alga spirulina

UNIVERSIDADE DE PASSO FUNDO

FACULDADE DE ENGENHARIA E ARQUITETURA

Curso de Engenharia Ambiental

Cristiane Tedesco

REMOO DE CROMO VI PELA MICROALGA Spirulina platensis

Passo Fundo, 2010.

1

Cristiane Tedesco

REMOO DE CROMO VI PELA MICROALGA Spirulina platensis

Orientadora: Dra. Luciane Maria Colla

Trabalho de Concluso de Curso apresentado

ao Curso de Engenharia Ambiental da

Faculdade de Engenharia e Arquitetura da

Universidade de Passo Fundo, como requisito

para a obteno do ttulo de Engenheira

Ambiental, sob orientao da Dra Luciane

Maria Colla.

Passo Fundo

2010

2

AGRADECIMENTO

Primeiramente agradeo a Deus

pela oportunidade de estar aqui hoje

A minha famlia, que sempre me apoiou em toda

a minha graduao, nunca permitindo que eu

desanimasse perante as dificuldades.

Professora Dra. Luciane Maria Colla, pela

orientao, pelos ensinamentos, pela amizade,

pela dedicao com o trabalho e principalmente

pela compreenso quando no consegui

desenvolver todas as atividades.

Ao professor Dr. Marcelo Hemkemeier, pela

dedicao, amizade e pela co-orientao deste trabalho.

Aos colegas formandos que estiveram sempre

junto comigo nessa longa caminhada,

compartilhando momentos felizes e tristes, e a todos

os amigos e amigas que conquistei na

Engenharia Ambiental.

Meu sincero agradecimento...

3

RESUMO

A biossoro uma tcnica que se fundamenta na ligao dos metais com materiais

biolgicos, tais como biomassas microbianas, para proporcionar a reteno, remoo ou

recuperao de metais pesados de um ambiente lquido. A microalga Spirulina tem sido

estudada pela possibilidade de serem utilizadas no tratamento de efluentes e na remoo

de metais pesados em solues aquosas, atravs do acmulo destes metais por

precipitao ou pela ligao dos componentes presentes na parede celular. Objetivou-se

avaliar a influncia da concentrao inicial de cromo VI em meio de cultivo padro

(Zarrouk) sobre os parmetros de crescimento e sobre a remoo do metal pela microalga

S. platensis. Os experimentos foram realizados atravs de um Planejamento Fatorial

Misto 21.4

1, sendo as variveis de estudo a cepa da microalga S. platensis (paracas ou

Leb) e a concentrao inicial de Cr VI no meio de cultivo (0, 10, 20 e 30 mg.L-1

). A

microalga foi cultivada no meio Zarrouk, a 30C, fotoperodo de 12 h e agitao, durante

30 d. Amostras dos cultivos foram retiradas diariamente para avaliao do crescimento da

microalga e quinzenalmente para avaliao do potencial de remoo, num perodo de 30

d. A microalga Spirulina platensis foi capaz de realizar a biossoro de cromo VI nos

meios contaminados com 10 mg/L, 20 mg/L e 30mg/L de cromo VI, com remoes de

78%, 88% e 92%, respectivamente.

Palavras Chaves: Remoo de metais, microalga, bioacumulao, Spirulina platensis.

4

ABSTRACT

Biosorption is a technique that is based on the binding of metals with biological

materials, such as microbial biomass, to provide the retention, removal or recovery of

heavy metals in a liquid environment. The Spirulina has been studied for possible use in

the treatment of wastewater and remove heavy metals from aqueous solutions through the

accumulation of these metals by precipitation or by binding of the components present in

the cell wall. The objective was to evaluate the influence of initial concentration of

chromium VI in standard culture medium (Zarrouk) on growth parameters and on the

metal removal by microalgae S. platensis. The experiments were carried out through a

21:41 Joint Planning Factor, and the study variables were the strain of microalgae S.

platensis (Paracas or Leb) and initial concentration of Cr VI in the culture medium (0, 10,

20 and 30 mg.L-1). The microalgae were cultivated in the middle Zarrouk, 30 C,

photoperiod of 12 h, stirring, for 30 d. Samples of cultures were taken daily to assess

growth of microalgae and biweekly for assessing the potential for removal, a period of 30

d. The microalga Spirulina platensis was able to accomplish the biosorption of chromium

VI in contaminated media at 10 mg / L, 20 mg / L and 30mg / L of chromium VI, with

removals of 78%, 88% and 92% respectively.

Keywords: Metals removal, microalgae, bioaccumulation, Spirulina platensis.

5

Lista de Figuras

Figura 1: Spirulina platensis.......................................................................................... 17

Figura 2: Ciclo de vida da Spirulina platensis. ............................................................... 18

Figura 3: Assimilao de amonnio atravs das enzimas glutamina desidrogenase (GDS)

e glutamina Sintetase (GS). ........................................................................................... 22

Figura 4: Fluxograma das atividades do projeto do trabalho de concluso de curso

realizadas no Laboratrio de Fermentaes da Faculdade de Engenharia e Arquitetura.. 32

Figura 5: Esquema simplificado dos cultivos aerados da cianobactria Spirulina platensis.

..................................................................................................................................... 34

Figura 6: Tcnica de separao de clulas por filtrao.................................................. 36

Figura 7: Curva padro da microalga Spirulina platensis Paracas. ................................. 37

Figura 8: Curva padro da microalga Spirulina platensis Leb. ....................................... 38

Figura 9: Concentrao Celular (gclulaseca/L) versus tempo (d) para o experimento 1

(controle). ..................................................................................................................... 38


(controle). ..................................................................................................................... 38


(contaminao de 10 mg/L de Cr VI). ........................................................................... 39











Figura 17: Regresso exponencial da concentrao de biomassa versus tempo para o

clculo da umax do experimento 1 (concentrao inicial de 0 mg/L de Cromo VI)........... 40


6

clculo da umax do experimento 2 (concentrao inicial de 10 mg/L de Cromo VI). ........ 40






clculo da umax do experimento 5 (concentrao inicial de 0 mg/L de Cromo VI)........... 41







Figura 25: Remoo de cromo VI (%) em funo da concentrao inicial de cromo nos

cultivos, da cepa e do tempo de cultivo (d). ................................................................... 44

7

Lista de Tabelas

Tabela 1: Padres de potabilidade de gua para metais pesados ..................................... 31

Tabela 2: Valores mximos admissveis de alguns metais, para o descarte de efluentes. 31

Tabela 3: Composio qumica do meio Zarrouk ........................................................... 33

Tabela 4: Matriz do Planejamento Fatorial Multinveis 21.4

1. ........................................ 35

Tabela 5: Concentrao celular mxima, tempo de gerao (Tg), velocidade especfica

mxima de crescimento (max) e intervalo da fase logartimica de crescimento para os

experimentos do planejamento experimental. ................................................................ 42

Tabela 6: Remoo de Cromo VI nos experimentos do Planejamento Experimental aos 15

d e 30 d de cultivo da microalga Spirulina ..................................................................... 43

8

Sumrio

1 INTRODUO ................................................................................................... 10

2 DESENVOLVIMENTO ...................................................................................... 12

2.1 REVISO BIBLIOGRFICA ................................................................................ 12

2.1.1 BIOPROCESSOS ....................................................................................... 12

2.1.2 PROCESSOS FOTOSSINTTICOS ...................................................... 12

2.1.3 Spirulina platensis ...................................................................................... 13

2.1.3.1 Histrico e Uso.............................................................................. 13

2.1.3.2 Vantagens e Desvantagens do Cultivo de Microalgas .................... 15

2.1.3.3 Caractersticas da Spirulina platensis............................................. 16

2.1.3.4 Condies de Cultivo .................................................................... 18

2.1.3.4.1 Luminosidade ........................................................................... 19

2.1.3.4.2 Fontes de Carbono .................................................................... 20

2.1.3.4.3 Fontes de Nitrognio ................................................................. 21

2.1.3.4.4 Concentrao de Oxignio ........................................................ 23

2.1.3.4.5 Temperatura.............................................................................. 24

2.1.3.4.6 Aerao e Agitao ................................................................... 24

2.1.3.4.7 Salinidade ................................................................................. 24

2.1.4 CONTAMINAO DAS GUAS POR METAIS................................. 25

2.1.5 PROBLEMAS DE SADE CAUSADOS POR CONTAMINAES

COM CROMO..................................................................................................... 26

2.1.6 BIOSSORO ...................................................................................... 27

2.1.6.1 Biossoro de Cromo VI ............................................................... 28

2.1.7 LEGISLAO AMBIENTAL ............................................................... 30

2.2 MATERIAL E MTODOS ............................................................................. 32

2.2.1 CULTIVO DA MICROALGA Spirulina platensis ................................. 33

2.2.1.1 Meio de cultivo ............................................................................. 33

2.2.1.2 Condies de Cultivo e Biorreatores .............................................. 34

2.2.2 PLANEJAMENTO EXPERIMENTAL .................................................. 35

9

2.2.3 DETERMINAES ANALTICAS ...................................................... 35

2.2.3.1 Determinao do pH ...................................................................... 35

2.2.3.2 Determinao da Concentrao Celular ......................................... 35

2.2.3.3 Determinao de Metais ................................................................ 36

2.3 RESULTADOS E DISCUSSO ..................................................................... 37

2.3.1 DETERMINAO DO pH .................................................................... 37

2.3.2 CRESCIMENTO DA BIOMASSA ........................................................ 37

2.3.3 REMOO DO METAL ....................................................................... 43

3 CONCLUSO ..................................................................................................... 45

REFERNCIAS ............................................................................................................ 46

APNDICES ................................................................................................................ 50

10

1 INTRODUO

A necessidade de tratamento eficiente e econmico para remoo de metais

txicos tem resultado no desenvolvimento de tecnologias como biossoro, baseada na

utilizao de materiais de origem natural ou biomassas microbianas como as algas

(BAIRD, 2002).

A biossoro uma tcnica que se fundamenta na ligao dos metais a materiais

biolgicos, tais como biomassas microbianas, para proporcionar a reteno, remoo ou

recuperao de metais pesados de um ambiente lquido (MURALEEDHARAN et al.,

1991). Um aspecto importante da biossoro que ela pode ocorrer mesmo com clulas

metabolicamente inativas. Isto pode ser considerado uma grande vantagem, pois facilita a

recuperao do metal e possibilita a reutilizao do material biossorvente (TOBIN et al.,

1994).

Atualmente, um dos problemas mais srios que afetam o meio ambiente a

poluio qumica de natureza orgnica ou inorgnica. Alguns metais pesados so

substncias altamente txicas. As formas em que os metais se encontram em soluo

determinam o tratamento especfico a ser escolhido (BAIRD, 2002).

A ocorrncia natural de sais de metais pesados muito rara, sendo a indstria a

principal responsvel por sua emisso nos cursos dgua. Este fato representa um perigo

de primeiro grau, pois o comportamento dos metais no pode ser controlado na prtica,

sabe-se que as intoxicaes que eles provocam desenvolvem-se lentamente, sendo muitas

vezes identificadas somente depois de anos (BAIRD, 2002).

A produo de microrganismos fotossintticos, como microalgas e cianobactrias,

tem sido amplamente estudada na biotecnologia, pois esses microrganismos apresentam

um sistema biolgico muito eficiente para a utilizao da energia solar e para a produo

de compostos orgnicos (VONSHAK, 1997).

A Spirulina tem sido estudada devido a sua composio qumica, rica em

protenas e outros nutrientes (minerais e cidos graxos poli-insaturados) e pelo seu

crescimento rpido em ambientes aquticos ricos em sais. Alm disso, a capacidade

destes microrganismos concentrarem metais txicos bem conhecida (RICHMOND,

1990). Nos anos 80, comearam a surgir problemas de contaminao ambiental e de

reciclagem de resduos, e, neste caso, as microalgas tornaram-se importantes pela

capacidade de utilizao de resduos orgnicos e inorgnicos de guas (DERNER, et al.,

11

2006).

Enquanto grandes empresas de alguns pases se dedicaram produo de

Spirulina sp. visando atender o mercado consumidor, centros de pesquisa em todo o

mundo comeam a estud-la, sob os diversos aspectos, tais como perfil bromatolgico em

clulas cultivadas sob diferentes condies fsico-qumicas, diversificao das fontes de

nutrientes visando o cultivo e utilizao da biomassa na biopurificao de efluentes. As

algas so bioindicadores de ambientes contaminados, j que so bioacumuladores. Alm

de acumularem substncias minerais, acumulam tambm metais txicos. As algas do

gnero Spirulina e Chororella possuem lipdeos, que esto relacionados com a qualidade

ambiental, j que em se tratando de poluio, acumulam lipides, alm de acumularem

tambm metais txicos (NUNES et al., 2003).

Objetivou-se verificar a remoo de cromo VI a partir da microalga Spirulina

platensis crescendo em meio Zarrouk padro, bem como avaliar o efeito das

concentraes de Cromo VI sobre os parmetros de crescimento da microalga.

12

2 DESENVOLVIMENTO

2.1 REVISO BIBLIOGRFICA

2.1.1 BIOPROCESSOS

A definio de bioprocessos no contexto da biotecnologia ambiental refere-se

aplicao de microrganismos (bactrias, fungos, algas), ou organismos mais

desenvolvidos como os protozorios e rotferos, capazes de eliminar total ou parcialmente

substncias txicas ao meio ambiente e seres vivos a este integrados, inclusive o homem

(MALAJOVICH, 2004).

O primeiro processo fermentativo industrial (bioprocesso) foi produo de

vinhos e cerveja. Ao longo do sculo XX, a expanso da microbiologia industrial e o

desenvolvimento de bioprocessos baseados no metabolismo microbiano possibilitaram a

produo de diversas substncias (antibiticos). Por motivos histricos, ainda hoje o

termo processos fermentativos se aplica em biotecnologia a qualquer processo

microbiano operando em grande escala, independentemente se este seja ou no uma

fermentao. E o termo fermentador se usa como sinnimo de biorreator, designando o

recipiente onde ocorre o processo, sendo este o elemento principal (MALAJOVICH,

2004).

De uma forma geral, um bioprocesso comea com a escolha do agente biolgico

adequado, segue com a transformao da matria prima, em condies que podem exigir

esterilizao, aerao e controle do processo (pH, temperatura e etc), e finaliza com a

separao e purificao do produto final (MALAJOVICH, 2004).

2.1.2 PROCESSOS FOTOSSINTTICOS

O termo fotossntese significa construo ou sntese pela luz. A fotossntese o

processo atravs do qual as plantas sintetizam compostos orgnicos a partir de matria

13

prima inorgnica na presena de luz solar. As algas e as plantas e certas bactrias captam

essa energia diretamente da radiao solar e a utilizam para a sntese de alimentos

essenciais. Portanto, no nosso planeta a fonte primaria de toda energia metablica o sol

e a fotossntese e so essencial para a manuteno de todas as formas de vida aqui

existente (HALL, 1980).

A fotossntese pode ser definida como o processo mediante o qual a energia

luminosa utilizada na sntese de compostos orgnicos. Assim, pode-se classificas os

organismos vivos em dois grandes grupos: autotrficos e heterotrficos. Os autotrficos

so capazes de sintetizar suas prprias substancias complexas a partir de substancias

simples como CO2 e H2O, utilizando a energia proveniente de diversas fontes. De acordo

com o tipo da fonte energtica, tm-se autotrficos fotossintetizantes e os autotrficos

quimiosintetizantes os quais utilizam a luz solar e a energia resultante da reao de xido-

reduo, respectivamente (FERRAZ,1986).

J os seres heterotrficos obtm a energia necessria para a sua sobrevivncia

mediante reaes degradativas de molculas complexas que retiram do meio ambiente e

convertendo-as em CO2 e H2O (FERRAZ,1986).

O processo fotossinttico pode ser dividido em aerbio ou anaerbio. Portanto,

quando usa oxignio , no caso das Spirulinas, trata-se de fotossntese aerbia, isso a

cianobactria utiliza a gua como doadora de eltrons e lber oxignio molecular

(CEZARE,1998).

2.1.3 Spirulina platensis

2.1.3.1 Histrico e Uso

As microalgas representam os nicos seres vivos por mais de 3 milhes de anos,

mas o estudo cientfico dos mesmos comeou somente em 1980 (VONSHAK, 1997). A

Spirulina contm bilhes de anos de sabedoria evolutiva no seu DNA e o fruto da

primeira forma de vida fotossinttica da Terra (ABALDE et al., 1995).

A Spirulina foi redescoberta nos anos 60. Jean Lonard, botnico presente em

uma expedio franco-belga frica, descreveu um bolo azul-esverdeado, encontrado no

14

mercado de Fort Lamy, em Chad. Estudos posteriores revelaram que este bolo, chamado

localmente de dih, continha uma alga azul-esverdeada identificada como Spirulina. Essa

alga era consumida pela tribo Kanembu, que vivia as margens dos lagos Chad e Niger.

Os integrantes desta tribo apresentavam constituio fsica diferenciada, pois cerca de

70% dos alimentos consumidos eram algas (DERNER et al, 2006).

Ao mesmo tempo em que Lonard descobria a Spirulina na frica, o Instituto

Francs do Petrleo recebia um pedido da Companhia Sosa Texcoco, localizada prxima

cidade do Mxico: o estudo de uma alga que vivia nos lagos de produo de carbonato

de sdio e aparecia com a evaporao da gua. Como resultado, o primeiro estudo

detalhado dos requerimentos nutricionais e da fisiologia da Spirulina foi realizado. Neste

estudo, parte da tese de ps-doutorado de Zarrouk, foi o desenvolvimento da base para o

estabelecimento da produo de Spirulina em larga escala (DERNER et al, 2006).

A Spirulina apareceu, como forma de alimento humano, em perodos diferentes

da histria humana. Foi o alimento dos Astecas do Mxico e tem sido a alimentao do

povo Kanembu, da frica Central durante sculos. Foi usada em partes do Sudeste da

sia, h mais de mil anos atrs, em sopas (DERNER et al, 2006).

Uma anlise da literatura histrica revela que 25 amostras separadas de alga de

gua fresca foram recolhidas e ingeridas em 15 pases diferentes, portanto est bem

testada e confiada por vrias culturas diferentes (DERNER et al, 2006).

A Spirulina a microalga mais conhecida e usada no Brasil. Quando manipulada

e transformada em biomassa, uma riqussima fonte de vitaminas e sais minerais, alm

de conter protenas de tima qualidade. Entre plantas e animais o organismo que mais

tem vitamina B12, cuja principal funo no ser humano aumentar a absoro de

protenas. O uso da Spirulina uma das alternativas mais claras para a soluo dos

problemas de nutrio da sociedade do futuro (COLLA, 1999).

A microalga Spirulina Platensis tem muitas aplicaes biotecnolgicas, uma

destas aplicaes tem sido na aqicultura, para a alimentao direta ou indireta de

algumas espcies de peixes, moluscos, crustceos e de diversos organismos forrageiros

de interesse econmico (DERNER et al., 2006).

Muitos estudos vm sendo realizados nos mais diversos campos, tais como, no

tratamento de guas residuais de inmeros processos industriais, para a detoxificao

biolgica e remoo de metais txicos; como bioindicadores, na deteco de nutrientes

(para as microalgas) e substncias txicas (detergentes, efluentes industriais, herbicidas

etc.). Na agricultura, a biomassa pode ser empregada como biofertilizante do solo

15

(DERNER et al., 2006).

As microalgas podem produzir uma gama de molculas bioativas com

propriedades antibiticas, anticncer, antiflamatrias, antivirais, redutoras de colesterol,

enzimticas e com outras atividades farmacolgicas (DERNER et al., 2006).

Alm disso, podem ser usadas na mitigao do efeito estufa, pela assimilao do

CO2, resultado do processo de queima dos combustveis fsseis e de prticas agrcolas

imprprias (as queimadas, por exemplo). Ainda, possibilitam produo de bicombustveis

(biodiesel, por exemplo) (DERNER et al., 2006).

A cultura da Spirulina parte da nova era da agricultura ecolgica. A componente

chave da produo de Spirulina a luz do Sol e dada ateno medio da temperatura

e aos nveis de oxignio. Porque os pesticidas e herbicidas matariam muitas formas de

vida num lago, os cientistas de algas aprenderam a equilibrar a ecologia do lago sem usar

essas substncias prejudiciais. Esta forma de aqicultura representa uma das solues

necessrias produo de alimentos enquanto se restaura o planeta.

2.1.3.2 Vantagens e Desvantagens do Cultivo de Microalgas

As Spirulinas sp. apresentam muitas vantagens em relao produo de

protenas a partir da agricultura ou pecuria, pois um microrganismo aqutico, no

requer solo frtil e no causa eroso nem contaminao de terras e guas (MAIER et al.,

2000).

O conceito de produo muito semelhante ao da agricultura convencional, em

que ocorre o uso da energia solar, pelo aparelho fotossinttico, na produo de biomassa

(VONSHAK, 1997).

Sob condies naturais, muitas algas crescem em comunidades mistas, incluindo

vrias espcies e gneros. Quando o objetivo estudar ou cultivar espcies individuais,

um meio que possibilite condies seletivas indispensvel para o cultivo. Os principais

requerimentos incluem carbono, fsforo, nitrognio, enxofre, potssio e magnsio. ons

ferro e mangans so requeridos em pequenas quantidades. Outros como cobalto, zinco,

boro, cobre e molibdnio so essenciais (BECKER, 2004).

Em condies normais, a Spirulina pode ser uma das muitas espcies presentes

em guas naturais, mas quando a salinidade e a alcalinidade aumentam, o habitat se torna

16

inadequado para outras formas de vida e a Spirulina se converte na nica espcie.

Um aspecto interessante ligado a Spirulina o seu meio de cultura; que pode ser

composto por efluentes rurais e urbanos ricos em nitrognio e fsforo. Desta forma, a

partir do cultivo recupera-se quase que a totalidade desses elementos, evitando a

proliferao de algas indesejveis e produzindo biomassa para consumo humano e animal

(LIMA et al., 1999).

Diversos so os fatores que podem influenciar o crescimento da Spirulina

platensis, tais como: pH, salinidade, luminosidade, presena de contaminantes,

temperatura, acmulo de oxignio e presena de ons bicarbonato, fonte de nitrognio,

tipo de biorreator, densidade da populao (REINEHR,2001).

Ainda que a Spirulina tenha uma boa adaptao gua salgada, so poucas cepas

que crescem no mar, porque o baixo contedo em carbonatos e as elevadas concentraes

de magnsio e clcio da gua marinha inibem o seu desenvolvimento (HENRIKSON,

1994).

2.1.3.3 Caractersticas da Spirulina platensis

As Spirulinas so classificadas como seres procariotos (parede celular,

ribossomos e cidos nuclicos), imveis, no esporulados e esto includas no grupo das

bactrias. Sua natureza procariota, seus pigmentos do tipo ficobiliprotico e produo de

oxignio via fotossinttica as diferencia das algas eucariotas e bactrias fotossintticas

(LIMA et al., 1999).

As cianobactrias, ainda que se trate de seres procariontes, so muito mais

complexas que as bactrias, pois possuem uma molcula de DNA, membrana tilacide e

vrias incluses ou estruturas citoplasmticas e parede celular caracterstica (DERNER et

al., 2006). Hoek et al., (1995) apontam que uma das principais caractersticas das

cianobactrias possurem pigmentos fotossintetizantes livres no citoplasma.

As Spirulinas vivem em meios lquidos ricos em sais minerais compostos

principalmente por bicarbonato e carbonato de sdio, com pH 8 a 11. As regies

propcias para cultivo so as tropicais e subtropicais, quentes e ensolaradas. So

utilizadas como fonte de alimento na dieta humana e rao animal, possuindo elevados

teores proticos e contendo todos os aminocidos essenciais em propores que

17

satisfazem as recomendaes da FAO (Food and Agriculture Organization). As

Spirulinas so capazes de acumular germnio, que importante devido sua atividade

hemoltica e indutora de interferon. Alm disso, possuem efeito hipocolesterolmico, ou

seja, seu consumo pode abaixar os nveis de colesterol no sangue, conforme foi descrito

em literatura (LIMA et al., 1999).

ALONSO (1998), descreve a Spirulina como sendo uma alga de cor azul

esverdeada, que se apresenta na forma espiral, conforme mostra a Figura 1, da seu nome.

Seu reconhecimento fcil j que forma uma espuma verde sobre a superfcie da gua.

Geralmente encontrada em lugares com muita luz solar e guas doces alcalinas.

Figura 1: Spirulina platensis

O gnero Spirulina pertence ao reino Monera, classe Cyanophyceae e famlia

Oscillatoriaceae e compreende o grupo das cianobactrias filamentosas (microalgas

verde-azuladas). caracterizado por cadeias de clulas, constituindo um filamento na

forma de espiral, denominado tricoma. Os tricomas so constitudos por clulas

cilndricas, curtas e largas, revestida por uma fina membrana. Seu dimetro pode variar

de 6 a 12 m, e as estruturas helicoidais formadas por este filamento podem apresentar

dimetro que variam de 30 a 70 m. As dimenses celulares, o grau de ondulao e o

comprimento dos filamentos variam de espcie para espcie. Esta ltima caracterstica

tambm pode variar conforme as condies ambientais de crescimento

(HENRIKSON,1994).

Ainda, a Spirulina uma microalga filamentosa que habita meios como solos,

pntanos, lagos alcalino e guas salobras, marinhas e doces. Por meio da fotossntese,

converte os nutrientes em matria celular e libera oxignio. Os nutrientes de que necessita

so gua e fonte de carbono, nitrognio, fsforo, potssio, ferro e outros oligoelementos.

Em lagos natural o aporte limitado de nutrientes pode regular os ciclos de crescimento,

sendo que a densidade celular cresce rapidamente, alcana uma concentrao mxima e

18

retrocede quando os nutrientes se esgotam. A liberao de nutrientes por parte das clulas

mortas ou o aporte de nutrientes de fora do lago iniciam um novo ciclo (HENRIKSON,

1994).

O ciclo de vida da Spirulina inicia quando um tricoma maduro se quebra em

vrios pedaos atravs de formao de clulas especializadas denominadas necrdios, que

aps a lise, proporcionam a formao de discos de separao bicncavos. A separao

dos necrdios leva formao dos hormognios, os quais formam um novo tricoma. As

clulas dos hormognios perdem a poro final dos necrdios, apresentando uma parede

celular final muito pequena ou ausente nas pores finais. Durante esse processo, o

citoplasma aparece menos granulado e as clulas assumem uma colorao verde-azulada

plida. O nmero de clulas no hormognio aumenta pela fisso celular enquanto o

citoplasma comea a apresentar-se granulado, as clulas assumindo uma colorao verde-

azulada brilhante. Por este processo, os tricomas aumentam em comprimento e assumem

a forma helicoidal tpica (RICHMOND, 1990). Na Figura 2 apresentado um esquema

representativo do ciclo de vida da Spirulina.

Figura 2: Ciclo de vida da Spirulina platensis.

2.1.3.4 Condies de Cultivo

Cada microrganismo possui condies timas de crescimento, tais como

temperatura, pH, e nveis de oxignio dissolvido. O meio de cultivo tem grande

influncia nesse processo e deve conter os nutrientes requeridos para o crescimento

celular (PIRT, 1975).

19

O cultivo de microalgas como parte da biotecnologia moderna tem recebido a

ateno de pesquisadores em todas as partes do mundo. As condies de crescimento e os

biorretores para o cultivo tm sido exaustivamente estudados (COLLA, 2004).

As fontes de energia classificadas nos seguintes grupos:

a) Fontes de elementos principais (carbono, hidrognio, oxignio e nitrognio);

b) Fontes dos elementos secundrios (fsforo, enxofre, potssio e magnsio);

c) Vitaminas e hormnios;

d) Fontes de elementos traos, requerimento em quantidades mnimas para o

crescimento microbiano (clcio, ferro, zinco e cobre). Usado em concentraes da

ordem de 10-4

para concentraes de 30 gramas de clulas seca por litro.

Alguns autores sugerem que a formao do meio de cultivo leve em conta a

composio celular, requerimento energtico e a necessidade de substncias especficas

(WANG et al., 1979).

O meio para crescimento microbiano deve conter os elementos presentes na

clula, em propores corretas. As fontes de nitrognio podem ser orgnicas ou

inorgnicas e no podem faltar na composio do meio, pois sua falta prejudica o

crescimento celular.

2.1.3.4.1 Luminosidade

As algas utilizadas para a produo de biomassa pertencem ma maioria das

vezes aos gneros Chlorella, Scenedesmus ou Spirulina. Podem crescer

fotossisteticamente e autotroficamente, luz e fonte de carbono inorgnico ou

heterotroficamente, com compostos orgnicos como fonte de carbono e de energia. O

mtodo mais racional para a obteno de biomassa de algas deve ser autotroficamente e o

fator limitante a iluminao (BULOCK e KRISTIANSEM, 1991).

Segundo VONSHASK, (1997), a disponibilidade de luz um dos principais

problemas observados no cultivo fotoautotrfico de microalgas. A luz precisa ser

continuamente fornecida ao sistema porque no pode ser acumulada. A limitao do

crescimento em culturas densas pode ocorrer devido ao sombreamento provocado pelas

prprias clulas medida que h o crescimento, impedindo que parte da cultura receba a

incidncia da luz. Para o caso especfico da Spirulina, o fenmeno do sombreamento

ocorre em concentraes superiores a 0.5 g.L-1

. A agitao da cultura pode ser um fator

20

decisivo na velocidade de crescimento, possibilitando uma absorso homognea da luz

pelas clulas.

A Spirulina considerada fotoautotrfica e no cresce no escuro, mesmo que o

meio contenha fonte de carbono orgnica. Na presena de luz a alga pode utilizar

carboidratos, como por exemplo, glicose a 0,1% no meio aumentando a velocidade de

crescimento e produo de clulas (FERRAZ et al., 1985).

Para o crescimento da Spirulina prefervel ter uma fonte de iluminao

artificial em vez da luz solar, uma vez que a ultima possui ondas ultravioletas, os quais

so prejudiciais as clulas da microalga. Mil lux de iluminao artificial suficiente para

o crescimento da maioria das microalgas (MICHEL et al., 1986).

2.1.3.4.2 Fontes de Carbono

O crescimento de algas quimiotrficamente ou fotoautrficamente ocorre pela

utilizao de CO2 ou uma de suas formas hidratadas para a sntese de compostos

orgnicos. Na gua, o CO2 pode apresentar-se como H2CO3, HCO3-

ou CO3-2

,

dependendo do pH (RICHMOND, 1990).

O Dixido de Carbono a fonte de carbono para o crescimento das algas. O ar

contm somente 0.03% de CO2, sendo necessria a adio de CO2 a cultura

(RICHMOND, 1990).

Cianobactrias so capazes de utilizar tanto o CO2 livre ou CO3-2

como fonte de

carbono inorgnico na fotossntese. Os ons hidrogenocarbonatos podem ser

transportados (na presena de luz) atravs da membrana plasmtica sendo acumulados na

clula para servir como carbono inorgnico na fotossntese. O hidrogenocarbonato

convertido a CO2 pela ao da enzima anidrase carbnica atravs da reao, como

mostrado na Equao 1:

HCO3- + H

+ CO2 + H2O Equao (1)

A atividade da anidrase carbnica aumenta quando as concentraes de CO2

externo diminuem (FAY, 1983).

21

2.1.3.4.3 Fontes de Nitrognio

Depois do carbono, o nitrognio quantitativamente o elemento mais importante

contribuindo com a massa seca das clulas. A proporo de nitrognio pode variar de 1-

10% em peso seco.

Algumas cianobactrias so capazes de fixar nitrognio atmosfrico pela

reduo do N2 a NH4+

catalisada pela enzima nitrogenase (RICHMOND, 1990). A

nitrogenase extremamente sensitiva ao O2 livre e atua somente em condies

anaerbicas. A sensibilidade da nitrogenase ao O2 e o fato de estar presente somente em

organismos procariticos sugere que a habilidade para fixar nitrognio foi desenvolvida

durante o perodo anoxignico da histria da terra. A passagem para o perodo oxignico

e o aumento das presses parciais de O2 tornou necessrio que as formas fixadoras de N2

se adaptassem, fazendo surgir compartimentos na clula que impedissem a inativao da

nitrogenase pelo O2 atmosfrico e tambm da atividade fotossinttica, que so os

heterocistos (FAY, 1983).

A Spirulina no fixa nitrognio atmosfrico por no apresentar heterocistos,

podendo utilizar fontes de nitrognio variadas como os ons nitrato, nitrito, amnio e

uria. Quando o nitrognio fornecido em uma forma oxidada, como o nitrato (NO3-) ou

nitrito (NO2-), este reduzido at amnia antes de ser incorporado em molculas

orgnicas (YANG et al., 2000), O estado de oxidao do tomo de N no nitrato de +5 e

na amnia 3, portanto sero necessrios 8 eltrons na reduo, como mostrado na

Equao 2.

NO3- NO2

- NH4

+ Equao (2)

So necessrios 2 eltrons na primeira etapa e 6 eltrons na segunda etapa. Na

primeira etapa as enzimas necessrias so a nitrato redutase e a nitrato oxidorredutase, e

na segunda etapa as enzimas necessrias so a nitrito redutase e a nitrito oxidorredutase

(RICHMOND, 1990; VONSHAK, 1997).

22

Quando os ons nitrato e amnio so fornecidos como fonte de nitrognio,

primeiramente consumido o amnio e somente depois o nitrato, sendo o amnio

utilizado na sntese de aminocidos. A incorporao do nitrognio amoniacal pode

ocorrer por duas vias: a catalisada pela enzima glutamina desidrogenase (GHD), que

incorpora o nitrognio amoniacal ao glutamato atravs da glutamina sintetase (GS), onde

o nitrognio amoniacal incorporado formando glutamina (RICHMOND, 1990), como

mostrado na Figura 3. Se somente nitratos e nitritos estiverem disponveis, ambos sero

assimilados simultaneamente (KINNE, 1978).

Figura 3: Assimilao de amonnio atravs das enzimas glutamina desidrogenase (GDS)

e glutamina Sintetase (GS).

Quando hidrxido de amnio usado como nica fonte de nitrognio, o pH pode

cair rapidamente, causando efeitos indesejveis. Algumas algas so sensveis a altas

concentraes de amnio e seu crescimento pode ser inibido por 1 mol.L-1

de amnio.

Esta inibio pode ser correlacionada com um acrscimo no pH interno devido

penetrao de molculas de hidrxido de amnio no dissociadas. Manabe et al. 1992,

estudaram o efeito da concentrao de cloreto de amnio no crescimento da Spirulina

platensis, verificando que o crescimento da microalga inibido na presena de cloreto de

amnio, no havendo crescimento em concentraes superiores a 25 mol.L-1

. Entretanto,

em 24 e 40 horas de crescimento aps a adio observou-se novamente o crescimento em

concentraes de 15 e 25 mol.L-1

de cloreto de amnio respectivamente.

23

A uria pode ser considerada como fonte de nitrognio para o crescimento de

microalgas, sendo hidrolisada antes de o nitrognio ser incorporado pelas algas, o que

pode ocorrer atravs de duas reaes enzimticas, ou catalisada pela urase ou pela

amidoliase, levando a formao de amnia (RICHMOND,1990). Comparada as fontes

como o nitrato de potssio ou nitrato de sdio, tem um custo relativamente baixo, alm

do que cada molcula de uria fornece dois tomos de nitrognio, enquanto cada sal de

nitrato de potssio ou sdio, apenas um (FAINTUCH et al., 1992).

Em geral, microrganismos respondem falta de nitrognio pela degradao

preferencial de uma ou mais macromolculas que contm nitrognio, resultando na

diminuio destes compostos e acmulo de compostos de reserva de carbono, como

polissacardeos e cidos graxos. O contedo de pigmentos fotossintticos diminui e a taxa

de fotossntese reduzida. Nestas condies, a habilidade de assimilar compostos

combinados de nitrognio aumenta (RICHMOND, 1990).

Nas cianobactrias duas fontes de estocagem de nitrognio endgeno que podem

ser utilizadas na deficincia de nitrognio nas clulas so cianofcias e ficocianina.

Grnulos de cianofcina so copolmeros de cido asprtico e arginina. Mudanas na

atividade enzimtica foram observadas na depleo de nitrognio. A atividade de nitrato-

redutase foi observada em clulas crescendo em amnio aps um curto perodo de falta

de nitrognio, sendo que o aumento da atividade de enzimas de assimilao

acompanhado por um decrscimo na taxa fotossinttica (RICHMOND, 1990).

2.1.3.4.4 Concentrao de Oxignio

A concentrao de O2 no tanque de cultura representa um bom parmetro para o

controle da atividade fotossinttica das microalgas. medida que aumenta a atividade

fotossinttica, a concentrao de O2 no tanque pode aumentar rapidamente a valores

acima do ponto de saturao, inibindo o processo de fotossntese e favorecendo o

processo de fotooxidao (Richmond, 1990), o qual ocasiona deteriorao celular e perda

completa da cultura (FAINTUCH, 1989).

24

2.1.3.4.5 Temperatura

A temperatura afeta a concentrao de biomassa, a natureza do metabolismo, as

necessidades nutricionais e a composio de biomassa (FAINTUCH, 1989), com efeitos

diretos sobre a fotossntese e a respirao. Por outro lado, a fixao de CO2, e evoluo

do O2, dependem tambm da luz.

A temperatura usual utilizada laboratorialmente para o cultivo da Spirulina varia

de 35C a 38C. timos de temperatura podem variar entre diferentes espcies e desvios

desta faixa podem inibir a capacidade fotossinttica. Estudos demonstraram que culturas

crescendo a temperaturas menores que a tima so mais sensveis a fotoinibio

(VONSHAK, 1997).

No inverno, a temperatura o fator limitante afetando o crescimento da

microalga em tanques abertos, enquanto no vero, o fator limitante a luminosidade.

Baixas temperaturas nos perodos escuros podem ser vantajosas visto que diminui a taxa

respiratria e, portanto, o consumo de biomassa (VONSHAK, 1997).

2.1.3.4.6 Aerao e Agitao

A injeo de ar aos cultivos em massa proporciona uma difuso efetiva dos

nutrientes, um aponte parcial de CO2, inorgnico, uma estabilizao do pH, o mantimento

das algas em suspenso e o cultivo uniformemente distribudo. Cultivos em volumes de

um litro ou menos no necessitam aerao, basta que se realize uma agitao manual

diariamente.

Nos cultivos em grande escala, a aerao deve ser leve durante a fase de

induo, que corresponde ao perodo de at 2 dias depois da inoculao, devendo ser

incrementada com o aumento da densidade da cultura (MICHEL et al., 1986).

2.1.3.4.7 Salinidade

A exposio de culturas de Spirulina a altas concentraes de cloreto de sdio

resulta numa imediata interrupo do crescimento. Aps a fase lag, um novo estado

25

estabelecido.

Foi analisado o crescimento de Spirulina em concentraes de NaCl de 0,5 e

0,75 M, observando-se um decrscimo na concentrao de biomassa, em comparao

com cultivos da microalga em meio padro. O perodo de adaptao a elevadas

concentraes salinas depende tambm da espcie estudada, estando em muitos casos

associado com o declnio de clorofila das clulas. Duas espcies da microalga

apresentaram velocidades especficas mximas de crescimento de 0,063 e 0,059 h-1

, 0,044

e 0,026 h-1

, e 0,034 e 0,018 h-1

, crescendo no meio de cultivo padro, com 0,5 e 0,75 M

de cloreto de sdio, respectivamente (VONSHAK, 1997).

Supe-se que a exposio a altas salinidades acompanhada de um aumento na

demanda de energia devido ao stress das clulas. A imediata inibio do sistema

fotossinttico e respiratrio aps a exposio a um stress salino foi explicada por

Ehrenfeld; Cousin (1984) e Reed et al. (1985), citados por Vonshak (1997). Eles

mostraram um acrscimo da concentrao celular de sdio ocasiona um aumento da

permeabilidade da membrana plasmtica durante os primeiros instantes de exposio a

altas concentraes salinas. Supe-se que a inibio da fotossntese provm da rpida

entrada do sdio que pode resultar na separao dos ficobilissomas da membrana

tilacide.

2.1.4 CONTAMINAO DAS GUAS POR METAIS

Os metais txicos surgem nas guas naturais devido aos lanamentos de efluentes

industriais tais como os gerados em indstrias extrativistas de metais, indstrias de tintas

e pigmentos e, especialmente, as galvanoplastias, que se espalham em grande nmero nas

periferias das grandes cidades. Alm destas, os metais podem ainda estar presentes em

efluentes de indstrias qumicas, como as de formulao de compostos orgnicos e de

elementos e compostos inorgnicos, indstrias de couros, peles e produtos similares,

indstrias do ferro e do ao, lavanderias e indstria de petrleo.

Os metais txicos constituem contaminantes qumicos nas guas, pois em

pequenas concentraes trazem efeitos adversos sade. Desta forma, podem inviabilizar

os sistemas pblicos de gua, uma vez que as estaes de tratamento convencionais no

os removem eficientemente e os tratamentos especiais necessrios so muito caros. Os

metais txicos constituem-se em padres de potabilidade estabelecidos pela Portaria

26

1.469 do Ministrio da Sade. Devido aos prejuzos que, na qualidade de txicos, podem

causar aos ecossistemas aquticos naturais ou de sistemas de tratamento biolgico de

esgotos, so tambm padres de classificao das guas naturais e de emisso de esgotos,

na legislao federal.

Para a remoo de metais txicos o processo mais eficiente o que se baseia no

fenmeno de troca inica, empregando-se resinas catinicas em sua forma primitiva de

hidrognio ou na forma sdica. Este processo permite uma remoo percentual bastante

significativa dos metais presentes na gua, viabilizando seu uso para finalidades

industriais especficas e permitindo tambm o reuso de efluentes industriais.

No campo do tratamento de efluentes, o processo mais utilizado o da

precipitao qumica na forma de hidrxidos metlicos. Cada on metlico tem o seu

valor de pH timo de precipitao como hidrxido, de forma que, quando se tm misturas

de diversos metais, pode ser necessrio que se trabalhe em mais de uma faixa de pH.

Como normalmente as vazes de efluentes so baixas, os tratamentos so desenvolvidos

de forma esttica, em regime de batelada, o que facilita o uso de mais de uma faixa de

pH. Nos processos contnuos, ter-se-ia que utilizar uma srie de sistemas de mistura e

decantao.

Um problema importante dos processos base de precipitao qumica que deve

ser levado em considerao a produo de quantidades relativamente grandes de lodos

contaminados com metais. Estes devem ser encaminhados a sistemas adequados de

tratamento ou disposio final, que nem sempre encontram-se disponveis (WEBBER,

1983).

2.1.5 PROBLEMAS DE SADE CAUSADOS POR CONTAMINAES COM

CROMO

O cromo obtido do minrio cromita, metal de cor cinza que reage com os cidos

clordrico e sulfrico. Alm dos compostos bivalentes, trivalentes e hexavalentes, o

cromo metlico e ligas tambm so encontrados no ambiente de trabalho. Entre as

inmeras atividades industriais, destacam-se: galvanoplastia, soldagens, produo de

ligas ferro-cromo, curtume, produo de cromatos, dicromatos, pigmentos e vernizes

(SALGADO, 1996).

A absoro de cromo por via cutnea depende do tipo de composto, de sua

27

concentrao e do tempo de contato. O cromo absorvido permanece por longo tempo

retido na juno dermo-epidrmica e no estrato superior da mesoderme. A maior parte do

cromo eliminada atravs da urina, sendo excretada aps as primeiras horas de

exposio. Os compostos de cromo produzem efeitos cutneos, nasais, bronco-

pulmonares, renais, gastrointestinais e carcinognicos. Os cutneos so caracterizados por

irritao no dorso das mos e dos dedos, podendo transformar-se em lceras. As leses

nasais iniciam-se com um quadro irritativo inflamatrio, supurao e formao crostosa.

Em nveis bronco-pulmonares e gastrointestinais produzem irritao bronquial, alterao

da funo respiratria e lceras gastroduodenais (SALGADO, 1996).

2.1.6 BIOSSORO

A capacidade de certos microrganismos de concentrar metais pesados bem

conhecida. Entretanto, somente durante as duas ltimas dcadas que os microrganismos

esto sendo usados como uma alternativa para a remoo e recuperao de metais. O

termo biossoro definido como um processo no qual slidos de origem natural ou

seus derivados so usados na reteno de metais pesados de um ambiente aquoso

(MURALEEDHARAN et al., 1991).

A biossoro compreende a ligao de metais biomassa por um processo que

no envolva energia metablica ou transporte, embora tais processos possam ocorrer

simultaneamente quando biomassa viva for usada, pois a biossoro pode ocorrer com

biomassa viva ou morta (TOBIN et al., 1994).

Embora altamente promissor, o mecanismo da biossoro no est ainda bem

entendido. O termo biossoro no especfico com respeito ao mecanismo de

reteno.

A biossoro de metais no baseada num nico mecanismo. Ela consiste de

vrios mecanismos que quantitativa e qualitativamente diferem de acordo com as

espcies usadas, a origem da biomassa e seu processamento. A biossoro de metais

segue mecanismos complexos, principalmente troca inica, quelao, adsoro por foras

fsicas e o aprisionamento de ons, como resultado do gradiente de concentrao e difuso

atravs da parede celular e membranas (VOLESKY & HOLAN, 1995).

28

Embora clulas vivas e mortas sejam capazes de acumular metais, pode haver

diferenas nos mecanismos envolvidos em cada caso, dependendo da extenso da

dependncia metablica (GADD, 1990).

O entendimento dos mecanismos pelos quais microrganismos acumulam metais

importante para o desenvolvimento de processos de concentrao, remoo e recuperao

de metais de solues aquosas. Por exemplo, o conhecimento das reaes qumicas ou

fisiolgicas durante a biossoro metlica poderia possibilitar a especificao e controle

dos parmetros do processo para aumentar a velocidade, quantidade e especificidade da

acumulao metlica.

As paredes de bactrias, algas e fungos so eficientes biossorventes metlicos, e

em muitos casos a ligao inicial pode ser seguida pela deposio inorgnica de

quantidades crescentes de metal. Ligaes covalentes e inicas podem estar envolvidas

na biossoro, com constituintes tais como protenas e polissacardeos. Em vrias

espcies, a biossoro pode ser a maior proporo da reteno total. Isto especialmente

verdadeiro para metais pesados como chumbo e alumnio, e radioativos como urnio e

trio. As variaes na composio das paredes celulares das clulas microbianas, que

podem ser influenciadas pelas condies de cultura, podem resultar em variaes

considerveis na capacidade biossortiva e permitir algum grau de acumulao seletiva

(GADD, 1990).

2.1.6.1 Biossoro de Cromo VI

Na maioria dos estudos sobre biossoro de ons metlicos, os mesmos so

removidos de uma soluo na forma de ctions, uma vez que a maioria dos metais existe

numa soluo na forma catinica. Entretanto, alguns metais podem existir em soluo

tanto como ction ou nion, dependendo do estado de valncia do metal. O cromo um

exemplo deste tipo de metal, sendo que o nion CrO4

2-

(Cr(VI)) altamente txico.

A remoo de cromo(VI), tem sido avaliada por vrios pesquisadores com

diferentes tipos de adsorventes, biolgicos e no biolgicos (SAG & KUTSAL, 1989;

PANDAY et al., 1984; SHARMA & FORSTER, 1993; NOURBAKHSH et al. 1994). Em

todos os casos o pH da soluo teve uma influncia muito grande na capacidade de

remoo do cromo(VI), sendo que as maiores remoes de cromo foram obtidas a pH 2,0.

29

A temperatura exerceu uma menor influncia, mas o aumento da temperatura (numa faixa

de 25 a 45o

C) provocou uma reduo na capacidade de reteno nos vrios adsorventes

utilizados.

SHARMA & FORSTER (1993) avaliaram o comportamento da turfa do musgo

esfagno, substncia que tem demonstrado capacidade de troca inica e complexao com

metais pesados, na biossoro de cromo(VI). A dessoro do metal com soluo de

NaOH 1M removeu somente 50% do metal sorvido, sugerindo que a interao metal-

musgo envolvia fortes foras de quimiossoro.

GUAN et al. (1993) estudaram a capacidade de adsoro de um consrcio de

bactrias desnitrificantes para CrO4

2-

. Para determinar quais fatores afetavam a

quantidade de metal captada pela biomassa, um conjunto de experimentos foi realizado.

Os fatores observados foram: pH, temperatura, concentrao de CCl4, estado da biomassa

(viva ou morta) e concentrao de Fe3+

. Os resultados tambm foram usados para

determinar quais dos parmetros experimentais tinham efeito significativo sobre os

parmetros da isoterma de Langmuir, mxima concentrao do ons na fase slida (limite

prtico da capacidade de adsoro de um material), e constante de equilbrio. Todos os

parmetros, diretamente ou por interao, tiveram um efeito significativo sobre os dois

parmetros da isoterma de Langmuir. Entretanto, os efeitos do pH da soluo e estado da

biomassa (ativa ou inativa) foram maiores.

A biossoro de Cr(VI) ou sua reduo para Cr(III), relativamente muito menos

txico, por microrganismos so processos teis na remediao de slidos e guas

contaminadas. Um grande nmero de bactrias, tanto aerbias como anaerbias,

removem Cr(VI) de solues reduzindo-o a Cr(III). Uma frao do Cr(VI) reduzido pode

tambm ser retido pelas clulas.

As cianobactrias Anabaena variabilis e Synechococcus PCC 6301 foram

avaliadas quanto s suas capacidades em biossorver e reduzir o on cromato (WILHELMI

& DUNCAN, 1995; GARNHAM & GREEN, 1995). Dois tipos de ensaios de biossoro

de cromato foram realizados (curto e longo). No ensaio curto, culturas em fase

exponencial de crescimento foram colocadas em contato com as solues contendo

cromato por 4 horas. No ensaio longo, as culturas cresciam na presena do ons

cromato por um perodo de 18 dias.

30

Os estudos de acumulao de cromato de curta durao revelaram nveis de

biossoro rpidos e relativamente baixos, quando comparados biossoro de ctions.

Para os autores, a composio da parede celular das cianobactrias, similar das bactrias

Nos estudos de exposio ao on cromato por perodos mais longos Anabaena

variabilis foi capaz de reduzir cromo(VI) a cromo(III) e acumular cromo(III). A espcie

Synechococcus PCC 6301 no foi capaz de reduzir cromato, interagindo com o on

apenas por biossoro.

2.1.7 LEGISLAO AMBIENTAL

A legislao ambiental no Brasil comeou a ser estabelecida na dcada de 80,

quando muitos dos representantes de grupos ambientalistas passaram a participar do

governo e outros setores pblicos. Atualmente as leis brasileiras de proteo ambiental

so internacionalmente aceitas. Foram criadas as reas de Proteo Ambiental, o Estatuto

de Tombamento e, em 1998, foi sancionada a Lei de Crimes Ambientais, que estabelece

as penas para infraes e agresses cometidas contra o meio ambiente no Brasil.

A resoluo 357/05 do CONAMA (Conselho Nacional do Meio Ambiente) define

padres de qualidade para classificar uma gua doce como potvel para consumo humano

em 0,05 mg/L de cromo total (CONAMA, 2007), definindo o limite mximo tolervel

dos contaminantes na gua para garantir a potabilidade da mesma. Porm, difcil,

devido falta de dados mais precisos em relao aos danos sade humana quando os

metais esto presentes em concentraes muito baixas. Os limites aceitveis podem variar

de um rgo regulador para outro. Por exemplo, o CONSEMA (Conselho Estadualdo

Meio Ambiente) define em sua resoluo 128/2006, 0,1 mg Cr+6

/L de cromo (VI) e

0,5mg Cr/L de cromo total.

O Conselho Nacional do Meio Ambiente estabeleceu a classificao das guas

doces, salobras e salinas do Territrio Nacional, atravs da Resoluo N 20, de 18 de

junho de 1986, atualmente substituda pela Resoluo CONAMA 357/2005. Conforme

est resoluo os valores mximos para alguns metais, para gua destinada ao

abastecimento domstico, aps o tratamento convencional, est apresentado no Tabela 1.

31

Tabela 1: Padres de potabilidade de gua para metais pesados

METAL CLASSE 1

(mg/L)

CLASSE 2 E 3

(mg/L)

Alunnio 0,100 0,100

Cdmio 0,001 0,010

Chumbo 0,030 0,050

Cobre 0,020 0,500

Cromo trivalente 0,500 0,500

Cromo hexavalente 0,1 0,1

Ferro solvel 0,300 5,000

Mangans 0,100 0,500

Mercrio 0,0002 0,002

Nquel 0,025 0,025

Zinco 0,180 5,00

Fonte: MOTA (1995).

Para descarte de efluentes a resoluo N 20 do CONAMA estabelece alguns

limites de emoses para uns metais, que mostra a Tabela 2.

Tabela 2: Valores mximos admissveis de alguns metais, para o descarte de efluentes.

METAL VMA(mg/L) METAL VMA(mg/L)

Cdmio 0,20 Ferro solvel 15,0

Chumbo 0,50 Mangans solvel 1,00

Cobre 1,00 Mercrio 0,01

Cromo(VI) 0,50 Nquel 2,00

Cromo(III) 2,00 Zinco 5,00

Fonte: MOTA (1995).

32

2.2 MATERIAL E MTODOS

O fluxograma da Figura 4 apresenta as atividades do Trabalho de Concluso de

Curso, as quais foram realizadas no Laboratrio de Fermentaes da Faculdade de

Engenharia e Arquitetura.

Figura 4: Fluxograma das atividades do projeto do trabalho de concluso de curso

realizadas no Laboratrio de Fermentaes da Faculdade de Engenharia e Arquitetura.

33

2.2.1 CULTIVO DA MICROALGA Spirulina platensis

Os cultivos foram realizados utilizando as cepas Spirulina platensis paracas e

Spirulina platensis Leb disponveis no Laboratrio de Fermentaes da Faculdade de

Engenharia e Arquitetura da UPF.

2.2.1.1 Meio de cultivo

O meio utilizado para o cultivo e preparo dos inculos foi o meio Zarrouk, de

composio qumica definida, e amplamente utilizado em experimentos com microalgas,

especialmente para a microalga Spirulina platensis. O meio Zarrouk foi preparado a partir

das Substncias descritas na Tabela 3.

Tabela 3: Composio qumica do meio Zarrouk

Reagentes Quantidades

NaHCO3 16,8(g.L-1

)

K2HPO4 0,5(g.L-1

)

NaNO3 2,5(g.L-1

)

K2SO4 1,0(g.L-1

)

NaCl 1,0(g.L-1

)

MgSO4.7H2O 0,2(g.L-1

)

CaCl2 0,04(g.L-1

)

FeSO4.7H2O 0,01(g.L-1

)

EDTA 0,08(g.L-1

)

Soluo A5 1 mL

Soluo B6 1 mL

Soluo A5 (g.L-1): H3BO3: 2,86; MnCl2.4H2O: 1,81; ZnSO4.7H2O: 0,222; CuCO4.5H2O: 0,079; MnO3:

0,015.

Soluo B6 (g.L-1): NH4VO3: 22,86; KCr(SO4)2. 12H2O:192; NiSO4. 6H2O: 44,8; NaWO4. 2H2O: 17,94;

34

TiOSO4. H2SO4. 8H2O: 61,1; CO(NO3)2. 6H2O: 43,98.

Para cada uma das solues, os sais foram pesados e solubilizados

separadamente em 100 mL de gua destilada e autoclavados. O FeSO4 foi autoclavado

separadamente dos 100 mL de gua.

Foram preparadas solues estoque do metal, utilizando dicromato, atravs da

dissoluo de 10 mg.L-1

, 20 mg.L-1

e 30 mg.L-1

de concentrao de cromo VI.

2.2.1.2 Condies de Cultivo e Biorreatores

O cultivo da microalga S. platensis foi realizado em estufa termostatizada a 30 C,

com iluminao proveniente de lmpadas fluorescentes de 20 W posicionadas no interior

da estufa, fornecendo um total de 1800 lux, fotoperodo de 12 horas (12 horas de claro e

12 horas de escuro) controlado por um temporizador automtico.

Os cultivos foram realizados em frascos de erlenmeyers de 2 L (biorretores)

contendo 1,8 L de meio inicial. O meio de cultivo utilizado foi o Zarrouk (Zarrouk,

1966), diludo a 50%. A aerao foi mantida com fluxo de ar constante, de 0,02 vvm

(volume de ar/volume de meio/minuto), mantida por bombas de diafragma. A Figura 5

mostra um esquema do aparato experimental.

Fonte: COLLA et al. (1999)

Figura 5: Esquema simplificado dos cultivos aerados da cianobactria Spirulina platensis.

35

2.2.2 PLANEJAMENTO EXPERIMENTAL

Os experimentos foram realizados a partir de um Planejamento Fatorial

Multinveis 21.4

1, conforme Tabela 4.

Tabela 4: Matriz do Planejamento Fatorial Multinveis 21.4

1.

Experimentos X1 (Cepa) X2 (Cromo VI (mg/L) inicial)

1 (-1) Paracas (-2) 0

2 (-1) Paracas (-1) 10

3 (-1) Paracas (+1) 20

4 (-1) Paracas (+2) 30

5 (+1) Leb (-2) 0

6 (+1) Leb (-1) 10

7 (+1) Leb (+1) 20

8 (+1) Leb (+2) 30

2.2.3 DETERMINAES ANALTICAS

2.2.3.1 Determinao do pH

Alquotas foram coletadas a cada 24 horas para o monitoramento do pH, durante

os 30 dias de cultivo, atravs de leitura em um potencimetro com eletrodo de vidro.

2.2.3.2 Determinao da Concentrao Celular

Alquotas foram coletadas a cada 24 horas para a determinao da concentrao

celular, durante 30 d, atravs de leitura da Abs a 670 nm em espectrofotmetro. As

absorbncias foram relacionadas com uma curva-padro de biomassa, construda

utilizando suspenses da microalga Spirulina platensis paracas e Spirulina platensis Leb.

A curva padro consiste numa relao pr-estabelecida entre a concentrao celular e a

absorbncia a 670 nm.

36

Para a construo da curva padro, as suspenses de clulas foram diludas a fim

de obterem-se diferentes concentraes da microalga. As concentraes de cada

suspenso foram determinadas atravs da filtrao em bomba de vcuo de 25 mL de cada

diluio como mostra a Figura 6. A massa celular retida no filtro foi transferida para uma

placa de Petri e colocada em estufa a 60C por 24 horas. Todas as diluies foram

submetidas leitura de absorbncia em espectrofotmetro UV a 670 nm. A relao ABS

(absorbncia) versus concentrao de biomassa (g/L) foi obtida a partir de regresso

linear dos dados utilizando-se o programa Excel.

Figura 6: Tcnica de separao de clulas por filtrao.

2.2.3.3 Determinao de Metais

A determinao de metais foi realizada atravs da espectrofotometria a 540 nm,

atravs do mtodo da colorimetria sendo realizada a avaliao dos metais nos tempos de

0, 15 d e 30 d.

A anlise de colorimetria realizada atravs de uma digesto cida, com cido

fosfrico (H3PO4) e logo aps adicionado soluo de Difenilcarbazida, o qual ir dar a

colorao que indicar a concentrao do metal em questo. Esperar um tempo de 10

minutos para que a soluo de Difenilcarbazida reagir com o metal, aps fazer a leitura

no espectofotometro de absoro em um comprimento de onda de 540 nm. Estas leituras

foram relacionadas com a curva padro do cromo VI pr estabelicida.

37

2.3 RESULTADOS E DISCUSSO

2.3.1 DETERMINAO DO pH

Em relao ao pH, todos os experimentos iniciaram com 10 e 10,5 e aps o

cultivo atingiu-se pH entre 10,9 a 11,00, quais mostra o Apndice A. Este aumento de pH

pode ser explicado pelo consumo de ons, ou pela troca inica determinada pela parede

celular da microalga (ROMERA et al., 2007). O pH timo para o cultivo da microalga

Spirulina platensis deve ser superior a 9 (VONSHAK, 1997) verificando-se que o pH foi

mantido na faixa tima para todos os cultivos. Os grficos que apresentam o pH ao longo

do tempo de cultivo esto no Apndice B

2.3.2 CRESCIMENTO DA BIOMASSA

A determinao da concentrao da biomassa para os cultivos das microalgas

Spirulina platensis Paracas e Spirulina platensis Leb foi obtida atravs da correlao

entre a absorbncia da amostra e a correspondente concentrao celular, apresentada nas

curvas padro das Figuras 7 e 8.

Figura 7: Curva padro da microalga Spirulina platensis Paracas.

38

Figura 8: Curva padro da microalga Spirulina platensis Leb.

Em relao ao crescimento ao longo do tempo observou-se que o mximo

crescimento celular ocorreu nos experimentos 1 e 5 conforme as Figuras 9 e 10, sendo

estes experimentos os controles realizados sem a contaminao com o metal,

apresentando concentraes mximas de biomassa de 1,45 gclula seca/L.

Os experimentos 2 e 6 (Figura 11 e 12), com contaminao de cromo de 10 mg/L

apresentaram concentraes de biomassa de 1,42 gclula seca/L e 1,40 gclula seca/L, similar ao

crescimento observado nos experimentos controle.

Os experimento 3, 4, 7 e 8 (contaminaes de cromo de 20 mg/L e 30 mg/L),

apresentaram baixo crescimento celular (Figuras 13, 14, 15 e 16), com concentraes de

biomassa mximas de 0,429 gclula seca/L; 0,187 gclula seca/L; 0,349 gclula seca/L e 0,129 gclula

seca/L.

Figura 9: Concentrao Celular

(gclulaseca/L) versus tempo (d) para o

experimento 1 (controle).



experimento 5 (controle).

39



experimento 2 (contaminao de 10 mg/L

de Cr VI).




de Cr VI).




de Cr VI).




de Cr VI).




de Cr VI).




de Cr VI).

40

O Apndice B apresenta os resultados de concentrao celular (gclula seca/L) para

os experimentos do planejamento experimental em funo do tempo de cultivo.

Para a obteno das velocidades especficas mximas de crescimento (max) e dos

tempos de gerao, foram cosntruidos os grficos apresentados nas Figuras 17, 18, 19,

20, 21, 22, 23 e 24. As regresses obtiveram altos coeficientes de correlao, o que indica

que os dados utilizados se aproximam do comportamento exponencial (fase Log), tpico

da fase logartimica de crescimento de microrganismos. As velocidades especifcas

mximas de crescimento so o coeficiente b das equaes representadas nas figuras

(Y=a.eb.X

).

Figura 17: Regresso exponencial da

concentrao de biomassa versus tempo

para o clculo da umax do experimento 1

(concentrao inicial de 0 mg/L de Cromo

VI).




(concentrao inicial de 10 mg/L de

Cromo VI).







41


Cromo VI).


Cromo VI).




(concentrao inicial de 0 mg/L de Cromo

VI).





Cromo VI).





Cromo VI).





Cromo VI).

42

Os resultados da concentrao celular mxima, tempo de gerao (Tg), velocidade

especfica mxima de crescimento (max) e intervalo da fase logartimica de crescimento

obtidos atravs do planejamento experimental esto apresentados na Tabela 5.

Tabela 5: Concentrao celular mxima, tempo de gerao (Tg), velocidade especfica

mxima de crescimento (max) e intervalo da fase logartimica de crescimento para os

experimentos do planejamento experimental.

Exp. X1 (Cepa)

X2 (Cromo

VI (mg/L)

inicial)

Conc. mx (gclula

seca/L) Tg (d)

max

(gclula/gclula.d)

Log

(d)

1 (-1) Paracas (-2) 0 1,446 4,0159 0,1726 15

2 (-1) Paracas (-1) 10 1,426 3,5113 0,1974 13

3 (-1) Paracas (+1) 20 0,478 2,7321 0,2537 7

4 (-1) Paracas (+2) 30 0,409 3,1041 0,2233 9

5 (+1) Leb (-2) 0 1,064 3,9094 0,1773 15

6 (+1) Leb (-1) 10 1,405 3,9653 0,1748 15

7 (+1) Leb (+1) 20 0,569 2,4252 0,2858 8

8 (+1) Leb (+2) 30 0,523 3,2450 0,2136 9

Verifica-se na Tabela 4 que maiores umax (menor tempo de gerao) foram obtidas

nos experimentos que apresentaram menores concentraes mximas de clulas, o que

pode ser explicado pelo fenmeno de sombreamento que causado nas clulas quando as

concentraes de biomassa so superiores a 0,5 g/L. O sombreamento limita a absoro

de energia luminosa da fotossntese, limitando as taxas de crescimento. Entretanto,

verifica-se que os experimentos que apresentaram elevadas umax permaneceram pouco

tempo na fase exponencial de crescimento (menores log), devido serem os

experimentos com as maiores contaminaes de cromo.

A concentrao de biomassa uma varivel importante durante a captao de

metal (ROMERA et al., 2007). Mas devemos considerar que quanto maior o crescimento

da biomassa, maior a quantidade de matria seca a ser disposta corretamente, pois o

metal que retirado do meio vai estar acumulado no interior da biomassa. Portanto em

experimentos de remoo de metais, o crescimento da biomassa no deve ser exagerado,

para no gerar um grande custo de tratamento e disposiso final desta biomassa. Neste

experimento o resultado foi muito bom, pois a biomassa no apresentou um crescimento

43

exagerado e o metal foi removido com uma boa eficincia.

2.3.3 REMOO DO METAL

A Tabela 6 apresenta os resultados de remoo de Cromo VI nos

experimentos do Planejamento Experimental aos 15 d e 30 d de cultivo da microalga

Spirulina. A anlise de varincia dos dados de remoo de cromo VI em funo do tempo

de cultivo, da cepa e da concentrao inicial de cromo demonstrou que a interao entre

as trs variveis foi significativa sobre a remoo de cromo (p < 0,00001). A comparao

de mdias dos resultados de remoo de cromo VI est apresentada na Tabela 6, sendo

que mdias seguidas de letras iguais no apresentam diferena significativa entre si (p >

0,05), enquanto mdias seguidas de letras diferentes apresentam diferena significativa

entre si (p < 0,05). A Figura 25 apresenta a remoo de cromo em funo das variveis

cepa e concentrao inicial de cromo e do tempo de cultivo.

Tabela 6: Remoo de Cromo VI nos experimentos do Planejamento Experimental aos 15

d e 30 d de cultivo da microalga Spirulina

Remoo (%)

Exp. (cepa) Concentrao de cromo VI (mg/L) 15 d (%) 30 d (%)

1 (Paracas) 0 00,0a 00,0

a

2 (Paracas) 10 77,50c 78,92

d

3 (Paracas) 20 88,75g 88,93

g

4 (Paracas) 30 89,84h 92,06

j

5 (Leb) 0 00,0a 00,0

a

6 (Leb) 10 74,10b 77,80

c

7 (Leb) 20 86,47e 88,04

f

8 (Leb) 30 90,50i 90,82

i

A anlise estatstica demonstrou que os melhores resultados foram obtidos nos

experimentos 4 e 8, ou seja, os que iniciaram com contaminao de Cr VI de 30mg/L. O

melhor resultado obtido foi no experimento 4 com a cepa Paracas em um tempo de 30 d,

mas no tempo de 15 d tambm obteve-se remoo significativa. O experimento 8 com a

cepa Leb, no apresentando diferenas significativas entre os tempos de cultivo, mas

apresentou remoo do metal. A maior remoo de cromo VI foi obtida no experimento

44

4, com contaminao inicial de 30 mg/L de cromo, aos 30 d de cultivo. Entretanto, sob o

ponto de vista econmico, o cultivo deve ser encerrado em 15 d de cultivo.

Cepa: S. platensis Paracas

[Cr] mg/L

0

10

20

30-10

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

110

Rem

o

o d

e cr

om

o (

%)

Cepa: S. platensis LEB

[Cr] mg/L

0

10

20

30

15 d

30 d

Figura 25: Remoo de cromo VI (%) em funo da concentrao inicial de cromo nos

cultivos, da cepa e do tempo de cultivo (d).

Calado et al. (2003) obtiveram remoes de Pb+2

de 85% com as algas Sargassum

spp e Arribadas, sendo estes valores semelhantes aos obtidos neste trabalho.

Viacelli (2007) utilizou concentraes iniciais de chumbo e cdmio de no mximo

0,2 mg/L obtendo remoes de 86% a 90%. Neste trabalho, a Spirulina realizou com

eficincia a remoo de cromo VI, demonstrando o potencial desta microalga para a

remoo de metais txicos por biossoro.

Bueno (2007) avaliou o potencial de remoo dos metais Pb(II), Cr(III) e Cu(II)

utilizando o microorganismo R. opacus como biossorvente. As concentraes iniciais

foram de 20 mg/L para os trs metais, no final do cultivo foi obtido resultados de 94% de

remoo para o Pb(II), 54% de remoo para o Cr(III) e 43% de remoo para o Cu(II).

Neste trabalho a microalga Spirulina realizou a remoo de Cr VI com maior eficincia,

demonstrando sua capacidade de remoo de metais txicos.

45

3 CONCLUSO

Conclui-se que a microalga Spirulina foi capaz de realizar a biossoro de cromo

VI nos meios contaminados com 10 mg/L, 20mg/L e 30 mg/L de cromo VI, apresentando

remoes de 78% at 92%, podendo ser utilizada em estudos posteriores de remoo de

cromo VI de efluentes lquidos.

46

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50

APNDICES

Apndice A

Anlise de pH referente aos 8 experimentos cultivados durante 30 dias.

pH

Exp. 1 Exp. 2 Exp. 3 Exp. 4 Exp. 5 Exp. 6 Exp 7 Exp. 8

1 10,47 10,52 10,52 10,59 10,77 10,65 10,68 10,54

2 10,81 10,95 10,65 10,56 10,65 10,9 10,64 10,46

3 10,65 10,34 10,3 10,49 10,65 10,52 10,56 10,4

4 10,63 10,58 10,5 10,31 10,51 10,46 10,39 10,3

5 10,48 10,34 10,43 10,3 10,42 10,43 10,48 10,36

6 10,85 10,78 10,59 10,55 10,82 10,67 10,54 10,53

7 10,62 10,62 10,66 10,57 10,77 10,81 10,73 10,69

8 10,45 10,49 10,54 10,38 10,5 10,51 10,53 10,37

9 10,52 10,49 10,57 10,45 10,55 10,56 10,62 10,39

11 10,52 10,47 10,5 10,33 10,5 10,48 10,55 10,27

12 10,53 10,36 10,44 10,35 10,71 10,63 10,66 10,5

13 10,36 10,29 10,33 10,15 10,38 10,57 10,45 10,39

14 10,28 10,46 10,49 10,41 10,69 10,81 10,78 10,58

15 10,32 10,44 10,45 10,36 10,8 10,6 10,68 10,52

16 10,3 10,36 10,36 10,05 10,54 10,39 10,3 10,19

18 10,59 10,49 10,56 10,29 10,53 10,53 10,38 10,5

19 10,88 10,76 10,67 10,71 10,91 10,08 10,9 10,63

20 10,93 10,97 10,87 10,76 10,87 10,9 10,97 10,68

21 11,07 11,12 10,94 10,73 10,97 10,96 11,01 10,74

22 11,19 11,23 11,07 10,86 11,17 11,17 10,96 10,86

23 10,84 10,82 10,77 10,57 10,81 10,73 10,66 10,46

25 10,79 10,83 10,64 10,45 10,81 10,88 10,84 10,53

26 10,86 10,84 10,69 10,52 10,83 10,76 10,74 10,67

27 10,82 10,99 10,77 10,72 10,94 10,85 10,61 10,63

28 10,99 10,97 10,67 10,51 10,96 10,94 10,82 10,74

30 10,91 10,96 10,64 10,73 10,88 10,91 10,69 10,56

52

Apndice B

Os grficos apresentam o pH ao longo do tempo de cultivo para os experimentos do planejamento experimental.

pH versus tempo de cultivo (d) do

experimento 1 do Planejamento

Experimental.



Experimental.



Experimental.



Experimental.

53



Experimental.



Experimental.



Experimental.



Experimental.

54

Apndice C

Anlise da concentrao celular (X) da microalga Spirulina platensis, em funo do tempo de cultivo.

Concentrao Celular (X)

Exp. 1 Exp. 2 Exp. 3 Exp. 4 Exp. 5 Exp. 6 Exp 7 Exp. 8

1 0,054 0,049 0,060 0,043 0,048 0,048 0,043 0,045

2 0,093 0,106 0,077 0,076 0,051 0,081 0,089 0,083

3 0,108 0,113 0,084 0,077 0,062 0,098 0,103 0,093

4 0,159 0,158 0,128 0,118 0,089 0,143 0,151 0,127

5 0,189 0,194 0,125 0,113 0,106 0,168 0,162 0,129

6 0,288 0,301 0,242 0,187 0,178 0,261 0,272 0,191

7 0,360 0,371 0,259 0,217 0,222 0,312 0,315 0,224

8 0,424 0,429 0,473 0,243 0,262 0,370 0,349 0,251

9 0,461 0,475 0,308 0,269 0,304 0,414 0,398 0,281

11 0,506 0,538 0,328 0,302 0,347 0,453 0,432 0,295

12 0,528 0,566 0,478 0,318 0,346 0,485 0,451 0,291

13 0,651 0,682 0,328 0,356 0,458 0,603 0,528 0,296

14 0,689 0,705 0,342 0,362 0,451 0,634 0,569 0,268

15 0,764 0,777 0,167 0,289 0,498 0,689 0,565 0,018

16 0,810 0,813 0,272 0,200 0,557 0,720 0,514 0,022

18 0,833 0,872 0,358 0,265 0,614 0,768 0,504 0.039

19 0,884 0,908 0,376 0,249 0,612 0,953 0,512 0,050

20 1,061 1,007 0,477 0,312 0,719 0,946 0,536 0,057

21 1,084 1,074 0,198 0,321 0,751 0,972 0,350 0,058

22 1,109 1,126 0,240 0,342 0,783 1,028 0,193 0,034

23 1,168 1,154 0,151 0,344 0,852 1,064 0,105 0,007

25 1,220 1,248 0,051 0,357 0,877 1,139 0,083 0,005

26 1,238 1,337 0,

alga spirulina

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