anÁlises forenses
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ANÁLISES FORENSES
Toxicologia Forense
• Definição: Ciência que detecta e identifica a presença de drogas e venenos em fluídos corpóreos, tecidos e órgãos.
Toxicologia Forense
• Funções diversas;
• Toxicologia Forense x Toxicologia Analítica;
• Várias matrizes para análises;
• Métodos químicos sofisticados (derivação química, cromatografia, espectrometria de massa);
Compostos Voláteis
• Compostos da forma liquida que podem ser detectadas por técnicas de cromatografia liquida ou gasosa, quando as matrizes podem sofrerem métodos de extração apropriados.
• Extrações Liquído-Liquído, head space, Micro extração em fase sólida e extração em fase sólida.
Substâncias Corrosivas
• Incluem ácidos minerais e bases;
• Vários agentes corrosivos são constituintes normais dos tecidos;
• Modificações das concentrações químicas no plasma podem determinar as lesões;
Metais
• Clássicos procedimentos de separação de matrizes orgânicas são utilizados para determinação de metais ( Ex: agentes químicos e oxidação térmica);
• Técnicas analíticas empregadas ( Ex: AAS, MEV e ICP-MS);
• Diferentes formas de metais ( Mercúrio, dimetilmercúrio);
Componentes orgânicos não voláteis
• Drogas prescritas e ilícitas, praguicidas, produtos naturais, poluentes e compostos industriais;
• Dificuldade de Separação....
A N Á L I S E S
Papel da Toxicologia analítica
BIOTRANSFORMAÇÃO DO BENZENO NO FÍGADO E MEDULA ÓSSEA
FÍGADO
CytP450 CytP450
Benzeno fenol hidroquinona
[O] [O]
MEDULA ÓSSEA
Prostaglandina sintetase
Hidroquinona radical fenoxil
(aplasia de medula )
Como determinar?
O que procurar nestas amostras?
metanfetamina
CH2 CH
CH3
N
CH3
H
efedrina
CH2 CH
CH3
N
CH3
H
OH
fenilpropanolamina
CH CH
CH3
N
H
H
OH
anfetamina
CH2 CH
CH3
N
H
H
femproporex
CH2 CH
CH3
N
CH2CH2CN
H
ESTERÓIDES ANABÓLICOS ANDROGÊNICOS
H
OH
HO
1-Androstenodiol
O
OH
Boldenona
O
OH
Cl Clostebol
OHCH3
N
NH
H
Estanozolol
OHC
O
CH
H5C2
Gestrinona
OH
O
Nandrolona
O
OH
OH Oxabolona
OH
O
Trembolona
OH
O
CH2CH3
H5C2
THG
AGENTES ANABÓLICOS 1. Esteróides anabólicos androgênicos
Algumas dos esteróides mais utilizados:
- metandienona (Dianabol),
- cipionato de testosterona (Testosterona Depot, Sustanon)
- decanoato de nandrolona (Deca-durabolin, Durabolin)
- oxandrolona (Anavar)
- enantato de metenolona (Primobolan)
- estanozolol ( Winstrol)
- undecilenato de boldenona (Equipoise) - uso veterinário
Efeitos tóxicos -Coletases e tumores no fígado, mais freqüentemente com o uso de derivados C-17 alquilados. Carcinomas hepáticos associados aos E.A. não produzem metástase e regridem após a descontinuação do uso.
Agentes anabólicos 1. Esteróides anabólicos androgênicos
O ciclo letal de Andreas Munzer
0-10 semanas antes da competição:
-Efedrina, Aspirina, Valium, clembuterol, hormônio da tireóide.
6-10 semanas antes da competição:
-2 inj. Testoviron 250mg (testosterona)
-1 inj. Parabolan (Trembolona)
- 30 comp. Halotestin (Fluoximesterona)
-30 comp. Metandienona
-20 doses GH
-20 doses insulina
3-5 semanas antes da competição:
-3 inj. Masteron (Drostanolona)
-2 inj. Parabolan(Trembolona)
-30 comp. Halotestin (Fluoximesterona)
-50 comp. Stromba (Estanozolol)
-2 inj. Stromba
-24 doses GH
-20 doses insulina
OUTROS: EPO, diuréticos
Baixas concentrações
ESTERÓIDES ANABÓLICOS ANDROGÊNICOS
DETECÇÃO URINA
O desafio dos anabolizantes
Conteúdo da seringa
18α-homo-pregna-4,9,11-trieno-17β-ol-3-ona
4,9,11- trieno-3-one
i) Novo esteróide, nova “entidade química”.
ii) Sem registro de CAS.
iii) Nunca antes usado em humanos ou animais.
iv) Nunca testado em screening farmacológico.
v) Propósito único – burlar o exame de dopagem.
vi) “O” esteróide de desenho.
Esteróides de desenho
Tetraidrogestrinona – Conclusões de Catlin et al.
Designer steroids
O desafio dos anabolizantes
Caracterização do THG
“CLUB DRUGS”: Freqüentadores de festas “raves”.
• MDMA: Ecstasy, pílula do amor. • GHB: “Ecstasy líquido”. • Cetamina: Special K, Kit kat. • Metamfetamina: Speed, Crystal, DOB. • LSD (Ácido, doce, ponto). • Fenciclidina: PCP. • Nitritos (Poppers).
GHB
Flunitrazepam (FNZ) Rohypnol
FNZ ilícito
Utilizadas em assaltos e estupros.
Efeitos: Incapacidade de reação e amnésia retrógrada.
GHB Gama-hidroxibutirato (Ecstasy líquido, GBL).
GHB Definição: • Gama-hidroxibutirato (Ecstasy líquido, GBL.
• Natural em SNC de mamíferos.
• Estrutura similar ao neurotransmissor GABA.
• Date rape drug (Relatos de uso em assaltos e
estupros).
• Líquido ligeiram. Salgado, amargo e inodoro.
• Popularizado na década de 1980 - realçar o efeito do etanol .
• Uso crescente por todo o país.
• Recentemente aprovado pelo FDA como tratamento
para narcolepsia.
• Alguns congêneres: gama-Butirolactona (GBL) e 1-4 butanediol
(solventes industriais utilizados na limpeza de CDs, Impressoras).
GHB Mecanismo de ação: Receptores só no SNC, principalmente hipocampo. • Liga-se fracamente em receptor GABA b.
• Depressor do SNC.
• Provoca liberação de opióides endógenos.
GHB • Farmacocinética: • Início de ação: 15-30 min e pico plasmático
em 25-45 min.
• Metabolizado em CO2 .
• GBL é convertido à GHB por via não enzimática.
• 1-4 butanediol é convertido à GHB pela álcool
desidrogenase.
• Efeito Bifásico. A ingestão concomitante de etanol, leva a
uma inibição competitiva pela álcool desidrogenase,
retardando a metabolização do 1-4 butanediol. Assim,
pode haver uma depressão inicial do nível de consciência
seguido por uma melhora quando o etanol é metabolizado
e logo em seguida evolução para coma com a
disponibilização da álcool desidrogenase.
DOB - (Cápsula do vento)
(4-bromo-2,5-Dimetoxi-4-bromoamfetamina
DOB - (Cápsula do vento)
(4-bromo-2,5-Dimetoxi-4-
bromoamfetamina
Derivado anfetamínico acrescido de um átomo de bromo ( responsável por potencializar o efeito da droga e por aumentar o
tempo de ação). Primeiramente sintetizada por Alexander Shulgin (EUA) in 1967.
Cápsula transparente com capacidade de 500 mg que contém cerca de 1 a 1,5 mg da substância.
Cocaína
(3%)
N
C
O
CH3
O
O CH3
CO
Éster metil ecgonina
(15-35%)
N
C
CH3
O
O CH3
OH
Ecgonina
(1-8%)
N
C
CH3
O
OH
OH
Norcocaína
(2-6%)
N
C
O
O
O CH3
CO
H
Benzoilecgonina
(15-50%)
N
C
O
CH3
O
CO
OH
Amostras
PRAGUICIDAS
• a) Derivados do ácido fosfórico.
• b) Derivados do ácido tiofosfórico.
• c) Derivados do ácido ditiofosfórico.
• d) Derivados do ácido fosfônico.
Derivados do ácido fosfórico.
Ex: Diclorvos,fosfamidon,Mevinfós, Monocrotofós.
Derivados do ácido Tiofosfórico.
Ex: Cloropirifós,Diazinon,Fention,Omeotoato,Paration metílico
Derivados do ácido Ditiofosfórico.
Ex:Azinfós,etion,forato,malation,tiometon
Derivados do ácido Fosfônico.
Ex:Triclorfon
Oral, respiratória e dérmica.
Biotransformação Oxidação
Ligação ao sitio enzimático
x
Ácido Carbâmico
Aldicarb,Carbaril,Carbofuran
INSETICIDAS ORGANOCLORADOS
São compostos de estruturas cíclicas, bastante lipofílicos e altamente resistentes aos mecanismos de decomposição do ambiente.Os principais organoclorados com atividade inseticida são:
• a) Hexaclodienos e análogos.
• b) DDT e análogos.
• c) Ciclodienos.
• d) Dodecacloro e clordecone.
DDT
2,2-BIS(P-CLORFENIL) 1,1,1 - TRICLOETANO
DDT
Aldrin Dieldrin
CICLODIENOS
PIRETRÓIDES
TÉCNICAS DE PREPARAÇÃO DE
AMOSTRAS EM ANÁLISES TOXICOLÓGICAS
-A preparação de amostras pode ser considerada como uma série de
operações unitárias necessárias para que determinada substância
(analito) possa ser detectada pela técnica analítica de escolha.
Típicas operações em preparação de amostras:
1) Liberação dos analitos da amostra
2) Remoção de interferentes endógenos
3) Técnicas de extração
4) Aumento da seletividade e sensibilidade
1) Liberação dos analitos da matriz
-Como se encontra o analito na matriz?
-conjugado/livre
-matriz?
BIOTRANSFORMAÇÃO
Maconha - 9THC
Delta-9-
Tetraidrocanabinol (THC)
CH3
O
CH3
CH3
OH
C5H11
Ácido 11-nor-
delta-9-THC-
COOH C
O
CH3
CH3
OH
C5H11
O
OH
Ácido 11-nor- delta -9
-THC-COOH conjugado
C
O
CH3
CH3
OH
C5H11
O
O ácido glicurônico
SUBSTÂNCIAS CONJUGADAS
-Hidrólise
-Alcalina
-Ácida
-Enzimática
HIDRÓLISE ALCALINA
-Exemplo
Ácido 11-nor- delta -9
-THC-COOH conjugado
C
O
CH3
CH3
OH
C5H11
O
O ácido glicurônico
Ácido 11-nor-
delta-9-THC-
COOH
C
O
CH3
CH3
OH
C5H11
O
OH
60°C
NaOH
HIDRÓLISE ÁCIDA/ALCALINA
-Vantagens:
-processo mais rápido
-custo baixo
- Desvantagens:
-degradação de analitos não estáveis
p.ex. benzodiazepínicos
HIDRÓLISE ÁCIDA/ALCALINA
Cl
N
N
OCH3
Cl
N
O
H
CH3
Diazepam Benzofenona
HCl
100°C
15 min.
Benzodiazepínicos
HIDRÓLISE ENZIMÁTICA
Esteróides
Anabólicos
conjugados
Esteróides
Anabólicos
livres
Beta glucuronidase
55°C
1 hora
HIDRÓLISE ENZIMÁTICA
-Vantagens:
-não degrada os analitos
- Desvantagens:
-custo mais alto
-maior tempo de reação
-controle mais rigoroso das condições
-enzimas podem ser inibidas por substâncias
presentes nas amostras
-aconselhável o uso de controle
OUTRAS AMOSTRAS P. ex: cabelo
-Matriz complexa
-como retirar os analitos do cabelo?
-digestão da matriz (solução de NaOH 1M e temperatura 70°C
durante 20 minutos)
substâncias estáveis (THC, anfetaminas)
OUTRAS AMOSTRAS P. ex: cabelo
-E para substâncias não estáveis?
P.ex. cocaína
N
C
O
CH3
O
O CH3
CO
-Incubação em solução
ácida ou metanol durante
18 horas a 50°C
2) Remoção de interferentes endógenos
Uma matriz biológica consiste de
muitos componentes, como proteínas,
lipídios, carboidratos que podem interferir
na análise.
2) Remoção de interferentes endógenos
A) Precipitação de proteínas:
A remoção de proteínas por desnaturação ou precipitação é muitas
vezes necessária principalmente em amostras como sangue total ou
plasma. A principal razão de remover proteínas é que elas podem
precipitar em contato com a fase móvel, obstruindo a coluna de
HPLC.
Métodos de precipitação:
a) com ácidos ( p.ex. ácido tricloroacético e ácido
perclórico)
-formam sais insolúveis com a forma catiônica
das proteínas em meio ácido
b) com solventes orgânicos
-solventes que são miscíveis em água como acetona,
metanol, etanol e acetonitrila podem abaixar a
solubilidade de proteínas.
Métodos de precipitação:
c) com sais metálicos: proteínas também podem ser
removidas da amostra com o uso de sais de zinco ou
cobre em condições alcalinas.
-não : analitos que complexam com metais.
b) sulfato de amônio: O sulfato de amônio é um
precipitante relativamente ineficiente: < 75% das
proteínas são removidas com a adição de 1,5mL de sol.
Saturada em 0,2ml de plasma. Entretanto, poderia ser
possível injetar o sobrenadante diretamente no HPLC.
Precipitação de pigmentos e sais biliares
Pigmentos urinários e sais biliares podem produzir altos
“backgrounds”que podem interferir na quantificação de analitos. A
remoção desses compostos com extensos esquemas de extração
podem ser relativamente difíceis ou demorados. Sua remoção pode
ser feita preferencialmente por precipitação com sais de chumbo.
3) Técnicas de extração
-Extração líquido-líquido (LLE)
-Extração em fase sólida (SPE)
-Extração por head space (HS)
-Micro extração em fase sólida (SPME)
EXTRAÇÃO
(líquido-líquido)
urina
Solvente
orgânico urina
Drogas/ metabólitos
Agitação
Centrifugação Separação da fase
orgânica extrato
EXTRAÇÃO
(líquido-líquido)
INFLUÊNCIA DO pH NA
HIDROSSOLUBILIDADE/LIPOSSOLUBILIDADE
• substâncias de caráter ácido. Ex. ácido 11-nor-delta -9-THC-COOH
H+
OH- ácido 11-nor-delta -
9-THC-COOH
Forma ionizada
Forma
não-ionizada
C
O
CH3
CH3
OH
C5H11
O
OH
C
O
CH3
CH3
OH
C5H11
O
OH
C
O
CH3
CH3
OH
C5H11
O
O
EXTRAÇÃO
(líquido-líquido)
INFLUÊNCIA DO pH NA
HIDROSSOLUBILIDADE/LIPOSSOLUBILIDADE
• substâncias de caráter básico. Ex. anfetaminas
Anfetamina
H+
OH-
Forma ionizada
Forma não-ionizada
CH2 CH
CH3
N
H
H
CH2 CH
CH3
N+
H
H
H
CH2 CH
CH3
N
H
H
EXTRAÇÃO (líquido-líquido)
EFEITO “SALTING OUT” = molécula de água
+ NaCl (cloreto de sódio)
Na+ Cl-
CH2 CH
CH3
N
H
H
CH2 CH
CH3
N
H
H
2mL Metanol +
2mL tampão fosfato
1
2,5mL Amostra + 2,5mL água +
PI + 2mL tampão fosfato
BE
PI
Interf.
COC
2
3mL água +3mL
HCl (0,1M),
secagem (5min)
+ 9mL metanol
3
2mL
diclorometano/
isopropanol /
NH3 (80:20:2)
4
EXTRAÇÃO (fase sólida)
Tipos de colunas (SPE)
-INTERAÇÕES NÃO-POLARES (Van der Waals)
SiC8
Octil
SiPH
Fenil
SiCH
Ciclo
hexil
Tipos de colunas (SPE)
-INTERAÇÕES POLARES (Dipolo-dipolo, pontes de H)
Si C N
H O
CN
Cianopropil
Si NH
H
H
O
NH2
Aminopropil
Si O
OH
O
H
H
NH
2OH
Diol
Tipos de colunas (SPE)
-INTERAÇÕES IÔNICAS (Eletrostática)
SiC
O
O-
+NH3 RCBA
Ácido
carboxílico
Si
SO3- +
NH3
SCX
Ácido
benzenosulfônico
Si N+(CH3)3
-SO3 R
SAX
Trimetil
aminopropil
EXTRAÇÃO
Benzoilecgonina
-metabólito da cocaína
H+
OH- Forma ionizada
Forma ionizada
C
O
O
N
C
CH3
O
OH
+H
C
O
O
N
C
CH3
O
OH
C
O
O
N
C
CH3
O
O-
EXTRAÇÃO (fase sólida)
SO3-+H
C
O
O
N
C
CH3
O
OH
EXTRAÇÃO POR HEAD SPACE
DETERMINAÇÃO DE VOLÁTEIS
Amostra (urina,
sangue ou saliva)
+ sulfato de sódio
+ PI
ESTUFA 70°C
30 min GC
seringa
MICRO EXTRAÇÃO EM FASE SÓLIDA
6 1 2 3 4 5
MICRO EXTRAÇÃO EM FASE SÓLIDA (SPME)
-Baseado na partição do analito entre a fibra de extração e a matriz
(amostra)
MICRO EXTRAÇÃO EM FASE SÓLIDA (SPME)
-Fibras comercialmente disponíveis:
Fase estacionária eespessura do filme
Abreviação Aplicação geral
Polidimetilsiloxano(100um)
PDMS Compostos não-polares, voláteis
Polidimetilsiloxano(30um)
PDMS Não-polares,voláteis e semi-
voláteisPolidimetilsiloxano
(7um)PDMS Não-polares, semi
e não voláteisPolidimetilsiloxano-
divinilbenzeno (65um)PDMS-DVB Polar
Poliacrilato (85um) PA Polar, uso geral,voláteis
Carboxeno-polidimetilsiloxano
(75um, 85um)
CAR-PDMS Voláteis
Carbowax-divinilbenzeno (65um,
75um)
CW-DVB Polar, voláteis
MICRO EXTRAÇÃO EM FASE SÓLIDA (SPME)
Fatores que afetam a eficácia de extração por SPME:
-Dimensões da fibra (comprimento, espessura);
-Tipo de fibra;
-Temperatura de extração;
-Efeito da matriz (presença de sal, pH);
-Velocidade de agitação;
-Tempo de extração.
MICRO EXTRAÇÃO EM FASE SÓLIDA (SPME)
-Influência do tempo de extração:
MICRO EXTRAÇÃO EM FASE SÓLIDA (SPME)
-Influência da temperatura de extração:
MICRO EXTRAÇÃO EM FASE SÓLIDA (SPME)
-Influência da concentração de sal:
MICRO EXTRAÇÃO EM FASE SÓLIDA (SPME)
-Influência do pH:
MICRO EXTRAÇÃO EM FASE SÓLIDA (SPME)
Vantagens da SPME sobre a SPE e extração líquido-líquido: -simplicidade -prático -rápido -extração sem utilização de solventes -pode ser automatizado.
4) Aumento da seletividade e
sensibilidade
-Derivação
Objetivo:
-melhorar as condições cromatográficas
(GC)
-aumentar a sensibilidade
-Derivação
Ex. opiáceos
O
H
OHHO
N.CH3
HH
OO
N.CH3
H
Si
CH3
CH3
CH3
OSiCH3
CH3
CH3
BSTFA
70°C 20 min
Aumento da volatilidade
(melhora das condições cromatográficas (GC)
-Derivação
Ex. benzoilecgonina
Aumento da sensibilidade para detectores ECD
N
C
CH3
O
O H
O C
O
N
C
CH3
O
O CH2CF2CF3
O C
O
PFP/PFPA
70°C 20 min
MATRIZES BIOLÓGICAS
• URINA • SANGUE • AR EXALADO MATRIZES ALTERNATIVAS: • SALIVA • CABELO • MECÔNIO • UNHA • SUOR
URINA
Néfron
URINA
CARACTERÍSTICAS:
• Coleta não invasiva • Disponibilidade de grandes volumes de
amostra • Concentração alta • Facilidade da análise (baixo custo) • Possibilidade de adulteração da amostra • Período de detecção: alguns dias • Detecção de uso eventual
SANGUE
CARACTERÍSTICAS:
• Coleta invasiva • Necessidade de profissional treinado • Matriz relativamente complexa • Período de detecção: algumas horas • Correlação com estado clínico • Maior dificuldade de adulteração
SALIVA
SALIVA
CARACTERÍSTICAS:
• Coleta não-invasiva • Facilidade na coleta • Coleta sob vigilância e em campo aberto • Correlação com concentração sangüínea • Período de detecção: algumas horas • Pouco volume de amostra • Concentração baixa
CABELO
CARACTERÍSTICAS:
• Coleta não-invasiva • Período de detecção: meses
–Retrospectiva e cronológica • Detecção: uso intenso • Disponibilidade: ???? • Adulteração: difícil • Possibilidade de contaminação • Baixa concentração • Matriz complexa -dificuldade na análise
CABELO
1 cm
2 cm
3 cm
4 cm
5 cm
6 cm
7 cm
8 cm
9 cm
10 cm
MECÔNIO
CARACTERÍSTICAS:
•Exposição fetal
•Coleta não-invasiva
•Matriz complexa -dificuldade na análise
•Período de detecção: meses
•Disponibilidade
•Possibilidade de contaminação
UNHA
UNHA
CARACTERÍSTICAS:
•Coleta não-invasiva
•Baixa concentração
•Dificuldade na análise
•Período de detecção: meses
•Uso intenso
•Disponibilidade????
•Adulteração: difícil •Possibilidade de contaminação
SUOR
CARACTERÍSTICAS:
• Coleta não-invasiva
• Coleta através de adesivos “patch”
• Baixa concentração
• Dificuldade na análise
• Não existem muitos estudos
• Monitorar pacientes em tratamento
Aumento da seletividade e
sensibilidade
-Derivação
Objetivo:
-melhorar as condições cromatográficas
(GC)
-aumentar a sensibilidade
-Derivação
Ex. opiáceos
O
H
OHHO
N.CH3
HH
OO
N.CH3
H
Si
CH3
CH3
CH3
OSiCH3
CH3
CH3
BSTFA
70°C 20 min
Aumento da volatilidade
(melhora das condições cromatográficas (GC)
-Derivação
Ex. benzoilecgonina
Aumento da sensibilidade para detectores ECD
N
C
CH3
O
O H
O C
O
N
C
CH3
O
O CH2CF2CF3
O C
O
PFP/PFPA
70°C 20 min
Técnicas de extração e detecção em amostras biológicas de acordo com a
estrutura química das moléculas
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