Hidrólisis ácida
Se tomaron 500 µL de disolución stock de benserazida y se llevaron a un matraz
aforado de 5 mL, enrasando con HCl 1 N. La disolución preparada se transfirió a
reflujo por 1 hora. Posteriormente se tomó una alícuota de 1250 µL de la
mσ3Y
LD blbl +=
mσ10Y
LC blbl +=E
d) Est
un balón de destilación de 25 mL conectado a un tubo refrigerante y se calentó a
15
Materiales y métodos
disolución hidrolizada y se transfirió a un matraz aforado de 5 mL, enrasando con
tampón Britton-Robinson 0.1 M, obteniéndose una disolución de concentración
2.5×10-4 M. Finalmente se ajustó pH a 6 y se midió por voltamperometría de
pulso diferencial.
ii) Hidrólisis básica
e tomaron 500 µL de disolución stock de benserazida y se llevaron a volumen
i) Fotólisis
lrededor de 15 mL de la disolución stock de benserazida, previamente
) Termólisis
lrededor de 5 mL de disolución stock de benserazida fueron repartidos en cuatro
S
final de 5 mL con NaOH 1 N en un matraz aforado. Dado que la hidrólisis fue
instantánea no fue necesario calentar a reflujo. De la disolución hidrolizada se
tomó una alícuota de 1250 µL que se llevó a un matraz aforado de 5 mL,
enrasando con tampón Britton-Robinson 0.1 M, obteniéndose una disolución de
concentración 2.5×10-4 M. Finalmente se ajustó pH a 6 y se midió por
voltamperometría de pulso diferencial.
ii
A
burbujeada con nitrógeno durante 10 minutos, fueron repartidos en tres cubetas
de cuarzo con tapa, las que se expusieron a luz de día durante una semana. De
las disoluciones fotolizadas, se tomaron alícuotas de 125 µL al tercer, quinto y
octavo día, las que fueron transferidas a matraces aforados de 5 mL y llevadas a
volumen con tampón Britton-Robinson 0.1 M ajustado a pH 6, para obtener
disoluciones de concentración 2.5×10-4 M.
iv
A
viales color ámbar, correctamente sellados y expuestos a una temperatura de
60ºC durante 7 horas. Alícuotas de 125 µL de las disoluciones sometidas a
temperatura fueron tomadas a los tiempos de 1, 3, 5 y 7 horas y llevadas a
matraces aforados de 5 mL, los cuales fueron enrasados con
16
Magdalena Pérez O.
tampón Britton-Robinson 0.1 M ajustado a pH 6, para obtener disoluciones de
concentración 2.5×10-4 M.
Las disoluciones finales obtenidas en cada uno de los ensayos de degradación se
) Estudio de recuperación
e realizó a dos niveles de concentración: rango bajo (4.5×10-5 M) y alto
n
uego, para realizar el estudio de recuperación en el rango alto de la curva de
e prepararon disoluciones stock de concentración 5.0×10-3 M para benserazida
ara realizar el estudio de recuperación en el rango bajo de la curva de
calibración, se tomaron 90 µL de las disoluciones stock y se llevaron a un matraz
analizaron además por HPLC, utilizando el método descrito en la Farmacopea
Británica.
e
S
(2.0×10-4 M) de la curva de calibración. En cada caso, se prepararon diez
muestras sintéticas en forma independiente; cada una ellas conteniendo
benserazida, levodopa y excipientes de acuerdo a lo declaro en la formulación.
En una primera etapa se preparó una mezcla de excipientes en una proporció
similar a la de fabricación. Los excipientes ensayados fueron: fosfato monoácido
de calcio, manitol, almidón de maíz, polividona, etilcelulosa, estearato de
magnesio, celulosa microcristalina y óxido de hierro rojo.
L
calibración, las muestras fueron preparas como se indica a continuación:
S
y 2.9×10-2 M para levodopa. De éstas se transfirieron alícuotas de 400 µL a un
matraz aforado de 10 mL, obteniéndose concentraciones finales de 2.0×10-4 M y
1.2×10-3 M respectivamente, lo que corresponde a 0.6 mg de benserazida y 2.3
mg de levodopa. Posteriormente se agregó al mismo matraz alrededor de 3.45
mg de la mezcla de excipientes, exactamente pesados. La mezcla fue suspendida
en tampón Britton-Robinson 0.1 M ajustado a pH 6 y luego llevada a volumen
final de 10 mL.
P
17
Materiales y métodos
aforado de 10 mL, obteniéndose disoluciones de concentración 4.5×10-5 M para
benserazida y 2.7×10-4 M para levodopa, lo que corresponde a 0.13 mg y
0.53 mg de los respectivos fármacos. Luego, se agregó al mismo matraz
alrededor de 0.77 mg de la mezcla de excipientes, exactamente pesados.
La mezcla final fue suspendida en tampón Britton-Robinson 0.1 M, ajustado a
pH 6 y luego llevada a un volumen final de 10 mL.
Las disoluciones así preparadas fueron medidas por triplicado, utilizando la
cnica de voltamperometría de pulso diferencial.
a la valoración y determinación de
niformidad de contenido de comprimidos de liberación convencional Prolopa® de
olieron 20 comprimidos hasta obtener un polvo fino, del cual, una
ez homogenizado, se pesó una cantidad correspondiente a 100 mg de levodopa.
té
2.2.3 Aplicación a forma farmacéutica
La metodología desarrollada fue aplicada
u
Laboratorio Roche, conteniendo según lo declarado 200 mg de levodopa y 50 mg
de benserazida. Como método comparativo se utilizó el descrito por la
Farmacopea Británica 2003, basado en cromatografía líquida de alta eficiencia.
i) Valoración
Se pesaron y m
v
La fracción de polvo pesada fue disuelta en un matraz aforado de 100 mL con
ácido ortofosfórico 0.1 M y ayuda de ultrasonido. La suspensión obtenida fue
filtrada a través de filtro Millipore de 0.45 µm, transfiriéndose 1 mL de esta
solución a un matraz aforado de 10 mL, el que luego fue llevado a volumen con
fase móvil. La disolución resultante se analizó por HPLC y la metodología
desarrollada (VPD), para lo cual se transfirió una alícuota de 1030 µL a un matraz
aforado de 5 mL con tampón Britton-Robinson 0.1 M, ajustado previamente a
pH 6. Tanto las mediciones por voltamperometría de pulso diferencial como las
inyecciones por cromatografía líquida se realizaron por triplicado, registrando los
voltamperogramas y cromatogramas correspondientes.
18
Magdalena Pérez O.
ii) Uniformidad de contenido
Se realizó el análisis de 10 comprimidos en forma individual, los que fueron
pesados y disueltos en un matraz aforado de 100 mL con ácido ortofosfórico 0.1
N y ayuda de ultrasonido. La suspensión fue filtrada a través de un filtro Millipore
de 0.45 µm, de la cual se transfirió una alícuota de 500 µL a un matraz aforado
de 10 mL, enrasando a volumen con fase móvil. De esta disolución se inyectaron
20 µL en el cromatógrafo, y se transfirió una alícuota de 515 µL a un matraz
aforado de 10 mL, llevando a volumen con tampón Britton-Robinson 0.1 M, la
que fue analizada por voltamperometría de pulso diferencial. Las mediciones se
realizaron por triplicado, registrando los voltamperogramas y cromatogramas
correspondientes.
2.2.4 Cromatografía líquida de alta eficiencia
Los resultados de valoración y uniformidad de contenido determinados para cada
forma farmacéutica fueron comparados con los obtenidos mediante la
metodología descrita en Farmacopea, basada en HPLC. El análisis de los
comprimidos se realizó a un flujo de 1.2 mL/min y una temperatura de 30°C.
2.2.5. Estudio de estabilidad por voltamperometría de pulso diferencial
a) Condiciones de trabajo
Para cada pH al que se llevó a cabo el estudio, se preparó 5 mL de solución stock
de benserazida a una concentración 1.0×10-2 M en tampón Britton-Robinson 0.1
M, ajustado al pH correspondiente (2.0; 6.0; 7.0). Cada una de ellas se repartió
en 10 viales ámbar, los que fueron herméticamente sellados y posteriormente
dispuestos durante 5 horas a una temperatura de 40ºC.
19
Materiales y métodos
20
Donde:
as de 125 µL de las disoluciones sometidas a
mperatura fueron tomadas cada una hora y llevadas a matraces aforados de 5
a determinar el orden de reacción se escogió el método
rafico28, en el cual si la resultante de la gráfica de la concentración remanente
ersus el tiempo es una línea recta, se trata de una reacción de orden cero,
del logaritmo natural de la
oncentración remanente versus o bien el inverso de la concentración remanente
ida media (t1/2), es el tiempo necesario para que reaccione la mitad de la
itad la concentración inicial de la sustancia inicial.
Para una reacción de primer orden, la vida media viene dada por la ecuación 4:
Ecuación 4.
Para cada pH estudiado, alícuot
te
mL, los cuales fueron enrasados con tampón Britton-Robinson 0.1 M ajustado a
pH 6, para obtener disoluciones finales de concentración 2.5×10-4 M, las que
fueron medidas por la técnica de voltamperometría de pulso diferencial y
cromatografía líquida de alta eficiencia (HPLC), utilizando el método descrito en
la Farmacopea Británica, al cual se le modificó el flujo de la fase móvil a 0.8
mL/min.
c) Determinación del orden de reacción
Como método par
g
v
mientras que si la resultante de la gráfica
c
versus tiempo, corresponden a una línea recta, se trata de una reacción de orden
uno o dos, respectivamente.
d) Determinación de la vida media
V
sustancia inicial presente, es decir, el tiempo necesario para que se reduzca a la
m
k = pendiente de la recta para cinética de orden uno.
k
221
ln/
t =
Magdalena Pérez O.
2.2.6. Determinación de la constante de disociación
A. Preparación de disoluciones
a) Disolución de trabajo
Se tomaron 1250 µL de disolución stock de benserazida, los que fueron llevados
a un matraz aforado de 50 mL, aforando con tampón Britton-Robinson 0.1 M,
bteniéndose una disolución de concentración final 2.5×10-4 M.
) Disolución blanco
espectral en un rango de pH de 2 a 12, utilizando
omo disolvente tampón Britton-Robinson 0.1 M, a la cual se fue incrementando
luciones concentradas de NaOH o HCl,
egún sea necesario, hasta alcanzar el pH requerido.
do un barrido de longitud de
nda entre 200 y 500 nm.
os resultados derivados del estudio de la influencia del pH en el comportamiento
espectral de benserazida, permitieron la determinación de dos de los pKa
aparentes del fármaco, mediante la ecuación de
o
b
Se realizó con tampón Britton-Robinson 0.1 M
B. Procedimiento
A partir de una disolución 2.5×10-4 M de benserazida, se estudió la influencia del
pH sobre su comportamiento
c
el pH en 0.5 unidades, empleando so
s
Las soluciones preparadas a cada pH fueron medidas en el espectrofotómetro con
cubetas de cuarzo de 10 nm de paso óptico, efectuan
o
L
Henderson-Hasselbach
modificada29:
21
Materiales y métodos
Ecuación 5. )A(A
A)(AlogpKpH máx −
+= min
a −
onde: máx = máxima absorbancia en el intervalo de pH escogido
el intervalo de pH escogido ución en el intervalo de pH escogido
DAAmin = mínima absorbancia en A = absorbancia al pH de la disol
A partir de la representación gráfica de pH versus log [(Amáx - A)/(A - Amin)] se
obtiene una recta, cuyo intercepto corresponde al valor de pKa.
22
Magdalena Pérez O.
3. RESULTADOS Y
-200 0 200 400 600 800 10000
1
2
3
4
5
6
7
I / µ
A
E / mV
pH 2 pH 3 pH 4 pH 5 pH 6
A
-200 0 200 400 600 800 10000
1
2
3
4
5
6
7
pH 6 pH 7 pH 8 pH 9 pH 10
B
I / µ
A
E / mV
-200 0 200 400 600 800 10000
1
2
3
4
5
6
7
I / µ
A
E / mV
I
II III IV
DISCUSIÓN
.1 Caracterización electroquímica
azida
.1.1.1 Voltamperometría de pulso diferencial en medio acuoso
el electrodo de
arbón vítreo.
En el intervalo de pH estudiado se observa una señal de oxidación
principal, bien definida, a potenciales relativamente bajos (señal I en Figura 2) y
otras tres señales a potenciales más anódicos, menos resueltas y de baja
intensidad de corriente, respecto a la principal (señales II, III y IV en Figura 2).
Todas las señales son pH dependientes y se desplazan progresivamente hacia
potenciales menos positivos, conforme aumenta el pH del medio.
Figura 2. Voltamperogramas de pulso diferencial de una disolución de benserazida 1×10-4 M en tampón Britton-Robinson 0.1 M a pH 2-6 (A), pH 6-10 (B). Inserto: voltamperograma a pH 6, en que se destaca cada una de las señales.
3
3.1.1 Comportamiento electroquímico de benser
3
Benserazida, en tampón Britton-Robinson 0.1 M, exhibe una respuesta
anódica bien definida en el intervalo de pH de 2 a 10, sobre
c
23
Resultados y discusión
24
2 4 6 8 100
1
2
3
4
5
6
7
Señal III
Señal II
Señal I
Ip /
µA
pH
Figura 3. A. Dependencia del potencial de pico (E
B
ciales de pico (EP) con el pH del medio se
uestra en la Figura 3 A. A partir de ella es posible inferir que los protones del
de oxidación para las señales I, II, III y
dependencia
neal con el pH, con pendientes de -62.9 mV/pH para la señal I entre pH 2 y 10
8), -50.0
V/pH para la señal III entre pH 2 y 6 (r2=0.9924) y -45.0 mV/pH para la
endencia con los protones del medio se puede observar también
ara el comportamiento de la corriente de pico (IP) de la señal I, la cual se
muy baja, va
incrementando su valor, en forma concomitante con la disminución de la
corriente de la señal I. Por último, la señal IV, que se insinúa entre pH 4 y 6
presenta intensidades de corrientes aún menores (no incluida en Figura 3B).
B. Dependencia de orriente de pico (IP) con el pH. Disolución de benserazida 1×10-4 M en tampón Britton-
La evolución de los poten
m
medio están involucrados en el proceso
IV. En efecto, estas cuatro ondas voltamperométricas exhiben una
li
(r2=0.9994), -54.0 mV/pH para la señal II entre pH 5 y 10 (r2=0.994
m
señal IV, que aparece entre pH 4 y 6 (r2= 0.9609).
Esta dep
p
mantiene estable a pH ácidos, para decrecer a pH neutros y alcalinos
(Figura 3 B). Este comportamiento ha sido observado previamente con
compuestos polifenólicos estructuralmente relacionados, del tipo alquilgalatos30.
Por otra parte, la señal II presenta una intensidad de corriente muy baja,
alrededor de 5 a 6 veces menor que la señal I, en tanto que la señal III, que
aparece alrededor de pH 5 con una intensidad de corriente
-150
0
150
300
450
600
750
A
Ep
/ mV
Señal II
Señal III
Señal I
Señal IV
P) con el pH.
2 4 6 8 10
pH
cRobinson 0.1 M.
Magdalena Pérez O.
Con el objetivo de dilucidar si los cambios que sufren las señales
secundarias de benserazida (señales II y III) con el pH, tienen alguna relación
con el pKa de la molécula, se realizó el estudio de la influencia de pH, en tampón
Britton-Robinson, sobre los máximos de absorción que presenta benserazida por
espectroscopia UV-Visible. La Figura 4 presenta los espectros obtenidos para
benserazida en un rango de pH de 2.0 a 12.0. Los espectros presentan máximos
de absorción importantes a 230 nm y 273 nm. A medida que aumenta la
alcalinidad del medio, se genera un desplazamiento
250 300 350 400 450 5000.0
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
0.5
B
Abs
orba
ncia
λ / nm
pH 7.5 pH 8.0 pH 8.5 pH 9.0 pH 9.5 pH 10.0 pH 11.0 pH 11.5 pH 12.0
aproximadamente.
250 300 350 400 450 5000,0
0,5
1,0
1,5
hipercrómico de los máximos
e absorción mencionados y aparecen otros dos a 340 y 410 nm,
5×10-4 M en tampón Britton-Robinson
de la absorbancia con el pH a
a presenta dos saltos importantes,
gura 5). Los datos obtenidos en
dos de los pKa de benserazida, de
ach mo a (Ecuación 5). Los
valores de pKa para el fármaco fueron calculados por el método de regresión
lineal, donde el pH fue la variable dependiente y el log [(Amáx - A)/(A - Amin)] la
variable independiente, como se presenta en la Figura 6. De esta forma, los
2,0
d
pH 1.5 pH 2.0 pH 2.5 pH 3.0 pH 5.5 pH 6.0 pH 6.5 pH 7.0
Abs
orba
ncia
λ / nm
pH 3.5 pH 4.0 pH 4.5 pH 5.0
A
Figura 4. Espectros de absorción de benserazida 2.
0.1 M, a pH 1.5-7.0 (A) y pH 7.5-12.0 (B)
Al graficar la evolución
272 nm, se puede observar que benserazid
entre pH 4 y 6 y pH 9 y 12, respectivamente (Fi
este estudio fueron utilizados para calcular
acuerdo a la ecuación de Henderson-Hasselb dificad
valores de pKa obtenidos fueron de 5.44 y 10.91.
25
Resultados y discusión
26
-1,0 -0,5 0,0 0,5 1,0
4,5
5,0
5,5
6,0
6,5
C
LOG((Amax-A)/(A-Amin))
2 4 6 8 10 120,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9 272 nm
Abs
orba
ncia
2 4 6 8 10 12
1,6
1,8
2,0
2,2
2,4
2,6
2,8Ab
sorb
anci
a230 nm
pH
-0,5 0,0 0,5 1,0 1,5
8,5
9,0
9,5
10,0
10,5
11,0pH
LOG((Amax-A)/(A-Amin))
pH
5 – 12.0) a λ 230 y 272 nm.
Figura 6.
Hasselb
Figura 5. Dependencia de la absorbancia con el pH (1.
pH = 5.441 – 1.250 log((Amax-A)/(A-Amin)) r = 0.9961
pH = 10.908 – 1.993 log((Amax-A)/(A-Amin)) r = 0.9920
Determinación de pKa por UV-Vis mediante la ecuación de Henderson-
ach
Comparando los pKa calculados para benserazida con el comportamiento
electroquímico, se podría decir que, aparentemente existe una relación entre el
pKa calculado de 5.44 con la aparición de la señal II a pH 5 y la desaparición de
la señal III a pH 6.0, y en consecuencia, que las señales observadas se deban a
un cambio de la especie que se oxida, de ionizada a desionizada.
Magdalena Pérez O.
3.1.1.2 Voltamperometría cíclica
Con el fin de completar los estudios electroquímicos básicos de
benserazida, se empleó la técnica de voltamperometría cíclica, utilizando como
electrodo de trabajo el electrodo de carbón vítreo. El estudio se realizó en medio
acuoso a diferentes pH y velocidades de barrido.
Los voltamperogramas cíclicos de benserazida en medio acuoso exhiben
dos señales de oxidación a pH 2.0 y pH 6.0 (Figuras 7 A-D), las cuales presentan
máximos aproximadamente a 500 y 750 mV (pH 2), y a 250 y 750 mV (pH 7).
Por otra parte, a pH 8.0, la solución originalmente traslúcida se torna amarilla y
por VC se observan tres señales de oxidación poco definidas. En todos los casos,
el pH del medio, sin la aparición de nuevas señales en los barridos de vuelta a pH
6 y 8, indicando que el proceso de oxidación es de carácter irreversible a esos pH
(Figuras 7 C-F). situación se produce a pH 2, ya que en los
voltamperogramas cíclicos realizados, si bien no se define una señal clara en los
barridos de vuelta, a velocidades de barrido elevadas (Vb > 1 V/s) es posible
observar la aparición de nuevas señales a potenciales cercanos a 300 y 600 mV
(Figura 7 B).
A objeto de clarificar las dependencia de las señales en cada
voltamperograma, se realizaron experimentos cambiando el potencial final de los
barridos a una velocidad fija (0.1 V/s). De este estudio se pudo apreciar que la
segunda señal de oxidación aparece en un barrido corto, entre 600 y 1000 mV,
una etapa independiente en el proceso de oxidación del fármaco
(Figura 8). Por otra parte, la primera onda en el barrido de vuelta depende de la
primer
disminuye al aumentar la velocidad de barrido) dependa de ésta.
estas señales se desplazan hacia potenciales menos positivos conforme aumenta
Distinta
en consecuencia, esta señal podría depender de la primera, así como podría
tratarse de
a señal de oxidación con un ΔEP=71 mV (que se hace mayor conforme
aumenta la velocidad de barrido), mientras que no se puede asegurar que la
segunda onda con un ΔEP=306 mV respecto a la segunda señal de oxidación (que
27
Resultados y discusión
28
2
0 250 500 750 1000 1250 1500 1750-100
-50
0
50
100
150
200
50A
500
600
I / µ
A
E / mV0 250 500 750 1000 1250 1500 1750
-200
-100
0
100
200
300
400
B
I / µ
A
E / mV
0 250 500 750 1000 1250 1500 1750-50
0
50
100
150
200
250C
I / µ
A
E / mV0 250 500 750 1000 1250 1500 1750
-150
0
150
300
450
600
750D
I / µ
A
E / mV
-500 0 500 1000 1500
-200
0
200
400
600
800 F
I / µ
A
E / mV
olución de benserazida 1×10-3 M en tampón
-500 0 500 1000 1500-100
0
100
200
300 E
I / µ
A
E / mV
Figura 7. Voltamperogramas cíclicos. DisBritton-Robinson 0.1 M. A, C y E: Vb de 0.1 V/s a 0.9 V/s a pH 2.0, 6.0 y 8.0, respectivamente. B, D y F: Vb de 1.0 V/s a 5.0 V/s a pH 2.0, 6.0 y 8.0, respectivamente.
Magdalena Pérez O.
29
500
520
2.00 2.25 2.50 2.75 3.00 3.25 3.50 3.75
420
440
460
480
540
E /
mV
Log V
A
2,00 2,25 2,50 2,75 3,00 3,25 3,50 3,75780
800
820
840
860
880
900
E /
mV
230
240
250
Log V
2.00 2.25 2.50 2.75 3.00 3.25 3.50 3.75170
180
190
200
210
220
Ep
/ mV
B
2,00 2,25 2,50 2,75 3,00 3,25 3,50 3,75600
620
Log Vb
640
660
680
700
Ep /
mV
-200-10
0
30
Log Vb
0 200 400 600 800 1000 1200
10
20
40 A 40I /
µA 20
30
E / mV
Figura 8. VC de benserazida a diferentes barridos de potencial. pH 2 (A) y pH 6 (B).
Con el propósito de aclarar la reversibilidad del proceso redox involucrado,
se evaluó el comportamiento de los potenciales de oxidación, respecto a la
velocidad de barrido (Figura 9). En esta figura se puede observar que los
potenciales de oxidación son dependientes de la velocidad de barrido,
sustentando el carácter irreversible de la reacción31
-200 0 200 400 600 800 1000 1200-10
Figura 9. Dependencia de EP con log Vb a pH 2.0 (A) y a pH 6 (B). Disolución de benserazida 1×10-3 M en tampón Britton-Robinson 0.1 M. Insertos: Dependencia de EP con log Vb de la segunda señal.
0
10
B
µI /
A
E / mv
Resultados y discusión
30
2,00 2,25 2,50 2,75 3,00 3,25 3,50 3,750,75
1,00
1,25
1,50
1,75
2,00
2,25
2,50 Pico 1 Pico 2
Log
Ip
Log Vb
B
Se estudió también el comportamiento de la variación de la corriente
respecto al incremento de la velocidad de barrido (log IP versus log Vb), con el
propósito de obtener información acerca de la naturaleza del proceso redox
involucrado en la oxidación del compuesto. De esta manera, si la pendiente del
gráfico log IP - log Vb tiende a 1, el proceso estará controlado por la adsorción de
la especie electroactiva sobre el electrodo de trabajo, mientras que si la
pendiente es cercana a 0.5 el proceso estará controlado por difusión32. Al
respecto, benserazida a los distintos pH estudiados, presenta una dependencia
lineal entre log IP y log Vb, con pendientes cercanas a 0.5, valores que indican
que el proceso de oxidación tiene un control difusivo (Figura 10). Sin embargo,
como se puede observar en la Figura 11, la gráfica de corriente de pico (IP)
versus la raíz cuadrada de la velocidad de barrido (Vb1/2), presenta dos tramos de
linealidad a los pH estudiados, evidenciándose más a pH 6 (Figura 11 B),
sugiriendo que, a ciertas velocidades de barrido, el proceso de oxidación no es
controlado completamente por difusión, existiendo adsorción de la especie
oxidable o de alguno de sus productos de oxidación.
Figura 10. Dependencia de log IP con log Vb a pH 2.0 (A). Dependencia de EP con log Vb (B). Disolución de benserazida 1×10-3 M en tampón Britton-Robinson 0.1 M.
2.00 2.25 2.50 2.75 3.00 3.25 3.50 3.751.00
1.25
1.50
1.75
2.00
2.25
2.50
A Pico 1 Pico 2
Log
Ip
Log Vb
Magdalena Pérez O.
10 20 30 40 50 60 700
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
220 Pico 1 Pico 2
Ip /
µA
Vb1/2
A
10 20 30 40 50 60 700
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
220 Pico 1 Pico 2
Ip /
µA
Vb1/2
B
Figura 11. Dependencia de IP con Vb1/2 a pH 2.0 (A) y a pH 6 (B). Disolución de
Tabla 1.
benserazida 1×10-3 M en tampón Britton-Robinson 0.1 M.
Parámetros cinéticos obtenidos por VC para benserazida a pH 2.0 y 6.0
pH Señal δlog IP/δ log Vb
2 2 0.5855 1 0.4474
6 1 0.4484
3.1.1.3 Voltamperometría hidrodinámica
Con el propósito de corroborar el tipo de control involucrado en el proceso
perficie del electrodo de carbón vítreo, se
ineal con el electrodo de disco rotatorio,
ódico no es controlado por difusión, en todo el
tudiado, lo que se complementa con los
tamperométrico realizado anteriormente.
oxidativo de benserazida sobre la su
utilizó la técnica de voltamperometría l
obteniéndose que el proceso electr
intervalo de velocidades de rotación es
resultados derivados del estudio ciclovol
evich, esto es, se graficó la corriente límite versus la raíz de la velocidad de
rotación del electrodo, de esta forma, en la Figura 12, se observa que no existe
un comportamiento lineal en todo el intervalo estudiado, sugiriendo que a
Los resultados obtenidos se representan de acuerdo a la ecuación de
L
31
Resultados y discusión
32
0 2500
500 750 1000
10
20
30
40
I lim /
uA
E / mV
100 rpm 200 rpm 300 rpm 400 rpm
A
20
40
60
80
0 250 500 750 10000
BI lim
/ uA
E / mV
500 rpm 1000 rpm 1500 rpm 2000 rpm 2500 rpm 3000 rpm
20 25 30 35 40 45
9
10
11
12
13
14
15C
I lim/ µ
A
velocid
igura 12. A y B. Voltamperogramas hidrodinámicos de benserazida sobre el electrodo de carbón vítreo a pH 6. C. Dependencia de la corriente límite con la velocidad de rotación.
ω1/2
ades menores a 500 rpm y mayores a 2000 hay adsorción de la especie
electroactiva, probablemente, debido a la formación de películas sobre la
superficie de trabajo. Este comportamiento a velocidades elevadas podría
deberse a que, bajo estas condiciones el flujo ya deja de ser laminar, mientras
que a velocidades bajas de rotación, es probable que la velocidad de reacción sea
mucho mayor a la velocidad con que difunde la especie, hacia la superficie del
electrodo. Además, como la recta de la gráfica de Ilim frente ω1/2 no pasa por el
origen, se vuelve a corroborar que el proceso de oxidación es irreversible33.
F
Magdalena Pérez O.
3.1.1.4 Electrólisis a Potencial Controlado
La electrólisis a potencial controlado se realizó con el fin de identificar los
intermediarios y productos de oxidación generados a partir de la reacción de
oxidación de benserazida, así como también, si es que es posible, calcular el
número de electrones transferidos en el proceso de electro-oxidación. Para ello
se utilizaron soluciones de benserazida a pH 2.0, 3.0 y 7.0; las que fueron
sometidas a electrólisis a un potencial constante de 400, 650 y 130 mV,
respectivamente; durante 120, 60 y 90 minutos para cada caso. El potencial de
de benserazida a cada valor de pH (Figura 2); de esta manera, con los estudios
alizados a pH 2 y 7 se espera obtener información sobre la primera etapa del
un potencial que produce la ión de tod ódicas observadas,
información sobre el proceso global.
En las Figur T) versus
tiempo y la evolución de la corriente con el tiempo de electrólisis,
estos datos experimentales y empleando la ecuación
e Faraday, se calculó el número de electrones transferidos a cada pH estudiado.
fue de 1.42 ± 0.16,
± 0.65 y 0.73 ± 0.04, para pH 2.0, 3.0 y 7.0, respectivamente.
ustancialmente de lo esperado.
C
electrólisis fue escogido de acuerdo al potencial de oxidación de la señal principal
re
proceso electroquímico, mientras que con el ensayo realizado a pH 3, al aplicar
oxidac as las ondas an
as 13 A-F se presentan las gráficas de carga total (Q
respectivamente. A partir de
d
De esta forma, el número de electrones encontrado
7.87
Desde el punto de vista teórico, y tomando como base otra moléculas
análogas, tanto de derivados catecólicos36,37 como pirogálicos, se deberían
encontrar dos electrones para la oxidación de la benserazida. Al respecto, de los
valores encontrados experimentalmente, el de 1.3 obtenido a pH 2.0, es el que
más se acerca a lo esperado; en tanto que los otros, para pH 3.0 y 7.0, difieren
s
abe destacar que la literatura reporta, que la oxidación de compuestos
de tipo polifenólicos, a excepción de los catecólicos, involucra inusualmente un
33
Resultados y discusión
34
0 20 40 60 800,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
4,0
número mayor de electrones que el número de hidroxilos en la molécula, y que
los catecoles, con dos hidroxilos, presentan valores de dos electrones a pH
menores a 7, pero que aumentan drásticamente a pH mayores a 7. Este inusual
gran número de electrones en los compuestos fenólicos, estaría íntimamente
relacionado con la irreversibilidad de los voltamperogramas cíclicos, debido
reacciones químicas posteriores a las reacciones electroquímicas34. Lo anterior
podría dar cuenta del valor de 10 electrones encontrado experimentalmente.
4,5
D
I / µ
A
10 20 30 40 50 600,5
1,0
1 ,5
2 ,0
2 ,5
3 ,0
3 ,5
4 ,0
4 ,5
t / m in
C
QT
A p licando 650 m VBritton-R ob inson pH 3
t / m in
0 20 40 60 80 100 1201,5
2,0
2,5
3,0
3,5
4,0
B
Ip /
µA
t / m in0 20 40 60 80 100 120
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
QT
t / m in
AAplicando 400 m VBritton-R ob inson pH 2
0 20 40 60 80 100
0,1
0 ,2
0 ,3
0 ,4
0 ,5
0 ,6
0 ,7 E
QT
t / m in
B ritton R ob inson pH 7A p licando 130 m V
0 20 40 60 80 100
2,5
3 ,0
3 ,5
4 ,0
4 ,5
5 ,0
5 ,5
6 ,0 F
I / µ
A
t / m in
la intensidad de corriente de la señal principal de benserazida con el tiempo de electrólisis para los tres pH evaluados (B, D, F).
Figura 13. Izquierda: carga total versus tiempo para benserazida y tampón Britton-Robinson 0.1 M a pH 2, 3 y 7 (A, C, E). ■ Benserazida, ● Britton Robinson. Derecha: cambio en
Magdalena Pérez O.
Adicionalmente, la electrólisis de benserazida se llevó a cabo por la técnica de
spectro-electroquímica, encontrándose que a medida que transcurre el tiempo de
ectróli
3 (338 nm)
n la Figura 15 se muestran los cromatogramas obtenidos, observándose
que aún c
la aparición de nuevas señales.
e
el sis, las bandas principales del compuesto a 231 y 274 nm sufren un cambio
hipercrómico, perdiendo el espectro rápidamente su morfología inicial.
En la Figura 14 A, es posible observar, que ya a los 5 minutos de electrólisis se
genera una nueva banda bien definida, cercana a los 338 nm, y otra mucho menos
insinuada a los 390 nm, ambas sufren también un cambio hipercrómico con el transcurso
de la electrólisis, definiendo al final de ésta un espectro completamente diferente al que
presenta benserazida.
0,6
0,8
1,0
1,2
Figura 14. A. Evolución del espectro ultravioleta correspondiente a la electrólisis a potencial controlado de benserazida a pH 6, aplicando un potencial de 200 mV cada 5 minutos. B. Evolución de las bandas de absorbancia 1 (231 nm), 2 (274 nm),y 4 (390 nm).
0 20 40 60 80 1000,0
Con el objetivo de obtener algo más de información sobre el o los
productos de electrolisis generados, se procedió a inyectar en el cromatógrafo
líquido las soluciones de pH 2.0 y 3.0, sometidas a electrólisis a potencial
constante.
E
uando la disminución del pico cromatográfico de benserazida es
notoria, siendo ésta de un 60% en el primer caso, y casi total en el segundo, sin
0,2
0,4
B
338 nm
231 nm
anci
a
390 nm
274 nm
Abs
orb
t / min300 400 500 600
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2A
3
2
4
Abs
orba
ncia
0 min 5 min 15 min 25 min 35 min 90 min
1
λ / nm
35
Resultados y discusión
36
10
Por otra parte, el cambio que se presenta entre 1 y 2 minutos en el
segundo cromatograma, se podría explicar por la extracción previa a la que fue
sometida la muestra, con el fin de lograr identificar algún producto de
degradación generado en la electrólisis que pudiera encontrarse en trazas,
pudiéndose deber entonces a trazas del solvente empleado. Considerando lo
anterior, la desaparición de la señal de benserazida, en este caso, tal vez, no se
0 2 4 6 80,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
Abs
orba
ncia
t / min
Blanco (Britton-Robinson pH 2.0) Benserazida estándar Benserazida electrolizada
deba a su electrólisis total, sino a que no se logró su extracción de manera
adecuada.
0 1 2 3 4 50,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
Blanco (Britton-Robinson pH 3.0) Benserazida estándar Benserazida electrolizada
Abs
orba
ncia
t / min
Figura 15 A. Cromatograma de la solución electrolizada a pH 2. B. Cromatograma del extracto clorofórmico de la solución electrolizada a pH 3.
Magdalena Pérez O.
En base a los resultados obtenidos y a los antecedentes bibliográficos previos,
benserazida experimentaría una oxidación vía dos electrones y dos protones, de
acuerdo a:
Para lo cual se puede postular el siguiente mecanismo:
No obstante, los resultados obtenidos a pH 7 dan cuenta que el proceso
global de oxidación de benserazida, involucra un número de electrones mayor a
lo propuesto, por lo que es probable la formación de dímeros en las reacciones
posteriores a la reacción electroquímica propuesta.
OH
OH
OH
NHNH OH
O
NH22H+ + 2e-
OH
O
O
NHNH OH
O
NH2
OH
O
NHNH OH
O
NH2
OH
OH
OH
OH
NHNH OH
O
NH2
C
OH
O
NHNH OH
O
NH2
OH C
OH
O
NHNH OH
O
NH2
OH
CH
OH
O
OHNH
NH OH
O
NH2
OH
O
NHNH OH
O
NH2
OH
C
OH
O
NHNH OH
O
NH2
OH
OH
O
O
NHNH OH
O
NH2
- H+, e-
- H+, e-
37
Resultados y discusión
-200 0 200 400 600 800 10000
1
5
6
2
3
4
7
8
I / µ
A
E / mV
pH 6 pH 7 pH 8 pH 9 pH 10
-200 0 200 400 600 800 10000
4
5
6
B7
8
1
2
3
pH 2 pH 3 pH 4 pH 5 pH 6
I / µ
A3.1.2
ado que las formulaciones farmacéuticas de benserazida se encuentran
asociad
e sentido, levodopa en tampón Britton-Robinson 0.1 M
presenta un comportamiento similar a benserazida, sobre el electrodo de carbón
vítreo, mostrando una respuesta anódica bien definida en un rango de pH de 2.0
a 10 y una o dos ondas mal resueltas, a potenciales más anódicos, las cuales se
insinúan a partir de pH 6 en adelante (Figura 17).
10 (B).
Figura 16. Estructura química de levodopa
Comportamiento electroquímico de levodopa
3.1.2.1 Voltamperometría de pulso diferencial en medio acuoso
D
as a levodopa, y a que presenta una estructura química similar
(Figura 16), se procedió a realizar el estudio de la respuesta electroquímica de
esta última, en condiciones experimentales análogas a las estudiadas con
benserazida. En est
OH
OHNH2
OH
O
A
E / mV
Figura 17. Voltamperograma de pulso diferencial de levodopa en tampón Britton-
Robinson 0.1 M a pH 2-6 (A), pH 6-
38
Magdalena Pérez O.
La evolución del potencial de pico (EP) de la señal principal con el pH del
medio se presenta en la Figura 18 A. En ella es posible observar un
comportamiento análogo a la benserazida, con una dependencia lineal entre
potenciales y pH, con una pendiente de 52.5 mV/pH (r2=0.9986), evidenciando
que el proceso de oxidación depende de la concentración de protones del
medio35. Esta dependencia con los protones del medio se puede observar
también para el comportamiento de la corriente de pico (IP), la cual se mantiene
estable a pH
2 4 6 8 100
1
2
3
4
5
6
7
8
I P /
µA
pH
B
2 4 6 8 100
100
200
300
400
500
EP
/ mV
pH
A
ácidos, para decrecer a pH neutros y alcalinos (Figura 18 B).
Lo anterior corrobora lo que ya está descrito en la literatura, pues se sabe
que el mecanismo de oxidación de levodopa involucra dos electrones,
acompañado por el mismo número de protones35- 37.
Figura 18. A. Dependencia del potencial de pico (EP) con el pH en tampón Britton-Robinson 0.1M. B. Dependencia de corriente de pico (IP) con el pH en tampón Britton-Robinson 0.1 M. 3.1.2.2 Voltamperometría cíclica
El comportamiento electroquímico de levodopa también fue estudiado por
voltamperometría cíclica en medio acuoso. Tanto los voltamperogramas cíclicos
ráfica EP versus log Vb muestran un perfil de oxidación seudo
V,
como la g
reversible, con potenciales de pico anódico y catódico a 240 y 280 m
39
Resultados y discusión
40
2,4
2,6
2,8
3,0
3,2
3,4
3,6
2,0 2,5 3,0 3,5 4,0
log
I P
A
y = a + b*x
a = 1.67792b = 0.4419R2= 0.99949
0 20 40 60 80 100
500
1000
1500
2000
2500
3000
Log Vb
0
y = a + b*x
a = 116.715b = 27.2008R2= 0.99905
I P / µA
b
B
V 1/2
2.0 2.5 3.0 3.5 4.0300
325
350
375
400
425
450
EP /
mV
Log Vb
B
0 250 500 750 1000 1250 1500
-200
0
200
400
600
0.1 V/sI / µ
A
E / mV
10 V/sA
menta de manera lineal con el logaritmo de la velocidad de barrido
entre 0.1 y 10 v/s, con una pendiente de 0.4419 (r= 0.99949), lo que sugiere
que el mecanismo oxidativo para este compuesto opera principalmente por
difusión (Figura 20).
Figura 19. Voltamperogramas cíclicos. Disolución de levodopa 1×10-3 M, en tampón Britton-Robinson 0.1 M, pH 2 (A). Dependencia de EP con log Vb (B).
encia de IP con Vb (B).
respectivamente (Figura 19). Por otra parte, en la evaluación de la influencia de
la velocidad de barrido en el proceso de oxidación, el logaritmo de las corrientes
de pico incre
Figura 20. Dependencia de log IP con log Vb (A). Depend 1/2
Magdalena Pérez O.
41
3.2. D rollo de la metodología electroanalítica
.2.1 Selección de condiciones óptimas
A objeto de encontrar las condiciones analíticas óptimas para la
Figura 21. Voltamperogramas superpuestos de benserazida y levodopa en tampón Britton-Robinson 0.1 M, pH 6 (A) y ácido clorhídrico 0.1 M (B).
Cuando se ensayó tampón Britton-Robinson a pH 5, 6 y 7, se obtuvo que
aún cuando ambas señales no se resolvían del todo, era posible identificar los
máximos de cada una, mientras que a menores valores de pH no se logró la
resolución completa ni parcial de ambas señales (Figura 22 B).
4
6
8
esar
3
determinación de benserazida en presencia de levodopa, se llevó a cabo un
estudio detallado del comportamiento de potenciales y corrientes de pico versus
pH, y distintos medios de disolución (tampón Britton-Robinson, HCl y HClO4)
para las mezclas entre ambos fármacos, ya que, dado a la similitud estructural
entre ellos, las señales de oxidación respectivas se producen en regiones de
potencial bastante cercanas complicando su determinación cuando se encuentran
en mezcla (Figura 21)
107
0 200 400 600 800 1000 12000
2
B
E / mV
I / µ
A
Levovopa Benserazida
-200 0 200 400 600 800 1000 12000
1
2
3
4
5
6
Levodopa Benserazida A
Ip /
µA
E / mV
Resultados y discusión
Adicionalmente, a pH iguales o mayores a 7, pese a que se logra una
mejor separación de dichas señales,
15
20
25
-200 0 200 400 600 800 1000 12000
5
10I /
E / mV
µA
5.0x10-4 M 1.0x10-4 M 5.0x10-5 M
A
15
20
25
-200 0 200 400 600 800 1000 12000
5
10I /
E / mV
µA
5.0x10-4 M 1.0x10-4 M 5.0x10-5 M
B
al (I) de benserazida es mucho menor respecto a la señal secundaria, que
a estos pH resulta ser de mayor intensidad (Figura 22 B), pero que, en este caso,
se ve solapada por la presencia de levodopa.
la intensidad de corriente de la señal
princip
Figura 22. Voltamperogramas de mezclas benserazida-levodopa (1:1) en tampón Britton-Robinson 0.1, M a pH 6 (A) y pH 7 (B).
Considerando lo anteriormente dicho, se seleccionó tampón Britton-
Robinson 0.1 M a pH 6 para la determinación analítica (Figura 23 A). Bajo estas
condiciones, benserazida exhibió un pico de oxidación y una onda anódica poco
definida y de baja intensidad a aproximadamente 100 y 300 mV
respectivamente, empleándose la primera señal para su cuantificación.
n tampón Britton-Robinson 0.1 M.
En la Figura 23 se ilustra el efecto de la mezcla de ambos compuestos, en
distintas proporciones, sobre los voltamperogramas en ácido perclórico 0.1 M y
e
42
Magdalena Pérez O.
0 250 500 750 1000 1250
0
2
4
6
8
10
12
14
16
B
I / µ
A
2
4
6
8
12
E / mV0 250 500 750 1000 1250
0
10A
I / µ
A
E / mV
Figura 23. Benserazida 5×10-5 M en presencia de distintas concentraciones de levodopa .0x10-5 M – 2 x 10-4 M), en tampón Britton-Robinson 0.1 M, pH 6 (A) y HClO4 0.1 M (B).
.2.2 Curva de calibración
Primeramente se realizó un estudio de concentración en un rango amplio
de manera de seleccionar el intervalo
inámico más adecuado (Figura 24). A partir de este estudio se observó una
2.5×10-4 M, por lo que fue en este intervalo en el que se construyó la curva de
alibración (Figura 25), la que quedó definida por la siguiente ecuación:
IP [µA] = 0.2907 [µA] + 52657 [µA/M] · C [M] (r = 0.9995;n = 9)
En la Tabla 2 se resumen los parámetros de eficiencia analítica para el
étodo por voltamperometría de pulso diferencial desarrollado. En esta tabla es
ara los ensayos de repetibilidad y reproducibilidad a los tres niveles de
oncentración ensayados, y porcentajes de recuperación superiores al 98%.
(5
3
de trabajo, desde 2.5×10-5 M a 2.5×10-3 M,
d
respuesta lineal de la corriente de pico (IP) con la concentración entre 2.5×10-5 M
y
c
m
posible apreciar que se obtuvieron coeficientes de variación aceptables (<2%),
p
c
43
Resultados y discusión
50
0,00 0,05 0,10 0,15 0,20 0,250
2
4
6
8
10
12
14
y = a + b*x
a = 0.29078b = 52657.9R2= 0.99955
I / µ
A
Concentración / mM-200 0 200 400 600 800 1000 12000
2
4
6
8
10
12
14
16
18
I / µ
A
E / mV
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.50
10
20
30
40
Ip /
µA
Concentración / mM-200 0 200 400 600 800 1000 12000
5
10
15
20
25
30
40
45
35
Ip /
µA
Figura 25. Curva de calibración por VPD para benserazida (2.5×10-5 M - 2.5×10-4 M) en
Tabla 2. Parámetros de eficiencia analítica de la metodología por VPD
E / mV
Figura 24. Estudio de concentración de benserazida (2.5×10-5 M - 2.5×10-3 M) en tampón Britton-Robinson 0.1 M a pH 6.
tampón Britton-Robinson 0.1 M a pH 6.
Repetibilidad (CV %) 1.09 (4.0×10-5 M)- 1.54 (1.0×10-4 M) - 1.64 (2.0×10-4 M)
Reproducibilidad (CV %) 1.41 (4.0×10-5 M) - 1.08 (1.0×10-4 M) - 1.86 (2.0×10-4
Límite detección (M) 7.12×10
M)
Límite cuantificación (M) 9.49×10-6
% Recuperación 98.5 (4.5×10-5 M) - 99.7 (2.0×10-4 M)
-6
44
Magdalena Pérez O.
45
500 750 1000 1250
4
16
0 2500
2
6
8
10
12
14
I / µ
A
E / mV
Benserazida pH 6 Hidrólisis ácida Hidrólisis básica
3.2.3
ble que se deba
sólo a la presencia del analito, libre de interferentes, tales como productos de
degradación. Además se incluye la evaluación del comportamiento de la señal
electroquímica de benserazida, frente a la presencia de algunos de los
excipientes presentes en las formulaciones farmacéuticas disponibles en el
mercado nacional que contienen este principio activo.
Como resultado del ensayo de hidrólisis ácida se observa un corrimiento
en el potencial de la señal principal de benserazida así como también un aumento
en la anchura y una leve disminución en la intensidad de corriente de ésta.
Además se puede notar la desaparición de las señales poco definidas que
).
igura 26. Voltamperogramas de benserazida en tampón Britton-Robinson 0.1 M pH 6,
espués de ser sometida a hidrólisis ácida y básica.
Estudios de Selectividad
El estudio de selectividad, en este caso incluye ensayos de degradación
hidrolítica, fotolítica y de termólisis, con la finalidad de comprobar si la
metodología desarrollada es capaz de producir una señal medi
aparecen entre 250 y 600 mV, y la aparición de una nueva señal a
aproximadamente 800 mV (Figura 26
F
d
Resultados y discusión
46
0 250 500 750 1000 1250
10
14
16
0
2
4
6
8
12
t = 0 días t = 7 horas
tos de degradación generados (Figura 28). Con estos resultados podemos
inferir que los productos de degradación de benserazida, bajo estas condiciones,
serían electroactivos y que sufrirían oxidación electroquímica en regiones de
potencial cercanas a su precursor, interfiriendo en la determinación de éste por
VPD.
I / µ
A
E / mV
Cuando benserazida es sometida a hidrólisis alcalina, la señal principal
cambia completamente su forma, presentándose más ancha y de menor
intensidad a potenciales menos positivos que a los que aparece el estándar, y
aunque al igual que en el caso anterior desaparecen las señales poco definidas
que se producen entre los 250 y 600 mV, no observándose la aparición de
nuevas señales de oxidación (Figura 26).
En la Figura 27 se observa que bajo condiciones de temperatura extrema,
a excepción del leve cambio que presenta el voltamperograma de benserazida
entre 250 y 900 mV, no existen diferencias respecto al desplazamiento e
yectar parte de la misma solución al cromatógrafo, se puede observar que a
s 7 horas de reacción, el área del pico cromatográfico de benserazida
os) ha decrecido un 77% respecto a la inicial, así
omo también se aprecian otras seis señales correspondientes a los posibles
produc
Figura 27. Voltamperogramas de benserazi tton-Robinson 0.1 M pH 6, espués de ser sometida a una temperatura de 60° durante 7 horas (benserazida .5×10-4 M en agua).
intensidad de la señal principal de una disolución estándar. Sin embargo, al
in
la
(aproximadamente a 3 minut
c
da en tampón Brid2
Magdalena Pérez O.
47
0.00
0.02
0.04
0.06
0.08
0.10
0.12
0.14
0.16
0.18
0 2 4 6 8 10 12 14
32
A, 2
20 n
m
t / min
0 horas 7 horas
1
200 250 300 350 4000.000
0.005
0.010
0.015
0.020
1
Abso
rban
cia
λ / nm
200 250 300 350 4000.00
0.05
0.10
0.15
0.20
2
Abs
orba
ncia
λ / nm200 250 300 350 400
0.00
0.02
0.04
0.06
0.08
0.10
3
Abso
rban
cia
λ / min
nte 7
ida
los
que
igura 29 B, el espectro de benserazida en
mpón Britton-Robinson 0.1 M pH 6, presenta máximos de absorción a 230 y
273 nm. ores de
bsorbancia a las longitudes de ondas mencionadas, insinuándose un tercer
medida que el tiemp
u
Figura 28. Cromatograma de benserazida en agua, sometida a 60ºC durahoras. Inserto: espectros UV de cada señal.
De manera similar a lo que ocurre con la degradación de benserazida bajo
condiciones de temperatura extrema, cuando la solución del fármaco es somet
a fotólisis, no se producen nuevas señales de oxidación ni se observan
variaciones en cuanto a morfología e intensidad en la señal principal en
voltamperogramas, aún cuando la solución se torna de color amarillo, por lo
se procedió a medir la muestra por espectrofotometría y HPLC, para corroborar
su potencial fotodegradación y los productos derivados de ésta.
Como se puede apreciar en la F
ta
Las soluciones fotolizadas muestran un aumento en los val
a
máximo a 325 nm a o de fotólisis aumenta, lo que es
concordante con el color q e presenta la solución.
Resultados y discusión Resultados y discusión
0 250 500 750 1000 1250
2
4
6
0
8
10
16
1212
1414
E / mV
t = 0 días t = 8 días 2.0
I / µ
AA
0.0
1.5
250 300 350 400 450 500
0.5
1.0
B
Abs
orba
n
t / min
cia
48
0
8
10
16
0 250 500 750 1000 1250
2
4
6
E / mV
t = 0 días t = 8 días 2.0
I / µ
AA
0.0
1.5
250 300 350 400 450 500
0.5
1.0
0 hB 48 h
96 h 192 h
cia
Abs
orba
n
t / min
250 300 350 400
0.00
0.01
0.02
0.03
ab
sorb
anci
a
λ
1
250 300 350 400
0,0000
0,0025
0,0050
0,0075
0,0100
2
abso
rban
cia
λ
250 300 350 400
0,00
0,01
0,02
0,03
3
abso
rban
cia
λ
250 300 35
0,000
0,025
0,050
0,075
0 400
4
abso
rban
cia
λ
or otra parte, el cromatograma de la solución expuesta a fotólisis durante
una se
zida fotolizada durante una semana. Inserto: espectros UV de cada señal.
0,00
0,02
0,04
0,06
0,08
0,10
0,12
0,14
0,16
0,18
Figura 29. Degradación fotolítica de benserazida por VPD (A) y espectrofotometría (B)
P
mana, exhibe una señal de benserazida con un área disminuida en un 66%
y otras tres señales nuevas (1, 2 y 4), correspondientes a los productos de
degradación fotolítica de benserazida (Figura 30). En este caso, al igual que en el
anterior podemos concluir que los productos de degradación generados son
electroactivos y sufren oxidación en la misma región de potencial que
benserazida.
Figura 30. Cromatograma de la solución de bensera
0 2 4 6 8 10 12 14
42
3
Abso
rban
cia
o horas 1 semana
1
t / min
48
Magdalena Pérez O.
Por último, del estudio de recuperación realizado a dos niveles de
concentración (2.0×10-4 M y 4.5×10-5 M ), en muestras simuladas que contenían
0.6 y 0.13 mg del fármaco puro más levodopa y excipientes en proporción similar
a la de fabricación, se obtuvo que la metodología analítica desarrollada por VPD
permite la determinación de benserazida en presencia de levodopa y excipientes,
sin interferencia y de manera satisfactoria (Figura 31), con porcentajes de
recuperación mayores al 98% en ambos casos. Los resultados del estudio de
recuperación se presentan de manera detallada en la Tabla 3.
Tabla 3. Estudio de recuperación de benserazida en muestras sintéticas
Muestra Benserazida (2.0×10-4 M)
% Recuperación Benserazida (4.5×10-5M)
% Recuperación
1 104.4 101.5
2 98.7 99.3
3 98.0 97.6
4 97.8 97.1
5 101.0 101.1
6 99.0 99.0
7 94.4 99.3
8 95.2 99.7
9 98.4 101.8
10 97.7 100.0
Promedio 98.5 99.6
d.e. 2.8 1.5
CV, % 2.8 1.6
49
Resultados y discusión
-200 0 200 400 600 800 1000 12000
5
35
10
15
20
25
30
I / µ
A
E / mV
Forma Farmacéutica simulada Estandar Benserazida
6
8
12
-200 0 200 400 600 800 1000 12000
2
4
10
Forma Farmacéutica simulada Estándar Benserazida
I / µ
A
E / mV
Figura 31. Voltamperogramas correspondiente al estudio de recuperación realizado a nivel alto (benserazida 2.0×10-4 M) y bajo (benserazida 4.5×10-5M) de la curva de calibración. 3.3 Aplicaciones de la metodología analítica
3.3.1 Cuantificación de benserazida en forma farmacéutica
Para la aplicación de la metodología electroanalítica desarrollada, se
procedió a realizar la valoración y posterior determinación de la uniformidad de
contenido de una forma farmacéutica presente en el mercado nacional que
ontiene benserazida. La formulación correspondió a comprimidos de libración
onvencional de la marca Prolopa® (Laboratorio Roche).
Tanto la valoración como la determinación de la uniformidad de contenido
e llevo a cabo empleando la metodología propuesta por voltamperometría de
uso diferencial bajo condiciones óptimas. Como método comparativo se utilizó el
escrito en la Farmacopea Británica 2003.
Los resultados obtenidos para la valoración y uniformidad de contenido
or ambas técnicas se muestran de manera detallada en las Tablas 4 y 5.
c
c
s
p
d
p
50
Magdalena Pérez O.
Tabla 4. Valoración de benserazida en comprimidos de benserazida y levodopa1
Benserazida (mg) D.E. (mg) CV (%)
VPD 50.8 0.8 0.79
HPLC 49.0 0.3 0.35 1Prolopa® Comprimidos (200 mg levodopa, 50 mg benserazida)
Tabla 5. Uniformidad de contenido de benserazida por la metodología propuesta y HPLC
VPD HPLC
Comprimido % encontrado % encontrado
1 98.0 94.5
2 103.4 95.4
3 95.2 91.9
92.8
5 103.9 101.0
6 102.0 104.1
4 99.7
7 109.2 99.9
8 97.6 94.1
9 105.7 97.2
10 108.2 93.8
Promedio 102.3 96.5
D.E. 4.7 4.0
CV (%) 4.6 4.1
51
Resultados y discusión
52
3.3.2 Estudio de estabilidad hidrolítica de benserazida
La aplicación del método voltamperométrico desarrollado al estudio de
estabilidad de benserazida, se realizó a una concentración de 2.5×10-4 M, a
cuatro valores de pH (2, 6, 7 y 9) en tampón Britton-Robinson 0.1 M y a una
temperatura de 40ºC, con el fin de conocer la influencia del pH del medio en la
velocidad de degradación de este fármaco.
En la figura 32 se presentan los voltamperogramas de benserazida a pH 7,
n,
in la aparición de nuevas señales anódicas.
Figura 32. Voltamperogramas correspondiente al estudio de degradación de benserazida a pH 7.
De los resultados de los ensayos de degradación se puede observar que la
degradación de benserazida se ve influenciada por el pH del medio,
incrementando su inestabilidad a medida que el pH aumenta; incluso a pH
superiores a 9, la degradación del fármaco es prácticamente instantánea,
quedando un remanente inferior al 20% de la concentración inicial a las dos
horas.
observándose que la señal de oxidación decae en transcurso de la degradació
s
-200 0 200 400 600 800 1000 12000
2
4
6
8
10
12
I / µ
A
E / mV
0 min 60 min 120 min 180 min 240 min 300 min
Magdalena Pérez O.
53
-8,0
0 50 100 150 200 250 300 350
-10,0
-9,5
-9,0
-8,5
pH 2 pH 6 pH 7 pH 9
log
C
t / min
Figura 33. Efecto del pH sobre la degradación de benserazida a 40º C por VPD
Con fines comparativos se llevó a cabo el ensayo de degradación por
HPLC. En la Figura 34 se presentan los cromatogramas de benserazida a pH 7,
observándose que la señal que aparece a los 8 minutos decae con el transcurso
de la degradación, sin la aparición de nuevos picos cromatográficos, por lo que es
probable que los productos de degradación generados sean m
Por otra parte, los valores de concentración remanente obtenidos se
ajustan a una cinética de seudo orden uno, con constantes de degradación de
2.6×10-4, 2.2×10-3, 3.8×10-3 y 1.3×10-2 min-1 para pH 2, 6, 7 y 9
respectivamente (Figura 33).
ucho más polares
ue su precursor y aparezcan a tiempos cercanos a cero, bajo la señal de blanco.
q
Resultados y discusión
0 50 100 150 200 250 300-11,5
-10,5
-9,5
-9,0
-8,0
-11,0
-10,0
-8,5
pH 2 pH 6 pH 7 pH 9
C
10 1200
0.02
0.04
0.08
0.10
0.12
0.14
0.16
0.18
ln
t / min
0 2 4 6 80.
0.06A, 2
m
t / min
20 n
0 horas 1 hora 2 horas 5 horas Blanco
Figura 34. Cromatogramas correspondiente al estudio de degradación de benserazida a pH 7.
Respecto al orden cinético de degradación, este fue concordante con lo
obtenido por VPD, es decir seudo orden uno, sin embargo las constantes de
degradación obtenidas por HPLC fueron superiores a las obtenidas por VPD, en
los 4 pH ensayados (Figura 35). Para una mejor visualización, en la Tabla 6 se
presentan los resultados obtenidos por ambas técnicas.
Figura 35. Efecto del pH sobre la degradación de benserazida a 40º C por HPLC
54
Magdalena Pérez O.
Tabla 6. Valores de constantes de degradación a distintos pH por VPD y HPLC.
Constante de degradación (k, min-1) pH
VPD HPLC
2 2.6×10 2.9×10 -4 -3
6 2.2×10 5.5×10
7 3.8×10 7.6×10
9 1.3×10 1.2×10-2
-3 -3
-3 -3
-2
Adicionalmente, a partir de los resultados del estudio de la influencia de
pH sobre la velocidad de degradación de benserazida por VPD y HPLC, se pudo
calcular la vida media del fármaco a partir de la ecuación 4 (ver metodología)
(Tabla 7).
Tabla 7. Valores de vidas medias a distintos pH por VPD y HPLC
Vida media (t1/2,h) horas pH
VPD HPLC
2 44.4 4.0
6 5.2 2.1
7 3.0 1.5
9 0.9 1
Como se puede observar en las Tablas 6 y 7, tanto los valores de las
constantes de degradación como los valores obtenidos para la vida media del
fármaco por VPD, difieren notablemente de lo encontrado por HPLC, siendo
mucho mayor esta diferencia a pH ácido (2.0) y haciéndose cada vez menores a
medida que aumenta la alcalinidad, encontrándose que a pH 9.0, los valores
obtenidos por ambas técnicas son prácticamente los mismos, esto debido a la
degradación instantánea que sufre benserazida bajo estas condiciones.
55
Magdalena Pérez O.
CON
r la técnica de voltamperometría de pulso d cial (VPD), ben a en
pón Britton-Robinso , pH 6, presen n respuesta anó on un
y de menor intensidad,
en un amplio intervalo de pH (2.0 - 10.0) sobre el electrodo de carbón vítreo.
• Las cuatro señales fueron dependientes de pH, existiendo una relación entre
la aparición-desaparición de la segunda y tercera señal con uno de los valores
de pKa .
• Benserazida senta dos máxim bsorción en el rango ultravioleta (230
y 272 nm), s que sufren c s apreciables con el pH del medio,
permitiendo ular dos de los p fármaco (pKa1 = Ka2 = 10.90).
• Los resultados de voltamperometría cíclica (VC) reve ue, en medio
acuoso, el proceso de oxidación de benserazida es le y está
gobernado principalmente por la ón de la especie electroactiva a la
superficie del electrodo a las velocidades de tudiadas
(0.1 - 5.0 V/s), aún cuando por voltamperometría lineal se aprecia, a
velocidades bajas, un comportamiento adsortivo.
• Los ensayo electrólisis a p ial controlado no permitieron calcular
satisfacto el número de ctrones transferidos en el proceso de
oxidación de benserazida, en las condiciones ensayadas.
• La metodología electroanalítica desarrollada por VPD, utilizando como
condiciones óptimas tampón Britton-Robinson 0.1 M, pH 6, resultó ser
reproducible, con coeficientes de variación menores al 2%, y selectiva frente
a los excipientes contenidos en la formulaciones comerciales que contienen
benserazida, con porcentajes de recuperación mayores a 98%, así como para
CLUSIONES • Po iferen serazid
tam n 0.1 M tó u dica c
pico principal de oxidación y tres ondas poco resultas
de la molécula
pre os de a
lo ambio
calc Ka del 5.44 p
laron q
irreversib
difusi
barrido es
s de otenc
riamente ele
56
Magdalena Pérez O.
sus productos de hidrólisis básica. Presentando límites de detección y de
cuantificación de 7.12×10-6 y 9.49×10-6 M, respectivamente.
to en la Farmacopea Británica (49.0
mg, CV = 0.30 %). Mientras que el estudio de uniformidad de contenido
res
• Del estudio de estabilidad realizado para benserazida, se obtuvo una
degradación hidrolítica de pseudo orden uno. La velocidad de degradación fue
pH dependiente, lo que se manifestó tanto en los valores de las constantes
cinéticas, como en las vidas medias encontradas.
• La valoración de los comprimidos de benserazida en asociación con levodopa,
Prolopa® que declaran contener 50 y 200 mg de los respectivos fármacos, dio
como resultado 50.8 mg (CV = 0.79%), lo que estuvo bastante cercano a lo
encontrado por el método oficial descri
ultó en 102.3 mg/comp (CV = 4.56%), como promedio de un estudio
individual de 10 comprimidos.
57
Magdalena Pérez O.
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