“aislamiento, purificación e identificación de metabolitos bioactivos

METABOLITOS BIOACTIVOS DE LA BIODIVERSIDAD YUCATECA

Luis Manuel Peña Rodríguez

Laboratorios de Química Orgánica

Unidad de Biotecnología

Centro de Investigación Científica de Yucatán

Mérida, Yucatán, México

lmanuel@cicy.mx

Metabolitos Bioactivos

• Productos naturalesobtenidos de diferentesfuentes naturales, terrestres y marinas, con aplicaciones en la medicina, la agriculturay la industriaalimenticia.

Microorganismos (6000 bacterias y 1.5 millones de hongos)

Organismos marinos (10 millones)

Insectos (30 millones)

Plantas (300,000 especies)

(Müller et al., 2000)

Fuentes naturales de metabolitosbioactivos

LAS PLANTAS EN LA MEDICINA

• Fuente de cura para el 80% de la población mundial

Salicina Salix sp.

Acido acetilsalicílico

Fármacos de origen vegetal

Catharanthus roseus (vicaria)

Vinblastina R=CH3

Vincristina R=CHO

Fármacos de origen vegetal

De 1981 a 2006 se reportaron 1184 nuevos fármacos5% productos naturales23% derivados de productos naturales10% modelados a partir de productos naturales4% productos naturales de síntesis química

(Newman & Cragg, 2007)

Productos naturales como fármacos

Vinblastina R=CH3

Vincristina R=CHO

Catharanthus roseus

Taxol

Taxus brevifolia

• De los 119 fármacos derivados de plantas, el 74% son constituyentes activos de plantas

VALOR COMERCIAL DE ALGUNOS PRODUCTOS NATURALES

• Taxol (Paclitaxel) 15.80 USD (1 mg)

• Vincristina 39.50 USD (1 mg)

• Vinblastina 10.38 USD (1 mg)

• Progesterona 2.66 USD (1 mg)

Fuente: Sigma-Aldrich

Existen aproximadamente 300,000especies de plantas superiores en elmundo

10% han sido estudiadas desdeun punto de vista fitoquímico ofarmacológico

Se calcula que existen 1 millónde metabolitos pendientes deidentificar

(Hostettmann et al., 2006)

Las plantas como fuente de nuevos fármacos

25 zonas de mayor biodiversidad44% de todas las especies vegetales1.4% del área terrestre

• 138,000 km2 (12% protegido)• 24,000 especies de plantas• 5,000 endémicas

Cada año México deforesta más de un millón de hectáreas

“La pérdida del conocimiento de los curanderos sobre losusos medicinales de las plantas, conforme desaparecensus culturas, ha sido comparada con la pérdida de labiblioteca en Alejandría. Pero para aquellos de nosotrosque estamos empezando a entender como leer lasmoléculas en los seres vivos, la pérdida de biodiversidadrepresenta también la pérdida de una biblioteca, unabiblioteca que contiene las respuestas a las preguntas quetodavía no hemos aprendido a formular.”

Lynn Helen Caporale in “Chemical Ecology: A View from thePharmaceutical Industry”

El total de la flora fanerógama de México se calcula en forma aproximada en

• 22,000 especies• 220 familias

• 2,410 géneros

• Mas de 7000 especies se utilizan como plantas medicinales (800 especies se emplean en la medicina tradicional yucateca

•Menos del 5% han sido estudiadas

•Factores económicos y sociales están llevando a la destrucción de estos recursos

• El estudio de los recursos puede contribuir a su protección

Número total de especies endémicas y nativas en la

Península deYucatán:

168

(Durán et al., 1998; Espadas et al., 2003)

Área de distribución de especies endémicas y nativas de la península de Yucatán

Selección del material vegetal

Elección del bioensayo

Extracción y purificación

Identificación de la estructura

Modificación química

Identificación de metabolitos bioactivos

(Claeson y Bohlin, 1997)

Plantas de interés

• Pentalinon andrieuxii (leishmanicida)

• Colubrina greggii (antiprotozoaria)

• Lonchocarpus xuul (citotóxica)

• Byrsonima bucidaefolia (antioxidante)

• Jacquinia flammea (antifùngica)

Urechites andrieuxii Muell. Arg.(APOCYNACEAE)

Planta trepadora conocida comobejuco guaco, cantibteac ocontrayerba.

Contra mordeduras de serpientes(raíz y hojas)

Disturbios nerviosos (látex)

Leishmaniasis cutánea localizada(raíz y hojas)

Pech-López. Tesis de Licenciatura-UADY, 2002.

ESTUDIOS DE RAYOS X

Urechitol A

Extracto crudo de hojas de P. andrieuxii

PA-1 (54.5g, 14.9%)

Polaridad baja

PA-2A

Obtención del ácido betulínico y derivados

Gravedad

Partición L-L (Hx)

Ácido betulínico (1)

(62.7 mg, 0.1%)

Maceración

Hojas de

Pentalinon andrieuxii

(365g)

Antiprotozoal Activity of Betulinic Acid Derivatives

Sample Leishmanicidal Trypanocidal Antiplasmodial

LA M2903 TULA F32

Betulinic acid (1) >200 >200 50.0 22.5

Betulinic acid acetate (2) 44.9 >200 154.4 11.8

Betulonic acid (3) 51.2 >200 161.4 >20

Betulinic acid methyl esther (4) >200 69.9 93.3 >20

Betulin (5) >200 >200 173.0 >20

Amphotericin B 0.6 0.2 0.2

Benznidazol 384.4

Chloroquine 0.2

LA: Leishmania amazonensis; M2903: L. braziliensis; TULA: Trypanosoma cruzi tulahuen; F32: Plasmodium falciparum.

Table 1. IC50 (µM) values of antiprotozoal activity of betulinic acid and derivates

TripanocidaLeishmanicida

Antiplasmódica

Ácido betulínico (1)

Betulinato de metilo (4)

Lonchocarpus xuul Lundell

Nombre común:Se le conoce como xuul, kan-xuul ó yaax-xuul.

Características generales:Árbol endémico de la Península de Yucatán.10m de alto, flor rojo-morado, fruto café, cortezaparda clara.

Usos locales:Su madera es usada localmente para la construcción

Distribución:Península de Yucatán, Chiapas (salto de agua),Belice (corozal, Orange walk) y Guatemala (Petén).

Phytochemistry ( 2002 ) 60 :533-540

LeishmaniaDonovani

IC50= 40μg/mL

LeishmaniaBrazilensis

IC50= 10μg/mL

TripanosomaCruzi

IC50= 26.7μg/mL

LeishmaniaAmazonensis

IC50= 26.7 μg/mL

P-388

IC50= 57μg/mL OVCA 433

IC50= 1.2 μMAnti-Cancer Drug Design ( 1995), 10, 482-490

Borges-Argaez et al. Phytomedicine (2007)

Actividad Biológica de Isocordoína

INHIBICIÓN DE LA IkBa CINASA (PROTEASA VIRAL EN EL VIH) DE ISOCORDOINA Y SUS DERIVADOS, NATURALES Y SEMISINTETICOS

Actividad analgésica de chalconas naturales y semisintéticas en el modelo de contorsiones abdominales inducidas por ácido acético

(0.6 %) administrado via intraperitoneal.

Byrsonima bucidaefolia Standl.

• Localizada principalmente en mesoaméricaNombres comunes: “craboo”, “nancenagria”, “zacpah”

• Actividad antioxidante en su extracto metanólico

BBH-16B(11.18 g)

BBH-17C(94.8 mg)

BBH-19K(5.6 mg)

CPG: 2 x 20 cmDCM/MeOH 1:1Sephadex LH-20

CLV7 x 5cmDCM/Hx/MeOH

BBH-19J(32.2 mg)BBH-19L(1.4 mg)

BBH-19H(4.9 mg)BBH-19I(35.8 mg)

Aislamiento del metabolito BBH-19K

Table 1. Antioxidant activity of metabolites 1-6 in the DPPH free-radical test.

Methyl gallate trimeric ester from gallotanins in B.

bucidaefolia

Castillo-Avila et al., Nat.Prod.Comm., 2009

Comparación de la composición de los extractos de B. bucidaefolia por CCD

1. Ext. MeOH

2. Ext. EtOAc

3. Ext. BBH

4. Ext. DCM

5. Ext. EtOH

6. Ext. An

7. Infusión

8. EtOAc (inf.)

9. C+ (vit. C)

Jacquinia flammea Millispaugh (Teophrastaceae)

Purificación de la fracción metanólicade J. flammea por VLC

Bioensayo antifúngico contraColletotrichum gloesporioides

9 fracciones JF16(A.H)

CHCl3:MeOH:H2O (14:7:1)CHCl3:MeOH:H2O (10:10:1)

Ext MeOH

Hidrólisis del producto mayoritario del extracto metanólico de J. flammea.

Sakurososaponina Primulagenina A (SL-11pp)

HCl 2N

1.- Extracto metanólico

2.- Producto de hidrólisis del extracto metanólico

pp.- Primulagenina A ( SL-11pp)

9.- Producto de acetilación de SL-11pp

A →L .- Fracciones de VLC (SL-7)

SK.- Sakurososaponina

(-).- Control negativo

(+).- Control positivo

Actividad antifúngica del extracto crudo hidrolizado de J. flammea

Cepa: Collectotrichum gloeosporoidesMedio: PDAControl (+) : Neomicol® ,10µg (5µl - 0.2%)Control(-) : CH2Cl2/MeOH (9:1)Concentración de muestras: 500µg (10µl - 5%) Sergio L. Medina Ruiz

Colubrina greggii S. Watson

Familia: Rhamnaceae

Sinonimia:Común: (china may, guayol, guayul,manzanita, pimiento ché, tatuán, trampillo,trompillo o vara prieta).

Descripción:Arbusto de 1 a 5 m de alturaHojas alternas, lanceoladas, ápice acuminadoInflorescencias en tirsos, de 15 a 40 flores,sépalos verdosos deltados.Frutos casi esféricos con semillas negras

Uso etnobotánico:Abscesos y granulaciones de párpadosAntitusivo y asmaTuberculosisDisenteríaEnfermedades del hígadoUlceraciones y emoliente

(Fernández, 1986)

Purificación de la fracción CG-2B

Extracto crudo

CG-1

Polaridad media

CG-2B

Partición L-LAcOEt

CG-5A

CG-5B

CG-5N

CG-5E

CG-6C

Crisofaneína (9)

FlashHx/An 8:2

CG-6F

Actividad antiprotozoaria

CG-6IGravedadEter/Hx (1:1)

VLCCH2Cl2/An (99:1-94:6)CHCl3/Hx/MeOH (70:25:5)

CG-7C

CG-7I

CG-8D-J

CG-8J-LVLCCH2Cl2/Hx/MeOH (70:20:1-89:1:10)CH2Cl2/MeOH (90:10)

CG-9E

CG-10DGravedad CHCl3/Hx/MeOH (50:40:10-70:20:10)

Ácido Betulínico (1)

|

H                             HMBC    

3.66 (3H, s)               174.27

3.68 (3H, s)               176.64

51.52

51.32

Corrección de la estructura de DCG-6F

HSQC de DCG-25

7 CH38 CH28 CH9 Cm/z 529 (M+ + H+) C32H47O6

m/z 511 (M+ ‐ H2O) C32H46O5

C34H52O6

9 CH39 CH27 CH9 C

m/z 557 (M+ + H+) C34H53O6

Metilacíón

CH3I /K2CO3

Acetato de ácido ceanótico

DCG-6H

Drug Dicovery Today, 10, 2005Cortesía: Dr. Fernando Echeverri

LOS COSTOS DE UN PRODUCTO FARMOQUIMICO

Taxus brevifolia

HISTORIA DEL TAXOL• 1963 Detección de actividad antitumoral en

extractos de Taxus brevifolia• 1971 Identificación de la estructura del Taxol• 1979 Establecimiento del modo de acción del Taxol • 1983 Inicio de las pruebas de Fase Clínica I• 1985 Inicio de las pruebas de Fase Clínica II• 1992 Se licencia la producción de Taxol a Bristol-Myers• 1992 Taxol es aprobado para tratar cáncer de ovario • 1993 Inicio de la búsqueda de fuentes alternas de Taxol• 1993 El uso de Taxol se aprueba en Europa y

Latinoamérica• 1994 Taxol es aprobado para tratar el cáncer de seno• 1995 Se aprueba el uso de Taxol semisintético• 1997 Taxol es aprobado para tratar el sarcoma de Kaposi• 1998 Aparece el Taxol genérico

DATOS SOBRE EL TAXOL• Rendimiento de taxol en Taxus brevifolia: < 0.02%.

• Un árbol de 100 años produce aprox. 5 Kg de corteza.

•12.5 ton. de corteza (2500 árboles) producen 1 Kg de taxol.

• Para las fases clínica y preclínica de taxol se colectaron entre 2.5 y 7.5 ton. de corteza (500-1500 árboles).

• 12,500 mujeres (casos por año en EU) requieren 90,000 árboles para su tratamiento de cáncer de ovario.

Arthur Barclay

Taxus baccata

Robert Holton

Preparación de Taxol semisintético

Economía del Taxol

Fuentes alternas de Taxol

Pestalotiopsis microspora

CTV’s Taxus baccata

Taxomyces adrenae

FUTURO

Cultivo de tejidos vegetales

Ingeniería metabólica

Biotransformación

Síntesis

Plantas transgénicas

ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA DE Capraria biflora

Proyectos: estudiantes

Claudia-DDMAntioxidantes en bromelias

Dafne-DDLeishmanicidas de plantas

Chucho-MBiosíntesis de terpenoides

Carlos-DDMFitotoxinas de M. fijiensis

Glendy-MTripanocidas de plantas

AgradecimientosNACIONALES• Dr. Salvador Said Fernández. CIBIN-IMSS, Monterrey, NL• Dra. Gloria M. Molina Salinas. CIBIN-IMSS, Monterrey, NL• MC Manuel J. Chan Bacab, Universidad Autónoma de Campeche• Dra. María Luisa Villarreal. Universidad Autónoma del Estado de Morelos

INTERNASQBB Karlina García Sosa-Técnico AcadémicoQBB Fabiola Escalante Erosa-Técnico Académico• Dr. Germán Carnevalli Fernández Concha. URN• Dr. Rafael Durán García. URN• Dra. M. Marcela Gamboa Angulo. UBT• Dra. Rocío de Lourdes Borges Argáez. UBT• Paulino Simá Polanco. URN• Filogonio May Pat. URN

AgradecimientosINTERNACIONALES

• Dra. Susana Zacchino. UNRosario, Argentina• Dr. Alberto Giménez Turba. IIFB-UMSA, Bolivia• Dr. Alberto Loyola Morales. UAntofagasta, Chile• Dr. Valdir Cechinel Filho. UNIVALI, Brasil• Dr. Alberto Sánchez. UELondon, UK• Dra. Giulia Getti. UELondon, UK• Dr. Solomon Habtemariam, UGreennwich, UK• Dr. Peter Waterman. SCU, Australia• Dra. Linda Balbury. SCU, Australia• Dr. Andrew Flowers. SCU, Australia• Dr. Olov Sterner. Lund University, Suecia• Dr. Jean-Luc Galzi. UStrasbourg, Francia• Dr. Eduardo Muñoz. UCórdoba, España• Dr. Gordon Cragg. NCI, USA• Dr. Scott Franzblau. LSU, USA

-International Foundation for Science

-Programa Iberoamericano de Ciencia y Tecnología para el Desarrollo (CYTED, Proyectos X.5, X.7, X.11, RIBIOFAR)

-Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología

-Red Alfa-Comunidad Europea

-FOMIX-Yucatán

-Consejo Británico

-Centro de Investigación Científica de Yucatán

FINANCIAMIENTO