aktivitas penghambatan pembentukan biofilm ekstrak...

AKTIVITAS PENGHAMBATAN PEMBENTUKAN BIOFILM EKSTRAK

ETANOL PEGAGAN (Centella asiatica (L.) Urban)

TERHADAP Staphylococcus aureus

SKRIPSI

Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat

Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S. Farm.)

Program Studi Farmasi

Oleh:

Felicita Eka Putri S

NIM: 158114107

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SANATA DHARMA

YOGYAKARTA

2019

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

i

AKTIVITAS PENGHAMBATAN PEMBENTUKAN BIOFILM EKSTRAK

ETANOL PEGAGAN (Centella asiatica (L.) Urban)

TERHADAP Staphylococcus aureus

SKRIPSI

Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat

Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S. Farm.)

Program Studi Farmasi

Oleh:

Felicita Eka Putri S

NIM: 158114107

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SANATA DHARMA

YOGYAKARTA

2019


ii


iii


iv


v


vi

ABSTRAK

Banyak infeksi yang disebabkan oleh bakteri Staphylococcus aureus seperti

infeksi saluran kencing, saluran darah, jaringan lunak, serta saluran pernapasan.

Kasus infeksi bakteri semakin parah dengan meningkatnya kasus resistensi S.

aureus terhadap antibiotik. Pembentukan biofilm pada S. aureus menjadi salah satu

penyebab resistensi. Tanaman pegagan (Centella asiatica (L.) Urban) merupakan

tanaman yang banyak tumbuh di Indonesia dan memiliki manfaat sebagai

antimikroba. Pada penelitian ini dilakukan uji aktivitas ekstrak etanol pegagan

terhadap penghambatan pembentukan biofilm S. aureus dan penentuan persen (%)

penghambatan pembentukan biofilm untuk masing-masing konsentrasi ekstrak

etanol pegagan. Metode yang digunakan adalah microtiter plates antibiofilm assay

dengan pewarnaan menggunakan crystal violet 1%. Selain itu juga dilakukan

skrining fitokimia menggunakan uji tabung.

Penelitian diawali dengan uji pertumbuhan biofilm. Hasilnya menunjukkan

bahwa penambahan glukosa 1% dapat meningkatkan pertumbuhan biofilm dan

termasuk dalam strong-biofilm former. Uji aktivitas ekstrak etanol herba pegagan

menggunakan konsentrasi 2 mg/ml, 4 mg/ml, 8 mg/ml, 16 mg/ml, dan 32 mg/ml.

Hasil penelitian menunjukkan bahwa ekstrak etanol pegagan memiliki aktivitas

antibiofilm dengan persentase penghambatan untuk masing – masing konsentrasi

secara berturut-turut adalah 47,13%, 55,90%, 63,13%, 67,68%, dan 70,94%.

Berdasarkan skrining fitokimia, ekstrak etanol herba pegagan mengandung

alkaloid, fenol, tanin, flavonoid, saponin, dan terpenoid.

Kata kunci : Staphylococcus aureus, antibiofilm, herba, Centella asiatica (L) Urban


vii

ABSTRACT

Many infections are caused by Staphylococcus aureus bacteria such as

urinary tract, blood vessels, soft tissue, and respiratory tract infections. Cases of

bacterial infection are getting worse by the increase of S. aureus resistance to

antibiotics cases. Biofilm formation in S. aureus is one of the causes of resistance.

Gotu kola (Centella asiatica (L.) Urban) is a plant that is widely grown in Indonesia

and has function as an antimicrobial. In this study, the activity test of gotu kola

ethanol extract was conducted to inhibit S. aureus biofilm formation and determine

the percent (%) inhibition of biofilm formation for each concentration of gotu kola

ethanol extract. The method used is microtiter plate antibiofilm assay by staining

using crystal violet 1%. In addition, phytochemical screening was also done using

a tube test.

The study began with a biofilm growth test. The result showed that the

addition of 1% glucose can increase biofilm growth and is included in the strong-

biofilm former. The activity test of the ethanol extract of gotu kola herb uses a

concentration of 2 mg/ml, 4 mg/ml, 8 mg/ml, 16 mg/ml, and 32 mg/ml. The result

showed that gotu kola ethanol extract had antibiofilm activity with inhibitory

percentages for each concentration of 47.13%, 55.90%, 63.13%, 67.68%, and

70.94%, respectively. Based on phytochemical screening, ethanol extract of gotu

kola herb contains alkaloids, phenols, tannins, flavonoids, saponins, and terpenoids.

Keywords: Staphylococcus aureus, antibiofilm, herb, Centella asiatica (L) Urban


viii

DAFTAR ISI

HALAMAN JUDUL ................................................................................................ i

HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING ..................................................... ii

HALAMAN PENGESAHAN ................................................................................ iii

LEMBAR PERNYATAAN KEASLIAN KARYA……………………………....iv

LEMBAR PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI …………………….v

ABSTRAK ............................................................................................................. vi

ABSTRACT .......................................................................................................... vii

DAFTAR TABEL ................................................................................................... x

DAFTAR LAMPIRAN ......................................................................................... xii

PENDAHULUAN .................................................................................................. 1

METODE PENELITIAN ........................................................................................ 3

Alat dan Bahan .................................................................................................... 3

Pengumpulan Bahan ............................................................................................ 3

Determinasi Tanaman .......................................................................................... 4

Pengukuran Kadar Air ......................................................................................... 4

Pembuatan Ekstrak Etanol Herba Pegagan ......................................................... 4

Kultur Bakteri Uji ................................................................................................ 5

Pembuatan Larutan Uji ........................................................................................ 5

Pembuatan Larutan Streptomycin ........................................................................ 5

Pembuatan Media Biofilm/TSB + Glukosa 1% (TSBG) .................................... 5

Pembuatan Suspensi Bakteri Uji ......................................................................... 5

Uji Pertumbuhan Biofilm .................................................................................... 6

Uji Aktivitas Penghambatan Pembentukan Biofilm ........................................... 6

Uji Kualitatif Fitokimia ....................................................................................... 8

Pada penelitian ini dilakukan skrining fitokimia menggunakan uji tabung yang

bertujuan untuk mengetahui kandungan senyawa kimia yang terkandung pada

ekstrak etanol pegagan. Metode uji tabung yang dilakukan pada penelitian ini

mengacu pada metode yang digunakan oleh Tiwari et al. pada 2011. ................ 8

Analisis data ........................................................................................................ 8


ix

HASIL DAN PEMBAHASAN ............................................................................... 9

Determinasi, Uji Kadar Air, dan Ekstraksi Herba Pegagan ................................ 9

Uji Pertumbuhan Biofilm .................................................................................. 10

Uji Aktivitas Penghambatan Pembentukan Biofilm ......................................... 13

KESIMPULAN ..................................................................................................... 22

SARAN ................................................................................................................. 22

DAFTAR PUSTAKA ........................................................................................... 23

LAMPIRAN .......................................................................................................... 32

BIOGRAFI PENULIS .......................................................................................... 44


x

DAFTAR TABEL

Tabel 1. Analisis Post-Hoc Tukey terhadap kelompok perlakuan …..…… 16

Tabel 2. Hasil Uji Fitokimia Ekstrak Etanol Pegagan……………………. 20


xi

DAFTAR GAMBAR

Gambar 1. Grafik Pembentukan Biofilm pada Staphylococcus aureus.. 10

Gambar 2. Uji Pertumbuhan Biofilm pada 96-well plate Setelah

Pencucian dan Pewarnaan CV 1% ........................................

11

Gambar 3. Uji Penghambatan Pembentukkan Biofilm pada 96-well

plate Setelah Pewarnaan menggunakan CV 1%....................

15

Gambar 4. Grafik Pengukuran Optical Density Konsentrasi Ekstrak

Etanol Pegagan pada 595nm……………………………….

15

Gambar 5. Grafik Persen Penghambatan Pembentukan Biofilm

Ekstrak Etanol Pegagan dengan Berbagai Konsentrasi pada

Staphylococcus aureus……………………………………..

17

Gambar 6. Simplisia Centella asiatica (L.) Urban…………………….. 35

Gambar 7. Pengukuran Kadar Air Serbuk Centella asiatica (L.) Urban

dengan Destilasi Toluen……………………………………

35

Gambar 8. Ekstrak Kental Centella asiatica (L) Urban……………….. 36

Gambar 9. Larutan Ekstrak Etanol Centella asiatica (L) Urban dengan

konsentrasi 2, 4, 8, 16, dan 32 mg/ml……………………….

36

Gambar 10. Uji Tabung………………………………………………… 37

Gambar 11. Endapan Berwarna Merah pada uji Alkaloid……...……….. 38


xii

DAFTAR LAMPIRAN

Lampiran 1. Surat Pengesahan Determinasi Tanaman Centella asiatica

(L) Urban………………………………………………….

32

Lampiran 2. Certificate of Quality Staphylococcus aureus ATCC

25923……………………………………………………...

33

Lampiran 3. Surat Legalitas Analisis Data oleh Pusat Kajian Clinical

Epidemiology & Biostatistics Unit Faculty of Medicine

Gadjah Mada University ….................................................

34

Lampiran 4. Bahan yang Digunakan Untuk Penelitian………………… 35

Lampiran 5. Pengukuran Kadar Air Serbuk Centella asiatica (L)

Urban……………………………………………………..

35

Lampiran 6. Hasil Ekstraksi…………………………………………… 35

Lampiran 7. Larutan Ekstrak Etanol Pegagan………………………… 36

Lampiran 8. Hasil Pengukuran Optical Density 595nm………………. 36

Lampiran 9. Perhitungan Persen Penghambatan Pembentukan Biofilm.. 37

Lampiran 10. Skrining Fitokimia ……………………………………… 37

Lampiran 11. Hasil Analisis Statistik…………………………………… 38


1

PENDAHULUAN

Otajevwo (2013) menyatakan bahwa 13,9% infeksi saluran kencing di

Senegal, Ghana, dan Nigeria disebabkan oleh Staphylococcus aureus. Menurut

Alabi et al. (2013) bakteri ini juga menyebabkan infeksi lain seperti infeksi saluran

darah (9,5-39%), infeksi kulit dan jaringan-jaringan lunak (62,8-90%), infeksi

telinga, hidung, dan tenggorokan (16,7-29%), serta infeksi pasca operasi (20,4-

32%). Rosalina dkk (2010) mengatakan bahwa S. aureus merupakan penyebab

tertinggi dermatosis vesikobulosa yaitu sebesar 42,1%.

Saat ini resistensi S. aureus menjadi masalah yang sangat serius. Pada tahun

2013, Falagas melakukan penelitian di Afrika terhadap Methicillin Sensitive

Staphylococcus aureus (MSSA) hasilnya menunjukkan bahwa 73,7%-100%

sampel Methicillin Sensitive Staphylococcus aureus (MSSA) tersebut telah resisten

terhadap penicillin, 15-89,1% terhadap co-trimoxazole, dan 21,8-92% terhadap

tetrasiklin. Di Indonesia kasus resistensi S. aureus terhadap vancomycin di Rumah

Sakit Margono Soekarjo Purwokerto sebesar 15,6% (Anjarwati, 2010). Di Rumah

Sakit Dr. Mohammad Hoesin Palembang pada periode Oktober 2011-September

2012, kasus resistensi S. aureus terhadap vancomycin sebesar 2,4% (Syaiful, 2013).

S. aureus memiliki kemampuan adaptasi yang luar biasa. Salah satu bentuk

adaptasi bakteri S. aureus adalah dengan membentuk biofilm atau kolonisasi

(Afifurahman dkk, 2014). Biofilm merupakan proses pengembangan kehidupan

bakteri dari tahap uniseluler nomaden (planktonik) menjadi tahap multiseluler yang

menetap, dimana kemudian berkembang menjadi komunitas terstruktur dan

dilanjutkan diferensiasi seluler (Otto, 2008). S. aureus dapat membentuk biofilm

melalui tiga proses yaitu penempelan, pematangan, dan pelepasan. Pembentukan

biofilm dapat memicu resistensi bakteri, salah satu penyebabnya adalah antibiotik

gagal penetrasi menyerang koloni bakteri (Paraje, 2011). Biofilm dapat

meningkatkan resistensi bakteri hingga 1000 kali lipat dibandingkan bakteri dalam

bentuk planktonik (Olsen, 2015).

Wu et al (2014) mengatakan bahwa pengobatan infeksi dengan biofilm bisa

dilakukan menggunakan antibiotik yang sensitif dan mampu menembus biofilm,

seperti antibiotik golongan aminoglikosida. Hal ini didukung oleh Ciofu et al


2

(2017) yang menyatakan bahwa tobramycin 300 mg digunakan sebagai pilihan

terapi infeksi paru-paru dengan biofilm dan gentamycin 2 mg/ml digunakan pada

terapi infeksi dengan biofilm pada pasien operasi ortopedi. Streptomycin yang

termasuk dalam golongan aminoglikosida juga menjadi pilihan terapi biofilm,

menurut Ahn et al (2018) penggunaan streptomycin mampu menghambat

pembentukkan biofilm.

Saat ini sudah ada penelitian penggunaan tanaman sebagai agen antibiofilm.

Penelitian yang telah dilakukan oleh Quave et al. (2008) menunjukkan bahwa

beberapa tanaman herbal asal Italia memiliki aktivitas penghambatan pembentukan

biofilm pada Methicillin Resistant Staphylococcus aureus (MRSA). Di Indonesia,

penelitian yang dilakukan oleh Kinning dkk (2016), menyatakan bahwa ekstrak air

daun pepaya yang mengandung tanin dan flavonoid mampu menghambat dan

mendegradasi biofilm pada Pseudomonas aeruginosa. Namun penelitian tentang

penggunaan tanaman sebagai agen antibiofilm di Indonesia masih sedikit.

Wilayah hutan Indonesia memiliki keanekaragaman hayati tertinggi ke-2 di

dunia. Sebanyak 40.000 jenis flora yang ada di dunia, 30.000 jenis diantaranya

dapat dijumpai di Indonesia (Kemenhut, 2010). Salah satu tanaman yang mudah

ditemukan di Indonesia adalah pegagan. Tumbuhan yang memiliki nama latin

Centella asiatica (L.) Urban, sering dijumpai di tempat yang terbuka, pada tanah

yang lembab dan subur seperti di pematang sawah, di padang rumput, di pinggir

parit, dan di pinggir jalan (BPOM, 2010). Taemchuay et al. (2009) menyatakan

ekstrak etanol pegagan memiliki aktivitas antimikroba terhadap bakteri S. aureus.

Menurut Hayati et al. (2013), ekstrak etanol daun pegagan yang mengandung tanin

dan flavonoid memiliki aktivitas antibakteri. Namun, di Indonesia belum ada

penelitian berkaitan pemanfaatan ekstrak etanol pegagan sebagai antibiofilm.

Slobodnikova (2016) mengatakan bahwa senyawa yang berperan sebagai

antibiofilm adalah fenol, termasuk di dalamnya adalah flavonoid dan tanin.

Penelitian Lestari dkk (2015) menunjukkan bahwa ekstrak etanol 75% pegagan

mengandung fenol total yang paling tinggi. Selain itu Biradar dkk (2013)

melakukan skrining fitokimia ekstrak etanol pegagan. Hasil penelitian tersebut

menyatakan bahwa ekstrak etanol pegagan mengandung senyawa flavonoid.


3

Berdasarkan latar belakang di atas, maka penelitian ini dilakukan untuk

mengetahui aktivitas penghambatan pembentukan biofilm ekstrak etanol pegagan

terhadap S. aureus dan persen penghambatan dari masing – masing konsentrasi

ekstrak etanol 75% herba pegagan yang diperoleh dengan maserasi. Selain itu pada

penelitian ini juga dilakukan skrining fitokimia kualitatif dengan uji tabung untuk

mengetahui kandungan senyawa aktif pada ekstrak etanol herba pegagan dan untuk

memperkirakan senyawa yang mungkin berperan dalam penghambatan

pembentukan biofilm bakteri S. aureus.

METODE PENELITIAN

Alat dan Bahan

Alat yang digunakan dalam penelitian ini : 96-well plate flat bottom (Iwaki),

Erlenmeyer (pyrex), tabung reaksi (pyrex), labu takar 10 ml (Iwaki), pipet ukur

(pyrex), gelas ukur (pyrex), gelas beker (pyrex), lempeng form shaker (Innova

2100), rotary evaporator (Buchi Rotavapor R-210), destilator (M. Topo tipe MS.

E. 103), autoclave (ALP. Co. Ltd KT.40), inkubator (Memert), microbiology safety

cabinet (LA2 – 3A1-E Class II serial 2016-95067), neraca analitik (Ohaus PA213),

vortex (Gallenkamp spinmix), nephelometer (BD PhoenixSpec), micropipette

(Gilson), microplate reader (Benchmark).

Bahan yang digunakan dalam penelitian ini : Bakteri Staphylococcus aureus

ATCC 25923 (Oxoid), simplisia herba pegagan dari B2P2TOOT, media Nutrien

Agar (Oxoid), media Nutrien Broth (Merck), media Trypticase soy Broth (BD),

glukosa 1% (Merck), etanol 96% (Merck), aquadest steril, toluen (Merck), crystal

violet (Merck).

Pengumpulan Bahan

Simplisia herba pegagan diperoleh dari Balai Besar Penelitian dan

Pengembangan Tanaman Obat dan Obat Tradisional (B2P2TOOT) Tawangmangu.

Simplisia tersebut kemudian diserbuk dan diayak menggunakan ayakan nomor

mesh 40.


4

Determinasi Tanaman

Determinasi tanaman pegagan dilakukan oleh Dyah Subositi, M.Sc yang

merupakan penanggungjawab identifikasi di Balai Besar Penelitian dan

Pengembangan Tanaman Obat dan Obat Tradisional (B2P2TOOT) Tawangmangu.

Pengukuran Kadar Air

Penetapan kadar air dilakukan dengan metode destilasi toluen. Serbuk

ditimbang dengan seksama sejumlah 10 gram, dimasukkan ke dalam labu yang

kering. Labu dihubungkan dengan tabung penerima dan pendingin, kemudian lebih

kurang 200 mL toluen p.a dimasukkan ke dalam labu. Labu dipanaskan perlahan-

lahan selama 15 menit. Setelah toluen mendidih, dilakukan penyulingan dengan

kecepatan lebih kurang 2 tetes per detik hingga sebagian besar air tersuling,

kemudian kecepatan penyulingan dinaikkan hingga 4 tetes per detik. Setelah

penyulingan, tabung penerima dibiarkan dingin hingga suhu kamar dan diusahakan

seluruh tetesan air turun. Volume air dibaca setelah toluen dan air terpisah

sempurna. Kadar air dinyatakan dalam persen.

𝐾𝑎𝑑𝑎𝑟 𝑎𝑖𝑟 = 𝑉𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒 𝑎𝑖𝑟

𝐵𝑒𝑟𝑎𝑡 𝑠𝑎𝑚𝑝𝑒𝑙 𝑥 100%

Pembuatan Ekstrak Etanol Herba Pegagan

Pembuatan ekstrak diawali dengan membuat etanol 75% dengan melarutkan

3,906 ml etanol 96% dalam labu takar 1 liter kemudian ditambahkan aquadest

sampai batas tanda. Tahapan maserasi yaitu dengan merendam 25 gram serbuk

herba pegagan dalam 250 ml etanol 75%. Maserasi dilakukan selama 48 jam dengan

bantuan shaker. Hasil maserat disaring menggunakan corong Buchner dengan

bantuan pompa kemudian diuapkan dengan rotary evaporator pada suhu 50oC

untuk menghilangkan pelarut yang mungkin masih ada dalam ekstrak (Lestari,

2015). Ekstrak yang didapat merupakan ekstrak kental dengan bobot tetap yang

telah dipersyaratkan. Selanjutnya dihitung rendemen ekstrak dengan rumus :

𝑅𝑒𝑛𝑑𝑒𝑚𝑒𝑛 = 𝐵𝑜𝑏𝑜𝑡 𝑒𝑘𝑠𝑡𝑟𝑎𝑘

𝐵𝑜𝑏𝑜𝑡 𝑠𝑖𝑚𝑝𝑙𝑖𝑠𝑖𝑎 𝑥 100%


5

Kultur Bakteri Uji

Staphylococcus aureus diinokulasikan pada media Nutrien Agar (NA)

dengan metode streak dan diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37oC. Setelah

inkubasi, ambil 2-3 ose bakteri kemudian inokulasikan ke media Nutrien Broth dan

diinkubasi selama 24 jam.

Pembuatan Larutan Uji

Ekstrak kental ditimbang sebanyak 5,12 gram kemudian dilarutkan

menggunakan aquadest steril dalam labu ukur 10 ml sehingga didapatkan larutan

stok dengan konsentrasi 512 mg/ml. Dari larutan stok diambil 625 µl kemudian

dilarutkan menggunakan aquadest dalam labu takar 10 ml sehingga menjadi larutan

dengan konsentrasi 32 mg/ml. Kemudian larutan tersebut diambil 5 ml lalu

dimasukkan ke dalam labu takar 10 ml, ditambahkan aquadest steril sampai batas

tanda sehingga didapatkan larutan dengan konsentrasi 16 mg/ml. Langkah tersebut

dilakukan berulang sampai mendapatkan larutan dengan konsentrasi terkecil yaitu

2 mg/ml.

Pembuatan Larutan Streptomycin

Serbuk streptomycin ditimbang sebanyak 0,00256 g kemudian dilarutkan

dalam 5 ml aquadest menggunakan labu takar 5 ml sehingga didapatkan larutan

streptomycin dengan konsentrasi 0,512 mg/ml yang setara dengan 512µg/ml.

Pembuatan Media Biofilm/TSB + Glukosa 1% (TSBG)

Pembuatan media TSBG diawali dengan melarutkan 2,4 gram serbuk media

TSB dalam 30 ml aquadest dengan cara dipanaskan dan dihomogenkan. Larutan

disterilisasi dengan autoclave pada suhu 121oC dan tekanan 1 atm selama 15 menit.

Setelah media dingin ditambahkan glukosa 1%.

Pembuatan Suspensi Bakteri Uji

Kultur bakteri uji disetarakan dengan MacFarland 0,5 menggunakan media TSB +

Glukosa 1%.


6

Uji Pertumbuhan Biofilm

Bakteri yang digunakan disuspensikan dalam media TSB tanpa tambahan

glukosa dan TSB + Glukosa 1%. Suspensi bakteri sebanyak 110 µL dimasukkan ke

dalam 96-well microplate. Kontrol negatif yang digunakan sebagai pembanding

merupakan media TSB tanpa suspensi bakteri. 96-well microplate ditutup dan

diinkubasi selama 48 jam pada suhu 37oC. Setelah diinkubasi, 96-well microplate

dicuci dengan aquadest steril. 96-well microplate selanjutnya diberikan pewarna

dengan cara dimasukkan 125 µL larutan kristal violet 1% dan diinkubasi selama 15

menit pada suhu ruang. Pewarna dicuci dengan aquadest steril dan dibiarkan kering

pada suhu ruang. Setelah kering, 200 µL etanol 96% ditambahkan ke dalam 96-well

microplate kemudian diinkubasi 15 menit pada suhu ruang. Kemudian 96-well

microplate diukur menggunakan microplate reader pada optical density 595nm

(Pratiwi, 2015).

Denah penggunaan 96-well plate :

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

A

B

C

D

E

F

G

H

Keterangan :

= media TSB + bakteri = media TSB (K. negatif)

= media TSB + glukosa 1% + bakteri

Uji Aktivitas Penghambatan Pembentukan Biofilm

Sebanyak 110 µl suspensi bakteri uji dan 90 µl ekstrak etanol herba pegagan

dimasukkan ke dalam 96-well microplate. Pada 96-well microplate juga terdapat


7

kontrol pelarut berisi 110 µl suspensi bakteri uji dan 90 µl aquadest steril, kontrol

positif berisi 110 µl suspensi bakteri uji dan 90 µl streptomycin, kontrol

pertumbuhan berisi media 110 µl suspensi bakteri uji, dan kontrol media. Kemudian

diinkubasi pada suhu 37oC selama 48 jam. Setelah diinkubasi, 96-well microplate

dicuci dengan aquadest steril. Kemudian dilakukan pewarnaan dengan

menggunakan 125 µL larutan crystal violet 1% dan diinkubasi selama 15 menit

pada suhu ruang. Pewarna dicuci dengan aquadest steril dan dibiarkan kering pada

suhu ruang. Setelah kering, 200 µL etanol 96% ditambahkan ke dalam 96-well

microplate kemudian diinkubasi 15 menit pada suhu ruang. Kemudian 96-well

microplate diukur menggunakan microplate reader pada optical density 595nm

(Pratiwi, 2015). Kemudian dihitung % penghambatan dari masing-masing

konsentrasi larutan uji dengan rumus :

% penghambatan = 𝑂𝐷 𝑘𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙 𝑝𝑒𝑟𝑡𝑢𝑚𝑏𝑢ℎ𝑎𝑛−𝑂𝐷 𝑝𝑒𝑟𝑙𝑎𝑘𝑢𝑎𝑛

𝑂𝐷 𝐾𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙 𝑝𝑒𝑟𝑡𝑢𝑚𝑏𝑢ℎ𝑎𝑛 x 100%

(Pratiwi, 2015)

Denah penggunaan 96-well plate :

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

A

B

C

D

E

F

G

H

Keterangan :

= kontrol media = aquadest steril = EEP 8 mg/ml

= streptomycin = EEP 2 mg/ml = EEP 16 mg/ml

= kontrol pertumbuhan = EEP 4 mg/ml = EEP 32 mg/ml


8

Uji Kualitatif Fitokimia

Pada penelitian ini dilakukan skrining fitokimia menggunakan uji tabung yang

bertujuan untuk mengetahui kandungan senyawa kimia yang terkandung pada

ekstrak etanol pegagan. Metode uji tabung yang dilakukan pada penelitian ini

mengacu pada metode yang digunakan oleh Tiwari et al. pada 2011.

a. Alkaloid

Ekstrak dilarutkan dalam asam hidroklorida encer kemudian disaring.

Kemudian filtrat ditambahkan reagen dragendroff. Terbentuknya endapan

berwarna merah menunjukkan adanya alkaloid.

b. Saponin

0,5 gram ekstrak digojok dengan 2 ml aquadest. Busa yang terbentuk dan

bertahan selama 10 menit menunjukkan adanya saponin.

c. Fenol

Ekstrak dilarutkan dalam aquadest kemudian diberikan 3-4 tetes larutan FeCl3.

Terbentuk warna biru kehitaman menunjukkan adanya fenol.

d. Tanin

Ekstrak sebanyak 1 gram ditambahkan 10 ml aquadest kemudian dididihkan.

Setelah dingin filtrat ditambahkan 5 ml FeCl3 1 % (b/v). Apabila terjadi

perubahan warna menjadi biru tua menunjukkan adanya tanin.

e. Flavonoid

Ekstrak dilarutkan dalam aquadest kemudian diberikan lead acetate (Timbal

(II) asetat). Terbentuk endapan berwarna kuning menunjukkan adanya

flavonoid.

f. Terpenoid

0,5 mg (0,0005 gram) ekstrak ditambahkan 2 ml kloroform kemudian

ditambahkan asam sulfat pekat untuk membentuk lapisan. Terbentuk warna

coklat kemerahan antarmuka menunjukkan adanya terpenoid.

Analisis data

Untuk menentukan normalitas distribusi data menggunakan Shapiro-Wilk.

Jika p-value > 0,05 maka data terdistribusi normal dan jika p-value < 0,05 maka


9

data tidak terdistribusi normal. Untuk menentukan homogenitas data menggunakan

Levene’s Test. Untuk data yang terdistribusi normal dan homogen dilanjutkan

menggunakan uji one way ANOVA dengan tingkat kepercayaan 95%. Jika tidak

terdistribusi normal atau tidak homogen, data diuji menggunakan uji Kruskall

Wallis. Nilai p-value < 0,05 menunjukkan adanya perbedaan signifikan antar

konsentrasi. Apabila ditemukan perbedaan, maka dilanjutkan Post-Hoc Tukey pada

taraf kepercayaan 95%.

HASIL DAN PEMBAHASAN

Determinasi, Uji Kadar Air, dan Ekstraksi Herba Pegagan

Determinasi sampel simplisia tanaman herba pegagan yang dilakukan di

Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Tanaman Obat dan Obat Tradisional

(B2P2TOOT) Tawangmangu menunjukkan bahwa tanaman yang digunakan sudah

benar yaitu C. asiatica yang dikenal dengan nama pegagan. Kebenarannya

dibuktikan dengan surat keterangan dari lembaga terkait (Lampiran 1). Simplisia

disortasi kering kemudian dilakukan penyerbukan dan pengayakan. Serbuk yang

didapatkan sebanyak 2,9 kg. Selanjutnya dilakukan penetapan kadar air

menggunakan metode destilasi toluen, dari 10,6625 gram serbuk pegagan

didapatkan volume air sebanyak 0,8 ml sehingga kadar air dari serbuk simplisia

herba pegagan sebesar 7,5%. Kadar air memenuhi standar yaitu dibawah 10%

(Depkes RI, 1995).

Pada penelitian ini pembuatan ekstrak dilakukan dengan cara maserasi.

Maserasi merupakan cara ekstraksi dingin, cara ini dipilih bertujuan untuk

mempertahankan senyawa yang ingin disari yaitu senyawa fenolik yang tidak tahan

pada suhu tinggi (Dewi, 2008). Jumlah sampel yang diekstrak sebanyak 25,263

gram dalam 250 ml etanol 75% selama 48 jam. Kemudian hasil maserasi disaring

menggunakan corong Buchner dengan bantuan pompa vakum. Larutan hasil

maserasi kemudian dievaporasi pada suhu 50oC selanjutnya didapatkan ekstrak

kental dan diukur bobot tetap menggunakan oven dengan cara 2 kali penimbangan

secara berturut-turut tidak lebih dari 0,5 mg. Ekstrak kental yang didapatkan

sebanyak 5,5445 gram sehingga rendemen yang didapatkan sebesar 21,95%.


10

Rendemen yang didapatkan memenuhi standar yang ditetapkan dalam Farmakope

Herbal Indonesia bahwa rendemen ekstrak etanol herba pegagan tidak kurang dari

7,5%. Pada pembahasan selanjutnya ekstrak etanol pegagan akan disebut EEP.

Uji Pertumbuhan Biofilm

Penelitian ini diawali dengan melakukan uji pertumbuhan biofilm terhadap S.

aureus. Uji pertumbuhan biofilm dilakukan dengan membandingkan optical

density dari kelompok kontrol negatif (hanya media TSB) dengan pertumbuhan

biofilm dalam media TSB tanpa tambahan glukosa dan media TSB + glukosa 1%

(Gambar 1).

Gambar 1. Pembentukan biofilm pada Staphylococcus aureus. Pengukuran optical density

pada panjang gelombang 595 nm.

0,091 ± 0,004

1,155 ± 0,049

2,509 ± 0,11

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

Media TSB Media TSB tanpa

Glukosa + bakteri

Media TSB + Glukosa

1% + bakteri

Op

tica

l D

esnit

y


11

Gambar 2. Uji Pertumbuhan Biofilm pada 96 well plates setelah pencucian dan

pewarnaan menggunakan CV 1%

Keterangan :

A1-A3, B1-B3 = Media TSB tanpa glukosa + bakteri,

A5-A7, B5-B7 = Media TSB + Glukosa 1%,

C1-C3, C5-C7 = Media TSB

Singh (2017) mengklasifikasikan pembentukan biofilm berdasarkan nilai

ODcut menjadi 4 kelompok yaitu :

Klasifikasi Nilai OD

Non-Biofilm-Former (NBF), ODsampel ≤ ODcut

Weak Biofilm-Former (WBF), ODcut < ODsampel ≤ 2 × ODcut

Moderate Biofilm-Former (MBF), 2 × ODcut < ODsampel ≤ 4 × ODcut

Strong Biofilm-Former (SBF). ODsampel ˃4 × ODcut

Nilai ODcut adalah tiga standar deviasi di atas rata-rata optical density kontrol

negatif (ODc) (Shivani, 2014) sehingga untuk mendapatkan nilai ODcut dihitung

dengan rumus :

Pada penelitian ini yang menjadi kontrol negatif adalah pembentukan

biofilm pada media TSB tanpa suspensi bakteri. Berdasarkan rumus di atas nilai

ODcut pada penelitian sebesar 0,103. Kemudian nilai ODcut dibandingkan dengan

𝑂𝐷𝑐𝑢𝑡 = 𝑂𝐷𝑐 + ( 3𝑥𝑂𝐷𝑐)


12

nilai OD sampel. Nilai OD sampel pada masing – masing kelompok perlakuan

adalah >4xODcut. Sehingga pembentukan biofilm S. aureus pada media TSB

dengan atau tanpa tambahan glukosa termasuk dalam strong biofilm-former (SBF).

Penambahan glukosa pada media TSB meningkatkan regulasi dari ekspresi

gen dari locus icaABCD. Ekspresi gen tersebut adalah sintesis polysaccharide

intracellular adhesion (PIA). PIA merupakan salah satu komponen dalam biofilm

berperan pada fase maturasi biofilm yaitu penempelan antarsel bakteri planktonik.

Sehingga dengan terjadi peningkatan regulasi dari gen icaABCD maka produksi

PIA akan meningkat dengan demikian proses penempelan antar sel bakteri

planktonik juga akan meningkat dan biofilm yang terbentuk akan semakin tebal

(Ferreira, 2010).

Pada media TSB tanpa tambahan gula dapat membentuk biofilm karena

media TSB sudah mengandung glukosa sebesar 0,25% (Stepanovic, 2007). Namun,

pada penelitian digunakan media TSB dengan penambahan glukosa 1% karena

pada konsentrasi glukosa tersebut terbentuk biofilm yang lebih tinggi daripada

media TSB tanpa tambahan glukosa. Selain itu pada penelitian sebelumnya yang

dilakukan oleh Knobloch et al. (2002) merekomendasikan penggunaan media TSB

dengan tambahan glukosa 1% untuk mendeteksi pembentukan biofilm pada S.

aureus. Penambahan glukosa 1% pada media TSB juga sering digunakan dalam

antibiofilm assay. Shahwany et al (2013) menggunakan penambahan glukosa 1%

untuk menginduksi pertumbuhan biofilm pada S. aureus dan Klebsiella pneumonia.

Shrestha et al (2016) dan Bai et al (2019) juga menggunakan tambahan glukosa 1%

pada media TSB untuk menginduksi pembentukan biofilm pada S. aureus.

Pada penelitian ini menggunakan crystal violet pada proses pengecatan

biofilm untuk mengevaluasi aktivitas dari EEP. Crystal violet merupakan salah satu

metode yang umum digunakan dalam pengujian biofilm. Parameter yang menjadi

tolak ukur dari pengukurannya adalah biomassa dari biofilm (Skogman, 2012).

Pengecatan menggunakan crystal violet akan mewarnai sel yang hidup dan sel yang

mati serta komponen yang menjadi penyusun dari matriks biofilm sehingga cocok

untuk mengukur total biomassa biofilm (Azeredo, 2016). Crystal violet merupakan

pewarna protein yang umum yang mampu berikatan dan mewarnai permukaan


13

dengan molekul yang bermuatan negatif seperti matriks eksopolisakarida yang

menjadi penyusun dari matrik biofilm (Petrachi, 2017). Penelitian yang dilakukan

oleh Novoa (2018) dan Kodali (2013) menggunakan crystal violet 1% untuk

mengevaluasi efek antibiofilm dari ekstrak tanaman.

Pada pengujian ini dilakukan proses pencucian yaitu sebelum dan sesudah

pengecatan menggunakan crystal violet. Pencucian dilakukan menggunakan

aquadest steril dan dilakukan berulang sebanyak tiga kali. Pencucian sebelum

pengecatan bertujuan untuk menghilangkan planktonik dan sel-sel yang tidak

menempel pada permukaan well-plate sedangkan pencucian sesudah pewarnaan

bertujuan untuk menghilangkan sel yang terwarnai oleh crystal violet tetapi tidak

menempel pada permukaan well-plate (Azeredo, 2016). Menurut Berlanga et al

(2014) salah satu faktor yang mempengaruhi proses penempelan atau adhesion

pada permukaan well-plate yang terbuat dari polystyrene adalah hidrofobisitas dari

suatu molekul. Hidrofobisitas yang tinggi akan meningkatkan kemampuan suatu

molekul untuk menempel pada permukaan polystyrene. Mirani et al (2018)

mengatakan bahwa sel planktonik S. aureus memiliki hidrofobisitas lebih rendah

dibandingkan dengan biofilm. Sehingga kemampuan menempel pada permukaan

polystyrene lebih rendah dan lebih mudah lepas/deattachment salah satunya melalui

proses pencucian/pembilasan. Dengan demikian sel planktonik tidak mengganggu

proses pengukuran optical density. Menurut Skogman (2012) pengukuran

dilakukan pada panjang gelombang 595nm sesuai dengan panjang gelombang

serapan crystal violet yang digunakan sebagai zat pewarna.

Uji Aktivitas Penghambatan Pembentukan Biofilm

Selanjutnya dilakukan pengujian aktivitas antibiofilm dari ekstrak etanol

herba pegagan. Pada penelitian ini uji aktivitas antibiofilm yang dilihat adalah

penghambatan pembentukan biofilm menggunakan konsentrasi di bawah MIC50.

Hal ini bertujuan agar konsentrasi tersebut tidak bersifat toksik sehingga bakteri

masih mengalami pertumbuhan sehingga dapat membentuk biofilm (Pratiwi, 2015).

Penelitian terkait dengan MIC ekstrak etanol 50% pegagan terhadap S. aureus telah

dilakukan oleh Udoh et al pada tahun 2012 menggunakan metode tube dilution


14

(macrodilution). Hasilnya menunjukkan bahwa ekstrak etanol pegagan memiliki

nilai MIC 62,5 mg/ml. Schwarz et al. (2010) menyatakan bahwa MIC memiliki

rentang nilai/sebaran MIC mulai dari nilai terendah dan akan bertingkat sampai

nilai tertinggi. MIC50 merupakan median dari rentang nilai MIC sehingga nilai

MIC50 akan lebih besar dari MIC. Berdasarkan data tersebut maka pada penelitian

kali ini menggunakan 5 konsentrasi larutan ekstrak etanol herba pegagan di bawah

nilai MIC yaitu 2 mg/ml, 4 mg/ml, 8 mg/ml, 16 mg/ml, dan 32 mg/ml.

Selain itu pada pengujian juga digunakan kontrol positif yaitu antibiotik

streptomycin dengan konsentrasi 512 µg/ml. Menurut Ahn et al (2018) penggunaan

streptomycin secara tunggal mampu menghambat pembentukkan biofilm dan

penelitian Hess et al tahun 2014 menunjukkan bahwa penambahan streptomycin

pada penggunaan glycerol monolaurate dalam pengujian antibiofilm menunjukkan

efek yang sinergis dalam menghambat pembentukan biofilm. Konsentrasi

streptomycin yang digunakan sebagai kontrol positif sebesar 512µg/ml. Udo (2003)

mengatakan bahwa streptomycin memiliki MIC >1024 µg/ml terhadap S. aureus.

Antibiotik ini juga digunakan oleh Pratiwi (2015) dengan konsentrasi 512 µg/ml

sebagai kontrol positif pada penelitian efek minyak kayu manis dan mayosi

terhadap pertumbuhan planktonik dan pembentukan biofilm pada bakteri S. aureus

dan Pseudomonas aeruginosa, hasilnya menunjukkan bahwa streptomycin mampu

menghambat pembentukan biofilm. Aquadest steril digunakan sebagai kontrol

pelarut karena aquadest steril merupakan pelarut ekstrak.

Setelah suspensi bakteri uji dan sampel diinkubasi selama 48 jam kemudian

dicuci menggunakan aquadest steril dan dilakukan pengecatan menggunakan

crystal violet 1%, kemudian dilakukan pengukuran optical density. Nilai OD yang

didapatkan menggambarkan ketebalan dari biofilm yang terbentuk. Crystal violet

yang digunakan pada proses pengecatan biofilm akan terikat pada matrik biofilm

(O’Toole, 2011). Gambar 3 merupakan hasil pengecatan menggunakan crystal

violet 1%, terdapat perbedaan intensitas warna biru. Semakin pekat warna biru

berarti semakin banyak crystal violet yang terikat pada matriks biofilm dan jika

diukur akan menghasilkan nilai OD yang tinggi. Semakin tinggi nilai OD

menggambarkan bahwa biofilm yang terbentuk semakin tebal.


15

Gambar 3. Uji Penghambatan Pembentukan Biofilm pada 96 well plates setelah

pewarnaan CV 1%.

Keterangan :

A1, B1, C1 = Media TSBG1%

A2, B2, C2 = Streptomycin

A3, B3, C3 = Media TSBG1% + bakteri

A4, B4, C4 = Media TSBG1% + bakteri + aquadest steril

A5, B5. C5 = Media TSBG1% + bakteri + EEP 2 mg/ml

A6, B6, C6 = Media TSBG1% + bakteri + EEP 4 mg/ml




Gambar 4. Pengukuran optical density masing-masing konsetrasi ekstrak etanol pegagan

pada panjang gelombang 595 nm.

2,213 ± 0,003 2,208 ± 0,018

1,170 ± 0,027

0,976 ± 0,042

0,816 ± 0,0450,713 ± 0,086 0,643 ± 0,067

0,201 ± 0,023

0

0,5

1

1,5

2

2,5

Op

tica

l D

ensi

ty

Kelompok Perlakuan


16

Dari gambar 4 diketahui bahwa nilai OD pada konsentrasi ekstrak etanol

pegagan 2, 4, 8, 16, dan 32 mg/ml secara berturut-turut adalah 1,17; 0,976; 0,816;

0,713; dan 0,643. Hasil ini menunjukkan bahwa dengan peningkatan konsentrasi

ekstrak etanol pegagan terjadi penurunan nilai OD. Nilai OD terkecil ditunjukkan

oleh streptomycin sebagai kontrol positif yaitu 0,201. Jika dibandingkan dengan

OD kontrol pertumbuhan yaitu 2,213; ekstrak etanol pegagan dan streptomycin

memiliki nilai OD yang lebih rendah. Penurunan nilai OD ini berarti ada

pengurangan intensitas warna biru yang menunjukkan bahwa ada penurunan

ketebalan matriks biofilm. Hal ini berarti bahwa ekstrak etanol pegagan mampu

menghambat pembentukan biofilm pada S. aureus.

Nilai OD yang diperoleh kemudian dianalisis secara statistika. Hasil uji

statistik menunjukkan bahwa data penghambatan pembentukkan biofilm

terdistribusi normal (p > 0,05) dan homogen (p>0,05). Oleh karena itu, analisis data

dilanjutkan dengan Annova One Way. Hasil uji Annova One Way (p=0,000)

menunjukkan bahwa terdapat perbedaan yang signifikan. Kemudian dilanjutkan

dengan uji Post Hoc Tukey. Tabel 1 menunjukan hasil uji Post Hoc Tukey.

Tabel 1. Analisis Posthoc Tukey terhadap masing – masing kelompok perlakuan.

Keterangan : K.Pertum. = Kontrol Pertumbuhan; KP = Kontrol Positif (Streptomycin 512

µg/ml); K. pel = Kontrol Pelarut (aquadest steril); EEP 2-32 = Ekstrak Etanol Pegagan

Konsentrasi 2-32 mg/ml; BB = berbeda bermakna; BTB = berbeda tidak bermakna

Kelompok K.

Pertum. KP K.Pel

EEP

32

EEP

16

EEP

8

EEP

4

EEP

2

K. Pertum. - BB BTB BB BB BB BB BB

KP BB - BB BB BB BB BB BB

K. Pel BTB BB - BB BB BB BB BB

EEP 32 BB BB BB - BTB BB BB BB

EEP 16 BB BB BB BTB - BB BB BB

EEP 8 BB BB BB BB BB - BB BB

EEP 4 BB BB BB BB BB BB - BB

EEP 2 BB BB BB BB BB BB BB -


17

Nilai OD yang diperoleh digunakan untuk menghitung persen

penghambatan pembentukan biofilm dengan membandingkan selisih OD sampel

dan OD kontrol pertumbuhan dengan OD kontrol pertumbuhan. Nilai OD dari

masing – masing kosentrasi dan persentase penghambatan pembentukan biofilm.

Gambar 5 merupakan grafik persen penghambatan dari masing – masing

konsentrasi EEP.

Gambar 5. Persen penghambatan pembentukan biofilm ekstrak etanol herba pegagan

dengan berbagai konsentrasi pada Staphylococcus aureus.

Dari hasil pengujian aktivitas penghambatan pembentukan biofilm yang

telah dilakukan, diperoleh nilai OD pada EEP 2 mg/ml adalah 1,170 ± 0,02. Analisis

statistik menunjukkan adanya perbedaan bermakna terhadap kontrol pertumbuhan

(p= 0,000). Berdasarkan hasil tersebut, EEP 2 mg/ml dapat dinyatakan memiliki

kemampuan menghambat pembentukkan biofilm dengan persen penghambatan

sebesar 47,13%. Pengujian EEP menggunakan konsentrasi 4 mg/ml mendapatkan

nilai OD 0,976 ± 0,02 menunjukkan adanya perbedaan bermakna terhadap kontrol

pertumbuhan (p= 0,000). Berdasarkan hasil tersebut, EEP 4 mg/ml dapat

dinyatakan memiliki kemampuan menghambat pembentukkan biofilm dengan

persen penghambatan sebesar 55,90%. Perbedaan yang signifikan dengan kontrol

47,13%

55,90%63,13%

67,78% 70,94%

90,92%

0,00%

10,00%

20,00%

30,00%

40,00%

50,00%

60,00%

70,00%

80,00%

90,00%

100,00%

Per

sen

(%

) H

am

ba

t

Konsentrasi Ekstrak


18

pertumbuhan juga ditunjukkan oleh EEP konsentrasi 8 mg/ml (p=0,000) dengan

nilai OD sebesar 0,816 ± 0,03. Berdasarkan hasil tersebut, EEP 8 mg/ml dapat

dinyatakan memiliki kemampuan menghambat pembentukkan biofilm dengan

persen penghambatan sebesar 63,13%. Pengujian terhadap EEP 16 mg/ml

memperoleh nilai OD 0,713 ± 0,05 menunjukkan adanya perbedaan bermakna

dengan kontrol pertumbuhan (p=0,000). Berdasarkan hasil tersebut, EEP 16 mg/ml

dapat dinyatakan memiliki kemampuan menghambat pembentukkan biofilm

dengan persen penghambatan sebesar 67,78%. Konsentrasi terakhir yang

digunakan pada pengujian adalah EEP 32 mg/ml yang memperoleh nilai OD 0,643

± 0,04. Berdasarkan hasil tersebut, EEP 32 mg/ml dapat dinyatakan memiliki

kemampuan menghambat pembentukkan biofilm dengan persen penghambatan

sebesar 70,94%.

Secara keseluruhan, kelompok perlakuan EEP memiliki aktivitas

penghambatan pembentukkan biofilm yang berbanding lurus/linier dengan adanya

kenaikan dosis. Hal tersebut didukung oleh hasil analisis statistik antar kelompok

perlakuan/antar peringkat konsentrasi EEP yag menunjukkan perbedaan bermakna

(p<0,05) pada dosis 2 mg/ml (1,170 ± 0,02), 4 mg/ml (0,976 ± 0,02), dan 8 mg/ml

(0,816 ± 0,03). Akan tetapi, uji statistik pada konsentrasi 16 mg/ml (0,713 ± 0,05)

dan 32 mg/ml (0,643 ± 0,04) menunjukkan perbedaan tidak bermakna (p>0,05).

Hasil tersebut menandakan bahwa peningkatan aktivitas penghambatan

pembentukan biofilm yang dimiliki oleh EEP 32 mg/ml belum signifikan terhadap

EEP 16 mg/ml. Ketidakbermaknaan ini disebabkan karena standar deviasi

kelompok EEP 32 mg/ml dan 16 mg/ml yang cukup besar dibandingkan dengan

kelompok uji yang lain.

Data persentase penghambatan pembentukan biofilm S. aureus pada grafik

menunjukkan bahwa penghambatan tertinggi sebesar 70,94% ditunjukkan oleh

konsentrasi 32 mg/ml dan yang terendah sebesar 47,13% ditunjukkan oleh

konsentrasi 2 mg/ml. Dari grafik tersebut juga menunjukkan bahwa peningkatan

konsentrasi ekstrak mampu meningkatkan penghambatan pembentukan biofilm.

Streptomycin merupakan antibiotik yang digunakan sebagai kontrol positif juga

mampu menghambat pembentukan biofilm dengan persentase penghambatan


19

paling tinggi dibandingkan dengan konsentrasi ekstrak yaitu 90,92%. Dengan

demikian EEP memiliki aktivitas penghambatan pembentukan biofilm yang lebih

rendah dibandingkan dengan streptomycin.

C. asiatica sudah pernah diteliti aktivitas penghambatan pembentukan

biofilm terhadap Vibrio cholera. Penelitian tersebut dilakukan oleh Jose et al pada

tahun 2012 menggunakan ekstrak metanol dengan konsentrasi 1 mg/ml dan 3

mg/ml yang menunjukkan hasil bahwa ekstrak metanol pegagan dengan konsentrasi

1 mg/ml mampu menghambat pembentukan biofilm sebesar 52% sedangkan

konsentrasi 3 mg/ml memiliki persen penghambatan 75%.

Pembentukan biofilm terdiri dari 3 tahap yaitu penempelan, maturasi, dan

pelepasan. Dari ketiga tahap ini yang menjadi perhatian dalam penghambatan

pembentukan biofilm adalah proses penempelan dan maturasi. Tahap penempelan

dipengaruhi oleh protein – protein adhesi yang berada pada permukaan bakteri

sedangkan proses maturasi dipengaruhi oleh polysaccharide intercellular adhesion

(PIA) yang diproduksi oleh gen intercellular adhesion (ica) (Otto, 2008), sehingga

untuk menghambat pembentukan biofilm dapat dilakukan dengan cara mencegah

proses penempelan dan menghambat maturasi agar tidak terbentuk agregat atau

penumpukan lapisan biofilm bakteri dengan mengganggu komponen-komponen

yang berperan dalam proses tersebut.

Miquel (2016) menyatakan senyawa bioaktif dari tanaman dapat

menunjukkan efek antibiofilm dengan mekanisme menghambat proses penempelan

(adhesi) bakteri pada permukaan solid, mengganggu regulasi quorum sensing, dan

menghambat pertumbuhan eksopolisakarida (EPS). Pernyataan serupa juga

dinyatakan oleh Jagani tahun 2009 yang mengatakan bahwa senyawa fenol mampu

menghambat pembentukan biofilm. Slobodnikova (2016) juga menyatakan bahwa

senyawa fenol mampu menekan pembentukan biofilm. Senyawa tersebut sebagai

senyawa antibiofilm dengan mekanisme menghambat proses penempelan

interseluler (adhesi).

Proses penempelan interseluler pada proses pematangan biofilm

dipengaruhi oleh polisakarida interseluler (PIA) yang merupakan polimer dari beta

1-6 linked N-acetyl glucosamine yang diproduksi melalui regulasi dari operon gen


20

icaABCD (Otto, 2008). Blanco (2005) mengatakan bahwa gen yang paling

berpengaruh dalam pembentukan biofilm adalah gen icaA dan icaD. Slobodnikova

(2016) mengatakan bahwa senyawa tanin dan flavonoid mampu menekan regulasi

dari gen icaA dan icaD sehingga proses produksi polisakarida interseluler menurun.

Dengan berkurangnya produksi PIA maka proses agregasi interseluler pada tahap

pematangan biofilm akan terganggu. Jika biofilm tidak matang maka proses

selanjutnya dalam siklus biofilm akan terganggu.

Beberapa penelitian tentang aktivitas antibiofilm C. asiatica pada bakteri

selain S. aureus menunjukkan bahwa C. asiatica mampu menghambat

pembentukan biofilm dengan mengganggu pembentukan eksopolisakarida dan

regulasi quorum-sensing. Jose (2017) menyatakan bahwa esktrak metanol C.

asiatica mampu menghambat pembentukan biofilm pada Vibrio cholera dengan

menurunkan aktivitas gen vps dan tcp yang berperan dalam pembentukan

eksopolisakarida. Vasavi (2014) menyatakan bahwa ekstrak etanol pegagan mampu

menghambat proses quorum-sensing pada bakteri Chromobacterium violaceum.

Pada penelitian ini dilakukan skrining fitokimia secara kualitatif

menggunakan uji tabung untuk mengetahui senyawa dalam EEP yang diperkirakan

berperan dalam aktivitas penghambatan pembentukan biofilm. Hasil dari uji tabung

ditunjukkan pada Tabel 2 sebagai berikut:

Tabel 2. Uji Fitokimia Ekstrak Etanol Pegagan

Senyawa Pereaksi Hasil Keterangan

Alkaloid Dragendroff + Terbentuk endapan merah

Fenol FeCl3 + Terbentuk warna biru

Tanin FeCl3 1% + Terbentuk warna biru

Saponin - + Terbentuk busa

Terpenoid Timbal(II)

asetat

+ Terbentuk warna coklat pada

antarmuka

Flavonoid H2SO4 pekat + Terbentuk endapan kuning


21

Berdasarkan hasil uji tabung di atas ekstrak etanol 75% herba pegagan

mengandung alkaloid, fenol, tanin, saponin, terpenoid, dan flavonoid. Hasil ini

sesuai dengan beberapa penelitian yang telah dilakukan. Hayati et al tahun 2013

yang menyatakan bahwa ekstrak etanol 96% pegagan mengandung tanin dan

flavonoid. Selain itu, Biradar dkk (2013) menyatakan bahwa ekstrak etanol absolut

pegagan mengandung senyawa flavonoid. Kristina dkk pada tahun 2009 juga

melakukan uji fitokimia terhadap tanaman pegagan dan menyatakan bahwa

tanaman pegagan mengandung alkaloid, saponin, tanin, fenol, flavonoid, dan

terpenoid. Penelitian fitokimia secara kuantitatif yang dilakukan Lestari (2015)

menyatakan bahwa ekstrak etanol 75% herba pegagan memiliki kandungan fenol

total paling tinggi dibandingkan pada ekstrak etanol 25%, 50%, dan 100% yaitu

sebesar 60, 958 mg/g.

Skrining fitokimia yang lebih spesifik pada ekstrak etanol pegagan juga

sudah pernah dilakukan oleh beberapa peneliti. Penelitian yang dilakukan oleh

Suresh et al pada tahun 2010 yaitu analisis kandungan senyawa pada ekstrak etanol

pegagan menggunakan Gas Chromatography menunjukkan hasil bahwa ekstrak

etanol pegagan mengandung senyawa fenol yaitu phenol-2,5-bis (1,1-

dimethylethyl) dan asarone yang merupakan golongan phenylpropane. Penelitian

lain yg dilakukan oleh Soumyanath et al. (2012) menganalisis kandungan senyawa

ekstrak etanol pegagan menggunakan HPLC menunjukkan bahwa ekstrak etanol

pegagan mengandung senyawa fenol golongan flavonoid yaitu prenylated flavone,

diacetyl flavone glycoside, diglycosyl flavonoid, dan proanthocyanidin. Senyawa

proantocyanidin juga terdapat dalam esktrak cranberry Amerika (Vaccinium

macrocarpon), senyawa proantocyanidin pada tanaman ini lebih dikenal dengan

active constituent proantocyanidin (PAC) dan telah diketahui mampu menghambat

pertumbuhan dan pembentukan biofilm dari bakteri Gram positif termasuk S.

aureus (Chung, 2014). Perlu penelitian lebih lanjut untuk mengetahui kandungan

senyawa – senyawa tersebut pada ekstrak etanol 75% herba pegagan.

Senyawa fenol yang terkandung dalam ekstrak etanol herba pegagan

diperkirakan merupakan senyawa yang berpengaruh dalam aktivitas penghambatan

pembentukan biofilm S. aureus. Namun perlu penelitian lebih lanjut untuk


22

mengetahui secara pasti senyawa yang berperan dalam aktivitas penghambatan

pembentukan biofilm pada S. aureus.

KESIMPULAN

Hasil penelitian menunjukkan bahwa ekstrak etanol 75% herba pegagan

memiliki aktivitas penghambatan pembentukan biofilm pada bakteri S. aureus.

Persen penghambatan pembentukkan biofilm pada konsentrasi 2 mg/ml, 4 mg/ml,

8 mg/ml, 16 mg/ml, dan 32 mg/ml berturut – turut adalah 47,13%, 55,90%, 63,13%,

67,78%, dan 70,94%. Berdasarkan hasil uji tabung ekstrak etanol pegagan

mengandung alkaloid, tanin, fenol, saponin, terpenoid, dan flavonoid. Senyawa

fenol yang terdapat dalam ekstrak diduga berperan dalam aktivitas penghambatan

pembentukan biofilm pada S. aureus.

SARAN

Pada penelitian ini belum dilakukan uji antibiofilm yang lain yaitu uji

aktivitas penghancuran biofilm dan identifikasi senyawa aktif secara spesifik

sehingga disarankan untuk penelitian selanjutnya dilakukan uji aktivitas

penghancuran biofilm S. aureus. Selain itu juga dilakukan uji pembentukan,

penghambatan, dan penghancuran biofilm pada S. aureus yang telah resisten serta

dilakukan uji fitokimia secara spesifik untuk mengetahui senyawa yang memiliki

aktivitas penghambatan pembentukan biofilm.


23

DAFTAR PUSTAKA

Afifurrahman, Samadin, K.H., Aziz S., 2014. Pola Kepekaan Bakteri

Staphylococcus aureus terhadap Antibiotik Vancomycin di RSUP Dr.

Mohammad Hoesin Palembang. MKS., 46 (4), 266-270.

Agfadila, T., Sandhi, P.A., Puspawati, N.N., 2017. Kemampuan Daya Hambat

Ekstrak Daun Pegagan (Centella asiatica (L.) Urban) terhadap Pertumbuhan

Escherichia coli ATCC 8739. Jurnal ITEPA, 6 (2), 21-29.

Ahn, K.B., Baik, J.E., Yun, C.H., Han, S.H., 2018. Lipoteichoic Acid Inhibits

Staphylococcus aureus Biofilm Formation. Frontier in Microbiology., 9

(327), 1-13.

Alabi, A.S., Frielinghaus, L., Kaba, H., Kosters, K., Huson, M. A. M., Kahl, B. C.,

Peters, G., Grobusch, M. P., Issifou, S., Kremsner, P. G., Schaumburg, F.,

2013. Retrospective analysis of antimicrobial resistance and bacterial

spectrum on infection in Gabon, Central Africa. BMC Infectious Diseasesi.,

13 (455), 1-6

Anjarwati, D.U. dan Dharmawan, A.B., 2010. Identifikasi Vancomycin Resistant

Staphylococcus aureus (VRSA) Pada Membran Stetoskop di Rumah Sakit

Margono Soekarjo Purwoketo. Mandala of Health., 4 (2,). 90

Azeredo, J., Azevedo, N.F., Briandet, R., Cerca, N., Coenye, T., Costa, A.R.,

Desvaux, M., Bonaventura, G.D., Hebraud, M., Jaglic, Z., Kacanovia, M.,

Knochel, S., Lourenco, A., Mergulhao, F., Meyer, R.L, Nuchas, G., Simoes,

M., Tresse, O., Sternberg, C., 2016. Critical Review on Biofilm Methods.

Critical Reviews in Microbiology., 43 (3), 313-351.

Badan Pengawas Obat dan Makanan RI, 2008. Acuan Sediaan Herbal. Volume 4,

Edisi 1, Jakarta: Badan Pengawas Obat dan Makanan, 27.

Badan Pengawas Obat dan Makanan RI, 2012. Acuan Sediaan Herbal. Volume 7,

Edisi 1, Jakarta: Badan Pengawas Obat dan Makanan, 6-8.


24

Bai, J.R., Wu, Y.P., Elena, G., Zhong, K., Ggao, H., 2019. Insight into the effect of

quinic acid on biofilm formed by Stsphylococcus aureus. The Royal Society

of Chemomistry., 9 (1), 3938-3945.

Berlanga, M., Domenech, O., Guerrero, R., 2014, Biofilm Formation on

polystyrene in detached vs planktonik cells of polyhydroxyalkanoate-

accumulating Halomonas venusta, International Microbiology, 17(4), 205-

212.

Berlanga, M., Guerrero, R., 2016. Living together in biofilm : the microbial cell

factory and its biotechnological implications, Microbial Cell Factories, 15

(165) 1-11.

Biradar, S.R., Rachetti, B.D., 2013. Extraction of Some Secondary Metabolites &

Thin Layer Chromatography From Different Parts of Centella asiatica L.

(URB). American Journal oh Life Sciences., 1(6), 243-247.

Blanco, A.R., Rocarro, A.S., Spoto, G.C., Nostro, A., Rusciano, D., 2005.

Epigallotechin Gallate Inhibits Biofilm Formation by Ocular Staphylococcal

Isolates. Antimicrobial Agents and Chemotherapy., 49 (10), 4339-4343.

Bueno, J., 2014. Antibiofilm Drug Suspectibility Testing Methods : Looking for

New Strategies against Resistance Mechanism. Journal of Microbial &

Biochemical Technology., 004, 1-9.

Ching, N.J., Aziz, Z., 2011. A Systematic Review on the Chemical Constituent of

Centella asiatica. Research Journal of Pharmaceutical, Biological and

Chemical Sciences., 2(3), 445-459.

Chung, P.Y., Toh, Y.S., 2014. Antibiofilm agents : recent breakthrough against

multi-drug resistant Staphylococcus aureus. Pathogens and Disease., 1 (1),

1-9.

Ciofu, O., Molinero, E.R., Macia, M.D., Oliver, A., 2017. Antibiotic Treatment of

Biofilm Infections. Acta Pathologica, Microbiologica et Immunologica

Scandinavica (APMIS)., 125 (1), 304-319.


25

Dewi, Y. S. K., Dominika, 2008. Aktivitas Antioksidasi Ekstrak Fenol Umbi

Sarang Semut (Hydniphytum Sp.) pada Berbagai Suhu Penyeduhan.

Agritech., 28 (2), 91-96.

Depkes RI, 1995, Materia Medika Indonesia, Jilid IV, Jakarta : Direktorat

Jenderal Pengawasan Obat dan Makanan, 50-52.

Falagas, M.E., Karageorgopoulus, D.E., Leptidis, J., Korbila, I.P., 2013. MRSA In

Africa : Filling the Global Map of Antimicrobial Resistance. PLOS ONE., 7

(8), 1-12.

Ferreira,A.A., Tette,P.A.S, Mendonça ,R.C. S, de Souza Soares,A.S, and Carvalho,

M.M., 2014. Detection of exopolysaccharide production and biofilm-related

genes in Staphylococcus spp. isolated from a poultry processing plant. Food

Science and Technology., 34 (4), 710-716.

Habib, F., Rind, R., Daruni, N., Bhutto, A.L., Buriro, R.S., Tunio, A., Aijaz, N.,

Lakho, S.A., Bugti, A.G., Shoaib, M., 2015. Morphological and Cultural

Characterization of Staphylococcus aureus Isolated from Different Animal

Species. Applied and Enviromental Microbiology., 5 (2), 15-26.

Handa, S.S., Khanuja, S.P.S., Longo, G., Rakes, D.D., 2008. Extraction

Technologies for Medicinal and Aromatic Plants. Italy: United Nations

Industrial Development Organization and the International Centre for Science

and High Technology, 22, 31.

Hayati Z., Hafdhah, N., Junaidi, 2013. The effect of ethanol extracts of pegagan

(Centella asiatica) Urban in inhibiting the growth of Staphylococcus aureus

and Klebsiella pneumonia that caused pneumonia. In : The 3rd Annual

International Conference Syiah Kuala University., (AIC Unsyiah) 2013, 67-

71.

Hess, D.J., Henry-Stanley, M., Wells, C.L., 2014. Antimicrobial Synergy of

Glycerol Monolaurate and Aminoglycosides in Staphylococcus aureus

Biofilms. Antimircobial Agents and Chemotherapy., 58 (11), 6970-6973.


26

Interagency Taxonomic Information System, 2012. Staphylococcus aureus,

https://www.itis.gov/servlet/SingleRpt/SingleRpt?search_topic=TSN&searc

h_value=369#, diunduh 18 Februari 2018.

Interagency Taxonomic Information System, 2011. Centella asiatica (L.) Urban,

https://www.itis.gov/servlet/SingleRpt/SingleRpt?search_topic=TSN&searc

h_value=369#, diunduh 6 Juni 2018.

Jagani, S., Chelikani, R., Kim, D.S., 2009. Effect of phenol and natural phenolic

compounds on biofilm formation by Pseudomonas aeruginosa. Biofouling.,

25(4), 321-324.

Jose, D., Lekshmi, N., Goel, A.K., Kumar, R.A., Thomas, S., 2017. Development

of a Novel Herbal Formulation to Inhibit Biofilm Formation in Toxigenic

Vibrio cholera. Journal of Food Protection., 80 (11), 1933-1940.

Kementerian Kehutanan Republik Indonesia (Kemenhut RI), 2010. Artikel

disampaikan pada Lokakarya Nasional Tanaman Obat Indonesia, Jakarta, 28-

30 Juli 2010.

Kementerian Kesehatan RI, 2014. Farmakope Indonesia Edisi V. Jakarta:

Direktorat Jenderal Pengawasan Obat dan Makanan Kementerian Kesehatan

RI. 33, 56.

Kinning, E., Falah, S., Nurhidayat, N., 2016. The In Vitro Antibiofilm Activity of

Water Leaf Extract of Papaya (Carica papaya L.) against Pseudomonas

aeruginosa. Current Biochemistry., 2 (3), 150-163.

Knobloch, J.K.M., Horstkotte, M.A., 2002. Evaluation of different detection

methods of biofilm formation in Staphylococcus aureus. Medicine

Microbilogy and Immunology., 191 (1), 101-106

Kodali, V.P., Karlapudi, A.P., Kotam, M., Kota, R.K., Punati, T., Byri, R.B., 2013.

Plant Extract as Antibiofilm Agents. International Journal of Pharmaceutical

Science Review and Research., 21(1), 325-328.


27

Kristina, N.N. Kusumah, E.D., Lailani, P.K., 2009. Analisis Fitokimia dan

Penampilam Polapita Protein Tanaman Pegagan (Centella asiatica) Hasil

Konservasi In Vitro. Bul. Littro., 20(1), 11-20.

Lestari, A.B.S., Fudholi, A., Nugroho, A.K., Setyowati, E.P., 2015. Pengaruh

Purifikasi n-Heksana pada Serbuk Simplisia terhadap Kadar Asiatikosida,

Penangkapan Radikal Bebas dan Kadar Fenol Total Ekstrak Etanolik Herba

Pegagan (Centella asistica (L.) Urban). Jurnal Ilmu Kefarmasian Indonesia.,

13 (1), 10-16.

Madigan, M.T., Martinko, J.M., Bender, K.S., Buckley, D.H., Stahl, D.A., 2015.

Brock biology of microorganisms. 14th ed., USA: Pearson Education, 814,

843, 868-869.

Mirani, Z.A., Fatima, A., Urooj, S., Aziz, M., Khan, M.N., Abbas, T., 2018.

Relationship of cell surface hydrophobicity with biofilm formation and

growth rate : A study on Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus,

and Escherichia coli, Iranian Journal of Basic Medical Sciences., 21 (1), 760-

769.

Miquel, S., Lagrafeuille, R., Souweine, B., Forestier, C., 2016. Antibiofilm Activity

as a Health Issue. Frontiers in Microbiology., 7 (592), 1-4.

Novoa, M.G.A., Moreno, M.I., Velaguez, O.A.S., Gomez, J.P.G., Medina, P.J.G.,

Lomeli, M.G., 2018. Biofilm Formation by Staphyococcus aureus Isolated

from Food Contact Surface in the Dairy Industry of Jalisco, Mexico. Journal

of Food Quality., 1 (1), 1-8.

Olsen, I., 2015. Biofilm Spesific antibiotic tolerance and resistance. Europe Journal

Microbiology Infextion Diseases.

Otajevwo, F.D., 2013. Urinary Tract Infection among Symptomatic Outpatiens

Visiting a Tertiary Hospital Based in Midwestern Nigeria. Canadian Global

Journal og Health Science., 5 (2), 187-199.

Otto, M., 2008. Staphylococcal Biofilms, In : Bacterial Biofilms. New York,

Springer. 208-223.


28

O'Toole, G. A., 2011. Microtiter dish biofilm formation assay. Journal of visualized

experiments: JoVE., 47 (1).

Paraje, M.G., 2011. Antimicrobial resistance in biofilms, FORMATEX, 736-744.

Pratiwi, S.U.T., Lagemdijk, E.L., Weert, S., Idroes, R., Hertiani, T., Hondel, C.V.,

2015. Effect of Cinnamum burmannii Nees ex Bl. and Massoia aromatic

Becc. Essential oil on Planctonic Growth and Biofilm formation of

Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus In Vitro. International

Journal of Applied Research in Natural Product., 8 (2). 1-13.

Petrachi, T., Resca, E., Piccino, M.S., Biagi, F., Strusi, V., Dominici, M., Veronesi,

E., 2017. An Alternative Approach to Investigate Biofilm In Medical

Devices : A Feasibility Study. International Journal of Environmental

Research and Public Health., 14 (1), 1-7

Polash, S.A., Saha, T., Hossain M. S., Sarker, S. R., 2017. Phytochemical contents,

antioxidant and antibacterial activity of the ethanolic of Centella asiatica (L.)

Urb leaf and stem. Jahangimagar University J. Biol., 6(1), 51-57.

Quave, C.L., Plano, L.R.W., Pantuso, T., Bennelt, B.C., 2008. Effect of extracts

from Italian medicinal plant on planktonik growth, biofilm formation and

adherence of methicillin-resistant Staphylococcus aureus. J.

Enthopharmacol., 118 (3), 418-428.

Rattanakom, S., Yasurin, P., 2015. Chemical Profiling of Centella asiatica under

Different Extraction Solvents and its Antibacterial Activity, Antioxidant

Activity. Oriental Journal of Chemistry., 31(4), 2453-2459.

Rosalina D., Martodihardjo, S., Listiawan, M. Y., 2010. Staphylococcus aureus

sebagai Penyebab Tersering Infeksi Sekunder pada Semua Erosi Kulit

Dermatosis Vesikobulosa. Berkala Ilmu Kesehatan Kulit dan Kelamin., 22

(2), 102-108.

Schwarz, S., Silley, P., Simjee, S., Woodford, N., Duijkeren, E., Johnson, A.P.,

Gaastra, W., 2010. Editorial : Assessing the antimicrobial suspectibility of


29

bacteria obtained from animals. Journal Antimicrobial Chemotherapy., 65

(1), 601-604.

Seidel, V., 2008, Initial and Bulk Extraction. In: Sarker, S. D., Latif, Z. and Gray,

A. I.,editors, Natural Products Isolation, 2nd Ed, United Kingdom, 33-34.

Shahwany, A. W. A., Tawfeeq, H.K., Hamed, S.E., 2016. Antibacterial and

Antibiofilm Activity of Three Phenolic Plant Extracts and Silver

Nanoparticles on Staphylococcus aureus and Klebsiella pneumonia.

Biomedicine and Biotechnologi., 4 (1), 12-18.

Shavina, S., Banerjee, G., Garg, R., Singh, M., 2014. Comparative Study of Biofilm

Formation in Pseudomonas aeruginosa Isolates from Patients of Lower

Respiratory Tract Infection. Journal of Clinic and Diagnostic Research., 8

(5), 9-11.

Shrestha, L., Kayama, S., Sasaki, M., Kato, F., Hisatsune, J., Tsuruda, K., Koizimu,

K., Tatsukawa, N., Yu, L., Takeda, K., Sugai, M., 2016. Inhibitory effect of

antibiofilm compound 1 against Staphylococcus aureus biofilm.

Microbiologi and Immunology., 60 (1), 148-159

Singh, A.K., Prakas, P., Achra, A., Singh, G.P., Das, A., Singh, R.K., 2017.

Standarization and Classification of In vitro Biofilm Formation by Clinical

Isolates of Staphylococcus aureus. Journal of Global Infectious Diseases., 9

(3), 93-101.

Singh, N., Patil, A., Ptabhune, A., Goel, G., 2016. Inhibition of quorum-sensing-

mediated biofilm formation in Cronobacter sakazakii strains. Mircobiology.,

162 (1), 1708-1714.

Skogman, M.E., 2012. A Platform for antibiofilm assays combining biofilm

viability, biomass, and matrix quantification in suspectibility assessments of

antimicrobials against staphylococcus aureus biofilm.

Slobodnikova, L., Fialova, S., Rendekova, K., Kovac, J., Mucaji, P., 2016.

Antibiofilm Activity of Plant Polyphenol. Molecules., 21, 1-15.


30

Soumyanath, A., Zhong, Y.P., Hensin, E., Wadsworth, T., Bishop, J., Gold, B.G.,

Quinn, J.F., 2012. Centella asiatica Extract Inprove Behavioral Deficits in a

Mouse Model of Alzheimer’s Disease : Invertigation of a Possible

Mechanism of Action. International Journal of Alzheimer’s Disease., 1 (1),

1-9.

Stepanovic, S., Vukonic, D., Hola, V., Bonaventur, G.D., Djukic, S., Cirkovic, I.,

Ruzicka, F., 2007. Quantification of biofilm in microtiter plates : overview of

testing conditions and pratical recommendations for assessment of biofilm

production by staphylococci. Journal Compilation APMIS., 115 (1), 891-899.

Suresh, M., Rath, P.K., Panneerselvam, A., Dhanasekaran, D., Thajuddin, N., 2010.

Anti-Mycobacterial Effect of Leaf Extract of Centella asiatica

(Mackinlayaceae). Research J. Pharm and Tech., 3 (3), 872-876.

Syaiful I. 2013. Pola Kepekaan Bakteri Staphylococcus aureus terhadap antibiotik

Vankomisin di RSMH Palembang periode oktober 2011- september 2012. FK

Unsri. 4:50

Taemchuay, D., Rukkwamsuk, T., Sakpuaram, T., Ruangwises, N., 2009.

Antibacterial Activity of Crude Extracts of Centella asiatica against

Staphylococcus aureus in Bovine Mastitis. Kasetsart Veterianrians., 19(3),

120-128.

Tambun R., Limbong, H.P., Pinem, C., Manurung, E., 2016. Pengaruh Ukuran

Partikel, Waktu, dan Suhu Pada Ekstraksi Fenol dari Lengkuas Merah. Jurnal

Teknik Kimia., 5(4), 53-56.

Tiwari, P., Kumar, B., Kaur, M., Kaur, G., Kaur, H., 2011. Phytochemical screening

and extraction : A review. International Pharmaceutical Sciencia., 1(1), 98-

106.

Udo, E.E., Al-Sweih N., Noroba, B.C., 2003. A chromosomal location of the mupA

gene in Staphylococcus aureus expressing high-level mupirocin resistance.

Journal of Antimicrobial Chemotherapy., 50 (1), 1283-1286.


31

Udoh, D.I., Asamudo, N.U., Bala, D.N., Enwongo O., 2012. Inhibitory Effect of

Varying Concentration of Leaves Extract of Centella asiatica (Gotu Kola) on

Some Microorganisms of Medical Importance. International Journal of

Chemical, Environmental and Pharmaceutical Research., 3 (2), 142-148.

Vasavi, H.S., Arun, A.B., Rekha, P.D., 2014. Anti-quorum sensing activity of

flavonoid-rich fraction from Centella asiatica L. against Pseudomonas

aeruginosa PAO 1. Journal of Microbiology, Immunology, and Infection., 1

(1), 1-8.

Wu, H., Moser, C., Wang, H.Z., Hoiby, N., Song, Z.J., 2014. Strategies for

Combating Bacterial Biofilm Infections. International Journal of Oral

Science., 1 (7), 1-7.


32

LAMPIRAN

Lampiran 1. Surat Determinasi tanaman Centella asistica (L). Urb


33

Lampiran 2. Certificate of Quality Staphylococcus sureus ATCC 25923


34

Lampiran 3. Surat Legalitas analisis data oleh Pusat Kajian Clinical Epidemiology

& Biostatistics Unit Fakultas Kedokteran Universitas Gajah Mada


35

Lampiran 4. Bahan yang digunakan

Gambar 6. Simplisia herba Pegagan

Lampiran 5. Pengukuran Kadar air Serbuk Centella asistica (L). Urban

Perhitungan Kadar air

𝐾𝑎𝑑𝑎𝑟 𝑎𝑖𝑟 = 0,8 𝑚𝑙

10,6625 𝑥 100% =7,5%

Gambar 7. Pengukuran Kadar Air menggunakan Destilasi Toluen

Lampiran 6. Hasil Ekstraksi

Perhitungan Rendemen

𝑅𝑒𝑛𝑑𝑒𝑚𝑒𝑛 = 5,5445 𝑔𝑟𝑎𝑚

25,263 𝑔𝑟𝑎𝑚 𝑥 100% =21,95%


36

Gambar 8. Ekstrak Kental Centella asiatica (L) Urban

Lampiran 7. Larutan Ekstrak Etanol Pegagan

Gambar 9. Larutan stok ekstrak etanol pegagan dan larutan ektrak etanol pegagan

dengan konsentrasi 2, 4, 8, 16, dan 32 mg/ml

Lampiran 8. Hasil Pengukuran Optical Density 595nm

No. Kelompok Optical Density 595nm

Rata-rata Standar

Deviasi Replikasi 1 Replikasi 2 Replikasi 3

1. Streptomycin

(K. Positif) 0,228 0,192 0,184 0,201

0,023

2. Aquadest steril

(K. Pelarut) 2,229 2,197 2,199 2,208

0,018

3. Kontrol

Pertumbuhan 2,214 2,210 2,216 2,213

0,003

4. EEP 2 mg/ml 1,185 1,186 1,139 1,170 0,027

5. EEP 4 mg/ml 0,939 0,967 1,022 0,976 0,042

6. EEP 8 mg/ml 0,796 0,785 0,868 0,816 0,045


37

7. EEP 16 mg/ml 0,710 0,628 0,800 0,713 0,086

8. EEP 32 mg/ml 0,632 0,582 0,715 0,643 0,067

Lampiran 9. Perhitungan Persen Penghambatan Pembentukan Biofilm

𝑝𝑒𝑟𝑠𝑒𝑛 𝑝𝑒𝑛𝑔ℎ𝑎𝑚𝑏𝑎𝑡𝑎𝑛 = 𝑂𝐷𝑝𝑒𝑟𝑡𝑢𝑚𝑏𝑢ℎ𝑎𝑛−𝑂𝐷𝑝𝑒𝑟𝑙𝑎𝑘𝑢𝑎𝑛

𝑂𝐷𝑝𝑒𝑟𝑡𝑢𝑚𝑏𝑢ℎ𝑎𝑛 𝑥 100%

OD Kontrol

Pertumbuhan

OD Kelompok Perlakuan ± SD Persen

Penghambatan

2,213

2 mg/ml 1,170 ± 0,027 47,13%

4 mg/ml 0,976 ± 0,042 55,90%

8 mg/ml 0,816 ± 0,045 63,13%

16 mg/ml 0,713 ± 0,086 67,78%

32 mg/ml 0,643 ± 0,067 70,94%

Streptomycin 0,201 ± 0,023 90,92%

Lampiran 10. Skrining Fitokimia

Gambar 10. Uji Tabung Ekstrak Etanol Pegagan


38

Gambar 11. Endapan merah yang terbentuk pada Uji Alkaloid

Lampiran 11. Uji Statistik

Tests of Normality

Kelompok

Kolmogorov-Smirnova Shapiro-Wilk

Statistic df Sig. Statistic df

Optical Density Kontrol Pertumbuhan .253 3 . .964 3

kontrol pelarut .365 3 . .797 3

kontrol Positif .321 3 . .881 3

Konsentrasi 32 mg/ml .232 3 . .980 3





Descriptives

Kelompok Statistic

Std. Error

Optical Density

Kontrol Pertumbuhan

Mean 2.21333 .001764

95% Confidence Interval for Mean

Lower Bound

2.20574

Upper Bound

2.22092

5% Trimmed Mean .

Median 2.21400

Variance .000

Std. Deviation .003055

Minimum 2.210

Maximum 2.216

Range .006

Interquartile Range .

Skewness -.935 1.225

Kurtosis . .

kontrol pelarut Mean 2.20833 .010349


39


Lower Bound

2.16380

Upper Bound

2.25286

5% Trimmed Mean .

Median 2.19900

Variance .000


Minimum 2.197

Maximum 2.229

Range .032


Skewness 1.708 1.225

Kurtosis . .

kontrol Positif Mean .20133 .013532


Lower Bound

.14311

Upper Bound

.25956

5% Trimmed Mean .

Median .19200

Variance .001


Minimum .184

Maximum .228

Range .044



Kurtosis . .

Konsentrasi 32 mg/ml

Mean .64300 .038786


Lower Bound

.47612

Upper Bound

.80988

5% Trimmed Mean .

Median .63200

Variance .005


Minimum .582

Maximum .715

Range .133


Skewness .717 1.225

Kurtosis . .


Mean .71267 .049670


Lower Bound

.49895


40

Upper Bound

.92638

5% Trimmed Mean .

Median .71000

Variance .007


Minimum .628

Maximum .800

Range .172


Skewness .139 1.225

Kurtosis . .

Konsentrasi 8 mg/ml

Mean .81633 .026028


Lower Bound

.70434

Upper Bound

.92832

5% Trimmed Mean .

Median .79600

Variance .002


Minimum .785

Maximum .868

Range .083



Kurtosis . .

Konsentrasi 4 mg/ml

Mean .97600 .024379


Lower Bound

.87111

Upper Bound

1.08089

5% Trimmed Mean .

Median .96700

Variance .002


Minimum .939

Maximum 1.022

Range .083


Skewness .916 1.225

Kurtosis . .

Konsentrasi 2 mg/ml

Mean 1.17067 .015857


Lower Bound

1.10244

Upper Bound

1.23889


41

5% Trimmed Mean .

Median 1.18500

Variance .001


Minimum 1.139

Maximum 1.188

Range .049


Skewness -1.709 1.225

Kurtosis . .

Test of Homogeneity of Variances Optical Density

Levene Statistic df1 df2 Sig.

1.944 7 16 .128

ANOVA Optical Density

Sum of Squares df Mean Square F Sig.

Between Groups 11.198 7 1.600 737.036 .000 Within Groups .035 16 .002

Total 11.233 23

Post Hoc Tests

Multiple Comparisons

Dependent Variable: Optical Density

(I) Kelompok (J) Kelompok Mean Difference

(I-J) Std. Error Sig.

95% Confidence Interval

Lower Bound

Upper Bound

Tukey HSD

Kontrol Pertumbuhan

kontrol pelarut .005000 .038039 1.000 -.12670 .13670

kontrol Positif 2.012000* .038039 .000 1.88030 2.14370


1.570333* .038039 .000 1.43864 1.70203


1.500667* .038039 .000 1.36897 1.63236

Konsentrasi 8 mg/ml

1.397000* .038039 .000 1.26530 1.52870

Konsentrasi 4 mg/ml

1.237333* .038039 .000 1.10564 1.36903

Konsentrasi 2 mg/ml

1.042667* .038039 .000 .91097 1.17436


42

kontrol pelarut Kontrol Pertumbuhan

-.005000 .038039 1.000 -.13670 .12670

kontrol Positif 2.007000* .038039 .000 1.87530 2.13870


1.565333* .038039 .000 1.43364 1.69703


1.495667* .038039 .000 1.36397 1.62736

Konsentrasi 8 mg/ml

1.392000* .038039 .000 1.26030 1.52370

Konsentrasi 4 mg/ml

1.232333* .038039 .000 1.10064 1.36403

Konsentrasi 2 mg/ml

1.037667* .038039 .000 .90597 1.16936

kontrol Positif Kontrol Pertumbuhan

-2.012000* .038039 .000 -2.14370 -1.88030

kontrol pelarut -2.007000* .038039 .000 -2.13870 -1.87530


-.441667* .038039 .000 -.57336 -.30997


-.511333* .038039 .000 -.64303 -.37964

Konsentrasi 8 mg/ml

-.615000* .038039 .000 -.74670 -.48330

Konsentrasi 4 mg/ml

-.774667* .038039 .000 -.90636 -.64297

Konsentrasi 2 mg/ml

-.969333* .038039 .000 -1.10103 -.83764


Kontrol Pertumbuhan

-1.570333* .038039 .000 -1.70203 -1.43864

kontrol pelarut -1.565333* .038039 .000 -1.69703 -1.43364

kontrol Positif .441667* .038039 .000 .30997 .57336


-.069667 .038039 .610 -.20136 .06203

Konsentrasi 8 mg/ml

-.173333* .038039 .006 -.30503 -.04164

Konsentrasi 4 mg/ml

-.333000* .038039 .000 -.46470 -.20130

Konsentrasi 2 mg/ml

-.527667* .038039 .000 -.65936 -.39597


Kontrol Pertumbuhan

-1.500667* .038039 .000 -1.63236 -1.36897

kontrol pelarut -1.495667* .038039 .000 -1.62736 -1.36397

kontrol Positif .511333* .038039 .000 .37964 .64303


.069667 .038039 .610 -.06203 .20136

Konsentrasi 8 mg/ml

-.103667 .038039 .018 -.23536 .02803

Konsentrasi 4 mg/ml

-.263333* .038039 .000 -.39503 -.13164

Konsentrasi 2 mg/ml

-.458000* .038039 .000 -.58970 -.32630

Konsentrasi 8 mg/ml

Kontrol Pertumbuhan

-1.397000* .038039 .000 -1.52870 -1.26530

kontrol pelarut -1.392000* .038039 .000 -1.52370 -1.26030

kontrol Positif .615000* .038039 .000 .48330 .74670


43


.173333* .038039 .006 .04164 .30503


.103667 .038039 .018 -.02803 .23536

Konsentrasi 4 mg/ml

-.159667* .038039 .012 -.29136 -.02797

Konsentrasi 2 mg/ml

-.354333* .038039 .000 -.48603 -.22264

Konsentrasi 4 mg/ml

Kontrol Pertumbuhan

-1.237333* .038039 .000 -1.36903 -1.10564

kontrol pelarut -1.232333* .038039 .000 -1.36403 -1.10064

kontrol Positif .774667* .038039 .000 .64297 .90636


.333000* .038039 .000 .20130 .46470


.263333* .038039 .000 .13164 .39503

Konsentrasi 8 mg/ml

.159667* .038039 .012 .02797 .29136

Konsentrasi 2 mg/ml

-.194667* .038039 .002 -.32636 -.06297

Konsentrasi 2 mg/ml

Kontrol Pertumbuhan

-1.042667* .038039 .000 -1.17436 -.91097

kontrol pelarut -1.037667* .038039 .000 -1.16936 -.90597

kontrol Positif .969333* .038039 .000 .83764 1.10103


.527667* .038039 .000 .39597 .65936


.458000* .038039 .000 .32630 .58970

Konsentrasi 8 mg/ml

.354333* .038039 .000 .22264 .48603

Konsentrasi 4 mg/ml

.194667* .038039 .002 .06297 .32636


44

BIOGRAFI PENULIS

Penulis skripsi dengan judul “Aktivitas Penghambatan

Pembentukan Biofilm Ekstrak Etanol Pegagan

(Centella Asiatica (L.) Urban Terhadap Staphylococcus

aureus” memiliki nama lengkap Felicita Eka Putri S, lahir

di Lubuklinggau, 1 Maret 1997. Penulis yang akrab

dipanggil Felis merupakan anak pertama dari 3 bersaudara

dari pasangan Yohanes Subardi dan Paulina Setyaningsih.

Penulis menempuh pendidikan di SD (2003-2009), SMP

(2009-2012) dan SMA (2012-2015) Xaverius Lubuklinggau, Sumatera Selatan.

Pada tahun 2015 melanjutkan pendidikan strata-1 di Program Studi Farmasi

Universitas Sanata Dharma Yogyakarata. Selama menempuh pendidikan sarjana,

penulis aktif mengikuti kegiatan kepanitiaan dan organisasi seperti Inisiasi Fakultas

Farmasi (TITRASI), Seminar Internasional ICPharmP, Pharmacy Performance,

Dewan Perwakilan Mahasiswa Fakultas Farmasi pada tahun 2017/2018 dan

2018/2019, dan Unit Kegiatan Fakultas Paduan Suara Veronika. Selain itu penulis

juga pernah menjadi asisten dosen praktikum Biologi Sel Molekuler, Farmakognosi

Fitokimia, dan Mikrobiologi Farmasi.


aktivitas penghambatan pembentukan biofilm ekstrak...

Documents