aktivitas inhibisi fraksi gelatin tulang ikan patin …
TRANSCRIPT
AKTIVITAS INHIBISI FRAKSI GELATIN TULANG IKAN PATIN
BERAT MOLEKUL TINGGI TERHADAP
ENZIM DIPEPTIDYL PEPTIDASE-IV
SKRIPSI
SELAWATI
15106015
PROGRAM STUDI ILMU DAN TEKNOLOGI PANGAN
FAKULTAS BIOINDUSTRI
UNIVERSITAS TRILOGI
JAKARTA
2020
ii
AKTIVITAS INHIBISI FRAKSI GELATIN TULANG IKAN PATIN
BERAT MOLEKUL TINGGI TERHADAP
ENZIM DIPEPTIDYL PEPTIDASE-IV
SKRIPSI
Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Teknologi Pangan
Pada
Program Studi Ilmu dan Teknologi Pangan
SELAWATI
15106015
PROGRAM STUDI ILMU DAN TEKNOLOGI PANGAN
FAKULTAS BIOINDUSTRI
UNIVERSITAS TRILOGI
JAKARTA
2020
iii
iv
v
vi
ABSTRAK
Selawati. Aktivitas Inhibisi Fraksi Gelatin Tulang Ikan Patin Berat Molekul Tinggi
Terhadap Enzim Dipeptidyl Peptidase-IV. Dibimbing oleh Yoni Atma, 2020.
Gelatin adalah bahan pendukung dalam industri pangan, farmasi dan kosmetika. Gelatin
digunakan sebagai pengemulsi dan penstabil. Sumber alternatif gelatin yang paling
potensial adalah yang berasal dari limbah produk pengolahan ikan terutama kulit dan
tulang. Salah satu ikan yang menghasilkan limbah tulang dalam kuantitas besar yakni ikan
patin. Gelatin dari tulang ikan dapat dihidrolisis lebih lanjut menjadi hidrolisat-hidrolisat
gelatin yang memiliki bioaktivitas tinggi. Hidrolisat gelatin diperoleh dari hasil hidrolisis
gelatin secara enzimatik dengan memanfaatkan enzim protease. Flavourzyme merupakan
enzim komersil yang banyak digunakan pada pembuatan hidrolisat gelatin ikan. Penelitian
ini bertujuan untuk menguji aktivitas antidiabetes fraksi hidrolisat gelatin tulang ikan
patin. Penelitian diawali dengan mengekstraksi gelatin tulang ikan patin yang dilanjutkan
dengan hidrolisis enzimatik menggunakan 3% enzim flavourzyme. Setelah itu, hidrolisat
dipisahkan dengan ultrafiltrasi kombinasi sentrifugasi 4000 rpm. Fraksi > 3kDa yang
diperoleh dimurnikan menggunakan kolom kromatografi yang mengandung gel filtrasi
fase diam sephadex G-25. Analisis meliputi aktivitas inhibisi terhadap enzim DPP-IV, uji
kadar protein, bobot aktivitas dan konsentrasi hambat setengah maksimal (IC50). Hasil
penelitian menunjukkan bahwa fraksi dengan berat molekul tinggi yang dimurnikan
dengan kolom gel filtrasi memiliki aktivitas penghambatan terhadap Dipeptidyl Peptidase-
IV sebesar 51,53% -67,86%. Fraksi ini memiliki kandungan protein 0,04 mg/mL–0,23
mg/mL. Dan bobot aktivitas 1170 sampai 268. IC50 dari hidrolisat gelatin tulang ikan
dengan berat molekul tinggi sekitar 0.0142 mg/mL.
Kata Kunci : Antidiabetes, Hidrolisat Gelatin Ikan, Inkretin, DPP-IV Inhibitor
vii
ABSTRACT
Selawati. Inhibitory Activity of High Molecular Weight Fractions Derived From Bone of
Pangasius Catfish Gelatin Hydrolysate Toward Dipeptidyl Peptidase-IV. Supervised by
Yoni Atma, 2020.
Gelatin is biomaterial used in food, medicine and cosmetic industries. The main faction
function of gelatin is as an emulsifier and stabilizer. The most potential alternative source
of gelatin is coming from fish processing by products especially skin and bone. Pangasius
catfish is one of fish that remain bone in large quantity during their filleting process.
Previously, gelatin from fish bones were hydrolyzed into gelatin hydrolysates which have
bioactivities. Gelatin hydrolysates obtained through of enzymatic hydrolysis by protease
action. Flavourzyme was used widely in order to produce fish gelatin hydrolysates. In this
study was measured the anti-diabetic bioactivity of fish gelatin fractions from bone of
pangasius sutchi. The research was began by extracting gelatin from bone of fish, then
followed by enzymatic hydrolysis using flavourzyme at enzyme substrate ratio of 3%. After
that, the hydrolysates separated by ultrafiltration coupled with centrifugation 4000 rpm.
The > 3kDa fraction which obtained was purified using chromatography column
contained stationary phase gel filtration (sephadex G-25). The analysis covering inhibitory
activity, protein content, value activity and the half maximal inhibitory concentration
(IC50). The result shows that high molecular weight fractions which purified by gel
filtration have inhibitory activity rage against dipeptidyl peptidase-IV around 51.53%-
67.86%. They have protein content 0.04 mg/mL–0.23 mg/mL. And value activity 1170-268.
The IC50 of high molecular weight fish bone gelatin hydrolisate was 0.0142 mg/mL.
Keywords: Antidiabetic, Fish Gelatin Hydrolyzate, Incretin, DPP-IV Inhibitors
viii
PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT atas segala karunia-Nya
sehingga karya ilmiah dengan judul “Aktivitas Inhibisi Fraksi Gelatin Tulang Ikan Patin
Berat Molekul Tinggi Terhadap Enzim Dipeptidyl Peptidase-IV” berhasil diselesaikan.
Skripsi disusun sebagai syarat untuk menyelesaikan pendidikan dan memperoleh gelar
Sarjana Teknologi Pertanian pada Program Studi Teknologi Pangan Universitas Trilogi.
Terselesaikannya skripsi ini tidak terlepas dari bantuan banyak pihak, sehingga pada
kesempatan ini dengan segala kerendahan hati dan penuh rasa hormat penulis
menghaturkan terima kasih yang sebesar-besarnya bagi semua pihak yang telah
memberikan bantuan dalam penyusunan skripsi ini hingga selesai, terimakasih kepada :
1. Bapak Yoni Atma, S.TP., M.Si selaku Dosen Pembimbing yang telah membimbing
dan memberikan arahan, waktu, tenaga dan kontribusi selama pelaksanaan
penelitian dan penyelesaian proposal skripsi ini.
2. Kedua orang tua saya tercinta Ibu Hj. Etty Mulyati dan Bapak H. Armansyah serta
kakak, yang telah banyak mendoakan penulis dan memberi dukungan baik segi
moril maupun material.
3. Sahabat (Serendipity) Dita, Stephanie, Angel, Thasya, Dian dan Intan serta team
gelatin (Dita, Yusinta, Dhea, dan Joshua) yang selalu memberikan dukungan, saran
dan mendengarkan keluh kesah selama penelitian maupun penulisan skripsi ini.
4. Kepada semua pihak yang telah membantu dalam penyelesaian skripsi ini yang
tidak dapat disebutkan satu per satu.
Penulis menyadari bahwa karya ilmiah ini masih jauh dari kata memuaskan, maka
diharapkan adanya saran untuk memperbaiki dan mengembangkannya. Akhir kata,
semoga karya ilmiah ini bermanfaat bagi semua pihak.
Jakarta, Februari 2020
penulis
ix
DAFTAR ISI
ABSTRAK vi
DAFTAR ISI ix
DAFTAR TABEL xi
DAFTAR GAMBAR xi
DAFTAR LAMPIRAN xi
PENDAHULUAN 1
Latar Belakang 1
Tujuan Penelitian 3
TINJAUAN PUSTAKA 4
Gelatin 4
Hidrolisat Gelatin 5
Ultrafiltrasi dan Kromatografi Kolom Gel Filtrasi 6
Inhibitor Dipeptidyl Peptidase-IV (DPP-IV) 7
METODOLOGI 8
Waktu dan Tempat 8
Bahan dan Alat 8
Metode Penelitian 8
Persiapan Ekstraksi Gelatin Kasar 9
Hidrolisis Enzimatik 10
Ultrafitrasi 10
Kromatografi Gel Filtrasi 10
Metode Analisis 12
Aktivitas Inhibisi DPP-IV 12
Penentuan Kadar Protein 12
Bobot Aktivitas 13
Penentuan IC50 13
Analisis Data 13
HASIL DAN PEMBAHASAN 14
Ekstraksi Gelatin 14
Hasil Ultrafiltrasi dan Fraksi Kromatografi Filtrasi Gel 15
Aktivitas Inhibisi Enzim Dipeptidyl Peptidase- IV (DPP-IV) 17
Kadar Protein 18
x
Bobot Aktivitas dan Aktivitas Penghambatan 50 persen (IC50) 19
PENUTUP 22
Kesimpulan 22
Saran 22
DAFTAR PUSTAKA 23
LAMPIRAN 27
RIWAYAT HIDUP
31
xi
DAFTAR TABEL
Tabel 1 Sifat Gelatin Berdasarkan Cara Pembuatannya 4
Tabel 2 Standar Mutu Gelatin 5
Tabel 3 Aktivitas spesifik enzim 19
DAFTAR GAMBAR
Gambar 1 Diagram alir untuk mendapatkan fraksi ultrafiltrasi 8
Gambar 2 Diagram alir kromatografi filtrasi gel 11
Gambar 3 Ekstrak gelatin dengan penambahan enzim flavourzyme 3% 14
Gambar 4 fraksi >3 kDa 15
Gambar 5 Pola protein fraksi hidrolisat gelatin berat molekul tinggi setelah
dimurnikan dengan kolom gel filtrasi
16
Gambar 6 Grafik aktivitas inhibisi 17
Gambar 7 Kadar Protein Gelatin Tulang Ikan Patin 18
Gambar 8 Bobot Aktivitas Penghambatan DPP-IV 19
DAFTAR LAMPIRAN
Lampiran 1 Tabel Kadar Protein dan Kurva Standar BSA (Bovine Serum
Albumin)
27
Lampiran 2 Kurva Standar BSA 28
Lampiran 3 Hasil Analisis Statistik Uji Protein 29
Lampiran 4 Hasil Analisis Statistik Aktivitas Inhibisi 30
PURIFIKASI FRAKSI GEL FILTRASI GELATIN
TULANG IKAN PATIN DENGAN HIGH PERFORMANCE
LIQUID CHROMATOGRAPHY (HPLC) UNTUK
IDENTIFIKASI PEPTIDA BIOAKTIF
SKRIPSI
DHEANISYA QAUSARINA AIDA
15106026
PROGRAM STUDI ILMU DAN TEKNOLOGI PANGAN
FAKULTAS BIOINDUSTRI
UNIVERSITAS TRILOGI
JAKARTA
2020
ii
PURIFIKASI FRAKSI GEL FILTRASI GELATIN
TULANG IKAN PATIN DENGAN HIGH PERFORMANCE
LIQUID CHROMATOGRAPHY (HPLC) UNTUK
IDENTIFIKASI PEPTIDA BIOAKTIF
SKRIPSI
Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Teknologi Pertanian
Pada
Program Studi Ilmu dan Teknologi Pangan
DHEANISYA QAUSARINA AIDA
15106026
PROGRAM STUDI ILMU DAN TEKNOLOGI PANGAN
FAKULTAS BIOINDUSTRI
UNIVERSITAS TRILOGI
JAKARTA
2020
iii
Judul Skripsi : Purifikasi Fraksi Gel Filtrasi Gelatin Tulang Ikan Patin
dengan High Performance Liquid Chromatogrphy (HPLC)
untuk Identifikasi Peptida Bioaktif
Nama : Dheanisya Qausarina Aida
NIM : 15106026
Penguji: Dr. M. Rizal Taufikurrahman, M.Si dan Hermawan Seftiono, S.Si., M.Si
Tanggal Lulus: 7 Februari 2020
iv
v
vi
ABSTRAK
Dheanisya Qausarina Aida. Purifikasi Fraksi Gel Filtrasi Gelatin Tulang Ikan Patin
dengan High Performance Liquid Chromatography (HPLC) untuk Identifikasi
Peptida Bioaktif. Dibimbing oleh Yoni Atma dan Apon Zaenal Mustopa, 2020.
Penelitian ini mengenai purifikasi fraksi gel filtrasi gelatin tulang ikan patin
menggunakan High Performance Liquid Chromatography (HPLC) dan uji
aktivitasnya dalam menghambat enzim dipeptidyl peptidase IV (DPP-IV).
Tujuannya ialah untuk mengetahui aktivitas penghambatan dari fraksi gel filtrasi
yang dimurnikan dengan metode High Performance Liquid Chromatography
preparatif. Penelitian terdiri atas empat tahapan yaitu (1) separasi fraksi hidrolisat
dari hasil hidrolisis 3% flavourzyme (rasio enzim:substrat [E/S]) dengan gel filtrasi,
(2) purifikasi fraksi gel filtrasi terpilih dengan HPLC, (3) uji aktivitas
penghambatan, (4) uji kadar protein dan IC50 (Inhibitory Concentration of 50%).
Hasil pemurnian dengan HPLC didapatkan dua puncak utama pada menit ke-3.1
dan 4.07. Hasil uji aktivitas penghambatan oleh ketujuh fraksi HPLC berada di
bawah 30%, fraksi HPLC 3 dan 4 sebagai puncak utama memiliki aktivitas
penghambatan lebih rendah daripada fraksi HPLC 1, 2, dan 5. Aktivitas
penghambatan tertinggi ada pada fraksi HPLC 1 sebesar 26.50%. Hasil uji kadar
protein menunjukkan antara sampel fraksi gel filtrasi dengan fraksi HPLC memiliki
perbedaan sangat nyata (p<0.05). Kadar protein tertinggi sebesar 1.57 mg/ml pada
sampel 3% F4, dan terendah sebesar 0.13 mg/ml pada sampel fraksi HPLC 1. Hasil
pengukuran aktivitas spesifik enzim menunjukkan nilai bobot tertinggi ada pada
fraksi HPLC 1 sebesar 203.85 kemudian diikuti oleh fraksi HPLC 2 sebesar 101.61,
untuk nilai bobot terendah sebesar 5.29 pada sampel 3% fraksi 1. Hasil pengukuran
IC50 pada sampel fraksi gel filtrasi diperoleh sebesar 1.03 mg/ml, dan pada sampel
fraksi HPLC sebesar 0.33 mg/ml.
Kata kunci: bradford, DPP-IV, HPLC preparatif, senyawa peptida
vii
ABSTRACT
Dheanisya Qausarina Aida. Purification of gel filtration fraction of fish bone
gelatin from Pangasius catfish using High Performance Liquid Chromatography
(HPLC) for identification a bioactive peptide. Supervised by Yoni Atma and Apon
Zaenal Mustopa, 2020.
This study aims to purify of gel filtration fraction of fish bone gelatin from
Pangasius catfish using High Performance Liquid Chromatography (HPLC), and
measured their activities against dipeptidyl peptidase IV (DPP-IV). Purification
stage was done by HPLC preparative equipment. The research conducted in four
stages including (1) hydrolysate >3 kDa (from 3% [E/S] ratio) separation through
gel filtration chromatography, (2) purification of selected gel filtration fraction, (3)
activity measurement, (4) protein content and IC50 determination. The result shown
that HPLC purification provide two main peaks at time retention of 3.1 and 4.07
minutes. All of purification fractions was below 30%, while fraction 3 and 4 (at
retention time 3.01 and 4.075) have inhibitory activity lower than fractions 1, 2,
and 5. The highest inhibitory activity from HPLC fraction was 26.50%. It is come
from fraction 1 (F1) (at retention time of 1.55 minutes). In addition the protein
content both of fraction; gel filtration and HPLC were significant different
(p<0.05). The highest protein content was from fraction 4 of HPLC which about
1.57 mg/ml, while the lower ones was from fraction 1 with concentration of 0.13
mg/ml. In addition, the activity value was also measured by dividing percent
inhibition with protein concentration. In this research, the highest activity value
was F1, F2, and the lower was F5 namely 203.85, 101.61, and 5.29 respectively.
The IC50 from gel filtration and HPLC fraction were 1.03 mg/ml and 0.33 mg/ml
respectively.
Keywords: bradford, DPP-IV, HPLC preparative, peptide compound
viii
PRAKATA
Puji syukur penulis panjatkan kepada Allah Subhanahu Wata’ala atas segala
rahmat dan karunia-Nya, sehingga dapat menyelesaikan karya ilmiah yang berjudul
“Purifikasi Fraksi Gel Filtrasi Gelatin Tulang Ikan Patin dengan High Performance
Liquid Chromatography (HPLC) untuk Identifikasi Peptida Bioaktif”. Sholawat
beserta salam penulis panjatkan untuk Rasulullah Muhammad Salallahu ‘Alaihi
Wasalam. Karya ilmiah ini disusun sebagai syarat untuk memperoleh gelar Sarjana
Teknologi Pertanian pada Program Studi Ilmu dan Teknologi Pangan, Universitas
Trilogi.
Terima kasih penulis ucapkan kepada Bapak Yoni Atma, S.TP., M.Si dan
Bapak Dr. Apon Zaenal Mustopa., M.Si selaku pembimbing atas bimbingan, waktu,
tenaga, saran, dan kontribusinya yang luar biasa terhadap penyelesaian karya ilmiah
ini. Penghargaan dan ungkapan terima kasih juga penulis sampaikan kepada kedua
orang tua, abang Eiryl, Kak Evan Prasetya selaku laboran di Program Studi Ilmu
dan Teknologi Pangan, seluruh teman dan pegawai di Laboratorium RGTDP, teman
halaqoh, teman sebimbingan (Sella, Dita, Yusi, Josua), seluruh kawan di Fakultas
Bioindustri khususnya Program Studi Ilmu dan Teknologi Pangan angkatan 2015,
Anggun, Dina, serta Khairia atas doa, kerjasama, dan dukungannya selama
penelitian.
Penulis menyadari bahwa karya ilmiah ini masih jauh dari kata memuaskan,
maka diharapkan adanya masukan serta saran untuk memperbaiki dan
mengembangkannya. Akhir kata, semoga karya ilmiah ini dapat bermanfaat bagi
yang membutuhkannya.
Jakarta, Februari 2020
Penulis
ix
DAFTAR ISI
DAFTAR ISI ix
DAFTAR TABEL x
DAFTAR GAMBAR x
DAFTAR LAMPIRAN x
PENDAHULUAN 1
Latar Belakang 1
Tujuan 2
TINJAUAN PUSTAKA 3
Gelatin Tulang Ikan 3
Fraksi Gel Filtrasi Gelatin sebagai Antidiabetes 5
Purifikasi 7
High Performance Liquid Chromatography (HPLC) 8
Pengukuran Konsentrasi Protein 9
Peptida Bioaktif 10
METODOLOGI 11
Waktu dan Tempat Pelaksanaan 11
Bahan dan Alat 11
Rancangan Percobaan dan Analisis Data 11
Metode Penelitian 12
Kromatografi Gel Filtrasi 12
Purifikasi Protein Fraksi Gel Filtrasi Gelatin Tulang Ikan Patin
menggunakan High Performance Liquid Chromatography 13
Uji Aktivitas Inhibisi terhadap DPP-IV (dipeptydil peptidase-IV) 13
Penentuan Kadar Protein dengan Metode Bradford 14
Pengukuran Aktivitas Spesifik 14
Penentuan Nilai IC50 14
HASIL DAN PEMBAHASAN 15
Purifikasi Protein 15
Uji Aktivitas Inhibisi terhadap DPP-IV (dipeptydil peptidase-IV) 18
Penentuan Kadar Protein dengan Metode Bradford 19
SIMPULAN DAN SARAN 23
Simpulan 23
Saran 23
DAFTAR PUSTAKA 24
LAMPIRAN 29
RIWAYAT HIDUP 35
x
DAFTAR TABEL
Tabel 1 Sumber Peptida Bioaktif 10
DAFTAR GAMBAR
Gambar 1 Skema Alur Penelitian 12
Gambar 2 Kromatogram dari Kolom Filtrasi Gel dengan Matriks
Sephadex G-25 15
Gambar 3 Aktivitas Penghambatan Enzim DPP-IV oleh Fraksi Gel Filtrasi 16
Gambar 4 Kromatogram dari Kolom HPLC C-18 17
Gambar 5 Ketujuh Fraksi HPLC Hasil Koleksi dengan Waktu Retensi,
Luas Area Puncak, dan Konsentrasi Protein Berbeda 18
Gambar 6 Aktivitas Penghambatan Enzim DPP-IV oleh Fraksi HPLC dan
Fase Gerak 19
Gambar 7 Kadar Protein pada Sampel Fraksi Gel Filtrasi dan Fraksi HPLC 20
Gambar 8 Aktivitas Spesifik Enzim pada Sampel Fraksi Gel Filtrasi dan
Fraksi HPLC 21
DAFTAR LAMPIRAN
Lampiran 1 Kurva Standar BSA dan Kadar Proteinnya 29
Lampiran 2 Kurva Regresi IC50 Sampel Fraksi Gel Filtrasi 30
Lampiran 3 Kurva Regresi IC50 Sampel Fraksi HPLC 31
Lampiran 4 Analisis Ragam ANOVA dan Uji Duncan 32
Lampiran 5 Dokumentasi Penelitian 34