第 13 章 淋巴细胞成熟与抗 原受体基因的表达 lymphocyte maturation & antigen...

第 13 章 淋巴细胞成熟与抗 原受体基因的表达

Lymphocyte Maturation & Antigen Receptor Expression

•免疫细胞（ immunocytes ）–凡参与免疫应答或与免疫应答有关的细胞–包括：

•淋巴细胞•单核巨噬细胞•抗原递呈细胞•粒细胞、肥大细胞、血小板等

•淋巴细胞– T 淋巴细胞– B 淋巴细胞– NK 细胞

•免疫活性细胞 (immunocompetent cell ， ICC)

– T 、 B细胞均有特异性抗原受体，接受抗原刺激后能发生活化、增殖和分化，产生特异性免疫应答，故称免疫活性细胞

第一节 B 细胞成熟过程 B cell maturation

• 骨髓内成熟• 骨髓外成熟

B 细胞因在骨髓（ bone marrow ）或禽类法氏囊（ bursa of Fabricius ）中分化成熟而得名，简称 B细胞

The discovery of B cell immunity

1957- Bruce Glick, Ohio State University

Studies on the function of the a lymphoid organ in the cloacal region of the chicken the bursa of Fabricius

Bursectomy – no apparent effect

None of the bursectomised

chickens made anti-Salmonella antibodies

• Bursa was the organ where antibody producing cells developed • Antibody producing cells were thereafter called B cells

Transfer foetalliver cells

Origin of B cells and organ of B cell maturation

No MatureB cells

After birth, development continues in the bone marrow

Normal bone marrow

Defective bone marrow

Mature B cellsin periphery

B cell development starts in the foetal liver

起源：胎儿期—胎肝和骨髓出生后—骨髓

两阶段 : •骨髓内成熟 (抗原非依赖期 )•骨髓外成熟 (抗原依赖期 )

一、骨髓内成熟过程

1 、骨髓微环境和 B细胞成熟2、 B细胞成熟的分期3、未成熟自身反应性 B细胞的阴性选择4、 Ig 基因重排

1 、骨髓微环境和 B细胞成熟

• B 细胞成熟四阶段–祖 B细胞（ pro B cells ）–前 B细胞（ pre B cells ）–未成熟 B细胞（ immature B cells ）–成熟 B细胞（ mature B cells ）

1 、骨髓微环境和 B细胞成熟•骨髓基质细胞提供微环境

VCAM-1SCFIL-7

基质细胞

VLA-4c-KitIL-7R

祖 B细胞

Early pro-B c-Kit

SCF

VLA-4 pro-B

Cytokines and cell-cell contacts at each stage of differentiation are

different

Stromal cell

CAM

VCAM-1

Early pro-B

IL-7R

Stromal cell

Late pro-B Pre-B

IL-7

Cytokines and cell-cell contacts at each stage of differentiation are

different

Bone marrow stromal cell

Maturing B cells

B

B

Stromal cell

2 、 B 细胞成熟的分期

分期 重链 轻链 表面标志祖 B细胞 (pro-B)（重链基因重排）

μ胞质

前 B细胞 (pre-B)（轻链基因重排）

μ 替代轻链

类 Ig

未成熟 B细胞 (immature-B)

（轻链基因重排、阴性选择）

μ κ 或 λ ｍ IgM

成熟 B细胞 (mature-B) μ+δ κ 或 λ ｍ IgMｍ IgD

四阶段：•祖 B细胞•前 B细胞•未成熟 B细胞•成熟 B细胞

主要事件：• Ig 基因重排•阴性选择

3 、阴性选择（ negative selection ）

•发生于未成熟 B细胞•若 mIgM 与基质细胞上的多价自身抗原结合，发生交联而致未成熟 B细胞凋亡（ apoptosis ）

•若 mIgM 与单价可溶性自身抗原结合，引起自身反应性 B细胞无能 (anergy)

•通过阴性选择的未成熟 B细胞继续发育为成熟 B细胞（表达 mIgM 和 mIgD ）

Negative selection-Apoptosis

Immature B cell recognises

MULTIVALENTself Ag

B

Clonal deletion by apoptosis

YYBImmature

B

Y

B

YY

YB

Anergic B cell

IgD normal IgM low

Immature B cell recognisessoluble self Ag

No cross-linking

YYB

ImmatureB

IgM

IgD

IgD

IgD

Negative selection-Anergy

YY

Y

YYY

Mature B cellexported to the

periphery

Y

Y

IgD and IgM normal

IgMIgD

IgD

IgD

IgD

IgMIgM

IgM

Immature B cell doesn’t recognise any

self Ag

YYB

ImmatureB

BB

Negative selection-Mature B cells

• Binding to self molecules in the bone marrow can lead to the death or inactivation of immature B cells

4 、 Ig 基因重排（ gene rearrangement ）

• Ig 的基因结构 (胚系基因 )– κ链基因 -- 2 号染色体 λ链基因 -- 22 号染色体 H 链基因 -- 14 号染色体 –轻链基因分为 V、 J、 C三组基因片段–重链基因分为 V、 D、 J、 C四组基因片段–无功能，不表达

• The numbers of functional gene segments for the V regions of human heavy and light chains

• Ig 的基因重排（ Ig gene rearrangement ） B 细胞成熟过程中， Ig 基因片段经重排后方能表达为功能性的 Ig

– 重链基因重排– 轻链基因重排– 等位排斥和同种型排斥

V D J C

D JV CD J

V CD JV

Germline

DH-JH joining

VH-DHJH joining

V J C

V CJV

Germline

VL-JL joining

Heavy chain rearrangement

CV D J VHDHJH-CH joining

V CJ VLJL-CLjoining

Light chain rearrangement

DJ

编码重链

VDJ(V 基因 )

VDJC

Splicing of IgM and IgD RNA

C1 C2 C3 C4 C1 C2 C3

pA1V D J

C1 C2 C3 C4 C1 C2 C3V D J

AAA

RNA cleaved and polyadenylated at pA2

V D J C IgM mRNA

RNA cleaved and polyadenylated at pA1

AAA

V D J C IgD mRNA

C1C3CCV D J

C1 C2 C3 C4 C1 C2 C3 DNApA1 pA2

V D J

Two types of mRNA can be made simultaneously in the cell by differential usage of alternative polyadenylation sites and splicing of the RNA

• VJ(V 基因 )

• VJC

• 编码轻链

• 等位排斥（ allelic exclusion ）– Ig 基因重排时，一对同源染色体上的两个等位基因中只有一个能表达

– 使得一个 B 细胞只能表达一种轻链和一种重链

• 同种型排斥（ isotypic exclusion ）– 一个 B 细胞中， κ 链基因和 λ 链基因只有其中

的一种能够表达– 使得一个 B 细胞只能表达 κ 或 λ 链中的一种

• Ig 基因重排机制

• Ig 基因重排机制– 重组识别信号序列和重组酶

• 重组酶 RAG1 和 RAG2• 识别信号序列 RSS

– 12/23 原则与 VDJ 基因片段重组

Vλ 7 23 9 Jλ7129

DH7129 7 12 9

VH 7 23 9 JH7239

• RSS 间隔序列相同的基因片段之间不能发生重组• 只有 RSS 间隔序列不同的基因片段之间能发生重组

•12merRSS 间隔序列的基因片段与 23merRSS 间隔序列的基因片段才有可能发生重组

Recognition signal sequences (RSS) and 12/23 Rule

V 7 23 9

D7 12 9J

V 7 23 9

7 23 9

7 12 9D7129 J

7 23 9

7 12 9

V

DJRAG1 & RAG 2 and ‘high mobility group proteins’ bind to the RSS

The two RAG1/RAG 2 complexes bind to each other and bring the V region adjacent to the DJ region

• The recombinase complex makes single stranded nicks in the DNA

• The nicks are ‘sealed’ to form a hairpin structure at the end of the V and D regions

• The recombinase complex remains associated with the break

Steps of Ig gene recombination

V

DJ

7 23 9

7 12 9

A number of other proteins, (Ku70:Ku80, XRCC4 and DNA dependent protein kinases) bind to the hairpins and the heptamer ends.

V D J

The hairpins at the end of the V and D regions are opened, and exonucleases and transferases remove or add random nucleotides to the gap between the V and D region

V D J 72

39

71

29

DNA ligase IV joins the ends of the V and D region to form the coding joint and the two heptamers to form the signal joint.

Steps of Ig gene recombination

• Ig 的表达（成熟 B ）– 重链与轻链的表达

•μ链和 δ链•κ链或 γ 链

– 重链与轻链的装配•μ链和 δ链分别与轻链配对，形成 IgM和IgD（ BCR）

•特异性相同，恒定区不同

二、骨髓外成熟过程

成熟 B 细胞在外周遇到抗原，产生免疫应答，最终分化成为浆细胞和记忆细胞

两个主要变化 :

• 体细胞高频突变• Ig转类（同种型转换）

B cell recognisesnon-self antigen

in periphery

Ig-secreting plasma cell

Differentiation in the periphery

YY Y YY YYY Y

B

Y Y

Y

Y

YYY

BY Y

YY

YYYB

Mature peripheralB cell

Y Y

Y

Y

YYY

B

memory cell

1 、体细胞高频突变(somatic hypermutation)

•初次免疫应答后期和再次免疫应答• 生发中心活化增殖的 B 细胞• 轻链和重链 V 基因发生随机点突变• 抗原选择

– 表达高亲和力 Ig 的 B 细胞被选择存活– 表达低亲和力 Ig 的 B 细胞凋亡– 抗体亲和力提高

——抗体亲和力成熟（ affinity maturation ）

B

B B B

B BBB

Mutation

B BBB

B

2 、重链转类 (class switching)

• Ig转类（ class switching ） 同种型转换（ isotype switching ）• B 细胞受抗原刺激后，最先产生 IgM ，然后再转成产生其它类别的 Ig ，这种现象称为 Ig转类

• 机制：转换重组，即 VDJ 基因片段与下游的另一个 C 基因重组

• 特点： Ig Fab 不变，抗体特异性不变• 意义： Ig Fc 的改变使抗体效应机制发生变化，以适应消灭病原菌的需要

class switching

C2CC4C2C1C1C3CC

C

C

C3VDJ

S3

C

C

C3

VDJ

C1

S1

C1

C3

VDJ C1

C3VDJ

IgG3 produced.Switch from IgM

VDJ C1

IgA1 produced.Switch from IgG3

VDJ C1

IgA1 produced.Switch from IgM

三、 Ig 多样性产生机制

•多个 V（ D） J基因片段•重组多样性（ VDJ 、 VJ随机重组）•连接的多样性（连接的不精确性、 N区多样性）

– N 区插入•Ig 重链基因重排时，在 V-D之间和 D-J之间额外加入新的核苷酸，这些核苷酸序列不是依赖模板而加入的，称为非模板区

• H 、 L链的随机组合•体细胞高频突变

Junctional Diversity – N nucleotide additions

V TC~GAAG D JAT

TA~TA

Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) adds nucleotides randomly to the P nucleotide ends of the single-stranded V and D segment DNA

CACTCCTTA

TTCTTGCAA

V TC~GAAG D JAT

TA~TA

CACACCTTA

TTCTTGCAA Complementary bases anneal

V D JDNA polymerases fill in the gaps with complementary nucleotides and DNA ligase IV joins the strands

TC~GAAG

ATTA~TA

CACACCTTA

TTCTTGCAA

D JTA~TA Exonucleases nibble back free endsV TC~GACACACCTTA

TTCTTGCAA

V TCDTA

GTT AT AT

AG C

第一节 T 细胞成熟过程

• 胸腺微环境与 T 细胞成熟分期

• T 细胞胸腺内成熟过程

T 淋巴细胞因在胸腺中分化成熟，所以称为胸腺依赖性淋巴细胞（ thymus-dependent lymphocytes ），简称 T 细胞

起源：• 胚胎期：卵黄囊、肝脏• 成人：骨髓

发育 :

• 胸腺

胸腺微环境：• 哺育细胞、胸腺上皮细胞、 DC 、 MΦ

• 胸腺激素、细胞因子• 胸腺细胞（ thymocytes ） —— 胸腺内发育中的 T 细胞

一、胸腺微环境与 T 细胞成熟分期

骨髓 胸腺 皮质浅层 皮质深层 髓质

T 细胞成熟分期

• T 细胞胸腺内成熟四阶段：–祖 T细胞（ pro T cells ）–前 T细胞（ pre T cells ）–未成熟 T细胞（ immature T cells ）–成熟 T细胞（ mature T cells ）

T 细胞成熟分期分期 TCR CD4/CD8 CD3

祖 T 细胞（ Pro T cell ）

TCR – CD4-CD8-

DN

CD3-

前 T 细胞（ Pre T cell ）

TCR pTα:β CD4+CD8+

DP

CD3+

未成熟 T 细胞（ Immature T cell ）

TCRαβ CD4+CD8+

DP

CD3+

成熟 T 细胞（ Mature T cell ）

TCRαβ CD4+/CD8+

SP

CD3+

胸腺细胞三阶段 :• DN （ double negative cells ）： CD4-CD8-• DP （ double positive cells ）： CD4+CD8+• SP （ single positive cells ）： CD4+/CD8+

二、 T 细胞在胸腺内成熟过程

三事件： • TCR 基因重排• 阳性选择• 阴性选择

1 、 TCR 受体基因重排

DN－ DP 阶段（祖 T 细胞、前 T 细胞、未成熟 T 细胞）

• TCRβ 基因重排– pTα∶β/ CD3– CD4; CD8

• TCRα 基因重排– TCR αβ/ CD3– CD4; CD8

2 、阳性选择（ positive selection ）

DP—SP

（未成熟 T 细胞）

• 凡所表达 TCR 能够识别结合胸腺上皮细胞上自身 MHC 分子的胸腺细胞被选择而存活

• 凡所表达 TCR 不能识别结合胸腺上皮细胞上自身 MHC 分子的胸腺细胞则自行凋亡

• 识别结合 MHCⅠ 类分子的胸腺细胞，发育为 CD8+T 细胞

• 识别结合 MHCⅡ 类分子的胸腺细胞，发育为 CD4+T 细胞

• 结果： 获得自身 MHC限制性

– CD8+T 细胞具有识别 MHCⅠ 类分子复合物的能力

– CD4+T 细胞具有识别 MHCⅡ 类分子复合物的能力

3 、阴性选择（ negative selection ）

（未成熟 T 细胞）

• 凡 TCR 与自身 Ag肽 -MHC 分子复合物高亲和力结合的胸腺细胞，发生凋亡

• 凡 TCR 与自身 Ag肽 -MHC 分子复合物低亲和力结合的胸腺细胞，则存活

• 结果 :

清除自身反应性 T 细胞，获得自身耐受

三、 TCR 基因重排

• TCR 基因重排特点– β链 V 基因有效重排机会多– N 区插入多于 Ig– α链基因重排不受严格等位排斥限制

• TCR 多样性产生机制–具有多个 V 、 D 、 J 基因片段– N 区多样化– α 、 β 链配对的多样性