AKTIVITAS ANTIBAKTERI EKSTRAK ETANOL KELOPAK

BUNGA ROSELLA (Hibiscus sabdariffa L.) TERHADAP

Pseudomonas aeruginosa SECARA IN VIVO MENGGUNAKAN

MODEL INFEKSI Drosophila melanogaster

IN VIVO ANTIBACTERIAL ACTIVITY OF ETHANOL EXTRACT OF

ROSELLE CALYCES (Hibiscus sabdariffa L.) AGAINST

Pseudomonas aeruginosa USING Drosophila melanogaster

AS THE INFECTION MODEL

HIKMAWATI

SEKOLAH PASCASARJANA UNIVERSITAS HASANUDDIN

MAKASSAR 2017

AKTIVITAS ANTIBAKTERI EKSTRAK ETANOL KELOPAK

BUNGA ROSELLA (Hibiscus sabdariffa L.) TERHADAP

Pseudomonas aeruginosa SECARA IN VIVO MENGGUNAKAN

MODEL INFEKSI Drosophila melanogaster

IN VIVO ANTIBACTERIAL ACTIVITY OF ETHANOL EXTRACT OF

ROSELLE CALYCES (Hibiscus sabdariffa L.) AGAINST

Pseudomonas aeruginosa USING Drosophila melanogaster

AS THE INFECTION MODEL

HIKMAWATI

P2501215006

SEKOLAH PASCASARJANA UNIVERSITAS HASANUDDIN

MAKASSAR 2017

AKTIVITAS ANTIBAKTERI EKSTRAK ETANOL KELOPAK BUNGA ROSELLA (Hibiscus sabdariffa L.) TERHADAP

Pseudomonas aeruginosa SECARA IN VIVO MENGGUNAKAN MODEL INFEKSI Drosophila melanogaster

Tesis

Sebagai Salah Satu Syarat untuk Mencapai Gelar Magister

Program Studi

Magister Farmasi – Herbal Medicine

Disusun dan diajukan oleh

HIKMAWATI

kepada

SEKOLAH PASCASARJANA UNIVERSITAS HASANUDDIN

MAKASSAR 2017

TESIS

AKTIVITAS ANTIBAKTERI EKSTRAK ETANOL KELOPAK BUNGA ROSELLA (Hibiscus sabdariffa L.) TERHADAP

Pseudomonas aeruginosa SECARA IN VIVO MENGGUNAKAN MODEL INFEKSI Drosophila melanogaster

Disusun dan diajukan oleh

HIKMAWATI

Nomor Pokok P2501215006

telah dipertahankan di depan Panitia Ujian Tesis

pada tanggal 18 Agustus 2017

dan dinyatakan telah memenuhi syarat

Menyetujui

Komisi Penasehat,

Dr. Sartini, M,Si, Apt Firzan Nainu, M.Biomed Sc.Ph.D., Apt Ketua Anggota

Ketua Program Studi Dekan Fakultas Farmasi

Magister Ilmu Farmasi, Universitas Hasanuddin

Dr. Hj. Latifah Rahman, DESS, Apt Prof. Dr. Gemini Alam, M.Si., Apt

iv

PERNYATAAN KEASLIAN TESIS

Yang bertanda tangan di bawah ini Nama : Hikmawati Nomor mahasiswa : P2501215006 Program Studi : Magister Farmasi – Herbal Medicine Menyatakan dengan sebenarnya bahwa tesis yang saya tulis ini benar-benar merupakan hasil karya saya sendiri, bukan merupakan pengambilalihan tulisan atau pemikiran orang lain. Apabila di kemudian hari terbukti atau dapat dibuktikan bahwa sebagian atau keseluruhan tesis ini hasil karya orang lain, saya bersedia menerima sanksi atas perbuatan tersebut.

Makassar, Agustus 2017 Yang Menyatakan Hikmawati

v

PRAKATA

Alhamdulillah segala puji bagi Allah SWT atas segala limpahan rahmat

dan hidayah-Nya sehingga Penulis dapat menyelesaikan tesis ini yang berjudul

“Aktivitas Antibakteri Ekstrak Etanol Kelopak Bunga Rosella (Hibiscus

sabdariffa L.) terhadap Pseudomonas aeruginosa secara In Vivo Menggunakan

Model Infeksi Drosophila melanogaster” sebagai salah satu persyaratan untuk

mencapai gelar Magister di Program Studi Ilmu Farmasi Konsentrasi Herbal

Medicine di Universitas Hasanuddin Makassar. Beriring pula shalawat beserta

salam kepada Rasulullah Muhammad SAW pemimpin dan tauladan seluruh

umat.

Dalam penyusunan tesis ini, Penulis mengalami berbagai rintangan dan

hambatan, namun berkat bantuan dari berbagai pihak sehingga tesis ini dapat

terselesaikan. Oleh karena itu, perkenankanlah Penulis mengungkapkan rasa

hormat dan terima kasih yang sebesar-besarnya kepada ayahanda dan ibunda

tercinta H. Sappara AS, Ak dan Hj. A. Najirah Isham, SE yang selalu

mendoakan, memberikan nasehat dan semangat serta membimbing Penulis

dengan tulus dan ikhlas. Semoga perjuangan dan pengorbanan mereka dalam

membesarkan dan mendidik Penulis menjadi amal ibadah di sisi Allah SWT.

Adik Ahmad Husain, SE dan Reni Retnowati, SE serta keponakan tersayang

Husnah Qorirah yang selalu memberikan senyuman, canda, tawa dan

menghibur Penulis.

vi

Penulis juga menyampaikan terima kasih yang setulusnya dan

penghargaan yang setinggi-tingginya kepada Ibu Dr. Hj. Sartini, M.Si., Apt dan

Bapak Firzan Nainu, M.Biomed.Sc., PhD., Apt. selaku komisi penasehat yang

disela-sela kesibukannya tetap dengan sabar dan tanpa kenal waktu

menuntun, mengarahkan, memberikan masukan dan memotivasi Penulis

dalam menyelesaikan tesis ini.

Pada kesempatan ini pula, Penulis menyampaikan terima kasih kepada:

1. Ibu Prof. Dr. Elly Wahyudin, DEA., Apt., Ibu Dr. Mufidah, S.Si., M.Si., Apt.

serta Bapak Prof. Dr. M. Natsir Djide, MS., Apt. selaku komisi penguji atas

saran, koreksi dan masukannya terhadap penyusunan tesis ini.

2. Bapak Prof. Dr. Gemini Alam, M.Si., Apt. selaku Dekan Fakultas Farmasi

Universitas Hasanuddin dan jajarannya.

3. Ibu Dr. Hj. Latifah Rahman, DESS., Apt. selaku Ketua Program Studi

Magister Ilmu Farmasi Universitas Hasanuddin.

4. Para dosen Fakultas Farmasi Universitas Hasanuddin yang telah

memberikan bekal ilmu bagi Penulis.

5. Bapak H. Sabirin Yahya, S.Sos selaku Bupati Sinjai yang telah memberi

kesempatan tugas belajar melalui bantuan beasiswa Badan

Pengembangan dan Pemberdayaan Sumber Daya Manusia Kesehatan

(BPPSDMK) Kementerian Kesehatan Republik Indonesia.

6. Para analis dan staf Laboratorium Biofarmaka Fakultas Farmasi,

Universitas Hasanuddin yang telah berbagi ilmu dan memberikan bantuan

pada penelitian ini.

vii

7. Seluruh teman angkatan Genome 2015 atas segala doa, bantuan serta

dukungannya selama ini. Terkhusus untuk kak Nurul dan dek Ahsan.

Terima kasih untuk waktu dan semangatnya dalam penelitian dan proses

penyusunan tesis.

8. Unhas Fly Research Group (UFRG) Fakultas Farmasi Universitas

Hasanuddin yang dibimbing oleh Bapak Firzan Nainu, M.Biomed.Sc.,

PhD., Apt. beserta rekan peneliti lainnya yaitu Tisar, Alvin, Yuni, Azan,

Mims dan Ulfah.

9. Semua pihak yang tidak sempat Penulis sebutkan namanya satu persatu

yang telah banyak membantu sehingga tesis ini dapat diselesaikan.

Semoga Allah SWT membalas kebaikan mereka dengan pahala yang

setimpal.

Penulis menyadari bahwa tesis ini masih memiliki banyak kekurangan

dan masih jauh dari kesempurnaan. Oleh karena itu, Penulis memohon maaf

bila ada kesalahan dalam penulisan tesis ini dan Penulis sangat

mengharapkan kritik dan saran yang sifatnya membangun dari semua pihak.

Semoga tesis ini dapat berkontribusi dalam pengembangan ilmu dan

bermanfaat bagi kita semua. Aamiin Yaa Rabbalalamin.

Makassar, Agustus 2017

Hikmawati

viii

ABSTRAK

HIKMAWATI. Aktivitas Antibakteri Ekstrak Etanol Kelopak Bunga Rosella

(Hibiscus sabdariffa L.) terhadap Pseudomonas aeruginosa secara In Vivo Menggunakan Model Infeksi Drosophila melanogaster (dibimbing oleh Sartini dan Firzan Nainu)

Salah satu tanaman yang telah terbukti secara in vitro bermanfaat sebagai antibakteri adalah rosella (Hibiscus sabdariffa L.). Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui aktivitas antibakteri ekstrak etanol kelopak bunga rosella secara in vivo dengan menggunakan model infeksi D. melanogaster.

Pengujian yang dilakukan berupa pengukuran kadar fenolik total, survival assay, colony forming assay, dan pengukuran level mRNA Diptericin. Pengukuran kadar fenolik total ditentukan dengan pereaksi Folin–Ciocalteu menggunakan Spetrofotometer UV-Vis pada panjang gelombang 750 nm. Survival assay dilakukan dengan cara pengamatan kelangsungan hidup D. melanogaster setelah diinfeksi P. aeruginosa. Colony forming assay dilakukan dengan cara menyiapkan filtrat dari 5 ekor D. melanogaster, setelah diinfeksi P. aeruginosa kemudian diinokulasikan pada medium CETA. Pengukuran level mRNA Diptericin ditentukan dengan cara menyiapkan RNA total dari 5 ekor D. melanogaster kemudian diamplifikasi menggunakan metode real-time Reverse Transcriptase PCR (RT-PCR) dan dianalisis.

Hasil penelitian menunjukkan bahwa kadar fenolik total ekstrak etanol kelopak bunga rosella yaitu 0,716% dengan rendemen 22,61%. Hasil survival assay dan colony forming assay menunjukkan ekstrak rosella 1,25% meningkatkan angka kelangsungan hidup dan menurunkan jumlah bakteri dalam tubuh D. melanogaster w1118 yang terinfeksi P. aeruginosa jika dibandingkan dengan kontrol negatif. Terdapat perbedaan yang signifikan pada level mRNA Diptericin kelompok kontrol negatif dan ekstrak 1,25%. Hasil survival assay dan colony forming assay terhadap D. melanogaster mutan imunologik imd1 serupa dengan D. melanogaster w1118. Hal ini menunjukkan bahwa ekstrak etanol kelopak bunga rosella memiliki aktivitas antibakteri secara in vivo menggunakan model infeksi D. melanogaster kemungkinan melalui interaksi langsung komponen ekstrak dengan bakteri. Kata kunci: antibakteri, Hibiscus sabdariffa L., Drosophila melanogaster,

Pseudomonas aeruginosa, in vivo

ix

ABSTRACT

HIKMAWATI. In Vivo Antibacterial Activity of Ethanol Extract of Roselle

Calyces (Hibiscus sabdariffa L.) against Pseudomonas aeruginosa Using Drosophila melanogaster as The Infection Model (supervised by Sartini and Firzan Nainu)

One of plants that has been proven in vitro useful as antibacterial is roselle (Hibiscus sabdariffa L.). This study was aimed to determine in vivo antibacterial activity of ethanol extract of roselle calyces using D. melanogaster as the infection model.

Assays performed in this study were analysis of total phenolic content,

survival assay, colony forming assay, and analysis of Diptericin mRNA level. Analysis of total phenolic content was determined by Folin–Ciocalteu reagent using UV-Vis spectrophotometer at wavelength 750 nm. Survival assay was carried out by observing the survival rate of D. melanogaster after P. aeruginosa infection. Colony forming assay was conducted by preparing a filtrate of five D. melanogaster after P. aeruginosa infection, then inoculated on CETA medium. Analysis of Diptericin mRNA level were determined by preparing total RNA from five D. melanogaster then amplified using real-time Reverse Transcriptase PCR (RT-PCR) method and analyzed.

The results showed that total phenolic content of ethanol extract of roselle calyces was 0.716% with the yield 22.61%. Results from survival and colony forming assays showed that the 1.25% roselle extract increased the survival rate and decreased the number of bacteria in D. melanogaster w1118 infected with P. aeruginosa when compared to negative control. A significant difference was observed in the level of Diptericin mRNA between negative control group and 1.25% extract treated group. The results of survival and colony forming assay in D. melanogaster immunologic mutants imd1 resembled those in D. melanogaster w1118. These suggest that ethanol extract of roselle calyces exert antibacterial activity in infection model of D. melanogaster which probably acted by direct interaction of extract component with bacteria. Keywords: antibacterial, Hibiscus sabdariffa L., Drosophila melanogaster,

Pseudomonas aeruginosa, in vivo

x

DAFTAR ISI

halaman

PRAKATA v

ABSTRAK viii

ABSTRACT ix

DAFTAR ISI x

DAFTAR TABEL xii

DAFTAR GAMBAR xiii

DAFTAR LAMPIRAN xiv

I. PENDAHULUAN

A. Latar Belakang Masalah 1

B. Rumusan Masalah 5

C. Tujuan Penelitian 5

D. Manfaat Penelitian 6

II. TINJAUAN PUSTAKA

A. Uraian Tumbuhan Rosella (Hibiscus sabdariffa L) 7

B. Uraian Bakteri Uji Pseudomonas aeruginosa 12

C. Uraian Hewan Uji Drosophila melanogaster 13

D. Kerangka Teori 18

E. Kerangka Konsep 19

F. Hipotesis 20

III. METODE PENELITIAN

A. Rancangan dan Lokasi Penelitian 21

xi

B. Alat dan Bahan 21

C. Metode Kerja 22

D. Pengumpulan dan Analisis Data 31

IV. HASIL PENELITIAN DAN PEMBAHASAN

A. Hasil Penelitian 32

B. Pembahasan 37

V. PENUTUP

A. Kesimpulan 43

B. Saran 43

DAFTAR PUSTAKA 44

xii

DAFTAR TABEL

nomor halaman

1. Perbandingan metode infeksi mikroba terhadap D. melanogaster 17

2. Hasil rendemen ekstrak etanol kelopak bunga rosella 32 3. Hasil pengukuran kadar fenolik total 32

4. Jumlah bakteri P. aeruginosa dalam tubuh D. melanogaster genotip w1118 5 hari setelah infeksi 34

5. Hasil pengukuran ekspresi gen Diptericin 35

6. Jumlah bakteri P. aeruginosa dalam tubuh D. melanogaster imd1 5 hari setelah infeksi 37 7. Hasil pengukuran absorbansi baku asam galat 56

xiii

DAFTAR GAMBAR

nomor halaman

1. Tanaman dan kelopak bunga rosella (Hibiscus sabdariffa L.) 7

2. Drosophila melanogaster 14

3. Grafik survival assay D. melanogaster w1118 yang diinfeksi P. aeruginosa 33

4. Grafik survival assay D. melanogaster w1118 yang tidak

diinfeksi P. aeruginosa 33

5. Grafik hasil colony forming assay pada D. melanogaster w1118 34 6. Grafik hasil pengukuran level mRNA Diptericin 35

7. Grafik survival assay D. melanogaster imd1 yang diinfeksi P. aeruginosa 36

8. Grafik survival assay D. melanogaster imd1 yang tidak

diinfeksi P. aeruginosa 36 9. Grafik hasil colony forming assay pada D. melanogaster imd1 37

10. Kurva baku asam galat 55 11. Kit isolasi RNA 61 12. Foto hasil colony forming assay pada D. melanogaster w1118

0 hari setelah infeksi 62

13. Foto hasil colony forming assay pada D. melanogaster w1118 5

hari setelah infeksi 63

14. Foto hasil colony forming assay pada D. melanogaster imd1

0 hari setelah infeksi 64

15. Foto hasil colony forming assay pada D. melanogaster imd1 5

hari setelah infeksi 65 16. Foto penyiapan simplisia dan ekstrak kelopak bunga rosella 75 17. Foto alat-alat penelitian 77

xiv

DAFTAR LAMPIRAN

nomor halaman

1. Skema kerja ekstraksi sampel 48

2. Skema kerja penyiapan model infeksi 49 3. Skema kerja survival assay 50 4. Skema kerja pengukuran kuantitas bakteri 51

5. Skema kerja pengukuran level mRNA Diptericin 52 6. Perhitungan konsentrasi ekstrak rosella dan antibiotik

tetrasiklin 53 7. Perhitungan konsentrasi kurva baku asam galat 54 8. Perhitungan kadar fenolik total 57

9. Komposisi medium 59

10. Komposisi pakan Drosophila melanogaster 60

11. Komposisi reagen SV Total RNA Isolation System 61

12. Gambar hasil colony forming assay pada Drosophila

melanogaster w1118 62 13. Gambar hasil colony forming assay pada Drosophila

melanogaster imd1 64 14. Perhitungan Colony Forming Unit (CFU) 66 15. Perhitungan level ekspresi Diptericin 71

16. Gambar penyiapan simplisia dan ekstrak kelopak bunga

rosella 75 17. Gambar alat-alat penelitian 76 18. Identifikasi tanaman 78

BAB I

PENDAHULUAN

A. Latar Belakang Masalah

Penggunaan bahan alam sebagai obat tradisional di Indonesia telah

dilakukan oleh nenek moyang kita sejak berabad-abad yang lalu. Indonesia

dengan jumlah penduduk lebih dari 200 juta jiwa, memiliki lebih kurang 30.000

spesies tumbuhan dan 940 spesies diantaranya termasuk tumbuhan

berkhasiat. Tumbuhan tersebut menghasilkan metabolit sekunder dengan

struktur molekul dan aktifitas biologi yang beraneka ragam serta memiliki

potensi yang sangat baik untuk dikembangkan menjadi obat berbagai macam

penyakit.

Salah satu tanaman di Indonesia yang dimanfaatkan sebagai bahan

obat tradisional adalah rosella (Hibiscus sabdariffa L.). Indonesia merupakan

negara produksi rosella ke-5 terbesar dengan presentasi 6,23% setelah Cina

(27,76%), India (17,91%), Sudan (9,1%) dan Uganda (8,40%) (Cid-Ortega, et

al., 2015). Rosella merupakan sumber vitamin, mineral, dan senyawa bioaktif,

seperti asam organik, fitosterol, dan polifenol. Kandungan fenol terutama terdiri

dari anthocyanin seperti delphinidin-3-glucoside, sambubioside, dan cyanidin-

3-sambubioside; flavonoid lain seperti gossypetin, hibiscetin, dan glikosida;

Asam protocatechuic, eugenol, dan sterol seperti β-sitoesterol dan ergoesterol

(Ali, et al., 2005).

2

Beberapa penelitian sebelumnya melaporkan bahwa rosella memiliki

efek sebagai antioksidan, antihipertensi, antidiare, antispasmodik, antiobesitas,

antidiabetes, antiinflamasi, antipiretik, antikolesterol, antihiperamonemia,

antiurolitiasis, antiparasit, antiprotozoa, antimutagenik, antikanker, diuretik,

hepatoprotektif, nefroprotektif, hemoprotektif, imunoprotektif, imunomodulator,

stimulan keratinosit, efek urikosurik, efek laktasi, efek sedatif/anxiolitik, efek

laksatif dan antibakteri (BPOM RI, 2010; Lim T.K., 2014).

Aktivitas rosella sebagai antibakteri secara in vitro terutama bagian

kelopak bunga telah dilakukan pula oleh beberapa peneliti sebelumnya. Liu, et

al,. (2005) melaporkan bahwa ekstrak kelopak bunga rosella dapat

menghambat pertumbuhan beberapa jenis bakteri gram positif dan gram

negatif termasuk P. aeuroginosa. Hal yang sama dilaporkan pula oleh Olaleye

(2007) bahwa ekstrak air-metanol kelopak bunga rosella pada konsentrasi 20

mg/mL terbukti dapat menghambat pertumbuhan P. aeuroginosa secara in vitro

dengan nilai hambat sebesar 10 ± 0.4 mm; Al-Hashimi (2012) melaporkan

bahwa ekstrak etanol kelopak bunga rosella pada konsentrasi 10 mg/mL

menghambat pertumbuhan P. aeuroginosa dengan nilai hambat sebesar ± 17

mm; Sirag, et al (2014) melaporkan bahwa ekstrak etanol kelopak bunga

rosella pada konsentrasi 250 mg/mL menghambat pertumbuhan P.

aeuroginosa dengan nilai hambat sebesar ± 29 mm; Effendi (2017) juga

melaporkan bahwa ekstrak etanol kelopak bunga rosella pada konsentrasi 25

mg/mL menghambat pertumbuhan P. aeuroginosa dengan nilai hambat

sebesar ± 21,05 mm (kekuatan daya antibakteri yang sangat kuat yaitu lebih

dari 20 mm menurut kriteria Davis dan Stout, 1991). Berdasarkan hasil in vitro

3

tersebut sehingga di anggap perlu untuk dilakukan pengujian aktivitas

antibakteri secara in vivo.

Pseudomonas aeuroginosa adalah bakteri gram negatif yang dapat

tumbuh dan berkembang di berbagai lingkungan dan sumber nutrisi. P.

aeruginosa merupakan patogen penting yang menyebabkan berbagai infeksi

akut dan kronis. P. aeruginosa jarang menyebabkan infeksi pada individu yang

sehat, tetapi merupakan patogen oportunistik yang menyebabkan infeksi serius

terutama pada pasien rawat inap, individu yang immunocompromised dan

pasien dengan cystic fibrosis, dan merupakan penyebab umum dari infeksi

nosokomial termasuk infeksi luka bakar, infeksi saluran kemih, bakteremia, dan

pneumonia (Sadikot, et al., 2005).

Salah satu alternatif model uji platform in vivo sebagai antibakteri yang

dapat digunakan terutama untuk mempelajari interaksi inang-patogen yaitu

lalat buah (Drosophila melanogaster). Hal ini dikarenakan: (1) D. melanogaster

dapat berkembang biak dengan cepat sehingga diperoleh hewan uji dalam

jumlah banyak dan tidak memerlukan kode etika bila digunakan dalam

penelitian; (2) tersedianya hewan mutan atau transgenik untuk penelusuran

mekanisme kerja dan eksperimen lanjutan; dan (3) memiliki susunan yang

relatif kompleks, dengan saluran pencernaan dan rongga tubuh yang berbeda

sehingga infeksi lokal atau sistemik masing-masing dapat berlangsung.

Keuntungan lain menggunakan D. melanogaster sebagai model uji adalah

ukurannya yang kecil sehingga tidak membutuhkan banyak tempat dan tidak

memerlukan biaya perawatan yang besar dan juga memiliki siklus hidup yang

singkat (60-90 hari) sehingga sangat cocok digunakan untuk pengamatan yang

4

berhubungan dengan toksisitas dan life span (usia satu hari D. melanogaster

kurang lebih sesuai dengan usia satu tahun manusia) (Pandey, et al., 2011;

Tzelepis, et al., 2013; Filloux, et al., 2014).

Belakangan ini studi microarray menunjukkan bahwa infeksi mikroba

menyebabkan perubahan luas dalam program ekspresi gen D. melanogaster.

Drosophila melanogaster tidak memiliki sistem kekebalan adaptif dan hanya

bergantung pada reaksi kekebalan tubuh alami sebagai pertahanan. Untuk

memerangi infeksi mikroba. D. melanogaster mengaktifkan beberapa respon

seluler dan humoral termasuk, misalnya, kaskade proteolitik yang

menyebabkan pembekuan darah dan melanisasi, produksi beberapa efektor

molekul seperti anti mikroba peptida (AMP) dan penyerapan mikroorganisme

oleh sel-sel darah. AMP yang dibuat dalam lemak tubuh D. melanogaster,

setara dengan fungsional hati mamalia, dan disekresi dalam hemolimf, di mana

mereka langsung membunuh mikroorganisme yang menyerang. Analisis

genetik menunjukkan bahwa gen AMP diatur oleh jalur Toll dan Imd. Jalur Toll

diaktifkan terutama oleh bakteri gram-positif dan jamur, sedangkan jalur Imd

merespon terutama untuk infeksi bakteri gram-negatif dan mengontrol ekspresi

gen antibakteri peptida (Tzou, et al., 2002a; Hoffmann, et al., 2002).

Berdasarkan uraian di atas, maka peneliti tertarik untuk melakukan

pengujian aktivitas antibakteri ekstrak etanol kelopak bunga rosella terhadap P.

aeruginosa secara in vivo menggunakan model infeksi D. melanogaster

genotip w1118 dan mutan imunologik imd1.

5

B. Rumusan Masalah

Berdasarkan latar belakang yang telah diuraikan sebelumnya, maka

rumusan masalah dalam penelitian ini adalah:

1. Apakah D. melanogaster dapat digunakan sebagai platform model uji in

vivo dari aktivitas antibakteri ekstrak etanol kelopak bunga rosella terhadap

P. aeruginosa?

2. Bagaimanakah pengujian survival assay, colony forming assay dan

pengukuran level mRNA Diptericin terhadap D. melanogaster genotip

w1118?

3. Bagaimanakah pengujian survival assay dan colony forming assay pada D.

melanogaster mutan imunologik imd1 dapat mengindikasikan mekanisme

kerja efek antibakteri ekstrak etanol kelopak bunga rosella?

C. Tujuan Penelitian

1. Mengetahui kemampuan D. melanogaster sebagai platform model uji in vivo

dari aktivitas antibakteri ekstrak etanol kelopak bunga rosella terhadap P.

aeruginosa.

2. Menganalisis mekanisme kerja efek antibakteri ekstrak etanol kelopak

bunga rosella.

6

D. Manfaat Penelitian

Manfaat penelitian ini yaitu untuk memberikan informasi mengenai

potensi penggunaan D. melanogaster sebagai platform uji in vivo kandidat obat

dari bahan alam.

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

A. Uraian Tumbuhan Rosella (Hibiscus sabdariffa L)

1. Klasifikasi

Gambar 1. Tanaman dan kelopak bunga rosella (Hibiscus sabdariffa L.) (Lim T.K., 2014)

Menurut Serial Data Ilmiah Terkini Tumbuhan Obat, Rosella

diklasifikasikan sebagai berikut: (BPOM RI, 2010)

Kerajaan : Plantae

Divisi : Magnoliophyta

Kelas : Magnoliopsida

Subkelas : Dilleniidae

Bangsa : Malvales

Suku : Malvaceae

Marga : Hibiscus

Jenis : Hibiscus sabdariffa L

8

2. Nama Lain

Arab: Bissap, Carcadé, Karkadé, Karkady; China: Mei Gui Qie, Luo

Shen Hua, Luo Shen Kui, Shan Qie Zi; India: Meśta / Meshta, Mathipuli,

Chukiar, Tengamora, Gongura, Pundi; Indonesia: Gamet Walanda (Sunda),

Kasturi Roriha (Ternate), Rosela; Inggris: Roselle; Sudan: Karkade; Uganda:

Kalabi, Musayi (Bulamogi Country), Musayi (Rutooro) (Lim T.K., 2014).

3. Deskripsi

Habitat asli tumbuhan rosella berasal dari Nigeria, namun tumbuh

berkembang di seluruh dunia, terutama daerah tropis. Rosella merupakan

herba tahunan yang berdaun lebat, tegak dan sangat bercabang, ketinggian

bisa mencapai antara 1 - 3 m dan memiliki akar tunggang. Batang kemerahan,

bulat, dan berbulu tajam. Daun berseling, berstipula, berpetiolate; panjang

tangkai daun 20 - 50 mm; panjang stipula 6 - 8 mm, filiform; berbentuk bulat

telur dan tidak berlekuk di bagian bawah, pangkal daun lonjong, pinggiran

bergerigi, dan ujung daun tajam, berwarna hijau tua sampai merah. Bunga

rosella keluar dari ketiak daun dan merupakan bunga tunggal, artinya pada

setiap tangkai hanya terdapat satu bunga, dominan berwarna kuning dan

merah, teratur. Tangkai bunga; epicalyx terdiri dari sekitar 12 daun pelindung

kemerahan, panjang 10 - 12 mm. Kelopak bunga panjangnya 15 - 30 mm (bila

terdapat buah dapat membesar sampai 40 mm), terdiri dari 5 sepal besar

berwarna kemerahan yang menyatu di dasar (kelopak bunga ini sering

dianggap bunga oleh masyarakat). Mahkota bunga panjangnya 15 - 25 mm,

benang sari 100 (beragam) berukuran pendek dan tebal, putiknya berbentuk

9

tabung berwarna kuning atau merah. Buah terbagi menjadi 5 ruang, tidak

berdaging, berbentuk kapsul bulat telur berwarna merah terang, panjang 18 -

20 mm dan lebar 15 - 18 mm. Bentuk biji menyerupai ginjal, berbulu dengan

panjang 5 mm dan lebar 4 mm. Saat masih muda biji berwarna putih dan

setelah tua berubah menjadi abu-abu (BPOM RI, 2010; Lim T.K., 2014; Cid-

Ortega, et al., 2015; Maryani, et al., 2005).

4. Kandungan Kimia

Kandungan senyawa bioaktif (terutama fenolik dan antosianin) pada

kelopak bunga rosella bervariasi sesuai dengan kultivar, metode ekstraksi,

jenis pelarut, dan ukuran partikel material. Kelopak bunga rosella kering

dilaporkan mengandung anthocyanidins, delphinidin-3-sambubioside dan

cyanidin-3-sambubioside sebagai komponen utama dan cyanidin-3-O-

rutinoside, delphinidin-3-O-glucoside dan cyanidin-3,5-diglucoside, dan asam

klorogenik sebagai komponen yang lebih kecil (Cid-Ortega, et al., 2015;

Segura-Carretero, et al., 2008).

Peng-Kong et al. (2002) melaporkan konsentrasi total antosianin dari

serbuk rosella adalah 2.520 ± 50 mg / 100 g (dinyatakan sebagai delphinidin-3-

glucoside). Mereka juga menyebutkan bahwa, menurut analisis High

Performance Liquid Chromatography (HPLC), antosianin utama di kelopak

bunga rosella adalah delphinidin-3-sambubioside (71,4%) dan cyanidin-3-

sambubioside (26,6%). Sedangkan Galicia-Flores et al. (2008) melaporkan

konsentrasi total antosianin antara 364,98 dan 606,67 mg / 100 g sampel

kering dalam ekstrak yang diperoleh dengan menggunakan metanol yang

10

diasamkan dengan 1% asam trifluoroasetat dan antara 172,58 dan 296,99 mg /

100 g kelopak bunga kering menggunakan air suling sebagai pengekstrak (Cid-

Ortega, et al., 2015).

5. Manfaat

Semua bagian tanaman rosella bermanfaat dan dapat dikonsumsi.

Bagian tanaman yang paling bernilai dan banyak digunakan adalah kelopak

bunga. Pada produk makanan, kelopak bunga rosella segar digunakan dalam

salad dan untuk membuat anggur rosela, sirup, gelatin, kavurma (makanan

tradisional Turki), minuman penyegar, puding, acar, kue, teh herbal, jeli, yogurt,

es krim, mentega, kue, saus, tart dan makanan penutup lainnya (Lim T.K.,

2014; Cid-Ortega, et al., 2015).

Aktivitas farmakologi kelopak bunga rosella dapat digunakan sebagai

antihipertensi, antiinflamasi, antiobesitas, antikolesterol, hepatoprotektif,

antidiare, antioksidan, antispasmodik, efek urikosurik, efek laktasi, efek

sedatif/anxiolitik, efek laksatif dan antibakteri (BPOM RI, 2010). Ekstrak

kelopak bunga rosella memiliki aktivitas sebagai antioksidan, antikanker,

hemoprotektif, hipolipidemik, diuretik, antipiretik, dan hipoglikemik. (Cid-Ortega,

et al., 2015). Ekstrak air dan etanol H.sabdariffa L memiliki aktivitas

antioksidan, antikanker dan antibakteri (Al-Hashimi, 2012; Sirag, 2014; Liu,

2005; Olaleye 2007).

11

6. Toksisitas

Profil toksisitas H. sabdariffa L telah banyak dilaporkan sebelumnya.

Pada salah satu uji toksisitas akut, tidak terdapat toksisitas setelah pemberian

oral dosis tinggi 15 g / kg ekstrak etanol dan air kelopak bunga H. sabdariffa

pada tikus yang diamati dalam waktu 7 hari (Reanmongkol, et al., 2007).

Penggunaan dalam jangka waktu lama pada dosis level 15 ekstrak air-

metanol kelopak bunga H. sabdariffa pada dosis 250 mg / kg dapat

menyebabkan kerusakan hati pada tikus (Akindahunsi, et al., 2003).

Uji toksisitas akut dilakukan dengan pemberian sekali dosis ekstrak

etanol kelopak rosella secara oral dalam dosis 40, 200, 1000 dan 5000 mg /

kg BB terhadap tikus SD yang diamati dalam rentang 14 hari setelah

pemberian, menunjukkan bahwa ekstrak etanol kelopak rosella ditemukan

LD50 pada 850,90 mg / kg BB, aktivitas AST, ALT, ALP tidak berbeda

signifikan pada kelompok perlakuan dengan kelompok kontrol (p<0,05) dan

histopatologi ditemukan beberapa perubahan struktur sel dan jaringan pada

organ hepar serta efek toksik yang tertunda sampai hari ke 14 juga tidak

ditemukan (Sari, et.al., 2016).

Pada uji toksisitas subkronis ditemukan bahwa nilai SGOT, SGPT,

alkaline fosfatase, bilirubin dan albumin berada dalam rentang nilai normal.

Urea dan dan kreatinin sebagai indikator fungsi ginjal juga dalam nilai normal

(BPOM RI, 2010). Uji toksisitas subkronis (12 minggu) dari ekstrak air kelopak

bunga H. sabdariffa pada dosis 1,15; 2,30; dan 4,60 g / kg dapat menginduksi

toksisitas testis pada tikus (Orisakwe, et al., 2004). Selain itu, pemberian oral

selama 90 hari pada tikus albino, ekstrak air dan alkohol kelopak bunga H.

12

sabdariffa dengan dosis 2.000 mg / kg menyebabkan kematian hewan, yang

didahului oleh penurunan berat badan disertai dengan diare (Fakeye, et al,.

2009).

Pemberian dosis tunggal ekstrak air H. sabdariffa 5.000 mg / kg berat

badan selama 14 hari tidak menghasilkan toksisitas akut. Begitu pula dengan

pemberian oral ekstrak air H. sabdariffa pada dosis 50, 100 dan 200 mg / kg

berat badan selama 270 hari tidak menyebabkan keracunan kronis pada tikus

(Sireeratawong, et al., 2013). Pemberian ekstrak etanol H. sabdariffa (200 mg

/ kg dan 300 mg / kg, secara oral) pada kelinci selama delapan minggu tidak

menunjukkan efek toksik (Ekor, et al., 2010).

B. Uraian Bakteri Uji Pseudomonas aeruginosa

1. Klasifikasi

Menurut Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology, bakteri

Pseudomonas aeruginosa diklasifikasikan sebagai berikut: (Garrity, et al.,

2005)

Kingdom : Bacteria

Filum : Proteobacteria

Kelas : Gammaproteobacteria

Bangsa : Pseudomonadales

Suku : Pseudomonadaceae

Marga : Pseudomonas

Jenis : Pseudomonas aeruginosa

13

2. Karakteristik Fisik dan Pertumbuhan Pseudomonas aeruginosa

Pseudomonas aeruginosa adalah bakteri Gram-negatif berbentuk

batang, panjang 2,5-3,0 μm dan lebar 0,5-0,8 μm, berspora (asporogenous),

dan monoflagellated. Memiliki penampilan seperti mutiara (pearlescent) dan

bau seperti anggur atau seperti tortilla. P. aeruginosa tumbuh baik pada 25oC

sampai 37oC, dan kemampuannya untuk tumbuh pada 42oC membantu

membedakannya dari spesies Pseudomonas lainnya. P. aeruginosa adalah

mikroorganisme yang memiliki kemampuan bertahan hidup di berbagai kondisi

lingkungan. P. aeruginosa tidak hanya menyebabkan penyakit pada tanaman

dan hewan, tetapi juga pada manusia, menyebabkan infeksi serius pada

pasien yang memiliki imunitas lemah (immunocompromised) dengan kanker

dan pasien yang menderita luka bakar dan cystic fibrosis (Wu, et al., 2015).

C. Uraian Hewan Uji Drosophila melanogaster

1. Klasifikasi

Menurut Kunci Determinasi Serangga, hewan uji Drosophila

melanogaster diklasifikasikan sebagai berikut: (Lilies, 2014)

Kerajaan : Animalia

Filum : Arthropoda

Kelas : Insecta

Bangsa : Diptera

Suku : Drosophilidae

Marga : Drosophila

Jenis : Drosophila melanogaster

14

2. Deskripsi

Drosophila melanogaster termasuk dalam kelas serangga yang memiliki

tiga bagian utama tubuh yaitu kepala, dada (thorax), dan perut (abdomen).

Bagian dada terbagi atas tiga segmen yaitu prothorax (anterior), mesothorax

(tengah) dan metathorax (posterior) (Gompel, et al., 2013).

D. melanogaster merupakan spesies dimorfik seksual, dimana jantan

dan betina dapat dengan mudah dibedakan atas dasar beberapa perbedaan

morfologi. Betina umumnya lebih besar dibandingkan jantan (tapi ini mungkin

bervariasi sesuai dengan usia, kondisi kultur, dan latar belakang genetik). Pada

jantan, segmen posterior abdomen sepenuhnya gelap dan mengkilat;

sedangkan pada betina, pewarnaan segmen ini bervariasi dari pucat ke hampir

seluruhnya gelap. Kedua jenis kelamin memiliki pola garis-garis melintang

gelap di sisi dorsal dari setiap segmen abdomen. Selain itu, betina memiliki

abdomen dengan ujung runcing sedangkan perut laki-laki bulat dan cenderung

meringkuk ke dalam (Gompel, et al., 2013).

Gambar 2. Drosophila melanogaster (Gompel, et al., 2013)

15

3. Pakan

Kondisi D. melanogaster sangat tergantung pada pakan, lebih dari pada

lingkungan. Survei terbatas mengenai laboratorium D. melanogaster di dunia

mengungkapkan bahwa kemungkinan tidak ada dua laboratorium yang

memproduksi persis makanan lalat yang sama. Hal ini dapat menyebabkan

masalah ketika aspek terkait pertumbuhan berada di bawah penyelidikan. Oleh

karena itu, bukan mengandalkan temuan yang dipublikasikan, tetapi harus

selalu melakukan kontrol terhadap kondisi gizi dan lingkungan yang sama

(Dahmann, 2008).

Sebagian besar resep makanan lalat didasarkan pada bahan-bahan

yang mirip yaitu air, agar, gula, tepung jagung, ragi, dan fungisida. Perbedaan

utama adalah sumber karbohidrat. Laboratorium di Amerika Serikat cenderung

menggunakan molase (produk sampingan dari pengolahan tebu atau gula bit),

sedangkan di Eropa dan Asia tampaknya lebih memilih glukosa atau dekstrosa.

Pada prinsipnya, makanan lalat dapat disiapkan dalam panci masak

sederhana. Namun, untuk mempersiapkan jumlah besar diperlukan ketel

pengaduk (volume sampai 100 L) dan pompa peristaltik (Dahmann, 2008).

4. Metode Infeksi Mikroba Terhadap Drosophila melanogaster

Pemilihan metode infeksi yang akan digunakan harus tergantung pada

hasil yang diinginkan (Apidianakis, et al., 2009).

a. Needle pricking pada bagian thorax atau abdomen; penusukan jarum

melibatkan penggunaan jarum tungsten yang dicelupkan ke dalam suspensi

bakteri, untuk menimbulkan luka di epitel kutikula thorax lalat dan otot

16

bagian dasar atau epitel perut. Metode ini memasukkan bakteri secara lokal

di lokasi luka; bakteri berkembang biak kemudian menyebarkan ke seluruh

tubuh lalat selama beberapa waktu tertentu. Metode ini menciptakan infeksi

luka dan memungkinkan untuk penilaian efek lokal dan sistemik.

b. Injector pumping; menghasilkan inokulasi terutama sistemik, karena bakteri

disuntikkan langsung dalam hemolymph Drosophila. Metode ini

memungkinkan untuk penilaian dampak secara sistemik, karena bakteri

segera didistribusikan ke seluruh tubuh lalat, sedangkan diameter kecil

pada ujung kapiler hanya menimbulkan luka minimal. Selain itu, metode

injector pumping memungkinkan inokulasi menggunakan dosis yang tepat

dari bakteri dan virus.

c. Feeding assay; metode infeksi ini dilakukan dengan cara memberikan

makanan pada lalat secara terus menerus dengan menggunakan media

yang mengandung bakteri dengan populasi tertentu. Metode ini menyerupai

infeksi pada usus yaitu memasukkan berbagai mikroba ke dalam usus lalat.

17

Tabel 1. Perbandingan metode infeksi mikroba terhadap D. melanogaster (Apidianakis, et al., 2009)

Metode

Tempat infeksi primer

Kehadiran bakteri / infeksi

Reproduktifitas

Pro dan Kontra

Kinetika bakteri

Needle pricking

Tempat luka

(lokal)

Tempat luka dan infeksi aliran darah

Baik Lancar, memungkinkan penilaian dari efek lokal dan sistemik, dan penyebaran potensi bakteri; cocok untuk skala besar

Eksponensial

Injector pumping

Sistemik Infeksi aliran darah

Sangat Baik Dikontrol beban inokulum; kurang cocok untuk skala besar

Eksponensial

Feeding assay

Intestinal (lokal)

Kolonisasi di usus / infeksi

Cukup Baik Manipulasi cairan makanan, cocok untuk skala besar; pemberian makanan konstan pada konsentrasi bakteri

Konstan 104-105 CFU tiap

lalat