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Ana Portela Arteaga
“CONTRIBUCIONAL ESTUDIODE LA CRONOFJSIOLOGIzI:
ASPECTOS EXPERIMENTALES”
DepartamentodeFacultadde
FisiologíaAnimalVeterinaria
UniversidadComplutensede Madrid1993
“CONTRIBUCIONAL ESTUDIO
DE LA CRONOFISIOLOGJA:
ASPECTOSEXPERIMENTALES”
MEMORIA que para la obtención
del grado de Doctor, presenta la
LicenciadaenVeterinariaDña. Ana
PortelaArteaga.
ESTA TESISHA SIDO REALIZADA BAJO LA DIRECCION DE:p
(
tU -
Prof. DÍfD JuanCarloslitera del Portal.
Licenciada Dña. Ana
Arteaga, aspirante al
Doctor en Veterinaria.
Portela
grado de
Madrid, Febrerode 1993.
ESTE TRABAJO HA SIDO REALIZADO EN:
* CHRONOBIOLOGYLABORATORIESUNIVERSITY OF MINNESOTABajo la dirección de:
PROF. FRANZ HALBERG
* DEPARTAMENTODE FISIOLOGíAFACULTAD DE VETERINARIA. UCM.Bajo la dirección de:
PROF. JUAN CARLOSILLERA
A mi familia y amigos
AGRADECIMIENTOS
Si citase a todaslas personasque, de algunaforma, me han ayudado en la
realizaciónde este trabajo,creo quepodríaescribir otra Tesis.Pero desdeestaspáginas
quiero agradecera todos los que meprestaron suapoyo, tanto de forma moral como
material El orden que ocupanen estaspáginas, no es un orden de importancia,pues
todos merecerían sercitadosenprimer lugar
Quiero agradecerenparticular a mi director de Tesis,el Prof Dr Juan Carlos
filera del Portal, Profesor Titular del Departamentode Fisiología; apanedel esfuerzoy
tiempoque meha dedicado~por su estímulo, suempujey su ubicuidad.Gracias.
Quiero manifestarmi agradecimientoal Prof Dr Franz Halberg considerado
comoel padrede la cronobiologíay Director del Laboratorio de Cronobiología de la
Universidad de Minnesota,porque él fue quien me introdujo en estemundo de la
cronobiologíaymeha enseñadotodo lo que acerca deella sé, teniendosupuertasiempre
abiertaparacualquierconsulta,transmitiendomesuentusiasmoy haciéndomeaprovechar
de un día, sus ‘25’ horas.
Asimismo,quiero manifestarmi agradecimiento alProf Dr D. Mariano fIlera
Martín, Catedrático-Directordel Departamentode Fisiología Anima4 por haberme
facilitado los mediospara comenzarmi andadurapor estecampotan apasionante.
Deseodar las graciasa todas las personasque meayudaronen la realización de
esteestudio,en cuantoal “material” empleadoen él, porquesin ellas no hubiesepodido
ser llevado acabo.Aunquelos estudios longitudinalesenpersonassanasfueronllevados
a cabo en mimisma,deboagradecera otras muchaspersonasque tambiénllevaron a
cabo estudios semejantes,las cualesmepermitieron hacer uso de susdatos. Le estoy
sinceramenteagradecidaa la Dra. EmaHalbergporpermitirme analizar suslargas series
de datos demarcadoresde crecimiento.Ema esperoque algún día y gracias a la
cronobiología, podamos ponersolución a tu enfermedadgracias tambiénpor tu gran
hospitalidad.
Quiero darle las gracias a Germaine, Dra. Cornélissen, Directora dc
Cronobiometríade la Universidad de Minnesota,por guiarme en cada pasode los
análisis, asícomoporcedermegráficose inestimablesdatos, tanto de ella misma,como
los del equz~ointernacionalquecon ella trabajan.
Gracias a Ma¡ySampson,que durantemi estanciaenMinnesotameproporcionó
una inestimableayuda escribiendoa máquinay corrigiendo mi inglés.
Gracias a todosmis “compis” del Departamentode Fisiología Anima4por sus
consejos,su ayuday sus largas cartasescritas’~ gracias a Gema,Pedro, May, MU José,
Anay Ramón.Gracias a las ‘Ma Josés”por su ayuda:a M~José(secre,quienmecedió
‘isin rechistar’ su PC), a MU José (Centro de Cálculo) y a MU José(Illera).
Lesdoy las graciasa mispadres,porquegraciasa ellos hellegado dondeestoy;a
mi madrepor ‘soportanne” con tanta pacienciadurantetanto tiempoy a ini padrepor
inculcarmesus ideas de trabajo ytesón.
A lkabely a Queta, graciaspor todos esoslargosfinesdesemana(y madrugadas)
dedicadosa las tablas y a la bibliografía, y a Peluy JoséManuelpor la ayuda queme
han prestado.
A Alberto, graciaspor ser tan positivo en todoslos momentosy por darmetodo
su apoyo, moraly materiaL
Enfin, graciasa todoslos que cuandoestuve lejos hicieronquemesintiesecerca.
CONTENIDO
CONTENIDO
OBJETIVO 2 - 3
INTRODUCCION 4-59
VARIACIONES CIRCADIANAS DEL CORTISOL
MARCADORES DE CRECIMIENTO, CA125 y CA13O
PRESION SANGUíNEAY FRECUENCIACARDIACA
DISEÑO EXPERIMENTAL
ANALISIS DE DATOS EN CRONOBIOLOGIA.
MATERIAL Y METODOS 60 - 75
OBTENCION Y ANAUSIS DE LAS MUESTRAS .... 61 -70
Experimento1: Variación circadianadel cortisol
Experimento2: Marcadoresde crecimiento,CA125
y CAI3O
Experimento3: Alofasecircatrigintanaentrepresión
sanguíneay frecuenciacardiaca
METODOLOGíA ANALíTICA CRONOBIOLOGICA 70-75
Experimento1: Variación circadianadel cortisol
Experimento2: Marcadoresde crecimiento,CA125 y
CAI3O
Experimento3: Alofasecircatrigintanaentre presión
sanguíneay frecuenciacardiaca
RESULTADOS 76 -126
Experimento1: Variación circadianadel cortisol
Experimento2: Marcadoresde crecimiento,CA125 y
CA13O
Experimento3: Alofasecircatrigintanaentre presión
sanguíneay frecuenciacardiaca
DISCUSION 127 -145
Experimento1: Variación circadianadel cortisol
Experimento2: Marcadoresde crecimiento,CA12Sy
CA13O
Experimento3: Alofasecircatrigintanaentre presión
sanguíneay frecuenciacardiaca
CONCLUSLON 146 -147
GLOSARIO 148 -161
BIBLIOGRÁFIA 162 -189
ABREVIATURAS
a Nivel de Probabilidad
r Periodo
4, Acrofase
Equiva]e
a Años
A Amplitud
a.m. Ante meridiano
ACTH Hormona adrenocorticotropa
ADH Hormona antidiurética
ANOVA Analisis de Varianza
AP Ana Portela
GradosCentígrados
CA125 CancerAntigen 125
CAI3O CancerAntigen 130
cm Centímetros
CRH Factorliberador de corticotropina
CV Coeficientede Variación
d Días
DL Dosis Letal
EH EmaHalberg
ELISA Enzimo inmunoanálisis
ES Error Standard
f Frecuencia
F F de Snédécor
FC Frecuencia Cardiaca
g Gramos
G Gauge
GC GermaineComnélissen
h Horas
Hipótesisnula
RíA Radioinmunoanálisis
RSS Sumaresidualde los cuadrados
SD SerialmenteDependiente
SI SerialmenteIndependiente
t t de student
U Unidades
UCM UniversidadComplutensede Madrid
VR Proporciónde Variabilidad
W Formade la curva
OBJETIVO
Como es muycomún hoy en día y desdehacemuchosaños,los animalesse
utilizan enexperimentación,casisiempreconla ideadepoderaplicar,posteriormente,
a los seres humanoslas “ventajas” y solucionesqueen ellosencontramos.Pero antes
depoderemplearestosresultados obtenidosde la experienciaanimal en las personas
deberíamostenerun conocimientomásexactode la fisiología de los mismos,por esto
creímosconvenienteahondarenel campode la cronofisiologíay teneren cuenta la
influencia del tiempo en todaslas variablesbiológicasque hoy en díase investigan.
Tambiénnos pareció oportunoprofundizarmás enel campode los diseñosde los
estudiosexperimentalesquellevamosacaboenlos animales,parapoderevitarla gran
variabilidad que existe en los parámetrosy a la que hacereferenciala bibliografía
actual, dandounos márgenesfisiológicos muy ámplios; por ejemplo, los niveles de
referencia de cualquierhormona, no sólo una variabilidad interespecíficasino
intraespecífica.
Estudiamos la existencia de lo(s) ritmo(s) del cortisol plasmático y
comprobamosla variaciónde susconcentracionesen el tiempo, dandounosperfiles
másprecisosque los encontrados hastaahora.
Asimismo, quisimoscomprobarlasdiferenciaso similitudesexistentesentrelos
ritmos del cortisol de distintosconejos(NZW) alojadosen diferentesciclos de luz-
oscuridady si existía algunadiferenciaen las concentracionesde cortisol al obtener
las muestrasde forma serialmentedependienteo independiente.
Por otro lado, comouno de los objetivosprimordiales,en biomedicina,es la
lucha contralas enfermedadesactualescomoson el cáncer,el SIDA, enfermedades
cardiovasculares(infartos de miocardioo hipertensión) frente alas cualeshoy endía
no existenverdaderassoluciones,debemosponertodos los mediosa nuestroalcance
paraencontrarlasy, sobretodo, prevenirlas.Estees unode los objetivos principales
de la cronohiología:la prevenciónde muchasde lasenfermedadesdenominadasen
la actualidadcomo“incurables”y si estono esposible,al menos lograrunatemprana
detección delas mismasmedianteun control rutinario, comoesel seguimientode los
parámetrosde los ritmos (MESOR, amplitudy acrofase)
2
Por las razonesanteriormenteexpuestas,hemos estudiadolos ritmos delos
incorrectamentellamados“marcadorestumorales”(marcadoresdecrecimiento)CA125
y CA13O, empleadosenel seguimientode la evoluciónde tumoresginecológicos,para
prevenir la aparición deestos tumores,o una vez detectadosllevar a cabo una
correctacronoterapia.
Asimismo seestudiaronla frecuencia cardiacay la presiónarterialintentando
conocer sus ritmos como el circadiano, circacentuminutano, circasemidiano,
circatrigintano,etc,y de estaforma, al detectarcualquieralteración enlos parámetros
de los mismos,poderprevenirenfermedadescardiovasculares.
3
INTRODUCCION
La cronobiologiaes la ciencia que se ocupa de cuantificar e investigar,
objetivamente,los mecanismosde la estructuratemporalbiológica,el cronoma,que
incluye las manifestacionesrítmicas de la vida. Fue diseñadapara describir las
característicasde los ritmos, comoson el MESOR (M), la amplitud (A), la acrofase
(~), el periodo(r), la frecuencia(O o la forma de la curva(W).
El término cronobiología,introducidopor Halberg(1957),es un neologismo
que procede delos vocabloschronos(= tiempo),bio (= vida) y logie (= ciencia).En
términos fisiológicos, proporcionaconceptosde aplicacióngeneraly técnicaspara
resolver (observar y cuantificar) problemasreferentesal estudio de los ciclos
predeciblesen el organismo,así como para aislar los efectosambientales,de los
mecanismosendógenospropios que estánenmascarados.La cronobiologíaincluye,
entre otras, las siguientes disciplinas: cronofisiologia, cronopatología y
cronofarmacología,la cual a suvez, comprendecronotoxicologíay cronoterapia(por
citar algunas).
La cronofisiología, disciplinaen la cual estamosmásinteresados,seencarga
del estudiode las manifestaciones temporalesde los procesosfisiológicos,evaluando
asimismo,las interaccionescíclicasbiológicas(endocrinas,nerviosas,metabólicas,etc.)
con el organismo,el cual sirve debasea las característicasbiológicastemporalesy a
susinteraccionesconel medioambiente.Tantola cronofisiología, comocualquierade
las disciplinascitadasanteriormente,necesitande una serie demétodosparapoder
serresueltas;la metodologíaempleadao ritmometría va a permitirdescribirun ritmo,
mediante laestimaciónde sus característicasanteriormentemencionadas:MESOR,
amplitud, acrofasey/o periodo,las cualesse calculanmediantehipótesisdeducidas
estadísticamente.
Lavida, ya seadeterminadapor bioquímicos,fisiólogoso morfólogos,envuelve
cambios en el tiempo; cualquier determinaciónde una variable fisiológica en
particular, deberíaser especificadade acuerdocon el momentoen quees estudiada.
En biología,engeneral,las diferenciasqueencontramos,por ejemplo,en funcióndel
momentodel díao del año, puedenser enormes.Normalmente podemos encontrar
5
valoresmáximosy mínimosque se repiten periódicamente;tambiénnosencontramos
con manifestacionesconsecutivasde acontecimientos similaresque ocurren en
intervalos regulares, formandociclos manifiestoso bioperiodicidades.
El tiempo biológico no essólo un componenteimportante dela vida animal
y vegetal,sino que tambiénse puededeterminarcuandolos ciclos estánocultos. Tan
prontocomose hanpodido medirlasdiferentesvariables enfunción del tiempo,y de
forma repetida,nos encontramoscon lasvariacionesperiódicas,las cualesmediante
métodos especialesde cronobiometríapuedenserresueltasy cuantificadasenlos seres
humanos,en células individualizadas procedentesde mamíferos, en organismos
unicelulares eincluso en procariotas.
Los cambiosrelacionadoscon el tiempo determinanla vida comoun espectro
de bioperiodicidades.Cambios similaresde aproximadamente(circa), pero no
exactamenteel mismo tipo y extensión, recurren en aproximadamente(no
exactamente)los mismosintervalos,enaproximadamentelas mismassecuencias,y a
todoslos nivelesdeorganizaciónde la vida animalo vegetal,desde procariotas a seres
humanos(Halberg,1969).
Las periodicidades,no siempreson ciclos precisos,son másgeneralesquela
vida, y se encuentran enmuchos de los fenómenosinvestigadospor diferentes
disciplinas, desdela astronomía hastala física cuántica.Las partículas elementales
puedenser vistascomo ondas(Hawking, 1988), las reaccionesquímicaspuedenser
periódicas,como lo son la fisiología y el comportamientode los microorganismos,
incluyendotanto alas bacteriascomo a los organismosunice]ulai-es(Giese, 1979;
Halbergy Connen, 1961); se puede decirlo mismo de las células ex vivo: p.e., las
células adrenales delratón sintetizan corticosteronain vitro no de una forma
arbitraria,sinoque cadacélulalo haceconuna periodicidadsimilar (Halberg, 1963).
Las células pinealesperfundidas también muestranbioperiodicidades(Ungar y
Halberg, 1963; Leung et aL, 1990), de igual forma que hacenlos organismos
multicelularesy tal comolos animalesexhiben comportamientos bioperiódicosensus
actividadesmotorasy de alimentación,duranteel crecimientoo el desarrolloy la
6
pubertad.
Los individuosexhibenritmos espontáneos oritmos “a”. Los ritmos reactivos
o “b” caracterizan la respuesta ante unestímulo,ya seafísico comomido o radiación,
químicocomo etanolo bacteriológicocomoendotoxinas(Halberget al., 1955; Haus
y Halberg, 1959; Halberg et aL, 1960). La respuesta a diferentesfármacos es
bioperiódica,al igual que ladosisde un fármacoo las radiacionesque matanel 50%
de los animales en30 días, la DL3% (todos estos hallazgosconducen haciauna
cronotoxicologíay cronofarmacología).Unamodulaciónpinealdel efectohipofisario
sobrela producciónde adrenocorticosteronaesun casopuntual(Sánchezde la Peña
et aL, 1983). Los ritmos “d” son intermodulacionesentre3 ó másentidades,en más
de unafrecuencia.Cuandoestosritmos sedemuestranin vivo sedesignanpor letras
griegas:los espontáneosson a, los reactivos son 13, las intermodulacionesen una
frecuenciasonl y a dos o másfrecuenciasson 6.
El margen defrecuenciasencontradoen la naturalezaes enorme,va desde
fenómenos electromagnéticosa biológicos;en estosúltimos estemargense extiende
desdemilésimasdesegundo, comolasondascerebraleso los 1000 Hz de descargade
los peceseléctricos,hastamásde cientosde años,comoel ciclo de floraciónde 120
años del bambúchino (como caso excepcional).En el espectrogeneralde las
frecuencias,las biológicas ocupan, relativamente,una banda estrecha. Algunas
frecuenciasestán normalmenteexpresadas comosusreciprocas(i/f = r ), es decir
comoperiodos,aúnasí el nombrede los dominiosdel espectrode bioperiodicidades
derivande la frecuencia.Estaelecciónde la frecuencia,envez del periodo, está hecha
parasituarlos cambiosbiológicosen relacióncon el espectrode las frecuenciasde las
radiaciones electromagnéticas.
Las bioperiodicidadescon unciclo aproximadode 24 horas,con unoslímites
aproximadosentre20 y 28 horassedescribencomocircadianasy frecuenciasmayores
o menoresque las circadianasson denominadascomo ultradianase infradianas,
respectivamente.A continuaciónvamosacitar algunosdeestosritmosbiológicos,con
susejemplos ilustrativosrespectivos:
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REGION DEL DOMINIO MARGEN EJEMPLO
Ultradiano r c 20 h
circaoctohorano r = 8 ± 1 h Presiónsanguíneay FCcircasemidiano r = 12 ± 2 h Frecuencia cardiacay FC
Circadiano r = 24 ± 4 h PS,FC, Temperatura
diano r = 24 + 02 h FC sincronizada
Infradiano t > 28 h
circasemiseptano r = 3 5 + 1 d Muerterepentinaen humanacircaseptano r = 7 ± 1 d Rechazo trasplantescorazóncircadiseptano r = 14 ± 3 d Excrec. urin. 17-oxoester.circavigintano ‘r = 21 ± 3 d Ciclo sexualvacacircatrigintano r = 30 ± 5 d Presiónsanguínea
circanual r = 1 ± 2 m PRLycortisol
circasepteniano r= 7 ± 1 a Indice gonadalinvert. mar.circaduodeceniano r = 12 ± 2 a Presiónsanguínea
Las bioperiodicidadesde los potencialesde acción del cerebroy del corazón
registradasen un electroencefalogramao electrocardiograma, respectivamente,son
ultradianas(Franket al, 1961; Crowley et al, 1972). Las circadianasson las más
estudiadas;por ejemplo, se demostróun cambio circadiano en el recuentode los
eosinófilossanguíneosen diferentesespecies:peces,ratones, ratas,hamster,perros,
monosy humanos(Halberg,1950; Halberget aL, 1951;Flink y Halberg,1952; Halberg
y Nabias,1954; Chaudryy Halberg, 1960).Entrelos infradianosse puede observaruna
bioperiodicidadde aproximadamenteuna semanao circaseptana,en los rechazosde
trasplantesde órganos.
Bioperiodicidadesde aproximadamenteun mes, nosólo se encuentran enlas
8
mujeres,sino tambiénen los hombresy en las mujeresantes dela pubertad,cuando
existeausenciade menstruación,duranteel embarazoy en la menopausia,así como
en presenciadel ciclo menstrual.Aproximadamenteanuales ovariacionescircanuales
son comunesen condicionesfisiológicas,por ejemplo, en el peso delovario del pez
gatoJamunariver de laIndia, el cualvaría desdeaproximadamente16 g cuandosopla
el monzón,hastaaproximadamente1 g, 6 mesesmás tarde.Cuandoestos pecesse
encuentranalojadosen continuaoscuridadduranteaños,el peso delovario continúa
siendocíclico con unciclo de curso libre,de aproximadamente1 año (Sundararajet
aL, 1973, 1982). Un circaseptenianoo ritmos de 7 años, aproximadamente,se
encuentranen el índice gonadal de algunos invertebradosmarinos (bimba et al.,
1981).
Cuandolos ritmos, en el estricto sentido de la palabra,son definidos como
fenómenosconfirmadosmediantededuccióny formulables algorítmicamente,cada
organismopresentasupropiocronoma,incluyendolos ritmosde multifrecuenciaque
siguenlas tendencias delcrecimiento,desarrolloy envejecimiento.Los ritmos son
endógenos,en parte, estánprogramadosen el código genético del organismo,la
información pertinenteestá localizadaen el genper, llamado de estaforma por
periodo. Este gencodificapara sintetizar proteínasen la célula que coordinarálos
ritmos. Estoshallazgoshansido realizadosen las moscas dela fruta (Hamblen-Coyle
el aL, 1986, 1992;Hardinet al., 1990; Young, 1992)y en las levaduras,documentados
desde hacetiempo en las mismas especiesy en muchasotras,medianteel fenómeno
de curso libre (Halberg, 1970).
La endogenicidadha sido demostradaen bastantes experimenwsdiferentesy
enbastantesvariables,p.e., estudiandola temperaturaen ratonesciegos (Hauset al.,
1967). En estosratoneslas variacionesde los eosinófilossanguíneoscirculantesno
muestranun ritmo sincronizadode 24 horas(con valoresaltosduranteel periodode
luz, cuandoestánalojadosenun régimende luz quealterna12 horas de luz con 12
de oscuridad).En lugar de este ritmo de 24 horas, en las células eosinófilas
sanguíneasapareceun ritmo de 23,5 horasen un ciclo ambientalde 24 horas de luz
y oscuridad.Esteestudiosellevó a caboen paralelocon otro grupo de ratones con
9
visiónnormal enlos cualesseencontróun ritmo de 24 horas.Los análisisrealizados
a mediodíay a medianoche enlos grupos de ratonesciegos al principio eranmuy
confusos;paraempezar,los ratonescon visiónnormal teníanun pico en mitad del
intervalo de luz y unadepresiónen mitad dei intervalo de oscuridad,y la diferencia
eraestadísticamentesignificativa.Los ratonesciegos,a suvez, teníandiferenciasque
cambiabansistemáticamentedesdeun pico en mitaddel intervalo de luz aun pico en
mitad del intervalo de oscuridad.Se decidió entoncesestudiaruna variable que
pudieseser medidavariasvecesal día,en los mismosanimalessin unacargaexcesiva
paraellos (Brusset aL, 1958; Halberg,1954).
En vez de emplearel muestreosanguíneo,el cual no podíaser llevado a cabo
fácilmentepuesconsistíaen tomarmuestras cada4 horasdurantevariosmeses,se
decidió estudiarel ritmo de la temperaturacorporal. Esteritmo, en animalescon
visión normalmantenidoscon luz desdelas 06:00 hastalas 18:00horas,muestraunos
picos constantesdurantelas horasde oscuridady depresionesdurantelashorasdeluz.
Lospicos ocurren, cadadía, aproximadamentehacia lasmismashoras,sobrelas 20:30
horas.En contraste,los animalesciegos muestranpicos que ocurren mástemprano,
cadadía, hasta queal final, trasvariassemanas,el pico se produce alas 08:30envez
de a las 20:30 horas. Entoncesun fenómeno no deseado,llamado “resultados
controversos”,fue resuelto rápidamente mediante laexpresiónde unapresumible
estructura temporalendógena.
Volviendo a los seres humanos, todolo aprendidode las otras formasdevida
sepuede extrapolar aestos.Personasvoluntarias,las cualesvivieron ensimas,aisladas
de los efectosambientalescíclicos de24 horas,lejos de la influenciade los ciclos de
la nochey el día, y de otras influenciaspsico-químicasy sociales,desarrollaronuna
rutina diaria cercana a24 horas,pero ligeramentemás larga; acostándosecada día
un poco más tarde, mostrandoen su temperaturacorporal y en otrasvariables,
periodosligeramentemás largos de 24 horas (Siffre et aL, 1966; Apfelbaumet al.,
1969).
En los seres humanos,unaevidenciacrítica encuantoa la elaboración interna
•l0
de los ritmos (endogenicidadde los ritmos) está ligadaa la, mal entendida, relación
entrela presiónsanguíneay los efectosde la actividadmotora,asícomolas respuestas
psicofisiológicas,no sólo para presión sanguíneasino tambiénpara la frecuencia
cardiaca.Estudios deestasdosvariables realizadosenpersonasgemelas,demuestran
rigurosamentela heredabilidadde la componente genéticade la amplitud circadiana
para la presión sanguíneay la frecuenciacardiaca al obtenerun coeficiente de
correlación,entre clases,altamentesignificativo (estadísticamente)(Halberg, 1983;
Hansonet al., 1984; Kumagaiet aL, 1992).
Un ciclo externo,como es el ciclo luz-oscuridad,alternandocada 12 horas,
únicamente puedesincronizarun ritmo circadiano,cuandoel periododel ciclo externo
es cercano al periodo endógenonatural. Los ratones puedentener un ritmo
sincronizadode 22 horassi estánsincronizadospor un régimende 11:11 horas (luz-
oscuridad,LO). La luz en este caso actúa comosincronizador,tambiénllamado
zeitbeger.El término alemánzeitbeger,significa “dador de tiempo”, no obstantesólo
puedeser interpretadocomoun donantedel tiempo de reloj o de calendario,no del
tiempo interno(Halberget aL, 1954; Nelsonet aL, 1975; Aschoff y Pohí, 1978).
Peroel tiempofisiológicocontinúasiendocíclico, enausencia deestosdadores
de tiempo,conunafrecuencialigeramente diferentea lade los ciclos ambientalesque
la puedensincronizar,como queda documentadoen el curso libre de los ratones.No
sólo los ritmos circadianos,de la temperatura corporal, los eosinófilos, la
corticosteronasérica, sino otros ritmos en la sangrey los órganos,y dentro de la
célula, estántodos sincronizadospor el ciclo de 24 horas de alternancia deluz y
oscuridad,como sincronizador.Pero si el régimen de luz utilizado consiste, por
ejemplo,en 6 horasde luz alternandocon 6 horasde oscuridad,esdecir, un ciclo de
12 horas luz-oscuridad, bastante diferente del ciclo interno fisiológico, de
aproximadamente23,5 horas en los ratonesinvestigados,el régimencíclico de luz-
oscuridadno sincronizaráestosritmos y los ratones estaránen curso libre, comolos
ratonesciegoscitadosanteriormente(Halberget aL, 1954; Halberg,1959). Estasson
otraslineasindirectasde evidenciaqueapoyanla endogenicidadde los ciclos.Incluso
bajo drásticascondicionesexiste un programainterno quepreparaa los mamíferos
11
.
para las actividades diarias(Halberg, 1953). Los ritmos hormonalesendógenos
muestranun aumento ensus concentraciones,antes incluso de despertase,y la
eosinopeniaendógenaocurreen preparación alas actividades diarias,por la mañana
antes de levantarseparalaspersonasy los perros (Halbergy Nabias, 1955; Kaine et
aL, 1955),y por latardeparalos deactividadnocturnacomoratones, ratasy hamsters
(Halberg, 1951; Halbergy Nabias, 1954; Halbergy Chaundry,1960>.Este aumento,
comoun aspecto deltiempo interno,persisteen ausenciade cualquierciclo ambiental
conocido.En otraspalabras,los ritmos circadianosestánsincronizadospor factores
externos (tiempo externo) como es la luz o la alarmade un reloj, pero no están
determinadoso producidos por los ciclos ambientales
Los experimentosen los ratonesciegos, citados con anterioridad, fueron
reproducidosvariasvecesobteniendoresultados similares(Halbergy Visscher,1972).
linade lasclavesfundamentalesdeunaexperimentaciónfiable,esla reproducibilidad
de los resultadosexperimentalesobtenidosbajo condicionesestándar. Estameta, de
cualquierforma, no se puede alcanzaraunquese asumaque todaslas variables,
exceptolas investigadas,sonlas mismasen cadamomentoconvenido,puesto queen
el caso de los ritmos con multifrecuencias(“arios componentes)cada variable
contribuirá en unamedicióndada,siendomuy improbablequeestosestados,de todos
los ritmos de multifrecuencia,se reproduzcancadavez quese repitaun estudiodado.
Por este motivo es por el que se determina mejor el cronoma (que no la
determinaciónde un sólo valor), o en caso de que no seaposible determinarlo,al
menosdeterminarel componentemásprominentedel cronoma,comoes el circadiano
quesemide comopartedeunacurvamuchomáscompleja.El principal puntoesque
unareplicación,de unestudiocircadiano,esmuchomásprobable queocurra,que una
replicaciónde un simple cronomaen un momentodado, sin especificarel tiempo,
inclusoaunquese especifiquenel momentodel día y la estación.
Algunos componentesdel cronomapuet~enser determinadosen su totalidad
mediantela ayudademonitoresautomáticos,disponiblesactualmentey cadavez más
usadosen fisiología y biología; por tanto, el tiempo biológico se convierteen una
dimensiónque puedey debeser medida.A diferenciadel sexo, laespecieo la edad,
12
aisladamente,variablesimportantespara determinadospropósitos,pero para otros
puedenser ignoradas; la informacióndel cronomaes indispensableen fisiología para
cualquier determinacióncompleta.En vez de fijar el tiempo del díapara eliminar
ritmos lo que es una tarea sisypheana (absurda), es mejor determinar
bioperiodicidades.No sólo debemosteneren mente queun ritmo es un fenómeno
formidable algorítmicamentey validable estadísticamente,que caracterizauna
variable,sinoqueesun fenómeno que puedeser determinado deforma efectivay sin
demasiadocoste(Cornélissenet aL, 1992).
La cronobiologia proveeconceptos aplicablesy técnicaspara resolverestos
cambiospredeciblesen los organismos,así comoparaaislar los efectosambientales
de losmecanismos endógenos.Las propiedadesbásicasde J05 ritmos son importantes
parala ecología,biologíay en particular parala medicinahumanay veterinaria.
Las manifestacionesrítmicas de la vida estánen desacuerdocon la práctica
actualde la medicina,y con el puntode vista, no común,de la homeostasis.Parano
desmerecer,la mayoríade lo quese conocey sepuedeevaluaren la actualidad,no
se debe alos métodoscronobiológicos,y además,las determinaciones experimentales,
no relacionadascon el tiempo tienen el principal crédito de que proporcionan
beneficiosobjetivos.La insulina para los diabéticos,así como la penicilina paralas
infeccionesfuerondescubiertassin la ayudade la cronobiología(en estoscasos,p.e.,
el tiempo de la insulina seríaunicamenteun refinamiento).Igual que la prácticade
la alquimiay la astrologíason menos complicadasque la químicao la astronomía,
respectivamente,la homeostasis también parece menos “complicada’t que la
cronobiología.Sin embargo,si la fisiología se debeestudiaren su propio margende
variaciones,la cronobiologíaes la única alternativa ala homeostasis;al principio la
cronobiologíanecesitadeterminacionesfrecuentesy densasdurantelargosperiodos
detiempo,parair conociendolas diferentesetapasde cada componentedel cronoma
y creandounosmapasguía; unavez que disponemosde estosmapas,unaspocaso
bien muestrasaisladas,puedenserlocalizadasen el tiempo einterpretadasa la luz de
los cronodesinoso intervalosde referenciaespecíficosenel tiempo (figura1).
13
.
Figura 1 CRONODESMO
LímiteSuperior
¡.~-anJ Datos
Déficit—
4 —w
rr
Tiempo
Figura 1
4.’
LímiteVNinterior
14
La terminologíacronobioló2icapuedeinclusoparecerextrañay complicadaal
principio, pero cadanueva cienciadebe desarrollarsuspropiosconceptosy métodos.
Con el tiempo, el contactocon los métodosanalíticos cronobiológicosy su uso, estos
términossevuelvenfamiliares.Originalmente,los métodosde determinación parael
estudiode unperiodocircadianose realizabana manoy setardabameseso años.En
la actualidadlos mismos análisisse realizanen segundoso comomucho enminutos,
graciasal uso de los ordenadores.
Los métodoscronobiológicosnos permitenevitar o reducirel riesgode error,
o de falsa información,que los métodosempleadoshastaahora no puedenevitar,
incluso fuera del margenfisiológico. Estosmétodosactuales,nos limitan a mediase
índices de dispersiónque no estánligados al tiempo, algunas veces hay errores
estándarmuy grandes y aún así se acepta un amplio margen normal. La
cronofisiologíaprimeramentereducela extensióndel intervaloquesecorrespondecon
el “margen normal”aceptable,y posteriormenteresuelve unos nuevosparámetros
dinámicosde las variacionesfisiológicas en el tiempo, es decir los ritmos (Halberg,
1979). De estemodo, no sólo predice cuándovan a ocurrir aproximadamentelos
valoresmásaltoso los másbajos, en un determinadodía, sino también,cuándovan
a ocurrir en una semanao año.
El riesgode elevaciónde unparámetropuedeser detectadopreviamentea la
apariciónde la enfermedad, controlandola alteraciónqueseproduceendeterminados
ritmos marcadores(Halberg, 1974). La cronofisiologíaofrece la oportunidad deun
tratamientopreventivoa tiempo (Halberg,1975>,a la edadadecuada,que puedeser
optimizadomediantemediciones adicionalescon nuevosdiseñosfarmacológicos,p.e.,
a lo largo de escalas circadianaso circaseptanas.La prevenciónde enfermedades
cardiológicas,endocrinasy oncológicas,hasta ahoraimposiblesde alcanzar,continúa
siendoun retoparala investigación,aunquealgunasde lasventajasde la cronoterapia
de cáncer hansido ya descritaspor Halbergy Cornélissen(1992).
15
VARIACIONES CIRCADIANASDEL CORTISOL
Pincuset aL(1948) describieroncambios de granmagnitud en la excreción
urinariadel 17-oxoesteroidey enel recuentode los linfocitos sanguíneos,como una
característicaexógena,esdecir, comorespuesta alos cambiosde la vida diaria. En
contraste, Halberg,basándose enestudios previos de muestreo serialmente
dependiente(Halberg y Visscher, 1950), así como en muestreo serialmente
independiente(Halbergy Visscher,1952; Halberget aL, 1951),presentóy documentó
el ciclo circadianoadrenocorticalcomo una entidad endógena,que presentacurso
libre, al producirunaenucleaciónbilateraldel nervio óptico en los ratones(Halberg,
1959, 1969;Halberget aL, 1954, 1959),pero sincronizadopor un cicloquealternala
luz con la oscuridad.
La ACTH es sintetizada deforma circadianaen la adenohipófisisa partir de
la proopiomelacortína,la síntesis de esta en las células cromafines de la
adenohipófisisestá bajoel control de el CRH hipotalámico,que essecretadotambién
con un ritmo circadiano.Esta secreción circadianano es debida al descensodel
cortisol plasmático,sino quees intrínsecaa] hipotálamo eindependientedel control
por funcionalidad negativa de los glucocorticoides (López-Calderón,1992). En
humanos se havistoqueel ritmo circadianodela ACTH persisteen situacionescomo
una estancia prolongada enla cama, ayunoy en la privación del sueñodurante2-3
días(Delgado,1992).
En los roedores la producción y/o liberación de los corticoides está
sincronizada porel ciclo de luz (L) y oscuridad(O), que alternan,por ejemplo, a
intervalos de 12 horas (LO 12:12), pero en las personasla rutina social es el
sincronizador,en el que estáincluido el encendidoy apagadode la luz, en funciónde
un despertador. Perola corteza suprarrenalsecretaglucocorticoidesen respuesta a
unagran variedad deestímulosestresantes; larespuestaal estrésse produce porla
activación de la secreciónhipotalámica de CRH, ADH y otras hormonas que
estimularánla secreciónhipofisariade ACTH.
16
¿Se puededemostrarel ritmo circadianodelcortisol plasmáticode los conejos,
en diferentes ciclos de 24 horas de luz y oscuridad?.Si la contestaciónfuese
afirmativa, mediante la estimaciónde sus característicasrítmicas, ¿seríaposible
explorar la influencia de la duraciónde la fotofracción(periodo de luz) diaria del
ciclo de24 horasde luz-oscuridad,enla variacióncircadianadelcortisol plasmático?.
Parapoderresolverestasdos preguntasseplanteóinvestigardosgruposdeconejos,
algunosde los cualessólo fueronmanejadosunavez parala extracciónde sangre,
mientras quelos otrosestabansujetosa cinco recogidasde sangre dela oreja,durante
24 horas. En relación al diseño experimentalde este estudio, fue interesante
determinar en qué medidael manejode los animales,durantela recogidade sangre
(sólo un pinchazo en la venade la oreja frente avarios pinchazos),influyó en las
característicascircadianasdelcortisol,y en relación a estacualificaciónmetodológica,
examinar el papel que juegala duración de la fotofracción respectoal ciclo
adrenocorticalbásico.
Selye, en 1936, observó que cualquier efecto estresante, (al referirnos a
estresanteno sólo nos referimos aefectos negativos,pues incluso una emoción,
aunque seapositiva puedetenerel mismo efecto) estimulael eje hipófisis-glándula
adrenal, produciéndose ACTHy el consecuenteaumentode cortisol; al conjunto de
cambios orgánicosque entran en juegocomo respuestadel organismoante estos
estímulos,Selyelo denominócomosíndromegeneralde adaptación.El cortisol actúa
a distintos nivelespuesto quecasitodaslas célulasorgánicasposeen receptorespara
glucocorticoides,por lo que éstos tienen acción en la mayoría de los tejidos del
organismo.Los glucocorticoidespresentanaccionesmetabólicas,actúan también a
nivel del sistemainmunitario,frenándolo:inhibe la liberaciónde histaminaspor las
células cebadasy los basófilos, impide la liberación de enzimas proteoliticasy
disminuye la formaciónde fibrina alrededor deláreainflamada.Se viO también que
existe sincronizaciónentre la eosinopeniacíclica, que ocurre en preparación ala
actividaddiaria, conel incrementodiario de los nivelesde hormonassuprarrenales.
(Halbergy Chaudhry,1960).
‘.7
MARCADORESDE CRECIMIENTO,CAJ3Oy C4125
Una forma de identificar el crecimiento de un tumor esmediante la
monitorización de un ritmo marcador como puedenser la a-fetoproteínao la
temperaturadel tumor. Los valoresmásaltosse corresponderán conel momentode
crecimientodel tumor y, por tanto,conel momentoen queel tumor es mássensible
a la radioterapia.Mediante la utilizaciónde estatécnicase ha conseguidodoblar el
porcentajede supervivenciaenpersonascon tumores periorales (Halberget al, 1974,
1975). Les ritmos marcadores terapéuticos puedenindicarnos,no sólo el momento
correcto dela terapia,sino tambiénnos puedendar la respuestaal tratamiento.
Sepuedenemplear,comoritmos marcadores delcrecimientode untumor, los
marcadorestumorales,queson sustanciasproducidaspor el propio tumory quenos
dan una ideasobre la actividad de ese tumor. Uno de estos incorrectamente
llamados”marcadorestumorales,el CA125, fue descritopor Basteta!, en 1981. Estos
autoresproducíanun anticuerpomonoclonal,llamado0C125,el cual reconocíaal
determinanteantigénicoCA125 de algunostumoresováricos,no mucosos.El análisis
del CA125 circulante se usa enel diagnósticoy monitorización,así como en el
pronóstico,de pacientesconenfermedadesginecológicas.
Como hemosdicho anteriormente: aesos factores se les ha llamado
“incorrectamente”marcadorestumorales,porque ensu comienzose determinaron
únicamenteen pacientes contumores, pensandoque eraexclusivode ellos. Estos
factores,CAI2S y CAI3O,no soninherentesaenfermos,sino quesepuedenencontrar
enpersonassanasasícomoen distintosanimales(vacas,conejos,ratas).Y no sóloes
propio del género femeninosino que se han localizado también en hombres.Por
tanto,estos“marcadorestumorales”deberíanserllamadosmarcadoresdecrecimiento
o de proliferación.
El CA125 presentaunos niveles elevadostambiénen condicionesbenignas
comoson en endometriosisy en inflamacionespélvicas(Eisermanny Collins, 1989;
18
Inabaet aL, 1989). En condicionesde saludtambiénsehandetectadocambiosen el
CA125 sanguíneo,como es en lagestación,durantela cual la concentración del
CA125 circulanteestá elevada (Hagaet a!, 1986; Itahashiet aL, 1988; Jacobset aL,
1988; Quirk et aL, 1988;Kobayashiet al., 1989;Jágereta!, 1990a),sobre tododurante
el parto(Touitou et aL, 1989) y tambiénen función de la menstruación(Jágeret aL,
1988). Un descensoen las concentracionesséricas del CA125 se asoció con una
amenorreainducida mediantefármacos,presumiblementeasociadacon la pérdidade
actividadhormonal porpartedel ovario (Nonogakieta!, 1991).Estosautores relatan
el hechode queexistencambios,de aproximadamente30 días(circatrigintanos),en
lasseriesdetiempodelCA 125 circulantedeunamujer, conunacurvade temperatura
quesugiereun ciclo ovulatorio.Tambiénseha detectadoCA12Sen pleura, pericardio,
peritoneoy epitelio derivadodel conducto mdlleriano(endocervical,endometrialy
tubal).
Se encontrarongrandesvariacionesdelCA12S séricoa lo largo deldía,sinque
éstosse pudiesen relacionar conun cambioen el estadodel paciente, perodebidoa
la inconsistenciay/o a los grandesniveles de error de la variación espontáneade
CA12S sérico,en pacientes con cáncer deovario, la búsquedade otro marcadorcon
un ritmo másprominenteparecióinteresante,un marcadorposiblemente relacionado
con el mecanismode coordinaciónde la producciónde CA 125 por el cuerpo, al
menosensitios diferentesdel tumor, sobre todoen organismossanos.La salivay la
orina eran unos candidatosobvios; se examinó la saliva puesto que se había
encontradoun ritmo circadianode gran amplituden el CAI2S salivarde unamujer
conun cáncerde ovario (Halberget aL, 1992; Cornélissenet al., 1992). Si el CA125
salivardeunapersonasanaexhibiesetambiénun ritmo circadiano,las características
de esteritmo en ausenciade un cáncermanifiestopodrían servir paracontrolarsu
alteración,en casode un posible riesgo, por ejemplo una elevacióndel CA125 ó
CAI3O circulante, previa al desarrollo de un cáncer. Einhorm et a! (1990),
describieronun casoen el queel CA125 séricosufrió un aumentovarios mesesantes
de la apariciónde la enfermedad.
La posibilidad de determinarel CA125 en saliva, tanto comoen suero,fue
19
demostradapor Chenet a! (1990), los cuales,además,trataronde separarpacientes
con cáncer deovario de los controles,en basea un nivel máximo de 3000U/ml en
la saliva recogidapor la mañanadespuésdel enjuaguede la boca.
Si comparamosla saliva conla sangre(plasmao suero),la primera representa
un líquido corporal accesible,que además puedeconservarsecon facilidad, que
podemos recogernosotros mismossin necesidadde ir al médicoy sin necesidadde
aparatosespeciales. Además,la saliva esun fluido a teneren cuenta,sobre todo,en
aquellospacientescon tumores que presentandisminuidassusdefensastras varias
sesionesde quimioterapia,de forma que, si se deben realizarvarias extracciones
sanguíneaspara controlarla evolución del tumor, se verían privados de las pocas
defensasque tienen. Si lo comparamoscon la orina, la saliva se almacena más
facilmente enel congeladordoméstico,por ejemplo. Por tanto, se deberíateneren
cuenta la utilización de la saliva como posibJe fluido para la determinaciónde
distintasvariables(Dawes,1974, 1974b).Katzy Shannon,(1964;1969ay b), sugirieron
el uso de la saliva en el estudiode Jashormonas,encontraronque la cantidadde
cortisol más corticosterona encontradaen la saliva era igual a la de cortisol más
corticosterona en plasma humanoy McVie et aL (1979), comprobaronque la
aldosteronaplasmática y salivar estabantotalmente correlacionados. Podemos
disponerde la metodología necesariaparaestepropósito(Walkeret aL, 1990; Wilson
et aL, 1990), y paradeterminarcronobiológicamentelos estrógenosy progesteronade
la saliva,asícomo otrosconstituyentessalivaresen el cursode los ciclos circaseptanos
y/o circatrigintanos.
El CA13Ocomoel ~Al25, normalmentedeterminadosensuero,presentanuna
mayor concentraciónen la saliva,caracterizándosepor un ritmo circadianode gran
amplitud, pero el CA13O tiene la ventaja de estar, en unos pocos casos,más
correlacionadocon el cursoclínico del cáncer.
20
PRESIONSANGUINEA YFRECUENCIA CARDIACA
William Harveydemostróla circulaciónde la sangre en1628,perono describió
la fuerza que lanzabala sangrealrededor delcuerpo. Stephen Hales(1677-1761)
midió la diferenciaentrela presión cuandoel corazónseexpande(diástole)y cuando
se contrae(sístole),él mismo relató las medicionesdirectasde la presiónsanguínea
que realizó endistintos animales, incluidos los caballos (Hales, 1733) cuando
exploraba,no la presiónsanguíneay la frecuenciacardiaca,sino susvariacionesa lo
largode la escalademinutosy segundos.Halesmidió claramentela presión sanguínea
mediay describiópequeñasoscilacionessincronizadasconlos latidosdelcorazón,las
cuales estabansuperpuestasa unas oscilacionesmenores, relacionadas con la
respiración.
La variabilidad de la presiónsanguínea humana,a lo largo de una escalade
24 horas,fue descrita porZadeken 1881, y posteriormente,distintos autorescitaron
estavariabilidad (Howell, 1897; Hill, 1898; Colombo, 1899; Brush y Fayerweather,
1901 y Janeway,1904, por citar algunospioneros). Janeway considerólos efectosde
algunos factorescomolasemociones,el ejercicio,la dieta, las horasdesueñoe incluso
los efectosde la presiónatmosférica.De acuerdocon éstosescribió: “En los casos
diariosy haciendo referenciaespecialmentea los efectosdel tratamientoen la presión
sanguínea,las determinacionesse debenhacer todasa las mismashoras’. En 1904
escribió:“Todo el mundo admitela importanciadeesto(variabilidada lo largo de las
24 horas)al estudiarel cursode la temperaturadurantelasenfermedades”.La presión
arterialno esmenosimportante. Corroboradoposteriormente,medianteel empleodel
método cosenor porHalberg, en 1970, y más tarde estudiado en profundidad por
Halberg(1991)y por Cornélissen(1992).
Tambiénexistedocumentaciónacercade las variaciones,deaproximadamente
un añoo circanuales,de la presiónsanguíneahumana(Schneidery Costiloe,1972) y
suvariaciónconla edad(Halberg,1970; Halberget aL, 1972; Levine y Halberg.,1972;
Bartter et aL, 1976; Sotherny Halberg, 1986), documentadasen partemedianteun
21
muestreolongitudinal en la mismapersona.
Con la disponibilidad actualde nuevos instrumentospararegistrarla presión
sanguíneay la frecuenciacardiaca,tanto en medicinahumanacomoveterinaria,así
como por los análisis cronobiológicos,se deben aplicarlos conceptosde la
cronobiología;enfocadosno sólamente aíndicesestadísticos, sinoa los dinámicosde
la presiónsanguíneaen la prácticadiaria.Por ejemplo,podemoscitar que en unperfil
cardiovascularde 24 horas,bajo unascondicionesdecontrolclínico totales,la presión
diastólicamayor, normalmenteexcedea la presiónsistólicamenor, incluso después
de eliminar algunosvaloresque podíanparecererrores instrumentales.
Actualmente,disponemosdel materialnecesarioparadeterminar lavariación
circadianaasí como otroscomponentes,por tanto mediante lacombinaciónde un
moderno“software” y “hardware”,los parámetrosde las variaciones circadianaspueden
ser determinadosy aprovechados.
22
DISEÑO EXPERIMENTAL
La mayoría de los clínicos y de los investigadores involucradosen
investigacionesbiológicas estándándosecuenta, ahora,quelos sistemasbiológicos
tienen una estructuratemporal,en la cualbastantes,si no todas,lasvariablesexhiben
fenómenososcilatorios;estos cambios son los ritmos biológicos. Dentro deestos
ritmos, el quemayor atenciónha suscitadoes el ritmo circadiano(Halberg,1959>, y
para determinarestasbioperiodicidadescircadianasy otras, comolas circaseptanas,
circatrigintanaso circanualesdebemostenerun diseñoexperimentalespecífico.
El diseño experimentalde la investigación va a determinarque los datos
recogidostengano no utilidad, únicamentela tendránsi se recogen enfunción del
tiempo. Debe estarbasadoen algún conocimientode la estructuratemporaldel
animal en general,y en la bioperiodicidadqueva a ser estudiadaenparticular. Un
diseñoexperimental,queenvuelvefuncionesquecambiancon el tiempo,debe estar
basadoen unos sólidos conocimientoscronobiológicos.La información estadística
obtenidade los diseñosexperimentales,puedeser evaluaday cuantificadamediante
ritmometriaestadística;ésta debecompensaral menos paraalgún tipo de valores
inusuales,separandola informacióndel ruido. Perola ritmometriano esun sustituto,
comotal, de datos recogidosde forma inadecuada.
En los estudioscon un sólo animal o bien en el de poblaciones,el muestreo
cronobiológicose debellevar a cabobajo condicionesestandarizadas,como son los
ciclos de luz-oscuridad,la horade las comidas,la temperaturay la humedad relativa
del aire, de la habitacióny el manejodel animal,el cual es una variable importante
a teneren cuentacuandoseestudianalgunasvariablesrelacionadascon el estrés(p.e.,
cortisol).
Cuandose trabajaen investigacionesexperimentales,los animalesdeben estar
estandarizadosal menosdurantelasdos semanaspreviasal estudio,en unciclo deluz
artificial, en el que sealternenlas horasde luz y las de oscuridad,con un horario
23
“aceptable” para el organismoen estudio y que se encuentre reconocidocomo
sincronizadorparadeterminadasespeciesy condiciones.El ciclo puedeconsistiren 12
horas de luz alternandocon 12 horas de oscuridad(LO 12:12), o un ciclo de luz
diferente de acuerdo conel propósito deseado;por ejemplo, en experimentaciones
sobrereproducción emplearíamosel ciclo 14:10,Silvánet aL (1990),puesesconel que
se obtienen mejores resultados.Se sabe que, bajo determinadosciclos de luz-
oscuridad,el ciclo circadianode algunashormonas cambia.
El ciclo de luzelegidodebe estarclaramente indicadoencualquier estudio,así
comoel momentoen que se enciendey seapagala luz, y tambiénel momentoexacto
en quese recogenlas muestraso se administranlos fármacos.
Unaexperimentaciónllevadaa caboa una determinadahora,puededefinirse
por su relación con el ciclo de luz-oscuridad(LO). Las cuatro referenciasde luz-
oscuridadson: HALO que significa horasdespuésde encenderla luz (Hours After
Light Onset),HAML: horas despuésde la mitad del intervalo de luz (Hours ASter
Mid Light), HADO: horasdespuésdel comienzode la oscuridad(Hours ASterDark
Onset)y HAMD: horasdespuésde la mitad del intervalo de oscuridad (Hours After
Mid Dark). Porejemplo:bajo un régimende LO 14:10 con luz desdelas 08:00hasta
las 20:00horas,se recogieron muestrasa las 2, 6, 10, 14, 18 y 22 HAMD.
Si realizamosla experimentación tomandoel ciclo luz-oscuridadcomotiempo
dereferencia,en lugar de tomarla medianoche,podremosahorrartiempo y espacio;
por ejemplo,tenemos6 lotesde animalesen los cualesqueremos determinar,cuál es
el momentoóptimo de utilización de un fármaco. Medianteel empleode un diseño
experimentalcronobiológico(Halbergy Halberg, 1980), en el cual hemos tomado
como tiempo de referencia HALO (horas después de encender la luz),
administraremosel fármaco alo largo de las 24 horas del díay a intervalosiguales
(p.e.,cada4 horas),el primerlote lo recibiría, 2 horasdespuésde encenderla luz, es
decir 2 HALO, el lote 2: 6 HALO, el lote 3: 10 HALO, el lote 4:14 HALO, el lote
5:18 HALO y el último lote (6): 22 HALO, esdecir 22 horasdespuésde encender
la luz.
24
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25
En lugarde tenerque establecerturnos parala administracióndel fármaco
a lo largo de todo el día, los lotes deanimalessepodríandistribuir en 2 habitaciones,
1 y II, conel mismo ciclo de luz-oscuridadpor ejemploLO 08:16; la diferencia estaría
en que enla habitación1, la luz se encendería alas 07:00y seapagaríaa las 15:00y
en la habitaciónII, la luz seencendería alas 20:00y se apagaría alas 4:00. Los lotes
1, 2 y 3 sealojarían en lahabitación1 y los lotes4, 5 y 6 en la habitación II.Mediante
estediseñoel trabajo (recogidade muestraso administraciónde fármacos)quedará
reducido (condensado)a 3 momentosescasosdel día. El lote 1 y el lote 4 se
sangrarán a las09:00y a las 10:00 horas,los lotes2 y 5 a las 13:00y 14:00horas,y los
lotes3 y 6 a las 17:00y 19:00 horas (figura 2).
Los resultados anteriores podríanreferirse también,a HAML, HADO 6
HAMD.
El modelose podríacomplicarcon máshabitaciones einclusocon diferentes
ciclos de luz-oscuridad, emplearíamos mayor número de animales pero
minimizaríamosel trabajo.
El mesy el año delestudiodeben estarindicados,puesto quelasvariaciones
circatrigintanasy circanualespueden caracterizarel MESORy la acrofasede una
función circadiana (Haus y Halberg, 1970), también sedeberíanespecificar la
localizacióndonde se ha realizadoel estudio.Se deben evitarlas interrupcionese
interferencias conlosanimalesantesy duranteel estudioexperimentalcronobiológico,
comopuedenser lastemperaturasextremas;asícomocualquier variacióno disturbio
en la habitaciónde experimentación.
El horariode alimentaciónde los animalesdebede detallarseen cadaestudio
(art libitum, sin comida, sin aguao con restricciónde comida); sobre todocuandose
estánllevandoa caboestudiossobrelos efectosde algún fármacopuestoque, como
essabido, algunosfenómenosbioperiódicos, comolosciclos desensibilidad-resistencia,
puedenpresentarunaacrofaseen movimiento debidoal momentode la ingestiónde
la comida.
26
Estas referenciasbiológicas indican algunos aspectosde la sincronización
animal y puedenser críticas,sobre todosi se limita el muestreo a una sólatoma o a
únicamente unascuantas.Otras funcionesde referenciaposibles,que debenser
consideradascomoritmos marcadores en eldominio circadiano,son: la temperatura
corporal, los electrolitossalivares(sobretodo sodioy potasio),el volumenurinarioy
los corticosteroides,aunquecualquierotra variable puedeservir como una posible
funciónde referencia.Preferentemente, se debe medir longitudinalmente aintervalos
frecuentesy ser determinadamediantemétodosno invasivos,si bien las variables que
se puedan determinarautomáticamentey detectar de forma fácil son las más
atractivas, comola telemetríade la temperaturacorporal,de la frecuencia cardiaca
o de la presiónsanguínea.
Cada díase está mejorandola tecnologíapara la recogida automática de
muestras y su transferencia directa al ordenador para analizarías mediante
ritmometría. El uso de este muestreo automático se hacenecesariopara evitar
interferenciascon los animalesque esténenvueltosen Ja experimentación(Halberg
et aL, 1971; Rungeet a!, 1974; Smith et a!, 1978). Cuandono se disponede esta
instrumentaciónpara realizar unarecogidade datosautomática,se puede utilizar
como ritmos marcadoreslas medicionesmanualesde algunas de las funciones
corporales de los animales en estudio y posteriormenteaplicar los métodos
cronobiológicos.
Las necesidadesde un muestreocorrectoson considerablemente importantes
parademostrarun ritmo de periododesconocido,especialmentesi no se cuentacon
él. La búsquedade bioperiodicidadesdesconocidaspuede estarapoyadapor el
conocimientode ritmosambientales(comoel ciclo de luz-oscuridad)que rodeanesas
bioperiodicidadesy quesirve desincronizadorde los ritmosbiológicos;perotambién
debemosteneren cuenta en quémedidala interferencia queejerceel investigador,
o el diseño delestudio,o sunaturaleza,nos conducena unabioperiodicidadde curso
libre, de esesupuestosincronizador.
La longituddel periodode observaciónquese necesita,dependede la región
27
espectral (circadiano,circaseptano,etc.) y de las característicasdel ritmo queseva a
estudiar.Unade laseleccionespuedeserel seguimientode un sóloanimal alo largo
deun espaciode tiempo (a lo largo de variosperiodosdel ritmo, p. e., el efectode
los fármacosen el tiempo) o también llamadosestudios longitudinales. Varios
animalesque exhibenel mismo ritmo puedenser estudiadosa través de un sólo
periodo ode variosperiodos en undiseñotransverso,o bienun númerodefinido de
animalespuedenser seguidos a travesde varios periodos enun diseñohíbrido o
mixto (Halberg, 1964).
El intervaloentreobservacionesconsecutivasdebeser lo suficientementecorto
para obtenerun resultadosegurodel ritmo queva a ser estudiado,y paraevitar el
bioaliasing(Engeli y Halberg, 1964; Bunning, 1973; I-lalberget aL, 1977) por alguna
componente de altafrecuencia,figura 3. Para evitarestebioaliasingel muestreo debe
de hacerse aintervalos lo suficientementecortospara resolver algunosritmos con
relativasaltasfrecuencias,y duranteun periodode tiempo lo suficientementelargo,
paraobteneralgunosde los componentesdealtafrecuencia.La obtencióndemuestras
durante largos periodos detiempo son de crucial importancia, con el uso del
registrador automáticoseevitan las limitacionesqueexistíanen la recogidade datos
y posteriormentese reduciráel costede los estudioscronobiológicos.En algunos
análisis (p.e., químicos) las muestrashan de elegirseoportunamente, más que por
conveniencia.
En Españasabemosque unainvestigacióncronobiológicaa nivel de campo,
hoyen día esmuy complicada,puesto quenó le podemos deciral ganadero que recoja
sangrede susanimalescada4 horaso quese levantea las 3 de la mañanaa recoger
una muestrao bien quele administrela comidaadeterminadahora,aunque conesto,
el animal aumenteel índice de transformación(Sundarajy Halberg, 1982). Los
diseños cronobiológicospueden mejorarla interpretación delos resultados,por
ejemplocuandomedimosuna variablefisiológica, como la presiónsanguíneao el
cortisol, amboscaracterizadospor unagran amplitud circadiana,si ignoramosesta
estructuratemporal, tomandolas muestrassin especificacióndel tiempo,p. e., desde
las 09:00hastalas 17:00 horas (suelenser lashorasde consulta,sin detallarla hora
28
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exacta),ésto nos conduciráa unos valores mediosque estánasociadosa un gran
indice de dispersión,ya que la mayor parte del margende variación predecible
asumido por la variable fisiológica está cubierto por elintervalo de observación
(figura 4). Si se tomanmuestrasaisladasde la mismavariable eignoramoslos tiempos
del muestreo,nuncanos daremoscuentade que, respectode la referenciaestándar
de un individuo, el mismo valor será unasvecesmuy alto, en unmomentodado,y
muy bajo, en otro, pero perfectamente aceptableen algunos momentos.
Es cierto que laelecciónde dos tiemposde recogidade muestras,justo antes
de que se produzcael máximo y el mínimo (figura 5, superior),asumidospor las
variables rítmicas, es óptimo únicamente enel caso de que conozcamos
aproximadamentecuandose van aproduciréstos.Perosi lasdosmuestras serecogen,
sin darnoscuenta,en los puntosde inflexión de lascurvas, noseencontraráninguna
diferenciay seobtendría unaconclusiónerrónea(figura 5, inferior). Perosi después
de un diseño inicialde 6 puntos,se eligendos momentosde obtenciónde muestras,
se obtendránresultadoscoincidentescon el empleo de seis puntos (Halbergy
Visscher, 1950; Cavallini et aL, 1987; Blank et aL, 1992), aunqueel uso de estosdos
momentosde muestreo a priori sedesaconsejantotalmente.
La consideración,en el diseño,de un tercermomentode recogidademuestras
nosdael puntode estimaciónde las característicasde los ritmos (figura6, superior).
Consólotresmomentosde recogidade muestras,podemosestimarlascaracterísticas
de un ritmo, pero no son suficientespara realizarpruebasde hipótesiso estimar
límitesdeconfianza.De cinco a ochomomentosderecogidademuestrasdistribuidos
de forma equidistante alo largode unciclo, constituyendetalladosy potentesdiseños
(Hilíman et aL, 1990; Binghamet aL, 1992) que permitenla realización,tanto de la
detecciónde un ritmo, comola estimaciónde parámetroscon una ciertamedidade
incertidumbre(figura 6, inferior).
Lo mencionadoanteriormente,en cuanto a la toma de muestraspara la
detección debioperiodicidades,puedeaplicarsetambién a la valoracióndel efectode
un fármaco,desdeel momentoen quepodemoshacercorresponderlos máximosy
30
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32
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Tiempo (horas de reloj)
Figura 6
¡ 1
6J
5-
Variable
Q,nidades a%bitrariasl
4
3-
o
33
mínimoscon un efecto deseadoy un efectono deseadoen la acciónde esefármaco
y, asignandolos anteriores puntos derecogidademuestras,al control delmismo en
distintosmomentosdel díay a diferentesanimales,puesto que adosis igualesde un
fármaco, éste producirá efectos diferentes dependiendo del momento de
administración.Por ejemplo, en caso de querer conocercuál es la mejor hora de
administraciónde un fármacoquedisminuyela frecuencia cardiaca,inocularíamosa
cada animalla mismadosispero adistintashoras,obteniendo avecesunarespuesta
circadiana,correspondiéndoseel efectopositivo del fármacocon el mínimo de la
curva y el efecto negativocon el máximo de la misma, al no disminuir la presión
sanguíneasino aumentarla.
En cronobiologia,la elecciónde los procedimientosde recogida demuestras
constituye una importante consideraciónen el diseño experimental.Cualquier
interferencia conel animal, debido a las técnicasempleadaspara realizar las
medicionesde undeterminado parámetro,puedenconducirnosacambiospuramente
artificialesde la funciónestudiada,Un aspectomuy importantede las reaccionesque
se producen, debido alos transtornosdel sangrado,es la observaciónde los ciclos
circadianosde susceptibilidady resistencia,no sólo antenumerososagentesfísicosy
químicos, nocivos y tóxicos, sino a simples procedimientoscomo el manejo, las
medicionesde temperaturarectalo inoculacionesde sueros salinos(Smolenskyeta!,
1978). Este problemase vuelve incluso máscomplejo, si se deben hacer varias
determinaciones enel mismo animal (muestreo serialmentedependiente).Parece
deseable utilizar cadaanimal,sólo unavez en cadatomade muestra,si el procesode
obtenciónde muestrasproduceinterferenciascon el sujeto estudiado, (muestreo
serialmenteindependiente).Esto requierela disponibilidadde un adecuadonúmero
de animales comparablesensexo,edad, antecedentesgenéticosy pasadohistórico,lo
que es másfácil cada día endeterminadasespeciesanimales,debido ala mayor
disposicióndeestirpesconsanguíneas; pero,endeterminadosestudios,se puede evitar
al sustituirel estrésve produce larecogidade muestrassanguíneas,por el uso de
otros fluidos biológicos como son la saliva o la orina. Por todo lo citado
anteriormente,en la experienciaanimal el estudio del diseñocronobiológicoes
esencialparauna buena prácticade laboratorio.
34
Todaestainformacióncronobiológica,disponibleen la actualidad,indica que
los diseñoscronobiológicosse hanvuelto requisitospreviosesencialesen el estudio
de tejidoscelularesde sujetos,asícomoen los estudiosdepoblaciones.A la estructura
del organismo,en el espacio,hay que añadirleLa estructuraen el tiempo,a la cual
llevamoshaciendoreferenciadesdeel principiode estetrabajo; aunque tan importante
escuándoocurre unfenómenobiológico, comodónde,~rnq y por qué,puntos que
tendremos queteneren cuenta ala hora del diseñoe interpretaciónde los resultados
obtenidos.
Los cronodesmoso valoresde referenciaen el tiempo son muy útiles cuando
definimos la normalidady la salud, si medimosla presiónsanguíneaen unapersona
a las 08:00de la mañana, será másbaja que si la medimospor la tarde, estos dos
valores están dentro del margende la normalidad y están dentro delos límites
referidosen los cronodesmos,pero paraun investigadorqueno seacronobiólogo,el
valordeterminadoa las 20:00horasestarádentrodel margende la hipertensión.Las
alteracionesde la estructuratemporal de un organismopodrían ser una señal
tempranadealguna posibledisfunción,anterioral desarrollode unaenfermedad;p.e.
si registramos,mediante telemetría, la temperaturacorporal en una vaca, una
elevaciónde lamismapodríaserun signo tempranode infección-mastitis-,(Lefcourt,
1983, 1990).
De igual importanciapara laobtenciónde unosresultadoscon sentido,es el
poderfamiliarizarsecon la metodologíade las investigaciones cronobiológicasy con
las necesidadesde unmuestreo para cadamargende frecuenciasestudiadas (Halberg
y Panofsky, 1961; Panofskyy Halberg, 1961; Halberget aL, 1964).Finalmente,los
datos obtenidos debenser analizadospor métodos de deducción estadísticade
ritmometriacuantitativa;estonospermitiráresolverla complejay dinámicaestructura
temporal de los animalesy nos conduciráhacia unos resultadosfinales (puntose
intervalos)para quelos parámetrosde los ritmos puedanser estudiados.
Al hablar delcostede los diseñosexperimentalescronobiológicos,la mayoría
de las personas tiene unconceptoerróneode ellos. Actualmente,el coste de un
35
estudiocronobiológicoes decididamentemenorque el delos diseñostradicionales.
Son más baratos porqueson muchomásefectivos,proveenmuchamásinformación
y en el caso de control de fármacos,por ejemplo, nos permiten conocerel efecto
opuesto endiferentes tiemposo bien nos permitenconocerla forma de mejorarun
efectodeseado.Tambiénnospuedellevara reducir latoxicidad: los tratamientoscon
quimioterápicosno se emplearíanen determinadosmomentosparaevitar el efecto
tóxico. La quimioterapiaadministrada en pacientes con cáncer se realiza, enla
actualidad,continuamentedurante24 horas,duranteesteperiodola quimioterapia
actúa‘matando”célulastumorales,pero tambiéncélulas sanas,comosonlos linfocitos
o las células de la médula ósea, dejando al paciente,muchasveces, en peores
condiciones.Medianteel control de los momentosde crecimientodel tumor,y con e]
uso de ritmos marcadores(como la temperaturaen tumoresaccesibleso los
marcadores tumoralesen los no accesibles),se trataríacon quimioterapia únicamente
en los momentosde crecimiento del tumor. Por tanto, el elevado coste de los
experimentoscronobiológicosesunconceptoerróneo, puesto quetodo lo que se haga
sin especificaciónde tiempo,se deberepetira diferentes tiempos.
El poderdelos cálculosanalíticosusadosen el métodocosenorrevela quecon
tan sólo 8 sujetosestudiados,en 6 momentosequidistantes delritmo, son suficientes
paradeterminarlas característicasde eseritmo cuandoJa relación señal-midoes 2
ó mayor, con un80% de poder, aproximadamente(Cornélissenet a!, 1992). Para
traducirestosresultadosacoste,el métodocronobiológicopropone tomarel número
inicial del tamañode la muestra,perodistribuyendocadasujetoen diferentestiempos.
La experiencia de varios autores y la simulación de análisis, sugieren que
aproximadamente6 momentosde recogida de muestras,distribuidos de forma
equidistante alo largo de un ciclo del ritmo investigado, nos conducirán ala
obtenciónde buenosresultados.Por tanto,comohemosvisto, el métodocosenorde
losdiseñoscronobiológicospresentadiferentes ventajas,comoson la necesidadde un
menor número deanimales, y un mayor poder que los métodos estadísticos
convencionales(Binghamet a!, 1992), y a la largaun menorcoste,puesto queno se
necesitaran posteriores repeticiones adiferenteshorascuandose realicenpruebasde
control.
36
ANALISIS DE DATOS EN CRONORIOLOGLA
La aplicación de la cronobiología, dependeráfundamentalmentede la
evaluación cuantitativade los datosrecolectadosenfunción del tiempo,mediantelos
métodosritmométricosy el empleode unabuenabasede datos.
Pasamosadescribiracontinuaciónlos diferentes métodos analíticos empleados
en cronobiología,parapoderllevar a caboestudioscronobiológicoscorrectos.
La dificultadde interpretarlos datos,deunaformapuramenteglobal,sedebe
al hecho de que el clásico pensamiento dela homeostasiaestá enfocado
exclusivamente,en índicesmediosde localizacióno dispersiónde datos,sin ninguna
consideraciónexplícita,dealgunade lasdiferenciasque puedenexistiren ladinámica
de dos grupos,quepresentenmediasy desviacionesestándarsimilares, cuandono
idénticas(Halberget aL, 1990).
La cronobiologíano sólo añadeun enfoque a ladimensiónde la variabilidad,
sino que,en vez de dejar éstasin resolver, los investigadoresque se ocupan del
estudio de la cronobiometríadividen el margen normal, obteniendoasí nuevos
parámetrosque proporcionanun métodode reducciónde datos,obteniendo mucha
másinformación de la que seobtienecon el margennormal,al igual quelos físicos
dividieronel átomo,que unavez secreyóindivisible (comoestáimplícito enel origen
de su nombre).El análisis de los ritmos, podría ser equiparadoa la fisión por la
obtencióndegrandesbeneficios:uno porla producciónde estosnuevosparámetros
y el otro por la produciónde grandescantidadesde energía.
Volviendo a laanalogíaanterior, lafusióndepartículas produceinclusomucha
más energía quela fisión; igualmenteel estudio de las relacionesentre ritmos,
equivalente ala fusión, proveede unainformación adicionalen unaaproximación
integrativa,pararelacionarlas característicasentreunosritmos y otros,y con las de
otros resultadosclínicos.
37
La detección deun componentedado requiere,al menos, reunir los datosy
calcularla media; pudiéndose detectarentoncesel efecto deltiempo,pero aúnexiste
la necesidad adicionalde una reducción temporalde los datos,en parámetroscon
plenosignificado, ellorequiere herramientas’especiales,comoes unordenadorcon
el adecuado“software”, al igual quesenecesitaninstrumentosespecialespara‘ver’ las
frecuenciasde las ondaselectromagnéticasque estánfueradelmargenvisible, u otro
tipo de ondascomolas de radioo rayosX.
A simple vista se pueden observarmuchascosas,pero no todas.La vista no
puedereemplazaral microscopioparaobservarla célula, de la misma formaqueno
se puedenreemplazarlos ordenadores paracuantificarun ritmo.
La alternativacronobiológicaconsisteenobtenermedicionesen serie deforma
sistemática(antesde cualquierestudioo diagnosis)y analizarestasseriesde datos
para determinarlos parámetrospredeciblesde las variacionesde los mismos. Los
procedimientosy estudioscronobiológicosson necesariospara reducir a simples
términosla esenciade algunosdatoscomplejos.
Los datospueden parecerirregularesy, comodijimos al principio, puedenno
ser cuantificadosa simplevista, pero estose solucionafácilmente conel uso de los
ordenadores.Una primera aproximaciónes la resoluciónde un ritmo circadiano,
medianteel empleodel métodocosenor,lo queimplica ajustarunacurvacosenode
24 horas a los datos,a través del método de los mínimos cuadrados.Se obtienen
entoncesestimacionesdelMESOR,mediaajustadaal ritmo,de laamplitudy acrofase
circadianos,que son medidasde la duracióny momentodel cambioquese produce
enel díay que es predecible.Estascaracterísticasde los ritmosestánilustradas enla
figura 7, junto con el periodo,duración de un ciclo completo,obtenido mediante
métodosde cronobiometría(Halberg, 1980) con estimaciónde un error. El método
cosenor se explicará posteriormentecon mayor precisión, al igual que las
característicasde los ritmos quede él sededucen.
38
4
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Tiempo dereferencia
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MESOR/~
funcióny\/’ritmica
AMPLITUD R
DOBLE AMPLITUD
ACROFASEFunciónrítmica
Figura7
39
Siempreesdeseablecuantificarla dinámicade cualquiercambio,mediantela
estimación de la extensióny el momento de ese cambio, ambos determinados
medianteel métodocosenorcomoparámetrosde los ritmos. Halberg,en 1969, dijo
que la cronobiologíasirve para evitarerrores,cuantificarnuevosparámetrosy para
decidirlos momentos oportunosde los muestreos,bien mediante latomademuestras
aisladaso bien medianteseriesde datos(Halberg, 1969; Halberg, 1980).
La aplicación de la cronobiologíay sus conceptosa la medicina humanay
veterinaria, depende fundamentalmentede una evaluacióncuantitativa delos datos
recogidosen funcióndel tiempo.Sólo sepodráobteneruna información cuantitativa
de los ritmos si disponemosde unabasede datosadecuada,y si las seriesde datos
biológicas,normalmentecontaminadas,seanalizanmediantemétodosde ritmometría,
estadísticamentededucible,que también separanel ritmo del mido.Estos métodos
hansidodesarrolladosy mejorados comotécnicasrutinariasdeordenadordurantelas
pasadasdécadas(Panofskyy Halberg, 1961; l-lalbergy Panofsky,1961; Halberga a!,
1965; Bunning cf aL, 1973). Partede la metodologíaritmométricabásicaha sido
incluso adaptadapara su uso con ordenadores portátilesy pequeñascalculadoras
(Cornélissenet aL, 1980).
Para queuna función fisiológica se puedaconsiderar como rítmica, el
acontecimiento,el intervalo y las secuenciasno necesitanrepetirseexactamente,
aunque deben mostraralgunaregularidadde repetición.Paraser calificadas como
ritmos, estaregularidaddebetenerun patrónidentificable, y debe mostrar quesu
ocurrenciano se debeal simpleazar.
Paradetectarbioperiodicidadesenseriesdetiempo cortas,sin tenerencuenta
el problemade los datosno equidistantes(problemacomún en muchosanálisis) se
desarrollóel modelocosenor (Halberg,1969). Estees un métodobastanteatractivo
y que hasido usado ampliamentepor su simplicidad,versatilidady la sugestiva
presentaciónde los resultadosanalíticos. El método cosenorsimple consisteen
ajustar, mediantemínimoscuadrados, unafuncióncosenoa los datos,asumiendoque
se conoceel periodo,r. El modeloes el siguiente:
40
Y (t) = M + A cos (2rt +
El ajuste de un sólo componente,p.e., 24 horas(figura 7) se caracteriza por tres
parámetros:el MESOR (M), (medialíneadel ritmo estimada estadísticamente)o
media ajustadaal ritmo; la amplitud (A), medida de la extensióndel cambio
predecible, alrededor delMESOR,en unciclo;y la acrofase(a), medida delmomento
en el que se producencasi todos los valoresmásaltos recurrentesen cadaciclo.
Cuandolos datosno son equidistantesy/o cubrensólounapartedel ciclo, el
MESOR puedeserdiferentede la mediaaritmética,y normalmenteproporcionauna
estimaciónmásexacta (menosdesviada)del valor medio asumido por la variable
rítmica. Cuandolos datosson equidistantesy cubrenun númeroenterode ciclos, el
MESOR es idéntico ala mediaaritmética, pero estáasociadonormalmente aun
error estándarmenor. Por tanto, normalmenteel MESOR es más precisoque la
media aritmética(Halberg, 1989; Cornélissenet al., 1992) (figura 8).
Si comparamosla dobleamulitud de la funciónajustada,comouna medidade
la extensióndel cambio del ritmo, estapuedeser considerablemente diferentedel
margen generalde los datos(figura 8).
El momentode los valoresmáximosno se puedecompararcon laacrofase,al
ajustar la función a los datos, la acrofase del ritmo estimada puede diferir
considerablemente,en tiempo,de unvalor extremofortuito e inifluenciable(figura 8).
La acrofasetambién puedeser definidacomoel retraso queexistedesdeun
tiempo de referenciadado,hasta que se produceel pico en el tiempo de la función
coseno ajustada alos datos; los tiempos de referenciamás usadosincluyen: la
medianochelocalparalos ritmos circadianos,el domingoparalos ritmos circaseptanos
y el 22 de diciembreprecedente alos datos recogidos,para los ritmos circanuales
(figura 9). Si empleamoslos tiemposde referenciaanteriormentecitados,la acrofase
41
VENTAJAS DE LA RITMOMETRIA
MESORvs MEDIA
AMPLITUD VS MARGEN
dobleampihud
ACROFASE (~> VS TIEMPO MAXJMO (tm)
tiempo
Figura 8
dato
e
Igualdadde áreas
MESaR
margen
(tJ
función
etiem~odetare rancia
42
Tiempo (Fechas del calendario)00:00D¡cn
1•00:00
Domingo240
160
80
a
00:00
Erie Feb Mar Abr Mayiunjul AgoSep CtA f4ov Dic Dic 22U U U U ¡¡ ¡ U U U ¡
Dom Lun Mar tAle Jue Vie SÉ 00:00Dom¡ngo
Tiempo <Horas de reloj>
Figura 9
00:00 06:00 12:00 18:00 00:00 06:00 12:00
43
recibeel nombre deacrofasecomputativa.Otro tiempodereferenciapuedeseralgún
puntoenel ciclo ambientalsincronizante(ciclo LO), por ejemplo,el punto mediodel
intervalo de luz (HAML) en el casode los ritmos circadianos(Halberga al., 1958;
Halbergcf aL, t959). Cuandoesésta lareferenciaseleccionada,la acrofaserecibeel
nombre deacrofase externa.Otra fasede referencia,usada frecuentemente, puedeser
un punto de otro ritmo con la mismafrecuenciadel ritmo que estamosinvestigando
y en el mismo sistemabiológico,por ejemplo,la acrofasedel ritmo circadianode los
linfocitos circulantespuedeser elegidacomofase dereferenciay conésta,la acrofase
seráacrofaseinterna(figura 10).
La acrofasese puede expresar en grados negativos, igualando 3600 a la
extensióndel periodo,o en unidades detiempo(minutos,horas,días,meses,etc.),por
ello, cuanto mástardeocurra laacrofaseenun ciclo, más negativaserá. Laacrofase
varia en el sentidode las agujasdel reloj desde~0O a ~360o.Debemos remarcar,que
la acrofasees el pico de la curvacosenoque másseaproximaa los datosy no tiene
que correspondersecon el valor más altode la serie temporal.
El MESOR y la amplitud se expresanen las unidadesen las que se está
trabajando. Comolos valoresde la amplitud representan, porconvenio,sólo la mitad
de la medidatotal de la curvacoseno,y comoésteno alcanza necesariamenteel pico
de los valores medidos, la amplitud no siempre representaun gran cambio.
Frecuentementees de gran utilidad expresarel cambio relativo predecibleen los
datos,como porcentajede cambio (A/M).
Junto conlos parámetrosestimadosdel M, A y q, el método cosenor
proporciona también intervalos estimadospara los parámetrosde los ritmos.
Asumiendovarias hipótesis y tras deducciones estadísticas,la F estadísticaque se
obtiene puedeser usadaparadeducir unaregión de confianzaelípticaparala A y la
‘p, en el caso de que los datos se representende forma polar (figura 11). Esta F
estadísticatambiénpuede usarsepara comprobarla hipótesis nula,H0: A = 0. Si se
rechaza estahipótesis,en un determinadonivel de probabilidada (p.e., 0,05), se
puedeasumirquelas fluctuacionesde los datosno son debidasal azar,sino cíclicas
44
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45
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REPRESENTACION POLAR DE LOS PARAMETROSDE LOS RITMOS ESTIMADOS (A,*>
JUNTO CON LA REGION DE CONFIANZA
Figura 11
46
C 4 8 oS
con un periodo i, proporcionando entonces una validez estadística a las
bioperiodicidades.Otra medida de la dominancia de una bioperiodicidad es el
porcentaje delritmo, estoes la proporciónde la variabilidad total de los datosen las
seriesde losmismos,quesonatribuiblesa la curvacosenousadaparadescribirritmos.
Despuésde recogerlos datos en función del tiempo, el método cosenor
(Halberg, 1969) se puede usarajustandomedianteel método de los mínimos
cuadradosunafunción periódica alos datos,de forma queunao varias funciones
coseno tenganperiodosanticipadosa los datosrecogidos.En la mayoríade los casos,
los periodosse conocendebido a unainformación biológicaanterior, comoson los
componentesdel cronoma, este asumenormalmenteuna periodicidadparejaen
frecuencia a la delmedioambiente.
Unavez determinadoslos componentesperiódicosse puedenrepresentar,el
modelo ajustadosedibuja junto a los datos originales,en función del tiempo,en la
figura de los mínimoscuadrados(figura 12).
Los componentesdel ritmo tambiénse puedenresumir en unafigura polar
(figura 13), dondeel par,amplitudy acrofase,estárepresentadocomoun vectorjunto
a una escalacircularde tiempo, la longitud de estalíneaindica laamplituddel ritmo
y la orientaciónde la línea,esdecir, su direccióncon respectoa la escala circular es
indicativa de la acrofasedel ritmo. Los 3600 de la circunferenciarepresentanla
extensióndelperiodoy 00 el tiempodereferencia.Al hacerla analogíaentre laesfera
del reloj y los ritmos, el 00 está en la partesuperiorde Ja figura y la acrofasese
expresará engradosnegativos,de forma que la acrofasevaría enel sentidode las
agujasdel reloj. El momentode referenciade la fase, alternanciade luz y oscuridad,
estacionesdel año, acontecimientosespeciales,etc.,puedenreflejarseen la porción
externade ¡a circunferencia.
En dicha figura también aparece unaregión de confianzadel 95% para la
combinaciónde amplitud y de la acrofase, comounaelipse de error alrededordel
extremodelvector.Cuandola elipseno incluyeel centrode la circunferencia, indica
47
Grados (36O0E24h)
¡300
Tiempo (Horas de íe¡oj)
Figura 12
.1 Región
deconfianza
[0
[05
[00
95
0.occ
Limites de Confianza
1~~
0600 0000
48
Cne P N pm B0118 AmpUte AaV(ff
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Figura 13
49
Horario
Para 0 en Grados3Wu 24 horas0~ medianoche local
que elritmo es estadísticamentesignificativo, o lo que eslo mismo, la amplitud es
diferentede cero.Inherente acualquierfunción biológica existe un cierto grado de
variabilidady estedebeser aceptadoennuestrasdeterminaciones,con talde quesus
limites puedanser estimados.Por tanto, de acuerdo con estas estimaciones,la
amplitud y acrofaseno son valores aislados,sino que cadaparámetrodebe estar
acompañadode unamedidadedispersión,llamada intervalo estimado.Las ventajas
de la representacióndel cosenose fundamentan enel hechode queproporcionan,
además deuna estimaciónde un punto para la amplitud y la acrofase, intervalos
estimadospara estosdos parámetros, enforma de región de confianza (Hausce
aL,1979).
En el casode estudioslongitudinales, desdeel momentoqueseespera quelas
característicasde los ritmos sufran cambios espontáneamente, será importante
detectary determinarestoscambios-en función del tiempo-y con estepropósito,se
desarrollaronlas seccionesen serie cronobiológicas(figura 14) (Halbergcf aL, 1977).
Este método estanto analíticocomo gráfico, la parteanalíticaes básicamenteigual
a ladel cosenosimple; primerodebemos considerarunasecciónde los datoscon una
extensión fija (llamada intervalo),posteriormenteeste intervalo es desplazado
progresivamente,a través de las seriesde tiempo con un incrementodado. Se va
ajustando a cadaintervalo de datos un coseno simple con un periodo fijo,
obteniéndoselos parámetrosdel ritmo, que aparecenrepresentadosen paralelo con
los datosoriginales.Esteprocedimientoesparticularmenteútil para mostrarcuando
ocurre unadesincronización,comoen el caso de los ratonesciegos,en los cualesla
luz no puede actuarcomosincronizador(Brusscf aL, 1958);o los estudiosen simas
o bunkers especialmentepreparados, donde algunas personas pasanmeses,
voluntariamente,sin ningún tiempo de referencia(Aschoff cf aL, 1971). Si no
dispusiésemosde estas seccionesen serie, los datospodríanser representados alo
largo de la escalade las frecuencias,enun espectrode los mínimoscuadrados.
Uno paso importante enla evaluaciónde los ritmosbiológicosesla inspección
de los datos originales.El cronogramanosproporciona unarepresentaciónútil de los
datos,obviamentela ritmicidad se podráreconocerfácilmente,si bien éstaes una
50
-
SECCION EN SERIE CRONOBIOLOG ¡CA
pordón dela representación
esque¡náuca que se om~eN
1 f 1.incrementos .
‘~~1
4• ....,.,,. •0~
- 1
.IÁtt4’
úlb¡no dato
k— Series de bempo analizadas
finComienzo
A—
~27Oo
1 •• 1
Acrof ase 1aO
~1
u-95%jo
- 9O~
P~mer dato
Figura 14
51
aproximaciónmacroscópica.Para una descripción cuantitativade los datos sería
necesariouna aproximaciónmicroscópicade estos. El cronogramapuede además
proporcionarnosunainformaciónmuyútil concernientea lanecesidadde transformar
los datos, la existenciade puntosextremos (incorrectos)o conocersi el modelo es
apropiado.El cronogramase puedeobteneral realizaruna secciónen serie de los
datos(figura 15).
Lasumaresidualde los cuadrados(RSS)sirve paradospropósitos:parael test
dehipótesis(deteccióndel ritmo) y parala estimaciónde los intervalosde confianza.
Los intervalosde confianzapara el periodo pueden estar determinados medianteel
métodono lineal de los mínimos cuadrados (Rummelcf aL, 1974; Binghamcf aL,
1992). Cuandolos límites de confianzadel periodo deun determinadoritmo no
incluyenel periodo ambiental,se dice que el ritmo presentaderiva de la acrofase,
cuando ésta reconocetodo el ciclo ambiental,sedice queel ritmo presentaencurso
libre. Estecursolibre hasidodocumentadode formaextensivaenausenciadetiempos
de referencia(Halbergcf aL, 1953; Halberg, 1969; Halbergcf aL, 1990), tal como
sugierela deriva de la acrofase,y su continuacióna lo largo de un ciclo completo,
afirma la endogenicidadde un ritmo fisiológico. Cuandoel desplazamientode la
acrofasede un ritmo ocurreenun momento dado,y duranteun determinadoespacio
detiempo, recibeel nombrede movimientode la acrofase.El desplazamiento puede
ser gradualo brusco.
En el plexograma(figura 16) los datospueden agruparseenun sólo ciclo, y un
número de claseselegidasaplicarsea un análisis de varianza (ANOVA) de una
dirección,paradeterminarlos efectosdel tiempo. Debemosteneren cuenta quelos
resultados van adependerdel númerode claseselegidasy del tiempo de referencia,
en el casode seriesde datos longitudinalesque cubren variosciclos en pequeños
intervalos(Hilíman cf al., 1990). Se debe señalar también queun efectodel tiempo,
estadísticamentesignificativo,encontradomedianteel empleodelANOVA, no puede
ser interpretadode inmediatocomoun ritmo. El ANOVA sólo revela queel tiempo
puedeser consideradocomouna fuentede variaciónestadísticamentesignificativa.
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54
Pararesumirlos resultadosindividuales,obtenidosde diferentesanimaleso
individuos que pertenecena la misma población, las característicasde los ritmos
obtenidasmedianteel coseno simple,puedenser analizadasposteriormentemediante
el cosenode mediasdepoblación(Halberget aL, 1967) (figura 17). Lascaracterísticas
delritmo, obtenidas medianteel cosenosimple,sonconsideradasentoncescomo datos
de entrada. Elcosenode mediasde poblacionescontribuye en unaestadísticade
segundoorden,que seaplicapara deducirregionesdeconfianza,relacionadas conel
total de la población. Los parámetrosestimadosestánbasadosen medias de las
estimacionesobtenidasparacadaindividuo en la muestra.Lasregionesdeconfianza,
para estos parámetrosde población,van a dependerde la variabilidad entre los
parámetrosindividuales estimados.Los test de ritmo y MESOR, son pruebas
deduciblesestadísticamentede la similitud de los parámetrosde los ritmos,en dos o
másritmos.
Cuandosedesconocela duracióndel periodode los ritmos,perose asumeque
está dentro deun cierto margen,se puedeaplicar una ventanacronobiológica. Este
procedimientoes muyútil también,cuandotratamosconbioperiodicidadesque están
desincronizadasdel periodo del medio ambiente. También se debeaplicar
preferentementecuandolos datoscubrenun númerosuficientede periodosy/o en
contra del componentebiológico. Este métodoconsisteen aplicarel procedimiento
del cosenosimple,no únicamente aun periodoprefijado,sino a una seriede periodos
de prueba que están dentrode unmargen(lineal enperiodo),y a disminucionesentre
periodosconsecutivosajustadospor la ritmometríade los mínimoscuadrados(lineal
en frecuencia).En tal caso, estaremosinteresadosen determinarla extensióndel
periodo, dentrode estemargen,para el cual la sumaresidualde los cuadradoses
mínima.
Otro procedimientoposible,para so]ucionarel problema delos datosno
equidistantes,es el uso del métodono lineal de los mínimoscuadradosparaestimar
el periodo, asícomo la amplitud y la acrofase.Este método tambiénnos permite
ajustar al mismo tiempo varias componentes.Para este propósito se usó una
combinaciónde programasde ordenador(Rummelet aL, 1974; Marquart,1963).
55
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56
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Primerose emplean métodos linealesy posteriormenteseaplica unaritmometríano
lineal contodos los periodos“candidatos”y suscaracterísticas(obtenidasdel método
lineal), usadoscomoestimacionesiniciales. Despuésdeuna serie deprocedimientos,
se obtienenlos parámetrosfinales (figura 18).
Desdeun puntode vistaclínico, la determinación deritmos con unaamplitud
relativamentegrande se basa enreconocer la necesidadde unos intervalos de
referenciaespecificadosen el tiempo. Se necesitanritmos con distintasfrecuencias
paracaracterizarvariablesde vital interésespecificadasenel tiempo,pero ignoradas
habitualmente.Estosritmos contribuyen,en gran parte, ala gran variabilidadquese
observaen los datos clínicos.Desdeahorase podrá mejorarel diagnóstico,si no se
recogenlos datos únicamente en undeterminadomomento,sino en intervalosde
referencia especificadosen el tiempo; los cronodesmos(Ha)berg et aL, 1978)
colaboraríaneficazmentea la interpretaciónde los datos.
Parala comparaciónde los parámetrosobtenidosmedianteel métodocosenor,
seempleanunos testde parámetrosdiseñados especificamenteparaello (Bingham
cf aL, 1982), estostest comparanlos MESORes,las amplitudesy/o las acrofasesque
se obtienen de ajustarla curvacoseno,bien aseries longitudinales,o alos parámetros
de un ritmo circadiano, aplicado a una determinadapoblación; por tanto, la
comparaciónse puedellevar a cabo, tanto de forma individual, como de forma
colectiva.
Al recogerlos datosenfunción del tiempo,ademásdeobtenerun valor medio
másexactoy preciso,tambiénobtendríamosuna dobleamplitud, quenos mostraría
cuál esla variaciónpredeciblede estosvaloresdel ritmo,y obtendríamosla acrofase;
por ejemplo, si estuviésemosanalizandolos eosinófilos,en dos gruposde animales,
perrosy ratas,supuestamentealojados bajolasmismas condicionesambientalesy bajo
el mismo ciclo de ]uz-oscuridad(LO 12:12), encendiéndosela luz a las 08:00horasy
apagándosea las 20:00h.; nospodríamos encontrarconun valor medio,enun grupo
de perrosde 0,5 x iO~/í y el valor mediode ungrupode ratasde 0,4 x íO~/í, lo único
que podríamos deciresquepresentanunasconcentracionessimilaresde eosinófilos;
57
Orthophase*(N = 24>
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oOO:aO a4:ao08:aO
Figura 18
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3000
2000
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58
en cambio, si empleasemosel método cosenor,obtendríamosel MESOR, que para
el primer grupo seria,p.e., igual a 0,44 x 10~/l y para elsegundo0,47 x io~/í; pero
tambiénobtendríamos laacrofase,dato fundamental enlo referenteal ritmo de los
eosinófilos, puesto quela acrofaseen los perros tendríaun valor de ~30Ó,lo que
significaquelos valoresmáximossealcanzanduranteel periodode oscuridady en el
grupo de ratas obtendríamosuna acrofasede -210~, lo que indica quelos valores
máximossealcanzanduranteel periodode luz, apartede obtenerla dobleamplitud.
Mientras que conlos métodosempleadoshastaahora,sólo podríamos decir quelos
valores de eosinófilos en rata y perro son similares,únicamente conestos tres
parámetrosnos damos cuenta quesus ritmos están enalofase (son opuestos).
También obtendremosnuevosparámetros,que puedenser evaluadospor sí mismos,
comoguíasdel efectode un tratamientoo de la prognosisde unaenfermedad.
El empleo del métodocosenor y la obtenciónde estos nuevos parámetros
-MESOR, amplitudy acrofase,quedefinenlos ritmos circadianos, circaseptanos,etc,
de forma más exacta, en el diseño experimental de una investigación— nos
proporcionaráresultadoscronofisiológicosmásprecisos.
59
MATERIAL Y METODOS
Al ser ésta,unaTesis dirigida por un Veterinarioy un Médico, en ellavamos
a encontrar, en cuanto asujetosempleadospara el posibledesarrollode la misma,
personasy animales,puesto que lacronobiologíaes unacienciaaplicable enambos
camposy de la cual sepuedenbeneficiar,tanto unos comootros.
OBTENCION Y ANÁLISIS DE LAS MUESTRAS
EXPERIMENTO1: Variación Circadianadel Cortisol
Animales:
En esteestudioseemplearonun total de 150 conejosmachosadultos,Blancos
de NuevaZelanda(NZW), cruzadosentresí a lo largo de másde 20 generaciones,
mantenidos en un ambiente microbiano convencional y con un peso de
aproximadamente2,90 0 15 kg. Los animalessedividieron endosgrupos,segúnel
métodode recogidade muestrasa seguir:serialmentedependientes(25 animales)y
serialmenteindependientes(125 animales),estosdos grupossesubdividierona suvez
en cinco subgrupossegúnel ciclo de luz empleado.
Alojamiento y alimentación:
* jaulas de malla metálicaindividualesde 48 x 61 x 46 cm
* condicionesambientalesestándar:
- temperaturaambiental:180 - 240C
humedad relativa delaire: 50-55%
- renovacióndel aire: 10 a 15 ciclos por hora
61
La dietaconsistió en 150 g/día de Purina LaboratoryRabbitChow
- 16,2% de proteína
- 2,5% de grasa
- 13,5%de fibra
y condisponibilidadde aguaad libiturn.
Los animales fueron alojadosbajo 5 ciclos diferentes deluz, con unas
duracionesde los periodosde luz-oscuridad(LO) de:
- LO 16:08- LO 14:10
- LO 12:12
- LO 10:14
- LO 08:16
En las cualesel primer númerose correspondecon la duración de la luz
(fotofracción)y el segundoconla duracióndel periodode oscuridad (escotofracción),
en unrégimende luz cíclico de 24 horas.En todos los ciclos la luz se encendió alas
08:00 am.
El periodo de adaptaciónparacadaunade estascondicionesfue de 20 días.
Toma de muestras:
Material
- Agujasde0,8 x 25 mm (21 G x 1”) (Becton Dickinson).
- Tubosvacutainerheparinizadosde 100 x 16 mmm (Becton Dickinson).
- Xileno (Panreac).
- Algodón.
62
Metodolo2iaempleadaparala toma de muestras
En laobtenciónde muestras,paradeterminarel ritmo circadianodel cortisol
en los conejosseempleóun estudiotransversaly dos métodos diferentes.Unade las
técnicasconsistió en la obtenciónde datosen los mismosanimales,o recogida de
muestrasde forma serialmentedependiente.En este procedimiento,cada conejo
proporciona5 muestrasdesangre aintervalosde 4 horas,duranteun ciclode24 horas
(se omitió unade las tomas de muestra).
La otra técnica consistió en la obtenciónde muestrasde forma serialmente
independiente, cadavalor de cortisol seobtuvo deun conejodiferente,es decir cada
conejoúnicamente proporciona unamuestrade sangre.Por tanto, en cadamomento
de la obtención de muestrasy para cadaciclo de luz, en un método serialmente
independiente,se obtienen5 valoresde cortisol, cada unoproviene de un conejo
diferente; necesitando25 conejospor cadaciclo deluz. Comoempleamoscinco ciclos
de luz diferentesparaestudiarel efectoqueéstostienenenel cortisol,necesitaremos
utilizar un total de 125 animales.
Las muestrassanguíneasserecogierona las 08:00, 12:00, 16:00,20:00y a las
00:00 horas,de la venamarginalde la oreja. Despuésde la extracciónde sangre,el
plasmafue separado en unacentrífugaMinifuge RF (Heraeus)a 1200 x g y a 40C,
durante20 mm. El plasmaobtenido seextrajo medianteel usode unapipetapasteur
(Brand) y se introdujoen tubosde plásticode 50x 15 mm, tapándoloscon parafilm
(AmericanCanCompany).Se identificó cadatubo medianteunaetiqueta enla que
se anotóel númerode animal, la horay la fechade recogida,así comoel númerode
alícuota. El plasmase conservó congeladoa -300C, hastael momentodel análisis
hormonal.
Determinaciónde las concentracioneshormonales
El procedimientoparadeterminarlas concentracionesplasmáticasde cortisol
fue el ELISA de competición, según el protocolo descrito por Silván (1991),
63
empleando como fasesólidaunamicroplacade poliestireno de Dynatech(Germany)
de 96 pocillos.
Los derivadosesteroides paralos conjugados(4-Pregnen-llWl7a,21-triol-3,20
dione 3-CMO) y la hormona estándar(4-Pregnen-11B,17a,21-triol-3,20dione) se
adquirieronen SteraloidsInc. (Wilton, New Hampsire,USA).
Los anticuerposy conjugadosfueron los producidosy caracterizadosen el
Departamentode FisiologíaAnimal de la Facultad de Veterinaria,UCM; la HRP
RZ=3,2(peroxidasade rábanopicante)seobtuvodeBoebringer Mannheimy la OPD
(O-phenylenediaminedihydrochloride)de SigmaChemicalCo. (St. Louis, Missouri,
USA).
La determinación delcortisol se realizó en el plasma sin extraer. La
sensibilidaddel ensayoesde 0,1 pg/pocillo y el coeficientede variación (CV) intra-
e inter-ensayofue menor del5%, en todos los casos. Lasdosisy las curvasestándar
de la hormona seobtuvieronusando un programaespecialde ELISA (Informatics
Department,Universityof California,Davis, California,USA).
EXPERIMENTO2: Marcadores dcCrecimiento,CA125 y CAI3O
Sujetos
En esteestudio la recogidade muestras salivaresse realizó tanto enpersonas
como en animales.
En lo concernienteal grupo de personas,éste estabaconstituidopor un total
de 32 mujeresy por un hombre.
El grupo de mujeresestabasubdivididoen tresgrupos:
- el primero secorrespondecon un grupo de personassanascon edades
64
comprendidasentrelos 28 y los 48 años.
- el segundogrupo estabaconstituido por un total de 5 mujerescon
tumores,casi todas ellaspresentaban cáncer deovario, susedades
estabancomprendidasentrelos 35 y los 72 años.
- el tercero y último lo constituíanun grupo de mujerescon ovarios
poliquisticos,cuyasedadesoscilabanentrelos 38 y los 45 años.
El hombre queparticipó enel estudioeraun hombreclínicamentesanode 72
añosde edad.
Los animales empleadosen el estudio de los marcadoresde crecimiento,
CA12S y CAI3O, fueron:
* vacas:
- RazaFrisona
- Edad: 2-4 años
- Alojamiento:explotaciónde producciónlechera
- Alimentación: dieta equilibradacompuestapor:
- soja44 20,0%
- maiz 20,0%
- cebada 55,5%
- grasaby-pass 1,5%
- corrector 3,0% (carbonato, fosfatoy oligoelementos)
- Agua: ad Iibitum
* conejos
- Raza:Blancosde NuevaZelanda(NZW)
- Edad:6 meses
- Peso:3 - 3,5 kg
- Alojamiento:jaulasindividualesde 48 x 61 x 46 cm
65
- Alimentación: 150 g/día de alimento paraconejos(Purina)
- proteína 16,2%
- grasa 2,5%
- fibra 13,5%
- Agua: att libitum
- Condicionesambientales: 21-240C
45-55% de humedad
LO 14:10, encendiéndose la luz alas
07:00horas
* ratas
- Estirpe:Wistar
- Edad: adultas
- Peso:250-300g
- Alimentaciónen forma de pellets (PurinaLab Chow) ad libitum
- Agua: att libifurn
* ratones
- Estirpe:Balb/c
- Edad:adultos
- Peso:22-25 g
- Alimentación: igual que laanterior
- Agua: att libitum
Toma de muestras
Material
- Tubos de plástico50 x 10 mm.
- Embudodep]ástico.
- Cánulasparala obtencióndesaliva (Andersen).
- Vasomedidorparadeterminar lacantidadde aguadel enjuaguede la boca.
66
Metodoloulaemuleadaen la toma de muestras
La saliva de las personasse recogió a lo largo del día, a intervalos de
aproximadamente4 horasdurantelas 24 horasy en algunoscasoscon ocasionales
interrupcionesdurantela noche.Lasmuestrasse recogíanal menos una horadespués
de cualquieringestióndecomidao líquidos. La obtenciónde estasalivase hizo antes
y despuésde un completo enjuagadode la boca. En cadacaso se recogió
aproximadamente1 ml de saliva en tubos de plástico de 50 x 10 mm (a veces
mediante laayuda de unembudo)y se congelóinmediatamente a-250C. El periodo
de recogida varíasegunla persona,éstese detallaposteriormenteen la tabla 6.
El diseño delestudioen estecasoesdetipo mixto o hfbrido,puessedetermina
envariaspersonas (transverso)y durantevariosdías en cadapersona(longitudinal).
El horario seguidofue similar en todasellas, levantándoseentrelas 07:00y 08:00 h
de lamañanay acostándoseentrelas 00:00 y la 01:00 h de la noche.
La saliva de los animales se recogiómediantecanulación de la glándula
parótiday siempreuna horadespuésde cualquier ingestiónde comidao líquido. Se
recogieronaproximadamente0,5 ml de saliva en pequeñosanimalesy de 1-2 ml en
vacas.Todaslas recogidasserealizaronsin enjuagarla boca.La saliva se congeló
a -250C hastasu posterioranálisis.
Las extraccionessanguíneasde las vacasse realizaronde la vena caudaldel
rabo; delos conejosde la venamarginalde la oreja,y de lasratasy de los ratonesde
la vena centralde la cola. La sangrese centrifugó y almacenó,hastasu posterior
análisis,siguiendolospasos descritosanteriormenteparalosconejos.Lasmuestrasse
recogierona las 08:00de la mañana entodos los animales.
67
Determinaciónde las concentracionesde los marcadores decrecimiento
Trabajamos condosmarcadores decrecimiento,CA12S (CancerAntigen 125)
y CA13O (CancerAntigen 130), inicialmentellamadosmarcadorestumorales,puesto
queal principio únicamenteseutilizabanparadeterminartumoresováricosdeorigen
no mucilaginoso (Bastcf aL, 1981).
Marcadorde crecimientoCA125
Fue determinadoen salivay suero,medianteradioinmunoanálisis(RíA), con
kits procedentesde Centocor(Malvern, Pennsylvania, USA),un test in vifro parauna
valoración cuantitativa del determinanteantigénico CA125. Las determinaciones
químicasfueronllevadasa cabosegúnlos métodosdescritosoriginalmentepor Bast
cf aL (1981)y Chena aL (1990),estosautores produjeronun anticuerpomonoclonal,
llamado 0C125, el cual reconoceal determinanteantigénico CA125, con una
sensibilidad del 88% en la detección de carcinomas ováricos epiteliales no
mucilaginososy de un 60% en cáncerde útero,necesitándoseúnicamente50 gl de
volumenpor muestra.
Marcadorde crecunienfo CA130
LasdeterminacionesdelCA13Oserealizaronmedianteradioinmunoanálisiscon
kits D-7111, procedentesde Daiichi Radioisotope Laboratories(Tokyo, Japan).Se
utilizó un análisisinmunoradiométricotipo “sandwich” (double-determinantassay)con
anticuerposmonoclonales130-22y 145-9 (Kobayasliia aL, 1991),obtenidosde ratón.
El ensayo muestra unaexcelente sensibilidad, especificidad, reproducibilidad,
cubriendo lacurvaestándarun margende 10 a 500 U/ml.
Lasmuestrasde los animalesdescritosfueronempleadas,tantoparacomprobar
la existenciade marcadoresde crecimiento, como para determinar, encaso de
encontrarestosmarcadores,cuál erasu concentracióna nivel sanguíneoy salivar,así
como su relación con los nivelesencontradosen la especiehumanay su posible
68
utilización eninvestigaciónanimal.
EXPERIMENTO3: PresiónSanguíneay FrecuenciaCardiaca
Sujeto
El estudiose realizó en unamujer clínicamentesanade28 años,en la quese
controló y midió la presiónsanguínea(PS) y la frecuencia cardiaca(FC). Iniciando
el día, aproximadamente,a las 07:00h y acostándose,aproximadamente,a las 00:00
horas.
Metodología
Material
- Monitor portátil automáticoABPM-630 (Colin Medical Instruments
Ltd., Komaki City, Japan).
- Casete dememoria.
- Cartuchode CO2.
- Procesadorde datos (Colin Medical InstrumentsLtd., Komaki City,
Japan).
- Ordenadorportátil IBM con una impresora LaserjetIII.
Método empleado en larecogidade datos
La recogidadedatos sellevó a cabodeformalongitudinal, desdeel 17 de abril
al 28 de julio de 1992, conun monitorportátil automático.
Este monitor esfácilmentetransportabley estáconstituidopor dos partes,la
unidadprincipal y un manguito,conectadosmedianteun tubo de plástico,por donde
circularáel CO2, y un cablequelleva la informacióndesdelos sensoresdel manguito
a la memoria delmonitor; el manguitosesitúaconlos sensoresen la cara internadel
69
brazo izquierdo, inmediatamente antes delcodo. En la unidad delmonitor se
encuentranalojados,apartedel programadiseñadoespecialmente parael control de
PSy FC, una memoria dondequedaránalmacenadoslos datos;conunacapacidadde
almacenajedeaproximadamente4-5 días(40.000bytes),dependiendode la frecuencia
con que éstos se recojan, esta memoria es extraible para poder conectarse
posteriormentea un procesadorde datos,conectado a un ordenador.
La unidad tambiéntiene capacidadpara alojar unabateríarecargabley un
cartuchode CO2 con el quese inflará elmanguito;ésteesde plásticoy estácubierto
por una funda de tela que aloja en su interior dos sensoresde presión, para
determinarcon una mayor precisiónla PS y FC, bien de forma oscilométrica(por
sensoresque detectanlas ondas de la presión sanguínea)y/o por sonidos de
Korotkoff. Apareciendolos datosmedidosen unapantallade cristal líquido.
El monitor que vacolocadoen la cintura puedeser programado paraobtener
datos,cada 15, 30 ó 60 minutos, de la presión arterial sistólica (PAS), la arterial
media (PAM) y la presiónarterialdiastólica(PAD), así comomedicionesde la FC.
Aunque en este caso, como hemos citadocon anterioridad, las medicionesse
realizaron cada 15 minutos, durante Las 24 horas del día, con ocasionales
interrupciones.
Al conectar la memoria al procesador de datos y éste al ordenador,
obtendremoslasseriesdedatosenel tiempo,partefundamental encronobiología.Los
datosde la PAS, PAM y la PAD vienenexpresadosen mm de Hgy la frecuencia
cardiacaen ppm (pulsacionespor minuto).
METODOLOGíA ANALíTICA CRONOBIOLOGICA
Despuésde la obtenciónde las seriesdedatos,tanto de la presiónsanguínea,
frecuencia cardiacay marcadores decrecimiento,comolasseriesdedatos delcortisol,
todas ellas fueron analizadasde forma cronobiológicamediante, unordenador
70
compatibleIBM, y con la ayudade programasdesarrolladosen los Chronobiology
Laboratories, University of Minnesota, Minneapolis (MN, USA) y cedidos
amablemente porel Dr. FranzHalberg, directorde dicho laboratorio.
Experimento1: Variacionescircadianasdel corfisol
Los datos delcortisol obtenidos fueronanalizadospor el métodocosenor
simple (Halberg, 1969).En estecasoel procedimientoconsistióen ajustar,mediante
el método delos mínimos cuadrados,una curva cosenode 24 horas (circadiana)y
también,unade 12 horas(circasemidiana),por separadoy unacombinaciónde ambas
curvascoseno,a los datos.
Por cada componenteconsideradoen el modelo (24 horas y 12 horas),se
obtienenunaamplitudy unaacrofase, éstasson medidasde la magnitudy el tiempo
del cambio que se producey que son predeciblesen un ciclodel ritmo, por tanto
obtendremos3 amplitudesy tresacrofases (unapara24 h, otrapara 12 h y la última
parael modelode dos componentes).Además,se estimael MESOR, media ajustada
al ritmo, siendoéstesimilar paralos tresmodelos.
Se eligió como fasede referencia,para todos los métodos,el HAML (punto
mediodel intervalode luz), despuésde realizardiferentescálculos previosy teniendo
en cuentatrabajosanteriores,en los quese tratanlasventajasde la utilización de las
distintasetapasde los ciclos de luz-oscuridad, comotiemposde referencia (Sothern
y Halberg, 1979; Sothernef aL, 1978).
Para simplificar los resultados obtenidosde cada conejo, en el muestreo
serialmentedependienteseusóel métodocosenordemediasdepoblaciones(Halberg
ef aL, 1967).Los datosobtenidosde cadacinco conejos,en el sangrado serialmente
independendiente,se analizaron medianteel método cosenorsimple, para poder
generalizarlas deducciones hechas,a la población.
71
Dos aspectos de este estudio fueron particularmenteinteresantes:uno
relacionado conla comparacióndel ritmo circadianodel cortisol de los conejos,
determinadoen dos esquemasde sangrado diferentes(serialmentedependientey
serialmenteindependiente),y el otro consiste en una comparación del perfil
circadianodel cortisol, entrediferentesciclos de luz, en ambos gruposde sangrado.
Para poder procedercon estas comparacionesse emplearonlos test de
comparaciónde parámetros, creados amedida para ello (Bingham a aL, 1982);
medianteestostestsecomparanlos MESORes,amplitudesy/o acrofases,primero de
forma separada(esdecir MESORconMESOR)y posteriormentede forma conjunta
(considerandoal mismo tiempo MESOR, acrofase y amplitud). Utilizando los
parámetrosque seobtuvierondeajustarunacurvacosenoa lasseries simplesde cada
conejo o bien, aplicándoloa los parámetros delritmo circadianode la poblaciónde
conejos,por tanto la comparaciónse puede llevara cabo tantode forma individual,
comode forma colectiva, comparandocadaparámetrodeforma separadao bien de
forma conjunta.
En el estudio del muestreo serialmente independiente, decadaconejo se
obtuvo una sola muestra,y las seriesde tiempo se construyeron considerandode
forma concomitantelos 25 datosde los 25 conejosen un determinadorégimen; es
decir, de entrelos 25 valores que proveníandel sangradode los 25 animales,no
existiópreferenciaal seleccionar5 seriesde 5 valores,quesecorrespondiesenconlas
5 series obtenidasde los 5 conejossangradosde formaserialmentedependiente,sino
que fue unaselecciónal azar. Porsupuestoexistíala posibilidadde considerar todas
las ordenacionesposibles,mediantecombinacionesy permutaciones,paraconstituir
seriesde 5 valoresparaanalizar,pero esteprocedimientono fue empleado eneste
caso.
72
Experimento2: Marcadores decrecimiento> CA125 y CAJ3O.
Las seriesde datosse analizaroncon métodosritmométricos,principalmente
medianteel método cosenorsimple, descritoanteriormente, con un periodo,r,
anticipadode 24 ó de 168 horas.
Primerofue necesariala detecciónde la existenciade un ritmo circadianoen
los marcadores decrecimientode laspersonassanasy de varias de laspersonascon
cáncer, cuando no se pudo detectar el ritmo circadiano, se abrió una ventana
cronobiológica, lineal en frecuencia, para detectar laexistencia de otras
bioperiodicidades,tambiénse ajustóuna curvacosenocircaseptana(168 h ó 7 días)
a los datos.
Para las diferentes característicasse obtuvieron los puntos e intervalos
estimados,estosparámetrosfueronel MESOR(M), la medialíneadel ritmo de los
marcadores decrecimiento estimadaestadísticamente;la dobleamplitud circadiana
(2A), o la medidade la extensióndel cambio de las concentracionesde CA125 y
CA13O, que se produce enun día y quees predecible;y la acrofase(~), unamedida
del momentoen que se produceel conjuntode los valoresmásaltosde CA125 y de
CAl3O y que recurren en cadaciclo.
La acrofaseestará expresada engradosnegativos,relacionandolos 3600con r,
si r 24 horas la acrofasese podráexpresartambién enhoras,y si r = 168 h se
podráexpresaren díasde la semana.El tiempo de referenciaelegidoparael estudio
de estosritmos fue la medianochelocal.
Seutilizaronmétodosconvencionalesde estadísticaqueconsistenenel cálculo
de medias,error estándary de un análisis devarianza (ANOVA) (Sokaly Rohlf,
1981). En vista de la distribucióndel CA125 y del CA330,algunosde los análisisse
realizarontambién,despuésde unatransformaciónlogarítmica,en base 10, de los
datos.Los análisis,por tanto, se llevarona cabo tanto enlos datos originales como
en los transformadosen logaritmosparafacilitar la interpretaciónde los mismos.El
73
primer análisis(datosoriginales)sirve paravisualizarla localizacióny la dispersión
de los datos originalesy el segundo(1og10 de los datos)paraaproximarde forma más
exactalo asumidoen los testsclásicos.
Los datosse agruparonen unosperiodosideales,circadianoy circaseptano,y
se analizaron medianteun análisisde varianza,para determinarel efectodel tiempo
enlos mismos,obteniendoal mismo tiempo plexogramaso representacionesgráficas
de los datosagrupadosen clases.
Experimento3: >4lofasecircatrigintana entrePS y FC
En estaocasión,al igual que enlas anteriores,los métodosempleados están
basadosen el coseno,empleandoel métodocosenorsimple.Primeramentese ajustó
unacurvacosenocon r = 24 horas,a los 8.583 datos,determinandola ya conocida
ritmicidad circadianade la presiónsanguíneay de la frecuencia cardiaca,por tanto
esteajustede la curvase realizó porcuatriplicado,esdecirunavez parala PAS, otra
vez paraPAM, posteriormentepara la PAD y por último parala FC. Por tanto el
volumen de datosempleadosfue de 34332datos. Comodía de referenciaparaesta
determinaciónse tomó el primer díadel ciclo menstrual,pueses el sincronizadorde
muchosde los ritmos en las mujeres,comoson el circaseptanoy el circatrigintano.
Trasla detección elritmo circadianoseprocedióa realizarseccionesen serie
de los datosde la presión sanguínea(PAS, PAM, PAD) y de la frecuencia cardiaca,
tomandocomoperiodo,intervalo e incremento24 horas,en todos los casosobtenido
un MESOR, una amplitud y unaacrofasepara cadadía. Estascaracterísticasde los
ritmosseránconsideradas,posteriormente,como datosde entradaparala realización
de otros análisis cronobiológicos.
Para la obtención del gráfico medianteel método lineal de los mínimos
cuadrados,seajustó la curvacosenode 720 horas(30 días>a los 92 MESOResdiarios,
obtenidosde ajustarla curvacosenocircadianaen la secciónen serie.
74
La figura polarcircadianaseobtuvomediante laaplicacióndel cosenorsimple
a los 92 MESORes,amplitudes,acrofases,P.R.y valoresde p, obtenidosde la sección
enserie,mientras que para lacircatrigintanase emplearonlos datosoriginalesdeuna
semana.
75
RESULTADOS
A continuación vamosa pasar a detallarlos resultados obtenidosa lo largo de
estaexperimentación;primeroexpondremoslos resultadosdel análisisde lasmuestras
de cortisol plasmático,en dos gruposde conejos,sangradosmediantedos métodos
diferentes:serialmente dependientey serialmente independiente.
A continuacióndetallaremoslos resultadosobtenidosal analizarel cronoma
de dos marcadoresde crecimiento,el CA125y el CAI3O, tanto ensujetossanos como
enfermoscon tumoresováricos.
Finalmente,expondremoslos resultados obtenidosal analizarlas largasseries
longitudinalesde la frecuencia cardiacay la presiónsanguínea.
77
EXPERIMENTO 1: VARIACIONES C!RCADL<4NASDEL CORTISOL
En la tabla1 están detalladaslascaracterísticasde] ritmo circadiano (MESOR,
amplitud y acrofase)del cortisol plasmáticoen conejosmantenidosbajo 5 ciclos de
luz diferentes, y que fueron sangradossiguiendo dos metodologías distintas:
serialmentedependientey serialmenteindependiente.Cadacaracterísticadel ritmo
esta expresada consus límites de confianzadel 95% (ES: para el MESOR y ~a
amplitud e IC: parala acrofase).La amplitud estáreferidaen susunidadesoriginales
y en porcentajedel MESOR; este tiltimo empleado paraeliminar el efectode la
variabilidad inter-individual.
La tabla 2 resumedos de los parámetros(A y acrofase)de los componentes
del ritmo (r = 12 horasy r = 24 horas)del cortisolplasmáticoy cómocontribuyen
(p y PR) estosdos componentesa la forma de la curva, asícomola probabilidady el
porcentaje delritmo, cuando consideramosel modelode la curvacosenoconstituido
por esosdos componentes(Total). Estas característicasdel ritmo se describende
forma independientepara cadaciclo de luz primeroy, posteriormente,los datosson
consideradoscomo unapoblación, es decir, se analizanlos datos comosi todos los
conejosperteneciesenal mismo colectivo,sin considerarlos distintos ciclos de luz.
En la tabla 3 estánrecogidos los parámetrosdel ritmo, y se indican las
diferenciasquese observanen el ritmo circadianodel cortisol plasmáticode mujeres
sanasa lo largo del año.
El esquema1 relacionalas horasde reloj con las horasHXML (Hours After
Mid Light: horasdespuésde la mitad del intervalo de luz) en los cinco ciclos de luz-
oscuridad.
En las gráficas1 a 5 estánrepresentadaslas diferentesconcentracionesdel
cortisol plasmático,a lo largo del día, en conejossangradosdc forma serialmente
independientey serialmentedependiente.Cada puntodel gráfico se correspondería
78
con la media de unaserie dc cinco conejos,y cadagráfico se correspondecon cada
uno delos 5 ciclos de luz empleados(LO 16:08, 14:10, 12:12, 10:14,08:16). En el eje
de ordenadasestá representadoel tiempo (HAML), y en el de abcisas las
concentracionesde cortisol (ng/mí).
En la gráfica 6 están representadoslos niveles de cortisol plasmático en el
conjuntode conejossangradosserialmentedependiente,y en la gráfica 7 el conjunto
de los sangradosde forma serialmenteindependiente(obsérvesela diferenciade
concentraciones).
La gráfica8 representala relaciónexistenteentrela duraciónde las horasluz
y la amplitud,determinadaen cadaconejo.
Las gráfica9 y 10 son representaciones polaresde los valoresdel cortisol. La
gráfica 9 de los conejossangradosserialmentedependiente,y la gráfica 10 de los
sangradosserialmenteindependiente.Cadaelipsedeconfianzarepresentalos valores
del cortisol en cadaciclo de luz-oscuridad.
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Gráfica 10
93
EXPERIMENTO 2: MARCADORESDE CRECIMIENTO. CA125 Y CA130
La tabla 4 es un resumenestadísticode los dos marcadores decrecimiento
estudiados.Este resumen fue realizadoen los datos originales,y en los datos
transformadosen logaritmos.La salivafue recogidaantesy despuésdelenjuagadode
la boca.
En la tabla 5, primero,se detallacomovarían las concentracionesdel CA12S
y del CA13O, a lo largo del día (porclasesde 4 horas); tanto cuandoseconsideran
únicamente23 muestras(10-14de abril), comocuandoseconsideran61 muestras(10-
21 de abril), en los valoresoriginalesy en los valorestransformadosen logaritmos.
Posteriormentemedianteel análisisde varianza(ANOVA) de los datosy aplicando
el métodocosenora los mismosdatos,obtenemoslos valoresde p, quenos indican
en qué medidalos datos dependendel tiempo. Obteniendoademás,al aplicar el
métodocosenor,las característicasdel ritmo, las cualesquedanreflejadasen la parte
inferior de Ja tabla. Podemos observarlas diferencias existentesentre media y
MESOR.
En la tabla6 serecogenlascaracterísticasde los sujetosqueparticipaneneste
estudio,asícomolas fechasen que sellevarona caboéstos,y se comparanlos valores
del CA125y delCAl3O dedichossujetos,unode ellos con cáncerde ovario (lO1EH)
y otros tres sanos (21OHM, 209GC, 21lAP); mostrando las diferencias de
concentracionesentreel CA125y el CA13O, antesy despuésdelenjuagadode la boca.
La tabla7 se confeccionécon los resultados obtenidosde comprobarsi las
diferencias encontradasentre las concentracionesde ~A125 y de CAI3O eran
consistentes.Para ello se analizaron series más largas, proporcionadas por una
paciente con cáncerde ovario (EH). Las diferenciasfueron estimadasen varios
espaciosde tiempo: entre00:00 y 04:00; 04:00 y 08:00; 08:00 y 12:00; 12:00 y 16:00;
16:00y 20:00; y 20:00y 00:00 horas.
94
En la tabla 8 se resumenlos análisis llevadosa cabo, para conocersi las
diferenciasentrelos dos marcadores estabanen función de las concentracionesde los
mismos.Se usaronlos datosde la pacientecontumor ovárico,paraformar diferentes
clasesbasadasen los valoresde las concentracionesde CAI2S. Se consideraronlas
siguientesclases:CA125 entre200 y 300 (no habíavalorespor debajode 200); 300y
400; ...; 900 y 1000; 1000 y 2000; 2000 y 3000; ...; 9000 y 10000; y mayoresde 10000.
En la gráfica 11 se comparanlas concentracionesde los marcadoresde
crecimiento CA125 y CA13O salivares,de dos personassanas,antesy despuésdel
enjuagadode la boca.En ambossujetosseobservanconcentracionesmenoresdespués
del enjuagado. Las diferencias de concentraciónentre CA125 y CA13O son
estadísticamentediferentesen todos los casos(medianteun t-test por parejas)
En lagráfica 12 se comparanlos MESOResdel CA13Osalivarentreun grupo
depersonassanas(n=2), y otro de personascon tumoresováricos (n=5). Se aprecia
la gran diferenciade concentracióndel marcadorde crecimiento entre estos dos
grupos,siendoéstaestadísticamentesignificativa.
En la gráfica13 secomparanlas distintasconcentracionesdelmarcadorCAI3O
salivar, entredos gruposde sujetossanos(n= 10), y otros con cáncerovárico(n= 6).Obteniendoquela diferencia entrelos MESORes,tanto enunidadesoriginales, como
en las transformadas enlogaritmos,son estadísticamentesignificativas.
Lasgráficas14. 15. 16 y 17 sonplexogramasen los que estánrepresentadaslas
concentracionesde los marcadoresde crecimiento,a distintashoras del día. En los
gráficos 14 y 15 secomparanlas concentracionesde CAI2S y CA130de muestrasde
saliva,halladasen los datos originales(14> y en datostransformadosen logaritmos
(35). En los plexogramas16 y 17 se puede vercomovarían las concentracionesdel
CAÍ3O a lo largo deldía, con datos originalesy transformadosen logaritmos,en 61
muestras desaliva.En todos los plexogramaspodemos ver lasignificaciónestadística
del ritmo circadianode los marcadores,halladatanto medianteel ANOVA comopor
el métodocosenor.
95
La gráfica18 representala curvacoseno(circadiana)que mejor seadaptaa los
23 datos del marcadortumoralCA12S de una mujer clínicamentesana,medianteel
método linealde los mínimoscuadrados;indicándonoscual essu MESOR, amplitud,
acrofase,valor de p y porcentaje delritmo. En el eje de ordenadas estárepresentado
el tiempo, días de abril de 1992, y en el eje de abcisas se representalas
concentracionesde CA12S en U/ml.
En la Rráfica 19, seobserva,al igual que enla gráfica anterior, que lacurva
cosenoque mejor se adaptaa los 61 datos del CAl3O esuna curva circadiana,y
también las característicasdel ritmo obtenidas medianteel método lineal de los
mínimoscuadrados.En el eje deordenadas estárepresentadoel tiempo(díasdeAbril
de 1992), y en el de abcisaslas concentracionesdel marcadorCAl3O (U/mí).
La gráfica20 representala curvacosenoque mejorseadaptaa los 14 datosdel
marcadorcrecimientoCA13O en otro sujeto (GC) en estecaso,y a diferencia del
anterior, la curva que mejor se adapta no es una curva circadiana sino
circasemiseptana.En este gráfico también se obtienen los valores delMESOR,
amplitud, acrofase,valor de p y porcentajedel ritmo. En el eje de ordenadasestá
representadoel tiempo, endíasde abril de 1992, y en el eje de abc¡sasserepresenta
las concentracionesde CA13O, en U/ml.
La gráfica 21 esunarepresentaciónde la amplitud delCAI3O, comoespectro
de frecuencias,de tressujetosclínicamentesanos.En los dos de la izquierda(AP y
JH) se observaunaprominenciadel espectrocircadiano(24 horas);mientras queel
sujeto cuyo espectro está representadoa la derecha (GC), presentaun ritmo
circasemiseptano(84 horas) predominante,con ausenciadel ritmo circadiano.
Las gráficas22 y 23 representanparte del cronomade unapacientecon un
adenocarcinoma queenvuelveel ovario, obtenido de un total de 669 muestrasde
saliva recogidasentre el 23 de Enero y el 6 de Julio de 1992. Aparte del ritmo
circadianoprominente con>r = 24 horasy dos arménicosde 12 y 8 horas,de ambos
marcadoresde crecimiento(parte superiorde lasgráficas),podemosver que elCAI2S
96
presentaun ritmo circaseptanosincronizadode 7 díasy un componentede 22,7 días,
mientras queel CA130 presentaritmos infradianosdiferentes alos del CAl2S:
circanuales, circadiseptanoy un ritmo circaseptanodesincronizador = 7,6 días
(p= 0,009)(parte inferiorde las gráficas).
En la gráfica 24 seobservala evolución detalladade los dos marcadoresde
crecimientoa lo largo de la escalacircadiana,cuandorepresentamoslos datos del
CA125 y del CA130, de EH, en unplexogramacircadiano;en el que los datosde
aproximadamente4 mesesse agrupan en un periodo“ideal de 24 horas(ideal,puesto
que enél se incluyen la totalidadde los datos),asignándose dichosdatosa 24 clases
diferentesde 1 hora.Se observaque ambos marcadorespresentanun ritmo circadiano
muy similar, demostrado estadísticamente,tanto mediante ANOVAcomo por el
métodocosenor.Esto nos da unaaproximaciónde la evoluciónde estosmarcadores,
a lo largodeldía, asícomolas concentracionesaproximadasen cada hora(clase).Los
valores máximos se producen entrelas 06:00y las 07:00, similaresa los descritos
anteriormenteen los gráficos 14 a 17, en los quelos valoresmáximosse alcanzaban
entrelas 04:00y las 08:00,al ser lasclasesde 4 horas.Seobservaconun segundopico
entrelas 18:00y las 19:00.
En la gráfica 25 está representadoel patrón circaseptanodescrito por el
CA125salivarde una pacientecon cáncer.En esteplexogramavemosque los valores
máximosdel CA125 seproducenlos lunes,y en menor medidalos domingos.Los 513
datos,recogidosentreel 22 de Febreroy el 29 de Mayo de 1992, se agruparonen 7
clases,de 24 horascadaclase,correspondiéndosecadauna, conun díade la semana,
comenzandopor el domingo.
Estosmarcadores decrecimiento,hasta ahoraexclusivosde la especiehumana,
fuerondeterminadostambiénen diferentesespeciesanimales,en sueroy/o saliva.
Estosresultados aparecen en lagráfica26, juntocon los de otrasmujerescon cáncer
ginecológico, conovariospoliquisticos, sanasy con los de unhombre.
97
En la gráfica 27 se aprecia quelas concentracionesde CA125 y CA13O
salivaresestáncorrelacionadasde forma positiva con las séricas,y son mucho más
altas en el primer fluido, que en el segundo,en humana, siendo la relación
saliva/suero> 30 en personassanas;la relación en ratasfue de 1,76. Resultados
basados en3 muestrasde suerofrente a8 de saliva,y la relación envacasesde 1,58
(basadoen 14 muestrasde saliva frente a2 de suero),similar al observadoen ratas.
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102
TABLA 8: COMPARACION ENTRE LOS MARCADORES DE CRECIMIENTO,CA12S Y CA13O, EN UNA PACIENTE CON CANCER DE OVARIO PARA
DIFERENTES CONCENTRACIONES DE CA 125*
CA125(U/mí) N
Media+ES
CA 125(UImí) CA 130(UImI)200-300 7 264 + 7 200 + 16300-400 15 348 + 6 269 + 17400-500 16 453 + 7 332 + 16500-600 20 550 + 6 403 + 27600-700 13 641 ± 7 500 + 31700-800 11 750 + 9 512 + 40800-900 19 865 + 6 569 + 38900-1000 18 947 + 7 647 + 37
1000-2000 86 1471 + 32 984 + 312000-3000 57 2506 + 37 1607 + 653000-4000 51 3407 + 40 2244 + 884000-5000 27 4469 + 56 3252 + 2375000-6000 29 5540 + 53 3356 + 1576000-7000 18 6435 + 75 3912 -4- 1877000-8000 12 7302 + 75 4039 + 2428000-9000 18 8347 + 58 4713 + 2479000-10000 13 9534 ± 61 5076 + 417
> 10000 8 12846 + 906 6292 + 587
438 muestras de saliva sin estimular (sin enjuagarse la boca),de 1.992; N=n’> dedatos por clase; ES=error standard
recogidasentre el 6de Marzo y el 27 de Mayo
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Unidades trariformadasen Iog.
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Amplitud 854
Valor de P= 0,090
Porcentaje Ritmo = 21No. Pts. 23
Acrofase rn -89~ (05:57)
Gráfica 18
10 11 12 13 14Tiempo (Días de Abril, 1992)
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Ritmo circadiano del CAl 30
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2000
1000
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Periodo A¡ustado~MESOR~
Amplitud =
Acrofase
24 horas11951020.-92 (05:09)
Valor de PPorcentaje Ritmo
No. Pta.
Gráfica 19
10 12 14 16 18 20tiempo ( Días de Abril, 1992)
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112
2500
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Periodo Ajustado.MESOR.Amplitud =
Acrofase
84hieio Valor de Pa Porcentaje Ritmo -
~ N0 Pts.
Gráfica 20
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Periodo, (Olas)
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Frecuencia (Ciclos por Año)
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Periodo, (Olas)
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1000
500
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3.400E
.4<
0
Gráfica 23
200
1500
1 100 200 300Frecuencia (Ciclo por Año)
116
laaDo-ANOVA
cAl2S F = 20,810 (P <0,001)VAlSO F = 19,544 (P <0,001)
II}lESdeV7.500-
5.000-
2.500
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‘Media,7 ¡Y
a — a
0M25 2AtS.347(P<QDOl)VAlSO 2Arn3242<P<QOO1)
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(0A125) (VAlSO)
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Total N
17 535
.3[II
16
00:00 OtGO OtilO 12:00 lOSO 2050 00:00
516
Gráfica 24
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100 t
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Subtotales:
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Medía de Analísís repetidos en MuestrasSeparadas del Mismo Individuo.
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119
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Media Total, ~
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MUJERES
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oEspecies
Numero deAnalísísSalivaISuero: 811 14/2 >250/>100
Gráfica 27
Rata yace Hombre
CC 10,92
120
EKiPERIMENTO 3: MOFASE CIRCATPJGINTANA ENTRE LA PRESION
SANGUíNEA Y LA FRECUENCIA CARDIACA
En la tabla 9, se resumenlas característicasde los ritmos circadiano y
circatrigintano (MESOR, amplitud y acrofase),acompañadasde sus límites de
confianzadel95%.Todoséstos,calculadosmedianteel métodocosenor,considerando
parael ritmo circadianolos datosoriginales(n= 8583) y parael circatrigintanolos 92
MESORescircadianos.
La tabla 10 muestralas característicasdel componentecircasemiseptano(3,5días),quese aprecia en lafrecuenciacardiaca,perono en ningunade lasvariablesde
la presión sanguínea(PAS, PAMy PAD).
La gráfica 28 obtenida medianteel método de los mínimos cuadrados,
representala evoluciónde la presión sanguíneasistólica,arterialmediay diastólica,
y de la frecuencia cardiaca,a lo largo de 3 mesesaproximadamente;y muestrala
curva coseno,de aproximadamente720 horas (1 mes), que mejor se ajusta a los
valoresde la PSy FC, enestecasolos MESOResqueseobtienende cadadía (cada
puntorepresentaun MESORcircadiano,considerandointervalosde 24 horasqueno
se superponen).Las líneasverticalessecorrespondencon el comienzode cadaciclo
menstrual.El eje de ordenadasrepresentael tiempo (mesesde 1992) y el eje de
ordenadasla presiónsanguínea(mm de Hg) y la frecuencia cardiaca(ppm).
El gráfico 29 nos proporciona unarepresentaciónpolar de los resultados
anteriormenteobtenidos en la gráfica 25. En la representaciónpolar circadiana
(derecha),se han empleadolos datosde unasemana.Se puede observar quese ha
tomadocomotiempode referenciala medianochelocal (00:00),por tanto 00 = 00:00
y 3600 24 horas.La banda oscurasecorrespondecon la duraciónde las horas de
sueño.Las elipsesde confianza(A, B, C y D), referentes a laPS y a la FC, están
localizadasen la mismazonade la circunferenciapolar,esdecir susacrofasesocurren
aproximadamentea las mismashoras.Las elipsesde confianzase superponen entre
121
sí, y al no encerrarel centro de la circunferencia,el ritmo es estadisticamente
significativo.
Al observarla representaciónpolardel ritmo circatrigintano,la circunferencia
equivale a 720 horas y 00 al primer día de un ciclo menstrual; se puedever la
diferenciaen gradosentrelas fasesde la PS (A, B y C) y de la FC (D).
122
TABLA 9: RELACIONES EN LA FASE CIRCADIANA Y CIIICATRIGINTANAENTRE LA PRESION SANGUNEA Y LA FRECUENCIA CARDIACA
EN UNA MUJER CLINICAMENTE SANA
Variable PR p MESOR±ES 2A+ES 4495%IC)
Componentecircadiano (datos originales; 17/04-28/07;n8583)
PASPAMPADFC
25,126,328,322,1
<0,001<0,001<0,001<0,001
107 0 + 0 182 0 + 0 163 9 + 0 178 3 + 0 1
19 4 + 0,418 8 + 0,415 0 + 0,218 8 + 0,4
~258Ó(~255,-260)-255~(-253, -257)~255O(~253,-257)~247o(~245,-250)
Componente circatrigintano (periodo: 720 horas; 17/04-28/07;n’92)
PASPAMPADFC
15,316,210,38,5
<0,001<0,001
0,0100,024
1070 +0482 9 + 0 364 5 + 0 379 2 + 0 4
4 8 + 1,24 0 + 1,02 4 + 0,83 6 + 1,2
~131o(40l,-160)~144o(416,-172)~170o(~132,-208)~292O(~245,-336)
¡‘AS: ?reuióruarterial aiatólic,u¡‘AM: PresiónarterialmediaPA)): Preuic5n arterialdiastólicaFC: FrecuenciacardiacaPR: Porcentajedel ritmo proporciónde la variacióntotal calculadaal ajustarcl modelop: Valor p de unu leaL de amplitud (12A: Doble amplituda: Acrofase (3ÓIY — duracióndcl periodoenhoraso dias; O> £Ú:Ú~ del primerdía dcmenstruaciónparalos componenlescireadianoy circatrigintano>ES: ErrorstandardIC: IntervalodeconfuanzaEl anílisis circatrigintanofué realizado enlos Ñ2 MI3SOReacircadianos
123
TABLA 10: COMPONENTE DE APROXIMADAMENTE 3,5 DíAS(CIRCASEMISEPTANO) EN LA FRECUENCIA CARDIACA DE UNA MUJER
CLINICAMENTE SANA
Variable PR p MESOR+ES 2A+ES 4495%IC)
PASPAMPADFC
0,61,50,8
10,3
0,9370,6440,8630,010
107,7 + 0 582,8 + 0464,5 + 0 379,2 + 0 4
0 5 + 1,31 0 + 1,10 4 + 0,83 9 + 1,3
~j39O
~162o
~106o
~197o(~158, -237)
PAS: Presión arterial sistólicaPAM: Presión arterial mediaPAD: Presión arterial diastólicaFC: Frecuencia cardiacaPR: Porcentaje del ritmo, proporción de la variación total calculadaal ajustar el modelop: Valor de p de un test de amplitud O2A: Doble amplitud~: Acrofase(3600= duración en horas del periodo;00 = 00:00 del 17 de Abril)ES: Error standardIC: Intervalo de confianzaEl análisis circatrigintano fié realizado en los 92 MESORes circadianos
124
Presion Sanguirlea <PS)
,5
5~• . 5
—0’•~• 5. 5 5
— ¡
eN55 •s
a..
.5
½ÑÁ•
Su
c-~.
Sistolica
Media Arterial
Diastolica
Frecuencia Cardiaca (FC>
Mayo
• ..5 5~
MESOR Diaria
(N 92)
JunioTiempo (Meses de 1992>
Acrofase ~e~95%I.C~~131 ( -92,.1440 (.107,.1700 (•118,.2920 (-226,
-169)
..202).358)
Gráfica 28
120
100 -
-a.
clzE
O.0
80-
60-
A
90
‘1o.ka
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80-
70 t
<>0.1~5 e
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5 .5
Abril Julio
SBPMAPDepMR
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(UO.
126
DISCUSION
:
EXPERJMENTO 1 VARIA ClON CIRCAL)IANA DEL CORTISOL
El mayor glucocorticoide,producidopor la corteza adrenalde los conejos,es
el cortisol; la relaciónentrecorticosterona:cortisoles 1:20 (Ganjama aL, 1972).Esta
relación cambia hacia un exceso en la producción de cortisol bajo algunas
circunstancias;unade estases la acciónde estímulosexógenos,comoson, el manejo
o las repetidaspuncionesvenosasdel sangradoserialmentedependiente(Singh et al,
1975; Redgateel al., 1981; illera a aL, 1992).
El ritmo de los corticosteroides adrenalesde los mamíferos,fue descrito,
inespecíficamente,en los pionerosestudiosde Pincus,y más tardefue confirmada
medianteel empleo de distintos protocolospor otros autores,como Ganjamet al
(1972),Singhel al. (1975)y Sowersel aL (1981).Asimismo fueestudiadaendiferentes
especiesde laboratorioy principalmenteen la especiehumana porHalberg(1964),
Weitzmanel al. (1971), Aschoff (1979), Dalle el al. (1980), Fujieda el al. (1982) y
Garris (1986).Pero, pesea esto, la mayoríade las citasconsultadassuelenreferirse
a la existenciadeun granmargenqueoscila entre0,6 y 5,8 ng/dl (Depaoloy Masoro,
1989) y citan que por las mañanaslos valores son más altos. Como podemos
comprobar, nuestrosvalores de los conejos sangradosde forma serialmente
independiente, se encuentran dentrode esteamplio margen,no ocurriendolo mismo
conlos conejossangradosde formaserialmentedependiente.Estospresentanalgunos
valoresque sesalenfuera delmismo margen. Al indicar, estosautores, que porla
mañana presentanvaloresmásaltos,se nos presentala duda de, si es porla mañana
nuestra(es decir podríanser las6:00, las 7:0<), las 8:00, las 9:00 h) siendoestemargen
bastanteamplio (dependiendode la personaque recojala muestra);o bien si esla
mañanadel conejo,quese correspondecon nuestranoche,pues, como esde todos
conocido,los conejos(Oiyctolaguscuniculus)son animalesnocturnosal igual que ratas
y ratones,y además la mañanade los conejosdependeríade cuándoseenciendela
luz en cadaanimalario.
128
Halbergel al. (1981) realizaronestudiossobreel cortisol plasmáticoenmujeres
clínicamentesanas,describiendounaforma de la curva circadiana delcortisol, que
presentabaun pico principal por las mañanasy un segundo picopor las tardes.
Nuestrosresultadosconfirmanla existenciade estosdos picos,comoquedareflejado
en la tabla2, en la que podemos vercomo, tantoel componentede 24 horas comoel
de 12 horas,sonsignificativosestadísticamente;y al considerarlosde forma conjunta
obtenemosun valor p<0,001, tanto para los conejossangradosSD y SI, lo que
significa la aceptación dela existenciade un ritmo circadianocon un componente
circasemidianoque influye en la forma de la curva, de forma estadísticamente
significativa.
Ritmocñcadianoen el con’isolplasmáticode los conejos.
Los datos del cortisol, de todos los conejos,fueron analizadosmedianteel
empleo del método cosenorsimple, en un ciclo de luz dado y de acuerdocon un
esquemade obtención de muestrasdeterminado,revelando un ritmo circadiano
estadísticamentesignificativo entodoslos casos,bajo todoslos ciclos de luz:oscuridad
(LO) delestudioserialmentedependiente(SD) conunasignificaciónde p < 0,001;en
el experimento serialmente independiente(SI), los ciclos LO 14:10,LO 16:08 y LO
10:14 mostrabanunasignificaciónestadísticaconunap < 0,001 y, sin embargo,bajo
LO 12:12, la p= 0,002,y bajo 08:16, la p= 0,003 (tabla1).
El ajustede un modelocompuestopor dos componentes,con períodosde 24
y de 12 horas,mediante elmétodode los mínimoscuadrados,indica que ambosson
estadísticamentesignificativos (p < 0,001) para los animales alojados en los 5
diferentesfotoperiodos,tanto en el casode quelas muestrasseobtuviesende forma
serialmente dependiente,comoindependiente (tabla2).
El componente circasemidiano contribuye,de forma estadísticamente
significativa,a la forma de la curvadel ritmo circadianodelcortisol de los conejos(p
< 0,001, salvo en el régimen LO 10:14 del grupo SI, p= 0,029). La prominencia
relativa deestos dos componentes,circadianoy circasemidiano,va a diferir entre
129
conejossangradosde forma serialmentedependiente,y aquellos sangradosde forma
serialmente independiente; mientras queparalos primerosel componentede24 horas
es más prominente queel componentede 12 horas,paralos segundosel componente
circasemidianoes más notableo de la mismamagnitudqueel circadiano.Unanálisis
cosenode medias depoblación,aplicadoa lascaracterísticas(M, A, q, PR) delritmo
del cortisol delos conejosbajo los diferentesciclos de luz, revelaun ritmo circadiano
y circasemidianodepoblaciónestadísticanientesignificativo, enlos conejossangrados
de forma SD (r =24h: p~ 0,019 y r = 12 h: p= 0,028),pero no paralos sangradosSI,
aunquesu componente de12 horas es casi significativa, (p= 0,079) (tabla2). Estos
resultadosindican, que las caracteristicasdel ritmo circadiano del cortisol son
diferentes,dependiendode la forma de extraer las muestrassanguíneasen los
animales.
Obtención de muestras deforma serialmente dependiente (SD)o serialmente
independiente (SI).
Los MESORes,amplitudesy acrofasesdel ritmo circadianodel cortisol se
compararonentrelos conejossangradosSD y SI, de forma separadapara cadacilco
de luz (tabla 1).
De forma global, existeunagran diferencia encuantoal MESOR delcortisol,
los conejossangradosSI tienenmenorconcentraciónde cortisol,quelos sangradosSD
(p’CO,OOl, en todos los ciclos de luz), por tanto presentanMESOResmenores.
Se apreciatambiénuna diferenciaen la amplitud circadiana,los conejos
sangradosSI tienenuna menoramplitudsi los comparamosconlos conejossangrados
SD (pc 0,001para los conejos bajociclos de LO 12:12, LO 14:10 y LO 16:08; p=
0,068paraaquellosbajo un ciclo deLO 10:14 y p= 0,092 paralos conejosalojados
en LO 08:16). Como se puede ver enlas gráfica 1-5; unas altasconcentracionesde
cortisol,y unagranamplitud circadiana,caracterizan alos conejossangradosde forma
serialmentedependiente,en relaciónconaquellos sangradosde forma independiente.
130
Al compararlos valoresdel MESORdel cortisol de los conejossangradosSD
y SI, por parejas,medianteel t-test, aparece una diferenciade 3 2 + 0 6 ng/ml
(t=5,421; p= 0,006).Parala amplitud circadianaseencuentraunadiferenciasimilar,
siendo estade 32 + 0,9 ng/mI (t=3,671;p= 0,021).Sin embargo,cuandoexpresamos
la amplitud en relaciónal MESOR, la diferencia(25,1 ± 13,2%)no es significativa,
aunque estácasi enel límite (u= 1,902;p= 0,130).
En LO 10:14 y en LO 08:16, esdecir, en ciclos de luzcon una fotofracción
menor de12 horas,la amplitud circadianarelativa(A/M), del ritmo del cortisol fue
estadísticamentediferente, aunqueno de forma significativa, siendomayor en los
conejosSI que enlos SD; sin embargo,cuandolas amplitudesestánexpresadasen
unidadesoriginalessucedelo contrario (tabla1).
En resumen,seobservaun ritmo con aproximadamenteel mismo periodo en
cadaciclo de luz, y en ambosmétodos de obtención de muestras(SD y SI). El
sangradoSI estáasociadocon un MESORy una amplitud circadianadel cortisol
menores,si los comparamoscon los sangradosSD.
Relación entre la amplitud circadianadel cort¿voly la duración delperiodode lui
En los conejossangradosSD seobserva,quela regresiónlineal de la amplitud
circadianacon la duraciónde la fotofracción del ciclo de luz, es estadísticamente
significativa(R 0,642;p 0,005),gráfica8. Estosresultados provienende los análisis
individuales,en los que cadaconejoprovee unaestimaciónindividual de la amplitud.
En los conejossangradosde forma SI, no se encuentraunarelaciónsimilar entrela
amplitud circadianadel ritmo del cortisol y la fotofraccióndel régimende luz.
Estos resultados a lavez soninteresantes porque, enmujeres clínicamente
sanas,se vió quela amplitud circadianadel cortisol es mayor enprimaveray verano
(más horasde luz), que en otoño einvierno. Esta diferenciase hacemayor incluso,
si comparamosúnicamenteveranoe invierno (tabla3).
131
Comparaciónentre los diferentesregímenesde luz.
Muestreo serialmentedependiente.
Aunquelascomparacionessehayan hecho,tanto enbasea seriessimplescomo
en base a procedimientosdel método cosenor de medías de poblaciones,se
encontraronlos siguientes resultados:
El MESOR delcortisol esmayor en los conejosalojadosen un ciclo de LO
12:12,que enaquellos alojadosen otros ciclos (p< 0,050) y el MESOR delcortisol
de los conejosmantenidos en unrégimen de LO 08:16, es menor queel de los
alojadosen el restode los ciclos (p< 0,001).
La amplitud circadianadel cortisol de los conejossometidosa los ciclos LO
10:14 y LO 08:16,es menor quela amplitud de los conejosalojadosen otros ciclos
(p.c 0,020).La amplitud, en los conejoscon LO 08:16 esligeramentemenor quecon
LO 10:14 (p 0,018,medianteel testdepoblaciones).Cuando seexpresala amplitud
circadianaen relaciónal MESOR (% del MESOR),estasigue siendomayor en los
conejosalojadosenLO 14:10queen los conejosalojadosbajo otros ciclos (p.c 0,050,
exceptoparaLO 16:08).
La acrofase circadianadelcortisol de los conejosenLO 12:12ocurremás tarde
(p.c 0,020,medianteel test de poblaciones),mientrasquela acrofasedel cortisol en
los conejosmantenidosen LO 14:10ocurre más temprano(p.c 0,050) quela de los
conejosalojadosenotros regímenes.
Muestreo serialmente independiente.
Con estetipo demuestreoel MESORdel cortisol de los conejos,en LO 10:14,
es mayor queel de los conejosen LO 12:12 (p~ 0,035), el cual es, a su vez, mayor
queel MESOR delos conejossometidosa otros regímenesde luz (p.c 0,010).
132
En los conejosdel ciclo LO 10:14 seobserva unaamplitud circadianaalgo
mayor (pc 0,050), con respectoa los demás(exceptoparaLO 08:16). Cuandola
amplitud se expresaen relación al MESOR, no se encuentrandiferencias
estadisticamentesignificativasentrelos diferentes regímenesde luz.
Las diferenciasen laacrofase circadianadel cortisol, no son constantesentre
los conejossangradosde forma SD o SI. Los intervalosde confianzapara los conejos
sangradosSI, bajo diferentesciclos de LO, no se solapan(figura 3). Por lo que se
refiere a la dispersión de las acrofasesdel ritmo circadiano, en los diferentes
regímenesde luz de los conejossangradosde forma SD (gráfica9), ésta esmucho
menorsi la comparamoscon la dispersiónque existeen las acrofasesde un régimen
de luz a otro enlos conejosSI <gráfica10), aunque seelija comotiempo dereferencia
HAML u otros tiempos (HALO, HADO o HAMD). Existe la posibilidadde quelos
animales,alojados bajodiferentesregímenesde luz, fueran estudiadosen una etapa
diferente de otroritmo biológico, comopuedeser el circanual,el cual puedehaber
contribuido enlas diferenciasen acrofase. Estose podríaexplicar en posteriores
estudios,al confirmar unamodulación circanualde lascaracterísticascircadíanas,en
conejossangradossistemáticamenteendiferentes regímenesde luz, paracomprobar
cambiosconcomitantesa lo largo dela escalacircadiana, circaseptana(Uezonoct al.,
1984) y circanual.La existenciade estasvariaciones circanualesen el cortisol de un
grupo demujeresfue estudiada por Halberg(1991) y quedareflejado en la tabla3.
Los resultadosobtenidosennuestro estudiodemuestranla existenciadel ritmo
circadianodel cortisol plasmáticoen conejosNZW machos,sin quetengainfluencia,
en este ritmoendógeno, la forma de obtención de las muestras.También se
demuestrany cuantificanlos parámetrosdel ciclo adrenocortical enlos conejos,tanto
en los sangradosserialmentedependientecomo en los serialmenteindependiente.
Hallazgos similaresfueron descritosen ratones (Halbergy Visscher, 1950, 1952;
HalbergeraL, 1958, 1959))utilizando comoparámetroa estudiarlos eosinófilos,yen
rataspor Glick a aL (1961); en estoscasos, la relacióncorticosterona:cortisoles
inversa a la del conejo, puesto que enestos animales el mayor glucocorticoide
producido por la corteza adrenal,no es el cortisol, sinola corticosterona.
133
Una vez demostradala existencia del ritmo circadiano del cortisol,
comprobamosla influencia del fotoperiodo (tantode la fotofracción como de la
escotofracción)en las concentracionesde cortisol plasmático,dependiendodel tipo
de sangrado(SD y/o SI). La amplificacióndel ritmo circadiano,medianteregímenes
de luz con unamayor fotofracción,puede deberse, en parte, a unahiperproducción
de cortisol por partede la corteza adrenal estimuladapor el efecto dela luz, como
quedareflejado en la gráfica 8, en el que podemosobservarla existenciade una
correlación positiva(R= 0,642> entre laduraciónde lashorasde luz y la amplitud del
cortisol (p.c 0,001). Aunque anteriormentese llevaron a cabo estudiossobre este
tema,endiferentesespeciesde laboratorioy en seres humanos(Nichoisy Tyler, 1967;
Nichols y Chevins,1981; Fujiedaet al., 1982; Haenet al., 1984; Garris, 1986), se
encuentranmuy pocostrabajosde la influenciade los ciclos de luz-oscuridaden las
concentracionesde cortisol plasmáticoen los conejos(Sothernet al., 1978; Sotherny
Halberg, 1979). Observamosque a mayor duración de la fotofracción más
pronunciadoes el ritmo circadiano,produciéndoseel pico de las concentraciones
plasmáticasde cortisol antes delinicio del periodo deoscuridady la gran influencia
delperiodode luz enel descensode los dospicosdecortisol discutidosanteriormente.
Haciendoun breveresumende lo tratadoanteriormentepodemosdecir, que
se demuestrala existenciadel ritmo circadianodel cortisol, con participaciónde]
componentecircasemidianoen la forma de la curva, sobre todoen los conejos
sangradosde forma serialmenteindependiente.Estos a su vez presentanmenores
MESOResy amplitudesquelos sangradosde forma serialmente dependiente,lo que
nos indica una mayor síntesiso liberacióndel cortisol ante determinadosestímulos.
Tambiénestudiamosla influenciade la luz enel ritmo delcortisol,comprobandoque
en los animalesquesangrabamosde formadependiente,cuanto mayorerala duración
de la fotofracción, mayor era la amplitud; produciéndoselas acrofasesantesdel
periodode oscuridad.
Todoello nos conducea teneren cuenta,y utilizar, los diseñoscronobiológicos
a la horade investigarcualquier variablefisiológica,puesto queel conocerlos ritmos
biológicos (en este caso sincronizadospor el régimen de luz) de muchas de las
134
característicasde los animalesde laboratorio, puede ayudarnosa reducir la gran
variabilidadde las mediciones cuantitativasen los mismos(Wollnik, 1989).
135
:
EXPERIMENTO 2 MARCADORESDE CRECIMIENTO, CA125Y CA130
Cuando analizamos los 23 datos de los dos marcadores de crecimiento,CA1125
y CA13O (transformadosen logaritmos) procedentesdeunamujer clinicamentesana,
medianteun análisis de varianzade un sentido,se muestraun efecto deltiempo,
estadísticamentesignificativo, (CA125:F= 3,149;p= 0,034), (CA13O: F= 3,081;p=
0,037> (gráfica 15). Cuando los análisis se llevan a cabo en los datosexpresadosen
unidadesoriginales,el efectodel tiempoes casiestadísticamentesignificativo (CA125:
F= 2,395; p~ 0,081> (CA130: F= 2,230; p= 0,099) (gráfica 16); encontrándose
también unasignificación estadísticadudosa parael componentecircadiano, al
analizarlos 23 datosmedianteel métodocosenorsimple (gráficos 15 y 16). Unavez
que disponemosde másdatos,como en el caso del CA13O, determinadoen las 61
muestras recogidasentreel 10 y el 21 de Abril, los resultadosson estadísticamente
significativos(p.c0,001) tanto medianteANO VA, comomedianteel métodocosenor
simple (p’cO,OOl) (gráficos 17 y 18).
Parala obtencióndeestosgráficos,los datosfueronagrupadosunos conotros,
en unas24 horas“ideales’ y asignadosa6 clasesdiferentesde 4 horas,de acuerdocon
la hora deldía. Cuandose comparanlas variaciones circadianasdel CA125 y del
CA13O, se puede observar queentrelas 04:00 y las 08:00horas,y en menor medida
entrelas 08:00y las 12:00 horas,tanto el CA125 comoel CA130estánaumentados,
al compararloscon los valoresdel resto de las horas.
El ritmo circadiano de los marcadores decrecimiento CA12S y CA13O
encontradoenesta personasana,separeceal encontradoenuna pacientecon cáncer
de ovario (EH) (Cornélissenet aL, 1991), sibien conunaamplitud circadianamenor
y un considerablemenor MESOR enla primera.En las gráficas 12 y 13 se pueden
observarestasdiferencias,estadísticamentesignificativas, entre los MESORes de
sujetossanosy con cáncer,tanto cuandose calculaen valoresoriginales (t = 2,837,
136
p = 0,0 13) como en valores transformados en logaritmos (t 3,384, p= 0,004).
Anteriormente citamos la existencia de un ritmo circadiano, en ambos
marcadores de crecimiento, demostrandolo tanto mediante análisis de varianza como
mediante el método cosenor (gráficas 14 a 17 y tabla 5>. Cuando representamos la
curva coseno que mejor se adapta a los 23 datos de CA12S (gráfica 18) y la quemejor
se adaptaa los 61 datos del CA13O (de AP), medianteel método lineal de los
mínimos cuadrados,obtenemosdos curvascircadianasdeigualescaracterísticasa las
encontradas anteriormente.
Se puede apreciar, de forma casi invariable, que el pico de la concentración
salivar de CA13Oocurre por las mañanas. Pero cuando tratamos de ajustar una curva
coseno, a los 14 datos del marcador de crecimiento CA130, de otro sujeto (GC), la
curva que mejor se adapta es una circasemiseptana, Esto quizá esté en relación con
una histerectomia sufrida unos añosantes (gráfica 20). Estos ritmos están
representadoscomoespectrosde frecuenciaen elgráfico 21, dondeseapreciacómo
sobresalenlos ritmos predominantesde entre los demás.
La tabla4 esun resumen estadísticode las23 muestrasde CA125y de CAI3O
de una persona clínicamente sana, expresados en unidades originales y despuésdesu
transformación enlogaritmos,antes ydespuésdelenjuagadode la boca.En ella están
reflejados: la media, su error estándar, el valor mínimo y el máximo, y la mediana de
cadavariable. El CA125 presentamayoresconcentracionesque CA130, cuandose
recoge la saliva antes del enjuagado de la boca; pero cuandoestasdeterminaciones
sellevan a cabo en muestras recogidas despuésdel enjuagado, encontramosque las
concentracionesde CA13O son ligeramente superiores,quelas de CA125.
De nuevo, al observar detalladamente cómo varían las concentracionesde los
dos marcadores alo largo del día (tabla5), observamos que los valores totales o los
MESORes enlasseriesde 23 y en lasde 61 datos,el marcadorde crecimientoCA125
es,en general,mayorqueel CA130, en los datos originalesy en los transformadosen
logaritmos,al dividir las concentracionessegúnel momentocircadiano.
137
Si comparamos las medias del CA125 y del CA130, antes y después del
enjuagado de la boca, de AP, con los de otro sujeto sano (GC), se obtienen unas
diferencias estadísticamente significativas, tanto para el CA125 (AP, p = 0,003; GC,
pc 0,001), como para el CA13O(AP, p= 0,007; GC, pc 0,001) (gráfica 11). Por tanto,
las concentraciones de los marcadores de crecimiento son mayores antes de enjuagarse
la boca quedespués.
Otrohechoa destacar,esqueencontramosquelasconcentracionesde CA13O
eran menoresquelas de CA125, estoesopuestoa lo publicadopor Kobayashiet al.
(1991),dichosautores determinaronambosmarcadores endiferentestejidos,asícomo
en fluidos, como amnios,corion, placentay líquido amniótico, para estudiar la
relaciónexistenteentreel CA12Sy el CAI3O. El coeficientede correlación(de 0,987)
entrelos dos marcadores,dadopor estosautores,seobtieneenasociacióna la recta
de regresión:
Y = 377,7+ 0,969X
dónde Y representala concentraciónde] CAI3O en U/ml y X representala
concentraciónde CA125, también enU/ml. Cuando usamos estaecuaciónpara
deducirlosvaloresrelativosde los dosmarcadores,seesperaríaqueel CABO tuviese
concentracionesmás altas queel CA125, pero nuestrosresultadosindicaban lo
contrario.
Resultó entonces interesante investigar otrasseriestemporales,paracomprobar
si el CAI3O era menor queel CA12S salivares,de forma consistente,o bien las
diferencias encontradasse debían a unamera variación interindividual. Al
comprobarlo,conotrossujetos,seencontróqueel CA13Oeraconsistentementemenor
queel CA125, tanto ensalivarecogidasin estimular,comoen la recogida despuésdel
enjuagadode la boca, comoquedareflejadoen la tabla 6; únicamenteen el casode
AP, cuando se recoge la saliva despuésde enjuaguarsela boca, el CA130 es
ligeramentemásalto queel CA125.
138
Al analizar las concentracionespor espaciosde tiempo, se encontróque la
diferenciaentreestosdos marcadoresesmayor, cuandolasconcentracionesson más
altas durante la noche y menor cuando las concentraciones sonmáspequeñas (tabla
7). Al comprobar si las diferencias estaban en función de las concentraciones de los
marcadores,vemos quede nuevoel CA13Oes consistentemente menor queel CA125
(tabla8).
Se compararonentresilos marcadoresCA13O y CA125 séricosde lamisma
paciente con cáncer de ovario, y comprobamos que la diferencia de 238±47U/ml era
estadísticamente significativa en una prueba (test) t por parejas (t = 5,082;p = 0,001)
y guardan relación con los resultados obtenidos en la saliva.
Podemos asumir, que el CA13O, tanto de sujetos sanos como con cáncer, tiene
menores concentraciones al compararlo con el CA125 y estos dos presentan un ritmo
circadiano con similares características entre sí, y con los de una paciente con
adenocarcinoma que envuelve el ovario. Esta prominente variación circadiana,que
caracteriza ambos marcadores, se debe tener en cuenta a la hora de establecerlos
críticos momentos de recogida de muestras, tanto satguíneas como de saliva,
especificadosen el tiempo, así como al instaurarun tratamientoterapéutico,para
determinar en quemomento exacto del día se deben administrar los fármacos
(Halberg, 1983).
Chenet al., en 1990 propusieronun valor límite de 3000 U/ml parael CA125
salivar,recogidopor la mañanay despuésde uncuidadoso enjuagadode boca.Esta
estipulación,usar el valor de la mañanadespuésdel enjuagado,es un paso en la
dirección correcta. Aunque, si se refiriese al momento de levantarse,sería una
especificaciónen el tiempo más precisa,y reduciríaciertas dudasrelacionadascon el
momentodeacostarse;por ejemplo,enun trabajador concambiode turnode trabajo.
Estaconsideraciónsólotendríasentido,cuandolasdeterminacionessehiciesenen las
muestras recogidas en el momento de levantarse,puessi lo hiciésemosen muestras
recogidas sobre la 13:00 horas, no detectaríamos ningún paciente con cáncer, y es
cuandolas concentracionesde los marcadoresde crecimientoson mínimas.Aunque
139
queda demostrado quelos MESOResde CA125y deCA130sonmayoresen pacientes
con tumores, que en individuos sanos.
Aparte de todo lo citado con anterioridad sobre el ritmo circadiano de los
marcadores de crecimiento, éstos quedan patentes en los espectros de frecuencia
(gráficas 22 y 23), en los que, aparte del ritmo circadiano (p.c 0,001), podemos
observar el resto de los componentes de cada cronoma: el CA12S tiene además un
componente circaseptano (p = 0,003) y circavigintano (p < 0,001), en el CA13O no se
observan estos componentes, sino un circanual y uno circadiseptano (p = 0,002, para
ambos) y un componente de 7,6 días (p=O, 009), pero no de 7 días. Hasta ahora se
conocen escasos cronomas completos, el más estudiado ha sido el de la presión
sanguínea y el de la frecuencia cardiaca, encontrando en éstos un componente
circadiano (el más estudiado), ultradianos y también infradianos, pero ésta esla
primera descripción detallada de los distintos componentes del cronoma de los
marcadores decrecimientoCAI2S y CA13O, anteriormente había sido descrito con
másdetallesólo el circadiano(Halberga al., 1992; Xu et al., 1992)
Tras determinarlos componentesdel cronomadeambosmarcadores,quisimos
estudiar conmayorprecisión,el componentecircadianoy paraello representamoslos
datosdel CA125y del CAI3O (EH) enun plexogramacircadianode24 clases.Estos
plexogramas nos dan unaaproximaciónde la evoluciónde dichosmarcadores,a lo
largo del día, así como de las concentracionesaproximadasen cada hora(clase),
gráfica24. Los valoresmáximosse producenentrelas 06:00y las 07:00 horas,como
se ha descrito anteriormente para las 23 muestrasde saliva deun sujetoclínicamente
sano (AP>, cuyos máximos valores se alcanzaban entre las 04:00 y las 08:00 h, al ser
las clases de 4 horas. Observamos que ambos marcadorespresentanun ritmo
circadiano muy similar, demostradoestadísticamente,tanto medianteANOVA como
por el método cosenor (CA125: F=20,810, 2A=5347, p.c 0,001 y CAI3O: F=19,544,
2A=3242,p.c 0,001)
En resumen,de todos los análisis macroscópicosy microscópicosanteriores,
se deduceque,losmarcadoresdecrecimiento,CA125 y CAI3O, tanto de sujetossanos
140
como de pacientes con tumoresováricos, presentanun ritmo circadiano de gran
amplitud y quesiguenpatronessimilares,cuya acrofaseselocalizaentre..600 y ~8Oo,
aunque con diferencias en cuanto a amplitud y MESOR.
El componentecircaseptanodelCA125,que juntoconel circadianocaracteriza
el cronoma de EH, se puede observar representado mediante un plexograma en la
gráfica 25, en el que, los mayores valorespredeciblesse producenlos lunes.Este
ritmo es detectadocuando los datos se analizan mediante el método cosenor
(2A= 1195;p= 0,017),y medianteel análisisdevarianza,empleadoen el plexograma
(F=2,594;p= 0,017).
Estosmarcadoresde crecimiento,hastaahoraconsideradoscomomarcadores
tumoralesdel crecimientode tumoresrelacionadosconel aparatoreproductorde las
mujeres,han sido determinadostambién enel suero de unhombrey en diferentes
especiesanimales (sanos),tantoensalivacomoensuero(exceptoenel ratón) (gráfica
26). Por tanto no son exclusivosde la mujer, tampocodel género humanoy no
deberíandenominarse marcadorestumorales,sino marcadoresde crecimiento.
De los resultados obtenidos en animales, y en los seres humanos,se puede
apreciar que las concentraciones de CA125 y CA13O salivares estan correlacionadas
de forma positiva con las séricas; en la especie humana, son mucho más altas en el
primer fluido queen el segundo, siendo la relación saliva/suero > 30, en personas
sanas;la relación encontrada en ratas fuede 1,76, resultadosbasadosen 3 muestras
de suerofrente a8 de saliva y la relación hallada envacasesde 1,58 (basado en14
muestrasde saliva frente a2 de suero).
Pero, en la actualidad, es muy difícil de explicar por qué enun individuo
aparentemente sano, el CAI3O no presenta un ritmo circadiano (p 0,442) sino que
éstees reemplazado porritmo de 3,5 días o circasemiseptano(p.c 0,001), quizá esto
esté relacionadocon la histerectomíasufrida 8 años antes.Tampoco existe, en la
actualidad,unaposible explicaciónde por quéel CA125 deuna pacientecon cáncer
presentaun ritmo de 7 díasexacto (p=0,OO3),mientrasque el CA13O muestraun
ritmo, estadísticamentesignificativo, con un periodo que difierede los 7 díasexactos
141
(r =7,6; p=0,0O9). Algún día esperamos poder encontrar la solución a todas estas
dudas y a otras muchas de las que se plantean actualmente, como es la posible
prevención de esta enfermedad o, si ésta no es posible, una temprana detección del
cáncer, mediante el control de algunos de los parámetros empleados en la
cronobiología.
142
EXPERIMENTO s: Ah OEASE CIRCATRIGINTANA ENTRE PRESION
SANGUíNEA Y FRECUENCIA CARDIACA
Anteriormente hablábamos de la posible prevención de algunas enfermedades
como el cáncer; otras de las enfermedades“actuales’ son las relacionadas con el
corazóny con la presión sanguínea;por esocuanto más podamosconoceracerca de
estas variables antes podremos dar una solución a estos problemas y evitar al mismo
tiempo fallos humanos, comolos cometidosal administrar unfármacoquedisminuye
la tensión a pacientes diagnosticados como hipertensos, y que realmente no lo son,
únicamente porque fueron al médico, a medirse la presión sanguínea durante la
consulta de la tarde (cuando la presión sanguínea y la frecuencia cardiaca presentan
susvaloresmáximos>(Cornélissenet al., 1990).
Ambas variables (PS y FC) presentan un ritmo circadiano, (p <0,0010),y se
encuentransincronizadasen fase(isofase),a lo largo de la escala circadiana; es decir,
se puede considerarque a lo largo de la escalacircadianadel tiempo, tanto la PS
como la FC presentansus máximosvalores,aproximadamentea las mismashoras,
entrelas 17:00y las 18:00horas (tabla8); por ejemplo,los valoresde la FCen un día
puedenoscilar, desdeunosvaloresmínimospredecibles (batifase)de 60 pulsaciones
por minuto (ppm>a las6:00 de la madrugada,hastaunosvaloresmáximospredecibles
o acrofasede 97 ppm a las 18:00 horas,sin queello presupongapeligro algunopara
la salud.
Este ritmo circadiano fue demostrado,medianteel método cosenor, por
Halberg(Halberga’ al., 1980; Halberg a’ al., 1988), y ampliamenteestudiado porél
y el grupo internacional que con él colabora (Cornélissen et al., 1992; Kumagaia’ al.,
1992; Wrbsky et aL, 1992), demostrando la existencia de éste y de otros ritmos, en
cientos de personas; este ritmo está amplia y detalladamente reflejado en esta
investigación.
Con las evidenciasque nos proporcionanlos resultados(gráficas 28 y 29),
sirvenparaconfirmar la afirmación de quela frecuencia cardiaca(FC) y la presión
143
sanguínea(PS) presentanvariacionesparalelas;asícomoestaconsideraciónesválida
en lo referente al ritmo circadiano, no puede hacerse extensiva al ritmo
circatrigintano.
Al hacer referencia al ciclo circatrigintano (de aproximadamente 30 días)
(Kawasaki et al., 1978), con unos valores de p <0,001 para PASy PAM, p = 0,010para
PAD y p = 0,024 en FC, vemos que la presión sanguínea y la frecuencia cardiaca se
encuentran en alofase circatrigintana, es decir, se observa una gran diferencia en fase
(de aproximadamente 1500) entre las dos variablescuandoconsideramosun periodo
arbitrariode 30días(720 horas),para realizarel análisis(tabla8).
Por tanto, en el transcurso de unmes (aproximadamente30 días), en el
momentoen que la PS alcanzasusvalorespredeciblesmásaltos, los de la FC son
mínimos. Esto se puedeobservar, tantosi ajustamosuna curva coseno a los 92
MESORescircadianos(n= 92) (figura 28), y en la Tabla 8; en la que al observarel
componente circatrigintano se aprecia que las acrofasesde la PS estánrelacionadas
entre sí, pero en alofase respecto de la FC. Esto no ha podido ser consultado con
otros autores, pues no se han encontrado citas al respecto. A diferencia de esto, en
dicha tabla, podemos comprobarque la PAS, la PAM y la FAO, siguenel mismo
patrón circadianoque la FC, alcanzandolos valores máximos a] mismo tiempo;
quedando reflejado, tanto en la gráfica 28 como en la gráfica 29.
La gráfica 29 nos proporciona una representación polar de los resultados;
circadiana a la derecha y circatrigintana a la izquierda. En la circadiana, las elipses de
confianza (A, B, C y O) referentes a la PS y la FC, se localizan en la misma zona de
la circunferenciapolar, es decirsusacrofasesocurrenenaproximadamentelasmismas
horas,las elipsessesuperponenentresí y no encierranel centrode lacircunferencia,
lo quesignificaqueel ritmo esestadísticamentesignificativo.En la representacióndel
componente circatrigintano (izquierda), en la cual 3600 720 horas, las elipses de
confianzade la PS ( PAS, PAM, PAD; A, B y C respectivamente) se superponen
presentando una relación entre fases, estando la FC casi en antifase respecto de la PS
(O).
144
Los MESOResde la presiónsanguíneay de la frecuencia cardiaca,circadiano
y circatrigintano,son aproximadamentelos mismos(tabla 8). Como el componente
circadianoes más prominente queel circatrigintano, existirá una mayor variación
predecible en laPSy FCcircadianas,con amplitudesde aproximadamente10 mm de
Hg, por tanto,lasvariacionesdiariastotales seránde ± 20mm de Hg, mientrasque
a lo largo del messólose aprecianvariacionescircatrigintanasmáximasde ± 5 mm
de Hg. Estos datospuedenservirparadar unaexplicaciónde la gran variabilidadde
la PS y FC, como hemoscomprobado(tabla 9).
También se demostró un componente de aproximadamente84 horas
(circasemiseptano) en la FC (p = 0,010), pero no en la PS (p >0,05) (tabla 9), lo que
apoyala teoríade la existenciade ciertadisociaciónentrela presión sanguíneay la
frecuenciacardiaca, lo que podríaayudarnosa ponersolución a los problemas
cardíacos,en .un futuro no muy lejano.
145
CONCLUSIONES
Unavez analizadoslos resultados obtenidosennuestroestudio,podemos sacar
deellos las siguientes conclusiones:
IP CONCLUSION:
2~ CONCLUSION:
3~
43 CONCLUSION:
CONCLUSION FINAL
Existe un ritmo circadiano endógeno, con dos
componentes (circadiano y circasemidiano), del cortisol
plasmático en conejos NZW, cuya acrofase está
sincronizadapor el ciclo de luz-oscuridad.
Se define el cronomade los marcadores decrecimiento
salivares,CA12Sy CA13O.Estefluido biológicopuedeser
unaalternativa alas extraccionesquese realizanparael
control de crecimientode los tumores.
Se demuestra la existencia de los marcadores de
crecimiento en personas sanas, hecho hasta ahora
desconocido.El ritmo circadiano es similar al de las
personascon cáncer,con unaacrofaseentrelas 04:00y
05:00 de la mañana,y con una amplitud y MESOR
mayores.
Sedemuestra laexistenciadeunaalofaseinfradiana,pero
no circadiana, entre la frecuencia cardiaca y la presión
sanguinea.
El empleode la cronofis¡ologíase recomiendaen
cualquier estudio experimental, con el objeto de
reducir la gran variabilidad de márgenes, hasta
ahora existentes en los parámetros fisológicos. Por
lo que se aconseja un diseño experimental
cronofisiológicopara llevar acabo correctamente
un protocolo de investigación.
147
GLOSARIO
Acrofase (0):
Distanciaquehaydesdeun tiempode referenciadado(comopuede ser
la medianoche o el despertar), hasta el momento en que se producen los
valores máximos de un ritmo (pico), definida mediante una función
matemática ajustada a los datos. La acrofase se expresa en grados
(negativos), donde 3600 equivalen al periodo elegido (circadiano,
circaseptano,etc.) y setoma 00 comotiempo de referencia.En el caso
de los ritmos circadianos,cuandose elige 0~ como la medianoche, la
acrofasetambién se puedeexpresaren horasy minutos.
Camputativa (t):
Externa ( ):
Interna (e):
acrofasereferida a una fecha y hora de reloj
arbitrarias fisiológicamente, por ejemplo, la
medianoche local.
el tiempo de referenciaes un punto enun ciclo
ambiental sincronizante, por ejemplo, la mitad del
intervalo de oscuridad.
acrofase referidaa la acrofasede otroritmo conel
mismo periodo enla misma unidadfisiológica.
Mofase:
Se dice que dos variables están en alofase en un periodo dado, cuando
sus acrofasesson estadísticamentediferentesuna dela otra, de forma
significativa.
Amplitud (A):
La mitad del cambio rítmico predecible que se produce en un ciclo
estimado mediante una función (sinusoidal u otra). En una curva coseno
es la diferencia quehaydesdeel pico de la curvahastael MESOR.El
cambio total predecible es la doble amplitud (2A).
149
Antifase:
Grandiferencia,deaproximadamentela mitad deun ciclo (1800 ± 15’),
en la localizacióntemporal(acrofaseu ortofase)de dos ritmos con el
mismo periodo.
Armónico:
Cualquier función periódica, con un periodo dado (r) se puede
considerarcomo la suma de un término constante(MESOR) y de
funcionescosinusoidalescon periodosr, r/2, r/3, etc., conamplitudes
y acrofasesdadas.El componentecon un periodo r es el armónico
fundamentalo armónicodeprimer orden;el componentecon r /n es el
armónicoeneavo,donden=2, 3, etc.
B¡oaliasing:
Ambigíledado erróneainterpretaciónde uno o máscomponentesde]
periodo t~, en las seriestemporales asociadasa intervalosun poco
largos entre muestrasconsecutivasy separadas enel tiempo por
intervalosiguales( t =r/2); por ejemplo, simulaciónde un ritmo o
tendencia,que resultadel inapropiadomuestreode un ritmo oculto de
alta frecuenciay másgeneralmente,todoslos productosresultantesde
unadensidadde muestreo,insuficientepara detectarlas características
(cambianteso estacionarias)de los ritmos (acrofase,amplitud,forma de
la onda o frecuencia).
Bioperiodicidad:
Ciclos ocultos,aunquesepresuponesu existencia.
150
Bisincronizacién:
Sincronización debida a dos factores, por ejemplo, dos factores
ambientales,comopuedenser la alternanciade luz y oscuridad,y la
disponibilidado no decomida.Por estomismotri- o multisincronización
puede significar sincronización por tres o más factores(incluyendo,p.e.,
los fármacos).
Características de un ritmo:
Parámetros cuantificables objetivamente, comoson el periodo (r), la
acrofase(~), la amplitud (A) y el MESOR (M), determinadosmediante
deducciones estadísticasal ajustar una función matemática mediante
aproximaciones.
Ciclo:
Conjunto de estados consecutivos y/o cambios específicoso
acontecimientos que se repiten regularmentede una forma
fisiológicamentecompleta,con unafrecuencia reconocibleo con un
periodo quese repite enel tiempo.
Circadiano:
Término que deriva del latín circa (= aproximadamente) y dies (= día ó
24 horas), relacionado con ritmos o variaciones biológicas, conuna
frecuencia de aproximadamente un ciclo en 24 horas, r = 24 + 4
horas.
Cron:
Elemento particulardentrodelcronoma,comosonlascaracterísticasde
un ritmo.
151
Cronobiologia:
Cienciaque cuantificae investigaobjetivamentelos mecanismosde la
estructuratemporalbiológica(cronoma),incluyendolasmanifestaciones
rítmicasde la vida. Neologismoqueprovienede los términos:chronos
(=tiempo),bio (=vida) y logie (= ciencia). Diseñada para describir las
característicasde los ritmos; en términos fisiológicos, proporciona
conceptosde aplicacióngeneraly técnicaspara resolver(observary
cuantificar),problemasreferentesal estudiode los ciclos predeciblesen
los organismosy, paraaislar los efectosambientales,de los mecanismos
endógenospropiosque estánenmascarados.
Cronodesmo:
Intervalo de referencia especificadoen el tiempo y respecto del
momento del ritmo.
Cronofarmacologla:
Debe entendersecomola aproximación cronobiológicaa los fenómenos
farmacológicos(una metodologíacronobiológicaenvuelveun menor
riesgo de error y/o falsa información, que el método homeostático
convencional).
Cronofisiología:
Estudia las manifestaciones temporales de los procesos fisiológicos,
evahia las interaccionescíclicas biológicas (endocrinas, nerviosas,
metabólicas, etc.) con el organismo, el cual sirve de base a las
características biológicas temporales y a la interacción de éstas con el
medio ambiente.
Cronograma:
Representacióngráfica de los datosde forma individual o en conjunto
en función del tiempo, haciendo que la ritmicidad sea fácilmente
reconocida.
152
Cronoma:
Neologismoque proviene de chronos (= tiempo), nomos (= regla) y
cromosoma.Se define como la estructura temporal delas variableso
sistemas biológicos, que se resuelven como aproximaciones, mediante
parámetrosdeducidosestadísticamente(crones)y resuelto conla ayuda
de ordenadores, enlas seriestemporalesde datos. El cronomaestá
codificado genéticamentey estásincronizadoambientalmentepor los
ciclos del hábitat socioecológico;estáinfluido por la dinámica delos
campos magnéticosinterplanetariosy puede alterarse porprocesos
endógenos(como son, la elevación del riesgo de enfermedado
cualquier patología),o también por factores externos, comoson,
cambios en los hábitos sociales o en los horarios habituales,
administración de fármacos y por el medio ambiente. La cronobiología
se encarga delestudiode laspropiedadespredecibles a]gorítmicamente
y del significadobiológico de] cronoma.
Cronopatología:
Estudia las alteraciones de las características biológicas temporales
como causantes,resultantes o concomitantesde los estados de
enfermedad (endocrinopatías,cáncer, alteración de la presión
sanguínea, por citar algunas).
Cronoterapia:
Tratamiento terapéuticoefectuado, teniendo encuentalos factores
temporalesy enparticularlos ritmos.
Cronotolerancia:
Momentos predecibles,con una significaciónestadísticamásalta de la
normal, en los que se presenta resistencia a los tratamientos psico -
químicos u otros, sin mostrar un efecto desfavorable, debidoa los
diferentes tiemposde su administración.
153
Cronotoxicologla:
Se encarga de ladescripciónde los efectosno deseadoso nocivosde los
agentesquímicos, físicos o de otra naturaleza (incluyendo una
sobredosificación)en las característicasbiológicas temporalesy en
función del tiempo biológico.
Curso libre:
Cuandounabioperiodicidadcontinúa consufrecuencianatural,aunque
estébajo unascondicionesambientalesfijadas(porejemplo,condiciones
constanteso cíclicas de24 horas), porlo general,ligeramentedistinto
de cualquierfactor ambientalconocido.
Deriva de la acrofase:
Desplazamiento gradualy continuo de la acrofasede un ritmo, a lo
largo de la escala del tiempo, con un periodo que difiere ligeramente al
del ciclo de referencia.
Descensoo valle (momentode):
El punto o lospuntos más bajos del modelocompletorecurrente de una
variable.
Desincronización:
Se dice que dos variables están desincronizadas, si difieren
estadisticamentede forma significativa en su frecuenciao en su acrofase
(desincronización en frecuencia o acrofase), habiendo estado
sincronizadaspreviamente.
Externa: cuando un ritmo biológico sedesincroniza respectoa un
ciclo ambiental.
Interna: cuando dos o más ritmos biológicos de la misma unidad
fisiológica, se desincronizan el uno respecto del otro.
154
Dominio del espectro:
Subdivisión del amplio espectrode ritmos
circadianoso infradianos) o exhibición de
ritmos a lo largo de la escalade frecuencias,
escala deltiempo.
fisiológicos (ultradianos,
las característicasde los
en vez de a lo largo de la
Elipse de confianza:
Ver Regiónde confianza.
Fase:
Ver Acrofase.
Forma de la curva (W):
Patróncompletode unavariación periódica.
Frecuencia (f):
Es el número devecesqueocurreun tipo deacontecimientodado,o el
número demiembrosde una poblaciónque se encuentrandentrode
una determinadaclase.En el estudio de las bioperiodicidades,es el
número de ciclos que ocurren porunidad de tiempo, es decir, el
recíprocodel periodo(i).
1
7-
Harbinger:
Acontecimiento o cambio de algunade las característicasdel ritmo,
previo al desarrollo de una alteración o enfermedad.
Infradiano:
Relativo a variacionesbiológicas o ritmos con un periodo superioral
circadiano,~ > 28 horas, vamosa ennumeraralgunosde ellos:
155
veinte días,
Circasemiseptanoo de aproximadamente media semana,
r = 3,5 ± 1 día
Circaseptano o de aproximadamente una semana,
r = 7 + 1 5 días
Circavigintanoo de aproximadamente
r = 21 ±3 días
Circatrigintanoo de aproximadamenteun mes,
T = 30 ±5 días
Circanualo deaproximadamenteun año,
r = 1 ±2 meses
Circasepteniano o de aproximadamente sieteaños,
r = 7 ± 1 año
confianza (IC):
Intervalodeducidoestadísticamenteparaunsoloparámetroinvestigado.
La afirmación de que un parámetro dado estádentro de esteintervalo,
será cierta en la mayoría de los casos,con una proporciónde 1 - a (1
menosa) de los casosanalizados,cuandosefija la probabilidada (p.e.,
0,05), enbasea la cual sehace estaafirmación.
referencia:
Margen de va]ores que se espera que contengan un numero específico
o unaproporciónde lasobservaciones futuras,tambiénsellama margen
normal, intervalo de predicción o intervalo de tolerancia. Ver
cronodesmo.
Sedice que dosvariables seencuentran en isofaseen un periodo dado,
cuando sus acrofases u ortofases son similares (±150) y no son
significativamentediferentes.
Intervalo de
Intervalo de
Isofase:
156
Límites de
Límites de
confianza:
Los valoresmás bajoy másalto queconstituyenlos límites del intervalo
de confianza.
tolerancia:
A diferencia de los límites de confianza, los limites de tolerancia son
valores que limitan dentro de los cuales caerá, con una probabilidad fija
(1 menos a), una proporción específica de una distribución. Dichos
límites pueden ser usados para decidir, si unas determinadas
observacionesprovienen de la misma población analizadacon
anterioridady usadaparadeterminarlos límites. En cronobiologíase
llama cronodesmo.
MESORAcrónimo de “Midline Estimating Statisticof Rhythm”. Valor mediode
una función rítmica (curva coseno) ajustada a los datos de una serie
temporal, normalmentees el puntomedioentrelos picosy descensode
la curva coseno. Es una media ajustada al ritmo.
Movimiento de la acrofase:
Desplazamiento relativamente sencillo, abrupto o gradual, aunque
transitorio,de la acrofasede un ritmo en relación aun ciclo dado,a lo
largo de la escala deltiempoy que tienelugar duranteun determinado
espaciode tiempo.
Ortofase:
Distanciadesde undeterminadopunto dereferenciaen eltiempo,hasta
el pico de la función no sinusal (múltiples componentes), aproximada
a un ritmo estimado de forma apropiada, que resulta al ajustar un
modelo que consiste en la combinación de dos o más armónicos.
157
Periodo (P):
La duración de un ciclo completo en una variación rítmica.
Pico (momento del):
Instante en el que se producen los máximos valores de un modelo
completo, expresadoa lo largo de la escala deltiempo. Momento en el
que el ritmo alcanzasu máximo.
Porcentaje del ritmo (PR):
Porcentaje de variabilidad explicadapor un modelo ajustado.
PR = VR x 100
Proporción de variabilidad (VR):
Es la parte útil de la señal (p.e.,del ritmo), calculado como la fracción
de la variabilidad total producida por la curva ajustada.
Referencia de la acrofase:
Punto en el tiempo, que se toma como referenciapara la estimaciónde
una acrofase.
Régimen de luz:
Aiternancia entre luz y/u oscuridad (LO), a la cual se expone un
organismo.
Región de confianza:
Generalización delintervalo de confianza, en el
consideren dos o más parámetros. Es la región en el
le correspondela probabilidad1 - a (1 menosa), de
estédentrode ella.
caso en que se
espacio a lacual
que el parámetro
158
Ritmo:
Cronobiológicamentedefinido, es lacomponenteperiódica predecible
de las series temporales biológicas, demostrada mediante medias
deducidas estadísticamente,preferiblemente mediantecaracterísticas
objetivamentecuantificables(es decir,frecuencia,acrofase, amplitud,
MESOR y/o forma de la onda).
Ritmo de referencia:
El ritmo de una variable usado como tiempo de referencia para otros
ritmos, acontecimientoso acciones.
Ritmometría:
Descripciónde un ritmo mediante pruebasde hipótesis definidas
estadísticamentey la estimaciónde suscaracterísticas,como: MESOR,
amplitud, acrofase, ortofase y/o periodo. La aplicación de la
cronobiologíasebasa,fundamentalmente,en la evaluación cuantitativa
de los datos recogidos en función del tiempo, mediante estos métodos
(ritmometría deducidaestadísticamente)y con una adecuadabasede
datos.
Secciónen seriecronobiológica:
Métodográficoy analítico.Se obtieneajustandounacurvacosenoa los
datos en cadasecciónde datos,solapadoso no, y desplazándolaen
incrementos a través de las series de tiempo. Este procedimiento
proporcionala estimaciónde los parámetrosdel ritmo (M, A, ~), los
valoresde la p (parael rechazoo aceptacióndel ritmo, asumiendola
hipótesisnula; A = 0) y el númerode datos porintervalo, los cuales
aparecen representados enparaleloconlos datos originales.
159
Series temporales:
Secuencias cronobiológicasde valoresparejos,uno de los cualesesel
tiempoy el otrounacaracterísticacuantitativadeun individuoo de una
población,en el tiempo considerado.
Sincronización:
Estado de unsistema, cuando dos o más variables muestran
periodicidades con la misma frecuencia y acrofases específicas, y/o con
frecuenciasqueson múltiplosenteroso submúltiplosde otra.
Sincronizador:
También llamadozeirbeger,es la periodicidadambientalque determina
la posición temporal de un ritmo biológico dado, a lo largo de una
apropiadaescalatemporal,obligandoal ritmo asincronizarse,esdecir,
a asumir su frecuencia, o un múltiplo entero o submúltiplo de su
frecuenciay unaacrofase específica.
Ultradiano:
Ritmo con un periodomenorde 20 horas,r c 20 h. Algunos ejemplos
de estos ritmos son:
Circaoctohorano o de aproximadamente ocho horas,
= 8 ± 1,5 horas
Circasemidiano o aproximadamentemedio día,
r = 12 ± 2 horas
Ventana cronobiolégica:
Estimaciónde cualquierade las característicasde un ritmo, en función
de los periodos de interés en regiones o dominios espectrales, mediante
la aplicaciónde losprocedimientosdel cosenorsimple,no sólamenteen
un sólo periodo fijado, sino en un conjunto de supuestosperiodosy
disminuciones entre periodosconsecutivos, ajustados mediante la
160
ritmometría de los mínimos cuadrados. Se puede aplicar cuando se
desconoceel periodode un ritmo biológico, pero seasumeque está
dentro de un cierto margen.
Zeitbeger:
Neologismoque provienede los términos alemanesZeit (= dador)y
beger(= tiempo),dador detiempo.Ver Sinctonizador.
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