adhésion des lymphocytes à l'endothélium vasculaire...
Post on 14-Sep-2018
220 Views
Preview:
TRANSCRIPT
N° d’ordre 01 ISAL 0023 Année 2001
THÈSE présentée DEVANT L’INSTITUT NATIONAL DES SCIENCES APPLIQUÉES DE LYON pour obtenir LE GRADE DE DOCTEUR FORMATION DOCTORALE: BIOCHIMIE ÉCOLE DOCTORALE INTERDISCIPLINAIRE SCIENCES-SANTÉ
par
Zury Ana DOMINGUEZ DELGADO Pharmacienne
MSc Ciencia de los Alimentos
ADHÉSION DES LYMPHOCYTES A L'ENDOTHÉLIUM VASCULAIRE.
MÉCANISMES IMPLIQUÉS DANS LA PRODUCTION DE PROSTACYCLINE INDUITE
Soutenue publiquement le 25 juin 2001 devant la Commission d’Examen
Directeur de thèse: M. le Pr. M. LAGARDE et Mme. le Dr. A.F. PRIGENT
JURY
M. le Dr. P. CALDER (Rapporteur)
M. le Dr. Y. LEBRANCHU (Rapporteur)
Mme. le Dr. O. MACOVSCHI
M. le Pr. M. LAGARDE (Président) Mme. le Dr. A.F. PRIGENT
Cette thèse a été préparée au Laboratoire de Biochimie et Pharmacologie de l’INSA de LYON (INSERM U352)
5
AAA mmmooonnn PPPèèèrrreee
∞∞∞
6
REMERCIEMENTS
__________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
Les recherches qui font l'objet de ce mémoire ont été réalisées dans le laboratoire de
Biochimie et Pharmacologie dddeee lll '''IIINNNSSSAAA dddeee LLLyyyooonnn, Unité de Recherche IIINNNSSSEEERRRMMM UUU333555222
Biochimie et Pharmacologie de la Médiation Lipidique.
DIRECTEUR: Professeur Michel Lagarde
JJJeee ttt iiieeennnsss ààà eeexxxppprrriiimmmeeerrr mmmeeesss rrreeemmmeeerrrccciiieeemmmeeennntttsss
à Monsieur le Professeur Michel LAGARDE. Pour la confiance qu’il ma témoignée en m'accueillant dans son laboratoire pour développer ce travail de recherche. Directeur de thèse, ses suggestions et ses critiques scientifiques ont été déterminantes dans la formulation des hypothèses de travail et dans la concrétisation des objectifs spécifiques qui ont permis l’évolution satisfaisante de ma formation doctorale. à Madame le Docteur Annie-France PRIGENT, Directeur de recherche INSERM. Pour sa compétence et ses qualités scientifiques et humaines qu'elle m'a témoignées tout au long de ces années. Directeur de thèse, sa rigueur dans la mise en place des manipulations et sa capacité d’analyses des résultats expérimentaux ont permis la prise de décisions opportunes pour le développement de ce travail de recherche et l’aboutissement à des conclusions solides. à Madame le Docteur Olga MACOVSCHI, Maître de Conférence INSA. Pour ses qualités scientifiques et humaines. Pour son savoir faire dans la transmission d’information ce qui m'a permis de comprendre rapidement les techniques de biologie cellulaire. Ses explications m'ont permis d'acquérir une grande autonomie pour la réalisation et l’adaptation des protocoles expérimentaux à notre modèle expérimental in-vitro. Pour la solidarité humaine qu'elle m'a témoignée dès mon arrivée au laboratoire ainsi que pour son esprit joyeux porteur de bonheur. à Monsieur le Professeur Yvon LEBRANCHU Pour l'honneur qu'il me fait en acceptant d'être rapporteur de cette thèse, me permettant ainsi de bénéficier de sa compétence et de ses connaissances. Pour l’intérêt qu’il a porté à ce sujet, témoigné par les critiques détaillées dans son rapport scientifique. Qu'il soit assuré de ma respectueuse considération et de ma sincère gratitude. to Doctor Philip CALDER For the honour he gave me by agreeing to review my work. For his interest in reading the manuscript and the comments in his report. For the opportunity of this exchange, which has enriched my scientific knowledge. Be assured of my grateful respect. à Monsieur le Docteur Georges Némoz et à Monsieur le Docteur Fabio Nero Pour l’intérêt qu’ils ont porté à l’évolution de ce travail, pour les discussions scientifiques qui ont été toujours profitables. al Consejo de Desarrollo Científico e Humanístico, CDCH de la Universidad Central de Venezuela por el financiamiento de mi formación doctoral.
7
Expreso mi agradecimiento A mi familia, a mi mami Elia Antonia quién supo apoyar mi partida del seno del hogar y aguardar con paciencia y confianza la culminación exitosa de esta empresa profesional que me mantuvo alejada del beneficio de sus caricias y amor maternal, to my parents Patricia and George for their love always present, for being side by side to us all the way through this experience, to Gary for his mind support, a mi hija, Rebecca Marie quién supo aceptar mi decisión de partir para acompañarme en esta aventura, a mi hermana Milagro por su solidaridad al asumir mis responsabilidades en Venezuela, a mi hermana Rubelia Maria por su entusiasmo frente a mi carrera profesional y el regalo de su presencia en este nuevo hogar que significa para mi la France, a mi hermano Hernán Guillermo por sus pensamientos que han sido presentes a lo largo de estos años, a mis sobrinos Katerine, K, por su madurez que me enorgullece, Nélson Anibal, Carmen Rubelia, Stella Maris y Maya Ixmucané por sus palabras siempre entusiastas, a mi cuñado Anibal Rubén. A Chantal quién me adoptó como hermana hace tantos años, gracias por todos esos momentos de felicidad que hemos pasado en el seno de la familia. Á mon cher cousin Bernard Santelli qui m’a aidé à retrouver mes racines corses. A todos mis seres queridos que me observan , me protegen e iluminan mi sendero con la luz de la eternidad. A la academia, a mis compañeros de la Cátedra de Patología General y Fisiopatología por el apoyo solidario a estos años de trabajo invertidos fuera del seno de la cátedra. En especial, al Profesor Marcelo Alfonso, Jefe de la Cátedra de Patología General y Fisiopatología y a la Profesora Itala Becemberg por su confianza y estímulo que supieron motivar y renovar mis energías en los momentos difíciles. A mis amigas y compañeros de la Sección de Lipidología, Venezuela, Carmencita, MariIsabel, Hilda, la señora Paula, por su presencia continua a través del correo electrónico. En especial al Profesor Virgilio Miguel Bosch Román, Director de la Sección de Lipidología, maestro y tutor quién me inició en el mundo de los lípidos y me abrió las puertas a una carrera de investigador y de docente. A mis amigas y compañeras de la UCV, Dayssi, Yury, Nathalie, Adelaida, Nilda, Himara, Magdalena, Olga en fin ese corazón que conforma las cátedras de Bioquimica y Fisiología por su presencia continua y sus dosis de buen humor en particular a tí, Lela. A mis amigos Jinny Emily, Yoly, Octavio, Raiza, Liu, Giovanni, MariIsabel «madrina», Pandemonium, Vivian, Felipe, Alfredo, Israel, Mireya, Sonia, Ale, Pata, Hernán, Edwin, por su continua presencia, À ma nouvelle famille française, puisque je suis arrivée avec ma fille. Bientôt, je partirai en laissant tout un groupe de gens qui sont devenus proches et chers à mon cœur. Il n’y a qu'un seul mot qui puisse traduire cette réalité: famille. Merci pour m’avoir permis de vivre cette expérience qui m’a fourni une énergie si forte qu'elle va rendre mon départ très difficile à vivre. Merci à Jacques et Bernard qui sont déjà partis, libérés des limites corporelles en s’envolant vers l’infini, ils restent pour toujours dans ma mémoire et dans mon cœur. À Papa Patrick qui a su prendre la place de grand frère en trouvant la solution de toutes ces petites choses qui ont rendu possible la naissance de mon nouveau chez moi, merci pour ta gentillesse, ta disponibilité inconditionnelle, merci à toi Caro pour ta solidarité et ton amitié et à ma petite Pauline pour la beauté de ton sourire musical. À Fabi, pour ton ouverture d'esprit, ton humour, ta complicité et ta touche artistique qui m'a laissée de beaux souvenirs et à Christophe pour ta joie de vivre. À Sam, pour ton innocence, ton regard d’enfant toujours avec un mot gentil et à Hélène, pour ta sensibilité si délicate qu'elle t’oblige à porter un vêtement de rigueur des fois très amusant, des fois trop pragmatique, ce qui m'a fait constater de nouveau que l’essentiel est invisible aux yeux. À Shaliha, mi amiga del alma, pour ton ouverture d'esprit qui nous touche de la lumière de tes grands yeux. À Nata, pour ta capacité d’observation qui reconnaît tout de suite l'essentiel, my shiny étoile qui clignote vers l’univers, puissante petite poupée qui connaît la valeur de l’amitié…, l’Atlantique est petit. Merci de m’avoir permis la joie de faire partie de ta famille, merci a Josette et Jean-Pierre, à Pepe ton grand père, à Fany, à Ivan, à Véro et à la petite et pétillante Marine, un deuxième noyaux de ta famille; à David, pour ta gentillesse et ta profondeur d’esprit. À Faten pour ton calme, ta profondeur et ta force intérieure, ce sont des qualités à imiter, à Momo et le
8
petit coquin Mr. Karan. À Magdalena, la grande, pour ta sensibilité aux besoins des autres, pour ton sens de la protection, ta rigueur douce qui surveille la sécurité de nous tous, pour notre maison de retraite et nos tomates. À Magdalena, la chiquita, pour ton intérêt au bien être des autres, cette façon anonyme de donner des solutions, pour ta sensibilité artistique et ta complicité dans le Jazz. À Muriel, pour ta confiance, ta sérénité et ces moments de réflexion que nous avons partagés à Roland pour ton charisme et à ce petit garçon qui se prépare à sortir à la vie extérieur. À Patricia, Patou pour ta force, ta capacité de décision, ton esprit humanitaire, ta sensibilité et ton amour pour la danse, à François et le petit soleil, Alex. À Chantal, pour ton imaginaire, pour la fantaisie qui fait que le côté dur de la vie soit moins difficile à traverser. À Isabelle pour ta facilité de trouver la simplicité dans des choses et ton ingéniosité. À Evelyne, pour ta disposition à l’aide d'un congénère, pour les longues discussions philosophiques qui m'ont enrichie l’esprit, pour les échanges merveilleux dans la parole. À Cathy, pour ta grâce et ta bonne humeur que tu laisses partir par surprise. À Jean Lecerf, pour ta gentillesse et cette façon de rire qui remplissait le labo de bonheur. À Hélène, pour ta disposition à partager tes connaissances. À Véro, pour ta douceur et ton mélange de spontanéité et ta timidité qui touche comme une caresse, à Philippe, à Lucie et Antoine pour la joie des moments vécus. À Céline, pour ton enthousiasme et ton optimisme pour ta "main amie" sincère et à Laurent pour ton charme de gentleman qui exalte la féminité. À Lolo, pour ton sourire, le brillant de tes yeux et ton humanité qui déborde. À Corinne pour ta pensée vivace et agile, ta profonde solidarité, ton charme et cette façon élégante d’exprimer l’opposition «en revanche». À André, pour ce ton de passivité imperturbable même pas par un autre gémeaux. À Martine, pour ta candeur et ta franchise. À Caro, pour ton charme, tes yeux pétillants et ton rire mélodieux. À Laurent, pour ton calme, ta volonté d’aide, ta curiosité scientifique et ton regard au style Richard. À Olivier, mon Comte charmant, pour ta délicatesse et tes clins d’yeux si sympathiques. À Pierre, pour ton énergie aussi vivace qu'une chute d’eau, pour la musique partagée. À Daniel, por tu mano amiga y franca, por mantener vivo el son latinoamericano. À Marc, pour ces discussions éclatantes d’intellectualité. À Anne-Marie, pour ta joie de vivre qui dégage tant d’amour. À Alain pour ces moments de discussions scientifiques et philosophiques qui n’ont jamais manqué de bonne humeur. À Dominique, Michel Guichardant, Alain Savani, Abdel, Roger Santini, Christian Laugier, Jeef, Christian, Anne, Valérie, Eduard, Mario, Patricia, Clarisse, Ulrich, Elise, Lisiana, Audrey, Monique, Sandrine, Dennis, Martine Croset, Sophie, David, Marie Thèrese, Mathias, Alexia, Nadia, Samira, Hibba, Joanna, Amal, pour leur disponibilité . À ma petite fille «ma blonde», Lucie, à Marikensa, Sandrine merci pour les petites mot clés, Bertrand, Demian, Nicolás, Julien, Franki mon maître de "fonétic", Olivier, François Jr, François, Loïc «Pepite» pour cet entourage de jeunesse qui m'a fait tant de bien. À Fred, pour tous ces moments d’aventure. À Patricia, Delphine, Annie, Claude, Felipe, Pascale, Virginie, Vincent, Sandre, Sandrine, Jennifer, Demian, Alonis, Katia, Florence, Beatrix, pour ces rêves de danse faits réalité. À Louis, Gilles, Julien, Israel, Olivier, François, John, Stéphane, Didier mes amis guitaristes pour l’inspiration que chacun de vous a apporté à ma passion pour la guitare. À mes copains Jean-Claude, Jean Mimi, Jean-Luc, Pierre et Catherine, Hank, Jaime, pour les bons moments partagés. À Aurora, ma petite sœur, c’est très très difficile de mettre dans des mots toutes tes qualités, donc je vais seulement remercier la vie pour m’avoir permise cette rencontre, merci à Jeff pour ta présence « clef » à ma toute petite nièce, Ema et à t’adorable famille. J’aimerais bien finir avec deux phrases de quelqu’un pour qui j’ai une profonde admiration
El sentido de la ciencia no es más que el refinamiento del pensamiento diario
Imagination is more important than knowledge
AAAlllbbbeeerrrttt EEEiiinnnsssttteeeiiinnn
9
AVANT-PROPOS
_________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
Le travail présente dans ce mémoire a fait l'objet de publications parues et soumises.
Publications scientifiques:
DOMINGUEZ Z*., MERHI-SOUSSI F, MACOVSCHY O, NEMOZ G, LAGARDE, M,
PRIGENT AF. Endothelial cell prostacyclin synthesis induced by lymphocytes is
independent of the membrane fatty acid composition of both cell types and of E-selectin,
VCAM-1 or ICAM-1-mediated adhesion. British Journal of Haematology 2001, vol 113,
n°2, p 521-532.
MERHI-SOUSSI F, DOMINGUEZ Z*, MACOVSCHY O, DUBOIS M, SAVANI A,
LAGARDE, M., PRIGENT AF. Human lymphocytes stimulate prostacyclin synthesis in
human umbilical vein endothelial cells. Invollvement of endothelial cPLA2. Journal of
leukocyte Biology, 2000, vol 68, p 881-889.
MERHI-SOUSSI F†, DOMINGUEZ Z*†, MACOVSCHY O, DUBOIS M, NEMOZ G,
LAGARDE, M., PRIGENT AF. Mechanism involved in the stimulation of prostacyclin
synthesis by human lymphocytes in human umbilical vein endothelial cells, en
préparation. †M-S F et DZ sont co- auters dans ce papier.
* Cátedra de Patología General y Fisiopatología, Escuela de Medicina Luis Razzetti
Facultad de Medicina, Universidad Central de Venezuela. Ciudad Universitaria, Caracas,
Venezuela.
Communication oral:
DOMINGUEZ Z, MACOVSCHI O, SOUSSI F, LAGARDE M, PRIGENT AF. Increased
PGI2 output in HUVEC-Lymphocyte coculture is partially dependent on adhesion
molecules. 1er Congrès annuel de la Société Française d'Athérosclérose. Arcachon,
France, juin, 1999.
10
Communications affichées:
DOMINGUEZ Z, SOUSSI F, MACOVSCHI O, LAGARDE M, PRIGENT AF. Human
lymphocyte-induced endothelial cell prostacyclin output is independent of ELAM-1,
VCAM-1 or ICAM-1 pathways and membrane fatyy acid composition. 4th Congress of the
International Society for the Study of Fatty Acids and Lipids (ISSFAL), Tsukuba, Japon,
juin, 2000.
MERHI-SOUSSI F, DOMINGUEZ Z, MACOVSCHI O, LAGARDE M, PRIGENT AF.
Human lymphocytes stimulate prostacyclin production via activation of cytosolic
phospholipase A2 in human umbilical vein endothelial cells. 11 th International Conférence
of advances in Prostaglandin and Leukotriene Research, Florence, Italy, juin, 2000.
DOMINGUEZ Z, MACOVSCHI O, SOUSSI F, LAGARDE M, PRIGENT AF. Increased
PGI2 output in HUVEC-Lymphocyte coculture is partially dependent on adhesion
molecules. 1er Congrès annuel de la Société Française d'Athérosclérose. Arcachon,
France, juin, 1999.
MERHI-SOUSSI F, DOMINGUEZ Z, MACOVSCHI O, LAGARDE M, PRIGENT AF.
Stimulation of prostacyclin syntheses in human umbilical vein endothelial cells by human
lymphocytes. 3th Congress of the International Society for the Study of Fatty Acids and
Lipids (ISSFAL), Lyon, France, juin, 1998.
11
SOMMAIRE
________________________________________________________________
TABLE DES ILLUSTRATIONS..................................................................... 18
ABREVIATIONS .............................................................................................. 20
INTRODUCTION............................................................................................. 22
PARTIE I. RAPPELS BIBLIOGRAPHIQUES............................................. 28
1. L’ENDOTHÉLIUM-UNE BARRIÈRE MÉTABOLIQUE ...................... 29 1.1 LES CELLULES ENDOTHÉLIALES...................................................................... 29
1.1.1.ORIGINE................................................................................................................. 29
1.1.2 ANATOMIE ............................................................................................................. 31
1.1.3 FONCTION.............................................................................................................. 32
1.1.4 LE CIRCUIT SANGUIN............................................................................................. 33
1.2 PROPRIÉTÉS ANTITHROMBOTIQUES DE L’ENDOTHÉLIUM.................... 35
1.2.1 FACTEURS ANTIPLAQUETTAIRES .......................................................................... 35
1.2.1.1 La prostacycline............................................................................................... 35
1.2.1.2 Le monoxyde d’azote ....................................................................................... 36
1.2.1.3 Les exonucléotidases ....................................................................................... 37
1.2.2 LES FACTEURS ANTICOAGULANTS ........................................................................ 37
1.2.2.1. La thrombomoduline ...................................................................................... 37
1.2.2.2 Les héparanes sulfates..................................................................................... 38
1.2.3 FACTEURS FIBRINOLYTIQUES ............................................................................... 38
1.2.3.1 Activateur tissulaire du plasminogène............................................................ 38
1.3 PROPRIÉTÉS PROCOAGULANTES DE L’ENDOTHÉLIUM........................... 39
1.3.1 FACTEURS PROCOAGULANTS ................................................................................ 39
1.3.1.1 Le Facteur von Willebrand ............................................................................. 39
1.3.1.2 Facteur V et récepteurs des facteurs plasmatiques de coagulation............... 40
1.3.1.3 Le facteur tissulaire ......................................................................................... 40
1.4 LES INTERACTIONS CELLULAIRES .................................................................. 40
2. LES EICOSANOÏDES D’ORIGINE ENDOTHÉLIALE..........................42 2.1 HÉTÉROGÉNÉITÉ DE L’ENDOTHÉLIUM ......................................................... 42
2.2 ACIDES GRAS ESSENTIELS .................................................................................. 43
12
2.3. TYPE D’EICOSANOÏDES........................................................................................ 44
2.3.1. LES PROSTANOÏDES .............................................................................................. 44
2.3.1.1 Actions générales des prostanoïdes................................................................. 46
2.3.2 LES LEUCOTRIÈNES .............................................................................................. 47
2.3.3 VOIE DU CYTOCHROME P450................................................................................ 47
2.4 EFFETS BIOLOGIQUES .......................................................................................... 48
2.4.1 LES PROSTANOÏDES ET LA RÉPONSE DÉPENDANT DU FLUX.................................. 48
2.4.2 EICOSANOÏDES ET LA RÉPONSE INFLAMMATOIRE ............................................... 48
3. BIOSYNTHÈSE DES PROSTANOÏDES: LES PROSTACYCLINES....50 3.1.DESCRIPTION DES LIPIDES MEMBRANAIRES............................................... 50
3.1.1 LES PHOSPHOLIPIDES ............................................................................................ 50
3.1.2 COMPOSITION DES PHOSPHOLIPIDES DANS LA CELLULE ENDOTHÉLIALE.......... 50
3.2 MÉCANISME DE LIBÉRATION DE L’ACIDE ARACHIDONIQUE................ 51
3.2.1 LES PHOSPHOLIPASES A2 ...................................................................................... 51
3.2.1.1 Les phospholipase A2 sécrétées ....................................................................... 51
3.2.1.2 Les Phospholipase A2 cytosoliques ................................................................. 53
3.2.1.2.1 Les iPLA2 calcium-indépendantes ............................................................... 53
3.2.1.2.2 La cPLA2-calcium-dépendante .................................................................... 54
3.2.2 LES PHOSPHOLIPASE C ......................................................................................... 57
3.2.2.1 Les PLC spécifiques des PI ............................................................................. 57
3.2.2.2 Les PLC spécifiques des PC ............................................................................ 57
3.2.3 LES PHOSPHOLIPASES D........................................................................................ 58
3.3 OXYGÉNATION DE L’ACIDE ARACHIDONIQUE: SYNTHÈSE DE
PROSTACYCLINE ................................................................................................. 59
3.3.1 LES PROSTAGLANDINES ENDOPEROXYDE H SYNTHASES: DEUX ISOFORMES...... 60
3.3.1.1 Localisation et structure.................................................................................. 61
3.3.1.2 Rôle des deux isoformes .................................................................................. 63
3.2 LA PROSTACYCLINE SYNTHASE ....................................................................... 64
3.3.3 EFFETS DE L’ASPIRINE SUR LA SYNTHESE DES EICOSANOÏDES ............................ 64
3.4 PERSPECTIVES......................................................................................................... 65
4. LES LYMPHOCYTES DU SANG PÉRIPHÉRIQUE...............................66 4.1 LE SYSTÈME DE DÉFENSE.................................................................................... 67
4.1.1 IMMUNITE INNÉE................................................................................................... 67
13
4.1.2 IMMUNITE SPÉCIFIQUE ......................................................................................... 67
4.1.3 LA TOLÉRANCE IMMUNE....................................................................................... 68
4.1.4 AUTO-IMMUNITÉ ................................................................................................... 68
4.2 RÔLE FONCTIONNEL DES SOUS-TYPES DE LYMPHOCYTES.................... 68
4.2.1 LE LYMPHOCYTE T ............................................................................................... 69
4.2.2 LES LYMPHOCYTES B............................................................................................ 70
4.2.3 LYMPHOCYTES LARGES GRANULEUX ................................................................... 70
4.3 DOMICILIATION DES LYMPHOCYTES............................................................. 71
5. MOLÉCULES D’ADHÉSION ENDOTHÉLIALES................................. 73 5.1 L’ADHÉSION CELLULAIRE .................................................................................. 73
5.2 LES LIAISONS INTERCELLULAIRES DU CIRCUIT SANGUIN..................... 73
5.2.1 MOLÉCULES DES JONCTIONS INTERCELLULAIRES............................................... 73
5.2.1.2 Les jonctions serrées et adhérentes................................................................. 74
5.3 MOLÉCULES D’ADHÉSION ENDOTHÉLIALE.................................................. 75
5.3.1 SÉLECTINES ........................................................................................................... 76
5.3.1.1 Signalisation par les sélectines........................................................................ 78
5.3.2 LES INTÉGRINES.................................................................................................... 80
5.3.2.1 Signalisation via les Intégrines ....................................................................... 83
5.3.3 MOLÉCULES D’ADHÉSION CELLULAIRE ............................................................... 85
5.3.3.1 Molécule d’adhésion intercellulaire-1, ICAM-1 ............................................ 85
5.3.3.1.1 Signalisation via ICAM-1............................................................................. 86
5.3.3.2 Molécule d’adhésion intercellulaire-2, ICAM-2 ............................................ 86
5.3.3.3 Molécule d’adhésion cellulaire vasculaire, VCAM-1 .................................... 86
5.3.3.4 Molécule d’adhésion cellulaire plaquette-cellule endothéliale, PECAM-1 .. 87
5.4 INTERACTION LYMPHOCYTE-CELLULE ENDOTHÉLIALE ...................... 88
6. ACIDES GRAS ω−3 ET LES MALADIES CARDIO-VASCULAIRES..89
6.1 SOURCES ALIMENTAIRES DES ACIDES GRAS ω−3 ....................................... 89
6.2 LA RÉVOLUTION INDUSTRIELLE ET LES MALADIES
CARDIOVASCULAIRES .................................................................................... 89
6.3 L’ATHÉROSCLEROSE UNE DES MALADIES CARDIOVASCULAIRES...... 90
6.3.1 ATHEROGENÈSE .................................................................................................... 90
6.3.1.1 L’évolution de la plaque athéromateuse......................................................... 91
14
6.4 LES ACIDES GRAS ω−3 ET L’ATHÉROSCLEROSE ......................................... 93
6.4.1 EFFETS ANTITHROMBOTIQUES DES ACIDES GRAS ω−3 ....................................... 93
6.4.2 EFFETS DES ACIDES GRAS ω−3 SUR LA SYNTHÈSE DE PROTÉINES ....................... 94
6.4.3 EFFETS DES ACIDES GRAS ω−3 SUR LA RÉPONSE IMMUNE................................... 96
6.5 PERSPECTIVES .......................................................................................................... 97
PARTIE II. MATÉRIELS ET MÉTHODES ..................................................98
1. MATÉRIELS ...............................................................................................99
1.1 MATÉRIEL POUR LA CULTURE CELLULAIRE .............................................. 99
1.2 ANALYSES LIPIDIQUES ......................................................................................... 99
1.3 MATÉRIELS POUR IMMUNOCHIMIE ................................................................ 99
1.4 MATÉRIELS POUR IMMUNOEMPREINTE...................................................... 100
1.5 ANALYSES DE LA PROSTACYCLINE ............................................................... 100
1.6 REACTIFS ET SOLVANTS DIVERS.................................................................... 100
1.7 PRODUIT RADIOACTIF........................................................................................ 100
1.8 APPAREILS .............................................................................................................. 101
2. MÉTHODES ..............................................................................................101
2.1 CULTURE PRIMAIRE DES CELLULES ENDOTHÉLIALES HUMAINES .. 101
2.1.1 REMISE EN CULTURE DES CELLULES ENDOTHÉLIALES ..................................... 102
2.1.2 CARACTERISATION DU PHENOTYPE ENDOTHÉLIAL........................................... 102
2.2 PRÉPARATION DES LEUCOCYTES ET DES PLAQUETTES HUMAINES 103
2.2.1. PRÉPARATION DES CELLULES MONONUCLÉÉES................................................ 103
2.2.2 PRÉPARATION DES LYMPHOCYTES DU SANG PÉRIPHÉRIQUE............................. 104
2.2.3 PRÉPARATION DES PLAQUETTES SANGUINES ..................................................... 104
2.2.4 PRÉPARATION DES CELLULES POLYMORPHONUCLÉAIRES................................ 105
2.2.5 VIABILITÉ DES CELLULES ................................................................................... 105
2.3 COINCUBATION LYMPHOCYTES-HUVEC ..................................................... 106
2.3.1 COINCUBATION LYMPHOCYTES-HUVEC DANS DES CONDITIONS DE ROTATION
CONTINUE............................................................................................................ 106
2.4 CARACTÉRISATION DU PHÉNOTYPE DES LYMPHOCYTES ADHÉRENTS
A L’ENDOTHÉLIUM .................................................................................................... 106
2.5 ÉTUDE AVEC DIFFERENTS INHIBITEURS ..................................................... 106
2.5.1 ÉTUDE D’INHIBITION AVEC LA SURAMINE, LA GÉNISTÉINE, LA TOXINE
PERTUSSIQUE LE PP1 ET LE PD98056............................................................... 107
15
2.6 ÉTUDE DE L’ADHÉSION DES LYMPHOCYTES A L’ENDOTHÉLIUM...... 107
2.7 ENRICHISSEMENT DES CELLULES EN ACIDES GRAS ω−3....................... 107
2.7.1 PRÉPARATION DU MILIEU DE CULTURE ENRICHI EN ACIDES GRAS ................... 108
2.7.2. ENRICHISSEMENT DES CELLULES EN ACIDES GRAS ω−3 ................................... 108
2.8 ANALYSES BIOCHIMIQUES................................................................................ 108
2.8.1 DOSAGE IMMUNOENZYMATIQUE DE LA 6-OXO-PGF1α ..................................... 108
2.8.2 ANALYSES DE LA MAPK ENDOTHÉLIALE PAR IMMUNOEMPREINTE ................ 110
2.8.2.1 Dosage des protéines selon la méthode de Bradford.................................... 110
2.8.2.2 Électrophorèse sur gel de polyacrylamide en présence de SDS................... 111
2.8.2.3 Transfert semi-sec.......................................................................................... 111
2.8.2.4 Immunodetection ........................................................................................... 111
2.8.3 ANALYSES LIPIDIQUES ........................................................................................ 111
2.8.3.1 Extraction lipidique ....................................................................................... 112
2.8.3.2 Séparation des différentes classes de lipides ................................................ 112
2.8.3.3 Analyse des acides gras des phospholipides totaux...................................... 112
2.9 ANALYSES FONCTIONNELLES ......................................................................... 113
2.9.1 BLOCAGE DES MOLÉCULES D’ADHÉSION ENDOTHÉLIALES............................... 113
2.9.2 DOSAGE DE L’EXPRESSION DES MOLÉCULES D’ADHÉSION ENDOTHÉLIALES ... 114
2.10 ANALYSES STATISTIQUES ............................................................................... 114
PARTIE III. RÉSULTATS EXPÉRIMENTAUX ET DISCUSSION ....... 115
CHAPITRE 1. LA SYNTHÈSE DE PROSTACYCLINE
ENDOTHÉLIALE EST INDUITE PAR LES LYMPHOCYTES
HUMAINS...............................................................................................116 1.1 CARACTÉRISATION DES CELLULES ENDOTHÉLIALES........................... 116
1.2 AUGMENTATION DE LA SYNTHÈSE DE PROSTACYCLINE
ENDOTHÉLIALE PAR LES LYMPHOCYTES DU SANG PÉRIPHÉRIQUE
.................................................................................................................................... 118
1.2.1 ÉTUDE CINÉTIQUE DE LA PRODUCTION DE PROSTACYCLINE INDUITE PAR LES
LYMPHOCYTES .................................................................................................... 118
1.2.2- SPÉCIFICITE DE LA RÉPONSE ENDOTHÉLIALE AU CONTACT DE
LYMPHOCYTES………………………………………………………………… 119
1.2.2.1 Le contact lymphocyte-HUVEC augmente de façon spécifique la production
16
de prostyacycline endothéliale................................................................................... 119
1.2.2.2 Caractérisation des lymphocytes adhérents à l’endothélium après la
coincubation............................................................................................................... 121
1.3 ÉTUDE DE L’EXPRESSION DES MOLÉCULES D’ADHÉSION
ENDOTHÉLIALE - ECAMs- ............................................................................ 122
1.3.1 EFFET DU CONTACT LYMPHOCYTE-HUVEC SUR L’EXPRESSION DES ECAMS 122
1.4 BLOCAGE DES MOLÉCULES D’ADHÉSION ENDOTHÉLIALES................ 124
1.4.1 ÉTUDE DU BLOCAGE DE LA SÉLECTINE-E, VCAM-1 ET ICAM-1.................... 124
1.4.1.1 Effet du blocage des ECAMs sur l’adhésion des lymphocytes .................... 124
1.4.1.2 Effet du blocage des ECAMs sur la production de prostacycline endothéliale
induite par les lymphocytes ....................................................................................... 126
1.5 EFFET DE LA COINCUBATION LYMPHOCYTES-HUVEC DANS DES
CONDITIONS DE ROTATION CONTINUE ...................................................... 126
1.6 CONCLUSIONS ET DISCUSSION ........................................................................ 128
CHAPITRE 2. DÉTERMINATION DES VOIES DE SIGNALISATION
IMPLIQUÉES DANS LA SYNTHÈSE DE PROSTACYCLINE
INDUITE PAR LE CONTACT LYMPHOCYTES-CELLULES
ENDOTHÉLIALES .............................................................................. 134 2.1 ÉTUDE DE L’IMPLICATION D’UNE VOIE PROTÉINE G-TYROSINE-
KINASE-MAPK DANS LA SYNTHÈSE DE PGI2 ENDOTHÉLIALE INDUITE
PAR LE CONTACT DES LYMPHOCYTES ....................................................... 134
2.1.1 EFFET DE L’INHIBITION LIGANDS-RÉCEPTEURS ET DE L’INHIBITION DES
PROTÉINES Gi...................................................................................................... 135
2.1.2 EFFET DE L’INHIBITION DES PROTÉINES TYROSINE KINASES ET DE TYROSINE
KINASES DE LA FAMILLE Src............................................................................... 136
2.1.3 EFFET DE L’INHIBITION DE LA MAP KINASE KINASE ET MISE EN ÉVIDENCE DE LA
PHOSPHORYLATION DE P42/P44MAPK PAR IMMUNOEMPREINTE.................... 137
2.2 CONCLUSIONS ET DISCUSSION ........................................................................ 139
CHAPITRE 3. LES ACIDES GRAS ω−3 ET LA FONCTION
CELLULAIRE ...................................................................................... 143
17
3.1 INCORPORATION DES ACIDES GRAS ω−3 DANS LES PHOSPHOLIPIDES
CELLULAIRES ....................................................................................................... 144
3.2 EFFET DE L’ENRICHISSEMENT EN ACIDE GRAS ω−3 SUR L’ADHÉSION
DES LYMPHOCYTES A L’ENDOTHÉLIUM ........................................................... 147
3.3 EFFET DE L’ENRICHISSEMENT EN ACIDE GRAS ω−3 SUR LA
PRODUCTION DE PROSTACYCLINE ENDOTHÉLIALE INDUITE PAR LES
LYMPHOCYTES............................................................................................................ 148
3.4 DISCUSSION ET CONCLUSIONS ........................................................................ 149
PARTIE IV. CONCLUSION GÉNÉRALE ET PERSPECTIVES............ 153
RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES...................................................... 160
RÉSUME EN ANGLAIS ................................................................................ 199
18
TABLE DES ILLUSTRATIONS
________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
FIGURE 1: ORIGINE DES CELLULES ENDOTHELIALES.................................................................................... 30
FIGURE 2: MICROPHOTOGRAPHIES EN CONTRASTE DE PHASE QUI MONTRENT LA REORGANISATION DES CELLULES EXPOSEES AU FLUX .................................................... 31
FIGURE 3: LA CASCADE DE LA COAGULATION SANGUIN .............................................................................. 34
FIGURE 4: ADHESION DES LEUCOCYTES A LA PAROI VASCULAIRE ......................................................... 41
FIGURE 5: LES TROIS SERIES DE PROSTANOÏDES ET LEUR ORIGINE BIOSYNTHETIQUE................... 46
FIGURE 6: VOIES DE LIBERATION DE L’ACIDE ARACHIDONIQUE PAR LES DIFFERENTES PHOSPHOLIPASES ............................................................................................................................ 52
FIGURE 7: PROSTANOÏDES SYNTHETISES A PARTIR DE L'ACIDE ARACHIDONIQUE........................... 60
FIGURE 8: RECIRCULATION DES LYMPHOCYTES............................................................................................. 66
FIGURE 9: MIGRATION A TRAVERS L'ENDOTHELIUM .................................................................................... 72
FIGURE 10: ARCHITECTURE DES PROTEINES AUX JONCTIONS CELLULE-CELLULE.......................... 75
FIGURE 11: STRUCTURE DES TROIS SELECTINES ............................................................................................. 77
FIGURE 12: MOLECULES D'ADHESION ENDOTHELIALES............................................................................... 82
FIGURE 13: FONCTION DES INTEGRINES.............................................................................................................. 84
FIGURE 14: EFFET DE LA REVOLUTION INDUSTRIELLE SUR L'APPORT CALORIQUE………………..90
FIGURE 15: DISTRIBUTION NON-ALEATOIRE DES LESIONS ATHEROMATEUSES.................................. 92
FIGURE 16: REPRESENTATION SCHEMATIQUE DU DOSAGE DE LA 6-OXO-PGF1α. ............................... 109
FIGURE 17: CELLULES ENDOTHELIALES DE VEINE DE CORDON OMBILICAL A ENVIRON 75% DE CONFLUENCE................................................................................................................................... 117
FIGURE 18: CELLULES ENDOTHELIALES DE VEINE DE CORDON OMBILICAL MARQUEES AVEC UN ANTICORPS ANTI-FACTEUR VON WILLEBRAND COUPLE A LA FLUORESCEÏNE..... 117
FIGURE 19: CINETIQUE DE PRODUCTION DE LA PROSTACYCLINE DANS LES SURNAGEANTS DE CULTURE DES CELLULES ENDOTHELIALES COINCUBEES AVEC LES LYMPHOCYTES............................................................................................................................................................ ..119
FIGURE 20: EFFET SPECIFIQUE DES LYMPHOCYTES SUR LA SYNTHESE DE PROSTACYCLINE ENDOTHELIALE .............................................................................................................................. 120
FIGURE 21: LYMPHOCYTES ADHERENTS AUX HUVEC .................................................................................. 121
FIGURE 22: EFFET DU BLOCAGE DES ECAMs SUR L’ADHESION DES LYMPHOCYTES AUX HUVEC............................................................................................................................................................... 125
19
FIGURE 23: EFFET DU BLOCAGE DES ECAMS SUR LA PRODUCTION DE PROSTACYCLINE ENDOTHELIALE INDUITE PAR LES LYMPHOCYTES .......................................................... 126
FIGURE 24: EFFET DE LA COINCUBATION LYMPHOCYTES-HUVEC EN CONDITION DE ROTATION CONTINUE SUR LA PRODUCTION DE PGI2 INDUITE PAR LES LYMPHOCYTES ......... 127
FIGURE 25: EFFET DE L’INHIBITION LIGANDS-RECEPTEURS ET DE L’INHIBITION DES PROTEINES Gi .......................................................................................................................................................... 136
FIGURE 26: EFFET DE L’INHIBITION DES PROTEINES TYROSINE KINASES ET DE TYROSINE KINASES DE LA FAMILLE Src...................................................................................................... 137
FIGURE 27: EFFET DE L’INHIBITION DE LA MAP KINASE KINASE............................................................. 138
FIGURE 28: MISE EN EVIDENCE DE LA PHOSPHORYLATION DE P42/P44MAPK PAR IMMUNOEMPREINTE .................................................................................................................... 139
FIGURE 29: EFFET DE L’ENRICHISSEMENT EN ACIDE GRAS ω−3 SUR L’ADHESION DES LYMPHOCYTES A L’ENDOTHELIUM........................................................................................ 147
FIGURE 30: EFFET DE L’ENRICHISSEMENT EN ACIDE GRAS ω−3 SUR LA PRODUCTION DE PGI2.... 148
TABLEAU I: EFFET DE LA COINCUBATION AVEC DES LYMPHOCYTES OU DE LA STIMULATION AVEC DU LPS DURANT 4 H SUR L’EXPRESSION DES ECAMS DES CELLULES ENDOTHELIALES............................................................................................................................ 123
TABLEAU II: COMPOSITION EN ACIDES GRAS DES PHOSPHOLIPIDES TOTAUX (% MOLAIRE) DANS LES HUVEC APRES 3 j DE CULTURE DANS UN MILIEU ENRICHI EN ACIDES GRAS….............................................................................................................................................................. 145
TABLEAU III: COMPOSITION EN ACIDES GRAS DES PHOSPHOLIPIDES TOTAUX (% MOLAIRE) DANS DES LYMPHOCYTES APRES 3 j DE CULTURE DANS UN MILIEU ENRICHI EN ACIDES GRAS ................................................................................................................................................... 146
20
ABRÉVIATIONS _________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
AA acide 5,8,11,14-eicosatétraénoïque ou acide arachidonique
ADN acide désoxyribonucléique
ADNc ADN complémentaire
AGE acides gras essentiels
ARN acide ribonucléique
ARNm ARN messager
BHT butyl-hydroxy-toluène
BSA sérum albumine bovine
Ca2+ calcium
CCM chromatographie couche mince
DAG diacylglycérol
DHA acide docosahexaénoïque
EDTA acide éthylènediamine tétraacétique
ECAMs molécules d’adhésion endothéliales
EGF epidermal growth factor
EGTA acide éthylèneglycol tétraacétique
EPA acide eicosapentaénoïque
HEPES acide hydroxy-2-éthyl-4-pipérazinyl-1,2-éthane-sulfonique
HUVEC human umbilical vein endothelial cells
IL interleukine
J jour
IP3 inositol trisphosphate
MAPK MAP-kinase
NO monoxyde d’azote
PA acide phosphatidique
L lymphocyte du sang périphérique
LPS lipopolysacharide
PBMC cellules mononucléées du sang périphérique
PBS phosphate buffer saline
PC phosphatidylcholine
PE phosphatidyléthanolamine
PG prostaglandine
PGE2 prostaglandine E2
PGHS prostaglandine endoperoxyde H synthase
PGI2 prostacycline I2
PGI3 prostacycline I3
PGIS prostacycline synthase
21
PHA phytohémaglutinine
PI phosphatidyl inositol
PKC protéine kinase C
PL phospholipide
PLA2 phospholipase A2
PLC phospholipase C
PLD phospholipase D
PMN cellules polymorphonucléaires
PRP plasma riche en plaquettes
PS phosphatidyl sérine
PTK protéine tyrosine kinase
PTX toxine pertussis
TNF tumor necrosis factor
TRIS tris (hydroxyméthyl)-amino-méthane
22
IIINNNTTTRRROOODDDUUUCCCTTTIIIOOONNN
23
La recherche fondamentale sur l’endothélium vasculaire est aussi importante pour
la médecine que pour la pharmacologie. Elle apporte des éléments essentiels pour la
compréhension de la physiologie ainsi que des mécanismes physiopathologiques mis en
route lors d’une altération de la fonction endothéliale. Elle pourrait déboucher sur des
innovations stratégiques thérapeutiques ou la mise au point de molécules plus efficaces
pour le rétablissement de la fonction vasculaire.
L’endothélium artériel des gros et moyens vaisseaux est le site privilégié de
localisation des lésions athéromateuses. La présence de lymphocytes T dans les lésions
athéromateuses naissantes a été mise en évidence par immunohistochimie, chez l’Homme
(Emeson et Robertson, 1988) et dans des modèles expérimentaux comme le lapin et le rat
(Stemme et Hansson, 1994., Haraoka et al., 1995). Au sein de la lésion, les lymphocytes
représentent plus de 20 % des cellules mononucléées (Yokota et Hansson, 1995). Dans
certains modèles expérimentaux le pourcentage de lymphocytes peut atteindre 60% durant
la phase initiale de formation de la lésion. Le rôle fonctionnel des lymphocytes T dans la
pathogénie de l’athérosclérose est ambigu. Des effets inhibiteurs (Hansson et al., 1991)
ainsi que stimulateurs (Emeson et al., 1996) de la formation de la lésion athéromateuse ont
été suggérés par des résultats obtenus avec des modèles expérimentaux in vivo. Il semble
que la réponse, positive ou négative, des lymphocytes T sur l’évolution du processus
athéromateux soit dépendante du type de lésion initiale (Hansson, 1997).
Les lymphocytes humains sont capables d’induire la synthèse de prostacycline au
contact de l’endothélium sain, in vitro; cet effet stimulateur n’est pas dépendant de la
préactivation des lymphocytes (Merhi-Soussi et al., 2000). La prostacycline (PGI2) est le
prostanoïde endothélial majoritaire des macrovaisseaux. A ces effets vasodilatateurs et
anti-agrégeants plaquettaires classiques, s’ajoute l’effet inhibiteur de l’activation et de
l’adhésion des leucocytes (Vane et Botting, 1995), l’inhibition de la prolifération des
cellules musculaires lisses (Nakaki et al., 1991), la diminution de la production d’IL-6
(Della-Bella et al., 1997) et la réduction de l’accumulation des esters de cholestérol dans
les cellules vasculaires (Pomerantz et al., 1995).
La prostacycline I2 (PGI2) est synthétisée à partir de l’acide arachidonique (AA) par
l’action de la prostaglandine endoperoxyde synthase (PGHS) et de la prostacycline
synthase (PGIS). La PGHS catalyse la formation de PGH2 à partir de l’AA et la PGIS
transforme la PGH2 en PGI2. La production de ce prostanoïde dépend de la disponibilité en
AA libéré à partir des phospholipides membranaires par l’action directe des
phospholipases A2 (PLA2) ou de façon indirecte par les phospholipase C et D. Parmi les
24
phospholipases, la PLA2 cytosolique (cPLA2) joue un rôle essentiel dans la formation des
prostanoïdes. Elle est considérée comme le facteur limitant de la libération de l’AA (Sa et
al., 1995). Hormis les lymphocytes B et T matures, la cPLA2 est une enzyme largement
distribuée dans les tissus humains incluant les thymocytes et les cellules B immatures
(Gilbert et al., 1996). La synthèse de PGI2 dépend aussi des actions successives de la
PGHS et de la PGIS. Deux isoformes de PGHS on été décrites dans les cellules
endothéliales de veine de cordon ombilical, (human umbilical vein endothelial cells:
HUVEC), l’isoforme–1, forme constitutive responsable de la production physiologique des
prostaglandines et l’isoforme-2, forme inductible régulée par des mitogènes et cytokines
pro-inflamatoires (Lee et al., 1992; Jones et al., 1993). L’expression de la PGHS-2 étant
induite par des médiateurs inflammatoires dans les cellules vasculaires et immunitaires et
étant régulée par les glucocorticoïdes, cette isoforme pourrait être responsable de la
formation des prostanoïdes dans des conditions physiopathologiques (Masferrer et al.,
1994; Seibert et al., 1994). La PGHS présente une spécificité de substrat et requiert trois
doubles liaisons en positions 8, 11, 14 des acides gras à 20 atomes de carbones. Les
substrats correspondants sont l’acide dihomo-γ-linolénique (20:3 ω−6), l’AA (20:4 ω−6) et
l’acide eicosapentaénoïque (20:5 ω−3). Ces trois acides gras sont les précurseurs respectifs
des séries 1, 2, et 3 des prostanoïdes. Cependant, l’activité de la PGH synthase peut être
inhibée par les acides gras ω−3. La production de PGI2 in vitro ainsi que l’expression des
ARNm de la PGHS-1 est diminuée après enrichissement des cellules endothéliales en
acides eicosapentaénoïque et docosahexaénoïque (Achard et al., 1997). Bien que la
production de PGI2 soit diminuée dans plusieurs modèles de cellules isolées (Spector et al.,
1983; Hadjiagapiou et Spector, 1987; Achard et al., 1997; Yerram et al., 1989), les études
conduites in vivo ne montrent pas de modification (von Schacky et al., 1985) ou même une
augmentation de la production de PGI2 (De Caterina et al.,1990) après une
supplémentation du régime alimentaire en acides gras ω−3 à longue chaîne. Ces acides
gras sont considérés comme protecteurs du système cardiovasculaire.
Il avait été montré que la coincubation de monocytes humains isolés à partir de
sang veineux périphérique avec des HUVEC augmentent la production de PGI2
endothéliale. Le même effet inducteur, avait été observé dans des cellules endothéliales
vasculaires cérébrales cocultivées avec des lymphocytes autologues isolés à partir de
ganglions lymphatiques chez le rat (Hakkert et al., 1992; Mc Carron, 1992). Cependant
aucune étude concernant l’influence des lymphocytes humains sur la synthèse de PGI2 par
25
les HUVEC n’avait été publiée. Nous avons montré pour la première fois que les
lymphocytes humains sont capables d’induire la synthèse de PGI2 par les HUVEC (Merhi-
Soussi et al., 2000). Cette augmentation observée dans des conditions de culture statique
est fonction du nombre de lymphocytes ajoutés aux HUVEC et dépendante du contact
direct entre les deux types cellulaires et de l’activité de la cPLA2.
Le premier objectif de ce travail a été d’étudier la cinétique de la production de
PGI2 endothéliale induite par les lymphocytes ainsi que la spécificité des lymphocytes sur
cette réponse. Pour ce faire, nous avons coincubé les deux types cellulaires et mesuré la
PGI2 dans les surnageants de culture collectés entre 20 min et 20 h. Pour vérifier
l’hypothèse de la spécificité du contact lymphocytes-HUVEC sur la réponse endothéliale
nous avons coincubé les HUVEC avec d’autres types cellulaires tels que les
polymorphonucléaires, les plaquettes ou avec des matériaux non biologiques comme les
billes de latex. Dans un second temps, nous avons entrepris l’étude des mécanismes
responsables de l’augmentation de la synthèse de PGI2 par les cellules endothéliales lors de
leur interaction avec les lymphocytes. La possibilité de la participation des molécules
d’adhésion endothéliale, (ECAMs), dans l’augmentation de la production de PGI2 induite
par le contact des lymphocytes a été étudiée en coincubant les lymphocytes avec des
HUVEC préalablement traitées par des anticorps anti-ECAMs. Nous avons également
vérifié l’effet de la dynamique des fluides dans cette réponse étant donné que la synthèse
de PGI2 est aussi induite par les forces de cisaillements (Grabowski et al., 1985; Doroudi et
al., 2000). Pour ce faire, nous avons coincubé les deux types cellulaires sous rotation
continue pour mimer les forces de cisaillements. L’ensemble de ces résultats constitue le
chapitre 1 de la Partie III: Résultats Expérimentaux.
Dans une deuxième étape de ce travail expérimental (chapitre 2) nous avons
cherché à identifier la voie de signalisation en amont de l’activation de la cPLA2 qui est à
l’origine de la libération de l’AA dans notre système de coincubation (Merhi-Soussi et al.,
2000). L’implication des protéines G et des kinases telles que la kinase régulée par des
signaux extracellulaires, mitogen-activated protein kinases (MAPK) et la protéine kinase C
dans l’activation de la cPLA2 a été démontrée (Leslie, 1997; Hirabayashi et Shimizu,
2000). Certains ligands de récepteurs couplés à la protéine Gi stimulent les MAPK et cette
activation est dépendante des tyrosine kinases de la famille Src (English et al., 1999; Wan
et al., 1996). Nous avons étudié la possibilité d’une activation de la p42/p44MAPK
endothéliale par une voie de signalisation impliquant les protéines Gi et les tyrosine
kinases de la famille Src. Nous avons constaté à l’aide d’inhibiteurs le caractère essentiel
26
des protéines tyrosine kinases du type Src dans la réponse endothéliale au contact de
lymphocytes et nous avons démontré que l’inhibition de la phosphorylation de
p42/p44MAPK par un inhibiteur spécifique de MAPK Kinase bloque la réponse
endothéliale induite par les lymphocytes. Enfin, nous avons mis en évidence une
phosphorylation de p42/p44MAPK dans les HUVEC après la coincubation avec des
lymphocytes.
Dans la dernière partie du travail (chapitre 3) nous avons étudié l’effet de
l’enrichissement des cellules en EPA ou DHA sur l’adhésion des lymphocytes aux
HUVEC et sur la production de PGI2 endothéliale lors de la coincubation lymphocytes-
HUVEC. Nous avons contrôlé l’enrichissement des cellules par l’analyse de la
composition en acides gras des phospholipides membranaires.
La première partie de ce mémoire, consacrée aux Rappels Bibliographiques
comporte six paragraphes. Le premier rapporte les données concernant l’endothélium et
son rôle de barrière métabolique; dans un deuxième paragraphe les eicosanoïdes d’origine
endothéliale sont détaillés; le troisième résume la biosynthèse des prostanoïdes et en
particulier celle de la prostacycline. Puis un quatrième paragraphe est dédié aux
lymphocytes du sang périphérique, leur rôle dans la fonction immune et leur domiciliation.
Dans le cinquième paragraphe nous décrivons les molécules d’adhésion endothéliales et
leur participation à la signalisation cellulaire. Enfin, le dernier paragraphe est consacré aux
acides gras ω−3, considérant leurs effets sur la fonction cellulaire et leur relation avec les
maladies cardiovasculares, en particulier l’athérosclérose.
Le reste de ce mémoire, réservé au travail personnel, s’articule autour de trois
parties distinctes: la partie II. Matériels et Méthodes; la partie III. Résultats
Expérimentaux et Discussion scindée en trois chapitres:
⎬ La synthèse de prostacycline endothéliale est induite par les lymphocytes
humains (Chapitre 1).
⎬ Détermination des voies de signalisation impliquées dans la synthèse de
prostacycline induite par le contact lymphocytes-cellules endothéliales (Chapitre 2).
⎬ Les acides gras ω−3 et la fonction cellulaire (Chapitre 3)
27
Chacun de ces trois chapitres comporte une brève introduction et un rappel des objectifs
préalablement à l’exposé des résultats, ceux-ci étant discutés en fin de chapitre. Enfin, le
mémoire se termine par la partie IV. Conclusion Générale et Perspectives.
28
RAPPELS BIBLIOGRAPHIQUES
29
PARTIE I. RAPPELS BIBLIOGRAPHIQUES 1. L’ENDOTHÉLIUM -UNE BARRIÈRE MÉTABOLIQUE-
L’endothélium représente une barrière de 5000 m2 de surface entre le sang et les
tissus. C’est un réseau d’informations qui varie d’une façon structurelle et fonctionnelle
selon le type de tissus qu’il irrigue. Ceci reflète l’adaptation des cellules endothéliales à
leur environnement. La cellule endothéliale est une cellule polarisée. Le côté basal est
ancré sur la matrice thrombogène car le sous-endothélium est composé de macromolécules
procoagulantes, synthétisées par la cellule endothéliale: le collagène, le facteur von
Willebrand. La face apicale est en contact avec le sang circulant et représente la surface
non thrombogène du fait de son organisation et de sa production de substances
anticoagulantes et antiagrégantes.
1.1 LES CELLULES ENDOTHÉLIALES
Les cellules endothéliales tapissent la surface intérieure de tous les vaisseaux
sanguins. Elles forment une monocouche continue qui représente la barrière métabolique la
plus grande de l’organisme. L'endothélium occupe une position anatomique stratégique
dans la paroi vasculaire, car il est localisé entre le sang circulant et les cellules musculaires
lisses vasculaires. Il peut répondre à des signaux mécaniques et hormonaux provenant du
sang; en effet, le sang est source de médiateurs qui peuvent moduler l'état contractile et les
réponses prolifératives des cellules musculaires lisses vasculaires, les fonctions
plaquettaires, la coagulation ainsi que l'adhésion des leucocytes à la surface endothéliale.
Dans les conditions physiologiques, l'endothélium joue un rôle protecteur en
prévenant l'adhésion des cellules sanguines circulantes. Il maintient les vaisseaux dans un
état de vasodilatation et inhibe la prolifération des cellules musculaires lisses vasculaires.
Dans les états pathologiques comme l'athérosclérose, le dysfonctionnement des cellules
endothéliales entraîne une augmentation des réponses vasoconstrictrices, l'adhésion des
plaquettes et des monocytes, et la prolifération des cellules musculaires lisses vasculaires.
1.1.1.ORIGINE
Au cours de l’embryogénèse le premier système qui se développe est l’organe cardio-
vasculaire. Pendant la gastrulation, les cellules du mésoderme migrent vers le feuillet
30
primitif (Figure 1). Les cellules endothéliales souches, appelées angioblastes, sont définies
par leur potentiel de différenciation mais elles n'ont pas encore les marqueurs
caractéristiques des cellules endothéliales, ni la capacité de former du lumen.
Ultérieurement, la vasculogenèse est mise en place grâce à la différenciation in situ des
angioblastes vers le phénotype endothélial permettant par la suite, la fusion et la formation
du lumen, et aboutissant à la formation d’un réseau vasculaire primaire. La prolifération
des cellules endothéliales, en formant des nouveaux capillaires, permet l’extension du
réseau par élongation et ramification; la morphogenèse vasculaire est ainsi mise en place.
L’angiogenèse, très active pendant l’embryogenèse et le développement de l’enfant, est
ralentie chez l’adulte (Engerman et al., 1967; Risau, 1995).
L’endothélium vasculaire est une interface dynamique mutable, avec des propriétés
structurales et fonctionnelles qui lui permettent de répondre à une variété de stimuli locaux
et systémiques.
Figure 1. Origine des cellules endothéliales. A) Vue schématique de la différenciation du
mésoderme et de la migration dans un embryon de poussin (environ 17 h d'incubation). B) Coupe
schématique d'une section d'un îlot sanguin dans l'aire opaque (AO) et des angioblastes dans l'aire
pellucide (AP) (d'après Risau, 1995).
B
A
31
1.1.2 ANATOMIE.
L’endothélium, constitué par les cellules endothéliales, la membrane basale et le
sous-endothélium, forme une surface relativement imperméable qui limite le transfert
passif de solutés, de macromolécules et d’éléments cellulaires ou de fluides entre le sang et
l’espace interstitiel. Ce flux est le produit de la transcytose, qui peut être ligand-spécifique
ou pas, et du passage du fluides à travers des liaisons intercellulaires. Des conditions
pathologiques, comme l’inflammation aiguë ou chronique, entraînent la perte de la barrière
et conduisent à l’œdème extracellulaire.
Les cellules endothéliales mesurent entre 0.3-0.5 µm d’épaisseur, 100 µm de long et 10µm
de large. Elles ont une forme en losange et leur juxtaposition forme un tapis en mosaïque.
Elles sont orientées dans la direction du débit sanguin (Figure 2).
Figure 2. Microphotographies en contraste de phase montrant la réorganisation des
cellules exposées au flux. La monocouche en A) a été cultivée en condition statique, sans flux,
alors que la monocouche en B) a été exposée pendant 24 h au flux (forces de cisaillements
laminaires 10 dyn/cm2). On remarque en B l'allongement individuel des cellules et leur orientation
dans la direction du flux indiquée par la flèche (d'après Topper et Gimbrone, 1999).
(A) (B)
32
Les cellules endothéliales in vivo s’attachent à la surface du vaisseau sanguin par
interaction avec le sous-endothélium. Celui-ci forme une matrice de molécules
parfaitement organisée comprenant collagène, élastine, fibronectine, laminine,
thrombospondine, intégrine, vibronectine, facteur von Willebrand et glycosaminoglycanes
comme le dermatane sulfate, l’héparane sulfate, la chondroïtine sulfate. Le sous-
endothélium est responsable de l’intégrité structurale, de la tension mécanique (mechanical
strength) et de l’élasticité des vaisseaux. Le collagène, sécrété majoritairement par les
cellules endothéliales, représente un des composés fondamentaux du sous-endothélium. Il
se lie à la surface endothéliale par interaction avec les β-intégrines, VLA-2 et VLA-3,
exprimées par les cellules endothéliales, la liaison avec le collagène permettant d’établir
des sites d’attachement. L’intégrine VLA2 est particulièrement importante car elle peut se
lier avec le collagène, la laminine et la fibronectine, et elle peut également s’associer aux
fibres d’actine. Celles-ci sont essentielles dans le mécanisme de mécanotransduction de
l’endothélium.
Le renouvellement du sous-endothélium est très faible. Cependant, il est soumis à
un processus de dégradation et de resynthèse qui est finement régulé par les cellules
endothéliales. L’endothélium se continue anatomiquement par la limitante élastique
interne, tout en formant la couche intime de la paroi vasculaire. Hormis les capillaires,
autour de l’intima se trouvent des cellules musculaires lisses, constituant une deuxième
couche anatomique appelée média. La média est la couche centrale de la paroi vasculaire.
Elle contient aussi des fibres élastiques disséminées, des feuillets d’élastine et des fibrilles
de collagène. La media participe également au remodelage de la matrice extracellulaire.
Son rôle principal vient de sa capacité de contraction qui lui permet de modifier le tonus de
l’arbre vasculaire. A l’extérieur, le vaisseau est limité par l’adventice qui entoure les
cellules musculaires lisses. L’adventice contient des fibroblastes et des adipocytes. La
structure globale de la paroi des vaisseaux varie selon le type de vaisseau. Par exemple, les
grandes artères qui assurent le transport du sang depuis le cœur vers les autres organes, ont
une paroi constituée de nombreuses cellules musculaires lisses, ce qui leur donne leur
élasticité. Le retour du sang au cœur, assuré par les veines, est un phénomène beaucoup
plus passif et les parois veineuses possèdent peu de cellules musculaires lisses. Dans les
capillaires, l’adventice et la média proprement dites ont disparu, et sont remplacées par des
cellules spécifiques appelées péricytes.
33
1.1.3 FONCTION
La recherche sur l’endothélium représente une branche relativement jeune de la
science cardio-vasculaire. Il y a seulement 40 ans l’endothélium était considéré comme une
barrière non-thrombogénique relativement inerte; cependant Florey en 1966 affirme que
l’endothélium est beaucoup plus qu’une feuille de cellophane nucléée. Plus tard, la mise en
route de cultures de cellules endothéliales in vitro a permis de mettre en évidence la
fonction endothéliale et d’étudier sa capacité de réponse aux changements
d’environnement, de type mécanique, chimique et humoral. Les cellules endothéliales
saines maintiennent une balance très fine entre
⎬ la promotion et l’inhibition de la croissance,
⎬ la vasoconstriction et la vasodilatation,
⎬ l’adhésion et la non-adhésion des cellules sanguines,
⎬ l’anticoagulation et la procoagulation, «l’hémostase».
De cette façon, l’endothélium contrôle le tonus vasomoteur, régule la structure vasculaire,
maintient les fluides du sang, et régule la réponse inflammatoire et immunologique.
1.1.4 LE CIRCUIT SANGUIN
Toutes les cellules de l’organisme puisent leur énergie et libèrent leurs déchets dans
le circuit sanguin dont aucune n’est éloignée de plus de 100 à 200 microns. La libre
circulation du fluide et des cellules à l’intérieur de ce circuit vasculaire est essentielle à la
survie de l’organisme et aucune fuite ne doit apparaître. L’hémostase englobe l’ensemble
des mécanismes qui permettent:
⎬ la libre circulation des cellules dans le circuit sanguin, «antithrombogénicité»
⎬ de colmater une éventuelle brèche du vaisseau, «thrombogénicité»
⎬ d’empêcher l’obstruction des vaisseaux, «fibrinolyse»
L’endothélium assure l’antithrombogénicité du circuit sanguin, favorise la
formation d’un caillot en cas de brèche vasculaire et initie les processus de destruction du
caillot par fibrinolyse puis antifibrinolyse qui limite l’intensité de cette réaction.
34
L’endothélium normalement antithrombogénique peut devenir prothrombotique
dans certaines circonstances, par exemple au cours d’un traumatisme ou d’un processus
inflammatoire. Normalement, le risque majeur est celui d’une hémorragie. La nature a
préparé toute une batterie de moyens de lutte efficaces et rapides conduisant à la formation
d’un caillot. Le rôle des plaquettes est primordial dans le colmatage d’une brèche
vasculaire. Quelques secondes après l’apparition de la brèche, elles adhèrent au sous-
endothélium, s’étalent à sa surface, s’agrègent les unes aux autres grâce à la présence de
glycoprotéines membranaires qui régissent les interactions inter-plaquettaires, et entre les
plaquettes et le sous-endothélium, formant ainsi le caillot plaquettaire; on parle
d’hémostase primaire. Immédiatement, les facteurs de coagulation plasmatiques sont
activés, et les phospholipides plaquettaires servent d’ancrage à ces facteurs. Un schéma
général de la coagulation est présenté dans la figure 3. La cascade de la coagulation
comprend une série de réactions qui culminent avec la formation de thrombine. Celle-ci est
capable de convertir une petite quantité de fibrinogène plasmatique en fibrine qui, par son
réseau périplaquettaire, consolide le caillot plaquettaire; on parle d’hémostase secondaire.
Chacune de ces réactions a besoin de la formation d’un complexe lié à la surface cellulaire
et la conversion des protéines précurseurs en protéases actives par une protéolyse limitée.
35
Figure 3. La cascade de la coagulation sanguine. Les zymogènes et les pro-cofacteurs sont
désignés par les chiffres romains. L'enzyme et le co-facteur dérivé ont l' indice a. (Dans:
Unsaturated Fatty Acids, Nutritional and Physiological significances. The report of the British
Nutrition Foundation's Task Force. Chapman & Hall for the British Nutrition Foundation. 1err ed
1992, Chap.13, Fig. 13.8, p 109, ISBN 0 412 45750 4. Modifiée par Dominguez, 2001).
1.2 PROPRIÉTÉS ANTITHROMBOTIQUES DE L’ENDOTHÉLIUM
Les cellules endothéliales exposent à leur surface et sécrètent différentes molécules
qui, soit s’opposent à l’agrégation plaquettaire, soit ont des propriétés antithrombotiques
ou fibrinolytiques.
1.2.1 FACTEURS ANTIPLAQUETTAIRES:
C’est un groupe hétérogène comprenant des molécules dérivées des acides gras, des
aminoacides et des protéines enzymatiques qui s’opposent à l’activité plaquettaire.
INTRINSIC SYSTEM (contact)
EXTRINSIC SYSTEM
36
1.2.1.1 La prostacycline
Les cellules endothéliales synthétisent de la prostacycline (PGI2) à partir de l’acide
arachidonique et la sécrètent dans le sang. Cette molécule est un puissant antiagrégant
plaquettaire et un vasodilatateur. Elle se lie à un récepteur spécifique sur les plaquettes
stimulant l’adénylate cyclase, entraînant ainsi la formation d’Adenosine Monophosphate
cyclique (AMPc). L’AMPc inhibe le changement de forme, la sécrétion, et l’agrégation
plaquettaire, et la liaison du fibrinogène aux récepteurs membranaires. La PGI2 a donc un
rôle anticoagulant. La demi-vie de la PGI2 est relativement courte, environ 2 min,
prolongée jusqu’à 30 min par la liaison à l’apolipoprotéine A-1. La synthèse et la sécrétion
de prostacycline sont modulées par un grand nombre de substances (thrombine, histamine,
ADP, ATP, cytokines, entre autres), par des variations de la force de cisaillement, ainsi que
par l’altération de l’endothélium.
Les cellules endothéliales peuvent convertir, grâce au métabolisme transcellulaire,
la PGH2, (principal précurseur de la synthèse des prostaglandines), d’origine plaquettaire
par exemple en PGI2. L’endothélium produit une quantité basale de PGI2, comme le
témoigne l’excrétion urinaire de son métabolite, la 2,3-dinor-6-oxo-prostaglandin F1α.
L’aspirine, la cyclosporine, les antiinflamatoires non stéroïdiens inhibent la
synthèse de PGI2 en inactivant la cyclooxygénase ou prostaglandine endoperoxyde H
synthase (PGHS), enzyme responsable de la synthèse de PGH2. La synthèse de la
prostacycline sera expliquée en détail ultérieurement dans le paragraphe 3, Biosynthèse
des prostanoïdes.
1.2.1.2 Le monoxyde d’azote
Comme la PGI2, le monoxyde d’azote (NO) synthétisé par les cellules
endothéliales, est un puissant vasodilatateur et un inhibiteur de l’adhésion et de
l’agrégation plaquettaire. La synthèse basale de NO est assurée par la NO synthase (NOS)
endothéliale constitutive, à partir de l’acide aminé L-arginine. NO inhibe aussi la
prolifération des cellules musculaires lisses. La production de NO induite par la
bradykinine est régulée par l'enzyme de conversion de l'angiotensine, enzyme localisée sur
la membrane plasmique des cellules endothéliales. En effet, l'enzyme non seulement active
la transformation de l'angiotensine I en angiotensine II, mais inactive également la
bradykinine. Le NO synthétisé, diffuse dans les cellules adjacentes où il agit de façon
paracrine. La PGI2 et le NO agissent en synergie, suggérant que, in vivo, des concentrations
37
faibles, inefficaces séparément, puissent ensemble supprimer l’agrégation plaquettaire.
Depuis la description initiale du NO comme le facteur de relaxation endothéliale (EDRF)
par Furchgott et Zawadzki en 1980, il est reconnu que le NO et la PGI2, à moindre degré la
PGE2, partagent un grand nombre de propriétés. Plusieurs des stimuli qui libèrent le NO
sont aussi des stimuli puissants pour la libération des prostaglandines (PG). La
vasodilatation induite par la bradykinine et par l’acétylcholine est dépendante de la
production de NO et de PG (Lamontagne et al., 1992).
Certaines études récentes suggèrent que les voies biosynthétiques du NO et des PG sont
modulables entre elles. Par exemple l’induction de PGE2 par l’endotoxine bactérienne
lipopolysaccharide (LPS) chez le rat est inhibée par les inhibiteurs de NOS; de plus, le
nitroprussiate de sodium mime l’effet activateur du LPS (Sautebin et DiRosa., 1994)
suggérant l’entrecroisement de ces deux voies métaboliques. Il a été suggéré que la
stimulation de la production endothéliale de NO stimule la production d’eicosanoïdes, par
activation de la PGHS (Davidge et al., 1995). De plus, il a été démontré que les
eicosanoïdes modulent la libération de NO et l’expression de la NOS. Ainsi dans les
plaquettes et dans les neutrophiles, l’acide arachidonique et le LTB4 stimulent la
production de NO (McCall et al., 1989).
Le mécanisme moléculaire d’interaction entre ces deux voies n’est pas connu
jusqu’à présent. Cependant, la plupart des effets du NO sont dus à l’interaction avec le fer
ou des protéines à fer héminique. Par exemple, les effets anti-plaquettaires et
vasodilatateurs du NO sont dus à la liaison du NO au groupe prosthétique hème-Fe2+ de la
guanylyle cyclase soluble. Cette interaction, conduit à l’activation de l’enzyme et à
l’augmentation du GMPc, second messager de NO pour ses effets relaxants et
antiagrégants (Ignarro, 1991). La cytotoxicité du NO à fortes concentrations semble être
due à l’interaction avec les clusters Fe-soufre de certains enzymes clés du cycle
respiratoire et de la synthèses d’ADN (Nathan, 1992). La PGHS, enzyme comportant un
groupement hème est une cible potentielle pour le NO (Kalyanaraman et al., 1982).
1.2.1.3 Les exonucléotidases
Les exonucléotidases sont exprimées à la surface des cellules endothéliales. Elles
sont capables de dégrader l’ATP et l’ADP en AMP et adénosine. Ces enzymes pourraient
jouer un rôle antiagrégant in vivo détruisant l’ADP relargué par les plaquettes sanguines
lors de la phase de sécrétion.
38
1.2.2 LES FACTEURS ANTICOAGULANTS
A la surface de l’endothélium deux facteurs principaux s’opposent à l’action
procoagulante de la thrombine, la thrombomoduline (TM) et les héparanes sulfates (HS).
Ils agissent de façon différente:
La TM est un protéoglycane transmembranaire à chondroïtine-sulfate (CS) qui
possède la propriété d’inverser l’activité procoagulante de la thrombine.
Les HS accélèrent l’inactivation de la thrombine par l’antithrombine III (ATIII).
1.2.2.1. La thrombomoduline
La thrombomoduline par sa partie protéique sert de récepteur à la thrombine qui,
une fois complexée à la TM, active la protéine C par protéolyse, déclenchant ainsi un
puissant système anticoagulant. La protéine C activée (PCa) empêche la formation de
nouvelles molécules de thrombine en inactivant les facteurs de coagulation Va et VIIa
(Figure 3, p 34). Elle désamorce la cascade explosive de la coagulation. Pour cela elle agit
en synergie avec un cofacteur qui est aussi, comme elle, vitamine K-dépendant: la protéine
S. Cette protéine est synthétisée et sécrétée par les cellules endothéliales. La protéine S se
lie à la fois à la membrane des cellules endothéliales et à la PCa, formant un complexe sur
la membrane cellulaire. La protéine C activée en présence de protéines S fixées sur les
surfaces cellulaires inactive les facteurs Va et VIIIa. Les déficits congénitaux en protéines
C ou S ainsi que certaines mutations sur le gène de la TM s’accompagnent de thromboses.
Ces conditions pathologiques démontrent le rôle primordial de ces molécules dans le
maintien de l’antithrombogénicité de l’endothélium.
1.2.2.2 Les héparanes sulfates
Il a été récemment démontré que des HS à activité antithrombique sont présents à la
surface vasculaire des cellules endothéliales et dans la matrice sous-endothéliale. Ces
molécules à activité «Heparin-like» ont été isolées. Leur fonction anticoagulante a été
démontrée par le fait qu’elle disparaît sous l’effet de l’héparinase, enzyme qui coupe les
séquences hépariniques. Ces molécules se lient à l’antithrombine III (ATIII) et accélèrent
l’inactivation des sérine protéases de la coagulation. L’ ATIII plasmatique est le principal
inhibiteur circulant de la thrombine. Le déficit congénital en ATIII entraîne une maladie
thrombotique et démontre le rôle important de cette protéine in vivo. L’ATIII seule
39
n’inhibe que très faiblement la thrombine, le facteur Xa et les autres sérine protéases de la
coagulation mais ce processus est accéléré fortement par la présence d’héparine ou d’HS.
Une petite fraction de l’ATIII est liée aux HS à la surface endothéliale et lors de
perméabilité endothéliale accrue, les HS présents en grande quantité dans la matrice sous-
endothéliale seraient disponibles pour l’ATIII afin de constituer une barrière
antithrombotique efficace. L’ATIII s’exprime de façon constitutive sur l’endothélium.
L’inhibiteur de la voie du facteur tissulaire (TFPI) est aussi synthétisé par les cellules
endothéliales. Le TFPI inhibe le facteur VIIa complexé au facteur tissulaire (Figure 3, p
34) dans un complexe quaternaire avec le facteur Xa. Il est présent en faible concentration
dans le plasma. L’héparine augmente considérablement la sécrétion du TFPI.
1.2.3 FACTEURS FIBRINOLYTIQUES
La fibrinolyse intervient dans la dissolution des dépôts fibrineux formés en
permanence à la surface des vaisseaux. Les cellules endothéliales synthétisent et sécrètent
à la fois les activateurs du plasminogène et les inhibiteurs de ces activateurs. De plus, elles
ont des récepteurs membranaires pour le plasminogène, la plasmine, l’activateur tissulaire
du plasminogène (tPA), l’activateur de l’urokinase (uPA) et l’inhibiteur du tPA dans le
plasma, le PAI-1.
1.2.3.1 Activateur tissulaire du plasminogène
Les cellules endothéliales constituent le site majeur de synthèse du tPA. Il est
sécrété en réponse à un grand nombre de stimuli, comme par exemple la thrombine, les
forces de cisaillement, l’exercice physique, l’augmentation de la pression veineuse,
l’acidose et l’hypoxie. Le tPA libre une fois fixé à la surface endothéliale devient
inaccessible à son inhibiteur physiologique, le PAI-1. De même que le tPA, le
plasminogène et le PAI-1 ne peuvent pas être efficaces en solution, les activités
fibrinolytiques ne pouvant s’exercer qu’in situ, sur la fibrine ou à la surface des cellules
endothéliales.
40
1.3 PROPRIÉTÉS PROCOAGULANTES DE L’ENDOTHÉLIUM
Toute lésion vasculaire responsable d’une rupture de la continuité de l’endothélium
entraîne le processus d’activation des plaquettes et de la coagulation.
1.3.1 FACTEURS PROCOAGULANTS
En cas de brèche vasculaire, les cellules endothéliales changent leur phénotype pour
fournir avec le sous-endothélium, des substances à activité vasoconstrictrice comme
l’endothéline-1, (ET-1), des facteurs procoagulants, proagrégeants et adhésifs, nécessaires
au colmatage de la lésion. Elles fourniront également divers facteurs et inhibiteurs de
croissance qui permettront l’adaptation de cellules migratoires, musculaires lisses ou
fibroblastes, et des facteurs contractants comme le thromboxane A2 et la prostaglandine H2,
pour la réparation de l’endothélium détruit. Contrairement au thromboxane A2 et à la
prostaglandine H2 qui activent les plaquettes, l'ET-1 n'a pas d'effet direct sur les plaquettes
mais a des propriétés vasoconstrictrices et induit la prolifération des cellules musculaires
vasculaires.
1.3.1.1 Le Facteur von Willebrand
Les cellules endothéliales synthétisent, stockent et sécrètent le facteur von
Willebrand (FvW), glycoprotéine plasmatique multimérique hétérogène. Il a deux
fonctions principales:
⎬ stabiliser l’adhésion plaquettaire
⎬ transporter le facteur VIII «facteur antihémophilique»
Le FvW est indispensable à l’adhésion plaquettaire. Il accomplit cette fonction par
la formation d’un lien entre la glycoprotéine Ib/IX plaquettaire et les fibrilles de collagène
sous-endothéliales. Il peut parfois jouer le même rôle entre les plaquettes, par exemple en
présence de forces de cisaillement élevées. Le FvW au départ est un monomère de 250
KDa qui subit d’importantes modifications post-traductionnelles et une multimérisation. Le
FvW est synthétisé de façon constitutive. Dans la cellule endothéliale il est stocké dans les
granules de Weibel-Palade.
L’anomalie d’un des allèles du gène du FvW conduit à trois types différents de la
maladie de vW. Ce désordre génétique a une fréquence de 1 sur 800 à 1000 individus.
Hormis le type III de la maladie, elle est héritée sur le mode autosomique dominant. La
41
maladie peut être symptomatique ou pas. Quand elle est symptomatique, même si elle est
hétérogène, l’epitaxis spontané ainsi que l’hémorragie des muqueuses orales, gastro-
intestinales, ou génitales et urinaires sont des signes communs aux différents phénotypes
de ce désordre hémorragique héréditaire. Environ, 1 individu sur 1 million a une forme
sévère de la maladie. Le type III, qui est phénotypiquement récessif, se présente avec des
hémorragies sévères des muqueuses; le FvW n’est pas détectable, et le facteur VIII est
présent en très faible concentration.
1.3.1.2 Facteur V et récepteurs des facteurs plasmatiques de coagulation
Les cellules endothéliales synthétisent le facteur V et présentent à leur surface des
récepteurs membranaires pour les facteurs V, IXa, Xa, et le kininogène de haut poids
moléculaire. La fixation de cette dernière molécule permettrait le lancement de la voie
d’activation du facteur «contact» ou voie intrinsèque (Figure 3, p 34).
1.3.1.3 Le facteur tissulaire
Le facteur tissulaire (FT) est une lipoprotéine ubiquitaire présente dans la
membrane cellulaire qui s’expose en cas de lésion cellulaire. Le FT déclenche la voie
extrinsèque de la coagulation (Figure 3, p 34). Le FT va générer la thrombine par le biais
de l’activation des sérine protéases. Il semble que le complexe FT-facteur VII soit actif en
continu et responsable principal de la coagulation basale.
1.4 LES INTERACTIONS CELLULAIRES
L’agression de l’endothélium a pour conséquence l’induction de l’expression des
récepteurs d’adhérence qui jouent un rôle essentiel dans les interactions cellulaires:
Adhérence plaquettes/endothélium par le biais des intégrines de type β3.
Adhérence leucocytes/endothélium par le biais de plusieurs molécules: les
sélectines P ou E et trois membres de la superfamille des immunoglobulines,
ICAM-1, ICAM-2 et VCAM-1.
42
Les leucocytes possèdent les ligands et les récepteurs pour ces protéines. Dans la
Figure 4 on observe l’adhésion des leucocytes à la paroi du vaisseau sanguin. Les
interactions adhésives s’accompagnent d’une activation des leucocytes qui permet de
déclencher le processus de coagulation à la surface endothéliale. L’activation des
leucocytes induit la coagulation par l’intermédiaire de FT et active directement le facteur X
par le biais d’une intégrine.
Figure 4. Adhésion des leucocytes à la paroi vasculaire. Microphotographie montrant
l'adhésion des leucocytes à une veinule dans un tissu enflammé. X 16000. (d'après M.J Karnovsky.
Dans: Roitt, Brostoff et Male, Immunology 4th ed., 1996. Chap.1 Introduction to the Immune
System, Fig. 1.16, p 1.9., ISBN 0 72342178 1).
42
2. LES EICOSANOÏDES D’ORIGINE ENDOTHÉLIALE.
Les eicosanoïdes sont des autacoïdes synthétisés à partir des acides gras essentiels à
longues chaînes. Les prostanoïdes sont les principaux eicosanoïdes produits par les cellules
endothéliales. Ce sont des molécules dérivées des acides gras à vingt atomes de carbone
ayant au moins 3 doubles liaisons en position 8, 11, 14 par la voie enzymatique de la
cyclooxygénase.
2.1. HÉTÉROGENÉITE DE L’ENDOTHÉLIUM
L’endothélium est sensible aux éléments circulants du sang et aux stimuli locaux. Il
répond de façon judicieuse par des changements de fonction et de nature des médiateurs
secrétés. L’endothélium est à la fois cible et source d’autacoïdes (PAF, PG), facteurs de
croissance, cytokines, radicaux oxygénés (NO, anion superoxyde), et facteurs
hémostatiques (FvW). Même si l’endothélium forme une monocouche continue le long du
circuit sanguin, celui-ci est loin d’être homogène. Il y a d’importantes différences
structurales dans les jonctions endothéliales, des interactions avec la membrane basale et
les autres cellules de la paroi vasculaire ainsi qu’une grande diversité dans la nature des
récepteurs exprimés. De plus, les cellules endothéliales ont des fonctions enzymatiques
spécifiques du type d'endothélium dont elles sont issues.
L’essentiel des connaissances initiales sur le rôle physiologique de l’endothélium
provient d’une seule source cellulaire: les cellules endothéliales de la veine du cordon
ombilical humain (HUVEC). Les résultats obtenus avec ces cellules ainsi que ceux obtenus
avec d’autres cellules endothéliales des larges vaisseaux, isolées de l’aorte et l’artère
pulmonaire, ont été à la base de conclusions inexactes sur l’endothélium. Un exemple, est
la cascade de l’acide arachidonique, voie métabolique qui a été généralisée à tout
l’endothélium à partir d’études réalisées sur les HUVEC et les cellules endothéliales des
larges vaisseaux. L’extrapolation des résultats obtenus dans ces études a conduit à
considérer la PGI2 comme la prostaglandine majeure produite par l’endothélium. Bien que
ceci soit vrai pour les gros et moyens vaisseaux, ce n’est pas le cas des microvaisseaux qui
produisent majoritairement de la PGE2 (Gerritzen et Cheli, 1983; Charo et al., 1984;
Carley et al., 1992).
43
Dans les petits vaisseaux placentaires il semble que la production de thromboxane
A2 soit importante étant donnée la forte immunoréactivité de la thromboxane synthase
trouvée à ce niveau. (Wetzka et al., 1994; Nusing et al., 1990). Par ailleurs, l’augmentation
de l’expression de la PGHS-1 peut être impliquée dans la physiopathologie de la pré-
eclampsie (Wetzka et al., 1997). La cellule endothéliale a le potentiel de générer des
médiateurs puissants qui affectent: le tonus vasculaire, la perméabilité, la libération
d’autres médiateurs, la fonction plaquettaire, l’activation des lymphocytes, le
chimiotactisme des leucocytes, la cytoprotection, la fonction rénale et le transport des ions.
2.2 ACIDES GRAS ESSENTIELS
Les acides linoléique 18:2 ω−6 et α-linolénique, 18:3 ω−3 ne peuvent être
synthétisés par l’Homme leur présence dans l’alimentation est indispensable. Les autres
acides gras polyinsataurés (AGPI) comme l’acide arachidonique, (AA), l’acide
eicosapentaénoïque (EPA) et l’acide docosahexaénoïque (DHA) peuvent provenir de
l’alimentation ou de la conversion métabolique des acides linoléique et α-linolénique
précurseurs des séries ω−6 et ω−3, respectivement.
Les acides gras essentiels (AGE) sont des molécules indispensables au maintien de
la compartimentation cellulaire; ils produisent des métabolites actifs, les eicosanoïdes, et
participent au transport/oxydation du cholestérol. Les travaux de Burr et Burr (1929, 1930)
ont clairement démontré le caractère essentiel des acides gras polyinsaturés et en
particulier des acides linoléique (18:2 ω−6) et arachidonique (20:4 ω−6). Plus tard,
Crawford (1976) démontra le caractère essentiel des acides gras (AG) de la série ω−3 pour
le développement du cerveau. Le rôle essentiel du DHA, 22:6 ω−3 pour la fonction
visuelle chez l’Homme a été mis en évidence par Neuringer et al., 1988; Connor et al.,
1988; Birch et al., 1992. Il a été montré que le contenu en DHA de la rétine est maintenu
constant par un mécanisme de recyclage très raffiné qui assure un pool de stockage dans la
matrice interphotorécepteurs, à disposition de la synthèse des membranes photoréceptrices
(Anderson et al., 1992; Bazan et al., 1992).
Ces deux familles d’acides gras se trouvent dans les triglycérides des huiles
alimentaires. Dans la plupart des huiles d’origine végétale, la série ω−6 est majoritaire,
tandis que la série ω−3 est plus restreinte. Cependant, celle-ci est importante dans les
huiles de poisson qui sont particulièrement riches en EPA et DHA, les produits
d’élongation de l’acide α-linolénique. Il y a cependant, une différence dans le rapport
44
EPA/DHA selon le type de poisson; le rapport augmente dans les huiles d’origine marine
tandis qu'il diminue dans les huiles de poissons d’eaux douces. (Simopoulos, 1991; Ortiz et
Bosch., 1993).
Les besoins journaliers en acides gras de la série ω−6 sont de l’ordre de 3% des calories
totales alors que ceux en acide gras de la série ω−3 représentent seulement 0.5% (British
Nutrition Foundation, 1992; Bjerve et al., 1987; Pascaud et Brouard, 1991).
2.3 TYPE D’EICOSANOÏDES
Les eicosanoïdes sont les dérives hydroxylés des acides gras polyinsaturés de la
famille ω−6 et ω−3, comprenant 20 atomes de carbones. Ils se répartissent en quatre
groupes:
⎬produits cycliques, formés initialement par une réaction de peroxydation. Ils sont
désignés de façon globale par le terme prostanoïdes et incluent les prostaglandines,
les prostacyclines et les thromboxanes.
⎬produits linéaires, issus du métabolisme de la 5-lipoxygénase: les leucotriènes (LT)
incluant les substances d’hypersensibilité retardée, peptido- leucotriènes (LTC4, TD4 et
LTE4) qui sont synthétisés lors du choc anaphylactique.
⎬produits formés par d’autres lipoxygénases: acide 12 Hydroxyperoxy-
eicosatétraénoique (12-HPETE) formé par action de la 12-lipoxygénase sur l’AA, et
15-HPETE dont la formation est catalysée par la 15-lipoxygénase.
⎬les produits mono-oxygénés dérivés des acides gras polyinsaturés (AGPI)
formés par l’hydroxylation de l’AA sur l’extrémité méthylée, sur le carbone
adjacent ou aux dépens d’une doubles liaisons sous la forme d’époxydes, sous
l’action du cytochrome P450.
2.3.1. LES PROSTANOÏDES
Il s’agit d’un groupe de composés biologiquement actifs dérivés des AGE,
synthétisés dans tous les tissus. Les prostanoïdes s'arrangent dans une structure
cyclopentanique à deux chaînes latérales, l’une contenant l’extrémité carboxyle (COOH),
45
l’autre contenant l’extrémité méthyle (CH3) ainsi que le groupe hydroxyle sur le carbone
15. Par conséquent les prostanoïdes peuvent être considérés comme des acides gras
hydroxylés cycliques. Selon la configuration de la partie cyclique, les prostanoïdes peuvent
être divisés en:
prostaglandines, prostacyclines, contenant un cycle à cinq carbones
thromboxanes contenant un héterocycle à oxygène et cinq carbones
Les prostanoïdes sont considérés comme des substances analogues aux hormones.
Cependant, elles ont des caractéristiques différentes des hormones. Les prostaglandines ont
des effets différents selon les types cellulaires, tandis que les hormones ont le même effet
sur toutes les cellules cibles. Les prostaglandines agissent seulement sur les cellules où
elles ont été synthétisées et/ou sur des cellules voisines (effet autocrine et/ou paracrine);
alors que les hormones peuvent avoir des effets sur toutes les cellules de l’organisme (effet
systémique).
Les prostaglandines, agissent sur la fonction immunitaire, sur le système nerveux et
sur les sécrétions gastro-intestinales. De plus, certaines prostaglandines font baisser la
pression sanguine. Elles peuvent stimuler la contraction ou la relaxation du muscle lisse.
Les prostanoïdes sont présents dans tous les tissus animaux où ils sont synthétisés à partir
des acides suivants:
⎬ acide dihomo-γ-linoléinique, 20:3 ω−6 à l’origine de la sséérriiee 11 des
prostanoïdes, caractérisée par une seule double liaison
⎬ acide arachidonique, 20:4 ω−6, précurseur de la sséérriiee 22 contenant deux
doubles liaisons
⎬ acide eicosapentaénoïque, 20:5, ω−3, précurseur de la sséérriiee 33 possédant
trois doubles liaisons.
La cyclooxygénase ou prostaglandine endoperoxyde synthase (PGHS) est l’enzyme
catalysant la production des trois séries de prostanoïdes (Figure 5). Les PGG sont
synthétisées par l’action de la PGHS qui a également une activité peroxydase aboutissant à
la formation de PGH, précurseur des PGE, PGD, PGF, PGI et TXA, TXB. La différence
46
structurale entre ces dernières est le nombre de double liaison indiquée en indice, tels que 2
(deux doubles liaisons) pour la PGE2.
2.3.1.1 Actions générales des prostanoïdes
Les résultats concernant l’action des prostanoïdes montrent que la PGE2 et la PGF2
ont des effets antagonistes. La PGE2 provoque une relaxation du muscle lisse des bronches
ainsi qu’une dilatation des vaisseaux sanguins, alors que la PGF2α a des effets opposés dans
les mêmes tissus. La PGE2 a un effet inhibiteur sur le chimiotactisme tandis que PGF2α est
stimulatrice. Les prostacyclines synthétisées par la paroi vasculaire sont de puissants
inhibiteurs de l’agrégation plaquettaire. Elles induisent la dilatation de la paroi artérielle ce
Figure 5. Les trois séries de prostanoïdes et leur origine biosynthétique.
Molécule moins réactive. (Dans: Unsaturated Fatty Acids, Nutritional and Physiological
Significances. The report of the British Nutrition Foundation's Task Force. Chap.19, fig. 19..2, p
140. Chapman & Hall for the British Nutrition Foundation. Première édition 1992, ISBN 0 412
45750 4). Modifiée par Dominguez Z, 2001.
qui entraîne la diminution de la pression artérielle. Le thromboxane A2, synthétisé par les
plaquettes sanguines stimule l’activation et l’agrégation plaquettaire, un des mécanismes
essentiel dans la réparation des tissus. De plus, il induit la contraction de la paroi artérielle
SÉRIE 1 SÉRIE 2 SÉRIE 3
Eicosapentaenoic acid (EPA) 20 :5 n-3
47
et conduit à l’élévation de la pression artérielle. La balance entre ces activités opposées est
essentielle pour la physiologie vasculaire.
2.3.2 LES LEUCOTRIÈNES
Bien qu’il ait été établi que les cellules endothéliales ne possèdent pas de 5-
lipoxygénase, donc ne synthétisent pas de leucotriènes, elles peuvent cependant générer les
leucotriènes C4 et D4 par un métabolisme transcellulaire. Au moment d’une activation
leucocytaire l’excès de LTA4 produit peut être converti en LTC4 et LTD4 par la GSH-S
transférase endothéliale, dont l’activité métabolique peut être notamment diminuée par le
blocage de la sélectine-L et des intégrines CD11b/CD18 (MAC-1) (Brady et Serhan,
1992). Le contact entre les deux types cellulaires est donc essentiel pour l’activité de la
transférase. En revanche, la 12-lipoxygénase est présente dans les HUVEC et autres
endothélia vasculaires (Nishiyama et al., 1993; Shannon et al., 1991). Le 15-HETE est
aussi synthétisé par les cellules endothéliales, cependant il semble être synthétisé par la
PGHS et non par la 15-lipoxygénase car l’inhibition pharmacologique la PGHS inhibe la
production de 15-HETE (Gorman et al., 1985).
2.3.3 VOIE DU CYTOCHROME P450
Les cellules endothéliales métabolisent l’AA par la voie du cytochrome P-450. Ce
système de monooxygénation enzymatique comporte une famille unique d’hémoprotéines
qui servent d’accepteurs terminaux du système d’oxydation NADPH-dépendant. Le
système, en présence de NADPH et oxygène moléculaire métabolise l’AA en divers
métabolites oxygénés tels que :
⎬ des époxydes régioisomériques les acides (5,6; 8,9; 11,12; 14,15)
epoxyeicosatetraénoïques (EET). Le 14,15 EET est majoritaire dans
l’endothélium vasculaire (Harder et al., 1995; Pritchard et al., 1990). Les EETs
sont ensuite hydrolysés en leur dérivés diol correspondants;
⎬ acides mono-hydroxyeicosatétraénoïques (HETEs) conjugués. Il a été suggéré
que le 12(R)-HETrE, stimule directement la prolifération des microvaisseaux et
la formation néocapillaire in vitro (Stoltz et al., 1996).
⎬ ω et ω−1 alcools.(Capdevila et al., 1992., Capdevila et al., 2.000).
48
Un des produits dérivés de l’oxydation de l’AA par la cytochrome P450 pourrait être le
médiateur de l’activité hyperpolarisante dépendant de l’endothélium (EDHF) (Bauersachs
et al., 1994; Campbell et al., 1996). L’EDHF agit sur les cellules musculaires lisses par
ouverture des canaux potassiques provoquant une hyperpolarisation de la cellule.
2.4 EFFETS BIOLOGIQUES
2.4.1 LES PROSTANOÏDES ET LA RÉPONSE DÉPENDANT DU FLUX
En cas d’occlusion temporaire d’une artériole, la vélocité des érythrocytes dans les
artérioles proches et parallèles augmente et cette augmentation de la vitesse du flux est
suivie ultérieurement par une augmentation du diamètre artériolaire; cette réponse
s’appelle dilatation flux-dépendant. Au moment de l’apparition de l’occlusion, la vitesse
du flux augmente. Pendant cette période le diamètre de l’artériole est initialement diminué
ce qui augmente par conséquent la force de cisaillement «wall shear stress». Après 6-15
secondes le diamètre de l’artériole augmente, et le flux érythrocytaire est rétabli à la valeur
basale. Il a été montré que la vasodilatation dépendante du flux était dépendante de
l’endothélium (Kuo et al., 1990; Koller et Kaley, 1991a,b). Il a été suggéré qu’un des
métabolites de l’AA serait le principal médiateur de la réponse (Koller et Kaley, 1990).
L’application d'inhibiteurs de la synthèse du monoxyde d'azote n’a pas d’effet sur la
dilatation tandis que les inhibiteurs de la cyclooxygénase, tels que l’indométacine ou le
méclofénamide inhibent complètement la dilatation de l’artériole en réponse à
l’augmentation du flux érythrocytaire. La synthèse des prostaglandines dérivées de
l’endothélium dans les endroits proches de l’occlusion jouerait un rôle importent dans ce
mécanisme de régulation qui peut augmenter considérablement le flux sanguin.
2.4.2 EICOSANOÏDES ET LA RÉPONSE INFLAMMATOIRE
Etant donné que l’activité PGHS est la première impliquée dans le processus
catalytique de conversion des AGE à vingt atomes de carbones en prostaglandines, elle
joue un rôle clé dans la génération des médiateurs de l’inflammation. Le traitement des
cellules endothéliales par des agonistes comme la bradykinine, l'ATP, l'angiotensine II,
l'endothéline ou la thrombine, entraîne une libération immédiate de prostaglandines.
Cependant d’autres stimuli comme les cytokines et les mitogènes induisent une formation
de prostanoïdes retardée qui dépendent en effet, d’une synthèse de protéines plus tardive.
49
La réponse inflammatoire aiguë est caractérisée par une séquence d’événements qui
s’additionnent: (11) une vasoconstriction artériolaire suivie (22) d'une vasodilatation et d'une
augmentation de la perméabilité venulaire qui entraîne la fuite de macromolécules et la
formation d’œdème (33) la migration de leucocytes vers la zone de lésion et leur diapédèse.
Dans cette séquence de réponse inflammatoire, les eicosanoïdes jouent plusieurs rôles. La
PGE2 et la PGI2 contribuent à la vasodilatation et augmentent la perméabilité induite par le
premier stimulus comme l’histamine, la bradykinine, les neuropeptides sensoriels et les
leucotriènes. Cependant, les PG peuvent aussi réduire la libération de médiateurs. La
PGE2, par exemple réduit in vivo la libération d’histamine induite par un antigène.
L’indométhacine, un inhibiteur de la cyclooxygénase, peut augmenter substantiellement la
libération d’histamine induite par des antigènes (Hedqvist et al., 1990).
La réponse vasoconstrictrice initiale est induite, au moins en partie, par les
leucotriènes LTC4 et LTD4. Les inhibiteurs de lipoxygénase offrent une certaine
protection, diminuent la fuite du plasma et le nombre de leucocytes qui migrent. De plus, la
vasoconstriction initiale est aussi inhibée. Les leucotriènes libérés soit par les cellules
circulantes, soit par les cellules du tissu, ainsi que les leucotriènes potentiellement générés
par le métabolisme transcellulaire, jouent certainement un rôle important durant la réponse
inflammatoire aiguë. Les lipoxines peuvent aussi jouer un rôle contre-régulateur important
en inhibant l’adhésion des neutrophiles à la cellule endothéliale ainsi que le chimiotactisme
des neutrophiles et des éosinophiles (Papayianni et al., 1996; Soyombo et al 1994; Takata
et al., 1994).
50
50
3. BIOSYNTHÈSE DES PROSTANOÏDES: LES PROSTACYCLINES La première étape dans la biosynthèse des prostanoïdes, dont la prostacycline, est la
libération de l’AGE à partir des phospholipides membranaires où il est stocké. Ceci est
réalisé par une famille d’enzymes cellulaires, les phophospholipases de type A2, ainsi que
par celles de types C et D agissant de concert avec les diglycérides lipases.
La deuxième étape, est la synthèse de la PGH, précurseur de tous les prostanoïdes:
prostaglandines, prostacyclines et thromboxanes. Cet intermédiaire est synthétisé par la
PGHS qui constitue l’étape limitante dans la biosynthèse des prostanoïdes.
3.1.DESCRIPTION DES LIPIDES MEMBRANAIRES
Les membranes cellulaires forment une mosaïque fluide constituée par un
agencement de lipides et de protéines. Parmi les lipides, les phospholipides représentent la
classe majoritaire. Les structures membranaires renferment aussi d’autres lipides
quantitativement moins importants tels que les lipides neutres (20-25%) comprenant le
cholestérol, quelques acides gras non estérifiés ainsi que des glycolipides (2-5%).
3.1.1 LES PHOSPHOLIPIDES
Les phospholipides sont constitués par un résidu glycérol acylé en position sn-1 par
un acide gras généralement saturé ou monoinsaturé, et en position sn-2 par un acide gras
polyinsaturé, comme l’acide arachidonique. La position sn-3 est occupée par un groupe
polaire, contenant une liaison phosphate. On distingue plusieurs classes de phospholipides
selon la nature de ce groupement polaire: les phosphatidylcholines (PC), les
phosphatidyléthanolamines (PE), les phosphatidylsérines (PS) et les phosphatidylinositols
(PI). L’inositol peut porter un ou deux groupements phosphates supplémentaires, le
phospholipide correspondant étant alors le phospatidylinositol (4) phosphate (PIP) ou le
phosphatidylinositol (4,5) biphosphate (PIP2). PI représente plus de 80% des
phosphoinositols totaux. PC et PE sont divisés en sous-classes selon la nature de la liaison
reliant la chaîne hydrocarbonée en position sn-1 au squelette glycérol.
3.1.2 COMPOSITION DES PHOSPHOLIPIDES DANS LA CELLULE ENDOTHÉLIALE
Au sein des cellules endothéliales humaines en culture les PC représentent 36,6%
des phospholipides totaux, les PE 10,2%, les PS 7,1%, les PI 3,1%, le reste étant composé
de: sphingomyéline 10,8%, choline plasmalogène 3,7%, éthanolamine plasmalogéne 7,6%,
lysophosphatidylcholine 7,5%, lysophosphatidyl-ethanolamine 3,6%, phosphatidylinositol
51
4,5 biphosphate 1,8%, acide phosphatidique 1,9%, phosphatidylinositol 4-phosphate 1,5%,
et cardiolipines 1,9% (Murphy et al., 1992).
3.2 MÉCANISME DE LIBÉRATION DE L’ACIDE ARACHIDONIQUE
Les cellules de mammifères contiennent l’acide arachidonique estérifié presque
exclusivement au niveau de la position sn-2 des phospholipides. Dans les cellules
endothéliales il est incorporé majoritairement dans les PC, (Takayama et al., 1987;
Takayama et al., 1989). Le taux d’AA libre dans les cellules au repos est très faible car il
est rapidement réestérifié dans les phospholipides par les acyl-CoA-transférases. Par
conséquent, pour le rendre disponible, l’hydrolyse des phospholipides par les
phospholipases est nécessaire.
Plusieurs phospholipases sont, directement ou indirectement, responsables de la libération
de l’AA. (Figure 6)
La PLA2 hydrolyse les phospholipides en position sn-2 et libère l’AA ainsi qu’un
lyso PL. C’est la voie principale de libération de l’AA.
Une voie indirecte impliquant une PLC et une diacyl ou monoacyl glycérol lipase
conduit également à la libération d’AA.
La voie de la PLD et de la PLA1 représentent des voies mineures.
3.2.1 LES PHOSPHOLIPASES A2
Les PLA2, sont classiquement répertoriées en trois grandes familles: les sPLA2 ou
PLA2 sécrétées, les cPLA2 ou PLA2 cytosoliques, et les iPLA2 cytosoliques calcium-
indépedantes (Murakami et al.,1997a), chacune comprenant plusieurs isoformes.
3.2.1.1 Les phospholipase A2 sécrétées
Les sPLA2
Ce sont des protéines de faible masse moléculaire (14KDa) qui sont sécrétées en
réponse à une stimulation. L’activité catalytique se développe pour des concentrations en
calcium de l’ordre du millimolaire et à pH 8-9. Elles n’ont pas de sélectivité vis a vis de
l’acide gras estérifié en position sn-2.
Chez l’Homme la sPLA2 de type IB est la plus importante. C’est une enzyme digestive,
présente dans le jus pancréatique sous forme de pro-enzyme, qui est activée par la trypsine
lors du processus de digestion auquel elle participe via le métabolisme des phospholipides.
52
Elle est également présente dans les organes non digestifs tels que la rate, les poumons, les
reins.
Figure 6. Voies de libération de l’acide arachidonique par les différentes
phospholipases.
La sPLA2 IIA est présente de manière constitutive dans divers tissus tels que le
foie, le thymus, la moelle osseuse, les amygdales et la rate (Murakami et al., 1995a). Elle
est induite par des stimuli pro-inflammatoires. En fait, elle est présente en quantité
importante dans le sang de patients ayant des maladies inflammatoires (Nevalainen et al.,
1993) sinon elle est présente en petite quantité et de façon constitutive dans certaines
cellules immunitaires telles que les PMN, les mastocytes, les macrophages.
PLA1
R1 C
O
O CH2
CHOCR2
O CH2 O P
O
O X
O-
PLC PLD
PLA1
PLA2
R1 C
O
O- + Lyso PL
R2 C
O
O- + Lyso PL
PLC
X + DAG Phosphatidate + XOH
PLD
DAG lipase
Monoacylglycérol (MAG) + R1 C O-
O
MAG lipase
Glycérol + R2 C
O
O-
P
PLA2
(acide arachidonique)
53
La sPLA2 V est fortement exprimée dans le cœur, le placenta et un peu moins dans
les poumons et le foie.
Le rôle des sPLA2 II et V dans la régulation de l’hydrolyse de l’AA a été récemment
examiné (Murakami et al., 1999). Ces enzymes fonctionnent en concertation avec la
cPLA2. Les cytokines inflammatoires comme le TNFα, l’IL-1, L’IL-6 et ou le LPS
induisent l’expression du gène de la sPLA2 type II. La protéine sécrétée dans le milieu
extracellulaire peut se lier à la membrane et libère l’AA à partir des phospholipides
membranaires. La participation respective de la sPLA2 et de la cPLA2 dans la synthèse
d’eicosanoïdes varie en fonction du type cellulaire, de l’agent initiateur, et de la cinétique
d’activation cellulaire. Dans les HUVEC, stimulées ou non par la thrombine, la cPLA2
interviendrait seule dans la libération d’AA. En revanche, dans ces mêmes cellules
stimulées par le TNFα, la sPLA2, serait également responsable de la libération d’AA.
(Murakami et al., 1993) Dans les mastocytes murins activés, la synthèse de PGD2
comporte 2 phases: l’une rapide pour laquelle la libération d’AA est catalysée par une
sPLA2, l’autre plus lente pour laquelle seule la cPLA2 est impliquée (Reddy et Herchman,
1997) Au sein de la lignée cellulaire macrophagique P388D1, la libération d’AA après
stimulation comporte également 2 phases. Cependant, la phase précoce est due à
l’intervention d’une cPLA2, tandis que la phase tardive à une sPLA2 (Balsinde et Dennis,
1996).
3.2.1.2 Les Phospholipase A2 cytosoliques
Les cPLA2
A la différence des sPLA2, la masse moléculaire de ce groupe de PLA2 est
beaucoup plus élevée, environ 80 KDa. Ces enzymes peuvent être ou non Ca2+-
dépendantes.
3.2.1.2.1 Les iPLA2 calcium-indépendantes
Une voie Ca2+-indépendante d’activation d'une PLA2 cytoplasmique a été mise en
évidence dans plusieurs types cellulaires dont les cellules endothéliales (Kaya et al., 1989).
Cette voie d’activation impliquerait la synthèse de novo d’une enzyme activatrice de la
PLA2 (Buckley et Whorton, 1994).
Les iPLA2 cytosoliques peuvent être classées en deux catégories: la iPLA2 groupe
VI de masse moléculaire 80 KDa qui semble être impliquée dans le remodelage des
54
phospholipides membranaires et deux autres iPLA2 (groupes VII et VIII) de masse
moléculaire 29 KDa qui se caractérisent par l’hydrolyse des phospholipides à chaînes
carbonées courtes (environ 9) et/ou à chaînes oxydées en position sn-2 excluant la
possibilité de libération des acides gras à longues chaînes comme l’AA.
Contrairement aux deux autres familles de PLA2, l’élévation du taux de calcium
intracellulaire n’active pas les iPLA2, induisant même une inhibition de leur activité.
3.2.1.2.2 La cPLA2-calcium-dépendante
Cette enzyme libère l’AA de façon préférentielle bien que d’autres acide gras
puissent être libérés lors de l’activation cellulaire. De nombreux stimuli extracellulaires
tels que les facteurs de croissance, les mitogènes, les peptides vasoactifs, les cytokines, les
interferons, les ligands des intégrines et des récepteurs Fc, activent la cPLA2. Cependant,
elle peut aussi être activée par des stimulations n’impliquant pas de récepteur comme les
stimuli de stress incluant l’oxydation, l’hyperglycémie, les rayons UV, les forces de
cisaillement (Kramer et Sharp, 1997). La masse moléculaire est de 85 KDa, elle est
constituée de deux domaines qui fonctionnent indépendamment:
Un domaine de liaison au calcium (CaLB) dans la séquence N terminale. Ce
domaine est en interaction avec les phospholipides membranaires par
l’intermédiaire de résidus hydrophobes, mais il n’est pas nécessaire pour l’activité
catalytique (Nalefski et al., 1994)
Un domaine catalytique à l’extrémité C terminale calcium-indépendant qui
contient le site actif de l’enzyme, une sérine nucléophile (Ser 228) (Huang et al.,
1996)
L’augmentation de la concentration en calcium intracellulaire, de l’ordre du µM,
induit l’activation et la translocation de la cPLA2 vers la membrane plasmique où elle se lie
via son domaine CaLB aux phospholipides. Après la formation du complexe enzyme-
substrat, la Ser 228 attaque la liaison ester sn-2 pour former un acyl (arachidonoyl)-enzyme
qui est alors hydrolysé par une molécule d’eau, ce qui génère l’AA libre. Ce cycle
catalytique est répété successivement jusqu’à ce que les concentrations d’acide gras libres
55
et de lysophospholipides augmentent, entraînant alors une diminution de l’affinité de
l’enzyme pour son substrat. La cPLA2 hydrolyse préférentiellement PC et PE, tandis que
PI ne semble pas être un bon substrat (Diez et Mong, 1990).
Bien que la cPLA2 montre une certaine spécificité pour des phospholipides qui possèdent
l’AA en position sn-2, elle fonctionne également quand cette position est occupée par
d’autres acides gras polyinsaturés comme l’acide α−linolénique (18:3 ω−3) ou l’acide
eicosapentaénoïque (EPA, 20:5 ω−3) (Diez et al, 1994).
La phosphorylation de la cPLA2 joue un rôle important dans la régulation de son
activité. Elle possède de nombreux sites de phosphorylation: 12 sites sérine/thréonine et 4
sites tyrosine. La Ser 505 est présente dans la séquence Pro-Leu-Ser-Pro reconnue par les
MAP-Kinases (Cobb et Goldsmith, 1995). La Ser 727 est entourée de résidus arginine
(Arg-Arg-(X)4-Arg-X-Ser-(X)8-Arg-Arg), sites préférés des PKC et PKA. Plusieurs voies
de phosphorylation de la cPLA2 ont été décrites :
Une voie dépendante des p42/p44 MAP-kinases
Plusieurs études ont montré que la cPLA2 est un substrat des p42/p44 MAP-
kinases, appelées aussi Extracellular-Regulated kinase ou ERK-1 et -2. La phosphorylation
de la Ser 505 in vitro augmente son activité et induit un retard caractéristique de la mobilité
électrophorétique ou gel shift (Nemenoff et al., 1993; Lin et al., 1993). Certaines études
ont montré que les cellules CHO transfectées avec une cPLA2 mutée qui ne possède pas ce
site de phosphorylation (Ser505-Ala cPLA2) libèrent moins d’AA, en réponse à divers
agonistes, que des cellules contrôles exprimant la cPLA2 non mutée (Lin et al., 1993).
L’activation de la cPLA2 peut être protéine kinase C (PKC)-indépendante ou PKC-
dépendante selon le type cellulaire (Kramer et Sharp, 1997). Ainsi, dans les cellules
musculaires lisses de lapin les lipoprotéines de haute densité (HDL) augmentent la
synthèse de prostacycline par un mécanisme faisant intervenir une MAP-kinase kinase ou
MEK mais indépendamment d’une activation de PKC (Vinals et al., 1999). De même, dans
les cellules endothéliales de lapin, l’acétylcholine induit la synthèse de prostacycline par
activation de la p42 MAP-kinase et de la cPLA2 via un mécanisme indépendant de la PKC
(Kan et al., 1996). Par contre, la lyso-PC augmente la sécrétion d’AA dans les HUVEC via
une activation de cPLA2 par un mécanisme impliquant une activation de PKC et de p42
MAP kinase (Wong et al., 1998). Dans les macrophages murins, le zymosan et le PMA
activent fortement les ERK-1/2 via la PKC (Gijon et Leslie, 1999). La PKC joue un rôle
56
dans l’activation de la cPLA2 en initiant une cascade de phosphorylations menant à une
activation de la MAP-kinase (Qiu et Leslie, 1994).
Des voies indépendantes des p42/p44 MAP-kinases
Il a été démontré dans des neutrophiles activés par le LPS ou par le TNFα et dans
des plaquettes stimulées par la thrombine que la phosphorylation de la cPLA2 est
indépendante de l’activation des ERK-1/2 (Fouda et al., 1995; Waterman et Sha'afi, 1995).
Récemment, il a été décrit que les kinases de stress JNK/SAPK (c-jun-N-terminal kinase
ou stress activated protein kinase) et la p38-MAPK, membres de la famille ERK,
pourraient intervenir dans la régulation de la phosphorylation de la cPLA2 (Gijon et Leslie,
1999). La kinase p38 serait responsable de la phosphorylation de la Ser 505 de la cPLA2
plaquettaire. Dans les macrophages, le zymosan active non seulement les ERK-1/2 mais
aussi la JNK et la p38- MAPK qui peuvent phosphoryler la cPLA2 in vitro et induire un gel
shift suggérant une phosphorylation sur la Ser505 (Gijon et al., 1999). Des voies de
signalisation Ras-JNK (Jo et al., 1997; Li et al., 1996) et Ras-p38 MAPK (Berk et al.,
1995; Li et al., 1996) ont été décrites.
Dans les cellules sf9 non stimulées, la cPLA2 est phosphorylée préférentiellement
sur les Ser 454 et 505 et plus faiblement sur les Ser 437 et Ser 727 (Gijon et Leslie, 1999).
Les cellules sf9 surexprimant la cPLA2 libèrent de l’AA en réponse à l’ionophore calcique
A23187 et à l’acide okadaïque (de Carvalho et al., 1996). L’acide okadaïque augmenterait
préférentiellement la phosphorylation de la cPLA2 sur la Ser 727 en bloquant les
phosphatases qui déphosphorylent normalement l’enzyme et/ou en induisant la
phosphorylation sur cette sérine via des kinases dont la nature reste à définir. Une
phosphorylation de la cPLA2 sur la Ser727 a aussi été observée dans les macrophages
murins et les monocytes humains en réponse à l’acide okadaïque (Qiu et al., 1998; de
Carvalho et al., 1996) et dans les plaquettes stimulées à la thrombine (Borsch-Haubold et
al., 1995). La phosphorylation de la Ser727 n’a pas de rôle fonctionnel dans l’activation de
la cPLA2. En effet, le remplacement de la sérine 727 par une alanine (Ser727A) n’affecte
pas l’activité cPLA2 des cellules Sf9 stimulées par l’ionophore A23187 ou l’acide
okadaïque. De plus, la délétion des acides aminés 721 à 749 au niveau de la région C-
terminale n’a pas de conséquence sur la libération d’AA alors que la substitution de la Ser
505 par l’alanine diminue de 50% la libération d’AA induite par l’A23187 ou par l’acide
okadaïque. Ces résultats montrent que dans les cellules sf9, la phosphorylation de la cPLA2
sur la Ser 505 augmente sa capacité à libérer l’AA mais aucun des sites de phosphorylation
identifiés n’est essentiel à l’activité de la cPLA2 dans ce modèle.
57
3.2.2 LES PHOSPHOLIPASE C –PLC-
Les PLC comprennent un grand nombre d’isoformes pouvant être soit
membranaires, soit solubles. Ces dernières sont probablement transloquées vers la
membrane plasmique lors de leur activation. Parmi les PLC, certaines hydrolysent
préférentiellement les PI (PI, PIP, PIP2) et conduisent à la formation d’Inositol phosphates
(IP, IP2, IP3 ) et DAG; d’autres hydrolysent sélectivement les PC en phosphocholine et
DAG.
3.2.2.1 Les PLC spécifiques des PI
Les PI-PLC
Les PLC spécifiques des PI renferment plusieurs isoformes regroupées en 4
familles principales dénommées α, β, γ et δ selon leurs poids moléculaires et leurs
analogies de séquences. Cette diversité de structure est associée à une pluralité des modes
de régulation. Les PLC sont activées par des agents spécifiques selon deux voies
principales. L’une fait intervenir des récepteurs couplés aux protéines G, l’autre implique
des récepteurs possédant une activité tyrosine kinase intrinsèque. Ces activités
phospholipasiques assurent la synthèse (rapide et transitoire) de DAG et d’IP3 (inositol 1,
4, 5 triphosphate) à partir du PIP2. Le DAG et l'IP3 sont des seconds messagers impliqués
directement ou indirectement dans la libération de l’AA par la cPLA2. L’IP3 est à l’origine
de la libération du Ca2+ depuis les compartiments intracellulaires (réticulum
endoplasmique). Cette augmentation du taux de Ca2+ dans le cytosol induit la translocation
de la PKC vers la membrane plasmique qui acquiert une forme active par liaison avec le
DAG formé. La PKC ainsi activée et la hausse de calcium intracellulaire activent à leur
tour la cPLA2. D’autre part, la PKC régule négativement les PLC spécifiques des PI tandis
qu’elle active dans certains cas la PLC spécifique de PC (Exton, 1994).
3.2.2.2 Les PLC spécifiques des PC
Les PC-PLC
Peu d’études ont porté sur la purification des PLC spécifiques des PC dont les
caractéristiques sont encore peu connues. Les formes purifiées hydrolysant spécifiquement
les PC, fonctionnent à pH neutre, et sont activées par des protéines G de façon Ca2+-
dépendante. Selon les types cellulaires, la PLC peut être activée par la PKC ou peut être
PKC indépendante (Billah et Anthes, 1990). La PKC étant elle-même activée lors du
métabolisme des PI, l’hydrolyse des PI et celle de PC seraient donc séquentielles.
58
L’hydrolyse des PC, au contraire de celle des PI, conduit à une synthèse de DAG plus lente
mais prolongée et permet ainsi une activation soutenue de la PKC, qui active alors la
cPLA2 entraînant la libération de l’AA (Exton, 1994). Certaines études montrent un rôle de
cette enzyme dans l’apoptose (Hannun et Obeid, 1995). La PC-PLC participerait à la
production de céramides, molécules impliquées dans l’apoptose, en activant des
sphingomyélinases, en réponse au TNF (Schütze et al., 1992) ou via le récepteur Fas/APO-
1 (Cifone et al., 1995). Malgré ces observations, l’existence de cette enzyme est remise en
cause. Récemment, il a été suggéré qu’une sphingomyéline synthase (SMS) serait
probablement responsable des multiples fonctions attribuées dans les études antérieures à
une PC-PLC car le D609, composé utilisé comme inhibiteur spécifique de la PC-PLC dans
plusieurs travaux, inhibe l’activité de la SMS (Luberto et Hannun, 1998).
3.2.3 LES PHOSPHOLIPASES D-
Les PLD
La PLD libère la tête polaire du phospholipide et du PA. Cette phospholipase est
une source indirecte de DAG suite à l'hydrolyse du PA par une phosphatidate
phosphohydrolase. L’activité PLD existe à la fois au niveau membranaire et au niveau
cytosolique. Les formes associées aux membranes hydrolyseraient uniquement les PC,
tandis que les formes cytosoliques hydrolyseraient à la fois PC, PE et PI (Billah, 1993). La
PLD est activée par des récepteurs couplés aux protéines G, elle est réguléee positivement
par la PKC et sa dépendance vis à vis du calcium varie d’un type cellulaire à l’autre (Billah
et Anthes, 1990) Les facteurs de croissance dont les récepteurs possèdent une activité
protéine tyrosine kinase intrinsèque activent la PLD. Ces récepteurs ne phosphorylent pas
directement l’enzyme. Il est possible que la PKC et/ou la famille des petites protéines G
Rho soit impliquées. D’autre part, des agonistes dont les récepteurs activent des protéines
tyrosine kinases (PTK) solubles appartenant aux famille Src ou Pyc peuvent conduire à
l’activation de l’enzyme (Exton, 1999).
Par ailleurs, la PLD est capable d'assurer le transfert du groupement phosphatidyl
sur un alcool primaire (éthanol ou butanol), donnant naissance à un phosphatidylalcool.
Cette propriété particulière de transphosphatidylation a été mise à profit pour détecter
l’activité PLD dans divers types cellulaires.
59
3.3 OXYGENATION DE L’ACIDE ARACHIDONIQUE: SYNTHÈSE DE
PROSTACYCLINE
Une fois libéré des phospholipides membranaires, l’AA est accessible aux enzymes
qui le convertissent en eicosanoïdes, les prostaglandine endoperoxyde H synthases
(PGHS). La PGHS est un polypeptide d’environ 70 KDa contenant deux groupes hème par
molécule. L'enzyme a une activité bifonctionnelle, elle catalyse:
⎬ l’insertion des atomes d’oxygène dans la partie pliée de l’acide gras
formant un endoperoxyde cyclique, la prostaglandine G (PGG)
⎬ la réduction de la fonction peroxyde de la PGG en hydroxyle donnant la
prostaglandine H (PGH)
Ces deux activités catalytiques ont lieu à deux sites actifs distincts de la protéine. Ceci fut
suggéré par le fait que les anti-inflammatoires non stéroïdiens tels que l’aspirine, de même
que le 22:6 ω−3 (DHA) sont des inhibiteurs compétitifs de la cyclooxygénase sans affecter
l’activité hydroperoxydase (Marshall et Kulmacz, 1988; Picot et al.,1994).
La PGH est l’intermédiaire clé pour la conversion en une vaste gamme
d’eicosanoïdes. La figure 7 illustre une variété des produits qui peuvent être synthétisés
quand l'AA est le substrat de la PGHS. La balance entre les activités des enzymes qui
catalysent ces réactions détermine la répartition des eicosanoïdes synthétisés dans un tissu
donné. L’alimentation est un facteur exogène qui peut affecter cette répartition.
La PGG et la PGH sont des précurseurs instables de tous les membres de la famille des
prostanoïdes. Ainsi dans les plaquettes et certains autres tissus contenant l’enzyme
thromboxane synthase, les endoperoxydes intermédiaires sont convertis en thromboxane
A2 (TXA2) composé instable, aussitôt converti en TXB2, un composé inerte. Dans d’autres
tissus, la prostacycline synthase forme la PGI2 à partir des endoperoxydes instables. La
PGI2, est elle aussi instable, cependant moins que le TXA2. Elle est aussi dégradée en une
forme inerte, la 6-oxo-PGF1 α. D’autres tissus peuvent contenir des enzymes qui
isomérisent les endoperoxydes en PGE, PGF et PGD. Cependant, cette réaction peut aussi
se produire par des réarrangements non enzymatiques.
60
3.3.1 LES PROSTAGLANDINE ENDOPEROXYDE H SYNTHASES: DEUX ISOFORMES
La PGHS, enzyme intracellulaire, aussi nommée cyclooxygénase (COX) existe
sous deux isoformes. L’une appelée PGHS-1 ou COX-1, constitutive et ubiquiste, a été
initialement isolée et clonée dans des sources murine, ovine et humaine. (DeWitt et Smith,
1988; Hemler et Lands, 1976; Yokoyama et Tanabe, 1989). L’isoforme inductible,
désignée PGHS-2 ou COX-2, a été initialement identifiée dans les cellules Swiss 3T3
(fibroblastes de souris) comme le produit d’un gène précoce induit par les esters de phorbol
( Kujubu et al., 1991). Ces deux enzymes ont une masse moléculaire similaire, environ 70
KDa et présentent 60 % d’homologie pour les acides aminés (aa) incluant les aa essentiels
de l’activité catalytique. Les PGHS-1 et 2 sont codées par deux gènes distincts, situés
respectivement sur le chromosome 9 et le chromosome 1. Ils sont transcrits en ARNm de
tailles différentes: 2.8 kb (PGHS-1) et 4.1 kb, (PGHS-2). Sur gel SDS-PAGE, la PGHS-1
présente une masse moléculaire de 70 kDa (Raz et al., 1988).
Figure 7. Prostanoïdes synthétisés à partir de l'acide arachidonique (d'après Jhonson et al.,
1983. Dans: Unsaturated Fatty Acids, Nutritional and Physiological significances. The report of the
British Nutrition Foundation's Task Force. Chapman & Hall for the British Nutrition Foundation,
1992. Chap.8, Fig. 8.4, p 58. ISBN 0 412 45750 4). Modifiée par Dominguez Z, 2001.
61
La différence entre la valeur de la masse moléculaire calculée (65 kDa) et celle déterminée
expérimentalement serait due, en partie, à la présence d’oligosaccharides liés à des résidus
asparagine. La PGHS-2 apparaît sous forme d’un doublet de masse moléculaire d’environ
72 kDa (Habib et al., 1993, Lecomte et al., 1994). Ce doublet pourrait être dû à un
phénomène de N-glycosylation post-traductionnelle s’opérant de manière hétérogène, la
PGHS-2 possédant un site de glycosylation supplémentaire par rapport à la PGHS-1
(Smith, 1992). La PGHS-1 présente une spécificité de substrat assez étroite et requiert la
présence de trois doubles liaisons, toutes en configuration cis, dans les position 8, 11, 14
des acides gras à 20 carbones :
⎬ acide cis, 8,11,14 eicosatriénoïque, dihomo-γ-linolénique, 20:3 ω−6
⎬ acide cis, 5,8,11,14 eicosatétraénoïque, arachidonique, 20:4 ω−6
⎬ acide cis, 5,8,11,14,17 eicosapentaénoïque, EPA, 20:5 ω−3
L’AA est le substrat préférentiel de cette enzyme, dont le Km pour cet acide gras se situe
vers 5µM (Marshall et Kulmacz, 1988). Hormis le 20:5 ω−3, les AGPI des séries ω−9 et
ω−3, ne sont pas substrats de l’enzyme mais peuvent être des inhibiteurs efficaces de la
PGHS. C’est notamment le cas du 22:6 ω−3 (DHA) (IC50 de 11µM) (Meade et al., 1993)
A la différence de la PGHS-1, la PGHS-2 ne montre pas une grande spécificité de substrat.
En plus des acides gras déjà mentionnés pour la PGHS-1, les acides linoléique (18:2 ω−6),
α-linolénique (18:3 ω−3) ou γ-linolénique (18:3 ω−6) sont efficacement oxygénés
(Laneuville et al.,1995).
3.3.1.1 Localisation et structure
La PGHS-1 est une enzyme ubiquiste. L’AA, substrat utilisé préférentiellement par
les cellules endothéliales, peut être d'origine endogène (libéré par des phospholipases) ou
exogène. Les PGHS sont localisées dans le réticulum endoplasmique et sur les membranes
internes et externes de l’enveloppe nucléaire. (Smith et Marnett, 1991). La PGHS est
localisée sur la face luminale du réticulum qui serait donc le lieu de synthèse de la PGH
(Otto et Smith, 1994). Les études réalisées par diffraction des rayons X (Picot et al.,1994;
Garavito et al., 1995) ont permis de confirmer les résultats des études biochimiques
réalisées auparavant, en particulier, le fait que la protéine se trouve sous forme d’un
homodimère « tête-bêche », et que les deux isoformes la constitutive, PGHS-1 et
l'inductible PGHS-2 comportent trois régions communes:
62
Une région N-terminale contenant un motif « EGF-like » localisé à l’interface entre les
deux monomères.
Une région permettant la fixation de la protéine à la membrane, domaine d’ancrage ou
« membrane binding domaine, MBD». Elle comporte quatre hélices α dont les
chaînes latérales des résidus aa hydrophobes interagissent avec une seul feuillet des
bicouches lipidiques membranaires, permettant l’ancrage de la protéine.
Une région contenant les deux sites actifs de la cyclooxygénase et de
l’hydroperoxydase, le site de fixation du groupe hème (His207 et His388) et l’Arg277
qui constitue un site de clivage par la trypsine (Marnett et al., 1988).
Il existe cependant des différences entre les structures des deux PGHS, en particulier au
site actif de l’activité cyclooxygénase. Les études par diffraction des rayons X (Luong et
al., 1996; Kurumbail et al., 1996) ont montré que le site actif de la PGHS-2 est plus
volumineux que celui de la PGHS-1. Il possède une cavité latérale accessible en raison
d’une différence en aa sur la position homologue 523 de la PGHS-1: la chaîne latérale de la
Val509 de la PGHS-2 étant plus petite que celle de l’Ile de la PGHS-1. Il semble
également que l’entrée du site actif de la PGHS-2 soit plus flexible (Luong et al., 1996).
Ces résultats pourraient expliquer la spécificité plus large de la PGHS-2 vis à vis des
substrats. Par ailleurs, Lecomte et al. (1994) ont montré que l’acétylation de la PGHS-2 par
l’aspirine mène à la formation d’une enzyme capable de catalyser l’oxygénation de l’AA
en 15R-HETE, et non à une inhibition totale de l’activité enzymatique comme c’est le cas
pour la PGHS-1. Enfin, des études de mutagenèse dirigée montrent l’importance de la
substitution Ile523 par une Val et l’implication pharmacologique vis à vis de la spécificité
des inhibiteurs de PGHS-2 (Gierse et al., 1996; Guo et al 1996; Wong et al., 1997). Il
existe également une autre différence structurale entre les deux PGHS. Malgré l’homologie
de séquence du site de clivage des deux isoformes, l’Arg277 de la PGHS-2 n’est pas
sensible à l’action de la trypsine (Otto et Smith, 1994; Guo et al., 1997). Ceci suggère donc
que la conformation de cette région est différente dans les deux isoformes.
63
3.3.1.2 Rôle des deux isoformes
Les PGHS interviennent dans des processus physiologiques et cellulaires différents.
La PGHS-1 conduit à la production rapide de prostanoïdes en réponse à des variations des
conditions physiologiques ou physiopathologiques. Ainsi, pour des fonctions telles que la
réabsorption d’eau par le rein ou l’hémostase qui exigent une réponse adaptative rapide,
l’enzyme constitutive a un rôle essentiel. De même, au cours des réactions
d’hypersensibilité par exemple, la PGHS-1 est responsable de la production rapide des
médiateurs de l’inflammation. Au contraire, la PGHS-2 n’intervient pas dans la production
précoce de prostanoïdes. La synthèse de novo de l’enzyme, induite par différents stimuli,
(facteurs de croissance, cytokines, endotoxines bactériennes) nécessite un temps de
latence. La PGHS-2 est considérée comme l’isoforme responsable de la synthèse des
prostaglandines qui entretiennent la réaction inflammatoire. Par ailleurs, elle est impliquée
dans l’ovulation (Wong et al., 1989) et dans le contrôle du cycle cellulaire (Tsujii et
DuBois, 1995).
Des expériences réalisées sur des macrophages (Reddy et Herschman, 1994) ou des
fibroblastes (Shitashige et al., 1998) murins montrent que les deux isoformes utilisent l’AA
provenant de compartiments différents. L’AA endogène serait préférentiellement
métabolisé par la PGHS-2, alors que PGHS-1 métaboliserait de préférence l’AA exogène.
En outre, il a été montré, que la production de PGD2 dans des mastocytes activés comporte
deux phases: la première rapide, est dépendante de la PGHS-1, alors que la seconde,
tardive, est due à la PGHS-2 (Murakami et al., 1995b; 1997b; Ashraf et al.,1996; Bingham
et al., 1996). L’ensemble de ces résultats confirme l’existence de deux systèmes de
production de prostaglandines, indépendants l’un de l’autre. Sur cette base, la PGHS-1
serait responsable de la synthèse des prostanoïdes pour la signalisation extracellulaire,
alors que la PGHS-2 serait responsable de la synthèse des prostanoïdes pour la
signalisation nucléaire (Otto et Smith, 1995). Etant donné que les deux isoformes ont la
même localisation sub-cellulaire (Spencer et al., 1998), il semble que les différences dans
le devenir des prostanoïdes synthétisés par les deux isoformes de PGHS soient dues à des
différences de cinétique enzymatique (concentration en hydroperoxydes requise pour
l’activité, régulations allostérique négative de la PGHS-1 à des concentrations faibles de
substrat (Spencer et al, 1998; Shitashige et al., 1998).
64
3.3.2 LA PROSTACYCLINE SYNTHASE
La prostacycline synthase (PGIS), est un nouveau membre de la superfamille des
cytochromes P450, donc une hémoprotéine, qui métabolise spécifiquement la PGH2 en
PGI2 (Figure 7, p 60). Au contraire de la PGHS qui est distribuée dans des tissus variés, la
PGIS est localisée de façon plus restreinte. Notamment, elle est prépondérante dans
l’endothélium, ce qui fait de ce tissu la source principale de prostacycline. La PGIS est
localisée sur les membranes nucléaires et du réticulum endoplasmique (Smith et al., 1983;
Hara et al., 1994). Le cDNA de la PGIS humaine a été cloné et séquencé à partir d'un
poly(A)+ARN extrait de cellules endothéliales d'aorte (Miyata et al., 1994). Le gène de la
PGIS est localisé sur le chromosome 20 chez l’Homme; il est d’environ 60 kb et contient
10 exons. Le site d’initiation de la transcription a été déterminé et une séquence d’environ
3kb dans la région 5’ a été obtenue. La région séquencée présente les caractéristiques de
gènes exprimés de façon constitutive. Elle ne comporte pas de boîte TATA, et possède une
région riche en GC. Elle possède des sites potentiels de liaison à des facteurs de
transcriptions tels que SP1, AP2, NF-Κb ainsi qu’un élément de réponse aux forces de
cisaillement. L’induction de production de la prostacycline par les forces de cisaillement a
été mise en évidence dans des cellules endothéliales en culture. (Frangos et al., 1985;
Bhagyalakshmmi et Frangos, 1989)
Une hypothèse a été émise récemment (Iwai et al., 1999) concernant le rôle du
polymorphisme du gène de la PGIS dans l’hypertension essentielle. Dans une population
japonaise une corrélation positive a été trouvée entre un polymorphisme répété dans la
région du promoteur du gène de la PGIS et la présence d’hypertension. Les auteurs ont
déduit de cette étude que le polymorphisme est un facteur de risque pour l’hypertension
systolique dans la population japonaise.
3.3.3 EFFETS DE L’ASPIRINE SUR LA SYNTHÈSE DES EICOSANOÏDES
Les études sur le mécanisme d’action de l’aspirine ont beaucoup aidé à la
compréhension du rôle des eicosanoïdes. Vane (1971) a été le premier à démontrer que ce
dérivé de l’acide salicylique inhibe fortement la synthèse de prostaglandines. Puis, il a été
démontré que cet effet inhibiteur était dû à l’acétylation irréversible de la sérine du site
actif de la PGHS. Cependant, l’isoforme inductible de la PGHS, la PGHS-2 acétylée par
l’aspirine synthétise du 15-R-HETE. (Lecomte et al.,1994). Celui-ci est aussi synthétisé à
partir de l’AA par la voie du cytochrome P450. Donc, le traitement des cellules avec de
65
l’aspirine peut dériver le métabolisme de l’AA vers la production de produits comme le 15-
HETE sous l’influence d’un stimulus inflammatoire ou mitogènique.
Le processus de diapédése est aussi modulé par les produits du métabolisme de
l’AA. Plusieurs métabolites de l’AA comme le LTB4, et l’acide 12(R)-
hydroxyeicosatriénoïque (12(R)-HETrE) sont chimiotactiques. Des études in vitro
montrent que LXA4 peut inhiber le chimiotactisme du PMN stimulé par LTB4 ou par le
fMLP (Lee et al., 1989).
3.4 PERSPECTIVES
La communauté scientifique continue de s’intéresser aux eicosanoïdes depuis les
premières observations de vonEuler et al., il y a presque 70 ans. Les techniques de biologie
moléculaire ont permis de mettre en évidence les mécanismes de régulation de la
biosynthèse d’eicosanoïdes, du "cross-talk" entre les voies de la NOS et des PGHS, et
d'elucider les mécanismes impliqués dans la pathogenèse de certaines maladies qui
conduisent à un dysfonctionnement de la synthèse et du métabolisme endothélial des
eicosanoïdes. L’élucidation du rôle des facteurs de transcription impliqués dans la
régulation de la synthèse d’eicosanoïdes et de NO en réponse aux forces de cisaillement, à
la pression, aux lésions tissulaires et aux cytokines inflammatoires représente un large
champ d'investigations pour de nouvelles recherches. La caractérisation des phénotypes de
souries déficientes en PGHS-1 et PGHS-2 a commencé. Les souris knock-out pour le gène
de la PGHS-1 ont peu d’anomalies phénotypiques. Les homozygotes sont stériles,
cependant l’homozygote croisé avec un hétérozygote produit des souris viables. Cette
observation n’est pas surprenante compte tenu du rôle bien connu des prostaglandines dans
l’ovulation, la spermatogenèse et la parturition. De plus, chez les souris KO pour la PGHS-
1, l’AA exogène ne provoque pas l’agrégation plaquettaire (Langenbach et al., 1996). En
revanche, les souris KO pour la PGHS-2 ne sont pas saines. Elles souffrent de
néphropathie progressive, évidente à six semaines, et meurent entre 8-16 semaines. Le
défaut semble être dû à l’arrêt prématuré de la différenciation et de la maturation du rein.
Ceci sous-entend qu’un petit pourcentage de néphrons sont fonctionnels (Morham et al.,
1996).
La disponibilité de modèles génétiquement modifiés représente une nouvelle étape
dans la biologie des eicosanoïdes. La biologie moléculaire et la physiologie permettront de
déterminer les mécanismes moléculaires des régulations impliquant les eicosanoïdes et de
valider les hypothèses émises à partir des modèles in vivo.
66
4. LES LYMPHOCYTES DU SANG PÉRIPHÉRIQUE
Les lymphocytes du sang périphérique (PBL) représentent 2% du total des
lymphocytes de l’organisme. La majorité des lymphocytes, se trouvent dans le canal
thoracique ainsi que dans les ganglions lymphatiques et, en proportion mineure, dans les
organes lymphoïdes secondaires. Les lymphocytes T représentent 70-80% des lymphocytes
totaux, les lymphocytes B matures entre 10-15 %, les lymphocytes larges granulaires
(LGL) environ 5-10 %. La figure 8 représente le trafic des lymphocytes entre les organes
lymphoïdes et les tissus.
Figure 8. Recirculation des lymphocytes. Les lymphocytes matures entrent dans le circuit
sanguin, les ganglions lymphatiques et les organes associés aux tissus lymphoïde via des cellules
endothéliales spécialisées localisées dans les veinules postcapillaires (HEV). Ils traversent les
vaisseaux lymphatiques efférents et continuent vers d'autres ganglions, pour arriver au canal
thoracique et entrent dans la circulation sanguine par la veine subclaviaire gauche. Les
lymphocytes entrant dans les différentes zones de la rate, sortent par la veine splénique. (Dans:
Roitt, Brostoff et Male, Immunology 4th ed., 1996. Chap. 3, Fig. 3.26, p 3.9. ISBN 0 72342178 1).
Modifiée par Dominguez Z, 2001).
67
4.1 LE SYSTÈME DE DÉFENSE
Le système de défense immunitaire a évolué pour protéger l’organisme contre les
infections. On distingue:
l'immunité innée, non-spécifique, ou non-adaptative.
l'immunité spécifique, ou adaptative.
4.1.1 IMMUNITE INNEÉ
L’immunité innée, aussi appelée non-immune ou non-adaptative, est un système de
réponse immédiate qui n’est pas spécifique de l’antigène qui est à l’origine de l’activation
du système. La réponse s’installe peu de minutes après l’invasion de l’agent agresseur sans
avoir besoin de la mémoire antigènique. Ce processus est appelé inflammation. Les
neutrophiles, les éosinophiles, les basophiles, les cellules «natural killer» (NK), les
monocytes, et les macrophages sont les médiateurs cellulaires de ce système de réponse.
Ces cellules jouent aussi un rôle dans le développement de la réponse immune-spécifique
4.1.2 IMMUNITE SPÉCIFIQUE
L’immunité spécifique ou adaptative, est caractérisée par une réponse antigène-
spécifique contre un antigène étranger ou pathogène. En général, la réponse immune exige
plusieurs jours, même plus, pour se mettre en place. Le signe distinctif de cette immunité
est la mémoire pour l’antigène qui est à l’origine de l’activation du système. Ceci permet
l’élaboration d’une réponse beaucoup plus rapide, et souvent plus forte, au moment d’une
deuxième exposition à l’agent infectieux.
Les lymphocytes T matures, les lymphocytes B, les monocytes et les cellules
présentatrices d’antigènes, comme les cellules dentritiques (Langerhans) ou les
macrophages entre autres, sont les responsables de l’installation de la réponse. Ces cellules
rentrent dans la circulation et se domicilient dans les organes lymphoïdes périphériques
(ganglions lymphatiques, rate), les organes associés au tissu lymphoïde (amygdales,
plaques de Peyer, appendice ) vers la peau et les muqueuses où elles attendent l’activation
induite par un antigène étranger ou pathogène.
68
4.1.3 LA TOLÉRANCE IMMUNE
La tolérance immune est une caractéristique fondamentale du système immunitaire
qui prévient la réactivité lymphocytaire contre les tissus du soi. Un processus
d’apprentissage, de reconnaissance des antigènes propres, assure ainsi une population
circulante et résidente de lymphocytes T et B non réactive aux auto-antigènes. La sélection
clonale faite sur les lymphocytes T dans le thymus, et sur les cellules B, dans la moelle
osseuse élimine les lymphocytes hyper-réactifs. Une deuxième sélection est faite à la
périphérie. Dans la circulation ou dans les tissus, les lymphocytes qui ont échappé à la
première sélection sont éliminés ou deviennent anergiques. Cette incapacité de répondre
aux auto-antigènes détermine la tolérance immune.
4.1.4 AUTO-IMMUNITÉ
La tolérance immune peut s'altérer et ainsi conduire à l’auto-immunité et à la
destruction du tissu corporel par le système immunitaire. L’auto-immunité peut apparaître
par exemple, après une forte co-stimulation de lymphocytes T par une cellule présentatrice
d’antigène. L’antigène dérivé du micro-organisme envahisseur peut croiser avec des auto-
antigènes et conduire à la perte de la tolérance immune. Une puissante stimulation des
lymphocytes T qui étaient auparavant anergiques aux auto-antigènes, les rend réactifs,
menant à une condition pathologique auto-immune dont le diabète type I fait partie.
4.2 RÔLE FONCTIONNEL DES SOUS-TYPES DE LYMPHOCYTES
Les lymphocytes sont les cellules entièrement responsables de la reconnaissance
immune-spécifique des pathogènes. Ce sont eux qui vont initier la réponse immune
adaptative. Les lymphocytes sont dérivés des cellules souches de la moelle osseuse; les
lymphocytes T se développent dans le thymus, tandis que les lymphocytes B restent dans
la moelle osseuse pour leur développement. Le système immunitaire est bifonctionnel:
l'immunité humorale est assurée par les lymphocytes B
l’immunité cellulaire est assurée par les lymphocytes T
D’autres cellules effectrices et régulatrices du système immunitaire sont les
lymphocytes larges granulaires, les monocytes-macrophages et les cellules
dentritiques/Langerhans.
69
4.2.1 LES LYMPHOCYTES T
Les cellules CD34+ pro-T- sont les cellules souches de la moelle osseuse qui
caractérisent la lignée T, ces cellules migrent vers le thymus où elles vont subir le
processus de maturation vers l'une ou l'autre des deux lignées de lymphocytes T. Le
récepteur à l'antigène des cellules T (TCR) est constitué soit des chaînes γ δ soit des
chaînes α β.
Seulement 1−10% des lymphocytes T expriment le récepteur γ δ TCR. Dans le
thymus, les lymphocytes γ δ TCR n’expriment ni la molécule CD4 ni CD8 mais au niveau
périphérique ils peuvent exprimer la molécule CD8. Les lymphocytes TCR γ δ ont une
fonction de surveillance des surfaces épithéliales et de défense contre des micro-
organismes et autres bactéries intracellulaires.
Les lymphocytes αβ TCR représentent de 90 à 99 % des lymphocytes intra-
thymiques totaux. Initialement les lymphocytes à récepteur αβ TCR immatures expriment
sur leur surface les deux molécules CD4 et CD8. Au fur et à mesure de leur maturation
thymique, et sous l’influence du processus de sélection auto-antigènique, ils vont réguler
négativement la molécule CD8 pour devenir lymphocyte T CD4+ (helper) ou il cessent
d’exprimer la molécule CD4 pour devenir CD8+ (cytotoxique).
Les lymphocytes αβ T CD4+ qui rentrent dans la circulation ont été sélectionnés pour
reconnaître des fragments de peptides associés aux molécules CMH de classe II des
cellules présentatrices d’antigènes. Les cellules matures αβ T CD4+ induisent la
différenciation des lymphocytes B, la prolifération des cellules CD8+ cytotoxiques,
synthétisent un nombre important de cytokines et régulent certaines étapes de
l’érythropoïèse. Les lymphocytes α β T CD8+ ont été sélectionnés pour reconnaître des
fragments antigèniques en association aux molécules de classe I du CMH.
Une fois le contact établi entre le lymphocyte T CD4+ ou CD8+ et le fragment antigénique
via les molécules CMH classe I ou classe II, la liaison est stabilisée par l’intermédiaire de
molécules d’adhésion non-antigène-spécifiques appartenant à la superfamille des
immunoglobulines et des intégrines. La stabilisation de la liaison mène à l’activation
cellulaire et à la transmission des signaux qui vont réguler la fonction lymphocytaire.
L’activation des tyrosine kinases de la famille Src, fyn et lck, la phosphorylation de la
chaîne CD3 ζ, l’activation des tyrosine kinases ZAP-70 et syk, l’activation de la voie de
Ras et des MAP kinases sont des processus déclenchés à la membrane plasmique, qui enfin
aboutissent à l’activation de facteurs de transcription NF-AT, fos et jun, et rel/NF-κB.
70
L’expression de l’IL-2 et de son récepteur, de l’IL-4, du TNF ou d’autres médiateurs
synthétisés par le lymphocyte T est ainsi induite. L’activation du lymphocyte T nécessite
également une co-stimulation comme celle de CD2 activé par le CD58 ou celle de CD28
activé par CD80. La signalisation via CD28 semble importante car le blocage de CD28
entraîne l’anergie ou l’inactivation du lymphocyte T (Joss et al., 2000)
4.2.2 LES LYMPHOCYTES B
Les lymphocytes B expriment sur leur surface des récepteurs d’antigènes: les
molécules d’immunoglobulines (Ig). À la différence des lymphocytes T, dont la
reconnaissance antigènique est restreinte aux fragments d’antigènes associés aux
molécules de classe I ou II du CMH, les lymphocytes B grâce à leur Ig de surface sont
capables de reconnaître des antigènes complets. Par ailleurs, les lymphocytes B expriment
aussi des récepteurs pour la fraction Fc des IgG (CD32) ainsi que des récepteurs pour les
composants actifs du système du complément (C3d ou CD21, C3b ou CD35). La fonction
principale des lymphocytes B est la production des anticorps. Les lymphocytes B
fonctionnent aussi comme des cellules présentatrices d’antigènes (APC) efficaces. La
fonction d’APC peut être augmentée par une variété de cytokines.
4.2.3 LYMPHOCYTES LARGES GRANULEUX
Ce sont des cellules non-adhérentes, non-phagocytaires comportant une grande
quantité de granules azurophiles. Certains lymphocytes larges granuleux (LGL) expriment
le récepteur pour la région Fc des IgG ce qui leur permet d’éliminer des cellules opsonisées
par des IgG, (cytotoxicité facilitée par anticorps). Un autre type de LGL, a une activité
cytotoxique du type NK. Celle-ci ne dépend pas de la mémoire immune, et est
fondamentale pour la surveillance immune et la destruction des cellules qui pourraient
devenir malignes de façon spontanée. Certains virus et cancers down-régulent l’expression
de la molécule CMH-I. La cellule infectée ou transformée n’est alors plus capable
d’induire une réponse cytotoxique de type T CD8+ restreinte par le CMH-I restrictif, d’où
l’importance de l’activité NK.
71
Certains LGL expriment des marqueurs de la lignée T, notamment CD8 et
prolifèrent en réponse à l’IL-2. Plusieurs récepteurs ont été identifiés sur les lymphocytes
NK. Ils représentent un groupe hétérogène de protéines, appartenant à deux familles
principales:
la super famille des immunoglobulines
la famille des protéines transmembranaires de type lectine.
4.3 DOMICILIATION DES LYMPHOCYTES
L’expression des molécules d’adhésion sur la surface des lymphocytes et des
cellules endothéliales contrôle la rétention et la sortie subséquente des lymphocytes des
sites de stimulation antigénique et prévient le retour des lymphocytes activés dans le pool
de lymphocytes circulants. Le processus de migration le mieux connu est la domiciliation
lymphocytaire ou «homing». Celle-ci comprend la recirculation des lymphocytes entre le
sang et les organes lymphoïdes secondaires (Figure 8, p 66). Différentes sous-populations
de lymphocytes migrent à travers les différents tissus lymphoïdes, la plupart vers les
ganglions lymphatiques, tandis que certains migrent préférentiellement vers les plaques de
Peyer dans l’intestin grêle, par exemple. Cette caractéristique permet de constituer des
sous-systèmes de lymphocytes organes-spécifiques. Le sous-type de lymphocytes localisé
dans les plaques de Peyer est spécialisé pour monter une réponse contre des antigènes qui
rentrent dans l’organisme par la voie intestinale. La recirculation des lymphocytes est
contrôlée par l’interaction lymphocyte/cellule endothéliale par l’intermédiaire des
récepteurs de domiciliation lymphocytaires et ses contre-récepteurs endothéliaux dans
certaines zones spécialisées des vaisseaux, appelée high endothelial venules (HEV). Ainsi,
la première étape du processus d’interaction est l’attachement et le roulement, ou rolling
des leucocytes sur la surface endothéliale. Le roulement des lymphocytes est facilité par la
molécule sélectine-L (CD62L); les contre-récepteurs exprimés par les HEV sont des
oligosaccharides sulfatés présents dans trois molécules différentes: la molécule dépendant
des glycosylaminoglycanes, glycosylation-dependent cell adhesion molecule 1 (GlyCAM-
1), le CD34, et l’adressine, mucosal cell adhesion molecule 1 (MAdCAM-1), qui
conduisent à l’adhésion des lymphocytes aux HEV. Le roulement des lymphocytes ralentit
le transit cellulaire à travers les veinules, ce qui assure un temps de contact bref mais
suffisant pour permettre l’activation des cellules qui ont adhéré. Ensuite, un deuxième
système d’adhésion dépendant de certains membres de la famille des intégrines comme
72
CD11b/CD18 (MAC-1) ou CD11a/CD18 (LFA-1) se met en place. Ceci permet une
interaction beaucoup plus forte qui conduit à l’arrêt des lymphocytes et leur migration vers
l’organe lymphoïde secondaire.
La première étape d’attachement des lymphocytes aux HEV ne dure que quelques
secondes, alors que la migration à travers l’endothélium (illustré dans la figure 9) requiert
environ 10 min. La molécule CD44 (H-CAM) des HEV ainsi que le glycocalix (matrice
extracellulaire) peuvent jouer un rôle important dans la migration. Finalement, l’expression
de métalloprotéases capables de digérer la membrane basale sous-endothéliale, riche en
collagène, est nécessaire pour la pénétration des cellules lymphoïdes vers les sites
extravasculaires. Les figures 4 (paragraphe 1, p 41). et 9 illustrent l’adhésion et la
migration des leucocytes, respectivement.
Figure 9. Migration à travers l'endothélium. La microphotographie montre la migration d'un
lymphocyte-T activé sur l'endothélium rétinien in vitro. La cellule migratoire s'attache à
l'endothélium et se projette par pseudopode (d'après Greenwood J dans: Roitt, Brostoff et Male
Immunology 4th ed., 1996. Chap. 14. Cell Migration and Inflamation, Fig. 14.1, p 4.1).
Des anomalies des HEV et des molécules d’adhésion, comme celles mentionnées
ci-dessus ont été impliquées dans la physiopathologie d’un certain nombre de maladies
inflammatoires chroniques comme l’arthrite rhumatoïde, la thyroïdite de Hashimoto, la
maladie de Graves, la sclérose multiple, la maladie de Crohn, la colite ulcérative et le
diabète sucré insuline dépendant (IDDM). Dans des modèles animaux de IDDM,
MAdCAM-1 et GlyCAM-1 sont fortement exprimés dans les HEV des îlots pancréatiques
enflammés. Le traitement des animaux avec des inhibiteurs de la sélectine-L et d’α-4
intégrines bloque le développement du diabète (Yang et al., 1994).
73
5. MOLÉCULES D’ADHÉSION ENDOTHÉLIALES Il est bien connu à présent que la différenciation et prolifération cellulaire ainsi que
l’apoptose sont des processus dépendant de l’adhésion cellulaire. L’adhésion a donc une
dualité fonctionnelle, morphogénétique et de signalisation qui explique le rôle
pléiotropique de ce processus dans la physiologie et la physiopathologie.
5.1 L’ADHÉSION CELLULAIRE
L’adhésion cellulaire se produit quand le récepteur d’adhésion exprimé sur la
membrane plasmique d’une cellule interagit avec une molécule de la matrice
extracellulaire ou avec celle d’une cellule voisine. La réversibilité de ce processus, qui se
traduit par des cycles d’adhésion et de détachement permet aux cellules de se déplacer
l’une par rapport à l’autre ou vers la matrice extracellulaire. Des processus fondamentaux
comme la fécondation, l’embryogenèse, la morphogenèse, la structuration et la réparation
des tissus sont dépendants de l’adhésion tout comme l’hémostase et les réponses
inflammatoires et immunes. Les interactions cellule-cellule et/ou cellule-matrice
extracellulaire, induisent la production de messages lors de l’activation des molécules de
signalisation cellulaire qui sont ancrées dans les sites d’adhésion.
5.2 LES LIAISONS INTERCELLULAIRES DU CIRCUIT SANGUIN
Les cellules endothéliales sont fortement liées entre elles, ce qui leur permet de
maintenir leur intégrité. Les interactions avec l’espace sous-endothélial et avec les cellules
voisines, cellules musculaires lisses, fibroblastes et cellules du sang sont également
importantes. De plus, l’innervation sensorielle de l’endothélium permet d’établir une
liaison entre les espaces intra et extra vasculaires. Des changements de la pression et du
flux, par exemple, sont détectés par l’endothélium. Les interactions intercellulaires et celles
avec la matrice extracellulaire déterminent la nature de la réponse biochimique ou
mécanique qui sera mise en place.
5.2.1 MOLÉCULES DES JONCTIONS INTERCELLULAIRES
La limitation des échanges entre le sang et les tissus est due aux caractéristiques
structurales de l’endothélium. Les jonctions intercellulaires sont à la base de la fonction de
«barrière» attribuée aux cellules endothéliales.
74
5.2.1.1 Les jonctions serrées et adhérentes
Les jonctions serrées sont particulièrement importantes dans l’endothélium de la
barrière hémato-encéphalique. Elles se différencient de celles des cellules endothéliales
d’autres tissus par leur complexité. L’occludine est une protéine transmembranaire qui
constitue les filaments des jonctions serrées. Elle s’exprime en forte proportion et se
distribue de façon continue aux jonctions des cellules endothéliales des capillaires
cérébraux. Dans les autres tissus, son expression est beaucoup plus faible et sa distribution
aux contacts cellule-cellule est discontinue (Hirase et al., 1997). Les claudines, sont des
protéines qui font aussi partie des jonction serrées. Ce sont des protéines intégrales de
membrane avec quatre domaines transmembranaires. La claudine 5 est exprimée dans la
cellule endothéliale de certains segments du vaisseau sanguin. D’autres protéines qui sont
aussi associées aux jonctions serrées sont les protéines cytoplasmiques Zonula occludens
ZO-1 ZO-2 et ZO-3. Cette large famille de molécules semble être impliquée dans la
fonction d’organisation des zones spécifiques de la surface cellulaire. ZO-1 et ZO-2
peuvent se lier directement aux jonctions adhérentes.
Les jonctions adhérentes, un des types de jonctions d’ancrage, relient les cellules entre
elles ainsi qu’à la matrice extracellulaire par l’intermédiaire du cytosquelette. Ce sont des
sites de connexion pour les filaments d’actine. Les cadhérines sont des composants
structuraux des jonctions adhérentes. (Figure 10). Ce sont des protéines
transmembranaires, sensibles au Ca2+ (Takeichi, 1991). Elles s’associent via leur domaine
cytoplasmique, aux caténines, protéines d’attachement intracellulaire ainsi qu’à la p120, un
substrat des tyrosine kinases (Shibamoto et al.,1995). Les caténines permettent
l’interaction de la cadhérine avec l’actine du cytosquelette. Une perturbation des jonctions
adhérentes, provoquée par exemple par une déplétion en Ca 2+ extracellulaire, induit une
augmentation de la perméabilité des jonctions serrées. Les cadhérines établissent
l’adhésion cellule- cellule par un mécanisme homophylique et lient les cytosquelettes des
cellules jointes. Les cadhérines sont une famille de plus de 15 protéines transmembranaires
avec 5 domaines extracellulaires homologues, une seule région transmembranaire et une
queue cytoplasmique qui interagit avec l’actine du cytosquelette via les protéines
d’attachement intracellulaire. L'E-cadhérine épitheliale est la plus connue, elle est aussi
exprimée dans l'endothélium. En outre, la N-cadhérine assure le contact entre les cellules
endothéliales et les cellules musculaires lisses ou les péricytes (Navarro et al., 1998). Les
HUVEC expriment la VE-cadhérine qui diffère des autres cadhérines essentiellement dans
la séquence cytoplasmique. La VE-cadherine constitue un marqueur des cellules
75
endothéliales, car elle s’exprime pendant les étapes très précoces du développent
vasculaire, sur les angioblastes.
Figure 10. Architecture des protéines aux jonctions cellule-cellule (d'après Staddon et
Rubin, 1996).
5.3.MOLÉCULES D’ADHÉSION ENDOTHÉLIALE
Les mécanismes endocrines sont apparus pour permettre des interactions entre
cellules de différente localisation anatomique. Les mécanismes paracrines ont raccourci la
distance qu’une molécule de signalisation doit traverser pour joindre son récepteur dans la
cellule cible. Le mécanisme le plus simple, s'opére quand une molécule d’adhésion dans
une cellule lie son contre-récepteur dans une autre cellule, en établissant le contact cellule-
cellule et la transmission de signaux. Le message transmis va altérer la fonction de la
deuxième cellule. Ceci est appelé signalisation juxtacrine.
Les facteurs d’adhésion vasculaire: sélectines, intégrines et certains membres de la
superfamille des immunoglobulines et leurs contre-récepteurs interagissent de façon
directe ou indirecte avec les systèmes de transduction de signaux intracellulaires. La
signalisation outside-in assurée par les intégrines est l’exemple le mieux connu. Elle a été
décrite initialement pour les interactions avec la matrice extracellulaire (Juliano et Haskill,
1993).
76
5.3.1 SÉLECTINES
La famille des sélectines comprend trois molécules d’adhésion, les sélectines-L, E et
P. La lettre désigne le type cellulaire où la molécule a été identifiée pour la première fois.
Ainsi
la plupart des leucocytes expriment la sélectine-L
l’endothélium activé la sélectine-E
les α-granules plaquettaires et les corps de Weibel-Palade endothéliaux la sélectine-P.
Ces molécules sont spécialisées dans la capture des leucocytes depuis la voie
sanguine vers la paroi du vaisseau. Le contact initial entre le leucocyte et la cellule
endothéliale est suivi par le ralentissement des leucocytes circulants et leur roulement.
C’est la première étape d’une cascade d’interactions moléculaires qui aboutit à
l’extravasation des leucocytes
La figure 11 représente la structure des sélectines. La partie extracellulaire est
composée de trois domaines différents. L’extremité NH2-terminale (120 aa)
particulièrement conservée, représente le domaine Ca2+ dépendant de type lectine C. Il lie
un oligosaccharide spécifique. Ce domaine, est suivi par une séquence répétée de 35-40 aa,
appelé EGF domain. La structure se continue avec un nombre variable de modules de
séquences courtes bien conservées de +/- 60 aa, homologues aux protéines régulatrices du
système de complément. Ce domaine nommé complement binding element (CB) domain
comporte six résidus cysteinyl capables d’établir des ponts disulfures. Il est suivi par un
segment transmembranaire et une queue cytoplasmique qui comporte l’extrémité
carboxyterminale. L’éclaircissement de la relation structure-fonction des sélectines, a
établi l’importance des domaines lectine et EGF. La plupart des anticorps monoclonaux
bloquants de l’adhésion reconnaissent des épitopes localisés dans ces régions (Waltz et al.,
1990; Siegelman et al., 1990; Pigott et al., 1991). Par contre, la fonction des modules
homologues des protéines régulatrices du complément est moins connue. Il a été montré
que l’élimination d’un nombre croissant de ces domaines affecte l’efficacité avec laquelle
la sélectine-P peut assurer le roulement des leucocytes (Patel et al., 1995). La différence de
taille entre les trois sélectines est due à la présence d’un nombre différent de domaines CB
dans leur séquence.
77
Bien que les trois sélectines aient une structure et des fonctions similaires, leur
profil d’expression sur la surface cellulaire est par contre bien diffèrent. L’expression de la
sélectine-E est restreinte à l’endothélium activé par des endotoxines ou par des cytokines
inflammatoires. L’expression maximale après 4-6 heures d’activation, retourne à la valeur
basale vers les 24-48 heures (Bevilacqua et al., 1989; Bevilacqua et al., 1987). La synthèse
de novo d’ARN et de protéines est obligatoire.
Figure 11. Structure des trois sélectines. Elles possèdent un domaine lectine qui lie des
saccharides exprimés sur les cellules indiquées (d'après: Roitt, Brostoff et Male. Immunology 4th
ed., 1996. Chap. 14 Cell Migration and Inflamation, Fig. 14.8, p 14.5). Modifiée par Dominguez Z,
2001.
En plus des facteurs solubles, le contact entre le leucocyte et la surface endothéliale
peut moduler l’expression de la sélectine-E. La coincubation des HUVEC avec des
monocytes humains du sang périphérique induit une expression de sélectine-E soutenue
pendant plus de 24 heures (Rainger et al., 1996). Le contact entre les cellules est
nécessaire, et les anticorps anti-TNF-α n’inhibent que partiellement la réponse (Noble et
al., 1996). De la même façon, l’expression de la sélectine-E est induite lors de la coculture
avec des lymphocytes T provenant de souris infectées avec Leishmania, ou sensibilisés aux
allergènes de contact (trinitrochlorbenzene) (Sunderkötter et al., 1996). De nouveau, le
contact entre les cellules est nécessaire et les anticorps anti-TNFα n’ont pas d’effet. Il
Sélectine-P Sélectine-E Sélectine-L
DomaineLectine
Domaine EGF
Domaine CB
STRUCTURE DES TROIS SÉLECTINES
saccharides exprimés surPlaquettes, PMN, leucocytes HEVendothélium endothélium
78
semble possible que la molécule CD40 soit partiellement responsable étant donné que la
liaison d’une forme soluble recombinante du ligand de CD40 au CD40 endothélial conduit
à l’induction de sélectine-E (von Hollenbaugh et al., 1995; Yellin et al.,1995).
Contrairement à la sélectine-E, la sélectine-P est synthétisée de façon constitutive et
stockée dans des compartiments intracellulaires. Les plaquettes sanguines ou les cellules
endothéliales stimulées peuvent mobiliser rapidement le pool intracellulaire à la surface de
la cellule. Dans la plaquette, l’expression de la sélectine P à la surface cellulaire se produit
en quelques secondes tandis que ce processus peut prendre quelques minutes dans la
cellule endothéliale. L’expression est de courte durée, maximale entre 5-10 min après la
stimulation, et retourne à l’état basal après 30-60 min. Récemment, il a été montré que la
synthèse de sélectine-P peut être induite, comme celle de sélectine-E, par l’IL-1 et le TNF
(Weller et al., 1992; Sanders et al., 1992). Par ailleurs, les deux sélectines endothéliales
peuvent être exprimées de façon constitutive dans certains tissus. L’expression constitutive
de la sélectine-E dans l’endothélium de tissus hématopoïétiques humains a été démontrée
par immunohistochimie (Schweitzer et al., 1996). D’une façon similaire, dans les veinules
de la peau non enflammée un rolling des lymphocytes en partie dépendant de la sélectine-P
a été mis en évidence. Ces résultats montrent que certains vaisseaux sanguins n’ont pas
besoin d’un stimulus inflammatoire pour exprimer la sélectine-P.
Parmi les trois sélectines, seule la sélectine-L est exprimée de façon constitutive à
la surface des cellules. Après activation, les sélectines sont rapidement clivées à la surface
cellulaire (Jung et al., 1988), un processus nommé shedding. Il semble donc, que l’activité
des sélectines puisse être contrôlée par leur apparition/disparition sur la surface cellulaire.
Le rolling est facilité par les trois sélectines tandis que le homing des lymphocytes aux
ganglions lymphatiques dépend exclusivement de la sélectine-L.
5.31.1 Signalisation par les sélectines.
Les premières observations montrant un rôle de la sélectine-L dans la transduction
des signaux ont été décrites dans des cellules humaines activées. Une augmentation du
Ca2+ cytosolique libre ainsi que de l’expression des ARNm du TNF-α et de l’IL-8
(Laudanna et al.,1994) a été observée dans les PMN, après liaison des résidus sulfatides à
la surface de la cellule. Les mêmes auteurs montrent une augmentation du Ca2+
intracellulaire induite par un anticorps monoclonal anti-sélectine-L. La liaison de
l’anticorps stimule aussi, en présence de concentrations sub-optimales de FMLP, la
production de H2O2 (Waddell et al., 1994). Des expériences réalisées sur des PMN
79
montrent que la liaison de la sélectine-L avec trois anticorps différents augmente la
phosphorylation de la tyrosine dans plusieurs protéines incluant la MAP kinase (Waddell et
al., 1995).
D’autre part, Crockett Torabi et al. (1995) ont été les premiers à montrer que la
liaison de la sélectine-L avec des anticorps augmente l’expression de la β2 intégrine, Mac-
1. Plusieurs travaux, ont ensuite démontré qu’il existe une séquence d’événements qui
conduit à l’activation des intégrines une fois que la voie des sélectines a été activée. Ainsi,
Hwang et al. (1996) ont démontré que la liaison de GlyCAM-1 à la sélectine-L des
lymphocytes humains induit l’activation de Mac-1 qui, par la suite, lie son contre-récepteur
ICAM-1. De la même manière, dans des PBL ou des cellules Jurkat T, il a été montré que
GlyCAM-1 peut aussi activer la liaison de la β1-intégrine à la fibronectine (Giblin et al.,
1997). L’activation des intégrines par la sélectine-L semble donc physiologique.
La liaison de la sélectine-E avec des anticorps permet la coprécipitation des
protéines du cytosquelette comme l’α-caténine, la vinculine, la paxilline, la filamine, et la
kinase d’adhésion focale (FAK). Ces protéines ne copurifient pas si l’étape de cross-
linking est omise (Yoshida et al.,1996). L’activation des plaquettes par des agonistes
comme la thrombine ou le collagène mène aussi à des changements de la forme de la
plaquette et à la phosphorylation/déphosphorylation rapide de la sélectine-P (Crovello et
al., 1993).
L’adhésion des monocytes à l’endothélium activé par des cytokines stimule
l’expression du facteur tissulaire. Ceci est partiellement inhibé par des anticorps anti-
sélectine-E. Certaines étapes de la cascade de transduction des signaux déclenchés par le
PSGL-1 ont été identifiées. La liaison de lymphocytes T humain provenant du sang
périphérique à la sélectine-P immobilisée stimule la tyrosine phosphorylation de FAK
(Haller et al., 1997). Les anticorps anti-PSGL-1 ainsi que l’addition de PMN à la sélectine-
P immobilisée stimulent la phosphorylation de certaines protéines, notamment la p42-44
MAPK, sur des résidus tyrosine (Hidari et al., 1997). Très récemment, Hu et al. (2000) ont
étudié l’importance, pour la transduction des signaux, de la partie transmembranaire de la
sélectine-E. Cette partie peut potentiellement agir sur de multiples événements incluant la
régulation des gènes des cellules endothéliales durant la première phase de la réponse anti-
inflammatoire, le recrutement des leucocytes. Des expériences in-vitro sur des HUVEC
activées (0-30’) par l’IL-1 β, montrent que des anticorps anti-sélectine-E, augmentent
80
substantiellement l’activité de la MAPK alors que des anticorps anti-HLA-1 dont
l’expression a été aussi forte que celle de la sélectine-E, n’ont pas d’effet.
Les anticorps anti-sélectine-E induisent la formation du complexe macromoléculaire
Ras/Raf-1/phospho-MEK, ainsi que l’augmentation de l'ARNm du gène précoce, c-fos, qui
dépend de l’activation de MAPK. Le domaine cytoplasmique de la sélectine-E peut être
essentiel pour le mécanisme de transduction du signal, car sa délétion partielle supprime
l’activation de la MAPK, la formation du complexe Ras, Raf-et phosphoMEK et
l’induction des ARNm de c-fos en réponse aux anticorps anti-sélectine-E (Hu et al., 2000).
En plus, l’expression de la sélectine-E dans les HUVEC induite par IL-1 ou le TNFα est
inhibée de façon dose-dépendante par les inhibiteurs de tyrosine kinases, la génistéine et
l’herbimycine (May et al.,1996). Dans les mêmes conditions, la génistéine inhibe
l’expression de VCAM-1 mais pas celle d’ICAM-1.
5.3.2 LES INTÉGRINES
Les intégrines forment une large famille de glycoprotéines homologues
transmembranaires. Elles fonctionnent comme récepteur cellulaire principal de la plupart
des protéines extracellulaires. Toutes les intégrines sont des hétérodimères constitués de
deux sous-unités α et β. Les domaines extracellulaires s’associent de façon non covalente
pour former des héterodimères α et β. Les deux sous-unités comportent des sites de
fixation pour des cations divalents et participent à la reconnaissance du ligand. Les deux
parties N-terminales des sous-unités α et β s’associent pour former une tête unique qui
reconnaît le ligand. L'association α/β détermine la spécificité pour le ligand
extracellulaire (Hynes, 1992). La plupart des intégrines reconnaissent dans leur ligand une
séquence Arg-Gly-Asp (RGD). Cependant, toutes les protéines contenant une séquence
RGD ne sont pas forcément reconnues par une intégrine. En général, les intégrines peuvent
interagir avec plusieurs ligands distincts, mais certaines ne peuvent en reconnaître qu'un
seul. Les cellules endothéliales expriment différentes intégrines, et sont donc capables de
se lier avec différentes protéines de la matrice extracellulaire (Hynes, 1992). Dans certains
cas, deux intégrines qui partagent le même ligand reconnaîtront chacune un site différent
de la même molécule ; dans d'autres cas, deux intégrines auront une affinité commune pour
la même région de leur ligand. L'expression des intégrines peut sembler redondante, mais
des explications commencent à être envisagées. Il se pourrait, tout d'abord, que de
multiples interactions de la cellule avec la même molécule matricielle soient requises pour
la stabilité du processus d'adhésion. Ensuite, deux intégrines différentes qui se lient à la
81
même région d'un ligand pourraient ne pas transmettre la même information dans la
cellule. Cette hypothèse est basée sur le fait que les domaines cytoplasmiques des
intégrines, en particulier ceux des sous-unités α, sont très variés; ceci pourrait indiquer
que chaque sous-unité contribue à des fonctions intracellulaires différentes, encore mal
connues. Il existe au moins 16 sous-unités α et 8 sous-unité β. Elles s’associent pour
former 21 hétérodimères, αβ, différents. L’expression de ces différentes combinaisons des
sous-unités d’intégrines permet la reconnaissance et la réponse à toute une variété de
protéines extracellulaires dans différentes conditions physiologiques. Par exemple, l’αvβ1
et l’α5β1 fonctionnent comme récepteur de la fibronectine. Ces intégrines sont fortement
exprimées dans les cellules endothéliales quiescentes. Au contraire, l’integrine αvβ3 qui
est aussi récepteur de la fibronectine et de la vitronectine est exprimée exclusivement
pendant le processus d’angiogénèse (Brooks et al 1994a). L'intégrine αvβ3 est aussi
significativement surexprimée durant la cicatrisation tissulaire (Brooks et al., 1994a). Le
fait que l'intégrine αvβ3 soit surexprimée durant les processus d'angiogenèse et de
vasculogenèse suggère qu'elle y joue un rôle important. Des expériences réalisées avec des
anticorps anti-αvβ3 confirment que cette intégrine intervient lors de la néovascularisation
(Brooks et al., 1994a,b; Friedlander et al., 1995). La liaison de l'intégrine αvβ3, en
particulier lors de l'angiogenèse tumorale, pourrait conduire à l'inactivation du gène p53
(Strömblad et al., 1996), et induire un signal de survie dans la cellule en l'empêchant de
rentrer en apoptose (Strömbald et Cheresh, 1996).
Pour simplifier, les intégrines connues sont classées en sous-familles qui ont en
commun la même sous-unité β. Plusieurs familles d’intégrines sont exprimées sur la
surface de la cellule endothéliale; elles incluent les récepteurs pour des composants de la
matrice extracellulaire: fibronectine, laminine, collagène. Elles appartiennent au groupe
des β−1 intégrines connues sous le nom de VLA pour very late antigen car elles ont été
identifiées pour la première fois, sur des lymphocytes T durant la phase tardive de la
réponse immune.
Les familles β1, β2 et β7 sont exprimées sur les lymphocytes. L’intégrine
α4β1(VLA-4) est la seule intégrine du groupe des β1-intégrines présente sur les
lymphocytes. Outre la fibronectine, elle reconnaît la protéine transmembranaire
endothéliale vascular cell adhesion molécule, VCAM-1. Celle-ci est une protéine
inductible qui appartient à la superfamille des immunoglobulines. Les intégrines β-1 sont
aussi exprimées sur les monocytes, les basophiles et les éosinophiles.
82
Les intégrines β2 sont présentes sur les leucocytes et phagocytes mononucléés. Les
membres de cette famille reconnaissent de façon sélective les ICAMs, Intercellular
adhesion molecule et les protéines C3b et C4b qui sont des composantes de la cascade
d’activation protéolytique du système du complément (Figure 12).
Figure 12. Molécules d'adhésion endothéliales. Les molécules ICAM-1, ICAM-2, VCAM-
1et MadCAM-1 sont illustrées dans le diagramme avec leurs domaines du type immunoglobuline.
MadCAM possède un segment fortement glycosylé qui peut se lier à la sélectine-E. Les intégrines
contre-récepteurs sont indiquées au dessus (d'après Roitt, Brostoff et Male. Immunology 4th ed.,
1996. Chap. 14 Fig. 14.6, p14.4). Modifiée par Dominguez Z, 2001.
Toutes les cellules T expriment une intégrine du sous groupe β2, LFA-1 ou αΛβ2,
pour lymphocyte function antigen. Cependant, cette intégrine s’exprime plus fortement sur
les cellules T RO+ (mémoire) que sur les cellules T RA+ (naïves). Les interactions entre
les intégrines LFA-1 leucocytaires et leur contre-récepteurs sur l’endothélium déterminent
l’adhésion ferme. Les leucocytes une fois ralentis par leur mouvement de roulement
peuvent alors répondre aux agents chimiotactiques et aux autres molécules exprimées sur
l’endothélium et la matrice extracellulaire. Ceci modifie la conformation de LFA-1 et
débute le processus de migration cellulaire.
ICAM-1 ICAM-2 VCAM-I MadCAM-1
Intégrines contre-récepteurs
LFA-1, CR3 LFA-1 VLA-4 (LPAM-1) LPAM-1=α4β7
83
La liaison des intégrines à la matrice extracellulaire est caractérisée par des
changements de conformation dans le domaine extracellulaire, la réorganisation du
cytosquelette et l’agrégation des intégrines. Dans plusieurs types cellulaires, l’agrégation
des intégrines conduit à la formation du complexe d’adhésion focal (FAC) qui contient des
protéines du cytosquelette et de nombreuses enzymes impliquées dans la signalisation.
5.3.2.1 Signalisation via les Intégrines
Bien que les intégrines n'aient pas les caractéristiques structurales classiques des
récepteurs de signalisation (pas d'activité kinase ou phosphatase par exemple), elles sont
néanmoins capables de transmettre des signaux depuis la matrice extracellulaire jusqu'au
compartiment intracellulaire (Jockusch et al., 1995) par l’interaction de complexes de
signalisation appelés points focaux d'adhésion (figure 13). Les protéines du cytosquelette
associées aux points focaux d’adhésion sont essentiellement l'α-actinine, la vinculine, la
taline, la tensine et la paxilline; les protéines de signalisation incluent les kinases focal
adhesion kinase (FAK), Src, et la protéine kinase C (PKC). Plusieurs cascade de
signalisation sont activées lorsque les intégrines se lient à leur ligand extracellulaire
(Juliano et Haskill, 1993; Miyamoto et al., 1995; LaFlamme et Auer, 1996). La diversité
des signaux qui résultent du nombre et du type d'intégrines liées, suggère qu'ils peuvent
être envoyés à différents compartiments de la cellule, y compris le noyau, et moduler
l'expression de gènes (Jockusch et al., 1995; Clark et Brugge, 1995). Un exemple de ces
différences de signalisation liées à l’intégrine mise en jeu est donné par Friedlander et al.
(1995), dans des expériences d'induction de l'angiogenèse dans la cornée de lapin. En effet,
l'induction de l'angiogenèse par le TNF-α ou le bFGF conduit à une néovascularisation
principalement αvβ3-dépendante, alors que l'induction de l'angiogenèse par le VEGF et le
TGF-α aboutit à une angiogenèse αvβ5-dépendante. De plus, ces auteurs ont montré que
l'angiogenèse dépendante de l'intégrine αvβ5, mais pas celle dépendante de l'αvβ3,
pouvait être inhibée par la calphostine C (un inhibiteur de la PKC); ces résultats mettent en
évidence que plusieurs voies de signalisation, selon le type d'intégrine mise en jeu, peuvent
intervenir dans la morphogenèse capillaire. Les intégrines αvβ3 et αvβ5, bien que
relativement proches d'un point de vue structural conduiraient cependant à deux voies de
signalisation différentes.
La liaison des intégrines à leur contre-récepteur active une variété de voies de
signalisation incluant des protéine kinases, des inositol lipide kinases, des protéines G et
l’antiport Na+/H+ qui sont normalement associés à des voies de stimulation par des facteurs
84
de croissance (Ingber et al., 1990). Dans plusieurs types cellulaires, la liaison des
intégrines induit la phosphorylation de FAK, et de la paxiline, une protéine adaptatrice. La
FAK joue un rôle dans la régulation des changements dynamiques d’organisation de
l’actine du cytosquelette pré-requis pour la migration cellulaire. La tyrosine-
phosphorylation de FAK est stimulée par le intégrines β1 et β3 (Guan et Shalloway, 1992).
Figure 13. Fonction des intégrines. Les intégrines (α,β) maintiennent les cellules par une
extrémité aux protéines de la matrice extracellulaire (fibronectine, collagène) ou à d'autres
molécules des cellules voisines. Par l'autre extrémité, les intégrines se lient aux protéines du
cytosquelette (actine, taline, tensine, vinculine, α-actine) et de la signalisation telles que les kinases
focal adhesion kinase (FAK), Src (d'après Horwitz A F, 1997). Modifiée par Dominguez Z, 2001.
PROTÉINES DE SIGNALISATION
PROTÉINES DU CYTOSQUELETTE
INTÉGRINES
MATRICE EXTRACELLULAIRE
FAK
85
De nombreux travaux montrent une convergence entre la signal généré par les intégrines et
la signalisation via Ras. (Chen et al., 1994). De la même façon, l’adhésion via des
intégrines active les MAPK. L’activation des MAPK se situe en aval de la signalisation via
Ras. Dans les HUVEC et les ECV304, il a été montré que la phosphorylation des MAPK
est dépendante de l’ancrage des cellules endothéliales à la fibronectine (Short et al., 1998).
Les mêmes auteurs ont montré que l’activation de MAPK induite par les mitogènes est
aussi dépendante des intégrines
5.3.3 MOLÉCULES D’ADHÉSION CELLULAIRE
Un certain nombre de molécules d’adhésion endothéliales appartient à la super-
famille des immunoglobulines: Intercellular adhesion molecule-1 et 2 (ICAM-1 et ICAM-
2), vascular cellular adhesion molecules-1 (VCAM-1), mucosal addressin cellular
adhesion molecule (MadCAM-1).
5.3.3.1 MolÉcule d’adhÉsion intercellulaire-1, ICAM-1-
ICAM-1 est exprimée de façon constitutive (à faible concentration) sur la cellule
endothéliale et elle est aussi présente dans d’autres types cellulaires incluant les
lymphocytes T (Dustin et al., 1986; Pober, 1988). ICAM-1 est une protéine fortement
glycosylée qui comporte cinq domaines extracellulaires, un segment transmembranaire et
une queue cytoplasmique (Figure 12, p 82). Dans des tissus vasculaires, in vivo,
l’expression d’ICAM-1 augmente significativement durant la réponse inflammatoire
(Munro et al., 1989). In vitro, son expression est rapidement régulée positivement par les
cytokines inflammatoires telles que l’IL-1, le TNF, l'INF-γ et l’endotoxine bactérienne,
LPS.
Au cours de la reconnaissance antigénique par les lymphocytes, l’expression d’ICAM-1 est
régulée positivement (Rothlein et al., 1988). L’utilisation des mAbs contre ICAM-1 et
LFA-1 a démontré que l’interaction ICAM-1/LFA-1 joue un rôle principal dans des
fonctions leucocytaires dépendant de l’adhésion ainsi que dans la réponse immunitaire. Il a
été montré que le blocage d’ICAM-1 bloque l’activation des lymphocytes B dépendant du
lymphocyte T, la reconnaissance de cibles par les lymphocytes T-cytotoxiques ainsi que la
réponse inflammatoire.
86
5.3.3.1.1 Signalisation via ICAM-1
Il était admis que la fonction d’ICAM-1 était restreinte à l’adhésion étant donné son
rôle dans l’adhésion ferme. Cependant, de nombreuses évidences ont établi sa participation
dans la signalisation. Dans des lymphocytes B de souris, la liaison d’ICAM-1 et de CMH
II induit l’expression des récepteurs de l’IL-2 (Poudrier et Owens, 1994). Dans les PMN, la
liaison d’ICAM-1 conduit à l'explosion respiratoire.
La transduction de signaux via les récepteurs de surface est régulée par des
changements dans l’activité de kinases et phosphatases spécifiques. La structure
moléculaire d’ICAM-1 ne prédit pas une activité tyrosine-kinase intrinsèque. Cependant,
dans une lignée de lymphocytes B, la phosphorylation de plusieurs protéines tyrosine-
kinase incluant la famille Src Kinase, Raf-1 et MAP kinase a été induite par l’activation
d’ICAM-1 (Holland et Owens, 1997). Les auteurs proposent que la liaison d’ICAM-1
permet l’association et/ou l’activation de Lyn, une des protéines de la famille Src,
induisent la tyrosine phosphorylation des protéines cellulaires. Les effets de l’activation de
Lyn, Raf-1 et MAP Kinases induits par la liaison d’ICAM-1 ne sont pas connus à présent.
Dans d’autres systèmes, la MAP kinase active plusieurs protéines cytoplasmiques telles
que les phospholipases C, A2 et des facteurs de transactivation nucléaire: facteur nucléaire
IL-6, c-Fos, cMyc entre autres (Thomas et al., 1992).
De plus, dans les HUVEC, la liaison d’ICAM-1 induit l’expression de VCAM-1 par
un mécanisme diffèrent de celle induit par le TNF ( Lawson et al., 1999).
5.3.3.2 MolÉcule d’adhÉsion intercellulaire-2, ICAM-2
ICAM-2 est un autre membre de la superfamille des immunoglobulines Elle
possède une masse moléculaire 55-65 kDa. Son expression sur l’endothélium est forte et
constitutive. Au contraire d’ICAM-1, l’expression n’est pas régulée par les médiateurs
inflammatoires (De Fougerolles et al., 1991). ICAM-2 est aussi présente dans les
lymphocytes et les monocytes. C’est un ligand constitutif de l’intégrine
CD11a/CD18(LFA-1), son contre-récepteur dans le mécanisme d’adhésion forte.
5.3.3.3 MolÉcule d’adhÉsion cellulaire vasculaire, VCAM-1
VCAM-1 est une protéine faiblement exprimée sur les cellules endothéliales au
repos mais son expression est rapidement induite par les médiateurs proinflammatoires.
Elle est aussi exprimée par des cellules présentatrices d’antigènes ainsi que, de façon
87
constitutive, dans la moelle osseuse. En général, la cinétique d’expression de VCAM-1,
induite par le LPS ou l’INF-γ montre un maximum après 3 h de stimulation. Avec le
TNFα, le pic est plus tardif, (6-8 h après la stimulation) et l’expression se poursuit pendant
72 h (Swerlick et al., 1992). L’amplitude de l’expression et sa cinétique varient selon le
type de stimulus et le type de cellules endothéliales considérés. Par exemple, l’expression
de VCAM-1 induite par le LPS ou le TNFα est plus forte et maintenue plus longuement
dans les HUVEC que dans les cellules endothéliales des microvaisseaux de l’intestin
humain. Ceci est aussi vrai pour l’ICAM-1 (Haraldsen et al., 1996). VCAM-1 est
impliquée dans l’adhésion ferme des leucocytes, mais également dans le roulement (Alon
et al., 1995). Ses contre-récepteurs sont les intégrines VLA-4 (α4β1) et (α4β7) exprimées
sur les cellules mononucléés, les monocytes et les lymphocytes.
La présence de VCAM-1 dans la lésion athéromateuse humaine est bien connue.
L’expression semble en relation avec l’augmentation du nombre de cellules mononuclées
dans la plaque athéromateuse (O’Brien et al, 1996).
5.3.3.4 MolÉcule d’adhÉsion cellulaire plaquette-cellule endothÉliale, PECAM-1
Une des protéines de contact inter-endothélial dont l’expression n’est pas restreinte
aux structures des jonctions est la PECAM-1, platelet endothelial cell adhesion molecule-
1. En plus des cellules endothéliales, elle est présente dans les plaquettes, les PMN, les
monocytes et dans quelques sous-types de lymphocytes T.
Dans les cellules endotheliales sub-confluentes, PECAM-1 est distribuée de façon diffuse.
Après établissement du contact cellule-cellule, elle est concentrée aux sites de jonctions
intercellulaires où elle participe à des interactions de type homophilique. Le blocage des
PECAM-1, leucocytaires et endothéliales, bloque la migration trans-endothéliale des
leucocytes (Muller et al., 1993).
Récemment Newman (1999) a présenté des arguments permettant de classer
PECAM-1 dans une sous-famille composée d’environ 30 membres. Ces protéines sont
caractérisées par la présence d’un ou plusieurs motifs ITIM pour immunoreceptor tyrosine-
based inhibitory motif dans leur domain cytoplasmique. La phosphorylation des différents
résidus tyrosine des ITIM permet le recrutement des tyrosine phosphatase SHP-1 et SHP-2
et inhibe la phosphorylation des tyrosine présentes dans les ITAM du CD3 (Vestweber,
2000). Le blocage de PECAM-1 avec des anticorps active les intégrines β-1, β-2 et β-3
(Varon et al., 1998; Tanaka et al., 1992; Piali et al., 1993).
88
5.4 INTERACTION LYMPHOCYTE-CELLULE ENDOTHELIALE
Le lymphocyte est une des cellules qui a le potentiel d’influer sur le recrutement
des leucocytes aux sites de la lésion. Grâce à sa capacité de sécrétion de cytokines et
d’autres médiateurs, il pourrait réguler l’expression des ECAMs (Vassalli, 1992). Le rôle
des lymphocytes dans l’amplification de la réponse inflammatoire a été bien étudié
(Jordan, 1991; Stutman, 1986).
Des résultats récents indiquent que plusieurs populations de leucocytes circulants
peuvent participer à la régulation de l’expression des ECAMs. Par exemple, Noble et al.
(1996) ont montré l’induction de l’expression de la sélectine-E lors de la coculture
d’HUVEC avec des monocytes du sang périphérique. Le contact cellule-cellule est
nécessaire pour observer l’effet. Un effet similaire, dépendant du contact, a été également
décrit pour différents ECAMs des cellules endothéliales de microvaisseaux cérébraux.
L’expression d’ICAM-1, VCAM-1 et de sélectine-E est induite par les membranes
plasmiques de lymphocytes T activés (Lou et al., 1996). La même étude montre que le
contact cellule-cellule augmente la production endothéliale d’IL-6 et d’IL-8. L’expression
des ECAMs et la production d’IL-6 est partiellement diminuée (<45%) en présence
d’inhibiteurs du TNFα.
89
6. ACIDES GRAS ω−3 ET LES MALADIES CARDIO-VASCULAIRES
L’intérêt pour les acides gras de la famille ω−3 en relation avec les maladies
cardiovasculaires (MCV) a démarré après les travaux de Bang et Dyerberg dans les années
70. Ces travaux ont montré chez les Inuites l’absence de MCV malgré une très forte
consommation de graisse (40% des calories totales journalières).
6.1 SOURCES ALIMENTAIRES DES ACIDES GRAS ω−3
La principale source d’acide α-linolénique (18:3 ω−3) trouvée dans la chaîne
alimentaire provient du règne végétal. Dans les feuilles vertes il représente 56 % des AG
totaux. Les légumes verts sont donc la principale source alimentaire de 18:3 ω−3 chez
l’Homme avec certains fruits (banane) et huiles végétales (soja). Les sources d’acides
eicosapentaénoïque (EPA, 20:5 ω−3) et docosahexaénoïque (DHA, 22: 6 ω−3) se trouvent
dans le règne animal. Les poissons marins sont particulièrement riches en EPA, notamment
la sardine. Un huile de sardine contient environ 21% d’EPA par rapport aux AG totaux,
(Dominguez et Bosch, 1994) une proportion largement supérieure aux 15% trouvés dans la
plupart des spécialités pharmaceutiques. Les poissons d’eaux douces sont par contre
relativement plus riches en DHA (Ortiz et Bosch., 1993).
6.2 LA RÉVOLUTION INDUSTRIELLE ET LES MALADIES
CARDIOVASCULAIRES
La révolution industrielle a sans doute marqué le point de départ vers une
augmentation des MCV. L’athérosclérose est une des MCV, qui a été longtemps
considérée comme liée au processus du vieillissement. Cependant des facteurs autres que
le vieillissement peuvent prédisposer à la maladie de façon précoce. La consommation
d’aliments contenant des acides gras saturés et des acides gras poly-insaturés de la famille
ω−6 a augmenté depuis l’industrialisation alimentaire. Ceci a eu pour conséquence de
modifier le rapport des acides gras ω6/ω3 de l’alimentation. Dans la Figure 14
l'estimation de cette modification est illustrée.
Des études épidémiologiques ont montré que les MCV sont pratiquement
inexistantes dans les populations consommatrices de produits d’origine marine (Kromhout
et al., 1985; Bjerregaard et Dyerberg, 1988; Keli et al., 1994; Hirai et al, 1989; Kromhout,
1989; Feskens et al., 1993).
90
Figure 14. Effet de la révolution industrielle sur l'apport calorique. Estimation de la
consommation de calories dérivées des lipides et de la modification du rapport des acides gras
ω6/ω−3 entre les périodes paléolithique et industrielle (d'après Eaton et Konner, 1985. Paleolitic
Nutition: a consideration of its nature and current implications. N Engl J Med. 312:283-289.
6.3 L’ATHÉROSCLÉROSE UNE DES MALADIES CARDIOVASCULAIRES
L'athérosclérose est une maladie atteignant les gros et moyens vaisseaux. Elle est à
l’origine de la plupart des coronaropathies, des anévrismes aortiques et des artériopathies
des membres inférieurs et joue également un rôle déterminant dans les artériopathies
cérébrales. L’épaississement et le durcissement de la paroi artérielle ont une forme en
plaque nodulaire. Les lésions sont habituellement classées en lésions précoces (lésions
initiales et stries lipidiques), en lésions intermédiaires, en plaques fibreuses et en lésions
compliquées. La formation de cette plaque est associée à des changements entraînant la
dégénérescence de la média et de l'adventice. Certaines plaques sont largement fibreuses,
d'autres sont molles, graisseuses et prédisposées à des complications additionnelles
(calcification, ulcération avec thrombose et hémorragie intraplaquettaire) qui rétrécissent
davantage la lumière ou même provoquent une occlusion totale. Le centre de ces plaques
contient des débris riches en lipides contenant du cholestérol (CH) et des esters de CH. Ces
plaques sont nommées athéromes, elles sont le signe pathognomonique de l’athérosclérose.
91
6.3.1 ATHÉROGENÈSE
Basée sur plusieurs données expérimentales, l’hypothèse de la réaction à un
traumatisme est une des théories sur la pathogénie de l’athéromatose généralement admise.
Selon cette hypothèse, les cellules endothéliales bordant l’intima sont exposées à des
agressions continues ou répétées menaçant leur intégrité. Á certains endroits du système
artériel, les cellules endothéliales lésées exposeraient le tissu sous-endothélial à des
concentrations croissantes des constituants plasmatiques. Le traumatisme de l’endothélium
peut être discret ou important provoquant pour ces cellules la perte de leurs fonctions
normales et de leur rôle de barrière. Á l’extrême, les cellules peuvent desquamer. Cela peut
amorcer toute une série d’événements comme l’adhésion des monocytes et des plaquettes,
la migration de monocytes dans l’intima et leur différenciation en macrophages,
l’agrégation des plaquettes et la formation de microthrombi. La libération de substances
sécrétées par les plaquettes et les macrophages, ainsi que des constituants du plasma
comme des lipoprotéines et des hormones telle que l’insuline pourraient stimuler la
prolifération des cellules musculaires lisses dans les endroits lésés. Parmi les exemples
d’agression de l’endothélium, on note les traumatismes d’origine métabolique comme une
hypercholestérolémie chronique ou l’homocystéinémie, ceux d’origine mécanique comme
dans l’hypertension, et ceux d’origine immunologique observés après une transplantation
cardiaque ou rénale ou dans les maladies autoimmunes.
6.3.1.1 L’évolution de la plaque athéromateuse
Le recrutement des leucocytes est un facteur déterminant dans la formation des
stries lipidiques. Ceci représente le stade précoce de l’athéromatose. Les lymphocytes et
les monocytes sont préférentiellement recrutés et conditionnent l’évolution de la lésion
athéromateuse. Ainsi, les cellules musculaires lisses répondent aux facteurs stimulants
sécrétés par les cellules recrutées, prolifèrent et synthétisent une matrice conjonctive, et se
chargent en lipides. Ce processus peut être accéléré par l’hyperlipidémie. Les macrophages
provenant des monocytes peuvent également se charger en lipides, qui pour la plupart
d’entre eux sont sous la forme de lipoprotéines oxydées. Ces modifications chimiques
produites par oxydation et glycation non-enzymatique des lipoprotéines complexées aux
protéoglycanes, ont un rôle important dans l’athérogénèse. Les macrophages sont aussi
capable de modifier les lipoprotéines in situ, favorisant leur captation par des récepteurs
éboueurs (scavengers). Les cellules endothéliales et les macrophages peuvent synthétiser
92
une protéine chimioattractante qui accélère l’accumulation de macrophages dérivant des
monocytes.
Les forces de cisaillement de type laminaire qui sont présentes dans la plupart des
artères suppriment l’expression des ECAMs, dont VCAM-1 et augmentent la production
endothéliale de monoxyde d’azote (NO) et de PGI2. Ces molécules vasodilatatrices
produites de façon constitutive par l’endothélium artériel peuvent agir localement comme
des autacoïdes anti-inflammatoires. L’altération locale des forces hémodynamiques peut
modifier ces mécanismes cellulaires de protection contre la formation d’une lésion
athéromateuse et expliquer ainsi sa distribution focale. En fait, les points de bifurcation des
vaisseaux où le flux est turbulent sont des sites préférentiels de développement de la lésion
athéromateuse (Figure 15).
Figure 15. Distribution non-aléatoire des lésions athéromateuses. Modèle expérimental
de d'hyperlipidémie de type II chez le lapin Watanabe. Les lésions riches en lipides dans la paroi
artérielle sont visualisées par le colorant Oil-Red-0. (d'après Topper et Gimbrone, 1999. Modifiée
par Dominguez Z, 2001).
Arche de l'aorte thoracique
Nature localisée des lésions
93
Trois types d’altération vasculaires se succéderaient de façon séquentielle:
l‘altération fonctionnelle des cellules endothéliales sans changements
morphologiques significatifs,
la dénudation endothéliale avec l’altération de l'intima, mais la média et la
lamina sont intactes, et
la dénudation endothéliale avec altérations de l'intima et de la média.
Ces altérations facilitant la brisure ou fissure de la plaque athéromateuse conduisent à la
thrombose. Celle-ci, joue un rôle important dans l'évolution de l'athérosclérose et dans les
manifestations des maladies coronariennes aiguës (Meyers et Maloley, 1993).
6.4 LES ACIDES GRAS ω−3 ET L’ATHÉROSCLÉROSE
L’apport essentiel des travaux menés par le groupe de Bang et Dyerberg chez les
Eskimos, a été l’établissement d’un relation de cause à effet entre la forte consommation
d’AGPI de la famille ω−3 et la faible incidence des MCV observée dans cette population.
Ces premières observations ont été le point de départ de différents travaux de recherche
visant à trouver des mécanismes susceptibles d’expliquer la protection contre les MCV
induite par les acides gras (AG) ω−3. Entre 1980 et 2000, les ω−3 ont fait l’objet de plus
de 3000 publications.
6.4.1 EFFETS ANTITHROMBOTIQUES DES ACIDES GRAS ω−3
Les eicosanoïdes dérivés des AG de la série ω−3 ont un effet inhibiteur de la
coagulation. Le temps de saignement qui est un index négatif du risque thrombotique
augmente significativement après une supplémentation en EPA et DHA. Chez les Eskimos
il est d’environ 8 min, le double de la moyenne trouvée chez les occidentaux (Dyerberg et
Bang, 1979). Dans les plaquettes sanguines, l'EPA inhibe le métabolisme de l’AA,
précurseur du thromboxane A2 (TXA2), le plus puissant agrégeant plaquettaire. La
libération de l’EPA à partir des phospholipides de la membrane plaquettaire en réponse
aux agonistes entraîne la synthèse de TXA3 qui n’est pas agrégeant plaquettaire, ainsi que
la diminution de la synthèse de TXA2. (Tamura et al., 1987). Dans le
polymorphonucléaire, la libération de l’EPA conduit à la synthèse de leucotriène B5
(LTB5) à activité chimiotactique très faible comparée à celle du LTB4, puissant
chimiotactique dérivé de l’AA.
94
La substitution partielle de l’AA par l’EPA dans les lipides membranaires induit la
diminution de la production des eicosanoïdes actifs par deux voies :
la production d’eicosanoïdes moins actifs, et
l’inhibition de la synthèse des dérivés de l’AA
Le DHA inhibe la PGHS, mais il peut aussi, après rétroconversion en EPA devenir
substrat pour la synthèse endothéliale de PGI3. Celle-ci est, comme la PGI2 un eicosanoïde
vasodilatateur et antiagrégeant plaquettaire (Sanders, 1989). Au contraire de l’effet observé
sous anti-inflammatoires non-stéroïdiens, la supplémentation orale en EPA et DHA de
l’ordre de 3-5 g/j conduit à la diminution de TXA2 et LTB4 sans diminution de PGI3
(Fischer et al., 1986).
La balance hémostatique après enrichissement des phospholipides en EPA et DHA
s’incline vers l’antithrombogénèse. La production d’eicosanoïdes des séries 3 et 5 assure
une moindre réactivité plaquettaire due à la diminution du rapport TXA2/TXA3 ainsi
qu’une faible chimiotaxie due à la production de LTB5. En revanche, la production de
prostacyclines biologiquement actives, PGI2 et PGI3 est globalement maintenue, (Fischer et
Weber, 1984; Hornstra et al.,1990; von Schacky et al., 1985), la diminution de PGI2 étant
partiellement compensée par la formation de PGI3 (Bordet et al., 1986).
Cependant, certains changements hématologiques, comme la diminution du nombre
de plaquettes et de la concentration en hémoglobine ont été montrés chez l’Homme après
la supplémentation en AGPI ω−3 (von Houwelingen et al, 1987., Sanders et Hinds, 1992).
Chez le rat, une anémie a été observée après 15 jours d’un régime contenant 10 ou 15 %
d'huile de poisson (Dominguez et Bosch, 1994) et un cas d’anémie sévère chez l’Homme a
été rapporté (Sinclair, 1981).
6.4.2 EFFETS DES ACIDES GRAS ω−3 SUR LA SYNTHÈSE DE PROTÉINES
Concernant la synthèse de protéines, l’enrichissement des cellules en AGPI ω−3 a
des effets opposés suivant le gène considéré:
un effet inhibiteur sur la synthèse de certaines cytokines: IL-1(α, β), ΙL2, TNFα
(Endres et al., 1989; Endres et al., 1993 ; Wallace et al., 2001), IL-6 (Meydani et
al., 1991; Khalfoun et al., 1997). Ceci entraîne la diminution de la fonction
95
immune spécifique et non-spécifique ou un déséquilibre entre les réponses de type
Th-1 (cellulaire) et Th-2 (humorale) (Wallace et al., 2001).
un effet inducteur de la synthèse de certaines enzymes: catalases, superoxyde-
dismutase, gluthation-peroxydase (Chandrasekar et Fernandez, 1994) enzymes clés
du système antioxydant protéique.
La régulation de la synthèse de protéines par les AGPI ω−3 a été mise en évidence
in-vivo. Il a été montré que les AGPI ω−3 sont les plus puissants répresseurs du gène de la
synthase des acides gras (FAS), du gène S14. (Clarke et al., 1990a.; Clarke et al., 1990b;
Blake et Clarke, 1990; Clarke et Jump, 1994), acyl-CoA carboxylase (ACC) et stearoyl-
CoA desaturase (SCD) (Pegorier, 1998). Les gènes de FAS, ACC et SCD sont sous le
contrôle de SREBP sterol regulatory element-binding proteins. Les AGPI ω−3 régulent
négativement l’expression de SREBP-1c ARNm; ceci a été proposé comme un des
mécanismes moléculaires responsable de l’inhibition de la lipogenèse induite par les AGPI
ω−3 (Kim et al., 1999). De cette façon, la régulation négative de la synthèse de lipides en
conjonction à la stimulation de leur oxydation peut expliquer la forte diminution de la
concentration de triglycérides plasmatiques induite par les AGPI ω−3 chez les
hypertriglyceridémiques (Rambjør et al., 1996; Roche et Gibney, 1999). En fait,
l’induction par les acides gras ω−3 d’enzymes régulatrices de l’oxydation des lipides telles
que la lipoprotéine lipase, l’acyl-CoA synthétase, la carnitine palmitoyltransférase1, l’acyl-
CoA dehydogenase et l’acyl-CoA oxydase a été démontrée (Clarke et Jump, 1994; Louet et
al., 2001). Le mécanisme moléculaire d’induction de l’oxydation peut s’expliquer au
moins en partie par l’induction de PPARα et la subséquente induction de l’acyl-CoA
oxydase microsomale et la cytochrome P450 4A2 peroxisomales, enzymes dépendant de
PPARα.
Il a été démontré que les AG de la série ω−3 régulent négativement l’expression
des ECAMs (Weber et al., 1995; Collie-Duguid et Wahle, 1996; Κhalfoun et al, 1996; De
Caterina et Libby, 1996; Sanderson et Calder, 1998) et celle des récepteur éboueurs du
macrophage de souris (Miles et al., 2000). Cette régulation est prétraductionnelle et semble
liée à la présence des doubles liaisons dans la chaîne hydrocarbonée. Les AGPI de la série
ω−3 ont la plus forte activité inhibitrice par rapport à la série ω−6 ou aux acides gras
monoinsaturés (De Caterina et al., 2000).
96
L’adhésion des lymphocytes au repos aux cellules endothéliales (Κhalfoun et al.,
1996 , Dominguez et al., 2001) ou à des macrophages (Sanderson et Calder, 1998) au
repos diminue après enrichissement des cellules en AGPI ω−3. Cet effet sur l’adhésion est
également observé dans différents modèles avec pré-activation des cellules (Weber et al.,
1995; De Caterina et Libby, 1996; Sanderson et Calder, 1998). Ces mécanismes
moléculaires et cellulaires peuvent expliquer les propriétés anti-athérogénes et anti-
inflammatoires attribuées au acides gras ω−3.
6.4.3 EFFETS DES ACIDES GRAS ω−3 SUR LA RÉPONSE IMMUNE
Le but thérapeutique dans la plupart des maladies immunes chroniques est de
rétablir la tolérance aux autoantigènes pour surmonter la contrainte d'une
immunosuppression pharmacologique. Il n’existe aucune évidence que la manipulation des
acides gras de l’alimentation influence les réponses immunes essentielles telles que la
mémoire immunologique ou l’induction de la tolérance immunologique. Néanmoins,
différentes manipulations chez des patients montrent un effet immunosuppresseur induit
par des régimes riches en AGPI ω−3 (Stenson et al., 1992; Lawrence et Sorrell, 1993).
Des modèles expérimentaux montrent également des résultats prometteurs d'une utilisation
thérapeutique des AGPI ω−3. La diminution de médiateurs de l’inflammation synthétisés
par des macrophages isolés de souris traitées avec des régimes riches en AGPI ω−3 a été
démontrée (Yaqoob et Calder, 1995). Plus récemment la diminution de NO, TNFα,
monocyte chemoatractan proteine-1 dans des macrophages alvéolaires ainsi que la
diminution de l’activité NK ont été décrites chez le rat après 5 semaines d’un régime riche
en AGPI ω−3 (Sasaki et al., 2000).
La suppression de la réaction d’hypersensibilité retardée et de la prolifération des
lymphocytes T induite par des mitogènes après un régime riche en EPA et DHA a été
montrée chez la souris. La réduction de la capacité proliferative des lymphocytes T est
corrélée à la diminution des ARNm du récepteur de l’IL-2 et de la sécrétion de IL-2. Ceci
suggère que les acides gras EPA et DHA bloquent l’activation autocrine mediée par l’IL-2
(McMurray et al., 2000). Les mêmes auteurs montrent l’amoindrissement in vitro de la
production des seconds messagers, tels que DAG et céramides après stimulation
mitogénique. Un effet immunosuppresseur sélectif du DHA sur la réaction
d’hypersensibilité par contact chez des souris sensibilisées avec le 2,4-dinitro-1-
fluorobenzène a été décrit. Le DHA mais pas l’EPA a été efficace pour réduire
97
l’infiltration des lymphocytes T CD4+ ainsi que l’expression des ARNm de interferon-γ,
IL-6, IL-1β, et IL-2 au site de la lésion (Tomobe et al., 2000). Enfin, la fonction
présentatrice d'antigènes des monocytes activés aux lymphocytes autologues, in vitro, est
significativement réduite par l’inhibition de l’expression de molécules MHC classe II
induite par les AGPI ω−3 (Hughes et Pinder, 2000).
6.5 PERSPECTIVES
De nombreux arguments indiquent que l’athérogenèse est liée à un processus
immuno-inflammatoire (Wick et al., 1997; Emeson et al., 1996; Zhou et al., 1996). Des
données sur les aspects cellulaires et moléculaires montrent qu’une des premières étapes
dans l’athérosclérose chez l’Homme et dans des modèles expérimentaux est l’adhésion de
monocytes et lymphocytes T à la surface endothéliale ainsi que leur subséquente migration
à l’intima (Duplaa et al., 1996; Watanabe et al., 1997; Campbell et Campbell., 1997). Ce
processus peut être dynamiquement régulé par l’état d’activation et d’expression des
molécules d’adhésion endothéliales. Les effets inhibiteurs des AGPI ω−3 sur l’expression
des ECAMs et sur l’adhésion des cellules mononucléées à l’endothélium vasculaire
pourraient faire partie des mécanismes de protection attribuée aux AGPI ω−3.
La révision et discussion des effets des acides gras ω−3 sur la prévention et le
traitement des MCV a fait l’objet d’une publication récente (Schmidt et al, 2.000) dans
laquelle les auteurs émettent les conclusions suivantes:
⎬ La consommation de poisson peut être recommandée pour réduire les risques de MCV
chez les sujets sains ainsi que chez les patients ayant de hauts risques de MCV ou chez
les malades CV.
⎬ L’utilisation des concentrés d'huiles de poisson ne peut pas être recommandée de
façon générale mais elle doit être considérée chez les patients hypertriglyceridémiques
et après un infarctus de myocarde.
⎬ L’augmentation de la consommation de poisson peut avoir des implications
substantielles en terme de santé publique et d’économie par la réduction du risque des
événements coronariens et de la morte subite.
98
MMMAAATTTÉÉÉRRRIIIEEELLLSSS EEETTT MMMÉÉÉTTTHHHOOODDDEEESSS
99
PARTIE II. MATÉRIELS ET MÉTHODES
1.MATÉRIELS 1.1 MATÉRIEL POUR LA CULTURE CELLULAIRE
Biomedia:
Sérum de Veau fœtal
Falcon:
Boites de culture (25mm et 75mm), plaques de 24 puits (mm) gélatinées.
Gibco:
Antibiotiques (peniciline/streptomycine), Collagènase de type I A, L-glutamine, Milieu de
culture (M-199), RPMI 1640 avec 25 mmoles/L HEPES et 2g/L bicarbonate, Milieu de
congélation des cellules, Phosphate Buffer Saline (PBS) avec et sans Ca2+-Mg2+, Trypsine-
EDTA.
Sigma-Aldrich:
Acides gras libres: acide docosahexaénoïque, acide eicosapentaénoïque, acide oléique,
facteur de croissance pour les cellules endothéliales, gélatine type B, sérum de veau
nouveau né décompleménté.
1.2 ANALYSES LIPIDIQUES
Merck:
Plaque de silice Gel 60 (200 x 200 x 0.5 mm)
Sigma-Aldrich:
Phosphatidylcholine diheptadécanoyl (PC-di 17:0), standard des lipides, Trifluorure de
bore (BF3) 10% dans le méthanol.
1.3 MATERIELS POUR IMMUNOCHIMIE
Chemicon:
anti-facteur von Willebrand, clone LM 609
Coulter:
anti-CD8 conjugué à la fluorescéine (SFCI21Thy2D3, IGG1 souris
anticorps secondaire (F(ab')2) couplé à la fluorescéine (FITC)
Dako:
1,4-diazobicyclo(2,2,2)-octane.
100
Sigma
colorant Hoechst N°33258
1.4 MATÉRIELS POUR IMMUNOEMPREINTE
Amersham-Pharmacia Biotech:
Hyperfilm, Kit ECL, Rainbow (standard de poids moléculaires).
Biorad:
Bio-Ready gels polyacrylamide 10%.
Sigma-Aldrich:
Albumine de sérum bovine, anticorps de souris anti-IgG humain couplé à la peroxidase de
raifort, aprotinine, leupeptine.
Tebu:
anti ERK1/2 non phosphorylé
anti p42-p44 phosphorylé, p-ERK (E-4) sc-7383
Zymed
Anti p42-p44 (ERK-708)
1.5 ANALYSES DE LA PROSTACYCLINE
SPIbio:
Kit de dosage de la 6-oxo-PGF 1α (Cayman Chemical Company).
1.6 RÉACTIFS ET SOLVANTS DIVERS
Prolabo:
Glycerol.
SDS:
Solvants organiques.
Sigma-Aldrich:
Dextran, ficoll, NaCl, lipopolysacharide (LPS), toxine pertussique (Bordetella pertussis),
suramine, Tris–HCL, Trisma base, tween-20, butylhydroxytoluène (BHT).
1.7 PRODUIT RADIOACTIF
NEN-Life Science Products:
Na251CrO4
101
1.8 APPAREILS
Balances (Mettler), centrifugeuses (Jouan), chromatographe (HP 6890 Series, (Hewlett
Packard), compteur gamma (Packard), lecteur de plaques multipuits (Logiciel; Bioelisa-
Labsystems IEMS Reader MF), stéricult (Bioblock) système d’électrophorèse (Bio-Rad),
système de transfert Semi-Phor (Hoeffer Scientific Instrument), microcentrifugeuse
microscope optique (Nikon), microscope à fluorescence ( Olympus BX60).
2 MÉTHODES 2.1- CULTURE PRIMAIRE DES CELLULES ENDOTHÉLIALES HUMAINES
Dans notre modèle expérimental nous utilisons des cellules endothéliales provenant
de la veine ombilicale humaine, isolées selon la méthode de Jaffe et al. (1973). Les
cordons ombilicaux proviennent du Service Maternité de la Clinique du Tonkin
(Villeurbanne, France). Un segment de cordon ombilical, de 25 cm en moyenne est prélevé
lors d'un accouchement normal et stocké à 4 °C dans un flacon stérile contenant une
solution isotonique (NaCl 0,15 moles/L). Il est utilisé dans les 12 h qui suivent la
récupération du cordon. Les manipulations sont réalisées dans des conditions stériles. Le
cordon est d’abord rincé avec du PBS préchauffé à 37 °C, et essuyé avec de la gaze stérile.
Les éventuelles marques de clamp aux extrémités sont coupées car elles sont génératrices
de contamination par des cellules musculaires lisses et fibroblastes. La veine ombilicale est
identifiée, canulée et clampée par une extrémité. La veine est rincée par 20 ml de PBS pour
éliminer les cellules sanguines contaminantes, puis une autre canule est placée et fixée à
l'autre extrémité de la veine. Après un nouveau rinçage, 2 seringues de 10 mL sont placées
sur chacune des canules, l'une d'elles contenant 10 mL de collagénase (225 U/mL) dans le
M-199. En jouant sur les 2 seringues la solution de collagénase remplit la veine. Le cordon
est incubé dans du NaCl (0,15 moles/L) à 37 °C pendant 10 à 13 min. A la fin de
l’incubation, le cordon est massé délicatement pour décoller les cellules endothéliales qui
sont restées accrochées à la matrice sous-endothéliale, puis la solution de collagénase
contenant les cellules endothéliales est récupérée dans un tube conique de 50 ml et la veine
est lavée 3 fois avec du PBS. Les tubes sont centrifugés à 200 g pendant 5 min, le culot
cellulaire est repris dans le milieu de culture M-199 contenant 20% de sérum de veau
nouveau-né décomplémenté, 100 µg/mL de streptomycine, 100 UI/mL de pénicilline, 2
mmoles/L de L-glutamine, 0,8 x106 cellules/cordon ombilical sont récupérées en moyenne.
Les cellules en suspension sont distribuées dans des boîtes (25 cm2) de culture traitées à la
102
gélatine, à une densité d’environ 1,5 x104cellules/cm2. Les cellules sont incubées pendant
24 h à 37 °C dans une atmosphère 95% air et 5% CO2 puis le milieu est changé pour
éliminer les cellules non viables non fixées. Les cellules sont alors cultivées dans un milieu
complet contenant le facteur de croissance des cellules endothéliales (50 ng/mL). Le milieu
est changé toutes les 48 h, les cellules atteignent la confluence après 4 jours en moyenne,
leur densité étant alors 5 x104cellules/cm2. Les cellules sont conservées à –200 °C dans le
milieu de congélation 90% SVF-10%-DMSO. La cryoconservation n’altère pas
l’expression constitutive d’ICAM-1, CMH classe I ou II (Ono et al, 1999). Dans toutes les
expériences, les cellules sont utilisées au premier passage (P1) à environ 90% de
confluence
2.1.1 REMISE EN CULTURE DES CELLULES ENDOTHÉLIALES
Le suspension cellulaire est remise en culture (P1) dans le milieu de culture
contrôle ou dans le milieu enrichi en acides gras (voir détails dans le paragraphe 2.7.1
enrichissement, p 108). La suspension est répartie dans des puits (plaque 24 puits
gélatinés) à une densité de 4 x104cellules/puits. Dans cette condition, les cellules arrivent à
confluence après 72 h. À confluence, le nombre de cellules dans les puits est de l’ordre de
105 cellules/puits. Pour les expériences d’analyse par western blotting des MAPK, les
cellules endothéliales sont réensemencées dans des boîtes de culture prégélatinées de 25
cm2. Dans cette condition le nombre de cellules à confluence est de l’ordre de 106
cellules/boîte.
2.1.2 CARACTÉRISATION DU PHÉNOTYPE ENDOTHÉLIAL
Lors de la mise en culture en P1, des aliquotes de la suspension cellulaire sont
dispersées dans des puits dans lesquels des lamelles de verre de 12 mm de diamètre ont été
disposées. Les cellules adhèrent à la lamelle et sont cultivées comme décrit ci-dessus.
Après 2 jours elles atteignent 90% de confluence, le milieu est enlevé et les cellules sont
rincées 2x avec du PBS. Les cellules sont ensuite fixées au paraformaldéhyde (3% dans du
PBS) pendant 30 min à température ambiante (T.A). Après rinçage, les cellules sont
incubées pendant 10 min avec NH4Cl (50 mmoles/L) pour enlever les traces de
paraformaldéhyde et rincées 3 fois avec du PBS. La monocouche est ensuite incubée
pendant 30 min dans un tampon de PBS-albumin 1% afin de saturer les sites de liaison non
spécifiques. La monocouche est rincée et les cellules sont incubées pendant 1 h à 4 °C avec
une solution d'anticorps primaire anti-facteur von Willebrand (monoclonal, clone LM 609,
103
Chemicon). Après lavage avec du PBS, le marquage fluorescent est obtenu en incubant
l'échantillon 45 minutes à 4 °C avec un anticorps secondaire (F(ab')2) couplé à la
fluorescéine (FITC coulter). Ensuite les cellules son incubées 10 min avec le colorant
Hoechst N°33258 pour visualiser les noyaux. Finalement, les cellules sont rincées 3 fois à
température ambiante avec du PBS, puis avec de l'eau. Les lamelles sont montées sur
lames de microscope avec un mélange de glycérol, contenant 2,5% de 1,4-
diazobicyclo(2,2,2)-octane (Dako), pour préserver le fluorochrome et ralentir son
extinction au moment de l’analyse par microscopie à fluorescence.
Nous avons vérifié que le marquage obtenu était spécifique, car aucun marquage n'a
été observé en employant l'anticorps secondaire directement.
2.2 PRÉPARATION DES LEUCOCYTES ET DES PLAQUETTES HUMAINES
Les polynucléaires, les cellules mononucléées et les plaquettes sont préparés à
partir de sang veineux périphérique d’un donneur sain, n’ayant eu aucun traitement
pharmacologique depuis au mois dix jours. Le sang est recueilli au centre de transfusion
sanguine de Lyon, sur l’anticoagulant citrate phosphate dextrose [CPD (acide citrique 15,6
mmoles/L, citrate de sodium 89,4 mmoles/L, phosphate monosodique 16,1 mmoles/L,
dextrose 128,7 mmoles/L, pH 5,6)] à raison d’un volume de CPD pour 7 volumes de sang.
2.2.1. PRÉPARATION DES CELLULES MONONUCLÉÉES
Au laboratoire dans des conditions stériles, le sang est immédiatement distribué
dans des tubes coniques par 40 mL de volume et centrifugé pendant 20 min à 120 g, sans
frein, pour éviter l’activation des plaquettes. La phase supérieure contenant le plasma riche
en plaquettes (PRP) est récupérée et la phase inférieure contenant le reste des constituants
sanguins est ajustée au volume initial par l’addition de NaCl 0,15 moles/L:EDTA
1mmole/L pH 7,3. Un volume de 10 mL d’une solution de dextran (1% concentration
finale dans NaCl 0,15 moles/L:EDTA 1mmole/L pH 7,3) est alors ajouté à chaque tube et
le tout est mélangé par inversion. Les tubes sont incubés à 37 °C pendant 30 min pour
faciliter la sédimentation des érythrocytes. Le surnageant contenant les leucocytes est
séparé par centrifugation sur un gradient de Ficoll Hypaque pendant 20 min à 600 g. Les
cellules mononucléées (PBMC), collectées à l’interface, sont lavées 3 fois dans du RPMI
1640 par centrifugation à 300 g pour éliminer le maximum de plaquettes contaminantes.
Les cellules sont ensuite resuspendues dans du RPMI 1640 et comptées au microscope
104
optique sur une cellule de Neubauer. On récupère en moyenne 400 x 106 PBMC pour 500
mL de sang total.
L’analyse par cytométrie de flux (FACS-Star, Becton Dickinson) des préparations
cellulaires montre que 65-70% des cellules sont des lymphocytes T CD3+ (clone T3,
Coulter), 4-6% sont des lymphocytes B CD19+ (clone B4, Coulter), 15-20% sont des
monocytes CD14+(clone UCHM-1, Sigma) et 2-4% sont des plaquettes CD41a+ (GP11b
IIIa, clone P2, Immunotech).
2.2.2 PRÉPARATION DES LYMPHOCYTES DU SANG PÉRIPHÉRIQUE
Les PBMC sont resuspendues à 106cellules/mL dans du RPMI 1640 contenant 10
% de sérum de veau fœtal, 100 U/mL de pénicilline, 100 µg/mL de streptomycine et 2
mmoles/L de glutamine. La déplétion en monocytes s’effectue par deux cycles d’adhésion
sur le polystyrène des boîtes de culture. Les PBMC sont incubées pendant 1 h à 37°C dans
des boîtes de culture de 162 cm2 (Costar), dans une atmosphère humide à 95% air et 5% de
CO2, avec un changement de boîtes de culture entre les incubations. La suspension
cellulaire ainsi enrichie en lymphocytes est récupérée et réincubée pendant 72 h, dans des
boîtes de culture de 162 cm2, dans le milieu contrôle ou dans le milieu enrichi en acides
gras (voir détails dans le paragraphe 2.7 «enrichissement», p 107). A la fin de la période
d’incubation, les lymphocytes sont récupérés, purifiés sur gradient de Ficoll-hypaque,
lavés et resuspendus à 1,8 x 106cellules/mL dans du RPMI 1640 contenant 100 U/mL de
pénicilline, 100 µg/mL de streptomycine et 2 mmoles/L de glutamine (milieu de
coincubation standard).
L’analyse par cytométrie de flux de cette suspension cellulaire enrichie en lymphocytes
montre qu’elle contient moins de 1% de monocytes CD14+ (Leu M3, Becton Dickinson).
2.2.3 PRÉPARATION DES PLAQUETTES SANGUINES
Le PRP récupéré après la première centrifugation du sang total est acidifié à pH 6,4,
par l’acide citrique 0,15moles/L afin d’éviter l’agrégation spontanée des plaquettes. Le
PRP est réparti par fractions de 7 mL dans des tubes coniques et aussitôt centrifugé
pendant 12 min à 900 g. Le surnageant est éliminé et le culot plaquettaire est remis en
suspension dans 5 mL de Tyrode-HEPES (NaCl 140 mmoles/L-KCL 2,7mmoles/L,
NaHCO3 12 mmoles/L, NaH2PO4 0,41 mmoles/L, MgCl2 1 mmole, glucose 5,5
mmoles/LHEPES 5 mmoles/L pH 7,35). Les plaquettes sont comptées et une aliquote de la
105
suspension plaquettaire est reprise dans un volume de milieu de coincubation pour avoir
1,8 x 106 cellules/mL.
2.2.4 PRÉPARATION DES CELLULES POLYMORPHONUCLÉAIRES
Les cellules polymorphonucléaires (PMN) sont récupérés dans le culot obtenu après
centrifugation sur gradient de Ficoll Hypaque Les érythrocytes contaminants sont lysés par
choc hypotonique et éliminés dans le surnageant après 5 min de centrifugation à 400 g. Les
PMN sont ensuite lavées 2 fois dans du PBS par centrifugation à 400 g, comptés et
resuspendus à 1,8 x 106cellules/mL dans le milieu de coincubation.
2.2.5 VIABILITE DES CELLULES La viabilité de tous les types cellulaires déterminée par le test d’exclusion au bleu
Trypan est supérieure à 95%.
2.3 COINCUBATION LYMPHOCYTES-HUVEC
Lorsque les HUVEC sont cultivées dans des plaques de 24 puits, elles arrivent à
environ 90% de confluence en 72 h et leur densité est d’environ 105 cellules/puits. À ce
moment, le milieu est enlevé, la monocouche est lavée 2 fois avec du RPMI et les HUVEC
sont mises en coincubation avec les lymphocytes qui ont été resuspendus dans le milieu de
coincubation à une densité de 1,8 x 106cellules/mL. Un volume de 0,5 mL de la suspension
de lymphocytes est ajouté à chaque puits pour avoir un rapport L/HUVEC 9:1. Le milieu
de coincubation standard (RPMI 1640, 100 U/mL pénicilline, 100 µg/mL streptomycine,
2 mmoles/L glutamine) ne contient pas de sérum. Les deux types cellulaires en contact
sont coincubés en conditions statiques à 37 °C dans une atmosphère humide contenant
95% air et 5% CO2.
La durée de la coincubation varie selon l’étude réalisée. Pour l’étude de la cinétique de
production de la prostacycline, les deux types cellulaires ont été coincubés pendant des
périodes allant de 0 à 20 h. Pour l’identification de la sous-population de lymphocytes qui
adhérent aux cellules endothéliales, la coincubation a duré 1 h. Pour l’analyse de la MAPK
endothéliale, la coincubation a duré 1, 2, 4, 8 et 20 h. Pour le reste des études, le temps de
coincubation à été fixé à 4 h. Dans toutes les expériences, les HUVEC témoins ont été
incubées dans les mêmes conditions sans addition d’autres types cellulaires. A la fin des
différents périodes d’incubation, les milieux de culture sont prélevés, les lymphocytes non
106
adhérents sont éliminés par centrifugation 1 min à 5000 rpm et les surnageants sont stockés
à –20 °C jusqu’au dosage de la 6-oxo-PGF1α.
2.3.1 COINCUBATION LYMPHOCYTES-HUVEC DANS DES CONDITIONS DE ROTATION
CONTINUE
Pour évaluer l’effet des forces de cisaillement sur la production de prostacycline
induite par les lymphocytes l’expérience de coincubation décrite ci-dessus a été réalisée sur
une plate-forme de rotation. La plate-forme est maintenue à une rotation constante de 9
révolutions par minute. Les cellules sont maintenues à 37 °C dans l’incubateur à
5%CO2/95% air dans une atmosphère humide. Après 4 h de coincubation avec rotation
continue, les milieux de culture sont prélevés, et les surnageants sont stockés pour doser la
6-oxo-PGF1α. La production basale de prostacycline est déterminée dans des HUVEC
témoins incubées seules dans la même condition de rotation.
2.4 CARACTÉRISATION DU PHÉNOTYPE DES LYMPHOCYTES ADHÉRENTS
A L’ENDOTHÉLIUM
Le phénotype des lymphocytes adhérant à la monocouche de cellules endothéliales
après la coincubation a été étudié par immunofluorescence.
Les HUVEC sont ensemencées sur des lamelles en verre et cultivées jusqu’à pré-
confluence dans du milieu 199 contenant 20% en sérum. Elles sont alors coincubées avec
des lymphocytes selon le protocole décrit dans le paragraphe 2.3 Coincubation
lymphocyte-HUVEC (page précédente). Après 1 heure de coincubation, les lamelles sont
rincées pour enlever les lymphocytes non adhérents et les cellules sont fixées selon le
protocole décrit dans le paragraphe 2.1.2 Caractérisation du phénotype endothélial, p 102.
Elles sont ensuite incubées pendant 1h à 4 °C avec un anticorps anti-CD8 conjugué à la
fluorescéine (SFCI21Thy2D3, IgG1 souris, Coulter clone).
2.5 ÉTUDE AVEC DIFFERENTS INHIBITEURS
Pour évaluer le rôle de la protéine Gi et des protéines tyrosine kinases dans la voie
de signalisation conduisant à la production de prostacycline induite par les lymphocytes
nous avons utilisé dans un premier temps, des inhibiteurs à large spectre comme la
suramine et la génistéine, et dans un deuxième temps des inhibiteurs spécifiques comme la
toxine pertussique le PP1 et le PD98059.
107
2.5.1 ÉTUDE D’INHIBITION AVEC LA SURAMINE, LA GÉNISTÉINE, LA TOXINE
PERTUSSIQUE LE PP1 ET LE PD98059.
Les HUVEC sont cultivées dans des plaques de 24 puits jusqu’à 90% de
confluence. Ensuite, elles sont incubées pendant 30 min à 37 °C avec la suramine
1mmolel/L, la génistéine 0,1mmole/L, la toxine pertussique 50 ng/mlL le PP1 50 µmoles/L
ou le PD98059 25 µmoles/L (concentrations finales). Après, cette période de pré-
incubation, les lymphocytes sont ajoutés (rapport L/HUVEC 9:1) et la coincubation est
maintenue pendant 4 h à 37 °C. Pour l'étude d'inhibition avec la toxine pertussique et le
PP1, avant de procéder à la coincubation, les inhibiteurs sont enlevés et la monocouche est
rincée 3 fois avec du RPMI. Ensuite, les lymphocytes sont ajoutés et la coincubation est
suivie comme décrit ci-dessu. Pour l'étude d'inhibition avec le PD98059, la coincubation a
été réalisée en présence ou en absence de l’inhibiteur. Par la suite, les milieux de culture
sont récupérés, et la 6-oxo-PGF1α. est déterminée dans les surnageants.
2.6 ÉTUDE DE L’ADHÉSION DES LYMPHOCYTES A L’ENDOTHÉLIUM
L’adhésion des lymphocytes à l’endothélium a été déterminée à l’aide de
lymphocytes marqués au 51Cr. Les lymphocytes sont incubés pendant 60 min à 37 °C avec
925 KBq de Na251CrO4/106 cellules. Ils sont ensuite lavés 3 fois avec du PBS et remis en
suspension dans le milieu de coincubation à une concentration de 1,8x 106cellules/mL puis
coincubés avec des HUVEC cultivées dans le milieu contrôle ou dans le milieu enrichi en
acides gras. La coincubation se déroule selon le protocole décrit dans le paragraphe 2.3
coincubation lymphocytes-HUVEC, (p 105 ) pendant 4 h. A la fin de la coincubation, le
surnageant est récupéré, les puits sont lavés 4 fois avec du PBS sans Ca2+-Mg2+ et les
cellules endothéliales + lymphocytes adhérents sont solubilisés avec 0,5 mL de NaOH
0,1mole/L. Les lysats sont récupérés et la radioactivité est mesurée dans un compteur
gamma (Riastar, modèle 5410). L’adhésion des lymphocytes est exprimée en pourcentage
de la radioactivité totale des lymphocytes ajoutés à chaque puits.
2.7 ENRICHISSEMENT DES CELLULES EN ACIDES GRAS ω−3
Pour étudier les effets des acides gras ω−3 sur la production de PGI2 et sur
l’adhésion des lymphocytes à l’endothélium chacun des types cellulaires, HUVEC et
lymphocytes, a été cultivé séparément dans un milieu enrichi en l’acide gras ω−3 d’intérêt,
l’EPA ou le DHA. L’acide oléique a été utilisé comme témoin négatif.
108
2.7.1 PRÉPARATION DU MILIEU DE CULTURE ENRICHI EN ACIDES GRAS
Le milieu de culture enrichi en acides gras a été préparé par substitution du sérum
contrôle par le sérum enrichi en l’acide gras d’intérêt. Le sérum de veau nouveau-né
décomplémenté (SVNN) utilisé pour la culture des HUVEC ou le sérum de veau fœtal
décomplémenté (SVF) utilisé pour les lymphocytes ont été incubés en agitation continue
pendant 4 h à 37 °C avec l’EPA, le DHA ou l’acide oléique. La concentration finale en
acide gras dans les milieux de culture enrichis est de 60 et 30 µmoles/L pour les HUVEC
et les lymphocytes, respectivement. Le rapport molaire final acide gras/albumine est de
0,5.
2.7.2. ENRICHISSEMENT DES CELLULES EN ACIDES GRAS ω−3
Les HUVEC en P1 ou les lymphocytes sont cultivés pendant 3 j dans leur milieu
contrôle ou enrichi respectif. L’incorporation de l’acide gras d‘intérêt dans les
phospholipides totaux est vérifiée par analyse en chromatographie phase gazeuse. Le
pourcentage de l’acide gras d‘intérêt augmente, par rapport aux cellules témoins, de 1,3
fois pour l’acide oléique, 37,5 fois pour l’EPA et 5 fois pour le DHA dans les HUVEC.
Dans le cas des lymphocytes l’augmentation est de 1,4 fois pour l’acide oléique, 10 fois
pour l’EPA et 4,4 fois pour le DHA.
2.8 ANALYSES BIOCHIMIQUES
2.8.1 DOSAGE IMMUNOENZYMATIQUE DE LA 6-OXO-PGF1α
L’immunodosage est basé sur une réaction antigène (Ag)-anticorps (Ac) qui permet
la détermination quantitative d’une espèce moléculaire grâce à la spécificité du complexe
Ag-Ac formé.
La détermination immunoenzymatique de la 6-oxo-PGF1α, métabolite stable de la PGI2, est
réalisé à l’aide d’un kit de dosage commercial. La figure 16 montre le principe de l’essai
immunoenzymatique. Les différents réactifs sont ajoutés dans les puits selon le protocole
du Kit. Les mesures sont réalisées directement sur une plaque de 96 puits au fond desquels
un anticorps monoclonal anti-lapin est fixé. Le principe du dosage repose sur la
compétition entre l’antigène 6-oxo PGF1α libre à doser dans les échantillons et le traceur,
l’antigène commercial 6-oxo PGF1α conjugué à l’acétylcholinestérase, vis à vis d’un
nombre fixe de sites de liaison sur l’anticorps anti-6-oxo-PGF1α. La concentration du
109
traceur est maintenue constante dans tous les puits tandis que la quantité de 6-oxo-
PGF1α dans les échantillons varie. La quantité de traceur qui se lie à l’anticorps anti-6-
oxoPGF1α est donc inversement proportionnelle à la concentration de la 6-oxo-PGF1α libre
contenue dans chaque échantillon. Le complexe Ag-Ac, [6-oxo-PGF1α (traceur ou libre)-
anti-6-oxoPGF1α (antisérum de lapin)], se fixe à l’anticorps monoclonal anti-lapin qui
recouvre chaque puits. La plaque est incubée pendant 18 h à 4°C. Après l’incubation la
plaque est lavée 5 fois avec 200 µL de tampon de lavage contenant 1% de Tween 20 pour
éliminer les réactifs non fixés. Ensuite, 200 µL de réactif d’Ellman contenant
Figure 16. Représentation schématique du dosage de la 6-oxo-PGF1α
l’acétylcholine, substrat de l’acétylcholinestérase et du 5,5’-dithio-bis-(acide 2-
nitrobenzoique) sont ajoutés. L’hydrolyse de l’acétylcholine par l’acétylcholinestérase
produit de la thiocholine qui réagit de façon non enzymatique avec le 5,5’-dithio-bis-(acide
2-nitrobenzoique). Le produit formé, l’acide 5-thio-2-nitrobenzoique développe une
A) puits pré-enduits B) addition du traceur, de l'anticorps anti-6-oxo-PGF1α et de l'échantillon à doser. Incubation
C) Lavages de puits D) Développement avec le réactif d'Ellman
ANTICORPS MONOCLONAL PROTEINES BLOQUANTES TRACEUR (Acétylcholinestérase conjugué à la 6-oxo-PGF1α ANTICORPS anti-6-xo-PGF1α libre 6-xo-PGF1α LIBRE
110
coloration jaune qui absorbe à 416 nm. Les mesures spectrophotométriques de la densité
optique (DO) sont effectuées dans un lecteur de plaque multipuits.
Une gamme étalon de 6-oxo-PGF1α (de 3,9 à 500 pg/mL) est mesurée en parallèle
avec les échantillons. La fixation non spécifique du traceur au puits en absence d’anticorps
spécifique (NSB, ou Non spécifique Binding), la liaison maximale du traceur à l’anticorps
spécifique en absence de 6-oxo-PGF1α (BO, Maximum Binding) et l’activité enzymatique
maximale de l’acétylcholinesterase (TA, ou Total Activity) sont également déterminées.
Pour chaque échantillon ou standard le % de liaison est calculé à l’aide d’un logiciel
BIOLISE:
(DO (échantillon) – DO (NSB)/ DO (Bo) – DO (NSB)] x 100.
La concentration en 6-oxo-PGF1α des échantillons est déterminée par comparaison avec la
gamme étalon de 6-oxo-PGF1α.
2.8.2 ANALYSES DE LA MAPK ENDOTHÉLIALE PAR IMMUNOEMPREINTE
Pour l’analyse par immunoempreinte (western blotting) de la MAPK endothéliale,
les HUVEC sont coincubées avec les lymphocytes pendant différentes périodes 1, 2, 4, 8 et
20 h ou incubées seules pendant 4 h (condition basale). A la fin des différents temps
d’incubation, les surnageants sont récupérés, les HUVECs sont lavées plusieurs fois avec
du PBS sans Ca2+/Mg2+ pour éliminer le maximum de lymphocytes non-adhérents. Les
HUVEC sont décollées par traitement avec le mélange trypsine (0,5 g/L)/EDTA (0,2 g/L),
centrifugées pendant 5 min à 400 g à 4 °C et les cellules sont ensuite homogénéisées dans
du tampon RIPA [ Tris-HCl 50 mmoles/L, NaCl 150 mmoles/L, NP-40 1%, EDTA 1
mmoles/L, EGTA 1 mmoles/L, Na-deoxycholate 0,25 % (aproptine, leupeptine, pepstatin 1
µg/mL, Na3VO4 1 mmmoles/L, NaF 1 mmoles/L, H2O q.s.p 100 mL] à l’aide d’un potter
verre jusqu’à la lyse totale des cellules. Les échantillons sont congelés à –20 °C jusqu’à
l’analyse par western blotting.
2.8.2.1 Dosage des protéines selon la méthode de Bradford
La quantité de protéines dans les homogènats d'HUVEC est déterminée par la
méthode de Bradford adaptée par Pierce et Suelter (1977). La lecture spectrophotométrique
est effectuée à 595 nm.
111
2.8.2.2 Électrophorèse sur gel de polyacrylamide en présence de SDS
Les échantillons, (20 µg de protéines totales) et des standards de poids moléculaires
sont ensuite déposés dans les puits des minigels de polyacrylamide (10 % pour le gel de
séparation et 4% pour le gel de concentration) et séparés par électrophorèse, dans un
tampon dénaturant en présence de SDS ( pH 8,3) à 120V pendant 90 min.
2.8.2.3 Transfert semi-sec
Le protéines sont alors électrotransférées sur une membrane Immobilon-pII en
polyvinyldifluorure (PVDF) (Milipore). Le transfert se déroule à 0.8mA/cm2 pendant 1h
dans un tampon contenant 25mmoles/L Tris, 0,19 moles/L de glycine et 20 % de méthanol
à pH 8,3 dans un appareil de transfert semi-sec Semi-Phor (Hoeffer Scientific Instruments).
2.8.2.4 Immunodétection
Toutes les étapes sont réalisées sous agitation orbitale dans un tampon salin TBS
(Tris base 20 mmoles/L, NaCl 137 mmoles/L pH 7,6) contenant 0,1 % de Tween-20,
(TBS-T). A l’issue du transfert, la membrane est incubée dans du TBS-T contenant 1 % de
BSA pendant une nuit à 4 °C pour limiter les fixations non spécifiques. Après 3 lavages de
10 min, la membrane est incubée à température ambiante, pendant 90 min en présence de
l’anticorps primaire: l'anticorps monoclonal anti-p42-p44 MAPK ou anti-phospho p42-p44
MAPK (dilution 1:2000).La membrane est lavée plusieurs fois puis incubée 1 h avec
l’anticorps secondaire couplé a la peroxydase de raifort: anti-IgG de souris (1:5000). La
membrane est soumise ensuite à une dernière série de lavages pendant 90 min avant la
révélation spécifique des protéines par une réaction chimioluminescente (détection ECL).
La solution contenant de l’eau oxygénée, du luminol et des amplificateurs chimiques de
chimioluminescence est ajoutée sur toute la surface de la membrane et laissée en contact
pendant 1 min. La membrane est ensuite exposée à un film (hyperfilm, Amersham).
2.8.3 .ANALYSES LIPIDIQUES
La composition en acides gras des phospholipides totaux est analysée dans les
HUVEC et dans les lymphocytes après 3 j de culture dans un milieu contrôle ou un milieu
enrichi en l’acide gras d’intérêt: EPA, DHA ou oléique (témoin négatif).
112
2.8.3.1 Extraction lipidique
Les lipides cellulaires sont extraits selon la technique de Boukhchache et Lagarde
(1982) par le système chloroforme/éthanol (6:3 v/v) contenant du butyl-hydroxytoluène
(BHT) comme antioxydant à la concentration finale de 5 x 10-5 moles/L. Le mélange est
mis à décanter pendant une nuit à 4 °C. La phase organique est recueillie, évaporée jusqu’à
300 µL de volume et conservée sous azote
2.8.3.2 Séparation des différentes classes de lipides
La séparation des différentes classes lipidiques est effectuée par chromatographie
sur couche mince (CCM). Les extraits lipidiques des cellules endothéliales sont évaporés à
sec sous azote et repris dans de faibles volumes (50-100µL) du mélange éther/méthanol
(9:1, v/v) et déposés sur une plaque de silice gel 60 préalablement lavée au méthanol et
séchée sous hotte. La migration est développée dans le système hexane:éther:acide
acétique (70:30:1, v/v). Les différentes classes de lipides sont identifiées après coloration à
la dichlorofluorescéine et exposition aux UV par comparaison avec des standards. Les
phospholipides, très polaires, restent à l’origine (Rf=0), alors que les lipides neutres
(cholestérol, acides gras libres, mono-, di- et triacylglycérol, esters de cholestérol) migrent
plus loin selon des Rf différents.
2.8.3.3 Analyse des acides gras des phospholipides totaux
Après séparation par CCM, la bande de silice correspondant aux phospholipides est
grattée. Les phospholipides sont transméthylés, sous une atmosphère d’azote, par 1 mL
d’H2SO4 à 5 % dans le méthanol, à 100 °C pendant 90 min. La réaction est arrêtée en
plongeant les tubes dans la glace pendant 5 min. Les esters méthyliques ainsi formés sont
traités par 1.5 mL de K2CO3, à 5% dans l’eau afin de neutraliser le milieu, puis extraits 2
fois par 3 mL d’isooctane. Après centrifugation à 500 g pendant 5 min les phases
organiques sont récupérées, rassemblées, puis évaporées à sec sous un courant d’azote. Les
extraits secs sont repris par un volume d’isooctane puis analysés par chromatographie
gazeuse (CPV) (HP 6890 Séries, Hewlett Packard), sur une colonne capillaire de 30 m x
0,32 mm (SP 2380, Supelco) sous une pression de 0,45 bars. Les esters méthyliques
d’acides gras injectés dans la colonne sont entraînés par le gaz vecteur, l’hélium C. La
température du four dans laquelle se trouve la colonne augmente selon un gradient de
113
températures programmé de 145 °C (5 min) à 215 °C à 2 °C/min Les produits sont
volatilisés dans l’injecteur à 230°C, et sont détectés en sortie de colonne par un détecteur à
ionisation de flamme dont la température est 250 °C.
La séparation s’effectue selon la polarité des acides gras. Cette technique permet
ainsi de séparer les acides gras selon le nombre d’atomes de carbone, le nombre
d’insaturations et la position de ces insaturations. La surface des pics est proportionnelle à
la masse d’acide gras. Les esters méthyliques d’acides gras individuels ont été identifiés
par la comparaison de leurs temps de rétention avec ceux des esters méthyliques d’acides
gras d’un mélange standard.
2.9 ANALYSES FONCTIONNELLES
Différentes expériences fonctionnelles ont été réalisées pour évaluer les
mécanismes qui pourraient expliquer l’induction de la production de la prostacycline
endothéliale lors de la coincubation avec les lymphocytes.
2.9.1 BLOCAGE DES MOLÉCULES D’ADHÉSION ENDOTHÉLIALES
Les molécules d’adhésion endothéliales sélectine-E, ICAM-1 et VCAM-1 ont été
bloquées avec des anticorps monoclonaux bloquants, provenant d'hybridomes. Ces
hybridomes, propriétés du Prof. Gimbrone M Jr, ont été aimablement donnés par le Dr. De
Caterina R. Les HUVEC sont incubées pendant 30 min à 37 °C avec 300 µL du surnageant
d’hybridome contenant l’anticorps monoclonal H18/7 (anti-sélectine-E), E1/6 (anti-
VCAM-1) ou HU5/3 (anti-ICAM-1). 200 µL d'une suspension de lymphocytes,
prémarqués au 51Cr, à une concentration de 4,5x106 cellules/mL sont ajoutés pour avoir un
rapport L/HUVEC 9:1. La coincubation se déroule pendant 4 h. Des HUVEC témoins sont
incubées avec le surnageant d'un hybridome témoin. A la fin de la période de coincubation
les milieux de culture sont prélevés, les lymphocytes non adhérents sont éliminés par
centrifugation 1 min à 5000 rpm. Les surnageants sont stockés à –20 °C pour doser la 6-
oxo-PGF1α. La concentration de 6-oxo-PGF1α determinée dans des surnageants provenant
de cellules HUVEC incubées avec le milieu de coincubation standard (sans sérum) ne
diffère pas de celle obtenue quand les HUVEC sont incubées avec le surnageant de
l’hybridome témoin. Les lymphocytes adhérents (plus cellules endothéliales) sont lysés et
la radioactivité est comptée. L’adhésion est exprimée en pourcentage par rapport à
l’adhésion des lymphocytes aux HUVEC témoins.
114
2.9.2 DOSAGE DE L’EXPRESSION DES MOLÉCULES D’ADHÉSION ENDOTHÉLIALES
L’expression des molécules d’adhésion endothéliales sélectine-E, ICAM-1 et
VCAM-1 a été evaluée par ELISA (Takami et al, 1998) sur des HUVEC incubées avec du
lipopolysacharide (LPS) (1µg/mL ou 10 µg/mL dans le milieu de coincubation standard)
utilisé comme témoin positif d’induction de l’expression des ECAMs (Schleimer et
Rutledge, 1986) ou coincubées avec les lymphocytes selon le protocole décrit dans le
paragraphe 2.3 coincubation lymphocytes-HUVEC, p 105. Des HUVEC témoins ont été
incubées dans le milieu de coincubation standard sans autre addition.
Après 4 h d’incubation, le milieu est enlevé, la monocouche de cellules
endothéliales est rincée 3 fois avec du PBS. Les cellules sont ensuite fixées avec une
solution de PBS-paraformaldehyde 1% à température ambiante pendant 15 minutes, lavées
3 fois avec du PBS et bloquées avec une solution de PBS-BSA 2% à 4 °C pendant une
nuit. La monocouche est ensuite rincée pour enlever la BSA et les anticorps monoclonaux
H18/7 (anti-sélectine-E), E1/6 (anti-VCAM-1) ou HU5/3 (anti-ICAM-1) sont ajoutés et
incubés pendant 1 h à 37°C. Les cellules sont ensuite lavées et incubées pendant 1h à 37
°C avec l’anticorps secondaire conjugué à la peroxydase (Sigma AO168), dilué 1:1000
dans 1% BSA-PBS. La monocouche est lavée 4 fois avec du PBS, le dernier lavage est
éliminé par aspiration à l’aide d’une pompe à vide pour enlever tout liquide résiduel. Par la
suite, 300 µL du substrat 3,3’,5’(-tetramethylbenzidine (TMB) Sigma T8665 sont ajoutés
dans chaque puits et la plaque est incubée 30 min à l’obscurité. Ensuite 150 µL d'H2SO4
0,5 M sont ajoutés pour arrêter la réaction. Les mesures spectrophotométriques de la
densité optique (DO) sont effectuées à 450 nm dans un lecteur de plaque. Les DO obtenues
sont corrigées par les DO correspondant aux cellules incubées seulement avec l’anticorps
secondaire pour tenir compte du marquage non spécifique.
2.10 ANALYSES STATISTIQUES
Les résultats représentent les moyennes ± SEM de n déterminations indépendantes.
Les comparaisons entre les différents groupes de valeurs ont été effectuées après analyse
de la variance à une voie. Les moyennes ont été comparées par un test t protégé (précisé
dans la légende de chaque figure ou tableau). Les différences sont considérées comme
significatives quand P < 0,05.
115
RRRÉÉÉSSSUUULLLTTTAAATTTSSS EEEXXXPPPÉÉÉRRRIIIMMMEEENNNTTTAAAUUUXXX EEETTT
DDDIIISSSCCCUUUSSSSSSIIIOOONNN
116
PARTIE III. RÉSULTATS EXPÉRIMENTAUX ET DISCUSSION
Chapitre 1. LA SYNTHÈSE DE PROSTACYCLINE ENDOTHÉLIALE
EST INDUITE PAR LES LYMPHOCYTES HUMAINS
L’adhésion des cellules mononucléées à l’endothélium vasculaire est un pré-réquis
à la migration cellulaire vers les tissus ou à l’éventuelle accumulation de ces cellules dans
l’espace sous-endothélial. Notre premier objectif a été d’étudier l’influence du contact
entre les cellules endothéliales de veine de cordon ombilical (HUVEC) et les lymphocytes
humains sur la synthèse de PGI2. Pour étudier l’effet spécifique des lymphocytes de sang
périphérique sur la production de PGI2 endothéliale nous avons mis au point un modèle
mimant une concentration focalisée de lymphocytes sur l’endothélium saine. La méthode
de Jaffe et al. (1973) a été suivie pour l’isolement des HUVEC. En ce qui concerne les
lymphocytes, nous avons suivi la méthode d’isolement des cellules mononucléées à partir
de sang veineux périphérique de sujets sains, technique pratiquée en routine au laboratoire.
A partir des cellules mononucléées nous avons obtenu une suspension cellulaire enrichie
en lymphocytes (<1% de monocytes) (voir méthodes, paragraphe 2.2.2, p 104).
1.1 CARACTÉRISATION DES CELLULES ENDOTHÉLIALES Les cellules endothéliales sont des cellules adhérentes qui se disposent en
monocouche. Cette disposition est assurée grâce au phénomène d’inhibition par contact qui
bloque leur croissance quand elles entrent en proximité. Á confluence, leur juxtaposition
forme un tapis arrangé en mosaïque caractéristique des cellules endothéliales. Cette
morphologie permet de les distinguer par exemple des fibroblastes qui sont des cellules
très allongées. Le noyau des cellules endothéliales occupe une position centrale. Dans le
cytoplasme se trouvent des inclusions typiques, les corps de Weibel-Palade. Ce sont des
bâtonnets parallèles au grand axe de la cellule stockant le facteur von Willebrand. Celui-ci
est fondamental pour l’hémostase primaire ainsi que pour l’hémostase secondaire car il
stabilise et transporte le facteur VIII de la coagulation sanguine.
Nous avons vérifié la nature endothéliale de nos cellules en culture par des critères:
⎬ morphologique: au cours de la culture des cellules, l’examen au microscope
inversé à contraste de phase a permis de vérifier l’aspect polygonal arrangé
en mosaïque typique des cellules endothéliales à confluence (Figure 17),
117
Figure 17. Cellules endothéliales de veine de cordon ombilical à environ 75% de
confluence. Les cellules endothéliales vasculaires sont isolées à partir de la veine de cordon
ombilical après digestion à la collagènase IA et ensemencées dans des boîtes de 25cm2 gélatinées
(voir méthodes, paragraphe 2.1, p 101 ). Á confluence, les cellules sont détachées et réensemencées
dans des puits prégélatinés (P1). La photo représente des cellules endothéliales (P1) à 70% de
confluence (microscopie optique, grossissement x 100).
⎬ physiologique: ces cellules synthétisent de la prostacycline, prostanoïde
majeur synthétisé par les cellules endothéliales des macrovaisseaux, et
⎬ immunohistochimique: notre étude par immunofluorescence montre qu’elles
expriment le facteur von Willebrand (Figure 18).
Figure 18. Cellules endothéliales de veine de cordon
ombilical marquées avec un anticorps anti-facteur von
Willebrand couplé à la fluorescéïne. Les cellules sont
cultivées dans des puits (4x 104 cellules/puits) contenant une
lamelle de verre de 12 mm Ø. (voir méthodes, paragraphe
2.1.2, p 102). À confluence, les cellules sont fixées au
paraformaldehyde (3% dans du PBS) et marquées avec
l’anticorps primaire anti-facteur vonWillebrand (voir détails
dans méthodes, paragraphe 2.1.2, p 102). La photo
représente des cellules endothéliales (P1) à 90% de
FvW
118
confluence (microscopie à fluorescence, grossissement x
100).
1.2 AUGMENTATION DE LA SYNTHÈSE DE PROSTACYCLINE
ENDOTHÉLIALE PAR LES LYMPHOCYTES DU SANG
PÉRIPHÉRIQUE. Les résultats d’une étude menée au sein de notre équipe (Merhi-Soussi et al., 2000)
montrent clairement que les cellules endothéliales humaines de veine de cordon ombilical,
incubées à confluence seules pendant 20 h produisent de faibles quantités de prostacycline
(280 ± 24 pg / 105 cellules). Les lymphocytes non activés ou activés pendant 3 jours par la
lectine mitogénique phytohémaglutinine 1µg/ml (PHA) puis lavés et incubés dans les
mêmes conditions, ne produisent pas de quantités détectables de prostacycline. En
revanche, la coincubation des cellules endothéliales et des lymphocytes non activés ou
activés par la PHA augmente significativement la synthèse de prostacycline. Il a été
observé que cette augmentation est fonction du nombre de lymphocytes ajoutés (rapport
lymphocytes/cellule endothéliale (L/HUVEC) 1 à 15 et non dépendante de l’activation
préalable des lymphocytes. Sur la base de ces résultats nous avons décidé de réaliser les
expériences avec un rapport L/HUVEC de 9:1.
1.2.1 ÉTUDE CINÉTIQUE DE LA PRODUCTION DE PROSTACYCLINE INDUITE PAR LES
LYMPHOCYTES.
La synthèse de prostacycline dans les cellules endothéliales peut être rapide (<20
min) ou nécessiter plusieurs heures de stimulation selon les agonistes. Par exemple, la
thrombine et l’histamine induisent une synthèse rapide de prostacycline alors que les
cytokines inflammatoires telles que le TNF, (tumor necrosis factor) et l’IL-1, interleukin-1
augmentent significativement la production de prostacycline après plusieurs heures de
stimulation des cellules endothéliales (Murakami et al., 1993). Afin de déterminer le temps
nécessaire aux lymphocytes pour stimuler la synthèse de prostacycline endothéliale, nous
avons mesuré la production de prostacycline en fonction du temps de contact entre les
deux types cellulaires. Les cellules endothéliales sont incubées seules (condition basale) ou
en présence de lymphocytes (rapport L/HUVEC 9:1). L’augmentation de la synthèse de
prostacycline est significative dès 20 minutes de coincubation (300%) et presque maximale
après 4 h de coincubation (augmentation de 500%) (Figure 19). Une faible augmentation
supplémentaire est observée entre 4 et 20 h de coincubation (20%). Ces résultats montrent
que la stimulation de la synthèse de prostacycline dans les cellules endothéliales par les
119
lymphocytes est un processus rapide. Une cinétique similaire a été observée lors de la
coincubation de cellules endothéliales avec des lymphocytes activés par la PHA (résultats
non montrés).
Figure 19. Cinétique de production de la prostacycline dans les surnageants de
culture des cellules endothéliales coincubées avec les lymphocytes. Les cellules
endothéliales sont incubées seules (HUVEC) (105 cellules/puits) ou en présence de lymphocytes
(rapport L/HUVEC 9:1) dans le milieu de coincubation standard (sans sérum). Les surnageants
sont collectés après 20 min et jusqu’à 20 h de coincubation. Les résultats sont exprimés en pg de 6-
oxo-PGF1α/puits et représentent les moyennes ± SEM des valeurs de 4 expériences indépendantes.
1.2.2 SPÉCIFICITE DE LA RÉPONSE ENDOTHÉLIALE AU CONTACT DES LYMPHOCYTES
Pour établir si la réponse endothéliale aux lymphocytes est due à des interactions
spécifiques entre la surface de ces deux cellules, les HUVEC ont été coincubées avec
d’autres types cellulaires: des polymorphonucléaires, des plaquettes non activées ou avec
un matériel non-biologique tel que les billes de latex.
0
500
1000
1500
2000
2500
6-ox
o-PG
F1α
(pg/
puits
)
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20
Time (h)
HUVEC + L
HUVEC
Temps (h)
120
1.2.2.1 Le contact lymphocyte-HUVEC augmente de façon spécifique la production de
prostyacycline endothéliale.
Les HUVEC sont coincubées dans le milieu de coincubation standard selon le
protocole décrit dans le paragraphe 2.3 p 105 (méthodes) avec des lymphocytes (L), des
plaquettes (PLQ), des polymorphonucléaires (PMN) ou des billes de latex de 2,5 et 9,5 µm
de diamètre. Après 4 h de coincubation, la PGI2 produite lors de la coincubation avec des
cellules autres que les lymphocytes, ou avec des billes de latex ne diffère pas (P > 0,05) de
celle produite dans des conditions basales (HUVEC seules) (Figure 20). Ce résultat
suggère qu’il existe une interaction spécifique entre les lymphocytes et les cellules
endothéliales qui est responsable de l’augmentation de la production de la PGI2 lors de la
coinbutation. Une modeste augmentation, non significative, de la production de PGI2 est
observée lors de la coincubation avec des billes de latex de 2,5 µm. Celle-ci, peut être
considérée comme une réponse au distress cellulaire induite par le contact avec du matériel
non-biologique. En fait, on a constaté par observation au microscope en contraste de phase,
la présence de billes de latex de 2,5 µm à l'intérieur des cellules alors que celles de 9.5 µm
de diamètre n’ont pas été phagocytées. La phagocytose de ces micro-sphères a pu activer,
de façon non-spécifique les HUVEC et augmenter ainsi la synthèse de PGI2. Ces résultats
sont en bon accord avec ceux de Rouzer et al. (1980) qui ont observé chez des
macrophages une augmentation de 2,5 fois de la production de PGE après l’internalisation
de billes de latex.
Figure 20. Effet spécifique des lymphocytes sur la synthèse de prostacycline
endothéliale. Les cellules endothéliales sont incubées seules (Basal) (105 cellules/puits) ou en
présence de lymphocytes, polymorphonucléaires, plaquettes ou billes de latex (2,.5 et 9,5 µm Ø)
(rapport L/HUVEC9:1) dans le milieu de coincubation standard (sans sérum). Les surnageants sont
0
1
2
3
Basal L PMN Plaquettes Latex 2,5 Latex 9,5
6-ox
o PG
F 1a
(aug
men
tatio
n re
lativ
e)
†
121
collectés après 4 h de coincubation pour mesurer la 6-oxo-PGF1α. Les résultats sont exprimés par
rapport à la production basale de PGI2. Les valeurs représentent les moyennes ± SEM des valeurs
de 4-5 expériences indépendantes. Les données ont été analysées par ANOVA et les moyennes sont
comparées par le test de Bonferroni. †P<0.001 vs Basal
1.2.2.2 Caracterisation des lymphocytes adhérents à l’endothélium après la
coincubation.
Les HUVEC sont coincubées dans le milieu de coincubation standard selon le
protocole décrit dans le paragraphe 2.3 p 105 (méthodes) avec des lymphocytes (rapport
L/HUVEC 9:1). Après 1 h de coincubation, les lymphocytes CD8+ sont visualisés par
immunochimie (voir méthods, paragraphe 2.4 p 106). Nous avons constaté que 50% des
lymphocytes adhérents sont CD8+ (Figure 21)
Figure 21. Lymphocytes adhérents aux HUVEC. Les cellules sont cultivées dans des puits
(4x 104 cellules/puits) contenant une lamelle de verre de 12 mm Ø. (voir méthodes, paragraphe
NOYAUXHUVEC
NOYAUXlymphocyte
CD8+
122
2.1.2, p 102). A confluence, les cellules sont fixées au paraformaldehyde (3% dans du PBS) et
marquées avec l’anticorps anti-CD8 et les noyaux sont visualisés avec le colorant Hoechst No
33258 (voir détails dans méthodes, paragraphe 2.4.p 106). La photo représente des cellules
endothéliales (P1) à 90% de confluence et les lymphocytes adhérents (microscopie à fluorescence,
grossissement x 100).
1.3 ÉTUDE DE L’EXPRESSION DES MOLÉCULES D’ADHÉSION
ENDOTHÉLIALE - ECAMS- Les molécules d'adhésion endothéliales sélectines, intégrines et certains membres
de la superfamille des immunoglobulines sont des facteurs d’adhésion vasculaire qui
participent de façon directe ou indirecte à la transduction de nombreux signaux
intracellulaires. Lors de l'adhésion des leucocytes aux cellules endothéliales ces molécules
peuvent activer différentes protéines telle que la PLC γ (Etienne-Manneville et al., 2000) et
voies de signalisation comme la cascade de MAPK (Hu et al., 2000). L'idée d'un effet
régulateur positif sur l'expression des ECAMs induit par certaines sous-populations des
leucocytes circulants est étayée par des résultats expérimentaux. Noble et al. (1996) ont
montré une augmentation de l'expression de la sélectine-E dans des HUVEC induite par
des monocytes humains du sang périphérique. Cet effet est dépendant du contact entre les
deux types cellulaires et partiellement dépendant du TNFα. De même, le caractère
essentiel du contact entre les cellules pour induire l'expression des ECAMs à été aussi
décrit dans des cellules endothéliales de microvaisseaux cérébraux. Les lymphocytes T
activés induisent l’expression de différentes ECAMs (ICAM-1, VCAM-1 et sélectin-E),
cet effet étant là encore partiellement dépendant du TNFα (Lou et al., 1996)
La sélectine-E et VCAM-1 sont des molécules d’adhésion inductibles dont
l’expression est minimale dans des conditions physiologiques alors que ICAM-1 est
exprimée de façon constitutive sur l’endothélium au repos. Pour évaluer l'influence des
lymphocytes sur l'expression de ces molécules d'adhésion, les HUVEC ont été coincubées
pendant 4 h avec des lymphocytes et l’expression des ECAMs a été mesurée par ELISA.
1.3.1 EFFET DU CONTACT LYMPHOCYTE-HUVEC SUR L’EXPRESSION DES ECAMS
Les HUVEC sont coincubées avec des lymphocytes ou incubées avec du LPS (1
µg/mL ou 10 µg/mL) pendant 4 h, temps correspondant à la production maximale de PGI2,
et les ECAMs sont dosées par ELISA selon le protocole décrit dans le chapitre méthodes,
paragraphe 2.9.2, p 114). Les résultats présentes dans le Tableau I montrent que les
123
lymphocytes induisent l’expression de la sélectine-E et que cette expression est similaire à
celle obtenu après traitement par 1µg/mL de LPS. Une expression plus forte de la
sélectine-E est observée avec 10 µg/mL de LPS. De même, l’expression de VCAM-1 et
ICAM-1 augmente de 2 fois après la coincubation avec les lymphocytes et après traitement
au LPS.
Tableau I. Effet de la coincubation avec des lymphocytes ou de la stimulation avec du
LPS durant 4 h sur l’expression des ECAMs des cellules endothéliales
Les HUVEC ont été incubées dans le milieu de coincubation standard (sans sérum) toutes
seules (témoins) ou avec des lymphocytes (rapport L/HUVEC 9:1) ou du LPS (1µg/mL) ou
10µg/mL pendant 4 h à 37 °C dans des conditions statiques (voir méthodes, paragraphe 2.3, p 105).
Les monocouches sont lavées et incubées avec des anticorps anti-sélectine-E, VCAM-1 ou VCAM-
1 durant 1 h à 37 °C et l’expression des ECAMs est déterminée par EIA (voir méthodes,
paragraphe 2.9.2, p 114). Les valeurs représentent les moyennes ± SEM des valeurs de 3
DENSITÉ OPTIQUE SP ÉCIFIQUE (UNITES ARBITRAIRES)
TRAITEM ENT Sélectine-E VCAM -1 ICAM -1
HUVEC seules 0,02 ± 0,01 0,53 ± 0,12 0,94 ± 0,13
HUVEC + L 0,78 ± 0,13*(39)
1,11 ± 0,04*(2,1)
1,73 ± 0,10*(1,8)
HUVEC + LPS1 µg/mL
0,58 ± 0,09*
(29)
0,76 ± 0,11
(1,4)
1,41 ± 0,18*
(1,5)
HUVEC + LPS10 µg/mL
1,07 ± 0,18*
(53)
1,12 ± 0,18*
(2,1)
1,48 ± 0,18*
(1,6)
124
expériences indépendantes. Les données ont été analysées par ANOVA et les moyennes sont
comparées par le test de t de Fisher *P<0,05 vs la valeur correspondant aux HUVEC incubées
seules. Les chiffres entre parenthèses correspondent au facteur de multiplication de l’expression par
rapport aux HUVEC témoins.
1.4 BLOCAGE DES MOLÉCULES D’ADHÉSION ENDOTHÉLIALES-
ECAMS- Le contact lymphocytes-cellules endothéliales est nécessaire pour observer l’effet
activateur des lymphocytes sur la synthèse de prostacycline endothéliale (Merhi-Soussi et
al., 2000). En effet, quand les lymphocytes sont incubés dans des inserts microporeux à
distance des cellules endothéliales, il n’y a pas d’augmentation de la synthèse de la PGI2.
Ces inserts empêchent le contact entre les cellules endothéliales et les lymphocytes mais
permettent le passage de molécules solubles telles que les cytokines. Ces observations
indiquent que le contact cellule/cellule est une condition essentielle pour déclencher la
réponse endothéliale. Afin de déterminer si l’effet des lymphocytes sur la synthèse de
prostacycline endothéliale dépend des ECAMs, trois des principales molécules d’adhésion
endothéliales, sélectine-E, VCAM-1 et ICAM-1 ont été bloquées avec des anticorps
monoclonaux bloquants lors de la coincubation lymphocyte-HUVEC
1.4.1 ÉTUDE DU BLOCAGE DE LA SÉLECTINE-E, VCAM-1 ET ICAM-1
Afin de préciser quelle molécule d’adhésion pourrait être impliquée dans ce
mécanisme de production de prostacycline dépendant du contact, les principales molécules
d'adhésion sélectine-E, VCAM-1 ou ICAM-1 ont été bloquées indépendamment.
Les HUVEC sont incubées séparément avec chacun des anticorps anti-ECAMs pendant 30
min à 37 °C. Ensuite, elles sont coincubées, toujours en présence de l’anticorps, avec des
lymphocytes préalablement marqués au 51Cr (selon les protocoles décrits dans la partie II,
méthodes paragraphes 2.6, p 107 et 2.9.1 p 113). Après 4 h de coincubation, les
surnageants sont récupérés pour mesurer la 6-oxo-PGF1α, témoin de la production de
prostacycline, et la radiactivité du 51Cr, dans les lysats cellulaires, directement
proportionnelle à la quantité de lymphocytes ayant adhéré aux HUVEC.
1.4.1.1 Effet du blocage des ECAMs sur l’adhésion des lymphocytes
Le pourcentage de lymphocytes adhérant aux cellules endothéliales dans nos
conditions expérimentales représente en moyenne 12% du total des lymphocytes ajoutés.
125
Cette valeur est considérée comme le 100% d'adhésion des lymphocytes aux HUVEC
témoins, non traitées par les anticorps bloquants.
Le blocage de la sélectine-E ou de VCAM-1 avec les anticorps H18/7 et E1/6,
respectivement ne modifie pas significativement l’adhésion des lymphocytes aux cellules
endothéliales; (86 et 71 % du témoin, respectivement (P >0,05). Le faible effet des
anticorps bloquants anti-selectine-E et anti-VCAM-1 ne peut pas être expliqué par
l’absence ou l’expression minimale de ces molécules d’adhésion dans des HUVEC non-
activées puisque leur expression augmente lors de la coincubation avec des lymphocytes.
D'autre part, l’adhésion diminue significativement quand ICAM-1 est bloqué avec
l’anticorps anti-ICAM-1, HU5/3. Dans ces conditions, l’adhésion des lymphocytes aux
HUVEC représente 66% de celle obtenue avec des HUVEC contrôles non traitées.
(P<0,05) (Figure 22).
Figure 22. Effet du blocage des ECAMs sur l’adhésion des lymphocytes aux HUVEC.
Les HUVEC sont incubées pendant 30 min à 37 °C avec 300 µL du surnageant d’hybridome
contenant l’anticorps monoclonal H18/7 (anti-Sélectine-E), E1/6 (anti-VCAM-1) ou HU5/3 (anti-
ICAM-1). Les lymphocytes sont marqués pendant 1h avec 925 KBq de Na251CrO4/106 cellules à
37°C. Après 3 lavages, 200 µL de la suspension de lymphocytes resuspendus à une concentration
de 4,5x106 cellules/mL sont ensuite ajoutés (rapport L/HUVEC 9:1) aux HUVEC préalablement
bloquées et aux HUVEC témoins. Après 4 h de coincubation dans des conditions statiques, les
puits sont lavés trois fois avec du PBS pour éliminer les lymphocytes non adhérents. Les
lymphocytes adhérents (plus cellules endothéliales) sont lysés et la radioactivité est comptée.
L’adhésion est exprimée en pourcentage par rapport à l’adhésion des lymphocytes aux HUVEC
contrôles considérée égale à 100. Les valeurs représentent les moyennes ± SEM de 6 expériences
0
20
40
60
80
100
120
Témoin anti-sélectine-E anti-VCAM-1 anti-ICAM-1
Adh
esio
n(%
du
tém
oin) *
126
indépendantes. Les données ont été analysées par ANOVA et les moyennes comparées par un test
de t de Fisher. *P<0,05 vs la valeur correspondant au témoin.
1.4.1.2 Effet du blocage des ECAMs sur la production de prostacycline endothéliale
induite par les lymphocytes.
La coincubation des lymphocytes avec des HUVEC augmente de 2,5 fois (P<0,01)
la production de PGI2 par rapport à celle obtenue avec des HUVEC incubées seules. Cet
effet n’est pas modifié par les différents anticorps bloquants utilisés (Figure 23).
Particulièrement, le blocage d’ICAM-1 qui diminuait significativement l’adhésion des
lymphocytes aux HUVEC n’a pas altéré la production de PGI2 induite par les lymphocytes.
Ce résultat indique que la production de PGI2 induite par les lymphocytes est indépendante
des molécules d'adhésion considérées dans cette étude.
Figure 23. Effet du blocage des ECAMs sur la production de prostacycline
endothéliale induite par les lymphocytes. Les HUVEC sont incubées pendant 30 min à 37°C
avec 300 µL de surnageant d’hybridome contenant l’anticorps monoclonal H18/7 (anti-sélectine-
E), E1/6 (anti-VCAM-1) ou HU5/3 (anti-ICAM-1). Ensuite, 200 µL de la suspension de
lymphocytes à une concentration de 4,5x106 cellules/mL sont ajoutés (rapport L/HUVEC 9:1) aux
HUVEC préalablement bloquées et aux HUVEC témoins. Après 4 h de coincubation les
surnageants sont collectés pour mesurer la 6-oxo-PGF1α. Les résultats sont exprimés par rapport à
la production basale de PGI2 considérée comme égale à 1. Les valeurs représentent les moyennes ±
SEM de 6 expériences indépendantes. Les données ont été analysées par ANOVA et les moyennes
sont comparées par un test de t de Fisher.
0
1
2
3
4
Basal L anti -Sé le ctine -E anti -VC AM-1 anti -IC AM-1
6-ox
o PG
F 1α
(aug
men
tatio
n re
lativ
e
Basal
C oincubation * * * *
127
1.5 EFFET DE LA COINCUBATION LYMPHOCYTES-HUVEC DANS
DES CONDITIONS DE ROTATION CONTINUE Les cellules endothéliales vasculaires sont influencées in vivo par deux types de
forces hémodynamiques, la tension circulaire (cyclical strain) due à la distension de la
paroi vasculaire induite par la pression transmurale, et les forces de cisaillement (shear
stress) générées par la friction du flux sanguin. Ces forces agissent sur la surface apicale
des cellules et les orientent dans la direction du flux (Fig. 2. Partie I, paragraphe 1, p 31).
In vitro, les forces de cisaillement induisent une réorganisation rapide du cytosquelette et
l'activation de différentes cascades de signalisation dans les cellules endothéliales qui
conduit à la libération de NO et PGI2 (Fisslthaler et al., 2000; Bhagyalakshmi et Frangos,
1989; Hanada et al., 2000). La régulation positive de l'expression des ARNm des PGHS,
PGHS-1 et PGHS-2 par les forces de cisaillement a été décrite (Doroudi et al., 2000;
McCormick et al., 2000).
Nous avons comparé la production de PGI2 induite par le contact des lymphocytes
dans des conditions statiques et non-statiques (voir protocole décrit dans la partie II
méthodes, paragraphe 2.3.1 rotation continue, p 106). Quand les HUVEC (seules) sont
incubées pendant 4 h dans des condition non-statiques la production basale de PGI2 est
légèrement augmentée (30%) par rapport à celle mesurée en condition statique. De même,
la production de PGI2, induite par les lymphocytes est légèrement supérieure quand la
coincubation lymphocytes-HUVEC est réalisée dans la condition de rotation continue
(Figure 24 ).
Figure 24. Effet de la coincubation Lymphocytes-HUVEC en condition de rotation continue
sur la production de PGI2 induite par les lymphocytes. Les HUVEC sont incubées seules (basal)
dans le milieu de coincubation standard ou coincubées avec des lymphocytes (rapport L/HUVEC 9:1) en
condition statique ou sur une plate-forme de rotation continue (9 révolutions par minute), à 37 °C pendant 4 h
0
1
2
3
Statique Rotation Statique Rotation
6-ox
o-PG
F 1α
(aug
men
tatio
n re
lativ
e)
Basal Coincubation
**
128
et la 6-oxo-PGF1α est mesurée dans les surnageants de culture. Les résultats sont exprimés par rapport à la
production basale de PGI2 considérée comme égale à 1. Les valeurs représentent les moyennes ± SEM de 3
expériences indépendantes. Les données ont été analysées par ANOVA et les moyennes comparées par le test
de t-Scheffé. *P< 0,05 par rapport à la valeur basale dans la condition statique.
Ce résultat suggère que les effets de la rotation et du contact des lymphocytes sont
additifs et que l’effet des lymphocytes per se n’est pas modifié dans des conditions qui
miment les forces de cisaillements.
1.6 CONCLUSIONS ET DISCUSSION A l’aide d’un modèle in vitro nous avons étudié l’effet du contact entre les
lymphocytes humains et l'endothélium de moyens vaisseaux. Comme approche de
l’interaction de ces cellules in vivo, nous avons coincubé des lymphocytes provenant du
sang périphérique avec des cellules endothéliales isolées de la veine du cordon ombilical.
Les résultats présentés dans ce chapitre montrent que les lymphocytes humains sont
capables de stimuler la production de prostacycline par les HUVEC. Cette réponse
physiologique est observée lors de la coincubation dans un milieu dépourvu de sérum et
sans activation préalable des cellules. L’effet stimulateur des lymphocytes sur la synthèse
de prostacycline endothéliale est un processus rapide. Le résultat de l’étude cinétique
réalisée entre 20 min-20h, montre qu'il n’y a pas de variation de la production basale de
PGI2 quand les HUVEC sont incubées seules. Par contre, en présence de lymphocytes 60%
de la réponse maximale sont déjà obtenus après 60 min de coincubation et le maximum est
observé après 4 h de coincubation (Figure 19, p 119). Cette cinétique est différente de
celle observée par Hakkert et al., (1992) lors de la coincubation des HUVEC avec des
monocytes humains. En effet, dans le cas des monocytes, 4 h de coincubation sont
nécessaires pour observer une augmentation significative de la synthèse de prostacycline et
le pic maximal de la réponse apparaît après 24 h de coincubation (Hakkert et al., 1992). La
comparaison des deux cinétiques suggère fortement que l’augmentation de la synthèse de
PGI2 endothéliale induite par le contact des cellules mononucléées, lymphocyte ou
monocyte, met en jeu des mécanismes différents.
Même si le contact lymphocytes–cellules endothéliales est capable d’induire la
synthèse de cytokines telles que l’IL-2 et l’INF-γ (Johnson et al., 1998), nos résultats
suggèrent que l’effet de la coincubation lymphocytes-HUVEC sur la synthèse de
prostacycline n’implique pas de cytokines. Premièrement, l’étude cinétique montre une
129
augmentation très rapide de la synthèse de prostacycline qui est déjà significative après 20-
30 minutes de coincubation. Ce résultat exclut l’effet de cytokines dont la synthèse requiert
plusieurs heures. De plus, aucune augmentation de synthèse de prostacycline n’est
observée lorsque les lymphocytes sont coincubés à distance des cellules endothéliales
(Merhi-Soussi et al., 2000). De même aucune induction de la PGHS-2 endothéliale,
isoforme inductible par les cytokines (Ristimäki et Viinikka., 1992; Mantovani et al., 1992;
Rossi et al., 1985), n’a pu être observée dans les lysats de cellules endothéliales après
coincubation avec des lymphocytes (Merhi-Soussi et al., 2000).
Nous pouvons conclure que l’augmentation de la synthèse de prostacycline lors de
la coincubation des lymphocytes avec les cellules endothéliales n’implique pas une
synthèse de cytokines solubles mais implique le contact direct entre les deux types
cellulaires. Ceci n’exclut pas un effet éventuel de cytokines fortement liées à la surface des
lymphocytes ou de cytokines transmembranaires. En effet, il a été montré que les
lymphocytes humains expriment une forme transmembranaire de la cytokine TNFα,
capable d’induire l’expression du facteur tissulaire dans les HUVEC via des interactions
avec le récepteur endothélial du TNFα de masse moléculaire 75 kDa (Reverdiau-Moalic et
al., 1998). Il faut noter que la synthèse du facteur tissulaire requiert, comme la synthèse de
PGI2, un contact direct entre les lymphocytes et les HUVEC et exige un temps
d’interaction de 4 h pour une synthèse maximale. D’autre part, le contact entre cellules est
essentiel pour induire l’expression des ECAMs ainsi que la production d’IL6 et IL8. Dans
un modèle de cellules endothéliales de microvaisseaux cérébraux humain en contact avec
des lymphocytes activés, le TNF-transmembranaire exprimé sur les lymphocytes active les
cellules endothéliales (Lou et al., 1996). Nous ne pouvons donc pas exclure la possibilité
d’une interaction entre le TNF membranaire lymphocytaire et son récepteur sur les
HUVEC qui activerait une cascade de signalisation conduisant à la synthèse de PGI2.
Compte tenu du besoin de contact direct entre les deux types cellulaires dans le
mécanisme d’augmentation de la PGI2 nous avons vérifié la spécificité des lymphocytes
sur cette réponse endothéliale. La coincubation des HUVEC avec des cellules
polymorphonucléaires (PMN), des plaquettes non activées ou des billes de latex
(microsphères de 2,5 ou 9,5 µm de ∅) n’induit pas de synthèse de PGI2 contrairement à ce
qui est observé avec les lymphocytes. La concentration de PGI2 est restée du même ordre
que celle observée dans les conditions basales (HUVEC seules), particulièrement quand les
HUVEC ont été coincubées avec des plaquettes (Figure 20, p 120). Schaub et al. (1990)
130
ont montré une augmentation de la synthèse de PGI2 lors de la coincubation (0-4h)
d’HUVEC avec une suspension de leucocytes (PMN 80-85%, monocytes 15-20%). Dans
leurs expériences, 4 h de coincubation sont nécessaires pour augmenter de 2-3 fois la
production endothéliale de PGI2. En outre, l'effet des leucocytes est indépendent du contact
entre les cellules car il est conservé quand les cellules ont été séparées par un insert (0,4
µm). Les auteurs attribuent la hausse de PGI2 à l’IL-1 produite par les monocytes, les PMN
ou la combinaison des deux. L’absence de réponse endothéliale aux PMN que nous avons
observée démontre d’une part l’absence de monocytes dans notre préparation et d’autre
part indique que s’il y a eu production d’IL-1 par les PMN, celle ci, a été insuffisante pour
augmenter significativement la synthèse de PGI2.
En revanche, le contact lymphocytes-HUVEC augmente de 2,5 fois la production
basale de PGI2 lors de la coincubation. Cette augmentation semble être dépendante des
interactions spécifiques entre les lymphocytes et les HUVEC et non pas d'une interaction
non-spécifique imposée par le contact physique dans les puits. Ce résultat suggère que dans
des conditions statiques, le contact lymphocytes-HUVEC est capable d’activer
l’endothélium. En effet, l’expression des molécules d’adhésion endothéliales inductibles
telles que la sélectine-E et VCAM-1, ainsi que celle d’ICAM-1, molécule constitutive,
augmente lors de la coincubation avec des lymphocytes. L’effet du contact des
lymphocytes sur l’expression des ECAMs est similaire à celui observé pour le LPS. Les
lymphocytes et le LPS, augmentent de 2 fois l’expression de VCAM-1 et ICAM-1 et
stimulent très fortement l’expression la sélectine-E (Tableau I, p 123 ). Ces résultats
indiquent que les HUVEC s’activent au contact des lymphocytes. Ces résultats sont en bon
accord avec ceux de Doukas et Pober (1990) montrant une induction de l’expression
d’ICAM-1 ainsi que d'autres marqueurs d’activation endothéliale telles que les molécules
de classe I et II du complexe majeur d’histocompatibilité sur des HUVEC mise au contact
de lymphocytes. En outre, Reverdiau-Moalic et al. (1998) ont montré dans des conditions
proches des nôtres, une augmentation de l’expression du facteur tissulaire, un autre
indicateur d’activation de l’endothélium, lors de la coincubation de cellules endothéliales
avec des lymphocytes.
Etant donné que le contact spécifique lymphocytes/cellules endothéliales est
essentiel pour déclencher la synthèse de PGI2, et que l’expression des ECAMs est régulée
positivement par le contact des lymphocytes, nous avons recherché si ces molécules
d’adhésion sont impliquées dans le mécanisme de production de PGI2 induite par les
lymphocytes.
131
A l’aide d'anticorps monoclonaux anti-ECAMs nous avons montré que seule le
blocage d’ICAM-1 inhibe significativement l’adhésion des lymphocytes aux HUVEC. Le
blocage spécifique de VCAM-1 ou de la sélectine-E est sans effet. Des résultats similaires
montrant que anti-VCAM-1 ou anti-sélectine-E n’ont pas d’effet sur l’adhésion des
lymphocytes T, activés par la PMA à des HUVEC non activées ont été décrits par Shimuzu
et al (1990). En revanche, le blocage de LFA-1, le contre-récepteur d’ICAM-1, inhibe
efficacement l’adhésion. Néanmoins, il a été aussi montré que le blocage d’ICAM-1 sur
des HUVEC non activées, n’a pas d’effet sur l’adhésion des lymphocytes (Dustin et
Springer, 1988). Cette différence d’effet pourrait être liée à l’état fonctionnel des cellules
endothéliales. Dustin et Springer, (1988) ont utilisé des cellules au passage 25, alors que
dans nos expériences les HUVEC ont toujours été utilisées au premier passage. Dans nos
conditions, la densité des molécules d’ICAM-1 qui est encore augmentée par le contact des
lymphocytes peut être suffisante pour observer une inhibition significative avec l’anticorps
monoclonal anti-ICAM-1.
L’inefficacité des anticorps monoclonaux anti-VCAM-1 et anti-sélectine-E pour
diminuer l’adhésion des lymphocytes à l’endothélium n’exclut pas la possibilité que ces
molécules d’adhésion soient effectivement utilisées durant le processus complexe
d’adhésion. Nos résultats suggèrent que l’interaction entre les intégrines CD11a/CD18
exprimées sur les lymphocytes et leur contre-récepteur endothélial ICAM-1 a un rôle
important dans l’adhésion de lymphocytes au repos à des HUVEC non activées
préalablement. Contrairement, aux résultats observés sur l’adhésion aucun des anticorps
monoclonaux bloquants utilisés dans notre étude n'a été efficace pour bloquer la synthèse
de PGI2 déclenchée par les lymphocytes. Ce résultat suggère que les molécules d’adhésion
qui ont été évaluées dans cette étude ne participent pas à la cascade de signalisation qui
déclenche la synthèse de PGI2 suite au contact des lymphocytes. Pourtant, dans le
mécanisme de production de PGI2 induit par les lymphocytes, le contact lymphocytes-
HUVEC est un pré-réquis. D’autres molécules probablement exprimées de façon sélective
par les lymphocytes et non par les PMN ou les plaquettes au repos pourraient expliquer
cette réponse endothéliale dépendante du contact. Ce mécanisme semble être indépendant
de facteur solubles, comme l’IL-1, qui induisent une réponse plus tardive. Six heures sont
nécessaires à l’IL-1 pour induire la synthèse de PGI2 dans des cellules endothéliales
(Dejana et al., 1984; Rossi et al., 1985).
D’autre part, il est bien connu que l’exposition des cellules endothéliales aux forces
de cisaillement induit une réponse rapide impliquant la régulation ou la réorganisation de
132
protéines préexistantes, suivie par une réponse moléculaire plus tardive mettant en jeu la
modulation de l’expression de gènes et une synthèse subséquente de protéines (Topper et
Gimbrone, 1999; Bongrazio et al., 2000). Parmi les réponses aiguës qui apparaissent dans
les secondes ou minutes l’augmentation rapide et de courte durée de la production de PGI2
a été bien caractérisée dans les cellules endothéliales provenant de différentes sources et
sous différentes conditions expérimentales. Il a été montré que les BAEC répondent aux
augmentations de forces de cisaillement par une surproduction de PGI2 maximale dans les
deux minutes et qui décline ensuite à la concentration basale (Grabowski et al., 1985). De
façon similaire, dans des HUVEC soumises à une force de cisaillement constante, deux
phases de production de PGI2 sont observées. L’augmentation initiale et transitoire est
suivie par une production soutenue de plusieurs fois supérieure à la production basale
(Bhagyalakshmi et Frangos, 1989). Dans des HUVEC perfusées avec différents gradients
de force de cisaillement pendant une période de 6 h, le taux de PGI2 augmente seulement
durant la première heure de perfusion (Doroudi et al., 2000). Lorsque les HUVEC sont
placées sur une plate-forme de rotation continue à 9 r.p.m pendant 4 h en absence de
lymphocyte une augmentation modérée (30%) de la production de PGI2 est observée par
rapport aux témoins incubés dans des conditions statiques. De plus, une augmentation de
l’effet stimulateur des lymphocytes sur la production de PGI2 est observée quand la
coincubation est réalisée en rotation continue par rapport à la coincubation statique (Figure
24, p 127). Donc, l’effet de conditions dynamiques de culture mimant les forces de
cisaillement et celui des lymphocytes semblent être additifs en terme de synthèse de PGI2.
Par ailleurs, il a été montré que la production de PGI2 dans les BAEC stimulées par l’acide
arachidonique exogène est similaire quelle que soit les conditions de culture, statiques ou
en présence des forces de cisaillement (Grabowski et al., 1985). Nos résultats suggèrent
que le stress mécanique et les lymphocytes activent des voies de signalisation différentes
qui convergent dans la libération de l’acide arachidonique. En effet, la production de PGI2
induite par les lymphocytes n’est pas sensible à l’inhibiteur de DAG lipase RHC80267
(Merhi-Soussi et al., en préparation) tandis que l’induction due aux forces de cisaillement
y est très sensible (-66%) (Hagyalakshmi et Frangos, 1989). Ces auteurs ont aussi montré
que les forces de cisaillement stimulent le turnover des phospholipides et activent la
phospholipase C PI-spécifique (Bhagyalakshmi et al., 1992). Nous avons observé que
l’effet stimulateur induit par les lymphocytes est dépendant de PI-PLC. Cependant le DAG
n’est pas la source d’acide arachidonique (Merhi-Soussi et al., en préparation). Donc, le
stimulus mécanique peut induire la libération d’arachidonate par activation de PI-PLC et
133
hydrolyse du DAG par la DAG lipase, alors que les lymphocytes activent essentiellement
la phospholipase A2 cytosolique (Merhi-Soussi et al., 2000). La participation de PI-PLC
dans nos conditions peut être liée à la production d’IP3 et à l’augmentation de Ca2+
intracellulaire car la synthèse de PGI2 induite par les lymphocytes est complètement
dépendante du calcium comme nous l’avons montré précédemment (Merhi-Soussi et al.,
2000).
Compte tenu de l’activation du métabolisme de l’acide arachidonique vers la
production de PGI2 endothéliale induite par le contact spécifique des lymphocytes, nous
avons émis l’hypothèse que le contact direct lymphocytes/cellules endothéliales augmente
l’activité de la cPLA2 par la voie de la MAPkinase. Les travaux réalisés pour tester cette
hypothèse sont rapportés dans le chapitre suivant (chapitre 2).
134
Chapitre 2. DÉTERMINATION DES VOIES DE SIGNALISATION
IMPLIQUÉES DANS LA SYNTHÈSE DE PROSTACYCLINE
INDUITE PAR LE CONTACT LYMPHOCYTES-CELLULES
ENDOTHÉLIALES.
En réponse à de nombreux agonistes, la phospholipase A2 cytosolique (cPLA2)
libère sélectivement l’acide arachidonique de la position sn-2 des phospholipides
membranaires. Cette enzyme, qui fonctionne en présence de quantités submicromolaires de
Ca2+, est considérée comme la principale responsable de la libération de l’acide
arachidonique. L’activité cPLA2 représente la voie enzymatique la plus directe de
libération de l’acide arachidonique, substrat principal pour la biosynthèse des eicosanoïdes.
Certaines études réalisées sur différents types cellulaires (Seufferlein et Rozengurt,
1994; Cazaubon et al., 1993) incluant les cellules endothéliales (Fleming et al., 1995)
indiquent que les agonistes qui opèrent via des récepteurs couplés aux protéines G
augmentent aussi la phosphorylation de l’isoforme p42 MAPK (mitogen-activated protein
kinases). En plus, quelques études ont montré que la cPLA2 est un substrat des p42/p44
MAP-Kinases. D’ailleurs, il a été montré dans des HUVEC que la production de PGI2
induite par la thrombine, activateur connu de la cPLA2 dans les plaquettes (BorshHaubold
et al., 1995; Kramer, et al., 1996) est complètement supprimée par l’inhibiteur spécifique
de MAPKKinase (MAPKK ou MEK), le composé PD98059 (Wheeler-Jones et al., 1997).
Les mêmes auteurs suggèrent que l’activation de cPLA2 et la synthèse de PGI2 induite par
le VEGF sont dépendantes de la voie de signalisation p42/p44 MAPK.
2.1 ÉTUDE DE L’IMPLICATION D’UNE VOIE PROTÉINE G-TYROSINE-
KINASE-MAPK DANS LA SYNTHÈSE DE PGI2 ENDOTHÉLIALE INDUITE
PAR LE CONTACT DES LYMPHOCYTES.
Nos résultats précédents confirment l’hypothèse de la spécificité du contact des
lymphocytes dans le mécanisme de production de PGI2 endothéliale. Cependant, ces
résultats montrent que les récepteurs impliqués dans ce mécanisme dépendant du contact
sont distincts des ECAMs étudiées dans la première partie de ce travail. Nous avons
examiné, dans un second temps, la possibilité que le mécanisme de signalisation mettre en
jeu des récepteurs liés aux protéines G, l’activation des protéines tyrosine-kinases et la
135
phosphorylation des MAPK. Dans ce but, les cellules endothéliales ont été traitées avec
des inhibiteurs des voies potentiellement impliquées et la phosphorylation de
p42/p44MAPK a été évaluée par immunoempreinte (western blotting).
2.1.1 EFFET DE L’INHIBITION LIGANDS-RECEPTEURS ET DE L’INHIBITION DES PROTÉINES
Gi.
Plusieurs types cellulaires répondent aux ligands de récepteurs couplés aux
protéines G, tels que la thrombine, l’histamine et aux récepteurs à activité tyrosine kinase
par une production immédiate et de courte dure d’eicosanoïdes, incluant la PGI2.
Certains ligands de récepteurs couplés à la protéine Gi stimulent les MAP kinases
par différents mécanismes (English et al., 1999). Ainsi la p42/p44MAPK est activée par de
nombreux agonistes tels que la vasopressine, l’angiotensine II, les agonistes α-
adrénergiques ou l’acide lysophosphatidique par une voie sensible à la toxine pertussique
(PTX) (Melien et al., 1998; Mclees et al.,1995). De plus, la capacité d’activation de
MAPK par des protéines G, du type Gi et Gq est réduite si les cellules n’ont pas de
tyrosine kinase de la famille Src (Wan et al., 1996). Afin de préciser si les interactions
ligands-récepteurs et la signalisation via des récepteurs couplés aux protéines Gi sont
potentiellement impliquées dans la réponse endothéliale observée dans notre système de
coincubation lymphocytes-HUVEC, nous avons bloqué, à l’aide de la suramine, les
interactions ligands-recepteurs entre les surfaces de deux types cellulaires et nous avons
inhibés les protéines Gi par la toxine pertussique (PTX), (voir protocoles décrits dans la
Partie II méthodes, paragraphe 2.5.1, p 107).
Les résultats montrent que chez les HUVEC incubées seules, la présence continue
de suramine dans le milieu de coincubation ou le pré-traitement avec la PTX ne modifie
pas la production de PGI2 basale. Par contre, la suramine bloque complètement l’effet
inducteur des lymphocytes sur la synthèse de PGI2 (Figure 25). Ceci indique que des
interactions ligands-récepteurs sont primordiales dans le mécanisme dépendant du contact
des lymphocytes. En revanche, lors de la coincubation avec les lymphocytes le pré-
traitement des HUVEC avec la PTX n’inhibe pas l’effet activateur des lymphocytes sur la
production de PGI2 (-20%) ce qui indique que la synthèse de PGI2 induite par les
lymphocytes ne suit pas une voie sensible à la PTX.
136
Figure 25. Effet de l’inhibition ligands-récepteurs et de l’inhibition des protéines Gi.
Les HUVEC sont cultivées dans des plaques de 24 puits jusqu’à 90% confluence. Ensuite, elles
sont pre-traitées pendant 30 min à 37 °C avec la suramine, 1mmole/L ou la PTX, 50 ng/mL. Les
HUVEC témoins sont incubées pendant la même période de temps sans inhibiteur. Les
lymphocytes sont ajoutés pour la coincubation (rapport L/HUVEC 9:1) qui est maintenue pendant
4 h à 37 °C. La Suramine est maintenue dans le milieu pendant la coincubation avec les
lymphocytes. La PTX est éliminée par lavage avant la coincubation. Les milieux de culture sont
récupérés, et la 6-oxo-PGF1α est mesurée dans les surnageants par EIA. Les valeurs représentent les
moyennes ± SEM de 3 expériences indépendantes. Les données sont analysées par ANOVA et les
moyennes sont comparées par le test-t de Fisher. * P<0.05 vs la valeur correspondant au témoin
dans la condition basale.
2.1.2 EFFET DE L’INHIBITION DES PROTEINES TYROSINE KINASES ET DE TYROSINE
KINASES DE LA FAMILLE Src.
Les protéines tyrosine kinases sont impliquées dans une diversité de voies de
signalisation cellulaire. La famille des protéines tyrosine kinase Src est activée par
différents stimuli tels que la thrombine (Liebenhoff et al., 1993; Chen et al.,1994), la
bradykinine (Lee et Villereal, 1996), le VEGF (He et al, 1999). Ces stimuli ont en commun
la capacité d’induire la synthèse de PGI2.
Afin de préciser si la signalisation induite par le contact des lymphocytes implique
les protéines tyrosine kinases et plus spécifiquement celles de la famille Src, nous avons
traité les cellules endothéliales avec la génistéine qui est un inhibiteur spécifique de
tyrosine kinase à large spectre fonctionnant par compétition directe avec l’ATP et
parallèlement, nous avons inhibé la voie de Src avec le PP1 qui est un inhibiteur sélectif de
la famille Src-tyrosine kinase.
0
400
800
1200
1600
Basal (HUVEC)
Coincubation(HUVEC+L)
6-ox
o-PG
F 1α
(pg
/pui
ts)
TémoinSuraminePTx
**
137
Les résultats montrent que le traitement des HUVEC avec les inhibiteurs ne modifie
pas la production basale de PGI2. En revanche, la génistéine aussi bien que le PP1 inhibent
fortement (-88 et -90%, respectivement) l’effet stimulateur des lymphocytes (Figure 26).
Ceci indique un rôle essentiel des protéines tyrosine kinases et particulièrement la famille
Src dans le mécanisme de production de PGI2 induit par le contact des lymphocytes.
Figure 26. Effet de l’inhibition des protéine tyrosine kinases et de tyrosine kinases de
la famille Src. Les HUVEC sont cultivées dans des plaques de 24 puits jusqu’à 90% confluence.
Ensuite, elles sont pre-traitées pendant 30 min à 37 °C avec la génistéine (0,1mmol/L) ou le PP1
(50 µmoles/L) concentration finale. Les HUVEC témoins sont incubées pendant la même période
de temps sans inhibiteur. Les lymphocytes sont ajoutés pour la coincubation (rapport L/HUVEC
9:1) qui est maintenu pendant 4 h à 37 °C. La génistéine est maintenue dans le milieu pendant la
coincubation avec les lymphocytes. Le PP1 est éliminée par lavage avant la coincubation.. Les
milieux de culture sont récupérés, et la 6-oxo-PGF1α. est mesurée dans les surnageants par EIA. Les
valeurs représentent les moyennes ± SEM des 3 expériences indépendantes. Les données sont
analysées par ANOVA et les moyennes sont comparées par le test-t de Fisher. *P<0.05 vs la valeur
correspondant au témoin dans la condition basale.
2.1.3 EFFET DE L’INHIBITION DE LA MAP KINASE KINASE ET MISE EN ÉVIDENCE DE LA
PHOSPHORYLATION DE P42/P44MAPK PAR IMMUNOEMPREINTE
Nous avons montré (Merhi-Soussi et al., 2000) que la cPLA2 est la principale
phospholipase engagée dans la synthèse de PGI2 induite par les lymphocytes. La voie en
amont de la cPLA2 peut être la p42/p44MAPK car la cPLA2 a été décrite comme un
substrat de cette enzyme (Leslie, 1997;. Sa et al., 1995). La MAPKK active la p42MAPK
(Berck et al., 1995) et son inhibition résulte en une inhibition de p42MAPK. Pour évaluer
si la cascade de la MAPK est impliquée dans l’activation de la cPLA2 déclenchée par le
0
400
800
1200
1600
Basal(HUVEC)
Coincubation(HUVEC+L)
TémoinGénistéine
PP1
*
6-ox
o-PG
F 1a
(pg/
puits
)
138
contact des lymphocytes, les HUVEC sont pré-traitées avec l’inhibiteur de MAPKK
PD98059 avant leur coincubation avec les lymphocytes. Ce composé prévient l’activation
de p42/p44MAPK qui phosphoryle à son tour des substrats spécifiques in vitro ainsi que
dans des cellules intactes (Dudley et al., 1995., Alessi et al., 1995). Les résultats de la
figure 27 indiquent que le pré-traitement avec l’inhibiteur de MAPKK diminue
significativement la synthèse de PGI2 induite par le contact des lymphocytes. En plus, cette
synthèse est totalement supprimée quand l’inhibiteur est maintenu dans le milieu de
coincubation. Ces résultats suggèrent que les lymphocytes sont capables d’induire la
phosphorylation et l’activation de p42/44MAPK dans les cellules endothéliales.
Figure 27. Effet de l’inhibition de la MAP kinase kinase. Les HUVEC à 90% confluence sont
pre-traitées pendant 30 min à 37 °C avec 25 µmoles/L de PD98085 concentration finale. Les
lymphocytes sont ajoutés (L/HUVEC 9:1) et la coincubation est maintenue pendant 4 h à 37 °C en
absence ou présence de l’inhibiteur. Les milieux de culture sont récupérés, et la 6-oxo-
PGF1α. est mesurée dans les surnageants par EIA. Les résultats sont exprimés en pg de 6-oxo-
PGF1α et sont les moyennes ± SEM de 5 expériences indépendantes. Les données sont analysées
par ANOVA et les moyennes sont comparées par le test-t de Scheffé. *significativement différent
des HUVEC incubées seules, significativement différent des HUVEC coincubées avec les
lymphocytes en absence de l’inhibiteur. *P<0.05 vs la valeur correspondant au témoin dans la
condition basale. †P<0.05 vs la valeur correspondant au témoin dans la condition coincubation.
0
500
1000
1500
2000
Basal (HUVEC)
Coincubation (HUVEC+ L)
6-ox
o-PG
F 1α
( pg/
puits
)
TémoinPD98059PD98059
*
**
˕
139
Pour vérifier cette hypothèses, l’expression des formes non phosphorylées et
phosphorylées de la p42/44MAPK a été évaluée dans les HUVEC seules ou coincubées
avec des lymphocytes pendant 1, 2, 4, 8 et 20 h. La figure 28 montre les résultats obtenus
par immunoempreinte avec l’anticorps monoclonal anti p-ERK (E-4): sc7383 qui reconnait
la Tyr 204-phosphorylée. La phosphorylation de p42/44MAPK induite par les lymphocytes
est déjà maximale après 1 h de coincubation et reste maintenue pendant 4 h déclinant à la
valeur basale après 8 h de coincubation.
Figure 28. Mise en évidence de la phosphorylation de p42/p44MAPK par
immunoempreinte. Immunoempreinte de p42/p44MAPK ( A) et phospho p42/p44MAPK (B)
des HUVEC coincubées avec des lymphocytes. Les HUVEC sont incubées en absence (basal) ou
en présence de lymphocytes (L/HUVEC 9:1) pendant les périodes de temps indiquées. Les
monocouches sont lavées pour enlevées les lymphocytes, les cellules sont lysées et les protéines
(20 µg protéine/puits) sont déposées dans le gel d’électrophorèse (10% SDS-polyacrylamide). La
figure montre les résultats d’une expérience représentative de 3 expériences indépendantes donnant
les mêmes résultats.
2.2 CONCLUSIONS ET DISCUSSION
Il est connu que l’activation de la cPLA2 est mediée par un certain nombre
d’agonistes différents et des signaux intracellulaires spécifiques impliquant les protéines G,
l’augmentation de la concentration de Ca2+ intracellulaire, l’activation de kinases telles que
140
la kinase régulée par des signaux extracellulaires (ERK ou MAPK) et la protéine kinase C
(PKC) (Leslie, 1997; Hirabayashi et Shimizu., 2000). Des données récentes indiquent
qu’en plus de la translocation induite par le Ca2+, la phosphorylation de sites spécifiques de
l’enzyme est essentielle pour l’activation de la cPLA2. Un de sites de phosphorylation le
mieux caractérisé est la Ser505 localisée dans le site consensus de phosphorylation par
MAPK (Hirabayashi et Shimizu., 2000). La phosphorylation de la Ser505 par
p42/p44MAPK augmente l’activité de la cPLA2 in vitro et in vivo (Hirabayashi et
Shimizu., 2000). La phosphorylation et l’activation de la cPLA2 sont corrélées à
l’activation des p42/p44MAPK dans plusieurs models cellulaires incluant les cellules
endothéliales (Clark et al., 1995; Sa et al., 1995; Kan et al., 1996;. Wheeler-Jones et al.,
1997). Il est connu que les MAP kinases s’organisent en modules, chacun contentant au
moins trois protéines kinases qui travaillent en série (English et al., 1999). Dans le module
p42/p44MAPK, la protéine Raf-1 est la première kinase qui phosphoryle les MAPK/ERK
kinases (MEK) sur le résidu serine ou thréonine. MEK activée phosphoryle et active à son
tour les MAPK p42/p44, ses cibles spécifiques. En amont de la cascade de la MAP kinase,
l’activité de Raf-1 est soumise à une régulation complexe qui implique de multiples
phosphorylations par la PKC, les tyrosine kinases et p21-kinases en plus de son interaction
avec Ras (Morrison et Cutler, 1997).
Des facteurs de croissance, des stimuli extracellulaires tels que le stress, les
hormones et les cytokines peuvent également conduire à l’activation des MAPKs.
Plusieurs de ces ligands transmettent leur signaux via des récepteurs hétérotrimeriques
couplés aux protéines G (GPCRs ). Même si les mécanismes d’activation de MAPKs par
les GPCR ne sont pas bien connus, des travaux récents indiquent que sous certaines
conditions la cascade MAPK peut être activée par la sous unité Gα, de différentes
protéines G (Gs, Gi, Go, Gq et G12) ainsi que par la sous-unite βγ. Il a été montré que des
ligands de récepteurs couplés à la sous-unité Gi, par exemple, activent les MAPKs
(Gutkind, 1998). La trans-activation des récepteurs tyrosine Kinases (RTKs), ainsi que
l’activation de tyrosine kinases de la famille Src, Ras, PKCζ et PI3K en conjonction avec
une réduction d’AMPc sont impliquées dans la voie Gi vers ERK/MAPK (Gutkind, 1998.,
Luttrell et al., 1999). Cependant, le mécanisme engagé a été attribué essentiellement aux
dimères βγ. La déplétion des sous-unités βγ endogènes par des peptides neutralisants
inhibe l’activation de p42/p44MAPK par des récepteurs couplés aux protéines Gi (Daaka
et al., 1997, Luttrell et al., 1996). La stimulation de p42/p44MAPK par des sous-unités
141
βγ est médiée par des protéines tyrosine kinases de la famille Src. L’activation de Src par
des protéines Gi n’est pas bien connue. Un des modèles propose que la sous-unité βγ
recrute l’isoforme γ de la PI3-Kinase à la membrane cellulaire induisant ainsi la production
de PIP3 (Lopez-Ilasaca et al., 1997). Etant donné que les domaines SH2 se lient au PIP3 in
vitro, PIP3 peut activer directement Src par son domaine SH2.
La PTX catalyse l’ADP ribosylation des sous-unités αi et αo de la protéine Gi/o et
inhibe la fonction de signalisation de Gi/o. Nos résultats montrent que la PTX n’inhibe pas
la production de PGI2 dans notre système de coincubation lymphocytes-HUVEC, ce qui
exclut la possibilité de participation de cette sous-unité dans le mécanisme de signalisation
induit par le contact des lymphocytes. Même s’il existe une sous-famille de Gi/o, (Gαz)
qui n’est pas sensible à la PTX, celle-ci est majoritairement exprimée dans les tissus
neuronaux. En revanche, comme il est montré dans la Figure 26, la génistéine et le PP1
inhibent totalement la production de PGI2 stimulée par le contact des lymphocytes. Ces
résultats suggèrent fortement la participation d’une tyrosine kinase de la famille Src dans la
voie de signalisation déclenchée durant la coincubation des cellules. Il a été montré que
l’activation de Src est impliquée dans différentes fonctions cellulaires induites par des
facteurs de croissances comme la mitogenèse induite par l’EGF (Wilson et al, 1989) ou la
motilité cellulaire induite par le PDGF ou l’EGF (Parsons et Parsons, 1997). Récemment,
le rôle de Src dans la voie de signalisation qui conduit à la synthèse de NO et de PGI2 a été
décrit dans des BAEC stimulées par le VEGF (He et al., 1999). La liaison du VEGF à son
récepteur déclenche une cascade de signalisation qui résulte en la phosphorylation de la
PLC γ1 sur un résidu tyrosine menant à l’augmentation de 1,4,5 IP3 et de Ca2+
intracellulaire. Cette activation cellulaire induit la synthèse de NO et de PGI2. La voie de
signalisation de VEGF requiert l’activation de tyrosine kinase Src car le pré-traitement des
cellules avec la génistéine (20µg/mL) ou le PP2 (1µmoles/L), un autre inhibiteur
spécifique des Src kinases, avant la stimulation par VEGF (10 ng/mL) bloque la synthèse
des deux autacoïdes, NO et PGI2. Cependant la voie de signalisation induite par le VEGF
diverge avant l’activation de NOS/guanyl cylase et de la cascade des MAPK puisque le
pré-traitement des cellules avec l’inhibiteur spécifique de MEK, PD98059 n’a pas d’effet
sur la production de NO alors qu’il bloque complètement la production de PGI2. D’autre
part, comme attendu, la production de NO est totalement bloquée par l’inhibiteur de NOS,
L-NAME tandis que ce dernier n’a pas d’effet sur la synthèse de PGI2.
142
Nous avons montré (Merhi-Soussi et al., 2000) que la libération de l’AA et la
production de PGI2 induites par le contact des lymphocytes dépend de l’activation de la
cPLA2 car l’inhibition irréversible de cette enzyme dans des HUVEC par le MAFP avant la
coincubation lymphocytes-HUVEC bloque (-80%) la production de PGI2. Les résultats
décrits ici, montrent un rôle essentiel de Src et des MAPK dans la voie de signalisation qui
conduit à la stimulation de la production de PGI2 par les lymphocytes. De plus, la
phosphorylation de p42/p44 MAPK est manifeste dès la première heure et jusqu’à 4 h de
coincubation, période de temps correspondant au plateau de la production de PGI2, comme
montré par l’étude cinétique présentée dans la première partie de ce travail.
L’activation de la cPLA2 par la p42/p44 MAPK a été décrite dans des cellules
endothéliales (Wheeler-Jones, 1997). D’après nos résultats nous proposons que le contact
des lymphocytes aux HUVEC induit une voie de signalisation impliquant l’activation
séquentielle de: Src ™ p42/p44 MAPK ™ cPLA2. L’activation de la cPLA2 conduirait à la
libération de l’AA et à la synthèse ultérieure de PGI2.
143
Chapitre 3. LES ACIDES GRAS ω−3 ET LA FONCTION
CELLULAIRE
De nombreuses études montrent qu’un régime supplémenté en EPA et DHA ou en
huiles de poisson inhibe le développement de l’athérosclérose chez l’animal par des
mécanismes indépendants de la concentration plasmatique de LDL-cholestérol ou des
modifications oxydatives de la particule de LDL (Davis et al, 1987; Leaf et Weber, 1988;
Wiener et al., 1986; Shimokawa et Vanhoutte, 1988; Parks et al, 1990). La capacité de
l’EPA et du DHA d’inhiber la prolifération des cellules musculaires lisses induite par des
mitogènes (Pakala et al., 1999) peut s’ajouter aux effets positifs des acides gras ω−3
décrits dans la littérature. Il est généralement admis que les acides gras EPA et DHA
opèrent par des mécanismes différents affectant ainsi des fonctions cellulaires distinctes.
L’effet antithrombotique résultant d’une diminution du rapport TXA2/TXA3 plaquettaire
est spécifique de l’EPA. Le DHA par exemple, protège contre le stress oxydant induit par
l’H2O2 in vitro (Bechoua et al., 1999), diminue l’expression des ECAMs (Weber et al.,
1995; De Caterina et al., 1995; Collie-Duguid et Wahle, 1996). Cet effet qui semblait être
spécifique du DHA a été aussi décrit pour l’EPA (Khalfoun et al., 1997).
Les changements de la composition lipidique des phospholipides cellulaires induits
par l’enrichissement du microenvironnement en acides gras ω−3 à longues chaînes peuvent
induire des altérations de certaines protéines et conduire à une altération de la transduction
de signaux. Il a été montré dans des thymocytes isolés à partir de rats soumis à un régime
riche en huile de poisson et activés par la Con-A, une altération des premières étapes
d’activation induite par le mitogène telles que l’induction rapide de l’ornithine
décarboxylase et de la phosphodiestérase des nucleotides cycliques (Valette et al., 1991).
Une absence d’inhibition des activités AMPc et GMPc phosphodiestérases en réponse à
H2O2 dans des cellules mononucléées de sang périphérique humain pré-traitees avec 5
µmoles/L DHA pendant 1h a été également décrite (Bechoua et al., 1999). D’autre part,
une augmentation de l’activité tyrosine kinase du récepteur à l’EGF et de la PLC-PI
spécifique, a été démontrée dans des cellules de carcinome mammaire traitées avec 52
µmoles/L d’un extrait d’huile de poisson (Estes et al., 1997). Les changements induits par
les acides gras ω−3 peuvent affecter la thromborésitance dépendante de l’endothélium et
en particulier, la production de PGI2. Les résultats de la littérature concernant la production
de PGI2 dans des cellules enrichies en des acides ω−3 sont contradictoires. Cette
144
contradiction peut être essentiellement due aux différents modèles expérimentaux ainsi
qu’aux différents acides gras ω−3 employés.
Afin de déterminer l’effet de l’enrichissement des cellules en acides gras ω−3 à
longues chaînes sur la réponse endothéliale induite par les lymphocytes dans notre
système, nous avons étudié en parallèle l’adhésion des lymphocytes aux HUVEC et la
production de PGI2 après 4 h de coincubation des deux types cellulaires. Les cellules sont
préalablement maintenues pendant 3 jours dans un milieu enrichi en EPA ou DHA. Des
cellules enrichies en acide oléique ont été utilisées comme témoins de la production de
PGI2. Nous avons vérifié l’enrichissement des cellules par l’analyse en CPV des acides
gras des phospholipides totaux, selon le protocole décrit dans la partie II (Méthodes
paragraphe 2.8.3, p 111).
3.1 INCORPORATION DES ACIDES GRAS ω−3 DANS LES PHOSPHOLIPIDES
CELLULAIRES.
Les phospholipides (PL) membranaires représentent le réservoir cellulaire de
précurseurs pour la biosynthèse des eicosanoïdes dont la prostacycline. La composition
lipidique de ce compartiment cellulaire détermine donc la nature des eicosanoïdes qui
seront préférentiellement synthétisés par les cellules. Les HUVEC ont un contenu
relativement élevé en acide arachidonique (AA), acide gras précurseur de la PGI2. Après 3
jours de culture dans un milieu contenant 60 µmoles/L d’EPA, DHA ou acide oléique, le
contenu des PL totaux en ces acide gras d’intérêt est significativement augmenté. (Tableau
II). La proportion d’AA, n‘est pas modifiée par l’enrichissement en acide oléique. Par
contre, l’enrichissement en EPA ou DHA diminue significativement la proportion d’AA (-
62 et –34%, respectivement). La diminution plus importante obtenue avec l’EPA reflète sa
plus forte capacité à remplacer l’AA dans les PL cellulaires par rapport au DHA.
Comme cela a été montré dans les cellules endothéliales d’aorte bovine (BAEC)
(Achard et al., 1995; Kanayasu-Toyoda et al., 1996), l’acide docosapentaénoïque (DPA),
22:5 ω−3 est le principal produit d’élongation de l’EPA dans les HUVEC. Par contre, la
rétroconversion du DHA est beaucoup plus faible dans les HUVEC que dans les BAEC
(Achard et al., 1995). D’autre part, on remarque que la proportion d’acide linoleique (18:2
ω−6) n’est pas modifiée par l’enrichissement.
Le tableau III montre la composition en acides gras des PL totaux de lymphocytes
maintenus pendant 3 j dans les milieux contrôle ou enrichi (30 µmoles/L d’EPA, DHA ou
145
acide oléique). Comme il a été observé dans les HUVEC, la culture des lymphocytes dans
un milieu enrichi augmente significativement le contenu des PL totaux en l’acide gras
considéré. L’enrichissement est particulièrement important avec l’EPA (10 fois vs
contrôle). L’enrichissement des lymphocytes en DHA augmente leur contenu en EPA (7
fois vs contrôle), ce qui peut indiquer une activité peroxisomale normale. On note que la
rétroconversion du DHA en EPA semble être plus efficace dans les lymphocytes que dans
les HUVEC comme l’indique le pourcentage élevé (21%) de DHA rétroconverti.
Les HUVEC sont cultivées dans un milieu contrôle ou dans un milieu enrichi en acide oléique,
EPA ou DHA 60 µmoles/L (concentration finale). Après 3 jours de culture dans des boîtes (T250
mm2) les cellules sont récoltées et les PL totaux séparés comme décrit dans la Partie II méthodes,
paragraphe 2.8.3, p 111. Les valeurs représentent les moyennes ± SEM du nombre de
déterminations indiqué entre parenthèses. Les moyennes sont comparées par le test de Bonferroni,
* (P <0,05), † (P <0,01) et ‡ (P <0,001), N.D= non détectée.
Tableau II. Composition en acides gras des phospholipides totaux (% molaire) dans des HUVEC après 3 j de culture dans un milieu enrichi en acides gras.
Acides Gras Cellules EnrichiesSaturés Témoin (n=6) Oléique (n=3) EPA (n=5) DHA (n=4)
16:0 20,3 ± 0,85 21,5 ± 1,2 19,8 ± 0,86 21,5 ± 1,218:0 20,4 ± 1,23 15,6 ± 0,63 13,9 ± 1,32* 18,2 ± 0,7420:0 0,1 ± 0,05 0,2 ± 0,05 0,2 ± 0,03 0,1 ± 0,0522:0 0,7 ± 0,19 1,2 ± 0,54 0,2 ± 0,06 0,6 ± 0,224:0 1,1 ± 0,29 0,1 ± 0,09* 0,4 ± 0,10* 0,6 ± 0,17
Monoinsaturés 16:1 ω−9 0,9 ± 0,18 1,2 ± 0,23 1,1 ± 0,06 1,2 ± 0,1916:1 ω−7 1,1 ± 0,21 1,3 ± 0,17 1,5 ± 0,26 1,6 ± 0,2418:1 ω−9 21,2 ± 0,86 29 ± 2,64* 23,9 ± 0,76 18,5 ± 0,718:1 ω−7 3,7 ± 0,2 3,8 ± 0,42 2,9 ± 0,07* 3,8 ± 0,3220:1 ω−9 0,3 ± 0,15 0,5 ± 0,04 0,2 ± 0,05 0,2 ± 0,08
Polyinsaturés18:2 ω−6 5,5 ± 0,84 3,8 ± 0,33 4,2 ± 0,15 3,9 ± 0,3720:3 ω−6 1,1 ± 0,49 1,2 ± 0,1 1 ± 0,09 2,1 ± 0,520:4 ω−6 11,5 ± 0,69 9,1 ± 0,43 4,4 ± 0,36‡ 7,6 ± 0,07† 20:5 ω−3 0,2 ± 0,06 0,4 ± 0,15 7,5 ± 0,42‡ 1 ± 0,3822:4 ω−6 3,6 ± 0,86 N.D N.D N.D22:5 ω−6 0,2 ± 0,08 0,1 ± 0,06 N.D ± N.D 0,02 ± 0,0122:5 ω−3 2,7 ± 0,21 1,6 ± 0,18 8,4 ± 0,49* 0,7 ± 0,25*22:6 ω−3 1,9 ± 0,23 0,9 ± 0,20* 0,4 ± 0,04* 9,7 ± 0,49‡
146
Un autre effet du DHA observé sur les lymphocytes et pas sur les HUVEC est la
diminution de l’acide palmitique (16:0). En revanche, l’élongation de l’EPA en DPA, 22:5
ω−3 est plus efficace dans les HUVEC que dans les lymphocytes (76 et 7%
respectivement). Le contenu en AA des PL totaux de lymphocytes témoins est très
supérieur à celui des HUVEC témoins (20 vs 11%, respectivement). Ce pourcentage est
diminué significativement (-33%) seulement dans les lymphocytes enrichis en EPA. De
plus, dans tout les cas, la supplémentation en acide gras diminue le contenu en 18:2 ω−6.
Les lymphocytes sont cultivées dans un milieu control ou dans un milieu enrichi en acide oléique,
EPA ou DHA 30 µmoles/L (concentration finale). Après 3 jours de culture dans des boîtes (T250
mm2) les cellules sont récoltées et les PL totaux séparés comme décrit dans la Partie II méthodes,
paragraphe 2.8.3, p 111. Les valeurs représentent les moyennes ± SEM du nombre de
déterminations indiqué entre parenthèses. Les moyennes sont comparées par le test de Bonferroni,
* (P <0,05), † (P <0,01) et ‡ (P <0,001), N.D= non détectée.
Tableau III. Composition en acides gras des phospholipides totaux (% molaire) dans des lymphocytes après 3 j de culture dans un milieu enrichi en acides gras.
Acides Gras Cellules EnrichiesSaturés Témoin (n=6) Oléique (n=3) EPA (n=5) DHA (n=4)
16:0 21,2 ± 1,0 18,7 ± 0,2 23,4 ± 0,4 16,4 ± 0,6*18:0 21,3 ± 1,1 16,9 ± 0,2 25,5 ± 0,1 23,7 ± 0,720:0 0,2 ± 0,1 0,3 ± 0,1 0,1 ± 0,1 N.D22:0 0,4 ± 0,1 0,4 ± 0,2* 1,2 ± 0,7 0,5 ± 0,224:0 0,4 ± 0,1 0,2 ± 0,04* 0,1 ± 0,1 0,4 ± 0,1
Monoinsaturés 16:1 ω−9 0,5 ± 0,1 0,4 ± 0,1 0,5 ± 0,04 0,6 ± 0,116:1 ω−7 0,5 ± 0,3 0,3 ± 0,1 0,4 ± 0,2 0,4 ± 0,118:1 ω−9 8,0 ± 0,5 11,4 ± 0,5* 6,1 ± 0,4 8,4 ± 0,618:1 ω−7 3,2 ± 0,1 2,7 ± 0,4 3,1 ± 0,1 3,0 ± 0,320:1ω−9 0,3 ± 0,1 0,5 ± 0,03 N.D 0,2 ± 0,03
Polyinsaturé18:2 ω−6 5,7 ± 0,3 3,4 ± 0,4† 4,1 ± 0,5* 3,8 ± 0,4† 20:3 ω−6 2,4 ± 0,2 1,3 ± 0,3 1,02 ± 0,9 1,5 ± 0,120:4 ω−6 20 ± 0,4 16,7 ± 0,7 13,4 ± 1,6* 17,5 ± 0,720:5 ω−3 0,7 ± 0,2 0,5 ± 0,1 7,6 ± 0,4‡ 4,6 ± 0,4‡22:4 ω−6 2,4 ± 0,3 1,0 ± 0,2 2,7 ± 0,5 2,0 ± 0,522:5 ω−6 0,1 ± 0,1 N.D 0,1 ± 0,1 N.D22:5 ω−3 2,7 ± 0,2 1,6 ± 0,1* 3,2 ± 0,2 1,5 ± 0,2† 22:6 ω−3 3,0 ± 0,2 2,1 ± 0,1 1,9 ± 0,1 13,2 ± 0,4‡
147
3.2 EFFET DE L’ENRICHISSEMENT EN ACIDE GRAS ω−3 SUR L’ADHÉSION
DES LYMPHOCYTES A L’ENDOTHÉLIUM
Il est admis que les acides gras, particulièrement le DHA diminuent la capacité
adhésive des cellules endothéliales activées par des cytokines ou par le LPS. (De Caterina
et al., 1995; Weber et al, 1995; Khalfoun et al, 1996; Sanderson et Calder, 1998). Nous
avons donc mesuré l’adhésion des lymphocytes enrichis en acides gras ω−3 puis marqués
au 51Cr, à des HUVEC également enrichies (voir partie II, méthodes; paragraphe 2.6, p
107). Les résultats présentés dans la figure 29 montrent que l’adhésion de lymphocytes
enrichis en EPA et DHA sur des HUVEC enrichies ne représente que 80 et 60%,
respectivement de celle observée avec des cellules non enrichies.
Figure 29. Effet de l’enrichissement en acide gras ω−3 sur l’adhésion des lymphocytes
à l’endothélium. Les HUVEC et les lymphocytes sont cultivés séparément pendant 3 j avec un
milieu contrôle ou enrichi en l'acide gras indiqué. Les lymphocytes sont marqués pendant 1h avec
925 KBq de Na251CrO4/106 cellules à 37°C. Après 3 lavages, 200 µL de la suspension de
lymphocytes resuspendus à une concentration de 4,5x106 cellules/mL sont ensuite ajoutés (rapport
L/HUVEC 9:1) aux HUVEC. Après 4 h de coincubation dans des conditions statiques, les puits
sont lavés trois fois avec du PBS pour éliminer les lymphocytes non adhérents. Les lymphocytes
adhérents (plus cellules endothéliales) sont lysés et la radioactivité est comptée. L’adhésion est
exprimée en pourcentage par rapport à l’adhésion des lymphocytes aux HUVEC témoins
considérée égale à 100. Les valeurs représentent les moyennes ± SEM de 6 expériences
indépendantes. Les données ont été analysées par ANOVA et les moyennes comparées par un test
de t de Fisher. *P<0,05 ou †P<0,001 vs la valeur correspondant au témoin.
0
60
120
Témoin O le ique EP A D HA
Adh
ésio
n (%
du
cont
röle
)
*
†
148
L’enrichissement des cellules en acide oléique ne modifie pas l’adhésion. Nos résultats sont en bon
accord avec ceux décrit par Khalfoun et al. (1996) montrant une diminution de l’adhésion de
lymphocytes au repos à des HUVEC au repos après pré-traitement de ces deux types cellulaires
avec de l’EPA et du DHA.
3.3 EFFET DE L’ENRICHISSEMENT EN ACIDE GRAS ω−3 SUR LA
PRODUCTION DE PROSTACYCLINE ENDOTHÉLIALE INDUITE PAR LES
LYMPHOCYTES.
Parallèlement à l’adhésion, nous avons mesuré la PGI2 dans les surnageants des
cellules enrichies en acides gras ω−3 ou non enrichies après 4 h de coincubation. La
production basale de PGI2 diminue significativement dans les HUVEC enrichis en acides
gras ω−3 par rapport aux HUVEC témoins (Figure 30). De même que d’autres auteurs
(Spector et al., 1983;. Achard et al., 1997) nous avons trouvé 50% de diminution de la
production de PGI2 dans les HUVEC enrichies en EPA ou DHA. Cette diminution peut
être attribuée à la diminution de la disponibilité du précurseur, l’AA, car il a été remplacé
dans les PL cellulaires (Tableau II), ou à la régulation négative de la PGHS-1 par les
acides gras ω−3, comme cela a été préalablement montré dans notre laboratoire (Achard et
al., 1997).
Figure 30. Effet de l’enrichissement en acide gras ω−3 sur la production de PGI2. Les
HUVEC et les lymphocytes sont cultivés séparément pendant 3 j dans un milieu contrôle ou enrichi
en l'acide gras indiqué (voir Matériels et Méthodes). Les HUVEC sont coincubées avec les
lymphocytes (rapport L/HUVEC 9:1). Après 4 h de coincubation les surnageants sont collectés
pour mesurer la 6-oxo-PGF1α. Les résultats sont exprimés par rapport à la production basale de
2 .3
2 .7
2 .6
2 .6
0
1
2
3
4
5
Té m oin O LEIQ UE EP A D HA
6-ox
o-PG
F 1α
Co in c u b a t io n
Ba s a l
* *
149
PGI2 considérée comme égale à 1. Les valeurs représentent les moyennes ± SEM de 10 expériences
indépendantes. Les données ont été analysées par ANOVA et les moyennes sont comparées par un
test de t de Fisher. Les barres solides représentent la production basale, les barres vides montrent la
synthèse induite par les lymphocytes. Les chiffres à l'intérieur des barres indiquent l'augmentation
relative à la production basale pour chaque traitement.
Par contre, la production de PGI2 ne varie pas par rapport au témoin dans des
HUVEC enrichies en acide oléique. Ce résultat montre un effet spécifique des acides gras
ω−3 sur la production basale de PGI2. Bien que l’enrichissement en EPA ou DHA ait
diminué la production basale de PGI2, l’effet stimulateur des lymphocytes sur la synthèse
de PGI2 n’est pas modifié après l’enrichissement de ces deux types cellulaires. En fait, la
coincubation lymphocytes-HUVEC enrichies augmente significativement la synthèse de
PGI2. L’amplitude de cette réponse qui représente 2,6 et 2,3 fois la production basale des
HUVEC enrichies en EPA ou DHA, respectivement, est égale à celle obtenue lors de la
coincubation de cellules témoins non enrichies ou de cellules enrichies en acide oléique.
3.4 DISCUSSION ET CONCLUSIONS
L’utilisation de cellules en culture donne la possibilité de modifier rapidement, en
terme d’heures, la composition en acides gras des phospholipides cellulaires (Spector et
al., 1981; Spector, 1969). Dans nos conditions d’enrichissement, suite à 3 jours de culture
dans un milieu enrichi en EPA ou DHA, la composition en acides gras des PL cellulaires
est fortement modifiée. Les PL sont nettement enrichis en EPA ou en DHA,
respectivement. De plus, nous avons observé une forte élongation de l’EPA en DPA, la
proportion de DHA restant basse dans les PL des cellules enrichies en EPA. Ces résultats
sont en accord avec des travaux antérieurs (Hadjiagapiou et al., 1986), montrant que
l’apport d’EPA aux cellules endothéliales n’entraîne pas d’augmentation de la proportion
de DHA dans les PL. En revanche, l’enrichissement en DHA se traduit par une
augmentation de la proportion en EPA, qui est beaucoup plus évidente dans les
lymphocytes que dans les HUVEC, et qui n’entraîne pas d’accumulation de DPA dans les
PL cellulaires. Les phénomènes de conversion de l’EPA et du DHA ont été mis en
évidence in vivo dans le cerveau et le foie (Bourre et al., 1990; Voss et al., 1992), et in
vitro, dans des BAEC (Hadjiagapiou et al., 1986; Hadjiagapiou et Spector, 1987).
150
Contrairement aux BAEC (Hadjiagapiou et al., 1986; Hadjiagapiou et Spector,
1987) où la réduction de la proportion d’AA est spécifique de l’EPA, nous observons dans
les HUVEC une diminution de l’AA induite par le DHA. Il est possible que ces résultats
contradictoires soit liés aux différences de conditions expérimentales. Tout d’abord, ces
auteurs ont travaillé avec un autre type de cellules endothéliales, (BAEC). Ces cellules ont
été incubées pendant 24 h avec des concentrations de DHA plus faibles, (40 µmoles/L).
Nous avons cultivé des HUVEC pendant 3 jours dans un milieu contenant 60 µmoles/L de
DHA. De plus, une certaine quantité de DHA a été rétroconvertie en EPA. Néanmoins, le
pourcentage de diminution de l’AA après enrichissement en DHA représente environ la
moitié de celui observé avec l’EPA (Tableau II ). Ceci met en évidence la plus forte
capacité de l’EPA pour déplacer l’AA, ce qui pourrait s’expliquer par sa structure
chimique. L’EPA et l’AA sont des acides gras à 20 atomes de carbone présents dans les
mêmes compartiments phospholipidiques, à savoir les PC et dans une moindre proportion
les PE (Takayama et al, 1987, 1989). Ils sont donc en compétition pour leur estérification
dans les PL. Par contre, les acides gras à 22 atomes de carbones comme le DHA étant
plutôt présents dans les PE (Hadjiagapiou et Spector, 1987; Weiner et Sprecher, 1985), leur
compétition vis à vis de l’AA est moindre.
Quand les HUVEC sont préalablement enrichies en acides gras ω−3 la production
basale de PGI2 (HUVEC seules) est réduite de 50 % par rapport aux cellules témoins.
Comme déjà mentionné auparavant des résultats contradictoires concernant l’effet des
acides gras ω−3 sur la production de PGI2 ont été rapportés. Saito et al. (1997) ont montré
une augmentation de la PGI2 basale dans les SVCM après 13 h d’incubation avec 160
µmoles/L d’EPA apporté sous forme de triacylglycerol. D’autres auteurs en accord avec
nos résultats ont décrit dans des HUVEC (Spector et al., 1983; Hadjiagapiou et Spector,
1987) et dans d’autres cellules endothéliales (Achard et al., 1997; Hadjiagapiou et Spector,
1987; Yerram et al, 1989) une réduction d’environ 50 % de la production de PGI2 basale
après traitement des cellules avec des acides gras ω−3. Ces auteurs proposent que l’effet
soit dû à une inhibition de la PGHS plutôt qu’à la diminution de la disponibilité de l’AA.
Dans des BAEC, l’incubation (24 h) avec 10 µmol/L d’EPA ou DHA induit la diminution
de la production basale de PGI2, alors que celle-ci augmente lorsque les cellules sont
cultivées pendant 5 j dans un milieu supplementé avec 10 µM EPA ou DHA (Hishinuma et
al., 1999). Des réductions similaires sont observées lorsque la synthèse de PGI2 est
stimulée par l’AA; la production de PGI2 diminue par rapport aux témoins dans des BAEC
151
(Achard et al., 1997) ainsi que des HUVEC (Spector et al., 1983) après exposition (<22 h)
aux acides gras ω−3 liés à l’albumine. De plus, sous l’action d’agonistes qui mobilisant
l’AA endogène tels que la thrombine (Spector et al., 1983), la bradykinine (Achard et al.,
1997) ou l’ionophore de calcium (Spector et al., 1983; Achard et al., 1997; Yerram et al.,
1989) la quantité de PGI2 issue des cellules traitée avec EPA ou DHA est toujours égale à
50 % de celle des cellules témoins. L’altération de la synthèse de PGI2 peut être liée à une
diminution de la PGHS-1 ou de son expression comme cela a été montré par Achard et al.,
(1997) dans des BAEC traitées avec EPA ou DHA. Ces résultats indiquent que l’EPA et le
DHA ont la capacité de moduler l’expression de la PGHS-1 car la quantité de l’enzyme
ainsi que celle des ARNm correspondants sont diminuées dans les cellules incubées
pendant 22 h avec 25µmoles/L d’EPA ou DHA.
D’autre part, les résultats des études nutritionnelles chez l’Homme montrent que la
production de PGI2 n’est pas modifiée après 40 semaines de régime avec un supplément en
huile de foies de morue (von Schacky et a.l, 1985). De plus, De Caterina et al. (1990) ont
montré une augmentation de la PGI2 basale dans les vaisseaux et le tissu atrial chez des
patients soumis à un pontage coronarien, après un régime riche en acides gras ω−3 pendant
28 jours.
Nos résultats montrent que malgré les 50 % de réduction de la production basale de
PGI2 observée dans les HUVEC après l’enrichissement en acides gras ω−3, la capacité
inductive des lymphocytes sur la production de PGI2 est préservée après l’enrichissement
des deux types cellulaires (Figure 30, p 148). Bien que l’activité de la PGHS-1 puisse être
régulée négativement par les acides gras ω−3, il semblerait que l’activité soit maintenue à
un niveau suffisant pour assurer la synthèse de PGI2 après libération de l’AA par une
cPLA2. En effet, lors de la coincubation, les HUVEC enrichies en acides gras ω−3 se
comportent comme les témoins (augmentation de la production de PGI2 d’un facteur 2,5)
malgré leur faible contenu en AA, particulièrement les cellules enrichies en EPA. Ceci
indique que la voie de signalisation induite par les lymphocytes n’est pas modifiée par les
changements dans la composition en acides gras des PL ni par des changements de fluidité
de la membrane cellulaire. D’autre part, bien que l’EPA ne soit pas le principal substrat, il
est quand même transformé par la PGHS en PGH3 (Willis, 1981; Whitaker et al., 1979;
Mai et al.,1981) qui peut être métabolisée en PGI3 (Hishinuma et al., 1999). Ce qui n’altère
pas la capacité antithrombogénique de l’endothélium.
152
D’après nos résultats il est clair que le mécanisme d’induction de la synthèse de
PGI2 ne requiert pas une adhésion forte de deux types cellulaires. Deux arguments sont en
faveur de cette idée: le blocage des ECAMs particulièrement ICAM-1 ne modifie pas la
réponse endothéliale induite par le contact avec les lymphocytes et l’amplitude de cette
réponse dans les cultures enrichies en EPA ou DHA est comparable aux témoins bien que
l’adhésion soit diminuée, notamment dans les cellules enrichies en DHA.
En conclusion, nos résultats indiquent que l’endothélium enrichi en acides gras ω−3
à longue chaîne répond efficacement au contact des lymphocytes par une augmentation de
la synthèse de PGI2. Quel que soit le mécanisme d’action, l’existence de cet effet in vivo
peut contribuer à expliquer la protection contre les maladies cardio-vasculaires attribuées
aux acides gras de la famille ω−3.
153
CCCOOONNNCCCLLLUUUSSSIIIOOONNN GGGÉÉÉNNNÉÉÉRRRAAALLLEEE EEETTT
PPPEEERRRSSSPPPEEECCCTTTIIIVVVEEESSS
154
PARTIE IV. CONCLUSION GÉNÉRALE ET PERSPECTIVES
Notre travail avait pour objectif principal d’étudier l’influence des lymphocytes du
sang périphérique sur le pouvoir vasodilatateur et anti-agrégeant de l’endothélium. Trois
aspects principaux ont été développés:
La spécificité du contact des lymphocytes sur la production de la PGI2 endothéliale
Les voies de signalisation impliquées dans la synthèse de la PGI2 lors de la
coincubation lymphocytes-HUVEC et
L’effet d’un changement majeur de la composition en acides gras des phospholipides
cellulaires sur la réponse endothéliale induite par les lymphocytes.
Des résultats précédents (Merhi-Soussi et al., 2000) avaient montré que les
lymphocytes humains sont capables d’induire la synthèse de prostacycline (PGI2) par les
cellules endothéliales de veine de cordon ombilical humain. Cette réponse observée, in
vitro, lors de la coincubation des deux types cellulaires en conditions statiques est fonction
du nombre de lymphocytes ajoutés mais ne dépend pas de leur condition métabolique. En
effet, aucune différence significative de production de PGI2 n’a été observée lors de la
coincubation des HUVEC avec des lymphocytes non activés ou des lymphocytes pré-
activés pendant 72 h par la PHA avant la coincubation. Toutefois, le contact entre les deux
types cellulaires est obligatoire car l’effet stimulateur des lymphocytes sur la synthèse de
PGI2 disparaît lorsque les lymphocytes sont coincubés à distance des cellules endothéliales.
Le présent travail a permis de montrer que l’effet stimulateur sur la synthèse de
PGI2 dépend des interactions spécifiques entre les lymphocytes et les HUVEC. Aucune
augmentation significative de PGI2 n’a été observée lorsque les HUVEC ont été
coincubées avec des plaquettes, des PMN ou des billes de latex. Ce résultat montre que le
contact physique per se n’est pas un stimulus efficace. La coincubation lymphocytes-
HUVEC dans des conditions statiques induit des interactions spécifiques entre les deux
types cellulaires et conduit à l’activation de l’endothélium, en particulier à l’augmentation
de l’expression des molécules d’adhésion endothéliales (ECAMs): sélectine-E, VCAM-1 et
ICAM-1.
L’étude cinétique de la production de PGI2 induite par les lymphocytes montre que
l’augmentation de la synthèse de PGI2 est déjà significative après 20-30 minutes de
155
coincubation. La rapidité du processus ainsi que la nécessité d’un contact direct entre les
deux types cellulaires sont deux arguments qui permettent d’exclure la participation de
médiateurs soluble comme les cytokines dans le mécanisme d’augmentation de la synthèse
de prostacycline. Cependant, même si les ECAMs sont régulées positivement par le contact
des lymphocytes nos résultats montrent clairement que la sélectine-E, VCAM-1 ou ICAM-
1, ne sont pas impliquées dans la voie de signalisation menant à la synthèse de PGI2 induite
par les lymphocytes (Dominguez et al., 2001).
Les résultats obtenus à l’aide des inhibiteurs génistéine et PP1 montrent que des
protéines tyrosine kinases, en particulier celle de la famille Src sont impliquées dans la
cascade de signalisation induite par le contact lymphocyte-HUVEC. D'ailleurs, nous avons
mis en évidence la phosphorylation de p42/p44 MAPK. De plus, il a été montré dans notre
système (Merhi-Soussi et al., 2000) que la synthèse de PGI2 induite par les lymphocytes
dépend de l’activité d’une cPLA2 calcium-dépendante et de l’activité constitutive de la
PGHS-1. Donc, nous pouvons postuler que la voie en amont de la libération de l’AA est
probablement dépendante de l’activation de PTK de la famille Src qui vont en suite
phosphoryler p42/p44MAPK conduisant à l’activation de la cPLA2 et à la synthèse
ultérieure de PGI2 par la PGHS-1.
Enfin, nous avons montré que le remplacement des acides gras du
microenvironnement cellulaire par des acides gras à longues chaînes de la famille ω−3 ne
modifie pas la synthèse de PGI2 induite par le contact des lymphocytes indiquant que
l’activité de la PGHS-1 est suffisamment maintenue dans ces conditions d’enrichissement
en EPA ou DHA pour assurer la synthèse de cet eicosanoïde à partir d’un pool d’AA
généré par la cPLA2.
Etant donné que le contact spécifique des lymphocytes aux cellules endothéliales
est essentiel pour déclencher la synthèse de PGI2, il serait important d’étudier l’implication
d’autres molécules exprimées sélectivement par les lymphocytes et non par les PMN ou les
plaquettes non-activées, susceptibles de jouer un rôle dans l’initiation de la voie de
signalisation dans les HUVEC qui mène à la synthèse ultérieure de la PGI2. Les molécules
de classe-I et II du complexe majeur d’histocompatibilité exprimées sur les cellules
endothéliales et leurs contre-récepteurs correspondants, les molécules CD8 et CD4
exprimées sur les lymphocytes pourraient être de bons candidats. Les HUVEC au repos
expriment de façon constitutive les antigènes de classe-I (Lidington et al., 1999). Nos
résultats montrent que le contact lymphocytes-HUVEC induit significativement
l’expression des ECAMs après 4 h de coincubation. Il est très possible que l’expression des
156
molécules CMH classe-II soit aussi régulée positivement. En effet, Doukas et Pober (1990)
ont montré l’induction de l’expression des molécules du CMH classe II et I ainsi que
d’ICAM-1 dans des HUVEC cocultivées pendant 72 h avec des lymphocytes du sang
périphérique avec un rapport lymphocyte/HUVEC 10:1, comparable au nôtre. En plus, il a
été montré que les molécules CMH classe I et II sont capables de délivrer des signaux
d’activation aux lymphocytes CD8 et CD4 et que cette activation est dépendante du
contact entre cellules (Adams et al., 1994; Page et al., 1994, Denton et al., 1999). Donc, on
peut spéculer que lors du contact entre cellules, les lymphocytes CD4 et CD8 pourraient
activer les cellules endothéliales pour produire de la PGI2.
Même si l’induction de la PGI2 par les lymphocytes est indépendante des cytokines
solubles, des cytokines fortement liées aux membranes cellulaires pourraient être
impliquées. Il serait intéressant d’étudier l’implication éventuelle du TNFα membranaire
lymphocytaire et de ses récepteurs endothéliaux dans l’activation de la cPLA2 et la
synthèse de prostacycline dans notre système d’interaction cellulaire. En effet, il a été
montré dans des conditions proches des nôtres, que les lymphocytes humains au repos
induisent l’expression du facteur tissulaire (FT) dans des HUVEC au repos via des
interactions entre le TNFα membranaire, exprimé sur les lymphocytes, et son récepteur de
masse moléculaire 75 kDa, exprimé sur les cellules endothéliales (Reverdiau-Moalic et al.,
1998). La synthèse de FT est dépendante du contact entre les deux types cellulaires et
montre une cinétique dont le maximum se situe à 4 h de coincubation. Le TNF-α a été
décrit comme activateur de la cPLA2 dans plusieurs types cellulaires tels que les cellules
endothéliales vasculaires humaines (Terry et al., 1999), les cellules endothéliales bovines
(Clark et al., 1988) et les cellules épithéliales humaines (Hansen et al., 1999). De plus,
Luschen et al., (2000) ont montré que la production d’eicosanoïdes en réponse au TNF
dans les fibroblastes implique une activation de ERK-1/2 et de cPLA2, cette activation
étant initiée à partir du récepteur du TNF de 55 kDa. De même, il a été montré que le TNF-
α active la voie de la MAPK menant à une activation de la PLA2 et à la synthèse de PGF2α
dans les cellules lutéales bovines (Sakumoto et al., 2000). La contribution des récepteurs
du TNFα membranaire à la production de PGI2 pourrait être vérifiée en préincubant les
HUVEC avec des anticorps bloquants anti-récepteurs TNFα avant leur coincubation avec
les lymphocytes.
D’autres molécules telles que PECAM-1 Platelet-endothelial cell adhesion
molecule-1, membre de la superfamille des immunoglobulines, ou CD44, glycoprotéine
157
transmembranaire, exprimées à la surface des lymphocytes et des cellules endothéliales,
seraient intéressantes à étudier même si elles ne sont pas uniquement exprimées sur les
lymphocytes. En effet, Gurubhagavatula et al. (1998) ont montré que des anticorps anti-
PECAM-1 augmentent la concentration en calcium intracellulaire des HUVEC ainsi que la
synthèse de PGI2. Des résultats suggérant la participation de PECAM-1 et de la famille des
tyrosine kinases Src dans la captation et la transduction du signal induit par les stimuli
mécaniques ont été publiés (Osawa et al., 1997); ce travail montre dans des cellules
endothéliales bovines et humaines la phosphorylation de PECAM-1 induite par le flux,
ainsi que la co-immunoprécitpitation de c-Src et d’une protéine de fusion contenant le
domaine cytoplasmique de PECAM-1. Nos résultats de coincubation dans la condition de
rotation continue montrent que le stimulus mécanique est synergique de l’effet inducteur
des lymphocytes sur la production de PGI2. Par ailleurs, l’engagement de PECAM-1 sur
des lymphocytes T, CD45RA conduit à la prolifération, la sécrétion de cytokines et la
régulation positive du récepteur de l’IL-2. Dans d’autres types cellulaires comme les
monocytes, la liaison de PECAM-1 avec des anticorps monoclonaux stimulants de la
fonction, entraîne la sécrétion de TNF-α alors que dans le PMN l’activation de PECAM-1
mène à la régulation négative de sélectine-L et à la régulation positive de Mac-1 et de
l’explosion respiratoire (Elias et al., 1998). Cependant, PECAM-1 contient un motif ITIM
dans son domaine cytoplasmique qui pourrait inhiber la signalisation. Par exemple,
l’inhibition de la signalisation du TCR médiée par PECAM-1 a été attribuée au moins en
partie à l’inhibition de la libération de Ca 2++ depuis les réserves intracellulaires (Newton-
Nash et Newman, 1999). Dans notre système, des interactions homophiliques entre les
PECAMs des HUVEC et des lymphocytes peuvent être possibles. L’utilisation d’un
anticorps bloquant anti-PECAM permettrait de vérifier cette hypothèse.
D’autre part, la stimulation du CD44 active des protéines tyrosine kinases (PTK)
intracellulaires et notamment les PTK de la famille Src qui sont couplées au CD44
(Ilangumaran et al., 1999). La préincubation des HUVECs et/ou des lymphocytes avec un
anticorps anti-CD44 avant leur coincubation permettrait d’étudier l’implication du CD44
en amont de l’activation des PTK de la famille Src dans la voie de signalisation déclenchée
dans les HUVEC par le contact des lymphocytes.
Egalement, pour compléter cette étude, la cascade de signalisation activée par le
contact lymphocytes-HUVEC pourrait être éclaircie. Nos résultats sont en faveur d’un voie
de signalissation dans laquelle une tyrosine kinase de la famille Src est activée et initie à
son tour une cascade de signalisation menant à l’activation de la p42/p44 MAPK et par la
158
suite à l’activation de la cPLA2. Premièrement, il serait nécessaire d’identifier le type de
PTK Src impliquée, à l’aide d’anticorps reconnaissant les différents membres de la famille
PTK Src, qui comprend au mois huit protéines: Scr, Yes, Fgr, Fyn, Lck, Lyn, Hck et Blk,
parmi lesquelles Src, Fyn, Lyn, sont exprimées dans les HUVEC. La mise en évidence des
formes phosphorylées de ces protéines, permettrait de caractériser complètement le chemin
de signalisation à partir du récepteur d’interaction lymphocytes-HUVEC dans notre
système.
Comme approche de la situation in vivo, nous avons utilisé un système de coculture
lymphocytes-HUVEC mimant une concentration locale de lymphocytes sur l’endothélium.
Ce travail confirme nos résultats précédents montrant la capacité des lymphocytes à
augmenter la production de prostacycline par les HUVEC et démontre que
l’enrichissement en EPA ou DHA n'altère pas la réponse, même si l’adhésion des
lymphocytes est substantiellement réduite par ces acides gras.
Compte tenu de l’absence d’induction de PGHS-2 et/ou de régulation de
l’expression de la PGHS-1 (Merhi-Sossi et al., 2000), nous avons émis l’hypothèse que le
contact direct lymphocytes/cellules endothéliales augmente la libération de l’acide
arachidonique indépendamment de la composition en acides gras des phospholipides
cellulaires
Les changements de composition en acides gras de la membrane peuvent induire
des altérations de la fonction de certaines protéines ( Stubbs et Smith‚ 1984; Keelan et al.,
1994; Bidard et al., 1984) et modifier la transduction du signal. L’enrichissement des
HUVEC en acides gras ω−3 préserve la capacité anti-thrombogénique de l’endothélium
puisque sa capacité de production de PGI2 est maintenue. Ceci doit être une fonction
essentielle durant les évènements qui précèdent le recrutement des monocytes et des
lymphocytes.
De plus, si on considère la supplémentation in vivo, la conversion d’EPA en PGH3
et la diminution de TXA2 en faveur de TXA3 dans les plaquettes est sans doute
d’importance majeure. Contrairement à la PGH2 et au TXA2, la PGH3 et le TXA3 sont de
très faibles inducteurs de l’activation et de l’agrégation plaquettaires. L’enrichissement des
plaquettes en EPA doit donc diminuer la réponse plaquettaire aux agonistes pro-agrégants
car le rapport AA/EPA est diminué. Ainsi, l’effet global de la substitution de l’AA par
l’EPA ou le DHA devrait se traduire par une réduction de l’agrégation plaquettaire car la
balance est en faveur de la production de médiateurs moins actifs. L’EPA dans la cellule
endothéliale, produit à partir de la PGH3 de la PGI3 qui a des effets inhibiteurs similaires à
159
ceux de la PGI2 (Needleman et al.‚ 1979; Moncada et Vane, 1979). Ainsi, l’effet de la
supplementation du régime alimentaire en acide gras ω−3 serait en faveur de
l’antiagrégation sans altération de la capacité vasodilatatrice et de production de PGI2
vasculaire (von Schacky et al., 1985). Ceci pourrait contribuer à expliquer la protection
contre les maladies cardio-vasculaires attribuée aux acides gras ω−3 (Leaf et Weber, 1988;
McLennan et al., 1995).
Ainsi le mécanisme par lequel les lymphocytes induisent la synthèse de PGI2 n’est
pas modifié par un microenvironnement enrichi en acides gras ω−3. Ce mécanisme
inducteur de la synthèse de PGI2 qui dépend du contact des lymphocytes peut constituer un
nouveau rôle régulateur des lymphocytes dans les cellules vasculaires. Ceci s’ajoute aux
autres effets connus des lymphocytes comme l’inhibition de la prolifération des cellules
musculaires lisses (Hansson et al., 1989., Hansson et al., 1991), et l’induction de la
synthèse de monoxyde d’azote (Shuler et al., 1995). Ces effets peuvent avoir un rôle
physiopathologique important dans les phases précoces de l’athérosclérose. Ces effets
positifs du lymphocyte pourraient contrebalancer son effet procoagulant (Schmid et al.,
1995, Reverdiau-Moalic et al., 1998) et jouer un rôle décisif dans les étapes précoces de
l’athérogenèse.
160
RRRÉÉÉFFFÉÉÉRRREEENNNCCCEEESSS BBBIIIBBBLLLIIIOOOGGGRRRAAAPPPHHHIIIQQQUUUEEESSS
161
ACHARD F., GILBERT M., BÉNISANT C., BEN SLAMA S., DEWITT D.L., SMITH
W.L., LAGARDE M. Eicosapentaenoic and docosahexaenoic acids reduce PGH synthase 1
expression in bovine aortic endothelial cells. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1997, vol
241., p 513-518.
ACHARD F.‚ BÉNISTANT C.‚ LAGARDE M. Interconversions and distinct metabolic
fate of eicosapentaenoic. Docosapentaenoic and docosahexaenoic acids in bovine aortic
endothelial cells. Bioch. Biophys. Acta., 1995, vol 1255, n° 3, p 260-266.
ADAMS P.W., LEE H.S., WALDMAN W.J., SEDMAK D.D., OROSZ C.G.
Alloantigenicity of human endothelial cells. III. Quantitated indirect presentation of
endothelial alloantigens to human helper T lymphocytes. Transplantation, 1994, vol 58, n° 4,
p 476-83.
ALESSI D.R., CUENDA A., COHEN P., DUDLEY D.T., SALTIEL A.R. PD 098059 is a
specific inhibitor of the activation of mitogen-activated protein kinase kinase in vitro and in
vivo. J. Biol. Chem., 1995, vol 270, n° 46, p 27489-27494.
ALON R., KASSNER P.D., CARR M.W., FINGER E.B., HEMLER M.E., SPRINGER
T.A. The integrin VLA-4 supports tethering and rolling in flow on VCAM-1. J. Cell. Biol.,
1995 , vol 128, n° 6, p 1243-1253.
ANDERSON R.E., O'BRIEN P.J., WIEGAND R.D., KOUTZ C.A., STINSON
A.M.Conservation of docosahexaenoic acid in the retina. Adv. Exp. Med. Biol., 1992, vol 318,
p 285-294.
ASHRAF M.M., MURAKAMI M., SHIMBARA S., AMAKASU Y., ATSUMI G.,
KUDO I. TYPE II phospholipase A2 is linked to cyclooxygenase-2-mediated delayed
prostaglandin D2 generation by cultured mouse mast cells following FcepsilonRI- and
cytokine-dependent activation. Biochim.. Biophys. Res. Commun., 1996, vol 229, p 726-732.
BALSINDE J., DENNIS. E.A. Distinct roles in signal transduction for each of the
phospholipase A2 enzymes present in P388D1 macrophages. J. Biol. Chem., 1996, vol 271, p
6758-6765.
BANG H.O., DYERBERG J., NIELSEN A.B. Plasma lipid and lipoprotein pattern in
Greenlandic West-coast Eskimos. Lancet., 1971 vol 1, n° 7710, p1143-1145.
BAUERSACHS J., HECKER M., BUSSE R. Display of the characteristics of endothelium-
derived hyperpolarizing factor by a cytochrome P450-derived arachidonic acid metabolite in
the coronary microcirculation. Br. J. Pharmacol., 1994, vol 113, n° 4, p 1548-1553.
162
BAZAN M.G., GORDON W.C., RODRIGUEZ DE TURCO E.B. Docosahexaenoic acid
uptake and metabolism in photoreceptors: retinal conservation by an efficient retinal pigment
epithelial cell-mediated recycling process. Adv. Exp. Med. Biol., 1992, vol 318, p 295-306.
BECHOUA S., DUBOIS M., DOMINGUEZ Z., GONCALVES A., NEMOZ G.,
LAGARDE M., PRIGENT A-F. Protective Effect of Docosahexaenoic acid against
hydrogen peroxide-induced oxiative stress in human lymphocytes. Biochem. Pharmacol.,
1999, vol 57, p 1021-1030.
BERK B.C., CORSON M.A., PETERSON T.E., TSENG H. Protein kinases as mediators
of fluid shear stress stimulated signal transduction in endothelial cells: a hypothesis for
calcium-dependent and calcium-independent events activated by flow. J. Biomech., 1995, vol
28, p 1439-1450.
BEVILACQUA M.P., POBER J.S., MENDRICK R.S., COTRAN RS., GIMBRONE
M.A Jr. Identification of an inducible endothelial-leukocyte adhesion molecule. Proc. Natl.
Acad. Sci. USA., 1987, vol 84, p 9238-9242.
BEVILACQUA M.P., STENGELIN S., GIMBRONE M.A Jr., SEED B. Endothelial
leukocyte adhesion molecule 1 : an inducible receptor for neutrophils related to complement
regulatory proteins and lectins. Science, 1989, Vol 243, n° 4895, p 1160-1165.
BHAGYALAKSHMI A., BERTHIAUME F., REICH K.M., FRANGOS J.A. Fluid shear
stress stimulates membrane phospholipid metabolism in cultured human endothelial cells. J.
Vasc. Res., 1992, vol 29, n° 6, p 443-449.
BHAGYALAKSHMI A., FRANGOS J.A. Mechanism of shear-induced prostacyclin
production in endothelial cells. Biochem. Byophys Res Comm., 1989, vol 158, p 31-37.
BIDARD J.N., ROSSI B., RENAUD J.F., LAZDUNSKI M. A search for an 'ouabain-like'
substance from the electric organ of Electrophorus electricus which led to arachidonic acid
and related fatty acids. Biochim Biophys Acta., 1984, vol 769, n°1, p 245-252.
BILLAH M.M. Phospholipase D and cell signaling. Curr. Opin. Immunol., 1993, vol 5,
p114-123.
BILLAH M.M., ANTHES J.C. The regulation and cellular functions of phosphatidylcholine
hydrolysis. Biochem. J., 1990, vol 269, p 281-291.
BINGHAM III. C.O., MURAKAMI M., FUJISHIMA. A heparin-sensitive phospholipase
A2 and prostaglandin endoperoxide synthase-2 are functionally linked in the delayed phase of
prostaglandin D2 generation in mouse bone marrow-derived mast cells. J. Biol. Chem., 1996,
vol 271, p 25936-25944.
163
BIRCH E.E., BIRCH D.G., HOFFMAN D.R., UAUY R.. Dietary essential fatty acid
supply and visual acuity development. Invest. Ophthalmol. Visual. Sci., 1992, vol 33, n° 11, p
3242-3256.
BJERREGAARD P., DYERBERG.J. Mortality from ischaemic heart disease and
cerebrovascular disease in Greenland. Int. J. Epidemiol., 1988, vol 17, n° 3, p 514-519.
BJERVE K.S., FISCHER S., ALME K. Alfa linolenic acid deficiency in man: Effect of
ethyl linolenato on plasma and erythrocyte fatty acid composition and biosynthesis of
prostanoids. Am. J. Clin. Nutr., 1987, vol 46, n° 4, p 570-576.
BLAKE W.L., CLARKE S.D. Suppression of rat hepatic fatty acid synthase and S14 gene
transcription by dietary polyunsaturated fat. J. Nutr.,1990, vol 120, n° 12, p 1727-1729.
BONGRAZIO M., BAUMANN C., ZAKRZEWICZ A., PRIES A.R., GAEHTGENS P.
Evidence for modulation of genes involved in vascular adaptation by prolonged exposure of
endothelial cells to shear stress. Cardiovasc. Res., 2000, vol 47, n° 2, p 384-393.
BORDET J-C., GUICHARDANT M., LAGARDE M. Arachidonic acid strongly stimulates
prostaglandin I3 (PGI3) production from eicosapentaenoic acid in human endothelial cells.
Biochem. Biophys. Res. Commun., 1986, vol 135, n° 2, p 403-410.
BORSCH-HAUBOLD A.G., KRAMER R.M., WATSON S.P. Cytosolic phospholipase A2
is phosphorylated in collagen- and thrombin-stimulated human platelets independent of
protein kinase C and mitogen-activated protein kinase. J. Biol. Chem., 1995, vol 270, n° 43, p
25885-25892.
BOUKHCHACHE D., LAGARDE M. Interactions between prostaglandin precursors
during their oxygenation by human platelets. Biochim. Biophys. Acta., 1982, vol 713, n° 2, p
386-392.
BOURRE J.M., BONNEIL M., DUMONT O., PICIOTTI M., CALAF R., PORTUGAL
H., NALBONE G., LAFONT H. Effect of increasing amounts of dietary fish oil on brain
and liver fatty acid composition. Biochim. Biophys. Acta., 1990, vol.1043, p 149-152.
BRADY H.R., SERHAN C.N. Adhesion promotes transcellular leukotriene biosynthesis
during neutrophil-glomerular endothelial cell interactions: inhibition by antibodies against
CD18 and L-selection. Biochem. Biophys. Res. Commun., 1992, vol 186, n° 3, p 1307-1314.
BRENNER B., JUNGE S., BIRLE A., KADEL S., LINDERKAMP O. Surfactant
modulates intracellular signaling of the adhesion receptor L-selectin. Pediatr. Res., 2000, vol
48, n° 3, p 283-288.
BRITISH NUTRITION FOUNDATION. RECOMMENDATIONS FOR INTAKES OF
UNSATURATED FATTY ACIDS. Unsaturated Fatty Acids: Nutritional and physiological
164
significance. The report of the British Nutrition Foundation´s Task Force., ed. Chapman &
Hall., London UK., 1992.
BROOKS P.C., CLARK R.A., CHERESH D.A. Requirement of vascular integrin alpha v
beta 3 for angiogenesis. Science., 1994a, vol 264, n° 5158, p 569-571.
BROOKS P.C., MONTGOMERY A.M., ROSENFELD M., REISFELD R.A., HU T.,
KLIER G., CHERESH D.A. Integrin alpha v beta 3 antagonists promote tumor regression
by inducing apoptosis of angiogenic blood vessels. Cell., 1994b, vol 79, n° 7, p 1157-1164.
BUCKLEY B.J., WHORTON A.R. Ca(2+)-independent arachidonic acid release by
vascular endothelium requires protein syntheses de novo. Biochem. J., 1994, vol. 300, p 449-
455.
BURR G.O., BURR, M. On the nature and rôle of the fatty acids essential in nutrition.
J.Biol.Chem.,1930, vol 86, n° 2, p 587-620.
BURR G.O., BURR M. A new deficiency disease produce by the rigid exclusion of fat from
diet . J. Biol. Chem., 1929, vol 82, n° 2, p 345-367.
CAMPBELL J.H., CAMPBELL G.R. The cell biology of atherosclerosis-new
developments. Aust. N. Z. J. Med., 1997, vol 27, n° 4, p 497-500.
CAMPBELL W.B., GEBREMEDHIN D., PRATT P.F., HARDER D.R. Identification of
epoxyeicosatrienoic acids as endothelium-derived hyperpolarizing factors. Circ. Res., 1996,
vol 78, p 415-423.
CAPDEVILA J.H., FALCK J.R., ESTABROOK R.W. Cytochrome P450 and the
arachidonate cascade. FASEB. J., 1992, vol 6, n° 2, p 731-736.
CAPDEVILA J.H., FALCK J.R., HARRIS R.C. Cytochrome P450 and arachidonic acid
bioactivation. Molecular and functional properties of the arachidonate monooxygenase. Lipid
Res., 2000, vol 41, n° 2, p 163-181.
CARLEY W.W., NIEDBALA M.J., GERRITSEN M.E. Isolation., cultivation., and partial
characterization of microvascular endothelium derived from human lung. Am. J. Respir. Cell.
Mol. Biol., 1992, vol 7, n° 6, p 620-630.
CAZAUBON S., PARKER P.J., STROSBERG A.D., COURAUD P.O. Endothelins
stimulate tyrosine phosphorylation and activity of p42/mitogen-activated protein kinase in
astrocytes. Biochem. J., 1993, vol 293, n° 2, p 381-386.
CHANDRASEKAR B., FERNANDES G. Decreased pro-inflamatory citokines and
increased antioxidant enzyme gene expression by ω-3 lipids in murine lupus nephritis. Bioch.
Bioph. Res. Comm., 1994, vol 200, n° 2, p 893-898.
165
CHARO I.F., SHAK S., KARASEK MA., DAVIDSON P.M., GOLDSTEIN I.M.
Prostaglandin I2 is not a major metabolite of arachidonate acid in cultured endothelial cells
from human foreskin microvessels. J.Clin. Invest., 1984, vol 74, n° 3, p 914-919
CHEN Y.H., POUYSSEGUR J., COURTNEIDGE S.A., VAN OBBERGHEN-
SCHILLING E. Activation of Src family kinase activity by the G protein-coupled thrombin
receptor in growth-responsive fibroblasts. J. Biol. Chem., 1994, vol 269, n° 44, p 27372-
27377.
CIFONE M.G., RONCAIOLI P., DE MARIA R., CAMARDA G., SANTONI A.,
RUBERTI G., TESTI R. Multiple pathways originate at the Fas/APO-1 (CD95) receptor:
sequential involvement of phosphatidylcholine-specific phospholipase C and acidic
sphingomyelinase in the propagation of the apoptotic signal. EMBO. J., 1995, vol 14, p 5859-
5868.
CLANDININ M.T., JUMPSEN J., SUH M. Relationship between fatty acid accretion.,
membrane composition and biologic functions. J. Pediatr., 1994, vol 125, n° 5, p S25-32.
CLARK E.A., BRUGGE J.S. Integrins and signal transduction pathways: the road taken.
Science, 1995, vol 268, n° 5208, p 233-239.
CLARK J.D., SCHIEVELLA A.R., NALEFSKI E.A., LIN L.L. Cytosolic phospholipase
A2. J. Lipid Mediat. Cell. Signal., 1995, vol 12, p 83-117.
CLARK M.A., CHEN M.J., CROOKE S.T., BOMALASKI J.S. Tumour necrosis factor
(cachectin) induces phospholipase A2 activity and synthesis of a phospholipase A2-activating
protein in endothelial cells. Biochem. J., 1988., vol 50, n° 1, p 125-132
CLARKE S.D., ARMSTRONG M.K., JUMP D.B. Dietary polyunsaturated fats uniquely
suppress rat liver fatty acid synthase and S14 mRNA content. J. Nutr.,1990b, vol 120, n° 2, p
225-231.
CLARKE S.D., JUMP D.B. Dietary polyunsaturated fatty acid regulation of gene
transcription. Annu. Rev. Nutr., 1994, vol 14, p 83-98.
CLARKE., S.D., ARMSTRONG., M.K., JUMP D.B. Nutritional control of rat liver fatty
acid synthase and S14 mRNA abundance. J. Nutr., 1990a, vol 120, n° 2, p 218-224.
COBB M.H., GOLDSMITH E.J. How MAP kinase are regulated. J. Biol. Chem., 1995, vol
270, n° 25, p 14843-14846.
COLLIE-DUGUID E.S.R., WAHLE K.W.J. Inhibitory effect of fish oil n-3
polyunsaturated fatty acids on the expression of endothelial cell adhesion molecules.
Biochem. Biophys. Res. Commun., 1996, vol 220, p 969-974.
166
CONNOR W.E., NEURINGER M. The effects of n-3 fatty acid deficiency and repletion
upon the fatty acid composition and function of the brain and retina. Prog. Cli. Biol. Res.,
1988, vol 282, p 275-294.
CRAWFORD M.A., HASSAM A.G., WILLIAMS G. Essential fatty acids and fetal brain
growth. Lancet,1976, vol 1 n° 7957, p 452-453.
CROCKETT-TORABI E., SULENBARGER B., SMITH C.W., FANTONE J.C.
Activation of human neutrophils through L-selectin and Mac-1 molecules. J. Immunol., 1995,
vol 154, n° 5, p 2291-3202.
CROVELLO C.S., FURIE B.C., FURIE B. Rapid phosphorylation and selective
dephosphorylation of P-selectin accompanies platelet activation. J. Biol. Chem., 1993, vol
268, p 14590-14593.
DAAKA Y., LUTTRELL L.M., LEFKOWITZ R.J. Switching of the coupling of the
beta2-adrenergic receptor to different G proteins by protein Kinase A. Nature., 1997, vol 390,
n° 6655, p 88-91.
DAVIDGE S.T., BAKER P.N., LAUGHLIN M.K, ROBERTS J.M. Nitric oxide produced
by endothelial cells increases production of eicosanoïds through activation of prostaglandin H
synthase. Circ. Res., 1995, vol 77, n° 2, p 274-283.
DAVIS H.R., BRIDENSTINE R.T., VESSELINOVITCH D., WISSLER R.W. Fish oil
inhibits development of atherosclerosis in rhesus monkeys. Arteriosclerosis., 1987, vol 7, n°
5, p 441-449.
DE CARVALHO M.S., McCORMACK A.L., OLSON E. Identification of phosphorylation
sites of human 85-kDa cytosolic phospholipase A2 expressed in insect cells and present in
human monocytes. J. Biol. Chem., 1996, vol 271, p 6987-6997.
DE CATERINA R., CYBULSKY M.A., CLINTON S.K., GIMBRONE M.A Jr., LIBBY
P. Omega-3 fatty acids and endothelial leukocyte adhesion molecules. Prostaglandins
Leukotrienes and essential fatty acids. 1995, vol 52, p 191-195.
DE CATERINA R., GIANNESSI D., MAZZONE A., BERNINI W., LAZZERINI G.,
MAFFEI S., CERRI M., SALVATORE L., WEKSLER B. Vascular prostacyclin is
increased in patients ingesting omega-3 polyunsaturated fatty acids before coronary artery
bypass graft surgery. Circulation., 1990, vol 82, n° 2, p 428-438.
DE CATERINA R., LIAO J.K., LIBBY P. Fatty acid modulation of endothelial activation.
Am. J. Clin. Nutr. 2000, vol 71, n° 1, p 213S-23S.
DE CATERINA R., LIBBY P. Control of endothelial leukocyte adhesion molecules by fatty
acids. 1996. Lipids, 1996, vol 31, p S57-S63.
167
DE FOUGEROLLES A.R., STACKER S.A., SCHWARTING R., SPRINGER T.A.
Characterization of ICAM-2 and evidence for a third counter-receptor for LFA-1. J. Exp.
Med., 1991, vol 174, n°1, p 253-267.
DEJANA E., BREVIARIO F., BALCONI G., ROSSI V., REMUZZI G., DE GAETANO
G., MANTOVANI A. Stimulation of prostacyclin synthesis in vascular cells by mononuclear
cell products. Blood, 1984, vol 64, n° 6, p 1280-1283.
DELLA BELLA S., MOLTENI M., COMPASSO S., ZULIAN C., VANOLI M.,
SCORZA R. Differential effects of cyclo-oxygenase pathway metabolites on cytokine
production by T lymphocytes. Prostaglandins Leukot Essent Fatty Acids, 1997, vol 56, n° 3, p
177-184.
DENTON MD, GEEHAN CS, ALEXANDER SI, SAYEGH MH, BRISCOE DM.
Endothelial cells modify the costimulatory capacity of transmigrating leukocytes and promote
CD28-mediated CD4(+) T cell alloactivation. J. Exp. Med., 1999, vol 190, n°4, p 555-566.
DEWITT D.L., SMITH W.L. Primary structure of prostaglandin G/H synthase from sheep
vesicular gland determined from the complementary DNA sequence. Proc. Natl. Acad Sci.
USA., 1988, vol 85, p 1412-1416.
DIEZ E., CHILTON F.H., STROUP G., MAYER R.J., WINKLER J.D., FONTEH A.N.
Fatty acid and phospholipid selectivity of different phospholipase A2 enzymes studied by
using mammalian membrane as a substrate. Biochem. J., 1994, vol 301, n°3, p 721-726.
Erratum in: Biochem. J., 1994, vol 15, n° 304, p 1023.
DIEZ E., MONG S. Purification of a phospholipase A2 from human monocytic leukemic
U937 cells. Calcium-dependent activatioj and membrane association. J. Biol. Chem., 1990,
vol 2665, p 14654-14661.
DOMINGUEZ Z., BOSCH V. Dietary fish oil affects food intake, growth and hematologic
values of weanling rats. Arch. Latinoam. Nutr., 1994, vol 44, n° 2, p 92-97.
DOMINGUEZ Z., MERHI-SOUSSI F., MACOVSCHY O., NEMOZ G., LAGARDE M.,
PRIGENT AF. Endothelial cell prostacyclin synthesis induced by lymphocytes is
independent of the membrane fatty acid composition of both cell types and of E-selectin,
VCAM-1 or ICAM-1-mediated adhesion. Br. J. Haematol., 2001, vol 113, n° 2, p521-532.
DOROUDI R., GAN L.M., SELIN SJOGREN L., JERN S. Effects of shear stress on
eicosanoid gene expression and metabolite production in vascular endothelium as studied in a
novel biomechanical perfusion model. Biochem. Biophys. Res. Commun., 2000, vol 269, n° 1,
p 257-264.
168
DOUKAS J., POBER J.S. Lymphocyte-mediated activation of cultured endothelial cells
(EC). CD4+ T cells inhibit EC class II MHC expression despite secreting INF-γ and
increasing EC class 1 MHC and intercellular adhesion molecule-1 expression. J. Immunol.,
1990, vol 145,n° 4, p 1088-1098.
DUDLEY D.T., PANG L., DECKER S.J., BRIDGES A.J., SALTIEL A.R. A synthetic
inhibitor of the mitogen-activated protein kinase cascade. Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 1995,
vol 92, p 7686-7689.
DUPLAA C., COUFFINHAL T., LABAT L., MOREAU C., PETIT-JEAN M.E.,
DOUTRE M.S., LAMAZIERE J.M., BONNET J. Monocyte/macrophage recruitment and
expression of endothelial adhesion proteins in human atherosclerotic lesions. Atherosclerosis,
1996, vol 121, n°2, p 253-266.
DUSTIN M.L., ROTHLEIN R., BHAN A.K., DINARELLO C.A., SPRINGER T.A.
Induction by IL 1 and interferon-gamma: tissue distribution, biochemistry, and function of a
natural adherence molecule (ICAM-1). J. Immunol., 1986, vol 137, n° 1, p 245-254.
DUSTIN M.L., SPRINGER T.A. Lymphocyte function-associated antigen-1 (LFA-1)
interaction with intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1) is one of at least three
mechanisms for lymphocyte adhesion to cultured endothelial cells. J. Cell. Biol., 1988, vol
107, n° 1, p 321-331.
DYERBERG J., BANG H.O. Haemostatic function and platelet polyunsaturated fatty acids
in Eskimos. Lancet, 1979, vol 2, n° 8140, p 433-435.
EATON S.B., KONNER M. Paleolithic nutrition. A consideration of its nature and current
implications. N. Engl. J. Med., 1985, vol 312, n° 5, p 283-289.
ELIAS C.G., SPELLBERG J.P., KARAN-TAMIR B., LIN C.H., WANG Y.J.,
MCKENNA P.J., MULLER W.A., ZUKOWSKI M.M., ANDREW D.P. Ligation of
CD31/PECAM-1 modulates the function of lymphocytes, monocytes and neutrophils. Eur. J.
Immunol., 1998, vol 28, n° 6, p1948-1958.
EMESON E.E., ROBERTSON A.L. Jr. T lymphocytes in aortic and coronary intimas.
Their potential role in atherogenesis. Am. J. Pathol., 1988, vol 130, n° 2, p 369-376.
EMESON E.E., SHEN M.L., BELL C.G., QURESHI A. Inhibition of atherosclerosis in
CD4 T-cell-ablated and nude (nu/nu) C57BL/6 hyperlipidemic mice. Am. J. Pathol., 1996, vol
149, n° 2, p 675-685.
Endothelial cells modify the costimulatory capacity of transmigrating leukocytes and
promote CD28-mediated CD4(+) T cell alloactivation. J Exp Med 1999 , vol 190, n° 4,
p:555-566.
169
ENDRES S., GHORBANI R., KELLEY V.E., GEORGILIS. K., LONNEMANN G., van
der MEER J.W.M., CANNON, J.G., ROGERS. T.S., KLEMPNER M.S., WEBER PC.,
SCHAEFER E.J., WOLFF S.M., DINARELLO C.A. The effect of dietary
supplementation with n-3 polyunsaturated fatty acids on the synthesis of interlukin-1 and
tumor necrosis factor by mononuclear cells. N. Engl. J. Med., 1989, vol 320, n°5, p 265-271.
ENDRES S., MEYDANI S.N., GHORBANI R., SCHINDLER R., DINARELLO C.A.
Dietary supplementation with n-3 fatty acids suppresses Interleukin-2 production and
mononuclear cell proliferation. Leukoc. Biol., 1993, vol 54, n° 6, p 599-603.
ENGERMAN. R.L, PFAFFENBACH D., DAVIS M.D. Cell turnover of capillaries. Lab
Invest., 1967, vol., n° 17, n°6, p 738-743.
ENGLISH J., PEARSON G., WILSBACHER J., SWANTEK J., KARANDIKAR M.,
XU S., COBB M.H. New insights into the control of MAP kinase pathways. Exp. Cell. Res.,
1999, vol 253, n° 1, p 255-270.
ESTES K.C., ROSE B.T., SPECK J.J., NUTTER M.L., REITZ R.C. Effects of ω−3 fatty
acids on receptor tyrosine kinase and PLC activities in EMT6 cells. J. Lipid Mediat. Cell.,
1997, vol 17, p 81-96.
ETIENNE-MANNEVILLE S., MANNEVILLE J.B., ADAMSON P., WILBOURN B.,
GREENWOOD J., COURAUD P.O. ICAM-1-coupled cytoskeletal rearrangements and
transendothelial lymphocyte migration involve intracellular calcium signaling in brain
endothelial cell lines. J. Immunol., 2000, vol 165, n° 6, p 3375-3383.
EXTON J.H. Phosphatidylcholine breakdown and signal transduction. Biochim. Biophys.
Acta., 1994, vol 1212, n°1, p 26-42.
EXTON J.H. Regulation of phospholipase D. Biochim. Biophys. Acta., 1999, vol 1439, n° 2,
p 121-133.
FESKENS E.J., BOWLES C.H., KROMHOUT D. Association between fish intake and
coronary heart disease mortality. Differences in normoglycemic and glucose intolerant elderly
subjects. Diabetes.Care., 1993, vol 16, n° 7, p 1029-1034.
FISCHER S., VISCHER A., PREAC-MURSIC V., WEBER P.C. Dietary
docosahexaenoic acid is retroconverted in man to eicosapentaenoic acid, which can be quickly
transformed to prostaglandin I3. Prostaglandins.,1987, vol 34, n° 3, p 367-375.
FISCHER S., WEBER P.C. Prostaglandin I3 is formed in vivo in Man after dietary
eicosapentaenoic acid. Nature., 1984, vol 307, n° 5947, p 165-168.
FISCHER S., WEBER P.C., DYERBERG J. The prostaciclin/tromboxane balance is
favourably shifted in Greenland Eskimos. Prostaglandins., 1986, vol 32, n° 2, p 235-241.
170
FISSLTHALER B., DIMMELER S., HERMANN C., BUSSE R., FLEMING I.
Phosphorylation and activation of the endothelial nitric oxide synthase by fluid shear stress.
Acta. Physiol. Scand., 2000, vol 168, n° 1, p 81-88.
FLEMING I., FISSLTHALER B., BUSSE R. Calcium signaling in endothelial cells
involves activation of tyrosine kinases and leads to activation of mitogen-activated protein
kinases.Circ. Res., 1995, vol 76, n° 4, p 522-529.
FLOREY. The endothelial cell. Br. Med. J., 1966, vol 5512, p 487-490.
FOUDA S.I., MOLSKI T.F., ASHOUR M.S., SHA'AFI R.I. Effect of lipopolysaccharide
on mitogen-activated protein kinases and cytosolic phospholipase A2. Biochem. J., 1995, vol
308, p 815-822.
FRANGOS J.A., ESKIN S.G., MCINTIRE L.V., IVES C.L. Flow effects on prostacyclin
production by cultured human endothelial cells. Science, 1985, vol 227, n° 4693, p 1477-
1479.
FRIEDLANDER M., BROOKS P.C., SHAFFER R.W., KINCAID C.M., VARNER J.A.,
CHERESH D.A. Definition of two angiogenic pathways by distinct alpha v integrins.
Science, 1995, vol 270, n° 5241, p 1500-1502.
FURCHGOTT R.F., ZAWADZKI J.V. The obligatory role of endothelial cells in the
relaxation of arterial smooth muscle by acetylcholine. Nature., 1980, vol 288, n° 5789, p 373-
376.
GARAVITO R.M., PICOT D., LOLL P.J. The 3.1 A X-ray crystal structure of the integral
membrane enzyme prostaglandin H2 synthase 1 Adv.Prostaglandin.Thromboxane Leukot.
Res., 1995, vol 23, p 99-103.
GERRITZEN M.E., CHELI C.D. Arachidonic acid and prostaglandin endoperoxide
metabolism in isolated rabbit and coronary microvessels and isolated and cultivated coronary
microvessels endothelial cells. J. Clin. Invest., 1983, vol 72, n° 5, p 1658-1671.
GIBLIN P.A., HWANG S.T., KATSUMOTO T.R., ROSEN S.D. Ligation of L-selectin on
T lymphocytes activates beta1 integrins and promotes adhesion to fibronectin. J. Immunol.,
1997, vol 159, n° 7, p 3498-3507
GIERSE J.K., McDONALD J.J., HAUSER S.D., RANGWALA S.H. A single amino acid
difference between cyclooxygenase-1 (COX-1) and –2 5COX-2) reverses the selectivity of
COX-2 specific inhibitors. J. Biol. Chem., 1996, vol 271, p 15810-15814.
GIJON M.A., LESLIE C.C. Regulation of arachidonic acid release and cytosolic
phospholipase A2 activation., J. Leukoc. Biol., 1999, vol 65, p 330-336.
171
GIJON M.A., SPENCER D.M., KAISER A.L., LESLIE C.C. Role of phosphorylation
sites and the C2 domain in regulation of cytosolic phospholipase A2. J. Cell. Biol., 1999, vol
145, p 1219-1232.
GILBERT J.J., STEWART A., COURTNEY C.A., FLEMING M.C., REID P.,
JACKSON C.G., WISE A., WAKELAM M.J., HARNETT M.M. Antigen receptors on
immature, but not mature, B and T cells are coupled to cytosolic phospholipase A2 activation:
expression and activation of cytosolic phospholipase A2 correlate with lymphocyte
maturation. J. Immunol., 1996, vol 156, n° 6, p 2054-2061.
GORMAN R.R., OGLESBY T.D., BUNDY G.L., HOPKINS N.K. Evidence for 15-HETE
synthesis by human umbilical vein endothelial cells. Circulation, 1985, vol 72, n° 4, p 708-
712.
GRABOWSKI E.F., JAFFE E.A., WEKSLER B.B. Prostacyclin production by cultured
endothelial cell monolayers exposed to step increases in shear stress. J. Lab. Clin. Med., 1985,
vol 105, n° 1, p 36-43.
GUAN J.L., SHALLOWAY D. Regulation of focal adhesion-associated protein tyrosine
kinase by both cellular adhesion and oncogenic transformation. Nature, 1992, vol 358, n°
6388, p 690-692.
GUO Q., CHANG S., DIEKMAN L., XIA G., KULMACZ R.J. Comparison of
prostaglandin H synthase isoform structures using limited proteolytic digestion. Arch.
Biochem. Byophys., 1997, vol 344, p 150-158.
GUO Q., WANG L-H., RUAN K-H. Rol of Val509 in time-dependent inhibitionof human
prostaglandin HH synthase-2 cyclooxygenase activity by isoform-selective agents. J. Biol.
Chem., 1996, vol 271, p 19134-19139.
GURUBHAGAVATULA I., AMRANI Y., PRATICO D., RUBERG F.L., ALBELDA
S.M., PANETTIERI R.A. Jr. Engagement of human PECAM-1 (CD31) on human
endothelial cells increases intracellular calcium ion concentration and stimulates prostacyclin
release. J. Clin. Invest., 1998, vol 101, n°1, p 212-222.
GUTKIND J.S. The pathways connecting G protein-coupled receptors to the nucleus through
divergent mitogen-activated protein kinase casacede. J. Biol. Chem., 1998, vol 273, n° 4, p
1839-1842.
HABIB A., CRÉMINON C., FROBERT GRASSI J., PRADELLES P., MACLOUF J.
Demonstration of an inducible cyclooxygenase in human endothelial cells using antibodies
raised against the carboxyl-terminal region of the cyclooxygenase-2. J. Biol. Chem., 1993, vol
268, p 23448-23454.
172
HADJIAGAPIOU C., KADUCE T., SPECTOR A.A. Eicosapentaenoic acid utilization by
bovine aortic endothelial cells : effects on prostacyclin production. Biochim. Byophys. Acta,
1986, vol 875, n° 2, p 369-381.
HADJIAGAPIOU C., SPECTOR A.A. Docosahexaenoic acid metabolism and effect on
prostacyclin production in endothelial cells. Arch. Biochem. Byophys., 1987, vol 253, n° 1, p
1-12.
HAKKERT B.C., RENTENAAR J.M., VAN MOURIK J.A. Monocytes enhance
endothelial von Willebrand factor release and prostacyclin production with different kinetics
and dependency on intercellular contact between these two cell types. Br. J. Haematol., 1992,
vol 80, n° 4, p 495-503.
HALLER H., KUNZENDORF U., SACHERER K., LINDSCHAU C., WALZ G.,
DISTLER A., LUFT F.C. T cell adhesion to P-selectin induces tyrosine phosphorylation of
pp125 focal adhesion kinase and other substrates. J Immunol., 1997, vol 158, n°3, p1061-
1067.
HANADA T., HASHIMOTO M., NOSAKA S., SASAKI T., NAKAYAMA K.,
MASUMURA S., YAMAUCHI M., TAMURA K. Shear stress enhances prostacyclin
release from endocardial endothelial cells. Life Sci., 2000, vol 66, n° 3, p 215-2120.
HANNUN Y.A., OBEID L.M. Ceramide: an intracellular signal for apoptosis. Trends.
Biochem. Sci., 1995, vol 20, n° 2, p 73-77.
HANSEN W.R., DREW A., HELSBY N., KEELAN J.A., SATO T.A., MITCHELL M.D.
Regulation of cytosolic phospholipase A2 expression by cytokines in human amnion cells.
Placenta., 1999, vol 20, n° 4, p303-308.
HANSSON G.K. Cell-mediated immunity in atherosclerosis. Curr. Opin. Lipidol., 1997, vol
8, n° 5, p 301-311.
HANSSON G.K., HELLSTRAND M., RYMO L., RUBBIA L., GABBIANI G. Interferon
gamma inhibits both proliferation and expression of differentiation-specific alpha-smooth
muscle actin in arterial smooth muscle cells. J. Exp. Med., 1989, vol, 170, n° 5, p 1595-1608.
HANSSON G.K., HOLM J., HOLM S., FOTEV Z., HEDRICH H.J., FINGERLE J. T
lymphocytes inhibit the vascular response to injury. Proc. Natl. Acad Sci. U S A, 1991, vol 88,
n° 23, p 10530-10534.
HARA S., MIYATA A., YOKOVAMA C., INOUE H., BRUGGER R., LOTTSPEICH
F., ULLRICH V., TANABE T. Isolation and molecular cloning of prostacyclin synthase
from bovine endothelial cells. J. Biol. Chem., 1994, vol 269, p 19897-19903.
173
HARALDSEN G., KVALE D., LIEN B., FARSTAD I.N., BRANDTZAEG P. Cytokine-
regulated expression of E-selectin, intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1), and vascular
cell adhesion molecule-1 (VCAM-1) in human microvascular endothelial cells. J. Immunol.,
1996, vol 156, n° 7, p 2558-2565.
HARAOKA S., SHIMOKAMA T., WATANABE T. Participation of T lymphocytes in
atherogenesis: sequential and quantitative observation of aortic lesions of rats with diet-
induced hypercholesterolaemia using en face double immunostaining. Virchows. Arch., 1995,
vol 426, n° 3, p 307-315.
HARDER D.R., CAMPBELL W.B., ROMAN R.J. Role of cytochrome P-450 enzymes and
metabolites of arachidonic acid in the control of vascular tone. J. Vasc. Res., 1995, vol 32, n°
2, 79-92.
HE H., VENEMA V.J., GU X., VENEMA R.C., MARRERO M.B., CALDWELL R.B.
Vascular endothelial growth factor signals endothelial cell production of nitric oxide and
prostacyclin through Flk-1/KDR activation of c-Scr. J. Biol. Chem., 1999, vol 274, n° 35, p
25130-25135.
HEDQVIST P., RAUD J., DAHLEN S.E. Microvascular actions of eicosanoids in the
hamster cheek pouch. Adv. Prostaglandin. Thromboxane Leukot. Res., 1990, vol 20, p 153-
160.
HEMLER M., LANDS W.E.M. Purification of the cyclooxygenase that forms
prostaglandins. Demonstration of two forms of the holoenzyme. J. Biol. Chem., 1976, vol
251, p 5575-5581.
HIDARI K.I., WEYRICH A.S., ZIMMERMAN G.A., MCEVER R.P. Engagement of P-
selectin glycoprotein ligand-1 enhances tyrosine phosphorylation and activates mitogen-
activated protein kinases in human neutrophils. J. Biol. Chem., 1997, vol 272, n° 45, p 28750-
28756.
HIRABAYASHI T., SHIMIZU T. Localization and regulation of cytosolic phospholipase
A2. Biochim. Biophys. Acta. 2000, vol 1488, p 124-138.
HIRAI A., TERANO T., YAMURA Y., YOSHIDA S. Eicosapentaenoic acid and adult
diseases in Japan: epidemiological and clinical aspects. J. Int. Med., 1989, vol 225, n°1, p 69-
75.
HIRASE T., STADDON J.M, SAITOU M, ANDO-AKATSUKA Y, ITOH M, FURUSE
M, FUJIMOTO K, TSUKITA S, RUBIN LL. Ocludin as a possible determinant of tight
jonctions permeability in endothelial cells. J. Cell. Sci., 1997, vol 110, p 1603-1613.
174
HISHINUMA T., YAMAZAKI T., MIZUGAKI M. Effects of long-term supplementation
of eicosapentaenoic and docosahexaenoic acid on the 2-., 3-series prostacyclin production by
endothelial cells. Prostaglandins Other Lipid Mediators, 1999, vol 57, p 333-340.
HOLLAND J., OWENS T. Signaling through intercellular adhesion molecule 1 (ICAM-1)
in a B cell lymphoma line. The activation of Lyn tyrosine kinase and the mitogen-activated
protein kinase pathway. J. Biol. Chem., 1997, vol 272, n° 14, p 9108-9112.
HOLLENBAUGH D., MISCHEL-PETTY N., EDWARDS C.P, SIMON J.C, DENFELD
R.W., KIENER P.A, ARUFFO A. Expression of functional CD40 by vascular endothelial
cells. J Exp Med,1995, vol 182, n°1, p 33-40.
HORNSTRA G., van HOUWELINGEN A.C., KIVITO G.A.A, FISCHER S.,
VEDELHOVEN W. Influence of dietary fish on eicosanoid metabolism in man.
Prostaglandins., 1990, vol 40, p 311-329.
HORWITZ A.F. Integrins and health. Sci. Am.,1997, vol, 276, n° 5, p 68-75.
HSI L.C., HOGANSON C.W., BABCOCK G.T., SMITH W.L. Characttherization of a
tyrosyl radical in prostaglandin endoperoxide synthase-2. Biochem. Biophys. Res. Commun.,
1994, vol 202, p 1592-1598.
HU Y., KIELY J.M., SZENTE B.E., ROSENZWEIG A., GIMBRONE M.A. Jr. E-
selectin-dependent signaling via the mitogen-activated protein kinase pathway in vascular
endothelial cells. J. Immunol., 2000, vol 165, n° 4, 2142-2148.
HUANG Z., PAYETTE P., ABDULLAH K., CROMLISH W.A., KENNEDY B.P.
Functional identification of the active-site nucleophile of the human 85-kDa cytosolic
phospholipase A2. Biochemistry, 1996, vol 35, n° 12, p 3712-3721.
HUGHES D.A., PINDER A.C. n-3 polyunsaturated fatty acids inhibit the antigen-presenting
function of human monocytes. Am. J Clin Nutr., 2000, vol 71, n° 1, p 357S-360S.
HWANG S.T., SINGER M.S., GIBLIN P.A., YEDNOCK T.A., BACON K.B., SIMON
S.I., ROSEN S.D. GlyCAM-1 a physiologic ligand for L-selectin, activates beta 2 integrins
on naive peripheral lymphocytes. J. Exp. Med., 1996, vol 184: 1343-1348.
HYNES R.O. Integrins: versatility, modulation and signalling in cell adhesion. Cell., 1992,
vol 69, p 11-25.
IGISHI T., GUTKIND J.S. Tyrosine kinases of the Src family participate in signaling to
MAP kinase from both Gq and Gi-coupled receptors. Biochem. Biophys. Res. Commun.,
1998, vol 244, n° 1, p 5-10.
175
IGNARRO L.J. Signal transduction mechanism involving nitric oxide. Biochem.
Pharmacol., 1991, vol 41, n° 4, p 485-490.
ILANGUMARAN S., BORISCH B., HOESSLI D.C. Signal transduction via CD44: role of
plasma membrane microdomains. Leuk. Lymphom., 1999, vol,35 n° 5-6, p 455-469.
INGBER D.E., PRUSTY D., FRANGIONI J.V., CRAGOE E.J. JR, LECHENE C.,
SCHWARTZ M.A. Control of intracellular pH and growth by fibronectin in capillary
endothelial cells. J. Cell. Biol., 1990, vol 110, n° 5, p 1803-1811.
INIGUEZ M.A., PUNZON C., FRESNO M. Induction of cyclooxygenase-2 on activated T
lymphocytes. Regulation of T cell activation by cyclooxygenase-2 inhibiteurs. J.
Immunol.,1999, vol 163, p 111-119.
IWAI N., KATSUYA T., ISHIKAWA K. Human prostacyclin synthase gene and
hypertension the suita study. Circulation., 1999, vol 100, p 2231-2236.
JAFFE E.A., NACHMAN R.L., BECKER C.G., MINICK C.R. Culture of human
endothelial cells derived from umbilical veins. Identification by morphologic and
immunologic criteria. J. Clin. Invest., 1973, vol 52, n° 11, p 2745-2756.
JO H., SIPOS K., GO Y.M. Differential effect of shear stress on extracellular signal-
regulated kinase and N-terminal Jun kinase in endothelial cells. Gi2- and Gbeta/gamma-
dependent signaling pathways. J. Biol. Chem., 1997, vol 272, p 1395-1401.
JOCKUSCH B.M., BUBECK P., GIEHL K., KROEMKER M., MOSCHNER J.,
ROTHKEGEL M., RUDIGER M., SCHLUTER K., STANKE G., WINKLER J. The
molecular architecture of focal adhesions. Annu. Rev. Cell. Dev. Biol., 1995, vol 11, p 379-
416.
JOHNSON D.R., HAUSER I.A., VOLL R.E., EMMRICH F. Arterial and venular
endothelial cell costimulation of cytokine secretion by human T cell clones. J. Leukoc. Biol.,
1998, vol 63, n° 5, p 612-619.
JOLLY C.A., MCMURRAY D.N., CHAPKIN R.S. Effect of dietary n-3 fatty acids on
interleukin-2 and interleukin-2 receptor alpha expression in activated murine lymphocytes.
Prostaglandins Leukot. Essent. Fatty Acids, 1998, vol 58, n° 4, p 289-293.
JONES D.A., CARLTON D.P., MCINTYRE T.M., ZIMMERMAN G.A., PRESCOTT
S.M. Molecular cloning of human prostaglandin endoperoxide synthase type II and
demonstration of expression in response to cytokines. J. Biol. Chem., 1993, vol 268, n° 12, p
9049-9054.
176
JORDAN J.D. Modulation of rap activite by direct interaction of G alpha (o) with
Rap1GTPase-activating protein. J. Biol. Chem. 1999, vol 274,p 21507-21510.
JORDAN S.C. Cytokines and lymphocytes. In Cytokines in Health and Disease. S.T. Kunkel
and D.G. Remick., eds Marcel Dekker., Inc. New York ,1991, p 309.
JOSS A., AKDIS M., FAITH A., BLASER K., AKDIS C.A. IL-10 directly acts on T cells
by specifically altering the CD28 co-stimulation pathway. Eur. J. Immunol., 2000, vol 30,
n°6, p 1683-1690.
JULIANO R.L., HASKILL S. Signal transduction from the extracellular matrix. J. Cell.
Biol., 1993, vol 120, n° 3, p 577-585
JUNG T.M., GALLATIN W.M., WEISSMAN I.L, DAILEY M.O. Down-regulation of
homing receptors after T cell activation. J. Immunol., 1988, vol 141, n° 12, p 4110-4117.
KALYANARAMAN B., MASON R.P., TAINER B., ELING T.E. The free radical formed
during the hydroperoxide-mediated deactivation of ram seminal vesicles is hemoprotein-
derived. J. Biol. Chem., 1982, vol 257, n° 9, p 4764-4768.
KAN H., RUAN Y., MALIK K.U. Involvement of mitogen-activated protein kinase and
translocation of cytosolic phospholipase A2 to the nuclear enveloppe in acetylcholine-induced
prostacyclin synthesis in rabbit coronary endothelial cells. Molec. Pharmacol., 1996, vol 50,
n° 5, p 1139-1147.
KANAYASU-TOYODA T.‚ MORITA I.‚ MUROTA S. Docosapentaenoic acid (22:5.n-3),
an elongation metabolite of eicosapentaenoic acid (20:5. n-3). Is a potent stimulator of
endothelial cell migration on pretreatment in vitro. Prostaglandins. Leukot. Essent. Fatty
Acids‚ 1996, vol 54, n° 5‚ p 319-325
KANG J.X., MAN S.F., HIRSH A.J., CLANDININ M.T. Characterization of platelet-
activating factor binding to human airway epithelial cells: modulation by fatty acids and ion-
channel blockers. Biochem. J., 1994, vol 303, n° 3, p 795-802.
KAYA H., PATTON G.M., HONG S.L. Bradykinin-induced activation of phospholipase
A2 is independent of the activation of phosphoinositide-hydrolyzing phospholipase C. J. Biol.
Chem., 1989, vol 264, n°9, p 4972-4977.
KEELAN M., DORING K., TAVERNINI M., WIERZBICKI E., CLANDININ M.T.
Dietary omega 3 fatty acids and cholesterol modify enterocyte microsomal membrane
phospholipids, cholesterol content and phospholipids enzyme activities in diabetic rats.
Lipids, 1994, vol 29, n° 12, p 851-858.
KELI S.O., FESKENS E.J., KROMHOUT D. Fish comsumption and risk of stroke. The
Zutphen Study. Stroke, 1994, vol 25, n° 2, p 328-332.
177
KHALFOUN B., THIBAULT F., WATIER H., BARDOS P., LEBRANCHU Y.
Docosahexaenoic and eicosapentaenoic acids inhibit in vitro human endothelial cell
production of interleukin-6. Adv. Exp. Med. Biol., 1997, vol 400B, p 589-597.
KHALFOUN B., THIBAULT G., BARDOS P., LEBRANCHU Y. Docosahexaenoic and
eicosapentaenoic acids inhibit in vitro human lymphocyte-endothelial cell adhesion.
Transplantation., 1996, vol 62, n° 11, p 1649-1657.
KHALFOUN B., THIBAULT G., LACORD M., GRUEL Y., BARDOS P.,
LEBRANCHU Y. Docosahexaenoic and eicosapentaenoic acids inhibit human
lymphoproliferative responses in vitro but not the expression of T cell surface activation
markers. Scand. J. Immunol., 1996, vol 43, n° 3, p 248-256.
KIM H.J., TAKAHASHI M., EZAKI O. Fish oil feeding decreases mature sterol regulatory
element-binding protein 1 (SREBP-1) by down-regulation of SREBP-1c mRNA in mouse
liver. A possible mechanism for down-regulation of lipogenic enzyme mRNAs. J. Biol.
Chem., 1999, vol 274, n° 36, p 25892-25898.
KOLLER A., KALEY G. A new role for prostaglandins in the regulation of peripheral
resistance. Adv Prostaglandin. Thromboxane Leukot. Res., 1991a, vol 21B, p 595-598.
KOLLER A., KALEY G. Endothelial regulation of wall shear stress and blood flow in
skeletal muscle microcirculation. Am. J. Physiol., 1991b, vol 260, n° 3, p H862-H868.
KOLLER A., KALEY G. Prostaglandins mediate arteriolar dilation to increased blood flow
velocity in skeletal muscle microcirculation. Circ. Res., 1990, vol 67, n° 2, p 529-534.
KOYASU S., TSE A.G., MOINGEON P., HUSSEY R.E., MILDONIAN A.,
HANNISIAN J., CLAYTON L.K., REINHERZ E.L. Delineation of a T-cell activation
motif required for binding of protein tyrosine kinases containing tandem SH2 domains. Proc.
Natl. Acad. Sci. U S A, 1994, vol 91, n° 14, p 6693-6697.
KRAMER R.M., ROBERTS E.F., UM S.L., BORSCH-HAUBOLD A.G., WATSON
S.P., FISHER M.J., JAKUBOWSKI J.A. p38 mitogen-activated protein kinase
phosphorylates cytosolic phospholipase A2 (cPLA2) in thrombin-stimulated platelets.
Evidence that proline-directed phosphorylation is not required for mobilization of arachidonic
acid by cPLA2. J. Biol. Chem., 1996, vol 271, n° 44, p 27723-27729.
KRAMER R.M., SHARP J.D. Structure., function and regulation of Ca2+ sensitive
cytosolic phospholipase A2 (cPLA2). FEBS Lett.,1997, vol 410, n° 1, p 49-53.
KROMHOUT D. n-3 fatty acids and coronary heart disease: epidemiology from Eskimos to
Western populations. J. Int. Med., 1989, vol 225, n° 1, p 47-51.
178
KROMHOUT D., BOSSCHIETER E.B., DE-LEZENNE COULANDER C. The inverse
relation between fish consumption and 20-year mortality from coronary heart disease. New.
Engl. J. Med., 1985, vol 312, n° 19, p 1205-1209.
KUJUBU D.A., FLETCHER B.S., VARNUM B.C., LIM R.W., HERSCHMAN H.R.
TIS10., a phorbol ester tumor promoter-inducible mRNA from Swiss 3T3 cells., encodes a
novel prostaaglandin synthase/cyclooxygenase homologue. J. Biol. Chem., 1991, vol 266, p
12866-12872.
KUO L., DAVIS M.J., CHILIAN W.M. Endothelium-dependent, flow-induced dilation of
isolated coronary arterioles. Am. J. Physiol., 1990, vol 259, n° 4, p H 1063-H1070.
KURUMBAIL R.G., STEVENS A.M., GIERSE J.K., Mc DONALD J.J. Structural basis
for selective inhibition of cyclooxygenase-2 by anti-inflammatory agents. Nature., 1996, vol
384, p 644-648.
KURZROK R., LIEB C.C. Biochemical studies of human semen II. The action of semen on
the human uterus . Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 1930, vol 28, p 268-272.
LaFLAMME S.E., AUER K.L. Integrin signaling. Semin. Cancer. Biol., 1996, vol 7, n° 3, p
111-118.
LAMONTAGNE D., KONIG A., BASSENGE E., BUSSE R. Prostacyclin and nitric oxide
contribute to the vasodilator action of acetylcholine and bradykinin in the intact rabbit
coronary bed. J. Cardiovasc. Pharmacol., 1992, vol 20, n°4, p 652-657.
LANEUVILLE O., BREUER D.K., XU N., HUANG. Z.H., GAGE D.A., WATSON J.T.,
LAGARDE M., DeWITT D.L., SMITH W.L. Fatty acid substrate specificities of human
prostaglandin-endoperoxide H synthase-1 and 2. J. Biol. Chem., 1995, vol 270, p 19330-
19336.
LANGENBACH R., TIANO M.S.G., LOFTIN H. Prostaglandin synhase 1 gene disruption
in mice reduces arachidonic acid-induced inflammation and indomethacine-induced gastric
ulceration. Cell., 1996, vol 83, p 483-492.
LAUDANNA C., CONSTANTIN G., BARON P., SCARPINI E., SCARLATO G.,
CABRINI G., DECHECCHI C., ROSSI F., CASSATELLA M.A., BERTON G.
Sulfatides trigger increase of cytosolic free calcium and enhanced expression of tumor
necrosis factor-alpha and interleukin-8 mRNA in human neutrophils. Evidence for a role of L-
selectin as a signaling molecule. J. Biol. Chem., 1994, vol 269, n° 6, p 4021-4026.
LAWRENCE R., SORRELL T. Eicosapentaenoic acid in cystic fibrosis: evidence of a
pathogenetic rôle for leukotriene B4. Lancet, 1993, vol 342, n° 8869, p 465-469.
179
LAWSON C., AINSWORTH M., YACOUB M., ROSE M. Ligation of ICAM-1 on
endothelial cells leads to expression of VCAM-1 via a nuclear factor-kappaB-independent
mechanism. J. Immunol., 1999, vol 162, n° 5, p 2990-2996.
LEAF A, WEBER P.C. Cardiovascular effects of n-3 fatty acids. N. Engl. J. Med., 1988, vol
318, n°9, p 549-557.
LECOMTE M., LANEUVILLE O., JI C. Acetylation of human prostaglandin
endoperoxide synthase-2(cyclooxygenase-2) by aspirin. J. Biol. Chem., 1994, vol 269, p
13207-13215.
LEE K.M., VILLEREAL M.L.Tyrosine phosphorylation and activation of pp60c-src and
pp125FAK in bradykinin-stimulated fibroblasts. Am. J. Physiol., 1996, vol 270, n° 5, p
C1430-C1437.
LEE S.H., SOYOOLA E., CHANMUGAM P., HART S., SUN W., ZHONG H., LIOU S.,
SIMMONS D., HWANG D. Selective expression of mitogen-inducible cyclooxygenase in
macrophages stimulated with lipopolysaccharide. J. Biol. Chem., 1992, vol 267, n° 36, p
25934-25938.
LEE T.H., HORTON C.E., KYAN-AUNG U., HASKARD D., CREA A.E., SPUR B.W.
Lipoxin A4 and lipoxin B4 inhibit chemotactic responses of human neutrophils stimulated by
leukotriene B4 and N-formyl-L-methionyl-L-leucyl-L-phenylalanine. Clin. Sci., 1989, vol 77,
n°2, p195-203.
LESLIE C.C. Properties and regulation of cytosolic phospholipase A2. J. Biol. Chem., 1997,
vol 272, n°27, p 16709-16712.
LI S., PIOTROWICZ R.S., LEVIN E.G. Fluid shear stress induces the phosphorylation of
small heat shock proteins in vascular endothelial cells. Am. J. Phys., 1996, vol 271, p C994-
C1000.
LIDINGTON EA, MOYES DL, MCCORMACK AM, ROSE ML. A comparison of
primary endothelial cells and endothelial cell lines for studies of immune interactions.
Transpl. Immunol., 1999, vol 7, n° 4, p 239-246.
LIEBENHOFF U., BROCKMEIER D., PRESEK P. Substrate affinity of the protein
tyrosine kinase pp60c-src is increased on thrombin stimulation of human platelets. Biochem.
J., 1993, vol 295, n° 1, p 41-48.
LIN L.L., WARTMANN M., LIN A.Y. cPLA2 is phosphorylated and activated by MAP
kinase. Cell., 1993, vol 72, n° 2, p 269-278.
180
LOPEZ-ILASACA M., CRESPO P., PELLICI P.G., GUTKIND J.S., WETZKER R.
Linkage of G protein-coupled receptors to MAPK signaling pathways through PI3-kinase
gamma. Science., 1997, vol 275, n° 5298, p 394-397.
LOU J., DAYER J.M., GRAU G.E., BURGER D. Direct cell/cell contact with stimulated T
lymphocytes induces the expression of cell adhesion molecules and cytokines by human brain
microvascular endothelial cells. Eur. J. Immunol., 1996, vol 26, p 3107-3113.
LOUET J.F., CHATELAIN F., DECAUX J.F., PARK E.A., KOHL C., PINEAU T.,
GIRARD J., PEGORIER J.P. Long-chain fatty acids regulate liver carnitine
palmitoyltransferase I gene (L-CPT I) expression through a peroxisome-proliferator-activated
receptor alpha (PPARalpha)-independent pathway. Biochem. J., 2001, vol 354, p 189-197.
LUBERTO C., HANNUN Y.A. Sphingomyelin synthase, a potential regulator of
intracellular levels of ceramide and diacylglycerol during SV40 transformation. Does
sphingomyelin synthase account for the putative phosphatidylcholine-specific phospholipase
C. J. Biol. Chem., 1998, vol 273, n° 23, p 14550-14559.
LUONG C., MILLER A., BARNETT J., CHOW J., RAMESHA C., BROWNER M.
Flexibility of the NSAID binding site in the structure of human cyclooxygenase-2. Nature
Struct. Bioll., 1996, vol 3, p 927-933.
LUSCHEN S., ADAM D., USSAT S., KREDER D., SCHNEIDER-BRACHERT W.,
KRONKE M., ADAM-KLAGES S. Activation of ERK1/2 and cPLA(2) by the p55 TNF
receptor occurs independently of FAN. Biochem. Biophys. Res. Commun., 2000, vol 274, n°
2, p 506-512.
LUTTRELL L.M. Regulation of tyrosine kinase cascades by G-protein-coupled
receptors.Curr. Opin. Cell. Biol., 1999, vol 11, p 177-183.
LUTTRELL L.M., HAWES B.E., van BIESEN T., LUTTRELL D.K., LANSING T.J.,
LEFKOWITZ R.J. Role of c-Src tyrosine Kinase in G protein-coupled receptor and G-βγ
subunit-mediated activation of mitogen–activated protein kinases. J. Biol. Chem., 1996, vol
271, n°32, p 19443-19450.
MAI J., GOSWAMI S.K., BRUCKNER G., KINSELLA J.E. A new prostaglandin, C22-
PGF4 alpha, synthesized from docosahexaenoic acid (C22:6n3) by trout gill. Prostaglandins,
1981, vol 21, n° 5, p 691-698.
MANTOVANI A., BUSSOLINO F., DEJANA E. Cytokine regulation of endothelial cell
function. FASEB J., 1992, vol 6, n° 8, p 2591-2599.
181
MARNETT L.J., CHEN Y-N.P., MADDIPATI K.R., PLE P., LABEQUE R. Functional
differentiation of cyclooxygenase and peroxidase activities of prostaglandin synthase by
trypsin treatment. J. Biol. Chem., 1988, vol 263, p 16532-26535.
MARSHALL P.J., KULMACZ R.J. Prostaglandin H synthase., distinct binding sites for
cyclooxygenase and peroxidase. Arch. Biochem. Biophys.,1988, vol 266, n° 1, p 162-170.
MASFERRER J.L., ZWEIFEL B.S., MANNING P.T., HAUSER S.D., LEAHY K.M.,
SMITH W.G., ISAKSON P.C., SEIBERT K. Selective inhibition of inducible
cyclooxygenase 2 in vivo is antiinflammatory and nonulcerogenic. Proc. Natl. Acad Sci. USA,
1994, vol 91, n° 8, p 3228-3232.
MAY M.J., WHEELER-JONES C.P., PEARSON J.D. Effects of protein tyrosine kinase
inhibitors on cytokine-induced adhesion molecule expression by human umbilical vein
endothelial cells. Br. J. Pharmacol., 1996, vol 118, n° 7, p 1761-1771.
McALLISTER T.N., DU T., FRANGOS J.A. Fluid shear stress stimulates prostaglandin
and nitric oxide release in bone marrow-derived preosteoclast-like cells. Biochem. Biophys.
Res. Commun., 2000, vol 270, n° 2, p 643-678.
McCALL T.B., BOUGHTON-SMITH N.K., PALMER R.M., WHITTLE B.J.,
MONCADA S. Synthesis of nitric oxide from L-arginine by neutrophils. Release and
interaction with superoxide anion. Biochem. J.,1989, vol 261, n° 1, p 293-296.
McCARRON R.M. IL-1-induced prostacyclin production by cerebral vascular endothelial
cells inhibits myelin basic protein-specific lymphocyte proliferation. Cell. Immunol., 1992,
vol 145, n° 1, p 21-29.
McCORMICK S.M., WHITSON P.A., WU K.K., MCINTIRE L.V. Shear stress
differentially regulates PGHS-1 and PGHS-2 protein levels in human endothelial cells. Ann.
Biomed. Eng., 2000, vol 28, n° 7, p 824-833.
McLEES A., GRAHAM A ., MALARKEY K ., GOULD G.W., PLEVIN R. Regulation of
lysophosphatidic acid-stimulated tyrosine phosphorylation of mitogen-activated protein
kinase C-ad pertussis toxin-dependent pathways in the endothelial cell line Eahy926.
Biochem. J., 1995, vol 307, n° 3, p 743-748.
McLENNAN P., HOWE P., ABEYWARDENA M., MUGGLI R., RAEDERSTORFF D.,
MANO M., RAYNER T., HEAD R. The cardiovascular protective rôle of docosahexaenoic
acid. European. J. Pharmacol., 1995, vol 300, p 83-89.
McMURRAY D.N., JOLLY C.A., CHAPKIN R.S. Effects of dietary n-3 fatty acids on T
cell activation and T cell receptor-mediated signaling in a murine model. J. Infect. Dis., 2000,
vol 182 Suppl., n° 1, p S103-S107.
182
MEADE E.A., SMITH W.L., DE WITT D.L. Differential inhibition of prostaglandin
endoperoxyde synthase (cyclooxygenase) isozymes by aspirin and other non-steroidal anti-
inflammatory drugs. J. Biol. Chem., 1993, vol 268, p 6610-6614.
MELIEN Ø., THORESEN G.H., SANDNES D., ØSTBY E., CHRISTOFFERSEN T.
Activation of p42/p44 mitogen activated protein Kinase by angiotensin II., vasopressin.,
norepinephrine., and prostaglandin F2α in hepatocyes is sustained., and like the effect of
epidermal growth factor, mediated through pertussis toxin-sensitive mechanisms. J. Cell.
Physiol., 1998, vol 175, n°3, p 348-358.
MERHI-SOUSSI F., DOMINGUEZ Z., MACOVSCHY O., DUBOIS M., NEMOZ G.,
LAGARDE M., PRIGENT AF. Mechanism involved in the stimulation of prostacyclin
synthesis by human lymphocytes in human umbilical vein endothelial cells. (en préparation).
MERHI-SOUSSI F., DOMINGUEZ Z., MACOVSCHY O., DUBOIS M., SAVANI A.,
LAGARDE M., PRIGENT AF. Human lymphocytes stimulate prostacyclin synthesis in
human umbilical vein endothelial cells. Invollvement of endothelial cPLA2. J.Leeukoc.Biol,
2000, vol 68, p, 881-889.
MEYDANI S.N., ENDRES S., WOODS M.M., GOLDIN B.R., SOO C., MORRILL-
LABRODE A., DINARELLO C.A., GORBACH S.L. Oral (n-3) fatty acid supplementation
suppresses cytokine production and lymphocyte proliferation: comparison between young and
older women. J. Nutr., 1991, vol 121, n° 4, p 547-555.
MEYERS D.G., MALOLEY P.A. The antioxidant vitamins: impact on atherosclerosis.
Pharmacotherapy, 1993, vol 13, n° 6, p 574-582.
MILES E.A., WALLACE F.A., CALDER P.C. Dietary fish oil reduces intercellular
adhesion molecule 1 and scavenger receptor expression on murine macrophages.
Atherosclerosis., 2000, vol 152, n° 1, p 43-50.
MILLER D.K., SADOWSKI S., SODERMAN D.D., KUEHL J.R. Endothelial cell
prostacyclin production induced by activated neuttrophils. J. Biol. Chem., 1985, vol 260, p
1006-1014.
MIYAMOTO S., TERAMOTO H., COSO O.A., GUTKIND J.S., BURBELO P.D.,
AKIYAMA S.K., YAMADA K.M. Integrin function: molecular hierarchies of cytoskeletal
and signaling molecules. J. Cell. Biol., 1995, vol 131, n° 3, p 791-805.
MIYATA A., HARA S., YOKOYAMA C., INOUE H., ULLRICH V., TANABE T.
Molecular cloning and exprression of human prostacyclin synthase. Biochem. Biophys. Res.
Commun., 1994, vol 200, n° 3, p 1728-1734.
183
MOCHIZUKI N. Activation of the ERK/MAP pathway by an isoform of the rap1GAP
associated with Galphai. Nature, 1999, vol 400, p 891-894.
MONCADA S., VANE J.R. The role of prostacyclin in vascular tissue. Fed. Proc., 1979, vol
38, n° 1, p 66-71.
MORHAM S,. LANGENBACH R., LOFTIN C., TIANO H. Prostaglgandin synthase 2
gene disruption causes severe renal pathology in the mouse. Cell., 1996, vol 83, p 493-501
MORRISON D.K., CUTLER R.E. The complexity of Raf-1 regulation. Curr. Opin. Cell.
Biol., 1997, vol 9, n° 2, p 174-179.
MORSON L.A., CLANDININ M.T. Diets varying in linoleic and linolenic acid content
alter liver plasma membrane lipid composition and glucagon- stimulated adenylate cyclase
activity. J. Nutr., 1986, vol 116, n° 2, p 2355-2362.
MULLER W.A., WEIGL S.A., DENG X., PHILLIPS D.M. PECAM-1 is required for
transendothelial migration of leukocytes. J. Exp. Med., 1993, vol 178, n° 2, p 449-460.
MUNRO J.M., POBER J.S., COTRAN R.S. Tumor necrosis factor and interferon-gamma
induce distinct patterns of endothelial activation and associated leukocyte accumulation in
skin of Papio anubis. Am. J. Pathol., 1989, vol 135, n° 1, p 121-133.
MURAKAMI M., KAMBE T., SHIMBARA S., KUDO I. Functional coupling between
various phospholipase A2s and cyclooxygenases in immediate and delayed prostanoid
biosynthetic pathways. J. Biol. Chim., 1999, vol 275, p 3103-3115.
MURAKAMI M., KUDO I., INOUE K. Molecular nature of phospholipase A2 involved in
prostaglandin I2 synthesis in human umbilical vein endothelial cells. Possible participation of
cytosolic and extracellular type II phospholipases A2. J. Biol. Chem., 1993, vol 268, n ° 2, p
839-844.
MURAKAMI M., KUDO I., INOUE K. Secretory phospholipase A2. J. Lipid Mediat. Cell.
Signal., 1995a, vol 12, p 119-130.
MURAKAMI M., MATSUMOTO R., URADE Y., AUSTEN K.F., ARM J. cKit ligand
mediates increased expression of cytosolic phospholipase A2., prostaglandin endoperoxyde
synthase-1., and hematopoietic prostaglandin D2 synthase and increased IgE-dependent
prostaglandin D2 generation in immature mouse mast cells. J. Biol. Chem., 1995b, vol 270, n°
7, p 3239-3246.
MURAKAMI M., NAKATANI Y., ATSUMI G., INOUE K., KUDO I. Regulatory
functions of phospholipase A2. Crit. Rev. Immunol., 1997a, vol 17, n° 3-4, p 225-283.
184
MURAKAMI M., TADA K., NAKAJIMA K-I., KUDO I. Ciclooxygenase-2-dependent
delayed prostaglandin D2 generation is initiaded by nerve growth factor in rat peritoneal mast
cells. J. Immunol., 1997b, vol 159, p 439-446.
MURPHY E.J., JOSEPH L., STEPHENS R., HORROCKS L. Phospholipid composition
of cultured human endothelial cells. Lipids, 1992, vol 27, n° 2, p 150-153.
NAKAKI T., OHTA M., KATO R. Inhibition of endothelin-1-induced DNA synthesis by
prostacyclin and its stable analogues in vascular smooth muscle cells. J. Cardiovasc.
Pharmacol., 1991, vol 17, n° 7, p S177-S178.
NALEFSKI E.A., SULTZMAN L.A., MARTIN D.M., KRIZ R.W., TOWLER P.S.,
KNOPF J.L., CLARK J.D. Delineation of two functionally distinct domains of cytosolic
phospholipase A2., a regulatory Ca(2+)-dependent lipid binding domain and a Ca(2+)-
independent catalytic domaine. J. Biol. Chem., 1994, vol 269, n° 27, p 18239-18249.
NATHAN C. Nitric oxide as a secretory product of mammalian cells. FASEB J., 1992, vol 6,
n° 12, p 3051-3064.
NAVARRO P., RUCO L., DEJANA E. Differential localization of VE- and N-cadherins in
human endothelial cells: VE-cadherin competes with N-cadherin for junctional localization. J.
Cell. Biol., 1998, vol 140, n° 6, p 1475-1484.
NEEDLEMAN P.‚ RAZ A.‚ MINKES M.S.‚ FERRENDELLI J.A., SPRECHER H.
Triene prostaglendins: prostacyclin and thromboxane biosynthesis and unique biological
properties. Proc.Natl.Acad. Sci., 1979, vol 76, n° 2, p 944-948.
NEMENOFF R.A., WINITZ S., QIAN N.X. Phosphorylation and activation of a high
molecular weight form of phospholipase A2 by p42 microtubule-associated protein 2 kinase
and protein kinase C. J. Biol. Chem., 1993, vol 268, n° 3, p 1960-1964.
NEURINGER M., ANDERSON G.J., CONNOR W.E. The essentiality of n-3 fatty acids
for the development and function of the retina and brain. Annu. Rev. Nutr., 1988, vol 8, p 517-
41.
NEVALAINEN T.J. Serum pho pholipases A2 in infammatory diseases. Clin. Chem., 1993,
vol 39, p 2453-2459.
NEWMAN P.J. Switched at birth: a new family for PECAM-1. J. Clin. Invest., 1999, vol
103, n° 1, p 5-9.
NEWTON-NASH DK, NEWMAN PJ. A new role for platelet-endothelial cell adhesion
molecule-1 (CD31): inhibition of TCR-mediated signal transduction. J Immuno., 1999, vol
163, n° 2, p 682-688.
185
NISHIYAMA M., WATANABE T., UEDA N., TSUKAMOTO H., WATANABE K.
Arachidonate 12-lipoxygenase is localized in neurons., glial cells., and endothelial cells of the
canine brain. J. Histochem. Cytochem., 1993, vol 41, n° 1, p 111-117.
NOBLE K.E.P., PANAYIOTIDIS P.W., COLLINS A.V., HOFFBRAND., YONG K.L.
Monocytes induce E-selectin gene expression in endothelial cells: role of CD11/CD18 and
extracellular matrix proteins. Eur. J. Immunol., 1996, vol 26, n° 12, p 2944-2951.
NOLLERT M.U., HALL E.R., ESKIN S.G., McINTIRE L.V. The effect of shear stress on
the uptake and metabolism of arachidonic acid by human endothelial cells. Biochim. Biophys.
Acta, 1989, vol 1005, n° 1, p 72-78.
NUSING R., LESCH R., ULLRICH V. Immunohistochemical localization of thromboxane
synthase in human tissues. Eicosanoids, 1990., vol. 3., n°1, p 53-58.
O'BRIEN K.D., MCDONALD T.O., CHAIT A., ALLEN M.D., ALPERS C.E.
Neovascular expression of E-selectin, intercellular adhesion molecule-1, and vascular cell
adhesion molecule-1 in human atherosclerosis and their relation to intimal leukocyte content.
Circulation, 1996, vol 93, n° 4, p 672-682.
OKAHARA K., SUN B., KAMBAYASHI J.U. Upregulation of prostacyclin synthesis-
related gene expression by shear stress in vascular endothelial cells. Arterioscler. Thromb.
Vasc. Biol., 1998, vol 18, n° 12, p1922-1926.
ONO M., NAKAJIMA J., LEE M.C., TAKAMOTO S. Influence of cryopreservation on
antigen expression and immunogenicity of human vascular endothelial cells. Transplant.
Proc., 1999, vol 31, n°1-2, p 985-987.
ORTIZ H.N., BOSCH V. Ácidos grasos en pescado de mar y de río de uso común en
Venezuela. II Congreso Solat. Sociedad Latinoamericana de Aterosclerosis. Abstract: 97.,
1993.
OSAWA M., MASUDA M., HARADA N., LOPES R.B., FUJIWARA K. Tyrosine
phosphorylation of platelet endothelial cell adhesion molecule-1 (PECAM-1, CD31) in
mechanically stimulated vascular endothelial cells. Eur. J. Cell. Biol., 1997 , vol 72, n°3, p
229-237.
OTTO J.C., SMITH W.L. Prostaglandin endoperoxyde synthase-1 and –2. J. Lipid Mediat.
Cell. Signal., 1995, vol 12, p 139-156.
OTTO J.C., SMITH W.L. The orientation of prostaglandin endoperoxydesynthases-11 and
2 in the endoplasmic reticulum. J. Biol .Chem., 1994, vol 269, p 19868-19875.
186
PAGE C.S., HOLLOWAY N., SMITH H., YACOUB M., ROSE M.L. Alloproliferative
responses of purified CD4+ and CD8+ T cells to endothelial cells in the absence of
contaminating accessory cells. Transplantation., 1994 , vol 57, n° 11, p 1628-1637.
PAKALA R., PAKALA R., SHENG W.L., BENEDICT C.R. Serotonin fails to induce
proliferation of endothelial cells preloaded with eicosapentaenoic acid and docosahexaenoic
acid. Atherosclerosis., 1999, vol 145, p 137-146.
PAPAYIANNI A., SERHAN C.N., BRADY H.R. Lipoxin A4 and B4 inhibit leukotriene-
stimulated interactions of human neutrophils and endothelial cells. J. Immunol., 1996, vol
156, n° 6, p 2264-2272.
PARKS J.S., KADUCK-SAWYER J., BULLOCK B.C., RUDEL L. Effect of dietary fish
oil on artery and aortic atherosclerosis in African green monkeys. Arteriosclerosis. 1990, vol
10, n° 6, p 1102-1112.
PARSONS J.T., PARSONS S.J. Src family protein tyrosine kinases: cooperating with
growth factor and adhesion signaling pathways. Curr Opin Cell Biol., 1997, vol 9, n° 2, p
187-192.
PASCAUD M., BROUARD C. Acides gras polyinsaturés essentiels ω-6 et ω-3. Besoins
nutritionnels., équilibres alimentaires. Cah. Nutr. Diét. XXVI, 1991, vol 3, p 185-190.
PATEL K.D., MOORE K.L., NOLLERT M.U., MCEVER R.P. Neutrophils use both
shared and distinct mechanisms to adhere to selectins under static and flow conditions. J.
Clin. Invest., 1995, vol 96, n°4, p1887-1896.
PEGORIER J.P. Regulation of gene expression by fatty acids. Curr. Opin. Clin. Nutr.
Metab. Care., 1998, vol 1, n°4, p 329-334.
PIALI L., ALBELDA S.M., BALDWIN H.S., HAMMEL P., GISLER R.H. Imhof BA
Murine platelet endothelial cell adhesion molecule (PECAM-1)/CD31 modulates beta 2
integrins on lymphokine-activated killer cells. Eur. J. Immunol., 1993, vol 23, n° 10, p 2464-
2471.
PICOT D., LOLL P.J., GARAVITO R.M. The X-ray crystal structure of the membrane
protein prostaglandin H2 synthase-1. Nature, 1994, vol 367, n° 6460, p 243-249.
PIERCE J., SUELTER C.H. An evaluation of the coomassie brillant blue G-250 dye-
binding method for quantitative protein determination. Anal. Biochem., 1977, vol 81, p 478-
480.
187
PIGOTT R., NEEDHAM L.A., EDWARDS., R.M. Structural and functional studies of the
endothelial activation antigen endothelial leukocyte adhesion molecule –1 using a panel of
monoclonal antibodies. J. Immunol., 1991, vol 147, p 130-135.
POBER J.S. Cytokine-mediated activation of vascular endothelium. Physiology and
pathology. Am. J. Pathol., 1988, vol 133, n° 3, p 426-433.
POBER J.S., GIMBRONE M.A. Jr, COTRAN R.S., REISS C.S., BURAKOFF S.J.,
FIERS W., AULT K.A. Ia expression by vascular endothelium is inducible by activated T
cells and by human gamma interferon. J. Exp. Med., 1983, vol 157, n°4, p 1339-1353.
POMERANTZ K.B., NICHOLSON A.C., HAJJAR D.P. Signal transduction in
atherosclerosis: second messengers and regulation of cellular cholesterol trafficking. Adv.
Exp. Med. Biol., 1995, vol 369, p 49-64.
POUDRIER J., OWENS T. CD54/intercellular adhesion molecule 1 and major
histocompatibility complex II signaling induces B cells to express interleukin 2 receptors and
complements help provided through CD40 ligation. J. Exp. Med., 1994, vol 179, n° 5, p 1417-
1427.
PRITCHARD K.A.J.r., WONG P.Y., STEMERMAN M.B. Atherogenic concentrations of
low-density lipoprotein enhance endothelial cell generation of epoxyeicosatrienoic acid
products. Am. J. Pathol., 1990, vol 136, n° 6, p 1383-1391.
QIU Z.H., GIJON M.A., DE CARVALHO M.S. The role of calcium and phosphorylation
of cytosolic phospholipase A2 in regulating acid release in macrophages. J. Biol. Chem., 1998,
vol 273, p 8203-8211.
QIU Z.H., LESLIE C.C. Protein kinase C-dependent and -independent pathways of
mitogen-activated protein kinase activation in macrophages by stimuli that activate
phospholipase A2. J. Biol. Chem., 1994, vol 269, n° 30, p 19480-19487.
RAINGER G.E., WAUTIER M.P., NASH G.B., WAUTIER J.L. Prolonged E-selectin
induction by monocytes potentiates the adhesion of flowing neutrophils to cultured
endothelial cells. Br. J. Haematol., 1996, vol 92, n° 1, p 192-1999.
RAMBJOR G.S., WALEN A.I., WINDSOR S.L., HARRIS W.S. Eicosapentaenoic acid is
primarily responsible for hypotriglyceridemic effect of fish oil in humans. Lipids, 1996, vol
31, p S45-S49.
RAMBJØR R.S., WALEN A.I., WINDSOR S.L., HARRIS W.S. Eicosapentaenoic acid is
primarily responsible for hypotriglyceridemic effect of fish oil in humans. Lipids, 1996, vol
31, p S-45-S49.
188
RAZ A., WYCHE A., SIEGEL N., NEEDLEMAN P. Regulation of fibroblast
cyclooxygenase synthesis by interleukin-1. J. Biol. Chem., 1988, vol 263, p 3022-3028.
REDDY S.T., HERSCHMAN H.R. Ligand-induced prostaglandin synthesis requires
expression of the TIS10/PGS-2 prostaglandin synthase gene in murine fibroblast and
macrophages. J. Biol. Chem., 1994, vol 269, p 15473-15480.
REDDY S.T., HERSCHMAN H.R. Prostaglandin synthase-1 and prostaglandin synthase-2
are coupled to distinct phospholipase for the generation of prostaglandin D2 in activated mast
cells. J. Biol. Chem., 1997, vol 272,p 3231-3237.
REVERDIAU-MOALIC P., WATIER H., IOCHMANN S., POUPLARD C., RIDEAU
E., LEBRANCHU I., BARDOS P., GRUEL Y. Human allogeneic lymphocytes trigger
endothelial cell tissue factor expression by a tumor necrosis factor-dependent pathway. J.
Lab. Clin. Med., 1998, vol 132, p 530-540.
RISAU W. Differentiation of enddothelium. FASEB J., 1995, vol 9, p 926-933.
RISSANEN T., VOUTILAINEN S., NYYSSONEN K., LAKKA T.A., SALONEN J.T.
Fish Oil-Derived Fatty Acids. Docosahexaenoic Acid and Docosapentaenoic Acid, and the
Risk of Acute Coronary Events : The Kuopio Ischaemic Heart Disease Risk Factor Study.
Circulation, 2000, vol 102, n° 22, p 2677-2679.
RISTIMAKI A., VIINIKKA L. Modulation of prostacyclin production by cytokines in
vascular endothelial cells. Prostaglandins Leukot Essent Fatty Acids, 1992, vol 47, n° 2, p 93-
94.
ROCHE H.M., GIBNEY M.J. Long-chain n-3 polyunsaturated fatty acids and
triacylglycerol metabolism in the postprandial state. Lipids, 1999, vol 34 (Suppl), pS259-
S265.
ROITT I., BROSTOFF J., MALE D. Immunology. 4th ed. Mosby eds. 1996, ISBN 0
723421781.
ROSSI V., BREVIARIO F., GHEZZI P., DEJANA E., MANTOVANI A. Prostacyclin
synthesis induced in vascular cells by interleukin-1. Science, 1985, vol 229, n° 4709, p 174-
176.
ROTHLEIN R., CZAJKOWSKI M., O'NEILL M.M., MARLIN S.D., MAINOLFI E.,
MERLUZZI V.J. Induction of intercellular adhesion molecule 1 on primary and continuous
cell lines by pro-inflammatory cytokines. Regulation by pharmacologic agents and
neutralizing antibodies. J. Immunol., 1988, vol 141, n° 5, p 1665-1669.
189
ROUZER C.A., SCOTT W.A., KEMPE J., COHN Z.A. Prostaglandin synthesis by
macrophages requires a specific receptor-ligand interaction. Proc. Natl. Acad Sc.i U S A,
1980, vol 77, n° 7, p 4279-4282.
SA G., MURUGESAN G., JAYE M., IVASHCHENKO Y., FOX P.L. Activation of
cytosolic phospholipase A2 by basic fibroblast growth factor via p42 mitogen-activated
protein kinase-dependent phosphorylation pathway in endothelial cells. J. Biol. Chem., 1995,
vol 270, p 2360-2366.
SAITO J., TERANO T., HIRAI A., SHIINA T., TAMURA Y., SAITO Y. Mechanism of
enhanced production of PGI2 in cultured rat vascular smooth muscle cells enriched with
eicosapentaenoic acid. Atherosclerosis., 1997, vol 131, p 219-228.
SAKUMOTO R., MURAKAMI S., OKUDA K. Tumor necrosis factor-alpha stimulates
prostaglandin F2alpha secretion by bovine luteal cells via activation of mitogen-activated
protein kinase and phospholipase A2 pathways. Mol. Reprod. Dev., 2000, vol 56, n° 3, p 387-
391.
SANDERS T.A. Effects of fish oils on lipid metabolism. Nutrition, 1989, vol 5, n° 4, p 248-
50.
SANDERS T.A., HINDS A. The influence of a fish oil high in docosahexaenoic acid on
plasma lipoprotein and vitamin E concentrations and haemostatic function in healthy male
volunteers. Br. J. Nutr., 1992, vol 68, n° 1, p 163-173.
SANDERS W.E., WILSON R.W., BALLANTYNE C.M., BEAUDET A.L. Molecular
cloning and analysis of in vivo expression of murine P-selectin. Blood., 1992, vol 80, n° 3, p
795-800.
SANDERSON P , CALDER P.C. Dietary fish oil diminishes lymphocyte adhesion to
macrophage and endothelial cell monolayers. Immunology, 1998, vol 94, n° 1, p 79-87.
SASAKI T., KANKE Y., KUDOH K., NAGAHASHI M., TOYOKAWA M., MATSUDA
M., SHIMIZU J., TAKITA T. Dietary n-3 polyunsaturated fatty acid and status of
immunocompetent cells involved in innate immunity in female rats. Ann. Nutr. Metab., 2000,
vol 44, n° 1, p 38-42.
SAUTEBIN L., Di ROSA M. Nitric oxide modulates prostacyclin biosynthesis in the lung of
endotoxin treated rats. Eur. J. Pharmacol., 1994, vol 262, p 193-196.
SCHAUB R.G., DUNN C.J., DEIBEL M.R., BERGER A.E., WUNDERLICH D.
FLEMING W.E. Correlation of leukocyte interleukin-1 production with the stimulation of
prostaglandin and tissue factor synthesis by human umbilical vein endothelial cells. Agents
Actions, 1990, vol 31, p 127-134.
190
SCHLEIMER R.P., RUTLEDGE B.K. Cultured human vascular endothelial cells acquire
adhesiveness for neutrophils after stimulation with interleukin 1, endotoxin, and tumor-
promoting phorbol diesters. J. Immunol., 1986, vol 136, n° 2, p 649-654.
SCHMID E., MULLER T.H., BUDZINSKI R.M., PFIZENMAIER K., BINDER K.
Lymphocyte adhesion to human endothelial cells induces tissue factor expression via a
juxtacrine pathway. Thromb. Haemost., 1995, vol 73, n° 3, p 421-428.
SCHMIDT E.B., SKOU H.A., CHRISTENSEN J.H., DYERBERG J. N-3 fatty acids from
fish and coronary artery disease: implications for public health. Public Health. Nutr., 2000,
vol 3, n° 1, p 91-98.
SCHMIDT E.B., SKOU H.A., CHRISTENSEN J.H., DYERBERG J. SCHUTZE S.,
POTTHOFF K., MACHLEIDT T., BERKOVIC D., WIEGMANN K., KRONKE M.
TNF activates NF-kappa by phosphatidylcholine-specific phospholipase C-induced « acidic »
sphingomyelin breakdown. Cell., 1992, vol 71, p 765-776.
SCHUTZE S., POTTHOFF K., MACHLEIDT T., BERKOVIC D., WIEGMANN K.,
KRONKE M. TNF activates NF-kappa B by phosphatidylcholine-specific phospholipase C-
induced "acidic" sphingomyelin breakdown. Cell., 1992, vol 71, n° 5, p 765-776.
SCHWEITZER K.M., DRAGER A.M., van der VALK P., THIJSEN S.F.,
ZEVENBERGEN A., THEIJSMEIJER A.P., VAN DER SCHOOT C.E. Langenhuijsen
MM Constitutive expression of E-selectin and vascular cell adhesion molecule-1 on
endothelial cells of hematopoietic tissues. Am. J. Pathol., 1996, vol 148, n° 1, p 165-175.
SEIBERT K., ZHANG Y., LEAHY K., HAUSER S., MASFERRER J., PERKINS W.,
LEE L., ISAKSON P. Pharmacological and biochemical demonstration of the role of
cyclooxygenase 2 in inflammation and pain. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A, 1994, vol 91, n° 25,
p 12013-12017.
SESSLER A.M., NTAMBI J.M. Polyunsaturated fatty acid regulation of gene expression. J.
Nutr., 1998, vol 128, n° 6, p 923-926.
SEUFFERLEIN T., ROZENGURT E. Sphingosine induces p125FAK and paxillin tyrosine
phosphorylation, actin stress fiber formation, and focal contact assembly in Swiss 3T3 cells.
J. Biol. Chem., 1994 , vol 269, n° 44, p 27610-27617.
SEUFFERLEIN T., ROZENGURT E. Sphingosylphosphorylcholine activation of mitogen-
activated protein kinase in Swiss 3T3 cells requires protein kinase C and a pertussis toxin-
sensitive G protein. J. Biol. Chem., 1995, vol 270, n° 41, p 24334-24342.
191
SHANNON V.R., CROUCH E.C., TAKAHASHI Y., UEDA N., YAMAMOTO S.,
HOLTZMAN M.J. Related expression of arachidonate 12- and 15-lipoxygenases in animal
and human lung tissue. Am. J. Physiol., 1991, vol 261, n° 6, p 399-405.
SHIBAMOTO S., HAYAKAWA M., TAKEUCHI K., HORI T., MIYAZAWA K.,
KITAMURA N., JOHNSON K.R., WHEELOCK M.J., MATSUYOSHI N., TAKEICHI
M., ITO F. Association of p120, a tyrosine kinase substrate, with E-cadherin/catenin
complexes. J Cell Biol., 1995, vol 128, n° 5, p 949-957.
SHIMIZU Y., van SEVENTER G.A., HORGAN K.J., SHAW S. Roles of adhesion
molecules in T-cell recognition: fundamental similarities between four integrins on resting
human T cells (LFA-1, VLA-4, VLA-5, VLA-6) in expression, binding, and costimulation.
Immunol. Rev., 1990, vol 114, p 109-143.
SHIMOKAMA T., HARAOKA S., WATANABE T. Morphological fate and sequelae of
human atherosclerosis : evaluation of immune mechanism in atherogenesis through
immunohistological and ultrastructural analysis. Pathol.Int., 1995, vol 45, n° 11, p 801-817.
SHIMOKAWA H., VANHOUTTE P.M. Dietary cod-liver oil improves endothelium-
dependent responses in hypercholesterolemic and atherosclerotic porcine coronary arteries.
Circulation., 1988, vol 78, n° 6, p 1421-1430.
SHITASHIGE M., MORITA I., MUROTA S-I. Different substrate utilization between
prostaglandins endoperoxide H synthase-1 and –2 in NIH3T3 fibroblasts. Biochim. Biophys.
Acta., 1998, vol 1389, p 57-66.
SHORT S.M., TALBOTT G.A., JULIANO R.L. Integrin-mediated signaling events in
human endothelial cells. Mol. Biol. Cell., 1998, vol 9, n° 8, p 1969-1980.
SHULER R.L., LASKIN D.L., GARDNER C.R., FEDER L.S., LASKIN J.D.
Lymphocyte-mediated nitric oxide production by rat endothelial cells. J. Leukoc. Biol., 1995,
vol 57, n° 1, p 116-121.
SIEGELMAN M.H., CHENG I.C., WEISSMAN I.L. The mouse lymph node homing
receptor is identical with the lymphocyte cell surface marker Ly-22 : rôle of the EGF domain
in endothelial binding. Cell., 1990, vol 61, p 611-622.
SIMOPOULOS A.P. Omega-3 fatty acids in health and disease and in growth and
development. Am.J.Clin.Nutr., 1991, vol 54, n° 3, p 438-463.
SINCLAIR H.M. The relative importance of essential fatty acids of the linoleic and linolenic
families: studies with an Eskimo diet. Prog. Lipid Res., 1981, vol 20, p 897-899.
192
SIROIS J., RICHARDS J. Characterization and regulation of the promoter of the rat
prostaglandin endoperoxyde synthase gene in granulosa cells . J. Biol. Chem., 1992, vol 267,
p 6382-6388.
SMITH W.L. Prostanoid biosynthesis and mecanisme of action. Am. J.Physiol., 1992, vol
263, p F181-F191.
SMITH W.L., DE WITT D.L ., ALLEN M.L. Bimodal distribution of the prostaglandin I2
synthase antigen in smooth muscle cells. J. Biol. Chem., 1983, vol 258, p 5922-5926.
SMITH W.L., MARNETT L.J. Prostaglandin endoperoxyde synthase : structure and
catalysis. Biochim. Biophys. Acta., 1991, vol 1083, p 1-17.
SOYOMBO O., SPUR B.W., LEE. Effects of lipoxin A4 on chemotaxis and degranulation
of human eosinophils stimulated by platelet-activating factor and N-formyl-L-methionyl-L-
leucyl-L-phenylalanine. TH Allergy., 1994 , vol 49, n° 4, p 230-234.
SPECTOR A.A. Influence of pH of the medium on free fatty acid utilization by isolated
mammalian cells. J. Lipid Res., 1969, vol 10, n° 2, p 207-215.
SPECTOR A.A., KADUCE T.L., FIGARD P.H., NORTON F.K., HOAK J.C.,
CZERVIONKE R.L. Eicosapentaenoic acid and prostacyclin production by cultured human
endothelial cells. J. Lipid Res., 1983, vol 24, p 1595-1604.
SPECTOR A.A., KADUCE T.L., HOAK J.C., FRY G.L. Utilization of arachidonic and
linoleic acids by cultured human endothelial cells. J. Clin. Invest., 1981, vol 68, n°4, p 1003-
1011.
SPENCER A., WOODS J.W., ARAKAWA T., SINGER I.I., SMITH W.L. Subcellular
localization of prostaglandin endoperoxide H synthase-1 and –2 by immunoelectron
microscopy. J. Biol. Chem., 1998, vol 273, p 9886-9893.
SPRINGER T.A. Traffic signals for lymphocyte recirculation and leukocyte emigration: the
multistep paradigm. Journal. Cell., 1994, vol 76, p 301-314.
STADDON J.M., RUBIN L.L.. Cell adhesion, cell junctions and the blood-brain barrier.
Curr Opin Neurobiol., 1996, vol, 6 n° 5, p 622-627.
STEMME S., HANSSON G.K. Immune mechanisms in atherogenesis. Ann. Med., 1994, vol
26, n° 3, p 141-146.
STENSON W.F., CORT D., RODGERS J., BURAKOFF R., GRAMLICH T.L.,
BEEKEN W. Dietary supplementation with fish oil in ulcerative colitis. Ann. Intern. Med.,
1992, vol 116, p 609-614.
193
STEWART A.G., DUBBIN P.N., HARRIS T., DUSTING G.J. Platelet-activating factor
may act as a second messenger in the release of icosanoids and superoxide anions from
leukocytes and endothelial cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A., 1990, vol 87, n° 8, p 3215-
3219.
STOLTZ R.A., CONNERS M.S., GERRITSEN M.E., ABRAHAM N.G., LANIADO-
SCHWARTZMAN M. Direct stimulation of limbal microvessel endothelial cell proliferation
and capillary formation in vitro by a corneal-derived eicosanoid. Am. J. Pathol., 1996, vol
148, n° 1, p 129-139.
STROMBLAD S., BECKER J.C., YEBRA M., BROOKS P.C., CHERESH D.A.
Suppression of p53 activity and p21WAF1/CIP1 expression by vascular cell integrin
alphaVbeta3 during angiogenesis. J. Clin. Invest., 1996, vol 98, n° 2, p 426-433.
STROMBLAD S., CHERESH D.A. Integrins, angiogenesis and vascular cell survival.
Chem Biol., 1996, vol 11, p 881-885.
STUBBS C.D., SMITH A.D. The modification of mammalian membrane polyunsaturated
fatty acid composition in relation to membrane fluidity and function. Biochim. Biophys. Acta.,
1984, vol 779, n° 1, p 89-137.
STUTMAN O. Postthymic Tcell development. Immunol. Rev., 1986, vol 91, p 159.
SUNDERKÖTTER C., STEINBRINK K., HENSELEIT U., BOSSE R., SCHWARZ A.,
VESTWEBER D., SORG C. Activated T cells induce expression of E-selectin in vitro and
in an antigen-dependent manner in vivo. Eur. J. Immunol., 1996, vol 26, p 1571-1579.
SWERLICK R.A., LEE K.H., LI L.J., SEPP N.T., CAUGHMAN S.W., LAWLEY T.J.
Regulation of vascular cell adhesion molecule 1 on human dermal microvascular endothelial
cells. J. Immunol., 1992, vol 149, n° 2, p 698-705.
TAKAMI S., YAMASHITA S., KIHARA S., ISHIGAMI M., TAKEMURA K., KUME
N., KITA T., MATSUZAWA Y. Lipoprotein(a) enhances the expression of intercellular
adhesion molecule-1 in cultured human umbilical vein endothelial cells. Circulation, 1998,
vol 97, n° 8, p 721-728.
TAKATA S., PAPAYIANNI A., MATSUBARA M., JIMENEZ W., PRONOVOST P.H.,
BRADY H.R. 15-Hydroxyeicosatetraenoic acid inhibits neutrophil migration across
cytokine-activated endothelium. Am. J. Pathol., 1994, vol 145, n° 3, p 541-549.
TAKAYAMA H., GIMBRONE M.A Jr., SCHAFER A.I. Preferential incorporation of
eicosanoid precursor fatty acids into human umbilical vein endothelial cell phospholipids.
Biochim. Biophys. Acta., 1987, vol 922, p 314-322.
194
TAKAYAMA H., KROLL M.H., GIMBRONE M.A JR., SCHAFER A.I. Turnover of
eicosanoid precursor fatty acids among phospholipids classes and subclasses of cultures
human umbilical vein endothelial cells. Biochel. J., 1989, vol 258, p 427-434.
TAKEICHI M. Cadherin cell adhesive receptors as a morphogenetic regulator. Science,
1991, vol. 251, p 1451-1455.
TAMURA Y., HIRAI A., TERANO T., YOSHIDA S., TAKENAGA M., KITAGAWA
H. Anti-thrombotic and anti-atherogenic action of eicosapentaenoic acid. Jpn. Circ. J, 1987,
vol 51, n° 4, p 471-477.
TANAKA Y., ALBELDA S.M., HORGAN K.J., van SEVENTER G.A., SHIMIZU Y.,
NEWMAN W., HALLAM J., NEWMAN P.J., BUCK C.A., SHAW S. CD31 expressed on
distinctive T cell subsets is a preferential amplifier of beta 1 integrin-mediated adhesion. J.
Exp. Med., 1992, vol 176, n°1, p 245-253.
TERANO T., SALMON J.A., MONCADA S. Biosynthesis and biological activity of
leukotriene B5. Prostaglandins., 1984, vol 27, n° 2, p 217-232.
TERRY C.M., CLIKEMAN J.A., HOIDAL J.R., CALLAHAN K.S. TNF-alpha and IL-
1alpha induce heme oxygenase-1 via protein kinase C, Ca2+, and phospholipase A2 in
endothelial cells. Am. J. Physiol., 1999, vol 276, n° 5, p H1493-501.
THOMAS S.M., DEMARCO M., D'ARCANGELO G., HALEGOUA S., BRUGGE J.S. Ras is essential for nerve growth factor- and phorbol ester-induced tyrosine phosphorylation
of MAP kinases. Cell.,1992, vol 68, n° 6, p 1031-1040.
TOMOBE Y.I., MORIZAWA K., TSUCHIDA M., HIBINO H., NAKANO Y.,
TANAKA Y. Dietary docosahexaenoic acid suppresses inflammation and immunoresponses
in contact hypersensitivity reaction in mice. Lipids, 2000, vol 35, n° 1, p 61-69.
TOPPER J.N., GIMBRONE M.A. Jr. Blood flow and vascular gene expression: fluid shear
stress as a modulator of endothelial phenotype. Mol. Med. Today., 1999, vol 5, n° 1, p 40-46.
TSUJII M., DUBOIS R.N. Alterations in cellular adhesion and apoptosis in epitheliial cells
overexpressing prostaglandin endoperoxide synthase-2. Cell., 1995, vol 83, p 493-501.
VALETTE L., CROSET M., PRIGENT AF., MESKINI N., LAGARDE M. Dietary
polyunsaturated fatty acids modulate fatty acid composition and early activation steps of
concavalin A-stimulated rat thymocytes. J. Nutr., 1991, vol 121, p 1844-1859.
VANE J., BOTTING R. Inflammation and the mechanism of action of anti-inflammatory
drugs. FASEB J., 1987, vol 1, n° 2, p 89-96.
195
VANE J.R. Inhibition of prostaglandin synthesis as a mechanism of action for aspirin-like
drugs. Nat. New. Biol., 1971, vol 231, n° 25, p 232-235.
VANE J.R., BOTTING R.M. .Pharmacodynamic profile of prostacyclin. Am. J. Cardiol.,
1995, vol 75, n° 3, p 3A-10A.
VARON D., JACKSON D.E., SHENKMAN B., DARDIK R., TAMARIN I., SAVION N.,
NEWMAN P.J. Platelet/endothelial cell adhesion molecule-1 serves as a costimulatory
agonist receptor that modulates integrin-dependent adhesion and aggregation of human
platelets. Blood, 1998, vol 91, n° 2, p 500-507.
VASSALLI P. The pathophysiology of tumor necrosis factor. Ann. Rev. Immunol., 1992, vol
10, p 411.
VESTWEBER D. Molecular mechanisms that control endothelial cell contacts. J. Pathol.,
2000, vol 190, n° 3, p 281-291.
VINALS M., MARTINEZ-GONZALEZ J., BADIMON L. Regulatory effects of HDL on
smooth muscle cell prostacyclin release. Arterioscler Thromb. Vasc. Biol., 1999, vol 19, p
2405-2411.
von HOLLENBAUGH D., MISCHEL-PETTY N., EDWARDS C.P., SIMON J.C.,
DENFELD R.W., KIENER P.A., ARUFFO A. Expression of functional CD40 by vascular
endothelial cells. J. Exp. Med., 1995, vol 182, n° 1, p 33-40.
von HOUWELINGEN R., NORDOY A., van der BEEK E., HOUTSMULLER U., De
METZ M., HORNSTRA G. Effect of a moderate fish intake on blood pressure, bleeding
time, hematology, and clinical chemistry in healthy males. Am. J. Clin. Nutr., 1987, vol 46, n°
3, p 424-436.
von SCHACKY C., FISCHER S., WEBER P.C. Long-term effects of dietary marine ω−3
fatty acids upon plasma and cellular lipids, platelet function and eicosanoid formation in
humans. J. Clin. Invest., 1985, vol 76, p 1626-1631.
VOSS A., REINHART M., SPRECHER H. Differences in the interconversion between 20-
and 22 carbon(n-3) and (n-6) polyunsaturated fatty acids in rat liver. Biochim. Biophys. Acta.,
1992, vol 1127, p 33-40.
WADDELL T.K., FIALKOW L., CHAN C.K., KISHIMOTO T.K., DOWNEY G.P.
Potentiation of the oxidative burst of human neutrophils. A signaling role for L-selectin. J.
Biol. Chem., 1994, vol 269, n° 28, p 18485-18491.
196
WADDELL T.K., FIALKOW L., CHAN C.K., KISHIMOTO T.K., DOWNEY G.P.
Signaling functions of L-selectin. Enhancement of tyrosine phosphorylation and activation of
MAP kinase. J. Biol. Chem., 1995, vol 270, n° 25, p 15403-15411.
WALLACE F.A, MILES E.A, EVANS C, STOCK T.E, YAQOOB P, CALDER PC.
Dietary fatty acids influence the production of Th1- but not Th2-type cytokines. J Leukoc
Biol., 2001, vol 69, n°3, p 449-457.
WALTZ G., ARUFFO A., KOLANUS M. Recognition by ELAM-1 of the sialyl-Lex
determinant on myeloid and tumor cells. Science., 1990, vol 250, p 1132-1135.
WAN Y., KUROSAKI T., HUANG X.Y. Tyrosine kinases in activation of the MAP kinase
cascade by G-protein-coupled receptors. Nature, 1996, vol 380, n° 6574, p 541-544.
WATANABE T., HARAOKA S., SHIMOKAMA T. Inflamatory and immunological
nature of atherosclerosis. Int. J. Cardiol., 1997, vol 54 Suppl., p S51-60.
WATERMAN W.H., SHA’AFI R.I. A mitogen-activated protein kinase independent
pathway involved in the phosphorylation and activation of cytosolic phospholipase A2 in
human neutrophils stimulated with tumor necrosis factor-alpha. Biochem. Biophys. Res.
Commun., 1995, vol 209, p 271-278.
WEBER C., ERL W., PIETSCH A., DANESCH P., WEBER C. Docosahexaenoic acid
selectively attenuates induction of vascular cell adhesion molecule-1 and subsequent
monocyte cell adhesion to human endothelial cells stimulated by tumor Necrosis Factor-a.
Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol., 1995, vol 15, p 622-628.
WEINER B.H., OCKENE I.S., LEVINE P.H., CUENOUD H.F., FISHER M.,
JOHNSON B.F., DAOUD A.S., JARMOLYCH J., HOSMER D., JOHNSON M.H.
Inhibition of atherosclerosis by cod-liver oil in a hyperlipidemic swine model. N. Eng.l J.
Med., 1986, vol 315, n° 14, p 841-846.
WEINER T.W., SPRECHER H. 22-carbon polyenoic acids. Incorporation into platelet
phospholipids and the synthesis of these acids from 20-carbon polyenoic acid precursor by
intact platelets. J. Biol. Chem., 1985, vol 260, p 6032-6038.
WELLER A.S., ISENMANN S., VESTTWEBER D. Cloning of the mouse endothelial
selectins: expression of both E- and P-selectin is inducible by tumor necrosis factor-α. J. Biol.
Chem.,1992, vol 267:151-15183.
WETZKA B., NUSING R., CHARNOCK-JONES D.S., SCHAFER W., ZAHRADNIK
H.P., SMITH S.K. Cyclooxygenase-1 and -2 in human placenta and placental bed after
normal and pre-eclamptic pregnancies. Hum. Reprod., 1997, vol 12, n° 10, p 2313-2320.
197
WETZKA B., SCHAFER W., KOMMOSS F., BETTENDORF H., NUSING R.,
BRECKWOLDT M., ZAHRADNIK H.P. Immunohistochemical localization of
thromboxane synthase in human intrauterine tissues. Placenta., 1994, vol 15, p 389-398.
WHEELER-JONES C., ABU-GHAZALEH R., COSPEDAL R., HOULISTON R A.,
MARTIN J., ZACHARYY I. Vascular endothelial growth facteur stimulates prostacyclin
production and activation of cytosilic phospholipase A2 in endothelial cells via p42/p44
mitogen-activated protein kinase. FEBS letters, 1997,vol 420, p 28-32.
WHITAKER M.O., WYCHE A., FITZPATRICK F., SPRECHER H., NEEDLEMAN P.
Triene prostaglandins: prostaglandin D3 and icosapentaenoic acid as potential antithrombotic
substances. Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A, 1979, vol 76, p 5919-5923.
WICK G., ROMEN M., AMBERGER A., METZLER B., MAYR G.,
FALKENSAMMER G., XU Q. Atherosclerosis, autoimmunity, and vascular-associated
lymphoid tissue. Faseb., 1997, vol 11, p 1199-1207.
WIENER B.H., OCKENE I.S., LEVINE P.H. Inhibition of atherosclerosis by cod-liver in a
hyperlipidaemic swine model. N. Engl. J. Med., 1986, n° 315, p 841-846
WILLEMS C., DE GROOT P.G., POOL G.A. Arachidonate metabolism in cultured
endothelial cells. Evidence for two prosaglandin synthetic pathways sensitive to acetysalicylic
acid. Bioch. Biophys. Acta., 1982, vol 713, p 581-588.
WILLIS A.L. Nutritional and pharmacological factors in eicosanoid biology. Nutr. Rev.,
1981, vol 39, n° 8, p 289-301.
WILSON L.K., LUTTRELL D.K., PARSONS J.T., PARSONS S.J. pp60c-src tyrosine
kinase, myristylation, and modulatory domains are required for enhanced mitogenic
responsiveness to epidermal growth factor seen in cells overexpressing c-src. Mol. Cell. Biol.,
1989, vol 9, n° 4, p 1536-1544.
WONG E., BAYLY C., WATERMAN H.L., RIENDEAU D., MANCINI J.A. Conversion
of prostaglandin G/H synthase-1 into anenzyme sensitive to PGHS-2 selective inhibitors by a
double His513- Arg and Ile523 Val mutation. J. Biol. Chem.,1997, vol 272, p 9280-9286.
WONG J.T., TRAN K., PIERCE G.N, CHAN A.C, O K, CHOY P.C.
Lysophosphatidilcholine stimulates the release of arachidonic acid in human endothelial cells.
J.Biol. Chem., 1998, vol 273, n°12, p6830-6836.
WONG W.Y.L., DeWITT D.L., SMITH W.L., RICHARDS J.S. Rapid inductuction of
prostaglandin endoperoxyde synthase in rat preovulatory follicles by luteinizing hormone and
198
cAMP is blocked by inhibitors of transcription and translation. Mol. Endocrinol.,1989, vol 3,
p 1714-1723.
YANG X.D., MICHIE S.A., TISCH R., KARIN N., STEINMAN L., MCDEVITT H.O.
Cell adhesion molecules: a selective therapeutic target for alleviation of IDDM. J.
Autoimmun., 1994, vol 7, n° 6, p 859-864.
YAQOOB P., CALDER P.C. Effects of dietary lipid manipulation upon inflammatory
mediator production by murine macrophages. Cell Immunol., 1995, vol 163, n° 1, p 120-128.
YELLIN M.J., BRETT J., BAUM D., MATSUSHIMA A., SZABOLCS M., STERN D.,
CHESS L. Functional interactions of T cells with endothelial cells: the role of CD40L-CD40-
mediated signals. J Exp Med., 1995, vol 182, n° 6, p 1857-1864.
YERRAM N.R., MOORE S.A., SPECTOR A.A. Eicosapentaenoic acid metabolism in
brain microvessel endothelium: effect on prostaglandin formation. J. Lipid Res., 1989, vol 30,
p 1747-1757.
YOKOTA T., HANSSON G.K. Immunological mechanisms in atherosclerosis. J. Intern.
Med., 1995, vol 238, n° 6, p 479-489.
YOKOYAMA C., TANABE T. Cloning of human gene encoding prostaglandin
endoperoxide synthase and primary sructure of the enzyme. Biochem. Biophys. Res.
Commun., 1989, vol 165, p 888-894.
YOSHIDA M., WESTLIN W.F., WANG N., INGBER D.E., ROSENZWEIG A.,
RESNICK N., GIMBRONE M.A. Jr. Leukocyte adhesion to vascular endothelium induces
E-selectin linkage to the actin cytoskeleton. J. Cel.l Biol., 1996, vol 133, n° 2, p 445-455.
ZHOU X., STEMME S., HANNSON G. Evidence for a local immune response in
atherosclerosis. CD4+ Tcells infiltrate lesions of apolipoprotein-E-deficient mice. Amer. J.
Pathol., 1996, vol 149, p 359-366.
199
RRRÉÉÉSSSUUUMMMEEE EEENNN AAANNNGGGLLLAAAIIISSS
200
TITRE DE LA THÈSE EN ANGLAIS:
LLYYMMPPHHOOCCYYTTEE AADDHHEESSIIOONN TTOO VVAASSCCUULLAARR EENNDDOOTTHHEELLIIUUMM..
MMEECCHHAANNIISSMM IINNVVOOLLVVEEDD FFOORR IINNDDUUCCEEDD PPRROOSSTTAACCYYCCLLIINN PPRROODDUUCCTTIIOONN
Prostacyclin (PGI2), regulates haemostasis, vascular tone, as well as the
proliferation of smooth muscle cells. We have previously reported that human peripheral
blood lymphocyte (L) contact to human umbilical vein endothelial cells (HUVEC)
enhances PGI2 output involving a cPLA2 pathway. Here, we demonstrate the specificity of
lymphocytes in switching-on this response. PGI2 synthesis during coincubation of
L/HUVEC was maximal at 4 h, reaching a plateau thereafter for up to 20 h. L/HUVEC
coincubated in serum-free medium, at a ratio of 9:1, under static or dynamic conditions,
enhanced the basal (HUVEC alone) PGI2 output by 2.5-fold. Preactivation of either cell is
not required but the mechanism depends on a specific contact with lymphocytes shown by
the absence of effect when HUVEC were coincubated with resting neutrophils, platelets or
latex beads at a ratio of 9:1. Blocking endothelial cell adhesion molecules (ECAM) E-
selectin, VCAM-1 or ICAM-1 did not modify the L/HUVEC effect. However, 51Cr-labeled
L adhesion was significantly decreased with anti-ICAM-1. Contrariwise, tyrosine proteins
kinases of the Scr family show to be essential. Moreover, phosphorylation of
p42/p44MAPK evidenced by western-blot occurred as early as 1 h of coincubation
remaining up to 4 h. Furthermore, the lymphocyte-induced PGI2-output was totally
abolished when inhibiting MAPKK by using PD98059, 25 µmoles/L, a concentration well
known to restrain p42/p44MAPK phosphorylation. Changes in fatty acid composition of
membrane phospholipids (PL) induced by incubation for 3 days with eicosapentaenoic or
docosahexaenoic acids resulted in less basal PGI2 output and adhesion of 51Cr- labeled
lymphocytes whilst the lymphocyte-induced PGI2 output was not modified.
This lymphocyte-induced PGI2 synthesis which does not primarily involves ECAM
pathway is independent of PL fatty acid composition and signals through the
p42/p44MAPK cascade. This physiological response might serve as a switch-on step for
operation of host defense against atherogenesis.
Keywords: prostacyclin, lymphocytes, HUVEC, E-selectin, VCAM-1, ICAM-1, Src,
MAP-Kinase, EPA, DHA, atherogenesis.
FOLIO ADMINISTRATIF
THÈSE SOUTENUE DEVANT L'INSTITUT NATIONAL DES SCIENCES APPLIQUÉES DE LYON
NOM : DOMINGUEZ DELGADO DATE DE SOUTENANCE : 25 Juin 2001
PRÉNOM : Zury Ana
TITRE : ADHÉSION DES LYMPHOCYTES À L'ENDOTHÉLIUM VASCULAIRE. MÉCANISMES IMPLIQUÉS DANS LA PRODUCTION DE PROSTACYCLINE INDUITE
NATURE : DOCTORAT NUMÉRO D'ORDRE : 01 ISAL 0023 FORMATION DOCTORALE : BIOCHIMIE
COTE B.I.U. - Lyon : T 50/210/19 / et bis CLASSE :
RÉSUME
Le but de cette étude était de déterminer les mécanismes impliqués dans l’induction de la synthèse de prostacyline
(PGI2) endothéliale par le contact avec des lymphocytes (L) humains in vitro. La coincubation des cellules endothéliales de
veine de cordon ombilical (HUVEC) avec des lymphocytes augmente de 2,5 fois la production basale de PGI2 dans des
HUVEC incubées seules. Cette augmentation est observée lors de la coincubation des cellules dans un milieu dépourvu en
sérum avec un rapport L/HUVEC de 9:1. La synthèse de PGI2 est maximale après 4 h. de coincubation. Cet effet est spécifique
des lymphocytes car la réponse n’est pas observée lorsque les HUVEC sont coincubées avec d'autres cellules sanguines ou
avec des billes de latex. Le contact des lymphocytes aux HUVEC est capable d’activer ces dernières et d'induire l’expression
des molécules d’adhésion endothéliales (ECAMs), telles que la sélectine-E, VCAM-1 et ICAM-1.
L’effet des lymphocytes sur la production de PGI2 par des HUVEC préalablement incubées avec des anticorps anti-
ECAMs n’est pas modifié, indiquant que ces ECAMs ne sont pas impliquées dans le mécanisme. En revanche, l’inhibition de
tyrosines kinases du type Src bloque totalement l’effet inducteur des lymphocytes. La participation de p42/p44MAPK dans la
cascade de signalisation est fortement suggérée par la présence de sa forme phosphorylée dès la première heure de
coincubation. L’enrichissement des phospholipides cellulaires en acides gras ω−3, assuré par la culture des cellules dans un
milieu contenant EPA ou DHA avant la coincubation, est sans effet sur l’induction de PGI2. Néanmoins, l’effet inhibiteur de
ces acides gras sur l’adhésion lymphocytaire à l’endothélium est constaté par la moindre adhésion de lymphocytes marqués au 51Cr préalablement enrichis à des HUVEC également enrichies en EPA ou DHA.
Ces résultats suggèrent que la synthèse de PGI2 induite par les lymphocytes pourrait constituer un mécanisme de
défense contre l'accumulation excessive de leucocytes sur la paroi vasculaire, situation physiopathologique qui survient durant
l’atherogenèse.
MOTS-CLEFS : Prostacycline, Lymphocytes, HUVEC, Sélectine-E, VCAM-1, ICAM-1, Src, MAP-Kinase, EPA, DHA, Atherogènese.
LABORATOIRE DE RECHERCHE : Laboratoire de Biochimie et Pharmacologie, INSERM-U352 INSA de Lyon, Bât. Louis Pasteur, 11 avenue Jean Capelle, 69620 Villeurbanne Cedex.
DIRECTEUR DE THÈSE : Annie France PRIGENT et Michel LAGARDE.
PRÉSIDENT DU JURY : Michel LAGARDE. COMPOSITION DU JURY : Yvon LEBRANCHU (rapporteur), Philip CALDER (rapporteur), Olga MACOVSCHI, Michel LAGARDE, et Annie France PRIGENT.
top related